CN112683884A

CN112683884A - 一种甜菜碱磁微粒化学发光检测试剂盒及其制备方法

Info

Publication number: CN112683884A
Application number: CN202011596357.2A
Authority: CN
Inventors: 廖智星; 李广乐; 张娟; 王伟; 姜城子; 吴雯
Original assignee: Shenzhen Tailede Medical Co ltd
Current assignee: Shenzhen Tailede Medical Co ltd
Priority date: 2020-12-29
Filing date: 2020-12-29
Publication date: 2021-04-20
Anticipated expiration: 2040-12-29
Also published as: CN112683884B

Abstract

本发明提供一种甜菜碱磁微粒化学发光检测试剂盒，包括：第一试剂、第二试剂、第三试剂和第四试剂；其中第一试剂为甜菜碱衍生物‑碱性磷酸酶连接物、第二试剂为甜菜碱抗体‑磁微粒子工作液、第三试剂为清洗缓冲液、第四试剂为酶促发光底物液。本试剂盒用于化学发光免疫分析技术全自动检测人体中甜菜碱的含量。

Description

一种甜菜碱磁微粒化学发光检测试剂盒及其制备方法

技术领域

本发明涉及磁微粒化学发光检测试剂盒技术领域，具体涉及一种甜菜碱磁微粒化学发光检测试剂盒及其制备方法。

背景技术

甜菜碱一种具有重要生理功能的物质，其分子量为117D。其主要生理功能有：1、参与同型半胱氨酸的代谢，在甜菜碱-同型半胱氨酸甲基转移酶的作用下甲基从甜菜碱转移到同型半胱氨酸上，分别产生二甲基甘氨酸和甲硫氨酸，从而降低了体内同型半胱氨酸的含量。2、体内甲基的高效供体，甜菜碱含有三个甲基，可代替甲硫氨酸为机体提供甲基；此外甜菜碱在将甲基转移给同型半胱氨酸的同时会生甲硫氨酸，从而降低人体对甲硫氨酸的需求量。3、调节脂肪的代谢，甜菜碱通过促进体内磷脂的合成，一方面降低肝脏中脂肪合成酶的活性；另一方面促进肝脏中载脂蛋白的合成，从而加速了肝脏中脂肪的迁移, 降低了肝脏中甘油三醋的含量，减少脂肪肝发生的机率。4、调节细胞内外渗透压、减少应激反应。在机体内渗透压发生激变时，甜菜碱可作为细胞的渗透保护剂，起到缓冲的作用。当机体内的组织渗透压发生变化时，甜菜碱可被细胞吸收，从而调节细胞内外渗透压，减少盐类进入细胞以及细胞内水分的流失。

鉴于甜菜碱在同型半胱氨酸的代谢中重要作用，可单独或联合叶酸和B族维生素B2、B6、B12作为高同型半胱氨酸血症的治疗，有助于降低卒中等心脑血管病的的风险。联合亚甲基四氢叶酸还原酶677 C-> T多态性及叶酸和B2、B6、B12的检测可作为血同型半胱氨酸含量变化的一个强有力的预测因子。通过甜菜碱-同型半胱氨酸甲基转移酶途径降低同型半胱氨酸含量并刺激蛋氨酸合成，进而增加了S-腺苷甲硫氨酸/ S-腺苷同型半胱氨酸的比率，并进一步推动磷脂酰乙醇胺N-甲基转移酶的活化，催化磷脂酰胆碱转变为胆碱，通过胆碱的作用促进体内脂肪的代谢，降低脂肪肝的发生的机率。

现有针对甜菜碱的检测方法主要为实验室分析化学类检测手段，如紫外分光光度法、液相色谱、质谱等方法。但现有的甜菜碱检测方法都有一定的局限性，如检测实验步骤较为复杂、不同检测机构的实验操作标准不一、耗时长、需要配备专用仪器、检测成本较高、不能实现全自动高通量分析等，都不适合大批量临床样品的测定。目前市场上缺乏稳定性好、灵敏度高、特异性强的甜菜碱检测试剂，尤其是质量好的全自动化检验试剂。

甜菜碱在人体内的一碳代谢、甲基转运、同型半胱氨酸的代谢及脂质代谢等方面均具有重要的生理学意义，同时也在心血管疾病的预防监控和治疗方面存在着巨大的潜力。为了克服现有检测技术中存在的固有缺陷，建立一种精准、快速、成本低廉且能实现大批量检测甜菜碱的方法学是非常有必要的。近年来基于标记免疫分析技术建立起来的化学发光检测方法在医学检验领域和临床诊断方面发挥了重要作用。因此，采用化学发光免疫分析技术开发一种全自动检测甜菜碱检测试剂是切实可行的。

发明内容

为解决上述问题，本申请提供一种甜菜碱磁微粒化学发光检测试剂盒，用于化学发光免疫分析技术全自动检测人体中甜菜碱的含量。

为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

本发明提供一种甜菜碱磁微粒化学发光检测试剂盒，包括：第一试剂、第二试剂、第三试剂和第四试剂；

所述第一试剂为甜菜碱衍生物-碱性磷酸酶连接物，所述第二试剂为甜菜碱抗体-磁微粒子工作液，所述第三试剂为清洗缓冲液、所述第四试剂为酶促发光底物液。

本发明还提供一种甜菜碱磁微粒化学发光检测试剂盒的制备方法，其特征在于，包括：

通过混合酸酐法制备所述的第一试剂，所述第一试剂为甜菜碱衍生物-碱性磷酸酶连接物；

通过甜菜碱抗体包被磁微粒子制备所述第二试剂，所述第二试剂为甜菜碱抗体-磁微粒子工作液；

表面活性剂与磷酸盐缓冲液、吐温-20混合制备第三试剂，所述第三试剂为清洗缓冲液；

将金刚烷AMPPD底物液用PBS缓冲液进行稀释，制得酶促发光底物液，所述第四试剂为酶促发光底物液。

优选地，所述的通过混合酸酐法制备所述的第一试剂的制备步骤包括：

将甜菜碱衍生物溶解于的二甲基亚砜中，并加入三丙胺和氯甲酸异丁酯进行活化反应，制备得活化的甜菜碱衍生物溶液；

量取100~1000μL的所述活化的甜菜碱衍生物溶液，加入10~100mg的碱性磷酸酶室温活化1小时，提纯后获得所述第一试剂。

优选地，所述的通过甜菜碱抗体包被磁微粒子制备所述第二试剂的制备步骤包括：

配制甜菜碱抗体溶液和生物素-N-琥珀酰亚胺基酯溶液，混合所述甜菜碱抗体溶液和生物素-N-琥珀酰亚胺基酯溶液，室温反应1小时后进行提纯，制得生物素标记的甜菜碱抗体；

将磁微粒子用磷酸盐缓冲液配制成10~100mg/ml的吸附溶液，向所述吸附溶液中加入所述生物素标记的甜菜碱抗体进行吸附反应，然后洗去未结合的其他物质，获得甜菜碱抗体-生物素-链霉亲和素-磁微粒子，用PBS缓冲液配制得所述第二试剂。

优选地，所述的第二试剂的制备步骤还包括：

用硼酸盐缓冲液稀释甜菜碱抗体配制成1mg/ml的甜菜碱抗体溶液，将甲苯磺酰基磁珠配制成20mg/ml的甲苯磺酰基磁珠吸附工作液；

混合所述甜菜碱抗体溶液和所述甲苯磺酰基磁珠吸附工作液，并加入3M的(NH₄)₂SO₄溶液400μl，37℃反应18h，反应完成后洗去未结合的其他物质，获得甜菜碱抗体包被的甲苯磺酰基磁珠，用PBS缓冲液将所述甜菜碱抗体包被的甲苯磺酰基磁珠配制成第二试剂。

优选地，所述PBS缓冲液为0.02M、pH＝7.4的PBS缓冲液，所述PBS缓冲液还含有0.5%的牛血清白蛋白、0.9%的氯化钠、0.1%的吐温-20,0.05%的生物防腐剂Proclin300 。

优选地，所述硼酸盐缓冲液为0.1M、pH＝9.5的硼酸盐缓冲液，所述硼酸盐缓冲液还含有2%的牛血清白蛋白和0.5%甘氨酸。

优选地，所述封闭液为0.2M、pH＝7.4的PBS缓冲液，所述PBS缓冲液还含2%的牛血清白蛋白。

优选地，所述封闭液为0.1M、pH＝9.5的硼酸盐缓冲液，所述酸盐缓冲液还含2%的牛血清白蛋白和0.5%甘氨酸。

优选地，所述提纯采用Sephadex G-25凝胶层析柱进行提纯。依据上述实施例所制备的甜菜碱检测试剂盒，实现了能够高效检测人体中的甜菜碱

本发明试剂盒采用特定的样品处理液对待测样本进行处理，具有如下优势：

(1) 将化学发光免疫分析方法和甜菜碱的检测原料相组合，制备出一种能够对甜菜碱含量定量检出的试剂盒；

(2) 能够实现高通量快速对不同类型的样本中甜菜碱含量的定量、准确的检出；

(3) 通过制备甜菜碱衍生物-碱性磷酸酶连接物和将甜菜碱抗体包被于磁微粒子上，结合酶促化学发光的基本原理，建立一种化学发光免疫分析竞争法检测样本中甜菜碱含量的方法；

(4)甜菜碱衍生物相对于甜菜碱能够更加牢固地结合碱性磷酸酶，从而更加灵敏地识别样本中的甜菜碱。

因此，本发明提供的甜菜碱磁微粒化学发光检测试剂盒能够实现特异性识别样品中的甜菜碱，并且检测灵敏度极高。

附图说明

图1为甜菜碱标准品测试曲线图；

图2为甜菜碱衍生物的分子式；

图3为本发明的甜菜碱化学发光免疫分析检测方法与液相二级质谱法的血清测试结果的相关性对比分析图。

具体实施方式

本发明公开了一种甜菜碱磁微粒化学发光检测试剂盒及检测方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

对所公开的实施例的说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

本发明提供的甜菜碱磁微粒化学发光检测试剂盒中所用材料或试剂均可由市场购得。其中，全自动化学发光免疫分析仪是由深圳市泰乐德医疗有限公司自行研制的VIT700全自动化学发光免疫分析仪。

实施例一

本实施例提供一种甜菜碱磁微粒化学发光检测试剂盒，包括：第一试剂、第二试剂、第三试剂和第四试剂；

其中，第一试剂为甜菜碱衍生物-碱性磷酸酶连接物，第二试剂为甜菜碱抗体-生物素-链霉亲和素-磁微粒子工作液，第二试剂还可以是甜菜碱抗体直接包被的磁微粒子的反应物，第三试剂为清洗缓冲液，第四试剂为酶促发光底物液。

具体的，第一试剂的制备方法包括步骤：

称取1mg甜菜碱衍生物，室温溶解于1mL的二甲基亚砜中，溶解后的终浓度为1mg/ml。上述溶液中分别加入10μl的三丙胺和10μl的氯甲酸异丁酯进行活化反应，室温混匀反应20min。反应完成后取100μl的活化后的甜菜碱衍生物，向其中加入10mg的碱性磷酸酶，室温反应60min。采用Sephadex G-25凝胶层析柱纯化上述连接产物，获得的最终产物为甜菜碱衍生物-碱性磷酸酶连接物，置于2-8℃下保存备用。

第二试剂的制备方法包括步骤：

取0.5mg的甜菜碱抗体，采用0.2M、pH＝8.0的PBS缓冲液稀释至1mg/ml。称取1mg的生物素-N-琥珀酰亚胺基酯，室温溶解于1mL的二甲基亚砜中，溶解后的终浓度为1mg/ml。向甜菜碱抗体中加入5μl的10mg/ml的生物素-N-琥珀酰亚胺基酯，室温反应1h。反应完成采用G-25凝胶层析柱纯化上述连接产物，获得的最终产物为生物素标记的甜菜碱抗体。取25mg的包被了链霉亲和素的磁微粒子（外购），采用0.2M、pH＝7.4的PBS缓冲液在高磁力的磁板上清洗3次，清洗完成后采用0.2M的磷酸盐缓冲液配制成10mg/ml，向其中加入生物素标记的甜菜碱抗体，室温混匀过夜反应16h。反应完成后采用0.2M、pH＝7.4的PBS缓冲液（含2%的牛血清白蛋白）对磁微粒子进行封闭，室温反应2h。反应完成后采用0.2M、pH＝7.4的PBS缓冲液在高磁力的磁板上清洗3次，洗去未结合的其他物质，即获得了甜菜碱抗体包被的磁微粒子，使用0.02M、pH＝7.4的PBS缓冲液（含0.5%的牛血清白蛋白、0.9%的氯化钠、0.1%的吐温-20,0.05%的生物防腐剂Proclin300 ）将上述甜菜碱抗体-生物素-链霉亲和素-磁微粒子配制成0.05～1mg/ml的工作液，置于2-8℃下保存备用。所述的甜菜碱抗体-生物素-链霉亲和素-磁微粒子的工作液浓度还可以是0.1mg/ml，或0.2mg/ml，或0.5mg/ml，或0.8mg/ml或更优选为0.15mg/ml。

第二试剂的制备方法也可以是包括步骤：

取0.5mg的甜菜碱抗体，采用0.2M、pH＝7.4的PBS缓冲液稀释至1mg/ml。称取1mg的生物素-N-琥珀酰亚胺基酯，室温溶解于1mL的二甲基亚砜中，溶解后的终浓度为1mg/ml。向甜菜碱抗体中加入5μl的10mg/ml的生物素-N-琥珀酰亚胺基酯，室温反应1h。反应完成采用Sephadex G-25凝胶层析柱纯化上述连接产物，获得的最终产物为生物素标记的甜菜碱抗体。采用0.02M、pH＝7.4的PBS缓冲液（含0.5%的牛血清白蛋白、0.9%的氯化钠、0.1%的吐温-20,0.05%的生物防腐剂Proclin300 ）将上述生物素标记的甜菜碱抗体配制成0.2～5μg/ml的工作液，置于2-8℃下保存备用。所述的生物素标记的甜菜碱抗体的工作液浓度还可以是0.5μg/ml，或2μg/ml，或3μg/ml，或更优选为1μg/ml。取5mg的包被了链霉亲和素的磁微粒子，采用0.02M、pH＝7.4的PBS缓冲液（含0.5%的牛血清白蛋白、0.9%的氯化钠、0.1%的吐温-20,0.05%的生物防腐剂Proclin300 ）在高磁力的磁板上清洗3次，清洗完成后采用上述PBS缓冲液配制成0.05～1mg/ml的链霉亲和素磁微粒子工作液，置于2-8℃下保存备用。所述链霉亲和素磁微粒子工作液还可以是0.1mg/ml，或0.3mg/ml，或0.5mg/ml，或0.8mg/ml或更优选为0.2mg/ml。

第二试剂的制备方法也可以是包括步骤：

取0.2mg的甜菜碱抗体，采用0.1M、pH＝9.5的硼酸盐缓冲液稀释至1mg/ml，取5mg甲苯磺酰基磁珠（外购）采用0.1M、pH＝9.5的硼酸盐缓冲液在高磁力的磁板上清洗3次，清洗完成后采用0.1M、pH＝9.5的硼酸盐缓冲液配制成20mg/ml，将两者进行混合，并加入3M的(NH₄)₂SO₄溶液400μl，37℃混匀过夜反应18h。反应完成后采用0.1M、pH＝9.5的硼酸盐缓冲液（含2%的牛血清白蛋白、0.5%甘氨酸）对磁微粒子进行封闭，37℃混匀反应4h。反应完成后采用0.2M、pH＝7.4的PBS缓冲液在高磁力的磁板上清洗5次，洗去未结合的其他物质，即获得了甜菜碱抗体包被的磁珠。使用0.02M、pH＝7.4的PBS缓冲液（含0.5%的牛血清白蛋白、0.9%的氯化钠、0.1%的吐温-20，0.05%的生物防腐剂Proclin300 ）将上述甜菜碱抗体-甲苯磺酰基磁珠配制成0.1～1mg/ml的工作液，置于2-8℃下保存备用。所述的甜菜碱抗体-甲苯磺酰基磁珠的工作液浓度还可以是0.2mg/ml，或0.3mg/ml，或0.5mg/ml，或0.8mg/ml或更优选为0.25mg/ml。

第三试剂的制备方法包括步骤：

称取Na₂HPO₄•12H₂O 4.37g、NaH₂PO_4•2H₂O 1.22g、NaCI 9g、5g吐温-20、

十六烷基溴化铵1g于烧杯中，加入0.8ml纯化水进行混匀，调节pH至7.5，最后定容至1L，置于2-8℃下保存备用。

第四试剂的制备方法包括步骤：

量取一定量的金刚烷AMPPD底物液，采用0.02M、pH＝7.0的PBS缓冲液稀释10倍，用于作为酶促发光底物液。

技术效果说明，本发明所提供的甜菜碱检测试剂盒，创造性地开发出一种可应用于化学发光免疫分析技术的甜菜碱检测试剂盒，所述试剂盒所应用的甜菜碱衍生物是本发明独创的，与一般的甜菜碱具有一定的区别，所制备出的甜菜碱磁微粒化学发光检测试剂盒的第一试剂中，甜菜碱衍生物相对于甜菜碱与碱性磷酸酶的连接效果更好，所制备出的试剂盒对于甜菜碱的检测灵敏度更高。

实施例二

本实施例提供一种用甜菜碱磁微粒化学发光检测试剂盒检测样品中甜菜碱含量的方法，具体步骤包括：

取50μl的待检样品或标准品、50μl第一试剂、50μl第二试剂加入至反应孔一起进行反应，37℃孵育5min，反应完成后取300μl的第三试剂对在高磁力的磁板上述反应物进行清洗3次，清洗完成后加入100μl的第四试剂，并加载至泰乐德医疗有限公司自行研制的VIT700全自动化学发光免疫分析仪上进行检测。也可以将第一试剂、第二试剂、第三试剂和第四试剂预先分装至泰乐德医疗有限公司的自制的试剂条中，并压膜分好制备成成品试剂。检测时只需在试剂条的样本孔中加入待检样本或标准品并加载至泰乐德医疗有限公司自行研制的VIT700全自动化学发光免疫分析仪上，即可实现仪器对样本中甜菜碱含量的全自动检测。

标准曲线的建立：采用不含甜菜碱健康人血清的将甜菜碱国家标准品配制成0、2.0、10.0、50.0、100.0、和500.0nmol/ml的标准品工作液，采用上述甜菜碱检测试剂进行检测，绘制标准曲线，标准曲线绘制结果见附图1。

配制测试样本：

将甜菜碱纯品溶解于纯水中制成1μmol/ml的储存液，并将此储存液稀释于不含甜菜碱健康人血清中，至终浓度分别为0.0、5.0、60.0、150.0nmol/ml，形成空白、低、中、高浓度的血清样本。利用前述化学发光免疫分析检测方法和图1的校准标准品曲线，对上述空白、低、中、高浓度的配制样本进行测试。

表 1配制血清样本中甜菜碱测试结果

由表1中结果可知：采用本发明甜菜碱检测试剂测定不同浓度样品中的甜菜碱回收率都较高，均＞95％，说明本发明所述甜菜碱检测试剂可以用于样本中甜菜碱的检测，并且结果准确度高。

实施例三

本实施例提供一种甜菜碱检测试剂的精密度评价方法：

将所述甜菜碱储存液采用不含甜菜碱健康人血清稀释为终浓度分别是：20.0、80.0、250.0nmol/ml，形成低、中、高浓度的质控品样本。利用前述甜菜碱的化学发光免疫分析检测方法和图1的校准标准品曲线，对上述空白、低、中、高浓度的质控品重复10次测定，计算平均值和变异系数。

表 2精密度测试结果

由表2中结果可知：采用本发明甜菜碱检测试剂测定不同浓度样品中的甜菜碱的变异系数均＜6%，精密度高。

与液相二级质谱法(LC-MS/MS)的血清样本测试结果进行对比：

质谱学方法是一种同时具备高特异性、高灵敏度及高准确性的普适性分析方法，能够准确的测定样品中物质的含量。现对90例临床血清标本分别使用液相二级质谱法和本发明的甜菜碱化学发光免疫分析检测方法同步进行测试，并将两种检测方法的测试结果进行相关性对比分析，测定的数据参见表3，相关性对比分析见图2。

表 3质谱测定数据

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种甜菜碱磁微粒化学发光检测试剂盒，其特征在于，包括：第一试剂、第二试剂、第三试剂和第四试剂；

所述第一试剂为甜菜碱衍生物-碱性磷酸酶连接物、所述第二试剂为甜菜碱抗体-磁微粒子工作液、所述第三试剂为清洗缓冲液、所述第四试剂为酶促发光底物液。

2.一种甜菜碱磁微粒化学发光检测试剂盒的制备方法，其特征在于，包括：

通过甜菜碱抗体与磁微粒子反应制备所述第二试剂，所述第二试剂为甜菜碱抗体-磁微粒子工作液；

3.根据权利要求2所述的甜菜碱磁微粒化学发光检测试剂盒的制备方法，其特征在于，所述通过混合酸酐法制备所述的第一试剂的制备步骤包括：

4.根据权利要求2所述的甜菜碱磁微粒化学发光检测试剂盒的制备方法，其特征在于，所述甜菜碱抗体与磁微粒子反应制备第二试剂的制备步骤包括：

5.根据权利要求2所述的甜菜碱磁微粒化学发光检测试剂盒的制备方法，其特征在于，所述第二试剂的制备步骤包括：

混合所述甜菜碱抗体溶液和所述磺基磁珠吸附工作液，并加入3M的(NH₄)₂SO₄溶液400μl，37℃反应18h，反应完成后洗去未结合的其他物质，获得甜菜碱抗体包被的甲苯磺酰基磁珠，用PBS缓冲液将所述甜菜碱抗体包被的甲苯磺酰基磁珠配制成第二试剂。

6.根据权利要求2、4和5中任一项所述的甜菜碱磁微粒化学发光检测试剂盒的制备方法，其特征在于，所述PBS缓冲液为0.02M、pH＝7.4的PBS缓冲液，所述PBS缓冲液还含有0.5%的牛血清白蛋白、0.9%的氯化钠、0.1%的吐温-20和0.05%的生物防腐剂Proclin300。

7.根据权利要求4所述的甜菜碱磁微粒化学发光检测试剂盒的制备方法，其特征在于，所述PBS缓冲液为0.2M、pH＝7.4的PBS缓冲液，所述PBS缓冲液还含2%的牛血清白蛋白。

8.根据权利要求5所述的甜菜碱磁微粒化学发光检测试剂盒的制备方法，其特征在于，所述硼酸盐缓冲液为0.1M、pH＝9.5的硼酸盐缓冲液，所述酸盐缓冲液还含2%的牛血清白蛋白和0.5%甘氨酸。

9.根据权利要求3或4所述的甜菜碱磁微粒化学发光检测试剂盒的制备方法，其特征在于，所述提纯采用Sephadex G-25凝胶层析柱进行提纯。