CN102707046A - 一种麦角生物碱多残留分析的酶联免疫分析测试盒及其检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于检测麦角生物碱的酶联免疫测试盒及其检测方法，主要适用于用该试剂盒快速批量测定原粮及其制品中多种麦角生物碱的含量，属于食品分析检测领域。以几种麦角生物碱的共有结构麦角酸偶联载体蛋白制成免疫抗原并获得高效价抗体为基础，以麦角酸偶联另一载体蛋白制成的包被抗原包被酶标板，经封闭后，加入所述高效价抗体与试验样品液进行竞争性结合反应，然后加入酶标二抗进行显色反应，最后加入终止液终止反应，通过定量检测吸光度值可以确定麦角生物碱的含量。本发明还提供了一种依据该方法制备的操作简便易行的酶联免疫测试盒。本发明的优点是能用于原粮及其制品中多种麦角生物碱的快速检测，样品的前处理过程简单，耗时少，灵敏度高，能同时检测批量的样品，样品检测成本远低于传统的检测方法。

Description

一种麦角生物碱多残留分析的酶联免疫分析测试盒及其检测方法

技术领域

本发明涉及一种用于检测麦角生物碱的酶联免疫测试盒及其检测方法，主要适用于用该试剂盒快速批量测定原粮及其制品中多种麦角生物碱的含量，属于食品分析检测领域。 

背景技术

麦角是麦角菌在寄生植物的子房中形成的紫黑色、具有真菌结构的长角形菌核，形状像动物的角，故称麦角（ergot）。其宿主多为禾本科植物。世界范围内种植的小麦、玉米、大麦、水稻、谷子、燕麦、高粱、黑麦等均可被麦角菌侵染。麦角中毒是由于受麦角菌侵染谷物中的一系列有活性的生物碱引起的。麦角菌毒素的有毒成分主要是以麦角酸为基本结构的一系列生物碱衍生物，如麦角毒碱（ergotoxin）、麦角胺（ergotamine）、麦角新碱（ergonovine）、麦角生碱（ergosine）、麦角克碱（ergocristine）等。麦角碱是一类物质的总称，医学上常用来收缩子宫、促进产程、治疗偏头痛及高血压等。另一方面麦角也是谷类作物的重要病害，不但能引起谷物减产，而且当人们食用了混杂有较大量的麦角谷物或面粉所做的食品后，就可能发生麦角菌中毒。麦角中毒的症状主要有两类，即坏疽性麦角中毒和痉挛性麦角中毒。前者症状包括剧烈疼痛，支端感染和肢体出现焦灼、发黑等坏疽症状；后者症状包括神经失调，主要是麻木、抽搐、运动失协、呼吸困难、脉搏加快、痉挛等，有的还会出现感觉神经紊乱而出现幻觉。由于麦角生物碱种类繁多，并且不同粮食作物中麦角生物碱的含量也不同，因此没有统一的限量标准。德国及瑞士规定总麦角碱在谷物中的限量分别是400~500μg/kg和100μg/kg。关于麦角在小麦中的限量，我国为0.01%，欧盟为0.05%，美国为0.3%，日本为0.04%。 

目前，有关麦角的检测大都采用感官检验以及化学定性分析。但对于已经研磨或某种处理使得菌核难于或不能辨认的谷物，就必须进行麦角生物碱含量的测定。针对麦角生物碱的检测方法有薄层色谱法（TLC）、高效液相色谱法（HPLC）、液质联用法（HPLC-MS）、酶联免疫吸附法（ELISA）和毛细管电泳法等。仪器法虽然具有很好的灵敏度和特异性，但操作繁琐、耗时长，且需要昂贵的仪器设备，检测成本高，也不适合现场监控及大量样本的筛选；ELISA方法具有特异性强、灵敏度高、方便快捷、分析容量大、安全廉价、仪器化程度要求不高、适应性强等特点，对复杂样品中超微量有毒有害物质残留分析和现场快速检测方面，具有广阔的应用前景和开发潜力。对于麦角生物碱的免疫分析方法早有报道，但要同时测定多种麦角生物碱并将其研制成酶联免疫测试盒，从而更好地应用于实际检测当中，这在国内外鲜有报道。 

发明内容

本发明的目的在于克服上述不足之处，提供一种高特异性、高灵敏度，操作方法简单快速，并能用于大批量样品快速检测的适用于多种麦角生物碱含量 测定的酶联免疫测试盒。 

按照本发明提供的技术方案，一种用于检测麦角生物碱的酶联免疫测试盒，包括盒体，盒体内设置有试剂板和96或48孔抗原包被板；所述试剂板包括泡沫塑料模具，泡沫塑料模具上设置有若干个试剂孔，每个试剂孔内均安放试剂瓶。 

所述试剂盒泡沫塑料模具中若干个试剂孔中安放的试剂瓶包括：浓缩洗涤液、样品稀释液、显色液a、显色液b、终止液、第一抗体溶液、酶标二抗溶液和麦角生物碱标准品。 

浓缩洗涤液，10~30mL/瓶；取氯化钠150~200g、磷酸二氢钠4~6g、磷酸氢二钠50~70g、吐温-208~12mL，以双蒸水定容至1L； 

样品稀释液，为质量浓度为10%~20%的甲醇-PBS溶液； 

显色液a，3~7mL/瓶，为0.005mol/L过氧化氢脲素溶液； 

显色液b，3~7mL/瓶，为0.0005mol/L 3,3’,5,5’-四甲基联苯胺溶液； 

终止液，3~7mL/瓶，为2mol/L的硫酸； 

第一抗体溶液，3~5mL/瓶；取1~2mg麦角酸-KLH，用2~4mL 0.1mol/L的经121℃高温灭菌20min的PBS溶解，然后取1~2mL溶解的抗原与等量完全弗氏佐剂充分混合，注射，分离抗血清，采用Protein A亲和纯化多克隆抗体； 

酶标二抗溶液，4~6mL/瓶；为辣根过氧化物酶标记羊抗兔抗体溶液； 

麦角生物碱标准品，共6瓶，2~4mL/瓶，浓度分别为0、5、10、20、40、80ng/mL，稀释液为质量浓度10%~20%的甲醇-PBS溶液； 

所述96或48孔抗原包被板的每个孔内均由包被液包被能与抗麦角生物碱抗体特异性结合反应的包被抗原，并用质量浓度1.0~3.0%的牛血清白蛋白进行封闭； 

所述的包被液为碳酸盐缓冲液，其含碳酸钠2.5~3.5g、碳酸氢钠4.5~6.5g、并用双蒸水定容至1L；所述包被抗原为麦角酸与卵清蛋白的偶联物。 

一种麦角生物碱多残留分析的酶联免疫分析测试盒的检测方法，步骤如下： 

（1）酶标板的制备：包被抗原麦角酸-OVA用pH9.6，0.005mol/L的碳酸盐缓冲液，其含碳酸钠2.5~3.5g、碳酸氢钠4.5~6.5g、双蒸水定容至1L，稀释成1~4μg/mL，在96或48孔抗原包被板的每孔中各加入105μL，2~6℃下包被过夜，倾去包被液，用洗涤液洗涤1次，拍干，然后每孔中加入质量浓度为1.0%~3.0%的牛血清白蛋白，2~6℃下封闭过夜，倾去封闭液，用洗涤液洗涤2次，得到酶标版，拍干后，真空包装后于-20℃保存； 

（2）待测样液的制备：称取2.5~5.0g样品，置100mL棕色具塞圆底烧瓶中，加入12.5~25.0mL 50%的甲醇-PBS溶液，振摇15~20min，过滤，弃去1/4初滤液，收集试样滤液，此即样品提取液；取质量浓度为10%~20%甲醇-PBS溶液稀释后作为待测样液用于ELISA检测； 

（3）测试过程：取步骤（1）制备的酶标板，恢复至室温后备用；按照常规ELISA方法加入50μL的标准溶液或处理好的待测样液到各自的微孔中，每孔加50μL第一抗体溶液，置于37℃温育l小时，洗涤液洗3次，再于每孔内 加入100μL酶标二抗溶液，37℃温育0.5小时，用洗涤液洗5次，每孔各加入50μL显色液a和50μL显色液b，37℃温育15分钟，最后于每孔内加入50μL终止液终止反应，并在450nm处测其吸光度值，从标准曲线计算样品中的麦角生物碱含量。 

本发明具有如下优点：该试剂盒对麦角生物碱的特异性较好，与简单的吲哚衍生物（如色氨酸）无交叉反应。间接竞争ELISA法对不同麦角生物碱的最低检测限各不相同，其中对麦角胺为5.7ng/mL，双氢麦角毒碱为4.3ng/mL、麦角新碱为6.5ng/mL；样品的加标回收率在70~80%之间。测试盒在2~6℃下至少保存6个月。 

本发明能用于原粮（小麦、玉米、大麦、水稻、燕麦、高粱、黑麦等）及其制品（面包等）中多种麦角生物碱残留的分析，样品的前处理过程简单，耗时少，能同时检测批量样品，检测成本远低于传统的检测方法。试剂盒采用高特异性、高效价、广谱性较好的多克隆抗体，提高了检测的灵敏度和准确性。测试盒保质期至少6个月。该发明提供的快速检测方法操作简便、快速，完成整个操作过程只需1.5~2小时，非常适合现场检测的需要。此外，该发明成本低廉、检测效率高、操作简便，既有经济效益又有社会效益，是一种创新性较高的具有良好应用前景的多残留免疫检测试剂盒。 

附图说明

图1本发明试剂盒结构主视图。 

图2本发明试剂板结构示意图。 

图3本发明96或48孔抗原包被板示意图。 

图4麦角生物碱标准曲线。 

图5本发明试剂盒37℃加速破坏曲线 

具体实施方式

实施例1麦角生物碱多残留分析的酶联免疫分析测试盒及其制备 

如图1-3所示，一种麦角生物碱多残留分析的酶联免疫分析测试盒，包括盒体11，盒体11内设置有试剂板和96或48孔抗原包被板10；所述试剂板包括泡沫塑料模具1，泡沫塑料模具1上设置有若干个试剂孔2~9，每个试剂孔内均安放试剂瓶。

所述试剂盒泡沫塑料模具1中若干个试剂孔2~9中安放的试剂瓶如下： 

试剂孔2为浓缩洗涤液，10~30mL/瓶；取氯化钠150~200g、磷酸二氢钠4~6g、磷酸氢二钠50~70g、吐温-208~12mL，以双蒸水定容至1L； 

试剂孔3为样品稀释液；为10%~20%的甲醇-PBS溶液； 

试剂孔4为显色液a，3~7mL/瓶，为0.005mol/L过氧化氢脲素溶液； 

试剂孔5为显色液b，3~7mL/瓶，为0.0005mol/L3,3’,5,5’-四甲基联苯胺溶液； 

试剂孔6为终止液，3~7mL/瓶，为2mol/L的硫酸； 

试剂孔7为第一抗体溶液，3~5mL/瓶；取1~2mg麦角酸-KLH，用2~4mL0.1mol/L的PBS经（经121℃高温灭菌20min）溶解，然后取1~2mL溶解的 抗原与等量完全弗氏佐剂充分混合，注射，分离抗血清，采用Protein A亲和纯化多克隆抗体； 

试剂孔8为酶标二抗溶液，4~6mL/瓶；为辣根过氧化物酶标记羊抗兔抗体溶液； 

试剂孔9为麦角生物碱标准品，共6瓶，2~4mL/瓶，浓度分别为0、5、10、20、40、80ng/mL，稀释液为质量浓度10~20%的甲醇-PBS溶液。 

所述96或48孔抗原包被板10的每个孔内均由包被液包被能与抗麦角生物碱抗体特异性结合反应的包被抗原，并用质量浓度为1.0~3.0%的牛血清白蛋白进行封闭； 

所述的包被液为碳酸盐缓冲液，其含碳酸钠2.5~3.5g、碳酸氢钠4.5~6.5g、并用双蒸水定容至1L；所述包被抗原为麦角酸与卵清蛋白的偶联物。 

所述试剂的准备： 

（1）完全抗原的制备： 

麦角酸-钥孔嘁血蓝蛋白（KLH）或卵清蛋白（OVA）的制备： 

①75~85mg麦角酸溶于10~15mL二氧六环（30℃左右水浴至麦角酸全部溶解），然后加入到100~120mg碳二亚胺（EDC）水溶液（5mL）中。 

②20~40mg钥孔嘁血蓝蛋白（KLH）或卵清蛋白（OVA）溶于10mL pH7.4的PBS（内含氯化钠7.5~9.5g、磷酸二氢钠0.15~0.35g、磷酸氢二钠2~4g、双蒸水1L）逐滴加入上一步制成的混合液中。 

③室温搅拌10小时后，4℃过夜保存。再用PBS透析2天，于-40℃真空冷冻干燥后-20℃保存备用。 

（2）抗麦角生物碱多克隆抗体的制备及纯化： 

步骤（1）所获得的免疫抗原（麦角酸-KLH）免疫三只健康雄性新西兰大白兔。免疫前一周从兔耳缘静脉采血作为阴性对照。称取1~2mg麦角酸-KLH，用2~4mL 0.1mol/L的PBS（经121℃高温灭菌20min）溶解，然后取1~2mL溶解的抗原与等量完全弗氏佐剂充分混合，乳化完全后在新西兰大白兔背部进行多点皮下注射。1个月后进行第1次加强免疫，采用四肢内部肌肉注射，剂量与首次免疫相同，与等量不完全弗氏佐剂混合充分乳化。共免疫5次，每次间隔2周。每次加强免疫前从兔耳缘静脉采血，采用间接ELISA法测定抗血清效价。效价合格后，采用兔颈动脉放血，收集血液于无菌离心管中。待血液凝固之后，用无菌滴管将血块与瓶壁剥离后，放入37℃，1~2h后取出放入2~6℃冰箱过夜，使血清充分析出，经3000r/min离心20min，分出抗血清，并采用ProteinA亲和纯化多克隆抗体，具体纯化过程如下：①装柱：将蛋白A sepharose CL-4B填料缓慢加入玻璃柱中，利用泵控制填充速度为1~2mL/min，避免柱干，利用10倍于床体积并经过预冷的TBS缓冲溶液（内含5.5~6.5g Tris，8~9g氯化钠，0.4~0.6g叠氮化钠，双蒸水1L，并用盐酸调节pH 7.3~7.5。）。②亲和层析：将抗体用TBS缓冲溶液以1∶4~1∶6的比例进行稀释，再用过滤器进行过滤。以0.5mL/min的速度将抗血清上到柱上,用TBS缓冲溶液清洗柱子后，用洗脱缓冲溶液（内含3.5~4.5g甘氨酸，双蒸水1L，并用盐酸调节pH 2.5~3.0。）以0.5 mL/min的速度洗脱至所有蛋白均流下来。用已经加入中和缓冲溶液（内含120~122g Tris，85~90g氯化钠，0.35~4.0g EDTA及4~6g叠氮化钠溶于1L蒸馏水中，并用盐酸调节pH7.5~8.5。）的试管收集洗脱液，混匀后用pH试纸检查洗脱液的pH，如果pH低于7可利用中和缓冲液调至约pH7.0~7.5以防止抗体的变性。③纯化好的抗体于-40℃真空冷冻干燥后-20℃保存备用。 

实施例2所述麦角生物碱多残留分析的酶联免疫分析测试盒的检测方法 

（1）酶标板的制备 

实施例1制备的包被抗原麦角酸-OVA用pH9.6，0.005mol/L的碳酸盐缓冲液（含碳酸钠2.5~3.5g、碳酸氢钠4.5~6.5g、双蒸水定容至1L）稀释成1~4μg/mL，在96或48孔抗原包被板的每孔中各加入105μL，2~6℃下包被过夜，倾去包被液，用洗涤液洗涤1次，拍干，然后每孔中加入质量浓度为1.0%~3.0%的牛血清白蛋白，2~6℃下封闭过夜，倾去封闭液，用洗涤液洗涤2次，拍干后，真空包装后于-20℃保存。 

（2）检测样品的前处理 

原粮及其制品：称取2.5~5.0g样品，置100mL棕色具塞圆底烧瓶中，加入12.5~25.0mL 50%的甲醇-PBS溶液，振摇15~20min，过滤，弃去1/4初滤液，收集试样滤液，此即样品提取液。取适量提取液用质量浓度为10%~20%甲醇-PBS稀释一定倍数后作为待测样液，用于ELISA检测。 

（3）试剂盒操作过程 

间接竞争ELISA法：取一块包被有麦角酸-OVA的酶标板，恢复至室温后备用。加入50μL的标准溶液或处理好的检测样品到各自的微孔中，再给加50μL第一抗体溶液，置于37℃温育l小时，洗涤液洗3次，再于每孔内加入100μL酶标二抗工作溶液，37℃温育0.5小时，用洗涤液洗5次，每孔各加入50μL显色液a和50μL显色液b，37℃温育15分钟，最后于每孔内加入50μL终止液终止反应，并在450nm处测其吸光度值，从图4所示标准曲线计算样品中的麦角生物碱含量。 

实施例3试剂盒保存期试验 

将试剂盒放入37℃环境下进行加速破坏试验，每隔24小时进行一次ELISA测定，测定阴性对照孔（0ng/mL标准溶液孔）的吸光度值，对数据统计分析，根据37℃下24小时相当于4℃下45天，推算试剂盒的稳定周期，结果图5所示。 

一般地，当阴性对照的吸光度值（A）低于0.6个单位时，测定结果的判断将出现较大偏差，此时试剂已不适用于样品测定，即试剂已失效。从图3可知，本试剂盒试剂在4℃下至少保存6个月。 

实施例4试剂盒灵敏度测定 

常用50%抑制浓度（即IC₅₀，指抑制率为50%时所对应的待测物浓度）来评价竞争ELISA试剂盒灵敏度的指标。将几种麦角生物碱（麦角胺、双氢麦角毒碱、麦角新碱等）标准溶液稀释成系列浓度（0、5、15、45ng/mL），分别用间接竞争ELISA法分析，结果显示，该试剂盒对麦角胺、双氢麦角毒碱、麦角 新碱的最低检出限分别为5.7ng/mL、4.3ng/mL、6.5ng/mL。 

实施例5试剂盒特异性试验 

以抗体与结构类似化合物的交叉反应程度，即以抑制抗体最大结合率的50%所需目标分析物的浓度（IC_50a）与所需各种结构类化合物的浓度（IC_50b）之比的百分数表示，即交叉反应率C.R（%）。 

$C.R(\%)=\frac{{\mathrm{IC}}_{50a}}{{\mathrm{IC}}_{50b}}\×100$

交叉反应率越小，抗体特异性越好；反之，抗体光谱性越高。交叉反应结果如表1所示，结果表明该试剂盒对以麦角酸为基本结构的麦角生物碱的广谱性较好，可保证对粮食及其制品中几种麦角生物碱的同时检测。 

表1交叉反应率 

实施例6试剂盒精密度试验 

取0、5、20ng/mL三个浓度的标准溶液，以不同批次的三批测试盒分别进行重复性和重现性的实验，每个浓度重复3次测定，每次做10个平行，将所得结果进行统计分析，分别计算批内、批间变异系数。结果表明，三个批次测试盒的批内变异系数为6.8%~12.3%，批间变异系数为9.4%~13.3%。 

实施例7试剂盒的准确性试验 

取3个浓度的麦角生物碱标样，对小麦样品进行添加回收试验，每个浓度分设3个平行，分别计算回收率，结果见表2。 

表2不同麦角生物碱的加标回收率 

Claims (3)

1. 一种麦角生物碱多残留分析的酶联免疫分析测试盒，其特征是：包括盒体（11），盒体（11）内设置有试剂板和96或48孔抗原包被板（10）；所述试剂板包括泡沫塑料模具（1），泡沫塑料模具（1）上设置有若干个试剂孔（2）~（9），每个试剂孔内均安放试剂瓶。

2.如权利要求1所述麦角生物碱多残留分析的酶联免疫分析测试盒，其特征是所述试剂盒泡沫塑料模具（1）中若干个试剂孔（2）~（9）中安放的试剂瓶如下：

试剂孔（2）为浓缩洗涤液，10~30 mL/瓶；取氯化钠150~200 g、磷酸二氢钠4~6 g、磷酸氢二钠50~70 g、吐温-20 8~12 mL，以双蒸水定容至1 L；

试剂孔（3）为样品稀释液；为质量浓度为10%~20%的甲醇-PBS溶液；

试剂孔（4）为显色液a，3~7mL/瓶，为0.005 mol/L过氧化氢脲素溶液； 

试剂孔（5）为显色液b，3~7mL/瓶，为0.0005 mol/L 3,3’,5,5’-四甲基联苯胺溶液；

试剂孔（6）为终止液，3~7mL/瓶，为2 mol/L的硫酸；

试剂孔（7）为第一抗体溶液，3~5 mL/瓶；取1~2 mg麦角酸-KLH，用2~4 mL 0.1 mol/L的经121℃高温灭菌20 min的 PBS溶解，然后取1~2 mL溶解的抗原与等量完全弗氏佐剂充分混合，注射，分离抗血清，采用Protein A亲和纯化多克隆抗体；

试剂孔（8）为酶标二抗溶液，4~6 mL/瓶；为辣根过氧化物酶标记羊抗兔抗体溶液；

试剂孔（9）为麦角生物碱标准品，共6 瓶，2~4 mL/瓶，浓度分别为0、5、10、20、40、80 ng/mL，稀释液为质量浓度10%~20%的甲醇-PBS溶液；

所述96或48孔抗原包被板（10）的每个孔内均由包被液包被能与抗麦角生物碱抗体特异性结合反应的包被抗原，并用质量浓度1.0~3.0%的牛血清白蛋白进行封闭；

所述的包被液为碳酸盐缓冲液，其含碳酸钠2.5~3.5 g、碳酸氢钠4.5~6.5 g、并用双蒸水定容至1 L；所述包被抗原为麦角酸与卵清蛋白的偶联物。

3.一种麦角生物碱多残留分析的酶联免疫分析测试盒的检测方法，其特征是步骤如下：

（1）酶标板的制备：包被抗原麦角酸-OVA用pH9.6，0.005 mol/L的碳酸盐缓冲液，其含碳酸钠2.5~3.5 g、碳酸氢钠4.5~6.5 g、双蒸水定容至1 L，稀释成1~4 μg/mL，在96或48孔抗原包被板的每孔中各加入105 μL，2~6℃下包被过夜，倾去包被液，用洗涤液洗涤1次，拍干，然后每孔中加入质量浓度为1.0%~3.0%的牛血清白蛋白，2~6℃下封闭过夜，倾去封闭液，用洗涤液洗涤2次，得到酶标版，拍干后，真空包装后于-20℃保存；

（2）待测样液的制备：称取2.5~5.0 g样品，置100 mL棕色具塞圆底烧瓶中，加入12.5~25.0 mL 50%的甲醇-PBS溶液，振摇15~20 min，过滤，弃去1/4初滤液，收集试样滤液，此即样品提取液；取质量浓度为10%~20%甲醇-PBS溶液稀释后作为待测样液用于ELISA检测；

（3）测试过程：取步骤（1）制备的酶标板，恢复至室温后备用；按照常规ELISA方法加入50 μL的标准溶液或处理好的待测样液到各自的微孔中，每孔加50 μL第一抗体溶液，置于37℃温育l小时，洗涤液洗3次，再于每孔内加入100 μL酶标二抗溶液，37℃温育0.5小时，用洗涤液洗5次，每孔各加入50 μL显色液a和50 μL显色液b，37℃温育15分钟，最后于每孔内加入50 μL终止液终止反应，并在450 nm处测其吸光度值，从标准曲线计算样品中的麦角生物碱含量。

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