CN104769436A - 阵发性心房纤颤的基于TnT的诊断 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用于诊断最近阵发性心房纤颤的方法。所述方法基于测定来自对象的样品中选自心脏肌钙蛋白、NT-原BNP(脑利尿钠肽的N-末端激素原)、hsCRP、IL-6(白介素-6)和IGFBP7(胰岛素样生长因子结合蛋白7)的至少一种标志物和比较这样测定的一个(或多个)量与一个(或多个)参考量。此外，本发明涉及用于鉴定易受抗凝治疗影响的对象的方法。进一步设想用于进行本文公开的方法的系统、试剂和试剂盒。

Description

阵发性心房纤颤的基于TnT的诊断

本发明涉及用于诊断最近阵发性心房纤颤的方法。所述方法基于测定来自对象的样品中选自心脏肌钙蛋白、NT-原BNP (脑利尿钠肽的N-末端激素原)、hsCRP、IL-6(白介素-6)和IGFBP7(胰岛素样生长因子结合蛋白7)的至少一种标志物和比较因此测定的一个(或多个)量与一个(或多个)参考量。进一步，本发明涉及用于鉴定易受抗凝治疗影响的对象的方法和用于基于IGFBP7的量的测定诊断进行性心房纤颤的方法。进一步设想用于进行本文公开的方法的系统、试剂和试剂盒。

心房纤颤是最常见的心律失常。然而，患者经常没有认识到心房纤颤(AF)。在约40％的指示该病史的患者中是这种情况，考虑到在心房纤颤的诊断方面不灵敏(Kamel H.等人, Curr Atheroscler Rep 2011: 13: 338 – 343)。虽然这些数目涉及持续性心房纤颤，但是阵发性心房纤颤甚至更难以诊断，并且仅可以通过住院患者心脏遥测术(cardiac telemetry)或甚至Holter监测来捕捉。因此，阵发性心房纤颤的识别是一项重大挑战，特别是，由于至少1％的一般群体具有持续性心房纤颤，并且频率随年龄而增加(Rizos T.等人)。

阵发性心房纤颤被定义为在少于七天、通常少于24小时内自发终止的心房纤颤的反复发作。它可以是自我终止的或间歇的。阵发性心房纤颤在5-10％的老年对象中是常见的(参见Prevalence, incidence and lifetime risk of atrial fibrillation: the Rotterdam study. Heeringa等人., Eur Heart J. 2006; 27(8):949)。未治疗的患者具有增加的中风风险(w/o抗凝)。

检测心房纤颤的黄金标准是心电图(ECG)，优选作为24小时ECG(Holter监测)进行。然而，Holter监测只有当心律失常在ECG记录的24小时期间内发生时才可以检测到心房纤颤。

一些出版物涉及增强水平的生物标志物与心房纤颤的关联(Biomarkers in Atrial Fibrillation: Investigating Biologic Plausibility, Cause, and Effect R. Becker Journal of Thrombosis and Thrombolysis 19(1), 71–75, 2005)。

NT-原BNP评价提供了评价收缩功能障碍的手段。高敏肌钙蛋白测定允许亚临床心脏损伤的检测。已经描述，肌钙蛋白T和NT-原BNP两者的升高水平独立地预测6或12个月后心房纤颤的首次复发的较高风险(Circulating cardiovascular biomarkers in recurrent atrial fibrillation: data from the GISSI-Atrial Fibrillation Trial, R. Latini等人., J Intern Med2011;269:160–171)。I. Beaulieu-Boire描述了具有急性缺血性中风(AIS)或短暂性脑缺血发作(TIA)的患者中的升高的cTnI水平预测新发作AF，且与较差预后和较高死亡率相关(I. Beaulieu-Boire等人 J Stroke Cerebrovasc Dis. 2012 Feb 15, 在线可得，排版中)。

几个其它出版物描述了增加水平的生物标志物与心房纤颤的诊断和/或预测的关联(Kirchhof等人, 2011年7月26日，Europace Epub, Comprehensive risk reduction in patients with atrial fibrillation: emerging diagnostic and therapeutic options-a report from the 3rd Atrial Fibrillation Competence NETwork/European Heart Rhythm Association consensus conference; Circulating cardiovascular biomarkers in recurrent atrial fibrillation: data from the GISSI-Atrial Fibrillation Trial, R. Latini等人., J Intern Med 2011;269:160–171, )。将允许诊断阵发性心房纤颤的最近发生的血液生物标志物是高度期望的，因为这些生物标志物的测定将允许鉴定可以受益于抗凝治疗的患者。

Bugnicourt等人.2010 (Eur Neurol 2010;63:24-28)公开了心脏肌钙蛋白I水平预测缺血性中风患者中的新发作心房纤颤。它还公开了已知升高肌钙蛋白水平与心房纤颤相关。

Hijazi等人.2012 (Circulation.125:1605-1616)公开了肌钙蛋白I和NT原BNP的升高在具有AF的患者中是常见的，并且与中风和死亡的增加风险独立相关。

Marcus等人.2008 (Heart Rhythm.2008 Feb;5(2):215-21)公开了CRP和IL-6水平在呈现心房纤颤的患者中升高。

Choudhury等人.2008 (Sep;l34(3):574-81)公开了诊断心房纤颤的基于sCD40L检测的方法。具体地，与健康对照对象相比，AF患者具有显著更高的sCD40L水平。

Cohen等人.2007 (doi:10.1093/eurheartj/ehm170)报道了诊断心房纤颤的基于D-二聚体检测的方法。

Latini等人.2011 (J Intern Med. 2011 Feb;269(2):160-71)公开了用于基于具有AF病史的患者中的NT原ANP、hsTnT或NT原BNP的检测预测心房纤颤的复发的方法。

Wachter等人.2012 (PLoS ONE 7(4):e34351. doi:l0.1371/journal.pone.0034351)公开了BNP可用于检测阵发性AF。

Rizos等人.2010 (Journal of Human Hypertension 24, 447-457)公开了hsCRP和IL-6可用于检测阵发性AF。

本发明潜在的技术问题可以视为提供用于符合前述需要的手段和方法。

该技术问题通过权利要求和本文下述内容中表征的实施方案得到解决。

因此，本发明涉及用于诊断对象中的最近阵发性心房纤颤的方法，其包括：

(a) 测定来自所述对象的样品中的至少一种标志物的量，所述标志物选自心脏肌钙蛋白，BNP型肽，特别是NT-原BNP(脑利尿钠肽的N-末端激素原)，hsCRP，IL-6(白介素-6)和IGFBP7(胰岛素样生长因子结合蛋白7)，和

(b) 将这样测定的所述至少一种标志物的量与一个(或多个)参考量进行比较，由此诊断最近阵发性心房纤颤，

其中所述对象在获得所述样品时不患有心房纤颤。

优选地，最近阵发性心房纤颤通过实施以下进一步步骤来诊断：c) 基于步骤b)中实施的比较的结果，诊断最近阵发性心房纤颤。

在一个实施方案中，步骤(a)中的生物标志物的量的测定通过以下进行：使样品与特异性结合生物标志物的检测试剂(或与特异性结合生物标志物的检测试剂)接触，由此形成具有检测试剂和生物标志物的复合物，检测形成的复合物的量，由此测定生物标志物的量。术语“检测试剂”已经在本文别处指定。

在一个实施方案中，上述方法可以进一步包括步骤(c)：当来自对象的样品中的生物标志物的量高于参考量时，提供最近阵发性心房纤颤的诊断和/或当来自对象的样品中的生物标志物的量低于参考量时，提供不存在心房纤颤的诊断。

优选地，本发明的方法是由体外到体内或体外方法。而且，除了上文明确提及的那些以外，它还可以包括其它步骤。例如，其它步骤可以涉及样品预处理或评估由所述方法获得的结果。所述方法可以手动或由自动化辅助进行。优选地，步骤(a)和/或(b)可以全部或部分由自动化辅助，例如通过用于步骤(a)中测定或计算机执行的比较和/或基于步骤(b)中所述比较的评估的合适的机器人和感应设备。

因此，本发明还优选涉及用于诊断对象中的最近阵发性心房纤颤的系统，其包含：

a) 配置用于在体外使来自患有肺炎的对象的样品的部分与包含对至少一种标志物的特异性结合亲和力的一种(或多种)配体接触的分析器单元，所述标志物选自心脏肌钙蛋白，BNP型肽，hsCRP(高敏CRP)，IL-6(白介素-6)和IGFBP7(胰岛素样生长因子结合蛋白7)，

b) 配置用于检测来自与所述一个配体(或多个配体)接触的所述对象样品部分的信号的分析器单元，

c) 计算装置，其具有处理器且与所述分析器单元可操作通信，和

d) 非短暂性机器可读介质，其包括可由所述处理器执行的多个指令，所述指令当执行时计算至少一种标志物的量，并将至少一种标志物的一个或多个量与一个参考量(或与多个参考量)比较，由此诊断所述对象中的最近阵发性心房纤颤。

如本文所使用，术语“诊断”，优选地，意指评价本文提到的对象是否最近已经患有阵发性心房纤颤。具体而言，评价所述对象是否最近已经患有阵发性心房纤颤的发作。如本领域技术人员将理解，此类评价通常并非意欲对于待诊断的100％对象是正确的。然而，该术语要求评价对于对象(例如，在组群研究中的组群)的统计学显著部分是正确的。使用多种众所周知的统计学评估工具，本领域技术人员可以不用再费周折地测定部分是否是统计学显著的，所述统计学评估工具例如测定置信区间、p值测定、Student氏t检验、Mann-Whitney检验等。详情见于Dowdy and Wearden, Statistics for Research, John Wiley & Sons, New York 1983。优选的置信区间为至少90％、 至少95％、至少97％、至少98％或至少99％。P值优选为0.1、0.05、0.01、0.005 或0.0001。

在本发明的背景下，应当诊断最近阵发性心房纤颤，即，应当诊断对象是否最近已经患有阵发性心房纤颤。

术语“心房纤颤”是本领域中众所周知的。心房纤颤综述于，例如Fuster等人.，其整个公开内容在此通过引用并入(Fuster V, Rydén LE, Asinger RW,等人. ACC/AHA/ESC Guidelines for the Management of Patients With Atrial Fibrillation: Executive Summary A Report of the American College of Cardiology/American Heart Association Task Force on Practice Guidelines and the European Society of Cardiology Committee for Practice Guidelines and Policy Conferences (Committee to Develop Guidelines for the Management of Patients With Atrial Fibrillation) Developed in Collaboration With the North American Society of Pacing and Electrophysiology. Circulation. Oct 23 2001;104(17):2118-50)。心房纤颤是一种异常的心脏节律，其牵涉心脏的两个上室。在正常的心脏节律中，由窦房结产生的脉冲扩散到心脏，并且引起心肌收缩和血液泵送。在心房纤颤中，窦房结的规则电脉冲被无组织的、快速的电脉冲替换，其导致不规则的心搏。

心房纤颤(AF)可以是永久性的、持续性的或阵发性的(经常也被称为“间歇性的”)。

如果AF已经持续超过一年，则优选地，对象患有永久性AF。具体而言，不发生回到窦性心律的转化(或仅在治疗时回到窦性心律)。

如果AF持续超过7天，并且需要药理或电干预以终止心房纤颤，则优选地，对象患有持续性AF。因此，持续性AF以发作方式发生(occurs in episodes)，但是心律失常不自动转化回窦性心律。

在本发明的背景下，应当诊断最近阵发性心房纤颤，具体而言，最近(在已经获得样品之前)发生的阵发性心房纤颤的发作。阵发性心房纤颤，优选地，是指持续数分钟至多达七天的心房纤颤的间歇发作。优选地，所述发作持续少于一小时。更优选地，所述发作持续少于一天。甚至更优选地，所述发作持续少于三天或五天。优选地，心房纤颤的发作的确自发终止。因此，心房纤颤，优选地，自发终止。

与心房纤颤的终止相关的术语“自发”由技术人员充分理解。如本文所使用的术语“自发终止”，优选地，意指心房终止在没有干预的情况下(具体而言没有心脏复律的情况下)终止。

优选地，如果阵发性心房纤颤在实施本发明的方法之前至多达十二周发生(或者，更精确地，如果阵发性心房纤颤在已经获得待测试的样品之前至多达十二周发生)，则阵发性心房纤颤被认为已经最近发生。相应地，诊断对象是否已经患有阵发性心房纤颤，具体而言，在已经获得样品之前十二周的期间内阵发性心房纤颤的发作。

更优选地，如果阵发性心房纤颤在已经获得样品之前至多达六周发生，则阵发性心房纤颤被认为最近已经发生。相应地，诊断对象是否已经患有阵发性心房纤颤，具体而言，在已经获得样品之前六周的期间内阵发性心房纤颤的发作。

甚至更优选地，如果阵发性心房纤颤在已经获得样品之前至多达15或30天发生，则阵发性心房纤颤被认为最近已经发生。相应地，诊断对象是否已经患有阵发性心房纤颤，具体而言，在已经获得样品之前15或30天(具体而言30天)的期间内阵发性心房纤颤的发作。在一个实施方案中，最近阵发性AF在已经获得样品之前1至30天内发生。

甚至更优选地，如果阵发性心房纤颤在已经获得样品之前至多达七天发生，则阵发性心房纤颤被认为最近已经发生。相应地，诊断对象是否已经患有阵发性心房纤颤，具体而言，在已经获得样品之前一周的期间内阵发性心房纤颤的发作。具体而言，优选的是，最近阵发性心房纤颤在已经获得样品之前1至7天内发生。

此外，设想的是，最近阵发性心房纤颤在已经获得样品之前72小时内发生。

优选地，本文提到的期间被绘制到心房纤颤的最后发作的终止。

如本文所使用，术语“对象”是指动物，优选哺乳动物，更优选是人。对象可以是雄性(具体而言雄性是大于60或65岁)。此外，对象可以是雌性(具体而言，雌性是大于60或65岁)。此外，设想的是，对象不患有心房纤颤，具体而言，在已经获得待测试的样品时，不患有心房纤颤，即没有表现出AF的发作。对象在这时是否患有心房纤颤可以由本领域技术人员无需再费周折即测定。优选地，不患有心房纤颤的对象显示心脏的正常窦性心律(或者反之亦然：不患有心房纤颤的对象没有显示异常窦性心律)。因此，如果对象患有最近阵发性心房纤颤，则心房纤颤应当已经转化回(正常)窦性心律，具体而言，在已经获得样品时。优选地，在已经获得样品之前至少30分钟，心房纤颤应当已经转化回(正常)窦性心律。因此，在已经获得样品之前至少30分钟内，对象应当没有表现出心房纤颤(AF)的发作。优选地，在已经获得样品之前至少3或6小时，心房纤颤应当已经转化回(正常)窦性心律。更优选地，在已经获得样品之前至少24或36小时，心房纤颤应当已经转化回(正常)窦性心律。甚至更优选地，在已经获得样品之前至少72分钟，心房纤颤应当已经转化回(正常)窦性心律。还设想的是，在已经获得样品之前至少6天，心房纤颤应当已经转化回(正常)窦性心律。

因此，优选地，在已经获得样品之前30分钟内，对象应当没有表现出心房纤颤(AF)的发作。还优选地，在已经获得样品之前3或6小时内，对象应当没有表现出心房纤颤(AF)的发作。更优选地，在已经获得样品之前24或36小时内，对象应当没有表现出心房纤颤(AF)的发作。甚至更优选地，在已经获得样品之前72小时内，对象没有表现出心房纤颤(AF)的发作。还设想的是，在已经获得样品之前6天内，对象没有表现出心房纤颤(AF)的发作。因此，设想的是，待诊断的最近阵发性AF在上述期间内没有发生。优选地，上述期间被相对于阵发性AF的最后发作的终止进行绘制。

根据本发明，因此设想诊断阵发性AF，具体而言在已经获得样品之前优选超过30分钟，更优选超过3或6小时，甚至更优选超过24或36个小时，且最优选地，超过72小时，但是，在已经获得样品之前优选少于7天，更优选少于15天，最优选少于30天发生(具体而言终止)的阵发性AF的发作。

在优选的实施方案中，设想的是诊断阵发性AF，具体而言在已经获得样品之前超过30分钟或3小时、但少于7天发生(具体而言终止)的阵发性AF的发作。在另一个实施方案中，设想的是诊断阵发性AF，具体而言在已经获得样品之前超过6小时、但少于7天发生(具体而言终止)的阵发性AF的发作。在另一个实施方案中，设想的是诊断阵发性AF，具体而言在已经获得样品之前超过24小时、但少于15或30天发生(具体而言终止)的阵发性AF的发作。此外，设想的是诊断阵发性AF，具体而言在已经获得样品之前超过72小时、但少于30天发生(具体而言终止)的阵发性AF的发作。

进一步，设想的是诊断阵发性AF，具体而言在已经获得样品之前超过6小时、但少于72小时发生(具体而言终止)的阵发性AF的发作。

优选地，上述期间相对阵发性AF的最后发作的终止进行绘制。

根据本发明的前述方法的对象应当怀疑已经患有最近阵发性心房纤颤。优选地，怀疑已经患有最近心房纤颤的对象是具有一种或多种心房纤颤风险的对象。这些风险因素是本领域中众所周知的，并且包括心脏病，包括瓣膜问题和心脏病发作和心脏手术史、系统性高血压(特别是如果它没有通过生活方式改变或药物良好控制)，和饮酒。优选地，受怀疑的对象属于风险组。具体而言，考虑的是，对象是具有证实或疑似的心脏病症的对象，包括具有易患心脏病症的风险因素的对象，诸如动脉或系统性高血压、糖尿病、吸烟者、具有高脂血或代谢综合征体征的个体(特别是如果对象为老年年龄(年龄超过60、65、70和优选超过75或80岁)。或者/此外，优选地，对象可以患有瓣膜病症，优选二尖瓣病变。

在本发明方法的一个特别优选的实施方案中，对象患有高血压和/或心脏衰竭。

在本发明的一个实施方案中，对象不是58岁大的男性。

高血压可以是本领域技术人员已知的任何形式的高血压。在本发明的一个优选的实施方案中，个体患有动脉高血压、收缩和/或和舒张高血压。具体而言，对象应当患有动脉高血压。优选地，如果收缩压超过140 mmHg和/或舒张压超过90 mmHg，则对象患有动脉高血压症。更优选地，如果收缩压超过140 mmHg和/或舒张压超过90 mmHg持续三个月或以上、六个月或以上、十二个月或以上、两年或以上、三年或以上或五年或以上，则对象患有动脉高血压症。

如本文所使用，术语“心脏衰竭”优选涉及受损的收缩和/或舒张性心脏功能，伴有心脏衰竭的明显迹象，如本领域技术人员已知。优选地，本文提及的心脏衰竭也是慢性心脏衰竭。根据本发明的心脏衰竭包括明显和/或晚期心脏衰竭。在明显心脏衰竭中，对象显示如已知本领域技术人员已知的心脏衰竭的症状。特别考虑的是，如本文所使用的术语“心脏衰竭”是指ACC/AHA分类的C期和D期。在这些阶段中，对象显示心脏衰竭的典型症状，即，对象不是明显健康的。具有心脏衰竭和分类成C期或D期的对象已经经历对他的心肌的永久性、非可逆的结构和/或功能改变，并且作为这些变化的结果，完全健康恢复是不可能的。

ACC/AHA分类是由美国心脏病协会和美国心脏协会开发的心脏衰竭的分类(参见J. Am. Coll. Cardiol. 2001;38;2101-2113, 2005年更新，参见J. Am. Coll. Cardiol. 2005;46;e1-e82)。定义了4个阶段A、B、C和D。A期和B期不是HF(心脏衰竭)，但视为帮助鉴定早在发展“真正的”HF之前的患者。A期和B期患者最佳定义为具有发展HF的风险因子的那些患者。例如，患有冠状动脉病、高血压或糖尿病，但尚未显现受损的左心室(LV)功能、肥大或几何室变形(geometric chamber distortion)的患者将被视为A期，而无症状但显示LV肥大(LVH，一种心室壁增厚的现象)和/或受损的LV功能的患者将称为B期。C期则指具有与根本的结构性心脏病有关的HF的当前或过去的症状的患者(许多患有HF的患者)，而D期指患有真正的难治性HF的患者。

在本发明的一个优选实施方案中，待测试的对象被分类为A期对象(根据如上提到的ACC/AHA分类)。

优选地，待诊断的最近阵发性心房纤颤没有连同中风发生。具体而言，设想的是，对象不应当还没有中风病史。

优选地，如果在阵发性心房纤颤和中风之间存在时间和/或因果关系，则阵发性心房纤颤被视为已经连同中风发生。优选地，如果阵发性心房纤颤在中风之前和/或之后一周内发生，则阵发性心房纤颤被视为已经连同中风发生。更优选地，如果阵发性心房纤颤在中风之前和/或之后一月内发生，则阵发性心房纤颤被视为已经连同中风发生。

优选地，在已经获得待测试的样品之前三个月内，没有任何中风病史的对象未患有中风。更优选地，在已经获得待测试的样品之前，没有任何中风病史的对象完全未患有中风。

术语“中风”是本领域众所周知的。如本文所使用，该术语，优选是指由于向脑部的血流的中断导致的脑部特定区域中细胞的猝死。中风也可以被称为脑意外、脑梗塞、脑血管意外。向脑部的血流的中断可以由动脉阻塞或动脉破裂引起，其防止正常血液循环。中风之前可以是短暂性脑缺血发作(TIA)，或微中风，其特征在于向脑部的血流的暂时中断。中风可以导致视力丧失、言语丧失、肌肉控制丧失、意识丧失、昏迷和死亡。

具体设想的是，最近阵发性心房纤颤没有连同缺血性中风发生。术语“缺血性中风”(本文也称为“中风”)是技术人员众所周知的(参见例如Adams等人., Guidelines for the Early Management of Adults With Ischemic Stroke, A Guideline From the American Heart Association/ American Stroke Association Stroke Council, Clinical Cardiology Council, Cardiovascular Radiology and Intervention Council, and the Atherosclerotic Peripheral Vascular Disease and Quality of Care Outcomes in Research Interdisciplinary Working Groups in Stroke. 2007;38:1655；或Stroke Genetics, edited by Hugh S. Markus, Chapter 1 "An introduction to stroke, Oxford University Press, Incorporated, Publish Date 06/03，两者在此关于其完整公开内容通过引用并入)。如本文所使用，该术语优选地是指脑缺血性中风。缺血性中风由减少的到脑部或其部分的血流(导致降低的到脑细胞的氧气递送(供应不足))引起。缺血性中风的特征可在于由动脉血流入的阻塞引起的组织贫血。它可以导致由于脑细胞死亡导致的不可逆组织损伤。

存在缺血性中风的多种分类系统。牛津社区中风项目(Oxford Community Stroke Project)分类(OCSP，又称为班福德(Bamford)或牛津分类)主要依赖于初始症状；基于症状的程度，中风发作分类为总前循环梗塞(total anterior circulation infarct, TACI)、部分前循环梗塞(partial anterior circulation  infarct, PACI)、腔隙性梗塞(lacunar infarct, LACI)或后循环梗塞(posterior  circulation infarct, POCI)。这四种实体预测中风的程度、受影响的脑区、根本性原因、和预后。

可通过众所周知的方法来测定对象是否患有中风，特别是缺血性中风。而且，中风的症状是本领域中众所周知的，且例如描述于Adams等人. (在上文引文)。例如，中风症状包括突然的脸、臂或腿，尤其是在身体一侧上的麻木或虚弱、突然的意识错乱、讲话或理解有问题、突然在一只或两只眼睛中有视力问题、和突然走路有问题、头晕、失去平衡或协调。

此外，设想的是，在本发明的背景下，对象不具有受损的肾功能。优选地，对象不患有肾衰竭，具体而言对象不患有急性、慢性和/或终末期肾衰竭。进一步，对象，优选地，不应当患有肾高血压。如何评估对象是否展现受损的肾功能是本领域众所周知的。可以通过已知的且认为适当的任何手段来诊断肾病症。具体地，可以通过肾小球滤过率(GFR)来评估肾功能。例如，GFR可以通过Cockgroft-Gault或MDRD公式计算(Levey 1999, Annals of Internal Medicine, 461-470)。GFR是每单位时间从肾小球毛细血管过滤到Bowman囊中的流体体积。临床上经常将其用于测定肾功能。GFR最初通过将菊粉(inulin)注射到血浆中来估计(从来都不能测定GFR，从公式诸如Cockgroft Gault公式或MDRD公式衍生的所有计算仅递送估计值而非“真实的”GFR)。由于菊粉在肾小球过滤后不被肾再吸收，因此其排泄速率直接与水和溶质越过肾小球滤器的过滤速率成正比。然而，在临床实践中，肌酸酐清除率用于测量GFR。肌酸酐是一种在身体中合成的内源性分子，其由肾小球游离过滤(但还由肾小管以非常小的量分泌)。肌酸酐清除率(CrCl)因此是GFR的紧密近似。GFR通常以毫升每分钟(mL/min)记录。男性GFR的正常范围为97至137mL/min，女性GFR的正常范围为88至128ml/min。因此，特别考虑不展现受损的肾功能的对象的GFR在该范围内。而且，所述对象优选具有低于0.9 mg/dl，更优选低于1.1 mg/dl且最优选低于1.3 mg/dl的血液肌酸酐水平(特别是血清肌酸酐水平)。

此外，进一步设想的是，对象不患有ACS(急性冠状动脉综合征)。如本文所使用，术语“ACS”包括STEMI(ST-升高心肌梗塞)；NSTEMI(非ST-升高心肌梗塞)和不稳定的心绞痛。还设想待测试的对象不具有ACS的病史。具体地，所述对象不应在实施本发明方法前一月内(更准确地，在获得样品前一月内)患有ACS。

还考虑的是，对象不患有冠状动脉疾病。术语“冠状动脉疾病”，缩写为CAD，经常也称为冠状动脉心脏疾病(CHD)或动脉粥样硬化心脏疾病，是本领域技术人员已知的。优选地，该术语是指其中向心脏供给血液和氧气的血管变窄的状况。冠状动脉疾病通常是被称为动脉粥样硬化的状况引起，当脂肪物质与被称为斑块的物质积聚在你的动脉壁上时，冠状动脉疾病发生。这引起它们变窄。具体地，CAD是供应心肌(心脏的肌肉)的动脉壁内的动脉粥样硬化斑块积累的结果。优选地，患有CAD的对象在至少一个主冠状动脉中具有至少50％狭窄(并且因此，至少50％闭塞)。因此，未患有CAD的对象，优选地，在主要冠状动脉中具有小于50％闭塞。如何评价冠状动脉的闭塞程度是本领域众所周知的，优选地，所述程度通过冠状动脉造影术评价。尽管冠状动脉疾病的症状和体征在疾病的晚期状态下是明显的，但是具有冠状动脉疾病的大多数个体持续数十年没有显示疾病的证据，随着疾病在急性事件的症状的首次发作之前进展，经常是“突然”心脏发作最终出现。

此外，对象不应当是怀孕的。此外，对象，优选地，不是运动员。

术语“样品”指体液的样品，分离细胞的样品或来自组织或器官的样品。体液的样品可以通过众所周知的技术获得，并且优选包括血液、血浆、血清或尿样品，更优选地，血液、血浆或血清样品。组织或器官样品可以通过例如活组织检查得自任何组织或器官。分离的细胞可以通过分离技术例如离心或细胞分选得自体液或组织或器官。优选地，细胞、组织或器官样品得自表达或产生本文提及的肽的那些细胞、组织或器官。在对象最近已经患有阵发性心房纤颤的情况下，优选地，在最近阵发性心房纤颤终止后，即阵发性心房纤颤的发作(具体而言上次发作)终止后，至少30分钟，并且更优选地，至少三个小时，或最优选地，至少6小时，已经获得样品。

术语“心脏肌钙蛋白”是指在心脏的细胞和优选地心内膜下细胞中表达的所有肌钙蛋白同种型。如例如Anderson 1995, Circulation Research, vol. 76, no. 4: 681-686和Ferrieres 1998, Clinical Chemistry, 44: 487-493中所述，这些同种型是本领域充分表征的。优选地，心脏肌钙蛋白指肌钙蛋白T和/或肌钙蛋白I，并且最优选地是指肌钙蛋白T。应当理解肌钙蛋白的同种型可以在本发明的方法中一起即同时或连续测定，或个别测定，即完全不测定其它同种型。关于人肌钙蛋白T和人肌钙蛋白I的氨基酸序列公开于Anderson上述引文和Ferrieres 1998, Clinical Chemistry, 44: 487-493中。

术语“心脏肌钙蛋白”还包括前述特异性肌钙蛋白，即优选地肌钙蛋白I，和更优选地肌钙蛋白T的变体。此类变体具有与特异性心脏肌钙蛋白至少相同的基本生物学和免疫学性质。特别地，如果它们可通过本说明书中提及的相同特异性测定检测，例如通过使用特异性识别所述心脏肌钙蛋白的多克隆或单克隆抗体的ELISA测定，那么它们共享相同的基本生物学和免疫学性质。此外，应当理解如根据本发明提及的变体应具有由于至少一个氨基酸取代、缺失和/或添加而不同的氨基酸序列，其中变体的氨基酸序列仍优选与特异性肌钙蛋白的氨基酸序列至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约92％、至少约95％、至少约97％、至少约98％或至少约99％相同(特别是相对整个长度)。优选地，通过在比较窗上比较2个最佳比对的序列测定同一性程度，其中与用于最佳比对的参考序列(其不包含添加或缺失)比较，在比较窗中氨基酸序列的片段可以包含添加或缺失(例如缺口或突出端)。通过下述计算百分比，测定相同氨基酸残基在2个序列中出现的位置数目，以获得匹配位置数目，将匹配位置数目除以比较窗中的位置总数目，并且将结果乘以100，以获得序列同一性百分比。用于比较的序列的最佳比对可以通过下述进行：Smith and Waterman Add. APL. Math. 2:482 (1981)的局部同源性算法，Needleman and Wunsch J. Mol. Biol. 48:443 (1970)的同源性比对算法，Pearson and Lipman Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 85: 2444 (1988)的相似性搜索方法，这些算法的计算机化实现(Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Dr., Madison, WI中的GAP、BESTFIT、BLAST、PASTA和TFASTA)，或目视检查。考虑到2个序列已鉴定用于比较，优选采用GAP和BESTFIT以测定其最佳比对，和因此同一性程度。优选地，使用对于缺口权重5.00和对于缺口权重长度0.30的默认值。变体可以是等位基因变体或任何其它物种特异性同系物、旁系同源物或直系同源物。此外，本文提及的变体包括特异性心脏肌钙蛋白或前述类型变体的片段，只要这些片段具有如上文提及的基本免疫学和生物学性质。优选地，心脏肌钙蛋白变体具有与人肌钙蛋白T或肌钙蛋白I的那些相当的免疫学性质(即表位组成)。因此，变体应可通过用于测定心脏肌钙蛋白浓度的前述手段或配体识别。因此，变体应可通过用于测定心脏肌钙蛋白浓度的前述手段或配体识别。此类片段可以是例如肌钙蛋白的降解产物。进一步包括的是由于翻译后修饰诸如磷酸化或肉豆蔻酰化而不同的变体。优选地，肌钙蛋白I及其变体的生物学性质是在体内和体外抑制肌动球蛋白ATP酶或抑制血管生成的能力，这可以例如基于由Moses等人. 1999 PNAS USA 96 (6): 2645-2650)描述的测定进行检测。优选地，肌钙蛋白T及其变体的生物学性质是与肌钙蛋白C和I形成复合物、结合钙离子或结合原肌球蛋白的能力，优选地如果作为肌钙蛋白C、I和T的复合物或由肌钙蛋白C、肌钙蛋白I和肌钙蛋白T的变体形成的复合物存在。已知低浓度的循环心脏肌钙蛋白可以在多种条件在对象中检测到，但是需要进一步的研究来理解其相应的作用和速率(Masson等人., Curr Heart Fail Rep (2010) 7:15–21)。

优选地，心脏肌钙蛋白是肌钙蛋白T，具体而言人肌钙蛋白T。优选地，肌钙蛋白T的量通过使用实施例中或WO2012/025355中描述的高灵敏肌钙蛋白测定法来测定。

如本文所使用，术语“BNP型肽”包含前-原BNP、原BNP、NT-原BNP和BNP。具体而言，BNP型肽是NT-原BNP或BNP。

前原肽(pre-pro peptide)(在前原BNP的情况下为134个氨基酸)包含短信号肽，其被酶促切除以释放原肽(在原BNP的情况下为108个氨基酸)。原肽被进一步切割成N端原肽(NT-原肽，在NT-原BNP的情况下为76个氨基酸)和活性激素(在BNP的情况下为32个氨基酸)。优选地，根据本发明的BNP-型肽是NT-原BNP、BNP、及其变体。BNP是活性激素，且与相应非活性对应物NT-原BNP相比具有较短的半衰期。BNP在血液中被代谢，而NT-原BNP则作为完整的分子在血液中循环并因此通过肾脏除去。NT-原BNP的体内半衰期比BNP的体内半衰期长120分钟，BNP的体内半衰期为20分钟(Smith 2000, J Endocrinol. 167: 239-46.)。应用NT-原BNP进行预分析是更稳健的，这使得样品转移至中心实验室变得容易(Mueller 2004, Clin Chem Lab Med 42: 942-4.)。血液样品可以在室温下储存几天或可邮寄或运输而没有回收率的损失。相反，将BNP储存在室温下或4℃ 48小时导致至少20%的浓度损失(Mueller 上述引文; Wu 2004, Clin Chem 50: 867-73.)。因此取决于时间进程或目标性质，活性的或非活性形式的利尿钠肽的测量都可以是有益的。根据本发明的最优选的利尿钠肽是NT-原BNP或其变体。如上文简短讨论，如根据本发明提及的人NT-原BNP是一种包含优选长度为76个氨基酸的多肽，其对应于人NT-原BNP分子的N端部分。现有技术中已详细描述了人BNP和NT-原BNP的结构，例如WO 02/089657、WO 02/083913或Bonow(上述引文)。优选地，如本文所使用的人NT-原BNP是如EP 0 648 228 B1中公开的人NT-原BNP。这些现有技术文件关于其中公开的特定NT-原BNP序列及其变体在此通过引用并入。根据本发明提到的NT-原BNP还涵盖上文论述的人NT-原BNP的所述特定序列的等位基因和其它变体。具体地，设想与人NT-原BNP，优选在NT-原BNP的整个长度在氨基酸水平上优选至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、或99％相同的变体多肽。在2个氨基酸序列之间的同一性程度可以通过本领域众所周知的算法进行测定。优选地，通过在比较窗上比较2个最佳比对的序列测定同一性程度，其中与用于最佳比对的参考序列(其不包含添加或缺失)比较，在比较窗中氨基酸序列的片段可以包含添加或缺失(例如缺口或突出端)。通过下述计算百分比，测定相同氨基酸残基在2个序列中出现的位置数目，以获得匹配位置数目，将匹配位置数目除以比较窗中的位置总数目，并且将结果乘以100，以获得序列同一性百分比。用于比较的序列的最佳比对可以通过下述进行：Smith and Waterman Add. APL. Math. 2:482 (1981)的局部同源性算法，Needleman and Wunsch J. Mol. Biol. 48:443 (1970)的同源性比对算法，Pearson and Lipman Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 85: 2444 (1988)的相似性搜索方法，这些算法的计算机化实现(Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Dr., Madison, WI中的GAP、BESTFIT、BLAST、PASTA和TFASTA)，或目视检查。考虑到2个序列已鉴定用于比较，优选采用GAP和BESTFIT以测定其最佳比对，和因此同一性程度。优选地，使用对于缺口权重5.00和对于缺口权重长度0.30的默认值。上文提及的变体可以是等位基因变体或任何其它物种特异性同系物、旁系同源物或直系同源物。基本上类似且设想的是蛋白水解解降解产物，其仍由针对各自的全长肽的诊断手段或配体识别。还涵盖相比于人NT-原BNP氨基酸序列具有氨基酸缺失、取代和/或添加的变体多肽，只要所述多肽具有NT-原BNP特性。如本文中提到的NT-原BNP特性是免疫学和/或生物学特性。优选地，所述NT-原BNP变体具有与人NT-原BNP的那些相当的免疫学特性(即表位组成)。因此，所述变体应可由用于测定利尿肽量的前述手段或配体识别。生物学和/或免疫学NT-原BNP特性可由以下中描述的测定法检测：Karl等人. (Karl 1999, Scand J Clin Lab Invest 230:177-181), Yeo等人. (Yeo 2003, Clinica Chimica Acta 338:107-115)。变体还包括翻译后修饰的肽，诸如糖基化肽。此外，根据本发明的变体还是在样品收集后已经修饰的肽或多肽，例如通过对肽共价或非共价连接标记，特别是放射性或荧光标记。

CRP，本文也称作C-反应蛋白，是一种急性期蛋白，超过75年前发现其是结合肺炎球菌的C-多糖的血液蛋白。CRP已知为反应性炎症标志物，并且由远端器官(即肝脏)响应或反应于源自初始病变部位的趋化因子或白介素产生。CRP由五个单亚基组成，所述单亚基是非共价连接的，并且组装为分子量为约110-140 kDa的环状五聚体。优选地，本文所使用的CRP涉及人CRP。人CRP的序列是众所周知的，并且公开于，例如，Woo等人.(J. Biol. Chem. 1985. 260 (24), 13384-13388)。CRP的水平在正常个体中通常低，但可以由于炎症、感染或损伤升高100至200倍或更高(Yeh (2004) Circulation.2004; 109:II-11-II-14)。已知CRP是用于预测心血管风险的独立因素。具体地，已经显示，CRP适合作为用于心肌梗塞、中风、外周动脉疾病和突然心脏死亡的预测物。此外，升高的CRP量也可以预测具有急性冠脉综合征(ACS)的对象和经历冠状动脉介入的那些中的复发性缺血和死亡。具有冠心病风险的患者中CRP的测定由专家小组(例如由美国心脏协会)推荐(还参见Pearson等人 (2003) Markers of Inflammation and Cardiovascular Disease. Circulation, 107: 499-511)。术语CRP还涉及其变体。

优选地，对象的样品中CRP的量通过使用具有高灵敏度的CRP测定法来测定。通过此类测定法测定的CRP经常也被称为高灵敏度CRP (hsCRP)。hsCRP测定法，例如，用于预测心脏疾病的风险。合适的hsCRP测定法是本领域已知的。在本发明的背景下特别优选的hsCRP测定法是检测限值为0.1 mg/l的Roche/Hitachi CRP (Latex) HS测试。

白介素-6(简称为IL-6)是由T细胞和巨噬细胞分泌以刺激免疫应答(例如，在感染过程中和创伤后，特别是烧伤或导致炎症的其它组织损伤)的白介素。其充当促炎和抗炎细胞因子两者。在人中，其由IL6基因编码。人IL-6的序列可以经由GenBank评价(对于多核苷酸序列，参见NM_000600.3，且对于氨基酸序列，参见NP_000591.1)。IL-6通过由配体结合IL-6Rα链(CD126)和信号转导组分gp130(也称为CD130)组成的细胞表面I型细胞因子受体复合物进行信号传导。CD130是用于几种细胞因子(包括白血病抑制因子(LIF)、睫状神经营养因子、抑癌蛋白M、IL-11和心肌营养素-1)的共同信号转导因子，并且几乎在大多数组织中普遍表达。相比之下，CD126的表达限于某些组织。当IL-6与其受体相互作用，其触发gp130和IL-6R蛋白以形成复合物，因此激活受体。这些复合物使得gp130的胞内区域在一起，以通过某些转录因子(Janus激酶(JAK)和信号传导与转录活化因子)引发信号转导级联。

标志物IGFBP7(胰岛素样生长因子结合蛋白7)是本领域众所周知的。胰岛素样生长因子结合蛋白(IGFBP)系统在细胞生长和分化中发挥重要的作用。它包含两种配体，IGF-I和IGF-II，两种受体，1型和2型IGF受体，并且到1995年为止六种IGF-结合蛋白(IGFBPs)，IGFBP-1至-6(Jones, J.I.,等人., Endocr. Rev. 16 (1995) 3-34)。最近IGFBP家族已经扩展至包括IGFBP-相关蛋白(IGFBP-rPs)，其具有与IGFBPs明显的结构相似性(Hwa, V.,等人., Endocr. Rev 20 (1999) 761-787)。因此，IGFBP超家族包括六种常规的IGFBPs，其具有对IGFs的高亲和力，以及至少10种IGFBP-rPs，其不仅具有IGFBPs保守的氨基端结构域而且对IGFs和胰岛素显示一定程度的亲和力。IGFBP-rPs是一类富含半胱氨酸的蛋白，其控制多种细胞功能，诸如细胞生长、细胞粘附和迁移，以及细胞外基质的合成。此外，这些蛋白可能参与生物学过程诸如组织增生和分化、再生、血管生成、创伤修复、炎症、纤维化和肿瘤生成(Hwa, V.,等人., Endocr. Rev 20 (1999)761-787)。

IGF结合蛋白7 (= IGFBP7)是30kDa的模块糖蛋白，已知由内皮细胞、血管平滑肌细胞、纤维母细胞和上皮细胞分泌(Ono, Y.,等人., Biochem Biophys Res Comm 202 (1994) 1490-1496)。在该著作中，该分子也已被命名为FSTL2；IBP 7；IGF结合蛋白相关蛋白I；IGFBP 7；IGFBP 7v；IGFBP rPl；IGFBP7；IGFBPRP1;胰岛素样生长因子结合蛋白7；胰岛素样生长因子结合蛋白7前体；MAC25；MAC25蛋白；PGI2刺激因子；和PSF或前列腺环素刺激因子。Northern印迹研究揭示该基因在人组织，包括心脏、脑、胎盘、肝、骨骼肌和胰腺中的广泛表达(Oh, Y.,等人., J. Biol. Chem. 271 (1996) 30322-30325)。

IGFBP7最初鉴定为在正常的柔脑膜和乳房上皮细胞中相比于它们对应的肿瘤细胞中差异性表达的基因，并命名为脑膜瘤相关cDNA (MAC25) (Burger, A.M.,等人., Oncogene 16 (1998) 2459-2467)。表达的蛋白作为肿瘤来源的粘附因子(后来重命名为血管调节素(angiomodulin))(Sprenger, C.C.,等人., Cancer Res 59 (1999) 2370-2375)以及作为前列腺环素刺激因子(Akaogi, K.,等人., Proc Natl Acad Sci USA 93 (1996) 8384-8389)独立纯化。此外，它已被报道为T1Al2，在乳癌中下调的基因(StCroix, B.,等人., Science 289 (2000) 1197-1202)。

优选地，术语“IGFBP7”是指人IGFBP7。该蛋白的序列是本领域众所周知的，并且例如可经由GenBank (NP_001240764.1)获得。如本文所使用的IGFBP7，优选地，也涵盖具体IGFBP7多肽的变体。

待连同上述方法测定的优选标志物可以是心脏肌钙蛋白、BNP型肽，特别是NT-原BNP (脑利尿钠肽的N-末端激素原)，和hsCRP，或IL-6(白介素-6)。

测定如本方面的方法的情况下提及的肽或多肽的量涉及测量量或浓度，优选半定量或定量地。测量可以直接或间接完成。直接测量涉及基于获得自肽或多肽自身和其强度与样品中存在的肽分子数目直接关联的信号测量肽或多肽的量或浓度。此类信号（在本文中有时被称为强度信号）可以例如通过测量肽或多肽的特异性物理或化学性质的强度值获得。间接测量包括测量获得自二级组分(即不是肽或多肽自身的组分)或生物学读出系统的信号，例如可测量的细胞应答、配体、标记或酶促反应产物。

根据本发明，测定肽或多肽的量可以通过用于测定样品中的肽量的所有已知手段实现。所述手段包含免疫测定和方法，其可以多种夹心、竞争或其它测定形式利用标记的分子。此类测定法优选地基于检测试剂诸如特异性识别待测定的肽或多肽的抗体。检测试剂应能够直接或间接地生成指示所述肽或多肽的存在或不存在的信号。此外，信号强度可以优选与样品中存在的多肽量直接或间接(例如反比例)关联。进一步合适的方法包括测量对于肽或多肽特异性的物理或化学性质，诸如其精确分子量或NMR谱。所述方法优选包括生物传感器、与免疫测定偶联的光学设备、生物芯片、分析设备诸如质谱仪、NMR分析仪或层析设备。进一步，方法包括基于微板ELISA的方法、完全自动化或机器人免疫测定(例如可在Elecsys^TM分析仪上获得)、CBA(酶促钴结合测定，例如可在Roche-Hitachi^TM分析仪上获得)、和乳胶凝集测定(例如可在Roche-Hitachi^TM分析仪上获得)。

优选地，测定肽或多肽的量包括步骤(a)使能够引发细胞应答的细胞与所述肽或多肽接触足够时间段，所述细胞应答的强度指示肽或多肽的量，(b)测量细胞应答。对于测量细胞应答，将样品或加工的样品优选加入细胞培养物中，并且测量内部或外部细胞应答。细胞应答可以包括报道基因的可测量表达或物质例如肽、多肽或小分子的分泌。表达或物质应生成与肽或多肽的量关联的强度信号。

还优选地，测定肽或多肽的量包括测量可获得自样品中的肽或多肽的特异性强度信号的步骤。如上所述，此类信号可以是在对于肽或多肽特异性的质谱或NMR谱中观察到的对于肽或多肽特异性的m/z变量处观察到的信号强度。

测定肽或多肽的量可以优选包括步骤(a)使所述肽与特定配体接触，(b)(任选地)除去未结合的配体，(c)测量结合的配体(即，步骤(a)中形成的配体的复合物)的量。根据一个优选的实施方案，所述接触、除去和测量的步骤可以由本文中公开的系统的分析器单元实施。根据一些实施方案，所述步骤可以由所述系统的单个分析器单元或彼此可操作通信的多于一个分析器单元实施。例如，根据一个特定的实施方案，本文中公开的所述系统可以包括用于实施所述接触和除去步骤的第一分析器单元和通过运输单元(例如机器人臂)可操作地连接至所述第一分析器单元的第二分析器单元，其实施所述测量步骤。

结合的配体，即配体或配体/肽复合物，将生成强度信号。根据本发明的结合包括共价和非共价结合。根据本发明的配体可以是任何化合物，例如肽、多肽、核酸或与本文描述的肽或多肽结合的小分子。优选配体包括抗体、核酸、肽或多肽诸如对于肽或多肽及其包含关于肽的结合结构域的片段的受体或结合配偶体、和适配体例如核酸或肽适配体。制备此类配体的方法是本领域众所周知的。例如，合适抗体或适配体的鉴定和产生也由商业供应商提供。本领域技术人员熟悉开发具有更高亲和力或特异性的此类配体衍生物的方法。例如，随机突变可以引入核酸、肽或多肽。根据本领域已知的筛选程序例如噬菌体展示，这些衍生物随后可以针对结合进行测试。如本文提及的抗体包括多克隆和单克隆抗体，以及其片段，诸如能够结合抗原或半抗原的Fv、Fab和F(ab)₂片段。本发明还包括单链抗体和人源化杂交抗体，其中显示出所需抗原特异性的非人供体抗体的氨基酸序列与人受体抗体的序列组合。供体序列通常将包括供体的至少抗原结合氨基酸残基，但还可以包含供体抗体的其它结构上和/或功能上相关的氨基酸残基。此类杂交物可以通过本领域众所周知的几种方法进行制备。优选地，配体或试剂特异性结合肽或多肽。根据本发明的特异性结合意指配体或试剂不应基本上结合(与之“交叉反应)待分析的样品中存在的另一种肽、多肽或物质。优选地，特异性结合的肽或多肽应以比任何其它相关肽或多肽高至少3倍、更优选高至少10倍且更加优选高至少50倍的亲和力结合。非特异性结合可以是可耐受的，如果它仍可以明确区分且测量，例如根据其在蛋白印迹上的大小，或通过其在样品中相对更高的丰度。配体的结合可以通过本领域已知的任何方法进行测量。优选地，所述方法是半定量或定量的。下文描述了用于测定多肽或肽的其它合适的技术。

配体的结合可以例如通过NMR或表面等离振子共振直接测量。根据优选的实施方案，配体结合的测量通过本文公开的系统的分析器单元执行。此后，测量的结合量可通过本文公开的系统的计算设备进行计算。如果配体还充当目标肽或多肽的酶促活性的底物，那么可以测量酶促反应产物(例如蛋白酶的量可以通过例如在蛋白印迹上测量切割底物的量进行测量)。或者，配体可以自身展示出酶促性质，并且各自由肽或多肽结合的“配体/肽或多肽”复合物或配体可以与合适底物接触，允许通过强度信号的生成进行检测。对于酶促反应产物的测量，优选地底物的量是饱和的。底物还可以在反应前用可检测标记进行标记。优选地，样品与底物接触足够时间段。足够时间段是指对于产生可检测优选可测量的量的产物所需的时间。代替测量产物的量，可以测量对于给定(例如可检测)量的产物出现所需的时间。第三，配体可以与标记共价或非共价偶联，允许配体的检测和测量。标记可以通过直接或间接方法完成。直接标记涉及标记与配体直接(共价或非共价)偶联。间接标记涉及二级配体与第一配体的结合(共价或非共价)。二级配体应特异性结合第一配体。所述二级配体可以与合适标记偶联和/或是结合二级配体的三级配体的目标(受体)。二级、三级或甚至更高级别配体的使用通常用于增加信号。合适的二级和更高级别配体可以包括抗体、二次抗体和众所周知的链霉抗生物素蛋白-生物素系统(Vector Laboratories, Inc.)。配体或底物还可以是用如本领域已知的一种或多种标签“标签的”。此类标签随后可以是更高级别配体的目标。合适标签包括生物素、地高辛配基(digoxygenin)、His-标签、谷胱甘肽-S-转移酶、FLAG、GFP、myc-标签、甲型流感病毒血凝素(HA)、麦芽糖结合蛋白等。在肽或多肽的情况下，标签优选在N末端和/或C末端。合适标记是可通过合适检测方法检测的任何标记。一般标记包括金颗粒、乳胶珠、吖啶(acridan)酯、鲁米诺、钌、酶促活性标记、放射性标记、磁性标记(“例如磁珠”包括顺磁和超顺磁标记)、和荧光标记。酶促活性标记包括例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、萤光素酶及其衍生物。用于检测的合适底物包括二氨基联苯胺(DAB)、3,3'-5,5'-四甲基联苯胺、NBT-BCIP(4-氯化硝基四氮唑蓝和5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸盐，可作为现成储存溶液从Roche Diagnostics获得)、CDP-Star? (Amersham Bio-sciences)、ECF? (Amersham Biosciences)。合适的酶-底物组合可以导致有色反应产物、荧光或化学发光，其可以根据本领域已知的方法(例如使用感光胶片或合适的照相机系统)进行测量。关于测量酶促反应，类似地应用上文给出的标准。一般的荧光标记包括荧光蛋白(例如GFP及其衍生物)、Cy3、Cy5、Texas Red、荧光素和Alexa染料(例如Alexa 568)。进一步的荧光标记例如可从Molecular Probes (Oregon)获得。还考虑了作为荧光标记的量子点的使用。一般放射性标记包括³⁵S、¹²⁵I、³²P、³³P等。放射性标记可以通过已知和合适的任何方法进行检测，例如感光胶片或磷光体显像仪。根据本发明的合适测量方法还包括沉淀(特别是免疫沉淀)、电化学发光(电生成的化学发光)、RIA(放射性免疫测定)、ELISA(酶联免疫吸附测定)、夹心酶免疫测试、电化学发光夹心免疫测定(ECLIA)、解离增强的镧系元素荧光免疫测定(DELFIA)、邻近闪烁测定(SPA)、比浊法、浊度法、乳胶增强的比浊法或浊度法、或固相免疫测试。本领域已知的进一步方法(例如凝胶电泳、2D凝胶电泳、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、蛋白印迹和质谱法)，可以单独或与如上所述的标记或其它检测方法组合使用。

肽或多肽的量还可以优选如下测定：(a)使包含关于如上指定的肽或多肽的配体的固体支持物与包含肽和多肽的样品接触，和(b)测量结合支持物的肽或多肽的量。优选选自核酸、肽、多肽、抗体和适配体的配体优选以固定化形式存在于固体支持物上。用于制造固体支持物的材料是本领域众所周知的，并且尤其包括商购可得的柱材料、聚苯乙烯珠、乳胶珠、磁珠、胶体金属颗粒、玻璃和/或硅片和表面、硝酸纤维素条、膜、片、duracytes、反应托盘的孔和壁、塑料管等。配体或试剂可以结合许多不同载体。众所周知的载体的实例包括玻璃、聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、聚碳酸酯、葡聚糖、尼龙、直链淀粉、天然和改性纤维素、聚丙烯酰胺、琼脂糖和磁石。载体的性质对于本发明的目的可以是可溶或不可溶的。用于固定/固定化所述配体的合适方法是众所周知的，并且包括但不限于离子、疏水、共价相互作用等。还考虑使用“悬浮阵列”作为根据本发明的阵列(Nolan 2002, Trends Biotechnol. 20(1):9-12)。在此类悬浮阵列中，载体例如微珠或微球体存在于悬液中。阵列由可能标记的、携带不同配体的不同微珠或微球体组成。产生例如基于固相化学和光不稳定保护基团的此类阵列的方法是一般已知的(US 5,744,305)。

如本文所使用，术语“量”涵盖绝对量的多肽或肽、相对量或浓度的所述多肽或肽以及与之关联或者从其衍生的任何值或参数。此类值或参数包含来自通过直接测量得自所述肽的所有特异性物理或化学性质的强度信号值，例如质谱或NMR谱中的强度值。此外，涵盖的是通过本说明书中其它地方指定的间接测量获得的所有值或参数，例如响应肽由生物学读出系统测定的应答量或得自特异性结合配体的强度信号。应当理解与上述量或参数关联的值还可以通过所有标准数学操作获得。根据本发明的优选实施方案，所述“量”的测定通过所述公开的系统执行，由此基于由所述系统的一个或多个分析器单元执行的接触和测量步骤，计算设备测定所述“量”。

如本文所使用，术语“比较”涵盖将由待分析的样品包含的如本文提及的标志物(特别是肽或多肽)的量与本说明书中别处指定的合适参考来源的量进行比较。应当理解如本文所使用的比较是指相应参数或值的比较，例如绝对量与绝对参考量比较，而浓度与参考浓度比较，或得自测试样品的强度信号与参考样品的相同类型的强度信号比较。本发明的方法的步骤(b)中提及的比较可以手动或通过计算装置(例如本文公开的系统)实施。对于计算机辅助比较，测定量的值可以与对应于合适参考的值比较，所述合适参考的值通过计算机程序存储于数据库中。计算机程序可以进一步评价比较的结果，即以合适输出格式自动化提供所需评估。所述结果可以，优选地，充当评价对象是否应当进行如本文别处所述的基于成像的诊断评价的辅助手段。例如，比较的结果可以以原始数据给出(绝对或相对量)，而在一些情况下以词语、短语、符号、或数值的形式的指示物给出，其可以指示具体的诊断。因此，应当选择参考量使得比较的量中的差异或相似性允许实施本发明的诊断。

如本文所使用的术语“参考量”是指这样的量，其允许将对象分配至最近患有阵发性心房纤颤(AF)的对象组，或最近没有患有阵发性心房纤颤(AF)的对象组。此类参照量可以是将这些组彼此分开的阈值量。

因此，如本文提到的生物标志物的参考量应当是这样的量，其允许将对象分配至最近患有阵发性心房纤颤(AF)的对象组，或最近没有患有阵发性心房纤颤(AF)的对象组。分离两个组的合适的阈值量可以基于本文提到的标志物的量通过本文别处提到的统计学测试，从最近患有阵发性心房纤颤(AF)的对象或对象组，或最近没有患有阵发性心房纤颤(AF)的对象或对象组无需再费周折即计算。本文中别处指示可以从前述对象或对象组衍生得到的优选参考量。

参考量可以用来定义和确立阈值量。阈值量，优选地，允许归入和/或排除最近患有阵发性心房纤颤(AF)的对象。所述归入和/或排除可由本文公开的系统的计算装置基于所述计算的“量”与参考或阈值的比较提供。例如，系统的计算装置可以提供以词语、符号、或数值的形式的指示物，其指示归入或排除。适用于个体对象的参考量可以根据多种生理学参数诸如年龄、性别或亚群，以及用于测定本文中提到的多肽或肽的手段而变化。合适的参考量可从待与测试样品一起(即同时或随后)分析的参考样品测定。优选地，参考量通过实施本发明的方法来测定。优选地，在关于最近阵发性AF相同的时间段内获得的一个/多个样品中测定参考量。

优选地，参考量是计算的参考量。优选地，参考量应当允许区分最近患有阵发性心房纤颤(AF)的对象和最近没有患有阵发性心房纤颤(AF)的对象。原则上，可通过应用标准的统计学方法基于给定生物标志物的平均值或均值对如上文指出的对象组群计算参考量。具体地，测试诸如目标为诊断事件与否的方法的准确度由其接受者操作特征(receiver-operating characteristics)(ROC)最佳描述(尤其参见Zweig 1993, Clin. Chem. 39:561-577)。ROC图是由连续改变整个观察数据范围的决定阈值产生的所有灵敏度/特异性对的绘图。诊断方法的临床表现取决于其准确度，即其正确将对象分为特定评估、预后或诊断的能力。ROC图通过绘制对于适用于进行区分的整个阈值范围的灵敏度相比于1-特异性来指示两个分布之间的重叠。y轴上是灵敏度，或真阳性分数，其定义为真-阳性测试结果的数目与真-阳性测试结果数目与假-阴性测试结果数目的乘积的比率。这也已称为疾病或状况存在的阳性。它仅从受影响亚群计算。x轴上是假-阳性分数或1-特异性，其被定义为假-阳性结果的数目与真-阴性结果数目与假-阳性结果数目的乘积的比率。它是特异性的指标，完全从未受影响亚群计算。因为真阳性分数和假阳性分数完全分开计算，通过使用来自两种不同亚群的测试结果，ROC图独立于组群中的事件流行性。ROC图上的每个点表示灵敏度/-特异性配对，其对应于特定的决定阈值。具有完美辨别力的测试(在两种结果分布中没有重叠)具有的ROC图穿过左上角，在那里真阳性分数为1.0或100%(完美的灵敏度)，且假阳性分数是0(完美的特异性)。对于无辨别力的测试(对两组的结果分布相同)，理论图是从左下角到右上角的45°对角线。大多数绘图落在这两种极端之间。如果ROC图完全落在45°对角线下，这容易通过将“阳性”标准从“大于”颠倒至“小于”(反之亦然)来补救。定性地，绘图越接近左上角，测试的总精度越高。根据期望的置信区间，可从ROC曲线衍生出允许以合适的灵敏度和特异性平衡分别诊断或预测给定事件的阈值。因此，待用于本发明前述方法的参考，可以优选地是阈值或截止量，优选可通过为如上文描述的所述组群建立ROC并从其衍生出阈值量来生成。根据对诊断方法的期望的灵敏度和特异性，ROC图允许衍生合适的阈值。

优选地，以下作为诊断算法适用(具体而言，如果参考是计算的参考量)：

优选地，相比于一个或多个参考量的至少一种标志物的增加量(多种标志物的增加量)指示最近阵发性心房纤颤的诊断，而相比于一个或多个参考量的至少一种标志物的减少量(多种标志物的减少量)指示对象最近未患有阵发性心房纤颤。

优选的参考量如下：

关于标志物hsCRP，参考量是优选地，2.5至3.5 mg/l的范围内，并且更优选地，3.0至3.5 mg/l的范围内。最优选地，参考量是3.0或3.5 mg/l。

关于心脏肌钙蛋白，参考量是优选地，4.0至6 pg/ml的范围内，并且更优选地，5.0至6.0 pg/ml的范围内。最优选地，参考量是5.5或6.0 pg/ml。

关于标志物Il-6，参考量是优选地，1.5至2.0 pg/ml的范围内，并且更优选地，1.6至1.9 pg/ml的范围内。最优选地，参考量是1.7或1.9 pg/ml。

关于标志物NT-原BNP，参考量是优选地，100至150 pg/ml的范围内，并且更优选地，110至130 pg/ml的范围内。最优选地，参考量是125或150 pg/ml。

IGFBP7的优选参考量是70至100 ng/ml的范围内，或更优选地70至90 ng/ml的范围内。特别优选的参考量是80 ng/ml。

如本文上面所述，一个(或多个)参考量也可以衍生自(i)已知已经患有最近阵发性心房纤颤的对象或对象组。在这种情况下，来自对象的样品中至少一种标志物相比于一个(或多个)参考量基本上相同的一个或多个量和/或一个(或多个)增加量指示最近阵发性心房纤颤的诊断。优选地，一个或多个参考量衍生自所述一个对象的样品或衍生自所述组或多个对象的样品。

优选地，通过应用上述参考量，可以归入所述对象已经患有最近阵发性心房纤颤。

额外地或可选地，一个或多个参考量可以，优选地，衍生自(i)已知没有患有最近阵发性心房纤颤的对象或对象组。优选地，至少一种标志物的一个或多个量指示所述对象没有患有最近阵发性心房纤颤，所述量是来自对象的样品中至少一种标志物相比于一个或多个参考量基本上相同的一个或多个量和/或降低的量(增加的量)。优选地，参考量衍生自所述一个对象的样品或衍生自所述组或多个对象的样品。

优选地，通过应用上述参考量，可以排除所述对象已经患有最近阵发性心房纤颤。

术语“对象”的定义在本文别处给出。所述定义也适用于参考对象。优选地，待测试的对象和参考对象具有相同的年龄、性别和/或种族。因此，优选的是，参考量针对年龄、性别和/或种族进行调整。

本文提到的标志物可以单独测定。然而，它们也可以一起测定，即，本发明的方法可以涵盖测定一种标志物、两种标志物、三种标志物或四种标志物。特别优选的组合是测定心脏肌钙蛋白和CRP(即hsCRP)。这些标志物的组合测定，优选地，允许诊断在已经获得样品之前30天期间内，更优选地在已经获得样品之前一周期间内，对象是否已经患有阵发性心房纤颤。

进一步优选的组合是测定心脏肌钙蛋白和BNP型肽，特别是NT-原BNP。这些标志物的组合测定，具体而言，允许诊断在已经获得样品之前一周期间内，对象是否已经患有阵发性心房纤颤。

进一步优选的组合是测定心脏肌钙蛋白和IL-6。这些标志物的组合测定，优选地，允许诊断在已经获得样品之前30天期间内，更优选地在已经获得样品之前一周期间内，对象是否已经患有阵发性心房纤颤。

另一个优选的组合是测定IL-6和BNP型肽，特别是NT-原BNP。这些标志物的组合测定，具体而言，允许诊断在已经获得样品之前一周期间内，对象是否已经患有阵发性心房纤颤。

另一个优选的组合是测定CRP和BNP型肽，特别是NT-原BNP。这些标志物的组合测定，具体而言，允许诊断在已经获得样品之前一周期间内，对象是否已经患有阵发性心房纤颤。

进一步优选的组合是测定hsCRP和IL-6。这些标志物的组合测定，优选地，允许诊断在已经获得样品之前30天期间内，更优选地在已经获得样品之前一周期间内，对象是否已经患有阵发性心房纤颤。

在本发明的一个方面，考虑用于确立用于诊断对象中的最近阵发性心房纤颤的辅助手段的方法，所述方法包括：

a) 通过以下测定选自心脏肌钙蛋白、BNP型肽、hsCRP(高敏CRP)、IL-6(白介素-6)和IGFBP7(胰岛素样生长因子结合蛋白7)的至少一种标志物的量：(i) 使样品与特异性结合所述至少一种标志物的一种或多种检测试剂接触，其时间足以允许形成所述检测试剂与来自样品的至少一种标志物的复合物，(ii)测定所形成的一种或多种复合物的量，其中，所述形成的一种或多种复合物的量与样品中存在的至少一种标志物的一个或多个量成正比，和(iii)将形成的复合物的一个或多个量转化为至少一种标志物的一个或多个量，其反映样品中存在的至少一种标志物的一个或多个量；

b) 将所述一个或多个量与一个或多个参考进行比较；和

c) 基于步骤b)中进行的比较的结果确立用于诊断对象中的最近阵发性心房纤颤的辅助手段。

在本发明的另一个方面，用于确立用于诊断对象中的最近阵发性心房纤颤的辅助手段的系统，其包含：

a) 配置用于使样品与特异性结合所述至少一种标志物的一种或多种检测试剂接触的分析器单元，所述标志物选自心脏肌钙蛋白、BNP型肽、hsCRP(高敏CRP)、IL-6(白介素-6)和IGFBP7(胰岛素样生长因子结合蛋白7)，持续时间足以允许形成所述检测试剂和来自样品的至少一种标志物的复合物，

b) 配置用于测量形成的复合物的量的分析器单元，其中所述形成的复合物的量与样品中存在的至少一种标志物的量成正比，

c) 具有处理器且与所述分析器单元可操作通信的计算装置，和

d) 非短暂性机器可读介质，其包括可由所述处理器执行的多个指令，所述指令当执行时将形成的复合物的量转化成至少一种的标志物的量，所述量反映样品中存在的至少一种标志物的量，将所述量与参考进行比较，并基于所述与所述参考比较的结果建立用于诊断对象中的最近阵发性心房纤颤的辅助手段。

在一个方面，合适的检测试剂可以是，特异性结合至少一种标志物的抗体，特别是单克隆抗体，即结合待通过本发明的方法研究的对象的样品中的心脏肌钙蛋白、BNP型肽、hsCRP(高敏CRP)或IL-6(白介素-6)的检测试剂。

在一个方面，另一种可应用的检测试剂可以是特异性结合样品中至少一种标志物的适配体(aptamere)。在又一个方面，在测量检测试剂与至少一种标志物之间形成的复合物的量之前，从所述复合物除去样品。因此，在一个方面，所述检测试剂可以固定化在固体支持物上。在又一个方面，可通过施用洗涤溶液将样品与固体支持物上形成的复合物去除。所形成的复合物与样品中存在的至少一种标志物的量成正比。应当理解，待应用的检测试剂的特异性和/或灵敏度定义样品中包含的能够被特异性结合的至少一种标志物的比例程度。在本文中别处还可见关于如何实施测定的更详细的描述。所形成的复合物的量将被转化为至少一种标志物的量，其反映样品中实际存在的至少一种标志物的量。此类量一个方面可以基本上是样品中存在的量，或者在另一个方面也可以是由于所形成的复合物与初始样品中存在的量之间的关系导致的作为其特定比例的量。

在前述方法的又一个方面，步骤a)可通过分析器单元实施，在一个方面，分析器单元如本文中别处所定义。

在本发明方法的一个方面，将步骤a)中测定的一个或多个量与参考进行比较。在一个方面，所述参考是如本文中别处定义的参考。在又一个方面，所述参考考虑测量的复合物的量和初始样品中存在的量之间的比例关系。因此，在本发明方法的一个方面中应用的参考是人为参考，其用于反映已经使用的检测试剂的限制。在另一个方面，当实施比较时还可以考虑所述关系，例如通过在实际比较测定量的值与参考之前对于测定量包括标准化和/或校正计算步骤。对于测定量的标准化和/或校正计算步骤再次采用比较步骤，使得正确地反映已使用的检测试剂的限制。在一个方面，自动化实施所述比较，例如通过计算机系统等辅助。

基于在步骤b)中实施的比较确立用于诊断最近阵发性心房纤颤的辅助手段，其通过本文别处所述的将对象分配至最近已经患有阵发性心房纤颤的对象组或最近没有患有阵发性心房纤颤的对象组来实现。如本文别处已讨论，对于研究的对象的划分不一定在100％的研究情况下是正确的。而且，研究的对象所归入的对象组是人为的组，因为它们是基于统计学考虑建立的，即本发明的方法应当基于其运行的某种预先选择的可能性程度。在本发明的一个方面，用于优化风险评估的辅助手段是自动建立的，例如，由如本文所述和公开的计算装置等辅助。

在本发明方法的一个方面，所述方法进一步包括根据比较结果推荐抗凝治疗的步骤。优选地，如果对象最近已经患有阵发性心房纤颤，则推荐抗凝治疗。

在前述方法的一个方面，通过本文中别处所述的一个或多个分析器单元来实施步骤b)和/或c)。

上文给出的解释和定义如作适当变动也适用于以下。

用于鉴定易受抗凝治疗影响的对象的方法

此外，本发明还涉及用于鉴定易受抗凝治疗影响的对象的方法：

(a) 测定来自被怀疑最近已经患有阵发性心房纤颤的对象的样品中的至少一种标志物的量，所述标志物选自心脏肌钙蛋白、NT-原BNP (脑利尿钠肽的N-末端激素原)、hsCRP、IL-6(白介素-6)和IGFBP7(胰岛素样生长因子结合蛋白7)，和

(b) 将这样测定的所述至少一种标志物的一个或多个量与一个或多个参考量进行比较，由此鉴定易受抗凝治疗影响的对象，

其中所述对象在获得所述样品时不患有心房纤颤。

优选地，易受抗凝治疗影响的对象通过实施进一步步骤c)基于步骤b)中实施的比较的结果鉴定易受抗凝治疗影响的对象，来实施。

在一个实施方案中，步骤(a)中的一种或多种生物标志物的量的测定通过以下进行：使样品与特异性结合生物标志物的检测试剂(或与特异性结合生物标志物的检测试剂)接触，由此形成具有检测试剂和生物标志物的复合物，检测形成的复合物的量，由此测定生物标志物的量。术语“检测试剂”已经在本文别处指定。

如本文所使用，术语“鉴定”意指评价对象是否将易受抗凝治疗影响，并且因此，是否需要所述治疗。优选地，如果对象将受益于所述治疗，则对象易受所述治疗影响。具体而言，如果治疗降低所述对象的中风的风险，则对象受益于所述治疗。此外，对于易受所述治疗影响的对象，所述治疗的优点应当大于缺点(特别是由某些治疗方案的不利副作用、而且关于成本引起的缺点)。此外，对于不易受所述治疗影响的对象，所述治疗的缺点(特别是，关于不利副作用，而且关于由于过度治疗引起的成本)将大于优点。具体地，如果对象不需要某些心脏治疗，则将节约由于过度治疗导致的成本和/或可以避免不利副作用。如本领域技术人员应当理解，此类评估通常不意图对于待鉴定的所有(即100％)对象都是正确的。然而，该术语要求可以鉴定统计学显著比例的对象(例如组群研究中的组群)。本领域技术人员使用多种众所周知的统计评价工具可以无需进一步费力地测定比例是否是统计学显著的，例如置信区间的测定、p值测定、Student氏t检验、Mann-Whitney检验等。细节可见Dowdy and Wearden, Statistics for Research, John Wiley & Sons, New York 1983。优选的置信区间是至少90％、至少95％、至少97％、至少98％或至少99％。p值优选是0.1、0.05、0.01、0.005或0.0001。更优选地，群体的对象中的至少60％、至少70％、至少80％或至少90％可以通过本发明的方法正确地鉴定。

待连同上述方法测定的优选标志物可以是心脏肌钙蛋白、BNP型肽，特别是NT-原BNP (脑利尿钠肽的N-末端激素原)，和hsCRP，或IL-6(白介素-6)。

抗凝治疗是本领域众所周知的。

如本文所使用，该术语，优选地，涉及目的在于减少或防止血液凝固的治疗。优选的抗凝治疗是施用抗凝剂。优选的抗凝剂选自肝素，香豆素衍生物，诸如华法林或双香豆素，组织因子途径抑制剂(TFPI)，抗凝血酶III，因子IXa抑制剂，因子Xa抑制剂，因子Va和VIIIa的抑制剂，凝血酶抑制剂。

易受抗凝治疗影响的对象也可以易受用至少一种抗心律失常药治疗影响。优选的抗心律失常药是I类药剂，诸如奎尼丁和利多卡因，II类药剂，即β受体阻滞剂，III类药剂，诸如伊布利特，IV类药剂，诸如维拉帕米，或V类药剂，诸如地高辛。

术语“参考量”已经在本文别处解释。在前述方法的背景下，该术语是指这样的量，其允许将对象分配至易受抗凝治疗影响的对象组，或不易受抗凝治疗影响的对象组。此类参考量可以是将这些群体彼此分离的阈值量。分离两个组的合适的阈值量可以基于本文提到的标志物的量，通过本文别处提到的统计学测试，从最近患有阵发性心房纤颤(AF)的对象或对象组，或最近没有患有阵发性心房纤颤(AF)的对象或对象组无需再费周折即计算。

优选地，以下作为诊断算法应(具体而言，如果参考是计算的参考量)：

优选地，相比于一个或多个参考量的至少一种标志物的增加量(多种标志物的增加量)指示易受抗凝治疗影响的对象，而相比于一个或多个参考量的至少一种标志物的减少量(多种标志物的减少量)指示不易受抗凝治疗影响的对象。

此外，一个或多个参考量可以衍生自(i)已知易受抗凝治疗影响的对象或对象组。在这种情况下，至少一种标志物的一个或多个量指示易受抗凝治疗影响的对象，所述量是来自对象的样品中至少一种标志物相比于一个或多个参考量基本上相同的一个或多个量和/或一个或多个增加的量。优选地，一个或多个参考量衍生自所述一个对象的样品或衍生自所述组或多个对象的样品。

优选地，通过应用上述参考量，可以归入所述对象易受抗凝治疗影响。

额外地或可选地，参考量可以，优选地，衍生自(i)已知不易受抗凝治疗影响的对象或对象组。优选地，至少一种标志物的一个或多个量指示所述对象不易受抗凝治疗影响，所述量是来自对象的样品中至少一种标志物相比于一个或多个参考量基本上相同的一个或多个量或降低的量(增加的量)。优选地，参考量衍生自所述对象的样品或衍生自所述组或对象的样品。

优选地，通过应用上述参考量，可以排除所述对象不易受抗凝治疗影响。

此外，本发明设想用抗凝治疗和/或抗心律失常剂治疗患者的方法，所述方法包括：

(a) 测定来自被怀疑最近已经患有阵发性心房纤颤的对象的样品中的至少一种标志物的量，所述标志物选自心脏肌钙蛋白、NT-原BNP (脑利尿钠肽的N-末端激素原)、hsCRP、IL-6(白介素-6)和IGFBP7(胰岛素样生长因子结合蛋白7)，和

(b) 将这样测定的所述至少一种标志物的量与一个(或多个)参考量进行比较，和

(c) 当至少一种标志物的一个或多个量高于一个或多个参考量时，选择和/或起始抗凝治疗和/或抗心律失常药。

上面提到的方法可以进一步包括步骤(b1)：当至少一种标志物的一个或多个量高于一个或多个参考量时，将对象鉴定为最近已经患有心房纤颤。

本发明还涉及i)选自心脏肌钙蛋白、BNP型肽、hsCRP(高敏CRP)、IL-6(白介素-6)和IGFBP7(胰岛素样生长因子结合蛋白7)的至少一种标志物或ii) 特异性结合BNP型肽的检测试剂，和/或特异性结合心脏肌钙蛋白的检测试剂，和/或特异性结合hsCRP的检测试剂，和/或特异性结合IL-6的检测试剂，和/或特异性结合IGFBP7的检测试剂，在对象的样品中用于诊断对象中的最近阵发性心房纤颤的用途。优选地，所述对象在获得所述样品时不患有心房纤颤。

本发明还涉及i)选自心脏肌钙蛋白、BNP型肽、hsCRP(高敏CRP)、IL-6(白介素-6)和IGFBP7(胰岛素样生长因子结合蛋白7)的至少一种标志物或ii) 特异性结合BNP型肽的检测试剂，和/或特异性结合心脏肌钙蛋白的检测试剂，和/或特异性结合hsCRP的检测试剂，和/或特异性结合IL-6的检测试剂，和/或特异性结合IGFBP7的检测试剂，在对象的样品中用于鉴定易受抗凝治疗影响的对象的用途。优选地，所述对象在获得所述样品时不患有心房纤颤。

本发明还涉及i)选自心脏肌钙蛋白、BNP型肽、hsCRP(高敏CRP)、IL-6(白介素-6)和IGFBP7(胰岛素样生长因子结合蛋白7)的至少一种标志物或ii) 特异性结合BNP型肽的检测试剂，和/或特异性结合心脏肌钙蛋白的检测试剂，和/或特异性结合hsCRP的检测试剂，和/或特异性结合IL-6的检测试剂，和/或特异性结合IGFBP7的检测试剂，用于制备用于诊断对象中的最近阵发性心房纤颤的诊断组合物的用途。优选地，所述对象在获得所述样品时不患有心房纤颤。

本发明还涉及i)选自心脏肌钙蛋白、BNP型肽、hsCRP(高敏CRP)、IL-6(白介素-6)和IGFBP7(胰岛素样生长因子结合蛋白7)的至少一种标志物或ii) 特异性结合BNP型肽的检测试剂，和/或特异性结合心脏肌钙蛋白的检测试剂，和/或特异性结合hsCRP的检测试剂，和/或特异性结合IL-6的检测试剂，和/或特异性结合IGFBP7的检测试剂，用于制备用于鉴定易受抗凝治疗影响的对象的诊断组合物的用途。优选地，所述对象在获得所述样品时不患有心房纤颤。

如本文所使用，术语“检测试剂”是指能够特异性识别和结合样品中存在的一种或多种生物标志物多肽的试剂。而且，所述试剂应当允许直接或间接检测由所述试剂和生物标志物形成的复合物。直接检测可通过将可检测标记包括进所述试剂来实现。间接标记可通过特异性结合包含生物标志物和检测试剂的复合物的进一步试剂来实现，其中所述进一步试剂则能够生成可检测信号。可用作检测试剂的合适的化合物是本领域中众所周知的。优选地，所述检测试剂是特异性结合生物标志物的抗体或适配体。术语“抗体”已经在本文别处描述。

本发明还涉及用于治疗已经患有最近阵发性心房纤颤的对象的抗凝剂或抗心律失常药，其中当来自患者的样品中选自心脏肌钙蛋白、BNP型肽、hsCRP(高敏CRP)、IL-6(白介素-6)和IGFBP7(胰岛素样生长因子结合蛋白7)的至少一种标志物的量大于参考量时，治疗所述对象。

根据本发明的一个优选实施方案，提供了适合用于诊断最近阵发性心房纤颤的装置，其包含

a) 包含特异性结合选自心脏肌钙蛋白、BNP型肽、hsCRP、IL-6(白介素-6)和IGFBP7(胰岛素样生长因子结合蛋白7)的标志物的一种(或多种)检测试剂的分析器单元，所述单元配置用于测定样品中的一种或多种标志物的量；和

b) 用于将一个或多个测定量与一个或多个参考量进行比较的分析器单元，由此诊断最近阵发性心房纤颤，所述单元包含如本文别处所述的具有一个(或多个)参考量的数据库和如本文别处所述的用于实施比较的计算机执行的算法。

根据本发明的另一个优选实施方案，提供了适合用于鉴定易受抗凝治疗影响的装置，其包含

a) 包含特异性结合选自心脏肌钙蛋白、BNP型肽、hsCRP、IL-6(白介素-6)和IGFBP7(胰岛素样生长因子结合蛋白7)的标志物的一种(或多种)检测试剂的分析器单元，所述单元适合用于测定样品中的一种或多种标志物的量；和

b) 用于将一个或多个测定量与一个或多个参考量进行比较的分析器单元，由此鉴定易受抗凝治疗影响的对象，所述单元包含如本文别处所述的具有一个(或多个)参考量的数据库和如本文别处所述的用于实施比较的计算机执行的算法。

优选的参考量和算法在本文别处公开。

如本文所使用，术语“装置”是指包含可操作地彼此连接以允许根据本发明的方法的诊断或监测的前述单元的系统。本文中别处公开了可用于分析器单元的优选的检测试剂。所述分析器单元优选地包含待与样品接触的在固体支持物上固定化形式的所述检测试剂，所述样品与包含其量待测定的生物标志物。而且，分析器单元还可包含测定特异性结合一种或多种生物标志物的检测试剂的量的检测器。测定的量可传输至评估单元。所述评估单元包含数据处理元件诸如计算机，具有用于实施测定量和合适参考之间比较的执行算法。合适的参考用本发明的方法衍生自在上下文中上述定义的对象或对象组。结果可以作为参数诊断性原始数据给出，优选地作为绝对或相对量。应当理解，这些数据将需要临床医师的解译。然而，还涵盖专家系统装置，其中输出包含经加工的诊断性原始数据，其解译不需要专门的临床医师。

本公开的一个优选的实施方案包括用于诊断最近阵发性心房纤颤的系统。系统的实例包括用于检测化学或生物反应结果或者监测化学或生物反应进程的，临床化学分析仪，凝固化学分析仪，免疫化学分析仪，尿分析仪，核酸分析仪。更具体地，本公开的示例性系统可包括Roche Elecsys^TM系统和Cobas^? c Immunoassay分析仪，Abbott Architect^TM 和Axsym^TM分析仪，Siemens Centaur^TM 和Immulite^TM 分析仪，和Beckman Coulter UniCel^TM 和Acess^TM 分 析仪，等。

所述系统的实施方案可包括用于实践本公开的一个或多个分析器单元。本文公开的系统的分析器单元可通过已知的任何有线连接，蓝牙，LANS，或无线信号与本文公开的计算装置可操作地通信。此外，根据本公开，分析器单元可以包含较大设备内的出于诊断目的进行样品检测(例如定性和/或定量评估)的一者或两者的独立的装置或模块。例如，分析器单元可以进行或辅助样品和/或试剂的移取、给予、混合。分析器单元可包含用于盛装试剂以进行测定的试剂盛装单元。试剂可以例如含有单独的试剂或试剂组的容器或盒(cassettes)的形式安排，其置于储藏室或输送器中适当的托座或位置中。检测试剂还可以是与样品接触的固体支持物上的固定化形式。此外，分析器单元可以包括针对特定的分析最优化的处理和/或检测组件。

根据一些实施方案，分析器单元可配置用于光学检测样品中的分析物，例如标志物。配置用于光学检测的示例性分析器单元包含配置用于将电磁能转化成电信号的装置，其包括单元件和多元件或阵列光学探测器。根据本公开，光学探测器能够监测光电磁信号并提供指示位于光路中的样品中分析物的存在和/或浓度的相对于基线信号的电输出信号或应答信号。此类装置还可以包括，例如光电二极管，包括雪崩光电二极管(avalanche photodiodes)，光电晶体管，光电导检测器，线性传感器阵列，CCD检测器，CMOS检测器，包括CMOS阵列检测器，光电倍增管，和光电倍增管阵列。根据某些实施方案，光学检测器，诸如光电二极管或光电倍增管可含有额外的信号调节或处理电器元件。例如光学检测器可包括至少一个预放大器，电子过滤器，或集成电路。合适的预放大器包括，例如集成、跨阻抗，和电流增益(电流反射器)预放大器。

此外，根据本公开的一个或多个分析器单元可包含用于发射光的光源。例如，分析器单元的光源可以由至少一个光发射元件(诸如，发光二极管，电力发射源诸如白炽灯，电致发光灯，气体放电灯，高强度放电灯，激光)组成，用于测量待测试样品中的分析物浓度，或使得能够能量转换(例如，通过荧光共振能量转移或催化酶)。

此外，所述系统的分析器单元可包括一个或多个孵育单元(例如用于将样品或试剂维持在特定温度或温度范围)。在一些实施方案中，分析器单元可包括用于使样品经受重复的温度循环中且监测样品中扩增产物量的变化的热循环仪，包括实时热循环仪。

此外，本文公开的系统的分析器单元可包含或可操作地连接至反应容器或小杯(cuvette)输送单元。示例性输送单元包括液体加工单元，诸如移取单元，用来将样品和/或试剂递送至反应容器。所述移取单元可包含可重复使用的耐洗针，例如钢针，或者一次性移液头。所述分析器单元还可包含一个或多个混合单元，例如用于振荡含液体的小杯的振荡器，或用于混合小杯或试剂容器中的液体的搅拌桨。

根据上文描述，根据本公开的一些实施方案，本文公开和描述的方法的一些步骤的部分可通过计算装置进行。计算装置可以是例如一般目的计算机或手提式计算装置。还应当理解，可一起使用多个计算装置，诸如经网络或转移数据的其它方法，用于实施本文公开的方法的一个或多个步骤。示例性计算装置包括桌面计算机、便携式计算机、个人数据助手(“PDA”)，诸如BLACKBERRY牌装置、手机装置(cellular device)、平板电脑、服务器等。通常，计算装置包含能够执行多个指令(诸如软件程序)的处理器。

计算装置能够访问存储器。存储器是计算机可读介质且可以包含单个存储装置或多个存储装置，例如其局部位于计算装置或可跨网络访问计算装置。计算机可读介质可以是可由计算装置访问的任何可访问介质，而且包括稳定和不稳定介质两者。此外，计算机可读介质可以是可移除和不可移除介质中的一者或两者。通过实例且非限制地，计算机可读介质可以包含计算机存储介质。示例性的计算机存储介质包括但不限于，RAM、ROM、EEPROM、闪存或任何其它存储技术，CD-ROM、数字通用光盘(DVD)或其它光盘存储器、磁盒、磁带、磁盘存储器或其它磁性存储装置，或任何其它可用于存储多个指令的介质，所述指令能够由计算装置访问且由计算机装置的处理器执行。

根据本公开的实施方案，软件可以包括指令，当由计算装置的处理器执行时，其可以进行本文公开方法的一个或多个步骤。一些指令可调整以产生控制其它机器运行的信号，因此可以通过那些控制信号运行以转化与计算机本身相距甚远的材料。这些描述和代表是由数据处理领域的技术人员使用的手段，例如以最有效地将其工作物质传达给其他本领域技术人员。

所述多个指令还可以包含这样的算法，其一般理解为导致期望结果的自身一致的步骤序列。这些步骤是需要物理量的物理操作的那些步骤。通常，尽管非必要地，这些量采用能够被存储、转移、转化、组合、比较和以其它方式操作的电或磁脉冲或信号的形式。有时主要出于常见用法的原因，将这些信号提及为值、字符、显示数据、数字等作为对其中这些信号被体现或表示的物理项或表现的提及，证明是方便的。然而，应当记住，所有这些和相似的术语应当与合适的物理量有关且本文中仅用作应用于这些量的方便的标记。根据本公开的一些实施方案，将用于实施本文公开的一种或多种标志物的测定量和合适参考之间的比较的算法通过执行指令来体现和进行。结果可以作为参数诊断性原始数据输出或作为绝对或相对量给出。根据本文公开的系统的多个实施方案，“诊断”可以由本文公开的系统的计算装置基于计算的“量”与参考或阈值的比较来提供。例如，系统的计算装置可以以词语、符号或数值的形式提供指示物，其指示具体的诊断。

所述计算装置还可以访问输出装置。示例性输出装置包括例如传真机、显示器、打印机和文档。根据本公开的一些实施方案，计算装置可以进行本文公开方法的一个或多个步骤，且其后经由输出装置提供输出，其涉及方法的结果、指示、比率或其它因素。

最后，本发明涉及适用于实施本发明的方法的试剂盒，其包含特异性结合选自脑利尿钠肽、心脏肌钙蛋白和sFlt-1的标志物的检测试剂、参考标准以及用于实施所述方法的指导。

如本文所使用，术语“试剂盒”是指上述组分的集合，优选地，其单独地或在单一容器内提供。所述容器内还包含用于实施本发明的方法的指导。这些指导可以是手册的形式，或可以通过计算机程序代码提供，当在计算机或数据处理装置上执行所述代码时，其能够实施本发明的方法中提及的比较，并相应地建立诊断。所述计算机程序代码可以在数据存储介质或设备诸如光学存储介质(例如，光盘)，或者直接在计算机或数据处理装置上提供。此外，试剂盒应当包含用于如上文上面定义的参考的至少一个标准品，即具有代表参考量的预先定义量的至少一种标志物的溶液。此类标准品可以代表，例如，来自最近已经患有阵发性心房纤颤的对象或对象组或最近没有患有阵发性心房纤颤的对象或对象组的至少一种标志物的量。

在一些实施方案中，本文公开的试剂盒包括用于实施公开的方法的至少一种组分或组分的包装组合。“包装组合”意指所述试剂盒提供了单一包装，所述单一包装含有如本文公开的一种或多种组分，诸如探针(例如，抗体)、对照、缓冲剂、试剂(例如，缀合物和/或底物)指导等的组合。含有单一容器的试剂盒也包括在“包装组合”的定义内。在一些实施方案中，所述试剂盒包括至少一种探针，例如抗体(对于如本文公开的生物标志物的表位具有特异性亲和力)。例如，试剂盒可以包括用荧光团标记的抗体或作为融合蛋白的成员的抗体。在试剂盒中，探针可以固定，并且可以以特定构象固定。例如，固定的探针可以在试剂盒中提供以特异性结合靶蛋白，以检测样品中的靶蛋白，和/或从样品中去除靶蛋白。

根据一些实施方案，试剂盒包括在至少一个容器中的至少一种探针，其可以是固定的。试剂盒还可以包括一个或多个容器中的多种探针，其任选是固定的。例如，多种探针可以存在于单一容器中或分开的容器中，例如，其中每个容器含有单一探针。

在一些实施方案中，试剂盒可以包括一种或多种非固定的探针和包括或不包括固定的探针的一种或多种固体支持物。一些此类实施方案可以包含对于将一种或多种探针固定至固体支持物所需的试剂和用品中的一些或全部，或对于将固定的探针结合至样品内的特定蛋白所需的试剂和用品中的一些或全部。

在某些实施方案中，单一探针(包括多个拷贝的相同探针)可以固定在单一固体支持物上，且提供在单一容器中。在其它实施方案中，在单一容器中提供两种或更多种探针，每种对于不同的靶蛋白或不同形式的单一靶蛋白(诸如特异性表位)是特异性的。在一些此类实施方案中，固定的探针可以在多个不同的容器中提供(例如，以一次性形式)，或者多种固定的探针可以在多个不同的容器中提供。在进一步实施方案中，探针可以固定在多种不同类型的固体支持物上。考虑固定的一种或多种探针和一个或多个容器的任何组合用于本文公开的试剂盒，并且其任何组合可以选择以获得合适的试剂盒用于期望用途。

试剂盒的容器可以是任何容器，其适合用于包装和/或含有本文公开的一种或多种组分，包括例如探针(例如，抗体)、对照、缓冲剂和试剂(例如，缀合物和/或底物)。合适的材料包括，但不限于，玻璃、塑料、纸板或其它纸制品、木材、金属及其任何合金。在一些实施方案中，容器可以完全包住固定的一种或多种探针，或者可以简单地覆盖探针以尽可能减少灰尘、油类等的污染和光暴露。在一些进一步实施方案中，试剂盒可包含单个容器或多个容器，并且当存在多个容器时，每个容器可以与所有其它容器相同，与其它容器不同，或与一些但不是所有其它容器不同。

用于诊断对象中的进行性心房纤颤的方法

有利地，在作为本发明基础的研究的背景下已经发现，来自对象的样品中的IGFBP7的测定允许诊断对象是否患有进行性心房纤颤。

因此，本发明涉及用于诊断对象中的心房纤颤的方法，其包括：

(a) 测定来自对象的样品中的生物标志物IGFBP7的量，且

(b) 将如步骤(a)中测定的生物标志物IGFBP7的量与参考量进行比较。

优选地，来自对象的样品中的生物标志物IGFBP7的量高于参考量表明所述对象具有心房纤颤。还优选地，来自对象的样品中的生物标志物IGFBP7的量低于参考量表明所述对象不具有心房纤颤。

在一个实施方案中，步骤(a)中的生物标志物的量的测定通过以下完成：使样品与特异性结合生物标志物的检测试剂接触，由此形成具有检测试剂和生物标志物的复合物，检测形成的复合物的量，由此测定生物标志物IGFBP7的量。术语“检测试剂”已经在本文别处指定。在一个实施方案中，所述试剂是特异性结合IGFBP7的抗体，诸如单克隆抗体。

如本文所使用的术语“检测”生物标志物是指采用本文别处所述的适当的检测方法检测样品中的生物标志物的量的方法。

在一个实施方案中，上述方法可以进一步包括步骤(c)：当来自对象的样品中的生物标志物的量高于参考量时，提供心房纤颤的诊断和/或当来自对象的样品中的生物标志物的量低于参考量时，提供不存在心房纤颤的诊断。

在上述诊断心房纤颤的方法的背景下，应当诊断对象在已经获得待测试的样品的时间点是否患有心房纤颤。因此，与诊断最近心房纤颤的方法相比之下，应当诊断对象是否患有进行性心房纤颤。上文已经定义术语“心房纤颤”。在上述方法的背景下，心房纤颤可以是永久性，持久性或，特别是阵发性心房纤颤。

如连同上述方法使用的术语“诊断心房纤颤”用于指示根据本发明的方法将个体分类为具有心房纤颤或在替代方案中分类为不具有心房纤颤。高于参考量的生物标志物IGFBP7的量用于提供心房纤颤的诊断。

在上述方法的背景下的术语“指示对象具有心房纤颤”用于说明高于参考量的IGFBP7的量是非常有价值的，但不是没有错误地诊断的。不是在所有(100％)具有心房纤颤的患者中，生物标志物的水平都高于参考量，并且不是在所有健康个体中，生物标志物的量都低于参考水平。如技术人员将理解，在许多疾病中，没有生物化学标志物具有100％特异性，同时具有100％灵敏度。在此类情况下，评价，例如，关于心房纤颤中生物标志物IGFBP7的水平的评价，以一定可能性（例如，以给定的特异性水平或以给定的灵敏度水平）来进行。技术人员充分熟悉用于计算特异性、灵敏度、阳性预测值、阴性预测值、参考值或总误差的数学/统计方法。任何这些参数都可以进行计算并用于获得心房纤颤的存在或不存在的指示。

如本文连同上述方法使用的短语“提供诊断”是指使用关于患者样品中IGFBP7的水平或存在生成的信息或数据以诊断患者中的心房纤颤。所述信息或数据可以是任何形式，书面、口头或电子形式。在一些实施方案中，使用生成的信息或数据包括通信、呈现、报道、存储、发送、传输、供给、传送、分配或其组合。在一些实施方案中，通信、呈现、报道、存储、发送、传输、供给、传送、分配或其组合通过计算装置、分析器单元或其组合进行。在一些进一步实施方案中，通信、呈现、报道、存储、发送、传输、供给、传送、分配或其组合由实验室或医学专业人员进行。在一些实施方案中，所述信息或数据包括IGFBP7的水平与参考水平的比较。在一些实施方案中，所述信息或数据包括诊断患者具有心房纤颤的指示。

如连同上述方法使用的术语“对象”涉及动物，优选哺乳动物，更优选人。对象可以是雄性(具体而言雄性是大于60或65岁)。此外，对象可以是雌性(具体而言，雌性是大于60或65岁)。

根据诊断心房纤颤的前述方法的对象应当怀疑患有阵发性心房纤颤。优选地，怀疑患有阵发性心房纤颤的对象是具有一种或多种心房纤颤风险的对象。这些风险因素是本领域中众所周知的，并且包括心脏病，包括瓣膜问题和心脏病发作和心脏手术史、系统性高血压(特别是如果它没有通过生活方式改变或药物充分控制)，和饮酒。优选地，受怀疑的对象属于风险组。特别地，涵盖的是，对象是具有证实或疑似的心脏病症的对象，包括具有对心脏病症易感的风险因素的对象，诸如动脉或系统性高血压、糖尿病、吸烟者、具有高脂血或代谢综合征体征的个体，特别是如果对象为老年年龄(年龄超过60、65、70和优选超过75或80岁)。可选地或额外地，优选地，对象可以患有瓣膜病症，优选二尖瓣病变。

在本发明方法的一个实施方案中，对象患有高血压和/或心脏衰竭。上文定义了术语“高血压”和“心脏衰竭”。所述定义相应地适用。在一个优选的实施方案中，对象患有根据ACC/AHA分类(如上文提到)分类为心脏衰竭A期或B期的心脏衰竭。在本发明的一个特别优选实施方案中，待测试的对象被分类为A期对象(根据如上所指的ACC/AHA分类)。

在诊断(进行性)心房纤颤的方法的一个实施方案中，对象优选不具有已知的心房纤颤病史。因此，对象不应当已经被诊断先前患有心房纤颤，特别是通过常规方法。

上文已经定义术语“样品”。在一个实施方案中，样品是血液、血清或血浆样品。

与诊断最近阵发性心房纤颤的方法相比之下，设想的是，心房纤颤连同中风发生。因此，待测试的对象可以在获得样品的时间点患有中风，或者可以具有中风病史。优选地，在已经获得待测试的样品之前三个月内，具有中风病史的对象已经患有中风。更优选地，已经获得样品一个月内，具有中风病史的对象已经患有中风。

上文已经给出标志物IGFBP7(胰岛素样生长因子结合蛋白7)的定义。

如何测定生物标志物的量已经连同诊断最近阵发性心房纤颤的方法进行描述。IGFBP7的量可以相应地测定。

关于上述方法的术语“参考量”是指预定值。在该背景下，“量”涵盖绝对量、相对量或浓度以及与其相关或可由其衍生的任何值或参数。如技术人员将理解，预定并设定参考量以满足在例如特异性和/或灵敏度方面的常规要求。这些要求可能在例如监管机构之间不同。它可以例如是，测定灵敏度或特异性分别必须设定为一定限制，例如分别为80％、90％、95％或98％。这些要求也可以在正或负预测值方面来定义。尽管如此，基于本发明中给出的教导，对于技术人员将总是可能达到那些要求的参考量。在一个实施方案中，参考量在来自健康个体的参考样品中测定。在一个实施方案中，参考量已经在来自患者属于的疾病实体的参考样品中预先测定。在某些实施方案中，参考量可以例如被设定为研究的疾病实体中的值的总体分布的25%和75％之间的任何百分比。在其它实施方案中，参考量可以例如被设定为如从来自研究的疾病实体的参考样品中值的总体分布测定的中值、三分位数或四分位数。在一个实施方案中，参考量被设定为如从研究的疾病实体中的值的总体分布测定的中值。参考量可以根据各种生理参数诸如年龄、性别或亚群以及用于测定本文提到的IGFBP7的平均值而变化。在一个实施方案中，参考样品是来自与来自进行本发明的方法的个体或患者的样品基本上相同类型的细胞、组织、器官或体液来源，例如，如果根据本发明，血液用作测定个体中的IGFBP7的量的样品，则所述参考量也在血液或其部分中测定。

在一个实施方案中，参考量是(预定)量，其允许区分患有心房纤颤的对象和不患有心房纤颤的对象。

IGFBP7的优选参考量是70至115 ng/ml的范围内，或更优选地80至90 ng/ml的范围内。特别优选的参考量是90 ng/ml。

在某些实施方案中，术语“高于参考水平”是指，通过本文所述的方法测定，与参考水平相比，来自个体或患者的样品中生物标志物的水平高于参考水平或总体增加5%、10%、20%、25%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%、100%或更大。在某些实施方案中，术语增加是指来自个体或患者的样品中生物标志物水平的增加，其中例如从参考样品预先测定，所述增加与参考水平相比高至少约1.5-、1.75-、2-、3-、4-、5-、6-、7-、8-、9-、10-、15-、20-、25-、30-、40-、50-、60-、70-、75-、80-、90-或100-倍。

在某些实施方案中，术语“降低”或“低于”是指，通过本文所述的方法测定，与参考水平相比，来自个体或患者的样品中生物标志物的水平低于参考水平或总体降低5%、10%、20%、25%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更大。在某些实施方案中，术语来自个体或患者的样品中生物标志物水平的降低，其中例如从参考样品预先测定，所述降低的水平是参考水平的至多约0.9-、0.8-、0.7-、0.6-、0.5-、0.4-、0.3-、0.2-、0.1-、0.05-或0.01-倍或更低。

在上述方法的一个优选实施方案中，其进一步包括测定BNP型肽的量，和比较因此测定的量与参考量(对于所述BNP型肽)。

因此，本发明还提供用于诊断对象中的心房纤颤的方法，其包括：

(a) 测定来自对象的样品中的IGFBP7和BNP型肽的量，且

(b) 比较如步骤(a)中测定的量与参考量(即，对于IGFBP7的参考量和对于所述BNP型肽的参考量)。

优选地，来自对象的样品中的生物标志物IGFBP7的量高于参考量和所述BNP型肽的量高于参考量指示所述对象具有心房纤颤。还优选地，来自对象的样品中的生物标志物IGFBP7的量低于参考量和来自对象的样品中的BNP型肽的量低于参考量指示所述对象不具有心房纤颤。

根据该方法，NT-原BNP的优选参考量在200至500 ng/l的范围内，或更优选300至400 ng/l的范围内。特别优选的参考量是400 ng/l。

上文已经定义术语“BNP型肽”。所述定义相应地适用。在一个实施方案中，BNP型肽是NT-原BNP。

在上述方法的一个优选实施方案中，所述方法进一步包括推荐适合于治疗心房纤颤的治疗的步骤。所述治疗可以包括本领域已知的用于进行性心房纤颤的治疗的任何治疗。优选地，所述治疗意在(i)终止所述心房纤颤，诸如电心脏复律或用抗心律失常药心脏复律或(ii)抗凝治疗。

上文已经定义术语“抗凝治疗”。上文还描述了优选的抗心律失常药。

此外，本发明设想用适合于治疗心房纤颤的疗法治疗患者的方法，所述方法包括：

(a) 测定来自对象的样品中的IGFBP7和，任选地，BNP型肽的量，且

(b) 将如步骤(a)中测定的一个(或多个)量与一个(或多个)参考量进行比较，且

(c) 当IGFBP7的量(或IGFBP7和BNP型肽的量)高于一个(或多个)参考量时，选择和/或起始适合于治疗心房纤颤的疗法。

上文提到的方法可以进一步包括步骤(b1)：当IGFBP7的量(或IGFBP7和BNP型肽的量)高于一个(或多个)参考量时，将对象鉴定为患有心房纤颤。

本发明进一步涉及i) IGFBP7和任选地，BNP型肽或ii) 特异性结合IGFBP的检测试剂，和任选地，特异性结合对象的样品中的BNP型肽的检测试剂，用于诊断所述对象中的心房纤颤，特别是进行性心房纤颤的用途。

本发明进一步涉及i) IGFBP7和任选地，BNP型肽或ii) 特异性结合IGFBP的检测试剂，和任选地，特异性结合BNP型肽的检测试剂用于制备用于诊断心房纤颤的诊断组合物的用途。优选地，来自对象的样品中的生物标志物IGFBP7的量高于参考量(和任选地，所述BNP型肽的量高于参考量)指示所述对象具有心房纤颤。还优选地，来自对象的样品中的生物标志物IGFBP7的量低于参考量(和任选地，来自对象的样品中的BNP型肽的量低于参考量)指示所述对象不具有心房纤颤。

根据本发明的一个优选实施方案，提供了适用于诊断进行性心房纤颤的装置，其包含

(a) 包含特异性结合IGFBP的检测试剂(和任选地，特异性结合BNP型肽的检测试剂)的分析器单元，所述单元适用于测定样品中的一种或多种标志物的一个或多个量；和

(b) 用于将一个或多个测定量与一个或多个参考量进行比较的分析器单元，由此诊断进行性心房纤颤，所述单元包含如本文别处所述的具有一个(或多个)参考量的数据库和用于实施比较的计算机执行的算法。

术语“装置”已经在本文别处定义。术语“检测试剂”已经在本文别处指定。在一个实施方案中，所述试剂是特异性结合标志物(即分别为IGFBP和BNP型肽)的抗体，诸如单克隆抗体。

本说明书中引用的所有参考文献关于其完整公开内容和在本说明书中具体提及的公开内容而言在此通过引用并入。

下述实施例应仅举例说明本发明。它们无论如何不应解释为限制本发明的范围。

实施例1：患者组群

在12-月访问时窦性心律(SR)中血液采样和生物标志物测定的n= 46名患者的血浆样品中已经测定了TnT-hs、IL-6、NT-原BNP和hsCRP水平。所有患者从随机化到12-月访问都具有>= 1次心房纤颤复发。所有46名患者自发转化为窦性心律。

· 阵发性心房纤颤(AF)后0-7天；n=9名患者

· 阵发性AF后8-30天；n=10名患者。

实施例2：测定

使用Roche的电化学发光ELISA夹心测试Elecsys肌钙蛋白Ths(高灵敏度)STAT(短周转时间(Short Turn Around Time))测定法测定肌钙蛋白T。该测试采用两种特异性针对人心脏肌钙蛋白T的单克隆抗体。所述抗体识别位于心脏肌钙蛋白T蛋白的中心部分中的两个表位(氨基酸位置125-131和136-147)，所述中心部分由288个氨基酸组成。hs-TnT测定允许测量3至10000 pg/mL范围内的肌钙蛋白T水平。

使用Roche的电化学发光ELISA夹心测试Elecsys原BNP II STAT(短周转时间)测定法来测定NT-原BNP。该测试采用识别位于原BNP(1-108) N端部分(1-76)中的表位的两种单克隆抗体。

IL-6(白介素6)通过电化学发光免疫测定法(ECLIA, Roche Diagnostics)测量。测试使用来自Roche Diagnostics的Cobas E601分析仪进行。该测试基于与生物素化的单克隆IL-6特异性抗体的第一孵育和与用钌络合物标记的单克隆IL-6特异性抗体和链霉亲和素包被的微粒的第二孵育。

高灵敏度(hs) CRP使用来自Roche Diagnostics的颗粒增强免疫比浊测定法（Tina-quant Cardiac C-reactive Protein (Latex) High Sensitive）测定。在该测试中，偶联至胶乳微粒的抗CRP抗体与样品中的抗原反应，以形成抗原/抗体复合物。凝集后，比浊测量复合物。

实施例3：结果

结果显示在下表中。

阵发性心房纤颤后的天数	hsTnT　(pg/mL)	Nt-原BNP	hsCRP　　　　mg/l	IL-6　　　pg/ml
					0-7  (n= 6)	8.37	191	4.20	2.21
8-30 (n=10)	6.51	58	4.35	2.04

数据评估显示，具有高于参考值的TnT-hs水平(独立于其它生物标志物)(在本研究中> 6 pg/mL)的患者被怀疑具有阵发性心房纤颤，并且可得益于抗凝。甚至显示，TnT-hs水平可以在7-30天后呈现窦性心律的患者中检测到。其它标志物诸如hsCRP显示心房纤颤自发终止后稍微不同的动力学，并且因此可以单独和/或组合协助阵发性心房纤颤的过去发作的检测。

因此，之后7-30天内呈现窦性心律的患者中阵发性心房纤颤的最近发生的诊断可以通过检测单独或与炎症的标志物(CRPhs，IL6)和/或心脏衰竭的标志物(NT-原BNP)组合的肌钙蛋白T的增强水平来实现。

实施例4：具有进行性心房纤颤的对象中IGFBP7和NT-原BNP的测定。

在来自49名明显健康的老年对象的血浆样品中测定IGFBP7。这49名对象中，17名在临床访问中通过ECG检测呈现AF的发作。在来自139名明显健康的老年对象的血浆样品中测定NT-原BNP。这139名对象中，45名在临床访问中通过ECG检测呈现AF的发作。28 / 82名针对性别和年龄匹配的对照在ECG时没有呈现AF的发作。

NT-原BNP已经如上所述测定。为了检测人样品中的IGFBP7，使用夹心ELISA实验。对于抗原的捕获和检测，将来自R&D Systems (目录号:AF 1334)的抗IGFBP7多克隆抗体的等分试样分别与生物素和地高辛缀合。

结果显示在下表中：

在呈现或不具有通过ECG检测的AF的发作的对象中比较生物标志物水平。因为它可以衍生自所述表，所以发现具有进行性AF的对象中NT-原BNP和IGFBP7显著更高。

实施例5：个例

具有A类心脏衰竭的71岁女性患者具有低于30 kg/m²的BMI和高血压。患者不具有任何中风病史。患者呈现窦性心律。测定从所述患者获得的血浆样品中肌钙蛋白T、白介素6和NT-原BNP。肌钙蛋白T值低于6 pg/ml，白介素6值低于1.5 pg/ml，且NT-原BNP值低于125 pg/ml。数据评估表明，该患者在上周没有阵发性心房纤颤的最近发作。

具有A类心脏衰竭的69岁男性患者具有低于30 kg/m²的BMI和高血压。患者呈现窦性心律。测定从所述患者获得的血浆样品中肌钙蛋白T、C反应蛋白和NT-原BNP。肌钙蛋白T值低于6 pg/ml，C反应蛋白值在1和3 mg/l之间，且NT-原BNP值低于125 pg/ml。数据评估表明，该患者之前长达7-30天没有阵发性纤颤的过去发作。告知患者在12个月内或如果症状恶化返回后续随访。12个月之后，患者来到后续随访。测定从所述患者获得的血浆样品中肌钙蛋白T、C反应蛋白和NT-原BNP。肌钙蛋白T值高于6 pg/ml，C反应蛋白值高于3 mg/l，且NT-原BNP值高于125 pg/ml。数据评估表明，该患者之前长达7-30天没有阵发性纤颤的过去发作，并且可受益于抗凝。

具有B类心脏衰竭的68岁男性患者具有高于30 kg/m²的BMI和高血压。患者呈现窦性心律。测定从所述患者获得的血浆样品中肌钙蛋白T、C反应蛋白和NT-原BNP。肌钙蛋白T值高于6 pg/ml，CRP值高于3 mg/l，且NT-原BNP值高于125 pg/ml。标志物相比于一个或多个参考量的增加量表明该对象在长达7-30天前患有阵发性心房纤颤的过去发作。本实施例表明，单独或与其它标志物组合的肌钙蛋白T的测定适合于检测因为阵发性心房纤颤的诊断而可受益于抗凝的患者。

具有A类心脏衰竭的76岁女性患者没有任何心房纤颤病史。患者呈现窦性心律。测定从所述患者获得的血浆样品中肌钙蛋白T、白介素6、NT-原BNP和IGFBP-7。肌钙蛋白T值高于6 pg/ml，白介素6值高于1.5 pg/ml，NT-原BNP值高于125 pg/ml，且IGFBP-7值高于80 ng/ml。数据评估表明，该患者在过去几天具有阵发性心房纤颤的最近发作，并且可受益于预防治疗。

结论：

作为本发明基础的研究的数据表明，心脏肌钙蛋白可以是诊断最近阵发性心房纤颤的发生的有用标志物。TnT-hs是在心房纤颤过程中从心脏释放到血液中的可溶性生物标志物，数据显示，它持续几天可检测，然后它在回溯至约一周心律失常之后下降。对于C反应蛋白、NT-原BNP和IL-6显示类似的模式，因此，这些标志物可以单独或组合辅助心房纤颤自发终止后长达一个月的阵发性心房纤颤的检测。

Claims (22)

1.用于诊断对象中的最近阵发性心房纤颤的方法，其包括：

(a) 测定来自所述对象的样品中的至少一种标志物的量，所述标志物选自心脏肌钙蛋白，BNP型肽、hsCRP(高灵敏度CRP)，IL-6(白介素-6)和IGFBP7(胰岛素样生长因子结合蛋白7)，和

(b) 将这样测定的所述至少一种标志物的一个或多个量与一个或多个参考量进行比较，由此诊断最近阵发性心房纤颤，

其中所述对象在获得所述样品时不患有心房纤颤。

2.权利要求1的方法，其中所述最近阵发性心房纤颤在已经获得样品之前至多达十二周发生。

3.权利要求1的方法，其中所述最近阵发性心房纤颤在已经获得样品之前1至30天内发生，具体而言其中所述最近阵发性心房纤颤在已经获得样品之前1至7天内发生。

4.权利要求1-3中任一项的方法，其中所述最近阵发性心房纤颤没有连同中风发生，具体而言其中所述对象不具有中风史。

5.权利要求1-4中任一项的方法，其中所述样品是血液、血清或血浆样品。

6.权利要求1-5中任一项的方法，其中所述对象是人。

7.权利要求1-6中任一项的方法，其中所述参考量是计算的参考量，并且其中相比于一个或多个参考量的至少一种标志物的增加量(多种标志物的多个增加量)指示最近阵发性心房纤颤的诊断，和/或其中相比于一个或多个参考量的至少一种标志物的减少量(多种标志物的多个减少量)指示所述对象最近未患有阵发性心房纤颤。

8.权利要求1-6中任一项的方法，其中所述一个或多个参考量衍生自(i)已知已经患有最近阵发性心房纤颤的对象或对象组，具体而言，其中来自所述对象的样品中至少一种标志物相比于一个或多个参考量基本上相同的一个或多个量和/或一个或多个增加的量指示最近阵发性心房纤颤的诊断，和/或其中所述一个或多个参考量衍生自(i)已知未患有最近阵发性心房纤颤的对象或对象组，具体而言，其中来自所述对象的样品中至少一种标志物相比于一个或多个参考量基本上相同的一个或多个量和/或一个或多个减少的量指示对象最近未患有阵发性心房纤颤。

9.权利要求1-8中任一项的方法，其中i) 测定心脏肌钙蛋白和hsCRP的量，并且其中诊断所述对象在已经获得样品之前30天的期间内是否已经患有阵发性心房纤颤，或其中ii) 测定心脏肌钙蛋白和BNP型肽、具体而言NT-原BNP的量，并且其中诊断所述对象在已经获得样品之前一周的期间内是否已经患有阵发性心房纤颤。

10.根据权利要求1-9中任一项的方法，其中纤颤的发作自发终止。

11.用于鉴定易受抗凝治疗影响的对象的方法，其包括：

(a) 测定来自被怀疑最近已经患有阵发性心房纤颤的对象的样品中的至少一种标志物的量，所述标志物选自心脏肌钙蛋白、BNP型肽、hsCRP、IL-6(白介素-6)和IGFBP7(胰岛素样生长因子结合蛋白7)，和

(b) 将这样测定的所述至少一种标志物的一个或多个量与一个或多个参考量进行比较，由此鉴定易受抗凝治疗影响的对象，

其中所述对象在获得所述样品时不患有心房纤颤。

12.权利要求11的方法，其中所述抗凝治疗选自肝素、香豆素衍生物诸如华法林或双香豆素、组织因子途径抑制剂(TFPI)、抗凝血酶III、因子IXa抑制剂、因子Xa抑制剂、因子Va和VIIIa的抑制剂、凝血酶抑制剂。

13.权利要求11或12的方法，其中所述参考量是计算的参考量，并且其中相比于一个或多个参考量的至少一种标志物的增加量(多种标志物的多个增加量)指示易受抗凝治疗影响的对象，和/或其中相比于一个或多个参考量的至少一种标志物的减少量(多种标志物的多个减少量)指示不易受抗凝治疗影响的对象。

14.权利要求11-13中任一项的方法，其中所述一个或多个参考量衍生自(i)易受抗凝治疗影响的对象或对象组，具体而言，其中来自所述对象的样品中至少一种标志物相比于一个或多个参考量基本上相同的一个或多个量和/或一个或多个增加量指示所述对象易受抗凝治疗影响，和/或其中所述一个或多个参考量衍生自(i)已知不易受抗凝治疗影响的对象或对象组，具体而言，其中来自所述对象的样品中至少一种标志物相比于一个或多个参考量基本上相同的一个或多个量和/或一个或多个减少量指示所述对象不易受抗凝治疗影响。

15.用于诊断对象中的进行性心房纤颤的方法，其包括

(a) 测定来自所述对象的样品中的生物标志物IGFBP7的量，且

(b) 将如步骤(a)中测定的生物标志物IGFBP7的量与参考量进行比较。

16.权利要求15的方法，其中所述样品是血液、血清或血浆样品。

17.权利要求15或16的方法，其中所述对象是人。

18.根据权利要求15-17中任一项的方法，其中所述对象患有根据ACC/AHA分类法分类为心脏衰竭A期或B期的心脏衰竭。

19.根据权利要求15-18中任一项的方法，其中来自所述对象的样品中的生物标志物IGFBP7的量高于参考量指示所述对象具有心房纤颤，还优选地，来自所述对象的样品中的生物标志物IGFBP7的量低于参考量表明所述对象不具有心房纤颤。

20.i)选自心脏肌钙蛋白、BNP型肽、hsCRP(高敏CRP)、IL-6(白介素-6)和IGFBP7(胰岛素样生长因子结合蛋白7)的至少一种标志物或ii) 特异性结合BNP型肽的检测试剂，和/或特异性结合心脏肌钙蛋白的检测试剂，和/或特异性结合hsCRP的检测试剂，和/或特异性结合IL-6的检测试剂，和/或特异性结合IGFBP7的检测试剂，在对象的样品中用于诊断所述对象中的最近阵发性心房纤颤或用于鉴定易受抗凝治疗影响的对象的用途，其中所述对象在获得所述样品时不患有心房纤颤。

21.IGFBP7和/或特异性结合对象的样品中的IGFBP7的检测试剂用于诊断所述对象中的进行性心房纤颤的用途。

22.适用于诊断对象中的最近阵发性心房纤颤的装置，其包含：

a) 包含特异性结合选自心脏肌钙蛋白、BNP型肽、hsCRP、IL-6(白介素-6)和IGFBP7(胰岛素样生长因子结合蛋白7)的标志物的一种或多种检测试剂的分析器单元，所述单元适用于测定样品中的一种或多种标志物的量；和

b) 用于将一个或多个测定量与一个或多个参考量进行比较的分析器单元，由此诊断易受抗凝治疗影响的对象，所述单元包含如权利要求7或8中所述的具有一个或多个参考量的数据库和如权利要求7或8中所述的用于实施比较的计算机执行的算法。