CN110554198A - 一种肌钙蛋白i检测试方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种肌钙蛋白I检测试方法,本发明优点是吖啶酯属于闪光型标记物,与激发液混合后,能够瞬时达到一个极高的发光值,将吖啶酯标记物标记在cTnI单抗上和Fc结合蛋白上,通过单抗上的Fc区域与Fc结合蛋白反应,形成一个cTnI单抗‑Fc结合蛋白复合物,该复合物将有更多的吖啶酯载量,能够瞬时激发出更高信号的发光值,实现0.01ng/mL功能灵敏度的测定。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域;具体地说,是涉及一种肌钙蛋白I检测试方法。
背景技术
心肌肌钙蛋白(cTn)是存在于心肌肌原纤维中细肌丝上的收缩调节蛋白,主要调节心肌收缩过程中粗、细肌丝之间的相对滑行。cTn含三个亚单位:肌钙蛋白I(CTnI)、肌钙蛋白T(cTnT)和肌钙蛋白C(cTnC)。心肌钙蛋白I(cTnI)是一个分子量为22 .5KD的心肌蛋白, 它与肌钙蛋白T(TnT)、肌钙蛋白C(TnC)一起形成一个心肌钙蛋白复合物,共同完成细胞内肌动蛋白间相互作用的钙信号传递的基本功能。
目前现有技术中,肌钙蛋白I的检测方法包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、免疫分析试纸条检测、管式化学发光法等。肌钙蛋白I测定对灵敏度要求极高,目前化学发光法测试灵敏度最高,可实现0.03ng/mL的功能灵敏度检测能力,达到超敏检出级别。
但是0.03ng/mL目前处于市面上化学发光诊断试剂的检出极限,无论是试剂及仪器的波动,产品的性能就会出现对0.03ng/mL浓度附近样本检测的不准确性。提升肌钙蛋白I是所有医疗诊断行业的目标。
发明内容
本发明的目的在于克服上述传统技术的不足之处,提供一种肌钙蛋白I检测试方法,可实现0.01ng/mL功能灵敏度的测定。
本发明的目的是通过以下技术措施来达到的:
一种肌钙蛋白I检测试方法,包括以下步骤:
S1、Fc结合蛋白进行吖啶酯标记:
S2、cTnI单抗进行吖啶酯标记;
S3、Fc结合蛋白与cTnI单抗反应;
S4、分离未结合的BSA。
作为一种改进:所述步骤S1,包括以下步骤:
A1、取Fc结合蛋白溶解于MES溶液中,充分溶解,配置成0.5-2.0mg/mL的BSA溶液;
A2、向A1的产物中加入偶联剂EDC溶液;
A3、向A2的产物中加入吖啶酯溶液;
A4、向A3的产物中加入甘氨酸溶液;
A5、对A4的产物进行超滤,除去未结合的过量的吖啶酯。
作为一种改进:在步骤A1中,所述Fc结合蛋白的质量为0.5-2.0mg,所述MES溶液的体积为1ml;
在步骤A2中,所述Fc结合蛋白溶液的体积为1ml,所述偶联剂EDC的浓度为10-50mg/mL,所述偶联剂EDC的体积为50-100ul,于25-37℃温度下,反应0.5-1h;
在步骤A3中,所述吖啶酯溶液的浓度为0.5-2.0 mg/mL,所述吖啶酯溶液的体积为50uL,于25-37℃温度下,反应0.5-1h。
在步骤A4中,所述甘氨酸溶液的浓度为5.0-10mg/mL,所述甘氨酸溶液的体积为1mL,于25-37℃温度下,反应20-30min。
在步骤A5中,使用10-30KD超滤管,转速6000-8000rpm,时间15-30min。
作为一种改进:所述步骤S2,包括以下步骤:
B1、取cTnI单抗溶解于MES溶液中,充分溶解,配置成0.5-1mg/mL的BSA溶液;
B2、向B1的产物中加入偶联剂EDC溶液;
B3、向B2的产物中加入吖啶酯溶液;
B4、向B3的产物中加入甘氨酸溶液;
B5、对B4的产物进行超滤,除去未结合的过量的吖啶酯。
作为一种改进:在步骤B1中,所述cTnI单抗的质量为0.5-1mg,所述MES溶液的体积为1ml;
在步骤B2中,所述cTnI单抗溶液的体积为1ml,所述偶联剂EDC的浓度为10-50mg/mL,所述偶联剂EDC的体积为50-100ul,于25-37℃温度下,反应0.5-1h;
在步骤B3中,所述吖啶酯溶液的浓度为0.5-1mg/mL,所述吖啶酯溶液的体积为50uL,于25-37℃温度下,反应0.5-1h。
在步骤B4中,所述甘氨酸溶液的浓度为5.0-10mg/mL,所述甘氨酸溶液的体积为1mL,于25-37℃温度下,反应20-30min。
在步骤B5中,使用10-30KD超滤管,转速6000-8000rpm,时间15-30min。
作为一种改进:所述步骤S3,包括以下步骤:
C1、将吖啶酯标记的cTnI单抗和吖啶酯标记的Fc结合蛋白进行混合、反应。
作为一种改进:在步骤C1中,吖啶酯标记的cTnI单抗和吖啶酯标记的Fc结合蛋白的摩尔比为1:1~1:5,于25-37℃温度下,反应20-30min。
作为一种改进:所述步骤S4,包括以下步骤:
D1、使用分子筛层析法,分离纯化cTnI-Fc结合蛋白复合物。
由于采用了上述技术方案,与现有技术相比,本发明的优点是:吖啶酯属于闪光型标记物,与激发液混合后,能够瞬时达到一个极高的发光值,将吖啶酯标记物标记在cTnI单抗上和Fc结合蛋白上,通过单抗上的Fc区域与Fc结合蛋白反应,形成一个cTnI单抗-Fc结合蛋白复合物,该复合物将有更多的吖啶酯载量,能够瞬时激发出更高信号的发光值,实现0.01ng/mL功能灵敏度的测定。
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步说明。
附图说明
附图1是本发明技术方案检测结果对照示意图。
附图2是本发明技术方案CV情况对照示意图。
具体实施方式
实施例1:一种肌钙蛋白I检测试方法,包括以下步骤。
S1、Fc结合蛋白进行吖啶酯标记。
所述步骤S1,包括以下步骤:
A1、取0.5mgFc结合蛋白溶解于1mlMES溶液中,充分溶解,配置成0.5mg/mL的BSA溶液;
A2、向1mlA1的产物中加入浓度为10mg/mL的偶联剂EDC溶液50ul,于25℃温度下,反应0.5h;
A3、向A2的产物中加入浓度为0.5mg/mL的吖啶酯溶液50uL,于25℃温度下,反应0.5h;
A4、向A3的产物中加入浓度为5.0mg/mL的甘氨酸溶液1mL,于25℃温度下,反应20min;
A5、使用10KD超滤管对A4的产物进行超滤,转速6000rpm,时间15min,除去未结合的过量的吖啶酯。
S2、cTnI单抗进行吖啶酯标记,包括以下步骤。
所述步骤S2,包括以下步骤:
B1、取0.5mgcTnI单抗溶解于1mlMES溶液中,充分溶解,配置成0.5mg/mL的BSA溶液;
B2、向1mlB1的产物中加入浓度为10mg/mL的偶联剂EDC溶液50ul,于25℃温度下,反应0.5h;
B3、向B2的产物中加入浓度为0.5mg/mL的吖啶酯溶液50uL,于25℃温度下,反应0.5h;
B4、向B3的产物中加入浓度为5.0mg/mL的甘氨酸溶液1mL,于25℃温度下,反应20min;
B5、使用10KD超滤管,对B4的产物进行超滤,转速6000rpm,时间15min,除去未结合的过量的吖啶酯。
S3、Fc结合蛋白与cTnI单抗反应,包括以下步骤:
所述步骤S3,包括以下步骤:
C1、将吖啶酯标记的cTnI单抗和吖啶酯标记的Fc结合蛋白按摩尔比为1:1进行混合,于25℃温度下,反应20min。
S4、分离未结合的BSA,包括以下步骤。
所述步骤S4,包括以下步骤:
D1、使用分子筛层析法,分离纯化cTnI-Fc结合蛋白复合物。
实施例2:一种肌钙蛋白I检测试方法,包括以下步骤。
S1、Fc结合蛋白进行吖啶酯标记。
所述步骤S1,包括以下步骤:
A1、取1.0mgFc结合蛋白溶解于1mlMES溶液中,充分溶解,配置成1.0mg/mL的BSA溶液;
A2、向1mlA1的产物中加入浓度为25mg/mL的偶联剂EDC溶液65ul,于29℃温度下,反应0.65h;
A3、向A2的产物中加入浓度为1.0mg/mL的吖啶酯溶液50uL,于29℃温度下,反应0.65h;
A4、向A3的产物中加入浓度为6.5mg/mL的甘氨酸溶液1mL,于29℃温度下,反应23min;
A5、使用20KD超滤管对A4的产物进行超滤,转速7000rpm,时间16.5min,除去未结合的过量的吖啶酯。
S2、cTnI单抗进行吖啶酯标记,包括以下步骤。
所述步骤S2,包括以下步骤:
B1、取0.65mgcTnI单抗溶解于1mlMES溶液中,充分溶解,配置成0.65mg/mL的BSA溶液;
B2、向1mlB1的产物中加入浓度为25mg/mL的偶联剂EDC溶液65ul,于29℃温度下,反应0.65h;
B3、向B2的产物中加入浓度为0.65mg/mL的吖啶酯溶液50uL,于29℃温度下,反应0.65h;
B4、向B3的产物中加入浓度为6.5mg/mL的甘氨酸溶液1mL,于29℃温度下,反应23min;
B5、使用20KD超滤管,对B4的产物进行超滤,转速7000rpm,时间20min,除去未结合的过量的吖啶酯。
S3、Fc结合蛋白与cTnI单抗反应,包括以下步骤:
所述步骤S3,包括以下步骤:
C1、将吖啶酯标记的cTnI单抗和吖啶酯标记的Fc结合蛋白按摩尔比为1:1~1:5进行混合,于29℃温度下,反应23min。
S4、分离未结合的BSA,包括以下步骤。
所述步骤S4,包括以下步骤:
D1、使用分子筛层析法,分离纯化cTnI-Fc结合蛋白复合物。
实施例3:一种肌钙蛋白I检测试方法,包括以下步骤。
S1、Fc结合蛋白进行吖啶酯标记。
所述步骤S1,包括以下步骤:
A1、取1.5mgFc结合蛋白溶解于1mlMES溶液中,充分溶解,配置成1.5mg/mL的BSA溶液;
A2、向1mlA1的产物中加入浓度为40mg/mL的偶联剂EDC溶液80ul,于33℃温度下,反应0.8h;
A3、向A2的产物中加入浓度为1.5mg/mL的吖啶酯溶液50uL,于33℃温度下,反应0.8h;
A4、向A3的产物中加入浓度为8mg/mL的甘氨酸溶液1mL,于33℃温度下,反应26min;
A5、使用20KD超滤管对A4的产物进行超滤,转速7000rpm,时间25min,除去未结合的过量的吖啶酯。
S2、cTnI单抗进行吖啶酯标记,包括以下步骤。
所述步骤S2,包括以下步骤:
B1、取0.8mgcTnI单抗溶解于1mlMES溶液中,充分溶解,配置成0.8mg/mL的BSA溶液;
B2、向1mlB1的产物中加入浓度为40mg/mL的偶联剂EDC溶液80ul,于33℃温度下,反应0.8h;
B3、向B2的产物中加入浓度为0.8mg/mL的吖啶酯溶液50uL,于33℃温度下,反应0.8h;
B4、向B3的产物中加入浓度为8mg/mL的甘氨酸溶液1mL,于33℃温度下,反应26min;
B5、使用20KD超滤管,对B4的产物进行超滤,转速7000rpm,时间25min,除去未结合的过量的吖啶酯。
S3、Fc结合蛋白与cTnI单抗反应,包括以下步骤:
所述步骤S3,包括以下步骤:
C1、将吖啶酯标记的cTnI单抗和吖啶酯标记的Fc结合蛋白按摩尔比为1:3进行混合,于33℃温度下,反应26min。
S4、分离未结合的BSA,包括以下步骤。
所述步骤S4,包括以下步骤:
D1、使用分子筛层析法,分离纯化cTnI-Fc结合蛋白复合物。
实施例4:一种肌钙蛋白I检测试方法,包括以下步骤。
S1、Fc结合蛋白进行吖啶酯标记。
所述步骤S1,包括以下步骤:
A1、取2.0mgFc结合蛋白溶解于1mlMES溶液中,充分溶解,配置成2.0mg/mL的BSA溶液;
A2、向1mlA1的产物中加入浓度为50mg/mL的偶联剂EDC溶液100ul,于37℃温度下,反应1h;
A3、向A2的产物中加入浓度为2.0mg/mL的吖啶酯溶液50uL,于37℃温度下,反应1h;
A4、向A3的产物中加入浓度为10mg/mL的甘氨酸溶液1mL,于37℃温度下,反应30min;
A5、使用30KD超滤管对A4的产物进行超滤,转速8000rpm,时间30min,除去未结合的过量的吖啶酯。
S2、cTnI单抗进行吖啶酯标记,包括以下步骤。
所述步骤S2,包括以下步骤:
B1、取1mgcTnI单抗溶解于1mlMES溶液中,充分溶解,配置成1mg/mL的BSA溶液;
B2、向1mlB1的产物中加入浓度为50mg/mL的偶联剂EDC溶液100ul,于37℃温度下,反应1h;
B3、向B2的产物中加入浓度为1mg/mL的吖啶酯溶液50uL,于37℃温度下,反应1h;
B4、向B3的产物中加入浓度为10mg/mL的甘氨酸溶液1mL,于37℃温度下,反应30min;
B5、使用30KD超滤管,对B4的产物进行超滤,转速8000rpm,时间30min,除去未结合的过量的吖啶酯。
S3、Fc结合蛋白与cTnI单抗反应,包括以下步骤:
所述步骤S3,包括以下步骤:
C1、将吖啶酯标记的cTnI单抗和吖啶酯标记的Fc结合蛋白按摩尔比为1:5进行混合,于37℃温度下,反应30min。
S4、分离未结合的BSA,包括以下步骤。
所述步骤S4,包括以下步骤:
D1、使用分子筛层析法,分离纯化cTnI-Fc结合蛋白复合物。
如图1所示,对照试剂为目前市场上肌钙蛋白I检测灵敏度最高的产品,雅培超敏肌钙蛋白I测定试剂盒。实施1-4为使用本发明专利技术对吖啶酯标记物进行改造的试剂。对照组对20例临床心肌损伤病例检查结果中有8例样本检测结果为0,而实施例对20例临床心肌损伤病例样本检测结果均能检测出结果。
如图2所示,功能灵敏度是能够准确进行定量检测的下限,一般认为在测量较低浓度样本时,重复测试20次,CV<20%的最低浓度点。下表为对照试剂和实施例同时测试0.03ng/mL浓度样本20次的CV情况,0.03ng/mL是对照试剂宣称的最低浓度点。由数据可以看出,实施例在该浓度时,CV只有6%,说明实施例分析灵敏度浓度值要低于0.03ng/mL,灵敏度高于对照试剂。
以上对本发明的数个实施例进行了详细说明,但所述内容仅为本发明的较佳实施例,不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明申请范围所作的均等变化与改进等,均应归属于本发明的专利涵盖范围之内。
Claims (8)
1.一种肌钙蛋白I检测试方法,其特征在于:包括以下步骤:
S1、Fc结合蛋白进行吖啶酯标记:
S2、cTnI单抗进行吖啶酯标记;
S3、Fc结合蛋白与cTnI单抗反应;
S4、分离未结合的BSA。
2.根据权利要求1所述的肌钙蛋白I检测试方法,其特征在于:所述步骤S1,包括以下步骤:
A1、取Fc结合蛋白溶解于MES溶液中,充分溶解,配置成0.5-2.0mg/mL的BSA溶液;
A2、向A1的产物中加入偶联剂EDC溶液;
A3、向A2的产物中加入吖啶酯溶液;
A4、向A3的产物中加入甘氨酸溶液;
A5、对A4的产物进行超滤,除去未结合的过量的吖啶酯。
3.根据权利要求2所述的肌钙蛋白I检测试方法,其特征在于:
在步骤A1中,所述Fc结合蛋白的质量为0.5-2.0mg,所述MES溶液的体积为1ml;
在步骤A2中,所述Fc结合蛋白溶液的体积为1ml,所述偶联剂EDC的浓度为10-50mg/mL,所述偶联剂EDC的体积为50-100ul,于25-37℃温度下,反应0.5-1h;
在步骤A3中,所述吖啶酯溶液的浓度为0.5-2.0 mg/mL,所述吖啶酯溶液的体积为50uL,于25-37℃温度下,反应0.5-1h;
在步骤A4中,所述甘氨酸溶液的浓度为5.0-10mg/mL,所述甘氨酸溶液的体积为1mL,于25-37℃温度下,反应20-30min;
在步骤A5中,使用10-30KD超滤管,转速6000-8000rpm,时间15-30min。
4.根据权利要求1所述的肌钙蛋白I检测试方法,其特征在于:所述步骤S2,包括以下步骤:
B1、取cTnI单抗溶解于MES溶液中,充分溶解,配置成0.5-1mg/mL的BSA溶液;
B2、向B1的产物中加入偶联剂EDC溶液;
B3、向B2的产物中加入吖啶酯溶液;
B4、向B3的产物中加入甘氨酸溶液;
B5、对B4的产物进行超滤,除去未结合的过量的吖啶酯。
5.根据权利要求4所述的肌钙蛋白I检测试方法,其特征在于:
在步骤B1中,所述cTnI单抗的质量为0.5-1mg,所述MES溶液的体积为1ml;
在步骤B2中,所述cTnI单抗溶液的体积为1ml,所述偶联剂EDC的浓度为10-50mg/mL,所述偶联剂EDC的体积为50-100ul,于25-37℃温度下,反应0.5-1h;
在步骤B3中,所述吖啶酯溶液的浓度为0.5-1mg/mL,所述吖啶酯溶液的体积为50uL,于25-37℃温度下,反应0.5-1h;
在步骤B4中,所述甘氨酸溶液的浓度为5.0-10mg/mL,所述甘氨酸溶液的体积为1mL,于25-37℃温度下,反应20-30min;
在步骤B5中,使用10-30KD超滤管,转速6000-8000rpm,时间15-30min。
6.根据权利要求1所述的肌钙蛋白I检测试方法,其特征在于:所述步骤S3,包括以下步骤:
C1、将吖啶酯标记的cTnI单抗和吖啶酯标记的Fc结合蛋白进行混合、反应。
7.根据权利要求6所述的肌钙蛋白I检测试方法,其特征在于:
在步骤C1中,吖啶酯标记的cTnI单抗和吖啶酯标记的Fc结合蛋白的摩尔比为1:1~1:5,于25-37℃温度下,反应20-30min。
8.根据权利要求1所述的肌钙蛋白I检测试方法,其特征在于:所述步骤S4,包括以下步骤:
D1、使用分子筛层析法,分离纯化cTnI-Fc结合蛋白复合物。
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