CN116124753B - 基于荧光转化能力的微流控定量检测试剂盒及方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于体外诊断与免疫检测技术领域，提出一种基于荧光转化能力的微流控定量检测试剂盒，包括载体，所述载体上沿样本流动方向依次设置有标记区、检测区，所述标记区包被有通过荧光素A标记的抗体，所述检测区包被有通过荧光素B标记的抗体，所述荧光素B的发射光谱与所述荧光素A的激发光谱重叠，通过预先测量荧光素B荧光强度，可以优先测定其芯片的包被量，消除不同芯片之间在包被过程中的产生的批间差，可以实现更加准确的定量。

Description

基于荧光转化能力的微流控定量检测试剂盒及方法
技术领域
本发明属于体外诊断及免疫检测技术领域，特别涉及一种基于荧光转化能力的微流控定量检测试剂盒及方法。
背景技术
荧光免疫微流控是一种新型精准POCT检测方法，此方法是将微流控技术和荧光免疫分析的原理相融合，是在胶体金免疫层析基础上的技术拓展，特点是用荧光微球标记，基于微流控原理，实现抗原-抗体的结合、游离标记物分离、荧光信号检测、检测结果的输出等。
微流控芯片通常为透光度较高的PMMA材质组成，微流控芯片中所有的试剂均预先包被并干燥于一张PMMA材质的芯片基片上，与含有通道结构的芯片盖片嵌合后形成完整的微流控芯片。为了保证准确定量，芯片包被量的一致性以及芯片的包被效率均是需要解决的主要问题，因此，采用全自动流水线进行芯片的制备，同时进行严格的质量控制。但是无论是直接包被还是间接包被均可能导致包被量的不同，虽然为全自动的包被系统，但其中仍有很多不可控的因素，导致最终检测结果出现偏差。在微流控芯片制备中，因包被材料差异或包被过程差异，芯片之间存在包被抗原/抗体分子数量的差异，最终导致微流控芯片存在一定差异性，致使在定量分析中，不能做到芯片检测的标准化，难于获得良好精密度和准确度。
发明内容
本发明针对现有荧光免疫微流控检测方法的不足，提供一种基于荧光转化能力的微流控定量检测试剂盒及方法，利用该方法可消除不同芯片之间在包被过程中的产生的批间差，使检测结果更加准确。
为实现上述目的，本发明的技术方案是这样实现的，一种基于荧光转化能力的微流控定量检测试剂盒，包括载体，所述载体上沿样本流动方向依次设置有标记区、检测区，所述标记区包被有通过荧光素A标记的抗体，所述检测区包被有通过荧光素B标记的抗体，所述荧光素B的发射光谱与所述荧光素A的激发光谱重叠。
所述载体为微流控芯片，所述微流控芯片包括微流控基片及压合于微流控基片上的微流控盖片，基片和盖片围合形成微通道，所述微通道一端与盖片上开设的加样孔连通，另一端与废液收集池连通，微流控基片的微通道内沿样本的流动方向依次设有标记区、检测区，荧光素A标记一种抗体，包被在芯片的标记区，荧光素B标记一种抗体，包被在芯片的检测区。
一种基于荧光转化能力的微流控定量检测方法，包括至少如下步骤：
1）获取校准函数：通过对预先包被在检测区，经过荧光素B标记的不同含量的抗体进行荧光检测，根据包被不同抗体分子量得出的荧光强度-抗体包被量的曲线,以荧光素B的荧光信号强度为纵坐标、抗体包被量为横坐标，获取标准函数T1；通过使含有靶分析物系列浓度标准品流经检测区所测得的剂量反应曲线，以检测区的荧光信号强度为纵坐标、标准品溶液浓度为横坐标，获取校准函数T2；
2）加入待测样本之前，将所述载体放入检测仪中，读取荧光素B的荧光信号强度Y0，通过校准函数T1评估包被抗体的分子数量；
3）加入待测样本，按标准操作检测，通过抗原-抗体结合致使荧光素A靠近荧光素B，荧光素B的发射光被荧光素A部分吸收，反应结束后继续读取荧光素B的荧光信号强度Y，或读取荧光素A的荧光信号强度Y’；
4）第二次检测如读取荧光素B的荧光信号强度，需计算荧光衰减Y0-Y作为信号值，经校准函数T2获得未知样本浓度；
第二次检测如读取荧光素A的荧光信号强度，则直接使用读取的荧光强度Y’作为信号值，经校准函数T2获得未知样本浓度。
通过上述技术方案得到的一种基于荧光转化能力的微流控定量检测试剂盒及方法，其有益效果是：
1、本发明将一种荧光素标记的抗体包被在芯片的检测区，在检测过程中优先将芯片放入检测仪中读取其荧光强度，可以优先测定其芯片的包被量，从而消除不同芯片之间在包被过程中的产生的批间差，可以实现更加准确的定量。
本发明采用两种荧光素分别位于检测区和标记区，加入样本后，抗原抗体结合，两种荧光素相遇，发生荧光抑制或荧光转化，其抑制强度或转化强度和抗原抗体结合强度相关，可代替参考区，发挥精密度校准的作用。
附图说明
图1是根据本发明的一个技术方案提出的检测心肌肌钙蛋白I（cTnI）的试剂盒结构；
图2是应用图1中试剂盒中对荧光素PE荧光强度的第一次检测结果；
图3是应用图1中试剂盒的检测过程；
图4是应用图1中试剂盒中对荧光素PE荧光强度的第二次检测结果。
具体实施方式
需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
除有定义外，以下实施例中所用的技术术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。以下实施例中所用的试验试剂，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
本发明总体来说涉及免疫检测技术领域，使用两种特定的荧光素分别标记抗体，其中一种荧光素B的发射光谱与另一种荧光素A的激发光谱重叠，通过对荧光素的定量检测，则可消除不同芯片之间在包被过程中的产生的批间差，可以实现更加准确的定量，具体的，使荧光素B标记的抗体预先包被于芯片的检测区，在加入样本反应之前预先将芯片放入仪器中进行检测，即主要通过检测其荧光素B的荧光强度，然后通过校准函数将其转化为抗体包被量，评估包被抗体分子数量。
下面结合实施例和附图对本发明作进一步的解释说明，可以理解的是，本发明并不限于描述的具体实施方式。
本发明提出一种基于荧光转化能力的微流控定量检测试剂盒，包括载体，所述载体上沿样本流动方向依次设置有标记区L、检测区T，所述标记区L包被有通过荧光素A标记的抗体，所述检测区T包被有通过荧光素B标记的抗体，所述荧光素B的发射光谱与所述荧光素A的激发光谱重叠。
不同的荧光素有其特定的激发光谱和发射光谱，所以在进行实验分析时可以同时标记发射不同波长荧光的荧光素，这些荧光素被激发后发射的荧光会被不同的荧光通道所接收，使用特定波长的激光照射荧光素B，使其发射出荧光，当荧光素A靠近荧光素B时，由于荧光素B的发射光谱与所述荧光素A的激发光谱重叠，荧光素B的发射光被荧光素A部分吸收，荧光素B的荧光强度受到抑制，转化为荧光素A的荧光强度。
所述载体可以选用依靠毛细管力驱动样本流动的微流控芯片或其他移动控制器驱动的样本流动的芯片。在一个实施方案中，所述载体选用微流控芯片，无需外力驱动。
具体的，微流控芯片包括微流控基片及压合于微流控基片上的微流控盖片，基片和盖片围合形成微通道，所述微通道一端与盖片上开设的加样孔连通，另一端与废液收集池连通，微流控基片的微通道内沿样本的流动方向依次设有标记区L、检测区T，荧光素A标记一种抗体，包被在芯片的标记区L，而将荧光素B标记一种抗体，包被在芯片的检测区T。
另一方面，本发明还提供了利用上述技术方案中的试剂盒定量检测待检抗原含量的方法，包括至少如下步骤：
1）获取校准函数：通过对预先包被在检测区，经过荧光素B标记的不同含量的抗体进行荧光检测，根据包被不同抗体分子量得出的荧光强度-抗体包被量的曲线,以荧光素B的荧光信号强度为纵坐标、抗体包被量为横坐标，获取标准函数T1；通过使含有靶分析物系列浓度标准品流经检测区所测得的剂量反应曲线，以检测区的荧光信号强度为纵坐标、标准品溶液浓度为横坐标，获取校准函数T2；
2）加入待测样本之前，将所述载体放入检测仪中，读取荧光素B的荧光信号强度Y0，通过校准函数T1评估包被抗体的分子数量；
3）加入待测样本，按标准操作检测，通过抗原-抗体结合致使荧光素A靠近荧光素B，荧光素B的发射光被荧光素A部分吸收，反应结束后继续读取荧光素B的荧光信号强度Y，或读取荧光素A的荧光信号强度Y’；
4）第二次检测如读取荧光素B的荧光信号强度，需计算荧光衰减Y0-Y作为信号值，经校准函数T2获得未知样本浓度；
第二次检测如读取荧光素A的荧光信号强度，则直接使用读取的荧光强度Y’作为信号值，经校准函数T2获得未知样本浓度。
由于在芯片包被过程中会有很多不可控因素，因此无法保证不同芯片之间包被量的一致性，进而无法准确的定量，所以将芯片在加入样本前要进行检测，主要是检测荧光素B标记抗体在芯片上的包被量，即主要是为了校准不同芯片之间由于包被过程所产生的包被误差。
在加入样本按标准化操作进行检测时，为获得准确的定量结果，可采用两种方法进行检测：第一种方法是在样本反应后直接检测荧光素B的荧光强度，由于其发射光波长与荧光素A的激发光波长相重合，故荧光素B的发射光会有部分被荧光素A所吸收，同时由于不同样本中待检抗原/抗体的含量不同，进而导致荧光素B的强度受到抑制的程度不同，因此在读取荧光素B的荧光强度后，需计算荧光衰减Y0-Y并将其作为信号值，经校准函数T2获得未知样本的浓度；第二种方法是在样本反应后直接检测荧光素A的荧光强度，将读取的荧光强度作为信号值Y’，使用校准函数T2获得未知样本的浓度，但其缺点是成本较高，因其需要读取两种不同，故需要检测仪器同时具备两种激光器。
在通常情况下，为消除芯片检测过程的误差，芯片内部会特定设置参考区R，分别读取检测区T和参考区R信号值，通过T/R 比值作为Y轴与校准品（样本）浓度值建立函数关系，而本技术发明采用两种荧光素分别位于检测区T和标记区L，样本加入前直接读取检测区获得包被分子数；加入样本后，抗原抗体结合，两种荧光素相遇，发生荧光抑制或荧光转化，其抑制强度或转化强度和抗原抗体结合强度相关，因此上述设计可代替参考区，发挥精密度校准的作用。为此，基于此技术发明的微流控芯片无需设置参考区。
实施例
图1-图4显示的是应用本发明中的其中一个技术方案检测心肌肌钙蛋白I（cTnI）的试剂盒及检测过程。
以心肌肌钙蛋白I（cTnI）为例，选择一对cTnI单克隆抗体，分别标记荧光素PE和荧光素Cy5，将PE标记的抗体包被于芯片的检测区，Cy5荧光素标记的抗体置于芯片的标记区。
在检测时，首先将芯片放入检测仪中用488 nm的激发光激发并读取PE的荧光强度Y0，通过获得的信号值，使用校准函数T1获得荧光素PE标记的抗体中的分子数；然后在加样孔加入一定体积的待测样本，样本首先用预干燥的样本缓冲液充分溶解，然后在控制器内样本与样本缓冲液充分作用，降低血液样本中的基质干扰，伴随液流将预干燥的荧光抗体充分溶解，在标记区内样本与荧光素Cy5标记的抗体充分混匀形成待检抗原-标记抗体的免疫复合物，随后免疫复合物通过预包被标记荧光素PE抗体的检测区，最终形成双抗体夹心复合物；剩余样本持续洗涤反应通道，最终全部收集在废液区，通道内的液体停止流动从而终止免疫反应。
将反应结束的芯片放入检测仪内，用488 nm的激发光激发并再次测定荧光素PE的荧光强度Y，由于荧光素PE被激发而产生发射光谱与标记检测抗体的荧光素Cy5的激发光谱相重叠，则荧光素PE会有部分发射光被荧光素Cy5所吸收，因此荧光素PE的荧光强度转换为荧光素Cy5的荧光强度，计算荧光素PE的荧光衰减Y0-Y将其作为信号值，信号值随着待测样本中抗原含量的增加而降低，通过获得的信号值，使用校准函数T2获得待检抗原的浓度值。
心肌肌钙蛋白I是心肌损伤坏死的血清标志物，对急性心肌梗死的诊断和危险分层有重要的临床意义，此项目日常应用于急诊科室，要求检测试剂具有较快的检测速度、较高的分析灵敏度和分析精密度，因此此种微流控免疫荧光分析能够较好的满足检测要求。
上述技术方案仅体现了本发明技术方案的优选技术方案，本技术领域的技术人员对其中某些部分所可能做出的一些变动均体现了本发明的原理，属于本发明的保护范围之内。

Claims (2)

1.一种基于荧光转化能力的微流控定量检测方法，应用一种基于荧光转化能力的微流控定量检测试剂盒进行检测，所述试剂盒包括载体，所述载体上沿样本流动方向依次设置有标记区、检测区，所述标记区包被有通过荧光素A标记的抗体，所述检测区包被有通过荧光素B标记的抗体，所述荧光素B的发射光谱与所述荧光素A的激发光谱重叠；
其特征在于，包括至少以下步骤：
1）获取校准函数：通过对预先包被在检测区，经过荧光素B标记的不同含量的抗体进行荧光检测，根据包被不同抗体分子量得出的荧光强度-抗体包被量的曲线,以荧光素B的荧光信号强度为纵坐标、抗体包被量为横坐标，获取标准函数T1；通过使含有靶分析物系列浓度标准品流经检测区所测得的剂量反应曲线，以检测区的荧光信号强度为纵坐标、标准品溶液浓度为横坐标，获取校准函数T2；
2）加入待测样本之前，将所述载体放入检测仪中，读取荧光素B的荧光信号强度Y0，通过校准函数T1评估包被抗体的分子数量；
3）加入待测样本，按标准操作检测，通过抗原-抗体结合致使荧光素A靠近荧光素B，荧光素B的发射光被荧光素A部分吸收，反应结束后继续读取荧光素B的荧光信号强度Y，或读取荧光素A的荧光信号强度Y’；
4）第二次检测如读取荧光素B的荧光信号强度，需计算荧光衰减Y0-Y作为信号值，经校准函数T2获得未知样本浓度；
第二次检测如读取荧光素A的荧光信号强度，则直接使用读取的荧光强度Y’作为信号值，经校准函数T2获得未知样本浓度。
2.根据权利要求1所述的微流控定量检测方法，其特征在于，所述载体为微流控芯片，所述微流控芯片包括微流控基片及压合于微流控基片上的微流控盖片，基片和盖片围合形成微通道，所述微通道一端与盖片上开设的加样孔连通，另一端与废液收集池连通，微流控基片的微通道内沿样本的流动方向依次设有标记区、检测区，荧光素A标记一种抗体，包被在芯片的标记区，荧光素B标记一种抗体，包被在芯片的检测区。
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