CN114486822A - 一种用fret技术检测抗原抗体相互作用的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于化学发光生物技术领域，特别涉及一种荧光共振能量转移技术，应用于抗原抗体亲和力相互作用的检测。本发明提供的一种用FRET检测技术是，选用异硫氰酸荧光素(FITC)和罗丹明B(Rhodamine B)做荧光标记物，将罗丹明B与偶联剂EDC/NHS预处理活化基团羧基，将荧光素基团与抗原抗体发生标记反应，将标记好的样品分别经Sephadex G‑25筛选纯化，将带有标记的抗原抗体在酶标板中反应，利用FRET技术测定其荧光强度，检测其相互作用的发生。本发明提供的检测技术旨在利用荧光标记技术搭建一个平台，用于抗原抗体相互作用的筛选检测，且不需多次孵育、洗涤循环，可直接在溶液中反应检测的便捷技术，可应用于抗体的制备、免疫治疗的研究、蛋白功能的检测等方面。
Description
技术领域
本发明属于化学发光生物技术领域，特别涉及一种荧光共振能量转移技术，应用于抗原抗体亲和力相互作用的检测。
背景技术
荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer，FRET)是一种检测活体中生物大分子在纳米级距离中是否存在直接相互作用的技术，它是距离很近的两个荧光分子间产生的一种能量转移的现象。当供体荧光分子的发射光谱与受体荧光分子的吸收光谱仪重叠，两分子的距离在10nm范围内，此时供体的荧光发生淬灭，而受体发射的荧光却大大增强，发生一种非放射性能量转移。FRET技术应用广泛，可定时、定量、定位检测在生理条件下蛋白质-蛋白质间相互作用规律，已在细胞内分子间相互作用、细胞膜蛋白及信号通路、酶活性检测等方面应用成熟，具有实时动态研究的特性，在生命科学领域中有巨大应用前景。
荧光标记技术(fluorescence technique)，所依赖的化合物称为荧光素，荧光素是具有共轭双键体系化学结构的化合物，该技术是一种利用荧光素共价结合或物理吸附在所要研究的分子上，受到紫外光或蓝紫光激发恢复基态时发出荧光，从而提供被研究对象信息一门技术。荧光标记技术，无放射物污染，操作简便，对所研究对象副作用小，使得其在蛋白质功能研究、药物筛选等多项研究领域中日趋广泛，也常常应用于标记抗原或抗体对其结合反应进行检测。在众多荧光修饰的研究内容中，较常选用的荧光素为异硫氰酸荧光素(FITC)，其具有较高的活性，在固相合成过程中引入该种荧光基团相对于其他荧光素要更容易，并且反应过程中不需要加入活化试剂。
抗原抗体反应(antigen-antibody reaction)是一种抗原与相应抗体在体内或体外发生的特异性结合反应，其主要有四点特性：特异性、比例性、可逆性、阶段性。随着免疫学的不断发展，目前，免疫检测抗原抗体反应技术不断进步，在肿瘤诊断、特异性治疗、药物筛选方面应用广泛。常用的免疫检测方法有免疫标记技术(酶联免疫吸附实验，ELISA)、凝集反应、沉淀反应等，多数技术需要孵育/洗涤步骤多次循环重复，需要将抗原或抗体固定封闭，工作繁杂时间长，且容易出现操作错误影响实验结果。相对而言，一个关键的技术挑战就是研发一种无需孵育洗涤、无需在固体表面固定的简单易操作的检测方法。
发明内容
本发明目的在于利用化学荧光标记技术搭建一个平台，用于抗原抗体相互作用的筛选检测，且不需多次孵育、洗涤循环，不需将待测物固定于固体表面，直接在液体中反应检测的便捷技术，可应用于抗体的制备、免疫治疗的研究、蛋白功能的检测等生命科学领域。
为达到上述发明目的，本发明提供的一种用FRET检测抗原抗体相互作用的技术方案是，选用异硫氰酸荧光素(FITC)和罗丹明B(Rhodamine B)做荧光标记物质，将罗丹明 B与偶联剂EDC/NHS预处理活化基团羧基，将荧光素基团与抗原抗体发生标记反应，将标记好的溶液分别经Sephadex G-25筛选得到FITC-抗体和RB-抗原，将带有标记的抗原抗体在酶标板中反应，利用FRET技术检测其相互作用。具体包括以下步骤：
步骤一：选择荧光素基团时，应保证供体荧光分子的发射光谱与受体荧光分子的吸收光谱重叠，则两分子足够近的距离时可发生荧光共振能量转移现象。查明FITC荧光素激发波长为 495nm，发射波长为520-530nm；Rhodamine B激发波长为530-550nm，发射波长为580-600nm.
步骤二：荧光素基团羧基活化，FITC标记容易不需加入活化试剂，将FITC粉末溶于DMSO中配制成浓度为1mg/ml的溶液；将RB溶于20mMPBS(含15mMNacl)磷酸盐缓冲液和MES 溶液的混合溶液中配制成1mg/ml的溶液，按照适量的摩尔比加入EDC和NHS，室温避光摇床孵育4小时，活化罗丹明B中的羧基。
步骤三：荧光素标记蛋白，取FITC溶液和活化好的RB溶液各150-200ul，加入到1mg/ml的抗原/抗体中，混匀，标记反应条件：4℃，摇床反应7-12小时。
步骤四：Sephadex G-25筛选，提前一天装柱过夜沉降，用5-10倍柱体积的双蒸水清洗柱体，再用5-10倍柱体积的20mMPBS(含15mMNacl)磷酸盐缓冲液润洗柱子，分别加入标记荧光素的抗原抗体溶液过柱，根据该柱原理，标记荧光素的蛋白分子量＞未标记蛋白＞游离荧光素，标记荧光素的蛋白先从柱下流出。
步骤五：FRET检测，先检测495nm激发，520-530nm发射波长下，FITC-抗体的荧光光谱，再检测抗原抗体反应混合物的荧光光谱，比较两者的荧光强度，判断是否发生能量转移。
优选的：步骤一：FITC荧光素激发波长为495nm，发射波长为530nm；Rhodamine B激发波长为530nm，发射波长为595nm。
步骤二中，羧基预处理活化，取1mgFITC粉末溶于1mlDMSO中配制成浓度为1mg/ml的溶液；将1mgRB溶于20mMPBS(含15mMNacl)磷酸盐缓冲液和MES溶液的混合溶液 1ml中配制成1mg/ml的溶液，按照摩尔比RB∶EDC∶NHS＝1∶1.2∶1.2加入EDC和NHS，室温避光孵育4小时。
步骤三中，荧光素标记蛋白，将待交联的抗体与交联反应液(碳酸钠-碳酸氢钠盐溶液)中4℃透析三次，至PH9.0。取150ulFITC-DMSO溶液加入浓度为1mg/ml的抗体中，取165ul活化后的RB溶液，加入到1mg/ml的抗原中，混匀，4℃，摇床反应7-12小时。
按照Yeasen公司提供的异硫氰酸荧光素FITC的说明书要求，检测偶联物中荧光素和蛋白的比值(F/P)可通过测定495nm和280nm处的吸光值来鉴定，F/P应位于0.3-1.0。F/P摩尔比计算公式为：Molar F/P＝[2.77×A495]/[A280-(0.35×A495)]。
步骤四中，Sephadex G-25筛选，装柱过夜，用5倍柱体积的双蒸水清洗柱体，再用5倍柱体积的20mMPBS(含15mMNacl)磷酸盐缓冲液平衡柱子，分别加入标记荧光素的抗原抗体溶液过柱，按照12r/s流速过柱。
步骤五中，多功能酶标仪FRET检测，在96孔板(避光)中第一个孔加入100ulFITC-抗体，检测495nm激发，530nm发射波长下荧光光谱及强度；在96孔板第二个孔加入100ulFITC-抗体和RB-抗原混合溶液，室温避光反应20min，检测495nm激发，580nm发射波长下荧光光谱及强度。
本发明提供的FRET技术检测抗原抗体相互作用的方法，采用光信号可对待测物进行实时动态研究，可定时、定位、定量、无损伤的检测蛋白质-蛋白质间相互作用，方法中化学成分及用量明确，检测时效快，成功率高。
本发明提供的FRET技术检测抗原抗体相互作用的方法，其具有迅速、灵敏的特征，能够方便的将荧光素基团标记在多种抗原抗体上，适应性广泛，应用全面，这种测定模式可在溶液中直接进行，较传统酶联免疫吸附测定减少了多个固定、孵育、洗涤步骤，时效快准确率高，且价格便宜。该检测技术可应用与抗体的制备、免疫治疗药物筛选、蛋白质功能学研究等方面，方法新颖、效果优良。
本发明所述的活化交联摩尔比RB∶EDC∶NHS＝1∶1.2∶1.2，该摩尔比例是通过多次不同摩尔比交联进行标记实验验证所确定的最优比例。
附图说明
图1是FRET技术检测抗原抗体相互作用示意图
图2是FITC和RB荧光素化学结构图
图3是FRET检测荧光光谱
图4是荧光共振能量转移率统计图
具体实施方式
以下结合实例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并未用于限定本发明的范围，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
选用降钙素原PCT(procalcitonin)作为检测抗原和PCT抗体作为检测抗体进行实施案例陈述。
实施例1：将预处理活化荧光素基团与待测蛋白标记
1.配制20mMPBS(含15mMNacl)磷酸盐缓冲液：1LNa2HPO4(12H2O)呈碱性和1LNaH2PO4(2H2O)呈酸性，混合在一起，调制PH至7.2，总计2L，按照2L*15mMNacl＝0.03molNacl 加入氯化钠粉末，将配制好的溶液经滤纸过滤备用。
2.预处理罗丹明B荧光素：取1mg罗丹明B粉末溶于1ml 20mMPBS(含15mMNacl)磷酸盐缓冲液和MES溶液的混合溶液中，两种溶液的比例为1∶1，配制成1mg/ml的RB溶液，按照摩尔比RB∶EDC∶NHS＝1∶1.2∶1.2比例混合，室温避光活化4小时。
3.罗丹明B与PCT抗原标记：将纯化出的浓度为1mg/ml的PCT抗原，取1ml用20mMPBS (含15mMNacl)溶液4℃，隔3小时透析一次，总计三次。取165ul活化后的RB溶液加入透析后的抗原溶液中，4℃，避光反应8h。
4.FITC与PCT抗体标记：FITC易于标记IgG所以反应前不需要加入活化剂。将纯化好的浓度为PCT抗体与交联反应液(碳酸钠-碳酸氢钠盐溶液)于4℃透析三次，至FITC标记适应PH9.0。取150ulFITC-DMSO溶液加入浓度为1mg/ml的抗体1ml中，避光4℃反应 8h。
实施例2：Sephadex G-25分子筛筛选纯化
1.装柱：提前一天装柱过夜，将溶胀的葡聚糖凝胶装入直径1.5cm的圆形玻璃柱，液体高度约12cm，4℃沉降过夜。
2.柱平衡：用80-100ml双蒸水过柱洗去75％的乙醇溶液，再用80-100ml20mMPBS(含15mMNacl)磷酸盐溶液平衡柱子。
3.上样：上样过程中注意避光，当柱内平衡液与凝胶最上层齐平时加入样品。
4.洗脱：用平衡液作为洗脱液洗脱样品，标记成功，可见洗脱液加入后柱内分为上中下三种颜色，上层为颜色较深的荧光素，中间为无色未标记的PCT抗原/抗体，下层为颜色适中的荧光素-蛋白溶液。用1.5mlEP管收集洗脱液，用于FRET检测。
实施例3：多功能酶标仪检测荧光强度
1.FITC-PCT抗体标记率检测：取100ul筛选后的FITC-PCT抗体溶液于比色皿中，通过测定495nm和280nm处的吸光值检测，经F/P摩尔比计算公式：Molar F/P＝[2.77×A495] /[A280-(0.35×A495)]计算，比值约为1说明效率较高。
2.FRET技术检测PCT抗原-抗体相互作用：利用多功能酶标仪，在96孔板中的一个孔加入 100ulFITC-PCT抗体，检测495nm激发，530nm发射波长下荧光光谱及强度；在96孔板第二个孔加入100ulFITC-PCT抗体和100ulRB-PCT抗原溶液，混匀，室温避光反应20min，检测495nm激发，580nm发射波长下荧光光谱及强度。
3.经统计学分析其荧光光谱和荧光强度，计算荧光共振能量转移率，若发生FRET现象，比较单独的FITC-抗体，抗原-抗体在530nm发射波长下荧光强度大幅下降，其在495nm激发下，在595nm发射波长下可检测到荧光强度且较高，通过计算FRET能量转移效率判断PCT抗原抗体发生了相互作用。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，不应理解为对本发明的限制。对于本领域的技术人员来说，在不背离本发明精神和实质的情况下对本发明方法、步骤或条件所做的修改和替换，这些修改和替换也应视为本发明的保护范围。
Claims (9)
1.一种用FRET检测抗原抗体相互作用的技术，其中，所述检测技术至少包括：
a)荧光素
b)偶联剂
c)抗原
d)抗体
e)葡聚糖凝胶柱
f)多功能酶标仪
其特征在于，包括以下步骤：步骤一、将所述技术中所述荧光素基团活化；步骤二，将所述荧光素基团与所述技术所述的待测抗原抗体标记；步骤三，将所述分别标记荧光素的抗原抗体经葡聚糖凝胶柱筛选纯化。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述步骤三之后还包括：步骤四，将所述技术所述带有荧光素的抗原抗体进行FRET检测，确定其抗原决定簇与抗体结合位点处于紧密的接触状态，发生相互作用。
3.如权利要求1所述技术，所述荧光素基团活化，其特征在于，将所述荧光素基团与偶联剂按照一定摩尔比预处理活化荧光素中的羧基，其中所述的偶联剂为N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和2-吗啉乙磺酸(MES)，所述的荧光素基团、EDC、NHS各制剂反应摩尔比为：1∶1.2∶1.2，根据此浓度比例活化的荧光素基团在标记实验上效果显著。
4.如权利要求1-3的任一项所述的技术方法，其特征在于，所述标记抗体的荧光素为异硫氰酸荧光素(FITC)，所述标记抗原的荧光素为罗丹明B(Rhodamine B)，其特征优势在于所述技术中所述的荧光素与所述抗原抗体标记后不影响抗体与抗原结合。
5.如权利要求4所述荧光素基团与所述抗原抗体发生交联反应，其特征在于，所述荧光素FITC与抗体反应，所述荧光素Rhodamine B与抗原反应，交联反应条件为4℃，6-8h。
6.如权利要求1-5所述技术方法，其特征在于，所述交联反应后的FITC-抗体/RB-抗原溶液经所述葡聚糖凝胶柱筛选，筛选除去未标记的蛋白和游离的荧光素，降低FRET检测背景值。
7.如权利要求6所述技术，所述FRET检测抗原抗体相互作用，其特征在于，所述荧光共振能量转移的发生条件为比色皿中的抗原抗体，彼此之间的距离<10nm。
8.如权利要求7所述技术，所述FRET检测抗原抗体相互作用，其特征在于，所述FRET检测条件为激发光波长(Excitation)为495nm，发射光(Emission)波长为595nm。
9.根据权利要求1-8的任一项所述，一种用FRET检测抗原抗体相互作用的技术，可作为在活细胞生理条件下检测蛋白质相互作用的创新技术，应用于抗原抗体以亲和力的作用方式结合在一起的检测。
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