CN116179737A - 用于检测syhtoh2转基因大豆品系的引物、探针、试剂盒及方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于分子生物学技术领域，公开了一种用于检测SYHTOH2转基因大豆品系的引物、探针、试剂盒及方法。本发明基于SYHTOH2转基因大豆边界序列进行引物和探针的设计，所建立的检测方法具有高效、准确、快速的特点，能够应用于SYHTOH2转基因大豆品系及其产品的定量检测，为检验监管工作和相关部门行政执法提供强有力的支撑，并为规范相关企业的生产行为和保障我国粮食安全等方面具有重大的意义。

Description

用于检测SYHTOH2转基因大豆品系的引物、探针、试剂盒及 方法

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，尤其涉及一种用于检测SYHTOH2转基因大豆品系的引物、探针、试剂盒及方法。

背景技术

植物转基因，是将人工分离和修饰过的外源基因导入到需要改良的植物体中，使之产生新的性状，从而达到改良生物的目的。通过转基因技术可培育高产、优质、抗病毒、抗虫、抗寒、抗旱、抗涝、抗盐碱、抗除草剂等特性的作物新品种，以减少对农药、化肥和水的依赖，降低农业成本，大幅度地提高单位面积的产量，改善食品的质量，缓解世界粮食短缺的矛盾。

但伴随着转基因商业化的迅猛发展，有关转基因食品安全性的争论备受关注，呈现愈演愈烈的趋势。争议的焦点主要集中在5个方面：毒性问题，过敏反应、营养问题、对抗生素的抵抗作用和对环境的威胁。我国对农业转基因生物实施“零容忍”态度，实行强制标识管理。解决标识最核心的问题就是如何准确、精确地确定转基因动植物的外源基因拷贝数及含量，考虑到转基因低水平混杂等客观实际，因此开展转基因成分定量检测方法的研究及应用，已经成为现今转基因产品检测技术研究的一个关键点，具有重要的科学和现实意义。转基因大豆作为转基因农产品的重要组成部分，通过对转基因大豆进行有效的监管，对于保障我国的食用安全、饲用安全和环境安全具有重要的意义。

而转基因大豆品系SYHTOH2作为转基因大豆的重要品系，本发明希望提出一种可高效、准确、快速检测SYHTOH2转基因大豆品系的技术方法，以用于保障我国大豆产业安全。

发明内容

本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种用于检测SYHTOH2转基因大豆品系的引物、探针、试剂盒及方法。本发明基于SYHTOH2转基因大豆边界序列进行引物和探针的设计，所建立的检测方法具有高效、准确、快速的特点，能够应用于SYHTOH2转基因大豆品系及其产品的定量检测，为检验监管工作和相关部门行政执法提供强有力的支撑，并为规范相关企业的生产行为和保障我国粮食安全等方面具有重大的意义。

本发明提供了一种用于检测SYHTOH2转基因大豆品系的引物，所述引物的核苷酸序列为：

SYHTOH2-F：5’-ACTACATAAGAAGGAGGTGGAG-3’(SEQ ID NO：1)，

SYHTOH2-R：5’-TCCGCAATGTGTTATTAAGTTG-3’(SEQ ID NO：2)。

本发明还提供了一种用于检测SYHTOH2转基因大豆品系的探针，所述探针的核苷酸序列为：

SYHTOH2-P：5-CTAAGCGTCAATTCTGTGATGGTTCT-3’(SEQ ID NO：3)。

优选地，所述探针的5’端标记有荧光基团，所述探针的3’端标记有淬灭基团。所述荧光基团包括但不限于FAM、TET、HEX、CY3或JOE，所述淬灭基团包括但不限于BHQ1、BHQ2、TAMRA、DABCYL、MGB或Eclipse。

本发明还提供一种用于检测转基因大豆品系的试剂盒，包括上述用于检测转基因大豆品系的引物和上述用于检测转基因大豆品系的探针。

优选地，所述试剂盒还包括检测内参基因Lectin的引物和探针。

更优选地，所述检测内参基因Lectin的引物，其核苷酸序列为：

LECTIN-F：5’-CGCTTCCTTCAACTTCACCTTC-3’(SEQ ID NO：4)，

LECTIN-R：5’-CTTAGTGTCAATTGGTGCGAGA-3(SEQ ID NO：5)。

所述检测内参基因Lectin的探针，其核苷酸序列为：

LECTIN-P：5’-AGAAGGCAAGCCCATCTGCAAGCCT-3’(SEQ ID NO：6)。

所述检测内参基因Lectin的探针的5’端标记有荧光基团，所述探针的3’端标记有淬灭基团，但其所用荧光基团与用于检测SYHTOH2转基因大豆品系的探针不相同。

本发明还提供了一种用于检测转基因大豆品系的方法，采用上述用于检测转基因大豆品系的试剂盒中的引物和探针进行检测，所述检测方法选自荧光定量PCR检测、微滴式数字PCR检测、基因芯片检测或等温核酸扩增检测。

优选地，当所述检测方法为微滴式数字PCR检测时，包括以下步骤：

(1)提取样品DNA；

(2)以所述样品DNA为模板，加入引物和探针、ddPCR Super Mix和蒸馏水，得到反应体系；

(3)将步骤(2)配制的反应体系和微滴生成油加入微滴生成卡中，置于微滴发生器中生成微滴；

(4)进行扩增反应，反应结束后进行微滴荧光数据分析。

更优选地，所述提取样品DNA的方法为改良CTAB-磁珠法，所述改良CTAB-磁珠法包括以下步骤：

(1)在样品中加入CTAB裂解液进行处理，取上清液备用；

(2)在五联管中从左往右依次加入以下试剂：第一管中加入上清液、磁珠吸附缓冲液和磁珠悬浮液；第二管中加入上清液、磁珠吸附缓冲液；第三管和第四管中分别加入酒精；第五管中加入ddH₂O；

(3)对第一管中液体震荡混匀，取磁珠；转移磁珠至第二管中，震荡混匀，取磁珠；转移磁珠至第三管中，震荡混匀，取磁珠；转移磁珠至第四管中，震荡混匀，取磁珠并干燥；转移磁珠至第五管中，震荡混匀，第五管剩余溶液即为样品DNA溶液。

本发明通过改良CTAB核酸提取方法，将CTAB和纳米磁珠结合，建立磁珠法全自动核酸提取深加工农产品中DNA的方法，实现了核酸提取自动化，提取的核酸浓度高、质量好，无PCR抑制物，核酸质量优于传统的CTAB法和SDS法，解决了复杂样品中转基因成分检测的瓶颈问题。

更优选地，步骤(2)的反应体系包括以下组分：2×ddPCR Super Mix 10μL、每种上游引物1μL、每种下游引物1μL、每种探针1μL、样品DNA 2μL、采用灭菌蒸馏水补足至20μL。

进一步优选地，步骤(2)中每种上游引物在反应体系的终浓度为600-1200nmol/L，每种引物在反应体系的终浓度为600-1200nmol/L，每种探针在反应体系的终浓度为150-400nmol/L。

更优选地，步骤(4)中扩增反应的反应程序为：95℃预变性10min；95℃变性15s，60℃退火延伸1min，40个扩增；98℃保持10min使酶失活。

相对于现有技术，本发明的有益效果如下：

(1)植物产品DNA的提取常采用的方法是CTAB法或SDS法，两种方法共同特点是操作步骤繁琐，费时费力，而且苯酚、氯仿、异戊醇等有机溶剂有损操作者健康。针对此类产品核酸提取的难题，本发明采用了一种改良的CTAB-磁珠提取方法，该方法操作步骤简单快捷，并且避免使用有毒的苯酚等试剂，省去了离心步骤，高效安全，适用于大批量样品核酸的提取，解决了高质量核酸提取的瓶颈问题。

(2)本发明通过分析SYHTOH2转基因大豆品系边界序列，结合内源标记基因的使用情况，筛选得到特异性的引物和探针。并基于双重微滴式数字PCR方法，建立了高效、准确、快速的转基因大豆品系定量检测方法，检测下限可达0.005ng/μL，为检验监管工作和有关部门决策提供切实可靠的科学依据和技术支撑，对提升转基因定量检测能力，规范大豆企业的生产行为，保障我国大豆产业安全，保障大豆进出口安全，避免产品因转基因含量超标造成退货或销毁等方面都具有重要的意义。

附图说明

图1为五联管加样示意图；

图2为SYHTOH2转基因大豆成分微滴数字PCR特异性检测结果；A04：SYHTOH2，G04：MON87751，H04：MON87712，H02：MON87701，G02：RRS，G01：MON87769，H01：MON88302，F01：非转基因大豆；

图3为SYHTOH2转基因大豆成分数字PCR检测方法的线性范围拟合标准曲线；

图4为Lectin内源基因数字PCR检测方法的线性范围拟合标准曲线；

图5为SYHTOH2转基因大豆成分数字PCR检测结果(50％含量)；其中通道1用于检测SYHTOH2，通道2用于检测Lectin。

具体实施方式

为了让本领域技术人员更加清楚明白本发明所述技术方案，现列举以下实施例进行说明。需要指出的是，以下实施例仅为本发明的优选实施例，对本发明要求的保护范围不构成限制作用，任何未违背本发明的精神实质和原理下所做出的修改、替代、组合，均包含在本发明的保护范围内。

以下实施例中所用的原料、试剂或装置如无特殊说明，均可从常规商业途径得到，或者可以通过现有已知方法得到。

实施例1：不同核酸提取方法的比较

1.试验样品：大豆、豆粕、米粉和菜籽粕。

2.仪器：恒温孵育仪(德国Eppendorf公司)；高速冷冻离心机(德国Eppendorf公司)；KingFisher mL核酸自动提取仪(美国赛默飞世尔公司)；罗氏LightCycler 480荧光定量PCR仪(瑞士Roche公司)；NanoDrop1000微量紫外分光光度计(美国赛默飞世尔公司)；移液枪(2.5μL，10μL，20μL，100μL，200μL，1000μL，德国艾本德公司)。

3.试剂：CTAB裂解液；磁珠吸附缓冲液；磁珠悬浮液(洛阳爱森生物科技有限公司)；TE缓冲液(Tris 10mmol/L，Na₂EDTA 1mmol/L，pH至8.0)；Wizard Magnetic DNAPurfication system for Food(美国Promega公司，文中简写为“PR试剂盒法”)；MagneticPlant Genomic DNA Kit(美国天根公司，文中简写为“TG试剂盒法”)；2×Premix Ex Taq(珠海宝锐生物科技有限公司)；荧光PCR引物和探针(大连宝生物公司合成)；75％酒精。

4.试验方法：本研究分别采用5种不同的方法提取试验样品中的基因组DNA，分别是改良CTAB-磁珠法、传统的CTAB法、SDS法、PR试剂盒法、TG试剂盒法。分别取0.5g粉末试验样品进行DNA提取。

改良CTAB-磁珠法

(1)样品裂解：在2mL离心管中加入0.5g样品和1.5mL的CTAB裂解液，充分混匀后于恒温混匀仪上65℃孵育30-60min；常温10000r/min离心10min，吸取上清液备用。CTAB裂解液的加入视样品情况而定，如若样品吸胀严重，则可酌情多加；

(2)加样：如图1所示，在KingFisher mL核酸自动提取仪配套使用提取核酸的五联管中从左往右依次加入以下试剂：

第一管中加入300μL上清液、600μL磁珠吸附缓冲液和10μL磁珠悬浮液；

第二管中加入300μL上清液、600μL磁珠吸附缓冲液；

第三管和第四管中分别加入800μL 75％酒精；

第五管中加入200μL ddH₂O；

(3)核酸提取：将加好试剂的五联管放入核酸自动提取仪中，在磁力架上放入管套，运行事先设置好的核酸提取程序：

对第一管中液体震荡混匀2min，取磁珠；转移磁珠至第二管中，震荡混匀2min，取磁珠；转移磁珠至第三管中，震荡混匀2min，取磁珠；转移磁珠至第四管中，震荡混匀2min，取磁珠并悬空室温干燥10min；转移磁珠至第五管中，震荡混匀2min，第五管剩余溶液即为样品DNA溶液，置于4℃冰箱中保存备用。

CTAB法

参考Dietrich Made等的改良CTAB法，具体操作为：称取0.5g粉碎好的样品放入15mL离心管内，加入3mL事先预热的2％CTAB抽提缓冲液，置于65℃水浴中过夜温浴；室温下12000rpm离心10min，直至沉淀完全；取600μL上清液转移到2mL离心管内，加入等体积的苯酚/氯仿/异戊醇(25：24：1)，剧烈振荡20s，静置5min，12000rpm离心10min，取上清液转移到新的1.5mL离心管，重复抽提1次；室温下(20-24℃)孵化60分钟；12000rpm离心15min；弃上清，将沉淀溶于350μL的1.2mol/L Nacl溶液中，再加入350μL氯仿，高速涡旋震荡30秒，混匀；12000rpm离心15分钟，小心将上清转移至新的反应管中，加入0.8倍体积的异丙醇，室温(20-24℃)孵化至少20分钟；12000rpm离心15分钟，弃上清；加入500μL的70％乙醇洗涤沉淀，小心高速涡旋震荡(约30秒)，12000rpm离心15分钟；弃上清，使沉淀干燥；将DNA溶于200μL双蒸水中，加入RNaseA(10μg/μL)2uL，37℃孵育30min后，置于4℃保存备用。

SDS法

参照杜道林等的方法，称取0.5g粉碎好的样品置于15mL的离心管中，加入3mL SDS提取缓冲液中混匀，60℃恒温孵育30min，其间颠倒混匀数次。12000rpm离心10min，取600μL上清加入等体积的酚-氯仿-异戊醇(25:24:1)充分混匀；12000rpm离心10min，取上清加入等体积异丙醇和1/10体积3mol·L^-1NaAc，置于-20℃静置20min，12000rpm离心10min；弃上清，沉淀用75％乙醇充分洗涤后，在室温下晾干，加入200μL的ddH₂O溶解；加入RNaseA(10μg/μL)2μL，37℃孵育30min后，置于4℃保存备用。

试剂盒法

PR和TG试剂盒法按照试剂盒的操作说明分别对样品进行DNA的提取将最终获得的基因组DNA溶液保存于4℃冰箱中保存备用。

5.DNA的浓度测定和实时荧光PCR检测DNA成分

取2μL上述提取的基因组DNA溶液，在Nano Drop 1000微量紫外分光光度计上测定260nm和280nm处的吸收值，仪器可自动读出被测DNA的浓度(单位为ng/μL)和纯度(用OD260/280值表示)。

采用实时荧光PCR方法分别检测大豆和豆粕(内源基因Lectin)、菜籽粕(内源基因HMG)、米粉(内源基因SPS)样品中内源基因成分。荧光PCR扩增反应体系为(25μL)：2×Premix Ex Taq 12.5μL，上下游引物(10μM)各1.25μL，探针(10μM)0.75μL，DNA模板量为1ng，加无菌双蒸水补足体积至25μL。以水代替DNA模板作为空白对照，每个反应均设置两个平行，最后取其Ct值的平均值进行分析。荧光PCR反应扩增条件为：95℃/10s；95℃/5s，60℃/60s，45个循环。

上述测试结果如表1所示。

表1不同方法提取样品的DNA浓度和内源基因Ct值

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由表1可以看出，相比于其他类型的核酸提取方法，采用改良CTAB-磁珠法进行提取的样品DNA浓度最高，内源基因的Ct值更小，表明其提取效果更佳。

实施例2：微滴式数字PCR定量检测方法

1.仪器：恒温孵育仪(德国Eppendorf公司)；高速冷冻离心机(德国Eppendorf公司)；KingFisher mL核酸自动提取仪(美国赛默飞世尔公司)；NanoDrop1000微量紫外分光光度计(美国赛默飞世尔公司)；Bio-Rad QX200TM Droplet Digital PCR系统(包括微滴发生器、封膜仪、梯度PCR仪和微滴荧光检测仪4部分)(美国伯乐公司)；移液枪(2.5μL，10μL，20μL，100μL，200μL，1000μL，德国艾本德公司)。

2.试剂：CTAB裂解液(20g/L CTAB,1.4mol/L NaCl)；磁珠吸附缓冲液(5g/LCTAB,40mmol/L NaCl)；磁珠悬浮液(洛阳爱森生物科技有限公司)；TE缓冲液(10mmol/LTris-HCl，Na₂EDTA 1mmol/L，pH至8.0)；75％酒精；2×ddPCR supermix for probes、微滴生成油(droplet generation oil for probes)、微滴分析油(ddPCR droplet reader oil)(美国伯乐公司)；引物、探针均由广州天一辉远基因科技有限公司合成，序列信息如表2所示。

表2引物、探针序列信息

3.试验样品

转基因大豆MON87751、MON87712、SYHTOH2、MON87701、RRS、MON87769、转基因油菜MON88302品系和非转基因大豆。

4.核酸提取

采用实施例1中的改良CTAB-磁珠法进行核酸提取，提取的基因组DNA用NanoDrop1000紫外分光光度计进行浓度和纯度测定，并保存于-20℃冰箱备用。

5.微滴式数字PCR定量检测方法

反应体系配置

20μL反应体系：2×ddPCR Super Mix 10μL，引物LECTIN-F、LECTIN-R、SYHTOH2-F、SYHTOH2-R各1μL(终浓度均为900nmol·L^-1)，探针LECTIN-P、SYHTOH2-P各1μL(终浓度均为250nmol·L^-1)、基因组DNA 2μL、灭菌蒸馏水补足体积。

微滴生成

将上述20μL反应体系以及70μL矿物油，分别加入到微滴发生卡的相应孔中，在微滴发生器上自动生成微滴。然后将产生的40μL油包水微滴小心地转移到96孔反应板中，再将96孔反应板在封膜仪上封膜，最后在梯度PCR仪上进行反应。

反应条件

PCR扩增的反应条件为：95℃预变性10min；95℃变性15s，60℃退火延伸1min，进行40个循环扩增；98℃进行10min酶失活反应。反应结束后半个小时内进行微滴荧光数据分析。

检测结果分析

在微滴式数字PCR荧光分析系统中进行荧光分析，在连接仪器的软件中进行设置：选择绝对定量方法，将特异性基因通道设置为FAM荧光通道，内参基因Lectin通道设置为HEX荧光通道，进行荧光数据分析。

6.转基因大豆品系数字PCR方法的特异性检测

将试验样品按上述反应体系和反应条件进行ddPCR(微滴数字PCR)扩增，进行特异性验证，检测结果见图2。除SYHTOH2转基因大豆品系有扩增曲线，其余7个试验样品的DNA均未见扩增曲线，结果表明上述引物和探针的检测特异性良好。

7.转基因大豆品系数字PCR方法的灵敏性检测

为了确定数字PCR检测体系的灵敏度，将样品DNA分别稀释为500pg/μL、100pg/μL、20pg/μL、10pg/μL、5pg/μL和2.5pg/μL等6个浓度梯度，加入到数字PCR反应体系中，进行灵敏度检测，每个梯度做3次重复试验，统计每个反应的拷贝数，测试该方法体系的灵敏度。灵敏度检测结果如表3所示，线性范围内的数据拟合标准曲线如图3-4所示。

表3数字PCR检测方法的线性范围验证

根据表3和图3-4，由实际拷贝数的检测结果拟合标准曲线可以看出，本发明所用检测方法在SYHTOH2基因拷贝数位于1.77-437.23个/L的区间内可以呈现出良好的线性，R2为0.9999，RSD值位于1.42％到22.88％之间，均小于25％；Lectin内参基因拷贝数位于2.13-457.73个/μL的区间内可以呈现出良好的线性，R²为0.9997，所有浓度组的RSD值位于1.76％到21.14％之间，均小于25％。以上结果表明SYHTOH2在模板浓度为2.5pg/μL-500pg/μL时具有良好的定量检测能力。

8.数字PCR的定量检测限

定量检测限(Limit Of Quantitation,LOQ)是指在方法线性范围内可以进行稳定定量检测最低拷贝数，因此取线性范围验证结果的最低模板量进行LOQ值验证。将线性范围下限的DNA样品进行8个平行的数字PCR扩增，计算内参基因和特异性基因的平均值拷贝数和RSD值，试验结果见表4。

表4数字PCR检测方法LOQ验证结果

由表4的结果可以得出，模板浓度为2.5pg/μL的内源基因Lectin扩增的拷贝数平均值为2.06个/μL，RSD为18.68％，低于25％实验方法要求，说明本方法对单位体系内的内源基因可进行稳定的定量检测的最低拷贝数为40.1个。模板浓度为2.5pg/μL SYHTOH2基因的扩增拷贝数平均值为1.84个/μL，RSD为24.33％，符合方法要求，说明本方法对单位体系内的MON87712基因可进行稳定定量检测的最低拷贝数为36.8个。

9.数字PCR的准确度验证

将SYHTOH2转基因标准品和非转基因大豆完全干燥后混合成50％、10％和1％含量样品进行核酸提取，稀释到0.5ng·μL^-1进行数字PCR准确度验证，每组做8个重复，计算特异性基因和内参基因拷贝数及其百分比，求百分比的平均值，得出实际检测含量，计算RSD，验证方法的准确度。准确度验证结果如表5所示，50％浓度的SYHTOH2转基因大豆扩增信号图谱见图5。

表5数字PCR检测方法的准确度验证

由表5和图5可知，SYHTOH2转基因大豆品系含量理论值为50％、10％和1％时所测得的含量分别为48.79％、9.36％和0.91％，对应检测的RSD值分别为3.53％、7.22％和8.28％，三组检测结果的相对标准偏差均小于25％，符合试验方法的要求，因此本方法可针对SYHTOH2样品进行准确的绝对定量检测。由上可知，上述SYHTOH2转基因标准品DNA的定量检测下限可为0.005ng·μL^-1，体现出优异的检测灵敏度和准确度。

上面结合附图对本申请实施例作了详细说明，但是本申请不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本申请宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本申请的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

Claims (10)

1.用于检测SYHTOH2转基因大豆品系的引物，其特征在于，所述引物的核苷酸序列为：

SYHTOH2-F：5’-ACTACATAAGAAGGAGGTGGAG-3’，

SYHTOH2-R：5’-TCCGCAATGTGTTATTAAGTTG-3’。

2.用于检测SYHTOH2转基因大豆品系的探针，其特征在于，所述探针的核苷酸序列为：

SYHTOH2-P：5-CTAAGCGTCAATTCTGTGATGGTTCT-3’。

3.根据权利要求2所述的探针，其特征在于，所述探针的5’端标记有荧光基团，所述探针的3’端标记有淬灭基团。

4.一种用于检测SYHTOH2转基因大豆品系的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的引物和权利要求2-3中任一项所述的探针。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括检测内参基因Lectin的引物和探针。

6.一种用于检测SYHTOH2转基因大豆品系的方法，其特征在于，采用权利要求4或5所述的试剂盒中的引物和探针进行检测，所述检测方法选自荧光定量PCR检测、微滴式数字PCR检测、基因芯片检测或等温核酸扩增检测。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，当所述检测方法为微滴式数字PCR检测时，包括以下步骤：

(1)提取样品DNA；

(2)以所述样品DNA为模板，加入引物和探针、ddPCR Super Mix和蒸馏水，得到反应体系；

(3)将步骤(2)配制的反应体系和微滴生成油加入微滴生成卡中，置于微滴发生器中生成微滴；

(4)进行扩增反应，反应结束后进行微滴荧光数据分析。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述提取样品DNA的方法为改良CTAB-磁珠法，所述改良CTAB-磁珠法包括以下步骤：

(1)在样品中加入CTAB裂解液进行处理，取上清液备用；

(2)在五联管中从左往右依次加入以下试剂：第一管中加入上清液、磁珠吸附缓冲液和磁珠悬浮液；第二管中加入上清液、磁珠吸附缓冲液；第三管和第四管中分别加入酒精；第五管中加入ddH₂O；

(3)对第一管中液体震荡混匀，取磁珠；转移磁珠至第二管中，震荡混匀，取磁珠；转移磁珠至第三管中，震荡混匀，取磁珠；转移磁珠至第四管中，震荡混匀，取磁珠并干燥；转移磁珠至第五管中，震荡混匀，第五管剩余溶液即为样品DNA溶液。

9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤(2)的反应体系包括以下组分：2×ddPCR Super Mix 10μL、每种上游引物1μL、每种下游引物1μL、每种探针1μL、样品DNA 2μL、采用灭菌蒸馏水补足至20μL。

10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤(4)中扩增反应的反应程序为：95℃预变性10min；95℃变性15s，60℃退火延伸1min，40个扩增；98℃保持10min使酶失活。

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