CN110714054A - 基于电场诱导释放检测技术结合靶标基因片段的转基因检测方法和试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明“基于电场诱导释放检测技术直接结合靶标基因片段的转基因检测方法和试剂盒”，涉及电化学基因检测技术，所述试剂盒包括检测CP4‑EPSPS序列的组合1和检测Lectin序列的组合2，可以快速高效地检测待测大豆材料是否为转基因材料。

Description

基于电场诱导释放检测技术结合靶标基因片段的转基因检测 方法和试剂盒

技术领域

本发明涉及基因检测技术，特别是基于电场诱导释放检测技术结合靶标基因片段的转基因检测方法和试剂盒

背景技术

转基因作物,又被称为生物技术作物，是运用DNA重组技术将外源基因整合到受体植物基因组中，从而改变其基因组成和基因表达的植物及其后代。目前，获批准的几十种转基因作物中，转基因大豆的种植面积最大，占据全球转基因作物种植面积的56％。

转基因大豆主要是指抗草甘膦大豆，是Monsanto公司研发成功的抗草甘膦大豆，其商品名为Roundup Ready^TM。草甘膦(Glyphosate,英文又名Roundup)是一种施于叶片、广谱性、非选择性的有机磷类除草剂，其作用的机理是特异抑制植物和细菌中莽草酸羟基乙烯转移酶(EPSPS)的活性，使其氨基酸合成受阻而死亡。由于所有植物都需要EPSPS来催化氨基酸的合成，所以在使用后，所有植物都会被杀死。抗草甘膦大豆基因工程的主要方法，就是采用修饰除草剂作用的靶蛋白，使其对除草剂不敏感，即促进EPSPS过量表达或用编码点突变的靶蛋白基因。Monsanto公司研究人员将CaMV35S启动子控制下的矮牵牛的EPsPs基因转入到大豆基因组中，获得了莽草酸羟基乙烯转移酶(EPSPS)表达量增加20-40倍的转基因大豆。这种大豆对除草剂草甘膦具有高度耐受性，在大田中施用草甘膦不会影响大豆产量。

目前已知的转基因大豆中的外源基因片段有Lectin,CP4-EPSPS,PAT,GAT4601,Cry1Ac,FMV35S-P,CaMV35S-P,NOS-3',CaMV35S-T。在我国，大豆及豆制品是传统食品，消耗量巨大。近些年来，我国从传统的大豆出口国转变成为世界头号大豆进口国，而在进口的大豆中，上述转基因大豆占三分之二以上。而转基因大豆的毒性和安全隐患问题一直备受争议。为保护消费者对转基因食品的知情权和选择权，建立相应的完善的转基因大豆检测技术显得尤其重要。

目前,转基因大豆检测技术发展迅速。根据检测样品及靶标的不同，已经衍生出很多相应的检测方法和手段。常用的检测转基因大豆的方法有以下几种，各有特点。

酶联免疫分析技术(ELISA)、试纸条法，其检测的准确性依赖检测物中靶标蛋白质的活性及结构并受杂质的影响。由于豆制品中的蛋白质会随着加工程度的不同而产生不同程度的变性，特别是一些经过高温高压深加工的豆制品，因此，在实际检测中难度较大，实际检测效率、准确性较差。

普通PCR技术，是能够快速、简便的扩增转基因大豆特异性片段CP4-EPSPS，并且具有高度的专一性和灵敏性。但检测过程需要较长时间，并不适用于快速鉴定。并且PCR扩增产物易污染实验区，易引起后期实验的假阳性等实验结果。此外，对工作人员技术和实验室要求高，工作人员需进行专门培训。

荧光PCR检测技术：目前有文献报道检测限可到0.01％，与普通PCR相比，实时荧光PCR技术在特异性、灵敏度和准确性方面均显示了巨大优势。且弥补了传统PCR技术交叉污染及假阳性的不足。但仍存在一些问题，荧光定量PCR技术对样本制备要求较高，且易受到DNA降解、复杂基质干扰等因素影响。

环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)，柳毅等以CP4一EPSPS外源基因为检测的目的片段，进行LAMP扩增，检测已知转基因大豆和市售大豆，检出限为0.01％。LAMP技术灵敏度高、特异性好、耗时短且对仪器要求不高，但引物设计较为复杂，对扩增产物处理不当容易造成污染，影响结果。

直接测序法：易受到DNA降解、复杂基质干扰等因素影响，低灵敏度将导致大量的漏检。同时，测序法检测操作复杂，时效性差，对于要求高时效性和高灵敏度实际应用检测，测序法的局限性早已凸显。

基因芯片技术：是将合成好的报告基因、启动子、终止子的特异性核苷酸片断以预先设定的排列方式固定在固相支持介质表面，形成高密度的阵列，待测产品的DNA与探针进行杂交，由特殊的装置检出信号，并由计算机进行分析综合，判断待测样品是否为转基因产品。但它制作芯片技术复杂，需要专门的仪器设备，所需的成本太高。另外，昂贵的检测仪器和复杂的样品制备限制了基因芯片技术作为常规的检测手段。

杂交检测方法：主要是Southern杂交和Northern杂交。Southern杂交是将经酶切DNA转移到杂交膜上与探针杂交的技术，可以确定外源DNA的位置和拷贝数。Northern杂交是将材料RNA与探针杂交的技术，用于检测基因在转录水平上的表达。Southern杂交和Northern杂交的基本过程都是将待检测的核酸段转移到一个特定部分的固相的支持物上，并进一步的结合到固相支持物上，然后使用核酸探针事前标记过的，检测将要检测的核酸。这种方法快速方便和易于操作，同时可以对多个样品进行测试。但在测试样品之前，不能对样品进行扩增放大，使检测灵敏度较低。另外，检测所需时间过长，无法进行现场检验或初筛。

综上，基于聚合酶链式反应(PCR)的各种衍生体系，如PCR反应的各种变形，如实时荧光PCR、LAMP，或者基于测序反应的NGS，以及基于分子杂交原理的基因芯片等。以上方法各有优缺点，都能在某些方面满足食品安全转基因的检测要求，但是由于以上方法均需要通过链式酶扩增反应来扩增目标基因片段的数量，因此都无法避免基因扩增造成的气溶胶污染，所以对实验环境以及实验人员的要求很高，标准实验室造价高昂，整体运行成本高，也无法进行现场检测，特别是用在进出口海关检验时，大大影响大豆及豆制品的通关速度。

发明内容

为了满足在不同场合简便地检测大豆及豆制品的转基因情况，本发明提供了一种简单、易用、快速、可靠的技术，概括如下：

基于EFIRM技术检测转基因大豆的试剂盒，其特征在于，包括以下探针组合：

检测CP4-EPSPS序列的组合1，由

第1捕获探针：5-AGAGTCAGCTTGTCAGCGTGTCAAAAAAAA-3，和

第1检测探针：5-GCGCGCGTTAATTTGTGCCATTCTTGAAAGATCTGCT-3组成，所述CP4-EPSPS序列为：

5-GACACGCTGACAAGCTGACTCTAGCAGATCTTTCAAGAATGGCACAAATTAAC

检测Lectin序列的组合2，由

第2捕获探针：5-TTGAAGGAAGCGGCGAAGCTGG-3，和

第2检测探针：5-GTGTCAGGGGCATAGAAGGTGAAG-3组成，

所述Lectin序列为：

CCAGCTTCGCCGCTTCCTTCAACTTCACCTTCTATGCCCCTGACACAAAAAG。

优选地，所述检测探针3’端或5’端标记有用于结合催化酶的亲和物；所述亲和物为地高辛、异硫氰酸荧光素或生物素。

优选地，还包括催化酶，所述催化酶为带有标记物的辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶；所述标记物为地高辛抗体、异硫氰酸荧光素抗体或链霉亲和素。

优选地，还包括对应所述催化酶的底物；

当所述催化酶为辣根过氧化物酶时，所述底物是TMB、ABTS和OPD中的任一种；

当所述催化酶为碱性磷酸酶时，所述底物是BCIP和NBT的组合物、对硝基苯磷酸盐、4-硝基苯磷酸二钠、萘酚AS-BI磷酸盐、萘酚-AS-MX-磷酸盐中的任一种。

优选地，上述任一所述试剂盒还包括用于将所述捕获探针固定至检测孔板上的反应孔中的固定物，所述固定物包括导电聚合物和离子化合物；

所述导电聚合物为吡咯、苯胺和噻吩中的任一种；

所述离子化合物为氯化钠或氯化钾。

优选地，上述任一试剂盒还包括清洗液，所述清洗液包括洗液A和洗液B，所述洗液A是含SDS的SSC缓冲液，所述洗液B是含Tween20的PBS缓冲液。

一种基于EFIRM技术检测转基因大豆的检测孔板，其特征在于，所述检测孔板的反应孔底部设置有工作电极并配置为可施加电压以形成电场；

所述检测孔板的反应孔内分配并固定有以下核苷酸序列所示的捕获探针：

第1捕获探针：5-AGAGTCAGCTTGTCAGCGTGTCAAAAAAAA

第2捕获探针：5-TTGAAGGAAGCGGCGAAGCTGG-3；

且一个反应孔仅固定一种捕获探针。

且一个反应孔仅固定一种捕获探针。

优选地，所述捕获探针是与导电聚合物和离子化合物混合成混合液后加到所述反应孔中，然后通过所述工作电极施加第一方波电场后固定在所述反应孔内底部表面；

所述第一电场的参数为：电压A：350mV，1s；电压B:950mV，1s；进行9个循环，

优选地，所述导电聚合物材料选自苯胺、噻吩和吡咯导电分子单体中的至少一种；

所述离子化合物选自氯化盐、硝酸盐、硫酸盐中的至少一种；

所述氯化盐为氯化钠、氯化钾、氯化镁、氯化铵中的一种，

所述硝酸盐为硝酸钠、硝酸钾、硝酸镁、硝酸铵中的一种，

所述硫酸盐为硫酸钠、硫酸钾、硫酸镁、硫酸铵中的一种。

一种基于EFIRM技术检测检测转基因大豆的方法，其特征在于，采用上述任一所述的试剂盒，步骤如下：

(1)采用任一所述的检测孔板；或将所述捕获探针加入到空白检测孔板中，所述反应孔内底部设置有电极，用于接通EFIRM检测仪后对反应孔内溶液施加电场进行聚合反应；接通EFIRM检测仪后对反应孔内溶液施加第一电场进行聚合反应；电场处理完毕，清洗检测孔板；所述第一电场处理的参数为：电压200-500mV，1-5s；电压800-1500mV，1-5s；3-10个循环；

(2)样本与捕获探针杂交

加入待测样本与杂交buffer的混合溶液，对反应孔施加第二电场：电压200-500mV，1-5s；电压300-800mV，1-5s；5-150个循环；清洗检测孔板；

(3)样本与检测探针杂交

加入与反应孔中的捕获探针对应的检测探针溶液，然后对反应孔施加第三电场：电压200-500mV，1-5s；电压300-800mV，1-5s；3-10个循环；清洗检测孔板，立即进行下一步操作；

所述检测探针溶液中检测探针的浓度为0.5-1.5μM

(4)加入所述催化酶液，孵育后清洗；

(5)加入底物，在电压为-100～-300mV的电场处理下读数，得到电流值，

(6)探针组1测得值与探针组2测得值的比值作为判断标准，当比值大于0.17时，判断为转基因样本；

当比值小于0.14时，判断为非转基因样本；

当比值在0.14和0.17之间时，对样本进行稀释或浓缩后重新测定样本。

本发明提供的转基因大豆检测方法具有以下优点：

一、操作简便快速

常规杂交方法需要长时间孵育,普通PCR扩增后需要进行电泳测序等结果判定过程，整个流程耗时长。基因芯片、实时荧光PCR及直接测序法均检测需对技术人员要求较高。

本检测方法基于EFIRM技术，用于转基因大豆鉴定时，只需取大豆DNA提取样本与检测试剂加入e-plate板的相应反应孔当中，再将e-plate放置到EFIRM检测仪的相应位置，在电脑上启动相应检测程序，期间经过简单的类似ELISA的洗板步骤后就可以由仪器完成检测工作，检测数据自动上传到云计算平台，经过分析后以图形或者数据方式直接在用户界面显示检测的结果。检测过程利用电场作用，加快反应速率，缩短反应时间，整个检测过程可以在一小时内完成，这样可以为工作人员缩短检测时间，提高工作效率。

二、高灵敏度与准确率

传统的探针固定方法是把探针的一端固定在平面支持物上，此方法由于芯片表面的疏水性等原因会降低探针与待测靶标DNA的杂交效率，本发明通过电荷吸附作用将捕获探针固定在聚吡咯孔内，可保证捕获探针具有超高活性；传统的核酸杂交过程通过控制杂交温度、盐离子、反应时间等提高杂交效率，本发明增加电场作为第四个控制条件，在电场的作用下提高了捕获探针对靶标DNA的捕获效率；本方法中通过测定HRP催化TMB氧化过程中产生的电子信号作为检测结果，由于酶的催化效率很高，间接地放大了杂交反应的结果，增加了测定方法的敏感度。瞬间靶标分子捕获、超高活性分子探针固定、捕获分子信号特异放大这三大核心技术保证了EFIRM方法具有超高的灵敏性。

普通PCR或荧光定量PCR，其灵敏度大约在0.1％～1％左右。酶联免疫检测方法其灵敏度在0.1％-5％，杂交方法因其技术原理限制其灵敏度较低。经试验数据证明，采用本发明的检测其灵敏度可达到0.1％。

在准确率方面，PCR检测技术由于自身的局限性容易出现假阳性，ELISA检测方法对检测样本要求较高，大豆经加工后蛋白变性会严重影响检测结果。本发明的方法基于EFIRM检测平台技术，其样本无需高温处理；特异性捕获探针的设计可特异性捕获所需基因片段，避免假阳性的实验结果，最后通过捕获分子信号特异放大，其准确率达97％以上，检测重复性>96％。

三、建立了基于EFIRM技术检测转基因的方法学建立

通过大量实验数据统计，本发明通过靶标基因探针对和内参基因探针对检测到的电流值比值来作为转基因检测的判断标准：

检测的为转基因样本时，靶标基因探针对的检测值与内参基因探针对的检测值的比值大于0.17；

检测的非转基因样本时，比值小于0.14。

当比值在0.14和0.17之间时，需重新测定样本，

四、成本低廉

首先，在检测设备方面，无论是直接测序、基因芯片还是荧光定量，其检测设备都非常昂贵，目前市售荧光定量仪、基因芯片杂交仪标价都为数十万元。高昂的价格严重制约了其在现实检测中的推广应用。而且此类仪器均需要对员工进行比较严格的培训，高昂的价格及对检测人员较高的要求都极大的限制了其在一般检测平台的推广应用。与之相比，EFIRM平台采用独创的电场引导的释放与测量技术，检测过程利用电场作用，反应快速，最终结果以电信号的形式检测，因此检测设备不像荧光定量PCR那样配备昂贵的荧光检测系统，因而设备的成本大幅降低，仅相当于荧光定量PCR仪的一半左右。

其次，在检测试剂方面EFIRM技术基于核酸杂交的原理，采用独特设计的电化学技术。本发明中使用的核酸探针采用人工合成寡核苷酸探针，检测探针中采用较常见的Biotin修饰方法，捕获探针无需修饰，探针的制备委托商业化的DNA化学合成公司完成，技术难度低，稳定性较好，成本低。

因此，从成本方面考虑，EFIRM检测无论从设备还是试剂，成本都低于基于PCR的技术，未来便携式EFIRM仪器设备的开发将进一步降低检测成本。

总之，我们开发的产品与现有技术相比，兼具精准可靠、快速便捷、经济的明显优势，利于反复多次取样检测，使用范围广，可以覆盖各种转基因大豆及其制品的检测，是理想的转基因大豆鉴定技术。

附图说明

图1本发明检测试剂盒的工作原理图。

具体实施方式

以下通过示例性实施例说明本发明，实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

试剂及仪器

本发明采用的EFIRM检测仪，为广州易活生物公司出品，记载于Fang Wei等2009年发表于Clinic Cancer Research上的“Electrochemical Sensor for MultiplexBiomarkers Detection,Clin Cancer Res.2009Jul 1；15(13):4446–4452中，即其中采用的电化学检测仪。

本领域技术人员根据本发明的描述，以及上述提到的现有技术，可以采用一般的可发生方波的仪器对反应孔施加方波(csw E-field)，也可以采用易活生物科技有限公司前期研发的EFIRM仪器及配套的软件来实现。

或采用申请号为201610658321.X、名称为保持结构及包括保持结构的检测仪中记载的EFIRM仪器。

本发明采用的底部设置有电极的空白检测孔板为广州易活生物技术有限公司出品其结构和工作原理记载于实用新型专利201620769829.2中。

本专利申请所涉及的序列如表1所示。

表1探针序列

注YHTS-2探针对检测的Lectin序列为内参序列，YHTS-1探针对和YHTS-3探针对检测的CaMV 35S启动子序列和CP4-EPSPS序列序列为靶标基因内序列。

实施例1

对不同检测样本分别采用以下步骤进行检测：

1.捕获探针(CP)的固定

Pyrrole与CP混合液配制：

取1个1.5mL离心管，依次加入超纯水885μl，100μl 3M KCl，涡旋震荡混匀，离心；加入5μlpyrrole，涡旋震荡混匀，离心；加入10μl CP@100μM,；涡旋震荡混匀后离心，备用。

1.1加样：

根据实验设计，在E-plate上，每个孔加入30μl的已配制好的pyrrole与CP混合液，加样时枪头贴近孔的底部，但是不接触到底部电极，加完后倾斜或拍打E-plate使液体在孔里的电极表面均匀覆盖，然后立刻到EFIRM上进行电场操作。

1.2 EFIRM电场处理：

在EFIRM软件上选择进行实验的对应列，电场参数设置为：电压A：350mV，1s；电压B:1100mV，1s；进行9个循环。电场处理完毕，立刻取出，清洗E-plate板。

1.3 E-plate板清洗：

在洗板机程序上选择对应的实验列，清洗程序选择(2bottom，2top)，洗液选择2×SSC(0.05％SDS)。清洗完毕，立刻进行下一步样本上样操作。

2.样本与捕获探针杂交

2.1杂交buffer预处理：

杂交buffer在水浴锅中65℃水浴处理20min。

2.2样本的配制

杂交buffer把合成的标准品序列稀释成不同浓度，混合，涡旋振荡后离心，即可上样进行检测。

2.3加样：

根据实验设计，在E-plate上，在对应的孔里加入空白对照buffer、相应浓度的阴性对照和阳性对照，上样量30μl。加样时枪头贴近孔的底部，但是不接触到底部电极，加完后倾斜或拍打E-plate使液体在孔里的电极表面均匀覆盖，然后立刻到EFIRM上进行电场操作。

2.4 EFIRM电场处理：

在EFIRM软件上选择进行实验的对应列，电场参数设置为：电压A：300mV，1s；电压B:500mV，1s；进行5个循环。电场处理完毕，立刻取出。

2.5室温孵育

盖上E-plate盖子，实验台上室温孵育15min。

2.6 E-plate板清洗：

在洗板机程序上选择对应的实验列，清洗程序选择(2bottom，2top)，洗液选择2×SSC(0.05％SDS)。清洗完毕，立刻进行DP加样操作。

3.检测探针(DP)与样本杂交

3.1 DP溶液配制：

从4℃冰箱取出casein/PBS(Thermo Scientific^TM，Catalog number，37582)溶液，取1个1.5mL离心管，加入990ul的casein/PBS(把casein/PBS溶液放回4℃冰箱)，加入10μl的DP@100μM，涡旋震荡混匀，离心，备用。

3.2加样：

根据实验设计在对应的孔加入对应DP溶液30μl，加样时枪头贴近孔的底部，但是不接触到底部电极，加完后倾斜或拍打E-plate使液体在孔里的电极表面均匀覆盖，然后立刻到EFIRM上进行电场操作。

3.3 EFIRM电场处理：

在EFIRM软件上选择进行实验的对应列，电场参数设置为：电压A：300mV，1s；电压B:500mV，1s；进行5个循环。电场处理完毕，立刻取出，清洗E-plate板。

3.4 E-plate板清洗：

在洗板机程序上选择对应的实验列，清洗程序选择(2bottom，2top)，洗液选择2×SSC(0.05％SDS)。清洗完毕，立刻进行加样操作。

4.HRP修饰的链霉亲和素与Biotin结合

4.1 Poly-HRP溶液配制：

从4℃冰箱取出casein/PBS溶液，取1个1.5mL离心管，加入999μl的casein/PBS(把casein/PBS溶液放回4℃冰箱)，加入1μl的poly-HRP，涡旋震荡混匀，离心，备用。

4.2加样：

根据实验设计在对应的孔加入Poly-HRP溶液30μl，加样时枪头贴近孔的底部，但是不接触到底部电极，加完后倾斜或拍打E-plate使液体在孔里的电极表面均匀覆盖。

4.3室温孵育

盖上E-plate盖子，实验台上室温孵育30min。

4.4 E-plate板清洗：

在洗板机程序上选择对应的实验列，清洗程序选择(3bottom，3top)，洗液选择PBST(0.1％Tween20)。清洗完毕，立刻进行TMB加样操作。

5.数据读取

5.1加样：

根据实验设计在对应的孔加入TMB/H₂O₂溶液，每个孔加入60μl，加样时枪头贴近孔的底部，但是不接触到底部电极。加完立刻到EFIRM上进行电场操作。

5.2 EFIRM电场读数：

在EFIRM软件上选择进行实验的对应列，电场参数设置为：电压：-200mV，60s，得到电流读数。电场处理完毕，立刻取出，清洗E-plate板。

本实施例中，不同检测样本包括阴性组和阳性组：

阴性组为探针对不针对的序列(比如，在此实例中使用YHTS-2探针对针对的序列作为YHTS-3探针对的阴性组检测模板，YHTS-3探针对针对的序列作为YHTS-2探针对的阴性组)，

阳性组为探针对针对的序列。每个样本设置10个平行孔进行检测。相应地，每组的阴性组和阳性组采用该组的检测探针对进行检测，以鉴定其检测的稳定性，检测的电流结果如表2所示。

表2检测结果(Mean)

表3中，变异系数cv(coefficient of variation)，亦称离散系数(coefficientof dispersion)或相对偏差(rsd)，是标准偏差与平均值之比，用百分数表示，计算公式为：cv＝sd/mean×100％。

从表2和表3可以看出，本发明提供的转基因大豆检测试剂盒以及使用该试剂盒检测转基因大豆，可检测低至1pM的序列含量的样本，检测灵敏度高；检测得到的数值的变动范围均在15％以下，有的甚至低至1％左右，检测稳定性好。此外，检测不同浓度的阴性样品和阳性样本，其检测得到的数值均有很好的线性关系。

实施例2本发明的试剂盒建立转基因大豆的检测方法

采用本发明的方法检测大量经PCR确定是否为转基因大豆的样本。

统计获得检测标准：

检测的转基因样本时，靶标基因探针对的检测值与内参基因探针对的检测值的比值大于0.17；

检测的非转基因样本时，比值小于0.14。

当比值在0.14和0.17之间时，需重新测定样本，

采用实例1的方法以及以上获得的检测标准，对经PCR确定是否为转基因大豆的样本进行双盲测试：

使用市售的植物基因组DNA提取试剂盒(如广州美基生物科技有限公司的安全型植物DNA抽提试剂盒，货号D3164)，按说明书的步骤进行大豆样本的核酸提取。使用核酸提取物98℃水浴处理10min，再与杂交buffer按体积比1:1混合，涡旋振荡后离心的样本配制方法。

测试结果与PCR检测结果进行对比，具体检测结果见表4。

表4样本检测结果(基于YHTS-3探针对/YHTS-2探针对)

表5符合率

其中,阳性符合率和阴性符合率的计算公式如下所示。

阳性符合率＝a/(a+c)×100％；

阴性符合率＝d/(b+d)×100％。

从表4和5可以看出，使用EFIRM平台进行检测有较好的符合率，准确率高，检测时间短，满足实际检测应用的要求。

基于YHTS-1探针对/YHTS-2探针对检测结果与表4和5相符。

检测过程替代性方案：

对以上实施例1-2的检测，可以采用以下检测步骤替代：

替代方法一.

1、捕获探针固定在检测孔板的板底

1.1噻吩与捕获探针(简称CP)的混合液配制：

捕获溶液含有以下成分：噻吩的重量百分数为5％，NaCl的浓度为2mol/L，捕获探针的浓度为1.5μmol/L。

1.2加样：

在96孔的检测孔板上，每个孔加入20μl的已配制好的噻吩与CP混合液，加样时枪头贴近孔的底部，但是不接触到底部电极，加完后倾斜或拍打检测孔板使液体在孔里的电极表面均匀覆盖，然后立刻到EFIRM检测仪上进行电场操作。

1.3EFIRM电场处理：

在EFIRM软件上选择进行实验的对应列，电场参数设置为：电压A：500mV，1s；电压B:1500mV，1s；进行10个循环。电场处理完毕，立刻取出，清洗检测孔板。

1.4检测孔板清洗：

在洗板机程序上选择对应的实验列，清洗程序选择(2bottom，2top)，洗液选择2XSSC(0.06％SDS)。清洗完毕，立刻进行下一步样本上样操作。

2、样本杂交：

2.1杂交buffer预处理

杂交buffer在水浴锅中95℃水浴处理5min，然后室温放置冷却。

2.2样本的配制

样本从-20℃冰箱取出，放进4℃冰箱解冻。完全溶解后，样本与杂交buffer按体积比1:1混合，涡旋振荡后离心，即可上样进行检测。

2.3加样：

在检测孔板上，在对应的孔里加入空白对照buffer、相应浓度的阴性对照(WT)和阳性对照(MT)，上样量80μl。加样时枪头贴近孔的底部，但是不接触到底部电极，加完后倾斜或拍打检测孔板使液体在孔里的电极表面均匀覆盖，然后立刻到EFIRM上进行电场操作。

2.4 EFIRM电场处理：

在EFIRM软件上选择进行实验的对应列，电场参数设置为：电压A：500mV，1s；电压B:800mV，1s；进行10个循环。电场处理完毕，立刻取出，清洗检测孔板。

2.5检测孔板清洗：

在洗板机程序上选择对应的实验列，清洗程序选择(2bottom，2top)，洗液选择2XSSC(0.06％SDS)。清洗完毕，立刻进行DP加样操作。

3、检测杂交

3.1 DP(检测探针)溶液配制：

检测溶液是以PBS作为溶剂，其中酪蛋白的重量百分数为5％，检测探针的浓度为1μM，涡旋震荡混匀，离心，备用。

3.2加样：

根据实验设计在对应的孔加入对应DP溶液30μl，加样时枪头贴近孔的底部，但是不接触到底部电极，加完后倾斜或拍打检测孔板使液体在孔里的电极表面均匀覆盖，然后立刻到EFIRM上进行电场操作。

3.3 EFIRM电场处理：

在EFIRM软件上选择进行实验的对应列，电场参数设置为：电压A：500mV，1s；电压B:800mV，1s；进行8个循环。电场处理完毕，立刻取出，清洗检测孔板。

3.4检测孔板清洗：

在洗板机程序上选择对应的实验列，清洗程序选择(2bottom，2top)，洗液选择2XSSC(0.06％SDS)。清洗完毕，立刻进行加样操作。

4、Reporter Hybridization

4.1 Poly-HRP溶液配制：

从4℃冰箱取出casein/PBS溶液，取1个1.5mL离心管，加入999μl的casein/PBS(把casein/PBS溶液放回4℃冰箱)，加入1μl的poly-HRP，涡旋震荡混匀，离心，备用。

4.2加样：

根据实验设计在对应的孔加入Poly-HRP溶液30μl，加样时枪头贴近孔的底部，但是不接触到底部电极，加完后倾斜或拍打检测孔板使液体在孔里的电极表面均匀覆盖，然后盖上检测孔板盖子，实验台上室温孵育40min，计时器倒数计时。孵育时间到，立刻清洗检测孔板。

4.3检测孔板清洗：

在洗板机程序上选择对应的实验列，清洗程序选择(3bottom，3top)，洗液选择PBST(0.15％Tween20)。清洗完毕，立刻进行TMB加样操作。

5、Readout

5.1加样：

根据实验设计在对应的孔加入TMB/H₂O₂溶液(购自thermo fisher,产品货号为34022，名称为Turbo TMB底物溶液)，每个孔加入80μl，加样时枪头贴近孔的底部，但是不接触到底部电极。加完立刻到EFIRM上进行电场操作。

5.2EFIRM电场读数：

在EFIRM软件上选择进行实验的对应列，电场参数设置为：电压A：-300mV，100s，得到电流读数。

检测结果与基于实施例1记载的步骤所得实施例1和2的结果一致。

替代检测过程二、

对待检测样本进行检测，具体步骤如下：

1、捕获探针固定在检测孔板的板底

1.1苯胺与捕获探针(简称CP)的混合液配制：

捕获溶液含有以下成分：苯胺的重量百分数为0.1％，NaCl的浓度为0.01mol/L，捕获探针的浓度为0.5μmol/L。

1.2加样：

在96孔的检测孔板上，每个孔加入80μl的已配制好的苯胺与CP混合液，加样时枪头贴近孔的底部，但是不接触到底部电极，加完后倾斜或拍打检测孔板使液体在孔里的电极表面均匀覆盖，然后立刻到EFIRM检测仪上进行电场操作。

1.3 EFIRM电场处理：

在EFIRM软件上选择进行实验的对应列，电场参数设置为：电压A：200mV，5s；电压B:800mV，5s；进行3个循环。电场处理完毕，立刻取出，清洗检测孔板。

1.4检测孔板清洗：

在洗板机程序上选择对应的实验列，清洗程序选择(2bottom，2top)，洗液选择2XSSC(0.04％SDS)。清洗完毕，立刻进行下一步样本上样操作。

2、样本杂交：

2.1杂交buffer预处理

杂交buffer在水浴锅中85℃水浴处理15min，然后室温放置冷却。

2.2样本的配制

样本从-20℃冰箱取出，放进4℃冰箱解冻。完全溶解后，样本与杂交buffer按体积比1:1.5混合，涡旋振荡后离心，即可上样进行检测。

2.3加样：

在检测孔板上，在对应的孔里加入空白对照buffer、相应浓度的阴性对照(WT)和阳性对照(MT)，上样量20μl。加样时枪头贴近孔的底部，但是不接触到底部电极，加完后倾斜或拍打检测孔板使液体在孔里的电极表面均匀覆盖，然后立刻到EFIRM上进行电场操作。

2.4EFIRM电场处理：

在EFIRM软件上选择进行实验的对应列，电场参数设置为：电压A：200mV，5s；电压B:300mV，5s；进行3个循环。电场处理完毕，立刻取出，清洗检测孔板。

2.5检测孔板清洗：

在洗板机程序上选择对应的实验列，清洗程序选择(2bottom，2top)，洗液选择2XSSC(0.04％SDS)。清洗完毕，立刻进行DP加样操作。

3、检测杂交

3.1 DP(检测探针)溶液配制：

检测溶液是以PBS作为溶剂，其中酪蛋白的重量百分数为0.1％，检测探针的浓度为0.5μmol/L，涡旋震荡混匀，离心，备用。

3.2加样：

根据实验设计在对应的孔加入对应DP溶液30μl，加样时枪头贴近孔的底部，但是不接触到底部电极，加完后倾斜或拍打检测孔板使液体在孔里的电极表面均匀覆盖，然后立刻到EFIRM上进行电场操作。

3.3 EFIRM电场处理：

在EFIRM软件上选择进行实验的对应列，电场参数设置为：电压A：200mV，5s；电压B:300mV，5s；进行3个循环。电场处理完毕，立刻取出，清洗检测孔板。

3.4检测孔板清洗：

在洗板机程序上选择对应的实验列，清洗程序选择(2bottom，2top)，洗液选择2XSSC(0.04％SDS)。清洗完毕，立刻进行加样操作。

4、Reporter Hybridization

4.1 Poly-HRP溶液配制：

以PBS作为溶剂，其中酪蛋白的重量百分数为0.1％，poly-HRP的体积百分数为0.05％(购自thermo fisher，产品名称为Pierce^TMStreptavidin Poly-HRP，货号为21140，单位规格为0.5mL)，涡旋震荡混匀，离心，备用。

4.2加样：

根据实验设计在对应的孔加入Poly-HRP溶液20-80μl，加样时枪头贴近孔的底部，但是不接触到底部电极，加完后倾斜或拍打检测孔板使液体在孔里的电极表面均匀覆盖，然后盖上检测孔板盖子，实验台上室温孵育20-40min，计时器倒数计时。孵育时间到，立刻清洗检测孔板。

4.3检测孔板清洗：

在洗板机程序上选择对应的实验列，清洗程序选择(3bottom，3top)，洗液选择PBST(0.05％Tween20)。清洗完毕，立刻进行TMB加样操作。

5、Readout

5.1加样：

根据实验设计在对应的孔加入TMB/H₂O₂溶液(购自thermo fisher,产品货号为34022，名称为Turbo TMB底物溶液)，每个孔加入30μl，加样时枪头贴近孔的底部，但是不接触到底部电极。加完立刻到EFIRM上进行电场操作。

5.2 EFIRM电场读数：

在EFIRM软件上选择进行实验的对应列，电场参数设置为：电压A：-100mV，40s，得到电流读数。

同样地，得到的结果与基于实施例1所得的实施例1和2的结果基本一致。

SEQUENCE LISTING

<110> 广州易活生物科技有限公司

<120> 基于电场诱导释放检测技术结合靶标基因片段的转基因检测方法和试剂盒

<130> P180404-YHS

<160> 9

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> YHTS-1探针对 CP

<400> 1

gcgtcatccc ttacgtcagt 20

<210> 2

<211> 31

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> YHTS-1探针对 DP

<400> 2

ggaagggtct tgcgaaggat agtgggattg t 31

<210> 3

<211> 51

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> YHTS-1探针对针对的CaMV 35S启动子序列

<400> 3

actgacgtaa gggatgacgc acaatcccac tatccttcgc aagacccttc c 51

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> YHTS-2探针对 CP

<400> 4

ttgaaggaag cggcgaagct gg 22

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> YHTS-2探针对 DP

<400> 5

gtgtcagggg catagaaggt gaag 24

<210> 6

<211> 52

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> YHTS-2探针对针对的Lectin序列

<400> 6

ccagcttcgc cgcttccttc aacttcacct tctatgcccc tgacacaaaa ag 52

<210> 7

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> YHTS-3探针对 CP

<400> 7

agagtcagct tgtcagcgtg tcaaaaaaaa 30

<210> 8

<211> 37

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> YHTS-3探针对 DP

<400> 8

gcgcgcgtta atttgtgcca ttcttgaaag atctgct 37

<210> 9

<211> 53

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> YHTS-3探针对针对的CP4-EPSPS序列序列

<400> 9

gacacgctga caagctgact ctagcagatc tttcaagaat ggcacaaatt aac 53

Claims (10)

1.基于EFIRM技术检测转基因大豆的试剂盒，其特征在于，包括以下探针组合：检测CP4-EPSPS序列的组合1，由

第1捕获探针：5-AGAGTCAGCTTGTCAGCGTGTCAAAAAAAA-3，和

第1检测探针：5-GCGCGCGTTAATTTGTGCCATTCTTGAAAGATCTGCT-3组成，

所述CP4-EPSPS序列为：5-GACACGCTGACAAGCTGACTCTAGCAGATCTTTCAAGAATGGCACAAATTAAC检测Lectin序列的组合2，由

第2捕获探针：5-TTGAAGGAAGCGGCGAAGCTGG-3，和

第2检测探针：5-GTGTCAGGGGCATAGAAGGTGAAG-3组成，

所述Lectin序列为：CCAGCTTCGCCGCTTCCTTCAACTTCACCTTCTATGCCCCTGACACAAAAAG。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述检测探针3’端或5’端标记有用于结合催化酶的亲和物；所述亲和物为地高辛、异硫氰酸荧光素或生物素。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，还包括催化酶，所述催化酶为带有标记物的辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶；所述标记物为地高辛抗体、异硫氰酸荧光素抗体或链霉亲和素。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，还包括对应所述催化酶的底物；

当所述催化酶为辣根过氧化物酶时，所述底物是TMB、ABTS和OPD中的任一种；

当所述催化酶为碱性磷酸酶时，所述底物是BCIP和NBT的组合物、对硝基苯磷酸盐、4-硝基苯磷酸二钠、萘酚AS-BI磷酸盐、萘酚-AS-MX-磷酸盐中的任一种。

5.根据权利要求1-4任一所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括用于将所述捕获探针固定至检测孔板上的反应孔中的固定物，所述固定物包括导电聚合物和离子化合物；

所述导电聚合物为吡咯、苯胺和噻吩中的任一种；

所述离子化合物为氯化钠或氯化钾。

6.根据权利要求1-5任一所述的试剂盒，其特征在于，还包括清洗液，所述清洗液包括洗液A和洗液B，所述洗液A是含SDS的SSC缓冲液，所述洗液B是含Tween20的PBS缓冲液。

7.一种基于EFIRM技术检测转基因大豆的检测孔板，其特征在于，所述检测孔板的反应孔底部设置有工作电极并配置为可施加电压以形成电场；

所述检测孔板的反应孔内分配并固定有以下核苷酸序列所示的捕获探针：

第1捕获探针：5-AGAGTCAGCTTGTCAGCGTGTCAAAAAAAA

第2捕获探针：5-TTGAAGGAAGCGGCGAAGCTGG-3；

且一个反应孔仅固定一种捕获探针。

8.根据权利要求7所述的检测孔板，其特征在于：所述捕获探针是与导电聚合物和离子化合物混合成混合液后加到所述反应孔中，然后通过所述工作电极施加第一方波电场后固定在所述反应孔内底部表面；

所述第一电场的参数为：电压A：350mV，1s；电压B:950mV，1s；进行9个循环。

9.根据权利要求8所述的检测孔板，其特征在于，所述导电聚合物材料选自苯胺、噻吩和吡咯导电分子单体中的至少一种；

所述离子化合物选自氯化盐、硝酸盐、硫酸盐中的至少一种；

所述氯化盐为氯化钠、氯化钾、氯化镁、氯化铵中的一种，

所述硝酸盐为硝酸钠、硝酸钾、硝酸镁、硝酸铵中的一种，

所述硫酸盐为硫酸钠、硫酸钾、硫酸镁、硫酸铵中的一种。

10.一种基于EFIRM技术检测检测转基因大豆的方法，其特征在于，采用权利要求1-6任一所述的试剂盒，步骤如下：

(1)采用权利要求7-9任一所述的检测孔板；或将所述捕获探针加入到空白检测孔板中，所述反应孔内底部设置有电极，用于接通EFIRM检测仪后对反应孔内溶液施加电场进行聚合反应；接通EFIRM检测仪后对反应孔内溶液施加第一电场进行聚合反应；电场处理完毕，清洗检测孔板；所述第一电场处理的参数为：电压200-500mV，1-5s；电压800-1500mV，1-5s；3-10个循环；

(2)样本与捕获探针杂交

加入待测样本与杂交buffer的混合溶液，对反应孔施加第二电场：电压200-500mV，1-5s；电压300-800mV，1-5s；5-150个循环；清洗检测孔板；

(3)样本与检测探针杂交

加入与反应孔中的捕获探针对应的检测探针溶液，然后对反应孔施加第三电场：电压200-500mV，1-5s；电压300-800mV，1-5s；3-10个循环；清洗检测孔板，立即进行下一步操作；

所述检测探针溶液中检测探针的浓度为0.5-1.5μM

(4)加入所述催化酶液，孵育后清洗；

(5)加入底物，在电压为-100～-300mV的电场处理下读数，得到电流值，

(6)探针组1测得值与探针组2测得值的比值作为判断标准，当比值大于0.17时，判断为转基因样本；

当比值小于0.14时，判断为非转基因样本；

当比值在0.14和0.17之间时，需重新测定样本。

Images