CN114592052A - 一种肾病综合征患者pdss2致病突变基因及其检测试剂 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种肾病综合征患者PDSS2致病突变基因及其检测试剂，所述突变位于PDSS2基因第六号外显子区域，第980位的核酸序列由鸟嘌呤替换为胸腺嘧啶，即PDSS2,c.980(exon6)G>T。此突变可引起PDSS2基因的编码错误，导致327位氨基酸由精氨酸变为异亮氨酸，引起蛋白质结构和功能改变。本发明的检测试剂可有效、快速地检测PDSS2的上述致病突变，且价格低廉。
Description
技术领域
本发明涉及遗传病基因检测领域，具体涉及一种肾病综合征患者PDSS2致病突变基因及其检测试剂。
背景技术
肾病综合征(Nephrotic syndrome,NS)是一种常见的慢性肾脏病，患者以大量蛋白尿、低蛋白血症和全身性水肿为其典型的临床特征。大约有20％的NS患者表现为激素和免疫抑制剂治疗无效，其中36％-50％的患者会在10年内发展为终末期肾病。目前，临床常用的肾活检术并不能从病理诊断上为上述问题提供准确的治疗指导。
近年来，50多个与NS发病机制相关的基因突变被陆续鉴定出来，使得肾病综合征的基因诊断成为可能。这些基因的筛查则可以帮助临床医师完成NS的“基因诊断”，这不仅可避免临床盲目用药及由此带来的药物不良反应和经济负担，对某些患者还可能进行早期干预或治疗，延迟甚至避免ESRD的发生。
在这些肾病综合征的致病基因中，COQ2、COQ6、COQ9、PDSS2和ADCK4基因参与辅酶Q10的生物合成。辅酶Q10是主要由人体合成的必须维生素。辅酶Q10缺乏导致能量耗竭和氧自由基产生细胞损伤，临床表现多样，主要累及中枢神经系统、骨骼肌、周围神经病变等。近年来发现辅酶Q10缺乏可引起肾病综合征，其特征性表现为激素耐药性肾病。原发性辅酶Q10缺乏是目前唯一可以应用辅酶Q10补充治疗的肾病综合征，因此早期发现及治疗尤为重要。
目前，对NS患者的致病基因的检测，往往多采用全外显子测序技术。该方法可以在全外显子范围内寻找到患者的致病突变。然而，该方法测序时间长，往往需要6-7个工作日，且需要花费相对较贵，检测成本大。因此，寻找对诊断有效的新致病突变，并研发省时、精准的对实验条件要求较低的诊断试剂对NS患者进行快速检测，是解决NS临床诊断的有效途径之一。
发明内容
有鉴于此，为了克服现有技术的不足，本发明提供一种NS致病突变基因，并基于此研发了突变检测试剂，可以快速、准确判断检测对象是否具有此致病突变基因。
本发明公开的一种肾病综合征患者PDSS2致病突变基因，所述突变位于PDSS2基因第六号外显子区域，第980位核酸序列由鸟嘌呤突变为胸腺嘧啶，即c.980(exon6)G>T；此突变可引起PDSS2基因编码蛋白质结构与功能改变。
本发明还提供上述PDSS2致病突变基因的病因学诊断试剂，所述诊断试剂包括基因组DNA点突变分析试剂，所述分析试剂包括1)患者样本基因组DNA提取试剂盒；2)DNA-PCR扩增试剂盒：采用引物P1和P2扩增患者基因组DNA，获得目的条带；3)DNA-PCR产物Sanger测序试剂盒：以引物P2对DNA-PCR产物Sanger测序；当检测得到PDSS2基因第六号外显子区域，第980位核酸序列由鸟嘌呤突变为胸腺嘧啶，即c.980(exon6)G>T，确诊为肾病综合征患者。
上述用于患者基因组DNA提取的样本为：外周血、尿液或指甲。
上述病因学诊断试剂中用于扩增患者基因组DNA的引物对组P1和P2，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1-2所示。
上述病因学诊断试剂中用于基因组DNA-PCR产物Sanger测序的引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明所公开的PDSS2突变基因可引起NS临床表现。该突变基因引起PDSS2基因所编码蛋白质发生空间结构改变。该突变不存在于ClinVar数据库、dbSNP等数据库，为新发现的致病突变，可引起隐性遗传的、因辅酶Q10缺乏的NS临床表现。
本发明还提供上述病因学诊断试剂的制备方法，包括如下步骤：将所述引物对组中的2条单链DNA分别单独包装后，与下述物质中的至少一种包装在同一试剂盒内：PCR反应缓冲液、DNA聚合酶和4种dNTP。
与现有技术相比，本发明的优势在于：
1.本发明公开的PDSS2致病突变基因是临床肾病综合征患者的致病突变之一，该突变导致PDSS2基因编码蛋白功能异常。
2.本发明的检测试剂可有效、快速地检测PDSS2的上述致病突变。
3.本发明的检测试剂价格低廉，可减轻患者经济负担。
附图说明
图1：测试者外周血基因组DNA提取
图中，采用本发明血液基因组DNA提取试剂盒分离获得外周血DNA。
(M:DNA marker；1～2：患者DNA样品；3-4：对照DNA样品。)
图2：本发明PDSS2致病突变基因的突变区域扩增
图中，采用引物P1和P2扩增测试者基因组DNA，获得目的条带。
(M:DNA marker；1～2：患者DNA样品；3-4：对照DNA样品。)
图3：genomic DNA-PCR产物Sanger测序
图中，将图2中PCR产物直接电泳、切胶纯化后分别进行测序。
结果显示，患者1基因组DNA中存在一个点突变，位于PDSS2基因第六号外显子区域，第980位核酸序列由鸟嘌呤突变为胸腺嘧啶，即c.980(exon6)G>T。
具体实施方式
实施例1本发明肾病综合征患者PDSS2致病突变基因患者症状及致病突变基因的发现
发明人在长期的临床研究中，对一核心近亲婚配家系的研究中发现来自新桥医院肾内科患者，症状：蛋白尿、血尿、薄基底膜，疑是NS患者。经全序列测序，比对，发现本发明肾病综合征患者PDSS2致病突变基因。
PDSS2基因原始序列如SEQ ID NO.3所示。其中，
ATAAATTCTGATGTCCAGCCTTTTATTAAAGAAAAGACCAGTGACTCCATGACTTTTAATCTAAACTCAGCTCCTGTAGTCTTACATCAGGAATTTCTTGGAAGAGATTTGTGGATTAAACAGATCGGAGAG部分为第六外显子，此序列包含本发明突变基因位点c.980(exon6)G在内。
实施例2本发明PDSS2致病突变基因区域扩增引物的设计与合成
从NCBI数据库中获得PDSS2基因组序列，应用Primer软件设计检测引物，所用引物序列如下。引物从北京六合华大基因有限公司合成，采用PAGE纯化。
PDSS2基因突变区域扩增引物
P1:TTCTGATGTCCAGCCTTTTAT(SEQ ID NO.1)
P2:TTAGCATTCACCACAGGCACT(SEQ ID NO.2)
Sanger测序引物:P1。
实施例3：本发明PDSS2致病突变基因的检测试剂，以及致病突变基因的检测和验证
一、获取临床样本并设置实验组和对照组
1)实验组
患者1，样本来自新桥医院肾内科，症状：蛋白尿、血尿、薄基底膜，疑是NS患者。
患者2，样本来自新桥医院肾内科，症状：蛋白尿、血尿、薄基底膜，疑是NS患者。
3)对照组
选取2例正常人为对照组，样品编号：3、4。
二、实验方案与步骤
1.筛查检测：
本发明诊断试剂包括1)测试者样本基因组DNA提取试剂盒；2)PCR扩增试剂盒:采用引物P1和P2扩增测试者基因组DNA，获得目的条带；3)测序试剂盒：genomic DNA-PCR产物Sanger测序。
当检测得到PDSS2基因第六号外显子区域，第980位核酸序列由鸟嘌呤突变为胸腺嘧啶，即c.980(exon6)G>T。确诊为肾病综合征患者。
1.1本实施例中基因组DNA提取样品为外周血样本
采用本发明基因组DNA提取试剂盒(离心柱法)提取外周血样品基因组DNA。
1.1.1取抗凝的外周血200μL。
1.1.2加入20μL Proteinase K溶液，混匀。
1.1.3加入200μL缓冲液GB，充分颠倒混匀，70℃放置10min。
1.1.4加人200μL无水乙醇，充分振荡混匀15sec。
1.1.5将上一步所得溶液加入吸附柱中，12000rpm/30sec，弃废液。
1.1.6向吸附柱中加入500μL GD，12000rpm/30sec，弃废液。
1.1.7向吸附柱中加入600μL PW，12000rpm/30sec，弃废液，重复一次。
1.1.8 12000rpm/2min。
1.1.9吸附柱移到新的1.5mL离心管中，室温5min，晾干。
1.1.10加入30μL TB，室温3min溶解，12000rpm/2min，得到DNA样品。(如图1所示)
1.2采用本发明PCR扩增试剂盒：引物P1和P2扩增测试者基因组DNA，获得目的条带。如图2所示。
1.2.1基因组DNA样品的PCR反应体系组成
1.2.1.1引物稀释：合成的引物加水溶解至10μM，备用。
1.2.1.2反应体系组成:
混匀后进行下一步。
1.2.2基因组DNA样品的PCR检测
1.2.2.1 PCR反应条件
1.2.2.2PCR产物电泳检测
PCR反应结束后，取5μL产物，于2％琼脂糖凝胶中进行电泳，观察产物的有无及分子量大小。
1.3采用本发明测序试剂盒：基因组DNA样品的PCR产物的序列测定：
将上述产物在低熔点琼脂糖凝胶中进行电泳，电泳结束后切除相应的DNA条带回收纯化产物。采用Sanger法直接测定序列，获得相应的峰图。
1.4结果显示：
患者甲：基因组DNA中PDSS2基因第六号外显子区域存在一个点突变第980位核酸序列由鸟嘌呤突变为胸腺嘧啶，即c.980(exon6)G>T，如图3所示。
患者乙：基因组DNA正常。
对照组1：基因组DNA正常。
对照组2：基因组DNA正常。
患者甲确诊为肾病综合征患者NS患者。患者乙或为其他病因引起的肾病综合征。
实施例4：
与实施例3基本相同，所不同之处在于：
本实施例中检测者基因组DNA提取样品为指甲。
1.1指甲DNA提取
1.1.1指甲剪碎后，装入2ml离心管内。
1.1.2.加入1mL 75％乙醇，离心甩一下，去上清。
1.1.3.加入1mL水，离心甩一下，去上清。
1.1.4.加入1mL水，离心甩一下，去上清。
1.1.5.加入200μLGA，20μL蛋白酶K，20μL 1M DTT，混匀。
1.1.6. 56℃孵育3小时。
1.1.7.离心甩一下，将上清移到新管，加入200μLGB。
1.1.8. 56℃孵育10min，每3min漩涡混匀一下。
1.1.9.加200μL无水乙醇，漩涡混匀，将溶液分加入到一个吸附柱中，12000rpm/30sec，弃废液。
1.1.10.向吸附柱中加入500μL GD，12000rpm/30sec，弃废液。
1.1.11.向吸附柱中加入600μL PW，12000rpm/30sec，弃废液，重复一次。
1.1.12. 12000rpm/2min。
1.1.13.吸附柱移到新的1.5mL离心管中，室温5min，晾干。
1.1.14.加入30μL TB，室温3min溶解，12000rpm/2min，得到DNA样品。
最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国人民解放军陆军军医大学第二附属医院
<120> 一种肾病综合征患者PDSS2致病突变基因及其检测试剂
<130> 中国专利申请CN 113543814 A
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ttctgatgtc cagcctttta t 21
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ttagcattca ccacaggcac t 21
<210> 3
<211> 750
<212> DNA
<213> 人
<400> 3
cctccctagt agctggaatg tgtgtgcaaa ccccccccaa tttttgtttt tttagtagag 60
atggggtttc gccattttga ccaggctggt ctcaaactcc tgacctcagg tgatccaccc 120
atcccagcct cccaaactgc tgagattaca ggcgtaagcc actgcacctg gcctgaaata 180
ttcttttgtt tattaaagta tatctaaaaa ctgcattcct taagcttcat atttcactgc 240
attaactggt actttctgaa tataactaaa acatactagt gtatatacat ttcactaatt 300
tactcattta attgcttctt gtagataaat tctgatgtcc agccttttat taaagaaaag 360
accagtgact ccatgacttt taatctaaac tcagctcctg tagtcttaca tcaggaattt 420
cttggaagag atttgtggat taaacagatc ggagaggtaa aatgaaatta ctcctgtttt 480
aggtaccagt agtaattagt ggattttaga acataattga tatttcttgg tgatatatgg 540
ctatagatga gccttaggca tattcacgta acaggtaaaa tcctttcttt gtaatcttcg 600
tttttaagag gtaaaagatt agttaaagtt agagattgca gtactgaatt tttctattat 660
ctgagttctt agaatactgc aacacaaaac tagtgcctgt ggtgaatgct aattaactca 720
gatgactttt tttttctaaa ggctttcaaa 750
Claims (5)
1.一种肾病综合征患者PDSS2致病突变基因，其特征在于，所述突变位于PDSS2基因第六号外显子区域，第980位核酸序列由鸟嘌呤突变为胸腺嘧啶，即c.980(exon6)G>T；此突变可引起PDSS2基因编码蛋白质结构与功能改变。
2.根据权利要求1所述PDSS2致病突变基因的病因学诊断试剂，其特征在于，所述诊断试剂包括基因组DNA点突变分析试剂，所述分析试剂包括1)患者样本基因组DNA提取试剂盒；2)DNA-PCR扩增试剂盒：采用引物P1和P2扩增患者基因组DNA，获得目的条带；3)DNA-PCR产物Sanger测序试剂盒：以引物P2对DNA-PCR产物Sanger测序；当检测得到PDSS2基因第六号外显子区域，第980位核酸序列由鸟嘌呤突变为胸腺嘧啶，即c.980(exon6)G>T，确诊为肾病综合征患者。
3.根据权利要求2所述PDSS2致病突变基因的病因学诊断试剂，其特征在于，所述用于患者基因组DNA提取的样本为：外周血、尿液或指甲。
4.根据权利要求2所述病因学诊断试剂中用于扩增患者基因组DNA的引物对组P1和P2，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1-2所示。
5.根据权利要求2所述病因学诊断试剂中用于基因组DNA-PCR产物Sanger测序的引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210348448.7A CN114592052A (zh) | 2022-04-01 | 2022-04-01 | 一种肾病综合征患者pdss2致病突变基因及其检测试剂 |
Applications Claiming Priority (1)
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Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN114592052A true CN114592052A (zh) | 2022-06-07 |
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ID=81820503
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| Country | Link |
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Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2010084668A1 (ja) * | 2009-01-20 | 2010-07-29 | 国立大学法人東京大学 | ネフローゼ症候群の検査方法、並びにネフローゼ症候群の予防又は治療薬およびそのスクリーニング方法 |
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| CN109161591A (zh) * | 2018-08-01 | 2019-01-08 | 上海交通大学医学院附属瑞金医院 | 单基因遗传性肾脏病基因联合筛查方法、试剂盒及其制备方法 |
| CN113543814A (zh) * | 2019-01-18 | 2021-10-22 | 布里斯托尔大学 | 用于治疗肾病综合征的aav基因疗法 |
-
2022
- 2022-04-01 CN CN202210348448.7A patent/CN114592052A/zh active Pending
Patent Citations (4)
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Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 张树忠等: "汉族人多囊肾病1型致病基因突变检测体系的建立及初步应用", 中华检验医学杂志, vol. 25, no. 04, pages 215 - 219 * |
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