TW201326195A - 衍生自雞貧血病毒（ｃａｖ）ｖｐ２蛋白質的細胞核定位信號胜肽以及它們的應用 - Google Patents

Abstract

本發明揭示具有細胞核定位活性並且衍生自雞貧血病毒(CAV)VP2蛋白質之經分離的胜肽。該經分離的胜肽被證實在一選定的標的物質(諸如蛋白質、胜肽、核酸、藥學活性試劑、化學物質等)的核遞送上是有用且有效的。該經分離的胜肽可以藉由與一標的物質(特別是一蛋白質)形成一綴合物或者經由一能夠表現一具有該經分離的胜肽與該標的蛋白質之融合蛋白質的表現匣來輸送該標的物質至一哺乳動物細胞的細胞核內。

Description

衍生自雞貧血病毒(CAV)VP2蛋白質的細胞核定位信號胜肽以及它們的應用 相關申請案的相互引述

本件申請案主張於2011年7月21日以及2012年2月21日所分別提申的的台灣申請案第100125831號以及第101105459號的優先權。

發明領域

本發明主要是有關於衍生自雞貧血病毒(chicken anemia virus,CAV)VP2蛋白質的細胞核定位信號(NLS)胜肽[nuclear localization signal(NLS)peptides]。該NLS胜肽在核遞送一選定的標的物質[諸如蛋白質、胜肽、核酸、藥學活性試劑(pharmaceutically active agents)、化學物質(chemical substances)等]上是有用且有效的，因而被預期具有供應用於製藥、醫學、生物技術以及基因工程等領域上的潛力。

核質運輸(nucleocytoplasmic transport)是一種於真核細胞中經由核孔複合體(nuclear pore complex,NPC)而在細胞核與細胞質之間運輸巨分子(macromolecules)[諸如核蛋白質(nuclear protein)以及RNA等]的過程，它在發育過程(developmental processes)、訊息傳遞(signal transduction)以及基因表現的調控(regulation of gene expression)上扮演一重要的角色。一般而言，離子與小分子的蛋白質(亦即那些具有一範圍落在40至60 kDa內的分子量者)可以藉由被動擴 散(passive diffusion)的方式穿過NPC，接而進入細胞核中。然而，細胞核定位信號(NLS)所媒介的主動運輸[nuclear localization signal(NLS)-mediated active transport]對於大分子的蛋白質要穿過NPC並且進入細胞核中是必要的。

典型地，大多數的NLSs是含有一或二群(clusters)的鹼性胺基酸殘基的短胜肽。NLSs能夠被一輸入蛋白家族(family of importins)中的成員[它們作用有如一載體(carrier)並且包括，例如輸入蛋白α(importin α)以及輸入蛋白β(importin β)]所辨識，藉此促使該輸入蛋白與一受質蛋白質(substrate protein)進行結合，而使得該受質蛋白質藉由穿過NPCs而被輸送至細胞核內。

目前，NLSs可以被區分為以下三大類型：(i)單分型NLSs(monopartite NLSs)，它們主要是由一群鹼性胺基酸殘基(basic amino acid residue)[諸如，離胺酸(lysine)以及精胺酸(arginine)]所構成，而其代表例是SV40大T抗原NLS(SV40 large T antigen NLS)(PKKKRKV，序列辨識編號：1)；(ii)二分型NLSs(bipartite NLSs)，它們主要是由兩群藉由一為大約10至12個胺基酸殘基的間隔(spacer)而被分隔的鹼性胺基酸殘基所構成，而其代表例是核質蛋白NLS(nucleoplasmin NLS)(KRPAATKKAGQAKKKK，序列辨識編號：2)；以及(iii)非典型NLSs(noncanonical NLSs)，它們主要是由極 性或非極性胺基酸殘基所構成，而其代表例包括，例如hnRNP A1蛋白的M9領域(M9 domain)、位於流行性感冒病毒(influenza virus)的核蛋白上的NLS、位於酵母菌轉錄抑制子Matα2(yeast transcription repressor Matα2)上的NLS以及位於酵母菌Gal4蛋白質上的NLS。

先前的研究顯示，帶有正電荷的NLS胜肽可以藉由靜電交互作用(electrostatic interaction)而被偶合至帶有負電荷的DNA分子上，藉此增強該DNA分子的核運輸(nuclear transport)。另擇地，NLS胜肽可被共價地偶合至一基因遞送系統(gene delivery system)的凝聚劑(condensing agent)[諸如一陽離子聚合物(cationic polymer)]或者一DNA分子的磷酸主鏈(phosphate backbone)上(Marieke A.E.M.van der Aa et al.(2006),Pharmaceutical Research,23：447-459)。此外，NLS胜肽可被連結至一抗癌藥物(antitumor drugs)[諸如一光敏劑(photosensitizer)以及一放射性核種(radionuclides)]，俾以將該抗癌藥物遞送至細胞核內以供治療(T.V.Akhlynina et al.(1997),J.Biol.Chem.,272：20328-20331；A.S.Sobolev(2009),Biochemistry(Moscow),74：1567-1574)。

基於上述有利的生物活性，NLS胜肽已被廣泛地應用於基因轉殖(gene transfection)[諸如，內源性或外源性核酸(endogenous or exogeneous nucleic acid)的表現調節，以及表觀基因調節(epigenetic regulation)]、基因治療(gene therapy)以及藥物遞送(drug delivery)上。

然而，一NLS胜肽是否具有上述任何一種應用的潛力將端視其核運輸效率(nuclear transport efficiency)而定。再者，為了有效地將一所欲的物質(諸如，一標的基因、蛋白質、藥物以及類似之物)遞送至一標的細胞的細胞核內並於該處展現活性/功能，除了就核運輸效率(nuclear transport efficiency)來最適化(optimizing)一NLS胜肽之外，還需要考量一被用來遞送該物質的核運輸系統(nuclear transport system)的生物性質，包括細胞攝取(cellular uptake)[諸如細胞吞噬作用(endocytosis)]以及細胞內運輸(intracellular trafficking)等。因此，本技藝中的研究人員致力於探究在哺乳動物細胞中展現細胞核定位能力之新的NLS胜肽。

雞貧血病毒(chicken anemia virus,CAV)[又被稱為雞傳染性貧血病毒(chicken infectious anemia virus,CIAV)]是一種小的、無外套膜的單股環狀DNA病毒(non-envelopedsingle-stranded circular DNA virus)，它會在受感染的雞隻身上引起一嚴重的免疫抑制症候群(severe immunosuppressive syndrome)以及貧血(anemia)。迄今，許多的CAV分離株[包括來自澳洲、孟加拉(Bangladesh)、巴西、中國、德國、馬來西亞、奈及利亞(Nigeria)、斯洛伐尼亞(Slovenia)、台灣以及美國的菌株]已被報導並且已使全部或部分的序列被公開(Schat KA(2009),Curr Top Microbiol Immunol.,331：151-183；以及Y.S.Lu et al.(1993),Exp.Rep.TPRIAH,29：81-89)。

CAV的DNA基因組(genome)在大小上大約2.3 kb，並 且具有3個開放閱讀架構(open reading frames,ORFs)存在於負義基因組(negative sense genome)上。至少3種病毒蛋白(virus proteins)是從一個單一多順反子的2.1 kb mRNA(single polycistronic 2.1 kb mRNA)中被生成，該單一多順反子的2.1 kb mRNA有如一單一分子而被生成，並且具有一啟動子(promoter)、TATA-盒(TATA-box)以及聚(A)信號[poly(A)signal]。該3種經轉譯的蛋白質分別被稱為VP1、VP2以及VP3，其中VP1是一為51 kDa的蛋白質，它是涉及病毒殼體的組裝(assembly of the viral capsid)的結構蛋白質(structural protein)；VP2是一為24 kDa的蛋白質，它具有一雙特異性磷酸酶(dual-specificity phosphatase,DSP)活性，並且對於病毒的感染、組裝與複製(replication)是必需的；以及VP3[亦被稱為凋亡蛋白(apoptin)]是一為13 kDa的蛋白質，它會在受感染的雞隻細胞中誘發細胞凋亡(apoptosis)。

有研究顯示，CAV VP3蛋白質具有兩個NLSs，一個(亦即NLS1)是坐落在橫跨胺基酸殘基82至88處的位置，而另一個(亦即NLS2)是坐落在橫跨胺基酸殘基111至121處的位置，其中這兩個NLSs一起作用有如一個二分型NLS，並且構成一種癌細胞-專一性的細胞核標靶信號(tumor cell-specific nuclear targeting signal)，能夠讓VP3蛋白質專一性地在癌細胞與經轉形的細胞(transformed cell)中誘發細胞凋亡，但是不會對正常或未經轉形的細胞造成影響(Astrid A.A.M.Danen-van Oorschot et al.(2003),J.Biol.Chem.,278：27729-27736；Ivan K.H.Poon et al.(2005),Cancer Res., 65：7059-7064)。

C.Lacorte等人評估3種被融合以綠色螢光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的CAV蛋白質，亦即GFP：VP1、GFP：VP2以及GFP：VP3，在植物細胞中的表現情形。被融合至GFP的VP1、VP2以及VP3皆顯示出細胞核定位(nuclear localization)，這表示這3種CAV蛋白質的細胞核定位信號在植物中是有功能的。然而，此細胞核定位並非一直被觀察到，因為VP3不會在正常人類細胞的細胞核中定位(C.Lacorte et al.(2007),Virus Research,129：80-86)。

然而，有鑑於NLS胜肽的短長度以及序列歧異性(sequence divergence)，要單純藉由分析一特定蛋白質的胺基酸序列來預測該蛋白質中的功能性NLS胜肽的位置是有困難的。

就申請人所知，有關CAV VP2蛋白質的細胞核定位的特定機制尚未被瞭解。於本發明中，申請人致力於探究來自CAV VP2蛋白質的NLS胜肽，它們在哺乳動物細胞中是具有功能的。因此，申請人使用一電腦化方法(In silico method)來分析各種不同的CAV分離株的VP2蛋白質，並預測它們所含有的可能的NLS胜肽，繼而進行刪除分析(deletion analysis)以及點突變分析(point mutation analysis)。所得到的實驗結果顯示：CAV VP2蛋白質含有一功能性NLS胜肽，它是坐落在一橫跨該CAV VP2蛋白質的全長胺基酸序列的胺基酸殘基133至138處的區域，並且該NLS胜肽已被証實能展現細胞核定位能力，以供用於在哺乳動 物細胞中的功能性分子(functional molecules)的核遞送(nuclear delivery)。

發明概要

於是，在一第一個方面，本發明提供一種具有細胞核定位活性之經分離的胜肽，其中該經分離的胜肽具有一胺基酸序列是：(i)對應於一全長具有216個胺基酸的野生型CAV VP2蛋白質所具者，除了位在該野生型CAV VP2蛋白質的133和/或134處的胺基酸殘基被替換為丙胺酸，或者位在該野生型CAV VP2蛋白質的136至138處的胺基酸殘基被替換為丙胺酸，或者位在該野生型CAV VP2蛋白質的150至152處的胺基酸殘基被替換為丙胺酸，或者位在該野生型CAV VP2蛋白質的136至138與150至152處的胺基酸殘基被替換為丙胺酸；或(ii)對應於該野生型CAV VP2蛋白質的一C端截短的產物所具者，其中位在該野生型CAV VP2蛋白質的133至138處的胺基酸殘基在C端截短之後未改變；或(iii)對應於該野生型CAV VP2蛋白質的一N端截短的產物所具者，其中位在該野生型CAV VP2蛋白質的133至138處的胺基酸殘基在N端截短之後未改變；或(iv)對應於該野生型CAV VP2蛋白質的一N端與C端截短的產物所具者，其中該野生型CAV VP2蛋白質的133至138處的胺基酸殘基在N端與C端截短之後未改變； 或(v)以下列式(I)來表示：Lys-Arg-Ala-X ₁ -X ₂ -X ₃ -Z (I)其中：X1、X2以及X3各自獨立地為一選自於丙胺酸、離胺酸以及精胺酸的胺基酸；以及Z為不存在，或者表示Leu、Leu-Asp或Leu-Asp-Tyr。

依據一第二個方面，本發明提供一種細胞核運輸系統，其包含有一要被遞送至一哺乳動物細胞的細胞核內的標的物質，其中該標的物質是與一如上所述之經分離的胜肽相締合。

依據一第三個方面，本發明提供一種編碼一包含有一如上所述的經分離的胜肽與一要被遞送至一哺乳動物細胞的細胞核內的標的蛋白質之融合蛋白質的核酸建構物，其中該核酸建構物包含有一編碼該經分離的胜肽的第一核酸片段以及一與該第一核酸片段相融合並且編碼該標的蛋白質之第二核酸片段。

依據一第四個方面，本發明提供一種能夠表現一包含有一如上所述的經分離的胜肽與一要被遞送至一哺乳動物細胞的細胞核內的標的蛋白質之融合蛋白質的表現匣，其中該表現匣包含有如上所述的核酸建構物以及一被可操作地連結至該核酸建構物的啟動子。

依據一第五個方面，本發明提供一種重組型載體，其帶有如上所述的表現匣。

圖式簡單說明

本發明的上述以及其它目的、特徵與優點，在參照以下的詳細說明與較佳實施例和隨文檢附的圖式後，將變得明顯，其中：圖1顯示質體pGEX-6P-1-VP2的架構圖，其中P_tac表示一tac啟動子；GST表示一編碼麩胱甘肽-S-轉移酶(glutathione-S-transferase)的基因；Amp^r表示一胺芐青黴素-抗性基因(ampicillin-resistance gene)；vp2表示一編碼CAV台灣CIA-89菌株的一VP2蛋白質的基因；以及EcoRI與XhoI分別表示對應的限制酶的辨識位址；圖2顯示質體pcDNA3.1-GFP的架構圖，其中P_CMV表示一CMV啟動子；gfp表示一編碼一綠色螢光蛋白質(green fluorescent protein,GFP)的基因；Amp^r表示一胺苄青黴素-抗性基因；以及EcoRI與XhoI分別表示對應的限制酶的辨識位址；圖3顯示一如在下面實施例1中所得到之重組型載體pVP2-yT&A的架構圖，其中Amp^r表示一胺苄青黴素-抗性基因；vp2表示一如序列辨識編號：3所示的vp2基因(參見下面實施例1)；以及EcoRI與XhoI分別表示對應的限制酶的辨識位址；圖4顯示一如在下面實施例1中所得到之重組型載體pcDNA3.1-VP2-GFP的架構圖，其中P_CMV表示在圖2中所顯示的CMV啟動子；vp2表示在圖3中所顯示之該如序列辨識編號：3所示的vp2基因；gfp表示在圖2中所顯示的 GFP編碼基因；Amp^r表示在圖2中所顯示的胺苄青黴素-抗性基因；以及EcoRI與XhoI分別表示對應的限制酶的辨識位址；圖5顯示HeLa細胞(上面部分)或CHO細胞(下面部分)在轉染以一對照質體pcDNA3.1-GFP或在下面實施1中所得到的重組型質體pcDNA3.1-VP2-GFP之後，在可見光下或者在一為480 nm(針對螢光影像)或350 nm(針對DAPI影像)的波長下使用一Zeiss AxioVert 200倒立顯微鏡並在一為400倍的放大倍率下所觀察到的GFP或VP2-GFP的表現，其中可見光影像顯示細胞在轉染之後的細胞形態(cellular morphology)；GFP的位置是藉由在一螢光影像中所發出的綠色螢光而被指明；以及一細胞核的位置是藉由在一DAPI影像中所發出的藍色螢光而被指明；圖6顯示6種不同的CAV分離株的VP2蛋白質藉由生物工作台3.2軟體(San Diego Supercomputer Center(SDSC),San Diego,CA,USA)來進行分析的胺基酸序列比對結果，其中在一VP2蛋白質的序列中一經底線標示的胺基酸殘基的區域表示一個由WoLF PSORT軟體(P.Horton et al.(2007),Nucleic Acids Research,35：W585-587)所預測出之推測的二分型NLS要素(motif)(在下文中意指為“BiNLS1要素”)的位置；以及在一VP2蛋白質的序列中一經粗體標示的胺基酸殘基的區域表示一個由NLStradamus軟體(Alex N Nguyen Ba et al.(2009),BMC Bioinformatics,10：202-212)所預測出之推測的單分型NLS要素(motif)(在下文中意指為“NLS2要 素”)的位置；圖7示意地顯示在下面實施例1中所生成的一全長VP2-GFP融合蛋白質(fusion protein)以及在下面實施例3中所生成的6種截短的VP2-GFP融合蛋白質(truncated VP2-GFP fusion proteins)，其中一全長或截短的VP2蛋白質是藉由一黑帶而被指明；在各個黑帶上面的每一個數字表示一在該全長VP2蛋白質中對應的胺基酸位置；以及一GFP蛋白質是藉由一白帶而被指明；圖8顯示HeLa細胞以及CHO細胞在轉染以下面實施例3中所構築出的6種不同的重組型質體之後，在一為480 nm(針對螢光影像)或350 nm(針對DAPI影像)的波長下使用一Zeiss AxioVert 200倒立顯微鏡並在一為400倍的放大倍率下所觀察到的顯微鏡檢查結果，其中以VP2-115dC、VP2-132dC、VP2-145dC、VP2-111dN、VP2-141dN以及VP2-160dN來表示的6種重組型質體分別帶有一在圖7中所顯示之編碼6種截短的VP2-GFP融合蛋白質之一者的截短的vp2-gfp融合基因；GFP的位置是藉由在一螢光影像中所發出的綠色螢光而被指明；以及一細胞核的位置是藉由在一DAPI影像中所發出的藍色螢光而被指明；圖9顯示HeLa細胞以及CHO細胞在轉染以下面實施例4中所構築出的6種不同的重組型質體之後，在一為480 nm(針對螢光影像)或350 nm(針對DAPI影像)的波長下使用一Zeiss AxioVert 200倒立顯微鏡並在一為400倍的放大倍率下所觀察到的顯微鏡檢查結果，其中該6種重組型質 體分別帶有一編碼一突變的VP2-GFP融合蛋白質之突變的vp2-gfp融合基因，該突變的VP2-GFP融合蛋白質含有一以VP2-150-152A、VP2-136-138A、VP2-136-138A/150-152A、VP2-136-138A/133A、VP2-136-138A/134A或VP2-136-138A/133A/134A來表示之突變的VP2蛋白質；GFP的位置是藉由在一螢光影像中所發出的綠色螢光而被指明；以及一細胞核的位置是藉由在一DAPI影像中所發出的藍色螢光而被指明；圖10顯示HeLa細胞以及CHO細胞在轉染以下面實施例4中所構築出的3種不同的重組型質體之後，在一為480 nm(針對螢光影像)或350 nm(針對DAPI影像)的波長下使用一Zeiss AxioVert 200倒立顯微鏡並在一為400倍的放大倍率下所觀察到的顯微鏡檢查結果，其中該3種重組型質體分別帶有一編碼一突變的VP2-GFP融合蛋白質之突變的vp2-gfp融合基因，該突變的VP2-GFP融合蛋白質含有一以VP2-133A、VP2-134A或VP2-133A/134A來表示之突變的VP2蛋白質；GFP的位置是藉由在一螢光影像中所發出的綠色螢光而被指明；以及一細胞核的位置是藉由在一DAPI影像中所發出的藍色螢光而被指明；圖11顯示HeLa細胞以及CHO細胞在轉染以下面實施例5中所構築出的一重組型質體pcDNA3.1-VP2(112-145)-GFP[以“VP2(112-145)”來表示]或一重組型質體pcDNA3.1-VP2(133-138)-GFP[以“VP2(133-138)”來表示]之後，在可見光下或者在一為480 nm(針對螢光影像)或350 nm(針對 DAPI影像)的波長下使用一Zeiss AxioVert 200倒立顯微鏡並在一為400倍的放大倍率下所觀察到的顯微鏡檢查結果，其中可見光影像顯示細胞在轉染之後的細胞形態；GFP的位置是藉由在一螢光影像中所發出的綠色螢光而被指明；以及一細胞核的位置是藉由在一DAPI影像中所發出的藍色螢光而被指明；以及圖12顯示HeLa細胞在轉染以下面實施例5中所構築出的重組型質體pcDNA3.1-VP2(112-145)-GFP[以“VP2(112-145)”來表示]以及下面實施例6中所構築出的4種重組型質體pcDNA3.1-VP2(112-145)-136-138A-GFP[以“VP2(112-145)-136-138A”來表示]、pcDNA3.1-VP2(112-145)-136-138A/133A-GFP[以“VP2(112-145)-136-138A/133A”來表示]、pcDNA3.1-VP2(112-145)-136-138A/134A-GFP[以“VP2(112-145)-136-138A/134A”來表示]與pcDNA3.1-VP2(112-145)-136-138A/133A/134A-GFP[以“VP2(112-145)-136-138A/133A/134A”來表示]之後，在可見光下或在一為480 nm(針對螢光影像)的波長下使用一Zeiss AxioVert 200倒立顯微鏡並在一為400倍的放大倍率下所觀察到的顯微鏡檢查結果，其中GFP的位置是藉由在一螢光影像中所發出的綠色螢光而被指明；以及一合併影像表示該螢光影像與一對應的可見光影像(其顯示細胞在轉染之後的細胞形態)的合併。

發明的詳細說明

要被瞭解的是：若有任何一件前案刊物在此被引述， 該前案刊物不構成一個下述承認：在台灣或任何其他國家中，該前案刊物形成本技藝中的常見一般知識之一部分。

為了本說明書之目的，將被清楚地瞭解的是：術語“包含有(comprising)”意指“包含但不限於”，以及術語“包括(comprises)”具有一對應的意義。

除非另外有所定義，在本文中所使用的所有技術性與科學術語具有熟悉本發明所屬技藝的人士所共同瞭解的意義。一熟悉本技藝者會認知到許多與那些被描述於本文中者相似或等效的方法和材料，它們可被用於實施本發明。當然，本發明決不受到所描述的方法和材料之限制。為表清楚，下面的界定被使用於本文中。

除非另有指明，核酸是以5’至3’方向而由左至右被書寫，而胺基酸序列分別是以胺基至羧基方向而由左至右被書寫。數值範圍包含界定範圍的數字在內。胺基酸可以其一般所知曉的三個字母符號或以IUPAC-IUB生物化學命名委員會(IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission)所建議的單一字母符號而於此處被意指。核苷酸同樣可以它們一般被接受的單一字母密碼而被意指。上面所界定的術語參照本說明書作為一整體而被更充分地界定。

“重組型DNA技術(Recombinant DNA technology)”意指用於聯合兩個異源性DNA分子(heterologous DNA molecules)的技術，通常憑藉活體外接合來自於不同生物體的DNA。重組型DNA分子一般藉由在基因工程(genetic engineering)上進行試驗而被製造。同義的術語包括“基因剪接(gene splicing)”、“分子選殖(molecular cloning)”以及“遺傳工程(genetic engineering)”。這些操作的產物導致一“重組體(recombinant)”或“重組型分子(recombinant molecule)”。

用於操作核酸的技術[諸如那些用於在序列上產生突變(mutation)、次選殖(subcloning)、標記(labeling)、探測(probing)、雜交(hybridization)等]被詳細地描述於科學發表以及專利文件中。參見，例如Sambrook J,Russell DW(2001)Molecular Cloning：a Laboratory Manual,3rd ed.Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York；Current Protocols in Molecular Biology,Ausubel ed.,John Wiley & Sons,Inc.,New York(1997)；以及Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology：Hybridization With Nucleic Acid Probes,Part I,Theory and Nucleic Acid Preparation,Tijssen ed.,Elsevier,N.Y.(1993)。

如此處所用的，術語“衍生自(derived from)”意指一組分是被分離自一被指明的分子或生物體，或者該被指明的分子或生物體的資訊，或是使用該被指明的分子或生物體，或者該被指明的分子或生物體的資訊而被製得。例如，一衍生自一第二多肽(polypeptide)的多肽可以含有一胺基酸序列是相同於或實質上相似於該第二多肽的胺基酸序列。就多肽而言，所衍生出的物種可以藉由，例如天然存在的突變發生(naturally occurring mutagenesis)、人工指引的突變發生(artificial directed mutagenesis)或人工隨機的突變發生(artificial random mutagenesis)而被獲得。被用來衍生出多 肽的突變發生可以是被有意地指明或有意地隨機過程，或者各自的一混合。一多肽的突變發生用以產生一衍生自第一者之不同的多肽可以是一隨機事件[例如由聚合酶的不精確(infidelity)所導致]，而所衍生的多肽的鑑別可以藉由適當的篩選方法(例如此處所討論的)來進行。一多肽的突變發生典型地必須操作編碼該多肽的聚核苷酸。如此處所用的，術語“衍生自”包含術語“源自於(originated from)”、“得自於(obtained from)或可得自於(obtainable from)”以及“分離自(isolated from)”。

如此處所用的，術語“經分離的(isolated)和/或經純化的(purified)”意指一核酸分子、一多肽、胜肽或蛋白質的活體外製備、分離和/或純化，而使得它不會與活體內物質相締合(associated)。因此，術語“經分離的”當被用來與一核酸有關聯時，有如在“經分離的寡核苷酸(isolated oligonucleotide)”或“經分離的聚核苷酸(isolated polynucleotide)”上意指一核酸序列，它是從至少一汙染物(contaminant)(其通常被締合於它的來源中)中被鑑別出或分開。一經分離的核酸是以一不同於其在自然界中被發現的形式(form)或環境(setting)而存在。相反地，非經分離的核酸(例如DNA與RNA)是以它們存於在自然界中的狀態而被發現。例如，一既定的DNA序列(例如一基因)是在一宿主細胞染色體(host cell chromosome)上於鄰近的基因附近被發現；而RNA序列(例如編碼一特定蛋白質之一特定的mRNA序列)在一細胞中是有如一與編碼許多蛋白質之大量的其他 mRNAs相混合的混合物而被發現。因此，有關一“經分離的核酸分子”，它包括一基因組的聚核苷酸、cDNA或合成性來源(synthetic origin)，或者它們的一些組合，該“經分離的核酸分子”：(1)沒有與全部或一部分的一聚核苷酸相締合，其中該“經分離的核酸分子”在自然界中被發現，(2)被可操作地連結至一在自然界中沒有與其相連結的聚核苷酸，或(3)沒有作為一較大序列的一部分而存在於自然界中。該經分離的核酸分子可以單股(single-stranded)或雙股形式(double-stranded form)而存在。

如此處所用的，術語“標的物質(target substance)”意指一意欲要被導入至一細胞的細胞核內的物質。由本發明所標靶的物質是在正常條件下不被導入的物質。因此，在本發明的一個重要方面中，可以在正常條件下藉由擴散(diffusion)或疏水性交互作用(hydrophobic interaction)而被導入至細胞內的物質不會被標靶。在正常條件下不被導入至細胞內的物質的實例包括，但不限於：蛋白質(胜肽)、RNA、DNA、多醣(polysaccharides)與它們的複合分子(composite molecules)(例如，醣蛋白、PNA等)、病毒載體以及其他的化合物。

如此處所用的，術語“締合以(associated with)”描述在2或多種基團(groups)、部分(moieties)、化合物、單體(monomers)等之間或之中的作用力。如此處所描述的，當2或多種物質(entities)被“締合以”一其他物質，它們藉由一直接或間接的共價(covalent)或非共價交互作用(non-covalent interaction)而被連結。較佳地，該締合是共價的。該共價締合可以是，例如，但不限於：經由一醯胺(amide)、酯、碳-碳、雙硫(disulfide)、胺甲酸酯(carbamate)、醚、硫醚(thioether)、脲(urea)、胺(amine)或碳酸酯(carbonate)鍵聯(linkage)。該共價締合亦可包括一連接部分(linker moiety)，例如一連接兩個多肽分子的間隔序列(spacer sequence)。所欲的非共價交互作用包括氫鍵結(hydrogen bonding)、凡得瓦交互作用(van der Waals interactions)、偶極-偶極交互作用(dipole-dipole interactions)、π堆疊交互作用(pi stacking interactions)、疏水性交互作用(hydrophobic interactions)、磁相互作用(magnetic interactions)、靜電交互作用(electrostatic interactions)等。2或多種部分或試劑亦可藉由一起存在於相同的組成物中而互相締合。如此處所用的，術語“締合以”可與術語“結合至(bound to)”、“偶合至(coupled to)”、“聯結至(linked to)”、“連結以(attached with)”、“綴合以(conjugated with)”、“融合以(fused with)”等同義。

如此處所用的，術語“綴合(conjugate)”或“綴合(conjugation)”意指2或多種化合物(特別是蛋白質)被一起結合的連結而形成一物質。這些化合物可以藉由連接子部分(linker moieties)、化學修飾(chemical modification)、胜肽連接子(peptide linkers)、化學連接子(chemical linkers)、共價或非共價鍵、蛋白質融合(protein fusion)或藉由一熟習此技藝者所詳知方法而被連結。該連結可以是永久的(permanent) 或可逆的(reversible)。在一些具體例中，為了利用該綴合物中的各個連接子或各個蛋白質之所欲的性質，數個連接子可被包含。彈性連接子(Flexible linkers)或增加該綴合物的可溶性的連接子被預期可單獨使用或與此處所併入的其它連接子一起使用。胜肽連接子可藉由表現編碼該連接子的DNA而被連結至該綴合物中的一或多個蛋白質。連接子可以是酸可切割的(acid cleavable)、光可切割的(photocleavable)以及熱-敏感性連接子(heat-sensitive linkers)。

如此處所用的，術語“序列歧異性(sequence divergence)”意指在相關的核酸序列之間的一比較後，於核苷酸序列上的百分比差異，或者在相關的蛋白質之間的一比較後，於胺基酸序列上的百分比差異。

如此處所用的，術語“%相同性(% identity)”意指2個胺基酸或核酸序列之間藉由一經定義的演算法(algorithm)而被決定的相同性的位準，因此一既定序列的同源物(homologue)在該既定序列的一長度上具有至少大約70%或80%，較佳地大約90、95或98%的序列相同性。將被瞭解的是：術語“70%同源性(homology)”與70%序列相同性意指相同的情況。

如此處所用的，術語“蛋白質”、“多肽(polypeptide)”和“胜肽(peptide)”可被交換地使用，且意指一種由2或多個經由肽鍵(peptide bonds)或其他鍵結(諸如酯鍵、醚鍵等)而被連結的組成胺基酸(constituent amino acids)所構成的有機聚合物。如此處所用的，術語“蛋白質”典型地意指大的多肽，而術語“胜肽”典型地意指短的多肽。如此處所用的，術語 “胺基酸”意指天然和/或非天然或者合成的胺基酸，包括甘胺酸(glycine)與D和L光學異構物(optical isomers)這兩者、胺基酸類似物(amino acid analogs)以及擬肽物(peptidomimetics)。

如此處所用的，術語“對應於(corresponding to)”或“對應於(corresponds to)”通常被用來指明一胺基酸殘基在一多肽上的位置/身分。為了簡明的目的，那些通常技藝者將會體會到的是：一標準編號系統(canonical numbering system)典型地被用來指明在一多肽中有關一特別建立的參考多肽的位置，藉此一胺基酸“對應於”，例如一位在第190個位置的殘基，不需真正是在一特定胺基酸鏈的第190個胺基酸，而是對應於被發現在該參考多肽中的第190個殘基。那些在本技藝中的通常技藝者可立即地體會到如何鑑別對應的胺基酸。術語“對應於”的定義亦適用於在一核酸分子中的核苷酸殘基。

如此處所用的，術語“重組型多肽(recombinant polypeptide)”被定義為一由重組型DNA方法學(recombinant DNA methodologies)所生產的多肽，其中該多肽在表現一編碼它的重組型聚核苷酸後而被生成。另擇地，多肽亦可被化學地合成，例如使用一自動化多肽合成儀(automated polypeptide synthesizer)。

如此處所用的，術語“野生型(wild-type)”意指一基因或一基因產物具有當分離自一天然存在的來源時的基因或基因產物的特性。如此處所用的，術語“野生型(wild-type)”與 術語“天然存在的(naturally-occurring)”可被交換地使用。

一“野生型”蛋白質意指該蛋白質必須是活化的而處於一在自然中所發現的活性的位準上，並且典型地必須是在自然界中所發現的胺基酸序列。在一個方面，術語“野生型”或“親代序列(parental sequence)”可以表示在本發明的一操作之前的一起始或參考序列。

如此處所用的，術語“突變(mutation)”意指一被導入至一親代序列中的改變，這包括，但不限於：取代(substitution)、插入(insertion)以及刪除(deletion)[包括截短(truncations)]。一突變的結果包括，但不限於：產生一種沒有在由該親代序列所編碼的蛋白質中被發現之新的特性、性質、功能、表現型(phenotype)或特徵。

如此處所用的，術語“突變體(mutant)”意指一基因或基因產物當相較於野生型基因或基因產物時會在序列和/或功能性質上展現修飾(亦即改變的特性)。要注意的是，天然存在的突變體可以被分離出，這是藉由當相較於野生型基因或基因產物時，它們具有改變的特性的事實而被確認。該突變體可以是一存在於自然界中者[諸如對偶基因型突變體(allelic mutant)]，或者一在自然界中尚未被鑑別者。該突變體可以被守恆地改變，其中經取代的胺基酸保留類似於那些原始胺基酸所具有的結構或化學特性。罕見地，突變體可能被非守恆地取代。

如此處所用的，術語“取代(substitution)”意指當相較於天然存在的分子，一或多個胺基酸或核苷酸分別被不同的 胺基酸或核苷酸置換。

就一蛋白質、多肽或它們的片段而言，術語“C端截短的產物(C-terminally truncated product)”一般表示當相較於該蛋白質、多肽或它們的片段，該產物具有一C端的一或多個胺基酸殘基的刪除。

就一蛋白質、多肽或它們的片段而言，術語“N端截短的產物(N-terminally truncated product)”一般表示當相較於該蛋白質、多肽或它們的片段，該產物具有一N端的一或多個胺基酸殘基的刪除。

如此處所用的，術語“核酸(nucleic acid)”以及“核酸序列(nucleic acid sequence)”意指一呈單股或雙股形式的去氧核糖核苷酸(deoxyribonucleotide)或核糖核苷酸(ribonucleotide)序列，其包含有天然存在的且已知的核苷酸或者人造化學仿效物(artificial chemical mimics)。如此處所用的，術語“核酸”與術語“基因”、“cDNA”、“mRNA”、“寡核苷酸(oligonucleotide)”以及“聚核苷酸(polynucleotide)”可被交換地使用。

如此處所用的，術語“聚核苷酸(polynucleotide)”意指一藉由磷酸二酯鍵聯(phosphodiester linkages)而被連結之核苷酸的序列。本發明的一聚核苷酸可以是一個呈單股或者雙股形式的去氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid,DNA)分子或核糖核酸(ribonucleic acid,RNA)分子。核苷酸鹼基在此是藉由一個單一字母代碼(letter code)而被表示：腺嘌呤(adenine,A)、鳥嘌呤(guanine,G)、胸腺嘧啶(thymine,T)、 胞嘧啶(cytosine,C)、肉苷(inosine,I)以及尿嘧啶(uracil,U)。本發明的一聚核苷酸可使用對於在本技藝中具有通常技術者所熟知的標準技術而被製備。這個術語不是要被解讀為限制關於一聚合物的長度，並且涵括天然核苷酸的已知類似物(analogues)，以及在糖和/或磷酸部分上被修飾的核苷酸。這個術語亦涵括含有經修飾的主鏈殘基(backbone residues)或鍵聯(linkages)的核酸，該等核酸是合成的、天然存在的(naturally occurring)以及非天然存在的，該等核酸具有如同參考核酸之相似的結合性質，並且該等核酸以一相似於參考核苷酸的方式被代謝。

如本文中所用的，術語“DNA片段(DNA fragment)”與“核酸片段”可被交換地使用，並且意指一種DNA聚合物(DNA polymer)，該DNA聚合物是呈一獨立節段(separate segment)的形式或者是作為一較大的DNA建構物(DNA construct)的一組分(component)，其可以是衍生自分離的DNA(isolated DNA)或是諸如藉由在別處所揭示的方法而被化學地或酵素地合成。

如此處所用的，術語“基因(gene)”意指一DNA序列，包括但不限於：一可被轉錄成mRNA[它可被轉譯成多肽鏈(polypeptide chains)]、被轉錄成rRNA或tRNA，或者供酵素以及其他涉及DNA複製(DNA replication)、轉錄(transcription)以及調節(regulation)的蛋白質作為辨識位址(recognition sites)的DNA序列。這個定義包括各種不同的序列多型性(sequence polymorphisms)、突變和/或序列變異 體(sequence variants)，其中該等改變(alternation)不會影響基因產物(gene product)的功能。該術語“基因(gene)”被意欲包括不只編碼基因產物的區域還有調節區域包括，例如：啟動子、終止區域(termination regions)、轉譯調節序列(translational regulatory sequences)[諸如，核糖體結合位址以及內部核糖體進入位址(internal ribosome entry sites)]、增強子(enhancers)、默化子(silencers)、絕緣子(insulators)、邊界要素(boundary elements)、複製源點(replication origins)、基質附著位址(matrix attachment sites)，以及基因座控制區域(locus control regions)。該術語“基因”進一步包括所有插入子(intron)以及其他被剪接自mRNA轉錄本(mRNA transcripts)的DNA序列，還有由選擇性剪接位址(alternative splice site)所導致的變異體。該術語“基因(gene)”包括，但不限於：結構基因(structural genes)、免疫基因(immunity genes)以及分泌(輸送)基因[secretory(transport)genes]。

如此處所用的，術語“融合基因(fusion gene)”意指一DNA節段(DNA segment)，其中兩個或多個基因被融合在一個單一閱讀架構(reading frame)內以編碼兩個或多個藉由一或多個肽鍵(peptide bond)而被結合的蛋白質。如此處所用的，術語“融合蛋白質(fusion protein)”意指由一融合基因所編碼的蛋白質或多肽，而它與術語“融合基因產物(fusion gene product)”可被交換地使用。

如此處所用的，術語“編碼(encoding)”或“編碼的 (encoded)”當用於一指定的核酸的情況時，意指該核酸包含有必要的資訊以指引該核苷酸序列轉譯為一指定的蛋白質。編碼一蛋白質的資訊是藉由密碼子(codon)的使用而被指明。一個編碼一蛋白質的核酸可包含有在該核酸的轉譯區域內的非-轉譯序列(non-translated sequences)[例如插入子(intron)]，或者可缺少該介於中間的非-轉譯序列(例如有如cDNA)。

如此處所用的，術語“密碼子(codon)”是一種基本的遺傳編碼單位(basic genetic coding unit)，它是由一為3個核苷酸的序列所構成，該序列指明一特定的要被併入至一多肽鏈中的胺基酸，或者一起始或終止訊號。術語“密碼子區域(codon region)”當被使用於關於結構基因(structural gene)時，意指該核苷酸序列由於一個mRNA分子的轉譯而編碼在初生的多肽(nascent polypeptide)中所發現到的胺基酸。

一個“DNA編碼序列(DNA coding sequence)”是一個雙股DNA序列，當被置於適當的調節序列的控制下時，它於活體內被轉錄成RNA，而該RNA被轉譯成一多肽。該編碼序列的邊界是以一個位在5’(胺基)端的起始密碼子與一個位在3’(羧基)端的終止密碼子來決定。一個編碼序列可包括，但不限於：來自真核細胞mRNA的cDNA、來自真核生物(例如，哺乳動物)的DNA的基因組DNA序列，以及甚至是合成的DNA序列。一個“cDNA”被定義為複本DNA(copy DNA)或互補DNA(complementary DNA)，並且是一來自一個mRNA轉錄本的反轉錄反應(reverse transcription reaction) 的產物。

如此處所用的，術語“經分離的DNA(isolated DNA)”表示該DNA已經從它的天然遺傳環境中被移除，並且因此無其他外來的(extraneous)或非所欲的編碼序列，而呈一適用於遺傳工程蛋白質生成系統(genetically engineered protein production systems)內的形式。該“經分離的DNA”可以藉由化學方法、重組DNA技術(recombinant DNA technology)或藉由在生物技術領域中已普遍應用的傳統技術[例如，DNA置換實驗(DNA shuffling experiments)或位址-指引的突變發生實驗(site-directed mutagenesis experiments)]而被合成。術語“一經分離的DNA”另擇地被稱為“一經選殖的DNA(cloned DNA)”。

除非另有指明，一核酸序列除了於本文中所揭示的特定序列外，亦涵蓋其互補序列(complementary sequences)，以及它們的守恆性類似物(conservative analogs)、相關的自然存在的結構變異體和/或合成的非天然存在的類似物。例如具有簡併性密碼子取代(degenerative codon substitution)以及守恆性刪除(deletion)、插入(insertion)、取代(substitution)或加入(addition)的同源性序列(homologous sequences)。特別地，簡併性密碼子取代可以經由，例如，在一核酸序列中的一或多個被選定的密碼子的第3位置處替換以其他的核苷酸殘基而被產生。

如此處所用的，術語“核酸建構物(nucleic acid construct)”意指一單股或雙股的核酸分子，它被分離自一天 然存在的基因，或者它已經以一種不會以其他形式存在於自然界中的方式而被修飾為含有核酸的節段(segments)。當該核酸建構物含有用於表現本發明的一編碼序列所需的控制序列(control sequences)，術語核酸建構物與術語“表現匣(expression cassette)”是同義的。

如此處所用的，術語“表現匣”意指一遺傳物質(genetic material)的建構物(construct)，它含有一編碼序列(coding sequences)以及足夠的調節資訊(regulatory information)而能在一接受者細胞(recipient cell)內指引該編碼序列的適當的轉錄(transcription)與轉譯(translation)。該表現匣可以被插入至一用來標靶至一所欲的宿主細胞內和/或至一個體中的載體(vector)。

如此處所用的，術語“表現載體(expression vector)”意指任一種重組型表現系統，它可於活體外(in vitro)或活體內(in vivo)，在任一種勝任的宿主細胞(competent host cell)內組成地(constitutively)或可誘導地(inducibly)表現一被選定的核酸序列。該表現載體可為一呈線性或環形的表現系統，且涵蓋保持游離基因(episomal)形式或是被整合至宿主細胞的基因組內的表現系統。該重組型表現系統可具有或不具有自我複製(self-replicate)的能力，它可能只會驅使宿主細胞的短暫表現。典型地，一表現載體含有一在宿主細胞中具有功能之複製的源點(origin)，以及用於偵測包含有該表現載體的宿主細胞之可選擇的標記(selectable markers)。本發明的表現載體含有一啟動子序列並且包括如此處所描述的 遺傳要素(genetic elements)，藉此一被插入的編碼序列可以在宿主細胞中被轉錄以及轉譯。在此處所描述的某些具體例中，一表現載體是一封閉的環形DNA分子。術語“表現載體”與“重組型載體(recombinant vector)”、“質體(plasmid)”以及“重組型質體(recombinant plasmid)”可被互換地使用。

如此處所用的，術語“啟動子(promoter)”與術語“啟動子序列(promoter sequence)”可被互換地使用，並且意指一能夠在一細胞中結合RNA聚合酶(RNA polymerase)並且起始一個下游(3’方向)編碼序列之轉錄的DNA調節區域。該啟動子是以它的3’端被結合在一編碼序列的轉譯起始密碼子(translation start codon)的旁邊，並且往上游(5’方向)延伸至包括起始轉錄所需的一最小數目的鹼基(bases)或要素(elements)。在多數情形下會引起一基因在多數細胞類型內被表現的啟動子通常被意指為“組成性啟動子(constitutive promoters)”。在一改變的環境條件或發育條件的影響之下會造成一結構核苷酸序列的有條件的表現的啟動子通常被意指為“可誘導的啟動子(inducible promoter)”。適用於本發明的啟動子序列可以衍生自病毒(viruses)、噬菌體(bacteriophages)、原核生物(prokaryotes)或真核生物(eukaryotes)。

如此處所用的，術語“可操作地連接(operably linked)”是指一個第一序列被配置在充分接近於一個第二序列，而使得該第一序列可影響該第二序列或處在該第二序列控制之下的區域。例如，一啟動子序列可被可操作地連接至一 基因序列，且通常是在該基因序列的5’端位置，而使得該基因序列的表現是在該啟動子序列的控制之下。此外，一調節序列可被可操作地連接至一啟動子序列，俾以增強該啟動子序列促進轉錄的能力。在這種情況下，該調節序列通常是位在該啟動子序列的5’端處。

如此處所用的，術語“上游(upstream)”以及“下游(downstream)”意指核苷酸序列的一要素的位置。“上游”表示一個要比參考要素(reference element)更加5’的要素。“下游”表示一個要比參考要素更加3’的要素。

依據本發明，術語“轉形(transformation)”與術語“轉染(transfection)”可被交替地使用，並且該術語被用來意指將一外源性核酸分子導入至一選定的宿主細胞內。依據本技藝中已知的技術，一核酸分子(例如，一重組型DNA建構物或一重組型載體)可藉由多種技術而被導入至一選定的宿主細胞內，例如磷酸鈣或氯化鈣媒介的轉染作用(transfection)、電穿孔法(electroporation)、微注射法(microinjection)、粒子撞擊法(particle bombardment)、脂質體媒介的轉染作用(liposome-mediated transfection)、利用細菌噬菌體的轉染作用或其他方法。含有該轉形的核酸分子的宿主生物(host organisms)可被意指為“經轉形的”、“基因轉殖”或“重組型”生物。

如此處所用的，術語“細胞”、“宿主細胞”、“轉形宿主細胞(transformed host cell)”以及“重組型宿主細胞(recombinant host cell)”可被交換地使用，而且不僅指特定 的個體細胞(individual cells)還包括繼代培養的子代(sub-cultured offsprings)或可能的子代(potential offsprings)。在後續世代中所形成的繼代培養的子代可能因為突變作用或環境影響而發生特定的遺傳修飾(genetic modification)，而致使子代細胞事實上可能與衍生出該繼代培養的子代的母細胞並不完全相同。然而，繼代培養的細胞仍被涵蓋在本文中所用的術語的範疇內。

如此處所用的，術語“哺乳動物細胞(mammalian cells)”包含衍生自一哺乳動物的正常組織或腫瘤的細胞。依據本發明，該哺乳動物可以選自於由下列所構成的群組：人、牛、綿羊、山羊、馬、犬、貓、兔、大鼠以及小鼠。

“細胞核定位信號(nuclear localization signal,NLS)”是一種存在於各種不同的蛋白質中的特定胜肽要素或節段，其特徵在於它具有指引該蛋白質至一細胞的細胞核的能力。有鑑於NLSs具有能夠將一標的物質(諸如一蛋白質或多肽)輸送至一細胞的細胞核內的能力，它們被預期具有一廣大範圍的應用，包括，例如：基因轉殖(gene transfection)、基因治療(gene therapy)以及藥物遞送(drug delivery)等。有趣地，雖然SV40大T抗原的NLS提供原型的單分型NLS(prototypic monopartite NLS)，但多數的NLSs並非由一種一致序列(consensus sequence)所構成。因此，在相關技藝中的研究員致力於探究來自各種不同生物的蛋白質之新穎且有用的NLSs。

雖然雞貧血病毒(chicken anemia virus)的天然的全長 VP2蛋白質(native full length VP2 protein)(在下文中被稱為“CAV VP2蛋白質”)已被報導會展現細胞核定位(nuclear localization)的功能，但是任一個於哺乳動物細胞中具有功能的在CAV VP2蛋白質中的NLS胜肽仍未被知曉。於本發明中，申請人證實CAV台灣CIA-89菌株的VP2蛋白質(Meng-Shiou Lee et al.(2009),Process Biochemistry,44：390-395)在兩種哺乳動物細胞株(亦即HeLa細胞以及CHO細胞)中的細胞核定位能力，並且接著分析該CAV台灣CIA-89菌株的VP2蛋白質的胺基酸序列，相較於一些被寄存於UniProtKB資料庫中的CAV的分離株的VP2蛋白質所具者，包括：澳洲/CAU269-7/2000(Australia/CAU269-7/2000)(UniProtKB登錄編號：Q9IZU7)、德國庫克斯港-1(Germany Cuxhaven-1)(UniProtKB登錄編號：P69484)、日本82-2(Japan 82-2)(UniProtKB登錄編號：P54093)、USA 26p4(UniProtKB登錄編號：P54092)以及USA CIA-1(UniProtKB登錄編號：P69485)。

基於所得到的序列比對結果，其顯示CAV VP2蛋白質的胺基酸序列在不同的分離株中是高度守恆的，申請人使用WoLF PSORT軟體(P.Horton et al.(2007)，如上述)以及NLStradamus軟體(Alex N Nguyen Ba et al.(2009)，如上述)去探究在該CAV台灣CIA-89菌株的VP2蛋白質的全長胺基酸序列中的NLS胜肽，其中一個二分型NLS要素 (bipartite NLS motif)(BiNLS1要素；序列辨識編號：4)被預測是坐落在一橫跨該CAV VP2蛋白質的胺基酸殘基136至153處的位置，以及一個單分型NLS要素(monopartite NLS motif)(NLS2要素；序列辨識編號：5)被預測是坐落在一橫跨該CAV VP2蛋白質的胺基酸殘基133至138處的位置。

為了查明這2種被預測出的NLS要素，申請人構築一系列的重組型質體，它們各自帶有一融合基因編碼一C端或N端截短的VP2-GFP融合蛋白質。所得到的表現結果顯示，當該CAV VP2蛋白質被C端截短至一含有胺基酸殘基1至132處的長度，或者N端截短至一含有胺基酸殘基142至216處的長度，它的細胞核定位能力會被廢除，這暗示一為序列辨識編號：6的NLS胜肽(完全涵蓋所預測出的NLS2要素)可能是坐落在一橫跨該CAV VP2蛋白質的胺基酸殘基133至141處的區域。

有鑒於該推定的BiNLS1要素以及NLS2要素在該CAVVP2蛋白質的可能位置，申請人進一步構築各種不同的位在該CAV VP2蛋白質的胺基酸位置133至134處、136至138處以及150至152處(鹼性胺基酸殘基所在處)的位址-指引的突變，俾以評估這些鹼性胺基酸殘基對於該CAV VP2蛋白質的細胞核定位能力的關鍵性。所得到的表現結果顯示，在該CAV VP2蛋白質的胺基酸位置136至138處的丙胺酸取代，或者在該CAV VP2蛋白質的胺基酸位置150至152處的丙胺酸取代，或者在該CAV VP2蛋白質的胺基酸位置136至138處與150至152處的丙胺酸取代，或者在 該CAV VP2蛋白質的胺基酸位置133處和/或134處的丙胺酸取代不會廢除該CAV VP2蛋白質的細胞核定位能力，這表示所預測出的BiNLS1要素並非該CAV VP2蛋白質中所含有功能性NLS胜肽，並且一功能性胜肽應是坐落在一橫跨該CAV VP2蛋白質的胺基酸殘基133至138處的區域，該區域與所預測出的NLS2要素(序列辨識編號：5)的位置相匹配。此外，位在133至134處和/或136至138處的胺基酸殘基可能對於該CAV VP2蛋白質的細胞核定位能力是重要的。

為了查明在該CAV VP2蛋白質中所預測出的NLS2要素(序列辨識編號：5)的角色，申請人進一步構築2種衍生自該CAV VP2蛋白質之短長度的胜肽，亦即VP2(133-138)以及VP2(112-145)，其中前者具有如序列辨識編號：5所示的胺基酸序列(亦即所預測出的NLS2要素的全長)，並且對應於該CAV VP2蛋白質的胺基酸位置133至138處，而後者具有如序列辨識編號：7所示的胺基酸序列，並且對應於該CAV VP2蛋白質的胺基酸位置112至145處。這2種短長度的胜肽被進行一種使用GFP蛋白質作為一報導子(reporter)的核運輸分析(nuclear transport assay)，而所得到的結果顯示，這2種短長度的胜肽展現有如該全長的CAV VP2蛋白質的細胞核定位能力，這表示一完整且功能性NLS要素是存在於一橫跨該CAV VP2蛋白質的胺基酸殘基133至138處的區域。

申請人進一步構築該VP2(112-145)胜肽的4種突變體， 各個突變體具有位在對應於該CAV VP2蛋白質的胺基酸殘基136至138處，或者胺基酸殘基133處與136至138處，或者胺基酸殘基134處與136至138處，或者胺基酸殘基133至134處與136至138處的丙胺酸取代。所得到的結果顯示，對應於該CAV VP2蛋白質的胺基酸位置133至134處以及136至138處的胺基酸殘基可能在該VP2(112-145)胜肽的細胞核定位能力上扮演一重要的角色。此發現與針對全長的CAV VP2蛋白質所觀察到者是一致的。

基於所得到的實驗結果而被預期的是，一衍生自該CAV VP2蛋白質的NLS胜肽可以被用於各種不同的生物活性物質(包括，核酸、蛋白質、胜肽、藥學活性試劑、化學物質等)的核遞送上。

因此，本發明提供一種具有細胞核定位能力之經分離的胜肽，其中該經分離的胜肽具有一胺基酸序列是：(i)對應於一全長具有216個胺基酸的野生型CAV VP2蛋白質所具者，除了位在該野生型CAV VP2蛋白質的133和/或134處的胺基酸殘基被替換為丙胺酸，或者位在該野生型CAV VP2蛋白質的136至138處的胺基酸殘基被替換為丙胺酸，或者位在該野生型CAV VP2蛋白質的150至152處的胺基酸殘基被替換為丙胺酸，或者位在該野生型CAV VP2蛋白質的136至138與150至152處的胺基酸殘基被替換為丙胺酸；或(ii)對應於該野生型CAV VP2蛋白質的一C端截短的產物所具者，其中位在該野生型CAV VP2蛋白質的133至 138處的胺基酸殘基在C端截短之後未改變；或(iii)對應於該野生型CAV VP2蛋白質的一N端截短的產物所具者，其中位在該野生型CAV VP2蛋白質的133至138處的胺基酸殘基在N端截短之後未改變；或(iv)對應於該野生型CAV VP2蛋白質的一N端與C端截短的產物所具者，其中該野生型CAV VP2蛋白質的133至138處的胺基酸殘基在N端與C端截短之後未改變；或(v)以下列式(I)來表示：Lys-Arg-Ala-X ₁ -X ₂ -X ₃ -Z (I)其中：X₁、X₂以及X₃各自獨立地為一選自於丙胺酸、離胺酸以及精胺酸的胺基酸；以及Z為不存在，或者表示Leu、Leu-Asp或Leu-Asp-Tyr。

依據本發明，該野生型CAV VP2蛋白質可以是衍生自下列經分離的CAV菌株之任一者：CAV台灣CIA-89菌株、CAV澳洲/CAU269-7/2000菌株(UniProtKB登錄編號：Q9IZU7)、CAV德國庫克斯港-1菌株(UniProtKB登錄編號：P69484)、CAV日本82-2菌株(UniProtKB登錄編號：P54093)、CAV USA 26p4菌株(UniProtKB登錄編號：P54092)以及CAV USA CIA-1菌株(UniProtKB登錄編號：P69485)。在本發明的一個較佳具體例中，該野生型CAV VP2蛋白質具有一選自於序列辨識編號：8、序列辨識編號：9、序列辨識編號：10、序列辨識編號：11、序列辨識編號： 12以及序列辨識編號：13所示的胺基酸序列。

在本發明的一個較佳具體例中，該經分離的胜肽具有一選自於序列辨識編號：14、序列辨識編號：15、序列辨識編號：16、序列辨識編號：17、序列辨識編號：18以及序列辨識編號：19所示的胺基酸序列。

在本發明的另一個較佳具體例中，該經分離的胜肽具有一胺基酸序列對應於該野生型CAV VP2蛋白質之一C端截短的產物。在本發明的一個更佳具體例中，該野生型CAV VP2蛋白質之C端截短的產物具有一如序列辨識編號：20所示的胺基酸序列。

在本發明的一個進一步的較佳具體例中，該經分離的胜肽具有一胺基酸序列對應於該野生型CAV VP2蛋白質之一N端截短的產物。在本發明的一個更佳具體例中，該野生型CAV VP2蛋白質之N端截短的產物具有一如序列辨識編號：21所示的胺基酸序列。

在本發明的一個進一步的較佳具體例中，該經分離的胜肽具有一胺基酸序列對應於該野生型CAV VP2蛋白質之一N端與C端截短的產物。在本發明的一個更佳具體例中，該野生型CAV VP2蛋白質之N端與C端截短的產物具有一如序列辨識編號：5、序列辨識編號：6或序列辨識編號：7所示的胺基酸序列。

本發明之經分離的胜肽可以被化學地、酵素地或重組地合成，或者可以衍生自一天然來源。在本發明的一個較佳具體例中，該經分離的胜肽是藉由重組DNA方法而被合 成。

依據本發明，該經分離的胜肽可被合成為一融合蛋白質，其中該經分離的胜肽被融合以一意欲要被運輸至一細胞(特別是一哺乳動物細胞)的細胞核內的標的蛋白質。在本發明的一個較佳具體例中，該融合蛋白質是藉由重組DNA方法而被合成。

本發明進一步提供一種細胞核運輸系統，其包含有一要被遞送至一哺乳動物細胞的細胞核內的標的物質，其中該標的物質是與如上面所描述的本發明之經分離的胜肽相締合。

依據本發明，該細胞核運輸系統進一步包含有一結合試劑，該結合試劑能夠使該細胞核運輸系統在該標的物質被運輸至該哺乳動物細胞的細胞核內之前進入至該哺乳動物細胞內。該結合試劑能夠結合至一位在一哺乳動物細胞的細胞外膜(outer cell membrane)或質膜(plasma membrane)上的特定細胞表面-表現抗原(cell surface-expressing antigen)或受體(receptor)，藉此該細胞核運輸系統可以藉由細胞吞噬作用(endocytosis)而進入至該細胞的細胞質內，之後該細胞核運輸系統經由一輸入蛋白-NLS路徑(importin-NLS pathway)而被運輸至該細胞的細胞核內。在本發明的一個較佳具體例中，該結合試劑是一抗體或其功能性片段，它結合至一位在一哺乳動物細胞的細胞外膜或質膜上的特定細胞表面-表現抗原或受體。

依據本發明，術語“標的物質(target substance)”與術語 “效應物(effector)”是同義的，並且意指任何感興趣的分子(molecule)或化合物(compound)，當它被遞送至一細胞內時會展現一所欲的生物活性或效用[例如，藥學上(pharmaceutical)、診斷(diagnostic)以及追蹤的性質(tracing properties)]。

依據本發明，該標的物質可以是選自於下列所構成的群組：蛋白質、胜肽、核酸分子、藥學活性試劑、化學物質、脂質(lipid)、醣類(carbohydrate)以及它們的組合。

適用於本發明的核酸分子包括，但不限於：DNA分子、RNA分子、肽核酸(peptide nucleic acids,PNAs)、小干擾RNA(small interfering RNAs,siRNAs)、反訊息分子(antisense molecules)、核糖酵素(ribozymes)、適合體(aptamers)以及誘餌分子(decoy molecules)。

適用於本發明的蛋白質包括，但不限於：酵素、激素(hormones)、細胞激素(cytokines)、缺脂脂蛋白(apolipoproteins)、生長因子(growth foctors)、抗原、抗體以及抗體片段(antibody fragments)。

適用於本發明的胜肽包括，但不限於：抗原胜肽(antigenic peptides)、抗菌胜肽(antimicrobial peptides)以及抗發炎胜肽(anti-inflammatory peptides)。

如此處所用的，術語“藥學活性試劑(pharmaceutically active agent)”意指一化學化合物，當它被投藥至一個體時會誘發一可偵測的藥理(pharmacological)和/或生理效用(physiological effect)。適用於本發明的藥學活性試劑包括， 但不限於：毒素(toxins)、抗生素(antibiotics)、抗病原劑(antipathogenic agents)、免疫調節劑(immunomodulators)、維生素(vitamins)、抗贅生劑(antineoplastic agents)以及治療試劑(therapeutic agents)。

適用於本發明的化學物質包括，但不限於：有機分子(organic molecules)、無機分子(inorganic molecules)、放射性同位素(radioisotopes)、螢光粒子(fluorescent particles)、磁粒子(magnetic particles)以及金屬奈米粒子(metal nanoparticles)。

適用於本發明的脂質包括，但不限於：脂肪酸(fatty acids)、甘油脂(glycerolipids)、磷脂(phospholipids)、固醇脂(sterol lipids)以及醣脂(saccharolipids)。

適用於本發明的醣類包括，但不限於：單醣(monosaccharides)、雙醣(disaccharides)、寡醣(oligosaccharides)以及多醣(polysaccharides)。

在本發明的一個較佳具體例中，本發明之經分離的胜肽與該標的物質一起形成一綴合物(conjugate)。在本發明的一個更佳具體例中，該標的物質經由一連接部分而被綴合以本發明之經分離的胜肽，該連接部分可以是一化學聯結劑(chemical linker)、一由胺基酸所組成的間隔序列等。較佳地，該連接部分在本發明之經分離的胜肽與該標的物質之間提供一強的鍵聯(linkage)，以避免在將該標的物質運輸至一哺乳動物細胞的細胞核內的過程中這兩者的解離(disassociate)。在本發明的一個較佳具體例中，該標的物質 是一蛋白質或多肽，而該連接部分是一由胺基酸所組成的間隔序列。

依據本發明，該經分離的胜肽以及該標的物質可以藉由傳統的化學方法而被個別地合成，例如，使用一商業上可獲得的合成套組(synthesis kit)或者於均質溶液中或在固相(solid phase)上執行化學合成方法。在此方面，可以參照，例如，Chiu-Heng Chen et al.(2010),J.Pept.Sci.,16：231-241。

依據本發明，該經分離的胜肽以及該標的物質可以使用本發明所屬技藝中的相關研究者或技術人員所普遍使用的化學、生化、酵素(enzymatic)或遺傳的偶合方法(genetic coupling methods)而被綴合。

在本發明的一個較佳具體例中，該經分離的胜肽是經由一化學交聯劑(chemical crosslinker)而與該標的物質被化學地偶合。適用於本發明的化學交聯劑包括，但不限於：二環己基碳化二亞胺(dicyclohexylcarbodiimide,DCC)、N-羥基琥珀醯亞胺(N-hydroxysuccinimide,NHS)、馬來醯亞胺基苯甲醯基-N-羥基琥珀醯亞胺酯(maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide ester,MBS)、N-乙基氧基羰基-2-乙基氧基-1,2-二氫喹琳(N-ethyloxycarbonyl-2-ethyloxy-1,2-dihydroquinoline,EEDQ)以及N-異丁氧基-羰基-2-異丁氧基-1,2-二氫喹琳(N-isobutyloxy-carbonyl-2-isobutyloxy-1,2-dihydroquinoline,IIDQ)。

在本發明的一個更佳具體例中，該標的物質是一蛋白 質或胜肽而與該經分離的胜肽形成一融合蛋白質。本發明的融合蛋白質可以藉由使用本發明所屬技藝中的相關研究者或技術人員所普遍使用的重組DNA方法而被合成。例如，本實施例例示說明重組合成一些由GFP融合以本發明的各種經分離的胜肽所構成的融合蛋白質，其中GFP作為一在核運輸分析中的報導子。

因此，本發明進一步提供一種編碼一包含有一如上所述的經分離的胜肽與一要被遞送至一哺乳動物細胞的細胞核內的標的蛋白質之融合蛋白質的核酸建構物(nucleic acid construct)，其中該核酸建構物包含有一編碼如上所述之經分離的胜肽的第一核酸片段以及一與該第一核酸片段相融合並且編碼該標的蛋白質之第二核酸片段。

本發明亦提供一種能夠表現一包含有本發明的經分離的胜肽與一要被遞送至一哺乳動物細胞的細胞核內的標的蛋白質之融合蛋白質的表現匣(expression cassette)，其中該表現匣包含有一如上所述的核酸建構物以及一被可操作地連結至該核酸建構物的啟動子。

依據本發明，該標的蛋白質可以是選自於下列所構成的群組：抗體、抗原、抗菌胜肽、激素、生長因子、酵素以及它們的組合。

較佳地，該啟動子序列是選自於下列所構成的群組：一tac啟動子、一CMV啟動子、一GAP啟動子、一SV40初期啟動子(SV40 initial promoter)、一RSV-啟動子、一HSV-TK啟動子、一U6啟動子、一CMV-HSV胸腺核苷激 酶啟動子(CMV-HSV thymidine kinase promoter)、一SRα啟動子以及一HIV‧LTR啟動子。在本發明的一個較佳具體例中，該啟動子序列是一CMV啟動子。

在本發明的一個較佳具體例中，該表現匣被攜帶於一載體中而形成一重組型載體。適用於本發明的載體包含一般遺傳工程技術中所使用的載體，諸如，質體(plasmids)、黏接質體(cosmids)、病毒(viruses)或反轉錄病毒(retroviruses)。

適用於本發明的載體可以含有其他表現控制要素(expression control elements)，諸如一轉錄起始位址(transcription starting site)、一轉錄終止位址(transcription termination site)、一核糖體結合位址(ribosome binding site)、一RNA剪接位址(RNA splicing site)、一個聚腺苷酸化位址(polyadenylation site)以及一個轉譯終止位址(translation termination site)等。適用於本發明的載體還可包含另外的調控要素(regulatory elements)，諸如一轉錄/轉譯的增強子序列(enhancer sequence)、一Shine-Dalgarno序列、一調節序列以及至少一個供在適當的條件下篩選該載體的標記基因(marker gene)[例如，一抗生素抗性基因(antibiotic-resistance gene)]或報導基因(reporter gene)。

依據本發明，任何可以攜帶DNAs至細胞內的輸送方法(delivery method)可被用來遞送本發明的重組型載體。例如，該重組型載體可經由一選自於由下列所構成的群組中的方法而被導入至一細胞內：基因槍(gene gun)或粒子撞擊法 (particle bombardment)、電穿孔(electroporation)、顯微注射(microinjection)、熱休克(heat shock)、磷酸鈣沉澱(calcium phosphate precipitation)、磁性轉染(magnetofection)、脂質體轉染(lipofection)、受體媒介的轉染作用(receptor-mediated transfection)、病毒載體媒介的轉染作用(viral vector-mediated transfection)、一轉染試劑(transfection reagent)的使用、一陽離子聚合物(cationic polymer)的使用，以及它們的組合。

本發明進一步提供一種用於輸送一標的物質至一細胞的細胞核內的方法，其包括：

令該細胞與一細胞核運輸系統相接觸，該細胞核運輸系統包含有該標的物質、一如上所述之經分離的胜肽以及一能夠使該細胞核運輸系統在該標的物質被運輸至該哺乳動物細胞的細胞核內之前進入至該哺乳動物細胞內的結合試劑，其中該標的物質、該經分離的胜肽以及該結合試劑是彼此相締合的。

如上面所描述的該標的物質以及該結合試劑的定義可以運用於此處。

當該標的物質是一標的蛋白質時，本發明的方法可包含令該哺乳動物細胞與一重組型載體相接觸，該重組型載體帶有一能夠表現一包含有一如上所述之經分離的胜肽與該標的蛋白質之融合蛋白質的表現匣，其中該表現匣包含有一核酸建構物，該核酸建構物包括一編碼如上所述之經分離的胜肽的第一核酸片段以及一與該第一核酸片段相融 合並且編碼該標的蛋白質之第二核酸片段。

該重組型載體與該哺乳動物的接觸可使用如上面所描述的針對DNAs的任何遞送方法而被執行。

有鑑於如此處所描述的生物活性，本發明之經分離的胜肽被預期對於具有已知功能的標的物質的核運輸具有一在醫學、製藥、生物技術以及基因工程等領域上的廣泛範圍的應用。本發明的NLS胜肽亦可被使用在探究或鑑別一新穎蛋白質的可能生物活性/功能上，在發展一用於調節一正訊息聚核苷酸分子(sense polynucleotide molecule)的基因表現的方法上，或者發展一種針對一疾病使用一已知化合物的新的治療方法。

取決於一具有一已知藥學活性的標的物質的功能，一包含有本發明之經分離的胜肽以及該標的物質的綴合物可利用本技藝中所普遍使用的技術而被製造成一適合於非經腸道地(parenterally)、局部地(topically)或口服地(orally)投藥的劑型。一包含有該綴合物的劑型可進一步包括一藥學上可接受的載劑(pharmaceutically acceptable carrier)。一適當的藥學上可接受的載劑的選用將視該劑型的種類以及該劑型的投藥方式而定，並且是落在本發明所屬技藝中的相關研究者或技術人士的例行技術範疇內。

較佳實施例之詳細說明

本發明將就下面的實施例來做進一步說明，但應瞭解的是，該等實施例僅是供例示說明用，而不應被解釋為本 發明的實施上的限制。

實施例 一般實驗材料：

1.質體pGEX-6P-1-VP2(5,626 bps，參見序列辨識編號：1以及圖1)是由連一洋教授(台灣屏東縣，國立屏東科技大學獸醫學系；Meng-Shiou Lee et al.(2009)，如上述)所友善地提供，在其之中帶有一tac啟動子(tac promoter,P_tac)、一麩胱甘肽-S-轉移酶(glutathione-S-transferase,GST)編碼基因、一胺苄青黴素-抗性基因(ampicillin-resistance gene,Amp^r)、一EcoRI辨識位址(recognition site)、一XhoI辨識位址以及一編碼CAV台灣CIA-89菌株的一VP2蛋白質的vp2基因，其中該vp2基因在它的5’-以及3’-端分別具有該EcoRI與XhoI辨識位址；

2.質體pcDNA3.1-GFP(6,252 bps，參見序列辨識編號：23以及圖2)是由王敏盈教授(台灣台中市，國立中興大學生物科技研究所)所友善地提供，在其之中具有一CMV啟動子(P_CMV)、一編碼一綠色螢光蛋白質(green fluorescent protein,GFP)的gfp基因、一胺苄青黴素-抗性基因(Amp^r)、一EcoRI辨識位址以及一XhoI切割位址辨識位址。

3.在下面的聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction,PCR)實驗中所使用的引子(primers)是由基龍米克斯生物科技股份有限公司(Genomics Biosci & Tech Co.Ltd.，台灣新北市)所合成。

4.下列材料是購自於Life Technologies,USA：Invitrogen^TM杜貝可氏最低基本培養基(Dulbecco’s minimum essential medium,DMEM)(Cat.No.11960-069)；GIBCO^®杜貝可氏改良的依格氏培養基：營養素混合物F-12(DMEM/F-12)培養基[Dulbecco’s Modified Eagle Medium：Nutrient Mixture F-12(DMEM/F-12)medium](Cat.No.11320-033)；Opti-MEM^®I低血清培養基(Opti-MEM^®I Reduced-serum medium)(Cat.No.31985)；Platinum^® Taq DNA聚合酶High Fidelity(Platinum^® Taq DNA polymerase High Fidelity)與10X Platinum^® Taq DNA聚合酶緩衝液(Cat.No.11304-029)；GIBCO^TM盤尼西林-鏈黴素液體(Penicillin-Streptomycin liquid)(Cat.No.15070063)；以及GIBCO^®胎牛血清(Fetal Bovine Serum,FBS)(Cat.No.16140-071)。

5.下列材料是購自於QIAGEN：QIAquick PCR純化套組(QIAquick PCR Purification Kit,Cat.No.28106)以及QIAGEN質體Mini套組(QIAGEN Plamid Mini Kit,Cat.No.12125)。

下列實驗材料是購自於Yeastern Biotech Co.,Ltd.(台灣新北市)：yT&A選殖載體套組(yT&A cloning vector kit,Cat.No.YC001)以及勝任大腸桿菌細胞(competent E.coli cells)(Cat.No.YE608)。

7.下列材料是購自於Thermo Fisher Scientific Inc.,Canada：TurboFect^TM活體外轉染試劑(TurboFect^TM in vitro Transfection Reagent)(Cat.No.R0531)；限制酶FastDigest^® EcoRI(Cat.No.FD0274)與FastDigest^® XhoI(Cat.No.FD0694)；T4 DNA接合酶(DNA ligase)(Cat.No.EL0016)；dNTPs(Cat.No.R0181)；以及MgSO₄(Cat.No.M2643)。

8.下列材料是購自於Stratagene,USA：PfuUltra ^TM High-Fidelity DNA聚合酶(PfuUltra ^TM High-Fidelity DNA polymerase)(Cat.No.600380)以及PfuUltra ^TM II Fusion HS DNA聚合酶(PfuUltra ^TM II Fusion HS DNA polymerase)(Cat.No.600670)。

9.下列材料是購自於Sigma-Aldrich Co.LLC.,USA：瓊脂(agar)(Cat.No.A5306)；胺苄青黴素(ampicillin)(Cat.No.A0166)；LB肉湯培養基(LB broth)(Cat.No.L3022)；磷酸鹽緩衝生理鹽水(phosphate-buffered saline,PBS)(Cat.No.P5368)；三聚甲醛(paraformaldehyde)(Cat.No.158127)；Triton X-100(Cat.No.X-100)；以及4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(4’,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)(Cat.No.D8417)。

10. ULTRAhyb^®-Oligo雜交緩衝液(ULTRAhyb^®-Oligo hybridization buffer)(Cat.No.AM8663)是購自於Ambion,Inc.。

11.在下面的轉染實驗中所使用的HeLa細胞(BCRC 60005)以及中國倉鼠卵巢細胞(Chinese hamster ovary cell,CHO cell)(BCRC 60006)是購自於台灣的食品工業發展研究所 (Food Industry Research and Development Institute,FIRDI)的生物資源保存及研究中心(Biosource Collection and Research Center,BCRC)(300新竹市食品路331號，台灣)。HeLa細胞被培養於含有DMEM[添加有10%(v/v)FBS、100單位/mL盤尼西林以及100 μg/mL鏈黴素]的75-cm²培養瓶(75-cm² flask)(BD Falcon^TM；Cat.No.353136)中。CHO細胞被培養於含有GIBCO^® DMEM/F-12培養基[添加有10%(v/v)FBS、100單位/mL盤尼西林以及100 μg/mL鏈黴素]的75-cm²培養瓶中。這兩種細胞株在培養條件被設定為37℃與95% O₂/5% CO₂的培養箱中進行培養，每隔4天更換新鮮的培養基。當所培養的細胞達到80%的匯聚(confluence)時，細胞繼代培養(cell passage)被執行。

一般實驗方法：

有關本發明中所採用的實驗方法以及用於DNA選殖(DNA cloning)的相關技術是參考本技藝中所詳知的教科書：Sambrook J,Russell DW(2001)Molecular Cloning：a Laboratory Manual,3rd ed.Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York，諸如使用限制酶的DNA切割反應(DNA cleavage reaction by restriction enzymes)、聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction,PCR)、使用T4 DNA接合酶的DNA接合反應(DNA ligation with T4 DNA ligase)、瓊脂糖凝膠電泳(agarose gel electrophoresis)以及質體轉形(plasmid transformation)等。位址-指引的突變PCR(site-directed mutagenic PCR)大體上是依據在L Zheng,et al.(2004)Nucl.Acids Res.,32：e115中所載述的操作程序而被執行。而這些技術都是熟悉此項技術人士可根據本身的專業素養來實施者。

1.大腸桿菌細胞的轉形(transformation)：

將一選定的質體與勝任大腸桿菌細胞混合均勻，繼而置於冰上作用歷時5分鐘。接著，將所形成的混合物塗佈於含有50 μg/mL胺芐青黴素的固態瓊脂培養盤(solid agar plate)上。在37℃下培養歷時16小時之後，抗-胺芐青黴素菌落(ampicillin-resistant colonies)從該等固態瓊脂培養盤上被挑選出，並且接而予以接種至含有50 μg/mL胺芐青黴素的LB肉湯培養基內，繼而於37℃下培養歷時16小時。

2. HeLa細胞與CHO細胞的轉染(transfection)：

一選定的質體是依據製造商的操作指南使用一TurboFect^TM活體外轉染試劑而被轉染至HeLa細胞或CHO細胞內。簡言之，將3 μL之選定的質體(2 μg/μL，配於Opti-MEM^®I低血清培養基中)以及3 μL的TurboFect^TM活體外轉染試劑予以混合，藉此形成一轉染混合物(transfection mixture)。在這期間，24-井培養盤(24-well plate)(BD Falcon^TM；Cat.No.353047)的各井被平盤培養以細胞(有關HeLa細胞，2x10⁴細胞/500 μL生長培養基/井，而有關CHO細胞，8x10⁴細胞/500 μL生長培養基/井)以供進行轉染，繼而培養於一培養箱(37℃，95% O₂/5% CO₂)中歷時4小時。在細胞貼附之後，移除該24-井培養盤的各井中的液體，並 且該轉染混合物隨後地被加入，繼而予以培育歷時6小時。之後，該24-井培養盤的各井被置換以完全生長培養基(complete growth medium)至一為1 mL的最終液體體積，繼而在轉染之後培育該細胞歷時又再48小時。

3.在經轉染的細胞上的螢光觀察(fluorescence observation)：

在上面所描述的轉染處理之後，於該24-井培養盤的各井中的細胞以500 μL的1X PBS予以洗滌3次，並且接而在室溫下處理以500 μL的一固定溶液(fixed solution)(配於1X PBS中的4%三聚甲醛)歷時15分鐘，繼而以500 μL的1X PBS予以洗滌3次以去除三聚甲醛。該等經固定的細胞隨後在25℃下以200 μL的一通透化溶液(permeabilization solution)(含有0.25% Triton X-100的PBS)予以培育歷時10分鐘，繼而以500 μL的1X PBS予以洗滌3次。之後，該等細胞於室溫下以1 μg/mL 4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)(配於1X PBS中)在黑暗中予以染色歷時10分鐘，藉此定位細胞核，繼而以500 μL的1X PBS予以洗滌3次。最後，該等細胞是使用一ZEISS AXIOVERT 200倒立顯微鏡(ZEISS AXIOVERT 200 inverted microscope)[配備有一為40倍的物鏡(objective)以及一AxioCam HRm CCD照相機(AxioCam HRm CCD camera)]而被進行觀察，其中GFP螢光影像以及DAPI影像是分別在一為480 nm或350 nm的激發波長(excitation wavelength)下被拍攝。GFP的位置是藉由在一螢光影像中所發出的綠色螢光而被指明，而細胞核的位置是藉由在一螢光影像中所發出的藍色螢光而被指明。 影像處理是使用Photoshop而被完成。

實施例1. VP2-GFP融合蛋白質在哺乳動物細胞中的次細胞定位(subcellular localization of VP2-GFP fusion protein in mammalian cells) 實驗方法： A、構築重組型質體pcDNA3.1-VP2-GFP：

以位在該質體pGEX-6P-1-VP2的核苷酸序列(序列辨識編號：22)中的954至977處以及1593至1607處的核苷酸殘基為基礎，一VP2前向引子F1以及一VP2反向引子R1被設計如下：

VP2前向引子F1

VP2反向引子R1

其中被標示底線的核苷酸代表一有如其下所指明的限制酶的辨識位址。

以質體pGEX-6P-1-VP2作為一模版(template)，一個不含有終止密碼子(stop codon)並且編碼CAV台灣CIA-89菌株的一VP2蛋白質的第一PCR產物(664 bps)是從一PCR實驗中而被獲得，該PCR實驗是使用上面所描述的該VP2前向引子F1與該VP2反向引子R1，以及下面表1中所示的PCR反應條件，繼而藉由1%瓊脂糖凝膠電泳(agarose gel electrophoresis)來確認分子量，並使用QIAquick PCR純化 套組來進行回收與純化。

之後，一個含有該第一PCR產物並且具有如在圖3中所示的結構的重組型質體pVP2-yT&A(3,392 bps)是使用yT&A選殖載體套組而被獲得，繼而依據“一般實驗方法”當中所描述的方法使用勝任大腸桿菌細胞來進行轉形，並使用QIAGEN質體Mini套組來進行抽取。依據基龍米克斯生物科技股份有限公司所進行的序列分析，一個具有一如序列辨識編號：3所示的核苷酸序列的vp2基因被涵括在該重組型質體pVP2-yT&A內。

該重組型質體pVP2-yT&A以限制酶EcoRI與XhoI予以切割，藉此而得到一個含有該序列辨識編號：3的vp2基因的第一切割產物(654 bps)。在此期間，質體pcDNA3.1-GFP以限制酶EcoRI與XhoI予以切割，藉此而得到一個含 有gfp基因的第二切割產物(6,219 bps)。接著，該第一與第二切割產物是以一為3：1的莫耳比(molar ratio)而被混合，並使用T4 DNA接合酶予以接合。由此所獲得的接合產物隨後依據“一般實驗方法”當中所描述的方法而被轉形至勝任大腸桿菌細胞內，繼而使用QIAGEN質體Mini套組來進行抽取。

由此所獲得的一大腸桿菌轉形株被證實帶有一個被命名為“pcDNA3.1-VP2-GFP”的重組型質體，該重組型質體被確定為具有一如在圖4中所示的質體建構物，其中該序列辨識編號：3的vp2基因被融合以gfp基因並且坐落在gfp基因的上遊，藉此一VP2-GFP融合蛋白質可以被表現。據此，該VP2-GFP融合蛋白質的次細胞定位可以藉由觀察由GFP所產生的綠色螢光而被確定。

B、VP2-GFP融合蛋白質在哺乳動物細胞中的位置：

依據上面“一般實驗方法”所描述的方法，將在上面第A項當中所得到的重組型質體pcDNA3.1-VP2-GFP轉染至HeLa細胞以及CHO細胞內，而由此所獲得的經轉染的細胞是依據上面“一般實驗方法”當中所描述的方法而被進行螢光觀察。為供比較，相同的實驗是使用質體pcDNA3.1-GFP作為一對照組(control)而被執行。

結果：

圖5顯示在轉染以一對照質體pcDNA3.1-GFP或該重組型質體pcDNA3.1-VP2-GFP之後的HeLa細胞(上面部分)或CHO細胞(下面部分)中，藉由一Zeiss AxioVert 200倒立顯 微鏡並在一為400倍的放大倍率下所觀察到的GFP或VP2-GFP的表現。從圖5可見，對於被轉染以質體pcDNA3.1-GFP的細胞會在細胞核與細胞質區域中被觀察到發出綠色螢光。相反地，對於被轉染以該重組型載體pcDNA3.1-VP2-GFP的細胞僅會在細胞核中被觀察到發出綠色螢光。這個實驗結果顯示：VP2-GFP融合蛋白質會展現出一細胞核定位信號(nuclear localization signal,NLS)功能。申請人據此而推論：VP2蛋白質可能在其之中具有一段引導一標的物質(特別是一感興趣的蛋白質)的核運輸至一細胞之細胞核內的功能性NLS胜肽。

實施例2. 來自不同CAV分離株的VP2蛋白質的序列比對(sequence alignment)以及在CAV VP2蛋白質中的NLS胜肽的預測

在本實施例中，申請人應用一電腦化方法(In silico method)來預測在不同CAV分離株的各個VP2蛋白質中的NLS胜肽的存在與位置。

該CAV台灣CIA-89菌株的VP2蛋白質具有一如序列辨識編號：8所示的胺基酸序列(Meng-Shiou Lee et al.(2009)，如上述)。申請人將該CAV台灣CIA-89菌株的VP2蛋白質的胺基酸序列與下列在UniProtKB資料庫中所登錄的一些CAV分離株的VP2蛋白質所具者作比較，包括：澳洲/CAU269-7/2000(UniProtKB登錄編號：Q9IZU7)、德國庫克斯港-1(UniProtKB登錄編號：P69484)、日本82-2(UniProtKB登錄編號：P54093)、 USA 26p4(UniProtKB登錄編號：P54092)以及USA CIA-1(UniProtKB登錄編號：P69485)。

在這6種CAV分離株的VP2蛋白質中的序列歧異性(sequence divergence)是使用生物工作台3.2軟體而被分析。

由此所得到的序列比對結果被顯示於圖6中，圖6顯示CAV VP2蛋白質的胺基酸序列在不同分離株中是高度守恆的(conserved)。因此，為了探究NLS胜肽，該CAV台灣CIA-89菌株的VP2蛋白質的全長胺基酸序列是使用WoLFPSORT以及NLStradamus軟體而被進一步利用與分析。

一個BiNLS1要素(序列辨識編號：4)是由WoLF PSORT軟體所預測出，它具有一段推定的要素位在橫跨該CAVVP2蛋白質的胺基酸殘基136至153處的位置(參見在圖6中所示之經底線標示的胺基酸殘基)。另一方面，一個NLS2要素(序列辨識編號：5)是由NLStradamus軟體並以一為0.5的預測截斷值(prediction cutoff value)所預測出，而該要素是坐落在一橫跨該CAV VP2蛋白質的胺基酸殘基133至138處的區域(參見在圖6中所示之經粗體標示的胺基酸殘基)。基於該等生物資訊學的分析結果，申請人推測：在CAV VP2蛋白質中的功能性NLS胜肽有可能是BiNLS1和/或NLS2。

實施例3. 各種截短的VP2-GFP融合蛋白質(truncated VP2-GFP fusion protein)在哺乳動物細胞中的次細胞定位

在本實施例中，申請人構築一系列的重組型質體，其 各自帶有一段不同的截短的vp2-gfp融合基因編碼一C端或N端截短的VP2-GFP融合蛋白質(C-terminal or N-terminal truncated VP2-GFP fusion protein)(亦即，一C端或N端截短的VP2蛋白質在C端處被融合以GFP)。這些重組型質體隨後被轉染至哺乳動物細胞內。基於觀察在經轉染的哺乳動物細胞中所表現之該等截短的VP2-GFP融合蛋白質的次細胞定位，在該CAV VP2蛋白質中之可能的功能性NLS胜肽被鑑別出。

實驗方法：

基於如序列辨識編號：8所示的CAV台灣CIA-89菌株之VP2蛋白質的胺基酸序列，申請人設計出3種C端截短的VP2蛋白質(亦即VP2-115dC、VP2-132dC與VP2-145dC)以及3種N端截短的VP2蛋白質(VP2-111dN、VP2-141dN與VP2-160dN)。為了選殖出編碼這6種截短的VP2蛋白質之對應的截短的vp2基因，如下面表2中所示的6組引子對是基於質體pGEX-6P-1-VP2中所攜帶的CAV台灣CIA-89菌株的vp2基因而被設計出，該vp2基因對應於在序列辨識編號：22中的核苷酸殘基960至1,610處。

以質體pGEX-6P-1-VP2作為一模版，6種不同的PCR產物(各自具有一如預期的大小，並且含有如表2中所示之一所欲的截短的vp2基因)是使用如表2中所列示之對應的引子對以及如表1中所示的PCR反應條件而被獲得，除了在30個循環的反應中，變性反應在95℃下被進行歷時45秒以及引子黏合在55℃下被進行歷時45秒，繼而藉由2%瓊脂糖凝膠電泳來確認分子量，並使用QIAquick PCR純化套組來進行回收與純化。

6種不同的重組型質體(各自分別含有前述的6種PCR產物之一者)隨後使用yT&A選殖載體套組而被獲得，繼而依據“一般實驗方法”當中所描述的方法使用勝任大腸桿菌細胞來進行轉形，並使用QIAGEN質體Mini套組來進行抽取。依據基龍米克斯生物科技股份有限公司所進行的序列分析，這6種重組型質體[它們分別被命名為pVP2-115dC-yT&A(3,089 bps)、pVP2-132dC-yT&A(3,140 bps)、pVP2-145dC-yT&A(3,179 bps)、pVP2-111dN-yT&A(3,062 bps)、pVP2-141dN-yT&A(2,972 bps)以及pVP2-160dN-yT&A(2,915 bps)]被確認帶有如表2中所顯示之對應的截短的vp2基因。

如在上面所得到的6種重組型質體大體上是依據實施例1當中針對重組型質體pcDNA3.1-VP2-GFP的構築所載述的方法而分別被用來構築一個帶有一截短的vp2-gfp融合基因的重組型質體。

6種重組型質體(各自帶有一截短的vp2-gfp融合基因編碼一如圖7中所示之對應的截短的VP2-GFP融合蛋白質)被 獲得，並且分別被命名為pcDNA3.1-VP2-115dC-GFP(6,570 bps)、pcDNA3.1-VP2-132dC-GFP(6,621 bps)、pcDNA3.1-VP2-145dC-GFP(6,660 bps)、pcDNA3.1-VP2-111dN-GFP(6,543 bps)、pcDNA3.1-VP2-141dN-GFP(6,453 bps)以及pcDNA3.1-VP2-160dN-GFP(6,396 bps)。這6種重組型質體隨後依據“一般實驗方法”當中所描述的方法而被轉染至HeLa細胞或CHO細胞，而由此所得到的經轉染的細胞是依據“一般實驗方法”當中所描述的方法而被進行螢光觀察。

結果：

圖8顯示HeLa細胞以及CHO細胞在轉染以質體pcDNA3.1-VP2-115dC-GFP(以“VP2-115dC”來表示)、pcDNA3.1-VP2-132dC-GFP(以“VP2-132dC”來表示)、pcDNA3.1-VP2-145dC-GFP(以“VP2-145dC”來表示)、pcDNA3.1-VP2-111dN-GFP(以“VP2-111dN”來表示)、pcDNA3.1-VP2-141dN-GFP(以“VP2-141dN”來表示)以及pcDNA3.1-VP2-160dN-GFP(以“VP2-160dN”來表示)之後，藉由一Zeiss AxioVert 200倒立顯微鏡並在一為400倍的放大倍率下所觀察到顯微鏡檢查結果。依據圖8所顯示的結果，各種截短的VP2-GFP融合蛋白質在由上述6種質體予以轉染的哺乳動物細胞中的次細胞定位被彙整於表3中。

從圖8以及表3可見，密集地發出的綠色螢光在被轉染以質體pcDNA3.1-VP2-145dC-GFP或pcDNA3.1-VP2-111dN-GFP的細胞之細胞核區域中被觀察到，而均勻分佈的綠色螢光在被轉染以其他4種質體的細胞的細胞質區域中被觀察到。所得到的結果顯示：一完整的NLS胜肽存在於截短的VP2-145dC-GFP蛋白質[其含有一具有如序列辨識編號：20所示的胺基酸序列之C端截短的VP2蛋白質(對應於序列辨識編號：8的VP2蛋白質的胺基酸殘基1至145處)]中，以及截短的VP2-111dN-GFP蛋白質[其含有一具有如序列辨識編號：21所示的胺基酸序列之N端截短的VP2蛋白質(對應於序列辨識編號：8的VP2蛋白質的胺基酸殘基112至216處)]中。基於此發現而被推論的是：一NLS胜肽可能是坐落在一橫跨該CAV VP2蛋白質的胺基酸殘基112至145處的區域。

依據序列比對結果，VP2-145dC-GFP融合蛋白質在C 端處要比VP2-132dC-GFP融合蛋白質還多出13個胺基酸殘基(對應於序列辨識編號：8的VP2蛋白質的胺基酸殘基133至145處)，以及VP2-111dN-GFP融合蛋白質在N端處要比VP2-141dN-GFP融合蛋白質還多出30個胺基酸殘基(對應於序列辨識編號：8的VP2蛋白質的胺基酸殘基112至141處)。而序列歧異性影響這些截短的VP2-GFP融合蛋白質的細胞核定位能力。據此而被推論的是：一如序列辨識編號：6的NLS胜肽可能是坐落在一橫跨該CAV VP2蛋白質的胺基酸殘基133至141處的區域。特別地，如在實施例2中所預測出的NLS2要素(對應於序列辨識編號：8的VP2蛋白質的胺基酸殘基133至138處)完全地被該胺基酸殘基133至141處的區域所涵蓋。相反地，如在實施例2中所預測出的BiNLS1要素(對應於序列辨識編號：8的VP2蛋白質的胺基酸殘基136至152處)部分地被該胺基酸殘基133至141處的區域所涵蓋。申請人據此而推論：CAV VP2蛋白質的NLS胜肽可能是如預測出的NLS2要素。

實施例4. 各種突變的VP2-GFP融合蛋白質(mutant VP2-GFP fusion protein)在哺乳動物細胞中的次細胞定位

為了鑑別在實施例2中所預測出的推定的要素(亦即BiNLS1和/或NLS2要素)哪一者在CAV VP2蛋白質的細胞核定位能力上扮演一個角色，於本實施例中，各種位址-指引的突變(site-directed mutations)被引入至該CAV VP2蛋白質位在133至134處、136至138處以及150至152處的胺 基酸序列(鹼性胺基酸所在之處)內，俾以評估這些鹼性胺基酸殘基對於CAV VP2蛋白質的細胞核定位能力的必要性。

實驗方法：

為了選殖一系列編碼各種VP2-GFP融合蛋白質(各自由一所欲突變的VP2蛋白質被融合以一GFP蛋白質所構成)之突變的vp2-gfp基因，在表4中所示的8組引子對是基於如在實施例1中所得到的質體pcDNA3.1-VP2-GFP所帶有的vp2基因(序列辨識編號：3)而被設計出，該vp2基因是坐落在質體的pcDNA3.1-VP2-GFP的核苷酸殘基949至1,596處。在突變的VP2蛋白質中所引入的胺基酸突變以及在質體pcDNA3.1-VP2-GFP中對應於所設計出的引子對的每一者的核苷酸位置亦被顯示於表4中。

以質體pcDNA3.1-VP2-GFP作為一模版，5種重組型質體(它們之後被命名為pcDNA3.1-VP2-136-138A-GFP、pcDNA3.1-VP2-150-152A-GFP、pcDNA3.1-VP2-133A-GFP、pcDNA3.1-VP2-134A-GFP以及pcDNA3.1-VP2-133A/134A-GFP)是使用在表4中所示的第1、2、6、7以及8組引子對以及如在表5中所示之PCR反應條件而被獲得。由此所獲得的該5種重組型質體隨後是依據“一般實驗方法”當中所描述的方法而被轉形至勝任大腸桿菌細胞內，繼而使用QIAGEN質體Mini套組來進行抽取。依據基龍米克斯生物科技股份有限公司所進行的序列分析，這5種重組型質體的每一者被確認帶有一編碼一突變的VP2-GFP融合蛋白質之突變的vp2-gfp融合基因，其中該融合蛋白質含有一如下的突變的VP2蛋白質：就質體pcDNA3.1-VP2-136-138A-GFP而言是“VP2-136-138A”，就質體pcDNA3.1-VP2-150-152A-GFP而言是“VP2-150-152A”，就質體pcDNA3.1-VP2-133A-GFP而言是“VP2-133A”，就質體pcDNA3.1-VP2-134A-GFP而言是“VP2-134A”，以及就質體pcDNA3.1-VP2-133A/134A-GFP而言是“VP2-133A/134A”。

以質體pcDNA3.1-VP2-136-138A-GFP作為一模版，4種額外的重組型質體(它們之後被命名為pcDNA3.1-VP2-136-138A/150-152A-GFP、pcDNA3.1-VP2-136-138A/134A-GFP、pcDNA3.1-VP2-136-138A/133A-GFP以及pcDNA3.1-VP2-136-138A/133A/134A-GFP)是分別使用在表4中所示的第2、3、4以及5組引子對以及如在表5中所示之PCR反應條件而被獲得。由此所獲得的該4種重組型質體隨後是依據“一般實驗方法”當中所描述的方法而被轉形至勝任大腸桿菌細胞內，繼而使用QIAGEN質體Mini套組來進行抽取。依據基龍米克斯生物科技股份有限公司所進行的序列分析，這4種重組型質體的每一者被確認帶有一編碼一突變的VP2-GFP融合蛋白質之突變的vp2-gfp融合基因，其中該融合蛋白質含有一如下的突變的VP2蛋白質：就質體pcDNA3.1-VP2-136-138A/150-152A-GFP而言是“VP2-136- 138A/150-152A”，就質體pcDNA3.1-VP2-136-138A/133A-GFP而言是“VP2-136-138A/133A”，就質體pcDNA3.1-VP2-136-138A/134A-GFP而言是“VP2-136-138A/134A”，以及就質體pcDNA3.1-VP2-136-138A/133A/134A-GFP而言是“VP2-136-138A/133A/134A”。

之後，如上面所獲得的9種重組型質體是依據“一般實驗方法”當中所描述的方法而分別被轉染至哺乳動物細胞(HeLa細胞或CHO細胞)內，而由此所獲得之經轉染的細胞是依據“一般實驗方法”當中所描述的方法而被拿來進行螢光觀察。

結果：

圖9顯示HeLa細胞以及CHO細胞在轉染以質體pcDNA3.1-VP2-150-152A-GFP(以“VP2-150-152A”來表示)、pcDNA3.1-VP2-136-138A-GFP(以“VP2-136-138A”來表示)、pcDNA3.1-VP2-136-138A/150-152A-GFP(以“VP2-136-138A/150-152A”來表示)、pcDNA3.1-VP2-136-138A/133A-GFP(以“VP2-136-138A/133A”來表示)、pcDNA3.1-VP2-136-138A/134A-GFP(以“VP2-136-138A/134A”來表示)以及pcDNA3.1-VP2-136-138A/133A/134A-GFP(以“VP2-136-138A/133A/134A”來表示)之後，藉由一Zeiss AxioVert 200倒立顯微鏡並在一為400倍的放大倍率下所觀察到的顯微鏡檢查結果。而圖10顯示HeLa細胞以及CHO細胞在轉染以質體pcDNA3.1-VP2-133A-GFP(以“VP2-133A”來表示)、pcDNA3.1-VP2-134A-GFP(以“VP2-134A”來表示)以及 pcDNA3.1-VP2-133A/134A-GFP(以“VP2-133A/134A”來表示)之後，藉由一Zeiss AxioVert 200倒立顯微鏡並在一為400倍的放大倍率下所觀察到的顯微鏡檢查結果。依據在圖9以及圖10中所示的結果，各種突變的VP2-GFP融合蛋白質在由上述9種質體予以轉染的哺乳動物細胞中的次細胞定位被彙整於表6中，表6亦顯示在各種對應的突變的VP2蛋白質的胺基酸殘基133至152處的突變位址以及2個所預測出的BiNLS1與NLS2要素的個別位置。

從圖9與圖10以及表6可見，密集地發出的綠色螢光在被轉染以質體pcDNA3.1-VP2-150-152A-GFP、pcDNA3.1-VP2-136-138A-GFP、pcDNA3.1-VP2-136-138A/150-152A-GFP、pcDNA3.1-VP2-133A-GFP、pcDNA3.1-VP2-134A-GFP或pcDNA3.1-VP2-133A/134A-GFP的細胞的細胞核區域中被觀察到，而均勻分佈的綠色螢光在被轉染以質體pcDNA3.1-VP2-136-138A/133A-GFP、pcDNA3.1-VP2-136-138A/134A-GFP或pcDNA3.1-VP2-136-138A/133A/134A-GFP的細胞的細胞質區域中被觀察到。所得到的結果顯示：雖然突變的VP2蛋白質VP2-150-152A(序列辨識編號：14)、VP2-136-138A(序列辨識編號：15)、VP2-136-138A/150-152A(序列辨識編號：16)、VP2-133A(序列辨識編號：17)、VP2-134A(序列辨識編號：18)以及VP2-133A/134A(序列辨識編號：19)各自具有如在表4中所示的位址-指引的突變，但是它們展現可相比於該如序列辨識編號：8的CAV VP2蛋白質的細胞核定位能力。由於CAV VP2蛋白質的細胞核定位能力沒有受到在胺基酸位置150至152處或胺基酸位置136至138處，或者這兩者之位址-指引的突變的破壞，被推斷的是：如在實施例2中所預測出的BiNLS1要素並非在CAV VP2蛋白質中所含有的功能性NLS胜肽。

依據其它突變的VP2蛋白質(在胺基酸位置133、134以及136至138處具有一或多個位址-指引的突變)的結果，以及在實施例2與3中所得到的結果，被進一步推斷的是：一功能性NLS胜肽應坐落在一橫跨該CAV VP2蛋白質的胺 基酸殘基133至138處的區域，此區域與在實施例2中所預測出之序列辨識編號：5的NLS2要素相匹配。基於在圖6中所彙整的結果，一如序列辨識編號：57的胜肽(它是序列辨識編號：5的NLS2要素的一種Ala突變體)被推測在展現所欲的細胞核定位能力上是有功能的。

實施例5. 衍生自CAV VP2蛋白質的NLS胜肽之細胞核定位能力的評估

依據實施例3以及實施例4當中所獲得的實驗結果，於本實施例中，申請人構築2種衍生自CAV VP2蛋白質的VP2 NLS胜肽，亦即VP2(133-138)以及VP2(112-145)。VP2(133-138)是由在序列辨識編號：5中所示的胺基酸殘基(亦即，所預測出的NLS2要素的全長)所構成，並且對應於位在序列辨識編號：8的CAV VP2蛋白質133至138處的胺基酸殘基。VP2(112-145)(涵蓋全長的NLS2要素)是由在序列辨識編號：7中所示的胺基酸殘基所構成，並且對應於位在序列辨識編號：8的CAV VP2蛋白質的112至145處的胺基酸殘基。這2種VP2胜肽是使用GFP蛋白質作為一報導子(reporter)而被拿來進行核運輸分析(nuclear transport assay)，俾以評估衍生自CAV VP2蛋白質的NLS胜肽的細胞核定位能力。

實驗方法： A、構築帶有一VP2(112-145)-編碼序列的重組型質體pVP2(112-145)-yT&A：

為了選殖出一編碼如序列辨識編號：7的VP2(112-145) 的核苷酸序列，如下面所示的一VP2前向引子F5與一VP2反向引子R5是基於位在序列辨識編號：22的質體pGEX-6P-1-VP2中的1,293至1,311處以及1,394至1,382處的核苷酸殘基而分別被設計出。

VP2前向引子F5

VP2反向引子R5

其中被標示底線的核苷酸代表一有如其下所指明的限制酶的辨識位址。

以質體pGEX-6P-1-VP2作為一模版，一個含有該VP2(112-145)-編碼序列的PCR產物(117 bps)是從一PCR實驗中而被獲得，該PCR實驗是使用上面所描述的該VP2前向引子F5與該VP2反向引子R6，以及如在表1中所示的PCR反應條件，除了在30個循環的反應中，變性反應在95℃下被進行歷時30秒、引子黏合在55℃下被進行歷時30秒以及延伸反應在72℃下被進行歷時1分鐘，繼而藉由2%瓊脂糖凝膠電泳來確認分子量，並使用QIAquick PCR純化套組來進行回收與純化。

一個帶有該PCR產物的重組型質體隨後使用yT&A選殖載體套組而被獲得，繼而依據“一般實驗方法”當中所描述的方法使用勝任大腸桿菌細胞來進行轉形，並使用QIAGEN質體Mini套組來進行抽取。依據基龍米克斯生物科技股份 有限公司所進行的序列分析，被命名為pVP2(112-145)-yT&A的重組型質體(2,845 bps)被確認帶有該VP2(112-145)-編碼序列。

B、製備一帶有一VP2(133-138)-編碼序列的DNA雜交物(DNA hybrid)：

為了選殖出一編碼如序列辨識編號：5的VP2(133-138)的核苷酸序列，如下面所示的2個DNA片段是基於在序列辨識編號：22的質體pGEX-6P-1-VP2中1,356至1,373處的核苷酸殘基而分別被設計出。

VP2(133-138)正訊息片段(sense fragment)

5’-aattcatgaaacgagctaaaagaaagc-3’(序列辨識編號：60)

VP2(133-138)反訊息片段(antisense fragment)

5’-tcgagctttcttttagctcgtttcatg-3’(序列辨識編號：61)

該2個DNA片段被拿來進行一使用如表7中所示之反應條件的雜交反應，藉此一含有一編碼該VP2(133-138)的核苷酸序列的DNA雜交物被獲得。另外，該DNA雜交物被形成具有2個黏端(sticky ends)而能使該DNA雜交物與一經EcoRI/XhoI切割的DNA片段進行接合。

C、構築重組型質體pcDNA3.1-VP2(112-145)-GFP以及pcDNA3.1-VP2(133-138)-GFP：

重組型質體pcDNA3.1-VP2(112-145)-GFP[6,330 bps，它帶有一編碼一VP2(112-145)-GFP融合蛋白質的核苷酸序列]大體上是依據在實施例1的第A項當中針對重組型質體pcDNA3.1-VP2-GFP的構築所載述的方法而被獲得，除了如上面所獲得的重組型質體pVP2(112-145)-yT&A被用來替代重組型質體pVP2-yT&A。

重組型質體pcDNA3.1-VP2(133-138)-GFP[6,246 bps，它帶有一編碼一VP2(133-138)-GFP融合蛋白質的核苷酸序列]同樣地是使用上面所得到的DNA雜交物而被獲得。

D、VP2(112-145)-GFP以及VP2(133-138)-GFP融合蛋白質在哺乳動物細胞中的定位：

如上面所獲得的重組型質體pcDNA3.1-VP2(112-145)-GFP以及pcDNA3.1-VP2(133-138)-GFP是依據“一般實驗方法”當中所述的方法而分別被轉染至HeLa細胞或CHO細胞內，而由此所獲得之經轉染的細胞是依據“一般實驗方法”當中所述的方法被拿來進行螢光觀察。

結果：

圖11顯示HeLa細胞以及CHO細胞在轉染以重組型質體pcDNA3.1-VP2(112-144)-GFP[以“VP2(112-145)”來表示]或pcDNA3.1-VP2(133-138)-GFP[以“VP2(133-138)”來表示]之後，藉由一Zeiss AxioVert 200倒立顯微鏡並在一為400倍的放大倍率下所觀察到的顯微鏡檢查結果。從圖11可見，密集地發出的綠色螢光在被轉染以質體pcDNA3.1-VP2(112-145)-GFP或質體pcDNA3.1-VP2(133-138)-GFP的細胞的細胞核區域中被觀察到。所得到的結果顯示：VP2(112-145)以及VP2(133-138)胜肽的細胞核定位能力可能是歸因於在它們之中所含有的序列辨識編號：5的NLS2要素。

實施例6. 點突變(point mutations)對於VP2(112-145)胜肽的細胞核定位能力的影響

為了證實點突變對於在實施例5中所構築的VP2(112-145)胜肽的細胞核定位能力的影響，於本實施例中，申請人構築VP2(112-145)胜肽的4種突變體，亦即VP2(112-145)-136-138A、VP2(112-145)-136-138A/133A-GFP、VP2(112-145)-136-138A/134A-GFP以及VP2(112-145)-136-138A/133A/134A。

實驗方法：

重組型質體pcDNA3.1-VP2(112-145)-136-138A-GFP大體上是依據在實施例4當中針對重組型質體pcDNA3.1-VP2-136-138A-GFP的構築所載述的方法而被獲得，除了使用在實施例5中所獲得的重組型質體pcDNA3.1-VP2(112- 145)-GFP作為一模版，以及在表8中所示的PCR反應條件。重組型質體pcDNA3.1-VP2(112-145)-136-138A-GFP帶有一編碼一突變的VP2(112-145)-GFP融合蛋白質的核苷酸序列，其中在該融合蛋白質中所含有之突變的VP2(112-145)胜肽具有丙胺酸取代(alanine substitutions)位在對應於該CAVVP2蛋白質的胺基酸殘基136至138處的位置。

重組型質體pcDNA3.1-VP2(112-145)-136-138A/133A-GFP、pcDNA3.1-VP2(112-145)-136-138A/134A-GFP以及pcDNA3.1-VP2(112-145)-136-138A/133A/134A-GFP大體上分別是依據在實施例4當中針對重組型質體pcDNA3.1-VP2-136-138A/133A-GFP、pcDNA3.1-VP2-136-138A/134A-GFP以及pcDNA3.1-VP2-136-138A/133A/134A-GFP的構築所載述的方法而被獲得，除了使用在上面所獲得的重組型質體pcDNA3.1-VP2(112-145)-136-138A-GFP作為一模版，以及在表8中所示的PCR反應條件。這3種重組型質體分別帶有一編碼一突變的VP2(112-145)-GFP融合蛋白質的核苷酸序列，其中在該融合蛋白質中所含有之突變的VP2(112-145)胜肽如下：就重組型質體pcDNA3.1-VP2(112-145)-136-138A/133A-GFP而言是“VP2(112-145)-136-138A/133A”、就重組型質體pcDNA3.1-VP2(112-145)-136-138A/134A-GFP而言是“VP2(112-145)-136-138A/134A”，以及就重組型質體pcDNA3.1-VP2(112-145)-136-138A/133A/134A-GFP而言是VP2(112-145)-136-138A/133A/134A。

之後，由此所獲得的4種重組型質體以及重組型質體pcDNA3.1-VP2(112-145)-GFP是依據“一般實驗方法”當中所述的方法而分別被轉染至HeLa細胞內，而由此所獲得之經轉染的細胞是依據“一般實驗方法”當中所述的方法被拿來進行螢光觀察。

結果：

圖12顯示HeLa細胞在轉染以重組型質體pcDNA3.1-VP2(112-145)-GFP[以“VP2(112-145)”來表示]、pcDNA3.1-VP2(112-145)-136-138A-GFP[以“VP2(112-145)-136-138A”來表示]、pcDNA3.1-VP2(112-145)-136-138A/133A-GFP[以“VP2(112-145)-136-138A/133A”來表示]、pcDNA3.1-VP2(112-145)-136-138A/134A-GFP[以“VP2(112-145)-136-138A/134A”來表示]以及pcDNA3.1-VP2(112-145)-136-138A/133A/134A-GFP[以“VP2(112-145)-136- 138A/133A/134A”來表示]之後，藉由一Zeiss AxioVert 200倒立顯微鏡並在一為400倍的放大倍率下所觀察到的顯微鏡檢查結果。

有關圖12，密集地發出的綠色螢光在被轉染以質體pcDNA3.1-VP2(112-145)-GFP以及pcDNA3.1-VP2(112-145)-136-138A-GFP的細胞的細胞核區域中被觀察到，而平均分布的綠色螢光在被轉染以質體pcDNA3.1-VP2(112-145)-136-138A/133A-GFP、pcDNA3.1-VP2(112-145)-136-138A/134A-GFP以及pcDNA3.1-VP2(112-145)-136-138A/133A/134A-GFP的任一者的細胞的細胞質區域中被觀察到。所得到的結果顯示：對應於CAV VP2蛋白質的胺基酸位置133至134處以及136至138處的胺基酸殘基可能在VP2(112-145)胜肽的細胞核定位能力上扮演一重要的角色。這個發現與針對全長的CAV VP2蛋白質所觀察到的是相符的。

有鑑於上面的實施例而被預期的是：本發明的VP2NLS胜肽可具有一在將效應物(effectors)(諸如蛋白質、胜肽、核酸、藥學活性試劑、化學物質等)遞送至一標的細胞的細胞核內上的廣泛範圍的應用。

於本說明書中被引述之所有專利和文獻以其整體被併入本案作為參考資料。若有所衝突時，本案詳細說明(包含界定在內)將佔上風。

雖然本發明已參考上述特定的具體例被描述，明顯地在不背離本發明之範圍和精神之下可作出很多的修改和變 化。因此意欲的是，本發明僅受如隨文檢附之申請專利範圍所示者之限制。

圖1顯示質體pGEX-6P-1-VP2的架構圖，其中P_tac表示一tac啟動子；GST表示一編碼麩胱甘肽-S-轉移酶(glutathione-S-transferase)的基因；Amp^r表示一胺芐青黴素-抗性基因(ampicillin-resistance gene)；vp2表示一編碼CAV台彎CIA-89菌株的一VP2蛋白質的基因；以及EcoRI與XhoI分別表示對應的限制酶的辨識位址；圖2顯示質體pcDNA3.1-GFP的架構圖，其中P_CMV表示一CMV啟動子；gfp表示一編碼一綠色螢光蛋白質(GFP)的基因；Amp^r表示一胺苄青黴素-抗性基因；以及EcoRI與XhoI分別表示對應的限制酶的辨識位址；圖3顯示一如在實施例1中所得到的重組型載體pVP2-yT&A的架構圖，其中Amp^r表示一胺苄青黴素-抗性基因；vp2表示一如序列辨識編號：3所示的vp2基因(參見實施例1)；以及EcoRI與XhoI分別表示對應的限制酶的辨識位址；圖4顯示一如在實施例1中所得到的重組型載體pcDNA3.1-VP2-GFP的架構圖，其中P_CMV表示在圖2中所顯示的CMV啟動子；vp2表示在圖3中所顯示之該如序列辨識編號：3所示的vp2基因；gfp表示在圖2中所顯示的GFP編碼基因；Amp^r表示在圖2中所顯示的胺苄青黴素-抗性基因；以及EcoRI與XhoI分別表示對應的限制酶的辨識位址； 圖5顯示HeLa細胞(上面部分)或CHO細胞(下面部分)在轉染以一對照質體pcDNA3.1-GFP或在實施1中所得到的重組型質體pcDNA3.1-VP2-GFP之後，在可見光下或者在一為480 nm(針對螢光影像)或350 nm(針對DAPI影像)的波長下使用一Zeiss AxioVert 200倒立顯微鏡並在一為400倍的放大倍率下所觀察到的GFP或VP2-GFP的表現，其中可見光影像顯示細胞在轉染之後的細胞形態；GFP的位置是藉由在一螢光影像中所發出的綠色螢光而被指明；以及一細胞核的位置是藉由在一DAPI影像中所發出的藍色螢光而被指明；圖6顯示6種不同的CAV分離株的VP2蛋白質藉由生物工作台3.2軟體(San Diego Supercomputer Center(SDSC),San Diego,CA,USA)來進行分析的胺基酸序列比對結果，其中在一VP2蛋白質的序列中一經底線標示的胺基酸殘基的區域表示一個由WoLF PSORT軟體(P.Horton et al.(2007),Nucleic Acids Research,35：W585-587)所預測出之推測的二分型NLS要素(motif)(在本文中意指為“BiNLS1要素”)的位置；以及在一VP2蛋白質的序列中一經粗體標示的胺基酸殘基的區域表示一個由NLStradamus軟體(Alex N Nguyen Ba et al.(2009),BMC Bioinformatics,10：202-212)所預測出之推測的單分型NLS要素(motif)(在本文中意指為“NLS2要素”)的位置；圖7示意地顯示在實施例1中所生成的一全長VP2-GFP融合蛋白質以及在實施例3中所生成的6種截短的 VP2-GFP融合蛋白質，其中一全長或截短的VP2蛋白質是藉由一黑帶而被指明；在各個黑帶上面的每一個數字表示一在該全長VP2蛋白質中對應的胺基酸位置；以及一GFP蛋白質是藉由一白帶而被指明；圖8顯示HeLa細胞以及CHO細胞在轉染以實施例3中所構築出的6種不同的重組型質體之後，在一為480 nm(針對螢光影像)或350 nm(針對DAPI影像)的波長下使用一Zeiss AxioVert 200倒立顯微鏡並在一為400倍的放大倍率下所觀察到的顯微鏡檢查結果，其中以VP2-115dC、VP2-132dC、VP2-145dC、VP2-111dN、VP2-141dN以及VP2-160dN來表示的6種重組型質體分別帶有一在圖7中所顯示之編碼6種截短的VP2-GFP融合蛋白質之一者的截短的vp2-gfp融合基因；GFP的位置是藉由在一螢光影像中所發出的綠色螢光而被指明；以及一細胞核的位置是藉由在一DAPI影像中所發出的藍色螢光而被指明；圖9顯示HeLa細胞以及CHO細胞在轉染以實施例4中所構築出的6種不同的重組型質體之後，在一為480 nm(針對螢光影像)或350 nm(針對DAPI影像)的波長下使用一Zeiss AxioVert 200倒立顯微鏡並在一為400倍的放大倍率下所觀察到的顯微鏡檢查結果，其中該6種重組型質體分別帶有一編碼一突變的VP2-GFP融合蛋白質之突變的vp2-gfp融合基因，該突變的VP2-GFP融合蛋白質含有一以VP2-150-152A、VP2-136-138A、VP2-136-138A/150-152A、VP2-136-138A/133A、VP2-136-138A/134A或VP2-136- 138A/133A/134A來表示之突變的VP2蛋白質；GFP的位置是藉由在一螢光影像中所發出的綠色螢光而被指明；以及一細胞核的位置是藉由在一DAPI影像中所發出的藍色螢光而被指明；圖10顯示HeLa細胞以及CHO細胞在轉染以實施例4中所構築出的3種不同的重組型質體之後，在一為480 nm(針對螢光影像)或350 nm(針對DAPI影像)的波長下使用一Zeiss AxioVert 200倒立顯微鏡並在一為400倍的放大倍率下所觀察到的顯微鏡檢查結果，其中該3種重組型質體分別帶有一編碼一突變的VP2-GFP融合蛋白質之突變的vp2-gfp融合基因，該突變的VP2-GFP融合蛋白質含有一以VP2-133A、VP2-134A或VP2-133A/134A來表示之突變的VP2蛋白質；GFP的位置是藉由在一螢光影像中所發出的綠色螢光而被指明；以及一細胞核的位置是藉由在一DAPI影像中所發出的藍色螢光而被指明；圖11顯示HeLa細胞以及CHO細胞在轉染以實施例5中所構築出的一重組型質體pcDNA3.1-VP2(112-145)-GFP[以“VP2(112-145)”來表示]或一重組型質體pcDNA3.1-VP2(133-138)-GFP[以“VP2(133-138)”來表示]之後，在可見光下或者在一為480 nm(針對螢光影像)或350 nm(針對DAPI影像)的波長下使用一Zeiss AxioVert 200倒立顯微鏡並在一為400倍的放大倍率下所觀察到的顯微鏡檢查結果，其中可見光影像顯示細胞在轉染之後的細胞形態；GFP的位置是藉由在一螢光影像中所發出的綠色螢光而被指明；以及 一細胞核的位置是藉由在一DAPI影像中所發出的藍色螢光而被指明；以及圖12顯示HeLa細胞在轉染以實施例5中所構築出的重組型質體pcDNA3.1-VP2(112-145)-GFP[以“VP2(112-145)”來表示]以及實施例6中所構築出的4種重組型質體pcDNA3.1-VP2(112-145)-136-138A-GFP[以“VP2(112-145)-136-138A”來表示]、pcDNA3.1-VP2(112-145)-136-138A/133A-GFP[以“VP2(112-145)-136-138A/133A”來表示]、pcDNA3.1-VP2(112-145)-136-138A/134A-GFP[以“VP2(112-145)-136-138A/134A”來表示]與pcDNA3.1-VP2(112-145)-136-138A/133A/134A-GFP[以“VP2(112-145)-136-138A/133A/134A”來表示]之後，在可見光下或在一為480 nm(針對螢光影像)的波長下使用一Zeiss AxioVert 200倒立顯微鏡並在一為400倍的放大倍率下所觀察到的顯微鏡檢查結果，其中GFP的位置是藉由在一螢光影像中所發出的綠色螢光而被指明；以及一合併影像表示該螢光影像與一對應的可見光影像(其顯示細胞在轉染之後的細胞形態)的合併。

<110> 中國醫藥大學

<120> 衍生自雞貧血病毒(CAV)VP2蛋白質的細胞核定位信號胜肽以及它們的應用

<130>

<150> 台灣申請案第100125831號

<151> 2011-07-21

<150> 台灣申請案第101105459號

<151> 2012-02-20

<160> 61

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工的序列

<220>

<223> SV40大T抗原NLS

<400> 1

<210> 2

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工的序列

<220>

<223> 核質蛋白NLS

<400> 2

<210> 3

<211> 648

<212> DNA

<213> CAV台灣CIA-89菌株

<400> 3

<210> 4

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工的序列

<220>

<223> 由WoLF PSORT軟體所預測出的BiNLS1要素

<400> 4

<210> 5

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工的序列

<220>

<223> 由NLStradamus軟體所預測出的NLS2要素

<400> 5

<210> 6

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工的序列

<220>

<223> CAV VP2蛋白質的胺基酸殘基133至141處

<400> 6

<210> 7

<211> 34

<212> PRT

<213> 人工的序列

<220>

<223> CAV VP2蛋白質的胺基酸殘基112至145處

<400> 7

<210> 8

<211> 216

<212> PRT

<213> CAV台灣CIA-89菌株

<400> 8

<210> 9

<211> 216

<212> PRT

<213> CAV澳洲/CAU269-7/2000菌株

<400> 9

<210> 10

<211> 216

<212> PRT

<213> CAV德國庫克斯港-1菌株

<400> 10

<210> 11

<211> 216

<212> PRT

<213> CAV日本82-2菌株

<400> 11

<210> 12

<211> 216

<212> PRT

<213> CAV USA 26p4菌株

<400> 12

<210> 13

<211> 216

<212> PRT

<213> CAV USA CIA-1菌株

<400> 13

<210> 14

<211> 216

<212> PRT

<213> 人工的序列

<220>

<223> CAV台灣CIA-89菌株的突變VP2蛋白質(VP2-150-152A)的胺基酸序列

<400> 14

<210> 15

<211> 216

<212> PRT

<213> 人工的序列

<220>

<223> CAV台灣CIA-89菌株的突變VP2蛋白質(VP2-136-138A)的胺基酸序列

<400> 15

<210> 16

<211> 216

<212> PRT

<213> 人工的序列

<220>

<223> CAV台灣CIA-89菌株的突變VP2蛋白質(VP2-136-138A/150-152A)的胺基酸序列

<400> 16

<210> 17

<211> 216

<212> PRT

<213> 人工的序列

<220>

<223> CAV台灣CIA-89菌株的突變VP2蛋白質(VP2-133A)的胺基酸序列

<400> 17

<210> 18

<211> 216

<212> PRT

<213> 人工的序列

<220>

<223> CAV台灣CIA-89菌株的突變VP2蛋白質(VP2-134A)的胺基酸序列

<400> 18

<210> 19

<211> 216

<212> PRT

<213> 人工的序列

<220>

<223> CAV台灣CIA-89菌株的突變VP2蛋白質(VP2-133A/134A)的胺基酸序列

<400> 19

<210> 20

<211> 145

<212> PRT

<213> 人工的序列

<220>

<223> CAV台灣CIA-89菌株之C端截短的VP2蛋白質(VP2-145dC)的胺基酸序列

<400> 20

<210> 21

<211> 105

<212> PRT

<213> 人工的序列

<220>

<223> CAV台灣CIA-89菌株之N端截短的VP2蛋白質(VP2-111dN)的胺基酸序列

<400> 21

<210> 22

<211> 5626

<212> DNA

<213> 人工的序列

<220>

<223> 質體pGEX-6P-1-VP2

<220>

<221> 限制位址

<222> (954)..(959)

<223> 被EcoRI所辨識

<220>

<221> CAV台灣CIA-89菌株的VP2蛋白質的編碼序列

<222> (960)..(1610)

<220>

<221> 限制位址

<222> (1611)..(1616)

<223> 被XhoI所辨識

<300>

<301> Meng-Shiou Lee et al.

<303> Process Biochemistry

<304> 44

<306> 390-395

<307> 2009

<400> 22

<210> 23

<211> 6252

<212> DNA

<213> 人工的序列

<220>

<223> 質體pcDNA3.1-GFP

<220>

<221> 限制位址

<222> (943)..(948)

<223> 被EcoRI所辨識

<220>

<221> 限制位址

<222> (976)..(981)

<223> 被所辨識XhoI

<220>

<221> 綠色螢光蛋白(GFP)的編碼序列

<222> (988)..(1743)

<400> 23

<210> 24

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工的序列

<220>

<223> VP2前向引子F1

<220>

<221> 限制位址

<222> (3)..(8)

<223> 被EcoRI所辨識

<400> 24

<210> 25

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工的序列

<220>

<223> VP2反向引子R1

<220>

<221> 限制位址

<222> (3)..(8)

<223> 被XhoI所辨識

<400> 25

<210> 26

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工的序列

<220>

<223> VP2反向引子R2

<220>

<221> 限制位址

<222> (3)..(8)

<223> 被XhoI所辨識

<400> 26

<210> 27

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工的序列

<220>

<223> VP2反向引子R3

<220>

<221> 限制位址

<222> (3)..(8)

<223> 被XhoI所辨識

<400> 27

<210> 28

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工的序列

<220>

<223> VP2反向引子R4

<220>

<221> 限制位址

<222> (3)..(8)

<223> 被XhoI所辨識

<400> 28

<210> 29

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工的序列

<220>

<223> VP2前向引子F2

<220>

<221> 限制位址

<222> (3)..(8)

<223> 被EcoRI所辨識

<400> 29

<210> 30

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工的序列

<220>

<223> VP2前向引子F3

<220>

<221> 限制位址

<222> (3)..(8)

<223> 被EcoRI所辨識

<400> 30

<210> 31

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工的序列

<220>

<223> VP2前向引子F4

<220>

<221> 限制位址

<222> (3)..(8)

<223> 被EcoRI所辨識

<400> 31

<210> 32

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工的序列

<220>

<223> 正訊息引子MF1

<400> 32

<210> 33

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工的序列

<220>

<223> 反訊息引子MR1

<400> 33

<210> 34

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工的序列

<220>

<223> 正訊息引子MF2

<400> 34

<210> 35

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工的序列

<220>

<223> 反訊息引子MR2

<400> 35

<210> 36

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工的序列

<220>

<223> 正訊息引子MF3

<400> 36

<210> 37

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工的序列

<220>

<223> 反訊息引子MR3

<400> 37

<210> 38

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工的序列

<220>

<223> 正訊息引子MF4

<400> 38

<210> 39

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工的序列

<220>

<223> 反訊息引子MR4

<400> 39

<210> 40

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工的序列

<220>

<223> 正訊息引子MF5

<400> 40

<210> 41

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工的序列

<220>

<223> 反訊息引子MR5

<400> 41

<210> 42

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工的序列

<220>

<223> 正訊息引子MF6

<400> 42

<210> 43

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工的序列

<220>

<223> 反訊息引子MR6

<400> 43

<210> 44

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工的序列

<220>

<223> 正訊息引子MF7

<400> 44

<210> 45

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工的序列

<220>

<223> 反訊息引子MR7

<400> 45

<210> 46

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工的序列

<220>

<223> 正訊息引子MF8

<400> 46

<210> 47

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工的序列

<220>

<223> 反訊息引子MR8

<400> 47

<210> 48

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工的序列

<220>

<223> 突變VP2蛋白質(VP2-150-152A)的胺基酸殘基133至152處

<400> 48

<210> 49

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工的序列

<220>

<223> 突變VP2蛋白質(VP2-136-138A)的胺基酸殘基133至152處

<400> 49

<210> 50

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工的序列

<220>

<223> 突變VP2蛋白質(VP2-136-138A/150-152A)的胺基酸殘基133至152處

<400> 50

<210> 51

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工的序列

<220>

<223> 突變VP2蛋白質(VP2-136-138A/133A)的胺基酸殘基133至152處

<400> 51

<210> 52

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工的序列

<220>

<223> 突變VP2蛋白質(VP2-136-138A/134A)的胺基酸殘基133至152處

<400> 52

<210> 53

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工的序列

<220>

<223> 突變VP2蛋白質(VP2-136-138A/133A/134A)的胺基酸殘基133至152處

<400> 53

<210> 54

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工的序列

<220>

<223> 突變VP2蛋白質(VP2-133A)的胺基酸殘基133至152處

<400> 54

<210> 55

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工的序列

<220>

<223> 突變VP2蛋白質(VP2-134A)的胺基酸殘基133至152處

<400> 55

<210> 56

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工的序列

<220>

<223> 突變VP2蛋白質(VP2-133A/134A)的胺基酸殘基133至152處

<400> 56

<210> 57

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工的序列

<220>

<223> 由NLStradamus軟體所預測出的NLS2要素的Ala突變形式

<400> 57

<210> 58

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工的序列

<220>

<223> VP2前向引子F5

<220>

<221> 限制位址

<222> (1)..(6)

<223> 被EcoRI所辨識

<400> 58

<210> 59

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工的序列

<220>

<223> VP2反向引子R5

<220>

<221> 限制位址

<222> (1)..(6)

<223> 被XhoI所辨識

<400> 59

<210> 60

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工的序列

<220>

<223> VP2(133-138)正訊息片段

<400> 60

<210> 61

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工的序列

<220>

<223> VP2(133-138)反訊息片段

<400> 61

Claims (18)

1. 一種具有細胞核定位活性之經分離的胜肽，其中該經分離的胜肽具有一胺基酸序列是：(i)對應於一全長具有216個胺基酸的野生型CAV VP2蛋白質所具者，除了位在該野生型CAV VP2蛋白質的133和/或134處的胺基酸殘基被替換為丙胺酸，或者位在該野生型CAV VP2蛋白質的136至138處的胺基酸殘基被替換為丙胺酸，或者位在該野生型CAV VP2蛋白質的150至152處的胺基酸殘基被替換為丙胺酸，或者位在該野生型CAV VP2蛋白質的136至138與150至152處的胺基酸殘基被替換為丙胺酸；或(ii)對應於該野生型CAV VP2蛋白質的一C端截短的產物所具者，其中位在該野生型CAV VP2蛋白質的133至138處的胺基酸殘基在C端截短之後未改變；或(iii)對應於該野生型CAV VP2蛋白質的一N端截短的產物所具者，其中位在該野生型CAV VP2蛋白質的133至138處的胺基酸殘基在N端截短之後未改變；或(iv)對應於該野生型CAV VP2蛋白質的一N端與C端截短的產物所具者，其中該野生型CAV VP2蛋白質的133至138處的胺基酸殘基在N端與C端截短之後未改變；或(v)以下列式(I)來表示：Lys-Arg-Ala-X ₁ -X ₂ -X ₃ -Z (I)其中：X₁、X₂以及X₃各自獨立地為一選自於丙胺酸、離胺酸 以及精胺酸的胺基酸；以及Z為不存在，或者表示Leu、Leu-Asp或Leu-Asp-Tyr。
2. 如申請專利範圍第1項的經分離的胜肽，其中該野生型CAV VP2蛋白質是衍生自下列經分離的CAV菌株之任一者：CAV台灣CIA-89菌株、CAV澳洲/CAU269-7/2000菌株(UniProtKB登錄編號：Q9IZU7)、CAV德國庫克斯港-1菌株(UniProtKB登錄編號：P69484)、CAV日本82-2菌株(UniProtKB登錄編號：P54093)、CAV USA 26p4菌株(UniProtKB登錄編號：P54092)以及CAV USA CIA-1菌株(UniProtKB登錄編號：P69485)。
3. 如申請專利範圍第1項的經分離的胜肽，其中該野生型CAV VP2蛋白質具有一如序列辨識編號：8或序列辨識編號：9或序列辨識編號：10或序列辨識編號：11或序列辨識編號：12或序列辨識編號：13所示的胺基酸序列。
4. 如申請專利範圍第1項的經分離的胜肽，其中該經分離的胜肽具有一選自於由下列所構成的群組中的胺基酸序列：序列辨識編號：14、序列辨識編號：15、序列辨識編號：16、序列辨識編號：17、序列辨識編號：18以及序列辨識編號：19。
5. 如申請專利範圍第1項的經分離的胜肽，其中該野生型CAV VP2蛋白質之C端截短的產物具有一如序列辨識編號：20所示的胺基酸序列。
6. 如申請專利範圍第1項的經分離的胜肽，其中該野生型CAV VP2蛋白質之N端截短的產物具有一如序列辨識編號：21所示的胺基酸序列。
7. 如申請專利範圍第1項的經分離的胜肽，其中該野生型CAV VP2蛋白質之N端與C端截短的產物具有一如序列辨識編號：5、序列辨識編號：6或序列辨識編號：7所示的胺基酸序列。
8. 如申請專利範圍第1項的經分離的胜肽，其中該經分離的胜肽是被化學地、酵素地或重組地合成，或者是衍生自一天然來源。
9. 如申請專利範圍第1項的經分離的胜肽，其中該經分離的胜肽是被合成為一融合蛋白質。
10. 如申請專利範圍第9項的經分離的胜肽，其中該融合蛋白質進一步包含有一要被運輸至一哺乳動物細胞的細胞核內的標的蛋白質。
11. 一種細胞核運輸系統，其包含有一要被遞送至一哺乳動物細胞的細胞核內的標的物質，其中該標的物質是與一如申請專利範圍第1項之經分離的胜肽相締合。
12. 如申請專利範圍第11項的細胞核運輸系統，其中該標的物質是選自於下列所構成的群組：蛋白質、胜肽、核酸分子、藥學活性試劑、化學物質、脂質、醣類以及它們的組合。
13. 如申請專利範圍第11項的細胞核運輸系統，其中該如申請專利範圍第1項之經分離的胜肽與該標的物質一起形成一綴合物。
14. 如申請專利範圍第12項的細胞核運輸系統，其中該標的物質是一蛋白質或胜肽，它與該經分離的胜肽形成一融合蛋白質。
15. 如申請專利範圍第11項的細胞核運輸系統，其進一步包含有一結合試劑，該結合試劑能夠使該細胞核運輸系統在該標的 物質被運輸至該哺乳動物細胞的細胞核內之前進入至該哺乳動物細胞內。
16. 一種編碼一包含有一如申請專利範圍第1項的經分離的胜肽與一要被遞送至一哺乳動物細胞的細胞核內的標的蛋白質之融合蛋白質的核酸建構物，其中該核酸建構物包含有一編碼該經分離的胜肽的第一核酸片段以及一與該第一核酸片段相融合並且編碼該標的蛋白質之第二核酸片段。
17. 一種能夠表現一包含有一如申請專利範圍第1項的經分離的胜肽與一要被遞送至一哺乳動物細胞的細胞核內的標的蛋白質之融合蛋白質的表現匣，其中該表現匣包含有如申請專利範圍第16項的核酸建構物以及一被可操作地連結至該核酸建構物的啟動子。
18. 一種重組型載體，其帶有如申請專利範圍第17項的表現匣。