JP2024503728A - 様々な状態を処置するためのペプチド治療薬を同定する方法 - Google Patents

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Abstract

本開示は、様々な状態を処置するためのペプチド治療薬を同定する方法を提供する。一部の実施形態では、ウイルス感染状態を処置するためのペプチド治療薬を同定する方法が記載される。一部の実施形態では、癌を処置するためのペプチド治療薬を同定する方法が記載される。一部の実施形態は、本明細書に記載の方法によって同定されるペプチドに関する。

Description

関連出願に対する相互参照
この出願は2021年1月19日に出願された米国仮出願第63/139,258号及び2021年3月9日に出願された同第63/158,792号の利益を主張し、参照によりその全体がどちらも本明細書に組み込まれる。
本技術は一般に、ペプチド治療薬の同定に関する。
COVID-19パンデミックが世界を襲った。医薬品開発の複数の現場で前例のない努力にもかかわらず、現在、ある程度の(限定的な)臨床効果を示しているのは、抗ウイルス薬の低分子薬レムデシビルの1つのみである。全体として、分子構造に基づいて重要なウイルス酵素をブロックしようとする合理的な設計、及び/又はそのような活性を持つ薬物の大規模スクリーニング、又は既知の分子標的を持つ既存の薬物を使用して宿主の病原メカニズムを調節する試み(薬物再利用)を含む、現在の戦略は、臨床現場でCOVID-19を制御するための意味のある有益な効果を持つ化合物を同定することにほとんど失敗している。
低分子薬の生物学的活性が限られている主な理由は、そのような薬物がタンパク質の活性に影響を与えるための分子的なレバレッジが本質的にほとんど無いためである。低分子化合物はタンパク質、典型的には酵素の活性部位の折り畳みポケットにフィットするときに最もよく機能する。対照的に、それらはタンパク質-タンパク質相互作用(PPI)、つまり感染性病原体がその病原性を発揮する微生物と宿主の相互作用を含む、疾患のメカニズムにおいて遍在的に重要な役割を果たしている鍵と錠の完璧にフィットした分子相互作用を破壊する能力は、ほとんど無い。
ほとんどのペプチド薬は、タンパク質複合体を破壊するために特定のタンパク質、更にはPPIの活性をブロックする構造的考察に基づいて合理的に設計されてきた。低分子薬とは異なり、ペプチドは主にin vitroで大規模にスクリーニングされて、微生物抗原への結合を含む、特定のタンパク質(複合体)に結合するペプチドが同定されている。ペプチドライブラリーは、結合アッセイ及び構造を指針にした設計以上の機能的(表現型)スクリーニング、つまり細胞培養におけるウイルス複製の阻害又は宿主細胞の保護等の複雑な生物学的活性を検出するためのバイオアッセイには、これまで日常的に用いられてこなかった。対照的に、サソリの毒から単離されたムクロポリン-M1又はマカクザルで見つかったθ-ディフェンシン-1等、抗ウイルス又は抗菌活性を持つ天然ペプチドが動物界で見つかっている。Mahendran A. Karnanら、「The Potential of Antiviral Peptides as COVID-19 Therapeutics」、Frontiers in Pharmacology、2020、第11巻、1475頁; Christine L. Wohlford-Lenaneら、「Rhesus Theta-Defensin Prevents Death in a Mouse Model of Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus Pulmonary Disease」、Journal of Virology、2009、83 (21) 11385～11390頁を参照;
歴史的には、溶液中又は細胞表面上の特定の標的タンパク質に結合する能力を持つペプチドを同定するために、ファージ(細菌に感染するウイルス)がランダムなペプチドをコードして、その表面に発現するバクテリオファージディスプレイライブラリーが使用されてきた。ファージは哺乳類細胞培養中では増殖しないため、ファージディスプレイライブラリーは哺乳類細胞における表現型スクリーニングには適していない。
したがって、ペプチドベースの治療薬を同定するための新しいアプローチが必要とされている。
米国特許第5,723,323号
Mahendran A. Karnanら、「The Potential of Antiviral Peptides as COVID-19 Therapeutics」、Frontiers in Pharmacology、2020、第11巻、1475頁 Christine L. Wohlford-Lenaneら、「Rhesus Theta-Defensin Prevents Death in a Mouse Model of Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus Pulmonary Disease」、Journal of Virology、2009、83 (21) 11385～11390頁 Smialowski, P.、Doose, G.、Torkler, P.、Kaufmann, S. & Frishman, D.、「PROSO II--a new method for protein solubility prediction.」、FEBS J 279、2192～2200頁(2012) Sachdeva, S.、Joo, H.、Tsai, J.、Jasti, B. & Li, X.、「A Rational Approach for Creating Peptides Mimicking Antibody Binding.」、Scientific reports 9、997頁(2019) Peng C、Shi C、Cao X、Li Y、Liu F、Lu F.、「Factors Influencing Recombinant Protein Secretion Efficiency in Gram-Positive Bacteria: Signal Peptide and Beyond.」、Front Bioeng Biotechnol. 2019;7:139頁 Agrawal, P.ら、「CPPsite 2.0: a repository of experimentally validated cell-penetrating peptides.」、Nucleic acids research 44、D1098～1103頁(2016) Park, S. E.、Sajid, M. I.、Parang, K. & Tiwari, R. K.、「Cyclic Cell-Penetrating Peptides as Efficient Intracellular Drug Delivery Tools.」、Mol Pharm 16、3727～3743頁(2019) D Derossi、S Calvet、A Trembleau、A Brunissen、G Chassaing、A Prochiantz、「Cell internalization of the third helix of the Antennapedia homeodomain is receptor-independent」、J Biol Chem. 1996年7月26日;271(30):18188～93頁 Delivoria, D. C.ら、「Bacterial production and direct functional screening of expanded molecular libraries for discovering inhibitors of protein aggregation.」、Sci Adv 5、eaax5108 (2019) Lee, A. C.、Harris, J. L.、Khanna, K. K. & Hong, J. H.、「A Comprehensive Review on Current Advances in Peptide Drug Development and Design.」、Int J Mol Sci 20 (2019) Peterson, D. G.、Wessler, S. R. & Paterson, A. H.、「Efficient capture of unique sequences from eukaryotic genomes.」、Trends Genet 18、547～550頁(2002) I.M. Chiu及びK. Lehtoma、「Direct cloning of cDNA inserts from lambda gt11 phage DNA into a plasmid vector by a novel and simple method」、Genet Anal Tech Appl、1990年2月;7(1):18～23頁 S. Kauffman. S.、「Differentiation of malignant to benign cells.」、J. Theor. Biol. 31、429～451頁(1971) Raghunathan, A.、Valiant, G. & Zou, J.、「Estimating the unseen from multiple populations.」、Proceedings of the 34th International Conference on Machine Learning, Sydney, Australia 70、(2017) Fisher, R. A.、Corbet, A. S. & Williams, C. B.、「The relation between the number of species and the number of individuals in a random sample of an animal population.」、J Animal Ecology 12、42～58頁(1943) Y. Kongら、Int. J. Clin. Exp. Pathol.、2017; 10(6):6198～6209頁 Sambrookら、「Molecular Cloning: A Laboratory Manual」(第2版、Cold Spring Harbor Laboratory Press社、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク(1989)) Coliganら、「Current Protocols in Immunology」(Current Protocols、Wiley Interscience社(1994))
一部の実施形態は、アッセイ細胞に所望の表現型を付与する生理活性ペプチドを同定する方法に関する。本方法は、以下の工程を含む:
(a)ペプチドのプールをコードするDNA配列のDNAライブラリーを生成する工程、
(b)ペプチドのプールを発現させるために、DNA配列をアッセイ細胞中に導入する工程、
(c)場合により、アッセイ細胞に外因性の選択圧を適用する工程、
(d)所望の表現型を示すアッセイ細胞を選択する工程、及び
(e)選択されたアッセイ細胞から単離されたDNAを配列決定することによって、アッセイ細胞に所望の表現型を付与するペプチドをペプチドのプールから同定する工程。
一部の実施形態は、アッセイ細胞に所望の表現型を付与する生理活性ペプチドを同定する方法に関する。本方法は、以下の工程を含む:
a.5～20アミノ酸長のペプチドのプールをコードするDNA配列のライブラリーを生成する工程、
b.DNA配列のライブラリーをプラスミドのプール中に配置する工程、
c.多様性の損失を最小限に抑えながら、プラスミドのプールをアッセイ細胞にトランスフェクト又は形質導入するためのウイルスベクターを構築する工程、
d.ペプチドのプールのうちのペプチドによって付与される所望の効果を示すことができるアッセイ細胞に、ウイルスベクターを形質導入又はトランスフェクトする工程、
e.自然選択又は細胞の物理的ソーティングのいずれかを介して、所望の表現型を示すアッセイ細胞を選択する工程、並びに
f.選択された細胞から単離されたDNAに対してターゲットシーケンス(targeted sequencing)を行うことにより、アッセイ細胞に所望の表現型を付与するペプチドを同定する工程。
一部の実施形態は、アッセイ細胞に所望の表現型を付与する生理活性ペプチドを同定する方法に関する。本方法は、以下の工程を含む:
a.5～20アミノ酸長のペプチドのプールをコードするDNA配列のライブラリーを生成する工程、
b.DNA配列のライブラリーをプラスミドのプール中に配置する工程、
c.多様性の損失を最小限に抑えながら、プラスミドのプールをアッセイ細胞にトランスフェクト又は形質導入するためのウイルスベクターを構築する工程、
d.ウイルスベクターを複数の細胞に形質導入又はトランスフェクトする工程、
e.複数の別個の微小培養物、オルガノイド、人工器官、又は微小液滴培養物を形成するために、複数の細胞のうちの1つ以上を、ウイルスベクターで形質導入又はトランスフェクトされていない1つ以上の他の細胞と別々に組み合わせる工程、
f.1つ以上の所望の表現型を示す微小培養物、オルガノイド、人工器官、又は微小液滴培養物を選択する工程、並びに
g.選択された微小培養物、オルガノイド、人工器官、又は微小液滴培養物から単離されたDNAに対してターゲットシーケンスを実行することにより、所望の表現型を付与するペプチドを同定する工程。
一部の実施形態は、本明細書に記載の方法によって同定されるペプチドに関する。一部の実施形態は、本明細書に記載の方法によって同定されたペプチドと90％同一であるペプチド配列を含むペプチドに関する。一部の実施形態は、本明細書に記載の方法によって同定された2つ以上のペプチドの組み合わせを含む組成物に関する。
本発明のこれら及び他の特徴、側面、及び利点は、以下の説明及び添付の特許請求の範囲を参照することにより、より良く理解されるであろう。
一般的なスクリーニングスキームを示すフローチャートである。
アッセイ細胞にSARS-CoV-2に対する所望の耐性表現型を付与する生理活性ペプチドを同定するための方法の実施形態を示す図である。図2aは、109以上の配列のランダムペプチドライブラリーをコードするDNA配列が合成されることを示している。図2bは、ランダムペプチドの発現のためのプラスミドが構築されることを示している。図2cは、ウイルスベクターが生成されることを示している。図2dは、標的細胞がウイルスベクターで形質導入されることを示している。図2eは、標的細胞がSARS-CoV-2ウイルスに曝露されることを示している。図2fは、抗ウイルスペプチドを有する細胞がウイルス感染を生き延び、そのような抗ウイルスペプチドをコードするDNA配列に対してターゲットシーケンスが行われることを示している;その後、医薬品リード開発のために、抗ウイルスペプチドが合成され得る。
本明細書では、様々な状態を処置するためのペプチド治療薬を同定するためのスクリーニングアプローチが説明される。本アプローチは、所望の表現型を示すものと同じ細胞内で試験ペプチドが発現される表現型スクリーニングスキームを利用する。本表現型スクリーニングスキームは、新薬が引き出すべき望ましい表現型を示すものとまさに同じ細胞によるペプチドの遺伝子コード化と生合成を利用する。1つの非限定的な例として、所望の表現型は、病原性ウイルス(例えば、SARS-CoV-2)の複製を阻害する細胞(例えば、気道上皮細胞)でありうる。様々な実施形態において、現在の方法によって達成されるものよりも多様性を実質的に増加させる新規プロトコールで生成されたランダムペプチドのライブラリーがスクリーニングされる。ランダムペプチドをコードする遺伝子配列は、発現ベクターを介して標的細胞中に導入され、そこでそれらが発現される。対象となる疾患の状態によっては、細胞はその後、疾患を引き起こす刺激(例えば、病原性ウイルス)に曝露されうる。次いで、その表現型を引き出すランダムペプチドの遺伝子配列を決定するために、所望の表現型(例えば、生存)を示す細胞が分析されうる。これらのペプチドのヒットを検証するために更なるスクリーニングが行われてもよく、それらはその後、直接的な治療用途のための更なる研究へと前進するか、又は治療薬の更なる最適化及び同定のためのリードとして働きうる。
図1は、一般的なスクリーニングスキームを示すフローチャートである。工程100では、ランダムなペプチド配列をコードする遺伝子配列のライブラリーが生成される。工程102では、遺伝子配列が標的細胞中に導入される。次に、ランダムペプチドの各配列が、標的細胞の個々又は小さなクレードで発現される。工程104では、細胞は場合により、疾患を引き起こす刺激等の外因性の選択圧に曝露される。場合により、細胞が既に所望のスクリーニング状態にある場合(例えば、細胞が癌細胞である場合)、工程104は必要ない。この手順はまた、同じ微小培養物中の他の細胞に望ましい方法で影響を与える能力を有するランダムペプチドの分泌型を作製した細胞を濃縮するためにも使用され得る。工程106では、次いで、どのランダムペプチドが所望の応答を引き出すかを決定するために、所望の表現型を示す細胞が遺伝子配列決定に供される。工程108では、次いで、これらのヒットペプチドが直接、治療薬として開発されるか、又は更なる治療薬開発のためのリードとして働きうる。次に、これらの工程が詳しく説明される。
ランダムなペプチド配列をコードするDNAライブラリーの生成
一部の実施形態では、ペプチドのプールをコードするDNA配列のDNAライブラリーが生成される。一部の実施形態では、DNAライブラリー中のDNA配列は、ランダムに生成される。ランダムDNAライブラリーを生成するための非限定的な方法は、米国特許第5,723,323号に記載されており、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。DNA配列は、既知のオリゴ合成技術によって生成され得る。次にDNA配列は、DNA配列の発現を駆動するための要素を含む、タンパク質発現カセットを含むプラスミドに組み込まれ得る。発現を駆動するための要素は、例えば、標的細胞に合わせたエンハンサー及びプロモーター、コード領域に隣接する転写未翻訳領域(UTR)、スプライス部位、ポリ(A)シグナル等を含み得る。
一部の実施形態では、DNA配列によってコードされるペプチドは、5～20アミノ酸長である。一部の実施形態では、ペプチドは12～15アミノ酸長である。更に他の実施形態では、ペプチドは6～9アミノ酸長である。
一部の実施形態では、DNA配列のランダム性が、DNA配列がコードするアミノ酸配列組成における確率的バイアス(probabilistic bias)又は決定論的修正(deterministic modification)によって制約される。一部の実施形態では、DNA配列は、所望の物理化学的特性を満たすペプチドをコードするように設計される。例えば、一部の実施形態では、可溶性となる可能性が高いペプチドをコードする配列を設計するために、Smialowski, P.、Doose, G.、Torkler, P.、Kaufmann, S. & Frishman, D.、「PROSO II--a new method for protein solubility prediction.」、FEBS J 279、2192～2200頁(2012)に記載されているアルゴリズムが使用されてもよく、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。一部の実施形態では、DNA配列は、抗体のCDR(相補性決定領域)を模倣するペプチドをコードするように設計される。例えば、Sachdeva, S.、Joo, H.、Tsai, J.、Jasti, B. & Li, X.、「A Rational Approach for Creating Peptides Mimicking Antibody Binding.」、Scientific reports 9、997頁(2019)に記載されている技術が使用されてもよく、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。一部の実施形態では、DNA配列は、例えばコドン使用表を参照することによって、遺伝暗号及びコドン使用を考慮したペプチドをコードするように設計される。一部の実施形態では、DNA配列は、受容体結合モチーフを含むペプチドをコードするように設計される。
一部の実施形態では、DNA配列は安定性、細胞透過性、又は細胞分泌等の特定の特性を有するペプチドをコードするように設計される。
一部の実施形態では、ランダムに生成されたDNA配列は、特定の機能を付与する所定のペプチド配列をコードする他のDNA配列に融合される。特定の機能は、細胞透過ペプチド(CPP)、環状化のためのインテイン由来の隣接配列、及びランダムペプチドが分泌されるのを可能にするペプチド(すなわち、シグナルペプチド)を含みうるが、これらに限定はされない。参照によりその全体が本明細書に組み込まれるPeng C、Shi C、Cao X、Li Y、Liu F、Lu F.、「Factors Influencing Recombinant Protein Secretion Efficiency in Gram-Positive Bacteria: Signal Peptide and Beyond.」、Front Bioeng Biotechnol. 2019;7:139頁を参照されたい。
細胞透過ペプチド(CPP)は、ナノサイズの粒子から小さな化合物、DNAの大きなフラグメントに至るまでの分子の細胞への取り入れ及び取り込みを促進する短いペプチドである。「カーゴ」は、共有結合による化学的結合(すなわち、融合ペプチドとして生合成される)、又は非共有結合的相互作用のいずれかを介してペプチドと結合される。本明細書に記載のランダムペプチドと共に利用されうるCPPは、Agrawal, P.ら、「CPPsite 2.0: a repository of experimentally validated cell-penetrating peptides.」、Nucleic acids research 44、D1098～1103頁(2016)に記載されているものを含み、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれるが、限定はされない。一部の実施形態では、Park, S. E.、Sajid, M. I.、Parang, K. & Tiwari, R. K.、「Cyclic Cell-Penetrating Peptides as Efficient Intracellular Drug Delivery Tools.」、Mol Pharm 16、3727～3743頁(2019)に記載されているもの等の環状CPP配列が使用され、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
一部の実施形態において、細胞透過性ペプチド(CPP)は、HIV TATタンパク質又は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるD Derossi、S Calvet、A Trembleau、A Brunissen、G Chassaing、A Prochiantz、「Cell internalization of the third helix of the Antennapedia homeodomain is receptor-independent」、J Biol Chem. 1996年7月26日;271(30):18188～93頁に記載されているもの等のアンテナペディア遺伝子によってコードされるタンパク質である。
一部の実施形態では、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるDelivoria, D. C.ら、「Bacterial production and direct functional screening of expanded molecular libraries for discovering inhibitors of protein aggregation.」、Sci Adv 5、eaax5108 (2019)に記載されているもの等のインテイン由来の隣接配列が、ランダムペプチドの環状化を誘導するために組み込まれる。
所望の特性を達成するためにランダム配列に追加、又はランダム配列中に設計されうる追加の配列は、Lee, A. C.、Harris, J. L.、Khanna, K. K. & Hong, J. H.、「A Comprehensive Review on Current Advances in Peptide Drug Development and Design.」、Int J Mol Sci 20 (2019)に記載されており、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
場合によっては、ランダム配列のライブラリーの多様性は、増幅工程によって引き起こされる偏った分布により統計的に減少される。一部の実施形態では、この多様性の減少は、より速いハイブリダイゼーション動態を利用することによって打ち消される。一部の実施形態では、不均一な増幅工程によってしばしば失われる配列の多様性の理論的最大値に近づけることが、以下の工程から構成されるプロセスによって達成される:
(a)ランダムな配列を含むDNAを変性させ、再ハイブリダイズさせる工程、
(b)分光法、例えばUV260nm吸収によって再アニーリングをモニタリングする工程、
(c)所定の程度の再アニーリングにおいて、熱不安定性二本鎖特異的ヌクレアーゼを用いてランダムな配列の一部を選択的に消化する工程、及び
(d)加熱によってヌクレアーゼを不活性化し、より少ない量の種の再アニーリングを続ける工程。
この手順に関する更なる詳細は、Peterson, D. G.、Wessler, S. R. & Paterson, A. H.、「Efficient capture of unique sequences from eukaryotic genomes.」、Trends Genet 18、547～550頁(2002)に記載されており、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
一部の実施形態では、配列の多様性の損失が、上記のようにして生成されたDNA配列のin vitro組換え及び変異誘発を実施することによって低減される。
アッセイ細胞へのDNA配列の導入
一部の実施形態では、DNA配列をアッセイ細胞中に導入する工程は、形質転換、形質導入、及びトランスフェクションから選択される方法を含む。
一部の実施形態では、1つ以上のDNA配列が、アッセイ細胞中に導入する前にプラスミド中の1つ以上の発現カセット中に配置される。一部の実施形態では、プラスミドはエピソームプラスミドである。一部の実施形態では、ペプチドの相乗的な組み合わせを調べるために、ランダムに生成された1つより多いDNA配列が、同じ発現カセット中に配置されてもよい。
一部の実施形態では、プラスミドは、DNA配列をアッセイ細胞中に導入する前に、ウイルスベクター中に導入される。ウイルスベクターは、レンチウイルス、アデノウイルス、又はバキュロウイルスベクターであり得る。一部の実施形態では、ウイルス感染細胞の選択がFACSによって行われ得るように、ウイルスベクターが蛍光でタグ付けされる。
一部の実施形態では、DNA配列は、細胞のゲノム中に組み込まれる。一部の実施形態では、組込みは、ヌクレアーゼ媒介性の部位特異的組込み、トランスポゾン媒介性の遺伝子送達、又はウイルス媒介性の遺伝子送達による。一部の実施形態では、ヌクレアーゼ媒介性の部位特異的組込みは、CRISPR/Cas9 RNPを介する。一部の実施形態では、ウイルス媒介性の遺伝子送達は、レンチウイルスを使用する。一部の実施形態では、レンチウイルスは、生成されたプラスミドをHEK 293T細胞にトランスフェクトすることによって生成される(例えば、Lenti-X(商標)293Tレンチウイルス生成プラットフォームを使用)。
ウイルスベクターを利用する一部の実施形態では、プラスミドプールからの異なるサンプルを用いてウイルス生成細胞を反復的にトランスフェクトすることによって、配列の多様性の損失が低減される。
標的アッセイ細胞が細菌細胞である実施形態では、既知のファージ技術を使用して、DNA配列が細菌細胞中に導入されうる。例えば、一部の実施形態では、I.M. Chiu及びK. Lehtoma、「Direct cloning of cDNA inserts from lambda gt11 phage DNA into a plasmid vector by a novel and simple method」、Genet Anal Tech Appl、1990年2月;7(1):18～23頁に記載されているように、ラムダgt11ファージが使用されてもよく、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
アッセイ細胞の選択
様々な実施形態において、標的アッセイ細胞は、動物細胞又は細菌細胞でありうる。一部の実施形態では、標的アッセイ細胞は、哺乳類細胞である。一部の実施形態では、標的アッセイ細胞は、ヒト細胞である。一部の実施形態では、標的アッセイ細胞は、癌幹細胞の有糸分裂終了細胞への分化等の表現型変化がモニタリングされ得るヒト気道細胞、ヒト癌細胞から選択される。
一部の実施形態では、アッセイ細胞はヒト気道細胞であり、外因性の選択圧はウイルス感染である。一部の実施形態では、ウイルスはSARS-Cov2である。一部の実施形態では、アッセイ細胞が示す望ましい表現型は、SARS-Cov2感染後に生存することである。一部の実施形態では、感染頻度又は感染細胞の割合が測定され得るように、ウイルスが蛍光でタグ付けされ得る。一部の実施形態では、感染細胞を選択するためにFACSが使用され得る。一部の実施形態では、生存するアッセイ細胞は、細胞集団中で自然に濃縮され、所望の表現型を示し、ヒットペプチドを含む細胞の自己選択を提供する。
一部の実施形態において、アッセイ細胞は癌細胞であり、アッセイ細胞が有する所望の表現型は、細胞死、又はStuart KauffmanによってS. Kauffman. S.、「Differentiation of malignant to benign cells.」、J. Theor. Biol. 31、429～451頁(1971)という論文で最初に提唱されたように、分化細胞への転換を指し示す特定のマーカー遺伝子のスイッチオンである。
一部の実施形態では、アッセイ細胞は微生物細胞であり、アッセイ細胞が有する所望の表現型は細胞死である。例えば、微生物細胞は、細菌細胞又は真菌細胞でありうる。
様々な実施形態において、アッセイ細胞においてペプチドが引き出す所望の表現型は、以下を含むが、これらに限定はされない:
a.ウイルスに対する感染から細胞を保護すること;
b.微生物の死滅又は増殖阻害;
c.以下を含む、哺乳類細胞の状態遷移を誘導すること
i.望ましくない状態(癌、炎症等)がアポトーシス経路の細胞死に入ること、
ii.癌幹細胞様状態から有糸分裂終了状態への分化、
iii.1つの細胞型から1つ以上の他の細胞型への分化;及び
d.特定の様式で細胞の形態を変化させること。
一部の実施形態では、所望の表現型は、所望の様式での細胞集団構造の変化である。例えば、特定の細胞集団における細胞表現型の比率が、異なる所望の比率に変更されうる。
上述のように、一部の実施形態では、所望の表現型を示すアッセイ細胞の選択が、所望の表現型(例えば、細胞の生存)を示す細胞の濃縮を介して自然に生じる。したがって、これらの実施形態では、更なる細胞選択は必要ない。例えば、SARS-CoV-2又は他のウイルスによる感染の場合、抗ウイルス活性を付与するペプチドのバージョンを発現する導入遺伝子を保持する少数の細胞を除いて、ウイルスは複製して細胞を殺し、細胞集団内で増殖する。これらの細胞はウイルスに抵抗して生き続け、増殖を続ける。それらの画分は、生存している細胞の集団を次第に支配していく。それらの抗ウイルスペプチド(「ヒット」)のそれぞれの遺伝子配列もまた濃縮される。
他の実施形態では、所望の表現型を示すアッセイ細胞を選択する方法は、FACS、バイオパニング、磁気ビーズ細胞分離、又は他のセルソーティング技術を含む。例えば、ウイルス感染(例えば、SARS-CoV-2)を利用する実施形態では、ウイルスは蛍光でタグ付けされていてもよい。他の実施形態では、レンチウイルスベクターが、蛍光でタグ付けされうる。一部の実施形態では、細胞の生存率及びウイルス感染をモニタリングするために、アッセイ細胞が蛍光レポータータンパク質で標識される。一部の実施形態では、これらの技術は互いに、また上記の自然な細胞選択と組み合わせて使用されうる。
いくつかの実施形態では、上記のアッセイは、細胞が他の細胞に何らかの変化を誘導するペプチドを同定するために改変される。したがって、いくつかの実施形態では、所望の特性は、ランダムペプチドを発現する細胞以外の細胞によって示される。いくつかの実施形態では、これらの方法は以下の工程を含む:
a.5～20アミノ酸長のペプチドのプールをコードするDNA配列のライブラリーを生成する工程、
b.DNA配列のライブラリーをプラスミドのプール中に配置する工程、
c.多様性の損失を最小限に抑えながら、プラスミドのプールをアッセイ細胞にトランスフェクト又は形質導入するためのウイルスベクターを構築する工程、
d.ウイルスベクターを複数の細胞に形質導入又はトランスフェクトする工程、
e.複数の別個の微小培養物、オルガノイド、人工器官、又は微小液滴培養物を形成するために、複数の細胞のうちの1つ以上を、ウイルスベクターで形質導入又はトランスフェクトされていない1つ以上の他の細胞と別々に組み合わせる工程、
f.1つ以上の所望の表現型を示す微小培養物、オルガノイド、人工器官、又は微小液滴培養物を選択する工程、並びに
g.選択された微小培養物、オルガノイド、人工器官、又は微小液滴培養物から単離されたDNAに対してターゲットシーケンスを実行することにより、所望の表現型を付与するペプチドを同定する工程。
これらの実施形態では、ランダムペプチドは、シグナルペプチドとの融合によって分泌されるように作られ、選択の単位は、ランダムペプチドの遺伝子を保持する個々の細胞ではなく、微小培養物(例えば、マルチウェル細胞培養プレート中のウェル、細胞培養液滴)、オルガノイド、又は人工器官中の細胞集団全体となる。ここでは、細胞集団中の細胞のごく一部のみが、ランダムペプチドを発現する遺伝子を含んでおり、細胞集団全体をレスキューするそれらの能力が、スクリーニングの標的表現型となる。
一部の実施形態では、微小培養物、オルガノイド、人工器官、又は微小液滴培養物においてヒットペプチドが同定された後、次いで、ヒットペプチドの任意の組み合わせのサブセットが、所望の特性についてスクリーニングされうる。
ヒットペプチドの同定
所望の表現型を示す細胞が単離又は濃縮された後、所望の表現型を誘導したヒットペプチドの配列を同定するために、それらが分析されうる。一部の実施形態では、配列は、DNA配列決定を用いて同定される。
一部の実施形態では、DNAを配列決定する方法は、ターゲットシーケンス(例えば、上述したように、ランダムに生成された配列中に導入された隣接配列を利用)を含むが、これに限定はされない次世代型遺伝子配列決定技術である。目的のペプチド(「ヒット」)の発見は、次世代型配列決定を使用して、大量のヒト細胞集団において生じる;これは、低分子薬物スクリーニングの場合のような、ハイスループット並行微小細胞培養アッセイの必要性を取り除く。
場合によっては、上記のようにして生成されたランダムライブラリーは、「未知の種」の問題に悩まされうる。具体的には、本明細書に記載のアッセイ手順で使用されるライブラリーの特定のサンプルは、生成される配列空間内の配列の多くを含んでいないおそれがある。この問題の側面は、Raghunathan, A.、Valiant, G. & Zou, J.、「Estimating the unseen from multiple populations.」、Proceedings of the 34th International Conference on Machine Learning, Sydney, Australia 70、(2017)に記載されており、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。この問題に対処するために、一部の実施形態では、アッセイは反復的又は大規模に並行して行われる。ランダムに生成されたライブラリーからの異なるサンプルを使用してアッセイを複数回実行することにより、より多くの配列空間がスクリーニングされることになる。したがって、例えば、自己ハイブリダイゼーション動態による最も豊富な配列の除去による多様性の損失の前述の防止に加えて、より多くの配列空間をカバーするために、上記のようにして生成されたプラスミドライブラリーが、アルゴリズム的にサンプリングされ、分析されてもよい。サンプリングの最適化は、ウイルスベクター生成細胞の数によって与えられる処理可能なクローンの最大数によって制約され、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるFisher, R. A.、Corbet, A. S. & Williams, C. B.、「The relation between the number of species and the number of individuals in a random sample of an animal population.」、J Animal Ecology 12、42～58頁(1943)に記載されているように、コルベットの法則に従って、シミュレーションにより決定され、配列決定によって別途、経験的に検証される。
ヒットペプチドのリード最適化
上記の手順を使用してヒットペプチドが同定された後、それらは、所望の表現型を引き出す能力が向上したペプチドを更に同定するための出発点として利用されうる。一部の実施形態では、より強力なペプチドの進化的選択を駆動するために、複数ラウンドのスクリーニングが実施される。一部の実施形態では、新規の組換えランダムペプチドライブラリーを生成して、その後、有効性についてスクリーニングするために、2つ以上の同定されたペプチドの遺伝子組換えが使用される。一部の実施形態では、同定されたペプチドが分泌ペプチドである場合、有効性についてスクリーニングするために2つ以上の同定されたペプチドが組み合わせられる。一部の実施形態では、組換えに使用されるヒットペプチドが、配列類似性を示すヒットのセットとなるように選択されるが、これは、ヒットのセットが同じ細胞標的に結合することを示唆しうる。一部の実施形態では、組換えに使用されるヒットペプチドは、80％、85％、90％、95％、98％、又は99％を超える相同性を有するように選択される。様々な実施形態において、2、3、4、5、6、7、又はそれ以上のヒットペプチドが、組換えのために選択される。
別の実施形態では、多様なヒットペプチドが組換えのために選択されるが、これは、それらが異なる細胞標的に結合しうることを示唆している。したがって、例えば、50%、70%、80%、85%、90%、95%、98%、又は99%未満の相同性を有するヒットペプチドが選択され、その後、スクリーニングのための新たなペプチドライブラリーを生成するために組換えに供される。様々な実施形態において、2、3、4、5、6、7、又はそれ以上のヒットペプチドが、組換えのために選択される。
他の実施形態では、類似したペプチドのセットを生成するために、点変異がヒットペプチド中に導入される。例えば、「疑似種」集団を生成するために、配列空間内でのハミング距離が1、2、又は3となる変異が導入されうる。次いで、この新たな配列集団は、本明細書に記載の技術を使用してスクリーニングされうる。点変異の利用は、上記の組換え技術に加えて、又はその後に利用されてもよい。
一部の実施形態では、いっそう有効性の高い配列を同定するために、上記の変異アプローチが反復して実施されうる。反復は、十分なレベルの有効性が達成されるまで、又は有効性の改善が達成されなくなるまで、繰り返されうる。
ヒットペプチドを治療薬として更に開発するために、他の既知の技術が使用されてもよい。一部の実施形態では、ペプチドの物理化学的特性及び薬物動態学的特性を変化させるために、ヒットペプチドの化学修飾が行われる。例えば、上述したようにCPP配列がランダム配列中にまだ組み込まれていない実施形態では、処置使用時における細胞侵入を促進するためにCPP配列が追加されうる。他の実施形態では、ペプチドの所望の物理化学的特性又は環状化等の所望の特性を達成するために、ペプチド配列に対して設計された変種が作成される。一部の実施形態では、in vivoでの安定性を高めるために、配列中の1つ以上のアミノ酸がD-アミノ酸へと変更される。
他の実施形態は、リポソーム又は他の脂質ナノ粒子に組み込む等、同定された治療用ペプチドを送達のための製剤パッケージに組み込むことを含む。
一部の実施形態は、本明細書に記載の任意の方法によって同定されるペプチドに関する。一部の実施形態は、本明細書に記載の方法によって同定された2つ以上のペプチドの組み合わせを含むペプチドに関する。一部の実施形態は、本明細書に記載のペプチドと90％同一であるペプチド配列を含むペプチドに関する。
一部の実施形態では、ヒットペプチドが更にスクリーニングされる。一部の実施形態では、ヒットペプチドは合成的に作られる。次に、合成ヒットペプチドが、細胞に所望の表現型を与えることができるかどうかを試験するために、それらは細胞に導入され得る。
ウイルス変異に対して有効なヒットペプチドの選択
上で論じたように、一部の実施形態は、抗ウイルス薬として有効なペプチドの同定を含む。一部の実施形態では、変異ウイルスに対して最も効果的なヒットのサブセット、又はヒットの組み合わせを同定するために、上記のようにして同定された抗ウイルス特性を示すヒットペプチドの集合が更にスクリーニングされる。そのようなヒットのサブセット又はヒットの組み合わせは、その後、そのサブセット又は組み合わせがウイルスの変異株に対して引き続き有効であることを期待して、特定の循環ウイルスに対して使用されうる。そのような治療法は、その治療法で処置された宿主内でのウイルス変異の蓄積を阻害することも期待されるであろう。
一部の実施形態では、追加のスクリーニングは、ヒト細胞培養物内の細胞の全て又は一部を、上記のようにして同定されたヒットペプチドからランダムに選択された単一のヒットペプチド又はその組み合わせを発現するレンチウイルスに感染させることを含む。一部の実施形態では、2、3、4、5、6、7、又はそれ以上のヒットペプチドを発現する1つ以上のレンチウイルスが使用される。一部の実施形態では、細胞の一部は、細胞の第1の集合を感染させ、続いて、非感染細胞を追加することによって生成される。十分な増殖期間(例えば、6時間)の後、標的ウイルス(例えば、SARS-CoV2)で細胞が感染される。一部の実施形態では、細胞及び/又は標的ウイルスは、感染のモニタリングを可能にするために標識されていてもよい。例えば、細胞は緑色蛍光タンパク質で標識されていてもよく、ウイルスはフルオレセインで標識されていてもよい。細胞シグナルとウイルスシグナルの比は、感染した細胞を保護するヒットペプチドの能力の試験を可能とする。ウイルスにおける変異の蓄積は、様々な(例えば、所定の)時点において、ウイルスの配列を決定する(例えば、ターゲットシーケンス又はディープシークエンシングを使用する)ことによって、モニタリングされうる。
1つの変形例では、初期の細胞培養物の一部が、異なる培養容器に移され、このプロセスが、細胞の一部の連続的な移送と共に繰り返されうる。一部の実施形態では、細胞の数及び移送率は、連続的な移送にわたって変動してもよい。各培養容器、又は培養容器のサブセット内のウイルスは、ウイルス変異の存在を決定するために(例えば、ターゲットシーケンス又はディープシークエンシングを使用して)配列決定されうる。
配列決定は、ウイルスのバリアントの数、どのバリアントがまだ増殖しており、どのバリアントが絶滅したか、各バリアントのコピー数、及び各バリアントに蓄積された変異の数を取得するために、使用され得る。一部の実施形態では、これらの変数が、いつ実験を停止するかを決定するために使用されうる。
この実験は、ランダムに選択された異なるヒットペプチド又はヒットペプチドの組み合わせを使用して繰り返されうる。次いで、ウイルス進化の発生を低減又は減速させるヒットペプチド又はペプチドの組み合わせが、治療薬としての開発及び使用のために選択されうる。また、このプロセスは、ウイルスの変異の可能性を同定するためにも使用されうる。これらの変異株は、上記の最初のヒットペプチドの同定プロセスにおいて使用され得るであろう。
一部の実施形態では、上記の実験の結果が、系統発生グラフを生成するために使用される。ヒットペプチド、ペプチドの組み合わせの有効性、又はヒットペプチドの濃縮は、系統発生グラフの検討に基づいて評価され得る。ウイルスの進化の減速又は停止は、系統発生グラフの分岐構造の低減によって示され得る。進化を減速させる効果が高まるにつれて、感染後の同程度の時点で見出される分岐の数は少なくなる。
一部の実施形態では、ウイルスバリアントが出現し、存続し、そしておそらくプロセスの過程で消滅する時のこれらバリアントのコピー数を確立するために、上記の実験の結果が使用される。
一部の実施形態では、1)新たな株の出現を阻止する、2)所定の培養時間の間に系中の所定の細胞総数において新たな株を絶滅させる、又は3)所定の時点以降は新たな株の出現を許容せず、その時点以降は初期のウイルスが集団内で増殖し続けることを許さないために有効なヒットペプチド又はペプチドの組み合わせが選択される。
一部の実施形態では、所望の抗変異特性を有するヒットペプチドの組み合わせが、上記の実験を使用して、ヒットペプチドのセットの全ての組み合わせ及びサブコンビネーションを試験することによって決定されうる。次いで、ヒットペプチドの最も優れた性能の組み合わせが、治療薬の開発に使用されうる。別の実施形態では、ヒットペプチドの第1のトライアルセット(ペプチドセット全体のサブセット)から始めることによって、ヒットペプチドの組み合わせが同定されてもよい。第1の後続のセットは、第1のトライアルセットからのヒットペプチドの1つの追加又は1つの除去を含みうる。全てのそのような第1の後続セットが試験され、最良のものが新たな開始セットとして使用され、そこから、新たな開始セットからの1つの追加又は1つの除去の全ての組み合わせバリアントを含む第2の後続セットが試験される。この「ヒルクライミング」プロセスは、所望のレベルの有効性が達成されるまで継続されうる。ヒットペプチドの適切な最終セットを効率的な方法で同定するために、他のヒルクライミング最適化アルゴリズムが使用されてもよいことが理解されるであろう。
細胞標的の同定
一部の実施形態は、本明細書で同定されたペプチドの細胞標的を同定する方法に関する。したがって、この同定は、治療介入のための新たなドラッガブルな標的を提供しうる。標的がわかれば、従来的なスクリーニング又は医薬化学アプローチを含む、その標的にヒットする治療薬を同定するための様々な方法が利用されうる。親和性に基づく方法を含む、ヒットペプチドの細胞標的を同定するための任意の既知の適切な方法が使用されてもよい。一部の実施形態では、ペプチドの作用機序に関与するタンパク質-タンパク質相互作用のパートナー及び細胞経路が同定される。
本発明を更に説明するために、以下の実施例が含められている。もちろん、実施例は本発明を特に限定するものとして解釈されるべきではない。特許請求の範囲内のこれらの実施例の変形は、当業者の範囲内であり、本明細書に記載され、特許請求される本発明の範囲内にあるとみなされる。本開示を理解した当業者であれば、網羅的な実施例がなくても本発明を調製し、使用することができることを読者は認識するであろう。
SARS-CoV-2感染に対する耐性を付与するペプチドを同定するための実験が行われる。図2に実験が示されている。図2aでは、109以上の配列のランダムペプチドライブラリーをコードするDNA配列が合成される。図2bでは、タンパク質発現カセットを含むプラスミドが構築される。プラスミドは、CPP配列を含むペプチドコーディングDNA配列を含む1つ以上の発現カセット、及び標的細胞内での発現のための調節部位、並びにウイルスベクターを生成するための配列要素(隣接LTR配列、パッケージングシグナル)を含む。図2cでは、293T細胞を利用してレンチウイルスベクターが生成される。図2dでは、標的細胞がウイルスベクターで形質導入される。SARS-Cov2ウイルスに感受性のあるヒト肺上皮細胞が、細胞培養物(数億個の細胞の集団)内の各細胞がランダムペプチドの異なるバージョンを発現するように、ランダムペプチドをコードする遺伝子発現カセットを含むレンチウイルスベクターで形質導入される。形質導入されたヒト肺上皮細胞は、コンフルエンスまで増殖される。図2eでは、標的細胞がSARS-Cov2ウイルスに曝露される。抗ウイルス活性を付与するペプチドのバージョンを発現するDNA配列を保持する少数の細胞を除いて、ウイルスは複製して細胞を殺し、細胞集団内で増殖する。これらの細胞はウイルスに抵抗して生き続け、増殖を続ける。それらの画分は、生存している細胞の集団を次第に支配していく。それらの抗ウイルスペプチドのそれぞれの遺伝子配列もまた濃縮され、生き残った細胞培養物全体の次世代型DNA配列決定によって一度に同定される。図2fでは、抗ウイルスペプチドを有する細胞がウイルス感染を生き延び、そのような抗ウイルスペプチドをコードするDNA配列に対してターゲットシーケンスが行われる;その後、医薬品リード開発のために、抗ウイルスペプチドが合成され得る。
この例は、SARS-CoV-2ウイルスの変異に対して有効であるか、又はその変異をブロックするヒットペプチドの選択の1つの応用例を示している。
SARS-CoV-2ウイルスに対する抗ウイルス活性を有するヒットペプチドは、実施例1の手順に従って同定される。
これらの抗ウイルスペプチドをコードするDNA配列が、レンチウイルスベクター中に挿入される。レンチウイルスは以前に記載されたようにして生成される。Y. Kongら、Int.J.Clin.Exp.Pathol.、2017;10(6):6198～6209頁。簡単に説明すると、レンチウイルスは、抗ウイルスペプチドを含むレンチウイルス発現プラスミドと3つのパッケージングプラスミドを含む4つのプラスミドの系をLipofectamine(商標)2000の助けを借りて293T細胞に同時トランスフェクトすることによって生成される。その結果生じるレンチウイルス粒子を含む培養上清が、トランスフェクションの48時間及び72時間後に回収され、次に、プールされた上清が50,000gで2時間超遠心分離される(Optima L-90K、Beckman社、米国)。調製物の感染力価は、倒立蛍光顕微鏡(Ti-s、Nikon社、日本)を使用して、濃縮レンチウイルスの段階希釈液でトランスフェクトされた後のGFP陽性293T細胞の割合を検出することによって決定される。
その結果生じたレンチウイルスでヒト肺細胞がトランスフェクトされる。トランスフェクトされた細胞が抗ウイルスペプチドを発現することを可能とする一定の期間の後、トランスフェクトされた細胞が、培養フラスコ内でトランスフェクトされていない他のヒト肺細胞と混合される。次に、混合された細胞がSARS-Cov2ウイルスに感染される。
次に、感染細胞は別々のフラスコに分けられ、このプロセスが連続的に繰り返される。数回の細胞継代後、SARS-Cov2ウイルスの進化と増殖を決定するために、ターゲットシーケンスが行われる。これらの結果に基づいて、ウイルスの変異に対して効果的であるか、又はそれをブロックする1つ以上の抗ウイルスペプチドが選択される。
詳細な説明のセクション、以下の特許請求の範囲、及び添付の図面では、本発明の特定の特徴(方法の工程を含む)への言及がなされる。本明細書における本発明の開示は、そのような特定の特徴のあらゆる可能な組み合わせを含むことを理解されたい。また、例えば、特定の特徴が、本発明の特定の側面若しくは実施形態、又は特定の請求項の文脈で開示されている場合、その特徴は、可能な範囲で、本発明の他の特定の側面及び実施形態と組み合わせて、並びに/又は本発明の他の特定の側面及び実施形態の文脈において、並びに本発明全般においても使用され得る。
2つ以上の定義された工程を含む方法が本明細書中で参照される場合、定義された工程は任意の順序で、又は同時に実行することができ(文脈がその可能性を排除する場合を除く)、また方法は、定義された工程のいずれかの前、2つの定義された工程の間、又は全ての定義された工程の後に実行される1つ以上の他の工程を含むことができる(文脈がその可能性を排除する場合を除く)。
ここで開示され特許請求される発明概念は、その適用において、以下の説明に記載される、又は図面、実験及び/又は結果に示される成分の構成及び配置の詳細に限定されないことを理解されたい。ここで開示及び請求される発明概念は、他の実施形態が可能であるか、又は様々な方法で実施又は実行されることが可能である。したがって、本明細書で使用される文言は、可能な限り広い範囲と意味が与えられることが意図されている;そして、実施形態は例示的なものであって、網羅的なものではない。また、本明細書で採用されている表現及び用語は、説明を目的としたものであり、限定的を課すものとみなされるべきではないことを理解されたい。
本明細書において特に定義されない限り、ここで開示及び/又は特許請求されている発明概念に関して使用される科学的及び技術的用語は、当業者によって一般的に理解される意味を有するものとする。更に、文脈によって別段要求されない限り、単数形の用語は複数形を含み、複数形の用語は単数形を含むものとする。一般に、本明細書に記載の細胞培養、組織培養、分子生物学、タンパク質及びオリゴ若しくはポリヌクレオチド化学、並びにハイブリダイゼーションに関連して使用される学術用語及び技術は、当該技術分野において周知であり、一般的に使用されているものである。組換えDNA、オリゴヌクレオチド合成、組織培養及び形質転換(例えば、エレクトロポレーション、リポフェクション)には、標準的な技術が使用される。酵素反応及び精製技術は、製造業者の仕様書に従って、又は当技術分野において一般的に達成されているように、又は本明細書に記載されているようにして実施される。前述の技術及び手順は、一般に、当技術分野で周知の従来的な方法に従って、また本明細書全体にわたって引用及び議論されている様々な一般的及び、より具体的な参考文献に記載されているようにして実施される。例えば、参照により本明細書に組み込まれるSambrookら、「Molecular Cloning: A Laboratory Manual」(第2版、Cold Spring Harbor Laboratory Press、コールドスプリングハーバー社、ニューヨーク(1989))及びColiganら、「Current Protocols in Immunology」(Current Protocols、Wiley Interscience社(1994))を参照されたい。本明細書に記載されている分析化学、有機合成化学、並びに医薬及び製薬化学に関連して使用される学術用語、並びに実験手順及び技術は、当技術分野において周知であり、一般的に使用されているものである。標準的な技術が、化学合成、化学分析、医薬品調製、製剤化、及び送達、並びに患者の治療に使用される。
本明細書で言及されている全ての特許、公開特許出願、及び非特許文献は、ここで開示及び/又は特許請求されている発明概念の属する技術分野における当業者の技術レベルを指し示すものである。この出願のいずれかの部分で言及されている全ての特許、公開特許出願、及び非特許文献は、個々の特許又は文献が参照により組み込まれることが具体的且つ個別に指し示されている場合と同じ程度に、その全体が参照により本明細書に明示的に組み込まれる。
本明細書において開示及び/又は特許請求されている組成物及び/又は方法は全て、本開示に照らして過度の実験をすることなく作成及び実行され得る。本発明の概念の組成物及び方法は、特定の実施形態の面から説明されているが、当業者には、ここに開示及び/又は特許請求されている発明概念の概念、精神及び範囲から逸脱することなく、組成物及び/又は方法、及び本明細書に記載の方法の工程又は一連の工程に変形が適用されうることが明らかであろう。当業者にとって明らかなそのような類似の代替物及び改変は全て、添付の特許請求の範囲によって定義される発明概念の精神、範囲及び概念内にあるとみなされる。
本開示に従って使用される以下の用語は、別段の指示がない限り、以下の意味を有するものと理解されるものとする:
特許請求の範囲及び/又は明細書において「含む(comprising)」という用語と組み合わせて使用される「1つ(a)」又は「1つ(an)」という語の使用は、「1つ(one)」を意味しうるが、「1つ以上(one or more)」、「少なくとも1つ(at least one)」及び「1つ又は1つより多い(one or more than one)」の意味とも一致する。単数形「1つの(a)」、「1つの(an)」、及び「その(the)」は、文脈が明らかにそうでないと指し示めさない限り、複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「1つの化合物(a compound)」への言及は、1つ以上、2つ以上、3つ以上、4つ以上、又はそれ以上の数の化合物を指していてもよい。「複数(plurality)」という用語は「2つ以上(two or more)」を意味する。特許請求の範囲における「又は(or)」という用語の使用は、開示が選択肢並びに「及び/又は」のみを指す定義をサポートしていても、選択肢のみを指すことが明示的に示されていない限り、又は選択肢が相互に排他的である場合を除き、「及び/又は」を意味するために使用される。本出願全体を通じて、「約」という用語は、値がデバイスに固有の誤差の変動、値を決定するために使用される方法、又は試験対象間に存在する変動を含むことを指し示すために使用される。例えば、限定するものではないが、「約」という用語が使用される場合、指定された値は、指定された値から±20%、又は±10%、又は±5%、又は±1%、又は±0.1%変動する可能性があるが、そのような変動は、開示の方法を実行するために適切であり、当業者には理解されるとおりである。用語「少なくとも1つ」の使用は、1つだけでなく、2、3、4、5、10、15、20、30、40、50、100等を含むがこれらに限定されない、1より多い量も含むと理解される。「少なくとも1つ」という用語は、それに付随する用語に応じて、100又は1000以上に及ぶ場合がある;更に100/1000の量は、これより高い制限でも満足のいく結果が得られうることから、限定的なものであるとはみなされない。更に「X、Y及びZのうちの少なくとも1つ」という用語の使用は、X単独、Y単独、及びZ単独、並びにX、Y及びZの任意の組み合わせを含むものと理解されるであろう。序数の用語(つまり「第1」、「第2」、「第3」、「第4」等)の使用は、2つ以上の項目を区別する目的のためのみであり、順序若しくは順番、例えば、ある項目の他の項目に対する重要性、又は追加の順序を暗示することを意図したものではない。
本明細書及び特許請求の範囲で使用される場合、用語「含む(comprising)」(及び「含む(comprise)」及び「含む(comprises)」等のその任意の形態)、「有する(having)」(及び「有する(have)」及び「有する(has)」等のその任意の形態)、「含む(including)」(及び「含む(includes)」及び「含む(include)」等のその任意の形態)又は「含む(containing)」(及び「含む(contains)」及び「含む(contain)」等のその任意の形態)は、包括的又は開放的であり、追加の未記載の要素又は方法の工程を除外するものではない。
「癌」という用語は、分化の喪失、増殖速度の増加、周囲組織への浸潤を伴う遺伝的、後成的又は表現型の変化を受け、転移することができる悪性新生物を意味する。「癌」という用語は、対象内の細胞の制御されない増殖により特徴付けられる疾患を含むと解釈されるものとする。一部の実施形態では、「癌」及び「腫瘍」という用語は互換的に使用される。一部の実施形態では、「腫瘍」という用語は、良性又は非悪性の増殖を指す。
本発明は実施形態及び実施例を参照して説明されているが、本発明の精神から逸脱することなく、数多くの様々な変更が加えられ得ることが理解されるべきである。したがって、本発明は、特許請求の範囲によってのみ限定される。

Claims (33)

  1. アッセイ細胞に所望の表現型を付与する生理活性ペプチドを同定する方法であって、
    (f)ペプチドのプールをコードするDNA配列のDNAライブラリーを生成する工程、
    (g)ペプチドのプールを発現させるために、DNA配列をアッセイ細胞中に導入する工程、
    (h)場合により、アッセイ細胞に外因性の選択圧を適用する工程、
    (i)所望の表現型を示すアッセイ細胞を選択する工程、及び
    (j)選択されたアッセイ細胞から単離されたDNAを配列決定することによって、アッセイ細胞に所望の表現型を付与するペプチドをペプチドのプールから同定する工程
    を含む、方法。
  2. DNAライブラリー中のDNA配列がランダムに生成される、請求項1に記載の方法。
  3. DNA配列のランダム性が、DNA配列がコードするアミノ酸配列組成における確率的バイアス又は決定論的修正によって制約される、請求項2に記載の方法。
  4. ランダムに生成されたDNA配列が、1つの単一の融合ペプチド内で特定の機能性を付与する所定のペプチド配列をコードする他のDNA配列に融合される、又は複数のペプチドとして、同じ発現カセット中のマルチシストロニック転写産物によって、若しくは別個の発現カセット中でコードされる、請求項2又は3に記載の方法。
  5. プール中のペプチドの長さが5～20aa長である、請求項1に記載の方法。
  6. DNA配列をアッセイ細胞中に導入する工程が、形質転換、形質導入、及びトランスフェクションから選択される方法を含む、請求項1に記載の方法。
  7. 1つ以上のDNA配列が、アッセイ細胞中に導入される前に、プラスミド中の1つ以上の発現カセット中に配置される、請求項1に記載の方法。
  8. 配列の多様性が、ハイブリダイゼーション動態を使用することによって、増幅によって引き起こされる種頻度の偏った分布を補正することにより増加される、請求項7に記載の方法。
  9. 配列の多様性の増加が、
    (a)ランダムな配列を含むDNAを変性させ、再ハイブリダイズさせる工程、
    (b)分光法により再アニーリングをモニタリングする工程、
    (c)所定の程度の再アニーリングにおいて二本鎖特異的ヌクレアーゼを用いてランダムな配列の一部を選択的に消化する工程、及び
    (d)ヌクレアーゼを不活性化する工程
    によって達成される、請求項8に記載の方法。
  10. DNA配列をアッセイ細胞中に導入する前に、プラスミドがウイルスベクター中に導入される、請求項7に記載の方法。
  11. 配列の多様性の損失が、ベクターウイルス生成細胞の反復トランスフェクションによって低減される、請求項10に記載の方法。
  12. 配列の多様性の損失が、DNA配列のin vitro組換え及び変異誘発を実施することによって低減される、請求項10に記載の方法。
  13. DNA配列が細胞のゲノム中に組み込まれる、請求項1に記載の方法。
  14. 組込みが、ヌクレアーゼ媒介性の部位特異的組込み、トランスポゾン媒介性の遺伝子送達、又はウイルス媒介性の遺伝子送達によるものである、請求項13に記載の方法。
  15. ヌクレアーゼ媒介性の部位特異的組込みが、CRISPR/Cas9 RNPを介したものである、請求項14に記載の方法。
  16. ウイルス媒介性の遺伝子送達がレンチウイルスを使用する、請求項14に記載の方法。
  17. アッセイ細胞がヒト気道細胞、癌細胞、及び細菌細胞から選択される、請求項1に記載の方法。
  18. アッセイ細胞がヒト気道細胞であり、外因性の選択圧がウイルス感染である、請求項17に記載の方法。
  19. ウイルスがSARS-Cov2である、請求項18に記載の方法。
  20. アッセイ細胞が示した所望の表現型が、SARS-Cov2感染後に生存することである、請求項19に記載の方法。
  21. アッセイ細胞が癌細胞であり、アッセイ細胞が有する所望の表現型が細胞死である、請求項1に記載の方法。
  22. アッセイ細胞が有する所望の表現型が、望ましくない状態から所望の状態への移行を含む、請求項1に記載の方法。
  23. 所望の表現型を示すアッセイ細胞を選択する方法が、自然選択又はセルソーティングを含む、請求項1に記載の方法。
  24. DNAを配列決定する方法が、次世代型ターゲット遺伝子配列決定である、請求項1に記載の方法。
  25. 請求項1～24のいずれか一項に記載の方法により同定されるペプチド。
  26. 請求項1～24のいずれか一項に記載の方法によって同定された2つ以上のペプチドの組み合わせを含む組成物。
  27. 請求項25に記載のペプチドと90％同一であるペプチド配列を含むペプチド。
  28. ランダムなペプチドのプールから生理活性ペプチドを同定する方法であって、
    a.5～20アミノ酸長のペプチドのプールをコードするDNA配列のライブラリーを生成する工程、
    b.DNA配列のライブラリーをプラスミドのプール中に配置する工程、
    c.多様性の損失を最小限に抑えながら、プラスミドのプールをアッセイ細胞にトランスフェクト又は形質導入するためのウイルスベクターを構築する工程、
    d.ペプチドのプールのうちのペプチドによって付与される所望の効果を示すことができるアッセイ細胞に、ウイルスベクターを形質導入又はトランスフェクトする工程、
    e.自然選択又は細胞の物理的ソーティングのいずれかを介して、所望の表現型を示すアッセイ細胞を選択する工程、並びに
    f.選択された細胞から単離されたDNAに対してターゲットシーケンスを行うことにより、アッセイ細胞に所望の表現型を付与するペプチドを同定する工程
    を含む、方法。
  29. a.組換えられた新規ランダムペプチドのプールを生成するために、同定されたペプチドのうちの2つ以上の遺伝子組換えを実施する工程、及び
    b.類似したペプチドのセットを生成するために、同定されたペプチドに点変異を導入する工程
    のうちの1つを更に含む、請求項28に記載の方法。
  30. ペプチドのプールのペプチドによって付与される所望の表現型が、
    a.ウイルスに対する感染から細胞を保護すること;
    b.微生物の死滅又は増殖阻害;
    c.哺乳類細胞の状態遷移を誘導すること;又は
    d.細胞の形態を変化させること
    を含む、請求項1又は28に記載の方法。
  31. 同定されたペプチドの作用機序に関与するタンパク質-タンパク質相互作用パートナー又は細胞経路を同定する工程を更に含む、請求項1又は28に記載の方法。
  32. ランダムなペプチドのプールから生理活性ペプチドを同定する方法であって、
    a.5～20アミノ酸長のペプチドのプールをコードするDNA配列のライブラリーを生成する工程、
    b.DNA配列のライブラリーをプラスミドのプール中に配置する工程、
    c.多様性の損失を最小限に抑えながら、プラスミドのプールをアッセイ細胞にトランスフェクト又は形質導入するためのウイルスベクターを構築する工程、
    d.ウイルスベクターを複数の細胞に形質導入又はトランスフェクトする工程、
    e.複数の別個の微小培養物、オルガノイド、人工器官、又は微小液滴培養物を形成するために、複数の細胞のうちの1つ以上を、ウイルスベクターで形質導入又はトランスフェクトされていない1つ以上の他の細胞と別々に組み合わせる工程、
    f.1つ以上の所望の表現型を示す微小培養物、オルガノイド、人工器官、又は微小液滴培養物を選択する工程、並びに
    g.選択された微小培養物、オルガノイド、人工器官、又は微小液滴培養物から単離されたDNAに対してターゲットシーケンスを実行することにより、所望の表現型を付与するペプチドを同定する工程
    を含む、方法。
  33. 所望の表現型が抗ウイルス効果であり、方法が更に、
    同定されたペプチドのうち1つ以上を発現するDNAを送達するように構成されたウイルスベクターを構築する工程;
    ヒト細胞培養物又はヒト細胞培養物の一部を、同定されたペプチドのうち1つ以上を発現するウイルスベクターで感染させる工程;
    ヒト細胞培養物を一定期間増殖させる工程;
    ヒト細胞培養物又はヒト細胞培養物の一部を、抗ウイルス効果が望まれるウイルスで感染させる工程;
    ウイルス変異の存在を決定するために、抗ウイルス効果が望まれるウイルスのDNA配列決定を複数の時点で実施する工程;並びに
    ウイルス変異の発生を阻害する能力に基づいて、同定されたペプチドのうちの1つ以上を選択する工程
    を含む、請求項1又は28に記載の方法。
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