JP2022513459A - タンパク質代替治療モダリティを送達するためのアネロソーム - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2018年12月12日に出願された米国仮特許出願第62/778,861号明細書、及び2018年12月12日に出願された米国仮特許出願第62/778,866号明細書の利益を主張する。前述した出願の内容は、その全体を参照により本明細書に組み込む。
本願は、ASCIIフォーマットに電子データとして提出された配列表を含み、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。前記ASCIIコピーは、2019年12月9日に作成され、V2057-7003WO_SL.txtと題し、そのサイズは、825,844バイトである。
(i)アルギニンリッチ領域、例えば、本明細書に記載されるアルギニンリッチ領域配列に対して少なくとも70%(例えば、少なくとも約70、80、90、95、96、97、98、99、若しくは100%)の配列同一性を有するアミノ酸配列、又は少なくとも60%、70%、若しくは80%の塩基性残基(例えば、アルギニン、リシン、若しくはそれらの組合せ)を含む少なくとも約40アミノ酸の配列を含む第1領域、
(ii)ゼリーロール(jelly-roll)ドメイン、例えば、本明細書に記載されるゼリーロール領域配列に対して少なくとも30%(例えば、少なくとも約30、35、40、50、60、70、80、90、95、96、97、98、99、若しくは100%)の配列同一性を有するアミノ酸配列、又は少なくとも6つのβ鎖を含む配列を含む第2領域、
(iii)本明細書に記載されるN22ドメイン配列に対して少なくとも30%(例えば、少なくとも約30、35、40、50、60、70、80、90、95、96、97、98、99、若しくは100%)の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第3領域、
(iv)本明細書に記載されるアネロウイルス(Anellovirus)ORF1 C末端ドメイン(CTD)配列に対して少なくとも70%(例えば、少なくとも約70、80、90、95、96、97、98、99、若しくは100%)の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第4領域、並びに
(v)任意選択で、上記ポリペプチドは、本明細書に記載される野生型アネロウイルス(Anellovirus)ORF1タンパク質に対して100%、99%、98%、95%、90%、85%、80%未満の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
a)以下:
(i)アネロソーム、例えば、本明細書に記載される合成アネロソームの遺伝子エレメントの核酸配列を含む第1核酸分子と、
(ii)第1核酸、又は例えば、表16のいずれかに列挙されるように、ORF1、ORF2、ORF2/2、ORF2/3、ORF1/1、若しくはORF1/2から選択されるアミノ酸配列、又はそれに対して少なくとも70%(例えば、少なくとも約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、若しくは100%)の配列同一性を有するアミノ酸配列の1つ若しくは複数をコード化する第2核酸分子と
を含む宿主細胞を用意するステップ;及び
b)アネロソームを作製するのに好適な条件下で宿主細胞をインキュベートするステップ
を含む。
a)アネロソーム、例えば、本明細書に記載される合成アネロソームの1つ若しくは複数の成分(例えば、全成分)を含む、例えば、発現する宿主細胞を用意するステップを含む。例えば、宿主細胞は、(a)本明細書に記載のアネロウイルス(Anellovirus)ORF1をコード化する配列を含む核酸(ここで、核酸は、プラスミドであるか、ウイルス核酸であるか、又はヘルパー細胞染色体中に組み込まれる);及び(b)遺伝子エレメントを含み、ここで、遺伝子エレメントは、(i)エフェクター(例えば、外性エフェクター若しくは内在性エフェクター)をコード化する核酸配列(例えば、DNA配列)に動可能に連結したプロモータエレメントと、(i)(a)のポリペプチドに結合するタンパク質結合配列と、を含み、その際、宿主細胞又はヘルパー細胞は、(a)及び(b)をcis又はtransのいずれかで含む。複数の実施形態において、(b)の遺伝子エレメントは、環状、一本鎖DNAである。一部の実施形態では、宿主細胞は、生産細胞株であり;
b)宿主細胞からアネロソームの調製物を生産するのに好適な条件下で宿主細胞を培養し(ここで、調製物のアネロソームは、遺伝子エレメント(例えば、本明細書に記載される通り)を包膜するタンパク質性外層(例えば、ORF1分子を含む)を含む)、それにより、アネロソームの調製物を製造するステップ;並びに
任意選択で、c)例えば、被験者への投与に好適な医薬組成物として、アネロソームの調製物を製剤化するステップ。
(i)本明細書に記載されるアネロソームの遺伝子エレメントの核酸配列を含む第1核酸分子、及び
(ii)任意選択で、表16のいずれかに列挙されるORF1、ORF2、ORF2/2、ORF2/3、ORF1/1、若しくはORF1/2から選択されるアミノ酸配列、又はそれに対して少なくとも70%(例えば、少なくとも約70、80、90、95、96、97、98、99、若しくは100%)の配列同一性を有するアミノ酸配列の1つ若しくは複数をコード化する第2核酸分子
を含む宿主細胞を特徴とする。
1.以下:
(a)タンパク質性外層;
(b)プロモータエレメントと、外性エフェクターをコード化する核酸配列(例えば、DNA配列)と、タンパク質結合配列(例えば、外部タンパク質結合配列)と、を含む遺伝子エレメント
を含む、アネロソームにおいて;
外性エフェクターは、変異すると、ヒトの疾患を引き起こすポリペプチド、又は前記ポリペプチドの機能性変異体を含み;
遺伝子エレメントは、タンパク質性外層内に閉じ込められており;且つ
アネロソームは、遺伝子エレメントを真核細胞に送達するように構成されており;
任意選択で、遺伝子エレメントが、野生型アネロウイルス(Anellovirus)ゲノム配列(例えば、本明細書に記載の通り)と比較して、少なくとも1つの相違(例えば、変異、化学修飾、若しくはエピジェネティックな改変)、例えば、挿入、置換、酵素的修飾、及び/又は欠失、例えば、特定のドメイン(例えば、TATAボックス、キャップ部位、転写開始部位、5’UTR、オープンリーディングフレーム(ORF)、ポリ(A)シグナル、若しくはGCリッチ領域のうち1つ若しくは複数)の欠失を有する、アネロソーム。
(a)タンパク質性外層;
(b)エフェクター(例えば、内在性エフェクター若しくは外性エフェクター)をコード化する異種核酸配列(例えば、DNA配列)に作動可能に連結したプロモータエレメントを含む遺伝子エレメント
を含む、アネロソームにおいて;
外性エフェクターは、変異すると、ヒトの疾患を引き起こすポリペプチド、又は前記ポリペプチドの機能性変異体を含み;
遺伝子エレメントは、タンパク質性外層内に閉じ込められており;
任意選択で、遺伝子エレメントが、野生型アネロウイルス(Anellovirus)ゲノム配列(例えば、本明細書に記載の通り)と比較して、少なくとも1つの相違(例えば、変異、化学修飾、若しくはエピジェネティックな改変)、例えば、挿入、置換、酵素的修飾、及び/又は欠失、例えば、特定のドメイン(例えば、TATAボックス、キャップ部位、転写開始部位、5’UTR、オープンリーディングフレーム(ORF)、ポリ(A)シグナル、若しくはGCリッチ領域のうち1つ若しくは複数)の欠失を有する、アネロソーム。
(a)タンパク質性外層;
(b)プロモータエレメントと、外性エフェクターをコード化する核酸配列(例えば、DNA配列)と、タンパク質結合配列(例えば、外部タンパク質結合配列)と、を含む遺伝子エレメント
を含む、アネロソームにおいて;
外性エフェクターは、酵素又は構造タンパク質を含み;
遺伝子エレメントは、タンパク質性外層内に閉じ込められており;且つ
アネロソームは、遺伝子エレメントを真核細胞に送達するように構成されており;
任意選択で、遺伝子エレメントが、野生型アネロウイルス(Anellovirus)ゲノム配列(例えば、本明細書に記載の通り)と比較して、少なくとも1つの相違(例えば、変異、化学修飾、若しくはエピジェネティックな改変)、例えば、挿入、置換、酵素的修飾、及び/又は欠失、例えば、特定のドメイン(例えば、TATAボックス、キャップ部位、転写開始部位、5’UTR、オープンリーディングフレーム(ORF)、ポリ(A)シグナル、若しくはGCリッチ領域のうち1つ若しくは複数)の欠失を有する、アネロソーム。
(a)タンパク質性外層;
(b)プロモータエレメントと、エフェクター(例えば、外性エフェクター又は内在性エフェクター)をコード化する核酸配列(例えば、DNA配列)と、タンパク質結合配列(例えば、外部タンパク質結合配列)と、を含む遺伝子エレメント
を含む複数のアネロソームを含有し;
エフェクターが、変異するとヒトの疾患を引き起こすポリペプチド、又は前記ポリペプチドの機能性変異体を含み;
遺伝子エレメントが、タンパク質性外層内に閉じ込められており;
任意選択で、遺伝子エレメントが、野生型アネロウイルス(Anellovirus)ゲノム配列(例えば、本明細書に記載の通り)と比較して、少なくとも1つの相違(例えば、突然変異、化学修飾、若しくはエピジェネティックな改変)、例えば、挿入、置換、酵素的修飾、及び/又は欠失、例えば、特定のドメイン(例えば、TATAボックス、キャップ部位、転写開始部位、5’UTR、オープンリーディングフレーム(ORF)、ポリ(A)シグナル、若しくはGCリッチ領域のうち1つ若しくは複数)の欠失を有する、方法。
(a)タンパク質性外層;
(b)プロモータエレメントと、エフェクター(例えば、外性エフェクター若しくは内在性エフェクター)をコード化する核酸配列(例えば、DNA配列)と、タンパク質結合配列(例えば、外部タンパク質結合配列)と、を含む遺伝子エレメント
を含む複数のアネロソームを含み;
遺伝子エレメントは、タンパク質性外層内に閉じ込められており;且つ
任意選択で、遺伝子エレメントが、野生型アネロウイルス(Anellovirus)ゲノム配列(例えば、本明細書に記載の通り)と比較して、少なくとも1つの相違(例えば、変異、化学修飾、若しくはエピジェネティックな改変)、例えば、挿入、置換、酵素的修飾、及び/又は欠失、例えば、特定のドメイン(例えば、TATAボックス、キャップ部位、転写開始部位、5’UTR、オープンリーディングフレーム(ORF)、ポリ(A)シグナル、若しくはGCリッチ領域のうち1つ若しくは複数)の欠失を有する、方法。
ここで、アネロソーム組成物は、以下:
(a)タンパク質性外層;
(b)プロモータエレメントと、エフェクター(例えば、外性エフェクター若しくは内在性エフェクター)をコード化する核酸配列(例えば、DNA配列)と、タンパク質結合配列(例えば、外部タンパク質結合配列)と、を含む遺伝子エレメント
を含む複数のアネロソームを含み;
任意選択で、遺伝子エレメントが、野生型アネロウイルス(Anellovirus)ゲノム配列(例えば、本明細書に記載の通り)と比較して、少なくとも1つの相違(例えば、変異、化学修飾、若しくはエピジェネティックな改変)、例えば、挿入、置換、酵素的修飾、及び/又は欠失、例えば、特定のドメイン(例えば、TATAボックス、キャップ部位、転写開始部位、5’UTR、オープンリーディングフレーム(ORF)、ポリ(A)シグナル、若しくはGCリッチ領域のうち1つ若しくは複数)の欠失を有し;
その際、遺伝子エレメントは、タンパク質性外層内に閉じ込められており;
これによって、酵素活性を被験者に送達する、方法。
ここで、アネロソーム組成物は、以下:
(a)タンパク質性外層;
(b)プロモータエレメントと、エフェクター(例えば、外性エフェクター若しくは内在性エフェクター)をコード化する核酸配列(例えば、DNA配列)と、タンパク質結合配列(例えば、外部タンパク質結合配列)と、を含む遺伝子エレメント
を含む複数のアネロソームを含み;
任意選択で、遺伝子エレメントが、野生型アネロウイルス(Anellovirus)ゲノム配列(例えば、本明細書に記載の通り)と比較して、少なくとも1つの相違(例えば、変異、化学修飾、若しくはエピジェネティックな改変)、例えば、挿入、置換、酵素的修飾、及び/又は欠失、例えば、特定のドメイン(例えば、TATAボックス、キャップ部位、転写開始部位、5’UTR、オープンリーディングフレーム(ORF)、ポリ(A)シグナル、若しくはGCリッチ領域のうち1つ若しくは複数)の欠失を有し;
その際、遺伝子エレメントは、タンパク質性外層内に閉じ込められており;
これによって、被験者の機能を回復する、方法。
ここで、アネロソーム組成物は、以下:
(a)タンパク質性外層;
(b)プロモータエレメントと、エフェクター(例えば、外性エフェクター若しくは内在性エフェクター)をコード化する核酸配列(例えば、DNA配列)と、タンパク質結合配列(例えば、外部タンパク質結合配列)と、を含む遺伝子エレメント
を含む複数のアネロソームを含み;
その際、エフェクターは、変異すると、ヒトの疾患を引き起こすポリペプチド、又は前記ポリペプチドの機能性変異体を含み;
任意選択で、遺伝子エレメントが、野生型アネロウイルス(Anellovirus)ゲノム配列(例えば、本明細書に記載の通り)と比較して、少なくとも1つの相違(例えば、変異、化学修飾、若しくはエピジェネティックな改変)、例えば、挿入、置換、酵素的修飾、及び/又は欠失、例えば、特定のドメイン(例えば、TATAボックス、キャップ部位、転写開始部位、5’UTR、オープンリーディングフレーム(ORF)、ポリ(A)シグナル、若しくはGCリッチ領域のうち1つ若しくは複数)の欠失を有し;
遺伝子エレメントは、タンパク質性外層内に閉じ込められており;
これによって、酵素活性を被験者に送達する、方法。
ここで、アネロソーム組成物は、以下:
(a)タンパク質性外層;
(b)プロモータエレメントと、エフェクター(例えば、内在性エフェクター又は外性エフェクター)をコード化する核酸配列(例えば、DNA配列)と、タンパク質結合配列(例えば、外部タンパク質結合配列)と、を含む遺伝子エレメント
を含む複数のアネロソームを含有し;
エフェクターが、変異するとヒトの疾患を引き起こすポリペプチド、又は前記ポリペプチドの機能性変異体を含み;
任意選択で、遺伝子エレメントが、野生型アネロウイルス(Anellovirus)ゲノム配列(例えば、本明細書に記載の通り)と比較して、少なくとも1つの相違(例えば、突然変異、化学修飾、若しくはエピジェネティックな改変)、例えば、挿入、置換、酵素的修飾、及び/又は欠失、例えば、特定のドメイン(例えば、TATAボックス、キャップ部位、転写開始部位、5’UTR、オープンリーディングフレーム(ORF)、ポリ(A)シグナル、若しくはGCリッチ領域のうち1つ若しくは複数)の欠失を有し;
遺伝子エレメントが、タンパク質性外層内に閉じ込められており;
これによって被験者の生物学的機能を調節、例えば、阻害若しくは増強する、方法。
ここで、アネロソーム組成物又は単離核酸分子は、プロモータエレメントと、エフェクター(例えば、外性エフェクター若しくは内在性エフェクター)をコード化する核酸配列(例えば、DNA配列)と(例えば、各々本明細書に記載の通り)、を含む遺伝子エレメントを含み;
その際、
(i)疾患又は障害は、神経筋疾患、例えば、脊髄性筋萎縮症であるか、又はそれを含み、エフェクターは、SMN又はその機能性変異体を含み;
(ii)疾患又は障害は、筋ジストロフィー(例えば、デュシェンヌ型筋ジストロフィー若しくはベッカー型筋ジストロフィー)であり、エフェクターは、ジストロフィン又はその機能性変異体、例えば、マイクロジストロフィンを含み;
(iii)疾患又は障害は、酵素欠損症、例えば、クリグラー・ナジャー(Crigler-Najjar)症候群であり、エフェクターは、ウリジン二リン酸グルクロニル-トランスフェラーゼ、例えば、UGT1A1又はその機能性変異体であり;
(iv)疾患又は障害は、白皮症、例えば、眼白皮症であり、エフェクターは、チロシナーゼ、例えば、OCA1又はその機能性変異体を含み;
(v)疾患又は障害は、C1欠損症であり、エフェクターは、C1又はその機能性変異体を含み;或いは
(vi)疾患又は障害は、表Aに記載の疾患又は障害であり、エフェクターは、表Aに記載の酵素、又はその機能性変異体を含み;
(vii)疾患又は障害は、表Bに記載の疾患又は障害であり、エフェクターは、表Bに記載のポリペプチド、又はその機能性変異体を含み;
これによって、被験者の疾患又は障害を治療する、方法。
ここで、アネロソーム組成物又は単離核酸分子は、プロモータエレメントと、エフェクター(例えば、外性エフェクター若しくは内在性エフェクター)をコード化する核酸配列(例えば、DNA配列)と(例えば、各々本明細書に記載の通り)、を含む遺伝子エレメントを含み;
その際、
(i)疾患又は障害は、神経筋疾患、例えば、脊髄性筋萎縮症であるか、又はそれを含み、エフェクターは、SMN又はその機能性変異体を含み;
(ii)疾患又は障害は、筋ジストロフィー(例えば、デュシェンヌ型筋ジストロフィー若しくはベッカー型筋ジストロフィー)であり、エフェクターは、ジストロフィン又はその機能性変異体、例えば、マイクロジストロフィンを含み;
(iii)疾患又は障害は、酵素欠損症、例えば、クリグラー・ナジャー(Crigler-Najjar)症候群であり、エフェクターは、ウリジン二リン酸グルクロニル-トランスフェラーゼ、例えば、UGT1A1又はその機能性変異体であり;
(iv)疾患又は障害は、白皮症、例えば、眼白皮症であり、エフェクターは、チロシナーゼ、例えば、OCA1又はその機能性変異体を含み;
(v)疾患又は障害は、C1欠損症であり、エフェクターは、C1又はその機能性変異体を含み;或いは
(vi)疾患又は障害は、表Aに記載の疾患又は障害であり、エフェクターは、表Aに記載の酵素、又はその機能性変異体を含み;
(vii)疾患又は障害は、表Bに記載の疾患又は障害であり、エフェクターは、表Bに記載のポリペプチド、又はその機能性変異体を含み;
これによって、被験者にエフェクターを送達する、方法。
a)先行実施形態のいずれかに記載のアネロソームの成分をコード化する1つ若しくは複数の核酸分子を含む宿主細胞を用意するステップ;
b)細胞が、1つ若しくは複数のアネロソームを産生することを可能にする条件下で宿主細胞を維持(例えば、培養)し、それにより、アネロソームを作製するステップ;並びに
c)例えば、被験者への投与に好適な医薬組成物として、アネロソームの調製物を製剤化するステップ
を含む、方法。
a)先行実施形態のいずれかに記載の複数のアネロソームを用意するステップ;
b)任意選択で、以下:本明細書に記載される混入物、光学密度測定値(例えば、OD260)、粒子数(例えば、HPLCにより)、感染力(例えば、粒子:感染単位比)のうち1つ又は複数について上記複数のアネロソームを評価するステップ;並びに
c)例えば、(b)のパラメータの1つ又は複数が、指定閾値を満たす場合、例えば、被験者への投与に好適な医薬組成物として、複数のアネロソームを製剤化するステップ
を含む、方法。
(i)CGCGCTGCGCGCGCCGCCCAGTAGGGGGAGCCATGC(配列番号160);
(ii)GCGCTX1CGCGCGCGCGCCGGGGGGCTGCGCCCCCCC(配列番号164)(X1は、T、G、若しくはAから選択される)
(iii)GCGCTTCGCGCGCCGCCCACTAGGGGGCGTTGCGCG(配列番号165);
(iv)GCGCTGCGCGCGCCGCCCAGTAGGGGGCGCAATGCG(配列番号166);
(v)GCGCTGCGCGCGCGGCCCCCGGGGGAGGCATTGCCT(配列番号167);
(vi)GCGCTGCGCGCGCGCGCCGGGGGGGCGCCAGCGCCC(配列番号168);
(vii)GCGCTTCGCGCGCGCGCCGGGGGGCTCCGCCCCCCC(配列番号169);
(viii)GCGCTTCGCGCGCGCGCCGGGGGGCTGCGCCCCCCC(配列番号170);
(ix)GCGCTACGCGCGCGCGCCGGGGGGCTGCGCCCCCCC(配列番号171);若しくは
(x)GCGCTACGCGCGCGCGCCGGGGGGCTCTGCCCCCCC(配列番号172);
又はそれらと少なくとも75、76、77、78、79、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、若しくは100%の配列同一性を有する核酸配列
の少なくとも10、15、20、25、30、31、32、33、34、35、若しくは36個の連続したヌクレオチドを含む領域を含む、先行実施形態のいずれかに記載のアネロソーム又は方法。
(a)本明細書に記載されるアルギニンリッチ領域配列(例えば、MPYYYRRRRYNYRRPRWYGRGWIRRPFRRRFRRKRRVR(配列番号216)若しくは
、又は表A2、A4、A6、A8、A10、A12、C1~C5、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20~37、若しくはD1~D10のいずれかに列挙される通り)に対して少なくとも70%(例えば、少なくとも約70、80、90、95、96、97、98、99、若しくは100%)の配列同一性を有するアミノ酸配列、又は少なくとも60%、70%、若しくは80%の塩基性残基(例えば、アルギニン、リシン、若しくはそれらの組合せ)を含む少なくとも40個のアミノ酸の配列を含む第1領域、
(b)本明細書に記載されるゼリーロール領域配列(例えば、
、又は表A2、A4、A6、A8、A10、A12、C1~C5、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20~37、若しくはD1~D10のいずれかに列挙される通り)に対して少なくとも30%(例えば、少なくとも約30、35、40、50、60、70、80、90、95、96、97、98、99、若しくは100%)の配列同一性を有するアミノ酸配列、又は少なくとも6つ(例えば、少なくとも6、7、8、9、10、11、若しくは12)のβ鎖を含む配列を含む第2領域;
(c)本明細書に記載されるN22ドメイン配列(例えば、
、又は表A2、A4、A6、A8、A10、A12、C1~C5、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20~37、若しくはD1~D10のいずれかに列挙される通り)に対して少なくとも30%(例えば、少なくとも約30、35、40、50、60、70、80、90、95、96、97、98、99、若しくは100%)の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第3領域;並びに
(d)本明細書に記載されるアネロウイルス(Anellovirus)ORF1 C末端ドメイン(CTD)配列(例えば、
、又は表A2、A4、A6、A8、A10、A12、C1~C5、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20~37、若しくはD1~D10のいずれかに列挙される通り)に対して少なくとも30%(例えば、少なくとも約30、35、40、50、60、70、80、90、95、96、97、98、99、若しくは100%)の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第4領域
のうち1つ又は複数を含むポリペプチド、例えば、ORF1分子であって、
ORF1分子が、野生型ORF1タンパク質(例えば、本明細書に記載の通り)と比較して、少なくとも1つの相違(例えば、突然変異、化学修飾、若しくはエピジェネティックな改変)、例えば、挿入、置換、化学若しくは酵素的修飾、及び/又は欠失、例えば、特定のドメイン(例えば、本明細書に記載されるように、例えば、アルギニンリッチ領域、ゼリーロールドメイン、HVR、N22、若しくはCTDのうち1つ若しくは複数)の欠失を有する、ポリペプチド。
(i)第1領域及び第2領域;
(ii)第1領域及び第3領域;
(iii)第1領域及び第4領域;
(iv)第2領域及び第3領域;
(v)第2領域及び第4領域;
(vi)第3領域及び第4領域;
(vii)第1領域、第2領域、及び第3領域;
(viii)第1領域、第2領域、及び第4領域;
(ix)第1領域、第3領域、及び第4領域;
(x)第2領域、第3領域、及び第4領域
を含む、実施形態1000に記載のポリペプチド。
(a)本明細書に記載されるアルギニンリッチ領域配列(例えば、MPYYYRRRRYNYRRPRWYGRGWIRRPFRRRFRRKRRVR(配列番号216)若しくは
、又は表A2、A4、A6、A8、A10、A12、C1~C5、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20~37、若しくはD1~D10のいずれかに列挙される通り)に対して少なくとも70%(例えば、少なくとも約70、80、90、95、96、97、98、99、若しくは100%)の配列同一性を有するアミノ酸配列、又は少なくとも60%、70%、若しくは80%の塩基性残基(例えば、アルギニン、リシン、若しくはそれらの組合せ)を含む少なくとも40個のアミノ酸の配列を含む第1領域、
(b)本明細書に記載されるゼリーロール領域配列(例えば、
、又は表A2、A4、A6、A8、A10、A12、C1~C5、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20~37、若しくはD1~D10のいずれかに列挙される通り)に対して少なくとも30%(例えば、少なくとも約30、35、40、50、60、70、80、90、95、96、97、98、99、若しくは100%)の配列同一性を有するアミノ酸配列、又は少なくとも6つのβ鎖を含む配列を含む第2領域;
(c)本明細書に記載されるN22ドメイン配列(例えば、
、又は表A2、A4、A6、A8、A10、A12、C1~C5、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20~37、若しくはD1~D10のいずれかに列挙される通り)に対して少なくとも30%(例えば、少なくとも約30、35、40、50、60、70、80、90、95、96、97、98、99、若しくは100%)の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第3領域;並びに
(d)本明細書に記載されるアネロウイルス(Anellovirus)ORF1 C末端ドメイン(CTD)配列(例えば、
、又は表A2、A4、A6、A8、A10、A12、C1~C5、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20~37、若しくはD1~D10のいずれかに列挙される通り)に対して少なくとも30%(例えば、少なくとも約30、35、40、50、60、70、80、90、95、96、97、98、99、若しくは100%)の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第4領域
を含むポリペプチド、例えば、ORF1分子であって、
ORF1分子が、野生型ORF1タンパク質(例えば、本明細書に記載の通り)と比較して、少なくとも1つの相違(例えば、突然変異、化学修飾、若しくはエピジェネティックな改変)、例えば、挿入、置換、化学若しくは酵素的修飾、及び/又は欠失、例えば、特定のドメイン(例えば、本明細書に記載されるように、例えば、アルギニンリッチ領域、ゼリーロールドメイン、HVR、N22、若しくはCTDのうち1つ若しくは複数)の欠失を有する、ポリペプチド。
第2領域が、表16に列挙されるORF1配列のアミノ酸39~246に対して少なくとも70%(例えば、少なくとも約70、80、90、95、96、97、98、99、若しくは100%)の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;
第3領域が、表16に列挙されるORF1配列のアミノ酸375~537に対して少なくとも70%(例えば、少なくとも約70、80、90、95、96、97、98、99、若しくは100%)の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;且つ/又は
第4領域が、表16に列挙されるORF1配列のアミノ酸538~666に対して少なくとも70%(例えば、少なくとも約70、80、90、95、96、97、98、99、若しくは100%)の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、先行実施形態のいずれかに記載のポリペプチド。
第2領域が、表A2、A4、A6、A8、A10、A12、C1~C5、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20~37、若しくはD1~D10のいずれかに列挙されるゼリーロール領域配列に対して少なくとも70%(例えば、少なくとも約70、80、90、95、96、97、98、99、若しくは100%)の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;
第3領域が、表A2、A4、A6、A8、A10、A12、C1~C5、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20~37、若しくはD1~D10のいずれかに列挙されるN22ドメイン配列に対して少なくとも70%(例えば、少なくとも約70、80、90、95、96、97、98、99、若しくは100%)の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;
第4領域が、表A2、A4、A6、A8、A10、A12、C1~C5、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20~37、若しくはD1~D10のいずれかに列挙されるCTD配列に対して少なくとも70%(例えば、少なくとも約70、80、90、95、96、97、98、99、若しくは100%)の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、先行実施形態のいずれかに記載のポリペプチド。
(a)先行実施形態のいずれかに記載のポリペプチド、及び
(b)プロモータエレメントと、エフェクター(例えば、外性エフェクター又は内在性エフェクター)をコード化する核酸配列(例えば、DNA配列)と、タンパク質結合配列と、を含む遺伝子エレメント
を含む複合体。
(a)ORF1分子、及び
(b)プロモータエレメントと、エフェクター(例えば、外性エフェクター又は内在性エフェクター)をコード化する核酸配列(例えば、DNA配列)と、タンパク質結合配列と、を含む遺伝子エレメント
を含む複合体であって、
ORF1分子が、遺伝子エレメントに結合(例えば、非共有結合により)し、
ORF1分子、遺伝子エレメント、又はORF1分子と遺伝子エレメントの両方が、野生型ORF1タンパク質、野生型アネロウイルス(Anellovirus)ゲノム、又は野生型ORF1タンパク質と野生型アネロウイルス(Anellovirus)ゲノムの両方と、それぞれ比較して(例えば、本明細書に記載の通り)、少なくとも1つの相違(例えば、突然変異、化学修飾、若しくはエピジェネティックな改変)、例えば、挿入、置換、化学若しくは酵素的修飾、及び/又は欠失、例えば、特定のドメイン(例えば、本明細書に記載のように、例えば、アルギニンリッチ領域、ゼリーロール領域、HVR、N22、若しくはCTDのうち1つ若しくは複数)又はゲノム領域(例えば、本明細書に記載のように、例えば、TATAボックス、キャップ部位、転写開始部位、5’UTR、オープンリーディングフレーム(ORF)、ポリ(A)シグナル、若しくはGCリッチ領域のうち1つ若しくは複数)の欠失を有する、複合体。
(i)CGCGCTGCGCGCGCCGCCCAGTAGGGGGAGCCATGC(配列番号160)
(ii)GCGCTX1CGCGCGCGCGCCGGGGGGCTGCGCCCCCCC(配列番号164)(X1は、T、G、若しくはAから選択される)
(iii)GCGCTTCGCGCGCCGCCCACTAGGGGGCGTTGCGCG(配列番号165);
(iv)GCGCTGCGCGCGCCGCCCAGTAGGGGGCGCAATGCG(配列番号166);
(v)GCGCTGCGCGCGCGGCCCCCGGGGGAGGCATTGCCT(配列番号167);
(vi)GCGCTGCGCGCGCGCGCCGGGGGGGCGCCAGCGCCC(配列番号168);
(vii)GCGCTTCGCGCGCGCGCCGGGGGGCTCCGCCCCCCC(配列番号169);
(viii)GCGCTTCGCGCGCGCGCCGGGGGGCTGCGCCCCCCC(配列番号170);
(ix)GCGCTACGCGCGCGCGCCGGGGGGCTGCGCCCCCCC(配列番号171);若しくは
(x)GCGCTACGCGCGCGCGCCGGGGGGCTCTGCCCCCCC(配列番号172)
のいずれかの核酸配列;
又はそれらと少なくとも75、76、77、78、79、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、若しくは100%の配列同一性を有する核酸配列
の少なくとも10、15、20、25、30、31、32、33、34、35、若しくは36個の連続したヌクレオチドを含む、実施形態1065に記載の複合体。
(a)タンパク質性外層;
(b)先行実施形態のいずれかに記載のポリペプチド又は複合体;
(c)エフェクター(例えば、本明細書に記載のように、例えば、内在性エフェクター又は外性エフェクター)をコード化する核酸配列(例えば、DNA配列)に作動可能に連結したプロモータを含む遺伝子エレメント
を含み;
ここで、遺伝子エレメントが、タンパク質性外層内に閉じ込められているアネロソーム。
(a)タンパク質性外層;
(b)以下:
(i)エフェクター(例えば、本明細書に記載のように、例えば、内在性エフェクター又は外性エフェクター)をコード化する核酸配列(例えば、DNA配列)に作動可能に連結したプロモータ、及び
(ii)先行実施形態のいずれかに記載のポリペプチドをコード化する核酸を含む遺伝子エレメント
を含み;ここで、遺伝子エレメントが、タンパク質性外層内に閉じ込められているアネロソーム。
(a)タンパク質性外層;
(b)ORF1分子又はORF1分子をコード化する核酸;
(c)エフェクターをコード化する異種核酸配列(例えば、DNA配列)に作動可能に連結したプロモータを含む遺伝子エレメント
を含み;
ここで、遺伝子エレメントが、タンパク質性外層内に閉じ込められているアネロソーム。
(a)タンパク質性外層;
(b)ORF1分子又はORF1分子をコード化する核酸;
(c)プロモータエレメントと、エフェクター(例えば、外性エフェクター又は内在性エフェクター)をコード化する核酸配列(例えば、DNA配列)と、核酸配列:
(i)CGCGCTGCGCGCGCCGCCCAGTAGGGGGAGCCATGC(配列番号160)
(ii)GCGCTX1CGCGCGCGCGCCGGGGGGCTGCGCCCCCCC(配列番号164)(X1は、T、G、若しくはAから選択される)
(iii)GCGCTTCGCGCGCCGCCCACTAGGGGGCGTTGCGCG(配列番号165);
(iv)GCGCTGCGCGCGCCGCCCAGTAGGGGGCGCAATGCG(配列番号166);
(v)GCGCTGCGCGCGCGGCCCCCGGGGGAGGCATTGCCT(配列番号167);
(vi)GCGCTGCGCGCGCGCGCCGGGGGGGCGCCAGCGCCC(配列番号168);
(vii)GCGCTTCGCGCGCGCGCCGGGGGGCTCCGCCCCCCC(配列番号169);
(viii)GCGCTTCGCGCGCGCGCCGGGGGGCTGCGCCCCCCC(配列番号170);
(ix)GCGCTACGCGCGCGCGCCGGGGGGCTGCGCCCCCCC(配列番号171);若しくは
(x)GCGCTACGCGCGCGCGCCGGGGGGCTCTGCCCCCCC(配列番号172);
又はそれらと少なくとも75、76、77、78、79、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、若しくは100%の配列同一性を有する核酸配列
の少なくとも10、15、20、25、30、31、32、33、34、35、若しくは36個の連続したヌクレオチドを含む領域と、を含む遺伝子エレメント
を含むアネロソームにおいて;
遺伝子エレメントが、野生型アネロウイルス(Anellovirus)ゲノム配列(例えば、本明細書に記載の通り)と比較して、少なくとも1つの相違(例えば、突然変異、化学修飾、若しくはエピジェネティックな改変)、例えば、挿入、置換、酵素的修飾、及び/又は欠失、例えば、特定のドメイン(例えば、TATAボックス、キャップ部位、転写開始部位、5’UTR、オープンリーディングフレーム(ORF)、ポリ(A)シグナル、若しくはGCリッチ領域のうち1つ若しくは複数)の欠失を有し;
遺伝子エレメントが、タンパク質性外層内に閉じ込められており;
アネロソームが、真核細胞中に遺伝子エレメントを送達するように構成されており;任意選択で、遺伝子エレメントは、以下:
(i)例えば、本明細書に記載されるように、野生型TTV-tth8ゲノム配列と比較してヌクレオチド3436~3607の欠失を含まない;
(ii)例えば、本明細書に記載されるように、野生型TTMV-LY2ゲノム配列と比較してヌクレオチド1432~2210の欠失を含まない;且つ/又は
(iii)例えば、本明細書に記載されるように、野生型TTMV-LY2ゲノム配列と比較して少なくとも101個のヌクレオチドの欠失を含まない、アネロソーム。
(a)タンパク質性外層;
(b)ORF1分子又はORF1分子をコード化する核酸;
(c)プロモータエレメントと、エフェクター(例えば、外性エフェクター又は内在性エフェクター)をコード化する核酸(例えば、DNA配列)と、少なくとも70%(例えば、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、若しくは80.6%)のGC含有率を有する少なくとも20(例えば、少なくとも20、25、30、31、32、33、34、35、若しくは36)個の連続したヌクレオチドを含む配列と、を含む遺伝子エレメント
を含むアネロソームにおいて;
遺伝子エレメントが、野生型アネロウイルス(Anellovirus)ゲノム配列(例えば、本明細書に記載の通り)と比較して、少なくとも1つの相違(例えば、突然変異、化学修飾、若しくはエピジェネティックな改変)、例えば、挿入、置換、酵素的修飾、及び/又は欠失、例えば、特定のドメイン(例えば、TATAボックス、キャップ部位、転写開始部位、5’UTR、オープンリーディングフレーム(ORF)、ポリ(A)シグナル、若しくはGCリッチ領域のうち1つ若しくは複数)の欠失を有し;
遺伝子エレメントが、タンパク質性外層内に閉じ込められており;
アネロソームが、真核細胞中に遺伝子エレメントを送達するように構成されており;任意選択で、遺伝子エレメントは、以下:
(i)例えば、本明細書に記載されるように、野生型TTV-tth8ゲノム配列と比較してヌクレオチド3436~3607の欠失を含まない;
(ii)例えば、本明細書に記載されるように、野生型TTMV-LY2ゲノム配列と比較してヌクレオチド1432~2210の欠失を含まない;且つ/又は
(iii)例えば、本明細書に記載されるように、野生型TTMV-LY2ゲノム配列と比較して少なくとも101個のヌクレオチドの欠失を含まない、アネロソーム。
(a)タンパク質性外層;
(b)ORF1分子又はORF1分子をコード化する核酸であって、
(i)ORF1分子のアミノ酸の少なくとも30%(例えば、少なくとも30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、90%、若しくはそれ以上)が、β鎖の一部であり;
(ii)ORF1分子の二次構造が、少なくとも3つ(例えば、少なくとも3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、若しくは20)のβ鎖を含み;
(iii)ORF1分子の二次構造が、少なくとも1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、若しくは10:1のβ鎖:αヘリックスの比を含む、
ORF1分子又はORF1分子をコード化する核酸;並びに
(c)プロモータエレメントと、エフェクター(例えば、外性エフェクター又は内在性エフェクター)をコード化する核酸配列(例えば、DNA配列)と、タンパク質結合配列と、を含む遺伝子エレメント
を含むアネロソームにおいて;
遺伝子エレメントが、野生型アネロウイルス(Anellovirus)ゲノム配列(例えば、本明細書に記載の通り)と比較して、少なくとも1つの相違(例えば、突然変異、化学修飾、若しくはエピジェネティックな改変)、例えば、挿入、置換、酵素的修飾、及び/又は欠失、例えば、特定のドメイン(例えば、TATAボックス、キャップ部位、転写開始部位、5’UTR、オープンリーディングフレーム(ORF)、ポリ(A)シグナル、若しくはGCリッチ領域のうち1つ若しくは複数)の欠失を有し;
遺伝子エレメントが、タンパク質性外層内に閉じ込められており;
アネロソームが、真核細胞中に遺伝子エレメントを送達するように構成されており;任意選択で、遺伝子エレメントは、以下:
(i)例えば、本明細書に記載されるように、野生型TTV-tth8ゲノム配列と比較してヌクレオチド3436~3607の欠失を含まない;
(ii)例えば、本明細書に記載されるように、野生型TTMV-LY2ゲノム配列と比較してヌクレオチド1432~2210の欠失を含まない;且つ/又は
(iii)例えば、本明細書に記載されるように、野生型TTMV-LY2ゲノム配列と比較して少なくとも101個のヌクレオチドの欠失を含まない、アネロソーム。
(a)タンパク質性外層;
(b)ORF1分子又はORF1分子をコード化する核酸;
(c)プロモータエレメントと、エフェクター(例えば、外性エフェクター又は内在性エフェクター)をコード化する核酸(例えば、DNA配列)と、タンパク質結合配列と、を含む遺伝子エレメント
を含むアネロソームにおいて;
遺伝子エレメントが、野生型アネロウイルス(Anellovirus)ゲノム配列(例えば、本明細書に記載の通り)と比較して、少なくとも1つの相違(例えば、突然変異、化学修飾、若しくはエピジェネティックな改変)、例えば、挿入、置換、酵素的修飾、及び/又は欠失、例えば、特定のドメイン(例えば、TATAボックス、キャップ部位、転写開始部位、5’UTR、オープンリーディングフレーム(ORF)、ポリ(A)シグナル、若しくはGCリッチ領域のうち1つ若しくは複数)の欠失を有し;
遺伝子エレメントが、タンパク質性外層内に閉じ込められており;
アネロソームが、真核細胞中に遺伝子エレメントを送達するように構成されており;任意選択で、遺伝子エレメントは、以下:
(i)例えば、本明細書に記載されるように、野生型TTV-tth8ゲノム配列と比較してヌクレオチド3436~3607の欠失を含まない;
(ii)例えば、本明細書に記載されるように、野生型TTMV-LY2ゲノム配列と比較してヌクレオチド1432~2210の欠失を含まない;且つ/又は
(iii)例えば、本明細書に記載されるように、野生型TTMV-LY2ゲノム配列と比較して少なくとも101個のヌクレオチドの欠失を含まない、アネロソーム。
(a)タンパク質性外層;
(b)プロモータエレメントと、エフェクター(例えば、外性エフェクター又は内在性エフェクター)をコード化する核酸(例えば、DNA配列)と、核酸配列:
(i)CGCGCTGCGCGCGCCGCCCAGTAGGGGGAGCCATGC(配列番号160)
(ii)GCGCTX1CGCGCGCGCGCCGGGGGGCTGCGCCCCCCC(配列番号164)(X1は、T、G、若しくはAから選択される)
(iii)GCGCTTCGCGCGCCGCCCACTAGGGGGCGTTGCGCG(配列番号165);
(iv)GCGCTGCGCGCGCCGCCCAGTAGGGGGCGCAATGCG(配列番号166);
(v)GCGCTGCGCGCGCGGCCCCCGGGGGAGGCATTGCCT(配列番号167);
(vi)GCGCTGCGCGCGCGCGCCGGGGGGGCGCCAGCGCCC(配列番号168);
(vii)GCGCTTCGCGCGCGCGCCGGGGGGCTCCGCCCCCCC(配列番号169);
(viii)GCGCTTCGCGCGCGCGCCGGGGGGCTGCGCCCCCCC(配列番号170);
(ix)GCGCTACGCGCGCGCGCCGGGGGGCTGCGCCCCCCC(配列番号171);若しくは
(x)GCGCTACGCGCGCGCGCCGGGGGGCTCTGCCCCCCC(配列番号172);
又はそれらと少なくとも75、76、77、78、79、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、若しくは100%の配列同一性を有する核酸配列
の少なくとも10、15、20、25、30、31、32、33、34、35、若しくは36個の連続したヌクレオチドを含む領域と、を含む遺伝子エレメント
を含むアネロソームにおいて;
遺伝子エレメントが、野生型アネロウイルス(Anellovirus)ゲノム配列(例えば、本明細書に記載の通り)と比較して、少なくとも1つの相違(例えば、突然変異、化学修飾、若しくはエピジェネティックな改変)、例えば、挿入、置換、酵素的修飾、及び/又は欠失、例えば、特定のドメイン(例えば、TATAボックス、キャップ部位、転写開始部位、5’UTR、オープンリーディングフレーム(ORF)、ポリ(A)シグナル、若しくはGCリッチ領域のうち1つ若しくは複数)の欠失を有し;
遺伝子エレメントが、タンパク質性外層内に閉じ込められており;
アネロソームが、真核細胞中に遺伝子エレメントを送達するように構成されており;
任意選択で、遺伝子エレメントは、以下:
(i)例えば、本明細書に記載されるように、野生型TTV-tth8ゲノム配列と比較してヌクレオチド3436~3607の欠失を含まない;
(ii)例えば、本明細書に記載されるように、野生型TTMV-LY2ゲノム配列と比較してヌクレオチド1432~2210の欠失を含まない;且つ/又は
(iii)例えば、本明細書に記載されるように、野生型TTMV-LY2ゲノム配列と比較して少なくとも101個のヌクレオチドの欠失を含まない、アネロソーム。
(a)タンパク質性外層;
(b)プロモータエレメントと、エフェクター(例えば、外性エフェクター又は内在性エフェクター)をコード化する核酸(例えば、DNA配列)と、少なくとも70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、若しくは80.6%のGC含有率を有する少なくとも20、25、30、31、32、33、34、35、若しくは36個の連続したヌクレオチドを含む配列と、を含む遺伝子エレメント
を含むアネロソームにおいて;
遺伝子エレメントが、野生型アネロウイルス(Anellovirus)ゲノム配列(例えば、本明細書に記載の通り)と比較して、少なくとも1つの相違(例えば、突然変異、化学修飾、若しくはエピジェネティックな改変)、例えば、挿入、置換、酵素的修飾、及び/又は欠失、例えば、特定のドメイン(例えば、TATAボックス、キャップ部位、転写開始部位、5’UTR、オープンリーディングフレーム(ORF)、ポリ(A)シグナル、若しくはGCリッチ領域のうち1つ若しくは複数)の欠失を有し;
遺伝子エレメントが、タンパク質性外層内に閉じ込められており;
アネロソームが、真核細胞内に遺伝子エレメントを送達するように構成されており;
任意選択で、遺伝子エレメントは、以下:
(i)例えば、本明細書に記載されるように、野生型TTV-tth8ゲノム配列と比較してヌクレオチド3436~3607の欠失を含まない;
(ii)例えば、本明細書に記載されるように、野生型TTMV-LY2ゲノム配列と比較してヌクレオチド1432~2210の欠失を含まない;且つ/又は
(iii)例えば、本明細書に記載されるように、野生型TTMV-LY2ゲノム配列と比較して少なくとも101個のヌクレオチドの欠失を含まない、アネロソーム。
(a)タンパク質性外層;
(b)プロモータエレメントと、エフェクター(例えば、外性エフェクター又は内在性エフェクター)をコード化する核酸(例えば、DNA配列)と、を含む遺伝子エレメント
を含むアネロソームにおいて;
遺伝子エレメントが、以下:
核酸配列:CGCGCTGCGCGCGCCGCCCAGTAGGGGGAGCCATGC(配列番号160)
に対して少なくとも95%(例えば、少なくとも95、96、97、98、99、若しくは100%)の配列同一性を有する領域(例えば、エフェクターをコード化する核酸配列に対して3‘側に位置する、例えば、パッケージング領域)を含み;
遺伝子エレメントが、タンパク質性外層内に閉じ込められており;
ここで、アネロソームは、真核細胞中に遺伝子エレメントを送達するように構成されている、アネロソーム。
(i)プロモータエレメントと、治療用外性エフェクターをコード化する核酸配列を含む遺伝子エレメント(遺伝子エレメントは、本明細書に記載のアネロウイルス(Anellovirus)(例えば、表A1、A3、A5、A7、A9、A11、B1~B5、1、3、5、7、9、11、13、15、若しくは17のいずれかに列挙される通り)由来の5’UTRヌクレオチド配列に対して少なくとも95%の配列同一性を有する配列を含む);及び/又は
(ii)本明細書に記載のアネロウイルス(Anellovirus)(例えば、表A1、A3、A5、A7、A9、A11、B1~B5、1、3、5、7、9、11、13、15、若しくは17のいずれかに列挙される通り)のORF1遺伝子によりコード化されるポリペプチドと少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチドを含むタンパク質性外層
を含むアネロソームにおいて;
遺伝子エレメントが、タンパク質性外層内に閉じ込められており;
任意選択で、アネロソームは、哺乳動物細胞内に遺伝子エレメントを送達することができる、アネロソーム。
(I)以下:
(a)プロモータエレメントと、(b)外性エフェクター(例えば、本明細書に記載される外性エフェクター)をコード化する核酸配列であって、核酸配列が、プロモータエレメントに作動可能に連結いる核酸配列と;(c)以下:
(c)(i)配列番号54のヌクレオチド323~393の核酸配列、若しくはそれに対して少なくとも85%同一の核酸配列;
(c)(ii)配列番号113、配列番号114、配列番号115、配列番号116、配列番号117、配列番号118、配列番号119のいずれかの核酸配列若しくはそれに対して少なくとも85%同一の核酸配列;又は
(c)(iii)配列番号61のヌクレオチド117~187の核酸配列、若しくはそれに対して少なくとも85%同一の核酸配列
を含む5’UTRドメインと、を含む遺伝子エレメント;
(II)ORF1分子を含むタンパク質性外層
を含むアネロソームにおいて、
遺伝子エレメントが、タンパク質性外層内に閉じ込められており;且つ
合成アネロソームが、遺伝子エレメントを哺乳動物、例えば、ヒト細胞内に送達することができる、アネロソーム。
任意選択で、単離核酸組成物は、野生型アネロウイルス(Anellovirus)ゲノム配列(例えば、本明細書に記載の通り)と比較して、少なくとも1つの相違(例えば、突然変異、化学修飾、若しくはエピジェネティックな改変)、例えば、挿入、置換、酵素的修飾、及び/又は欠失、例えば、特定のドメイン(例えば、TATAボックス、キャップ部位、転写開始部位、5’UTR、オープンリーディングフレーム(ORF)、ポリ(A)シグナル、若しくはGCリッチ領域のうち1つ若しくは複数)の欠失を有し;
任意選択で、核酸分子は、以下:
(i)例えば、本明細書に記載されるように、野生型TTV-tth8ゲノム配列と比較してヌクレオチド3436~3607の欠失;
(ii)例えば、本明細書に記載されるように、野生型TTMV-LY2ゲノム配列と比較してヌクレオチド1432~2210の欠失;及び/又は
(iii)例えば、本明細書に記載されるように、野生型TTMV-LY2ゲノム配列と比較して少なくとも101個のヌクレオチドの欠失
を含まない、単離核酸組成物。
ここで、
(i)ORF1分子のアミノ酸の少なくとも30%(例えば、少なくとも30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、90%、若しくはそれ以上)が、βシートの一部であり;
(ii)ORF1分子の二次構造が、少なくとも3つ(例えば、少なくとも3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、若しくは20)のβシートを含み;
(iii)ORF1分子の二次構造が、少なくとも1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、若しくは10:1のβシート:αヘリックスの比を含み;
遺伝子エレメントが、プロモータエレメントと、エフェクター(例えば、外性エフェクター又は内在性エフェクター)をコード化する核酸配列と、タンパク質性外層と、を含み;
遺伝子エレメントが、野生型アネロウイルス(Anellovirus)ゲノム配列(例えば、本明細書に記載の通り)と比較して、少なくとも1つの相違(例えば、突然変異、化学修飾、若しくはエピジェネティックな改変)、例えば、挿入、置換、酵素的修飾、及び/又は欠失、例えば、特定のドメイン(例えば、TATAボックス、キャップ部位、転写開始部位、5’UTR、オープンリーディングフレーム(ORF)、ポリ(A)シグナル、若しくはGCリッチ領域のうち1つ若しくは複数)の欠失を有し;
任意選択で、核酸分子は、以下:
(i)例えば、本明細書に記載されるように、野生型TTV-tth8ゲノム配列と比較してヌクレオチド3436~3607の欠失;
(ii)例えば、本明細書に記載されるように、野生型TTMV-LY2ゲノム配列と比較してヌクレオチド1432~2210の欠失;及び/又は
(iii)例えば、本明細書に記載されるように、野生型TTMV-LY2ゲノム配列と比較して少なくとも101個のヌクレオチドの欠失
を含まない、単離核酸組成物。
(a)ORF1分子をコード化する遺伝子エレメント;
(b)核酸配列:
(i)CGCGCTGCGCGCGCCGCCCAGTAGGGGGAGCCATGC(配列番号160)
(ii)GCGCTX1CGCGCGCGCGCCGGGGGGCTGCGCCCCCCC(配列番号164)(X1は、T、G、若しくはAから選択される)
(iii)GCGCTTCGCGCGCCGCCCACTAGGGGGCGTTGCGCG(配列番号165);
(iv)GCGCTGCGCGCGCCGCCCAGTAGGGGGCGCAATGCG(配列番号166);
(v)GCGCTGCGCGCGCGGCCCCCGGGGGAGGCATTGCCT(配列番号167);
(vi)GCGCTGCGCGCGCGCGCCGGGGGGGCGCCAGCGCCC(配列番号168);
(vii)GCGCTTCGCGCGCGCGCCGGGGGGCTCCGCCCCCCC(配列番号169);
(viii)GCGCTTCGCGCGCGCGCCGGGGGGCTGCGCCCCCCC(配列番号170);
(ix)GCGCTACGCGCGCGCGCCGGGGGGCTGCGCCCCCCC(配列番号171);若しくは
(x)GCGCTACGCGCGCGCGCCGGGGGGCTCTGCCCCCCC(配列番号172);
又はそれらと少なくとも75、76、77、78、79、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、若しくは100%の配列同一性を有する核酸配列
の少なくとも10、15、20、25、30、31、32、33、34、35、若しくは36個の連続したヌクレオチド;並びに
(c)野生型アネロウイルス(Anellovirus)ゲノム配列(例えば、本明細書に記載の通り)と比較して、少なくとも1つの相違(例えば、突然変異、化学修飾、若しくはエピジェネティックな改変)、例えば、挿入、置換、酵素的修飾、及び/又は欠失、例えば、特定のドメイン(例えば、TATAボックス、キャップ部位、転写開始部位、5’UTR、オープンリーディングフレーム(ORF)、ポリ(A)シグナル、若しくはGCリッチ領域のうち1つ若しくは複数)の欠失
を含む(例えば、1、2、若しくはそれ以上の核酸分子を含む)単離核酸組成物において;
任意選択で、核酸分子は、以下:
(i)例えば、本明細書に記載されるように、野生型TTV-tth8ゲノム配列と比較してヌクレオチド3436~3607の欠失;
(ii)例えば、本明細書に記載されるように、野生型TTMV-LY2ゲノム配列と比較してヌクレオチド1432~2210の欠失;及び/又は
(iii)例えば、本明細書に記載されるように、野生型TTMV-LY2ゲノム配列と比較して少なくとも101個のヌクレオチドの欠失
を含まない、単離核酸組成物。
(a)ORF1分子をコード化する遺伝子エレメント;
(b)少なくとも70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、若しくは80.6%のGC含有率を有する少なくとも20、25、30、31、32、33、34、35、若しくは36個の連続したヌクレオチドを含む(例えば、1、2、若しくはそれ以上の核酸分子を含む)単離核酸組成物において;
単離核酸組成物が、野生型アネロウイルス(Anellovirus)ゲノム配列(例えば、本明細書に記載の通り)と比較して、少なくとも1つの相違(例えば、突然変異、化学修飾、若しくはエピジェネティックな改変)、例えば、挿入、置換、酵素的修飾、及び/又は欠失、例えば、特定のドメイン(例えば、TATAボックス、キャップ部位、転写開始部位、5’UTR、オープンリーディングフレーム(ORF)、ポリ(A)シグナル、若しくはGCリッチ領域のうち1つ若しくは複数)の欠失を有し;
任意選択で、核酸分子は、以下:
(i)例えば、本明細書に記載されるように、野生型TTV-tth8ゲノム配列と比較してヌクレオチド3436~3607の欠失;
(ii)例えば、本明細書に記載されるように、野生型TTMV-LY2ゲノム配列と比較してヌクレオチド1432~2210の欠失;及び/又は
(iii)例えば、本明細書に記載されるように、野生型TTMV-LY2ゲノム配列と比較して少なくとも101個のヌクレオチドの欠失
を含まない、単離核酸組成物。
(i)CGCGCTGCGCGCGCCGCCCAGTAGGGGGAGCCATGC(配列番号160)
(ii)GCGCTX1CGCGCGCGCGCCGGGGGGCTGCGCCCCCCC(配列番号164)(X1は、T、G、若しくはAから選択される)
(iii)GCGCTTCGCGCGCCGCCCACTAGGGGGCGTTGCGCG(配列番号165);
(iv)GCGCTGCGCGCGCCGCCCAGTAGGGGGCGCAATGCG(配列番号166);
(v)GCGCTGCGCGCGCGGCCCCCGGGGGAGGCATTGCCT(配列番号167);
(vi)GCGCTGCGCGCGCGCGCCGGGGGGGCGCCAGCGCCC(配列番号168);
(vii)GCGCTTCGCGCGCGCGCCGGGGGGCTCCGCCCCCCC(配列番号169);
(viii)GCGCTTCGCGCGCGCGCCGGGGGGCTGCGCCCCCCC(配列番号170);
(ix)GCGCTACGCGCGCGCGCCGGGGGGCTGCGCCCCCCC(配列番号171);若しくは
(x)GCGCTACGCGCGCGCGCCGGGGGGCTCTGCCCCCCC(配列番号172);
又はそれらと少なくとも75、76、77、78、79、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、若しくは100%の配列同一性を有する核酸配列
の少なくとも10、15、20、25、30、31、32、33、34、35、若しくは36個の連続したヌクレオチド;並びに
野生型アネロウイルス(Anellovirus)ゲノム配列(例えば、本明細書に記載の通り)と比較して、少なくとも1つの相違(例えば、突然変異、化学修飾、若しくはエピジェネティックな改変)、例えば、挿入、置換、酵素的修飾、及び/又は欠失、例えば、特定のドメイン(例えば、TATAボックス、キャップ部位、転写開始部位、5’UTR、オープンリーディングフレーム(ORF)、ポリ(A)シグナル、若しくはGCリッチ領域のうち1つ若しくは複数)の欠失
を含む(例えば、1、2、若しくはそれ以上の核酸分子を含む)単離核酸組成物において;
任意選択で、核酸分子は、以下:
(i)例えば、本明細書に記載されるように、野生型TTV-tth8ゲノム配列と比較してヌクレオチド3436~3607の欠失;
(ii)例えば、本明細書に記載されるように、野生型TTMV-LY2ゲノム配列と比較してヌクレオチド1432~2210の欠失;及び/又は
(iii)例えば、本明細書に記載されるように、野生型TTMV-LY2ゲノム配列と比較して少なくとも101個のヌクレオチドの欠失
を含まない、単離核酸組成物。
単離核酸組成物が、野生型アネロウイルス(Anellovirus)ゲノム配列(例えば、本明細書に記載の通り)と比較して、少なくとも1つの相違(例えば、突然変異、化学修飾、若しくはエピジェネティックな改変)、例えば、挿入、置換、酵素的修飾、及び/又は欠失、例えば、特定のドメイン(例えば、TATAボックス、キャップ部位、転写開始部位、5’UTR、オープンリーディングフレーム(ORF)、ポリ(A)シグナル、若しくはGCリッチ領域のうち1つ若しくは複数)の欠失を含み;
任意選択で、核酸分子は、以下:
(i)例えば、本明細書に記載されるように、野生型TTV-tth8ゲノム配列と比較してヌクレオチド3436~3607の欠失;
(ii)例えば、本明細書に記載されるように、野生型TTMV-LY2ゲノム配列と比較してヌクレオチド1432~2210の欠失;及び/又は
(iii)例えば、本明細書に記載されるように、野生型TTMV-LY2ゲノム配列と比較して少なくとも101個のヌクレオチドの欠失
を含まない、単離核酸組成物。
(i)CGCGCTGCGCGCGCCGCCCAGTAGGGGGAGCCATGC(配列番号160)
(ii)GCGCTX1CGCGCGCGCGCCGGGGGGCTGCGCCCCCCC(配列番号164)(X1は、T、G、若しくはAから選択される)
(iii)GCGCTTCGCGCGCCGCCCACTAGGGGGCGTTGCGCG(配列番号165);
(iv)GCGCTGCGCGCGCCGCCCAGTAGGGGGCGCAATGCG(配列番号166);
(v)GCGCTGCGCGCGCGGCCCCCGGGGGAGGCATTGCCT(配列番号167);
(vi)GCGCTGCGCGCGCGCGCCGGGGGGGCGCCAGCGCCC(配列番号168);
(vii)GCGCTTCGCGCGCGCGCCGGGGGGCTCCGCCCCCCC(配列番号169);
(viii)GCGCTTCGCGCGCGCGCCGGGGGGCTGCGCCCCCCC(配列番号170);
(ix)GCGCTACGCGCGCGCGCCGGGGGGCTGCGCCCCCCC(配列番号171);若しくは
(x)GCGCTACGCGCGCGCGCCGGGGGGCTCTGCCCCCCC(配列番号172);
に対して少なくとも95%(例えば、少なくとも95、96、97、98、99、若しくは100%)の配列同一性を有する核酸配列を含む、単離核酸分子(例えば、発現ベクター)。
(a)先行実施形態のいずれかに記載のポリペプチドをコード化する核酸(核酸はプラスミドであるか、ウイルス核酸であるか、又は細胞染色体中に組み込まれている)、及び
(b)遺伝子エレメントであって、遺伝子エレメントは、プロモータエレメントと、エフェクター(例えば、外性エフェクター又は内在性エフェクター)をコード化する核酸配列(例えば、DNA配列)と、タンパク質結合配列と、を含み、任意選択で、遺伝子エレメントは、ORF1ポリペプチド(例えば、ORF1タンパク質)をコード化する遺伝子エレメント
を含む、単離細胞、例えば、宿主細胞。
(a)ORF1分子をコード化する核酸(核酸はプラスミドであるか、ウイルス核酸であるか、又は細胞染色体中に組み込まれている)、及び
(b)遺伝子エレメントであって、遺伝子エレメントは、プロモータエレメントと、エフェクター(例えば、外性エフェクター又は内在性エフェクター)をコード化する核酸配列(例えば、DNA配列)と、タンパク質結合配列と、を含む遺伝子エレメント
を含む単離細胞、例えば、宿主細胞。
(a)ORF1分子をコード化する核酸(核酸はプラスミドであるか、ウイルス核酸であるか、又は細胞染色体中に組み込まれている)、及び
(b)ORF1分子をコード化しない遺伝子エレメントであって、遺伝子エレメントは、プロモータエレメントと、エフェクター(例えば、外性エフェクター又は内在性エフェクター)をコード化する核酸配列(例えば、DNA配列)と、タンパク質結合配列と、を含む遺伝子エレメント
を含む単離細胞、例えば、宿主細胞。
(i)本明細書に記載されるアネロソームの遺伝子エレメント(例えば、ORF1分子をコード化しない遺伝子エレメント)の核酸配列を含む核酸分子(例えば、第1核酸分子)、及び
(ii)任意選択で、例えば、表16のいずれかに列挙されるように、ORF1、ORF2、ORF2/2、ORF2/3、ORF1/1、若しくはORF1/2から選択されるアミノ酸配列、又はそれに対して少なくとも70%(例えば、少なくとも約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、若しくは100%)の配列同一性を有するアミノ酸配列の1つ若しくは複数をコード化する核酸分子、例えば、第2核酸分子
を含む単離細胞、例えば、宿主細胞。
(a)本明細書に記載される単離細胞、及び
(b)本明細書に記載されるアネロソーム
を含む組成物。
(a)ORF1分子をコード化する核酸(例えば、核酸はプラスミドであるか、ウイルス核酸であるか、又は細胞染色体中に組み込まれている)を含む細胞、及び
(b)ORF1分子をコード化しない遺伝子エレメント(例えば、細胞内又は細胞外、例えば、細胞培地中の)であって、遺伝子エレメントが、プロモータエレメントと、エフェクター(例えば、外性エフェクター又は内在性エフェクター)をコード化する核酸配列(例えば、DNA配列)と、タンパク質結合配列と、を含む遺伝子エレメント
を含む組成物。
(a)先行実施形態のいずれかに記載のポリペプチドをコード化する核酸を含む宿主細胞(例えば、本明細書に記載される宿主細胞)を用意するステップ、及び
(b)細胞がポリペプチドを産生することを可能にする条件下で宿主細胞を維持し、これによってORF1分子を製造するステップ
を含む方法。
(a)先行実施形態のいずれかに記載の核酸組成物を含む宿主細胞(例えば、本明細書に記載される宿主細胞)を用意するステップ、及び
(b)細胞がポリペプチドを産生することを可能にする条件下で宿主細胞を維持し、これによってORF1分子を製造するステップ
を含む方法。
(a)ヘルパー細胞、例えば、本明細書に記載のヘルパー細胞を用意するステップ;
(b)細胞がアネロソームを産生することを可能にする条件下で、遺伝子エレメントをヘルパー細胞に導入するステップ、並びに
(c)例えば、被験者への投与に好適な医薬組成物として、アネロソームを製剤化するステップ
を含み、
これにより、アネロソーム組成物を作製する方法。
(a)宿主細胞を用意するステップ;
(b)ヘルパー細胞を宿主細胞に導入するステップ;
(c)細胞がアネロソームを産生することを可能にする条件下で、遺伝子エレメントを宿主細胞に導入する(例えば、(b)の前、後、若しくはそれと同時に)ステップ、並びに
(d)例えば、被験者への投与に好適な医薬組成物として、アネロソームを製剤化するステップ
を含み、
これにより、アネロソーム組成物を作製する方法。
(a)ORF1分子をコード化する核酸(例えば、核酸はプラスミドであるか、ウイルス核酸であるか、又はヘルパー細胞染色体中に組み込まれている)を含むヘルパー細胞を用意するステップ;
(b)細胞がアネロソームを産生することを可能にする条件下で、ヘルパー細胞を宿主細胞に導入するステップであって、遺伝子エレメントは、ORF1分子をコード化せず、遺伝子エレメントが、プロモータエレメントと、エフェクター(例えば、外性エフェクター又は内在性エフェクター)をコード化する核酸配列(例えば、DNA配列)と、タンパク質結合配列と、を含むステップ;並びに
(c)例えば、被験者への投与に好適な医薬組成物として、アネロソームを製剤化するステップ
を含み、
これにより、アネロソーム組成物を作製する方法。
(a)宿主細胞を用意するステップ;
(b)ORF1分子をコード化するヘルパー核酸(例えば、核酸はプラスミドであるか、又はウイルス核酸である)を宿主細胞に導入するステップ;並びに
(b)細胞がアネロソームを産生することを可能にする条件下で、ヘルパー細胞を宿主細胞に導入する(例えば、(b)の前、後、若しくはそれと同時に)ステップであって、遺伝子エレメントは、ORF1分子をコード化せず、遺伝子エレメントが、プロモータエレメントと、エフェクター(例えば、外性エフェクター又は内在性エフェクター)をコード化する核酸配列(例えば、DNA配列)と、タンパク質結合配列と、を含むステップ
を含み、
これにより、アネロソームを作製する方法。
a)以下:
(i)アネロソーム、例えば、本明細書に記載される合成アネロソームの遺伝子エレメントの核酸配列を含む、核酸分子、例えば、第1核酸分子と、
(ii)例えば、表16のいずれかに列挙されるように、ORF1、ORF2、ORF2/2、ORF2/3、ORF1/1、若しくはORF1/2から選択されるアミノ酸配列、又はそれに対して少なくとも70%(例えば、少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、若しくは100%)の配列同一性を有するアミノ酸配列の1つ若しくは複数をコード化する核酸分子、例えば、第2核酸分子と;
を含む宿主細胞を用意するステップ;及び
b)アネロソームを作製するのに好適な条件下で宿主細胞を培養するステップ
を含む方法。
(a)ORF1分子を含むタンパク質性外層;
(b)プロモータエレメントと、エフェクター(例えば、外性エフェクター又は内在性エフェクター)をコード化する核酸配列(例えば、DNA配列)と、核酸配列:
(i)CGCGCTGCGCGCGCCGCCCAGTAGGGGGAGCCATGC(配列番号160)
(ii)GCGCTX1CGCGCGCGCGCCGGGGGGCTGCGCCCCCCC(配列番号164)(X1は、T、G、若しくはAから選択される)
(iii)GCGCTTCGCGCGCCGCCCACTAGGGGGCGTTGCGCG(配列番号165);
(iv)GCGCTGCGCGCGCCGCCCAGTAGGGGGCGCAATGCG(配列番号166);
(v)GCGCTGCGCGCGCGGCCCCCGGGGGAGGCATTGCCT(配列番号167);
(vi)GCGCTGCGCGCGCGCGCCGGGGGGGCGCCAGCGCCC(配列番号168);
(vii)GCGCTTCGCGCGCGCGCCGGGGGGCTCCGCCCCCCC(配列番号169);
(viii)GCGCTTCGCGCGCGCGCCGGGGGGCTGCGCCCCCCC(配列番号170);
(ix)GCGCTACGCGCGCGCGCCGGGGGGCTGCGCCCCCCC(配列番号171);若しくは
(x)GCGCTACGCGCGCGCGCCGGGGGGCTCTGCCCCCCC(配列番号172);
又はそれらと少なくとも75、76、77、78、79、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、若しくは100%の配列同一性を有する核酸配列
の少なくとも10、15、20、25、30、31、32、33、34、35、若しくは36個の連続したヌクレオチドを含む領域と、を含む遺伝子エレメント
を含むアネロソームを被験者に投与するステップを含み;
ここで、遺伝子エレメントは、タンパク質性外層内に閉じ込められており;
任意選択で、遺伝子エレメントは、
(i)例えば、本明細書に記載されるように、野生型TTV-tth8ゲノム配列と比較してヌクレオチド3436~3607の欠失を含まない;
(ii)例えば、本明細書に記載されるように、野生型TTMV-LY2ゲノム配列と比較してヌクレオチド1432~2210の欠失を含まない;且つ/又は
(iii)例えば、本明細書に記載されるように、野生型TTMV-LY2ゲノム配列と比較して少なくとも101個のヌクレオチドの欠失を含まず;
これにより、エフェクターを被験者に送達する方法。
(a)ORF1分子を含むタンパク質性外層;
(b)プロモータエレメントと、エフェクター(例えば、外性エフェクター又は内在性エフェクター)をコード化する核酸配列(例えば、DNA配列)と、少なくとも70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、若しくは80.6%のGC含有率を有する少なくとも20、25、30、31、32、33、34、35、若しくは36個の連続したヌクレオチドを含む配列と、を含む遺伝子エレメント
を含むアネロソームを被験者に投与するステップを含み;
ここで、遺伝子エレメントは、タンパク質性外層内に閉じ込められており;
任意選択で、遺伝子エレメントは、
(i)例えば、本明細書に記載されるように、野生型TTV-tth8ゲノム配列と比較してヌクレオチド3436~3607の欠失を含まない;
(ii)例えば、本明細書に記載されるように、野生型TTMV-LY2ゲノム配列と比較してヌクレオチド1432~2210の欠失を含まない;且つ/又は
(iii)例えば、本明細書に記載されるように、野生型TTMV-LY2ゲノム配列と比較して少なくとも101個のヌクレオチドの欠失を含まず;
これにより、エフェクターを被験者に送達する方法。
(a)ORF1分子を含むタンパク質性外層;
(b)プロモータエレメントと、エフェクター(例えば、外性エフェクター又は内在性エフェクター)をコード化する核酸配列(例えば、DNA配列)と、タンパク質結合配列と、を含む遺伝子エレメント
を含むアネロソームを被験者に投与するステップを含み;
ここで、遺伝子エレメントは、タンパク質性外層内に閉じ込められており;
任意選択で、遺伝子エレメントは、
(i)例えば、本明細書に記載されるように、野生型TTV-tth8ゲノム配列と比較してヌクレオチド3436~3607の欠失を含まない;
(ii)例えば、本明細書に記載されるように、野生型TTMV-LY2ゲノム配列と比較してヌクレオチド1432~2210の欠失を含まない;且つ/又は
(iii)例えば、本明細書に記載されるように、野生型TTMV-LY2ゲノム配列と比較して少なくとも101個のヌクレオチドの欠失を含まず;
これにより、エフェクターを被験者に送達する方法。
(a)ORF1分子を含むタンパク質性外層;
(b)プロモータエレメントと、エフェクター(例えば、外性エフェクター又は内在性エフェクター)をコード化する核酸配列(例えば、DNA配列)と、核酸配列:
(i)CGCGCTGCGCGCGCCGCCCAGTAGGGGGAGCCATGC(配列番号160)
(ii)GCGCTX1CGCGCGCGCGCCGGGGGGCTGCGCCCCCCC(配列番号164)(X1は、T、G、若しくはAから選択される)
(iii)GCGCTTCGCGCGCCGCCCACTAGGGGGCGTTGCGCG(配列番号165);
(iv)GCGCTGCGCGCGCCGCCCAGTAGGGGGCGCAATGCG(配列番号166);
(v)GCGCTGCGCGCGCGGCCCCCGGGGGAGGCATTGCCT(配列番号167);
(vi)GCGCTGCGCGCGCGCGCCGGGGGGGCGCCAGCGCCC(配列番号168);
(vii)GCGCTTCGCGCGCGCGCCGGGGGGCTCCGCCCCCCC(配列番号169);
(viii)GCGCTTCGCGCGCGCGCCGGGGGGCTGCGCCCCCCC(配列番号170);
(ix)GCGCTACGCGCGCGCGCCGGGGGGCTGCGCCCCCCC(配列番号171);若しくは
(x)GCGCTACGCGCGCGCGCCGGGGGGCTCTGCCCCCCC(配列番号172);
又はそれらと少なくとも75、76、77、78、79、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、若しくは100%の配列同一性を有する核酸配列
の少なくとも10、15、20、25、30、31、32、33、34、35、若しくは36個の連続したヌクレオチドを含む領域と、を含む遺伝子エレメント
を含むアネロソームと標的細胞を接触させるステップを含み;
ここで、遺伝子エレメントは、タンパク質性外層内に閉じ込められており;
任意選択で、遺伝子エレメントは、
(i)例えば、本明細書に記載されるように、野生型TTV-tth8ゲノム配列と比較してヌクレオチド3436~3607の欠失を含まない;
(ii)例えば、本明細書に記載されるように、野生型TTMV-LY2ゲノム配列と比較してヌクレオチド1432~2210の欠失を含まない;且つ/又は
(iii)例えば、本明細書に記載されるように、野生型TTMV-LY2ゲノム配列と比較して少なくとも101個のヌクレオチドの欠失を含まず;
これにより、エフェクターを標的細胞に送達する方法。
(a)ORF1分子を含むタンパク質性外層;
(b)プロモータエレメントと、エフェクター(例えば、外性エフェクター又は内在性エフェクター)をコード化する核酸配列(例えば、DNA配列)と、少なくとも70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、若しくは80.6%のGC含有率を有する少なくとも20、25、30、31、32、33、34、35、若しくは36個の連続したヌクレオチドを含む配列と、を含む遺伝子エレメント
を含むアネロソームと標的細胞を接触させるステップを含み;
ここで、遺伝子エレメントは、タンパク質性外層内に閉じ込められており;
任意選択で、遺伝子エレメントは、
(i)例えば、本明細書に記載されるように、野生型TTV-tth8ゲノム配列と比較してヌクレオチド3436~3607の欠失を含まない;
(ii)例えば、本明細書に記載されるように、野生型TTMV-LY2ゲノム配列と比較してヌクレオチド1432~2210の欠失を含まない;且つ/又は
(iii)例えば、本明細書に記載されるように、野生型TTMV-LY2ゲノム配列と比較して少なくとも101個のヌクレオチドの欠失を含まず;
これにより、エフェクターを標的細胞に送達する方法。
(a)ORF1分子を含むタンパク質性外層;
(b)プロモータエレメントと、エフェクター(例えば、外性エフェクター又は内在性エフェクター)をコード化する核酸配列(例えば、DNA配列)と、タンパク質結合配列と、を含む遺伝子エレメント
を含むアネロソームと標的細胞を接触させるステップを含み;
ここで、遺伝子エレメントは、タンパク質性外層内に閉じ込められており;
任意選択で、遺伝子エレメントは、
(i)例えば、本明細書に記載されるように、野生型TTV-tth8ゲノム配列と比較してヌクレオチド3436~3607の欠失を含まない;
(ii)例えば、本明細書に記載されるように、野生型TTMV-LY2ゲノム配列と比較してヌクレオチド1432~2210の欠失を含まない;且つ/又は
(iii)例えば、本明細書に記載されるように、野生型TTMV-LY2ゲノム配列と比較して少なくとも101個のヌクレオチドの欠失を含まず;
これにより、エフェクターを標的細胞に送達する方法。
(i)プロモータエレメントと、治療用外性エフェクターをコード化する核酸配列とを含む遺伝子エレメント(遺伝子エレメントは、本明細書に記載のアネロウイルス(Anellovirus)(例えば、表A1、A3、A5、A7、A9、A11、B1~B5、1、3、5、7、9、11、13、15、若しくは17のいずれかに列挙される通り)由来の5’UTRヌクレオチド配列に対して少なくとも95%の配列同一性を有する配列を含む);及び/又は
(ii)本明細書に記載のアネロウイルス(Anellovirus)(例えば、表A1、A3、A5、A7、A9、A11、B1~B5、1、3、5、7、9、11、13、15、若しくは17のいずれかに列挙される通り)のORF1遺伝子によりコード化されるポリペプチドと少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチドを含むタンパク質性外層
を含むアネロソームと標的細胞を接触させるステップを含み;
ここで、遺伝子エレメントは、タンパク質性外層内に閉じ込められており;
任意選択で、遺伝子エレメントは、
(i)例えば、本明細書に記載されるように、野生型TTV-tth8ゲノム配列と比較してヌクレオチド3436~3607の欠失を含まない;
(ii)例えば、本明細書に記載されるように、野生型TTMV-LY2ゲノム配列と比較してヌクレオチド1432~2210の欠失を含まない;且つ/又は
(iii)例えば、本明細書に記載されるように、野生型TTMV-LY2ゲノム配列と比較して少なくとも101個のヌクレオチドの欠失を含まず;
これにより、エフェクターを標的細胞に送達する方法。
TVVRRRGRSPRRRTPSPRRRRSQSPRRRRSQSRESQC(配列番号808)、
RRRYARPYRRRHIRRYRRRRRHFRRRR(配列番号809)、
MPYYYRRRRYNYRRPRWYGRGWIRRPFRRRFRRKRRVR(配列番号216)、又は
に対して少なくとも70%(例えば、少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、若しくは100%)の配列同一性を有する、実施形態1149~1151のいずれかに記載のポリペプチド、複合体、アネロソーム、単離核酸、細胞、組成物、又は方法。
を有するゼリーロールドメインのアミノ酸配列、又は表A2、A4、A6、A8、A10、A12、C1~C5、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20~37、若しくはD1~D10のいずれかに列挙されるゼリーロールドメイン配列に対して少なくとも30%(例えば、少なくとも約30、35、40、50、60、70、80、90、95、96、97、98、99、若しくは100%)の配列同一性を有するゼリーロールドメインを含む、先行実施形態のいずれかに記載のポリペプチド、複合体、アネロソーム、単離核酸、細胞、組成物、又は方法。
を有するN22ドメインのアミノ酸配列、又は表A2、A4、A6、A8、A10、A12、C1~C5、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20~37、若しくはD1~D10のいずれかに列挙されるN22ドメイン配列に対して少なくとも30%(例えば、少なくとも約30、35、40、50、60、70、80、90、95、96、97、98、99、若しくは100%)の配列同一性を有するN22ドメインを含む、先行実施形態のいずれかに記載のポリペプチド、複合体、アネロソーム、単離核酸、細胞、組成物、又は方法。
(i)CGCGCTGCGCGCGCCGCCCAGTAGGGGGAGCCATGC(配列番号160)
(ii)GCGCTX1CGCGCGCGCGCCGGGGGGCTGCGCCCCCCC(配列番号164)(X1は、T、G、若しくはAから選択される)
(iii)GCGCTTCGCGCGCCGCCCACTAGGGGGCGTTGCGCG(配列番号165);
(iv)GCGCTGCGCGCGCCGCCCAGTAGGGGGCGCAATGCG(配列番号166);
(v)GCGCTGCGCGCGCGGCCCCCGGGGGAGGCATTGCCT(配列番号167);
(vi)GCGCTGCGCGCGCGCGCCGGGGGGGCGCCAGCGCCC(配列番号168);
(vii)GCGCTTCGCGCGCGCGCCGGGGGGCTCCGCCCCCCC(配列番号169);
(viii)GCGCTTCGCGCGCGCGCCGGGGGGCTGCGCCCCCCC(配列番号170);
(ix)GCGCTACGCGCGCGCGCCGGGGGGCTGCGCCCCCCC(配列番号171);若しくは
(x)GCGCTACGCGCGCGCGCCGGGGGGCTCTGCCCCCCC(配列番号172);
に対して少なくとも75%(例えば、少なくとも75、76、77、78、79、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、若しくは100%)の配列同一性を有する領域を含む、先行実施形態のいずれかに記載のポリペプチド、複合体、アネロソーム、単離核酸、細胞、組成物、又は方法。
(i)CGCGCTGCGCGCGCCGCCCAGTAGGGGGAGCCATGC(配列番号160)
(ii)GCGCTX1CGCGCGCGCGCCGGGGGGCTGCGCCCCCCC(配列番号164)(X1は、T、G、若しくはAから選択される)
(iii)GCGCTTCGCGCGCCGCCCACTAGGGGGCGTTGCGCG(配列番号165);
(iv)GCGCTGCGCGCGCCGCCCAGTAGGGGGCGCAATGCG(配列番号166);
(v)GCGCTGCGCGCGCGGCCCCCGGGGGAGGCATTGCCT(配列番号167);
(vi)GCGCTGCGCGCGCGCGCCGGGGGGGCGCCAGCGCCC(配列番号168);
(vii)GCGCTTCGCGCGCGCGCCGGGGGGCTCCGCCCCCCC(配列番号169);
(viii)GCGCTTCGCGCGCGCGCCGGGGGGCTGCGCCCCCCC(配列番号170);
(ix)GCGCTACGCGCGCGCGCCGGGGGGCTGCGCCCCCCC(配列番号171);若しくは
(x)GCGCTACGCGCGCGCGCCGGGGGGCTCTGCCCCCCC(配列番号172);
に対して少なくとも95%(例えば、少なくとも95、96、97、98、99、若しくは100%)の配列同一性を有する領域を含む、先行実施形態のいずれかに記載のポリペプチド、複合体、アネロソーム、単離核酸、細胞、組成物、又は方法。
に対して少なくとも75%(例えば、少なくとも75、76、77、78、79、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、若しくは100%)の配列同一性を有する核領域を含む、先行実施形態のいずれかに記載のポリペプチド、複合体、アネロソーム、単離核酸、細胞、組成物、又は方法。
に対して少なくとも75%(例えば、少なくとも75、76、77、78、79、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、若しくは100%)の配列同一性を有する領域を含む、先行実施形態のいずれかに記載のポリペプチド、複合体、アネロソーム、単離核酸、細胞、組成物、又は方法。
(i)表38に示されるコンセンサス5’UTR核酸配列;
(ii)表38に示される例示的なTTV 5’UTR核酸配列;
(iii)表38に示されるTTV-CT30F 5’UTR核酸配列;
(iv)表38に示されるTTV-HD23a 5’UTR核酸配列;
(v)表38に示されるTTV-JA20 5’UTR核酸配列;
(vi)表38に示されるTTV-TJN02 5’UTR核酸配列;
(vii)表38に示されるTTV-tth8 5’UTR核酸配列;
(viii)表39に示されるコンセンサスGCリッチ領域;
(ix)表39に示される例示的なTTV GCリッチ領域;
(x)表39に示されるTTV-CT30F GCリッチ領域;
(xi)表39に示されるTTV-JA20 GCリッチ領域;
(xii)表39に示されるTTV-TJN02 GCリッチ領域;
(xiii)表39に示されるTTV-HD23a GCリッチ領域;
(xiv)表39に示されるTTV-tth8 GCリッチ領域
に対して少なくとも約75%(例えば、少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、若しくは100%)の同一性を有する、先行実施形態のいずれかに記載のアネロソーム。
(i)TTV-tth8配列、例えば、表5に示される核酸配列のヌクレオチド3436~3607;
(ii)TTMV-LY2配列、例えば、表15に示される核酸配列のヌクレオチド574~1371及び/又はヌクレオチド1432~2210;
(iii)TTMV-LY2配列、例えば、表15に示される核酸配列のヌクレオチド1372~1431;又は
(iv)TTMV-LY2配列、例えば、表15に示される核酸配列のヌクレオチド2610~2809
に対応する核酸配列を含む欠失を含む、実施形態1234に記載のアネロソーム。
a)医薬組成物が、医薬又は適正製造基準(GMP)を満たすこと;
b)医薬組成物が、適正製造基準(GMP)に従って製造されていること;
c)医薬組成物が、予め定めた基準値を下回る病原体レベルを有する、例えば、病原体を実質的に含まないこと;
d)医薬組成物が、予め定めた基準値を下回る混入物レベルを有する、例えば、混入物を実質的に含まないこと;
e)医薬組成物が、予め定めたレベルの非感染性粒子、又は予め定めた粒子:感染性単位の比(例えば、<300:1、≦200:1、≦100:1、若しくは<50:1)を有すること、或いは
f)医薬組成物が、例えば、本明細書に記載の通り、低免疫原性を有する、又は実質的に非免疫原性であること
の1つ又は複数を有する、実施形態1262~1265のいずれかに記載の組成物又は医薬組成物。
核酸分子が、一本鎖DNAであり、また、核酸分子は、環状である、且つ/又は細胞に進入する核酸分子の約0.001%、0.005%、0.01%、0.05%、0.1%、0.5%、1%、1.5%、若しくは2%未満の頻度で組み込まれ;
エフェクターは、TTV由来ではなく、しかもSV40-miR-S1ではなく;
核酸分子は、TTMV-LYのポリヌクレオチド配列を含まず;
プロモータエレメントは、真核細胞におけるエフェクターの発現を指令することができる、核酸分子。
(i)プロモータエレメント、及びエフェクター(例えば、ペイロード)をコード化する配列(任意選択で、エフェクターは、野生型アネロウイルス(Anellovirus)配列に対して外性である)と、
(ii)野生型アネロウイルス(Anellovirus)配列に対して少なくとも75%の配列同一性を有する少なくとも72個の連続したヌクレオチド(例えば、少なくとも72、73、74、75、76、77、78、79、80、90、100、若しくは150ヌクレオチド);又は野生型アネロウイルス(Anellovirus)配列に対して少なくとも72%(例えば、少なくとも72、73、74、75、76、77、78、79、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、若しくは100%)の配列同一性を有する少なくとも100の連続したヌクレオチドと:
(iii)タンパク質結合配列、例えば、外部タンパク質結合配列と、
を含む遺伝子エレメントにおいて、
核酸構築物が、一本鎖DNAであり;
核酸構築物が、環状である、且つ/又は細胞に進入する遺伝子エレメントの約0.001%、0.005%、0.01%、0.05%、0.1%、0.5%、1%、1.5%、若しくは2%未満の頻度で組み込まれる、遺伝子エレメント。
a)アネロソーム、例えば、本明細書に記載される合成アネロソームの成分をコード化する1つ若しくは複数の核酸分子を含む宿主細胞を用意するステップであって、例えば、アネロソームは、タンパク質性外層、及び遺伝子エレメント、例えば、プロモータエレメントと、エフェクター(例えば、内在性若しくは外性エフェクター)をコード化する配列と、タンパク質結合配列(例えば、外部タンパク質結合配列、例えば、パッケージングシグナル)とを含む遺伝子エレメントを含むステップ;
b)宿主細胞からアネロソームを産生させ、これによって、アネロソームを作製するステップ;並びに
c)アネロソームを、例えば、被験者への投与に好適な医薬組成物として製剤化するステップ
を含む、方法。
a)先行実施形態のいずれかに記載の複数のアネロソーム、組成物、又は医薬組成物を用意するステップ;
b)任意選択で、以下:本明細書に記載される混入物、光学密度測定(例えば、OD260)、粒子数(例えば、HPLCにより)、感染力(例えば、粒子:感染単位比、例えば、蛍光及び/又はELISAにより決定される)のうち1つ若しくは複数について複数のアネロソームを評価するステップ;並びに
c)例えば、(b)のパラメータの1つ又は複数が、指定される閾値を満たしていれば、複数のアネロソームを、例えば、被験者への投与に好適な医薬組成物として製剤化するステップ
を含む、方法。
(i)非病原性外部タンパク質をコード化する配列と、(ii)遺伝子エレメントを非病原性外部タンパク質に結合させる外部タンパク質結合配列と、(iii)エフェクター、例えば、調節核酸をコード化する配列と、を含む遺伝子エレメント;及び
遺伝子エレメントと結合される、例えば、これを包膜又は閉じ込めるタンパク質性外層
を含む、合成アネロソーム。
a)(i)非病原性外部タンパク質をコード化する配列と、(ii)遺伝子エレメントを非病原性外部タンパク質に結合させる外部タンパク質結合配列と、(iii)エフェクター、例えば、調節核酸をコード化する配列と、を含む遺伝子エレメント;及び
遺伝子エレメントと結合される、例えば、これを包膜又は閉じ込めるタンパク質性外層
を含む、アネロソーム;並びに
b)製剤用賦形剤
を含む、医薬組成物。
a)(i)非病原性外部タンパク質をコード化する配列と、(ii)遺伝子エレメントを非病原性外部タンパク質に結合させる外部タンパク質結合配列と、(iii)エフェクター、例えば、調節核酸をコード化する配列と、を含む遺伝子エレメント;及び
遺伝子エレメントと結合される、例えば、これを包膜又は閉じ込めるタンパク質性外層
を含む、少なくとも103、104、105、106、107、108、又は109個のアネロソーム(例えば、本明細書に記載の合成アネロソーム)
b)製剤用賦形剤、並びに任意選択で、
c)予め定めた量に満たない量の以下:マイコプラズマ、外毒素、宿主細胞核酸(例えば、宿主細胞DNA及び/又は宿主細胞RNA)、動物由来のプロセス不純物(例えば、血清アルブミン若しくはトリプシン)、複製可能生物(RCA)、例えば、複製可能ウイルス若しくは不要なアネロソーム、遊離ウイルスキャプシドタンパク質、偶発性物質、及び/又は凝集体
を含む医薬組成物。
第1DNA配列が、表A1、A3、A5、A7、A9、A11、B1~B5、1、3、5、7、9、11、13、15、若しくは17のいずれかに挙げる対応する配列に対して少なくとも80%(例えば、少なくとも85%、90%、95%、97%、99%、100%)の配列同一性を有する少なくとも500(少なくとも600、700、800、900、1000、1200、1400、1500、1600、1800、2000)ヌクレオチドを含むか、又は
第1DNA配列が、表A2、A4、A6、A8、A10、A12、C1~C5、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20~37、若しくはD1~D10に挙げるORFに対して少なくとも80%(例えば、少なくとも85%、90%、95%、97%、99%、100%)の配列同一性を有する配列をコード化するか、或いは
第1DNA配列が、表19に挙げるコンセンサス配列に対して少なくとも90%(例えば、少なくとも95%、97%、99%、100%)の配列同一性を有する配列を含む、方法。
(a)アネロソーム、例えば、先行実施形態のいずれかに記載のアネロソーム、及び
(b)小胞、脂質ナノ粒子(LNP)、赤血球、エキソソーム(例えば、哺乳動物若しくは植物エキソソーム)、又はフソソームから選択される担体
を含む、医薬組成物。
(a)タンパク質性外層;
(b)プロモータエレメントと、エフェクター(例えば、内在性エフェクター若しくは外性エフェクター)をコード化する核酸配列(例えば、DNA配列)と、タンパク質結合配列(例えば、外部タンパク質結合配列)と、を含む遺伝子エレメントを含むアネロソームであって、
遺伝子エレメントが、以下:
(i)表A1に列挙されるアネロウイルス(Anellovirus)配列に対して少なくとも72.2%(例えば、少なくとも72.2、72.3、72.4、72.5、73、74、75、76、77、78、79、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、若しくは100%)の配列同一性;
(ii)表A3に列挙されるアネロウイルス(Anellovirus)配列に対して少なくとも68.4%(例えば、少なくとも68.4、68.5、68.6、68.7、68.8、68.9、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、若しくは100%)の配列同一性;
(iii)表A5に列挙されるアネロウイルス(Anellovirus)配列に対して少なくとも81.7%(例えば、少なくとも81.7、81.8、81.9、82、83、84、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、若しくは100%)の配列同一性;
(iv)表A7に列挙されるアネロウイルス(Anellovirus)配列に対して少なくとも92.6%(例えば、少なくとも92.6、92.7、92.8、92.9、93、94、95、96、97、98、99、若しくは100%)の配列同一性;
(v)表A9に列挙されるアネロウイルス(Anellovirus)配列に対して少なくとも65%(例えば、少なくとも65、66、67、68、69、70、75、76、77、78、79、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、若しくは100%)の配列同一性;又は
(vi)表A11に列挙されるアネロウイルス(Anellovirus)配列に対して少なくとも65%(例えば、少なくとも65、66、67、68、69、70、75、76、77、78、79、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、若しくは100%)の配列同一性
を有し;
任意選択で、遺伝子エレメントは、野生型アネロウイルス(Anellovirus)ゲノム配列(例えば、本明細書に記載の通り)と比較して、少なくとも1つの相違(例えば、突然変異、化学修飾、若しくはエピジェネティックな改変)、例えば、挿入、置換、酵素的修飾、及び/又は欠失、例えば、特定のドメイン(例えば、TATAボックス、キャップ部位、転写開始部位、5’UTR、オープンリーディングフレーム(ORF)、ポリ(A)シグナル、若しくはGCリッチ領域のうち1つ若しくは複数)の欠失を含み;
遺伝子エレメントが、タンパク質性外層内に閉じ込められており;
アネロソームが、真核細胞に遺伝子エレメントを送達するように構成されている、アネロソーム。
(a)タンパク質性外層;
(b)プロモータエレメントと、エフェクター(例えば、内在性エフェクター若しくは外性エフェクター)をコード化する核酸配列(例えば、DNA配列)と、タンパク質結合配列(例えば、外部タンパク質結合配列)と、を含む遺伝子エレメント
を含むアネロソームであって、
遺伝子エレメントが、以下:
(i)表A1に列挙されるアネロウイルス(Anellovirus)配列と比較して、約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、125、150、175、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900、1000、1010、1011、1012、1013、1014、1015、1016、若しくは1017以下のヌクレオチド相違、例えば、置換、挿入若しくは欠失;
(ii)表A3に列挙されるアネロウイルス(Anellovirus)配列と比較して、約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、125、150、175、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900、1000、1100、1110、1120、1130、1140、1150、11160、1170、1171、1172、1173、若しくは1174以下のヌクレオチド相違、例えば、置換、挿入若しくは欠失;
(iii)表A5に列挙されるアネロウイルス(Anellovirus)配列と比較して、約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、125、150、175、200、250、300、350、400、450、500、600、610、620、630、640、650、660、670、671、若しくは672以下のヌクレオチド相違、例えば、置換、挿入若しくは欠失;
(iv)表A7に列挙されるアネロウイルス(Anellovirus)配列と比較して、約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、125、150、175、200、250、260、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、若しくは280以下のヌクレオチド相違、例えば、置換、挿入若しくは欠失;
(v)表A9に列挙されるアネロウイルス(Anellovirus)配列と比較して、約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、125、150、175、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900、若しくは1000以下のヌクレオチド相違、例えば、置換、挿入若しくは欠失;又は
(vi)表A11に列挙されるアネロウイルス(Anellovirus)配列と比較して、約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、125、150、175、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900、若しくは1000以下のヌクレオチド相違、例えば、置換、挿入若しくは欠失
を含み;
任意選択で、遺伝子エレメントは、野生型アネロウイルス(Anellovirus)ゲノム配列(例えば、本明細書に記載の通り)と比較して、少なくとも1つの相違(例えば、突然変異、化学修飾、若しくはエピジェネティックな改変)、例えば、挿入、置換、酵素的修飾、及び/又は欠失、例えば、特定のドメイン(例えば、TATAボックス、キャップ部位、転写開始部位、5’UTR、オープンリーディングフレーム(ORF)、ポリ(A)シグナル、若しくはGCリッチ領域のうち1つ若しくは複数)の欠失を含み;
遺伝子エレメントが、タンパク質性外層内に閉じ込められており;
アネロソームが、真核細胞に遺伝子エレメントを送達するように構成されている、アネロソーム。
(a)タンパク質性外層;
(b)プロモータエレメントと、エフェクター(例えば、内在性エフェクター若しくは外性エフェクター)をコード化する核酸配列(例えば、DNA配列)と、タンパク質結合配列(例えば、外部タンパク質結合配列)と、を含む遺伝子エレメントを含むアネロソームであって、
遺伝子エレメントが、以下:
(i)表B1に列挙されるアネロウイルス(Anellovirus)配列と比較して、約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、125、150、175、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900、1000、1010、1011、1012、1013、1014、1015、1016、若しくは1017以下のヌクレオチド相違、例えば、置換、挿入若しくは欠失;
(ii)表B2に列挙されるアネロウイルス(Anellovirus)配列と比較して、約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、125、150、175、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900、1000、1100、1110、1120、1130、1140、1150、11160、1170、1171、1172、1173、若しくは1174以下のヌクレオチド相違、例えば、置換、挿入若しくは欠失;
(iii)表B3に列挙されるアネロウイルス(Anellovirus)配列と比較して、約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、125、150、175、200、250、300、350、400、450、500、600、610、620、630、640、650、660、670、671、若しくは672以下のヌクレオチド相違、例えば、置換、挿入若しくは欠失;
(iv)表B4に列挙されるアネロウイルス(Anellovirus)配列と比較して、約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、125、150、175、200、250、260、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、若しくは280以下のヌクレオチド相違、例えば、置換、挿入若しくは欠失;又は
(v)表B5に列挙されるアネロウイルス(Anellovirus)配列と比較して、約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、125、150、175、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900、若しくは1000以下のヌクレオチド相違、例えば、置換、挿入若しくは欠失;
を含み;
任意選択で、遺伝子エレメントは、野生型アネロウイルス(Anellovirus)ゲノム配列(例えば、本明細書に記載の通り)と比較して、少なくとも1つの相違(例えば、突然変異、化学修飾、若しくはエピジェネティックな改変)、例えば、挿入、置換、酵素的修飾、及び/又は欠失、例えば、特定のドメイン(例えば、TATAボックス、キャップ部位、転写開始部位、5’UTR、オープンリーディングフレーム(ORF)、ポリ(A)シグナル、若しくはGCリッチ領域のうち1つ若しくは複数)の欠失を含み;
遺伝子エレメントが、タンパク質性外層内に閉じ込められており;
アネロソームが、真核細胞に遺伝子エレメントを送達するように構成されている、アネロソーム。
(i)CGCGCTGCGCGCGCCGCCCAGTAGGGGGAGCCATGC(配列番号160);
(ii)GCGCTX1CGCGCGCGCGCCGGGGGGCTGCGCCCCCCC(配列番号164)(X1は、T、G、若しくはAから選択される)
(iii)GCGCTTCGCGCGCCGCCCACTAGGGGGCGTTGCGCG(配列番号165);
(iv)GCGCTGCGCGCGCCGCCCAGTAGGGGGCGCAATGCG(配列番号166);
(v)GCGCTGCGCGCGCGGCCCCCGGGGGAGGCATTGCCT(配列番号167);
(vi)GCGCTGCGCGCGCGCGCCGGGGGGGCGCCAGCGCCC(配列番号168);
(vii)GCGCTTCGCGCGCGCGCCGGGGGGCTCCGCCCCCCC(配列番号169);
(viii)GCGCTTCGCGCGCGCGCCGGGGGGCTGCGCCCCCCC(配列番号170);
(ix)GCGCTACGCGCGCGCGCCGGGGGGCTGCGCCCCCCC(配列番号171);若しくは
(x)GCGCTACGCGCGCGCGCCGGGGGGCTCTGCCCCCCC(配列番号172);
又はそれらと少なくとも75、76、77、78、79、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、若しくは100%の配列同一性を有する核酸配列
の少なくとも10、15、20、25、30、31、32、33、34、35、若しくは36個の連続したヌクレオチドを含む領域を含む、先行実施形態のいずれかに記載のアネロソーム。
(i)表A1に列挙されるアネロウイルス(Anellovirus)配列に対して少なくとも72.2%(例えば、少なくとも72.2、72.3、72.4、72.5、73、74、75、76、77、78、79、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、若しくは100%)の配列同一性;
(ii)表A3に列挙されるアネロウイルス(Anellovirus)配列に対して少なくとも68.4%(例えば、少なくとも68.4、68.5、68.6、68.7、68.8、68.9、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、若しくは100%)の配列同一性;
(iii)表A5に列挙されるアネロウイルス(Anellovirus)配列に対して少なくとも81.7%(例えば、少なくとも81.7、81.8、81.9、82、83、84、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、若しくは100%)の配列同一性;
(iv)表A7に列挙されるアネロウイルス(Anellovirus)配列に対して少なくとも92.6%(例えば、少なくとも92.6、92.7、92.8、92.9、93、94、95、96、97、98、99、若しくは100%)の配列同一性;
(v)表A9に列挙されるアネロウイルス(Anellovirus)配列に対して少なくとも65%(例えば、少なくとも65、66、67、68、69、70、75、76、77、78、79、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、若しくは100%)の配列同一性;又は
(vi)表A11に列挙されるアネロウイルス(Anellovirus)配列に対して少なくとも65%(例えば、少なくとも65、66、67、68、69、70、75、76、77、78、79、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、若しくは100%)の配列同一性
を有する遺伝子エレメントを含む単離核酸分子(例えば、発現ベクター)であって;
任意選択で、遺伝子エレメントは、野生型アネロウイルス(Anellovirus)ゲノム配列(例えば、本明細書に記載の通り)と比較して、少なくとも1つの相違(例えば、突然変異、化学修飾、若しくはエピジェネティックな改変)、例えば、挿入、置換、酵素的修飾、及び/又は欠失、例えば、特定のドメイン(例えば、TATAボックス、キャップ部位、転写開始部位、5’UTR、オープンリーディングフレーム(ORF)、ポリ(A)シグナル、若しくはGCリッチ領域のうち1つ若しくは複数)の欠失を含む、単離核酸分子。
(i)表A1に列挙されるアネロウイルス(Anellovirus)配列と比較して、約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、125、150、175、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900、1000、1010、1011、1012、1013、1014、1015、1016、若しくは1017以下のヌクレオチド相違、例えば、置換、挿入若しくは欠失;
(ii)表A3に列挙されるアネロウイルス(Anellovirus)配列と比較して、約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、125、150、175、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900、1000、1100、1110、1120、1130、1140、1150、11160、1170、1171、1172、1173、若しくは1174以下のヌクレオチド相違、例えば、置換、挿入若しくは欠失;
(iii)表A5に列挙されるアネロウイルス(Anellovirus)配列と比較して、約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、125、150、175、200、250、300、350、400、450、500、600、610、620、630、640、650、660、670、671、若しくは672以下のヌクレオチド相違、例えば、置換、挿入若しくは欠失;
(iv)表A7に列挙されるアネロウイルス(Anellovirus)配列と比較して、約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、125、150、175、200、250、260、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、若しくは280以下のヌクレオチド相違、例えば、置換、挿入若しくは欠失;
(v)表A9に列挙されるアネロウイルス(Anellovirus)配列と比較して、約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、125、150、175、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900、若しくは1000以下のヌクレオチド相違、例えば、置換、挿入若しくは欠失;又は
(vi)表A11に列挙されるアネロウイルス(Anellovirus)配列と比較して、約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、125、150、175、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900、若しくは1000以下のヌクレオチド相違、例えば、置換、挿入若しくは欠失
を含む遺伝子エレメントを含む単離核酸分子(例えば、発現ベクター)であって;
任意選択で、遺伝子エレメントは、野生型アネロウイルス(Anellovirus)ゲノム配列(例えば、本明細書に記載の通り)と比較して、少なくとも1つの相違(例えば、突然変異、化学修飾、若しくはエピジェネティックな改変)、例えば、挿入、置換、酵素的修飾、及び/又は欠失、例えば、特定のドメイン(例えば、TATAボックス、キャップ部位、転写開始部位、5’UTR、オープンリーディングフレーム(ORF)、ポリ(A)シグナル、若しくはGCリッチ領域のうち1つ若しくは複数)の欠失を含む、単離核酸分子。
(i)表B1に列挙されるアネロウイルス(Anellovirus)配列と比較して、約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、125、150、175、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900、1000、1010、1011、1012、1013、1014、1015、1016、若しくは1017以下のヌクレオチド相違、例えば、置換、挿入若しくは欠失;
(ii)表B2に列挙されるアネロウイルス(Anellovirus)配列と比較して、約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、125、150、175、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900、1000、1100、1110、1120、1130、1140、1150、11160、1170、1171、1172、1173、若しくは1174以下のヌクレオチド相違、例えば、置換、挿入若しくは欠失;
(iii)表B3に列挙されるアネロウイルス(Anellovirus)配列と比較して、約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、125、150、175、200、250、300、350、400、450、500、600、610、620、630、640、650、660、670、671、若しくは672以下のヌクレオチド相違、例えば、置換、挿入若しくは欠失;
(iv)表B4に列挙されるアネロウイルス(Anellovirus)配列と比較して、約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、125、150、175、200、250、260、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、若しくは280以下のヌクレオチド相違、例えば、置換、挿入若しくは欠失;又は
(v)表B5に列挙されるアネロウイルス(Anellovirus)配列と比較して、約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、125、150、175、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900、若しくは1000以下のヌクレオチド相違、例えば、置換、挿入若しくは欠失;
を含む遺伝子エレメントを含む単離核酸分子(例えば、発現ベクター)であって;
任意選択で、遺伝子エレメントは、野生型アネロウイルス(Anellovirus)ゲノム配列(例えば、本明細書に記載の通り)と比較して、少なくとも1つの相違(例えば、突然変異、化学修飾、若しくはエピジェネティックな改変)、例えば、挿入、置換、酵素的修飾、及び/又は欠失、例えば、特定のドメイン(例えば、TATAボックス、キャップ部位、転写開始部位、5’UTR、オープンリーディングフレーム(ORF)、ポリ(A)シグナル、若しくはGCリッチ領域のうち1つ若しくは複数)の欠失を含む、単離核酸分子。
ここで、
(i)ORF1分子のアミノ酸の少なくとも30%(例えば、少なくとも30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、90%、若しくはそれ以上)が、βシートの一部であり;
(ii)ORF1分子の二次構造が、少なくとも3つ(例えば、少なくとも3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、若しくは20)のβシートを含み;
(iii)ORF1分子の二次構造が、少なくとも1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、若しくは10:1のβシート:αヘリックスの比を含む、先行実施形態のいずれかに記載の単離核酸分子。
(i)CGCGCTGCGCGCGCCGCCCAGTAGGGGGAGCCATGC(配列番号160);
(ii)GCGCTX1CGCGCGCGCGCCGGGGGGCTGCGCCCCCCC(配列番号164)(X1は、T、G、若しくはAから選択される)
(iii)GCGCTTCGCGCGCCGCCCACTAGGGGGCGTTGCGCG(配列番号165);
(iv)GCGCTGCGCGCGCCGCCCAGTAGGGGGCGCAATGCG(配列番号166);
(v)GCGCTGCGCGCGCGGCCCCCGGGGGAGGCATTGCCT(配列番号167);
(vi)GCGCTGCGCGCGCGCGCCGGGGGGGCGCCAGCGCCC(配列番号168);
(vii)GCGCTTCGCGCGCGCGCCGGGGGGCTCCGCCCCCCC(配列番号169);
(viii)GCGCTTCGCGCGCGCGCCGGGGGGCTGCGCCCCCCC(配列番号170);
(ix)GCGCTACGCGCGCGCGCCGGGGGGCTGCGCCCCCCC(配列番号171);若しくは
(x)GCGCTACGCGCGCGCGCCGGGGGGCTCTGCCCCCCC(配列番号172);
又はそれらと少なくとも75、76、77、78、79、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、若しくは100%の配列同一性を有する核酸配列
の少なくとも10、15、20、25、30、31、32、33、34、35、若しくは36個の連続したヌクレオチドを含む、先行実施形態のいずれかに記載の単離核酸分子。
(i)CGCGCTGCGCGCGCCGCCCAGTAGGGGGAGCCATGC(配列番号160)
(ii)GCGCTX1CGCGCGCGCGCCGGGGGGCTGCGCCCCCCC(配列番号164)(X1は、T、G、若しくはAから選択される)
(iii)GCGCTTCGCGCGCCGCCCACTAGGGGGCGTTGCGCG(配列番号165);
(iv)GCGCTGCGCGCGCCGCCCAGTAGGGGGCGCAATGCG(配列番号166);
(v)GCGCTGCGCGCGCGGCCCCCGGGGGAGGCATTGCCT(配列番号167);
(vi)GCGCTGCGCGCGCGCGCCGGGGGGGCGCCAGCGCCC(配列番号168);
(vii)GCGCTTCGCGCGCGCGCCGGGGGGCTCCGCCCCCCC(配列番号169);
(viii)GCGCTTCGCGCGCGCGCCGGGGGGCTGCGCCCCCCC(配列番号170);
(ix)GCGCTACGCGCGCGCGCCGGGGGGCTGCGCCCCCCC(配列番号171);若しくは
(x)GCGCTACGCGCGCGCGCCGGGGGGCTCTGCCCCCCC(配列番号172);
又はそれらと少なくとも75、76、77、78、79、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、若しくは100%の配列同一性を有する核酸配列
の少なくとも10、15、20、25、30、31、32、33、34、35、若しくは36個の連続したヌクレオチドを含む領域(例えば、パッケージング領域)を含む、先行実施形態のいずれかに記載のアネロソーム又は単離核酸。
(a)本明細書に記載されるアネロウイルス(Anellovirus)ORF1分子(例えば、表C1~C5、A2、A4、A6、A8、A10、若しくはA12のいずれかに列挙されるアネロウイルス(Anellovirus)ORF1配列)のアルギニンリッチ領域配列に対して少なくとも70%(例えば、少なくとも約70、80、90、95、96、97、98、99、若しくは100%)の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第1領域;
(b)本明細書に記載されるアネロウイルス(Anellovirus)ORF1分子(例えば、表C1~C5、A2、A4、A6、A8、A10、若しくはA12のいずれかに列挙されるアネロウイルス(Anellovirus)ORF1配列)のゼリーロール領域配列に対して少なくとも30%(例えば、少なくとも約30、35、40、50、60、70、80、90、95、96、97、98、99、若しくは100%)の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第2領域;
(c)本明細書に記載されるアネロウイルス(Anellovirus)ORF1分子(例えば、表C1~C5、A2、A4、A6、A8、A10、若しくはA12のいずれかに列挙されるアネロウイルス(Anellovirus)ORF1配列)のN22ドメイン配列に対して少なくとも30%(例えば、少なくとも約30、35、40、50、60、70、80、90、95、96、97、98、99、若しくは100%)の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第3領域;及び/又は
(d)本明細書に記載されるアネロウイルス(Anellovirus)ORF1分子(例えば、表C1~C5、A2、A4、A6、A8、A10、若しくはA12のいずれかに列挙されるアネロウイルス(Anellovirus)ORF1配列)のアネロウイルス(Anellovirus)ORF1 C末端ドメイン(CTD)配列に対して少なくとも30%(例えば、少なくとも約30、35、40、50、60、70、80、90、95、96、97、98、99、若しくは100%)の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第4領域
のうち1つ若しくは複数を含むポリペプチドであって;
ORF1分子が、野生型ORF1タンパク質(例えば、本明細書に記載の通り)と比較して、少なくとも1つの相違(例えば、突然変異、化学修飾、若しくはエピジェネティックな改変)、例えば、挿入、置換、化学若しくは酵素的修飾、及び/又は欠失、例えば、特定のドメイン(例えば、本明細書に記載されるように、例えば、アルギニンリッチ領域、ゼリーロールドメイン、HVR、N22、若しくはCTDのうち1つ若しくは複数)の欠失を含む、ポリペプチド。
(a)本明細書に記載されるアネロウイルス(Anellovirus)ORF1分子(例えば、表C1~C5、A2、A4、A6、A8、A10、若しくはA12のいずれかに列挙されるアネロウイルス(Anellovirus)ORF1配列)のアルギニンリッチ領域配列に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第1領域;
(b)本明細書に記載されるアネロウイルス(Anellovirus)ORF1分子(例えば、表C1~C5、A2、A4、A6、A8、A10、若しくはA12のいずれかに列挙されるアネロウイルス(Anellovirus)ORF1配列)のゼリーロール領域配列に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第2領域;
(c)本明細書に記載されるアネロウイルス(Anellovirus)ORF1分子(例えば、表C1~C5、A2、A4、A6、A8、A10、若しくはA12のいずれかに列挙されるアネロウイルス(Anellovirus)ORF1配列)のN22ドメイン配列に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第3領域;及び/又は
(d)本明細書に記載されるアネロウイルス(Anellovirus)ORF1分子(例えば、表C1~C5、A2、A4、A6、A8、A10、若しくはA12のいずれかに列挙されるアネロウイルス(Anellovirus)ORF1配列)のアネロウイルス(Anellovirus)ORF1 C末端ドメイン(CTD)配列に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第4領域
のうち1つ若しくは複数を含むポリペプチドであって;
ORF1分子が、野生型ORF1タンパク質(例えば、本明細書に記載の通り)と比較して、少なくとも1つの相違(例えば、突然変異、化学修飾、若しくはエピジェネティックな改変)、例えば、挿入、置換、化学若しくは酵素的修飾、及び/又は欠失、例えば、特定のドメイン(例えば、本明細書に記載されるように、例えば、アルギニンリッチ領域、ゼリーロールドメイン、HVR、N22、若しくはCTDのうち1つ若しくは複数)の欠失を含む、実施形態2031に記載のポリペプチド。
(i)第1領域及び第2領域;
(ii)第1領域及び第3領域;
(iii)第1領域及び第4領域;
(iv)第2領域及び第3領域;
(v)第2領域及び第4領域;
(vi)第3領域及び第4領域;
(vii)第1領域、第2領域、及び第3領域;
(viii)第1領域、第2領域、及び第4領域;
(ix)第1領域、第3領域、及び第4領域;
(x)第2領域、第3領域、及び第4領域
を含む、実施形態2031に記載のポリペプチド。
(a)先行実施形態のいずれかに記載のポリペプチド、及び
(b)プロモータエレメントと、エフェクター(例えば、外性エフェクター若しくは内在性エフェクター)をコード化する核酸配列(例えば、DNA配列)と、タンパク質結合配列と、を含む遺伝子エレメント
を含む複合体。
第1DNA配列が、表B1~B5、A1、A3、A5、A7、A9、若しくはA11のいずれかに列挙される対応する配列に対して少なくとも80%(少なくとも85%、90%、95%、97%、99%、100%)の配列同一性を有する少なくとも500(少なくとも600、700、800、900、1000、1200、1400、1500、1600、1800、2000)ヌクレオチドを含むか、又は
第1DNA配列が、アネロウイルス(Anellovirus)ORF1、ORF1/1、ORF1/2、ORF2、ORF2/2、ORF2/3、ORF2t/3、及び/又はORF3分子(例えば、表C1~C5、A2、A4、A6、A8、A10、若しくはA12のいずれかに列挙される)に対して少なくとも80%(例えば、少なくとも85%、90%、95%、97%、99%、100%)の配列同一性を有する配列をコード化すること
を含む、方法。
a)先行実施形態のいずれかに記載のアネロソームの成分をコード化する配列を含む1つ若しくは複数の核酸分子を含む宿主細胞を用意するステップであって、アネロソームが、タンパク質性外層と、遺伝子エレメント、例えば、プロモータエレメントと、エフェクター(例えば、内在性エフェクター又は外性エフェクター)をコード化する配列と、タンパク質結合配列(例えば、外部タンパク質結合配列、例えば、パッケージングシグナル)と、を含む遺伝子エレメントを含む、ステップ;
b)宿主細胞からアネロソームを生産し、それによってアネロソームを作製するステップ;並びに
c)例えば、被験者への投与に好適な医薬組成物として、アネロソームを製剤化するステップ
を含み;
任意選択で、1つ若しくは複数の核酸分子が、ヘルパータンパク質をコード化する、方法。
a)先行実施形態のいずれかに記載の複数のアネロソームを用意するステップ;
b)任意選択で、以下:本明細書に記載の混入物、光学密度測定値(例えば、OD260)、粒子数(例えば、HPLCにより)、感染力(例えば、粒子:感染単位比)のうち1つ又は複数について上記複数のアネロソームを評価するステップ;並びに
c)例えば、(b)のパラメータの1つ又は複数が、指定閾値を満たす場合、例えば、被験者への投与に好適な医薬組成物として、複数のアネロソームを製剤化するステップ
を含む、方法。
a)先行実施形態のいずれかに記載の少なくとも103、104、105、106、107、108、又は109個のアネロソーム;
b)製剤用賦形剤、並びに任意選択で、
c)予め定めた量に満たない量のマイコプラズマ、外毒素、宿主細胞核酸(例えば、宿主細胞DNA及び/又は宿主細胞RNA)、動物由来のプロセス不純物(例えば、血清アルブミン若しくはトリプシン)、複製可能生物(RCA)、例えば、複製可能ウイルス又は不要なアネロソーム、遊離ウイルスキャプシドタンパク質、偶発性物質、及び/又は凝集体
を含む医薬組成物。
a)先行実施形態のいずれかに記載の少なくとも103、104、105、106、107、108、又は109個のアネロソーム;
b)製剤用賦形剤、並びに任意選択で、
c)予め定めた量に満たない量のマイコプラズマ、外毒素、宿主細胞核酸(例えば、宿主細胞DNA及び/又は宿主細胞RNA)、動物由来のプロセス不純物(例えば、血清アルブミン若しくはトリプシン)、複製可能生物(RCA)、例えば、複製可能ウイルス又は不要なアネロソーム、遊離ウイルスキャプシドタンパク質、偶発性物質、及び/又は凝集体
を含む医薬組成物。
a)医薬組成物が、医薬又は適正製造基準(GMP)を満たすこと;
b)医薬組成物が、適正製造基準(GMP)に従って製造されていること;
c)医薬組成物が、予め定めた基準値を下回る病原体レベルを有する、例えば、病原体を実質的に含まないこと;
d)医薬組成物が、予め定めた基準値を下回る混入物レベルを有する、例えば、混入物を実質的に含まないこと;
e)医薬組成物が、予め定めたレベルの非感染性粒子、又は予め定めた粒子:感染性単位の比(例えば、<300:1、≦200:1、≦100:1、若しくは<50:1)を有すること、或いは
f)医薬組成物が、例えば、本明細書に記載の通り、低免疫原性を有する、又は実質的に非免疫原性であること
の1つ又は複数を有する、実施形態2085~2090のいずれかに記載の組成物又は医薬組成物。
(X1は、Cであるか、又は存在しない)
の核酸配列、
又はそれに対して少なくとも95%の同一性を有する核酸配列
を含む5’UTRを含む、先行実施形態のいずれかに記載のポリペプチド、複合体、アネロソーム、単離核酸、細胞、組成物、又は方法。
(I)以下:
(a)プロモータエレメント、
(b)外性エフェクターをコード化する核酸配列であって、核酸配列は、プロモータエレメントに作動可能に連結しており、
ここで、外性エフェクターは、変異すると、ヒトの疾患を引き起こすポリペプチド、又は前記ポリペプチドの機能性変異体を含み、これは、以下:
(i)治療用酵素(例えば、第IX因子、UGT1A1、若しくはCCA1)、
(ii)構造タンパク質(例えば、SMN、ジストロフィン)、又は
(iii)補体タンパク質(例えば、C1)
から選択される、核酸配列;及び
(c)以下:
配列番号54のヌクレオチド323~393の核酸配列、若しくはそれと少なくとも85%同一の核酸配列;
配列番号113、配列番号114、配列番号115、配列番号116、配列番号117、配列番号118、配列番号119若しくはそれと少なくとも85%同一の核酸配列;又は
配列番号61のヌクレオチド117~187の核酸配列、若しくはそれと少なくとも85%同一の核酸配列
を含む5’UTRドメイン
を含む遺伝子エレメント;
(II)ORF1分子を含むタンパク質外層
を含む合成アネロソームにおいて;
遺伝子エレメントは、タンパク質性外層内に閉じ込められており;且つ
合成アネロソームは、遺伝子エレメントを真核細胞に送達するように構成されている、合成アネロソーム。
(i)先行実施形態のいずれかに記載の合成アネロソームの遺伝子エレメントの配列を含む第1核酸分子(例えば、二本鎖又は一本鎖環状DNA)、及び
(ii)例えば、表16に列挙されるORF1、ORF2、ORF2/2、ORF2/3、ORF1/1、若しくはORF1/2から選択されるアミノ酸配列、又はそれに対して少なくとも85%の配列同一性を有するアミノ酸配列の1つ若しくは複数をコード化する第2核酸分子
を含む、反応混合物。
a)以下:
(i)先行実施形態のいずれかに記載の合成アネロソームの遺伝子エレメントの核酸配列を含む第1核酸分子と、
(ii)表16のいずれかに列挙される、ORF1、ORF2、ORF2/2、ORF2/3、ORF1/1、若しくはORF1/2から選択されるアミノ酸配列、又はそれに対して少なくとも85%の配列同一性を有するアミノ酸配列の1つ若しくは複数をコード化する第2核酸分子と、
を含む宿主細胞を用意するステップ;及び
b)合成アネロソームを作製するのに好適な条件下で宿主細胞をインキュベートするステップを含み、
それによって合成アネロソームを作製する方法。
a)実施形態3001~3035に記載の複数の合成アネロソーム、実施形態3036~3038のいずれかに記載の医薬組成物、又は実施形態3039~3044のいずれかに記載の反応混合物を用意するステップ;
b)任意選択で、以下:本明細書に記載される混入物、光学密度測定値(例えば、OD260)、粒子数(例えば、HPLCにより)、感染力(例えば、粒子:感染単位比)のうち1つ又は複数について上記複数を評価するステップ;並びに
c)例えば、(b)のパラメータの1つ又は複数が、指定閾値を満たす場合、例えば、被験者への投与に好適な医薬組成物として、複数の合成アネロソームを製剤化するステップ
を含む、方法。
(i)先行実施形態のいずれかに記載の合成アネロソームの遺伝子エレメントの核酸配列を含む第1核酸分子、及び
(ii)任意選択で、表16のいずれかに列挙されるORF1、ORF2、ORF2/2、ORF2/3、ORF1/1、若しくはORF1/2から選択されるアミノ酸配列、又はそれに対して少なくとも85%の配列同一性を有するアミノ酸配列の1つ若しくは複数をコード化する第2核酸分子;
を含む宿主細胞。
(a)先行実施形態のいずれかに記載の合成アネロソームを用意するステップ;及び
(b)哺乳動物細胞を合成アネロソームと接触させるステップ
を含み;
ここで、合成アネロソームは、遺伝子エレメントを哺乳動物細胞に送達することができ;
任意選択で、遺伝子エレメントを宿主細胞中のタンパク質性外層内に閉じ込めるのに好適な条件下で、遺伝子エレメントを宿主細胞に導入することにより、合成アネロソームが生産され;
これによって、治療用外性エフェクターを哺乳動物細胞に送達する、方法。
具体的な実施形態に関して、いくつかの図を参照にしながら本発明を説明するが、本発明は、特許請求の範囲を除いて、それらに限定されない。以下に記載する用語は、別に指示されない限り、概してそれらの一般的意味で理解すべきである。
I.アネロソーム
A.アネロウイルス(Anellovirus)
B.ORF1分子
C.ORF2分子
D.遺伝子エレメント
E.タンパク質結合配列
F.5’UTR領域
G.GCリッチ領域
H.エフェクター
I.タンパク質性外層
II.ベクター
III.組成物
IV.宿主細胞
V.使用方法
VI.生産方法
VII.投与/送達
一部の態様では、本明細書に記載される本発明は、組成物並びにアネロソーム、アネロソーム調製物、及び医薬組成物の使用及び製造方法を含む。一部の実施形態では、アネロソームは、アネロウイルス(Anellovirus)(例えば、本明細書に記載されるアネロウイルス(Anellovirus)、例えば、表A1~12、B1~B5、C1~C5、1~18、20~37、若しくはD1~D10のいずれかに示される配列を含む核酸配列又はポリペプチド、又はその断片若しくは部分を含むアネロウイルス(Anellovirus))、或いは他の実質的に非病原性のウイルス、例えば、共生ウイルス、片利共生ウイルス、ネイティブウイルスをベースとする配列、構造、及び/又は機能を有する。一部の実施形態では、アネロウイルス(Anellovirus)ベースのアネロソームは、アネロウイルス(Anellovirus)に対して外性の少なくとも1つのエレメント、例えば、外性エフェクター、又はアネロソームの遺伝子エレメント内に配置される外性エフェクターをコード化する核酸配列を含む。一部の実施形態では、アネロウイルス(Anellovirus)ベースのアネロソームは、アネロウイルス(Anellovirus)由来の別のエレメントとは異種の少なくとも1つのエレメント、例えば、別の連結核酸配列に対して異種であるエフェクターコード化核酸配列、例えばプロモータエレメントなどを含む。一部の実施形態では、アネロソームは、遺伝子エレメント(例えば、環状DNA、例えば、一本鎖環状DNA)を含み、これは、遺伝子エレメントの残り及び/又はタンパク質性外層(例えば、本明細書に記載される、例えば、エフェクターをコード化する外性エレメント)に対して外性である少なくとも1つのエレメントを含む。アネロソームは、宿主、例えば、ヒトへのペイロードの送達ビヒクル(例えば、実質的に非病原性送達ビヒクル)であってもよい。一部の実施形態では、アネロソームは、真核細胞、例えば、哺乳動物細胞、例えば、ヒト細胞中で複製することができる。一部の実施形態では、アネロソームは、哺乳動物(例えば、ヒト)細胞において、実質的に非病原性であり、且つ/又は実質的に非総合作用性である。一部の実施形態では、アネロソームは、哺乳動物、例えば、ヒトにおいて、実質的に非免疫原性である。一部の実施形態では、アネロソームは、複製欠損である。一部の実施形態では、アネロソームは、複製可能である。
a)(i)非病原性外部タンパク質をコード化する配列と、(ii)非病原性外部タンパク質に遺伝子エレメントを結合させる外部タンパク質結合配列と、(iii)エフェクター(例えば、内在性又は外性エフェクター)をコード化する配列と、を含む遺伝子エレメント;及び
b)遺伝子エレメントと結合される、例えば、これを包膜又は閉じ込めるタンパク質性外層
を含むアネロソームを含む。
一部の実施形態では、例えば、本明細書に記載のアネロソームは、アネロウイルス(Anellovirus)由来の配列又は発現産物を含む。一部の実施形態では、アネロソームは、アネロウイルス(Anellovirus)に対して外性の1つ若しくは複数の配列又は発現産物を含む。一部の実施形態では、アネロソームは、アネロウイルス(Anellovirus)に対して内在性の1つ若しくは複数の配列又は発現産物を含む。一部の実施形態では、アネロソームは、アネロソーム中の1つ若しくは複数の他の配列又は発現産物に対して異種である1つ若しくは複数の配列又は発現産物を含む。アネロウイルス(Anellovirus)は一般に、負極性を有する一本鎖環状DNAゲノムを有する。アネロウイルス(Anellovirus)は、ヒト疾患と関連付けられていない。しかし、アネロウイルス(Anellovirus)感染をヒト疾患と関連付ける試みは、対照コホート集団における無症候性アネロウイルス(Anellovirus)ウイルス血症の高い発生率、アネロウイルス(anellovirus)ウイルス科の著しいゲノム多様性、このウイルスをインビトロでの増殖がこれまで不可能であったこと、並びにアネロウイルス(Anellovirus)疾患の動物モデルがないことによって妨げられている(Yzebe et al.,Panminerva Med.(2002)44:167-177;Biagini,P.,Vet.Microbiol.(2004)98:95-101)。
一部の実施形態では、アネロソームは、ORF1分子及び/又はORF1分子をコード化する核酸を含む。概して、ORF1分子は、アネロウイルス(Anellovirus)ORF1タンパク質(例えば、本明細書に記載される、例えば、表A2、A4、A6、A8、A10、A12、C1~C5、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20~37、若しくはD1~D10のいずれかに列挙されるアネロウイルス(Anellovirus)ORF1タンパク質)、又はその機能性断片の構造特徴及び/又は活性を有するポリペプチドを含む。一部の実施形態では、ORF1分子は、アネロウイルス(Anellovirus)ORF1タンパク質(例えば、本明細書に記載される、例えば、表A2、A4、A6、A8、A10、A12、C1~C5、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20~37、若しくはD1~D10のいずれかに列挙されるアネロウイルス(Anellovirus)ORF1タンパク質)と比較して切断を含む。一部の実施形態では、ORF1分子は、アネロウイルス(Anellovirus)ORF1タンパク質の少なくとも10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、若しくは700個のアミノ酸が切断されている。一部の実施形態では、ORF1分子は、表A2、A4、A6、A8、A10、A12、C1~C5、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20~37、又はD1~D10のいずれかに示されるアネロウイルス(Anellovirus)ORF1タンパク質配列に対して少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、若しくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ORF1分子は、例えば、本明細書に記載される、アルファトルクウイルス(Alphatorquevirus)、ベータトルクウイルス(Betatorquevirus)、又はガンマトルクウイルス(Gammatorquevirus)ORF1タンパク質に対して少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、若しくは99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。ORF1分子は、一般に、DNA(例えば、本明細書に記載される、例えば遺伝子エレメント)に結合することができる。一部の実施形態では、ORF1分子は、細胞の核に局在化する。特定の実施形態では、ORF1分子は、核小体に局在化する。
アルギニンリッチ領域は、本明細書に記載されるアルギニンリッチ領域配列又は少なくとも60%、70%、若しくは80%の塩基性残基(例えば、アルギニン、リシン、若しくはそれらの組合せ)を含む少なくとも約40アミノ酸の配列に対して少なくとも70%(例えば、少なくとも約70、80、90、95、96、97、98、99、若しくは100%)の配列同一性を有する。
ゼリーロールドメイン又は領域は、以下の特徴:
(i)ゼリーロールドメインのアミノ酸の少なくとも30%(例えば、少なくとも約30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、90%、若しくはそれ以上)が、1つ若しくは複数のβシートの部分である;
(ii)ゼリーロールドメインの二次構造が、少なくとも4つ(例えば、4、5、6、7、8、9、10、11、若しくは12)のβ鎖を含む;且つ/又は
(iii)ゼリーロールドメインの三次構造が、少なくとも2つ(例えば、2、3、若しくは4つ)のβシートを含む;且つ/又は
(iv)ゼリーロールドメインが、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、若しくは10:1のβシート:αヘリックスの比を含む
のうち1つ若しくは複数(例えば、1、2、若しくは3)を含むポリペプチド(例えば、より大きなポリペプチドに含まれるドメイン又は領域)を含む(例えば、それから構成される)。
一部の実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチド(例えば、ORF1分子)は、アミノ酸配列YNPX2DXGX2N(配列番号829)(Xnは、任意のn個のアミノ酸の連続した配列である)を含む。例えば、Xnは、任意の2つのアミノ酸の連続した配列を示す。一部の実施形態では、YNPX2DXGX2N(配列番号829)は、例えば、本明細書に記載されるORF1分子のN22ドメイン内に含まれる。一部の実施形態では、本明細書に記載される遺伝子エレメントは、アミノ酸配列YNPX2DXGX2N(配列番号829)(Xnは、任意のn個のアミノ酸の連続した配列である)をコード化する核酸配列(例えば、本明細書に記載される、例えば、ORF1分子をコード化する核酸配列)を含む。
一部の実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチド(例えば、ORF1分子)は、アネロウイルス(Anellovirus)ORF1タンパク質(例えば、本明細書に記載の通り)に含まれる1つ又は複数の二次構造エレメントを含む。一部の実施形態では、ORF1分子は、アネロウイルス(Anellovirus)ORF1タンパク質のゼリーロールドメイン(例えば、本明細書に記載の通り)に含まれる1つ又は複数の二次構造エレメントを含む。一般に、ORF1ゼリーロールドメインは、N末端からC末端方向の順で、第1β鎖、第2β鎖、第1αヘリックス、第3β鎖、第4β鎖、第5β鎖、第2αヘリックス、第6β鎖、第7β鎖、第8β鎖、及び第9β鎖を含む二次構造を含む。一部の実施形態では、ORF1分子は、N末端からC末端方向の順で、第1β鎖、第2β鎖、第1αヘリックス、第3β鎖、第4β鎖、第5β鎖、第2αヘリックス、第6β鎖、第7β鎖、第8β鎖、及び/又は第9β鎖を含む二次構造を含む。
一部の実施形態では、本明細書に記載のポリペプチド(例えば、ORF1分子)は、例えば、表20~37、又はD1~D10)のいずれかに記載される、1つ若しくは複数のアネロウイルス(Anellovirus)ORF1部分配列に対して少なくとも約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、若しくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本明細書に記載のアネロソームは、例えば、表20~37、又はD1~D10のいずれかに記載される、1つ若しくは複数のアネロウイルス(Anellovirus)ORF1部分配列に対して少なくとも約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、若しくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本明細書に記載のアネロソームは、例えば、表20~37、又はD1~D10のいずれかに記載される、1つ若しくは複数のアネロウイルス(Anellovirus)ORF1部分配列に対して少なくとも約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、若しくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むORF1分子をコード化する核酸分子(例えば、遺伝子エレメント)を含む。
一部の実施形態では、例えば、本明細書に記載されるORF1分子は、ゼリーロールドメイン、N22ドメイン、及び/又はC末端ドメイン(CTD)の1つ若しくは複数を含む。一部の実施形態では、ゼリーロールドメインは、本明細書に記載される(例えば、表37A~37Cのいずれかに列挙される)ゼリーロールドメインコンセンサス配列を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、N22ドメインは、本明細書に記載される(例えば、表37A~37Cのいずれかに列挙される)N22ドメインコンセンサス配列を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、CTDドメインは、本明細書に記載される(例えば、表37A~37Cのいずれかに列挙される)CTDドメインコンセンサス配列を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、表37A~37Cのいずれかにフォーマット「(Xa-b)」で列挙されるアミノ酸は、連続したシリーズのアミノ酸を含み、その際、このシリーズは、少なくともa、且つ多くともbのアミノ酸を含む。特定の実施形態では、上記シリーズのアミノ酸はすべて同じである。他の実施形態では、上記シリーズは、少なくとも2(例えば、少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、又は21)個の異なるアミノ酸を含む。
一部の実施形態では、アネロソームは、ORF2分子及び/又はORF2分子をコード化する核酸を含む。概して、ORF2分子は、アネロウイルス(Anellovirus)ORF2タンパク質の構造特徴及び/又は活性を有するポリペプチド(例えば、本明細書に記載される、例えば、表A2、A4、A6、A8、A10、A12、C1~C5、2、4、6、8、10、12、14、16、若しくは18のいずれかに列挙されるアネロウイルス(Anellovirus)ORF2タンパク質)、又はその機能性断片を含む。一部の実施形態では、ORF2分子は、表A2、A4、A6、A8、A10、A12、C1~C5、2、4、6、8、10、12、14、16、若しくは18のいずれかに示されるアネロウイルス(Anellovirus)ORF2タンパク質配列に対して少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、若しくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチド(例えば、ORF2モチーフ)は、アミノ酸配列[W/F]X7HX3CX1CX5H(配列番号949)を含み、ここで、Xnは、任意のn個のアミノ酸の連続した配列である。複数の実施形態では、X7は、任意の7アミノ酸の連続した配列を示す。複数の実施形態では、X3は、任意の3アミノ酸の連続した配列を示す。複数の実施形態では、X1は、任意の単一アミノ酸を示す。複数の実施形態では、X5は、任意の5アミノ酸の連続した配列を示す。一部の実施形態では、[W/F]は、トリプトファン又はフェニルアラニンのいずれかであり得る。一部の実施形態では、[W/F]X7HX3CX1CX5H(配列番号949)は、例えば、本明細書に記載されるORF2のN22ドメイン内に含まれる。一部の実施形態では、本明細書に記載される遺伝子エレメントは、アミノ酸配列[W/F]X7HX3CX1CX5H(配列番号949)(Xnは、任意のn個のアミノ酸の連続した配列である)をコード化する核酸配列(例えば、本明細書に記載のように、ORF2分子をコード化する核酸配列)を含む。
一部の実施形態では、アネロソームは、遺伝子エレメントを含む。一部の実施形態では、遺伝子エレメントは、以下の特徴のうち1つ若しくは複数を有する:宿主細胞のゲノムと実質的に相互作用しない、エピソーム核酸である、一本鎖DNAである、環状である、約1~10kbである、細胞の核内に存在する、内在性タンパク質によって結合され得る、宿主又は標的細胞の遺伝子、活性、若しくは機能をターゲティングするポリペプチド若しくは核酸(例えば、RNA、iRNA、microRNA)などのエフェクターを産生する。一実施形態では、遺伝子エレメントは、実質的に非相互作用性DNAである。一部の実施形態では、遺伝子エレメントは、パッケージングシグナル、例えば、キャプシドタンパク質に結合する配列を含む。一部の実施形態では、パッケージング又はキャプシド結合配列の外部で、遺伝子エレメントは、野生型アネロウイルス(Anellovirus)核酸配列に対して70%、60%、50%、40%、30%、20%、10%、5%未満の配列同一性を有し、例えば、本明細書に記載されるアネロウイルス(Anellovirus)核酸配列に対して70%、60%、50%、40%、30%、20%、10%、5%未満の配列同一性を有する。一部の実施形態では、パッケージング又はキャプシド結合配列の外部で、遺伝子エレメントは、アネロウイルス(Anellovirus)核酸配列に対して少なくとも70%、75%、80%、8%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、若しくは100%同一である500、450、400、350、300、250、200、150、若しくは100個未満の連続したヌクレオチドを有する。特定の実施形態では、遺伝子エレメントは、プロモータ配列と、治療用エフェクターをコード化する配列と、キャプシド結合タンパク質と、を含む環状の一本鎖DNAである。
多くのウイルスによって使用される戦略は、ウイルスキャプシドタンパク質が、そのゲノム内の特定のタンパク結合配列を認識することである。例えば、酵母のL-Aウイルスなどの非分節型ゲノムを有するウイルスの場合、ゲノムの5’末端に二次構造(ステムループ)と特定の配列があり、その両方がウイルスキャプシドタンパク質との結合に使用される。しかし、レオウイルス科(Reoviridae)、オルトミクソウイルス科(Orthomyxoviridae)(インフルエンザ)、ブンヤウイルス科(Bunyaviruse)及びアレナウイルス科(Arenaviruses)など、分節型ゲノムを有するウイルスは、ゲノムセグメントの各々をパッケージングする必要がある。一部のウイルスは、ウイルスがそれぞれゲノム分子の1つを含有するのを促進するために、セグメントの相補性領域を使用する。他のウイルスは、様々なセグメントの各々に対して特定の結合部位を有する。例えば、Curr Opin Struct Biol.2010 Feb;20(1):114-120;及びJournal of Virology(2003),77(24),13036-13041を参照されたい。
一部の実施形態では、遺伝子エレメント(例えば、遺伝子エレメントのタンパク結合配列)は、表38及び/又は図20に示す核酸配列に対して少なくとも約75%(例えば、少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、若しくは100%)の同一性を有する核酸配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子エレメント(例えば、遺伝子エレメントのタンパク結合配列)は、表38に示すコンセンサス5’UTR配列の核酸配列を含み、ここで、X1、X2、X3、X4、及びX5は、各々独立に任意のヌクレオチドであり、例えば、X1=G又はT、X2=C又はA、X3=G又はA、X4=T又はC、及びX5=A、C、又はTである)。一部の実施形態では、遺伝子エレメント(例えば、遺伝子エレメントのタンパク結合配列)は、表38に示すコンセンサス5’UTR配列に対して少なくとも約75%(例えば、少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、若しくは100%)の同一性を有する核酸配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子エレメント(例えば、遺伝子エレメントのタンパク結合配列)は、表38に示す例示的なTTV 5’UTR配列に対して少なくとも約75%(例えば、少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、若しくは100%)の同一性を有する核酸配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子エレメント(例えば、遺伝子エレメントのタンパク結合配列)は、表38に示すTTV-CT30F 5’UTR配列に対して少なくとも約75%(例えば、少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、若しくは100%)の同一性を有する核酸配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子エレメント(例えば、遺伝子エレメントのタンパク結合配列)は、表38に示すTTV-HD23a 5’UTR配列に対して少なくとも約75%(例えば、少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、若しくは100%)の同一性を有する核酸配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子エレメント(例えば、遺伝子エレメントのタンパク結合配列)は、表38に示すTTV-JA20 5’UTR配列に対して少なくとも約75%(例えば、少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、若しくは100%)の同一性を有する核酸配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子エレメント(例えば、遺伝子エレメントのタンパク結合配列)は、表38に示すTTV-TJN02 5’UTR配列に対して少なくとも約75%(例えば、少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、若しくは100%)の同一性を有する核酸配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子エレメント(例えば、遺伝子エレメントのタンパク結合配列)は、表38に示すTTV-tth8 5’UTR配列に対して少なくとも約75%(例えば、少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、若しくは100%)の同一性を有する核酸配列を含む。
一部の実施形態では、遺伝子エレメント(例えば、遺伝子エレメントのタンパク結合配列)は、表39及び/又は図20及び32のいずれかに示される核酸配列に対して少なくとも約75%(例えば、少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、若しくは100%)の同一性を有する核酸配列を含む。複数の実施形態では、遺伝子エレメント(例えば、遺伝子エレメントのタンパク結合配列)は、表39に示されるGCリッチ配列に対して少なくとも約75%(例えば、少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、若しくは100%)の同一性を有する核酸配列を含む。
(i)CGCGCTGCGCGCGCCGCCCAGTAGGGGGAGCCATGC(配列番号160);
(ii)GCGCTX1CGCGCGCGCGCCGGGGGGCTGCGCCCCCCC(配列番号164)(X1は、T、G、若しくはAから選択される)
(iii)GCGCTTCGCGCGCCGCCCACTAGGGGGCGTTGCGCG(配列番号165);
(iv)GCGCTGCGCGCGCCGCCCAGTAGGGGGCGCAATGCG(配列番号166);
(v)GCGCTGCGCGCGCGGCCCCCGGGGGAGGCATTGCCT(配列番号167);
(vi)GCGCTGCGCGCGCGCGCCGGGGGGGCGCCAGCGCCC(配列番号168);
(vii)GCGCTTCGCGCGCGCGCCGGGGGGCTCCGCCCCCCC(配列番号169);
(viii)GCGCTTCGCGCGCGCGCCGGGGGGCTGCGCCCCCCC(配列番号170);
(ix)GCGCTACGCGCGCGCGCCGGGGGGCTGCGCCCCCCC(配列番号171);又は
(x)GCGCTACGCGCGCGCGCCGGGGGGCTCTGCCCCCCC(配列番号172);
から選択される。
一部の実施形態では、遺伝子エレメントは、機能性エフェクター、例えば、内在性エフェクター若しくは外性エフェクター、例えば、治療用ポリペプチド又は核酸、例えば、細胞傷害性若しくは細胞溶解性RNA又はタンパク質をコード化する1つ若しくは複数の配列を含んでもよい。一部の実施形態では、機能性核酸は、ノンコーディングRNAである。一部の実施形態では、機能性核酸は、コーディングRNAである。エフェクターは、例えば、酵素活性、遺伝子発現、細胞シグナル伝達、及び細胞若しくは器官機能を増大又は低減するなど、生物活性を調節することができる。エフェクター活性はまた、調節タンパク質と結合して、転写又は翻訳などの調節因子の活性を調節することも含み得る。エフェクター活性は、さらにアクチベータ又はインヒビター機能も含み得る。例えば、エフェクターは、酵素中の基質親和性増大をトリガーすることにより酵素活性を誘導することができ、例えば、フルクトース2,6-ビスホスフェートは、ホスホフルクトキナーゼ1を活性化して、インスリンに応答する糖分解の速度を高める。別の例では、エフェクターは、基質が受容体に結合するのを阻害して、その活性化を遮断することができ、例えば、ナルトレキソン及びナロキソンは、オピオイド受容体に、それらを活性化することなく結合して、受容体が、オピオイドに結合する能力を遮断する。エフェクター活性はまた、タンパク質安定性/分解及び/又は転写物安定性/分解の調節も含み得る。例えば、タンパク質は、分解のためにそれらをマーキングするタンパク質上の、ポリペプチド補因子、ユビキチンにより、分解の目的でターゲティングされ得る。別の例では、エフェクターは、酵素の活性部位を遮断することにより酵素活性を阻害し、例えば、メトトレキサートは、テトラヒドロ葉酸の構造類似体、すなわち、天然基質の1000倍超強度にジヒドロ葉酸レダクターゼに結合して、ヌクレオチド塩基合成を阻害する酵素ジヒドロ葉酸レダクターゼの補酵素である。
一部の実施形態では、エフェクターは調節核酸である。調節核酸は、内在性遺伝子及び/又は外性遺伝子の発現を修飾する。一実施形態では、調節核酸は、宿主遺伝子をターゲティングする。調節核酸として、限定はされないが、外性遺伝子とハイブリダイズする核酸(例えば、本明細書の他所に記載するmiRNA、siRNA、mRNA、lncRNA、RNA、DNA、アンチセンスRNA、gRNA)、ウイルスDNA若しくはRNAなどの外性核酸とハイブリダイズする核酸、RNAとハイブリダイズする核酸、遺伝子転写を妨害する核酸、RNA翻訳を妨害する核酸、分解のターゲティングなどによってRNAを安定化する、若しくは不安定化する核酸、並びにDNA若しくはRNA結合因子を調節する核酸が挙げられる。複数の実施形態では、調節核酸は、miRNAをコード化する。
一部の実施形態では、遺伝子エレメントは、治療用ペプチド又はポリペプチド、例えば、タンパク質代替治療薬をコード化する配列を含む。こうした治療薬として、限定はされないが、低分子ペプチド、ペプチド模倣物(例えば、ペプトイド)、アミノ酸、及びアミノ酸類似体が挙げられる。こうした治療薬は、概して、モル当たり約5,000グラム未満の分子量、モル当たり約2,000グラム未満の分子量、モル当たり約1,000グラム未満の分子量、モル当たり約500グラム未満の分子量、並びにこうした化合物の塩、エステル、及び他の薬学的に許容される形態を有する。こうした治療薬として、限定はされないが、神経伝達物質、ホルモン、薬物、毒素、ウイルス若しくは微生物粒子、合成粒子、及びそれらのアゴニスト又はアンタゴニストが挙げられる。
一部の実施形態では、遺伝子エレメントは、調節配列、例えば、プロモータ又はエンハンサーを含み、エフェクターをコードする配列に作動可能に連結される。
一部の実施形態では、アネロソーム、例えば、合成アネロソームの遺伝子エレメントは、1つ又は複数の複製タンパク質をコード化する配列を含んでもよい。一部の実施形態では、アネロソームは、ローリングサークル複製法、例えば、リーディング鎖の合成により複製することができ、ラギング鎖は結合されない。こうした実施形態では、アネロソームは、3つの追加エレメント:i)イニシエータタンパク質をコード化する遺伝子、ii)二本鎖起点、及びiii)一本鎖起点を含む。複製タンパク質を含むローリングサークル複製(RCR)タンパク質複合体は、リーディング鎖に結合して、複製起点を不安定化する。RCR複合体は、ゲノムを切断して、自由3’OH末端を生成する。細胞DNAポリメラーゼは、自由3’OH末端からウイルスDNA複製を開始する。ゲノムが複製された後、RCR複合体は、ループを共有結合により閉鎖する。これにより、環状プラス一本鎖親DNA分子、及び親マイナス鎖と新しく合成されたプラス鎖とから構成される環状二本鎖DNA分子の放出が起こる。一本鎖DNA分子は、包膜されるか、又は第2ラウンドの複製に参加することができる。例えば、Virology Journal 2009,6:60 doi:10.1186/1743-422X-6-60を参照されたい。
一部の実施形態では、遺伝子エレメントは、産物をコード化する核酸(例えば、リボザイム、タンパク質をコード化する治療用mRNA、外性遺伝子)をさらに含む。
例えば、遺伝子エレメントは、シグナル伝達生化学経路に関連する遺伝子、例えば、シグナル伝達生化学経路関連遺伝子又はポリヌクレオチドを含んでもよい。例として、疾患関連遺伝子又はポリヌクレオチドがある。「疾患関連」遺伝子又はポリヌクレオチドは、非疾患対照の組織若しくは細胞と比較して、疾患に罹患した組織由来の細胞において異常なレベル又は異常な形態で転写若しくは翻訳産物をもたらしているあらゆる遺伝子又はポリヌクレオチドを指す。これは、異常に高いレベルで発現される遺伝子であってもよいし;異常に低いレベルで発現される遺伝子であってもよく、その際、改変された発現は、疾患の発生及び/又は進行と相関する。疾患関連遺伝子はまた、遺伝子プロセシング突然変異又は遺伝子変異とも呼ばれ、これは、疾患の直接の原因であるか、又は病因となる遺伝子との連関不均衡状態にある。
一部の実施形態では、遺伝子エレメントは、少なくとも1つのウイルス配列を含む。一部の実施形態では、これらの配列は、一本鎖DNAウイルス、例えば、アネロウイルス(Anellovirus)、ビドナウイルス(Bidnavirus)、サーコウイルス(Circovirus)、ジェミニウイルス(Geminivirus)、ゲノモウイルス(Genomovirus)、イノウイルス(Inovirus)、ミクロウイルス(Microvirus)、ナノウイルス(Nanovirus)、パルボウイルス(Parvovirus)、及びスピラウイルス(Spiravirus)由来の1つ若しくは複数の配列に対して相同性又は同一性を有する。一部の実施形態では、配列は、二本鎖DNAウイルス、例えば、アデノウイルス(Adenovirus)、アンプラウイルス(Ampullavirus)、アスコウイルス(Ascovirus)、アスファウイルス(Asfarvirus)、バキュロウイルス(Baculovirus)、フセロウイルス(Fusellovirus)、グロブロウイルス(Globulovirus)、グッタウイルス(Guttavirus)、ヒトロサウイルス(Hytrosavirus)、ヘルペスウイルス(Herpesvirus)、イリドウイルス(Iridovirus)、リポスリックスウイルス(Lipothrixvirus)、ニマウイルス(Nimavirus))、及びポックスウイルス(Poxvirus)由来の1つ若しくは複数の配列に対して相同性又は同一性を有する。一部の実施形態では、配列は、RNAウイルス、例えば、アルファウイルス(Alphavirus)、フロウイルス(Furovirus)、肝炎ウイルス(Hepatitis virus)、ホルデイウイルス(Hordeivirus)、トバモウイルス(Tobamovirus)、トブラウイルス(Tobravirus)、トリコルナウイルス(Tricornavirus)、ルビウイルス(Rubivirus)、ビルナウイルス(Birnavirus)、シストウイルス(Cystovirus)、パルティティウイルス(Partitivirus)、及びレオウイルス(Reovirus)由来の1つ若しくは複数の配列に対して相同性又は同一性を有する。
アネロソームの遺伝子エレメントは、遺伝子編集システムの1構成体をコード化する1つ又は複数の遺伝子を含んでもよい。例示的な遺伝子編集システムとして、クラスター化規則間隔短回文反復(clustered regulatory interspaced short palindromic repeat)(CRISPR)システム、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)、及び転写アクチベータ様エフェクターベースヌクレアーゼ(TALEN)がある。ZFN、TALEN、及びCRISPRに基づく方法は、例えば、Gaj et al.Trends Biotechnol.31.7(2013):397-405に記載されており;遺伝子編集のCRISPR法は、例えば、以下:Guan et al.,Application of CRISPR-Cas system in gene therapy:Pre-clinical progress in animal model.DNA Repair 2016 Oct;46:1-8.doi:10.1016/j.dnarep.2016.07.004;Zheng et al.,Precise gene deletion and replacement using the CRISPR/Cas9 system in human cells.BioTechniques,Vol.57,No.3,September 2014,pp.115-124に記載されている。
一部の実施形態では、アネロソーム、例えば、合成アネロソームは、遺伝子エレメントを閉じ込めるタンパク性外層を含む。タンパク性外層は、哺乳動物において免疫応答を誘発することができない実質的に望ましくない非病原性の外部タンパク質を含むことができる。アネロソームのタンパク質性外層は、典型的に、実質的に非病原性のタンパク質を含み、これは、自己集合して、タンパク質性外層を構成する二十面体を形成し得る。
本明細書に記載の遺伝子エレメントは、ベクター内に含有させてもよい。好適なベクター並びにそれらの製造及びそれらの使用方法は、従来技術分野で公知である。
本明細書に記載のアネロソームは、多数の動物モデル及びインビトロモデルで検定することができる。例えば、脊髄性筋萎縮症のマウスモデルを用いて、SMN又はその機能性変異体をコード化するアネロソームの活性を定量することができる。一部の実施形態では、筋ジストロフィーのマウスモデルを用いて、マイクロジストロフィン又はその機能性変異体をコード化するアネロソームの活性を定量することができる。一部の実施形態では、UGT1A1欠損症マウスモデルを用いて、UGT1A1又はその機能性変異体をコード化するアネロソームの活性を定量することができる。
本明細書に記載のアネロソーム又はベクターはまた、例えば、本明細書に記載する通り、製剤用賦形剤と一緒に医薬組成物に含有させてもよい。一部の実施形態では、医薬組成物は、少なくとも105、106、107、108、109、1010、1011、1012、1013、1014、又は1015個のアネロソームを含む。一部の実施形態では、医薬組成物は、105~1015、105~1010、又は1010~1015個のアネロソームを含む。一部の実施形態では、医薬組成物は、約108(例えば、約105、106、107、108、109、又は1010)ゲノム当量/mLのアネロソームを含む。一部の実施形態では、医薬組成物は、例えば、実施例18の方法に従って決定される場合、105~1010、106~1010、107~1010、108~1010、109~1010、105~106、105~107、105~108、105~109、105~1011、105~1012、105~1013、105~1014、105~1015、又は1010~1015ゲノム当量/mLのアネロソームを含む。一部の実施形態では、医薬組成物は、細胞当たりアネロソーム中に含まれる少なくとも1、2、5、若しくは10、100、500、1000、2000、5000、8,000、1×104、1×105、1×106、1×107、又はそれ以上の遺伝子エレメントのコピーを真核細胞の集団に送達する上で十分なアネロソームを含む。一部の実施形態では、医薬組成物は、細胞当たりアネロソーム中に含まれる少なくとも約1×104、1×105、1×106、1×107、又は約1×104~1×105、1×104~1×106、1×104~1×107、1×105~1×106、1×105~1×107、又は1×106~1×107の遺伝子エレメントのコピーを真核細胞の集団に送達する上で十分なアネロソームを含む。
a)(i)非病原性外部タンパク質をコード化する配列と、(ii)非病原性外部タンパク質に遺伝子エレメントを結合させる外部タンパク質結合配列と、(iii)調節核酸をコード化する配列;及び
遺伝子エレメントと結合される、例えば、これを包膜する又は閉じ込めるタンパク質性外層を含む遺伝子エレメントを含むアネロソーム;並びに
b)製剤用賦形剤
を含む医薬組成物を含む。
一部の実施形態では、組成物は、さらに、担体構成体、例えば、マイクロ粒子、リポソーム、小胞、又はエキソソームを含む。一部の実施形態では、リポソームは、内部の水性コンパートメントを取り囲む単一若しくは多重膜脂質二重層と、比較的非透過性の外側親油性リン脂質二重層から構成される球体小胞構造を含む。リポソームは、アニオン性、中性又はカチオン性であってよい。リポソームは、一般に、生体適合性、非毒性であり、親水性及び親油性薬物分子の両方を送達し、それらの積荷を血漿酵素による分解から保護し、生体膜を介してそれらの積荷を輸送することができる(例えば、論文については、Spuch and Navarro,Journal of Drug Delivery,vol.2011,Article ID 469679,12 pages,2011.doi:10.1155/2011/469679を参照)。
本明細書に記載の組成物(例えば、医薬組成物)は、担体を含む、担体と一緒に製剤化される、及び/又は担体を用いて送達され得る。一態様では、本発明は、本明細書に記載の組成物(例えば、本明細書に記載されるアネロソーム、アネロウイルス(Anellovirus)、アネロベクター、若しくは遺伝子エレメント)を含む(例えば、包膜する)担体(例えば、小胞、リポソーム、脂質ナノ粒子、エキソソーム、赤血球、エキソソーム(例えば、哺乳動物若しくは植物エキソソーム)、フソソーム)を含む組成物、例えば、医薬組成物を包含する。
一部の実施形態では、組成物は、細胞内に、又は膜、例えば、細胞若しくは核膜を通して、構成体を運搬するための膜貫通ポリペプチド(MPP)をさらに含む。膜を通した物質の輸送を促進することができる膜貫通ポリペプチドとして、限定はされないが、細胞貫通ペプチド(CPP)(例えば、米国特許第8,6,03,966号明細書を参照)、植物細胞内送達のための融合ペプチド(例えば、Ng et al.,PLoS One,2016,11:e0154081を参照)、タンパク質形質導入ドメイン、Trojanペプチド、及び膜転位シグナル(MTS)(例えば、Tung et al.,Advanced Drug Delivery Reviews 55:281-294(2003)を参照)が挙げられる。いくつかのMPPは、アルギニンなどのアミノ酸が豊富で、陽荷電側鎖を有する。
一態様では、本明細書に記載するアネロソーム又はアネロソームを含む組成物は、さらに1つ又は複数の異種部分を含んでもよい。一態様では、本明細書に記載のアネロソーム又はアネロソームを含む組成物はまた、融合物中に1つ又は複数の異種部分を含み得る。一部の実施形態では、異種部分は、遺伝子エレメントと連結されていてもよい。一部の実施形態では、異種部分は、アネロソームの一部としてタンパク性外層内に閉じ込めてもよい。一部の実施形態では、アネロソームと一緒に異種部分を投与してもよい。
一部の実施形態では、組成物は、さらに、異種部分としてウイルス、例えば、一本鎖DNAウイルス、例えば、アネロウイルス(Anellovirus)、ビドナウイルス(Bidnavirus)、サーコウイルス(Circovirus)、ジェミニウイルス(Geminivirus)、ゲノモウイルス(Genomovirus)、イノウイルス(Inovirus)、ミクロウイルス(Microvirus)、ナノウイルス(Nanovirus)、パルボウイルス(Parvovirus)、及びスピラウイルス(Spiravirus)を含み得る。一部の実施形態では、組成物は、さらに、二本鎖DNAウイルス、例えば、アデノウイルス(Adenovirus)、アンプラウイルス(Ampullavirus)、アスコウイルス(Ascovirus)、アスファウイルス(Asfarvirus)、バキュロウイルス(Baculovirus)、フセロウイルス(Fusellovirus)、グロブロウイルス(Globulovirus)、グッタウイルス(Guttavirus)、ヒトロサウイルス(Hytrosavirus)、ヘルペスウイルス(Herpesvirus)、イリドウイルス(Iridovirus)、リポスリックスウイルス(Lipothrixvirus)、ニマウイルス(Nimavirus)、及びポックスウイルス(Poxvirus)を含み得る。一部の実施形態では、組成物は、さらに、RNAウイルス、例えば、アルファウイルス(Alphavirus)、フロウイルス(Furovirus)、肝炎ウイルス(Hepatitis virus)、ホルデイウイルス(Hordeivirus)、トバモウイルス(Tobamovirus)、トブラウイルス(Tobravirus)、トリコルナウイルス(Tricornavirus)、ルビウイルス(Rubivirus)、ビルナウイルス(Birnavirus)、シストウイルス(Cystovirus)、パルティティウイルス(Partitivirus)、及びレオウイルス(Reovirus)を含み得る。一部の実施形態では、アネロソームは、異種部分としてのウイルスと一緒に投与される。
一部の実施形態では、本明細書に記載の組成物又はアネロソームは、さらに、ターゲティング部分、例えば、標的細胞上に存在する目的の分子に特異的に結合するターゲティング部分を含み得る。ターゲティング部分は、目的の分子又は細胞の特定の機能を調節し、特定の分子(例えば、酵素、タンパク質若しくは核酸)、例えば、経路内の目的の分子の下流の特定の分子を調節する、又は標的に特異的に結合して、アネロソーム若しくは遺伝子エレメントを局在化することができる。例えば、ターゲティング部分は、目的の特定の分子と相互作用して、その機能を増大、低減、又はそうでなければ調節する治療薬を含み得る。
一部の実施形態では、本明細書に記載の組成物又はアネロソームは、さらに、本明細書に記載の組成物又はアネロソームを標識若しくはモニターするためのタグを含み得る。タグ付け又はモニタリング部分は、化学物質又は酵素切断、例えば、タンパク質分解若しくはインテインスプライシングにより除去可能であってもよい。アフィニティタグは、アフィニティ技術を用いてタグ付けされたポリペプチドを精製するのに有用となり得る。いくつかの例として、キチン結合タンパク質(CBP)、マルトース結合タンパク質(MBP)、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ(GST)、及びポリ(His)タグが挙げられる。可溶化タグは、大腸菌(E.coli)などのシャペロン欠失種に発現される組換えタンパク質が、タンパク質の適正な折り畳みを補助し、それらが沈殿するのを防ぐのを助ける上で有用となり得る。いくつかの例として、チオレドキシン(TRX)及びポリ(NANP)が挙げられる。タグ付け又はモニタリング部分は、感光性タグ、例えば、蛍光を含んでもよい。蛍光タグは、視覚化に有用である。GFP及びその変異体が、蛍光タグとして一般に用いられるいくつかの例である。タンパク質タグは、特定の酵素修飾(ビオチンリガーゼによるビオチン化など)又は化学修飾(蛍光イメージングのためのFlAsH-EDT2との反応など)を起こすことが可能である。タグ付け又はモニタリング部分は、タンパク質を複数の他の構成体とつなげるために、結合させることが多い。タグ付け又はモニタリング部分は、また、特定のタンパク質分解又は酵素切断(例えば、TEVプロテアーゼ、トロンビン、Xa因子又はエンテロペプチダーゼによる)によって除去することもできる。
一部の実施形態では、本明細書に記載の組成物又はアネロソームは、さらに、ナノ粒子を含み得る。ナノ粒子としては、約1~約1000ナノメートル、約1~約500ナノメートル、約1~約100nm、約50~約300nm、約75~約200nm、及び約100~約200nm、並びにこれらの間の任意の範囲のサイズを有する無機材料が挙げられる。ナノ粒子は、一般に、ナノ単位の寸法の複合構造を有する。一部の実施形態では、ナノ粒子は、典型的に球体であるが、ナノ粒子組成物に応じて様々な形態が可能である。ナノ粒子に対して外部の環境と接触するナノ粒子の部分は、一般に、ナノ粒子の表面として識別される。本明細書に記載するナノ粒子の場合、サイズ制限を2つの寸法に限定することができ、そのため、ナノ粒子は、約1~約1000nmの直径を有する複合構造を含み、ここで、具体的な直径は、ナノ粒子組成物及び実験設計に従うナノ粒子の意図される使用に応じて変わる。例えば、治療用途に使用されるナノ粒子は、典型的に、約200nm以下のサイズを有する。
一部の実施形態では、本明細書に記載の組成物又はアネロソームは、さらに、小分子を含み得る。小分子として、限定はされないが、概して、モル当たり約5,000グラム未満の分子量を有する、低分子ペプチド、ペプチド模倣物(例えば、ペプトイド)、アミノ酸、アミノ酸類似体、合成ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチド類似体、ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、有機及び無機化合物(ヘテロ有機及び有機金属化合物を含む)、例えば、モル当たり約2,000グラム未満の分子量を有する有機又は無機化合物、例えば、モル当たり約1,000グラム未満の分子量を有する有機又は無機化合物、例えば、モル当たり約500グラム未満の分子量を有する有機又は無機化合物、並びにこうした化合物の塩、エステル、及び他の薬学的に許容される形態が挙げられる。小分子は、限定はされないが、神経伝達物質、ホルモン、薬物、毒素、ウイルス若しくは微生物粒子、合成分子、及びアゴニスト又はアンタゴニストを含み得る。
一部の実施形態では、本明細書に記載の組成物又はアネロソームは、さらに、ペプチド又はタンパク質を含み得る。ペプチド部分として、限定はされないが、ペプチドリガンド又は抗体フラグメント(例えば、細胞外受容体などの受容体に結合する抗体フラグメント)、神経ペプチド、ホルモンペプチド、ペプチド薬、有毒ペプチド、ウイルス若しくは微生物ペプチド、合成ペプチド、及びアゴニスト若しくはアンタゴニストペプチドを挙げることができる。
一部の実施形態では、本明細書に記載の組成物又はアネロソームは、さらに、オリゴヌクレオチドアプタマーを含み得る。アプタマー部分は、オリゴヌクレオチド又はペプチドアプタマーである。オリゴヌクレオチドアプタマーは、一本鎖DNA又はRNA(ssDNA又はssRNA)分子であり、これらは、タンパク質及びペプチドをはじめとする予め選択した標的に、高い親和性及び特異性で結合することができる。
一部の実施形態では、本明細書に記載の組成物又はアネロソームは、さらに、ペプチドアプタマーを含み得る。ペプチドアプタマーは、低分子量、12~14kDaのペプチドを含め、1つ(又は複数の)短い可変ペプチドドメインを有する。ペプチドアプタマーは、細胞内のタンパク質-タンパク質相互作用に特異的に結合し、それを阻害するように、設計することができる。
本発明はさらに、本明細書に記載のアネロソームを含む宿主又は宿主細胞に関する。一部の実施形態では、宿主又は宿主細胞は、植物、昆虫、細菌、真菌、脊椎動物、哺乳動物(例えば、ヒト)、又はその他の生物若しくは細胞である。いくつかの実施形態では、本明細書で確認される通り、提供されるアネロソームは、多種多様な宿主細胞に感染する。標的宿主細胞は、中胚葉、内胚葉、又は外胚葉由来の細胞を含む。標的宿主細胞として、例えば、上皮細胞、筋肉細胞、白血球(例えば、リンパ球)、腎組織細胞、肺組織細胞が挙げられる。
本明細書に記載のアネロソーム及びアネロソームを含む組成物は、例えば、それを必要とする被験者(例えば、哺乳動物被験者、例えば、ヒト被験者)の疾患、障害、又は状態を治療する方法に用いることができる。本明細書に記載の医薬組成物の投与は、例えば、非経口(静脈内、腫瘍内、腹腔内、筋肉内、体腔内、及び皮下を含む)投与により実施してよい。アネロソームは、単独で投与してもよいし、又は医薬組成物として製剤化してもよい。
遺伝子エレメントの生産
アネロソームの遺伝子エレメントを製造する方法は、例えば、Khudyakov & Fields,Artificial DNA:Methods and Applications,CRC Press(2002);in Zhao,Synthetic Biology:Tools and Applications,(First Edition),Academic Press(2013);及びEgli & Herdewijn,Chemistry and Biology of Artificial Nucleic Acids,(First Edition),Wiley-VCH(2012)に記載されている。
一部の実施形態では、タンパク質性外層中にパッケージングしようとする遺伝子エレメントは、一本鎖環状DNAである。遺伝子エレメントは、いくつかの事例において、一本鎖環状DNA以外の形態で宿主細胞に導入され得る。例えば、遺伝子エレメントは、二本鎖環状DNAとして宿主細胞に導入される。次に、二本鎖環状DNAを宿主細胞(例えば、ローリングサークル複製に好適な酵素、例えば、Rep68/78、Rep60、RepA、RepB、Pre、MobM、TraX、TrwC、Mob02281、Mob02282、NikB、ORF50240、NikK、TecH、OrfJ、若しくはTraIを含む宿主細胞、例えば、Wawrzyniak et al.2017,Front.Microbiol.8:2353に記載される通り;列挙される酵素に関して、参照により本明細書に組み込む)中で一本鎖環状DNAに変換することができる。一部の実施形態では、二本鎖環状DNAは、例えば、実施例35に記載されるように、インビトロ環状化によって生産される。一般に、インビトロ環状化DNA構築物は、パッケージングしようとする遺伝子エレメントの配列を含むプラスミドを消化して、遺伝子エレメント配列が線状DNA分子として切除されるようにすることにより、生産することができる。得られた線状DNAは、例えば、DNAリガーゼを用いて、後に連結することにより、二本鎖環状DNAを形成することができる。いくつかの事例において、インビトロ環状化により生産された二本鎖環状DNAは、例えば、本明細書に記載される通り、ローリングサークル複製に付すことができる。理論に束縛されることは意図しないが、インビトロ環状化により、二本鎖環状DNAが得られ、これをそれ以上修飾せずにローリングサークル複製に付すことによって、例えば、本明細書に記載のようなアネロソームにパッケージングする上で好適なサイズの一本鎖環状DNAを生産することができることが考えられる。一部の実施形態では、二本鎖環状DNA構築物は、プラスミド(例えば、細菌プラスミド)より小さい。一部の実施形態では、二本鎖環状DNAをプラスミド(例えば、細菌プラスミド)から切除した後、例えば、インビトロ環状化により、環状化する。
遺伝子エレメント及び本明細書に記載のように作製した遺伝子エレメントを含むベクターは、アネロソームを適切な宿主細胞に発現させるための様々な方法で使用することができる。一部の実施形態では、遺伝子エレメント及び遺伝子エレメントを含むベクターを適切な宿主細胞にトランスフェクトすると、得られたRNAが、アネロソーム遺伝子産物、例えば、高レベルの非病原性タンパク質及びタンパク質結合配列の発現を指令し得る。高レベルの発現をもたらす宿主細胞系は、ウイルス機能を供給する連続細胞株、例えば、APV又はMPVにそれぞれ重感染した細胞株、APV又はMPV機能を補完するように操作された細胞株が挙げられる。
組成物(例えば、本明細書に記載のアネロソームを含む医薬組成物)は、薬学的に許容される賦形剤を含むように、製剤化してもよい。医薬組成物は、任意選択で、1つ又は複数の追加活性物質、例えば、治療及び/又は予防に有効な物質を含んでもよい。本発明の医薬組成物は、滅菌及び/又はパイロジェンフリーであってもよい。医薬剤の製剤化及び/又は製造に関する一般指針は、例えば、Remington:The Science and Practice of Pharmacy 21st ed.,Lippincott Williams & Wilkins,2005(参照により本明細書に組み込む)に見出すことができる。
実施例1:アネロソームの調製:インターフェロン(IFN)発現を阻害するアネロソームの設計及び合成。
実施例2:アネロソーム(アネロソームA及び/又はB)のラージスケール生産:アネロソームの生産及び増殖
実施例3:インビトロでのアネロソーム(アネロソームA)の効果:細胞感染後のアネロソームの発現及びエフェクター機能、例えば、miRNAの発現のインビトロ評価
実施例4:アネロソーム(アネロソームA)の免疫作用:投与後のアネロソームのインビボエフェクター機能、例えば、miRNAの発現
実施例5:合成アネロソームの調製:合成アネロソームのインビトロ生産
実施例6:アネロソームのアセンブリ及び感染:実施例5に記載する通り、合成DNA配列を用いた感染性アネロソームのインビトロ産生
実施例7:アネロソームの選択性:インビトロで生産された合成アネロソームは、様々な組織に由来する細胞株に感染する
実施例8:タンパク質結合配列の同定及び使用:アネロウイルス(Anellovirus)ゲノム内の推定タンパク質結合部位
実施例9:アネロウイルス(Anellovirus)ゲノム
実施例10:アネロウイルス(Anellovirus)ゲノムへの様々な長さのヌクレオチド挿入:アネロウイルス(Anellovirus)ゲノムへの様々な長さのDNA配列の付加
実施例11:送達しようとする例示的な積荷:アネロソーム内の例示的なクラスの核酸及びタンパク質ペイロード
実施例12:例示的なペイロード組込み遺伝子座
実施例13:アネロウイルス(Anellovirus)の規定カテゴリー及びその保存領域
実施例14:複製欠損アネロソーム及びヘルパーウイルス
実施例15:複製可能アネロソームの製造方法
実施例16:複製欠損アネロソームの製造方法:複製欠損アネロソームの回収及び生産スケール拡大方法
実施例17:懸濁細胞を用いたアネロソームの生産:懸濁液中の細胞におけるアネロソームの生産
実施例18:qPCRによるアネロソームゲノム当量の定量:アネロソームを定量するための加水分解プローブに基づく定量PCRアッセイの開発
実施例19:マウスにおいて外性タンパク質を発現させるためのアネロソームの使用:機能性モデルタンパク質をインビボで発現させるためのアネロソームの使用
実施例20:アネロソームDNAが宿主ゲノムに組み込まれたか否かを決定するためのゲノムアラインメント
実施例21:宿主ゲノムへのアネロソーム組込みの評価
実施例22:外性microRNA配列を発現するアネロソームの機能効果:機能性核酸エフェクターを発現させるためのアネロソームの使用
実施例23:外性ノンコーディングRNAを発現するためのアネロソームの調製及び生産:外性低分子ノンコーディングRNAを発現するためのアネロソームの使用
実施例24:アネロウイルス(Anellovirus)クレードにおける保存:アルファトルクウイルス(alphatorquevirus)属の7つのクレードの同定
実施例25:アネロソームからの内在性miRNAの発現及び内在性miRNAの欠失
実施例26:アネロウイルス(Anellovirus)ORFの局在化
実施例27:アネロソーム作製に必要な領域の特性決定
実施例28:インビボでの外性タンパク質のアネロソーム送達:この実施例は、投与後のアネロソームのインビボでのエフェクター機能(例えば、タンパク質の発現)を実証する。
実施例29:アネロウイルス(Anellovirus)における前駆体miRNA(pre-mIR)の同定:様々なアネロウイルス(Anellovirus)によりコード化される新たな前駆体miRNAを同定するための計算及び実験アプローチ
実施例30:アネロウイルス(Anellovirus)pre-miRの内在性標的の決定:内在性標的、並びにアネロウイルス(Anellovirus)の様々な株によりコード化されるpre-miRの潜在的治療関連標的経路を決定するための分析
実施例31:ネイティブアネロウイルス(Anellovirus)pre-miRをコード化するアネロソームの作製:ネイティブアネロウイルス(Anellovirus)pre-miRを発現するアネロソームの複製又は非複製形態のいずれかをパッケージングする方法
実施例32:インビトロ細胞培養モデルにおける腫瘍抑制因子としてのアネロウイルス(Anellovirus)pre-miRの使用:例えば、実施例29に記載される分析から腫瘍抑制性であると同定された候補pre-miRの表現型
実施例33:インビボでの腫瘍抑制因子としてのアネロウイルス(Anellovirus)pre-miRの使用:例えば、実施例32に記載されるインビトロ分析からの腫瘍抑制性アネロウイルス(Anellovirus)pre-miR及び癌細胞株の腫瘍抑制効果を確認するためのインビボ実験
実施例34:アネロウイルス(Anellovirus)ゲノムのタンデムコピー
実施例35:インビトロで環状化したアネロウイルス(Anellovirus)ゲノム:最小非ウイルスDNAと共に、環状二本鎖環状アネロウイルス(Anellovirus)ゲノムDNAを含む構築物
実施例36:ORF1のモデル化と、保存残基及びドメインの同定:ベータトルクウイルス(Betatorquevirus)のORF1タンパク質のモデル化及び推定ドメインの画定
実施例37:異なるトルク・テノウイルス(Torque Teno Virus)株由来の超可変ドメインを含むキメラORF1を含有するアネロソームの生産
実施例38:超可変ドメインの代わりに非TTVタンパク質/ペプチドを含有するキメラORF1の生産
実施例39:インビボでの分泌酵素のアネロソーム送達
実施例40:DNAペイロードを保有するアネロソームの設計
実施例41:各々が肺癌細胞へのEPO遺伝子の形質導入を達成したtth8及びLY2に基づくアネロソーム
実施例42:治療用トランスジーンを含むアネロソームは、静脈内(i.v.)投与後にインビボで検出することができる。
実施例43:アネロウイルス(Anellovirus)中のコーディング配列のサイズ分布
実施例44:ORF2を特性決定するための高度に保存されたモチーフ
実施例45:ヒトにおける完全長アネロウイルス(Anellovirus)ORF1mRNAのエビデンス
実施例46:アネロソームをインビトロで生産するための投入材料としてのインビトロ環状化ゲノム
実施例47:アネロウイルス(Anellovirus)ORF1中の保存二次構造モチーフの同定
この実施例では、インターフェロン(IFN)発現を阻害する合成アネロソームの設計及び合成を説明する。
この実施例では、アネロソームの生産及び増殖を説明する。
この実施例は、細胞感染後のアネロソームの発現及びエフェクター機能、例えば、miRNAの発現のインビトロ評価を説明する。
この実施例は、投与後のアネロソームのインビボエフェクター機能、例えば、miRNAの発現を説明する。
この実施例は、合成アネロソームのインビトロ産生を実証する。
この実施例は、実施例5に記載する通り、合成DNA配列を用いた感染性アネロソームのインビトロ産生の達成を実証する。
この実施例は、インビトロで生産された合成アネロソームが、様々な組織に由来する細胞株に感染する能力を実証する。
この実施例は、例えば、本明細書に記載のアネロソームにおいて、エフェクターを増幅及びパッケージングするために用いることができるアネロウイルス(Anellovirus)ゲノム内の推定タンパク質結合部位を説明する。一部の事例では、タンパク質結合部位は、キャプシドタンパク質などの外部タンパク質と結合することができると考えられる。
この実施例は、アネロウイルス(Anellovirus)ゲノムにおける欠失を説明する。
この実施例は、アネロウイルス(Anellovirus)ゲノムへの様々な長さのDNA配列の付加を説明し、これは、一部の事例において、本明細書に記載のアネロソームを作製するために用いることができる。
この実施例は、例えば、本明細書に記載するアネロソーム、例えば、アネロウイルス(Anellovirus)に基づくアネロソームを用いて送達することができる例示的なクラスの核酸及びタンパク質ペイロードを説明する。
この実施例は、核酸ペイロードを挿入することができるTTV-tth8(GenBankアクセッション番号:AJ620231.1)及びTTMV-LY2(GenBankアクセッション番号:JX134045)のゲノム内の例示的な遺伝子座を説明する。
ヒトに存在する3つのアネロウイルス(Anellovirus)属がある:アルファトルクウイルス属(Alphatorquevirus)(トルク・テノウイルス(Torque Teno Virus)、TTV)、ベータトルクウイルス属(Betatorquevirus)(トルク・テノミディウイルス(Torque Teno Midi Virus)、TTMDV)、及びガンマトルクウイルス属(Gammatorquevirus)(トルク・テノミニウイルス(Torque Teno Mini Virus)、TTMV)。アルファトルクウイルス属(Alphatorquevirus)は、少なくとも5つ(例えば、7つ)の十分に支持される系統発生クレードがある(図11C)。本明細書に記載のアネロソームを生産するために、アネロウイルス(Anellovirus)のいずれかをウイルス源(例えば、ウイルスDNA配列の供給源)として用いることができると考えられる。
アネロソームの複製及びパッケージングのために、いくつかのエレメントをトランスで提供することができる。これらは、DNA複製又はパッケージングを指令若しくは支持するタンパク質又はノンコーディングRNAを含む。トランスエレメントは、一部の事例において、ヘルパーウイルス、プラスミドなどのアネロソームに代わる供給源、又は細胞ゲノムから供給することができる。
この実施例は、複製可能アネロソームの回収及びその生産のスケール拡大方法を説明する。アネロソームは、細胞内で複製するのに必要な全ての遺伝子エレメント及びORFをそのゲノムにコード化するとき、複製可能である。これらのアネロソームは、その複製に欠損がないため、トランで提供される補完活性を必要としない。しかしながら、これらは、転写のエンハンサー(例えば、酪酸ナトリウム)又はウイルス転写因子(例えば、アデノウイルスE1、E2、E4、VA;HSV Vp16及び前初期タンパク質)などのヘルパー活性を必要とし得る。
この実施例は、複製欠損アネロソームの回収及び生産スケール拡大方法を説明する。
この実施例は、懸濁液中の細胞におけるアネロソームの生産を説明する。
この実施例は、アネロソームを定量するための加水分解プローブベースの定量PCRアッセイの開発を明らかにする。最終ユーザ最適化を含むソフトウェアGeneiousを用いて、TTV(アクセッション番号:AJ620231.1)及びTTMV(アクセッション番号:JX134045.1)の選択ゲノム配列に基づいて複数セットのプライマー及びプローブを設計した。プライマー配列を以下の表44に示す。
この実施例は、マウスにおいてホタルルシフェラーゼタンパク質を発現するように、トルク・テノミニウイルス(Torque Teno Mini Virus)(TTMV)が操作されているアネロソームの使用を説明する。
この実施例は、トルク・テノウイルス(Torque Teno Virus)(TTV)がヒトゲノムに組み込まれたか否かを調べることによって、アネロソームDNAが宿主ゲノムに組み込まれ得るか否かを決定するために実施されるコンピュータ分析を説明する。
この実施例では、A549細胞(ヒト肺癌細胞株)及びHEK293T細胞(ヒト胎児腎細胞株)をアネロソーム粒子又はAAV粒子のいずれかに、5、10、30若しくは50のMOIで感染させる。感染から5時間後、細胞をPBSで洗浄してから、新鮮な増殖培地に取り換える。次に、細胞を37℃及び5%二酸化炭素で増殖する。感染から5日後、細胞を採取し、ゲノムDNA抽出キット(Qiagen)を用いて、これらを処理することにより、ゲノムDNAを採取する。また、非感染細胞(陰性対照)からもゲノムDNAを採取する。Nextera DNAライブラリー調製キット(Illumina)を用いて、製造者のプロトコルに従い、これらの採取したDNAについて全ゲノムシーケンシングライブラリーを調製する。NextSeq 550システム(Illumina)を用いて、製造者のプロトコルに従い、DNAライブラリーをシーケンシングする。シーケンシングデータを参照ゲノムに対してアセンブルし、分析して、アネロソーム又はAAVゲノムと宿主ゲノム同士のジャンクションを探す。ジャンクションが検出される場合、これらを、PCRによるシーケンシングライブラリー調製前の元のゲノムDNAサンプル中で確認する。ジャンクションを含み、それを取り囲む領域を増幅するように、プライマーを設計する。qPCRによりジャンクションの数(組込み事象を表す)及びサンプル中のアネロソームコピーの総数を定量することによって、宿主ゲノムへのアネロソームの組込みの頻度を決定する。この比率をAAVのものと比較することができる。
この実施例には、ネイティブプロモータを用いた、アネロソームゲノムからの外性miRNA(miR-625)の発現の達成を実証する。
i)空のプラスミドバックボーン
ii)内在性miRNAがノックアウト(KO)されたTTV-tth8ゲノムを含有するプラスミド
iii)内在性miRNAが非ターゲティングスクランブルmiRNAで置換されているTTV-tth8
iv)内在性miRNAが、miR-625をコード化するmiRNAで置換されているTTV-tth8
この実施例は、外性低分子ノンコーディングRNAを発現するためのアネロソームの合成及び生産を説明する。
この実施例は、アルファトルクウイルス(alphatorquevirus)属の7つのクレードの同定を説明する。これらのクレード間の代表的な配列は、配列全域で54.7%のペアワイズ同一性を示した(図18)。ペアワイズ同一性は、オープンリーディングフレーム間で最も低く(約48.8%)、ノンコーディング領域でより高い(5’NCRで69.1%、3’NCRで74.6%)(図18)。これは、ノンコーディング領域内のDNA配列又は構造が、ウイルス複製に重要な役割を果たすことを示唆している。
1つの実施例では、修飾TTV-tth8株ゲノム(実施例27に記載されるように、GCリッチ領域中の欠失でTTV-tth8株ゲノムを修飾した)を含むアネロソームを用いて、培養中のRaji B細胞を感染させた。これらのアネロソームは、TTV-tth8アネロウイルス(Anellovirus)の内在性ペイロードをコード化する配列(n-myc相互作用タンパク質(NMI)をコード化するmRNAをターゲティングするmiRNAである)を含み、これらは、アネロウイルス(Anellovirus)ゲノムを含むプラスミドを宿主細胞内に導入することによって生産した。NMIは、JAK/STAT経路の下流で作動して、インターフェロン刺激遺伝子、増殖及び成長遺伝子、並びに炎症反応の媒介物質をはじめとする多様な細胞内シグナルの転写を調節する。図22に示すように、標的Raji B細胞中にウイルスゲノムが検出された。対照細胞と比較して、標的Raji B細胞中にNMIのノックダウンの達成が観察された(図23)。NMIに対するmiRNAを含むアネロソームは、対照細胞と比較して、NMIタンパク質レベルの75%超の低下を誘導した。この実施例は、ネイティブアネロウイルス(Anellovirus)miRNAを含むアネロソームが、宿主細胞中の標的分子をノックダウンすることができることを実証する。
この実施例は、アネロウイルス(Anellovirus)の様々なORFの新たな機能性を説明する。この実施例では、各ORFのN末端側で、タグ付けされたタンパク質(即ち、ナノルシフェラーゼ)の下流に推定オープンリーディングフレーム(ORF配列を設計した。各ORF-nLucプラスミドは、化学トランスフェクションにより12ウェルプレート内の5E+05細胞中に、又はエレクトロポレーションにより懸濁液中の5E+05細胞中に導入した。最適な期間後(例えば、トランスフェクションから3~7日後)に、PBS中の4%パラホルムアルデヒド(ThermoFisher cat♯28908)で細胞を固定し、0.5%Triton X-100で透過処理してから、ウサギポリクローナル抗nLuc抗体(Promega Corp.からの親切な寄贈品)、続いてヤギ抗ウサギAlexa488(ThermoFisher cat♯A-11008)共役二次抗体でnLucを染色した。DAPI(ThermoFisher cat♯D3571)で核を染色した。染色した細胞は、タグ付けしたタンパク質細胞局在化について、20×対物レンズ及びモノクロームAxiocam506カメラを備えるZeiss AxioVert A1で視覚化した。
この実施例は、ウイルス複製及びアネロソーム生産に十分なゲノムの部分の特性決定に役立つアネロウイルス(Anellovirus)ゲノム中の欠失を説明する。ORF下流のTTV-tth8のノンコーディング領域(NCR)中に一続きの欠失を作製した(nts3016~3753)。36ヌクレオチド(nt)配列(CGCGCTGCGCGCGCCGCCCAGTAGGGGGAGCCATGC(配列番号160))をGC領域から欠失させた(Δ36nt(GC)と称する)。さらに、78-ntpre-microRNA配列
を3’NCRから欠失させた(Δ36nt(GC)ΔmiRと呼称)。最後に、Δ36nt(GC)の3’NCR中の追加171ntsを欠失させ
、Δ3’NCRと称した(表26)。2μgの環状pTTV-tth8(WT)、pTTV-tth8(Δ36nt(GC))、pTTV-tth8(Δ36nt(GC)ΔmiR)、pTTV-tth8(Δ3’NCR)DNAプラスミド(それぞれ前述した改変3’NCRTTV-tth8を保有する)を、リポフェクタミン2000を用いた12ウェルプレート中の60%密集のHEK293に、3回反復でトランスフェクトした。トランスフェクションから48時間後、細胞ペレットを回収し、溶解させて、mRNA転写物を単離した(RNeasy,Qiagen cat♯74104)後、cDNAに変換した(High-Capacity cDNA Reverse Transcription kit,ThermoFisher,cat♯4368814)。全てのサンプルに対してqPCRを実施して、各欠失を含むウイルス転写物発現を測定した後、GAPDHの内標準mRNAに対して正規化した。
この実施例は、投与後のアネロソームのインビボでのエフェクター機能(例えば、タンパク質の発現)を実証する。
この実施例は、多様なアネロウイルス(Anellovirus)によりコード化される新たな前駆体miRNAを同定するための様々な計算及び実験アプローチを説明する。
アネロウイルス(Anellovirus)株は、ヌクレオチド配列のレベルが互いに極めて異なっている。しかし、アネロウイルス(Anellovirus)株、特に同じクレードのものは、プロモータ、GCリッチ領域、ノンコーディング領域、及びコーディング領域など様々な成分のゲノム機構に関して互いにかなりの類似性を呈示し得る(例えば、図29Dを参照)。本明細書には、多様なアネロウイルス(Anellovirus)株(そのpre-miR配列は不明)のpre-miR配列を、そのpre-miR配列が実験によって既に確認されているアネロウイルス(Anellovirus)株とアラインメントすることにより、予測する方法が記載される。
1つの実施例では、新たなアネロウイルス(Anellovirus)コード化pre-miRNAを見出すために、アネロに感染したヒト組織又は血液サンプルに対してハイスループット低分子RNAシーケンシングを実施する。これを実施するために、均質化したヒト組織サンプル又はヒト血液サンプルからRNAを採取する。低分子RNAライブラリーを調製し、Illuminaキット及びシーケンシングプラットホームを用いてシーケンシングする。BaseSpace Sequence Hub(Illumina)によりシーケンシングリードを保存、アラインメント、及び解析する。
この実施例は、内在性標的、並びにアネロウイルス(Anellovirus)の様々な株によりコード化されるpre-miRの潜在的治療関連標的経路を決定するための分析を説明する。
この実施例は、ネイティブアネロウイルス(Anellovirus)pre-miRを発現するアネロソームの複製又は非複製形態のいずれかをパッケージングする方法を説明する。
この実施例は、例えば、実施例29に記載されるような分析から腫瘍抑制性として同定された候補pre-miRの表現型効果を確認するための試験を説明する。
この実施例は、実施例32に記載されるようなインビトロ分析から、ショートリストに掲載される腫瘍抑制性アネロウイルス(Anellovirus)pre-miR及び癌細胞株についての腫瘍抑制効果を確認するためのインビボ実験を説明する。
この実施例は、上流ゲノムのGCリッチ領域が、下流ゲノムの5’領域付近(図31A)に位置するようにタンデムで配列された、単一アネロウイルスゲノムの2つのコピーを含むプラスミドに基づく発現ベクターを説明する。
この実施例は、最小非ウイルスDNAと共に、環状二本鎖環状アネロウイルス(Anellovirus)ゲノムDNAを含む構築物を説明する。これらの環状ウイルスゲノムは、野生型アネロウイルス(Anellovirus)複製中に見出される二本鎖DNA中間体と、より高度に一致する。細胞に導入したら、最小非ウイルスDNAを含むこのような環状の二本鎖アネロウイルス(Anellovirus)ゲノムDNAをローリングサークル複製に付して、例えば、本明細書に記載される遺伝子エレメントを生産することができる。
この実施例は、ベータトルクウイルス(Betatorquevirus)のORF1タンパク質のインシリコモデル化、並びに構造モチーフ及びアミノ酸保存/類似性に基づく推定ドメインの画定を説明する。
この実施例は、ORF1アルギニンリッチ領域、ゼリーロールドメイン、N22、及び1つのTTV株のC末端ドメイン、及び異なるTTV株のORF1タンパク質由来の超可変ドメインを含むキメラアネロソームを生産するための、ORF1の超可変領域のドメインスワッピングを説明する。
この実施例は、1つのTTV株のアルギニンリッチ領域、ゼリーロールドメイン、N22、及びC末端ドメインと、超可変ドメインの代わりに非TTVタンパク質/ペプチドと、を含有するキメラORF1タンパク質を生産するための、目的の他のタンパク質又はペプチドを含むORF1の超可変ドメインの置換を説明する。
この実施例は、投与後にアネロソームにより送達された分泌酵素のインビボエフェクター機能を説明する。
この実施例は、trans遺伝子を保有する例示的なアネロソーム遺伝子エレメントの設計を説明する。遺伝子エレメントは、例えば、タンパク質若しくはノンコーディングRNA発現遺伝子を含み得る非アネロウイルス(Anellovirus)ペイロードと一緒に、アネロウイルス(Anelloviridae)科のメンバー由来の必須cis複製及びパッケージングドメインから構成される。アネロソームは、複製及びパッケージングのための必須transタンパク質エレメントが欠失しているため、ローリングサークル複製及びキャプシド形成のための他の供給源(例えば、ヘルパー、例えば、複製ウイルス、発現プラスミド、若しくはゲノム組込み)により供給されるタンパク質を必要とする。
この実施例では、エリスロポエチン遺伝子(EPO)を担持する2つの異なるアネロソームを用いて、非小細胞肺癌株(EKVX)を形質導入した。アネロソームは、本明細書に記載される通り、インビトロ環状化により作製したが、これらは、LY2又はtth8バックボーンに基づく2つのタイプのアネロソームを含んだ(例えば、それぞれ、表15及び16、又は表5及び6に記載される通り)。LY2-EPO及びtth8-EPOアネロソームは各々、EPOコード化カセット及びLY2又はtth8ゲノムのノンコーディング領域(5’UTR、GCリッチ領域)をそれぞれ含むが、例えば、実施例40に記載のような、アネロウイルス(Anellovirus)ORFは含まない遺伝子エレメントを含んだ。細胞に精製アネロソーム又は陽性対照(高用量又はアネロソームと同じ用量のAAV2-EPO)を接種した後、7日間インキュベートした。アネロウイルス(Anellovirus)ORFを個別のインビトロ環状化DNAにtransで供給した。インキュベーションから3、5.5、及び7日後に培養上清をサンプリングし、市販のELISAキットを用いて検定し、EPOを検出した。LY2-EPO及びtth8-EPOアネロソームのいずれも、良好に細胞に形質導入され、非処理(陰性)対照細胞と比較して、有意に高いEPO力価を示した(全時点で、P<0.013)(図40)。
この実施例では、静脈内(i.v.)投与後に、ヒト成長ホルモン(hGH)をコード化するアネロソームをインビボで検出した。LY2バックボーンを基材とし、且つ外性hGHをコード化する複製欠損アネロソーム(LY2-hGH)を、本明細書に記載されるインビトロ環状化により作製した。LY2-hGHアネロソームの遺伝子エレメントは、LYノンコーディング領域(5’UTR、GCリッチ領域)及びhGHコード化カセットを含むが、例えば、実施例40に記載のように、アネロウイルス(Anellovirus)ORFは含まなかった。LY2-hGHアネロソームをマウスに静脈内投与した。アネロウイルス(Anellovirus)ORFを個別のインビトロ環状化DNAにtransで供給した。手短には、アネロソーム(LY2-hGH)又はPBSを第0日に静脈内注射した(n=4マウス/群)。アネロソームは、マウス当たり4.66E+07アネロソームゲノムで、独立した動物群に投与した。
内部で同定した野生型株の広範なカタログを使用して、全てのアネロウイルス(Anellovirus)のコーディング配列(CDS)長さを評価した。アネロウイルス(Anellovirus)のCDS長さをプロットし、3つのヒトアネロウイルス(Anellovirus)属(アルファトルクウイルス(Alphatorquevirus)、α;ベータトルクウイルス Betatorquevirus)、β、及びガンマトルクウイルス(Gammatorquevirus)、γ)の間でウイルス株を比較した後、一般に入手可能なゲノム配列長さを、本発明者らにより内部(社内)でアセンブルしたものと比較した。全てのアネロウイルス(Anellovirus)の平均CDS長さは、約2100ヌクレオチドである。アルファトルクウイルス(Alphatorquevirus)中のTTVは、ベータトルクウイルス(Betatorquevirus)及びガンマトルクウイルス(Gammatorquevirus)属からのアネロウイルス(Anellovirus)(それぞれ、TTVミニ及びTTVミディ)より大きかった。具体的には、アルファトルクウイルス(Alphatorquevirus)TTVでは、2237ヌクレオチドの平均CDSが観察され、1800~2541ヌクレオチドの範囲であった。ベータトルクウイルス(Betatorquevirus)の場合、2011ヌクレオチドの平均CDS長さが認められ、1803~2229ヌクレオチドの範囲であった。ガンマトルクウイルス(Gammatorquevirus)については、2012ヌクレオチドの平均CDS長さが認められ、1812~2379ヌクレオチドの範囲であった。
図43Aの例示的なゲノムに示すように、アネロウイルス(Anellovirus)ORF2は、考えられるホスファターゼ活性を有する構造不定タンパク質をコード化し、ウイルス複製及び宿主免疫の調節に特定の役割を果たすと考えられる。保存ORF2アミノ酸モチーフの存在について、広範なウイルス配列リポジトリを調べた(図43B)。次に、このモチーフを用いて、社内及び公開配列の中から1,000を超えるアネロウイルス(Anellovirus)ORF2配列を同定した。このORF2モチーフは、ヒトアネロウイルス(Anellovirus)株、さらには検定したヒト以外の全てのアネロウイルス(Anellovirus)(げっ歯類、ブタ、及び霊長類アネロウイルス(Anellovirus)、並びにニワトリ貧血ウイルス)の膨大なカタログの間で、依然として保存されていることが判明し、そのため、これまでに同定された中で最も高度に保存されたアネロウイルス(Anellovirus)モチーフである。また、ORF2構造モデル化も実施したが、それにより、ORF2モチーフ中の保存残基は、金属結合ドメインの可能性を示唆する配向と共に、ヘリックスターンヘリックス構造を維持することが明らかにされた(図43C)。興味深いことに、ORF2と比較したORF1の系統樹(図43D)は、アルファトルクウイルス(Alphatorquevirus)、ベータトルクウイルス(Betatorquevirus)、及びガンマトルクウイルス(Gammatorquevirus)による属レベルでの同様の断絶を示したが、これは、ORF2が、属特異的であることを示している。
アネロウイルス(Anellovirus)は、インビトロで少なくとも3つの選択的スプライシング型mRNAを発現し、その最長(約2.2kb)のものが、完全長ORF1をコード化すると予測される。この実施例では、ORF1mRNA転写物をインビボで評価した。
この実施例は、本明細書に記載されるアネロソーム遺伝子エレメントの材料物質としてのインビトロ環状化(IVC)二本鎖アネロウイルスDNAが、予想密度のパッケージ済アネロソームゲノムを取得する上で、プラスミド中のアネロウイルスゲノムDNAよりも頑健であることを実証する。
この実施例では、計算モデル化を用いて、アネロウイルス(Anellovirus)ORF1タンパク質の二次構造中の保存モチーフを同定した。二次構造予測は、プログラムJPredを用いて、単一株に対して実施した。
Claims (54)
- 以下:
(I)以下:
(a)プロモータエレメントと、
(b)外性エフェクターをコード化する核酸配列であって、前記核酸配列が、前記プロモータエレメントに作動可能に連結されており、前記外性エフェクターが、エリスロポエチン(EPO)である、核酸配列と;
(c)以下:
配列番号54のヌクレオチド323~393の核酸配列、若しくはそれに対して少なくとも90%同一の核酸配列を含む5’UTRドメインと、
を含む遺伝子エレメント;
(II)アネロウイルス(Anellovirus)ORF1核酸によりコード化されるポリペプチド、例えばORF1分子を含むタンパク質性外層
を含む合成アネロソームにおいて;
前記遺伝子エレメントが、前記タンパク質性外層内に閉じ込められており;且つ
前記合成アネロソームが、前記遺伝子エレメントをヒト細胞内に送達することができる、合成アネロソーム。 - 前記ORF1分子が、配列番号217のアミノ酸配列、又はそれに対して少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項1に記載の合成アネロソーム。
- 前記ORF1分子が、配列番号54のヌクレオチド612~2612によりコード化される、請求項1又は2に記載の合成アネロソーム。
- 前記遺伝子エレメントが、配列番号54のヌクレオチド2868~2929の核酸配列、又はそれに対して少なくとも85%の配列同一性を有する核酸配列を含む、請求項1~3のいずれか1項に記載の合成アネロソーム。
- 前記ORF1分子が、表16に列挙されるargリッチ領域、ゼリーロールドメイン、超可変ドメイン、N22ドメイン、及び/又はC末端ドメインのアミノ酸配列、又はそれに対して少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列のうち1つ若しくは複数を含むアミノ酸配列を含む、請求項1~4のいずれか1項に記載の合成アネロソーム。
- 前記ORF1分子が、配列番号58のアミノ酸配列、又はそれに対して少なくとも85%の配列同一性を有する核酸配列を含む、請求項1~5のいずれか1項に記載の合成アネロソーム。
- 表16に列挙されるORF2、ORF2/2、ORF2/3、ORF1/1、若しくはORF1/2のアミノ酸配列、又はそれに対して少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをさらに含む、請求項1~6のいずれか1項に記載の合成アネロソーム。
- 前記遺伝子エレメントが、表16に列挙されるORF1、ORF2、ORF2/2、ORF2/3、ORF1/1、若しくはORF1/2のアミノ酸配列、又はそれに対して少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列をコード化する、請求項1~7のいずれか1項に記載の合成アネロソーム。
- 前記合成アネロソームが、表16に列挙されるORF2、ORF2/2、ORF2/3、TAIP、ORF1/1、若しくはORF1/2のアミノ酸配列、又はそれに対して少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドを含まない、請求項1~8のいずれか1項に記載の合成アネロソーム。
- 前記遺伝子エレメントが、表16に列挙されるORF1、ORF2、ORF2/2、ORF2/3、ORF1/1、若しくはORF1/2のアミノ酸配列、又はそれに対して少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列をコード化しない、請求項1~9のいずれか1項に記載の合成アネロソーム。
- 前記ORF1分子が、アミノ酸配列YNPX2DXGX2N(配列番号829)(Xnは、各々独立して、任意のn個のアミノ酸の連続した配列である)を含む、請求項1~10のいずれか1項に記載の合成アネロソーム。
- 前記ORF1分子が、アミノ酸配列YNPX2DXGX2N(配列番号829)とフランキングする第1β鎖及び第2β鎖をさらに含み、例えば、前記第1β鎖は、前記アミノ酸配列YNPX2DXGX2N(配列番号829)のチロシン(Y)残基を含み、且つ/又は前記第2β鎖は、前記アミノ酸配列YNPX2DXGX2N(配列番号829)の第2アスパラギン(N)残基(NからC)を含む、請求項11に記載の合成アネロソーム。
- 前記ORF1分子が、N末端からC末端方向の順で、第1β鎖、第2β鎖、第1αヘリックス、第3β鎖、第4β鎖、第5β鎖、第2αヘリックス、第6β鎖、第7β鎖、第8β鎖、及び第9β鎖を含む、請求項1~12のいずれか1項に記載の合成アネロソーム。
- 前記遺伝子エレメントが、宿主細胞内でのローリングサークル複製により増幅されて、例えば、少なくとも8コピーを産生することができる、請求項1~13のいずれか1項に記載の合成アネロソーム。
- 前記遺伝子エレメントが、一本鎖である、請求項1~14のいずれか1項に記載の合成アネロソーム。
- 前記遺伝子エレメントが、環状である、請求項1~15のいずれか1項に記載の合成アネロソーム。
- 前記遺伝子エレメントが、DNAである、請求項1~16のいずれか1項に記載の合成アネロソーム。
- 前記遺伝子エレメントが、マイナス鎖DNAである、請求項1~17のいずれか1項に記載の合成アネロソーム。
- 前記遺伝子エレメントが、前記細胞に進入する前記アネロソームの10%、8%、6%、4%、3%、2%、1%、0.5%、0.2%、0.1%未満の頻度で組み込まれ、例えば、合成アネロソームは、非統合性である、請求項1~18のいずれか1項に記載の合成アネロソーム。
- 前記遺伝子エレメントが、表16-1に示すコンセンサス5’UTR核酸配列の配列を含む、請求項1~19のいずれか1項に記載の合成アネロソーム。
- 前記遺伝子エレメントが、表16-2に示すコンセンサスGCリッチ領域の配列を含む、請求項1~20のいずれか1項に記載の合成アネロソーム。
- 前記遺伝子エレメントが、少なくとも100ヌクレオチド長の配列を含み、これは、少なくとも70%(例えば、約70~100%、75~95%、80~95%、85~95%、若しくは85~90%)の位置のG又はCから構成される、請求項1~21のいずれか1項に記載の合成アネロソーム。
- 前記遺伝子エレメントが、配列番号120の核酸配列を含む、請求項1~22のいずれか1項に記載の合成アネロソーム。
- 前記プロモータエレメントが、野生型アネロウイルス(Anellovirus)に対して外性である、請求項1~23のいずれか1項に記載の合成アネロソーム。
- 前記プロモータエレメントが、野生型アネロウイルス(Anellovirus)に対して内在性である、請求項1~24のいずれか1項に記載の合成アネロソーム。
- 前記遺伝子エレメントが、約1.5~2.0、2.0~2.5、2.5~3.0、3.0~3.5、3.1~3.6、3.2~3.7、3.3~3.8、3.4~3.9、3.5~4.0、4.0~4.5、又は4.5~5.0kbの長さを有する、請求項1~25のいずれか1項に記載の合成アネロソーム。
- 前記合成アネロソームが、ヒト細胞、例えば、ニューロン(例えば、運動ニューロン)、筋細胞、網膜細胞、肝細胞、血球、皮膚細胞、神経細胞、脂肪細胞、又は内皮細胞に、例えば、インビボで感染することができる、請求項1~26のいずれか1項に記載の合成アネロソーム。
- 実質的に非免疫原性であり、例えば、実施例4に記載の方法に従って検出される場合、例えば、検出可能な及び/又は不要な免疫応答を誘導しない、請求項1~27のいずれか1項に記載の合成アネロソーム。
- 前記実質的に非免疫原性のアネロソームが、被験者において、免疫応答が欠損する対照被験者における効力の少なくとも約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、又は100%である効力を有する、請求項28に記載の合成アネロソーム。
- 少なくとも1000の前記アネロソームの集団が、少なくとも約100コピー(例えば、少なくとも1、2、3、4、5、10、20、30、40、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、又は1000コピー)の遺伝子エレメントを1つ若しくは複数のヒト細胞内に送達することができる、請求項1~29のいずれか1項に記載の合成アネロソーム。
- 以下:
(I)以下:
(a)プロモータエレメント、
(b)外性エフェクターをコード化する核酸配列であって、前記核酸配列は、前記プロモータエレメントに作動可能に連結しており、
ここで、外性エフェクターは、変異すると、ヒトの疾患を引き起こすポリペプチド、又は前記ポリペプチドの機能性変異体を含み、これは、以下:
(i)治療用酵素、
(ii)構造タンパク質、又は
(iii)補体タンパク質
から選択される、核酸配列;及び
(c)配列番号54のヌクレオチド323~393の核酸配列、若しくはそれと少なくとも85%同一の核酸配列を含む5’UTRドメイン
を含む遺伝子エレメント;或いは
(II)ORF1核酸によりコード化されるポリペプチド、例えば、ORF1分子を含む、タンパク質外層
を含む合成アネロソームにおいて;
前記遺伝子エレメントは、前記タンパク質性外層内に閉じ込められており;且つ
前記合成アネロソームは、前記遺伝子エレメントをヒト細胞に送達するように構成されている、合成アネロソーム。 - 請求項1~31のいずれか1項に記載の合成アネロソーム、及び薬学的に許容される担体又は賦形剤を含む、医薬組成物。
- 少なくとも103、104、105、106、107、108、又は109の合成アネロソームを含む、請求項32に記載の医薬組成物。
- 前記医薬組成物が、予め定めた比の粒子:感染性単位(例えば、<300:1、<200:1、<100:1、若しくは<50:1)を有する、請求項32又は33に記載の医薬組成物。
- 以下:
(i)請求項1~31のいずれか1項に記載の合成アネロソームの前記遺伝子エレメントの配列を含む第1核酸(例えば、二本鎖又は一本鎖環状DNA)、及び
(ii)例えば、表16に列挙されるORF1、ORF2、ORF2/2、ORF2/3、ORF1/1、若しくはORF1/2から選択されるアミノ酸配列、又はそれに対して少なくとも85%の配列同一性を有するアミノ酸配列の1つ若しくは複数をコード化する第2核酸配列
を含む、反応混合物。 - 前記第1核酸及び第2核酸が、同じ核酸分子中にある、請求項35に記載の反応混合物。
- 前記第1核酸及び第2核酸が、異なる核酸分子である、請求項35に記載の反応混合物。
- 前記第1核酸及び第2核酸が、異なる核酸分子であり、且つ、前記第2核酸が、二本鎖環状DNAとして提供される、請求項35に記載の反応混合物。
- 前記第1核酸及び第2核酸が、異なる核酸分子であり、且つ、前記第1及び第2核酸が、二本鎖環状DNAとして提供される、請求項35に記載の反応混合物。
- 前記第2核酸配列が、ヘルパー細胞又はヘルパーウイルスに含まれる、請求項37に記載の反応混合物。
- 合成アネロソームを作製する方法であって、前記方法が、以下:
a)以下:
(i)請求項1~31のいずれか1項に記載の合成アネロソームの遺伝子エレメントの前記核酸配列を含む第1核酸分子と、
(ii)例えば、表16のいずれかに列挙される、ORF1、ORF2、ORF2/2、ORF2/3、ORF1/1、若しくはORF1/2から選択されるアミノ酸配列、又はそれに対して少なくとも85%の配列同一性を有するアミノ酸配列の1つ若しくは複数をコード化する第2核酸分子と、
を含む宿主細胞を用意するステップ;及び
b)合成アネロソームを作製するのに好適な条件下で前記宿主細胞をインキュベートするステップを含み、
それによって前記合成アネロソームを作製する方法。 - ステップ(a)の前に、前記第1核酸分子及び/又は前記第2核酸分子を前記宿主細胞に導入するステップをさらに含む、請求項41に記載の方法。
- 前記第2核酸分子が、前記第1核酸分子の前に、それと同時に、又はその後に前記宿主細胞に導入される、請求項42に記載の方法。
- 前記第2核酸分子が、前記宿主細胞のゲノム中に組み込まれる、請求項41又は42に記載の方法。
- 前記第2核酸分子が、ヘルパー(例えば、ヘルパープラスミド又はヘルパーウイルスのゲノム)である、請求項41~44のいずれか1項に記載の方法。
- 第2核酸分子が、アミノ酸配列[W/F]X7HX3CX1CX5H(配列番号949)(Xnは、任意のn個のアミノ酸の連続した配列である)を含むORF2分子をコード化する、請求項41~44のいずれか1項に記載の方法。
- 合成アネロソーム調製物を製造する方法であって、前記方法が、以下:
a)請求項1~31のいずれか1項に記載の複数の合成アネロソーム、請求項32~34のいずれか1項に記載の医薬組成物、又は請求項35~40のいずれか1項に記載の反応混合物を用意するステップ;
b)任意選択で、以下:本明細書に記載の混入物、光学密度測定値(例えば、OD260)、粒子数(例えば、HPLCにより)、感染力(例えば、粒子:感染単位比)のうち1つ又は複数について前記複数を評価するステップ;並びに
c)例えば、(b)のパラメータの1つ又は複数が、指定閾値を満たす場合、例えば、被験者への投与に好適な医薬組成物として、前記複数の合成アネロソームを製剤化するステップ
を含む、方法。 - 以下:
(i)請求項1~31のいずれか1項に記載の合成アネロソームの遺伝子エレメントの前記核酸配列を含む第1核酸分子、及び
(ii)任意選択で、表16のいずれかに列挙されるORF1、ORF2、ORF2/2、ORF2/3、ORF1/1、若しくはORF1/2から選択されるアミノ酸配列、又はそれに対して少なくとも85%の配列同一性を有するアミノ酸配列の1つ若しくは複数をコード化する第2核酸分子;
を含む宿主細胞。 - 外性エフェクター(例えば、治療用外性エフェクター)を哺乳動物細胞に送達する方法において、以下:
(a)請求項1~31のいずれか1項に記載の合成アネロソームを用意するステップ;及び
(b)哺乳動物細胞を前記合成アネロソームと接触させるステップ
を含み;
ここで、前記合成アネロソームは、前記遺伝子エレメントを前記哺乳動物細胞に送達することができ;
任意選択で、前記遺伝子エレメントを宿主細胞中の前記タンパク質性外層内に閉じ込めるのに好適な条件下で、前記遺伝子エレメントを前記宿主細胞に導入することにより、前記合成アネロソームが生産され;
これによって、前記治療用外性エフェクターを前記哺乳動物細胞に送達する、方法。 - 前記遺伝子エレメントの宿主細胞への送達を目的とする、請求項1~31のいずれか1項に記載の合成アネロソーム又は請求項32~34のいずれか1項に記載の医薬組成物の使用。
- 被験者の疾患又は障害の治療を目的とする、請求項1~31のいずれか1項に記載の合成アネロソーム又は請求項32~34のいずれか1項に記載の医薬組成物の使用。
- 被験者の疾患又は障害の治療に使用するための、請求項1~31のいずれか1項に記載の合成アネロソーム又は請求項32~34のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- 被験者の疾患又は障害を治療する方法であって、前記方法が、請求項1~31のいずれか1項に記載の合成アネロソーム又は請求項32~34のいずれか1項に記載の医薬組成物を前記被験者に投与するステップを含む、方法。
- 被験者の疾患又は障害の治療のための薬剤の製造における請求項1~31のいずれか1項に記載の合成アネロソーム又は請求項32~34のいずれか1項に記載の医薬組成物の使用。
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