KR20170091044A

KR20170091044A - Ｆｙｃｏ１으로부터 유래된 자가포식소체 검출용 프로브 및 이의 용도

Info

Publication number: KR20170091044A
Application number: KR1020170012792A
Authority: KR
Inventors: 강봉균; 이진아; 장덕진
Original assignee: 경북대학교 산학협력단; 한남대학교 산학협력단; 서울대학교산학협력단
Priority date: 2016-01-29
Filing date: 2017-01-26
Publication date: 2017-08-08
Also published as: KR101883593B1

Abstract

본 발명은 자가포식소체를 검출하기 위한 프로브에 관한 것으로, 보다 구체적으로, FYCO1 (FYVE and coiled-coil domain containing 1) 유전자 또는 이의 돌연변이로부터 유래한 LIR (LC3-interacting region) 모티프; ApPDE4 (Aplysia phosphodiesterase 4)의 N-말단 소수성 도메인; 및 리포터 형광 단백질 부위를 함유하는 자가포식소체 검출용 프로브 및 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 종래 자가포식소체 검출 방법이 가지고 있었던 LC3 과발현에 의한 다양한 부작용의 문제점을 해결하여 보다 정확하고 특이적으로 자가포식소체를 효과적으로 검출할 수 있게 함으로써, 자식작용에 관련된 생체 내의 다양한 정보를 수득하여 활용할 수 있게 한다.

Description

ＦＹＣＯ１으로부터 유래된 자가포식소체 검출용 프로브 및 이의 용도{Probes for detecting autophagosome derived from FYCO1 and uses thereof}

본 발명은 자가포식소체를 검출하기 위한 프로브에 관한 것으로, 보다 구체적으로, FYCO1 (FYVE and coiled-coil domain containing 1) 유전자 또는 이의 돌연변이로부터 유래한 LIR (LC3-interacting region) 모티프; ApPDE4 (Aplysia phosphodiesterase 4)의 N-말단 소수성 도메인; 및 리포터 형광 단백질 부위를 함유하는 자가포식소체 검출용 프로브 및 이의 용도에 관한 것이다.

자가포식(autophagy) 현상은 기아상태생존, 감염성 세균으로부터의 보호 및 신경붕괴조절과 같은 세포 기능을 하는데 중요한 역할을 하는데, 이는 진화적으로 보존된 과정으로, 이스트에서 포유류에 이르기까지 모든 진핵세포에서 나타난다.

초기에는, 세포질 및 세포 내 기관들은 오토파고좀(autophagosome)이라는 이중막 결합 구조로 퇴화하고, 상기 퇴화된 오토파고좀은 리소좀(lysosome)과 융합하여 오토리소좀(autolysosome)을 형성하며, 상기 오토리소좀에 의해 퇴화된 물질이 가수분해되어 재사용된다. 그러나, 이러한 과정에 내재한 분자적 작용기작은 아직 밝혀지지 않았기 때문에 이를 규명하기 위한 연구가 활발히 진행되고 있다

지금까지 알려진 바에 의하면, 효모, 초파리 등을 대상으로 수행된 다양한 유전학/생화학적 연구를 통하여 세포 내에서 자가포식(autophagy) 현상을 일으키는데 필요한 단백질들이 발굴되었고, 이들의 상관관계를 분석하기 위한 연구가 수행되고 있다. 지금까지 밝혀진 바에 의하면, 자가포식은 유도단계(induction/nucleation), 세포막 변형단계(membrane elongation/closure) 및 포식단계(vesicle trafficking/maturation/fusion/degradation)의 세 가지 단계로 크게 구분된다고 알려져 있다. 또한, 자가포식 경로는 Atg8PE(phosphatidylethanolamine) 또는 Atg12Atg5을 경유하는 두개의 독특한 유비퀴틴-유사 접합 시스템을 포함하는데, 상기 경로는 효모의 Vps34 동족체인 클라스 III PI3K(phosphatidylinositol 3-kinase)과 Beclin1(효모유래 Atg6의 오토로그)으로 구성된 복합체와 함께 오토파고좀 형성에 관련된다.

많은 종류의 세포에서, 성장요소 및 사이토카인에 의한 class I PI3K/AKT 신호 경로의 자극은 자가포식을 억제하는 효과를 나타낸다. 상기 억제 효과는 아마도 오토파지를 하향 조절하는 라파마이신표적(target of rapamycin(TOR)) 키나아제의 class I PI3K/AKT-의존적 활성화 때문인 것으로 예상되고 있다. 예를 들어, PI 3-키나아제 억제제인 워트마닌(wortmannin) 및 3-메틸아데닌(3-MA)으로 처리한 세포에서는 오토파고좀 전구체가 발생하지 않는데, 이는 오토파지성 액포 형성 초기단계에서 PI3K-AKT-mTORC1 신호전달계의 활성 억제의 중요성을 시사한다. 이러한 자가포식 현상의 억제 또는 활성화는 단순한 세포활성 뿐만 아니라, 상기 세포를 포함하는 생체내 생리학적 또는 병리학적 변화에 큰 영향을 미친다.

근래 다양한 동물모델 및 질병의 유전자 분석 연구를 통하여 자가포식과정이 당뇨, 고혈압등의 대사성 질환, 퇴행성 뇌질환, 감염성 질환, 그리고 암등의 매우 다양한 질환에서 중요한 역할을 하고 있음이 보고됨으로써 그 중요성이 부각되고 있다.

따라서 자가포식(autophagy) 작용에 대한 정보를 수득하는 방법은 새로운 작용점을 타겟으로 하는 질병치료제 개발에 매우 중요한 역할을 할 수 있을 것이다.

기존에는 자가포식소체 형성에 직접적으로 관여하는 LC3에 GFP 또는 RFP를 붙인 RFP/GFP-LC3가 일반적으로 자가포식소체를 표지하기 위해 사용되었다. 그러나, LC3 자체가 자가포식소체 형성에 직접 관여하기 때문에, LC3 과발현에 의한 다양한 부작용은 피할 수가 없었다.

이에, 본 발명자들은 자가포식소체를 검출하는 새로운 탐침(프로브)을 개발하기 위해, 기존의 접근법과는 달리 FYCO1 (FYVE & coiled-coil domain containing 1) 유전자 또는 이의 돌연변이로부터 유래한 LIR (LC3-interacting region) 부위에 군소(Aplysia) 유래의 ApPDE4(phosphodiesterase 4) short-form의 N-말단을 결합시키고, 리포터 형광 단백질을 결합시켜 자가포식소체 검출용 프로브를 제작하고, 이의 세포 내 자가포식소체 검출 효과를 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

1. 한국 등록특허 10-1524426 2. 한국 공개특허 10-2015-0129166 3. 한국 공개특허 10-2015-0039894

1. Feng Y, He D, Yao Z, Klionsky DJ. The machinery of macroautophagy. Cell Res 2014; 24:24-41. 2. Pfeifer U. Cellular autophagy and cell atrophy in the rat liver during long-term starvation. A quantitative morphological study with regard to diurnal variations. Virchows Arch B Cell Pathol 1973; 12:195-211. 3. Klionsky DJ. Autophagy: from phenomenology to molecular understanding in less than a decade. Nat Rev Mol Cell Biol 2007; 8:931-7.

본 발명의 주요한 목적은 자가포식소체 검출용 프로브를 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 자가포식소체 검출용 프로브 및 이를 함유하는 벡터를 포함하는 자가포식소체 검출용 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 자가포식소체 검출용 프로브를 이용하여 자식작용에 관한 정보를 제공하는 방법을 제공하는데 있다.

본 발명은 상기 과제를 해결하기 위하여, FYCO1 (FYVE and coiled-coil domain containing 1)으로부터 유래된 LIR (LC3-interacting region) 모티프; ApPDE4 (Aplysia phosphodiesterase 4)의 N-말단 소수성 도메인; 및 리포터 형광 단백질 부위를 함유하는 자가포식소체 검출용 프로브를 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 N-말단 소수성 도메인은 군소에서 유래한 ApPDE4의 짧은 형태의 N 말단 소수성 도메인인 것이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 서열번호 1로 표시되는 30개의 아미노산 서열로 이루어진 것을 사용하고, 가장 바람직하게는 서열번호 2로 표시되는 20개의 아미노산 서열로 이루어진 것을 사용한다. 상기 서열번호 2의 아미노산은 상기 서열번호 1의 30개 아미노산 서열에 기초하여, 10개 아미노산 잔기(RQSGRKSSTD)를 결실시킨 코어 소수성 잔기에 해당한다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 FYCO1 (FYVE and coiled-coil domain containing 1) 유전자는 인간 유래의 것을 사용할 수 있으며, 이 경우 상기 FYCO1 유전자의 LIR 모티프는 GenBank accession No. NM_024513의 뉴클레오티드 위치 4032~ 4103에 상응하는 서열이 이용될 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 FYCO1의 LIR 모티프는 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 FYCO1의 LIR 모티프는 FYCO1 유전자의 돌연변이로부터 유래된 것일 수 있으며, 바람직하게는 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 리포터 형광 단백질은 녹색 형광 단백질(GFP), 변형된 녹색 형광 단백질(modified green fluorescent protein), 증강된 녹색 형광 단백질(enhanced green fluorescent protein; EGFP), 적색 형광 단백질(RFP), 변형된 적색 형광 단백질(mRFP)을, 가장 바람직하게는 증강된 녹색 형광 단백질(EGFP) 및 변형된 적색 형광 단백질(mRFP)을 리포터 단백질로서 사용한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 자가포식소체 검출용 프로브는, 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 N-말단 소수성 도메인(각각 “S(N30)” 또는 “S(N20)”으로 표시); 상기 도메인에 연결된 서열번호 3 또는 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 FYCO1 으로부터 유래된 LIR 모티프("LIR(Fy)"로 표시); 및 상기 LIR 부위에 연결된 EGFP 또는 mRFP("EGFP/mRFP"로 표시)를 포함하는 것일 수 있다. 본 발명의 바람직한 자가포식소체 검출용 프로브의 예는 S(N30)-LIR(Fy)-EGFP/mRFP 또는 S(N20)-LIR(Fy)-EGFP/mRFP로 구성된 구조체이고, 가장 바람직하게는 S(N20)-LIR(Fy)-EGFP/mRFP로 구성된 구조체이다.

상기 프로브는 자가소화성(자식작용성) 액포에 위치(localization)함으로써 자가소포체 검출에 매우 유용하게 사용될 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 자가포식소체 검출용 프로브 또는 이를 함유하는 벡터를 포함하는 자가포식소체 검출용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 프로브 또는 조성물을 이용하되, 상기 리포터 형광 유전자(단백질) 발현량이 정상 대조군에 비해 증가하는 경우 세포 내 자가포식소체 수 및 자식작용이 증가하는 것으로 판별하는 것을 특징으로 하는, 자식작용에 대한 정보 제공 방법을 제공한다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 자식작용에 대한 정보는 헌팅턴 병에 관한 것일 수 있다.

본 발명은 종래 자가포식소체 검출 방법이 가지고 있었던 LC3 과발현에 의한 다양한 부작용의 문제점을 해결하여 보다 정확하고 특이적으로 자가포식소체를 효과적으로 검출할 수 있게 함으로써, 자식작용에 관련된 생체 내의 다양한 정보를 수득하여 활용할 수 있게 한다.

도 1은 본 발명에 따른 자가포식소체 검출용 프로브의 다양한 구조 및 그 도메인 구조의 모식도, 및 HEK293T 세포에서 RFP-LC3-양성 자가포식소체에 대한 위치화(localization)를 나타낸 도면이다.
도 2는 MEF에서 S(N30)-EGFP-LIR(Fy)과 대조하여 RFP-LC3-양성 자가포식소체의 S(N30)-LIR(Fy)-EGFP의 효과적인 위치화를 보여준다.
도 3은 세럼 기아 동안 MEF에서 S(N30)-EGFP-LIR(Fy)과 비교하여 RFP-LC3-양성 자가포식소체에 대한 S(N30)-LIR(Fy)-EGFP의 효과적인 위치화를 나타낸다.
도 4는 WT 또는 atg5-/- MEFs 및 배양된 대뇌 피질 뉴런에서 RFP-LC3-양성 자가포식소체에 대한 S(N20)-LIR(Fy)-EGFP의 효과적인 위치화를 나타낸다.
도 5는 WT 또는 atg5-/- MEFs에서 RFP-LC3-양성 자가포식소체에 대한 S(N20)-LIR(Fy)-EGFP의 효과적인 위치화를 나타낸다.
도 6은 MEF에서 S(N20)-LIR(Fy)-EGFP 및 S(N30)-LIR(Fy)-EGFP 사이의 자가포식소체 검출의 효율성의 비교를 나타낸다.
도 7은 WT 또는 ATG5-/- MEFs에서 RFP-LC3-양성 자가포식소체에 대한 S(N20)-2xLIR(Fy)-EGFP의 효과적인 위치화를 나타낸다.
도 8은 자식작용-의존성 방법으로 혈청 기아 또는 라파마이신으로 자식작용 유도 동안 자가포식소체 구조물에 대한 S(N20)-LIR(Fy)-EGFP의 효과적인 위치화를 나타낸다.
도 9는 혈청 기아 또는 라파마이신으로 자식작용 유도 동안 WT MEFs에서 자식작용성 액포에 대해 S(N20)-2xLIR(Fy)-EGFP의 효과적인 위치화를 나타낸다.
도 10은 자식작용성 플럭스 상에서 S(N20)-LIR(Fy)-EGFP 발현의 영향을 나타낸 것이다.
도 11은 혈청 기아 동안 S(N20)-LIR(Fy)-GFP 또는 GFP-LC3-발현하는 MEFs의 자가포식소체 수를 모니터링한 것이다.
도 12는 Nhtt-16Q-발현하는 MEFs가 아닌,poly(Q)-확장된 돌연변이 헌팅톤 (Nhtt-150Q)-발현하는 MEFs에서 생성된 자가포식소체에 대한 S(N20)-LIR(Fy)-RFP의 효과적인 타겟팅을 나타낸다.
도 13은 Nhtt-16Q-발현하는 MEFs가 아닌,poly(Q)-확장된 돌연변이 헌팅톤 (Nhtt-150Q)-발현하는 뉴런에서 생성된 자가포식소체에 대한 S(N20)-LIR(Fy)-RFP의 효과적인 타겟팅을 나타낸다.
도 14는 S(N20)-LIR(Fy)-EGFP에 의한 자식작용성 멤브레인의 검출을 보여준다.
도 15는 atg5-/- 세포에서 RFP-LC3의 응집체 형성을 나타낸다.
도 16은 자가포식(autophagy) 유도 과정 동안 S(N20)-LIR(Fyco1)-GFP의 LIR-의존적 위치화(localization)를 나타낸다. 수치는 3회의 독립된 실험들의 평균 ± SEM 이다. 유의차(Significant differences)는 다음과 같이 나타내었다: ***P < 0.001(일방향(one-way) ANOVA와 Tukey's multiple-comparison test에 따름). 막대(bar) 위의 숫자는 실험에 사용된 세포의 수를 나타낸다. Starvation, serum starvation.
도 17은 MEF에서 자가포식 유도에 따른 S(N20)-LIR(Fyco1)-GFP의 RFP-LC3B, mRFP-GABARAP 또는 mRFP-GABARAPL2-양성 오토파고좀(autophagosomes)으로의 세포 내 위치화를 나타낸다. 수치는 3회의 독립된 실험들의 평균 ± SEM 이다. 유의차(Significant differences)는 다음과 같이 나타내었다: ***P < 0.001(일방향(one-way) ANOVA와 Tukey's post-hoc test에 따라 모든 다른 그룹들과 비교). 막대(bar) 위의 숫자는 실험에 사용된 세포의 수를 나타낸다. Starvation, serum starvation.

본 발명에서 사용되는 용어에 대한 정의는 이하와 같다.

"자가포식(Autophagy)은 라이소좀-의존 방식으로 세포내 구성물질을 변동, 조정하는 과정으로, 결함이 있는 거대 단백질 복합체 및 세포내 소기관을 제거하여, 세포 성장, 생존 및 항상성에 중요한 역할을 한다. 자가포식은 손상된 단백질 및 세포 소기관의 세포내 변동을 통한 세포 항상성의 유지를 위한 중요한데, 그 결과, 자가포식현상이 저하될 경우, 변성단백질(misfolded protein)의 축적이 초래되어 이로 인해 신경변성질환이 발생한다(Komatsu et al., (2006), Nature, 441, 880-884).

"자가포식 관련 질환"이란, 자식작용이 관여하여 유발되거나 또는 악화되는 질환을 의미한다. 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 악성종양, 신경퇴행성 질환, 허혈성 질환, 당뇨병, 폐섬유화증 등이 될 수 있고, 보다 바람직하게는, 유방암, 폐암, 섬유육종, 대장암 등의 악성종양; 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅턴병 등의 신경퇴행성 질환; 협심증, 심근경색 (myocardiac infarction), 심부전(cardiac failure), 허혈성 대장염, 허혈성 급성 신부전증, 급성 허혈성 뇌졸중 등의 허혈성 질환; 제1형 당뇨병, 제2형 당뇨병 등의 당뇨병, 폐섬유화증 등이 될 수 있다.

"진단"은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 그 중에서도 본 발명은 자가포식 관련 질환에 대한 정보를 제공하는 것에 유용하다. 본 발명에서는 자가포식소체 수의 증감 특성은 유용한 지표(진단 마커)로 사용될 수 있다.

"진단용 마커 또는 프로브(탐침)(diagnosis marker or probe)란 자가포식소체를 다른 세포와 구분하여 진단할 수 있는 물질로, 자가포식 관련 질환이 있는 경우 자가포식소체가 증가 또는 감소 양상을 보이는 폴리펩타이드 또는 핵산(예: mRNA 등), 지질 , 당지질, 당단백질, 당(단당류, 이당류, 다당류 등) 등과 같은 유기 생체 분자 등을 포함한다.

"프로브"는 mRNA와 특이적 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수개 염기 내지 길게는 수백 개 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미한다. 프로브는 올리고 뉴클레오티드 프로브, 단일가닥 DNA 프로브, 이중가닥 DNA 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다. 적당한 프로브의 선택 및 혼성화 조건은 당해분야에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다.

"대상" 또는 "환자"는 인간, 소, 개, 기니아 피그, 토끼, 닭, 곤충 등을 포함하여 치료가 요구되는 임의의 단일 개체를 의미한다. 또한, 임의의 질병 임상 소견을 보이지 않는 임상 연구 시험에 참여한 임의의 대상 또는 역학 연구에 참여한 대상 또는 대조군으로 사용된 대상이 대상에 포함된다.

"조직 또는 세포 샘플"은 대상 또는 환자의 조직으로부터 얻은 유사한 세포의 집합체를 의미한다. 조직 또는 세포 샘플의 공급원은 신선한, 동결된 및/또는 보존된 장기 또는 조직 샘플 또는 생검 또는 흡인물로부터의 고형 조직; 혈액 또는 임의의 혈액 구성분; 대상의 임신 또는 발생의 임의의 시점의 세포일 수 있다. 조직 샘플은 또한 1차 또는 배양 세포 또는 세포주일 수 있다.

"핵산"은 임의의 DNA 또는 RNA, 예를 들어, 조직 샘플에 존재하는 염색체, 미토콘드리아, 바이러스 및/또는 세균 핵산을 포함하는 의미이다. 이중가닥 핵산 분자의 하나 또는 두개 모두의 가닥을 포함하고, 무손상 핵산 분자의 임의의 단편 또는 일부를 포함한다.

"유전자"는 단백질 코딩 또는 전사시에 또는 다른 유전자 발현의 조절시에 기능적 역할을 갖는 임의의 핵산 서열 또는 그의 일부를 의미한다. 유전자는 기능적 단백질을 코딩하는 모든 핵산 또는 단백질을 코딩 또는 발현하는 핵산의 일부만으로 이루어질 수 있다. 핵산 서열은 엑손, 인트론, 개시 또는 종료 영역, 프로모터 서열, 다른 조절 서열 또는 유전자에 인접한 특유한 서열 내에 유전자 이상을 포함할 수 있다.

"단백질"은 또한 기준 단백질과 본질적으로 동일한 생물 활성 또는 기능을 보유하는, 단백질의 단편, 유사체 및 유도체를 포함하는 것이다

"표지" 또는 "라벨"는 직접 또는 간접적으로 시약, 예를 들어 핵산 프로브 또는 항체에 컨쥬게이팅 되거나 융합되고 컨쥬게이팅 되거나 융합된 시약의 검출을 용이하게 하는 화합물 또는 조성물을 의미한다. 표지는 그 자체가 검출될 수 있거나 (예를 들어, 방사성 동위원소 표지 또는 형광 표지), 효소 표지의 경우에, 검출가능한 기질 화합물 또는 조성물의 화학적 변형을 촉매 할 수 있다.

"약"이라는 것은 참조 양, 수준, 값, 수, 빈도, 퍼센트, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이에 대해 30, 25, 20, 25, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1% 정도로 변하는 양, 수준, 값, 수, 빈도, 퍼센트, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이를 의미한다.

본 명세서를 통해, 문맥에서 달리 필요하지 않으면, "포함하다" 및 "포함하는"이란 말은 제시된 단계 또는 원소, 또는 단계 또는 원소들의 군을 포함하나, 임의의 다른 단계 또는 원소, 또는 단계 또는 원소들의 군이 배제되지는 않음을 내포하는 것으로 이해하여야 한다.

이하, 본 발명에 대하여 구체적으로 설명한다.

본 발명은 자가포식소체(autophagosome)를 검출하는 새로운 프로브(탐침)에 관한 것으로, 더욱 구체적으로는 S(N30)-LIR(Fy)-EGFP/mRFP 또는 S(N20)-LIR(Fy)-EGFP/mRFP 구성의 자가포식소체 검출용 프로브, 이의 제작 및 이의 용도에 관한 것이다.

자가포식현상은 리소좀(lysosome)을 통해 세포구성물이 제거되는 과정으로 생리적으로 자가포식은 세포소기관과 단백질을 생성/분해하는데 균형을 잡는 역할을 한다. 자가포식은 질병이 발생하는 과정을 매개하고, 세포내 신호전달과 단백질 손상 과정에서 일어나는 활성산소족과 활성질소족(ROS/RNS)의 정보교환(crosstalk)에 관여하는 것으로 밝혀지고 있다.

자가포식은 기질이 어떻게 리소좀에 이르는지에 따라 세 가지로 분류된다: (i) 대자가포식(macroautophagy) - 일반적으로 일컫는 자가포식을 대자가포식이라 한다. 자가포식소체(autophagosome)를 형성하는 방법이다. (ii) 소자가포식 - 리소좀이 직접 세포 구성물을 둘러싸고 소화한다. (iii) 샤페론 매개 자가포식 - 샤페론이 결합한 단백질 복합체는 LAMP-2A수용체에 결합해 표적 단백질을 리소좀에 데려가 분해한다

포유류 세포에서, 영양분이 감소하면 TOR(target of rapamy-cin)가 억제되어 atg13이 탈인산화(dephosphorylated)된다. 탈인산화된 atg13은 atg1 상동단백질(homologue)과 결합하여 활성화한다. 활성화된 atg1은 FIP200과 유도결합(recruit)한다. 이 단백질 복합체는 분리막을 연장하여 자가포식소체( autophagosome) 구조가 완성되도록 유도한다.

자가포식소체 구조를 이루기 위해서는 beclin-1-class III PI3K 복합체가 필요하고, LC3(light chain 3)-II가 자가포식소체의 막에 삽입되어야 한다. LC3는 유비퀴틴(ubiquitin)과 유사한 단백질이며 LC3는 해독후변형(post translational modifications)되어 LC3-II가 된다. LC3는 Atg4에 잘려나가 LC3-I이 된 후 C말단에 글라이신(Glycine) 잔기를 노출시킨다. 이후 LC3-I과 PE(phosphatydilethanolamine) 가 결합하여 LC3-II가 된다. 이 과정은 자가포식소체가 확장하는 것에 필수적이다

자가포식의 전형적인 특징은 자가포식을 유도하는 신호, 표적, 그리고 세포의 유형에 따라 다양한 크기(0.5 - 1.5 um)를 가지는 자가포식소체의 형성이다. 효모를 이용한 유전적 스크린을 통하여 자가포식소체 형성의 여러 가지 과정을 조절하는 35개 이상의 자가포식에 관련된(autophagy-related, Atg) 유전자들이 발견되었다.

그러므로, 형성된 자가포식소체를 검출함으로써 자가포식 관련 질환에 대한 다양한 정보를 수득할 수 있고, 본 발명은 이러한 자가포식소체 검출용 프로브에 관한 것이다.

자가포식작용이 실제로 일어나고 있는지 확인하기 위해서 성숙하고 있는 각단계의 자가포식소체를 전자현미경으로 관찰하는 것이 가장 전통적인 방법이다. 또 다른 방법으로 수명이 긴 단백질의 분해 속도를 파동추적(PULSE-CHASE) 방법으로 측정하는 것이 일반적이면서도 보조적이다. LC3에 기반한 방법도 자가포식을 측정하는 데에 널리 이용되고 있어왔다. LC3는 PE와 결합하여 LC3-II로 변환된다. LC3-I과 II는 전기영동에서 이동성의 차이로 구분할 수 있다. 자가포식소체가 형성될 때 LC3-II가 자가포식소체막에 삽입되는 것이 일관되게 일어나는 중요한 단계이며 LC3의 양은 세포 내 자가포식소체의 상대적인 양을 반영한다. LC3-II 단백질은 자가포식소체와 결합하면 세포면역염색법으로 관찰할 때 소낭과 같은 작은 점으로 보이게 된다.

기존에는 자가포식소체 형성에 직접적으로 관여하는 LC3에 GFP 또는 RFP를 붙인 RFP/GFP-LC3가 일반적으로 자가포식소체를 표지하기 위해 사용되었다.

이는 RFP가 산성조건에 저항성이 있는 반면 GFP는 산성에서 약해지는 원리를 이용한다. GFP와 RFP가 연속으로 결합된 LC3은 리소좀과 결합하지 않은 자가포식소체에서 GFP와 RFP 빛을 동시에 내지만, 자가포식소체(autolysosome)가 성숙하면 RFP만 발산하게 된다.

그러나, LC3 자체가 자가포식소체 형성에 직접관여하기 때문에, LC3 과발현에 의한 다양한 부작용은 피할 수가 없었다.

본 발명은 이러한 문제를 해결할 수 있는, 새로운 자가포식소체 검출용 프로브 및 이의 이용에 관한 것이다.

그러므로 본 발명은 일 관점에서, 상기 구성요소를 함유하는 자가포식소체 검출용 프로브에 관한 것이다. 상기 프로브 구조체는 세포 내 자가포식소체 수준을 확인하여 자식작용에 대한 다양한 정보 제공을 위해 사용될 수 있다.

본 발명의 프로브는, FYCO1 유전자의 LIR 모티프 (LIR[Fy]), N-말단 소수성 도메인, 리포터 유전자를 함유하는 것을 특징으로 한다.

상기 FYCO1, N-말단 소수성 도메인 서열은 동물 유래, 바람직하게는 FYCO1은 인간 공지 유전자 서열 및 이의 돌연변이로부터, ApPDE4는 군소 (Aplysia)로부터 수득할 수 있으며, 야생형(wild type) 뿐만 아니라, 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합에 의한 변이체를 포함한다.

상기 단백질 등을 코딩하는 유전자는 당업계에 공지된 염기서열을 참조하여 이의 말단 부분에 상보적인 올리고뉴클레오타이를 작제한 후 이를 프라이머로 하고 특정한 세포의 지노믹 DNA나 cDNA를 주형으로 하여 PCR을 수행함으로써 수득할 수 있다.

본 발명은 상기 단백질과 기능적 동등물인 경우를 모두 포함한다. '기능적 동등물'이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 원래 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90%이상, 더 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다. '실질적으로 동질의 생리활성'이란 자식작용 메커니즘에 관여하는 각 단백질들의 활성을 의미한다.

자가포식소체에 위치한 내생성 LC3를 모니터링하기 위한 본 발명의 프로브에 있어서, LC3-, Rab7-, 및 PI3P-상호작용하는 단백질로 알려진 FYCO1의 LIR 모티프(LIR(Fy), RPPDDAVFDIITDEELCQIQESGS)(서열번호 3)를 사용할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서 상기 FYCO1의 LIR 모티프는 인간 FYCO1 유전자(GenBank accession No. NM_024513)의 뉴클레오티드 위치 4032~ 4103에 상응하는 FYCO1 유전자의 LIR 모티프 (LIR[Fy])를 이용할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 LIR 모티프는 야생형(WT) FYCO1의 LIR 모티프의 보존적 서열((W/F/Y)-X-X-(I/L/V))을 돌연변이시킨 것일 수 있으며, 바람직하게는 서열번호 4의 아미노산 서열(RPPDDAV F DI A TDEELCQIQESGS)을 갖는 것일 수 있다.

특히, 본 발명에서는 상기 LIR 모티프를 N-말단 소수성 도메인과 융합함으로써 더 효율적으로 LC3-양성의 자가포식소체(autophagosomes)를 검출할 수 있다.

바람직하게는 ApPDE4(phosphodiesterase 4)의 N-말단 소수성 도메인, 더욱 바람직하게는 ApPDE4의 short-form의 N-말단(S(N30))을 결합시키고, 가장 바람직하게는 상기 S(N30)의 소수성 잔기 내 아미노산 서열에 기초하여, 10개 아미노산 잔기(RQSGRKSSTD)를 결실시킨 코어 소수성 잔기 S(N20)을 결합시킨다. 즉, 상기 도메인은 서열번호 1로 표시되는 30개의 아미노산 서열로 이루어지거나 서열번호 2로 표시되는 20개의 아미노산 서열로 이루어진 것이 바람직하다.

소수성 모티프, LIR에 연결되는 이러한 30 또는 20개 아미노산 잔기가, LC3- 양성 자가포식소체에 효과적인 위치화에 현저한 효과를 발휘한다.

상기 FYCO1에서 FYVE 도메인은 PI3P-풍부한 파고포어(phagophores)(preautophagosomal membranes)와 관련할 수 있지만, 단일 FYVE 도메인은 소수성 잔기로 구성된 S(N30)와 대조적으로 LC3-양성 자가포식소체에 대한 LIR(Fy)의 세포성 위치화에 영향을 미치지는 않는다.

또한, 본 발명은 자가포식소체의 세포 내 수준을 검출하기 위해서 리포터 유전자로서 형광 단백질을 융합시켜 발현시키는 것을 특징으로 한다.

리포터 형광 유전자는 그 업스트림(upstream)의 프로모터 활성에 따라 유전자가 발현되어 세포 내에서 그 발현 여부를 확인할 수 있다. 리포터 유전자의 예로는 녹색 형광 단백질(GFP), 변형된 녹색 형광 단백질(modified green fluorescent protein), 증강된 녹색 형광 단백질(enhanced green fluorescent protein; EGFP), 적색 형광 단백질(RFP), 변형된 적색 형광 단백질(mRFP), 청색 형광 단백질(BFP), 증강된 청색 형광 단백질(EBFP), 황색 형광 단백질(YFP), 증강된 황색 형광 단백질(EYFP), 남색 형광 단백질(CFP), 및 증강된 남색 형광 단백질(ECFP) 및 레닐라 루시퍼라제(Renila luciferase), 적색 형광 단백질(DsRed) 등을 포함하나 상기 예에 제한되는 것은 아니다. 바람직하게는 녹색 형광 단백질(GFP), 변형된 녹색 형광 단백질(modified green fluorescent protein), 증강된 녹색 형광 단백질(enhanced green fluorescent protein; EGFP), 적색 형광 단백질(RFP), 변형된 적색 형광 단백질(mRFP)을, 가장 바람직하게는 증강된 녹색 형광 단백질(EGFP) 및 변형된 적색 형광 단백질(mRFP)을 리포터 단백질로서 사용한다.

그러므로, 본 발명은 바람직한 실시예로서, S(N30)-LIR(Fy)-EGFP/mRFP 또는 S(N20)-LIR(Fy)-EGFP/mRFP의 구조를 갖는 자가포식소체 검출용 프로브 구조체를 제공할 수 있으며, 가장 바람직하게는 S(N20)-LIR(Fy)-EGFP/mRFP 프로브를 제공한다.

특히, 본 발명의 프로브는 자가소화성(자식작용성) 액포에 효과적으로 위치하므로 자가포식소체 센서로 매우 유용하다.

또한, 본 발명은 상기 자가포식소체 검출용 프로브를 함유하는, 자식작용에 대한 정보 제공을 위한 자가포식소체 검출용 재조합 벡터에 관한 것이다.

상기 벡터는 예를 들어, 상기 프로브에 함유되어 있는 유전자 각각을 포함할 수도 있고 이들이 융합된 재조합 단백질을 코딩하는 서열을 포함할 수도 있다.

"벡터"란 적당한 숙주세포에서 목적 단백질을 발현할 수 있는 발현 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물을 말한다.

벡터는 플라스미드, 파지 입자 또는 간단하게 잠재적 게놈 삽입물일 수 있다. 적당한 숙주로 형질전환되면, 벡터는 숙주 게놈과 무관하게 복제하고 기능할 수 있거나, 또는 일부 경우에 게놈 그 자체에 통합될 수 있다. 플라스미드가 현재 벡터의 가장 통상적으로 사용되는 형태이므로, 본 발명의 명세서에서 "플라스미드(plasmid)" 및 "벡터(vector)"는 때로 상호 교환적으로 사용된다. 플라스미드 벡터는 (a) 숙주세포당 수백 개의 플라스미드 벡터를 포함하도록 복제가 효율적으로 이루어지도록 하는 복제 개시점, (b) 플라스미드 벡터로 형질전환된 숙주세포가 선발될 수 있도록 하는 항생제 내성 유전자 및 (c)외래 DNA 절편이 삽입될 수 있는 제한효소 절단부위를 포함하는 구조를 지니고 있다. 적절한 제한효소 절단부위가 존재하지 않을지라도, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오타이드 어댑터 (oligonucleotide adaptor) 또는 링커 (linker)를 사용하면 벡터와 외래 DNA를 용이하게 라이게이션 (ligation)할 수 있다

"작동 가능하게 연결된"이란, 본 발명의 프로모터 서열의 다운스트림에 유전자가 연결될 때, 해당 유전자의 발현이 가능한 형태로 연결되는 것을 의미하며, 상기 목적을 달성하기 위하여 임의의 서열이 추가로 포함될 수 있다. 상기 임의의 서열을 예로 들면, 오퍼레이터(operator) 서열, 인프레임(in frame)을 위한 서열 등이 있으며, 또한 본 발명의 유전자 이외에 인핸서 (enhancer)와 같은 시스 요소 (cis element), 스플라이싱 시그널 (splicing signal), 폴리 A 추가 시그널 (poly A addition signal), 선택 마커 (selection marker), 라이보좀 결합 서열 (ribosome binding sequence, SD sequence) 등을 추가로 포함할 수 있다. 선택 마커의 예로, 클로람페니콜 저항 유전자, 암피실린 저항 유전자, 디하이드로폴레이트 환원효소(dihydrofolate reductase), 네오마이신 저항 유전자 등이 사용될 수 있으나, 상기 예들에 의해 작동 가능하도록 연결되기 위한 추가적 구성요소가 제한되는 것은 아니다.

다른 관점에서, 본 발명은 상기 프로브 또는 상기 벡터를 포함하는, 자가포식소체 검출 및 자식작용에 대한 정보 제공을 위한 자가포식소체 검출용 조성물에 관한 것이다.

이 때, 리포터 형광 단백질의 발현 정도를 확인하여 자가포식소체를 검출한다. 상기 '발현 수준 측정'이란, mRNA 또는 이의 단백질 발현 수준을 측정하는 것을 모두 포함한다.

mRNA 발현수준 측정을 위한 분석 방법으로는 역전사중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소반응(Competitive RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소반응(Realtime RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅(Northern blotting), DNA 칩 등이 있으나 이로 제한되는 것은 아니다.

이 때, 사용되는 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 중합효소 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성이 개시할 수 있다. 본 발명의 프라이머는, 각 마커 유전자 특이적인 프라이머로 7개 내지 50개의 뉴클레오타이드 서열을 가진 센스 및 안티센스 핵산이다. 프라이머는 DNA 합성의 개시점으로 작용하는 프라이머의 기본 성질을 변화시키지 않는 추가의 특징을 혼입할 수 있다. 상기 프라이머는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있고, 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다.

단백질 발현수준 측정은 상기 유전자의 단백질에 대하여 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 단백질의 양을 확인할 수 있다. 항체란 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 다클론 항체, 단클론 항체 및 재조합 항체를 모두 포함한다.

이를 위한 분석 방법으로는 웨스턴 블랏, 엘라이자(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA), 방사선면역분석(RIA: Radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), 유세포분석(Fluorescence Activated Cell Sorter, FACS), 단백질 칩(protein chip) 등이 있으나 이로 제한되는 것은 아니다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질 전환된 세포를 제공한다.

상기 형질 전환 방법은 당업계에 공지된 방법, 예를 들어 이에 한정되지는 않으나, 열 충격 방법(heat shock method), 칼슘 포스페이트 침전법, 전기 천공법(electroporation), 유전자 총(gene gun), 실리콘 탄화물 위스터 (Silicon carbide whiskers), 초음파 처리(sonication), 및 PEG (polyethylenglycol)를 이용한 침전법, 자연 도입 방법 등이 있으나, 상기 예에 의해 본 발명의 벡터를 도입하는 방법이 제한되는 것은 아니다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 대상 세포를 형질 전환하는 단계; 및 상기 형질 전환체의 리포터 형광 단백질 양을 정량하는 단계를 포함하는 자가포식소체 수준을 확인함으로써 자식작용에 대한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.

자가포식소체 수준에 따라 발현되는 리포터 형광 단백질 양이 결정되는데, 세포 내 자가포식소체 수준이 높을수록 발현되는 리포터 형광 단백질 양이 많아지므로, 발현되는 형광 단백질 양을 정량하면 세포 내 자가포식소체 수준을 측정할 수 있고 이를 바탕으로 자식작용과 관련된 다양한 정보를 수득할 수 있는 것이다

본 발명의 일 구체예에 있어서 형질감염(형질전환)에 이용되는 세포주는 바람직하게는 동물 세포, 보다 바람직하게는 포유동물 세포주인 것이 바람직하다. 본 발명에서 이용될 수 있는 배지는 동물세포의 배양에 통상적으로 이용되는 어떠한 배지도 가능하며, 예를 들어, Eagles's MEM (Eagle's minimum essential medium, Eagle, H. Science 130:432(1959)), α-MEM (Stanner, C.P. et al., Nat. New Biol. 230:52(1971)), Iscove's MEM (Iscove, N.et al., J. Exp. Med. 147:923(1978)), 199 배지 (Morgan et al., Proc. Soc. Exp. Bio. Med., 73:1(1950)), CMRL 1066, RPMI 1640 (Moore et al., J. Amer. Med. Assoc. 199:519(1967)), F12 (Ham, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 53:288(1965)), F10 (Ham, R.G. Exp. Cell Res. 29:515(1963)), DMEM (Dulbecco's modification of Eagle's medium, Dulbecco, R. et al., Virology 8:396(1959)), DMEM과 F12의 혼합물 (Barnes, D. et al., Anal. Biochem. 102:255(1980)), Way-mouth's MB752/1 (Waymouth, C. J. Natl. Cancer Inst. 22:1003(1959)), McCoy's 5A (McCoy, T.A., et al., Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 100:115(1959)) 및 MCDB 시리즈 (Ham, R.G. et al., In Vitro 14:11(1978)) 등이 이용될 수 있다.

본 발명에서는, 상기 형질감염된 세포주에서 형광 단백질의 발현량을 이용하여 자식작용 관련 자가포식소체 수준을 확인할 수 있고 이를 비교 분석하여 상향조절(up-regulation)된 것으로 측정되면 자식작용이 많은 것으로 판별한다.

본 발명의 자가포식소체 프로브를 이용하여 자가포식소체 검출을 효과적으로 할 수 있으므로, 이를 이용하여 자가포식 작용 관련 질환에 대한 정보를 제공할 수 있다.

최근에는 신경변성질환인 알츠하이머병과 파킨슨병, 헌팅턴병 그리고 암, 당뇨병, 염증반응 등과 같은 다양한 질병과 병리학적 현상에서 자가포식의 중요한 역할이 밝혀지고 있다.

자식작용은 특정 신경변성질환에서 세포보호능을 통해 신경세포의 세포사멸을 억제하는 것으로 알려져 있다. 단백질 응집체의 축적은 정상적인 신경세포의 기능을 방해하며 세포독성을 나타낸다. 자식작용은 신경변성질환에서 나타날 수 있는 다음과 같은 비정상적 단백질의 분해와 연관성을 나타낸다. 헌팅턴병을 일으키는 헌팅턴 단백질(huntington, Htt) 내의 글루타민 다량체의 확장, 그리고 파킨슨병을 유도하는 α-synuclein, 전측두엽치매와 연관하는 tau 단백질, 루게릭병에서의 Cu-ZnSOD의 돌연변이가 그 예이다. Atg7이 결핍된 마우스에서는 신경세포의 기능이상과 세포사멸이 일어난다. 자식작용은 이러한 단백질 응집의 해소뿐만 아니라 신경세포의 항상성을 유지시켜줌으로써 세포를 보호한다. 또한 신경변성질환 환자의 뇌조직에서도 자기소화액포(autophagic vacuole)가 축적되어 있음이 보고되어 있다. 알츠하이머병에서 presenilin-1 단백질의 돌연변이는 자가포식소포체의 성숙과 리소좀을 통한 분해능을 억제하며, presenilin-1 단백질의 손실은 자가포식소포체의 산성화를 방해하여 단백질 분해능을 방해한다

또한, 자식작용은 암 질환에도 관여한다.

자식작용은 종양형성에서 두 가지 역할을 담당한다. 첫째는 종양억제자로서의 세포사멸유도이고, 둘째는 종양형성기전에서의 세포사멸억제이다. 종양형성의 주요원인은 방사능과 산화적 스트레스, 노화 등의 요소로부터 기인하는 DNA 손상과 돌연변이이다. 미토콘드리아 DNA는 복구기전과 히스톤 단백질에 의한 보호의 부족으로 손상에 보다 취약하다. 미토콘드리아는 전자전달계 활동의 부산물로 다량의 활성산소를 발생시킬 수 있으며 이러한 활성산소의 조절 부재는 미토콘드리아 DNA를 손상시키고 내막과 외막의 산화를 초래할 수 있다. 또한 미토콘드리아의 기능장애는 보다 많은 활성산소를 축적시켜 그 결과 세포의 산화적 스트레스와 다른 미토콘드리아의 손상을 일으킨다. 자식작용은 손상된미토콘드리아를 제거하여 산화적 스트레스를 완화시킴으로써 발암현상을 억제한다. 한편, 종양형성에서 자식작용은 제한적 영양상태와 저산소 상태에서 그리고 방사능 노출 등에서 손상단백질과 세포소기관을 제거함으로써 암세포를 생존시킬 수 있다.

또한, 자식작용은 당뇨병 질환에도 관여한다.

당뇨병은 췌장 β세포의 기능장애와 인슐린저항성에 의해 발생한다. 산화적 스트레스가 유발한 미토콘드리아의 기능장애는 당뇨병의 발전에 중요한 역할을 담당하며 손상된 미토콘드리아는 자식 작용에 의해 제거된다. Atg7-/-마우스는 췌장 β세포의 급격한 감소를 보이며 이에 따라 인슐린분비량의 감소를 나타낸다. 또한, Atg7돌연변이 마우스는 저인슐린혈증과 과혈당증를 나타낸다. 췌장 β세포의 기능장애에 이어 자식작용의 기능장애는 인슐린저항성과 연관되어 있다. 소포체스트레스는 인슐린수용체의 세포막발현을 약화시켜 인슐린저항성을 일으킨다. 인슐린저항성은 순환적으로 자식작용을 억제하여 결국 기능장애 상태의 단백질과 미토콘드리아 등의 세포소기관의 분해를 방해하여 췌장 β세포의 사멸을 유도하게 된다. 따라서 자식작용은 췌장 β세포의 기능과 세포항상성에 중요한 기전이며 인슐린감수성에 영향을 미칠 수 있다. 노화의 경우에도 당내성과 연관이 있기 때문에 자식작용의 활성은 노화와도 밀접한 연관이 있을 것으로 사료된다.

또한, 자식작용은 심혈관계 질환에도 관여한다.

정상적인 심혈관계 기능을 위해 자식작용은 반드시 필요한 세포 기전이나 비정상적인 자식작용은고혈압과 심장기능부전을 일으킬 수 있다. 심근질환의 하나인 다논병(danon disease)의 경우, 자가포식소포체와 리소좀의 결합에 관여하는 LAMP-2 단백질의 결핍에 의해 일어난다. 심혈관계질환 관련 질병모델에서 자식작용은 병리학적 조건에 따라 세포보호 또는 세포사멸의 효과를 나타낸다. 관상동맥혈전증에서 심장근육세포는 자식작용을 일으킨다. 교차대동맥협착(transverse aortic constriction, TAC) 모델에서 Atg5 단백질의 결핍은 세포사멸을 증가시키나 Beclin1 단백질의 결핍은 심장기능의 악화로부터 세포를 보호한다. 즉, Beclin1은 Bcell lymphoma 2 (Bcl-2) 단백질과 상호작용하여 항 아폽토시스효 과를 억제하여 세포사멸을 유도한다. 파킨슨병 연관유전자로 알려진 Parkin은 p62와의 상호작용을 통해 심장에서 미토콘드리아 특이적 자식작용을 일으킨다.

또한, 자식작용은 염증반응에도 관여한다.

자식작용은 선천성 면역반응의 중요한 요소이며 적응성 면역반응에서도 다양한 기능을 담당하고 있다. 자식작용은 자가포식용해소체 경로를 통해 침입한 병원체의 성장을 제한한다. 세균 그리고 바이러스, 기생충 등은 자식작용의 표적이다. 자식작용은 특정 단일가닥 RNA 바이러스의 탐색을 가능하게 한다. 이 과정에서 엔도좀내로 이동된 바이러스 복제 중개체는 병원체 형태 인식수용체(pathogen pattern-recognition receptor, PRR)와 TLR7에 의해 인지된다. 또한 자식작용은 전 염증시토카인의 생성과 관련이 있다.형질세포양수지상세포(plasmacytoid dendritic cell, pDC)에서 자식작용은 제1형 인터페론(infection-initiated type I interferon, IFN)의 생성에 필요한 기전이다. 그러나 ATG5 결핍 마우스의 배아 섬유아세포는 단일가닥 RNA 바이러스의 감염에 대해 제1형 인터페론의 생성을 촉진하였으며, 이 경우에는 자식작용이 시토카인의 생성을 억제한다는 것을 보여준다. 따라서 자식작용은 선천성면역반응에서 전 염증반응과 항 염증반응에서 두 가지 상반되는 역할을 담당한다.

이처럼, 자식작용은 신경변성질환 그리고 암, 당뇨병, 염증반응 등과 같은 다양한 질병으로 진행하는 기작에 관여하므로, 본 발명의 자가포식소체 검출 프로브를 이용하여 관련 정보를 수득 및 제공할 수 있을 것이다.

이처럼, 본 발명은 S(N30)-LIR(Fy)-EGFP/mRFP 또는 S(N20)-LIR(Fy)-EGFP/mRFP를 구조체를 이용하여 자가포식소체의 세포 내 수준을 확인함으로써, 자식작용에 대한 다양한 정보 제공를 제공하는 모든 용도를 포함한다.

즉, 자가포식소체의 수준을 특정 형광리포터 검출을 통해 쉽게 확인할 수 있는 특징이 있어, 자가포식소체 검출과 관련된 용도로 효과적으로 사용할 수 있고, 나아가 자식작용 관련 질환의 새로운 치료제를 발굴하는 데 유용할 것이다.

< 실시예 >

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

달리 지시되지 않는 한, 핵산은 좌측에서 우측으로 5'→3' 배향으로 기록된다. 명세서 내에서 열거된 수치 범위는 범위를 정의하는 숫자를 포함하고, 정의된 범위 내의 각각의 정수 또는 임의의 비-정수 분획을 포함한다.

달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 분야의 당업자가 통상적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기술된 것들과 유사하거나 등가인 임의의 방법 및 재료가 본 발명을 테스트하기 위한 실행에서 사용될 수 있지만, 바람직한 재료 및 방법이 본원에서 기술된다.

대상 및 방법

1. DNA 구조물

pEGFP-C3 또는 pEGFP-N3 백본으로부터 플라스미드를 제작하였다.

인간 FYCO1 (GenBank accession No. NM_024513)의 뉴클레오티드 위치 4032-4103에 상응하는 FYCO1 유전자의 LIR 모티프 (LIR[Fy]) 또는 인간 p62 (GenBank accession No. NM_003900) 뉴클레오티드 위치 1050-1127에 상응하는 p62 유전자의 LIR motif (LIR[p62])를 합성 프라이머를 이용하여 프라이머 확장에 의해 생성하고 pEGFP-C3 또는 pEGFP-N3 벡터 내로 서브클로닝하여 (또는 HindIII-KpnI 위치에서 스펙트럼 변종 모노머성 적색 형광 단백질(spectral variants monomeric red fluorescent protein, mRFP) 또는 사이안 형광 단백질(cyan fluorescent protein, CFP)), 각각 EGFP-LIR 및 LIR-EGFP를 형성하였다.

또한, S(N30)-LIR(Fy)-EGFP 및 EGFP-LIR(Fy)-LIR(Fy)를 생성하기 위해, PCR에 의해 증폭된 S(N30) 및 LIR(Fy)을 각각 pEGFP-N3-LIR(Fy) 및 pEGFP-C3-LIR(Fy) 내로 HindIII-HindIII 위치에 삽입하였다.

S(N30)-EGFP-LIR(Fy) 및 S(N30)-EGFP-LIR(Fy)-LIR(Fy) 구조물을 생성하기 위해, 주형으로 각각 pEGFP-C3-LIR(Fy) 또는 pEGFP-C3-LIR(Fy)-LIR(Fy)을 이용하여 EGFP-LIR(Fy) 및 EGFP-LIR(Fy)-LIR(Fy)을 증폭시키고 pcDNA3.1(+)-S(N30)-mRFP 벡터 내로 XbaI-KpnI 위치에 서브클로닝하였다.

S(N30)-EGFP-LIR(p62), EGFP-LIR(p62)를 생성하기 위해, 주형으로서 pEGFP-C3-LIR(p62)를 이용하여 증폭시키고 pcDNA3.1(+)-S(N30)-mRFP 내로 XbaI-ApaI 위치에 서브클로닝시켰다.

pcDNA3.1-FYVE-EGFP-LIR(Fy)를 생성하기 위해, 주형으로 GFP-EEA1 wt (Addgene # 42307)를 이용하여 증폭시킨 인간 EEA1 (GenBank accession No. NM_003566)의 뉴클레오티드 위치 4241 - 4498에 상응하는 FYVE 모티프(EEA1 유전자의)를 pcDNA3.1-S(N30)-EGFP-LIR(Fy) 벡터 내로 NheI-XbaI 위치에 삽입하였다.

또한, 증폭된 S(N20) 및 LIR(Fy)를 각각 HindIII-HindIII 부위 및 KpnI-BamHI 부위에 pEGFP-N3-LIR(Fy) 벡터 내로 삽입하였다.

pEGFP-N3-S(N20)-LIR(Fy)-LIR(Fy)를 생성하기 위해, 증폭된 S(N20)를 HindIII-HindIII 부위에 pEGFP-N3-LIR(Fy)-LIR(Fy) 내로 삽입하였다. pEGFP-C3-S(N20)-EGFP-LIR(Fy)-LIR(Fy)를 제조하기 위해, 주형으로 pcDNA3.1(+)-S(N30)-mRFP를 이용하여 증폭한 S(N20)-EGFP를 pEGFP-C3-LIR(Fy)-LIR(Fy) 벡터 내로 NheI-XhoI 부위에 서브클로닝하였다. 상이한 형광 파장을 사용하면, EGFP은 CFP 또는 mRFP로 대체되었다.

2. 세포 배양, 형질감염, 약물 처리 및 세포 이미징

HEK293T 세포 또는 MEFs를 세포배양 배지(Dulbeccos modified Eagles medium [DMEM]: 10% [v/v] FBS 및 페니실린/스트렙토마이신 보충)에서 5% (v/v) CO₂ 를 함유하는 습한 대기 및 37℃에서 성장시켰다. 일차 신경세포 배양을 수행하였다.

혈청 기아(serum starvation)를 위해, HeLa 세포 또는 MEFs를 FBS 없이 세포 배양 배지에서 24 h 동안 배양시켰다. 상기 세포들을, 칼슘 포스페이트 방법 또는 리포펙타민 2000(Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) 중 어느 하나를 이용하여 DNA 구조물로 형질 감염시키고 24시간 동안 배양하였다.

형광 이미지들을 공초점 레이저-스캐닝 현미경(Radiance 2000, Zeiss)으로 수득하고 NIH Image J software (National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA)로 분석하였다.

자식작용(autophagy)을 유도하기 위해, HeLa 세포, WT MEFs, atg5-/- MEFs, 또는 배양된 뉴런들을, 10 nM 라파마이신으로 세포 유형 및 실험에 따라 10 mM NH₄Cl 존재 또는 부존재 하 4 h동안 배양하였다.

3. 면역세포화학분석

내생성 LC3를 검출하기 위해, 세포들을 PBS로 헹구고 4% 파라포름알데하이드로 10분간 고정시켰다. 세포들을 0.1% Triton X-100로 5분 동안 투과시키고 3% BSA(bovine serum albumin)로 1시간 동안 상온에서 블로킹시켰다.

1차 항체(anti-LC3, BML, 1:500, #PM036)를 블로킹 용액에 첨가하거나 4℃에서 오버나이트시켰다. 상기 세포들을 1× PBS로 3회 세척하고, 세척 후 CY3-항-래빗 2차 항체들과 1시간 동안 상온에서 배양하였고(Jackson Laboratory, 1:500), 그 후 1× PBS로 3회 세척하였다.

상기 세포들을 글래스 슬라이드 상에 마운팅하고 LSM700 공초점 현미경으로(Carl Zeiss) 분석하였다.

4. 면역골드 전자 현미경 분석(Immunogold electron microscopy)

Lipofectamine 2000으로 형질감염시킨 WT 또는 atg5-/- MEFs를 1 h 동안 4 ℃ 하 0.1% 글루타르알데하이드(glutaraldehyde), 4% 포름알데하이드, 및 3.5% 수크로오스를 함유하는 PBS에서 고정시켰다. 상기 세포들을 세포 스크래퍼로 배양 디쉬로부터 분리하고 원심분리기로 2000 x g 에서 2 min 동안 4℃ 하 펠렛화하였다.

상기 세포 펠렛들을 따뜻한 아가(1% in PBS)에 재현탁하고 다시 원심분리시켰다. PBS에서 3회 세척 후, 상기 아가-포매된 세포 펠렛들을, 에탄올 및 프로필렌 옥사이드 용액 단계별로 탈수 후 Epon 812 혼합물에 포매하였다.

면역골드 라벨링 실험을 위해, Formvar-코팅된 골드 격자 상에 둔 초박막 (80-nm) 부분을 30분 동안 신선하게 준비한 3% 소듐 메타과요오드산염 적하 상 떠가게 하였다. 상기 면역골드 라벨링 공정은 제조자의 변형 프로토콜로 구성되어 있다 (British Biocell International). 에칭 및 세척 후, 용액 A (PBS, pH 8.2, 4% 정상 염소 혈청, 1% BSA, 0.1% Tween 20, 및 0.1% 소듐 아지드 포함)의 50-μL 적하 상 격자를 위치시키고 30분 동안 배양하였다.

상기 격자를, 3시간 동안 상온에서 습한 챔버에서 용액 B (1% 정상 염소 혈청을 제외하고는 용액 A와 동일)에 희석한 항-래빗 GFP 모노클로날 항체 (Cell Signaling Technology, Danvers, MA cat. # 2956)의 50-μL 드롭렛(droplet) 상에서 배양하고, 용액 B에서 헹구었다.

상기 격자를, 용액 A에 희석시킨 15-nm-골드-컨쥬게이트된 염소 항-래빗 IgG 이차 항체와 반응시켰다. GFP 면역골드 라벨렝의 특이성을 위한 대조군은 1) 일차 항체의 생략 2) 일차 항체를 전면역 혈청(preimmune serum)으로 대체를 포함한다.

PBS 및 탈이온수에서 세척한 후, 상기 격자를 우라닐 아세테이트 (7 min) 및 리드 사트레이트 (2 min)로 대비 염색하고 Tecnai G2 Spirit 전자 현미경(FEI, Hillsboro, OR, USA)을 이용하여 관찰하였다.

실시예 1 : ApPDE4 의 N-말단 소수성 도메인과 융합 효과

1-1. LIR 모티프 이용

자가포식소체에 위치한 내생성 LC3를 모니터링하기 위한 신규 프로브를 생성하기 위해, 잘 알려진 LC3- 결합하는 단백질의 LIR 모티프를 이용하였다.

p62 (LIR(p62), EGRPEEQMESDNCSGGDDDWTHLSSK)의 LIR 모티프 또는 LC3-, Rab7-, 및 PI3P-상호작용하는 단백질로서 알려진 FYCO1 (LIR(Fy), RPPDDAVFDIITDEELCQIQESGS)의 LIR 모티프를 실험에 사용하여 LIR 모티프가 자식작용 유도 동안 LC3-양성 자가포식소체를 검출할 수 있는지를 결정하였다

EGFP를 FYCO1 또는 p62으로부터 LIR 모티프의 N-말단에 융합하여 EGFP-LIR(Fy) 또는 EGFP-LIR(p62)를 각각 생성하였다(도 1B).

RFP-LC3와 함께 EGFP-LIR(Fy) 또는 EGFP-LIR(p62) 중 어느 하나 또는 RFP-LC3 단독으로 HEK293T 세포에서 발현되었고 (24 h 동안 배양), 그 후 상기 세포들을 라파마이신(10 nM, 4 h)으로 배양하였다(자식작용의 일반적인 유도자:NH₄Cl (10 mM, 4 h)로 라이소좀적 분해의 저해 동안, 라이소조모트로픽(lysosomotrophic ) 시약 : 그들의 축적을 최대화함으로써 자가포식소체를 용이하게 검출하기 위하여).

그 결과, RFP-LC3가 라파마이신 및 NH₄Cl 처리한 세포들에서 자가 소화적 액포에 위치하였고, 반면 대조군 세포들은 자식작용 유도 신호 부존재에서 RFP-LC3-양성 자가포식소체를 거의 나타내지 않았다.

한편, EGFP-LIR(Fy) 또는 EGFP-LIR(p62) 어느 하나도 라파마이신 및 NH₄Cl 처리한 세포들에서 LC3-양성 자가포식소체에 위치하지 않았고, 상기 발현 패턴은 대부분 널리 퍼져있었다(도 1C).

이러한 결과들은 LIR 모티프 자체가 자가포식소체에서 LC3와 안정적 연계에 불충분함을 보여주었다.

1-2. 소수성 도메인과 LIR 모티프의 융합

플라즈마 멤브레인 타겟팅에서 N-말단 소수성 도메인이 중요하다. N-말단 소수성 도메인 자체는 멤브레인 타겟팅에 충분하지 않고, basic-rich 도메인 및 UCR1-2과 같은 부가적 도메인이 플라즈마 멤브레인에 위치화하기 위해 필요하다.

그러므로, 본 발명자들은 추가로 ApPDE4 short-form 으로부터 부가적 N-말단 소수성 도메인이 EGFP-LIR(Fy) 또는 EGFP-LIR(p62)의 서브세포적 위치화(subcellular localization)를 유도할 수 있는지 여부를 테스트하였다.

게다가, FYCO1에서 FYVE 도메인이 PI3P-풍부한 파고포어(phagophores)(preautophagosomal membranes)와 관련할 수 있으므로, EEA1로부터 PI3P-결합하고 있는 FYVE 도메인이 LIR 모티프와 함께, 자가포식소체에 대해 센서의 위치화를 이끌어 낼 수 있는지 여부를 테스트하였다.

이를 위하여, 상기 N-말단 소수성 영역(short-form 영역(S(N30)에서 30 소수성 아미노산 잔기로 구성된 N-말단 영역)이 EGFP-LIR의 N-말단에 융합시켜, 결과적으로 S(N30)-EGFP-LIR(Fy) 또는 S(N30)-EGFP-LIR(p62)를 형성하였다. FYVE-EGFP-LIR(Fy) 또한 생성하여 S(N30)-EGFP-LIR(Fy)의 경우와 자가포식소체에 대한 위치화를 비교하였다.

그 결과, 도 1C에서 나타낸 바와 같이, 라파마이신 및 NH₄Cl로 처리된 HeLa 세포에서 S(N30)-EGFP-LIR(Fy)는 대부분 RFP-LC3-양성 자가포식소체에 위치하였고, 반면에 S(N30)-EGFP-LIR(p62)는 RFP-LC3-양성 자가포식소체에 덜 효율적으로 위치하였다.

대조군으로서 S(N30)-mRFP는 GFP-LC3- 양성 자가포식소체에 위치하지 않았다. 이러한 결과들은 자가포식소체에 대한 센서로서 소수성 도메인과 융합한 LIR motif (LIR(Fy))의 적합성을 시사한다.

또한, 단일 FYVE 도메인은 소수성 잔기로 구성된 in S(N30)와 대조적으로 RFP-LC3-양성 자가포식소체에 대한 EGFP-LIR(Fy)의 세포성 위치화에 영향을 미치지 않았다(도 1C). 뿐만 아니라, 상기 데이터들은 FYCO1 유래 EGFP-LIR(Fy)가 소수성 도메인과 융합되었을 때(그 자체로는 멤브레인에 위치하지 않음), RFP-LC3-양성 자가포식소체에 효과적으로 위치하였다.

즉, ApPDE4의 N-말단 소수성 도메인과 융합한 경우, p62 아닌 FYCO1로부터 EGFP-LIR가 더 효율적으로 RFP-LC3-양성의 자가포식소체(autophagosomes)에 위치함을 확인하였다.

그러므로, 이러한 재조합 단백질은 새로운 자가포식소체 센서로서 제공될 수 있을 것이다.

실시예 2 : LIR ( Fy ) 모티프에 인접한 S( N30 ) 소수성 모티프

WT MEFs 에서 EGFP에 융합된 LIR(Fy) 모티프의 N-말단에 인접한 소수성 도메인은 RFP-LC3-양성 자가포식소체에 더욱 효과적으로 위치한다.

FYCO1 유래 LIR 모티프는(p62 유래와 대조적) 라파마이신으로 자식작용 유도 동안 내생성 LC3-양성 자가포식소포체의 검출에 더 적합하므로, 본 발명자들은 LIR(Fy)를 이용하여 연속되는 실험에서 추정적 센서를 개선시켰다.

S(N30) 근처의 LIR(Fy) 모티프의 위치가 자기포식소체에서 내생성 LC3에 서브세포적 위치화를 촉진시킬 수 있는지 여부를 테스트하기 위하여, S(N30)를 LIR(Fy)-EGFP의 N-말단에 융합시켰고, 결과적으로 S(N30)-LIR(Fy)-EGFP를 형성하였다(도 2A).

LC3-양성 자가포식소포체에 대한 S(N30)-EGFP-LIR(Fy) 및 S(N30)-LIR(Fy)-EGFP의 위치화를 비교하기 위해, S(N30)-EGFP-LIR(Fy) 또는 S(N30)-LIR(Fy)-EGFP를 WT MEFs에 발현시키고, 상기 세포들을 NH₄Cl (10 mM, 4 h; 도 2)와 함께 또는 제외하고 라파마이신과 배양하거나(10 nM, 4 h).

또한 혈청 기아 동안 배양하였다(24 h 동안; 도 3).

도 2B~E에 나타난 바와 같이, 라파마이신으로 자식작용 유도 동안 S(N30)-LIR(Fy)-EGFP는 WT MEFs에서 S(N30)-EGFP-LIR(Fy)보다 RFP-LC3-양성 자가포식소포체에 더 효과적으로 위치하였다.

이러한 결과에 따라, 비록 S(N30)-EGFP-LIR(Fy)는 자가포식소체에 위치하지만, 세포질에 대한 이들의 위치화는 S(N30)-EGFP-LIR(Fy)의 경우보다 더 널리 퍼져있고, 이는 LIR(Fy) 모티프에 인접한 S(N30) 소수성 모티프가 LC3 인식에 더 효과적일 수 있고 멤브레인에 위치화를 유도함을 의미한다.

S(N30)의 소수성 잔기 내에 필수적인 최소의 영역을 규명하기 위하여, 본 발명자들은 S(N30)의 결실 변이체 구조물을 형성시켰다.

S(N30)의 소수성 잔기 내 아미노산 서열에 기초하여, 코어 소수성 잔기가 영역 S(N30) 내 위치하므로 10개 아미노산 잔기(RQSGRKSSTD) 결실을 결정하였다.

S(N20)-LIR(Fy)-EGFP가 라파마이신으로 자식작용 유도 (도 4 A 및 B) 또는 WT MEFs에서 혈청 기아 동안 발현되면(도 5), 이는 RFP-LC3-양성 자가포식소체에 특이적으로 위치하였다. 후자는 자식작용이 부족한 atg5-/- MEFs가 아닌, WT MEFs NH4Cl 로 라이소좀성 분해의 저해 결과로서 더 강하게 축적되어졌다.

S(N20)-LIR(Fy)-EGFP를 발현하는 세포 및 S(N30)-LIR(Fy)-EGFP를 발현하는 세포 사이에서, GFP 센서의 공위치화에 RFP-LC3-양성 자가포식소체와 유의미한 차이는 나타나지 않았다(도 6).

이러한 결과는 소수성 모티프, LIR에 연결되는 긴 20 아미노산 잔기가, LC3- 양성 자가포식소체에 효과적인 위치화를 위해 충분함을 가리킨다(도 4).

다음으로, LIR의 복제(duplication)가 S(N20)-LIR(Fy)-EGFP의 서브세포성 위치화의 효율성에 영향을 미치는지 여부를 결정하기 위해, 2개의 LIR 모티프를 S(N20)의 C-말단 및 EGFP의 N-말단 사이에 삽입하고; 형성된 구조물을 S(N20)-2xLIR(Fy)-EGFP으로 명명하였다.

RFP-LC3와 함께 S(N20)-LIR(Fy)-2xLIR(Fy)-EGFP가 성공적으로 발현되고 자식작용이 WT MEFs에서 라파마이신으로 유도되었다.

그 결과, 예상외로, S(N20)-2xLIR(Fy)-EGFP는, atg5-/- MEFs가 아닌 WT MEFs에서 시토졸 중 S(N20)-LIR(Fy)-EGFP (단일 LIR 모티프 함유)의 경우와 유사한 방법으로 RFP-LC3-양성 자가포식소체에 위치하였다 (도 7 A 및 B).

이러한 결과는 단일 LIR 모티프가 소수성 모티프(S(N20)와 결합할 때, LC3와의 결합을 통해 자가포식소체 타겟팅에 더욱 효율적이고 충분함을 시사한다.

또한, S(N20)-LIR(Fy)-EGFP가 유사분열 후 뉴런에서 LC3-양성 자가포식소체를 검출하는지 여부를 테스트하기 위해, S(N20)-LIR(Fy)-EGFP를 배양된 피질 WT 또는 atg5-/- 뉴런에서 RFP-LC3로 공발현시켰다.

그 후, 상기 뉴런들을 NH4Cl로 라이소좀성 분해의 저해 동안 라파마이신으로 배양하였다.

그 결과, 도 4 C 및 D에 나타낸 바와 같이, S(N20)-LIR(Fy)-EGFP가 atg5-/- 가 아닌 WT 뉴런에서 RFP-LC3-양성 자가포식소체에 대부분 위치하였다.

실시예 3 : S( N20 )- LIR ( Fy )- EGFP의 자가소화성 액포 내 위치화

S(N20)-LIR(Fy)-EGFP가 센서 후보로 이용될 수 있음을 확인하였으므로, 추가로 S(N20)-LIR(Fy)-EGFP이 외생성 RFP-LC3 발현없이 WT MEFs 및 atg5-/- MEFs 에서 혈청기아 또는 라파마이신에 의해 유도된 자가포식소체에서 내생성 LC3이 특이적으로 검출될 수 있는지 확인코자 하였다.

S(N20)-LIR(Fy)-EGFP가 혈청 기아 또는 라파마이신(10 nM, 4 h)에 의해 우도된 자식작용을 나타내는 WT 또는 atg5-/- MEFs 어느 하나에서 발현되는지 확인하였다.

도 8 A 및 B에 나타난 바와 같이, S(N20)-LIR(Fy)-EGFP는 atg5-/- MEFs가 아닌 WT에서 자가소화성 액포에 효과적으로 위치하였다.

S(N20)-LIR(Fy)-EGFP-양성 자가소화성 액포는 NH4Cl로 라이소좀성 분해의 저해동안 더 강하게 축적되었고, 이는 S(N20)-LIR(Fy)-EGFP가 어떠한 외생성 RFP-LC3 없이 내생성 LC3-양성 자가포식소체를 효과적으로 검출할 수 있음을 의미한다.

또한, WT MEFs에서 내생성 LC3-양성 자가포식소체의 세포성 위치화에 관하여 S(N20)-LIR(Fy)-EGFP 및 S(N20)-2xLIR(Fy)-LIR(Fy)-EGFP를 비교하면, 현저한 차이는 없었고(도 9); 이러한 결과는 도 7에서 보여준 데이터와 일치하였다.

한편, S(N20)-LIR(Fy)-EGFP가 내생성 자가소화성 액포에 위치하는지 직접적으로 테스트하기 위해, 항-LC3 항체를 이용하여 면역세포화학 분석을 수행하고; S(N20)-LIR(Fy)-EGFP-발현 WT 또는 atg5-/- MEFs에서 항-GFP 항체를 이용하여 면역골드-전자-현미경 분석을 수행하였다

그 결과, 도 8C에 나타난 바와 같이, S(N20)-LIR(Fy)-EGFP는 대부분 atg5-/- MEFs 아닌 WT에서 혈청 기아로 자식작용 활성에 의해 유도되는 항-LC3 항체에 의해 검출되는 내생성 LC3-양성 자가포식소체의에 위치함을 확인하였다.

유사하게, GFP-센서 (S(N20)-LIR(Fy)-EGFP)를 발현하는 WT 세포에서 면역골드-표지된 GFP는 자가포식소체 멤브레인 상 및 자가포식소체 내에 우세하게 발견되고(화살표로 표시), 면역골드-표지된 GFP는 또한 세포질에서 가끔 검출되었다(도8D [a-c]). 대조적으로, 골드 입자로 표지된 GFP는 atg5-/- MEF에서 오직 세포질에서 검출되었다 (도 8D[d]).

이러한 데이터들은 명확하게 S(N20)- 8IR(Fy)-EGFP 이 자식작용 유도 동안 MEFs에서 내생성 자가소화성 액포에 우선적으로 위치함을 보여주었고, 또한, S(N20)-LIR(Fy)-EGFP의 새로운 자가포식소체 센서로서의 적합성을 뒷받침한다.

이와 같이, S(N20)-LIR(Fy)-EGFP 는 atg5-/- MEFs가 아닌 WT에서 혈청 기아 또는 라파마이신으로 자식작용 유도 동안 자가소화성 액포에 효과적으로 위치함을 알 수 있었다.

실시예 4 : 자가소화성 플럭스(flux)에의 영향

S(N20)-LIR(Fy)-EGFP는 자식작용 유도 동안 자가소화성 플럭스에 영향을 미치는 일 없이 자가포식소체 형성/축정의 병리학적 공정을 반영한다.

비록 S(N20)-LIR(Fy)-EGFP이 내생성 LC3-양성 자가소화성 액포에 위치하지만 (도 8), 이러한 재조합 단백질은 내생성 LC3을 격리시킬 수 있는 외생성 LIR 모티프의 발현을 통해 자가소화성 플럭스(autophagic flux)에 영향을 미칠 수 있고 이의 기능에 영향을 끼칠 수 있다.

그러므로, S(N20)-LIR(Fy)-EGFP 발현이 WT MEFs에서 자가소화성 플럭스에 영향을 끼칠 수 있는지 여부를 테스트하였다.

자가소화성 플럭스를 측정하기 위해, NH4Cl 존재 또는 부존재 하 S(N20)-LIR(Fy)-EGFP 발현하는 세포에서 LC3-II의 수준을 웨스턴 블랏 분석으로 정량화하였다.

도 10 A 및 B에 나타난 바와 같이, S(N20)-LIR(Fy)-EGFP 발현하는 MEFs는 대조군 세포의 경우와 유사한 유도를 보였고, 이는 S(N20)-LIR(Fy)-EGFP의 발현이 자가소화성 플럭스에 영향을 미치지 않음을 의미한다.

살아있는 세포에서 자가소화성 플럭스를 결정하는 다른 분석으로서, 탠덤 모노머(tandem monomeric) RFP-GFP-태그된 LC3를 포함하는 형광-기반의 분석을 이용하였다.

이 분석에서, GFP 및 RFP 형광의 공위치화는 자가포식소체와 같은 라이소좀과 융합되지 않은 구획(compartment)을 가리키고; 이는 어떠한 약물학적 처리없이 자가소화성 구획을 통해 플럭스의 동시적 평가를 가능하게 한다. 그러므로, Image J software를 이용하여 RFP 및 GFP 신호의 공위치화의 효율을 측정함으로써 S(N20)-LIR(Fy)-CFP-발현하는 MEFs에서 자가소화성 플럭스를 분석하였다.

도 10 C에 나타낸 바와 같이, S(N20)-LIR(Fy)-CFP는 GFP- 및 RFP-LC3-양성 자가소화성 액포 모두에 위치하였다. S(N20)-LIR(Fy)-ECFP 및 ECFP 발현하는 MEFs 에서 공위치화 효율은 유사하였다(도 10 D 및 E).

병리학적 LC3-양성 자가포식소체의 검출을 위한 센서로서 S(N20)-LIR(Fy)-EGFP 및 LC3-EGFP를 비교하기 위해, LC3-EGFP 또는 S(N20)-LIR(Fy)-EGFP를 발현하고 있는 MEFs에서 기아 후 매 3시간마다 자가포식소체 수를 계수하였다 .

흥미롭게도, 도 11에 도시한 바와 같이, 기저 상태(혈청 기아 없이)에서 GFP-LC3-GFP 발현하는 MEFs에서 GFP-LC3 양성 자가포식소체를 쉽게 검출할 수 있었고, 반면, S(N20)-LIR(Fy)-EGFP 양성 자가포식소체는 거의 검출되지 않았다. 그러나, S(N20)-LIR(Fy)-EGFP 발현하는 MEFs에서 자가포식소체의 수는 혈청 기아 후 점차 증가하였다. S(N20)-LIR(Fy)-EGFP 발현하는 MEFs에서 자가포식소체 수는 LC3-EGFP-발현하는 MEFs의 경우와 유사하게 증가되었다 (도 11).

이러한 데이터는, S(N20)-LIR(Fy)-EGFP가 자가소화성 플럭스 영향없이도 내생성 LC3-양성 자가포식소체에 대한 센서로서 사용될 수 있음을 시사한다.

실시예 5 : 세포성 질환 헌팅턴 모델에서의 적용

S(N20)-LIR(Fy)-EGFP 에 기반한 형광 센서가 세포성 질환 모델에서 생성된 자가포식소체 또한 검출할 수 있는지 여부를 알아보기 위해, 자식작용과 강하게 연계되어 있는 헌팅턴 질환(HD)의 세포성 poly(Q) 모델을 선택하였다

상기 세포성 질환 모델에서 신규 자식작용 센서를 평가하기 위해, poly(Q)-확장된 (150Q) 돌연변이 헌팅턴의 N-말단을 EGFP (150Q-Nhtt-EGFP) 또는 16Q-Nhtt-EGFP와 융합시켜 WT 또는 atg5-/- MEFs에서 24~48 시간 동안 발현시켰다.

도 12 A에 나타낸 바와 같이, 150Q-Nhtt-EGFP-발현하는 WT MEFs는 작거나 큰 poly(Q) 응집체 및 S(N20)-LIR(Fy)-RFP-양성 자가소화성 액포를 보여주었다.

poly(Q) 응집체의 일부는 S(N20)-LIR(Fy)-RFP-양성 자가소화성 액포에 축적되어 있었다(도 12). 그러나 atg5-/- MEFs는 어떠한 S(N20)-LIR(Fy)-RFP-양성 자가소화성 액포없이 WT MEFs 보다 훨씬 더 큰 poly(Q) 응집체 및 poly(Q) 응집체의 더 많은 축적을 나타내었다(도 12).

또한, 150Q-Nhtt-EGFP-발현하는 배양된 뉴런에서 S(N20)-LIR(Fy)-RFP이 내생성 LC3-양성 자가포식소체에 위치함을 확인하였다(도 13). 즉, 본 발명의 S(N20)-LIR(Fy)-RFP는 poly(Q)-확장된-돌연변이-헌팅턴-발현 MEFs및 뉴런에 축적된 자가포식소체를 검출할 수 있다.

그리고, 본 발명의 센서를 이용하여 RFP-LC3-양성 액포를 둘러쌀 수 있는 자식 멤브레인을 명확하게 관찰할 수 있었고(도 14). Second, according to our results (Supplementary Fig. 9), 과발현된 RFP-LC3는 때때로 atg5-/- 세포에서 LC3-양성 응집체를 유도하지만, 본 발명의 프로브는 atg5-/- 세포에서 가시적인 응집체를 보여주지 않았다(도 15). 이는 외생성 LC3-양성 자가포식소체의 특이적 검출의 지표가 될 수 있음을 의미한다.

실시예 6 : 돌연변이 FYCO1 LIR 모티프( LIR ( Fy ))의 제작

본 발명자들은 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 야생형 FYCO LIR 모티프와 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 돌연변이형 FYCO LIR 모티프를 갖는 본 발명의 프로브를 제작하여 자가포식작용(autophagy) 유도 과정에서 나타나는 위치화(localization)를 관찰하였다. 위 프로브의 제작과 실험방법은 상기 실시예들과 같다.

야생형 LIR (S(N20)-LIR(Fyco1)-GFP) 또는 돌연변이형 LIR (S(N20)-LIR(Fyco1)_m-GFP) 을 포함하는 구조체(construct)들은 RFP-LC3 와 함께 야생형 MEF에 트랜스펙션되었다. HyD-LIR(Fy)_m-GFP에서, FYCO1의 LIR 모티프들의 보존적 서열((W/F/Y)-X-X-(I/L/V))을 알라닌으로 점-돌연변이시켰다(FYCO1: AVFDI I TD -> AVFDI A TD). 자가포식작용 유도를 위해, 세포를 8시간 동안 기아 상태(serum deprivation)로 만들었다.

공초점 현미경 관찰 결과, 야생형 MEFs에서 상기 야생형 또는 돌연변이형 LIR을 삽입한 본 발명의 프로브들은 자가포식작용(autophagy) 유도 과정 동안 RFP-LC3-양성 자가소화성 액포(autophagic vacuoles)에 위치화하는 것을 확인할 수 있었다(도 16A). 도 16B의 막대 그래프는 세포당 S(N20)-LIR(Fyco1)_WT _/m-GFP-positive dots의 수를 나타내며, 도 16C는 상기 야생형 또는 돌연변이 LIR을 포함하는 센서(프로브)의 형광 강도의 Autophagosome/Cyoxsol 비율을 나타낸다. 상기 결과는 FYCO1의 LIR 부위를 이용한 센서(프로브)가 LIR부위의 LC3와의 결합 기능에 의존적으로 autophagosome으로 위치화한다는 사실을 보여준다.

실시예 7 : autophagosome의 종류에 따른 프로브의 탐지 효과 측정

효모에는 한 개의 LC3(ATG8)가 존재하는 반면 포유류에는 6개의 LC3 family (LC3A, LC3B, LC3C, GABARAP, GABARAPL1, GABARAPL2)가 존재한다.

도 17(A)는 자가포식작용 유도에 따른 MEF에서 S(N20)-LIR(Fyco1)-GFP 구조체의 세포 내 위치화를 나타내는 공초점 현미경 사진이다. S(N20)-LIR(Fyco1)-GFP 구조체는 RFP-LC3, mRFP-GABARAP 또는 mRFP-GABARAPL2 와 함께 트랜스펙션(co-transfected) 시키고, 24시간 후에, 세포들을 10 mM NH₄Cl에 의한 lysosomal inhibition 조건에서 10 nM rapamycin과 함께 4시간 동안 배양시켰다. Scale bar, 10 μm. 도 17(B)의 막대 그래프는 센서(프로브)-양성 RFP-LC3, mRFP-GABARAP 또는 mRFP-GABARAPL2의 비율을 나타내며, 도 17(C)는 S(N20)-LIR(Fyco1)-GFP의 형광 강도의 Autophagosome/Cyoxsol 비율을 나타낸다.

상기 결과들은 본 발명의 센서(프로브)가 autophagosome 중에 GABARAP, GABARAPL2-양성(positive) autophagosome보다 LC3B-양성(positive) autophagosome을 더 잘 탐지한다는 것을 보여준다.

상기 결과를 통해 본 발명의 새로운 센서 S(N20)-LIR(Fy)-RFP가 세포성 질환 모델에서 병리학적 상태 하 생성되는 LC3-양성 자가포식소체의 검출에 사용될 수 있음을 알 수 있다.

이러한 결과들을 통해 본 발명의 프로브를 이용한 자가포식소체 검출법은 그 효과가 우수하여 손쉽게 효과적으로 LC3-양성 자가포식소체의 검출이 가능한 바, 이를 바탕으로 앞으로 LC3-양성 자가포식소체 관련 질환을 앓고 있는 환자에서 의 활용도가 높을 것이다.

<110> Industry Academic Cooperation Foundation of Kyungpook National University Institute for Industry-Academy Cooperation of Hannam University SNU R&DB Foundation <120> Probes for detecting autophagosome derived from FYCO1 and uses thereof <130> PN1701-063 <150> KR 16/0011365 <151> 2016-01-29 <160> 4 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> N30 peptide sequence <400> 1 Met Gln Lys Leu Asn Phe Leu Ser Pro Leu Phe Asn Lys Asn Gly Lys 1 5 10 15 Asn Arg Asp Gly Arg Gln Ser Gly Arg Lys Ser Ser Thr Asp 20 25 30 <210> 2 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> N20 peptide sequence <400> 2 Met Gln Lys Leu Asn Phe Leu Ser Pro Leu Phe Asn Lys Asn Gly Lys 1 5 10 15 Asn Arg Asp Gly 20 <210> 3 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LIR motif of FYCO1 <400> 3 Arg Pro Pro Asp Asp Ala Val Phe Asp Ile Ile Thr Asp Glu Glu Leu 1 5 10 15 Cys Gln Ile Gln Glu Ser Gly Ser 20 <210> 4 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutant of LIR motif of FYCO1 <400> 4 Arg Pro Pro Asp Asp Ala Val Phe Asp Ile Ala Thr Asp Glu Glu Leu 1 5 10 15 Cys Gln Ile Gln Glu Ser Gly Ser 20

Claims

FYCO1 (FYVE and coiled-coil domain containing 1)으로부터 유래된 LIR (LC3-interacting region) 모티프; ApPDE4 (Aplysia phosphodiesterase 4)의 N-말단 소수성 도메인; 및 리포터 형광 단백질 부위를 함유하는 자가포식소체 검출용 프로브.
제1항에 있어서,
상기 N-말단 소수성 도메인은 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 자가포식소체 검출용 프로브.
제1항에 있어서,
상기 FYCO1 으로부터 유래된 LIR 모티프는 서열번호 3 또는 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 자가포식소체 검출용 프로브.
제1항에 있어서,
상기 리포터 형광 단백질은 증강된 녹색 형광 단백질(enhanced green fluorescent protein; EGFP) 또는 변형된 적색 형광 단백질(modified red fluorescent protein; mRFP)인 것을 특징으로 하는 자가포식소체 검출용 프로브.
제1항에 있어서,
상기 FYCO1 은 인간으로부터 유래된 것을 특징으로 하는 자가포식소체 검출용 프로브.
제1항에 있어서,
상기 프로브는 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 N-말단 소수성 도메인; 상기 도메인에 연결된 서열번호 3 또는 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 FYCO1 으로부터 유래된 LIR 모티프; 및 상기 LIR 부위에 연결된 EGFP 또는 mRFP를 포함하는 것을 특징으로 하는 자가포식소체 검출용 프로브.
제1항에 있어서,
상기 프로브는 자가소화성 액포(autophagic vacuoles)에 위치(localization)하는 것을 특징으로 하는 자가포식소체 검출용 프로브.
제1항의 자가포식소체 검출용 프로브 또는 이를 발현하는 벡터를 포함하는 자가포식소체 검출용 조성물.
제1항의 프로브 또는 제8항의 조성물을 이용하되, 리포터 형광 단백질의 발현량이 정상 대조군보다 증가하는 경우 세포 내 자가포식소체 수 및 자식작용이 증가하는 것으로 판별하는 것을 특징으로 하는, 자식작용에 대한 정보 제공 방법.
제9항에 있어서,
상기 정보는 헌팅턴 질환(Huntington's disease)에 관한 것을 특징으로 하는 정보 제공 방법.