WO2007138810A1 - 神経変性疾患の予防・治療剤 - Google Patents

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WO2007138810A1
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Hitoshi Okazawa
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National University Corporation Tokyo Medical And Dental University
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    • C12Q2600/158—Expression markers

Definitions

  • the present invention relates to a preventive / therapeutic agent for neurodegenerative diseases (for example, polyglutamine disease), and a method of screening a substance having a preventive / therapeutic effect on neurodegenerative diseases (for example, polyglutamine disease).
  • a preventive / therapeutic agent for neurodegenerative diseases for example, polyglutamine disease
  • a method of screening a substance having a preventive / therapeutic effect on neurodegenerative diseases for example, polyglutamine disease
  • Polyglutamine disease such as Huntington's disease is a neurodegenerative disease caused by abnormally elongated polyglutamine chains present in the causative gene product.
  • Creine which is involved in muscle contraction
  • minocycline which is an apoptosis inhibitor
  • polyglutamine disease model mice it is difficult to clinically use an anti-apoptotic drug in force, where it is widely pointed out that apoptosis causes cell death.
  • Patent Document 1 discloses an oligosaccharide or a compound containing an oligosaccharide moiety as a substance capable of preventing or treating polyglutamine disease by inhibiting protein aggregation induced by abnormally extended polyglutamine chain.
  • HMGB family proteins are a type of HMG (High Mobility Group: high-speed movement group protein).
  • HMG is a group of non-histone proteins extracted from chromatin by 0.35 M NaCl and showing high mobility by electrophoresis, and is present in the nuclei of all higher organisms, and its amino acid sequence is highly elevated among higher organisms. It is saved.
  • HMGB family tongue The proteins are abundant in the nucleus and are well conserved among species, which suggests that the HMGB family protein plays an important role in the nucleus.
  • HMGB Family The exact function of HMGB is unknown
  • the HMGB protein has two HMG boxes for DNA binding, transcription factors, site-specific recombinant proteins, DNA repair proteins, silencing complexes, viruses Interacting with proteins (Non-patent Document 1), has a region rich in acidic and basic amino acids at the C-terminus, is inserted between DNA and histone complexes, and plays an important role in the reconstitution of genomic DNA. Recombinement of nucleosome by preferentially binding to distorted DNA, bending DNA, loosening wrapped DNA and promoting the proximity of chromatin remodeling complexes Promoting (Non-patent Document 2) etc. have been reported.
  • Patent Document 1 Japanese Patent Application Laid-Open No. 2003-267874
  • Non-patent literature l Agresti, A. et al., Curr. Opin. Genet Develop. 13, 170-178.
  • Non-patent literature 2 Travers A. E. EMBO reports 4, 131-136. (2003)
  • the present invention is primarily aimed at providing a preventive 'therapeutic agent for neurodegenerative diseases (eg, polyglutamine disease).
  • neurodegenerative diseases eg, polyglutamine disease
  • Another object of the present invention is to provide a method of screening for substances having a preventive-therapeutic effect against neurodegenerative diseases (eg, polyglutamine disease).
  • neurodegenerative diseases eg, polyglutamine disease
  • the present invention provides HMGB family proteins that function in the nucleus by binding to abnormal polyglutamine proteins produced in neurodegenerative diseases such as HMGB family proteins and polyglutamine diseases, and being incorporated into nuclear inclusion bodies. Reduction, which results in a neurodegenerative disease such as polydaltamine disease, as well as complementing (eg, replenishing the reduced HMGB family proteins) or reducing the reduction of HMGB family proteins that function in the nucleus. Based on the new findings, it is possible to prevent and treat neurodegenerative diseases such as polyglutamine disease by suppressing (eg, inhibiting the binding between HMGB family protein and abnormal polyglutamine protein). It is completed and to solve the above-mentioned subject In addition, the present invention provides the following agents for preventing and treating neurodegenerative diseases, and methods of screening for substances having preventive and therapeutic effects on neurodegenerative diseases.
  • a preventive-therapeutic agent for neurodegenerative diseases which comprises an HMGB family protein or a derivative thereof.
  • the above HMGB family protein power The prophylactic 'therapeutic agent according to the above (1), which is a protein according to the following (a) or (b).
  • a protein consisting of an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted, added or inserted in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2, 4, 6 or 8, which abnormality occurs in neurodegenerative disease With binding activity to type B polyglutamine protein
  • a therapeutic / prophylactic agent for neurodegenerative diseases which comprises a recombinant vector capable of expressing an HMGB family protein or a derivative thereof.
  • a protein consisting of an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted, added or inserted in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2, 4, 6 or 8, which abnormality occurs in neurodegenerative disease Encoding a protein having binding activity to type B polyglutamine protein
  • the test substance is HMGB protein or a derivative thereof, and a neurodegenerative disease
  • V Determining whether or not to inhibit the binding to the abnormal polyglutamine protein produced, and screening the test substance that inhibits the binding as a substance having a preventive or therapeutic effect against neurodegenerative diseases.
  • test substance induces the expression of the gene encoding the HMGB family protein or its derivative, and the test substance that induces the expression has a therapeutic effect on the neurodegenerative disease.
  • a screening method for a substance having a preventive and / or therapeutic effect on neurodegenerative diseases which comprises the step of screening as
  • the present invention provides a preventive / therapeutic agent for neurodegenerative diseases such as polyglutamine disease, and a method of screening a substance having a preventive / therapeutic effect on neurodegenerative diseases such as polyglutamine disease.
  • FIG. 1 shows a standard protocol for nuclear protein purification.
  • Fig. 2 shows whole cell lysate (Rane 1) of cortical neurons expressing mutant polyglutamine protein (AH-82Q) or cortical neurons expressing mutant polyglutamine protein (Httl 11Q), the same cells.
  • Fig. 6 shows the results of Western blot analysis using a CAG53b antibody for soluble protein fractions (lane 2) and non-soluble fractions (lane 3) of nuclear extracts that were also prepared.
  • FIG. 3 shows representative spots showing large differences (more than 2 times) between soluble proteins of neuronal nuclear extracts expressing normal and mutant polyglutamine proteins.
  • FIG. 4 shows immunohistological analysis of adenovirus vector-infected primary cortical neurons (3 days after infection) with anti-HMGB protein antibody and anti-Htt (N18) antibody or anti-ATI (H21) antibody. It is a figure which shows a result.
  • FIG. 5 shows the results of Western blotting using CAG53b antibody and anti-GFP antibody and the result of immunoprecipitation using anti-HMGB or anti-EGFP antibody.
  • FIG. 6 shows the result of pull-down assay using HeLa cells expressing polyglutamine protein.
  • FIG. 7 shows the results of analysis by immunohistochemistry using mutant Htt transgenic mice and ATI knock-in mice, and the results of quantitative analysis of signal intensity.
  • FIG. 8 shows the results of analysis by immunohistochemistry of ATI knock-in mice and the results of quantitative analysis of signal intensity.
  • Fig. 9 shows the suppressive effect of HMGB on mutant Htt-induced cell death in cortical neurons
  • Fig. 9b is a Western blot of Htt and HMGB protein expression levels in primary cortical neurons. It is a figure which shows the confirmation result by.
  • Fig. 10a is a diagram showing Purkinje cells stained with anti-calbindin 28K antibody and showing the degree of survival and neurite outgrowth using Aquacosmos (HA MAMATSU), and Fig. 10b shows infected primary cortical neurons.
  • FIG. 6 shows the results of confirmation of expression levels of ATI and HMGB proteins in yeast by western blot.
  • Fig. 11 shows the results of quantitative analysis of Purkinje cell survival.
  • Fig. 11b shows the results of quantitative analysis of Purkinje cell neurite outgrowth. It is a figure which shows the quantitative analysis result regarding the neurite branch of a Purkinje cell.
  • FIG. 12 shows the results of observation of the modification of the eyes of the fly fly that expresses mutant type ATI using a light microscope and an electron microscope.
  • FIG. 13 is a diagram showing the results of histological analysis of the cut surface of the eye, showing the effect of HMGB1 on the Htt-induced order degeneration of the fly snail.
  • the agent for preventing and / or treating neurodegenerative diseases of the present invention contains HMGB family proteins or derivatives thereof, or recombinant vectors capable of expressing HMGB family proteins or derivatives thereof.
  • the "HMGB family protein” includes any protein belonging to the HMGB family. Examples of proteins belonging to the HMGB family include HMGB1, HMGB2, HMGB3 and the like. The properties, functions, etc.
  • HMGB proteins commonly possessed by the proteins belonging to the HMGB family include, for example, a group of non-histone proteins which are extracted from chromatin by 0.35 M NaCl and show high mobility in electrophoresis; Composed of about 200 amino acids and having the motif of HMG Box, flexibly recognize the DNA structure via HMG Box, bind nonspecifically to the base sequence non-specifically, bend the DNA molecule and regulate transcription, nucleosome Linker One: acting on DNA and participating in chromatin remodeling, interacting with many molecules such as transcription factor, site-specific recombination enzyme, DNA repair protein, virus-derived protein (Agresti, A. & Bianchi , ME (2003) HMGB proteins and gene expression. Urr. Opin. Genet Develop. 13 170-178 J and the like.
  • the "HMGB family protein” includes HMGB family proteins derived from any higher organisms. That is, since the amino acid sequence of the HMGB family protein is highly conserved among higher organisms, the HMGB family protein derived from the same species as the target / preventive species and the HMGB family protein as well as the heterologous HMGB family protein can be prevented. You may use it for For example, when the subject to be treated for prevention is human, HMGB family proteins derived from humans and HMGB family proteins derived from non-human higher organisms may be used. However, when the subject to be treated is human, it is preferred to use the HMGB family protein of human origin.
  • the "HMGB family proteins” include wild type HMGB family proteins, as well as mutant HMGB family proteins that retain the binding activity to abnormal polyglutamine proteins produced in neurodegenerative diseases.
  • the mutant HMGB family proteins also constitute amino acid sequences in which one or more amino acids are deleted, substituted, added or inserted in the amino acid sequence of a wild type HMGB family protein.
  • the number and position of amino acids deleted, substituted, added or inserted in the amino acid sequence of the wild-type HMGB family protein are particularly limited as long as the binding activity to abnormal polyglutamine protein produced in neurodegenerative diseases is maintained. It is not a thing. Deletion, substitution, addition or insertion
  • the number of amino acids introduced is usually 20 or less, preferably 10 or less (eg, 5 or less, 3 or less, or 1).
  • the mutant HMGB family protein has one or more of transcription promoting activity, DNA repair promoting activity, cell death suppressing activity, etc., in addition to the binding activity to abnormal polyglutamine protein produced in neurodegenerative diseases. It is preferable to hold The mutant HMGB family protein, which retains the binding activity to the abnormal polyglutamine protein that occurs in neuropathic diseases, binds the abnormal HMGB family protein to the abnormal polyglutamine protein by binding to the abnormal polyglutamine protein. It can be incorporated into inclusion bodies and suppress the decrease of endogenous HMGB family proteins that function in the nucleus, thereby preventing or treating neurodegenerative diseases.
  • Wild-type HMGB family proteins can prevent and treat neurodegenerative diseases by the same mechanism of action as mutant HMGB family proteins, and also function in place of endogenous HMGB family 1 proteins incorporated into inclusion bodies. Can prevent and treat neurodegenerative diseases. Mutant HMGB family protein power In addition to the binding activity to abnormal polyglutamine protein generated in neurodegenerative diseases, mutant HMGB family protein if it retains activities such as transcription promotion activity, DNA repair promotion activity and cell death suppression activity. By acting in place of endogenous HMGB family proteins incorporated into inclusion bodies, neurodegenerative diseases can be prevented and treated.
  • HMGB family proteins include the proteins described in the following (a) or (b).
  • protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, 4, 6 or 8 (hereinafter referred to as “protein
  • protein (b) A protein consisting of an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted, added or inserted in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2, 4, 6 or 8, which abnormality occurs in neurodegenerative disease Protein having a binding activity to polyglutamine protein of type (hereinafter referred to as "protein (b)")
  • the amino acid sequence force protein of SEQ ID NO: 2 is HMGB1 of human origin
  • the amino acid sequence force protein of SEQ ID NO: 4 and 6 is HMGB2 of human origin
  • a protein that also has the amino acid sequence strength shown in SEQ ID NO: 8 is HMGB3 of human origin.
  • the protein having the amino acid sequence force shown in SEQ ID NOS: 4 and 6 is considered to be a splice variant.
  • the number and position of amino acids deleted, substituted, added, or inserted in the amino acid sequences of SEQ ID NO: 2, 4, 6 or 8 are the same as in the case of neurodegenerative diseases, in which the binding activity to abnormal polyglutamine protein is maintained. It is not particularly limited as long as The number of amino acids to be deleted, substituted, added or inserted is usually 20 or less, preferably 10 or less (eg, 5 or less, 3 or less, or 1).
  • mutations such as deletion, substitution, or addition have been introduced to the protein).
  • proteins include, for example, mammals including humans (eg, humans, monkeys, animals, dogs, dogs, dogs, dogs, dogs, dogs, dogs, dogs, etc.) And proteins from Usagi, dogs, cats, mice, rats, etc.), including proteins that can be generated by polymorphisms in these mammals.
  • Aberrant polyglutamine protein caused by neurodegenerative disease is produced by adding a repeating sequence of three bases (CAG) encoding polyglutamine chain to the causative gene of neurodegenerative disease.
  • CAG repeating sequence of three bases
  • a protein with an abnormally extended polyglutamine chain added.
  • As a neurodegenerative disease and its causative gene Huntington's disease Z Huntingtin gene, Spinocerebellar degeneration Z-Ataxin-1, -2, -3, -6, -7, -17 gene, Denticulocyte red nucleus palsy Examples include bulbar atrophy ZDRPLA gene, bulbar and spinal muscular atrophy Z androgen receptor gene, and the like.
  • the abnormally elongated polyglutamine chain contained in the abnormal polyglutamine protein usually contains 40 or more glutamine residues.
  • the "derivative of HMGB family protein” includes any derivative as long as the binding activity to abnormal polyglutamine protein generated in neurodegenerative diseases is maintained.
  • the derivatives of HMGB family proteins include, for example, glycosylated HMGB family proteins, pharmaceutically acceptable salts of HMGB family proteins, and fusion proteins containing HMGB family proteins.
  • the types, positions, etc. of sugar chains added to HMGB family proteins differ depending on the type of host cell used in the production of HMGB family proteins. Also included are proteins obtained using any host cell.
  • HMGB family proteins examples include non-toxic alkali metal salts such as sodium, potassium, lithium, calcium, magnesium, sodium, ammonium and alkaline earth metal salts. And ammonium salts, non-toxic acid addition salts and the like.
  • non-toxic acid addition salts for example, hydrochloride, hydrochloride, hydrobromide, sulfate, bisulfate, acetate, borate, valerate, oleate, laurate, oxalic acid Salt, salt, salt, lactate, phosphate, p-toluenesulfonate (tosylate), citrate, maleate, fumarate, succinate, tartrate, sulfonate, glycol Acid salts, maleate salts, ascorbic acid salts, benzene sulfonates and the like.
  • proteins or peptides to be fused with HMGB family proteins include ⁇ -galactosidase, protein ⁇ , IgG binding region of protein ⁇ ⁇ , chloramphenicol 'acetyltransferase, poly (Arg), poly (Glu), Protein G, maltose binding protein, glutathione S-transferase (GST), polyhistidine chain (His-tag), S peptide, DNA binding protein domain, Tac antigen, thioredoxin, green 'fluorescent' protein, hemagglutin protein (HA )-tag, FLAG-tag, Myc-tag, GAL4-AD, T7 gene 10 protein, ushipa pilloma virus LI protein, streptavidin, VSV-G-tag, TAT (Trans-activating protein), TAT-derived PTD ( protein transd uction domain), etc.
  • HMGB family protein can be improved by fusing HMGB family protein with hemagglutinin protein (HA) -tag, FLAG-tag, GAL4-AD and the like.
  • HA hemagglutinin protein
  • FLAG-tag FLAG-tag
  • GAL4-AD hemagglutinin protein
  • HMGB family proteins can be imparted with cell membrane permeability.
  • the "recombinant vector capable of expressing the HMGB family protein or its derivative” is a fusion protein comprising HMGB family protein or HMGB family protein. And a promoter provided upstream thereof.
  • the recombinant vector can be produced by inserting a DNA fragment encoding a fusion protein containing HMGB family protein or HMGB family protein downstream of the promoter of an appropriate expression vector.
  • the DNA fragment encoding the HMGB family protein or the fusion protein containing the HMGB family protein is required to be incorporated into the expression vector so that its function can be exhibited, and the expression vector is not only a promoter but also an enhancer.
  • Etc. having a cis element such as a splicing signal, a poly-A attachment signal, a selective marker (eg, a dihydrofolate reductase gene, an ampicillin resistance gene, a neomycin resistant gene), a ribosome binding sequence (SD sequence), etc. Even!
  • a cis element such as a splicing signal, a poly-A attachment signal, a selective marker (eg, a dihydrofolate reductase gene, an ampicillin resistance gene, a neomycin resistant gene), a ribosome binding sequence (SD sequence), etc.
  • the expression vector is not particularly limited as long as it can be autonomously replicated in the cells of the target species to be treated and / or treated.
  • a plasmid vector, a phage vector, a virus vector and the like can be used.
  • plasmid vectors include plasmids derived from E.
  • phage vectors include, for example, ⁇ phage (for example, Charon4A, Charon21A, EMBL3, EMBL4, gtl0, gtll, ⁇ , etc.), and as virus vectors,
  • animal viruses such as retrovirus, vaccinia virus, adenovirus and insect viruses such as baculovirus can be mentioned.
  • Examples of the DNA encoding the HMGB family protein include the DNAs described in the following (c) to (f).
  • DNA (c) DNA encoding a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, 4, 6 or 8 (hereinafter referred to as “DNA (c)”)
  • a protein consisting of an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted, added or inserted in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2, 4, 6 or 8, which abnormality occurs in neurodegenerative disease Encoding a protein having a binding activity to the type-polyglutamine protein (hereinafter referred to as "DNA (d)"!
  • DNA (e) DNA having the ability of the base sequence listed in SEQ ID NO: 1, 3, 5 or 7 (hereinafter referred to as "DNA (e)")
  • DNA and stringency complementary to DNA consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, 3, 5 or 7 DNA which can be hybridized under various conditions, and which encodes a protein having binding activity to abnormal polyglutamine protein produced in neurodegenerative diseases (hereinafter referred to as "DNA (f)").
  • the DNAs having the base sequences listed in SEQ ID NOs: 1, 3, 5 and 7 have SEQ ID NOs: 2, 4 and 7, respectively.
  • stringent conditions include the conditions of 42 ° C, 2X SSC and 0.1% SDS, preferably the conditions of 65 ° C, 0.1 X SSC and 0.1% SDS, and the sequence As a DNA that can be hybridized under stringent conditions with a DNA complementary to the DNA having the nucleotide sequence number 1, 3, 5 or 7 listed under SEQ ID NOs: 1, 3, 5 or 7. And DNA having a homology of 80% or more, preferably 95% or more (eg, 97% or more, 98% or more, 99% or more) with the DNA consisting of
  • DNAs (d) and (f) may be DNA that has been artificially mutated with respect to DNA (c) or (e), as well as naturally occurring DNA in which mutation has been introduced, It also includes DNA artificially introduced with mutations.
  • Naturally occurring DNAs in which mutations have been introduced include, for example, mammals including humans (eg, humans, monkeys, dogs, dogs, dogs, dogs, dogs, dogs, dogs, dogs, dogs, cats, etc. , DNAs derived from mice, rats, etc.) (including DNAs that can be generated by polymorphisms in these mammals).
  • Artificial mutations to DNA (c) or (e) can be introduced, for example, by site-directed mutagenesis.
  • the introduction of a mutation can be carried out, for example, using a kit for introducing a mutation, for example, Mutant-K (TaKaRa), Mutant-G (TaKaRa), or a TaKaRa LA-PCR in vitro Mutagenesis series kit.
  • a kit for introducing a mutation for example, Mutant-K (TaKaRa), Mutant-G (TaKaRa), or a TaKaRa LA-PCR in vitro Mutagenesis series kit.
  • a DNA encoding HMGB family protein is a cDNA library prepared using mRNA extracted from tissue of mammalian tissue (eg, brain, liver, kidney etc.) such as human, as shown in SEQ ID NOS: 1, 3 It can be obtained by screening a clone containing the DNA of interest from a cDNA library using a probe synthesized based on the nucleotide sequence described in 5 or 7 above. In addition, when the base sequence has already been determined, chemical synthesis can also be performed.
  • DNA synthesizer for example, a DNA synthesizer (manufactured by Shimadzu Corporation) using the thiophosphite method, a DNA synthesizer using the phosphoramidite method (Perkin-E. It can be carried out using Luma 1).
  • the cDNA library can be prepared, for example, as follows. After total RNA is obtained from tissues of mammals (eg, brain, liver, kidney, etc.) from humans, etc., it is prepared by affinity column method using oligo dT-cellulose, poly (U-sepharose), etc., notch method, etc. Poly (A) + RNA (mRNA) is obtained. At this time, poly (A) + RNA (mRNA) may be fractionated by sucrose density gradient centrifugation or the like.
  • single-stranded cDNA is synthesized using an oligo dT primer and a reverse transcriptase, and then double-stranded cDNA is synthesized from the single-stranded cDNA.
  • the double-stranded cDNA thus obtained is incorporated into a suitable cloning vector to prepare a recombinant vector, and the recombinant vector is used to transform a host cell such as E. coli to obtain tetracycline resistance and ampicillin resistance. By selecting transformants as an index, a library of cDNA can be obtained.
  • a cloning vector for producing a cDNA library may be, for example, phage vector, plasmid vector, etc., as long as it can be replicated autonomously in a host cell.
  • a host cell for example, Escherichia coli can be used. Transformation of a host cell such as E. coli can be carried out by a method such as adding a recombinant vector to combinatorial cells prepared in the presence of calcium chloride, magnesium chloride or rubidium chloride.
  • a plasmid it is preferable to contain a drug resistance gene such as tetracycline or ampicillin.
  • a commercially available kit for example, Superscript Plasmid, is used to produce a cDNA library.
  • a primer is synthesized based on the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1 or 3, and used to synthesize a polymerase chain reaction (PCR). Perform to obtain a PCR amplified fragment.
  • the PCR amplified fragment may be subcloned using an appropriate plasmid vector.
  • An objective DNA can be obtained by performing colony hybridization or plaque hybridization on a cDNA library using the PCR amplified fragment as a probe.
  • a PCR amplified fragment may be isotope (eg, ⁇ SUP> 32 ⁇ / SUP> P, SUP> 35 ⁇ / SUP> S), those labeled with piotin, digoxigenin etc. can be used.
  • a clone containing the target DNA can also be obtained by expression screening such as immuno screening using an antibody.
  • the nucleotide sequence of the obtained DNA is cut into the DNA fragment as it is or with a suitable restriction enzyme and then incorporated into a vector by a conventional method, and a commonly used nucleotide sequence analysis method, for example, Maxam Gilbert's It can be determined using a chemical modification method or deoxynucleotide chain termination method. Alternatively, sequencing can be performed using a base sequence analyzer such as 373A DNA Sequencer (manufactured by Perkin Elmer).
  • HMGB family protein can be obtained, and HMGB family 1 protein can be produced by expressing the obtained DNA in host cells according to the following steps. .
  • a DNA fragment of appropriate length containing the coding region of the protein of interest is prepared.
  • a DNA is prepared in which bases are substituted so that the base sequence of the coding region of the target protein is the optimum codon for expression in the host cell.
  • a recombinant vector By inserting this DNA fragment downstream of the promoter of an appropriate expression vector, a recombinant vector can be produced, and the recombinant vector can be introduced into an appropriate host cell to produce the target protein. Transformants can be obtained.
  • the above-mentioned DNA fragment needs to be incorporated into a vector so that its function can be exhibited, and the vector may be a promoter, cis-element such as enhancer, splicing signal, poly
  • It can contain an A addition signal, a selection marker (eg, dihydrofolate reductase gene, ampicillin resistance gene, neomycin resistance gene), ribosome binding sequence (SD sequence) and the like.
  • a selection marker eg, dihydrofolate reductase gene, ampicillin resistance gene, neomycin resistance gene
  • SD sequence ribosome binding sequence
  • the expression vector is not particularly limited as long as it is capable of autonomous replication in a host cell, and for example, a plasmid vector, a phage vector, a virus vector and the like can be used.
  • plasmid vectors include plasmids derived from E. coli (eg, pRSET, pBR322, pBR325, pUC118, pUC119, pUC18, pUC19), Bacillus subtilis Plasmid (eg, pUB110, pTP5), plasmid derived from yeast (eg, 1313, 2424,
  • phage vectors examples include ⁇ phage (eg, Charon)
  • EM EMBL3, EMBL4, gt10, gtll, ⁇ ZAP animal viruses
  • virus vector for example, animal viruses such as retrovirus, vaccinia virus, adenovirus, and insect viruses such as baculovirus Be
  • any of prokaryotic cells, yeast, animal cells, insect cells, plant cells and the like may be used as long as they can express the target gene.
  • animals, plants, silkworms etc. may be used.
  • Escherichia coli such as Escherichia coli
  • Bacillus sp Such as Bacillus subtilis, Bacillus sp.
  • Bacteria belonging to the genus Lysobium, such as Rhizobium meliloti can be used as host cells.
  • Bacillus subtilis can be used as a host cell.
  • the promoter in this case is not particularly limited as long as it can be expressed in bacteria such as E. coli, for example, trp promoter, lac promoter, P ⁇ sub> SUB> L ⁇ / sub> promoter, P ⁇ sub> SUB> R ⁇ / A promoter derived from E. coli, phage or the like such as SUB> promoter can be used.
  • artificially designed and modified promoters such as tac promoter, lacT7 promoter and let I promoter are used.
  • the method for introducing a recombinant vector into bacteria is not particularly limited as long as it is a method by which DNA can be introduced into bacteria. For example, using a method using calcium ion, electoral porosity method, etc. Can.
  • Saccharomyces cerevisiae Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Pichia pastoris or the like can be used as a host cell.
  • the promoter in this case is not particularly limited as long as it can be expressed in the yeast, for example, gall promoter, gallO promoter A mouth motor, heat shock protein promoter, 1 promoter, PH05 promoter, PGK promoter, GAP promoter, ADH promoter, AOX1 promoter, etc. can be used.
  • the method for introducing a recombinant vector into yeast is not particularly limited as long as it is a method capable of introducing DNA into yeast, and for example, electoral clearance method, sulfoplast method, lithium acetate method, etc. are used. be able to.
  • monkey cell COS-7, Vero, Chinese no, Muster ovary cell (CHO cell), mouse L cell, rat GH3 or human FL cell etc. should be used as a host cell.
  • the promoter in this case is not particularly limited as long as it can be expressed in animal cells, and, for example, SRa promoter, SV40 promoter, LTR (Long Terminalal Repeat) promoter, CMV promoter, early remains of human cytomegalovirus A gene promoter can be used.
  • the method for introducing the recombinant vector into animal cells is not particularly limited as long as it is a method by which DNA can be introduced into animal cells.
  • electoral clearance method for example, electoral clearance method, calcium phosphate method, lipofection method, etc. may be used.
  • ovarian cells of Spodoptera frugiperda ovarian cells of Trichoplusia ni, cultured cells derived from silkworm ovary, etc. can be used as host cells.
  • the method for introducing a recombinant vector into an insect cell is not particularly limited as long as it can introduce DNA into an insect cell, and for example, a calcium phosphate method, a lipofection method, an electrification method or the like can be used. .
  • the transformant into which the recombinant vector into which the DNA encoding the target protein has been incorporated, has been introduced and cultured according to a conventional culture method. Culturing of transformants can be performed according to a conventional method used for culturing host cells.
  • a carbon source carbohydrates such as glucose, fructose, sucrose and starch, organic acids such as acetic acid and propionic acid, and alcohols such as ethanol and propanol can be used.
  • Nitrogen sources include ammonia, ammonium chloride, ammonium sulfate, ammonium acetate, ammonium acetate, ammonium salts of inorganic acids or organic acids such as ammonium salts, peptones, meat extracts Yeast extract, corn steep liquor, casein hydrolyzate, etc. can be used.
  • the inorganic salt it is possible to use monopotassium phosphate, dipotassium phosphate, magnesium phosphate, magnesium sulfate, sodium chloride, ferrous sulfate, manganese sulfate, copper sulfate, calcium carbonate, etc. .
  • Culturing of the transformant is performed under aerobic conditions such as shaking culture or aeration and stirring culture.
  • the culture temperature is usually 30 to 37 ° C.
  • the culture time is usually 12 to 16 hours
  • the pH is maintained at 6. 0 to 8.0 during the culture period.
  • the pH can be adjusted using an inorganic acid, an organic acid, an alkali solution, urea, calcium carbonate, ammonia or the like.
  • antibiotics such as ampicillin and tetracycline may be added to the medium as necessary.
  • an inducer may be added to the medium as needed.
  • an inducer may be added to the medium as needed.
  • a microorganism transformed with an expression vector using a lac promoter a microorganism transformed with isopropyl-.beta.-D-thiogalatopyranoside etc. or an expression vector using a trp promoter may be used.
  • RPMI 1640 medium, Eagle's MEM medium, ⁇ -MEM medium, DMEM medium or fetal bovine serum etc. in these media are commonly used as a medium for culturing transformants obtained using animal cells as host cells. And the like can be used. Culturing of transformants is usually carried out at 30 to 37 ° C. for 1 to 7 days in the presence of 5% CO ⁇ SUB> 2 ⁇ / SUB>.
  • antibiotics such as kanamycin, penicillin, streptomycin, neomycin, o, idaromycin and blasticidin may be added to the medium as necessary.
  • TNM-FH medium manufactured by Pharmingen
  • TC-100 medium manufactured by G3 ⁇ 4co BRL
  • Sf-900 II SFM medium Gibco BRL
  • ExCell 400 ExCell 405 (JRH Biosciences) or the like
  • Cultivation of transformants is usually performed at 25-28 ° C. for 48-96 hours.
  • antibiotics such as gentamycin to the medium as needed.
  • the target protein can also be expressed as a secreted protein or a fusion protein.
  • Proteins to be fused include, for example, j8-galatatidase, protein A, IgG binding region of protein A, chloramphetol 'acetyl transferase, poly (Arg), poly (Glu), protein G, maltose binding protein, daltathione S- Transferase, poly-histidine chain (His-tag), S peptide, DNA binding protein domain, Tac antigen, thioredoxin, green 'fluorescent' protein, hemagglutinin protein (HA) -tag, FLAG-tag, Myc-tag, Examples include T7 gene 10 protein, sicula pilloma virus L1 protein, VSV-G-tag and the like.
  • the target protein By collecting the target protein from the culture of the transformant, the target protein can be obtained.
  • the term "culture” includes any of culture supernatant, cultured cells, cultured cells, crushed cells or cells.
  • the cells in the culture are collected by centrifuging the culture, the cells are washed, and then the cells are disrupted to achieve the objective. Extract the protein to be When the target protein is secreted outside the transformant, the culture supernatant is used as it is or cells or cells are removed from the culture supernatant by centrifugation or the like.
  • the protein thus obtained can be obtained by solvent extraction, salting out with ammonium sulfate etc., precipitation with an organic solvent, jetylaminoethyl (DEAE) -Sepharose, ion exchange chromatography, hydrophobic chromatography, etc. Purification can be carried out by the graphic method, gel filtration method, affinity chromatography or the like.
  • the Fmoc method fluorenylmethyloxyca It can also be produced by a chemical synthesis method such as the rubonyl method), tBoc method (t-butyl oxycarbon method) and the like. At this time, a commercially available peptide synthesizer can be used.
  • the agent for preventing and / or treating neurodegenerative diseases of the present invention may be composed only of HMGB family proteins or derivatives thereof, or recombinant vectors capable of expressing HMGB family proteins or derivatives thereof, but Usually, it is formulated according to a conventional method together with one or more types of pharmaceutically acceptable carriers, additives, reagents for introducing DNA or protein into cells, and the like.
  • Examples of the pharmaceutically acceptable carrier include water, pharmaceutically acceptable organic solvents, collagen, polyvinyl alcohol, polyvinyl pyrrolidone, carboxyvinyl polymer, sodium alginate, water-soluble dextran, carboxymethyl starch sodium. , Pectin, xanthan gum, gum arabic, casein, gelatin, agar, glycerin, propylene glycol, polyethylene glycol, petrolatum, paraffin, stearyl alcohol, stearic acid, human serum albumin, man-tol, sorbitol, ratatose, etc. .
  • additives used at the time of formulation include fillers, extenders, binders, moisturizers, disintegrants, surfactants, lubricants, excipients, stabilizers, antibacterial agents
  • agents include buffers, isotonic agents, chelating agents, pH adjusters, surfactants and the like, and these additives are appropriately selected according to the administration unit form of the preparation and the like.
  • components used for ordinary protein preparations and the like for example, stabilizers, antibacterial agents, buffers, isotonic agents, chelating agents, pH adjusters, surfactants and the like are preferably selected.
  • the reagent for introducing DNA or protein into cells is appropriately selected according to the introduction method.
  • Stabilizer human serum albumin; L amino acids such as glycine, cysteine, glutamic acid; monosaccharides such as glucose, mannose, galactose, fructose, sugar alcohols such as man-tole, inositol, xylitol, sucrose, maltose, lactose Saccharides such as polysaccharides such as disaccharides, dextran, hydroxypropyl starch, chondroitin sulfate, hyaluronic acid and derivatives thereof; methyl cellulose, ethyl cellulose, hydroxy cellulose, hydroxypropyl cellulose, hydroxypropyl methyl cellulose, sodium canoroxyx methyl cellulose cellulose derivatives and the like, such as n Surfactants: Surfactants such as polyoxyethylene glycol sorbitan alkyl ester, polyoxyethylene alkyl ether type, sorbitan monoacyl ester type, fatty acid glyceride type and the like.
  • Buffer boric acid, phosphoric acid, acetic acid, citric acid, ⁇ -aminocaproic acid, glutamic acid and salts thereof (eg, alkali metal salts such as sodium salt, potassium salt, calcium salt, magnesium salt and the like, alkaline earth Metal salts).
  • alkali metal salts such as sodium salt, potassium salt, calcium salt, magnesium salt and the like, alkaline earth Metal salts.
  • Isotonicity agents sodium chloride, potassium chloride, saccharides, glycerin and the like.
  • Chelating agent sodium edetate, citric acid and the like.
  • administration routes include oral administration as well as parenteral administration such as intracerebral, intraperitoneal, oral, airway, intestinal, subcutaneous, intramuscular and intravenous.
  • the prophylactic 'therapeutic agent for a degenerative disease is directly administered to a target site in need of the' preventive 'treatment of a neurodegenerative disease.
  • the administration to the target site can be performed, for example, using an injection, a catheter, an incision and the like.
  • the dosage form include, for example, sprays, capsules, ribosomes, tablets, granules, syrups, emulsions, suppositories, injections, ointments, tapes and the like.
  • the dose and the number of doses of the agent for preventing or treating neurodegenerative diseases of the present invention can be appropriately adjusted according to the desired effect, age, body weight, etc. of the patient, and the number of doses is the dose, It can be appropriately adjusted according to the administration route, dosage form and the like.
  • the neurodegenerative diseases to be prevented or treated are not particularly limited, but include Huntington's disease, spinocerebellar degeneration, dentate nucleus red nucleus pallidus Lewis atrophy, bulbar spinal muscular atrophy In addition to polyglutamine diseases such as E. al., Neurodegenerative diseases such as Alno, Ima disease, Parkinson's disease, amyotrophic lateral sclerosis, etc.
  • the agent for preventing and treating neurodegenerative diseases of the present invention is particularly useful for the prevention and treatment of nerve cell dysfunction, nerve cell death and the like which occur in neurodegenerative diseases.
  • the method of screening a substance having a preventive or therapeutic effect on neurodegenerative diseases of the present invention comprises: a test substance comprising HMGB failimi protein or a derivative thereof and an abnormal polyglutamine produced in a neurodegenerative disease Determine whether or not to inhibit protein binding, (B) screening a test substance that inhibits binding as a substance having a preventive or therapeutic effect on neurodegenerative diseases, or the test substance induces the expression of a gene encoding an HMGB family protein or a derivative thereof. And screening the test substance that induces the expression as a substance having a preventive and therapeutic effect against neurodegenerative diseases.
  • test substance is not particularly limited.
  • high molecular weight compounds low molecular weight compounds, cell cultures, tissue extracts, antibodies, proteins, peptides, nucleic acids, carbohydrates, inorganic salts, metal complexes, These complexes etc. are mentioned.
  • the "nucleic acid” includes DNA, RNA and their analogs or derivatives (eg, peptide nucleic acid (PNA), phosphorothioate DNA etc.).
  • the test substance is HMGB falimi protein or a derivative thereof, in neurodegenerative diseases!
  • the method of determining the force which can be determined as follows whether or not to inhibit the binding to the abnormal polyglutamine protein produced is not limited to this.
  • the binding amount of HMGB family protein or its derivative with abnormal polyglutamine protein Measure and compare the amount of binding in the presence of the test substance with the amount of binding in the absence of the test substance. As a result, when the binding amount in the presence of the test substance is smaller than the binding amount in the absence of the test substance, the test substance inhibits the binding of the HMGB family protein or its derivative to the abnormal polyglutamine protein. It can be determined.
  • a neurodegenerative disease such as polyglutamine disease is caused by binding of an HMGB family protein to an abnormal polyglutamine protein to be incorporated into inclusion bodies, and the reduction of HMGB family proteins functioning in the nucleus. Therefore, a substance capable of suppressing the binding between the HMGB family protein or its derivative and the abnormal polyglutamine protein prevents neurodegeneration diseases such as polyglutamine disease by suppressing the decrease of the HMGB family protein functioning in the nucleus. There is a possibility that it can be treated. That is, a substance capable of inhibiting the binding between HMGB family protein or its derivative and abnormal polyglutamine protein is a substance having a preventive or therapeutic effect on neurodegenerative diseases such as polyglutamine disease. Can be screened.
  • the substance capable of suppressing the binding between the HMGB family protein or its derivative and the abnormal polyglutamine protein is a substance which acts on either the HMGB family protein or its derivative or the abnormal polyglutamine protein, It may be a substance that works on both sides. Further, as substances capable of suppressing the binding between the HMGB family protein or derivative thereof and the abnormal polyglutamine protein, substances capable of suppressing the binding between the two in the dissociated state, substances capable of dissociating both in the bound state, etc. included.
  • HMGB family protein or a derivative thereof and the abnormal polyglutamine protein may be contacted in vitro or in vivo.
  • an HMGB family protein or a derivative thereof or an abnormal polyglutamine protein When contacted in vitro, as an HMGB family protein or a derivative thereof or an abnormal polyglutamine protein, (i) an endogenous protein from which cells or tissues expressing the protein of interest are also extracted (( ii) A recombinant vector capable of expressing a target protein is introduced into a host cell to prepare a transformant, and the culture material of the transformant is a recombinant protein extracted, (iii) a chemically synthesized peptide, etc. Can be used
  • HMGB family proteins or derivatives thereof, or abnormal polyglutamine proteins (i) endogenous proteins present in cells, (ii) a set capable of expressing the target protein A recombinant protein or the like present in a transformant produced by introducing a replacement vector into a host cell can be used.
  • the binding activity to a wild-type HMGB family protein or an abnormal polyglutamine protein produced in a neurodegenerative disease is used as the HMGB family protein. It is possible to use mutant HMGB family proteins that retain.
  • any derivative may be used as long as the binding activity to the abnormal polydaltamin protein generated in neurodegenerative disease is maintained, for example, a glycosylated HMGB family protein, Pharmaceutically acceptable salts of HMGB family proteins, fusion proteins containing HMGB family proteins, labels A quality-added HMGB protein etc. can be used.
  • labeling substances include fluorescent compounds such as fluorescein, rhodamine, phycoerythrin, Cy dyes, Alexa dyes, BODIP Y dyes, etc .; chemiluminescent compounds such as luminol, lucigenin, ataridimu ester; Enzymes such as alkaline phosphatase and horseradish peroxidase; Bioluminescent compounds such as luciferase and luciferin; SUP 32 32 / / SUP P P 35 35 ⁇ / SUP SUP S such as radio isotope (RI) Can be mentioned.
  • fluorescent compounds such as fluorescein, rhodamine, phycoerythrin, Cy dyes, Alexa dyes, BODIP Y dyes, etc .
  • chemiluminescent compounds such as luminol, lucigenin, ataridimu ester
  • Enzymes such as alkaline phosphatase and horseradish peroxidase
  • HMGB family protein or its derivative with abnormal polyglutamine protein When contacting HMGB family protein or its derivative with abnormal polyglutamine protein, conditions which affect the binding of HMGB family protein or its derivative with abnormal polyglutamine protein are regulated, The binding of the family protein or its derivative to the abnormal polyglutamine protein depends on the presence or absence of the test substance.
  • Conditions affecting the binding of HMGB family protein or its derivative and abnormal polyglutamine protein include, for example, temperature, type of solvent, concentration of HMGB family protein or its derivative, abnormal polyglutamine Protein concentration etc.
  • the binding amount of HMGB family protein or derivative thereof and abnormal polyglutamine protein may be, for example, the amount of a conjugate of HMGB family protein or derivative thereof and abnormal polyglutamine protein, abnormality with HMGB family protein or derivative thereof It is possible to measure the amount of signal or the like generated by the binding to the type 1 polyglutamine protein as an index.
  • the binding amount of the HMGB family protein or its derivative and the abnormal polyglutamine protein can be determined, for example, by adding a labeling substance to at least one or more of the HMGB family protein or its derivative and the abnormal polydaltamine protein. Every time the HMGB family protein or derivative thereof is brought into contact with the abnormal polyglutamine protein, the complex of the HMGB family protein or derivative thereof with the abnormal polyglutamine protein is separated, and the mass of the labeled substance that the complex has Can be measured as an indicator. Specifically, it can be measured as follows using the GST pull down method. RI is attached to either the HMGB family protein or its derivative or abnormal polyglutamine protein.
  • the other is a fusion protein with GST, and after contacting the HMGB family protein or derivative thereof with the abnormal polyglutamine protein, a complex of the HMGB family protein or derivative thereof with the abnormal polyglutamine protein is Adsorb on sepharose column. After washing the column, elute the proteins bound to the column. The eluted protein is subjected to SDS-PAGE to separate a complex of HMGB family protein or derivative thereof with abnormal polyglutamine protein, and then the amount of RI possessed by the complex is used as an indicator to compare with HMGB family protein or derivative thereof with abnormality. The amount of conjugate with the type I polyglutamine protein is measured.
  • the amount of the conjugate of the HMGB family protein or derivative thereof with the abnormal polyglutamine protein can be determined by a known protein analysis technique, for example, in a complex of the HMGB family protein or derivative thereof with the abnormal polyglutamine protein. It can be measured by Western blotting, immunoprecipitation, ELISA, tissue immunostaining, etc. using an antibody or fragment thereof that can react.
  • antibody includes both monoclonal antibodies and polyclonal antibodies, and "monoclonal antibodies” and “polyclonal antibodies” include all classes of monoclonal and polyclonal antibodies.
  • fragment of antibody include Fab fragments, F (ab) 's SUB2 / SUBs fragments, single chain antibodies (scFv) and the like.
  • the type of signal generated by the binding of the HMGB family protein or its derivative with the abnormal polyglutamine protein is not particularly limited, and, for example, expression of reporter gene, fluorescence energy transfer (FRET), Examples include surface plasmon resonance (SPR) or detection of local density change due to frequency shift of a quartz oscillator.
  • FRET fluorescence energy transfer
  • SPR surface plasmon resonance
  • the binding amount of the HMGB family protein or derivative thereof to the abnormal polyglutamine protein is For example, it can be measured as follows using transcriptional activation factor.
  • either one of HMGB family protein or its derivative and abnormal polydaltamin protein is expressed as a fusion protein with the DNA binding domain of GAL4 protein which is a transcriptional activity factor, With an activit beta domain (TA) It is expressed as a fusion protein.
  • GAL4 protein or its derivative does not interact with the abnormal polyglutamine protein
  • the GAL4 DNA binding domain and the agonist domain are not in close proximity, and the HMGB family protein or its derivative and the abnormal polyglutamine protein interact with each other.
  • the GAL4 DNA binding domain and the affinity domain will be in close proximity.
  • a reporter gene having UASG upstream is introduced into the yeast cell, its expression level is increased, thereby causing the presence or absence of interaction between HMGB family protein or its derivative and abnormal polyglutamine protein, and The intensity can be measured.
  • reporter gene examples include j8 galactosidase gene, chloramphenicol transferase gene, luciferase gene, ampicillin resistance gene, tetracycline resistance gene, kanamycin resistance gene and the like
  • reporter activity examples include Examples include j8 galactosidase activity, chloramphetamine transferase activity, luciferase activity, ampicillin resistance, tetracycline resistance, force namycin resistance and the like.
  • the amount of binding of the HMGB family protein or its derivative with the abnormal polyglutamine protein can be measured as follows.
  • Either one of HMGB family protein or its derivative and abnormal polyglutamine protein is fused with a fluorescent protein (donor) and the other is fused with fluorescent protein (a acceptor), and then HMGB family protein or its After contacting the derivative with the abnormal polyglutamine protein, the amount of fluorescence generated by the binding of the HMGB family protein or its derivative with the abnormal polyglutamine protein is measured.
  • CFP cyan fluorescent protein
  • YFP yellow fluorescent protein
  • FRET Phosphorus energy transfer
  • Whether or not a test substance induces the expression of a gene encoding an HMGB family protein or a derivative thereof can be determined, for example, as follows, but the determination method is not limited thereto. Absent.
  • the expression amount of a gene encoding HMGB family protein or its derivative is measured, and after contact of the test substance The expression level is compared with the expression level before contact of the test substance. As a result, if the expression level after the contact of the test substance is larger than the expression level before the contact of the test substance, it is determined that the test substance induces the expression of the gene encoding the HMGB family protein or its derivative. it can.
  • HMGB family protein or its derivative in tissues such as brain, spinal cord and peripheral nerve.
  • the expression level of the gene is measured, and the expression level after administration of the test substance is compared with the expression level before administration of the test substance. As a result, if the expression level after administration of the test substance is greater than the expression level before administration of the test substance, it may be determined that the test substance induces the expression of the gene encoding the HMGB familial protein or its derivative.
  • a neurodegenerative disease such as polyglutamine disease is caused by binding of an HMGB family protein to an abnormal polyglutamine protein to be incorporated into inclusion bodies, and a decrease in HMGB family proteins functioning in the nucleus. Therefore, a substance capable of inducing the expression of a gene encoding an HMGB family protein or a derivative thereof can prevent or treat a neurodegenerative disease such as polyglutamine disease by compensating for the decrease in HMGB family proteins functioning in the nucleus.
  • a substance capable of inducing the expression of a gene encoding an HMGB family protein or a derivative thereof can be screened as a substance having a preventive or therapeutic effect on a neurodegenerative disease such as polyglutamine disease [0090]
  • Substances include substances capable of inducing transcription of a gene into mRNA, and substances capable of inducing translation of mRNA into protein.
  • Examples of cells expressing a gene encoding an HMGB family protein or a derivative thereof include, for example, (i) cells expressing an objective protein as an endogenous protein,
  • a transformant or the like produced by introducing a recombinant vector capable of expressing a target protein can be used.
  • a model animal an animal (for example, rat, mouse, guinea pig, musagi, etc.) that expresses a gene encoding an HMGB family protein or a derivative thereof can be used.
  • a transgenic animal in which a gene encoding an HMGB family protein or a derivative thereof is artificially expressed can also be used.
  • the expression amount of the gene encoding the HMGB family protein or its derivative is HMG
  • It can be measured based on the amount of B family protein or its derivative or the amount of mRNA.
  • the amount of HMGB family protein or derivative thereof can be quantified using an antibody against HMGB family protein or derivative thereof or a fragment thereof.
  • an antibody against HMGB family protein or derivative thereof or a fragment thereof for example, radioactive immunoassay (RIA), enzyme-linked immunosorbent assay (EIA), chemiluminescent assay (CLIA), fluorescent immunoassay (FIA), etc.
  • RIA radioactive immunoassay
  • EIA enzyme-linked immunosorbent assay
  • CLIA chemiluminescent assay
  • FIA fluorescent immunoassay
  • the amount of HMGB family protein or its derivative can also be measured by measuring the activity of HMGB family protein or its derivative.
  • the activity of the HMGB family protein or its derivative can be measured, for example, by a known method such as Western blotting, ELISA, etc. using an antibody or a fragment thereof capable of reacting to the protein.
  • antibody includes both monoclonal and polyclonal antibodies, and "fragment of antibody” includes any fragment as long as it can react with a predetermined protein.
  • antibody fragments include Fab fragments, F (ab) 's and SUBs / subs, and single chain antibodies (scFv).
  • Can react includes reacting with any part of a given protein.
  • RNA (mRNA) When measuring the amount of mRNA, known gene analysis techniques, for example, hybridization techniques (eg, Northern hybridization, dot blot method, DNA microarray method, etc.), gene amplification techniques (eg, RT) -PCR etc. can be used.
  • mR A specific method of measuring the abundance of NA will be described using RT-PCR as an example.
  • the synthesized cDNA is used as a template, PCR is performed using a primer set that can hybridize to the cDNA, and the amount of mRNA present is measured by quantifying the PCR amplified fragment.
  • PCR is carried out under conditions (for example, the number of PCR cycles in which the PCR amplification fragment increases exponentially) such that the amount of PCR amplification fragment production reflects the amount of initial indigo cDNA.
  • the method for quantifying the PCR amplified fragment is not particularly limited. For example, a quantitative method using radioisotope (RI), a quantitative method using a fluorescent dye, etc. can be used for quantifying the PCR amplified fragment.
  • RI radioisotope
  • a fluorescent dye etc.
  • the measured value of the expression level of the gene is corrected based on the measured value of the expression level of the gene (for example, housekeeping genes such as the ⁇ -actin gene, GAPDH gene, etc.) while the expression level does not greatly fluctuate. Is preferred.
  • the substances screened include, for example, Huntington's disease, spinocerebellar degeneration, dentate nuclear red nuclear pallidoleucine atrophy, polyglutamine diseases such as bulbo-spinal muscular atrophy etc. It is useful for the prevention and treatment of neurodegenerative diseases such as Parkinson's disease, Parkinson's disease and amyotrophic lateral sclerosis, and can prevent and treat nerve cell dysfunction and nerve cell death that occur in these neurodegenerative diseases. .
  • Cortical neurons and cerebellar neurons are known methods (Tagawa, K. et al, J. Neurochem. 89, 974-987. (2004); Fernandez-Funez, P. et al., Nature 408, 101-106. Prepared and cultured according to (2000)).
  • the nuclear extract was prepared according to Cell 60, 461- 472. (1990): cells were lysed with 8 volumes of lysis buffer (20 mM HEPES (pH 7.9), Im mM EDTA (pH 8.0), Im M DTT, 10).
  • % Glycerolane 0.5 mM spermidine, ImM phenylsulfo-lufluoride, 1 ⁇ g / ml leupeptin, 1 ⁇ g / ml pepstatin A, 0.3 ⁇ g / ml antipain, 0.3% NP- 40
  • the suspension was centrifuged, and the separated nuclei were centrifuged and resuspended in a lysis buffer containing 1 M KC1 and centrifuged at 100,000 ⁇ g for 30 minutes at 4 ° C. The supernatant was collected and dialyzed against lysing buffer at 4 ° C.
  • Nuclear extracts were prepared as described above and quantified (BioRad). Two-dimensional gel electrophoresis was performed according to standard methods (Amersham Biosciences). That is, 50 ⁇ g of nuclear extract was dialyzed against 2% urea and 2% CHAPS for 2 hours (twice), and immobilized pH gradient gel (immo bilized pH gradient gel: IPu) ⁇ 3-10, 18 cm, Amersham Biosciences)-Rehydrated water. Isoelectric focusing (IEF) [Electrophoresis Power Supply ESP 3500 XL (Pharmacia Biotech) was used under conditions of 500V for 1 minute, 3500V for 1.5 hours and 3500V for 16 hours. IPG strips were used immediately after IEF or stored at -80 ° C.
  • the IPG pieces were equilibrated with 50 mM Tris-HCl (pH 8.8), 6 M urea, 30% glycerol, 2% (w / v) SDS and 0.0125% bromophenol blue for 10 minutes (2 Times).
  • 50 mM Tris-HCl pH 8.8
  • 6 M urea 3 M urea
  • 30% glycerol 3 M urea
  • 2% (w / v) SDS 0.0125% bromophenol blue for 10 minutes (2 Times).
  • Two-dimensional electrophoresis was again performed for spot identification by TOF-MASS, and the gel was stained with a Silver Stain MS kit (Wako).
  • Candidate spots of polyacrylamide gel were destained with A and B solution (Silver Stain MS kit, Wako).
  • the gel was incubated for 10 minutes (3 times) in 50% acetonitrile (Aldrich), 50 mM ammonium carbonate, and further incubated for 5 minutes in 100% acetonitrile, and allowed to dry at room temperature for 10 minutes.
  • the gel is digested at 30 ° C.
  • the peptide in solution is recovered by passage through ZiPtip (Millipore), washed three times with 0.1% TFA for desalting and purification, 1 ⁇ l of elution solution (10 g / 1 a-Siano-4) Elution with hydroxycinnamic acid (CHCA), 50% acetylonitrile, 0.1% TFA) and subjected to SHIM AZU / KRATOS MALD TO TOF / MS AXIMA-CRF (SHIMAZU BIOTECH).
  • CHCA hydroxycinnamic acid
  • SHIMAZU BIOTECH SHIM AZU / KRATOS MALD TO TOF / MS AXIMA-CRF
  • the original 1 is analyzed by AXIMA-CFR (S / W Version 2), and the result is submitted to MASCOT (http: www.matrixxscience.com) research engine (querying NCBI database), and the corresponding protein is obtained. Identified.
  • HeLa cells (5 ⁇ 10 6 SUP> 4 / SUP>) and cortex-derived primary neurons (1.7 ⁇ 10 6 SUP> 6 / SUP) were cultured in 6 cm dishes and fixed 2 days after adenoviral vector infection (Tag awa, K. et al., J. Neurochem. 89, 974-987. (2004))
  • a primary antibody an anti-Htt xyg polyclonal antibody (N- 18; 1: 100; Santa Cruz), an anti-ATI agent.
  • H21 1: 100; Santa Cruz
  • anti HMGB1 rabbit polyclonal antibody 1: 1000; BD Bioscience
  • anti HMGB2 rabbit polyclonal antibody 1: 200; BD Biosciences
  • the antibodies used were Alexa Flour 488 anti-Ash Antibody (Molecular Probes) and Cy3 Anti-Shog Antibody (Jacks on Immuno-Rearch)
  • the cells were first incubated with H21 or N-18 for 1 hour at room temperature. The cells were then incubated with Alexa Flour 488 anti-Ash antibody (secondary antibody) for 1 hour at room temperature. Incubate with milk for 30 minutes, and incubate at 4 ° C with anti-HMG B1 antibody or anti-HMGB2 antibody, Cy3 anti-bark antibody (secondary antibody) And incubated for 1 hour at room temperature.
  • Sample loading buffer (62.5 mM Tris / HCl (pH 6.8), 2% (w / v) sodium dodecyl sulfate (SDS), 2.5% (v / v) 2-mercaptoethanol, 5% v / v) Glycerin, 0.0025% (w / v) bromophenol blue) was dissolved and heated at 100 ° C. for 3 minutes.
  • the dilution conditions for the primary antibody are as follows. 1C2 (1: 2000; Chemicon), CAG 53b (1: 2000) (Scherzinger, E. et al., Cell. 90, 549-558. (19 97)), HMGB1 (1: 5000; BD Biosciences), HMGB2 (H. 1: 2000; BD Biosciences), ATIH 21 (1: 500; Santa Cruz), GFP (1: 1000; Clontech)
  • HeLa cells (1 ⁇ 10 ⁇ SUP> 6 ⁇ / SUP> cells) in a 10 cm dish were transfected with SuperEct (invitrogen) with pEGFP-N1, pEGFP-N 1-HMGB1 or pEGFP-N1-HMGB2.
  • SuperEct invitrogen
  • an adenovirus vector (AxCAwt, AxCA-HMGB1, AxCA-HMGB2, AxCA-htt20Q, AxCA-httlllQ, AxCA-ATI-30Q or AxCA-ATI-82Q) was infected as described above. Immunoprecipitation was performed according to a known method (Okazawa, H. et al., Neuron. 34, 701-713. (2002)).
  • HeLa cells were collected, incubated in TNE buffer (10 mM Tris-HCl (pH 7.8), 10% NP-40, 0.15 M NaCl, ImM EDTA) for 1 hour at 4 ° C. 17,400 ⁇ g Centrifuged for 20 minutes. The supernatant was pre-incubated with protein G-sepharose (Amersham Biosciences) for 2 hours at 4 ° C. and centrifuged. The supernatant is incubated with anti-HMGB1 antibody (1: 600, BD Biosciences), anti-HMGB2 antibody (1: 600, BD Biosciences) or anti-GFP antibody (1: 600, Clontech), and incubated with protein G-Sepharose. Incubated for 2 hours.
  • TNE buffer 10 mM Tris-HCl (pH 7.8), 10% NP-40, 0.15 M NaCl, ImM EDTA
  • Protein G beads were collected by centrifugation (5 min at 2,000 ⁇ g) and washed 5 times with TNE buffer. Bound proteins were eluted with sample buffer, separated by SDS-PAGE, and blotted with CAG53b antibody (Scherzinger, E. et al., Cell. 90, 549-558. (1997)).
  • coli is recovered, suspended in PBS containing ImM EDTA and ImM PMSF, sonicated, incubated with Triton-100 (l%) for 30 min at 4 ° C., 10,000 X g 5 Centrifuge for a minute. The supernatant was purified with glutathione-sepharose 4B (Amersham Biosciences) beads. The GST fusion protein was eluted with glutathione buffer (50 mM Tris-HC1, 10 mM Glutatione-red uced form), and the supernatant was collected by centrifugation at 500 ⁇ g. GST fusion proteins were detected by W-stamp lot. Samples for IP were pre-incubated for 1 hour at 4 ° C.
  • GS4B beads were collected by centrifugation (5 min at 2,000 ⁇ g) and washed 5 times with TNE buffer. Bound proteins were eluted with sample buffer, separated by SDS-PAGE, and blotted with CAG53b antibody (Scherzinger, E. et al., Cell. 90, 549-558. (1997)).
  • mice 64 week old R6 / 2 huntingtin transgenic mice (Scherzinger, E. et al., Cell. 90, 549-558. (1997)) or 40 week old SCA1 (154Q / 2Q) knock in mice (Watase, K. et al. et al., Neuron. 34, 905-919. (2002)) and their littermates were prepared brain tissue. The sections were deparaffinized, rehydrated and pretreated with 0.1 M sodium acetate buffer (pH 7.0).
  • Sections are incubated with 11 NQ (anti-polyglutamine heron polyclonal antibody, 1: 100, ref 35) for SCA1 (154 Q / 2 Q) knock-in mice, followed by Alexa flour 488 anti-shrimp antibody (Mole cular Probes) and room temperature. Incubate for 1 hour.
  • As for huntingtin transgenic mice sections are treated with 0.3% hydrogen peroxide for 30 minutes to inhibit endogenous hydrogen peroxide, and anti-Htt E. coli polyclonal antibody (N-18; 1:20; Santa Cruz) and Each sample was incubated for 1 hour at room temperature with anti-HRP-labeled secondary antibody.
  • Sections were then detected with Flurorescine Amplification Reagent for 5 minutes at room temperature (1:50; TSA BIOTIN SYSTEM; PerkinElm er). For double staining, the sections are blocked with 5% skimmed milk-PBS, and then with anti-HMGB1 rabbit polyclonal antibody (1: 100; BD Bioscience) or anti-HMGB2 rabbit polyclonal antibody (1:50; BD Bioscience) 4 The mixture was incubated with a secondary anti-C3 antibody against Cy3 for 1 hour at room temperature. The signal intensity per um2 was measured by Aquacosmos (HAMAMATSU).
  • the plasmids pBS-HMGBl / 2, pEGFP-Nl- HMGBl / 2, pCI- HMGB1 / 2 and pGEX-3X- HMGB1 / 2 are respectively the plasmids pBluescript II SK + (Clontech), pEGFP-Nl (Clont ech), pCI- It was constructed by inserting full-length HMGBL cDNA (SEQ ID NO: 9) or HMGB2 cDNA (SEQ ID NO: 11) from neo (Clontech) and pGEX-3X (Amersham) rat.
  • pGEX-3X-HMGB1-ACl / 2 and pGEX-3X-HMGB2-ACl / 2 were constructed by inserting C-terminal region deleted HMGB1 cDNA or HMGB2 cDNA into pGEX-3X. All constructs were verified by sequence analysis and expression levels of the encoded protein were examined by Western blot.
  • the C-terminal region deleted HMGB1 cDNA contained in pGEX-3X-HMGB1-AC1 contains a region encoding amino acid 1-186 of rat HMGB1 (215 amino acids, SEQ ID NO: 10), and PGEX-3X- HMGB1-AC2
  • the C-terminal region-deleted HMG Bl cDNA contained in contains the region encoding amino acids 1-146 of rat HMGB1 (215 amino acids, SEQ ID NO: 10).
  • the C-terminal region deleted HMGB2 cDNA contained in PGEX-3X-HMGB2-AC1 contains a region encoding 1-186 amino acids of rat HMGB2 (210 amino acids, SEQ ID NO: 12), and PGEX-3X- HMGB2-AC2
  • the C-terminal region deleted HMGB2 cDNA contained in contains the region encoding amino acids 1-165 of rat HMGB2 (210 amino acids, SEQ ID NO: 12).
  • Adenovirus AxCA-HMGBl and AxCA-HMGB2 were constructed according to the manufacturer's instructions (Takara). Specifically, HMGB1 and HMGB2 cDNA fragments were excised from pBS-HMGB1 and pBS-HMGB2 as Xhol-EcoRI fragments, blunted using Blunting kit (TOYOBO), and subcloned into Swal site of pAxCAwt (Takara). The expression of HMGB1 and HMGB2 proteins by these adenoviruses was confirmed before use.
  • the adenoviral vectors AxCA-httllllQ and AxCA-htt20Q contain 111 or more each.
  • AxCA-ATI-30Q and AxCA-ATI-82Q contain 30 and 82, respectively, of human Htt Axon I to which a repeat of 3 bases (CAG) encoding 20 polyglutamine chains is added.
  • CAG 3 bases
  • These adenoviral vectors were constructed according to known methods (Tagawa, K. et al., J. Mol. Biol., 1984), containing full-length human ATI cDNA to which a 3-base (CAG) repeating sequence encoding a polyglutamine chain was added. Neurochem. 89, 974—987. (2004)) 0
  • Cerebellar neurons were prepared from fetal 20-20 day-old Wistar rats, cultured and cultured according to known methods (Hirai, H. et al., J. Neurosci. 20, 5217-5224. (2000)), and Purkinje's cells. Analyzes for growth and spinous processes were performed. That is, a seeding solution (DMEM / F-12 with 10% FBS) for seeding 401 (5 ⁇ 10SUPSUPSUP6 ⁇ / SUP ⁇ cells / ml) on a 12-well plate coated with poly L-al-tin The cells were seeded with 2 ⁇ 10 SUP SUP 5 5 / SUP cells / well cells. Three hours after seeding, 1 ml of culture medium containing no FBS was added.
  • DMEM / F-12 with 10% FBS for seeding 401
  • the cells were seeded with 2 ⁇ 10 SUP SUP 5 5 / SUP cells / well cells. Three hours after seeding, 1 ml of culture medium containing no FBS was added.
  • PI Iodine iodide
  • AxCA ⁇ AxCA-HMGBl, AxCA- HMGB2, AxCA- htt20Q, AxCA- httlllQ, AxCA-AT1-30Q or AxCA-ATl-82Q Three days after incubation of primary neurons with BrU for 3 hours, 1% paraformaldehyde The cells were fixed with 0.1 M phosphate buffer and stained with anti-BrU mouse monoclonal antibody (1: 200, Sigma-Aldrich). BrU immunoreactivity is determined by a known method (Hoshino, M. at al., Biochem Biophys Res Commun. 313, 110-116. (2004)). I weighed it.
  • UAS-HMGB1 transgenic flies clone rat cDNA into pUAST transformation vector and divide DNA construct w (cslO) eggs (Dura, JM et al., J Neurogenet. 9, 1-14. (1993)) (Rubin, GM et al "Science. 218, 348-353. (1982)) Photoreceptor neuronal degeneration and / or characteristic eyes induced by expression of human httl20Q or SCA182Q.
  • the head of adult flies (0-10 days) is treated with 2% formaldehyde and 2.5% dalaraldehyde in 0.1 M phosphate buffer (PB) at 4 ° C, After immobilization, fix at room temperature for 3 hours with 1% osmium, then dehydrate with ethanol, incorporate in EPON, make sections (2 ⁇ m) of longitudinal section and cross section, and stain with toluidene blue did.
  • PB phosphate buffer
  • the head of the fly is fixed with 0.1 M PB containing 2.5% glutaraldehyde and then fixed with 0.1 M PB containing 1% osmium (each 2 hours at 4 ° C.), Dehydrated with Tanol and dried at critical point. At least 5 individuals were used for each genotype and time.
  • Httl1lQ mutant huntingtin
  • AT1-82Q mutant ataxin-1
  • huntingtin is a causative gene product of huntington (Huntington's disease: HD)
  • ataxin-1 ataxin-1: ATI
  • ATI type 1 spinocerebellar ataxia (spinoc erebellar ataxia type). 1: It is a causative gene product of SCA1).
  • the nuclear extract was dialyzed against a low potassium buffer solution, and centrifuged to separate non-soluble proteins capable of permeabilizing the nuclear membrane. After centrifugation, the supernatant was subjected to two-dimensional electrophoresis (Fig. 2, lane 2).
  • the soluble nucleoprotein fraction did not contain large aggregates of mutant proteins and either small intermediates or denatured products (Fig. 2, lane 2).
  • the mutant polyglutamine protein was separated into nuclear fractions or nonsoluble fractions of nuclear extracts (Fig. 2, lanes 1 and 3). The non-soluble fraction containing the mutant protein was not used further in this experiment.
  • FIG. 2 shows whole cell lysates (lane 1) of cortical neurons expressing mutant polyglutamine protein (AT1-82Q) or cortical neurons expressing mutant polydaltamine protein (Httl lQ).
  • CAG 53b antibody Sherzinger, E.
  • Soluble nuclear proteins from cortical or cerebellar primary neurons expressing normal or mutant polyglutamine protein were separated on a two-dimensional gel. As controls, soluble proteins from uninfected neurons and AxCA mock virus-infected neurons were used. The analysis was performed three times independently. About 400 spots were detected on a two-dimensional gel by silver staining and these spots were numbered sequentially. The signal intensity of 400 spots was quantified by ImageMaster 2D Elite ver. 4.01 (Amersham Biosciences) and infected with normal polyglutamine protein expression vector (AxCA-htt20Q), mutant polyglutamine protein expression vector (AxCa-httlllQ).
  • AxCA mock vector (AxCA) infected and uninfected nerve cells were compared. Focusing on differences between neurons expressing normal and mutant polyglutamine proteins, spots showing large differences (more than 2 fold) were selected for TOF-MASS analysis. A representative spot is shown enlarged ( Figure 3). The protein at this spot was dramatically reduced in expression in mutant Htt (Httl HQ) -expressing cortical neurons as compared to normal Htt (Htt20Q) -expressing cortical neurons. The peptide mass footprints from this spot were further analyzed using Mascot Reserch Engine. As a result, this spot was found to be HMGB1.
  • HMGB1 and 2 were decreased in cerebellar neurons expressing mutant AT1 and in cortical neurons expressing mutant Htt. Cerebellar and cortical neurons are adversely affected in SCA1 and HD, respectively.
  • HMGB protein was not decreased in cortical neurons expressing mutant ATI. Cortical neurons are not adversely affected by SCA1.
  • the reduction of HMGB1 and 2 in the soluble fraction of nuclear extract was reconfirmed by Western blot (data not shown).
  • HMGB1 and 2 co-localized with mutant Htt or ATI in inclusions of cortical neurons ( Figure 4). In cells with mutated polyglutamine aggregates, HMGB1 and 2 were reduced in the outer nuclear matrix of inclusion bodies (FIG. 4). Similar colocalization power was observed in HeLa cells for exogenous HMGB and overexpressed mutant polyglutamine proteins (data not shown). This suggests that the mutant polyglutamine protein interacts with HMGB1 and 2.
  • Figure 4 shows the immunohistochemistry of adenoviral vector-infected primary cortical neurons (3 days after infection) with anti-HMGB protein antibody and anti-Htt (N18) antibody or anti-ATI (H21) antibody, as indicated by the white arrow. Is the nuclear matri In addition, HMGB protein is reduced to indicate cells with nuclear inclusions.
  • a normal or mutant polyglutamine protein-expressing adenoviral vector was infected to express a normal or mutant polyglutamine protein.
  • the expression levels of polyglutamine protein and HM GB-EGFP protein were checked by Western blot using CAG53b antibody and anti-GFP antibody (left panel in FIG. 5). Immunoprecipitation was performed using anti-HMGB or anti-EGFP antibody.
  • the mutant polyglutamine protein co-precipitated with HMGB1 and HMGB2, but the normal polyglutamine protein was weak (Fig. 5, right panel).
  • mutant polyglutamine protein and HMGB protein were confirmed by pull-down assay using HeLa cells expressing polyglutamine protein (FIG. 6).
  • FIG. 5 lane 1 shows pEGFP-N1-HMGB1 transfection and AxCA infection
  • lane 2 shows pEGFP-N1-HMGB1 transfection and AxCA-ATI-30Q infection
  • lane 3 shows pEGF P-N1-HMGB1 transfection.
  • lane 4 is pEGFP-N1- HMGB2 transfection and AxCA infection
  • lane 5 is pEGFP-Nl- HMGB2 transfection and AxCA-ATI-30Q infection
  • lane 6 is pEGFP-Nl- HMGB2 transfection and AxCA-ATl-82Q infection
  • lane 7 is pEGFP-Nl-HMGBl transfection and AxC
  • lane 1 shows AxCA infection
  • lane 2 shows AxCA-ATI-30Q infection
  • lane 3 shows AxCA-ATI-82Q infection
  • lane 4 shows AxCA infection
  • lane 5 shows AxCA-htt20Q infection
  • lane 6 shows AxCA -A represents AT82Q
  • H represents HttlllQ, as a result of httlllQ infection.
  • mutant Htt transgenic mice confirmed co-localization of HMGB and mutant polyglutamine protein in inclusion bodies, and a decrease in HMGB in the nuclear matrix of neurons with inclusion bodies (Figure 7).
  • the left panel of Fig. 7 shows that HMGB colocalizes with mutant Htt protein in the inclusion bodies of striatal neurons in Htt transgenic mice, 64 weeks old R6 / 2 Mouse striatum was stained with anti-Htt (N_18) and HMGB antibodies.
  • FIG. 7 shows the results of quantitative analysis of the signal intensity of the nuclear matrix obtained with more than 100 neuronal cells, which clearly indicates that the reduction of HMGB in the nuclear matrix of inclusion body positive cells is (*: P ⁇ 0.01; Student t-test).
  • inclusions like Purkinje cells, were almost undetectable in neurons of ATI knockin mice.
  • numerous inclusions were observed in the hippocampus and cerebral cortex (data not shown).
  • Histoimmunochemistry of ATI knock-in mice revealed that HMGB is reduced in Purkinje cells and in the nuclear matrix of granulocytes (FIG. 8).
  • FIG. 9a shows the inhibitory effect of HMGB on mutant Htt-induced cell death of cortical neurons, and the cell death rate was calculated from the proportion of PI-positive cells 3 days after adenoviral vector infection.
  • cell death is increased by the adenovirus vector expressing HttlllQ, and this increase is suppressed by coinfection with the mock adenovirus vector that was suppressed by AxCA-HMGB1 or 2 coinfection. It was a force.
  • FIG. 9 b shows the results of Western blot confirmation of the expression levels of Htt and HMGB proteins in primary cortical neurons.
  • FIG. 9a shows the results of Western blot confirmation of the expression levels of Htt and HMGB proteins in primary cortical neurons.
  • lane 1 is AxCA and AxCA co-infection
  • lane 2 is AxCA- HMGB1 and AxCA co-infection
  • lane 3 is AxCA- HMGB2 and AxCA co-infection
  • lane 4 is AxCA and AxCA-Httl 11 Q Co-infection
  • lane 5 with AxCA-HMGB1 and AxCA-HttlllQ
  • lane 6 with AxCA-HMGB2 and AxCA-Httl 1
  • HMGB protein The effect of HMGB protein on ATI-induced toxicity of brain neurons was examined. Since mutant ATI did not induce cell death of granular neurons as expected from human SCA1 pathology, its effect on Purkinje cells was examined. The mutant ATI prevented Purkinje cell survival, neurite outgrowth, and neurite bifurcation (Fig. 10a, AT82Q) 0 However, AxCA and Ax CA-AT30Q virus infection did not significantly affect Purkinje cells ( mock, AT3 0Q). HMGB1 and 2 proteins alleviated the toxicity of mutant ATI to neurite outgrowth, neurite bifurcation, and survival of Purkinje cells (Fig.
  • Fig. 1 Ob shows the results of western blot confirmation of expression levels of ATI and HMGB proteins in infected primary cortical neurons
  • lane 1 shows AxCA infection
  • lane 2 shows AxCA-AT 30Q infection
  • lane 3 shows AxCA-AT82Q infection
  • Lane 4 shows the results of AxCA-AT82Q and AxCA-HMG B1 infection
  • lane 5 shows the results of AxCA-AT82Q and AxCA-HMGB2 infection.
  • 11a shows the results of quantitative analysis of Purkinje cell survival, and analysis was performed on 20 fields (*: p ⁇ 0.01; Student t-test) 0
  • Fig. Lib is a quantitative analysis of neurite outgrowth of Purkinje cells
  • HMGB1 protein transgenic flies were constructed and human mutant ATI and Htt expressing snails fly (Fernandez-Funez, P. et al. , Nature 408, 1001-106 (2000); Jacks on, GR et. Al, Neuron. 21, 633-642 (1998)).
  • HMGB1 protein is specifically expressed in the developmental stage and in the adult eye by GMR-GAL4 in the transgenic fly that we made (data not shown).
  • Degeneration of E. coli fly expressing mutant ATI was detected by light microscopy and scanned at 25 ° C. for 1 to 10 days using an electron microscope (FIG. 12).
  • HMGB1 Heterozygous HMGB1 (HMGB1-2.1) flies, ATI- 82Q homozygous transgenic flies (F7, the human ATI gene is located on the X chromosome) B) to generate a population of flies expressing both genes and flies expressing only AT1-82Q.
  • lane 1 is X / Y; GMR-GAL4 / Cyo, and lane 2 is X / Y.
  • GMR-GAL4 / UAS-HMGB1-2.1 lane 3 is UAS-ATI- 82Q / X; GMR-GAL4 / Cyo, lane 4 is UAS-ATI- 82Q / X; GMR-GAL4 / UAS- HMGB1-2. 1 Show the results. We observed the effect of HMGB1 on Htt-induced diastolic degeneration of the freshwater fly. Since the mutant Htt transgenic mice do not show a rough-eyed phenotype (Jackson, GR et.
  • HM GB1 suppresses polyglutamine-induced neurodegeneration in the Shojiyou fly model.
  • EP-HMMD HMG box and Hjo box fly HMG with a basic Z acidic region
  • EP-DSP1 EP-DSP1

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Abstract

　神経変性疾患（例えばポリグルタミン病）の予防・治療剤を提供することを目的とし、この目的を達成するために、HMGBファミリータンパク質又はその誘導体、例えば、下記（ａ）又は（ｂ）記載のタンパク質を含有する神経変性疾患の予防・治療剤を提供する。 （ａ）配列番号２、４、６又は８記載のアミノ酸配列からなるタンパク質 （ｂ）配列番号２、４、６又は８記載のアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、神経変性疾患において生じる異常型ポリグルタミンタンパク質に対する結合活性を有するタンパク質

Description

神経変性疾患の予防 ·治療剤
技術分野
[0001] 本発明は、神経変性疾患 (例えばポリグルタミン病）の予防'治療剤、及び神経変性 疾患 (例えばポリグルタミン病）に対して予防 ·治療効果を有する物質のスクリーニン グ方法に関する。
背景技術
[0002] ハンチントン病等のポリグルタミン病は、原因遺伝子産物に存在する異常に伸長し たポリグルタミン鎖によって引き起こされる神経変性疾患である。これまでに、筋収縮 に関わるクレアチン、アポトーシス抑制剤であるミノサイクリン等の投与力 ハンチント ン病モデルマウスに対して有効であるという報告はあるものの、ポリグルタミン病に対 して予防 '治療効果を有する物質の報告は非常に少ない。また、ポリグルタミン病モ デル細胞ではアポトーシスによって細胞死が起こることが広く指摘されている力 実 際にアポトーシス抑制剤を臨床で用いることは困難である。
[0003] このような状況の下、異常に伸長したポリグルタミン鎖が核内で不溶性タンパク質凝 集体の形成を誘起することに着目し、異常に伸長したポリグルタミン鎖が誘起するタ ンパク質凝集を阻害できる物質を、ポリグルタミン病の予防又は治療に用いることが 提案されている。例えば、特許文献 1には、異常に伸長したポリグルタミン鎖が誘起 するタンパク質凝集を阻害することによりポリグルタミン病を予防又は治療できる物質 として、オリゴ糖又はオリゴ糖部分を含む化合物が開示されている。神経細胞内での タンパク質凝集体の形成は、ポリグルタミン病だけでなぐアルッノヽイマ一病等の神 経変性疾患にも共通の特徴であることから、神経細胞内でのタンパク質凝集を抑制 することにより、種々の神経変性疾患を予防又は治療できるものと期待される。
[0004] 一方、 HMGBファミリータンパク質は、 HMG (High Mobility Group：高速移動群タン パク質）の一種である。 HMGは、クロマチンから 0.35M NaClにより抽出され、電気泳 動で高い移動度を示す一群の非ヒストンタンパク質であり、全ての高等生物の核に存 在し、そのアミノ酸配列は高等生物間で高度に保存されている。 HMGBファミリータン ノ ク質は、核に豊富に存在し、種間でよく保存されており、このことにより、 HMGBファ ミリ一タンパク質が核にぉ ヽて重要な役割を果たすことを示唆される。 HMGBファミリ 一の正確な機能は未知である力 HMGBタンパク質は、 DNA結合のための 2つの HM Gボックスを有し、転写因子、部位特異的組換えタンパク質、 DNA修復タンパク質、サ ィレンシング複合体、ウィルスタンパク質と相互作用すること (非特許文献 1)、 C末端 に酸性及び塩基性アミノ酸リッチな領域を有し、 DNA及びヒストン複合体間に挿入さ れ、ゲノム DNAの再形成に重要な役割を果たすこと（非特許文献 1, 2)、 distorted D NAに優先的に結合し、 DNAを湾曲させ、 Wrapped DNAを緩め、クロマチン再形成複 合体の近接性を促進することにより、ヌクレオノームの再形成を促進すること (非特許 文献 2)等が報告されている。
特許文献 1：特開 2003-267874号公報
非特許文献 l :Agresti, A.等， Curr. Opin. Genet Develop. 13, 170-178. (2003) 非特許文献 2 :Travers A.E. EMBO reports 4, 131-136. (2003)
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0005] 本発明は、第一に、神経変性疾患 (例えばポリグルタミン病）の予防 '治療剤を提供 することを目的とする。
また、本発明は、第二に、神経変性疾患 (例えばポリグルタミン病）に対して予防- 治療効果を有する物質のスクリーニング方法を提供することを目的とする。
課題を解決するための手段
[0006] 本発明は、 HMGBファミリータンパク質力 ポリグルタミン病等の神経変性疾患にお いて生じる異常型ポリグルタミンタンパク質と結合し、核封入体に取り込まれることに より、核内で機能する HMGBファミリータンパク質の減少が生じ、これにより、ポリダル タミン病等の神経変性疾患が生じること、並びに、核内で機能する HMGBファミリータ ンパク質の減少を補う（例えば、減少した HMGBファミリータンパク質を補充する）又は 減少を抑制する（例えば、 HMGBファミリータンパク質と異常型ポリグルタミンタンパク 質との結合を阻害する)ことにより、ポリグルタミン病等の神経変性疾患を予防，治療 できると ヽぅ新たな知見に基づ ヽて完成されたものであり、上記課題を解決するため に、本発明は、以下の神経変性疾患の予防，治療剤、及び神経変性疾患に対して予 防'治療効果を有する物質のスクリーニング方法を提供する。
(l) HMGBファミリータンパク質又はその誘導体を含有する、神経変性疾患の予防- 治療剤。
(2)前記 HMGBファミリータンパク質力 下記 (a)又は (b)記載のタンパク質である、前 記（1)記載の予防'治療剤。
(a)配列番号 2、 4、 6又は 8記載のアミノ酸配列からなるタンパク質
(b)配列番号 2、 4、 6又は 8記載のアミノ酸配列において 1又は複数個のアミノ酸が 欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、神経変 性疾患において生じる異常型ポリグルタミンタンパク質に対する結合活性を有するタ ンパク質
(3)前記 (b)記載のタンパク質が、転写促進活性、 DNA修復促進活性及び細胞死抑 制活性のうち 1種以上の活性を有する前記（2)記載の予防 '治療剤。
(4) HMGBファミリータンパク質又その誘導体を発現し得る組換えベクターを含有す る、神経変性疾患の予防'治療剤。
(5)前記組換えベクターが、下記 (c)〜 (f)の 、ずれかに記載の DNAを含む前記 (4) 記載の予防，治療剤。
(c)配列番号 2、 4、 6又は 8記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする DNA
(d)配列番号 2、 4、 6又は 8記載のアミノ酸配列において 1又は複数個のアミノ酸が 欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、神経変 性疾患において生じる異常型ポリグルタミンタンパク質に対する結合活性を有するタ ンパク質をコードする DNA
(e)配列番号 1、 3、 5又は 7記載の塩基配列力 なる DNA
(f)配列番号 1、 3、 5又は 7記載の塩基配列からなる DNAに相補的な DNAとストリンジ ェントな条件下でノ、イブリダィズし得る DNAであって、神経変性疾患にぉ 、て生じる 異常型ポリグルタミンタンパク質に対する結合活性を有するタンパク質をコードする D NA
(6)前記 (d)又は (f)記載の DNAがコードするタンパク質力 転写促進活性、 DNA修 復促進活性及び細胞死抑制活性のうち 1種以上の活性を有する前記（5)記載の予 防 *治療剤。
(7)試験物質が、 HMGBフアリミ一タンパク質又はその誘導体と、神経変性疾患にお
V、て生じる異常型ポリグルタミンタンパク質との結合を阻害する否かを判別し、前記 結合を阻害する試験物質を神経変性疾患に対して予防'治療効果を有する物質とし てスクリーニングする工程を含む、神経変性疾患に対して予防 ·治療効果を有する物 質のスクリーニング方法。
(8)試験物質が、 HMGBファミリータンパク質又はその誘導体をコードする遺伝子の 発現を誘導するか否かを判別し、前記発現を誘導する試験物質を神経変性疾患に 対して予防'治療効果を有する物質としてスクリーニングする工程を含む、神経変性 疾患に対して予防 ·治療効果を有する物質のスクリ一二ング方法。
発明の効果
[0008] 本発明により、ポリグルタミン病等の神経変性疾患の予防 ·治療剤、及びポリグルタ ミン病等の神経変性疾患に対して予防 ·治療効果を有する物質のスクリーニング方 法が提供される。
図面の簡単な説明
[0009] [図 1]図 1は、核タンパク質精製の標準プロトコルを示す図である。
[図 2]図 2は、変異型ポリグルタミンタンパク質 (AH-82Q)発現皮質神経細胞又は変 異型ポリグルタミンタンパク質 (Httl 11Q)発現皮質神経細胞の細胞溶解物全体 (レ ーン 1)、同細胞力も調製した核抽出物の可溶性タンパク質フラクション (レーン 2)及 び非可溶性フラクション（レーン 3)に関する、 CAG53b抗体を用いたウェスタンブロット 解析の結果を示す。
[図 3]図 3は、正常型及び変異型ポリグルタミンタンパク質を発現する神経細胞核抽 出物の可溶性タンパク質間で大きな相違 (2倍以上)を示す代表的スポットを示す図 である。
[図 4]図 4は、抗 HMGBタンパク質抗体及び抗 Htt (N18)抗体又は抗 ATI (H21)抗体 による、アデノウイルスベクター感染初代皮質神経細胞 (感染後 3日）の免疫組織ィ匕 学による解析結果を示す図である。 [図 5]図 5は、 CAG53b抗体及び抗 GFP抗体を用いたウェスタンブロット結果と、抗 HM GB又は抗 EGFP抗体を用いた免疫沈降結果を示す図である。
[図 6]図 6は、ポリグルタミンタンパク質を発現する HeLa細胞を用いたプルダウンアツ セィ結果を示す図である。
[図 7]図 7は、変異型 Httトランスジエニックマウス及び ATIノックインマウスを用いた免 疫組織ィ匕学による解析結果と、シグナル強度の定量的解析結果を示す図である。
[図 8]図 8は、 ATIノックインマウスの免疫組織ィ匕学による解析結果と、シグナル強度 の定量的解析結果を示す図である。
[図 9]図 9aは、皮質神経細胞の変異型 Htt誘導細胞死に対する HMGBの抑制効果を 示す図であり、図 9bは、初代皮質神経細胞における Htt及び HMGBタンパク質の発 現レベルの、ウェスタンブロットによる確認結果を示す図である。
[図 10]図 10aは、プルキンェ細胞を抗 calbindin 28K抗体で染色し、 Aquacosmos(HA MAMATSU)を用いて生存及び神経突起伸長の程度を示す図であり、図 10bは、感 染初代皮質神経細胞における ATI及び HMGBタンパク質の発現レベルの、ゥエスタ ンブロットによる確認結果を示す図である。
[図 11]図 11aは、プルキンェ細胞の生存に関する定量的解析結果を示す図であり、 図 l ibは、プルキンェ細胞の神経突起伸長に関する定量的解析結果を示す図であ り、図 11cは、プルキンェ細胞の神経突起分岐に関する定量的解析結果を示す図で ある。
[図 12]図 12は、変異型 ATIを発現するショウジヨウバエの目の変性の、光学顕微鏡 及び電子顕微鏡を用いた観察結果を示す図である。
[図 13]図 13は、ショウジヨウバエの Htt誘導目変性に対する HMGB1の効果を示す、 目の切断面の組織学的分析結果を示す図である。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明について詳細に説明する。
本発明の神経変性疾患の予防 ·治療剤は、 HMGBファミリータンパク質又はその誘 導体、あるいは HMGBファミリータンパク質又はその誘導体を発現し得る組換えべク ターを含有する。 [0011] 「HMGBファミリータンパク質」には、 HMGBファミリーに属するいずれのタンパク質も 含まれる。 HMGBファミリーに属するタンパク質としては、例えば、 HMGB1、 HMGB2、 HMGB3等が挙げられる。 HMGBファミリーに属するタンパク質が共通して有する性質 、機能等としては、例えば、クロマチンから 0.35M NaClによって抽出され、電気泳動 で高い移動度を示す一群（High Mobility Group)の非ヒストンタンパク質であること、 約 200アミノ酸で構成され HMG Boxというモチーフを有すること、 HMG Boxを介して D NA構造を柔軟に認識し塩基配列非特異的に結合すること、 DNA分子を湾曲させ転 写調節をすること、ヌクレオソーム間のリンカ一 DNAに作用しクロマチンリモデリングに 関与すること、転写因子、部位特異的組み換え酵素、 DNA修復タンパク質、ウィルス 由来タンパク質等の多くの分子と相互作用すること（Agresti,A.& Bianchi,M.E.(2 003) HMGB proteins and gene expression. し urr.Opin.Genet Develop.13 170— 178J 等が挙げられる。
[0012] 「HMGBファミリータンパク質」には、いずれの高等生物由来の HMGBファミリータン パク質も含まれる。すなわち、 HMGBファミリータンパク質のアミノ酸配列は高等生物 間で高度に保存されているので、予防 ·治療対象生物種と同一種由来の HMGBファ ミリ一タンパク質はもちろん、異種由来の HMGBファミリータンパク質を予防 '治療のた めに使用してもよい。例えば、予防'治療対象がヒトである場合、ヒト由来の HMGBファ ミリ一タンパク質の他、ヒト以外の高等生物由来の HMGBファミリータンパク質を使用 してもよい。但し、予防'治療対象がヒトである場合、ヒト由来の HMGBファミリータンパ ク質を使用することが好まし 、。
[0013] 「HMGBファミリータンパク質」には、野生型 HMGBファミリータンパク質に加え、神経 変性疾患において生じる異常型ポリグルタミンタンパク質に対する結合活性を保持 する変異型 HMGBファミリータンパク質も含まれる。変異型 HMGBファミリータンパク質 は、野生型 HMGBファミリータンパク質のアミノ酸配列において 1又は複数個のァミノ 酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列力もなる。野生型 HMGBファミリー タンパク質のアミノ酸配列において欠失、置換、付加又は挿入されるアミノ酸の個数 及び位置は、神経変性疾患にぉ 、て生じる異常型ポリグルタミンタンパク質に対する 結合活性が保持される限り特に限定されるものではない。欠失、置換、付加又は挿 入されるアミノ酸の個数は、通常 20個以内、好ましくは 10個以内（例えば、 5個以内 、 3個以内、 1個）である。
[0014] 変異型 HMGBファミリータンパク質は、神経変性疾患において生じる異常型ポリグ ルタミンタンパク質に対する結合活性に加え、転写促進活性、 DNA修復促進活性、 細胞死抑制活性等のうち 1種又は 2種以上の活性を保持することが好ましい。神経変 性疾患において生じる異常型ポリグルタミンタンパク質に対する結合活性を保持する 変異型 HMGBファミリータンパク質は、異常型ポリグルタミンタンパク質と結合すること により、内因性 HMGBファミリータンパク質が異常型ポリグルタミンタンパク質と結合し て封入体に取り込まれ、核内で機能する内因性 HMGBファミリータンパク質の減少を 抑制することができ、これにより、神経変性疾患を予防 ·治療することができる。野生 型 HMGBファミリータンパク質は、変異型 HMGBファミリータンパク質と同様の作用機 序により神経変性疾患を予防，治療することができる他、封入体に取り込まれた内因 性 HMGBファミリ一タンパク質の代わりに機能することにより、神経変性疾患を予防 · 治療することができる。変異型 HMGBファミリータンパク質力 神経変性疾患において 生じる異常型ポリグルタミンタンパク質に対する結合活性に加え、転写促進活性、 DN A修復促進活性、細胞死抑制活性等の活性を保持する場合、変異型 HMGBファミリ 一タンパク質は、封入体に取り込まれた内因性 HMGBファミリータンパク質の代わりに 機能することにより、神経変性疾患を予防，治療することができる。
[0015] HMGBファミリータンパク質としては、例えば、下記（a)又は (b)記載のタンパク質が 挙げられる。
(a)配列番号 2、 4、 6又は 8記載のアミノ酸配列からなるタンパク質 (以下「タンパク質
(a)」という。 )
(b)配列番号 2、 4、 6又は 8記載のアミノ酸配列において 1又は複数個のアミノ酸が 欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、神経変 性疾患において生じる異常型ポリグルタミンタンパク質に対する結合活性を有するタ ンパク質 (以下「タンパク質 (b)」と 、う。）
[0016] 配列番号 2記載のアミノ酸配列力 なるタンパク質は、ヒト由来の HMGB1であり、配 列番号 4及び 6記載のアミノ酸配列力 なるタンパク質は、ヒト由来の HMGB2であり、 配列番号 8記載のアミノ酸配列力もなるタンパク質は、ヒト由来の HMGB3である。配 列番号 4及び 6記載のアミノ酸配列力 なるタンパク質はスプライシング変異体である と考えられる。
配列番号 2、 4、 6又は 8記載のアミノ酸配列において欠失、置換、付加又は挿入さ れるアミノ酸の個数及び位置は、神経変性疾患にぉ 、て生じる異常型ポリグルタミン タンパク質に対する結合活性が保持される限り特に限定されるものではない。欠失、 置換、付加又は挿入されるアミノ酸の個数は、通常 20個以内、好ましくは 10個以内（ 例えば、 5個以内、 3個以内、 1個）である。
[0017] タンパク質お)には、タンパク質 (a)に対して人為的に欠失、置換、付加等の変異を 導入したタンパク質の他、欠失、置換、付加等の変異が導入された状態で天然に存 在するタンパク質や、それに対して人為的に欠失、置換、付加等の変異を導入したタ ンパク質も含まれる。欠失、置換、付加等の変異が導入された状態で天然に存在す るタンパク質としては、例えば、ヒトを含む哺乳動物（例えば、ヒト、サル、ゥシ、ヒッジ、 ャギ、ゥマ、ブタ、ゥサギ、ィヌ、ネコ、マウス、ラット等）由来のタンパク質 (これらの哺 乳動物において多型によって生じ得るタンパク質を含む。）が挙げられる。
[0018] 「神経変性疾患にぉ 、て生じる異常型ポリグルタミンタンパク質」は、神経変性疾患 の原因遺伝子に、ポリグルタミン鎖をコードする 3塩基 (CAG)の繰り返し配列が付カロ されることにより生じる、異常伸長ポリグルタミン鎖が付加されたタンパク質である。神 経変性疾患及びその原因遺伝子としては、ハンチントン病 Zハンチンチン遺伝子、 脊髄小脳変性症 Zァタキシン- 1, -2, -3, -6, -7, -17遺伝子、歯状核赤核淡蒼球ル ィ体萎縮症 ZDRPLA遺伝子、球脊髄性筋萎縮症 Zアンドロゲン受容体遺伝子等が 挙げられる。異常型ポリグルタミンタンパク質に含まれる異常伸長ポリグルタミン鎖は 、通常 40個以上のグルタミン残基を含む。
[0019] 「HMGBファミリータンパク質の誘導体」には、神経変性疾患において生じる異常型 ポリグルタミンタンパク質に対する結合活性が保持される限り、いかなる誘導体も含ま れる。 HMGBファミリータンパク質の誘導体としては、例えば、糖鎖が付加された HMG Bファミリータンパク質、医薬的に許容される HMGBファミリータンパク質の塩、 HMGB ファミリータンパク質を含む融合タンパク質等が挙げられる。 [0020] HMGBファミリータンパク質に付加される糖鎖の種類、位置等は、 HMGBファミリータ ンパク質の製造の際に使用される宿主細胞の種類によって異なる力 HMGBファミリ 一タンパク質の誘導体には、 V、ずれの宿主細胞を用いて得られるタンパク質も含ま れる。
[0021] 医薬的に許容される HMGBファミリータンパク質の塩としては、例えば、ナトリウム、 カリウム、リチウム、カルシウム、マグネシウム、ノ リウム、アンモ-ゥム等の無毒性アル カリ金属塩、アルカリ土類金属塩、アンモニゥム塩、無毒性酸付加塩等が挙げられる 。無毒性酸付加塩としては、例えば、塩酸塩、塩化水素酸塩、臭化水素酸塩、硫酸 塩、重硫酸塩、酢酸塩、蓚酸塩、吉草酸塩、ォレイン酸塩、ラウリン酸塩、硼酸塩、安 息香酸塩、乳酸塩、リン酸塩、 p—トルエンスルホン酸塩（トシレート）、クェン酸塩、マ レイン酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、スルホン酸塩、グリコール酸塩、マ レイン酸塩、ァスコルビン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩等が挙げられる。
[0022] HMGBファミリータンパク質と融合させるタンパク質又はペプチドとしては、例えば、 β ガラクトシダーゼ、プロテイン Α、プロテイン Αの IgG結合領域、クロラムフエニコー ル'ァセチルトランスフェラーゼ、ポリ（Arg)、ポリ（Glu)、プロテイン G、マルトース結合 タンパク質、グルタチオン S-トランスフェラーゼ（GST)、ポリヒスチジン鎖（His- tag)、 S ペプチド、 DNA結合タンパク質ドメイン、 Tac抗原、チォレドキシン、グリーン 'フルォレ ッセント'プロテイン、へマグルチュンタンパク質（HA) - tag、 FLAG- tag、 Myc- tag、 GA L4- AD、 T7遺伝子 10タンパク質、ゥシパピローマウィルス LIタンパク質、ストレプトァ ビジン、 VSV— G— tag、 TAT (Trans-activating protein)、 TAT由来 PTD (protein transd uction domain)、等が挙げられる。例えば、 HMGBファミリータンパク質とへマグルチ ニンタンパク質（HA) -tag、 FLAG- tag、 GAL4- AD等とを融合させることにより、 HMGB ファミリータンパク質の細胞内安定性を向上させることができる。また、 HMGBファミリ ~~タンノヽク貧と TAT (Trans— activating protein)、 TAT由来 PTD (protein transduction domain)等とを融合させることにより、 HMGBファミリータンパク質に細胞膜通過能を付 与することができる。
[0023] 「HMGBファミリータンパク質又はその誘導体を発現し得る組換えベクター」は、 HM GBファミリータンパク質又は HMGBファミリータンパク質を含む融合タンパク質をコー ドする DNAと、その上流に設けられたプロモーターとを含む。組換えベクターは、適 当な発現ベクターのプロモーターの下流に、 HMGBファミリータンパク質又は HMGB ファミリータンパク質を含む融合タンパク質をコードする DNA断片を挿入することによ り作製することができる。 HMGBファミリータンパク質又は HMGBファミリータンパク質を 含む融合タンパク質をコードする DNA断片は、その機能が発揮されるように発現べク ターに組み込まれることが必要であり、発現ベクターは、プロモーターの他、ェンハン サ一等のシスエレメント、スプライシングシグナル、ポリ A付カ卩シグナル、選択マーカ 一（例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐 性遺伝子）、リボソーム結合配列（SD配列）等を有して 、てもよ!/、。
[0024] 発現ベクターとしては、予防 ·治療対象生物種の細胞において自立複製が可能な ものであれば特に限定されず、例えば、プラスミドベクター、ファージベクター、ウィル スベクター等を使用することができる。プラスミドベクターとしては、例えば、大腸菌由 来のプラスミド（例えば、 pRSET、 pBR322、 pBR325、 pUC118、 pUC119、 pUC18、 pUC 19)、枯草菌由来のプラスミド (例えば、 pUB110、 pTP5)、酵母由来のプラスミド (例え ば、 YEpl3、 YEp24、 YCp50)が挙げられ、ファージベクターとしては、例えば、 λファ ージ（例えば、 Charon4A、 Charon21Aゝ EMBL3、 EMBL4、 gtl0、 gtll、 λ ΖΑΡ)が 挙げられ、ウィルスベクターとしては、例えば、レトロウイルス、ワクシニアウィルス、ァ デノウィルス等の動物ウィルス、バキュロウィルス等の昆虫ウィルスが挙げられる。
[0025] HMGBファミリータンパク質をコードする DNAとしては、例えば、下記（c)〜（f)記載 の DNAが挙げられる。
(c)配列番号 2、 4、 6又は 8記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする DNA( 以下「DNA(c)」という。 )
(d)配列番号 2、 4、 6又は 8記載のアミノ酸配列において 1又は複数個のアミノ酸が 欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、神経変 性疾患において生じる異常型ポリグルタミンタンパク質に対する結合活性を有するタ ンパク質をコードする DNA (以下「DNA (d)」と!、う。）
(e)配列番号 1、 3、 5又は 7記載の塩基配列力 なる DNA (以下「DNA(e)」という。 )
(f)配列番号 1、 3、 5又は 7記載の塩基配列からなる DNAに相補的な DNAとストリンジ ェントな条件下でノ、イブリダィズし得る DNAであって、神経変性疾患にぉ 、て生じる 異常型ポリグルタミンタンパク質に対する結合活性を有するタンパク質をコードする D NA (以下「DNA(f)」という。 )
[0026] 配列番号 1、 3、 5及び 7記載の塩基配列力 なる DNAは、それぞれ配列番号 2、 4、
6又は 8記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする。
[0027] 「ストリンジェントな条件」としては、例えば、 42°C、 2 X SSC及び 0.1% SDSの条件、好 ましくは 65°C、 0.1 X SSC及び 0.1% SDSの条件が挙げられ、配列番号 1、 3、 5又は 7記 載の塩基配列力 なる DNAに相補的な DNAとストリンジェントな条件下でノヽイブリダィ ズし得る DNAとしては、配列番号 1、 3、 5又は 7記載の塩基配列からなる DNAと 80% 以上、好ましくは 95%以上（例えば、 97%以上、 98%以上、 99%以上）の相同性を 有する DNAが挙げられる。
[0028] DNA (d)及び (f)には、 DNA(c)又は（e)に対して人為的に変異を導入した DNAの 他、変異が導入された状態で天然に存在する DNAや、それに対して人為的に変異を 導入した DNAも含まれる。変異が導入された状態で天然に存在する DNAとしては、 例えば、ヒトを含む哺乳動物（例えば、ヒト、サル、ゥシ、ヒッジ、ャギ、ゥマ、ブタ、ゥサ ギ、ィヌ、ネコ、マウス、ラット等）由来の DNA (これらの哺乳動物において多型によつ て生じ得る DNAを含む。）が挙げられる。 DNA(c)又は（e)に対する人為的な変異は 、例えば、部位特異的変異誘発法等によって導入することができる。変異の導入は、 例えば、変異導入用キット、例えば、 Mutant- K (TaKaRa社製）、 Mutant- G (TaKaRa社 製）、 TaKaRa社の LA- PCR in vitro Mutagenesisシリーズキットを用いて行うことがで きる。
[0029] HMGBファミリータンパク質をコードする DNAは、ヒト等の哺乳動物組織 (例えば脳、 肝臓、腎臓等)の組織力ゝら抽出した mRNAを用いて cDNAライブラリーを作製し、配列 番号 1、 3、 5又は 7記載の塩基配列に基づいて合成したプローブを用いて、 cDNAラ イブラリーから目的の DNAを含むクローンをスクリーニングすることにより得ることがで きる。また、塩基配列が既に決定されている場合には化学合成することもできる。 DN Aの化学合成は、市販の DNA合成機、例えば、チォホスファイト法を利用した DNA合 成機 (島津製作所社製)、フォスフォアミダイト法を利用した DNA合成機 (パーキン ·ェ ルマ一社製)を用いて行うことができる。
[0030] cDNAライブラリ一は、例えば、次のようにして作製することができる。ヒト等の哺乳動 物の組織 (例えば脳、肝臓、腎臓等)から全 RNAを得た後、オリゴ dT-セルロースゃポ リ U-セファロース等を用いたァフィユティーカラム法、ノ ツチ法等によりポリ（A) +RNA( mRNA)を得る。この際、ショ糖密度勾配遠心法等によりポリ (A) +RNA(mRNA)を分画 してもよい。次いで、得られた mRNAを铸型として、オリゴ dTプライマー及び逆転写酵 素を用いて一本鎖 cDNAを合成した後、該一本鎖 cDNAから二本鎖 cDNAを合成する 。このようにして得られた二本鎖 cDNAを適当なクローユングベクターに組み込んで組 換えベクターを作製し、該組換えベクターを用いて大腸菌等の宿主細胞を形質転換 し、テトラサイクリン耐性、アンピシリン耐性を指標として形質転換体を選択すること〖こ より、 cDNAのライブラリーを得ることができる。 cDNAライブラリーを作製するためのクロ 一-ングベクターは、宿主細胞中で自立複製できるものであればよぐ例えば、ファ ージベクター、プラスミドベクター等を使用することができる。宿主細胞としては、例え ば、大腸菌（Escherichia coli)等を使用することができる。大腸菌等の宿主細胞の形 質転換は、塩ィ匕カルシウム、塩ィ匕マグネシウム又は塩化ルビジウムを共存させて調製 したコンビテント細胞に、組換えベクターを加える方法等により行うことができる。なお 、ベクターとしてプラスミドを用いる場合は、テトラサイクリン、アンピシリン等の薬剤耐 性遺伝子を含有させておくことが好まし 、。
[0031] cDNAライブラリーの作製にあたっては、市販のキット、例えば、 Superscript Plasmid
System for cDNA Synthesis and Plasmid Cloning (Gibco BRL社製;)、 ZAP— cDNA Syn thesis Kit (ストラタジーン社製)等を使用することができる。
[0032] cDNAライブラリーから目的の DNAを含むクローンをスクリーニングする際には、配 列番号 1又は 3記載の塩基配列に基づいてプライマーを合成し、これを用いてポリメ ラーゼ連鎖反応 (PCR)を行い、 PCR増幅断片を得る。 PCR増幅断片は、適当なブラ スミドベクターを用いてサブクローユングしてもよ 、。
[0033] cDNAライブラリーに対して、 PCR増幅断片をプローブとしてコロニーハイブリダィゼ ーシヨン又はプラークハイブリダィゼーシヨンを行うことにより、 目的の DNAを得ること ができる。プローブとしては、 PCR増幅断片をアイソトープ（例えば、 <SUP>32</SUP> P、く SUP〉35〈/SUP〉S)、ピオチン、ジゴキシゲニン等で標識したものを使用することが できる。 目的の DNAを含むクローンは、抗体を用いたィムノスクリーニング等の発現ス クリーニングによっても得ることができる。
[0034] 取得された DNAの塩基配列は、 DNA断片をそのまま、又は適当な制限酵素等で切 断した後、常法によりベクターに組み込み、通常用いられる塩基配列解析方法、例え ば、マキサム ギルバートの化学修飾法、ジデォキシヌクレオチド鎖終結法を用いて 決定することができる。また、 373A DNAシークェンサ一（Perkin Elmer社製）等の塩基 配列分析装置を用いて配列決定することもできる。
[0035] 以上のようにして、 HMGBファミリータンパク質をコードする DNAを得ることができ、得 られた DNAを以下の工程に従って宿主細胞中で発現させることにより、 HMGBファミリ 一タンパク質を製造することができる。
[0036] 〔組換えベクター及び形質転換体の作製〕
組換えベクターを作製する際には、 目的とするタンパク質のコード領域を含む適当 な長さの DNA断片を調製する。また、 目的とするタンパク質のコード領域の塩基配列 を、宿主細胞における発現に最適なコドンとなるように、塩基を置換した DNAを調製 する。
[0037] この DNA断片を適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより組 換えベクターを作製し、該組換えベクターを適当な宿主細胞に導入することにより、 目的とするタンパク質を生産し得る形質転換体を得ることができる。上記 DNA断片は 、その機能が発揮されるようにベクターに組み込まれることが必要であり、ベクターは 、プロモーターの他、ェンハンサ一等のシスエレメント、スプライシングシグナル、ポリ
A付加シグナル、選択マーカー（例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、アンピシリン 耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子）、リボソーム結合配列（SD配列）等を含有す ることがでさる。
[0038] 発現ベクターとしては、宿主細胞において自立複製が可能なものであれば特に限 定されず、例えば、プラスミドベクター、ファージベクター、ウィルスベクター等を使用 することができる。プラスミドベクターとしては、例えば、大腸菌由来のプラスミド (例え ば、 pRSET、 pBR322、 pBR325、 pUC118、 pUC119、 pUC18、 pUC19)、枯草菌由来の プラスミド（例えば、 pUB110、 pTP5)、酵母由来のプラスミド（例えば、 ΥΕρ13、 ΥΕρ24、
YCp50)が挙げられ、ファージベクターとしては、例えば、 λファージ（例えば、 Charon
4A、 Charon21Aゝ EMBL3、 EMBL4、 gtl0、 gtl l、 λ ZAP)が挙げられ、ウィルスべ クタ一としては、例えば、レトロウイルス、ワクシニアウィルス、アデノウイルス等の動物 ウィルス、バキュロウィルス等の昆虫ウィルスが挙げられる。
[0039] 宿主細胞としては、 目的とする遺伝子を発現し得る限り、原核細胞、酵母、動物細 胞、昆虫細胞、植物細胞等のいずれを使用してもよい。また、動物個体、植物個体、 カイコ虫体等を使用してもょ 、。
[0040] 細菌を宿主細胞とする場合、例えば、エッシェリヒァ 'コリ（Escherichia coli)等のェシ エリヒア属、バチルス'ズブチリス（Bacillus subtilis)等のバチルス属、シユードモナス' プチダ（Pseudomonas putida)等のシユードモナス属、リゾビゥム 'メリロティ（Rhizobium meliloti)等のリゾビゥム属に属する細菌を宿主細胞として使用することができる。具 体的には、 Escherichia coll XLl- Blue、 Escherichia coll XL2- Blue、 Escherichia coll DH1、 Escherichia coli K12、 Escherichia coli JM109、 Escherichia coli HB101等の大 腸菌や、 Bacillus subtilis MI 114、 Bacillus subtilis 207-21等の枯草菌を宿主細胞とし て使用することができる。この場合のプロモーターは、大腸菌等の細菌中で発現でき るものであれば特に限定されず、例えば、 trpプロモーター、 lacプロモーター、 Pく SUB 〉L〈/SUB〉プロモーター、 Pく SUB〉R〈/SUB〉プロモーター等の大腸菌やファージ等に 由来するプロモーターを使用することができる。また、 tacプロモーター、 lacT7プロモ 一ター、 let Iプロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーターを使用する ことちでさる。
[0041] 細菌への組換えベクターの導入方法としては、細菌に DNAを導入し得る方法であ れば特に限定されず、例えば、カルシウムイオンを用いる方法、エレクト口ポレーショ ン法等を使用することができる。
[0042] 酵母を宿主細胞とする場合、サッカロミセス ·セレビシェ（Saccharomycescerevisiae) 、シゾサッカロミセス 'ボンべ（Schizosaccharomyces pombe)、ピヒア'パストリス（Pichia pastoris)等を宿主細胞として使用することができる。この場合のプロモーターは、酵 母中で発現できるものであれば特に限定されず、例えば、 gallプロモーター、 gallOプ 口モーター、ヒートショックタンパク質プロモーター、 1プロモーター、 PH05プロ モーター、 PGKプロモーター、 GAPプロモーター、 ADHプロモーター、 AOX1プロモー ター等を使用することができる。
[0043] 酵母への組換えベクターの導入方法は、酵母に DNAを導入し得る方法であれば特 に限定されず、例えば、エレクト口ポレーシヨン法、スフエロプラスト法、酢酸リチウム法 等を使用することができる。
[0044] 動物細胞を宿主細胞とする場合、サル細胞 COS-7、 Vero、チャイニーズノ、ムスター 卵巣細胞 (CHO細胞）、マウス L細胞、ラット GH3、ヒト FL細胞等を宿主細胞として使 用することができる。この場合のプロモーターは、動物細胞中で発現できるものであ れば特に限定されず、例えば、 SR aプロモーター、 SV40プロモーター、 LTR(Long T erminal Repeat)プロモーター、 CMVプロモーター、ヒトサイトメガロウィルスの初期遺 伝子プロモーター等を使用することができる。
[0045] 動物細胞への組換えベクターの導入方法は、動物細胞に DNAを導入し得る方法で あれば特に限定されず、例えば、エレクト口ポレーシヨン法、リン酸カルシウム法、リポ フエクシヨン法等を使用することができる。
[0046] 昆虫細胞を宿主とする場合には、 Spodoptera frugiperdaの卵巣細胞、 Trichoplusia niの卵巣細胞、カイコ卵巣由来の培養細胞等を宿主細胞として使用することができる
。 Spodoptera frugiperdaの卵巣細胞としては S19、 Sf21等、 Trichoplusia niの卵巣細胞 としては High 5、 ΒΤΙ-ΤΝ-5Β1-4 (インビトロジェン社製)等、カイコ卵巣由来の培養細 胞としては Bombyx mori N4等が挙げられる。
[0047] 昆虫細胞への組換えベクターの導入方法は、昆虫細胞に DNAを導入し得る限り特 に限定されず、例えば、リン酸カルシウム法、リポフエクシヨン法、エレクト口ポレーショ ン法等を使用することができる。
[0048] 〔形質転換体の培養〕
目的とするタンパク質をコードする DNAを組み込んだ組換えベクターを導入した形 質転換体を通常の培養方法に従って培養する。形質転換体の培養は、宿主細胞の 培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。
大腸菌や酵母等の微生物を宿主細胞として得られた形質転換体を培養する培地と しては、該微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体 の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地の ヽずれを使用してもよ い。
[0049] 炭素源としては、グルコース、フラクトース、スクロース、デンプン等の炭水化物、酢 酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類を使用す ることができる。窒素源としては、アンモニア、塩化アンモ-ゥム、硫酸アンモ-ゥム、 酢酸アンモ-ゥム、リン酸アンモ-ゥム等の無機酸又は有機酸のアンモ-ゥム塩、ぺ プトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物等を使用 することができる。無機塩としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マ グネシゥム、硫酸マグネシウム、塩ィ匕ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅 、炭酸カルシウム等を使用することができる。
[0050] 形質転換体の培養は、振盪培養又は通気攪拌培養等の好気的条件下で行う。培 養温度は通常 30〜37°C、培養時間は通常 12〜16時間であり、培養期間中は pHを 6. 0〜8.0に保持する。 pHの調整は、無機酸、有機酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシ ゥム、アンモニア等を用いて行うことができる。また、培養の際、必要に応じてアンピシ リン、テトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよ 、。
[0051] プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微 生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例 えば、 lacプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するとき にはイソプロピル- β -D-チォガラタトピラノシド等を、 trpプロモーターを用いた発現べ クタ一で形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸等を培地に添 カロしてちょい。
[0052] 動物細胞を宿主細胞として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に 使用されている RPMI1640培地、 Eagleの MEM培地、 α - MEM培地、 DMEM培地又は これら培地に牛胎児血清等を添加した培地等を使用することができる。形質転換体 の培養は、通常 5% CO〈SUB〉2〈/SUB〉存在下、 30〜37°Cで 1〜7日間行う。また、培 養の際、必要に応じてカナマイシン、ペニシリン、ストレプトマイシン、ネオマイシン、 ノ、イダロマイシン、ブラストサイジン等の抗生物質を培地に添加してもよ 、。 [0053] 昆虫細胞を宿主細胞として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に 使用されている TNM-FH培地（ファーミンジェン社製）、 TC-100培地（G¾co BRL社 製)、 Sf-900 II SFM培地（Gibco BRL社製）、 ExCell400、 ExCell405 (JRHバイオサイエ ンシーズ社製)等を使用することができる。形質転換体の培養は、通常 25〜28°Cで 48 〜96時間行う。また、培養の際、必要に応じてゲンタマイシン等の抗生物質を培地に 添カロしてちょい。
[0054] 目的とするタンパク質は、分泌タンパク質又は融合タンパク質として発現させること もできる。融合させるタンパク質としては、例えば、 j8—ガラタトシダーゼ、プロテイン A、プロテイン Aの IgG結合領域、クロラムフエ-コール'ァセチルトランスフェラーゼ、 ポリ（Arg)、ポリ（Glu)、プロテイン G、マルトース結合タンパク質、ダルタチオン S-トラ ンスフェラーゼ、ポリヒスチジン鎖（His-tag)、 Sペプチド、 DNA結合タンパク質ドメイン 、 Tac抗原、チォレドキシン、グリーン 'フルォレツセント'プロテイン、へマグルチニンタ ンパク質 (HA)- tag、 FLAG- tag、 Myc- tag、 T7遺伝子 10タンパク質、ゥシパピローマウ ィルス L1タンパク質、 VSV-G- tag等が挙げられる。
[0055] 〔タンパク質の単離 ·精製〕
形質転換体の培養物より目的とするタンパク質を採取することにより、 目的とするタ ンパク質を得ることができる。ここで、「培養物」には、培養上清、培養細胞、培養菌体 、細胞又は菌体の破砕物のいずれもが含まれる。
目的とするタンパク質が形質転換体の細胞内に蓄積される場合には、培養物を遠 心分離することにより、培養物中の細胞を集め、該細胞を洗浄した後に細胞を破砕し て、 目的とするタンパク質を抽出する。 目的とするタンパク質が形質転換体の細胞外 に分泌される場合には、培養上清をそのまま使用するか、遠心分離等により培養上 清から細胞又は菌体を除去する。
[0056] こうして得られるタンパク質は、溶媒抽出法、硫安等による塩析法脱塩法、有機溶 媒による沈殿法、ジェチルアミノエチル（DEAE)—セファロース、イオン交換クロマトグ ラフィ一法、疎水性クロマトグラフィー法、ゲルろ過法、ァフィユティークロマトグラフィ 一法等により精製することができる。
[0057] タンパク質は、そのアミノ酸配列に基づ 、て、 Fmoc法（フルォレニルメチルォキシカ ルボニル法）、 tBoc法 (t ブチルォキシカルボ-ル法）等の化学合成法によって製 造することもできる。この際、市販のペプチド合成機を使用することができる。
[0058] 本発明の神経変性疾患の予防 ·治療剤は、 HMGBファミリータンパク質又はその誘 導体、あるいは HMGBファミリータンパク質又はその誘導体を発現し得る組換えべク ターのみ力も構成されていてもよいが、通常は、医薬上許容される 1種以上の担体、 添加剤、細胞に DNA又はタンパク質を導入するための試薬等をとともに常法に従つ て製剤化される。
[0059] 医薬上許容される担体としては、水、医薬的に許容される有機溶剤、コラーゲン、ポ リビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビ二ルポリマー、アルギン酸ナ トリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ぺクチン、キサン タンガム、アラビアゴム、カゼイン、ゼラチン、寒天、グリセリン、プロピレングリコール、 ポリエチレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒ ト血清アルブミン、マン-トール、ソルビトール、ラタトース等が挙げられる。
[0060] 製剤化に際して使用される添加剤としては、例えば、充填剤、増量剤、結合剤、付 湿剤、崩壊剤、表面活性剤、滑沢剤、賦形剤、安定化剤、抗菌剤、緩衝剤、等張ィ匕 剤、キレート剤、 pH調整剤、界面活性剤等が挙げられ、これらの添加剤は製剤の投 与単位形態等に応じて適宜選択される。これらのうち、通常の蛋白製剤等に使用さ れる成分、例えば、安定化剤、抗菌剤、緩衝剤、等張化剤、キレート剤、 pH調整剤、 界面活性剤等が好ましく選択される。細胞に DNA又はタンパク質を導入するための 試薬は、導入方法に従って適宜選択される。
[0061] 添加剤の具体例を以下に列挙する。
安定化剤：ヒト血清アルブミン;グリシン、システィン、グルタミン酸等の L アミノ酸； グルコース、マンノース、ガラクトース、果糖等の単糖類、マン-トール、イノシトール、 キシリトール等の糖アルコール、ショ糖、マルトース、乳糖等の二糖類、デキストラン、 ヒドロキシプロピルスターチ、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸等の多糖類及びそれら の誘導体等の糖類；メチルセルロース、ェチルセルロース、ヒドロキシェチルセルロー ス、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カノレボキシメ チルセルロースナトリウム等のセルロース誘導体等 n 界面活性剤：ポリオキシエチレングリコールソルビタンアルキルエステル、ポリオキシ エチレンアルキルエーテル系、ソルビタンモノァシルエステル系、脂肪酸グリセリド系 等の界面活性剤。
緩衝剤：ホウ酸、リン酸、酢酸、クェン酸、 ε—アミノカプロン酸、グルタミン酸及びそ れらの塩（例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩等のアル カリ金属塩やアルカリ土類金属塩)。
等張化剤:塩ィ匕ナトリウム、塩ィ匕カリウム、糖類、グリセリン等。
キレート剤：ェデト酸ナトリウム、クェン酸等。
[0062] 投与経路及び投与剤形は、治療に際して最も効果的なものを使用するのが望まし い。投与経路の一般例としては、経口投与の他、脳内、腹腔内、 口腔内、気道内、直 腸内、皮下、筋肉内及び静脈内等の非経口投与が挙げられるが、本発明の神経変 性疾患の予防'治療剤は、神経変性疾患の予防'治療を必要とする標的部位へ直接 投与することが好ましい。標的部位への投与は、例えば、注射、カテーテル、切開術 等を用いて行うことができる。投与剤形の一般例としては、例えば、噴霧剤、カプセル 剤、リボソーム剤、錠剤、顆粒剤、シロップ剤、乳剤、座剤、注射剤、軟膏、テープ剤 等が挙げられる。
[0063] 本発明の神経変性疾患の予防，治療剤の投与量及び投与回数は、 目的とする効 果、患者の年齢や体重等に応じて適宜調節することができ、投与回数は投与量、投 与経路、投与剤形等に応じて適宜調節することができる。
[0064] 予防，治療対象となる神経変性疾患は特に限定されるものではないが、ハンチント ン病、脊髄小脳変性症、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症、球脊髄性筋萎縮症等の ポリグルタミン病に加え、アルッノ、イマ一病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症 等の神経変性疾患が挙げられる。本発明の神経変性疾患の予防，治療剤は、神経 変性疾患おいて生じる神経細胞機能障害、神経細胞死等の予防，治療に特に有用 である。
[0065] 本発明の神経変性疾患に対して予防'治療効果を有する物質のスクリーニング方 法は、試験物質が、 HMGBフアリミ一タンパク質又はその誘導体と、神経変性疾患に お 、て生じる異常型ポリグルタミンタンパク質との結合を阻害する否かを判別し、前 記結合を阻害する試験物質を神経変性疾患に対して予防'治療効果を有する物質 としてスクリーニングする工程、あるいは、試験物質が、 HMGBファミリータンパク質又 はその誘導体をコードする遺伝子の発現を誘導するか否かを判別し、前記発現を誘 導する試験物質を神経変性疾患に対して予防'治療効果を有する物質としてスクリ 一-ングする工程を含む。
[0066] 試験物質の種類は特に限定されるものではなぐ例えば、高分子化合物、低分子 化合物、細胞培養物、組織抽出物、抗体、タンパク質、ペプチド、核酸、糖質、無機 塩類、金属錯体、これらの複合体等が挙げられる。なお、「核酸」には、 DNA、 RNA及 びこれらの類似体又は誘導体（例えば、ペプチド核酸（PNA)、ホスホロチォエート DN A等）が含まれる。
[0067] 試験物質が、 HMGBフアリミ一タンパク質又はその誘導体と、神経変性疾患にお！、 て生じる異常型ポリグルタミンタンパク質との結合を阻害する否かは、例えば、次のよ うにして判別できる力 判別方法はこれに限定されるものではな 、。
[0068] HMGBファミリータンパク質又はその誘導体と異常型ポリグルタミンタンパク質とを試 験物質の存在下又は不存在下で接触させた後、 HMGBファミリータンパク質又はそ の誘導体と異常型ポリグルタミンタンパク質との結合量を測定し、試験物質の存在下 における結合量と試験物質の不存在下における結合量とを比較する。その結果、試 験物質の存在下における結合量が試験物質の不存在下における結合量よりも少な ければ、試験物質が、 HMGBファミリータンパク質又はその誘導体と異常型ポリグルタ ミンタンパク質との結合を阻害すると判別することができる。
[0069] ポリグルタミン病等の神経変性疾患は、 HMGBファミリータンパク質が異常型ポリグ ルタミンタンパク質と結合して封入体に取り込まれ、核内で機能する HMGBファミリー タンパク質が減少することにより生じる。したがって、 HMGBファミリータンパク質又は その誘導体と異常型ポリグルタミンタンパク質との結合を抑制できる物質は、核内で 機能する HMGBファミリータンパク質の減少を抑制することにより、ポリグルタミン病等 の神経変性疾患を予防 '治療することができる可能性がある。すなわち、 HMGBフアミ リータンパク質又はその誘導体と異常型ポリグルタミンタンパク質との結合を抑制でき る物質を、ポリグルタミン病等の神経変性疾患に対する予防，治療効果を有する物質 としてスクリーニングすることができる。
[0070] HMGBファミリータンパク質又はその誘導体と異常型ポリグルタミンタンパク質との結 合を抑制できる物質は、 HMGBファミリータンパク質又はその誘導体、又は異常型ポ リグルタミンタンパク質のいずれか一方に作用する物質であってもよいし、両方に作 用する物質であってもよい。また、 HMGBファミリータンパク質又はその誘導体と異常 型ポリグルタミンタンパク質との結合を抑制できる物質には、解離状態にある両者の 結合を抑制できる物質、結合状態にある両者を解離させることができる物質等が含ま れる。
[0071] HMGBファミリータンパク質又はその誘導体と異常型ポリグルタミンタンパク質とは、 i n vitroで接触させてもよいし、 in vivoで接触させてもよい。
[0072] in vitroで接触させる場合、 HMGBファミリータンパク質又はその誘導体、あるいは異 常型ポリグルタミンタンパク質として、（i)目的とするタンパク質を発現している細胞又 は組織力も抽出した内因性タンパク質、（ii)目的とするタンパク質を発現できる組換 えベクターを宿主細胞に導入して形質転換体を作製し、当該形質転換体の培養物 力 抽出した組換えタンパク質、（iii)化学合成したペプチド等を使用することができる
[0073] in vivoで接触させる場合、 HMGBファミリータンパク質又はその誘導体、あるいは異 常型ポリグルタミンタンパク質として、（i)細胞内に存在する内因性タンパク質、 (ii)目 的とするタンパク質を発現できる組換えベクターを宿主細胞に導入することにより作 製された形質転換体内に存在する組換えタンパク質等を使用することができる。
[0074] HMGBファミリータンパク質又はその誘導体と異常型ポリグルタミンタンパク質とを接 触させる際、 HMGBファミリータンパク質としては、野生型 HMGBファミリータンパク質、 又は神経変性疾患において生じる異常型ポリグルタミンタンパク質に対する結合活 性を保持する変異型 HMGBファミリータンパク質を使用することができる。 HMGBファ ミリ一タンパク質の誘導体としては、神経変性疾患において生じる異常型ポリダルタミ ンタンパク質に対する結合活性が保持される限り、いかなる誘導体も使用してもよぐ 例えば、糖鎖が付加された HMGBファミリータンパク質、医薬的に許容される HMGB ファミリータンパク質の塩、 HMGBファミリータンパク質を含む融合タンパク質、標識物 質が付加された HMGBタンパク質等を使用することができる。標識物質としては、例 えば、フルォレセイン、ローダミン、フィコエリトリン、 Cy系色素、 Alexa系色素、 BODIP Y系色素等の蛍光性化合物;ルミノール、ルシゲニン、アタリジゥムエステル等の化学 発光性ィ匕合物；アルカリホスファターゼ、ホースラディッシュペルォキシダーゼ等の酵 素；ルシフェラーゼ、ルシフェリン等の生物発光性化合物；く SUP〉32〈/SUP〉P、 <SUP> 35〈/SUP〉S等のラジオアイソトープ（RI)等が挙げられる。
[0075] HMGBファミリータンパク質又はその誘導体と異常型ポリグルタミンタンパク質とを接 触させる際、 HMGBファミリータンパク質又はその誘導体と異常型ポリグルタミンタン ノ ク質との結合に影響を与える条件を調節し、 HMGBファミリータンパク質又はその 誘導体と異常型ポリグルタミンタンパク質との結合が試験物質の有無に依存するよう にする。
[0076] HMGBファミリータンパク質又はその誘導体と異常型ポリグルタミンタンパク質との結 合に影響を与える条件としては、例えば、温度、溶媒の種類、 HMGBファミリータンパ ク質又はその誘導体の濃度、異常型ポリグルタミンタンパク質の濃度等が挙げられる
[0077] HMGBファミリータンパク質又はその誘導体と異常型ポリグルタミンタンパク質との結 合量は、例えば、 HMGBファミリータンパク質又はその誘導体と異常型ポリグルタミン タンパク質との結合体量、 HMGBファミリータンパク質又はその誘導体と異常型ポリグ ルタミンタンパク質との結合によって生じるシグナル量等を指標として測定することが できる。
[0078] HMGBファミリータンパク質又はその誘導体と異常型ポリグルタミンタンパク質との結 合体量は、例えば、 HMGBファミリータンパク質又はその誘導体及び異常型ポリダル タミンタンパク質の ヽずれか 1種類以上に標識物質を付加しておき、 HMGBファミリー タンパク質又はその誘導体と異常型ポリグルタミンタンパク質とを接触させた後、 HM GBファミリータンパク質又はその誘導体と異常型ポリグルタミンタンパク質との複合体 を分離し、当該複合体が有する標識物質量を指標として測定することができる。具体 的には、 GST pull down法を利用して次のように測定できる。 HMGBファミリータンパク 質又はその誘導体及び異常型ポリグルタミンタンパク質のいずれか一方に RIを付カロ するとともに、他方を GSTとの融合タンパク質としておき、 HMGBファミリータンパク質 又はその誘導体と異常型ポリグルタミンタンパク質を接触させた後、 HMGBファミリー タンパク質又はその誘導体と異常型ポリグルタミンタンパク質との複合体をダルタチ オンセファロースカラムに吸着させる。カラムを洗浄した後、カラムに結合したタンパク 質を溶出する。溶出したタンパク質を SDS-PAGEに供して HMGBファミリータンパク質 又はその誘導体と異常型ポリグルタミンタンパク質との複合体を分離した後、当該複 合体が有する RI量を指標として、 HMGBファミリータンパク質又はその誘導体と異常 型ポリグルタミンタンパク質との結合体量を測定する。
[0079] また、 HMGBファミリータンパク質又はその誘導体と異常型ポリグルタミンタンパク質 との結合体量は、公知のタンパク質解析技術、例えば、 HMGBファミリータンパク質又 はその誘導体と異常型ポリグルタミンタンパク質との複合体に反応できる抗体又はそ の断片を使用したウェスタンブロッテイング法、免疫沈降法、 ELISA、組織免疫染色 法等によって測定することができる。なお、「抗体」には、モノクローナル抗体及びポリ クローナル抗体のいずれもが含まれ、「モノクローナル抗体」及び「ポリクローナル抗 体」には全てのクラスのモノクローナル抗体及びポリクローナル抗体が含まれる。また 、「抗体の断片」には、 Fab断片、 F(ab)'く SUB〉2く/ SUB〉断片、単鎖抗体 (scFv)等が含 まれる。
[0080] HMGBファミリータンパク質又はその誘導体と異常型ポリグルタミンタンパク質との結 合によって生じるシグナルの種類は特に限定されるものではないが、例えば、レポ一 ター遺伝子の発現、蛍光エネルギー移動（FRET)、表面プラズモン共鳴 (SPR)又は 水晶振動子の振動数移動による局所密度変化の検出等が挙げられる。
[0081] HMGBファミリータンパク質又はその誘導体と異常型ポリグルタミンタンパク質との結 合によって生じるシグナルがレポーター遺伝子の発現である場合、 HMGBファミリータ ンパク質又はその誘導体と異常型ポリグルタミンタンパク質との結合量は、例えば、 転写活性ィ匕因子を利用して次のように測定することができる。
[0082] 同じ細胞内で、 HMGBファミリータンパク質又はその誘導体及び異常型ポリダルタミ ンタンパク質の 、ずれか一方を、転写活性ィ匕因子である GAL4タンパク質の DNA結 合ドメインとの融合タンパク質として発現させ、他方をァクティベータドメイン (TA)との 融合タンパク質として発現させる。 HMGBファミリータンパク質又はその誘導体と異常 型ポリグルタミンタンパク質とが相互作用しない場合、 GAL4 DNA結合ドメインとァク ティベータドメインとは近接せず、 HMGBファミリータンパク質又はその誘導体と異常 型ポリグルタミンタンパク質とが相互作用をする場合、 GAL4 DNA結合ドメインとァク ティベータドメインが近接することになる。後者のとき、 UASGを上流にもつレポーター 遺伝子が酵母細胞に導入されていれば、その発現量が上昇し、これによつて HMGB ファミリータンパク質又はその誘導体と異常型ポリグルタミンタンパク質の相互作用の 有無及び強度を測定することができる。
[0083] レポーター遺伝子としては、例えば、 j8ガラクトシダーゼ遺伝子、クロラムフエニコー ルァセチルトランスフェラーゼ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、アンピシリン耐性遺伝 子、テトラサイクリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子等が挙げられ、レポーター 活性としては、例えば、 j8ガラクトシダーゼ活性、クロラムフエ-コールァセチルトラン スフエラーゼ活性、ルシフェラーゼ活性、アンピシリン耐性、テトラサイクリン耐性、力 ナマイシン耐性等が挙げられる。
[0084] HMGBファミリータンパク質又はその誘導体と異常型ポリグルタミンタンパク質との結 合によって生じるシグナルが蛍光エネルギー移動（FRET)である場合、 HMGBファミリ 一タンパク質又はその誘導体と異常型ポリグルタミンタンパク質との結合量は、例え ば、次のように測定することができる。
[0085] HMGBファミリータンパク質又はその誘導体と異常型ポリグルタミンタンパク質の ヽ ずれか一方を蛍光タンパク質 (ドナー）と融合するとともに他方を蛍光タンパク質 (ァク セプター）と融合しておき、 HMGBファミリータンパク質又はその誘導体と異常型ポリ グルタミンタンパク質とを接触させた後、 HMGBファミリータンパク質又はその誘導体と 異常型ポリグルタミンタンパク質との結合によって生じる蛍光量を測定する。この際、 蛍光タンパク質（ドナー）としては、 CFP(cyan fluorescent protein)、蛍光タンパク質（ ァクセプター）としては、 YFP (yellow fluorescent protein)を使用することができる。蛍 光エネルギー移動 (FRET)は、ある分子の蛍光団（ドナー）から他の分子の蛍光団（ ァクセプター）へ励起エネルギーが移動する現象で、励起された蛍光団はそのエネ ルギーを熱や新たな蛍光として放出する。蛍光エネルギー移動（FRET)が効率良く 起こるためには、 2つの分子がある程度近くにある必要があるので、細胞内で起こるタ ンパク質間の相互作用を検出する有効な手段として利用することができる。
[0086] 試験物質が、 HMGBファミリータンパク質又はその誘導体をコードする遺伝子の発 現を誘導するか否かは、例えば、次のようにして判別できるが、判別方法はこれに限 定されるものではない。
[0087] HMGBファミリータンパク質又はその誘導体をコードする遺伝子を発現する細胞と 試験物質とを接触させた後、 HMGBファミリータンパク質又はその誘導体をコードする 遺伝子の発現量を測定し、試験物質の接触後の発現量と、試験物質の接触前の発 現量とを比較する。その結果、試験物質の接触後の発現量が試験物質の接触前の 発現量よりも多ければ、試験物質が、 HMGBファミリータンパク質又はその誘導体をコ ードする遺伝子の発現を誘導すると判別することができる。
[0088] また、 HMGBファミリータンパク質又はその誘導体をコードする遺伝子を発現するモ デル動物に試験物質を投与した後、脳、脊髄、末梢神経等の組織における HMGBフ アミリータンパク質又はその誘導体をコードする遺伝子の発現量を測定し、試験物質 投与後の発現量と、試験物質投与前の発現量とを比較する。その結果、試験物質投 与後の発現量が試験物質投与前の発現量よりも多ければ、試験物質が、 HMGBファ ミリ一タンパク質又はその誘導体をコードする遺伝子の発現を誘導すると判別するこ とがでさる。
[0089] ポリグルタミン病等の神経変性疾患は、 HMGBファミリータンパク質が異常型ポリグ ルタミンタンパク質と結合して封入体に取り込まれ、核内で機能する HMGBファミリー タンパク質が減少することにより生じる。したがって、 HMGBファミリータンパク質又は その誘導体をコードする遺伝子の発現を誘導できる物質は、核内で機能する HMGB ファミリータンパク質の減少を補うことにより、ポリグルタミン病等の神経変性疾患を予 防 ·治療することができる可能性がある。すなわち、 HMGBファミリータンパク質又はそ の誘導体をコードする遺伝子の発現を誘導できる物質を、ポリグルタミン病等の神経 変性疾患に対する予防 ·治療効果を有する物質としてスクリーニングすることができる [0090] HMGBファミリータンパク質又はその誘導体をコードする遺伝子の発現を誘導でき る物質には、遺伝子の mRNAへの転写を誘導できる物質、及び mRNAのタンパク質へ の翻訳を誘導できる物質が含まれる。
[0091] HMGBファミリータンパク質又はその誘導体をコードする遺伝子を発現する細胞とし ては、例えば、（i)目的とするタンパク質を内因性タンパク質として発現している細胞、
(ii)目的とするタンパク質を発現できる組換えベクターを導入して作製した形質転換 体等を使用することができる。
[0092] モデル動物としては、 HMGBファミリータンパク質又はその誘導体をコードする遺伝 子を発現する動物（例えば、ラット、マウス、モルモット、ゥサギ等）を使用することがで きる。モデル動物としては、 HMGBファミリータンパク質又はその誘導体をコードする 遺伝子を人為的に発現させたトランスジエニック動物を利用することもできる。
[0093] HMGBファミリータンパク質又はその誘導体をコードする遺伝子の発現量は、 HMG
Bファミリータンパク質又はその誘導体量、又は mRNA量に基づき測定することができ る。
[0094] HMGBファミリータンパク質又はその誘導体量は、 HMGBファミリータンパク質又は その誘導体に対する抗体又はその断片を用いて定量することができる。この際、例え ば、放射能免疫測定法 (RIA)、酵素免疫測定法 (EIA)、化学発光測定法 (CLIA)、蛍 光免疫測定法 (FIA)等を利用することができる。また、 HMGBファミリータンパク質又は その誘導体量は、 HMGBファミリータンパク質又はその誘導体の活性を測定すること によって行うこともできる。 HMGBファミリータンパク質又はその誘導体の活性は、例え ば、当該タンパク質に反応し得る抗体又はその断片を利用したウェスタンブロッテイン グ法、 ELISA法等の公知の方法によって測定することができる。なお、「抗体」には、 モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体のいずれもが含まれ、「抗体の断片」に は、所定のタンパク質に反応し得る限り、いかなる断片も含まれる。抗体の断片として は、例えば、 Fab断片、 F(ab)'く SUB〉2く/ SUB〉断片、単鎖抗体 (scFv)等が挙げられる。 「反応し得る」には、所定のタンパク質のいずれの部分と反応する場合も含まれる。
[0095] mRNA量の測定にあたっては、公知の遺伝子解析技術、例えば、ハイブリダィゼー シヨン技術（例えば、ノーザンハイブリダィゼーシヨン法、ドットブロット法、 DNAマイクロ アレイ法等）、遺伝子増幅技術 (例えば、 RT-PCR等)等を利用することができる。 mR NAの存在量の具体的測定方法にっ 、て、 RT- PCRを利用する場合を例にして説明 する。 HMGBファミリータンパク質又はその誘導体をコードする遺伝子を発現する細 胞カも全 RNAを得た後、オリゴ dT-セルロースやポリ U-セファロース等を用いたァフィ ユティーカラム法、バッチ法等によりポリ（A) +RNA(mRNA)を得る。 cDNAを合成した 後、合成した cDNAを铸型とし、当該 cDNAにハイブリダィズし得るプライマーセットを 用いて PCRを行い、 PCR増幅断片を定量することによって mRNAの存在量を測定する 。この際、 PCRは、 PCR増幅断片生成量が初期铸型 cDNA量を反映するような条件（ 例えば、 PCR増幅断片が指数関数的に増加する PCRサイクル数)で行う。 PCR増幅 断片の定量方法は特に限定されるものではなぐ PCR増幅断片の定量には、例えば 、ラジオアイソトープ (RI)を用いた定量方法、蛍光色素を用いた定量方法等を利用 することができる。 RT-PCRを利用する場合には、例えば ABI PRISM 7700 (Applied Bi ◦systems社)等の市販の装置を利用して、遺伝子増幅過程をリアルタイムでモニター リングすることにより、 PCR増幅断片のより定量的な解析を行うことができる。
[0096] 遺伝子の発現レベルの測定値は、発現レベルが大きく変動しな 、遺伝子 (例えば、 β—ァクチン遺伝子、 GAPDH遺伝子等のハウスキーピング遺伝子）の発現レベルの 測定値に基づ 、て補正することが好ま 、。
[0097] スクリーニングされた物質は、例えば、ハンチントン病、脊髄小脳変性症、歯状核赤 核淡蒼球ルイ体萎縮症、球脊髄性筋萎縮症等のポリグルタミン病に加え、アルッノ、 イマ一病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症等の神経変性疾患の予防'治療に 有用であり、これら神経変性疾患おいて生じる神経細胞機能障害、神経細胞死等を 予防'治療することができる。
実施例
[0098] 1.方法
(1)初代神経細胞の培養及び核抽出物の調製
皮質神経細胞及び小脳神経細胞を公知の方法 (Tagawa, K. et al, J. Neurochem. 89, 974-987. (2004)； Fernandez- Funez, P. et al., Nature 408, 101-106. (2000))に より調製し、培養した。 AxCAwt、 AxCAwt— HMGB1、 AxCAwt— HMGB2、 AxCA— htt20 Q、 AxCA- HttlllQ、 AxCA- ATI- 30Q又は AxCA- ATI- 82Qを感染させた後 2日目に 、神経細胞を回収した。 6 10く31^〉7く/31^〉個の初代神経細胞から、公知の方法（ Dignam, J.D. et al, Nucleic Acids Res. 11, 1475—1489. (1983)； Okamoto, K. et al" Cell 60, 461-472. (1990))により核抽出物を調製した。すなわち、細胞を 8倍容量の 溶解用緩衝液（20mM HEPES (pH 7.9), ImM EDTA (pH 8.0), ImM DTT, 10%グリセ ローノレ， 0.5mMスペルミジン， ImMフエ-ルメチルスルホ -ルフルオライド， 1 μ g/ml ロイぺプチン， 1 μ g/mlぺプスタチン A, 0.3 μ g/mlアンチパイン， 0.3% NP- 40)中に 懸濁し、 Dounceホモジナイザータイプ Bを用いてホモジナイズした。分離した核を遠 心に供した後、 1M KC1を含有する溶解用緩衝液に再懸濁し、 4°C、 100,000 X gで 30 分間遠心に供した。上清を回収し、 PlusOneく SUP〉TM〈/SUP〉 mini dialysis kit (Amer sham Biosciences)を用いて溶解用緩衝液に対して 4°Cでー晚透析した。溶液を 17,4 00 X gで 15分間遠心に供し、上清を核抽出物として使用した。なお、そのァリコートを - 80°Cで保存した。
(2)二次元ゲル電気泳動及び銀染色
核抽出物を上記のように調製し、定量した (BioRad)。二次元ゲル電気泳動は、標 準的方法（Amersham Biosciences)に従って行った。すなわち、核抽出物 50 μ gを 8Μ 尿素及び 2% CHAPSに対して 2時間透析し (2回）、固定化 pHグラジェントゲル (immo bilized pH gradient gel： IPu) Η 3—10, 18cm, Amersham Biosciences)中でー晚 再水ネロした。等電; ¾電気泳動 (Isoelectric focusing : IEF)【ま、 Electrophoresis Power S upply ESP 3500 XL (Pharmacia Biotech)を用いて、 500Vで 1分間、 3500Vで 1.5時間 及び 3500Vで 16時間の条件で行った。 IPG片は、 IEF後直ちに使用するか、又は- 80 °Cで保存した。二次元電気泳動による分離後、 IPG片を 50mM Tris-HCl (pH 8.8)、 6 M尿素、 30%グリセロール、 2%(w/v) SDS及び 0.0125%ブロモフエノールブルーで 10 分間平衡化した (2回)。なお、 1回
目の平衡化の際には、 lOmg/mlジチオスレィトールを添カ卩し、 2回目の平衡化の際に は、 25mg/mlョードアセトアミドを添カ卩した。その後、 IPG片をポリアクリルアミドゲル（E xcelGel XL SDS 12-14, 245 X 180 X 0.5mm)上に置き、 1000V/20mAで 45分間及び 1 000V/40mAで 2時間 40分間電気泳動した。電気泳動後直ちにポリアクリルアミドゲル を銀染色キット（Amersham Biosciences)で染色し、 ImageMaster 2D Elite ver. 4.01 ( Amersham Biosciences)でスキャンしてタンパク質スポットを定量化した。
[0100] (3)ゲルのトリプシン消化及び TOF- Mass
TOF-MASSによるスポット同定のために、二次元電気泳動を再度行い、ゲルを Silve r Stain MS kit (Wako)で染色した。ポリアクリルアミドゲルの候補スポットを、 A及び B 溶液（Silver Stain MS kit, Wako)で脱染色した。ゲルを 50%ァセトニトリル (Aldrich)、 50mM炭酸アンモ -ゥム中で 10分間インキュベートし（3回）、さらに 100%ァセトニトリ ル中で 5分間インキュベートし、室温で 10分間乾燥させた。ゲルを、 20 1の消化用溶 液（50ng/ μ 1 sequence gradeトリプシン（Promega) , 30%ァセトニトリノレ， 50mM炭酸 アンモ-ゥム）中、 30°Cでー晚消化し、 30分間真空乾燥し、 0.1%トリフルォロ酢酸 (TF A)で再溶解した。溶液中のペプチドを ZiPtip (Millipore)を通過させることにより回収し 、脱塩及び精製のために 0.1% TFAで 3回洗浄し、 1 μ 1の溶出用溶液（10 g/ 1 a— シァノ -4-ヒドロキシ桂皮酸（CHCA) , 50%ァセトニトリル， 0.1% TFA)で溶出し、 SHIM AZU/KRATOS MALDト TOF/MS AXIMA-CRF (SHIMAZU BIOTECH)に供した。生 じた 1を AXIMA- CFR (S/W Version 2)で解析し、結果を MASCOT (http：〃 www.matri xscience.com)リサーチエンジン（NCBIデータベースへ照会する）に提出し、対応する タンパク質を同定した。
[0101] (4)免疫細胞化学
HeLa細胞（5 X 10く SUP〉4く/ SUP〉）及び皮質由来初代神経細胞（1.7 X 10く SUP〉6く /SUP を 6cmディッシュで培養し、アデノウイルスベクター感染 2日後に固定した (Tag awa, K. et al. , J.Neurochem. 89, 974-987. (2004))。 1次抗体としては、抗 Httャギポリ クローナル抗体（N- 18 ; 1 : 100 ; Santa Cruz)、抗 ATIャギポリクローナル抗体（H21； 1 : 1 00 ; Santa Cruz)、抗 HMGB1ゥサギポリクローナル抗体（1 : 1000 ; BD Bioscience)及び 抗 HMGB2ゥサギポリクローナル抗体（1 :200 ; BD Biosciences)を使用し、 2次抗体とし ては、 Alexa Flour 488抗ャギ抗体（Molecular Probes)及び Cy3抗ゥサギ抗体（Jacks on Immuno-Rearch)を使用した。細胞を最初に H21又は N- 18と室温で 1時間インキュ ペートし、次いで Alexa Flour 488抗ャギ抗体（2次抗体）と室温で 1時間インキュベー トした。二重染色のために、細胞を 5%スキムミルクと 30分間インキュベートし、抗 HMG B1抗体又は抗 HMGB2抗体と 4°Cでー晚インキュベートし、 Cy3抗ャギ抗体 (2次抗体 )と室温で 1時間インキュベートした。
[0102] (5)ウェスタンブロット解析
サンプルをサンプルローデイング用緩衝液（62.5mM Tris/HCl (pH6.8), 2%(w/v)ド デシル硫酸ナトリウム（SDS) , 2.5%(v/v) 2-メルカプトエタノール， 5%(v/v)グリセリン， 0. 0025%(w/v)ブロモフエノールブルー）に溶解し、 100°Cで 3分間加熱した。電気泳動 後、ゲルをポリビ-リデンジフルオライド膜（Fine Trap, Nihon Eido)に転写し、 1次抗 体とインキュベートし、ホースラディッシュペルォキシダーゼ結合 2次抗体と 1時間イン =Τュへ1 ~~トし、 enhanced chemiluminescence Western Blotting Detection system (Ame rsham Biosciences)により可視化した。 1次抗体の希釈条件は次の通りである。 1C2 (1 :2000 ;Chemicon) , CAG53b (1:2000) (Scherzinger, E. et al., Cell. 90, 549-558. (19 97)) , HMGB1 (1:5000 ;BD Biosciences) , HMGB2 (1:2000 ;BD Biosciences) , ATIH 21 (1:500 ; Santa Cruz) , GFP (1: 1000 ;Clontech)
[0103] (6)免疫沈降
10cmディッシュ中の HeLa細胞（1 X 10〈SUP〉6〈/SUP〉個）に pEGFP- Nl、 pEGFP- N 1- HMGB1又は pEGFP- Nl- HMGB2を SuperFect (invitrogen)によりトランスフエタトし た。また、アデノウイルスベクター（AxCAwt、 AxCA— HMGB1、 AxCA— HMGB2、 AxCA - htt20Q、 AxCA- httlllQ、 AxCA- ATI- 30Q又は AxCA- ATI- 82Q)を上記と同様に 感染させた。免疫沈降は、公知の方法（Okazawa, H. et al., Neuron. 34, 701-713. (2 002))に従って実施した。すなわち、 HeLa細胞を回収し、 TNE緩衝液（10mM Tris-H Cl (pH7.8) , 10% NP-40, 0.15M NaCl, ImM EDTA)中、 4°Cで 1時間インキュベートし 、 17,400 X gで 20分間遠心した。上清をプロテイン G-セファロース（Amersham Bioscie nces)と 4°Cで 2時間プレインキュペートした後、遠心した。上清を抗 HMGB1抗体（1:60 0, BD Biosciences)、抗 HMGB2抗体（1:600, BD Biosciences)又は抗 GFP抗体（1:60 0, Clontech)とー晚インキュベートし、プロテイン G-セファロースと 2時間インキュベー トした。プロテイン Gビーズを遠心（2,000 X gで 5分）により回収し、 TNE緩衝液で 5回洗 浄した。結合タンパク質をサンプル緩衝液で溶出し、 SDS-PAGEで分離し、 CAG53b 抗体（Scherzinger, E. et al., Cell. 90, 549-558. (1997))でブロットした。
[0104] (7)プルダウンアツセィ GST、 GST- HMGBl/2、 HMGB1/2- ACl及び HMGB1/2- AC2融合タンパク質を発 現させ、製造業者のプロトコル（Glutathione Sepharose 4 FastFlow;Amersham Pharm acia Biotech)に従って精製した。すなわち、大腸菌 BL21に pGEX-3X、 pGEX-3X-H MGBl/2、 pGEX- 3X- HMGB1/2- AC1又は pGEX- 3X- HMGB1/2- AC2プラスミドをト ランスフ タトし、培養した。融合タンパク質を IPTG (l.OmM)により誘導した。大腸菌 を回収し、 ImM EDTA及び ImM PMSFを含有する PBS中に懸濁させ、超音波処理し 、 Triton-100 (l%)をカ卩えて 4°Cで 30分間インキュベートし、 10,000 X gで 5分間遠心し た。上清をグルタチオンーセファロース 4B (Amersham Biosciences)ビーズで精製した 。 GST融合タンパク質をグルタチオン緩衝液（50mM Tris- HC1, 10mM Glutatione- red uced form)で溶出し、上清を 500 X gで遠心して回収した。 GST融合タンパク質をゥェ スタンプロットにより検出した。プルダウンアツセィのために、 IP用サンプルを GS4Bビ ーズと振盪しながら 4°Cで 1時間プレインキュペートした。上清を遠心により回収し、 GS T、 GST— HMGBl/2、 GST— HMGB1/2— AC1、 GST— HMGB1/2— AC2とー晚インキュ ペートした。 GS4Bビーズを遠心（2,000 X gで 5分）により回収し、 TNE緩衝液で 5回洗 浄した。結合タンパク質をサンプル緩衝液で溶出し、 SDS-PAGEで分離し、 CAG53b 抗体（Scherzinger, E. et al.， Cell. 90, 549-558. (1997))でブロットした。
(8)トランスジエニックマウス脳の免疫組織ィ匕学
64週齢 R6/2ハンチンチントランスジエニックマウス（Scherzinger, E. et al.， Cell. 90, 549-558. (1997))又は 40週齢 SCA1 (154Q/2Q)ノックインマウス（Watase, K. et al.， N euron. 34, 905-919. (2002))及びそれらの同腹子から脳組織を調製した。切片を脱 パラフィンし、再水和し、 0.1M酢酸ナトリウム緩衝液 (pH 7.0)で前処理した。 SCA1 (15 4Q/2Q)ノックインマウス用として、切片を 11NQ (抗ポリグルタミンゥサギポリクローナ ル抗体， 1:100, ref35)とインキュベートし、次いで Alexa flour 488抗ゥサギ抗体（Mole cular Probes)と室温で 1時間インキュベートした。ハンチンチントランスジェニックマウ ス用として、切片を 0.3%過酸化水素で 30分間処理し、内因性過酸化水素を阻害し、 抗 Httャギポリクローナル抗体（N-18 ; 1:20 ; Santa Cruz)及び抗ャギ HRP標識 2次抗 体とそれぞれ室温で 1時間インキュベートした。次いで、切片を Flurorescine Amplifica tion Reagentを用いて室温で 5分間検出した（1:50 ;TSA BIOTIN SYSTEM； PerkinElm er)。二重染色のために、切片を 5%スキムミルク- PBSでブロッキングした後、さらに抗 HMGB1ゥサギポリクローナル抗体（1:100 ;BD Bioscience)又は抗 HMGB2ゥサギポリ クローナル抗体（1:50 ;BD Bioscience)と 4°Cでー晚、 Cy3抗ゥサギ二次抗体と室温で 1時間インキュベートした。 um2あたりのシグナル強度を Aquacosmos (HAMAMATSU) により測定した。
[0106] (9)クローユング及びプラスミド構築
プラスミド pBS-HMGBl/2、 pEGFP- Nl- HMGBl/2、 pCI- HMGB1/2及び pGEX- 3X- HMGB1/2は、それぞれ、プラスミド pBluescript II SK+ (Clontech), pEGFP— Nl (Clont ech)、 pCI-neo (Clontech)及び pGEX-3X (Amersham)〖こラット由来の全長 HMGBl cD NA (配列番号 9)又は HMGB2 cDNA (配列番号 11)を挿入することにより構築した。 p GEX- 3X- HMGBl- ACl/2及び pGEX- 3X- HMGB2- ACl/2は、 pGEX- 3Xに C末端 領域欠損 HMGBl cDNA又は HMGB2 cDNAを挿入することにより構築した。全ての構 築物について、配列解析による確認を行い、コードされるタンパク質の発現レベルを ウェスタンブロットにより調べた。なお、 pGEX- 3X- HMGBl- AC1に含まれる C末端領 域欠損 HMGBl cDNAは、ラット HMGB1 (215アミノ酸、配列番号 10)の 1-186アミノ酸 をコードする領域を含み、 PGEX-3X- HMGB1-AC2に含まれる C末端領域欠損 HMG Bl cDNAは、ラット HMGB1 (215アミノ酸、配列番号 10)の 1-146アミノ酸をコードする 領域を含む。また、 PGEX-3X- HMGB2-AC1に含まれる C末端領域欠損 HMGB2 cD NAは、ラット HMGB2 (210アミノ酸、配列番号 12)の 1-186アミノ酸をコードする領域を 含み、 PGEX-3X- HMGB2-AC2に含まれる C末端領域欠損 HMGB2 cDNAは、ラット HMGB2 (210アミノ酸、配列番号 12)の 1-165アミノ酸をコードする領域を含む。
[0107] (10)アデノウイルス構築及び発現確認
アデノウイルス AxCA-HMGBl及び AxCA-HMGB2は、製造業者の説明書（Takara) に従って構築した。すなわち、 HMGB1及び HMGB2 cDNA断片をそれぞれ pBS-HM GB1及び pBS- HMGB2から Xhol— EcoRI断片として切り出し、 Blunting kit (TOYOBO) を用いて平滑末端化し、 pAxCAwt (Takara)の Swal部位にサブクローユングした。これ らのアデノウイルスによる HMGB1及び HMGB2タンパク質の発現は、使用前に確認し た。アデノウイルスベクター AxCA-httlllQ及び AxCA-htt20Qは、それぞれ 111個及 び 20個のポリグルタミン鎖をコードする 3塩基 (CAG)の繰り返し配列が付加されたヒト Httェクソン Iを含み、 AxCA- ATI- 30Q及び AxCA- ATI- 82Qは、それぞれ 30個及び 8 2個のポリグルタミン鎖をコードする 3塩基 (CAG)の繰り返し配列が付加された全長ヒ ト ATI cDNAを含み、これらのアデノウイルスベクターは公知の方法により構築した (T agawa, K. et al., J. Neurochem. 89, 974—987. (2004)) 0
[0108] (11)プルキンェ細胞の初代培養
小脳神経細胞は、 20-21日齢 Wistarラット胎児力 調製し、公知の方法 (Hirai, H. e t al., J. Neurosci. 20, 5217-5224. (2000))で培養し、プルキンェ細胞の生育及び榭 状突起分ィ匕のための解析を行った。すなわち、ポリ L-オル-チンでコーティングした 12ゥエルプレートに、 40 1 (5 X 10〈SUP〉6〈/SUP〉細胞/ ml)の播種用溶液（10% FBS 含有 DMEM/F-12)を用いて、 2 X 10〈SUP〉5〈/SUP〉細胞/ゥエルの細胞を播種した。 播種 3時間後、 FBSを含有しない培養液 1mlを添加した。播種後 17日目に、小脳神経 細胞にアデノウイルスベクターを感染させ、その 4日後に固定ィ匕した。プルキンェ細 胞の形態学的分析のために、抗マウスモノクローナル calbindin-28k抗体（1:200, Si gma-Aldrich)を用いて、室温で 1時間、免疫染色を行った。
[0109] (12)細胞死アツセィ
初代皮質神経細胞の細胞死アツセィのために、 6ゥヱルプレートの神経細胞（1.6 X 10〈SUP〉5〈/SUP〉細胞/ゥエル）に、播種 3日後、 AxCAゝ AxCA- HMGB1、 AxCA-HM GB2、 AxCA-htt20Q又は AxCA-httlllQ (m.o.i 300)を感染させた。その 48時間後、 1 :1000に希釈したヨウ化プロビジゥム（PI)を培養液に加え、 20分間インキュベートした 。神経細胞を洗浄し、 1%ノ《ラホルムアルデヒドを含有する 0.1Mリン酸緩衝液で洗浄 し、 PI陽性細胞をカウントした。
[0110] (13) BrU転写アツセィ
AxCAゝ AxCA-HMGBl, AxCA- HMGB2、 AxCA- htt20Q、 AxCA- httlllQ、 AxCA- AT1-30Q又は AxCA-ATl-82Qの感染 3日後、初代神経細胞を BrUと 3時間インキュ ペートし、 1%パラホルムアルデヒド含有 0.1Mリン酸緩衝液で固定化し、抗 BrUマウス モノクローナル抗体（1:200, Sigma-Aldrich)で染色した。 BrU免疫反応性は公知の方 法（Hoshino, M. at al., Biochem Biophys Res Commun. 313, 110—116. (2004))で定 量した。
[0111] (14)ショウジヨウバエ遺伝学
ハエの培養及び交配は 25°Cで行った。 P{GMR- GAL4}(BL8121)、 P{GMR- HD120Q } (BL8533) (Jackson, G.R. et al., Neuron. 21, 633-642. (1998))は、 Bloomington Sto ck Centerから得た。ヒト変異型 丁1トランスジェ-ックハェ（ 〈31^〉1〈/31^〉\¥〈31^〉1 118</SUP>UAS:SCA182Q[F7];GMR-GAL4)は公知である（Fernandez- Funez, P. et al., Nature. 408, 101-106. (2000))。 UAS- HMGB1トランスジエニックハエは、 pUAST トランスフォーメーションベクターにラット cDNAをクローユングし、 DNA構築物を分割 w (cslO)卵（Dura, J.M. et al., J Neurogenet. 9, 1-14. (1993))に導入することにより作成 した（Rubin, G.M. et al" Science. 218, 348-353. (1982))。ヒト httl20Q又は SCA182Q の発現により誘起される光受容体神経細胞変性及び/又は特徴的な目の表現型に 対する HMGB1の効果を F1集団間で比較するために、： y〈SUP〉l〈/SUP〉w〈SUP〉l 118〈/SUP〉UAS:SCA182Q[F7];GMR— GAL4又は GMR— HD120Q;GMR— GAL4を、メス UAS- HMGBl/Cyoと交配させた。遺伝子型の評価のために、異なるォスとの独立し た交配を少なくとも 4回行った。
[0112] (15)ショウジヨウバエ組織学
ハエ光受容体神経細胞の切片を得るため、成虫ハエ（0-10日 )の頭を 2%ホルムァ ルデヒド及び 2.5%ダルタルアルデヒド含有 0.1Mリン酸緩衝液（PB)で、 4°C、ー晚固定 化した後、 1%オスミウムで、室温、 3時間固定化し、次いで、エタノールで脱水し、 Epo nに組み込み、縦断面及び横断面の切片（2 μ m)を作成し、 toluidene blueで染色し た。電子顕微鏡（SEM)のために、ハエの頭を 2.5%グルタルアルデヒド含有 0.1M PB で固定化した後、 1%オスミウム含有 0.1M PBで固定ィ匕し (それぞれ 4°Cで 2時間）、ェ タノールで脱水し、臨界点乾燥した。各遺伝子型及び時間について、少なくとも 5個 体を用いた。
[0113] 2.結果及び考察
変異型ポリグルタミンタンパク質により引き起こされる核機能障害のパターンを理解 するためには、転写、 RNA修飾、クロマチン再構築等が行われるドメインにおける可 溶性核タンパク質量の変化を定量することが必要である。し力しながら、核封入体の 成分につ ヽては知られて 、るものの、核マトリックスにおける可溶性タンパク質の変化 につ ヽては知られて ヽな ヽ。
[0114] そこで、変異型ハンチンチン（Httl l lQ)又は変異型ァタキシン- 1 (AT1-82Q)を発 現する初代神経細胞における可溶性タンパク質のプロテオーム解析を行った。なお 、ハンチンチン (huntingtin： Htt)はハンチントン（Huntington's disease： HD)の原因遺 伝子産物であり、ァタキシン- 1 (ataxin-1： ATI)は 1型脊髄小脳性運動失調症（spinoc erebellar ataxia type 1 : SCA1)の原因遺伝子産物である。
[0115] 核封入体を含まな 、核マトリックス力も可溶性タンパク質を単離するために、核タン パク質精製の標準プロトコル（Dignam, J.D. et.al, Nucleic Acids Res. 11, 1475-1489 (1983))に従う図 1に示す工程を行った。ポリグルタミンを発現するアデノウイルスべク ターのトランスフエクシヨン 2日後（細胞死が生じる前）、核を神経細胞から分離した。 核膜を穿孔することなぐ核タンパク質を塩ィ匕カリウムの浸透圧により溶出させた。凝 集体が完全に除去されていることを、ウェスタンプロット解析により確認した（図 2)。 Ht tタンパク質の凝集体 (ゲル上部に堆積）は、予想通り核ペレットに含有されていた（図 2,棒線)。 ATIタンパク質の大部分も除去された（図 2,矢印)。核抽出物を低カリウム 緩衝液で透析した後、遠心することにより核膜を透過可能な非可溶性タンパク質を分 離した。遠心後、上清を二次元電気泳動に供した (図 2, レーン 2)。可溶性核タンパク 質フラクションは、変異型タンパク質の大きな凝集体及び小さな中間体又は変性体の いずれも含まな力 た（図 2,レーン 2)。変異型ポリグルタミンタンパク質は、核抽出物 のうち、核フラクション又は非可溶性フラクションに分離された（図 2,レーン 1及び 3)。 変異型タンパク質を含有する非可溶性フラクションは、この実験ではこれ以上使用し なかった。 ATI及び Httタンパク質の予想分子量はそれぞれ 93.6及び 21.5kDであり、 立体構造変化により SDS-PAGEにおける移動が遅れたために、主要バンドが予想分 子量よりも大きくなつたと考えられる（図 2)。オリゴマー又はマルチマーの形成も、非 可溶性フラクションにおいて高分子量バンドを発生させ得ると考えられる（図 2, レー ン 1及び 3)—方、低分子量バンドは分解産物に相当すると考えられる。なお、図 2は、 変異型ポリグルタミンタンパク質 (AT1-82Q)発現皮質神経細胞又は変異型ポリダル タミンタンパク質 (Httl l lQ)発現皮質神経細胞の細胞溶解物全体 (レーン 1)、同細 胞カも調製した核抽出物の可溶性タンパク質フラクション (レーン 2)及び非可溶性フ ラタシヨン（レーン 3)に関する、 CAG53b抗体（Sherzinger, E. et al. Cell. 90, 549-558. (1997))を用いたウェスタンブロット解析の結果を示す。各ポリグルタミンタンパク質の 特異的バンド（AT1-82Qのレーン 1, Httl 11Qのレーン 1)を矢印で示す。高分子量の 変異型 Htt凝集体 (ゲル上部に堆積)を棒線で示す。 AT1-82Q (レーン 1,矢印）の主 要バンドは核抽出により消失した (レーン 2, 3)。これは、 AT1-82Qが核膜孔を透過で きず核内に残存したことを示す。一方、 Httl 11Qは核力ゝら抽出されたが、非可溶性の ために調製中に沈殿した (レーン 3,矢印)。変異型タンパク質は可溶性核タンパク質 フラクション中では検出されな力つた。
正常型又は変異型ポリグルタミンタンパク質を発現する皮質又は小脳初代神経細 胞由来の可溶性核タンパク質を、二次元ゲル上で分離した。コントロールとして、非 感染神経細胞及び AxCA mockウィルス感染神経細胞由来の可溶性タンパク質を用 いた。解析は独立して 3回行った。銀染色により二次元ゲル上に約 400スポットが検出 され、これらのスポットに順に番号を付けた。 400スポットのシグナル強度を ImageMast er 2D Elite ver.4.01 (Amersham Biosciences)により定量し、正常型ポリグルタミンタン パク質発現ベクター (AxCA-htt20Q)感染、変異型ポリグルタミンタンパク質発現べク ター（AxCa-httlllQ)感染、 AxCA mockベクター（AxCA)感染及び非感染の神経細 胞間で比較した。正常型及び変異型ポリグルタミンタンパク質を発現する神経細胞間 の相違に焦点を当て、大きな相違 (2倍以上）を示すスポットを TOF-MASS解析用に 選択した。代表的なスポットを拡大して示す（図 3)。このスポットのタンパク質は、正常 型 Htt (Htt20Q)発現皮質神経細胞と比較して、変異型 Htt (Httl HQ)発現皮質神経 細胞において、発現が劇的に減少していた。このスポット由来のペプチドマスフットプ リントについて、 Mascot Reserch Engineを用いてさらに解析した。その結果、このスポ ットが HMGB1であることが判明した。類似の解析を、正常型 AT1 (A -30Q)又は変 異型 ATI (AT1-82Q)を発現する皮質神経細胞、及び正常型 ATI又は変異型 ATIあ るいは正常型 Htt又は変異型 Httを発現する小脳神経細胞につ 、て行った。次！ヽで 、ゲルから切り出した 200スポットを TOF-MASSに同様に供した。いくつかのスポットは 数個の候補タンパク質に対応し、等電点による同定が可能であった。これらのうち 59 タンパク質が最終的に同定され、それらのスポットに関して、正常型及び異常型ポリ グルタミンタンパク質発現神経細胞間のシグナル強度の比率を求めた結果、 HD又は SCA1患者において、変異型 Htt及び ATIは定常的に HMGBファミリータンパク質を減 少させることが明ら力となった (表 1)。表 1に示すように、 HMGB1及び 2は、変異型 AT 1を発現する小脳神経細胞及び変異型 Httを発現する皮質神経細胞において減少し ていた。小脳及び皮質神経細胞は、それぞれ SCA1及び HDにおいて悪影響を受け る。一方、 HMGBタンパク質は、変異型 ATIを発現する皮質神経細胞では減少しなか つた。皮質神経細胞は SCA1では悪影響を受けない。核抽出物の可溶性フラクション における HMGB1及び 2の減少は、ウェスタンブロットにより再確認した（データは示さ ない)。
[0117] [表 1]
Figure imgf000038_0001
[0118] HMGBファミリータンパク質及び変異型ポリグルタミンタンパク質の関係を解析する ため、変異型ポリグルタミンタンパク質を発現する初代神経細胞の免疫組織ィ匕学を 行った。皮質神経細胞の封入体において、 HMGB1及び 2は、変異型 Htt又は ATIとと もに共局在していた（図 4)。変異型ポリグルタミン凝集体を有する細胞の場合、封入 体の外側の核マトリックスにおいて、 HMGB1及び 2は減少していた（図 4)。外因性 HM GB及び過剰発現変異型ポリグルタミンタンパク質に関する類似の共局在力 HeLa細 胞において観察された (データは示さない)。このことは、変異型ポリグルタミンタンパ ク質が HMGB1及び 2と相互作用することを示唆する。なお、図 4は、抗 HMGBタンパク 質抗体及び抗 Htt (N18)抗体又は抗 ATI (H21)抗体による、アデノウイルスベクター 感染初代皮質神経細胞 (感染後 3日）の免疫組織化学を示し、白色矢印は、核マトリ ックスにお 、て HMGBタンパク質が減少して 、た、核封入体を有する細胞を示す。
[0119] HMGBファミリータンパク質及びポリグルタミンタンパク質が相互作用することを試験 するために、免疫沈降及びプルダウンアツセィを行った。免疫沈降の前に、様々な抗 ポリグルタミン抗体の特異性をウェスタンプロット解析により特徴付けた (データは示さ ない）。 CAG53b抗体は、正常型及び変異型ポリグルタミンタンパク質 (ATI及び Htt) と反応した。抗 ATI抗体 (H21)は、正常型及び変異型 ATIを検出したが、 Httは検出 しな力つた。 1C2抗体は、変異型 Htt及び ATIに優先的に反応した。これらの特異性 を考慮し、免疫沈降及びプルダウンアツセィは、 CAG53b抗体を用いて行った。
[0120] pEGFP- N1- HMGB1/2プラスミドを HeLa細胞にトランスフエクシヨンした後、正常型 又は変異型ポリグルタミンタンパク質発現アデノウイルスベクターを感染させ、正常型 又は変異型ポリグルタミンタンパク質を発現させた。ポリグルタミンタンパク質及び HM GB- EGFPタンパク質の発現レベルは、 CAG53b抗体及び抗 GFP抗体を用いたウェス タンプロットによりチェックした（図 5の左パネル)。免疫沈降は、抗 HMGB又は抗 EGFP 抗体を用いて行った。変異型ポリグルタミンタンパク質は、 HMGB1及び HMGB2と共 沈殿したが、正常型ポリグルタミンタンパク質はしな力つた（図 5の右パネル)。ポリグ ルタミンタンパク質を発現する HeLa細胞を用いたプルダウンアツセィにより、変異型 ポリグルタミンタンパク質と HMGBタンパク質との相互作用が確認された（図 6)。なお、 図 5中、レーン 1は pEGFP- N1- HMGB1トランスフエクシヨン及び AxCA感染、レーン 2は pEGFP- N1- HMGB1トランスフエクシヨン及び AxCA- ATI- 30Q感染、レーン 3は pEGF P- Nl- HMGB1トランスフエクシヨン及び AxCA- ATI- 82Q感染、レーン 4は pEGFP- N1- HMGB2トランスフエクシヨン及び AxCA感染、レーン 5は pEGFP- Nl- HMGB2トランスフ ェクシヨン及び AxCA- ATI- 30Q感染、レーン 6は pEGFP- Nl- HMGB2トランスフエクシ ヨン及び AxCA-ATl-82Q感染、レーン 7は pEGFP-Nl-HMGBlトランスフエクシヨン及 び AxC
A感染、レーン 8は pEGFP- Nl- HMGB1トランスフエクシヨン及び AxCA- htt20Q感染、 レーン 9は pEGFP- Nl- HMGB1トランスフエクシヨン及び AxCA- httlllQ感染、レーン 1 0は pEGFP- Nl- HMGB2トランスフエクシヨン及び AxCA感染、レーン 11は pEGFP- N1- HMGB2トランスフエクシヨン及び AxCA- htt20Q感染、レーン 12は pEGFP- Nl- HMGB2 トランスフエクシヨン及び AxCA-httlllQ感染の結果であり、 Aは AT82Qを表し、 Hは H ttlllQを表す。また、図 6中、レーン 1は AxCA感染、レーン 2は AxCA- ATI- 30Q感染 、レーン 3は AxCA- ATI- 82Q感染、レーン 4は AxCA感染、レーン 5は AxCA- htt20Q 感染、レーン 6は AxCA- httlllQ感染の結果であり、 Aは AT82Qを表し、 Hは HttlllQ を表す。
さらに、変異型 Httトランスジエニックマウス及び ATIノックインマウスを用いた免疫組 織ィ匕学による解析を行った。変異型 Httトランスジエニックマウスを用いた結果により、 封入体における HMGB及び変異型ポリグルタミンタンパク質の共局在、及び封入体 を有する神経細胞の核マトリックスにおける HMGBの減少が確認された（図 7)。なお、 図 7の左パネルは、 Httトランスジエニックマウスの線条体神経細胞の封入体にお!、て 、 HMGBが変異型 Httタンパク質と共局在することを示し、 64週齢 R6/2マウスの線条 体は抗 Htt(N_18)及び HMGB抗体で染色した。また、図 7の右パネルは、 100以上の 神経細胞力 得られた核マトリックスのシグナル強度の定量的解析結果を示し、この 結果から、封入体陽性細胞の核マトリックスにおける HMGBの減少が明ら力となった（ *:p&lt;0.01, Student t- test)。変異型 Httトランスジエニックマウスとは対照的に、封入 体は、プルキンェ細胞と同様に、 ATIノックインマウスの神経細胞ではほとんど観察さ れな力つた。一方、海馬及び大脳皮質では、多数の封入体が観察された (データは 示さない）。 ATIノックインマウス（AT1-KI)の組織免疫化学により、 HMGBはプルキン ェ細胞及び顆粒細胞の核マトリックスにおいて減少することが明ら力となった（図 8)。 なお、図 8の上パネルは、 11NQ抗体を用いた ATIノックインマウスの免疫組織ィ匕学に よる解析結果を示し、下パネルはそれぞれ 100以上の細胞力 得られたシグナルの 定量的解析結果を示す（*:p&lt;0.01, **:p&lt;0.05, Student t-test)。上記結果は、 変異型 ATIタンパク質を発現する初代脳神経細胞の可溶性核タンパク質フラクション における HMGBタンパク質の減少と一貫する。コントロールマウスにおける HMGBレべ ルは、他の神経細胞よりもプルキンェ細胞において減少した。 ATIノックインマウスの プルキンェ細胞において、 HMGBの核シグナルは、細胞質シグナルよりもさらに減少 した（図 8)。これらの結果は、封入体への HMGBの取り込みは、 HMGBの減少にとつ て必須ではないが、その減少は、 HD及び SCA1モデルマウスの神経細胞における共 通の特徴の特徴であることを示唆する。 HMGB及び凝集前ポリグルタミンタンパク質（ モノマー又はオリゴマー）間の相互作用は、 HMGBの減少に重要である力 タンパク 質複合体の変性様式は 2つのマウスモデルで異なると考えられる。
[0122] HMGBの減少力 ポリグルタミン病にどのように影響するかを調べるために、アデノ ウィルスベクターを用いた HMGBの供給により、初代神経細胞がポリグルタミンタンパ ク質毒性から保護されるか否かを試験した。まず、皮質神経細胞の Htt誘導細胞死に 対する HMGBタンパク質の影響を観察した。細胞死はバックグラウンドレベルまで減 少した（図 9a)。このことは、 HMGBが Htt誘導細胞死を抑制できることを示す。変異型 Httが HMGBとともに発現されて!、ること確認した（図 9b)。 Httトランスジヱニックマウス 由来の初代神経細胞をこのアツセィに用いた。なお、図 9aは、皮質神経細胞の変異 型 Htt誘導細胞死に対する HMGBの抑制効果を示し、細胞死の割合はアデノウィル スベクター感染 3日後の PI陽性細胞の割合により算出した。図 9aに示されるように、細 胞死は HttlllQを発現するアデノウイルスベクターにより増加し、この増加は AxCA- HMGB1又は 2の共感染により抑制された力 mockアデノウイルスベクターの共感染に より抑制されな力つた。また、図 9bは、初代皮質神経細胞における Htt及び HMGBタ ンパク質の発現レベルの、ウェスタンブロットによる確認結果を示す。図 9b中、レーン 1は AxCA及び AxCAの共感染、レーン 2は AxCA- HMGB1及び AxCAの共感染、レー ン 3は AxCA- HMGB2及び AxCAの共感染、レーン 4は AxCA及び AxCA- Httl 11 Qの 共感染、レーン 5は AxCA- HMGB1及び AxCA- HttlllQの共感染、レーン 6は AxCA- HMGB2及び AxCA- Httl 1
1Qの共感染の結果を示す。
[0123] 脳神経細胞の ATI誘導毒性に対する HMGBタンパク質の効果を試験した。変異型 ATIは、ヒト SCA1病理から予想されるように、顆粒神経細胞の細胞死を誘導しなかつ たから、プルキンェ細胞における効果を調べた。変異型 ATIはプルキンェ細胞の生 存、神経突起伸長、神経突起分岐を妨げた（図 10a、 AT82Q) 0しかし、 AxCA及び Ax CA-AT30Qウィルス感染は、プルキンェ細胞に顕著な影響を与えなつた (mock, AT3 0Q)。 HMGB1及び 2タンパク質は、プルキンェ細胞の神経突起伸長、神経突起分岐 、生存に対する変異型 ATIの毒性を緩和した（図 10a, AT82Q+HMGB1 AT82Q+HM GB2) (p&lt;0.01) (図 lla-c)。 ATIノックインマウス及び SCA1ヒト病理と同様に、プル キンェ細胞には、顆粒細胞とは対照的に封入体が観察されな力つた（図 10a)。しかし 、 ATI及び HMGBタンパク質の発現は確認された（図 10b)。新生 ATIノックインマウス 力 調製した初代脳神経細胞を用いた類似の実験を行った。 HMGBタンパク質によ る同様の改善傾向が観察されたが、統計的には確認できな力つた。これは、無症状 の新生マウスの脳神経細胞において、変異型 ATIの毒性は極めて小さいからである 。なお、図 10aにおいて、プルキンェ細胞は抗カルビンジン (calbindin) 28K抗体で染 色し、 Aquacosmos(HAMAMATSU)を用いて生存及び神経突起伸長を測定した。図 1 Obは、感染初代皮質神経細胞における ATI及び HMGBタンパク質の発現レベルの、 ウェスタンブロットによる確認結果を示し、レーン 1は AxCA感染、レーン 2は AxCA-AT 30Q感染、レーン 3は AxCA- AT82Q感染、レーン 4は AxCA- AT82Q及び AxCA- HMG B1感染、レーン 5は AxCA-AT82Q及び AxCA-HMGB2感染の結果を示す。図 11aは プルキンェ細胞の生存に関する定量的解析結果であり、 20個の視野について解析 した（*:p&lt;0.01, Student t-test) 0図 libはプルキンェ細胞の神経突起伸長に関す る定量的解析結果であり、 AxCA-ATl-82Q (n=20)以外の各感染については 50以上 のプルキンェ細胞を解析した（*:p&lt;0.01, Student t-test) 0図 11cはプルキンェ細 胞の神経突起分岐に関する定量的解析結果であり、 AxCA-ATl-82Q (n=20)以外の 各感染については 50以上のプルキンェ細胞を解析した（*:p&lt;0.01, Student t-test
) o
ポリグルタミンの毒性に対する HMGBタンパク質の保護効果をさらに明らかにするた めに、 HMGB1タンパク質トランスジエニックハエを作成し、ヒト変異型 ATI及び Htt発 現ショウジヨウバエ（Fernandez- Funez, P. et al., Nature 408,1001-106 (2000)； Jacks on, G.R. et.al, Neuron. 21, 633-642 (1998))と交配させた。我々が作成したトランス ジエニックハエにおいて HMGB1タンパク質は、 GMR-GAL4によって、発生段階及び 成虫の目において特異的に発現する（データは示さない)。変異型 ATIを発現するシ ョウジヨウバエの目の変性は、光学顕微鏡で検出し、電子顕微鏡を用いて 1〜10日間 25°Cでスキャンした（図 12)。ヘテロ接合体 HMGB1 (HMGB1- 2.1)ハエを、 ATI- 82Q ホモ接合体トランスジエニックハエ（F7,ヒト ATI遺伝子は Xクロモソーム上に位置する )と交配させ、両遺伝子を発現するハエ及び AT1-82Qのみを発現するハエの集団を 発生させた。 LM及び SEMを用いた解析により、 HMGB1は、 in vivoにおいて、変異 AT 1による神経変性を抑制することが明ら力となった。類似の効果が、 HMGB1トランスジ エニックハエ（HMGB1- 4.1)の別の系でも確認された。 ATI- 82Q発現が、 UAS- ATI- 82Q及び UAS-HMGB1-2.1間での GL4タンパク質に対する競合により減少したことの 可能性を排除するために、 2種のハエ（UAS-ATl-82Q/X;GMR-GAL4/Cyo及び UAS - ATI- 82Q/X;GMR- GAL4/UAS- HMGB1- 2.1)における ATI- 82Qの発現を調べ、 A T-82Qはこれらのハエにお!、ても等しく発現されて 、ることが確認された（データは示 さない)。なお、図 12の上パネルは光学顕微鏡による観察結果を示し、図 12の下パネ ルは電子顕微鏡による観察結果を示し、レーン 1は X/Y;GMR-GAL4/Cyo、レーン 2 は X/Y;GMR- GAL4/UAS- HMGB1- 2.1、レーン 3は UAS- ATI- 82Q/X;GMR- GAL4/ Cyo、レーン 4は UAS- ATI- 82Q/X;GMR- GAL4/ UAS- HMGB 1-2.1の結果を示す。 ショウジヨウバエの Htt誘導目変性に対する HMGB1の効果を観察した。変異 Httトラ ンスジエニックハエは粗い目の表現型を示さないので（Jackson, G.R. et.al, Neuron. 21, 633-642 (1998))、目の切断面の組織学的分析により HMGB1の効果を調べた。 変異 Htt発現は、個眼の構造を乱し、光受容体細胞を破壊した（図 13a、パネル 4)。 H MGB1発現は、光受容体神経細胞の破壊を回復させた（図 13a、パネル 8)。この効果 は、 GMR- GAL4発現単独による効果でも（図 13a、パネル 7)、 UAS- HMGB1トランスジ ーン単独による効果（図 13a、パネル 6)でもない。個眼あたりの感桿分体数の定量解 祈により、 HMGB1発現によるこの効果が支持された（図 13b)。これらの結果から、 HM GB1は、ショウジヨウバエモデルにおけるポリグルタミン誘導神経変性を抑制すること が確認された。 EP-HMGD (HMGボックス及び塩基性 Z酸性領域を有するショウジョ ゥバエ HMG)は、 ATI誘導神経変性の抑制因子であり、 EP-DSP1 (2つの HMGボック スは有するが塩基性 Z酸性領域は欠いているショウジヨウバエタンパク質）は、その 病理の促進因子であり、このことは、 HMGBタンパク質がポリグルタミン病の抑制因子 であることを支持する。

Claims

請求の範囲
[1] HMGBファミリータンパク質又はその誘導体を含有する、神経変性疾患の予防'治 療剤。
[2] 前記 HMGBファミリータンパク質が、下記 (a)又は (b)記載のタンパク質である、請 求項 1記載の予防'治療剤。
(a)配列番号 2、 4、 6又は 8記載のアミノ酸配列からなるタンパク質
(b)配列番号 2、 4、 6又は 8記載のアミノ酸配列において 1又は複数個のアミノ酸が 欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、神経変 性疾患において生じる異常型ポリグルタミンタンパク質に対する結合活性を有するタ ンパク質
[3] 前記 (b)記載のタンパク質が、転写促進活性、 DNA修復促進活性及び細胞死抑制 活性のうち 1種以上の活性を有する請求項 2記載の予防 '治療剤。
[4] HMGBファミリータンパク質又その誘導体を発現し得る組換えベクターを含有する、 神経変性疾患の予防 ·治療剤。
[5] 前記組換えベクター力 下記 (c)〜 (f)の 、ずれかに記載の DNAを含む請求項 4記 載の予防'治療剤。
(c)配列番号 2、 4、 6又は 8記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする DNA
(d)配列番号 2、 4、 6又は 8記載のアミノ酸配列において 1又は複数個のアミノ酸が 欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、神経変 性疾患において生じる異常型ポリグルタミンタンパク質に対する結合活性を有するタ ンパク質をコードする DNA
(e)配列番号 1、 3、 5又は 7記載の塩基配列力 なる DNA
(f)配列番号 1、 3、 5又は 7記載の塩基配列からなる DNAに相補的な DNAとストリンジ ェントな条件下でノ、イブリダィズし得る DNAであって、神経変性疾患にぉ 、て生じる 異常型ポリグルタミンタンパク質に対する結合活性を有するタンパク質をコードする D NA
[6] 前記 (d)又は (f)記載の DNAがコードするタンパク質力 転写促進活性、 DNA修復 促進活性及び細胞死抑制活性のうち 1種以上の活性を有する請求項 5記載の予防 · 治療剤。
[7] 試験物質が、 HMGBフアリミ一タンパク質又はその誘導体と、神経変性疾患におい て生じる異常型ポリグルタミンタンパク質との結合を阻害する否かを判別し、前記結 合を阻害する試験物質を神経変性疾患に対して予防'治療効果を有する物質として スクリーニングする工程を含む、神経変性疾患に対して予防 ·治療効果を有する物質 のスクリーニング方法。
[8] 試験物質が、 HMGBファミリータンパク質又はその誘導体をコードする遺伝子の発 現を誘導するか否かを判別し、前記発現を誘導する試験物質を神経変性疾患に対 して予防'治療効果を有する物質としてスクリーニングする工程を含む、神経変性疾 患に対して予防 ·治療効果を有する物質のスクリ一二ング方法。
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