JP2001522234A

JP2001522234A - β−カテニン、ＴＣＦ−４およびＡＰＣは相互作用して癌を防ぐ

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Publication number: JP2001522234A
Application number: JP54083298A
Authority: JP
Inventors: バーカー，ニック; クレヴェルス，ハンス; キンツラー，ケネス・ダブリュー; コリネック，ウラジミール; モリン，パトリス・ジェイ; スパークス，アンドリュー・ビー; ヴォーゲルスティン，バート
Original assignee: Johns Hopkins University
Current assignee: Johns Hopkins University
Priority date: 1997-03-20
Filing date: 1998-03-20
Publication date: 2001-11-13
Also published as: WO1998041631A3; ATE336575T1; DE69835590T2; AU6765898A; US5851775A; EP0972037A2; US5998600A; WO1998041631A2; EP0972037B1; CA2285701C; DE69835590D1; CA2285701A1

Abstract

(57)【要約】 APC癌抑制タンパタ質は、Tcf/Lef転写因子と相互作用することが最近示されたタンパク質である、β-カテニンに結合する。ここに、大腸上皮に発現している、Tcfファミリーの一員をコードする遺伝子（hTcf-4）をクローン化し、特徴付けた。hTcf-4は、β-カテニンと結合したときにのみ転写をトランス活性化する。APC^-/-大腸癌細胞の核に、Tcfレポーター遺伝子の転写によって測定されるように、構成的に活性な、安定なβ-カテニンhTCF-4複合体が含まれていることを見出した。APCを再び導入するとhTcf4からβ-カテニンが除かれ、転写のトランス活性化が失われた。APC機能の喪失に起因するTCF標的遺伝子の構成的な転写は、大腸癌の初期の悪性形質転換における決定的な出来事であり得る。大腸癌に見出される変異体APC遺伝子の産物はβ-カテニン/Tcf-4転写活性化の調節ができないことも、ここに示す。さらに、無傷のAPC遺伝子を持つ大腸癌が、機能的重要なリン酸化部位を変えるような、β-カテニンの微妙な活性化変異を含むことを示した。これらの結果は、β-カテニンの調節がAPCの腫瘍抑制効果に決定的であること、およびこの調節をAPCあるいはβ-カテニンのいずれかの変異によって回避し得ることを示している。

Description

【発明の詳細な説明】 β-カテニン、TCF-4およびAPCは相互作用して癌を防ぐアメリカ合衆国政府は、本発明に関して支払い済みのライセンスを有し、限られた状況においては特許権者に対し、国立衛生研究所から与えられた補助金CA57 345の条件によって規定されている通りの妥当な条件で他者にライセンスを与えるよう要求する権利を有する。発明の属する技術分野本発明は、癌の診断および治療の分野に関する。さらに詳しくは、APCまたは β-カテニンの変異に関連した癌を診断および治療する方法に関する。発明の背景腺腫様大腸ポリポーシス（APC）遺伝子の変異は、ヒトにおける、疾患の原因となる最も一般的な遺伝子事象であり、その集団のおよそ50%が、平均的な寿命のあいだにそのような変異から始まる大腸ポリープになるだろう(14)。結腸直腸腫瘍形成におけるAPCの癌抑制あるいは“監視”機能と一致して、APC変異を遺伝的に受け継いだ個体は何千個もの結腸直腸腫瘍を生じる(15、16)。APCはそのアミノ末端を介してホモニ量化し(17)、他の少なくとも6つのタンパク質、すなわちβ-カテニン(18)、γ-カテニン（プラコグロビン）(19)、チューブリン(20)、 EB1(21)、Drosophila腫瘍抑制タンパク質の相同体であるhDLG(22)、およびZW3/G SK3βキナーゼ（23）と相互作用する。これらの相互作用するタンパク質のうちに、どれかAPC増殖調節シグナルを伝達するものがあるかどうかは不明である。それゆえ、この技術分野では、腫瘍抑制遺伝子APCが細胞内でどのように機能するかをより完全に理解する必要がある。発明の概要転写活性化タンパク質をコードするヒトのヌクレオチド配列を提供することは、本発明の1つの目的である。転写活性化タンパク質の単離された調製物を提供することは、本発明の別の目的である。野生型APCあるいはAPC転写調節経路の下流タンパク質が細胞内に存在するかあるいは存在しないかを決定する方法を提供することは、本発明の1つの目的である。本発明の別の目的は、家族性腺腫性ポリポーシス（FAP）患者あるいは癌を発生するリスクの高まった患者に使用するための候補薬物を同定する方法を提供することである。癌患者、とりわけAPCあるいはβ-カテニン変異のある癌患者を治療するための候補薬物を同定する方法を提供することは、本発明のさらに別の目的である。本発明の別の目的は、腫瘍性（neoplastic）であると疑われる試料に関して癌を診断する方法を提供することである。本発明の別の目的は、結腸直腸癌あるいはFAPと関連する他の癌の患者を治療する方法を提供することである。本発明のこれらおよび他の目的は、以下に記載する1つあるいはそれ以上の態様を提供することにより達成される。本発明の一態様においては、SEQ ID NO:2 または4に示すTcf-4タンパク質をコードする、イントロンフリーのDNA分子を提供する。本発明の別の態様に従い、単離されたTcf-4タンパク質を提供する。このタンパク質は、他のヒトタンパク質を事実上含まず、SEQ ID NO:2または4に示す配列を有する。本発明の別の態様においては、野生型APCあるいはAPC転写調節経路の下流タンパク質が細胞内に存在するかあるいは存在しないかを決定する方法を提供する。その方法には以下の段階が含まれる。すなわち、 Tcf応答性レポーター遺伝子を細胞内に導入すること；および、前記レポーター遺伝子の転写を測定すること；であって、前記レポーター遺伝子の活発な転写を支持する細胞は、野生型APCを有していないか、あるいはAPC 転写調節経路の野生型の下流タンパク質を有していない。本発明のさらに別の態様に従い、野生型APCが細胞内に存在するかあるいは存在しないかを決定する方法を提供する。その方法には以下の段階が含まれる。すなわち、 Tcf応答性レポーター遺伝子を細胞の可溶化物と接触させること；および、前記レポーター遺伝子の転写を測定すること；であって、前記転写を阻害するような可溶化物が野生型APCを有する。本発明のさらに別の態様においては、候補薬物を同定する方法を提供する。その薬物は、FAPあるいは他の癌の患者、または癌を発生するリスクの高まった患者の治療に有用であり得る。その方法には以下の段階が含まれる。すなわち、野生型APCを持たないか、あるいは変異体β-カテニンを含む細胞を試験化合物と接触させること； cf応答性レポーター遺伝子の転写を測定すること；であって、レポーター遺伝子の転写を阻害するような試験化合物が、癌治療のための候補薬物である。本発明のさらに別の観点に従い、FAP患者、結腸癌患者、β-カテニンあるいは APCに変異のある患者、あるいは癌を発生するリスクの高まった患者に使用するための候補薬物を同定する、別の方法を提供する。その方法には以下の段階が含まれる。すなわち、 Tcf応答性レポーター遺伝子を、レポーター遺伝子が試験化合物の非存在下で転写されるような条件下で、試験化合物と接触させること；および、 Tcf応答性レポーター遺伝子の転写を測定すること；であって、前記転写を阻害するような試験化合物が癌治療のための候補薬物である。本発明の別の観点に従い、FAP患者あるいは癌を発生するリスクの高まった患者に使用するための候補薬物を同定する方法を提供する。その方法には以下の段階が含まれる。すなわち、試験化合物を、β-カテニンおよびTcf-4が互いに結合するような条件下で、 β-カテニンおよびTcf-4と接触させること、および、試験化合物がβ-カテニンとTcf-4の結合を阻害するかどうか決定すること、であって、結合を阻害するような試験化合物が癌の治療あるいは予防のための候補である。本発明のさらに別の態様に従い、腫瘍性であると疑われる試料に関して癌を診断する方法を提供する。その方法には以下の段階が含まれる。すなわち、試料中に見出されるCTNNB配列を、正常組織に見出される第二のCTNNB配列と比較することであって、第一および第二の配列の間の違いが癌の指標である。本発明の別の観点に従い、結腸直腸癌あるいはFAPに関連した他の癌の患者を治療する方法を提供する。その方法には以下の段階が含まれる。すなわち、 APCコード配列の一部分を含むヌクレオチド配列を患者に投与することであって、前記一部分はβ-カテニン結合部位を含む。本発明の別の観点に従い、結膀直腸癌あるいはFAPに関連した他の癌の患者を治療する方法を提供する。その方法には以下の段階が含まれる。すなわち、 APCコード配列の一部分を含むポリペプチドを患者に投与することであって、前記一部分はβ-カテニン結合部位を含む。このように、本発明は、とりわけFAPおよびAPCあるいはβ-カテニン変異を伴う他の癌に有用な診断、治療および薬物発見の方法を用いる技術を提供する。図面の簡単な説明図1 hTcf-4およびhTcf-1の配列の比較おのおの異なるCOOH末端をコードする、hTcf-4の2つの選択的スプライス型を同定した。一方の型（hTcf-4E）はhTCF-1E（上段）(7)と相同であり、もう一方の型（hTcf-4B）はhTcf-1B（下段）と相同であった。非常に保存されたNH₂末端の相互作用ドメインおよび高移動度グループ（HMG）ボックスDNA結合領域を囲ってある。アミノ酸に対する略語は、A、Ala；C、Cys；D、Asp；E、Glu；F、Phe； G、Gly；H、His；I、Ile；IC、Lys；L、Leu；M、Met；N、Asn；P、Pro；Q、Gln ；P、Arg；S、Ser；T、Thr；V、Val；W、Trp；およびY、Tyrである。ヌクレオチド配列はGenBankに寄託してある(受託番号：)。図2 結腸上皮におけるhTcf-4発現の解析 (図2A)Jurkat T細胞(レーン1)；結腸粘膜(レーン2)；結腸癌腫細胞株DLD-1(レーン3)、HCT116(レーン4)；SW480(レーン5)；SW620(レーン6)；HT29（レーン7）におけるhTcf-4、hTcf-1、hLef-1発現のノーザンブロット解析。レーン2には5μ gの総RNAが含まれており、その他すべてには15μgの総RNAが含まれている。18S および28SリボソームRNAの位置を示してある。EtBrは臭化エチジウム染色である。（図2B）hTcf-4プローブに対する健常なヒト結腸組織のin s ituハイブリダイゼーション。（図2C）陰性対照プローブ（大腸菌ネオマイシン耐性遺伝子の断片）に対するin situハイブリダイゼーション。図3 β-カテニン/hTcf-4のトランス活性化特性全てのレポーターアッセイを二重のトランスフェクションとして行った。各条件ごとに、両方の値を示してある。（図3A）IIA 1.6B細胞におけるレポーター遺伝子アッセイ。細胞に1μgのルシフェラーゼレポータープラスミド、５μgのβ- カテニン発現プラスミド、および3II-hTcf-4発現プラスミドを、エレクトロポレーションによりトランスフェクトした。空のpCDNAを、プラスミドDNAが合計10μ gになるまで加えた。（図3B）SW480結腸癌細胞におけるレポーター遺伝.子アッセイ。細胞に、0.3μgの表示ルシフェラーゼレポーター遺伝子、内部対照として 0.7μgのpCATCONTROL、表示量のpCMVNeoAPC、そしてプラスミドDNAが合計2.5μg になるまで空のPCDNAをトランスフェクトした。対照のCAT値を右パネルに示してある。図4 APC^-/-細胞におけるβ-カテニンhTcf-4複合体の構成的な存在表示の細胞株由来の核抽出物に対し、Zn⁺⁺に20時間曝露する前と後に、ゲル遅延アッセイを行った。レーン1、4、7、10の試料を標準的な条件下でインキュベーションした。レーン2、5、8、11の試料に、0.25μgの抗β-カテニンを加えた。レーン3、6、9、12の試料に、0.25μgの対照（ヒトCD4）抗体を加えた。N.S. すなわち非特異的なバンドも、変異体（非結合）プローブ（レーンMt）とともに観察された。図5 CRTに対するAPC変異の影響。（図5A）野生型（WT）および変異体APCの概略図。APCは、アミノ末端にアルマジロ（ARM）リピート(33)、中央の領域に15および20 AAβ-カテニン結合リピート(18、19)、そしてカルボキシ末端に塩基性領域（32）を含む、2843アミノ酸（AA）タンパク質である(32)。カルボキシ末端には、DLG結合を媒介するTXV配列も含まれている(22)。（図5B）CRTに対するWTおよび変異体APCの影響。内在性変異体APCを含むSW480細胞に、（図5A）に示すAPC 発現ベクターをトランスフェクトし、CRTを測定した。細胞に、徐々に増加する量のWT APC（0、0.15および0.5μg）あるいは0.5μgの変異体APCをトランスフェクトした。CRTレポーター活性は、WT APCを含まないアッセイに対する割合で表してあり、3回の反復実験の平均である。エラーバーは標準誤差を表す。リポフェクタミン（Lipofectamine）を用いてSW480に、内部対照(0.5μgのpCM V-βgal)、レポーター構築物（0.5μgのpTOPFLASHあるいはpFOPFLASH）および表示量の様々なAPC発現ベクターをコトランスフェクトした。pTOPFLASHレポーターはルシフェラーゼレポーター遺伝子の5'に、最適化されたTcf結合部位を含んだのに対し、pFOPFLASHはTcfに結合しないような変異された部位を含んだ。各トランスフェクションにおけるDNAの量は、適切な量の空の発現ベクター（pCEP4）を加えることにより一定に保った。トランスフェクション後16時間にルシフェラーゼおよびβ-ガラクトシダーゼ活性を求めた。ルシフェラーゼ活性を、トランスフェクション効率（対照のβ-ガラクトシダーゼ活性を用いて）および非特異的転写（pFOPFLASH対照を用いて）に関して補正した。図6 WT APCを持つ結腸直腸癌細胞株におけるCRTの評価。（図6A）APCモノクローナル抗体FE9（34）にて発色させた、DLD1、SW480、HCT116、SW48および293細胞における内在性APCのイムノブロット。(図6B)内在性の変異あるいはWT APCを持つ細胞株における、CRTに対する外来性WT APCの影響。細胞に、徐々に増加する量（DLD1およびSW48については0、0.15μg、0.5μg；HCT116については0、0.5 μg、5μg）のWT APCあるいはAPC1309Δ変異体（DLD1およびSW48については0.5 μg；HCT116については５μg）をトランスフェクトし、CRTを図5のように評価した。CRTレポーター活性は、外来性APCなしの抽出物における活性に対する割合で表してあり、3回の反復実験の平均である。エラーバーは標準偏差を表す。図7 WT APCを持つ結腸直腸癌細胞株におけるβ-カテニンの評価。（図7A）β- カテニンモノクローナルC19220（Transduction Laboratories、Lexington、KY） (31)にて発色させた、本研究で用いた細胞株のイムノブロット。(図7B)HCT116およびSW48におけるCTNNB1の配列。完全なCTNNB1を構成する、オーバーラップする部分を、SW480、DLD1、HCT116、およびSW48細胞からRT-PCRにより増幅し、Therm oSequenase（Amersham）を用いて直接、配列決定した。HCT116の場合、欠失領域を含むPCR産物もpCI-neo（Promega、Madison）内にクローン化し、各アリルに相当する複数のクローンを個別に配列決定した。左パネル（HCT116由来のnts121から143）は、WT配列の他に欠失の存在を示している。中央のパネル(HCT116の、WTおよび欠失したアリルのアンチセンス鎖156 から113)は、半分のクローンにおいてコドン45を除くような3bpの欠失(ΔTCT)を示している。右パネル（SW48由来のnts80から113）は、コドン33に影響するCからAへの変化（TCTからTAT）を示している。（図7C）アルマジロリピート（33）および負の調節ドメインを図示する、β-カテニンの概略図。大きい方の活字の残基はGSK3βリン酸化（29）のコンセンサス配列に合っており、太字のものは、 GSK3βリン酸化を介してβ-カテニンの抑制制御に影響することがXenopus胚において明らかにされている(27)。ヒト結腸癌において見出された5つの変異を上段に示してある。図8 β-カテニン変異体の機能の評価。（図8A）HCT116細胞におけるβ-カテニンおよびTcfの構成的な核複合体。核のβ-カテニンTcf複合体の存在を、ゲルシフトアッセイにより評価した。レーン1から3、最適化されたTcf遅延プローブが、抗体無し(レーン1)、抗β-カテニン(0.25μg、レーン2)、あるいは無関係な抗体（0.25μg、レーン3）添加した、HCT116細胞由来の核抽出物とともに移動した。レーン4、変異体Tcf遅延プローブが、HCT116細胞由来の核抽出物とともに移動した。n.s.、変異体プローブで見られた非特異的な移動。（図8B）CRTに対するβ-カテニン変異の影響。293細胞に、WT(WT)または変異体(Δ45、S33Y)β-カテニンをトランスフェクトし、CRTを評価した。CRTレポーター活性は、WT β-カテニンに対する割合で表してあり、3回の反復実験の平均である。エラーバーは標準偏差を表す。β-カテニン発現構築物を以下のように調製した。WT CTNNB1を SW480細胞からRT-PCRにより増幅し、ほ乳類発現ベクターpCI-neo（Promega）内にクローン化してpCI-neo-β-catを作出した。pCI-neo-β-cat内のコドン1から8 9を、それぞれHCT116またはSW48 cDNA由来の同等の領域をコードするPCR産物で置き換えることにより、pCI-neo-β-catΔ45およびS33Yを得た。すべての構築物の構造を配列解析によって確認した。リポフェクタミンを用いて、293 細胞に内部対照(0.1μgのCMV-βgal)、レポーター(0.5μgのpTOPFLASHまたはpFO PFLASH)、Tcf-4発現ベクター(0.5μgのpCDNA-TCF4)、およびβ-カテニン（0.5μ g）またはドミナントネガティブhTcf-4（1.0μg）発現ベクターをコトランスフェクトした。CRTを上に記載のように決定した。詳細な説明結腸直腸上皮細胞においてhTcf-4がβ-カテニンに結合し、転写を活性化するということは、本発明の発見である。さらに、現在、少なくとも部分的にはβ- カテニンに結合することにより、APCがこの転写活性化を調節するということがわかっている。結腸直腸癌細胞においては、APCの変異あるいはβ-カテニンの変異のいずれかによって、この制御はしばしば排除されている。ヒトTcf-4の2つの選択的スプライス型が見出された。一方の型(hTcf-4E)は、h Tcf-1Eと相同であり、もう一方(hTcf-4B)はhTcf-1Bに相同である。ヌクレオチドの配列およびアミノ酸配列をSEQ ID NO：1-4に示す。コード配列およびタンパク質は、以下に記載するようにアッセイに用いることができる。もともとはmRNA分子の逆転写によって作られた、イントロンフリーのDNA分子を提供する。それらは細胞内で増やし得るか、あるいは望むように増幅し得る。例えば、ヌクレオチド配列を非ヒト細胞内に発現させる場合は、単離されたTcf-4タンパク質は他のヒトタンパク質を事実上含まないように提供し得る。そのような発現を達成するための方法およびベクターは、この技術分野では十分に知られている。そのような発現手段の選択は、目的とする用法および都合にしたがって当業者によってなされる。細胞を試験して、野生型APCあるいは、本明細書中ではCRT経路(β-カテニン/T cfにより制御される転写、β-catenin/Tcf-regulated transcription)と呼ぶAPC 転写調節経路の野生型の下流タンパク質を持っているかどうか決定し得る。ヒトの癌における変異の標的として同定された、CRT経路内の1つのタンパク質は、β -カテニン（CTNNB1遺伝子によってコードされる）である。この経路の他の部分も標的となり得る。CRT経路の標的遺伝子は同定されていないが、本明細書中に開示の系を用いて容易に同定し得る。例えば、野生型および変異体CTNNB1 の存在下で異なって転写されるような遺伝子を同定し得る。 Tcf応答性レポーター遺伝子は、Tcf応答性エレメントにcisで結合している、容易に検出できるあるいはアッセイできる遺伝子(ルシフェラーゼ、β-ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼなど)を含む構築物である。そのような応答性エレメントはこの技術分野で知られており(7)、それらのどのエレメントも用い得る。最適なTcfモチーフには、配列CCTTTGATCが含まれている。1から20コピー、好ましくは3から6コピーのモチーフを用い得る。配列がCCTTTGGCCに変異すると、応答性を失う。そのような構築物の別の必要な部分は、c-Fosあるいはヘルペスウイルスチミジンキナーゼプロモーターなどの最小プロモーターである。レポーター遺伝子の転写は、この技術分野で知られているあらゆる手段によって、免疫学的な検出方法も用い得るが一般的にはコードされている遺伝子の活性をアッセイすることにより行うことができる。加えて、典型的にはオリゴヌクレオチドプローブを用いて、転写されたmRNAを直接測定することにより、転写をモニターすることができる。以下に示すように、野生型APCタンパク質を持つ細胞はCRTを阻害するだろう。しかし、APC内のほとんどの変異は、APCをCRTを阻害できないようにする。同様に、CTNNB1における特定の変異は、β-カテニンを超活性にする、および／またはAPCによる阻害に対して不応性にする。それゆえ、Tcf応答性レポーター遺伝子の転写を測定することは、APCおよびCTNNB1の状態の指標である。これら遺伝子の両方の変異は癌と関連し、そしてしたがって、診断的または予防的情報を提供する。 CRTに関するアッセイはin vitroまたは細胞内でなし得る。アッセイを細胞内で行う場合は、Tcf応答性レポーター遺伝子を細胞内に導入しなければならない。感染、トランスフェクション、エレクトロポレーションを含むがそれらに限定されない、細胞内に遺伝物質を導入するためのあらゆる方法を用い得る。アッセイをin vitroで行う場合は、転写の構成要素が存在しなければならない。これらには、リボヌクレオチドはもちろん適切なバッファー、RNAポリメラーゼも含まれる。タンパク質産物がアッセイ可能な場合は、リボソームおよびアミノ酸といった翻訳の構成要素も存在しなければならない。これらのアッセイは、抗癌治療剤として可能性のある化合物をスクリーニングするのにも用い得る。このアッセイのin vitroあるいは細胞での方法のいずれかを用いて、野生型APCの効果を模倣できるかどうかを決定するのに、あるいは変異体APCをCRTを阻害できる形に、または変異体β-カテニンをAPCによって調節可能な形に変換するのに、試験化合物を導入し得る。加えて、β-カテニンとTcf-4 の結合を阻害し、それゆえAPCの作用を模倣する能力に関して化合物を試験することができる。そのような試験は、例えばツーハイブリッドアッセイを用いて、 in vitroあるいはin vivoで行い得る。癌の診断のための手段は、CTNNB1変異が腫瘍細胞、とりわけ野生型APCを持つものに見出されるという観察の結果である。そのような変異は、とりわけ試料中に見出される遺伝子あるいはタンパク質のいずれかを配列決定することにより見つけ得る。β-カテニンがAPCまたはTcf-4に結合するかどうか、あるいはCRTを媒介することが出来るかどうかなど、機能的なアッセイも用い得る。配列を、ヒト、とりわけ試験すべき試料を提供したのと同一のヒトの正常組織に見出されるものと比較することができる。試験に適した腫瘍には、FAPと関連するものが含まれるが、それらに限定はされない。適した腫瘍には、結腸直腸癌、甲状腺癌、脳癌、髄芽腫、デスモイド腫瘍、骨腫、乳癌、頭部および頚部癌が含まれる。APC 変異は非常に頻繁にあり、さらにAPC変異はCTNNB1変異と同一の腫瘍には起こらないとみられるため、CTNNB1決定を行う前に、APC変異について試料をあらかじめスクリーニングすることができる。 APC遺伝子のうちβ-カテニン結合部位をコードする部分を、遺伝子治療の形式に用い得る。遺伝子を腫瘍に投与することに関して、適切な手法がこの技術分野で知られており、そのような手法のいずれも用い得る。適切な発現ベクターもこの技術分野で知られており、適したものを選択することは当業者の技術の範囲内にある。腫瘍細胞内にAPCのβ-カテニン結合部位を発現させると、β-カテニンが結合し、Tcf-4に結合して絶えず滴定され、それゆえCRT標的遺伝子の非制御発現を妨げるだろう。同様に、β-カテニン結合部位を含むAPCのポリペプチド部分を細胞に投与して、β-カテニンの滴定を行うことができる。そのような細胞への投与の手法は、この技術分野で十分に知られている。ポリヌクレオチドあるいはポリペプチドのいずれかにより処理される細胞を使用して、APCとβ-カテニン間の相互作用を研究し、そしてそのような結合を妨げる薬物を開発することができる。上記の開示は、本発明を概略的に説明している。より完全な理解は、本明細書中で例証のみの目的で提供されており、本発明の範囲を限定することは意図していない、以下の特定の実施例を参照することにより得ることができる。実施例１この実施例は、結腸直腸上皮細胞中においてファミリーの構成分子として発現されているものとしてTcf-4を同定し、そしてクローン化されたcDNAの完全配列を提供する。ほ乳類においては、Tcf/Lefファミリーの既知の構成分予が4種存在する：すなわちリンパ球特異的因子Tcf-1およびLef-1(7、8)、およびそれよりもあまり特性決定されていないTcf-3および4(9)である。我々は、43種の結腸腫瘍細胞株に対して、4種のTcf/Lef遺伝子の発現について、定性的逆転写酵素-ポリメラーゼ連鎖反応アッセイを行った。ほとんどの結腸細胞株が1つより多い遺伝子を発現したが、hTcf-4のmRNAのみが本質的にすべての株において発現された。我々は次いで、ヒト胎児cDNAライブラリーをスクリーニングし、そして完全長 hTcf-4をコードするクローンを回収した(図1)。hTcf-4のHMGボックス領域(7)をコードするゲノム断片を使用して、ラムダGT-11中のヒト12週胎児cDNAをプローブした。陽性のクローンをpBluescriptSK中にサブクローニングし、そして配列決定した(SEQ ID No:1および3を参照)。hTcf-4の予測された配列は、hTcf-1の配列とほとんど同一であった。選択的スプライシングの結果2種のCOOH末端を得、それらはhTcf-1およびhTcf-4の間で保存されていた。hTcf-1、mLef-1およびXeno pusのTCF-3ではβ-カテニンに対する結合を媒介する(6)NH₂末端もまた、hTcf-4 において保存されていた。選択された結腸癌腫細胞のノザンブロット解析により、hTcf-4の高レベルの発現が示された(図2)。ノザンブロットハイブリダイゼーション（7）を、完全長hTcf-1、hLef-1およびhTcf-4のcDNAを用いて行った。結胴上皮細胞は、健康な外科的結腸試料から切除した粘膜調製物から新しく調製した。試料を細かく刻み、そして1mMのジチオスレイトール（DTT）とともにHanks'培地中でインキュベーションし、粘液を除去した。室温にてHanks'培地中0.75mMのEDTA中、室温でインキュベーションすることにより、単一細胞懸濁液を調製した。上皮細胞は、Percoll密度勾配遠心法によりリンパ球から分離した。 in situハイブリダイゼーション（図2BおよびC）およびノザンブロット（図2A ）により明らかになったように、hTcf-4のmRNAは正常の結腸上皮では容易に検出可能であるのに対して、hTcf-1およびhLef-1は検出できなかった。健康な結腸バイオプシー試料の6μの凍結切片についてin situハイブリダイゼーションを記載されたように行った(10)。アミノ酸200から310をコードするhTcf-4のcDNAを増幅し、そしてPCRによりDig-11-dUTP(Boehringer Mannheim，Germany)で標識した。ハイブリダイゼーションおよび洗浄の後、続いてマウス抗-Dig抗体（Boehringer ）およびホースラディッシュペルオキシダーゼ結合ウサギ抗マウスイムノグロブリン抗体（Dako，Glostrup，Denmark）とともに切片をインキュベーションした。シグナルは、赤茶色の沈殿を生じるジアミノベンジジンを用いて視覚化した。青の対比染色は、ヘマトキシリンを用いて行った。実施例２この実施例は、Tcf-4およびβ-カテニンの相互作用、およびそれらの転写活性化因子としての機能を示す。 hTcf-4が機能的にβ-カテニンと相互作用するかどうかを研究するため、我々は、β-カテニン-Tcfレポーター遺伝子アッセイにおいて2セットのレポーター構築物を使用した(7)。一つは、最小c-Fosプロモーター駆動ルシフェラーゼ発現部位の上流に、3コピーの最適TcfモチーフであるCCTTTGATC、または3コピーの変異モチーフであるCCTTTGGCCを含む(PTOPFLASHおよびPFOPFLASH)。第二のセットは、最小ヘルペスウィルスチミジンキナーゼプロモーター駆動クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（CAT）発現部位の上流に、3コピーの最適モチーフ、または3コピーの変異モチーフを含む(それぞれPTOPCATおよび PFOPCAT)。レポーター遺伝子アッセイは、（7）に記載されるように行った。簡単に言うと、2×10⁶個の細胞に対してエレクトロポレーションによりプラスミドをトランスフェクトした。24時間後に細胞を回収し、そして1mM DTT、1％Triton X-100、15％グリセロール、25mM Tris pH7.8そして8mM MgCl₂中で溶解した。My cでタグ付けされた型のβ-カテニンおよびhTcf-4をコードするcDNAを、ほ乳類発現ベクターであるpCDNA（Invitrogen）中に挿入した。SV40プロモーターの調節下でCAT酵素をコードするPCATCONTROLは、Promega社から購入した。エピトープをタグ付けしたhTcf-4およびNH₂末端の30アミノ酸を欠損する欠失変異体（ΔNhTcf-4）を、発現ベクターpCDNA中でクローニングした。一過性トランスフェクションをネズミのB細胞株（IIA1.6）中で行ったところ、Tcf遺伝子は何も発現していない(6)。 TOPFLASHレポーターは、β-カテニンおよびhTcf-4プラスミドと組合せてコトランスフェクションすると強力に転写されたが、しかしプラスミド単独、または β-カテニンおよびΔNhTcf-4プラスミドと組合せても強力には転写されなかった。陰性対照であるPFOPFLASHでトランスフェクトした細胞中では、転写の向上は全く検出されなかった(図3A)。これらの結果から、hTcf-4のNH₂-末端とβ-カテニンとの相互作用は、結果として転写の活性化を引き起こすことが示される。実施例３この実施例は、野生型APCによるCRT転写活性の機能的制御を示す。 3種類のAPC^-/-癌腫細胞株であるSW480、SW620およびDLD-1（Fig.3B）において、PTOPFLASHレポーターは、PFOPFLASHよりも5〜20倍活発に転写された。重要なことは、レポーター遺伝子およびAPC発現ベクターによりSW480細胞をトランスフェクションすることにより、濃度依存的に転写活性が排除される(Fig.3B)。対照的に、APCは、コトランスフェクションした内部対照（pCATCONTROL）上で何の作用も有さないか、またはPFOPFLASHの基底レベルの転写に効果を有している(図3B )。PTOPFLASHおよびPFOPFLASHのかわりにPTOPCATおよびPFOPCATについて、同等の観察を行った。APC^-/-結腸癌腫細胞におけるTcfレポーター遺伝子の構成的転写活性は、IIA1.6B細胞(図3A)、C57MG乳癌腫細胞株;JurkatおよびBW5147 T細胞株；DaudiおよびNs1 B細胞株；K562赤血球脊髄性細胞株；HeLa子宮頸管癌腫細胞株；HepG2ヘパトーマ細胞株；3T3、3T6、およびRat-1繊維芽細胞；そして腎臓由来SV40-トランスフォームCOS細胞株(7、16)を含む非結腸細胞株中でのこれら遺伝子の不活性と明確な対照をなした。実施例４この実施例は、機能的β-カテニン-hTcf-4複合体がAPC^-/-細胞中で構成的に存在することを示す。我々は、APCがメタロチオネインプロモーターにより調節されている、HT29-AP C^-/-結腸癌腫細胞（12）を使用した。Zn⁺⁺による誘導は、野生型レベルのAPCを回復させ、そしてアポトーシスを誘導する(12)。Zn⁺⁺-誘導LacZ遺伝子を保持するHT29-Gal細胞を対照として使用した。HT29中で発現される唯一のTcfファミリーの構成分子は、hTcf-4である(図2C)。誘導されていないHT29由来トランスフェクタント由来の核抽出物において、我々はゲル遅延によりhTcf-4を容易に検出した(図4)。若干より遅く移動する別のバンドも観察された。β-カテニン抗体を添加することにより、後者のバンドが特異的に遅延するという結果が得られたことから、これがβ-カテニン-hTcf-4複合体を示すことが示された(図4)(12)。20時間にわたるZn⁺⁺誘導の後、HT29-APC1中におけるβ-カテニンhTcf-4複合体は、複合体化されていないhTcf-4と比較して1/6に減少したが、その一方でHT29-Ga1細胞中では顕著な変化は何も観察されなかった(図4)。重要なことは、細胞β-カテニンの全体的レベルは、HT29-APC1細胞中では誘導期間中ずっと変化していない( 12)。ゲル遅延アッセイは、ほかの文献（7）中で記載されたように行った。抽出物は、4回洗浄して細胞質β-カテニンが混在しないようにした無傷の核から調製した。最適Tcf/Lefプローブとして、我々は二本鎖15量体CCCTTTGATCTTACCを使用し；対照プローブはCCCTTTGGCCTTACCとした(すべてのオリゴヌクレオチドはIsogen e，Hollandより入手した)。β-カテニン抗体はTransduction Laboratory(Lexlng ton，KY)より購入した。典型的な結合反応においては、25μlの結合バッファー( 60mMKCl、1mM EDTA、1mM DTT、10％グリセロール）中に、3μgの核タンパク質、 0.1 ngの放射標識プローブ、100ngのdIdCを含んだ。試料を室温で20分間インキュベーションし、抗体を添加し、そして試料をさらに20分間インキュベーションした。これらのデータをもとにして、我々は以下のモデルを提案する。正常な結腸上皮において、hTcf-4はTcfファミリーのうちで唯一発現されている構成分子である。β-カテニンとhTcf-4との相互作用は、APCにより制御されている。適切な細胞外シグナルが上皮細胞に送達されると、GSK3β-APCとは複合体化せず、そしてその核輸送を可能にしそしてhTcf-4と結合する形態で、β-カテニンは蓄積する。hTcf-4のHMGドメインは、特異的標的遺伝子の制御配列に配列特異的様式で結合し；β-カテニンはトランス活性化ドメインを供給する。このように標的遺伝予の転写活性化は、hTcf-4がβ-カテニンと結合するときにのみ生じる。hTcf-4 標的遺伝子は、相変わらず同定されている。しかしながら、APCおよびカテニンとの結合は、これらの遺伝子が上皮細胞の生成およびターンオーバーに関与しうることを示唆する。野生型APCの欠損の場合には、細胞外刺激の非存在下で単量体β-カテニンが蓄積し、hTcf-4標的遺伝子の非調節転写を引き起こす。いくつかの結腸癌腫細胞株中におけるTcfファミリーのその他の構成分子の一見すると新しい発現により、同一の機構によるTcf標的遺伝子発現の非制御をさらに引き起こしているようでもある。β-カテニン-Tcfシグナリングの調節は、APCの監視機能（19）の重要な部分であるようであり、そしてその崩壊は悪性転帰の初期工程であるようである。実施例５この実施例は、変異APCタンパク質がCRTを制御し、そしてAPCにおける完全なセットの20-AAリピートがCRTの阻害を媒介するために必要とされることを示す。我々は、トランスフェクションアッセイにおいてβ-カテニン/Tcf-制御された転写（CRT）を阻害する能力について、4種のAPC変異体を試験した(図5)。第一の変異体であるAPC331Δは、家族性腺腫性ポリポーシス（FAP）の患者の生殖系列中および散発性腫瘍中に見られる変異の型を示す(15)。APC331Δタンパク質は、コドン331で短縮され、アミノ末端側のコドン1020および1169の間の3つの15-アミノ酸（AA）β-カテニン結合リピートを短縮している。第二の変異体であるAPC 1309Δは、もっとも一般的な生殖系列APC変異であり(15)、5bpの欠失によりコドン1309にフレームシフトを起こし、そしてタンパク質が短縮されている。APC130 9Δタンパク質は、15-AAβ-カテニンリピートは保持するが、コドン1323および2 075の間にありβ-カテニンの結合とリン酸化に関与する7つの20-AAリピートを欠損する(18)。第三の変異体であるAPC1941Δは、結腸直腸腫瘍において観察されるもっとも末端の体細胞変異の一つを示す(25)。APC1941Δタンパク質はコドン1 941で短縮され、そしてしたがって15-AAリピートおよび終わり二つの20-AAリピートを除くすべての20-AAリピートを含む。最後に、APC2644Δは、コドン2644において4bpの欠失に由来する生殖系列変異を示す。異常なカルボキシ末端変異のこの型を伴う患者は、ほとんどポリープを発生しないが(減弱ポリポーシス)、結腸外疾患、特にデスモイド腫瘍を引き起こす(26)。それぞれのAPC変異体を、CRTレポーターとともにSW480結腸直腸癌細胞株中にコトランスフェクションした。SW480細胞は短縮されたAPCを有し、外来性WTCRT により抑制することができる構成的に活性なCRTを有する。すべて4種類の変異体がトランスフェクション後に匹敵するレベルのAPCタンパク質を産生するが、それらはそのCRT阻害活性において異なる。典型的なポリポーシスまたは癌を伴う患者において見いだされる3種の変異体は、CRTの阻害を顕著に欠損していた(図5 B)。APC1309ΔおよびAPC1941Δの活性の減少から、β-カテニン結合がCRTのAPC 媒介阻害に十分でなく、そして完全なセットの20-AAリピートが必要であることが示唆される。興味深いことに、減弱ポリポーシスに関連するAPC2644Δ変異体の阻害活性は、WT APCの阻害活性と匹敵することから(図5B)、APCのカルボキシ末端に存在するDLG結合ドメインはCRTの抑制制御には必要とされないことが示唆される。 WTおよび変異APC構築物（2μg）を、293、SW480およびHCT116細胞中にリポフェクタミン（GIBCO/BRL，Gaithersburg）を使用してトランスフェクトした。タンパク質を24時間後に回収し、そしてAPCモノクローナル抗体FE9を使用するイムノブロット解析に供した(23)。HCT116および293細胞においては、外来性WT APC が内在性変異APCとともに移動した。SW480細胞においては、APC1309Δが内在性A PCとともに移動した。その他のすべてのケースでは、トランスフェクションしていないAPC構築物（APC331Δ、APC1309ΔおよびAPC1941Δ）がAPCのCRT機能型（A PC WTおよびAPC2644Δ）と同等かまたはそれ以上のタンパク質を産生した。実施例６この実施例は、APC制御経路の他の構成要素がいくつかの癌細胞において影響を受けることを示す。我々は、完全長のAPCを発現する2種の結腸直腸腫瘍細胞株（HCT116およびSW48 ）においてCRTを評価した(図6A)。HCT116およびSW48は両方とも、構成的に活性なCRTを示し、そして短縮型のAPCを有する細胞株（DLD1およびSW480）と比較して、この活性が外来性WT APCにより阻害されなかった(図5Bおよび6B)。WT APCを発現するその他の（非結腸直腸癌）細胞株は、構成的CRT活性を示さない。これらのトランスフェクションの結果から、HCT116およびSW48における構成的CRTがA PC腫瘍抑制経路の改変された下流構成要素によっていることが示唆された。実施例７この実施例は、CRTに影響を及ぼす、β-カテニンをコードする遺伝子中の欠損を、いくつかの癌細胞中において示す。我々は、同じ4種類の株中で、APC腫瘍抑制経路であるβ-カテニンの下流構成要素として候補になりそうな状態を評価した。すべて4種類の株は、イムノブロットにより評価した場合、一見して無傷のβ-カテニンを、同様な量発現した(図 7A)。しかしながら、配列解析からは、HCT116およびSW48の両方がβ-カテニン遺伝子中に変異を有していることが示された（CTNNB1）(図7B)。HCT116は、3bpの欠失を有し、その結果一つのAA（Ser-45）が除去され、そしてSW48はCからAへのミスセンス変異を有し、その結果Ser-33がTyrに変化した。HCT116の患者から採取されたパラフィン包埋された保存組織を解析することにより、この変異の体細胞の性質および培養前に原発性腫瘍中のその存在を確認した。興味深いことに、両方の変異はセリンに影響を与え、その結果Xenopus胚においてZW3/GSK3 βキナーゼによるリン酸化を介して、β-カテニンの抑制制御に関与した（図7C ）(27、28)。 HCT116細胞株の由来である患者から採取したパラフィン包埋した正常組織および腫瘍組織から、ゲノムDNAを単離した。次いで、変異を含む95bpのPCR産物をPC Rで増幅し、そしてTHERMOSEQUENASE（Amersham）を使用して直接配列決定した。 3bpの欠失は腫瘍組織中では観察されたが、正常組織中では観察されなかった。この変異機構の普遍性を試験するため、我々は、APCの完全コード領域を配列決定することにより変異がないことを示した5種の原発結腸直腸癌を評価した(25 )。これら5種の腫瘍のうち3種で、潜在的なZW3/GSK3βリン酸化部位を変化させるCTNNB1変異を含むことがわかった（S45F、S45F、およびT44A）(図7C)。それぞれの変異は、2個のCTNNB1アリルのうちの一方だけに影響を与え、そして体細胞的であるようであった。凍結切片にした結腸直腸癌からゲノムDNAを単離し、次いでPCRによりCTNNB1のエクソン3を含む1001bpのPCR産物を増幅し、ThermoSequenase（Amersham）を使用して直接配列決定した。コドン41におけるACCのGCCへの変化（T41A）およびコドン45におけるTCTのTTTへの変化（S45F）をそれぞれ、1および2種の腫瘍中で観察した。実施例８この実施例は、WT APCの作用に対してCRT非感受性を付与するCTNNB1のドミナント変異を示す。 β-カテニン変異はヘテロ接合体であったので、我々は、変異がドミナント作用を発揮し、APC媒介抑制制御に対して非感受性の細胞β-カテニンの一部を付与しうると仮定した。この見解を試験するため、我々はトランスフェクトしていないHCT116細胞から採取した核抽出物を用いてゲルシフト解析を行った。無傷のAP Cを有する非結腸直腸癌細胞株と比較すると、HCT116細胞は最適化Tcf-結合オリゴヌクレオチドをゲルシフトするβ-カテニン/Tcf複合体を含み、そしてこの複合体は抗β-カテニンとともにスーパーシフトした(図8A)。我々はまた、β-カテニン発現ベクターを構築し、そしてHCT116から採取した変異β-カテニン(β-CatΔ 45)およびSW48から採取した変異β-カテニン（β-CatS33Y）の生物学的活性を、 WTのものと比較した。これらの実験のために、非常にトランスフェクトしやすく、内在性CRTが低いことが示され、そして高レベルの内在性APCを含むという理由から、293腎臓上皮細胞株を使用した(図6A)。内在性APCの存在下においては、両方の変異β-カテニンがWTタンパク質と比較して少なくとも６倍高い活性を示し、そしてこの活性はドミナントネガティブなhTcf-4により阻害された(図8B)。同時に、これらの結果から、APC媒介性CRT制御を破壊することは結腸直腸腫瘍形成に対して決定的であることが示される。両方のAPCアリルの劣性不活性化変異により、このことはほとんど一般的に達成されるが、しかしここで示したように、WT APCの作用に対してCRT非感受性を付与するCTNNB1のドミナント変異により、このことを達成することもできる。我々の結果から、CRTのAPC阻害では、複数の部位でβ-カテニンをリン酸化する必要があることが示唆された。これらの潜在的なリン酸化部位は、XenopusおよびDrosophila細胞中でβ-カテニンを負に制御し(27)、ほ乳類細胞中ではAPCおよびβ-カテニンと相互作用をする（23）セリンキナーゼである、ZW3/GSK3βの既知の特異性（29）と矛盾しない。これらの結果からその他の腫瘍型において観察される偶然のCTNNB1変異についての機能的基礎を示唆し(30)、そして経路の別の構成要素における変異を発見することにより、どのようにヒト疾患において重要な経路を解明することができるのかを示す。APC機能の理解における次の工程は、hTcf-4/β-カテニン複合体により活性化されそしてWT APCにより阻害される遺伝子を同定することであろう。これらの遺伝子は、結腸直腸癌細胞においてアポトーシスを誘導するAPCの能力に関連しているようである(31)。

【手続補正書】【提出日】平成１１年１２月８日（１９９９．１２．８）【補正内容】１．請求の範囲を次の通り補正する。『１． SEQ ID No:5または6に示されるTcf-4タンパク質をコードする、イントロンフリーのDNA分子。２． SEQ ID No:1または2のヌクレオチド配列を有する、請求項１に記載のDN A分子。３． SEQ ID No:5または6に示される配列を有する、実質的に他のヒトタンパク質を含まない、単離されたTcf-4タンパク質。４．細胞内において野生型APCまたはAPC転写制御経路中の下流タンパク質が存在するかまたは存在しないかを決定する方法であって、以下の工程： Tcｆ応答性レポーター遺伝子を細胞中に導入すること；そして前記レポーター遺伝子の転写を測定すること；その中で、前記レポーター遺伝子の活発な転写を支持する細胞が野生型APCまたはAPC転写制御経路中の下流タンパク質を有さないことを含む前記方法。５．細胞内において野生型APCが存在するかまたは存在しないかを決定する方法であって、以下の工程： Tcf応答性レポーター遺伝子を細胞の可溶化物と接触させること；そして前記レポーター遺伝子の転写を測定すること；その中で、前記転写を阻害する可溶化物は野生型APCを含むことを含む前記方法。６． FAP患者、APCまたはβ-カテニン変異を有する患者、または癌を発生するリスクが高まった患者において使用するための候補薬物を同定する方法であって、以下の工程：野生型APCを有さないかまたは変異β-カテニンを有する細胞を試験化合物と接触させること； Tcf応答性レポーター遺伝子の転写を測定すること；その中でレポーター遺伝子の転写を阻害する試験化合物が癌療法に対する候補薬物であることを含む前記方法。７．細胞が、β-カテニン結合または制御を欠損するAPCタンパク質を生成する、請求項６に記載の方法。８．細胞が、超活性またはAPC結合を欠損するかまたはAPC制御に耐性である β-カテニンタンパク質を生成する、請求項６に記載の方法。９．細胞が検出可能なAPCタンパク質を何も生成しない、請求項６に記載の方法。１０． FAP患者、APCまたはβ-カテニン変異を有する患者、または癌を発生するリスクが高まった患者において使用するための候補薬物を同定する方法であって、以下の工程：レポーター遺伝子が試験化合物の非存在下において転写される条件下で、Tc f応答性レポーター遺伝子を試験化合物と接触させること； Tcf応答性レポーター遺伝子の転写を測定すること；その中で前記転写を阻害する試験化合物が癌療法に対する候補薬物であることを含む前記方法。１１．野生型APCを有さない細胞の可溶化物の存在下で接触する工程を行う、請求項１０に記載の方法。１２． APC結合を欠損するかまたはAPC制御に抵抗性である変異β-カテニンを有する細胞、または超活性である細胞の可溶化物の存在下で接触する工程を行う、請求項１０に記載の方法。１３．細胞が、β-カテニン結合または制御を欠損するAPCタンパク質を生成する、請求項１１に記載の方法。１４．腫瘍性が疑われる試料中で癌を診断する方法であって、以下の工程：試料中で見いだされるCTNNB配列を、正常組織中で見いだされる第二のCTNNB 配列と比較することであって、その中で、第一の配列と第二の配列との間の相違が癌の指標であることを含む前記方法。１５．配列がヌクレオチド配列である、請求項１４に記載の方法。１６．配列がアミノ酸配列である、請求項１４に記載の方法。１７．正常組織が試料として同一のヒトから単離されたものである、請求項１４に記載の方法。１８．癌が、結腸直腸癌、甲状腺癌、脳癌、髄芽腫、デスモイド腫瘍、骨腫、乳癌、および頭部および頸部癌からなる群から選択される、請求項１４に記載の方法。１９．以下の工程：試料中で見いだされる第一のAPC配列を正常組織中で見いだされる第二のAPC 配列と比較することにより比較工程を行う、請求項１４に記載の方法。２０．第一および第二のAPC配列間に相違が検出されない、請求項１９に記載の方法。２１．試料中にAPC変異が検出されない、請求項１４に記載の方法。２２．結腸直腸癌またはFAPに関連するその他の癌を有する患者を治療する方法であって、以下の工程：患者に対して、APCコード配列の一部分を含むヌクレオチド配列であって、前記一部分がβ-カテニン結合部位からなる配列を投与することを含む前記方法。２３．結腸直腸癌またはFAPに関連するその他の癌を有する患者を治療する方法であって、以下の工程：患者に対して、APCコード配列の一部分を含むポリペプチドであって、前記一部分がβ-カテニン結合部位からなるポリペプチドを投与することを含む前記方法。２４． FAP患者または癌を発生するリスクが高まった患者において使用するための候補薬物を同定する方法であって、以下の工程： β-カテニンおよびTcf-4が互いに結合する条件下で、試験化合物をβ-カテニンおよびTcf-4と接触させること；試験化合物がβ-カテニンおよびTcf-4との結合を阻害するかどうかを決定し、結合を阻害する試験化合物が癌療法または予防のための候補化合物であることを含む前記方法。』２．明細書の記載を次の通り補正する。（１）明細書第2頁第14〜16行の「本発明の一態様においては、SEQ ID NO:2または4に示すTcf-4タンパク質をコードする、イントロンフリーのDNA分子を提供する。」の記載を、『本発明の一態様においては、SEQ ID NO:5または6に示すTc f-4タンパク質をコードする、イントロンフリーのDNA分子を提供する。』と補正する。（２）明細書第2頁第17〜19行の「このタンパク質は、他のヒトタンパク質を事実上含まず、SEQ ID NO:2または4に示す配列を有する。」の記載を、『このタンパク質は、他のヒトタンパク質を事実上含まず、SEQ ID NO:5または6に示す配列を有する。』と補正する。（３）明細書第8頁第13〜14行の「ヌクレオチドの配列およびアミノ酸配列をS EQ ID NO：1-4に示す。」の記載を、『ヌクレオチドの配列およびアミノ酸配列をSEQ ID NO：1、2、5および6に示す。』と補正する。（４）明細書第11頁第22〜23行の「陽性のクローンをpBluescriptSK中にサブクローニングし、そして配列決定した(SEQ ID No:1および3を参照)。」の記載を、『陽性のクローンをpBluescriptSK中にサブクローニングし、そして配列決定した(SEQ ID No:1および2を参照)。』と補正する。（５）第23頁〜第35頁に記載の配列表を次の配列表と差し替える。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ０７Ｋ 14/47 Ｇ０１Ｎ 33/15 ＺＣ１２Ｑ 1/68 33/50 ＺＧ０１Ｎ 33/15 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 33/50 Ａ６１Ｋ 37/02 (72)発明者クレヴェルス，ハンスオランダ国エヌエル―3712 エイピー, ルイスダーラーン７ (72)発明者キンツラー，ケネス・ダブリューアメリカ合衆国メリーランド州21015，ベルエアー，ハルカーク・ウェイ 1403 (72)発明者コリネック，ウラジミールチェコ国共和国 14000 プラハ４，カプリツカ 49／856 (72)発明者モリン，パトリス・ジェイアメリカ合衆国メリーランド州21030，コロンビア，ジー・マルコム・サークル 10335 (72)発明者スパークス，アンドリュー・ビーアメリカ合衆国メリーランド州21208，ボルティモア，ブレトン・ヒル・ロード―３エイ 10 (72)発明者ヴォーゲルスティン，バートアメリカ合衆国メリーランド州21208，ボルティモア，ブレトン・ウェイ 3700 【要約の続き】の調節をAPCあるいはβ-カテニンのいずれかの変異によって回避し得ることを示している。

Claims

【特許請求の範囲】１． SEQ ID No:2または4に示されるTcf-4タンパタ質をコードする、イントロンフリーのDNA分子。２． SEQ ID No:1または3のヌクレオチド配列を有する、請求項１に記載のDN A分子。３． SEQ ID No:2または4に示される配列を有する、実質的に他のヒトタンパク質を含まない、単離されたTcf-4タンパク質。４．細胞内において野生型APCまたはAPC転写制御経路中の下流タンパク質が存在するかまたは存在しないかを決定する方法であって、以下の工程： Tcf応答性レポーター遺伝子を細胞中に導入すること；そして前記レポーター遺伝子の転写を測定すること；その中で、前記レポーター遺伝子の活発な転写を支持する細胞が野生型APCまたはAPC転写制御経路中の下流タンパク質を有さないことを含む前記方法。５．細胞内において野生型APCが存在するかまたは存在しないかを決定する方法であって、以下の工程： Tcf応答性レポーター遺伝子を細胞の可溶化物と接触させること；そして前記レポーター遺伝子の転写を測定すること；その中で、前記転写を阻害する可溶化物は野生型APCを含むことを含む前記方法。６． FAP患者、APCまたはβ-カテニン変異を有する患者、または癌を発生するリスクが高まった患者において使用するための候補薬物を同定する方法であって、以下の工程：野生型APCを有さないかまたは変異β-カテニンを有する細胞を試験化合物と接触させること； Tcf応答性レポーター遺伝子の転写を測定すること；その中でレポーター遺伝子の転写を阻害する試験化合物が癌療法に対する候補薬物であることを含む前記方法。７．細胞が、β-カテニン結合または制御を欠損するAPCタンパク質を生成する、請求項６に記載の方法。８．細胞が、超活性またはAPC結合を欠損するかまたはAPC制御に耐性である β-カテニンタンパク質を生成する、請求項６に記載の方法。９．細胞が検出可能なAPCタンパタ質を何も生成しない、請求項６に記載の方法。１０． FAP患者、APCまたはβ-カテニン変異を有する患者、または癌を発生するリスクが高まった患者において使用するための候補薬物を同定する方法であって、以下の工程：レポーター遺伝子が試験化合物の非存在下において転写される条件下で、Tc f応答性レポーター遺伝子を試験化合物と接触させること； Tcf応答性レポーター遺伝子の転写を測定すること；その中で前記転写を阻害する試験化合物が癌療法に対する候補薬物であることを含む前記方法。１１．野生型APCを有さない細胞の可溶化物の存在下で接触する工程を行う、請求項１０に記載の方法。１２． APC結合を欠損するかまたはAPC制御に抵抗性である変異β-カテニンを有するか、または超活性である細胞の可溶化物の存在下で接触する工程を行う、請求項１０に記載の方法。１３．細胞が、β-カテニン結合または制御を欠損するAPCタンパク質を生成する、請求項１１に記載の方法。１４．腫瘍性が疑われる組織中で癌を診断する方法であって、以下の工程：試料中で見いだされるCTNNB配列を正常組織中で見いだされる第二のCTNNB配列と比較することであって、その中で、第一の配列と第二の配列との間の相違が癌の指標であることを含む前記方法。１５．配列がヌクレオチド配列である、請求項１４に記載の方法。１６．配列がアミノ酸配列である、請求項１４に記載の方法。１７．正常組織が試料として同一のヒトから単離されたものである、請求項１４に記載の方法。１８．癌が、結胴直腸癌、甲状腺癌、脳癌、髄芽腫、デスモイド腫瘍、骨腫、乳癌、および頭部および頸部癌からなる群から選択される、請求項１４に記載の方法。１９．以下の工程：試料中で見いだされる第一のAPC配列を正常組織中で見いだされる第二のAPC 配列と比較することにより比較工程を行う、請求項１４に記載の方法。２０．第一および第二のAPC配列間に相違が検出されない、請求項１９に記載の方法。２１．試料中にＡＰＣ変異が検出されない、請求項１４に記載の方法。２２．結腸直腸癌またはFAPに関連するその他の癌を有する患者を治療する方法であって、以下の工程：患者に対して、APCコード配列の一部分を含むヌクレオチド配列であって、前記一部分がβ-カテニン結合部位からなる配列を投与することを含む前記方法。２３．結腸直腸癌またはFAPに関連するその他の癌を有する患者を治療する方法であって、以下の工程：患者に対して、APCコード配列の一部分を含むポリペプチドであって、前記一部分がβ-カテニン結合部位からなるポリペプチドを投与することを含む前記方法。２４． FAP患者または癌を発生するリスクが高まった患者において使用するための候補薬物を同定する方法であって、以下の工程： β-カテニンおよびTcf-4が互いに結合する条件下で、試験化合物をβ-カテニンおよびTcf-4と接触させること；試験化合物がβ-カテニンおよびTcf-4との結合を阻害するかどうかを決定し、結合を阻害する試験化合物が癌療法または予防のための候補化合物であることを含む前記方法。