ES2336605T3 - Metodo para identificar la proteina diana de un agente y metodo para explorar un agente terapeutico para diabetes usando la proteina diana. - Google Patents
Metodo para identificar la proteina diana de un agente y metodo para explorar un agente terapeutico para diabetes usando la proteina diana. Download PDFInfo
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Abstract
Un método para explorar un agente para tratar diabetes, que comprende [1] una etapa de permitir que (1) un polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID Nº: 2, (2) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID Nº: 2 o una secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 2 en la que de 1 a 10 aminoácidos de la misma están delecionados, sustituidos y/o insertados y que también se une a biguanida y/o inhibe la activación de AMPK por biguanida, debido a sobre-expresión, (3) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad del 90% o más con la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID Nº: 2 y que también se une a biguanida y/o inhibe la activación de AMPK por biguanida debido a sobre-expresión o (4) una célula transformada con un vector que comprende un polinucleótido que codifica el polipéptido descrito en (1) a (3) esté en contacto con una sustancia a ensayar en coexistencia de biguanida y [2] una etapa de analizar la unión de dicho polipéptido con la sustancia a ensayar.
Description
Método para identificar la proteína diana de un
agente y método para explorar un agente terapéutico para diabetes
usando la proteína diana.
La presente invención se refiere a un método
para explorar un agente terapéutico para diabetes usando una
proteína diana encontrada por el método de identificación de la
presente invención.
Un gran número de compuestos de bajo peso
molecular usados como agentes farmacéuticos todavía permanecen poco
claros con respecto a sus mecanismos de acción, a pesar de sus
distintas acciones farmacológicas. En general, la mayoría de los
agentes farmacéuticos actúan sobre proteínas específicas in
vivo y alteran las funciones de las proteínas e inducen
acciones farmacológicas como resultado. En los agentes cuyos
mecanismos de acción están poco claros, las proteínas como sus
dianas no se han identificado. En años recientes, como resultado
del avance en la aclaración del sistema de transducción de señal
in vivo a nivel molecular, se ha identificado un gran número
de moléculas de proteínas específicas necesarias para inducir
acciones farmacológicas específicas. Como resultado, el desarrollo
de los agentes denominados agentes de dirección de molécula que se
dirigen a tales moléculas de proteína específicas últimamente está
avanzando, y su proporción está aumentando rápidamente. En el caso
de un compuesto cuya proteína diana es evidente, su mecanismo
funcional in vivo está claro y la estructura del compuesto
se puede modificar con el uso de su potencia para unirse a dicha
proteína o un cambio en la actividad enzimática poseída por la
proteína como el índice. Por tanto, es fácil realizar estudios con
el objetivo de mejorar la farmacocinética, que incluye absorción y
degradación, así como actividad farmacológica, de tal forma que es
notablemente ventajosa en agentes en desarrollo. En el caso de un
compuesto cuya proteína diana no está clara, por el contrario, no
es sencillo intentar la mejora de su estructura química con el
propósito de mejorar la actividad, incluso cuando se encuentra una
acción farmacológica distinta (compárese con Referencia No de
patente 1). Además, aunque existen diferencias en grado, los agentes
farmacéuticos generalmente tienen tanto acciones farmacológicas
deseables (efectos principales) como acciones farmacológicas
indeseables (efectos secundarios adversos). Incluso en el caso de
agentes de dirección de molécula cuyas proteínas diana llevan los
principales efectos y ya están en el mercado, existen muchos casos
en los que la información con respecto a las proteínas diana
concerniente a los efectos secundarios adversos es escasa, y esto
provoca el problema de necesitar tiempo y costes para estudiar la
mejora para evitar los efectos secundarios adversos (compárese con
Referencia No de Patente 1). De hecho, existe un gran número de
agentes farmacéuticos cuyas acciones farmacológicas significativas
se conocen, pero sus proteínas diana son poco claras. Como ejemplos
representativos, se pueden citar la biguanida, que se ha usado
durante mucho tiempo como un agente para tratar la diabetes
(compárese con Referencia No de Patente 2) y la talidomida, en la
que su presencia se ha reconsiderado en vista de su efecto
terapéutico espectacular sobre mieloma múltiple (compárese con
Referencia No de Patente 3). Aunque la biguanida tiene una acción
hipoglucemiante significativa y la talidomida una acción inhibidora
de la angiogénesis significativa, la proteína diana directa para
cada uno de estos agentes in vivo no se ha identificado. Por
tanto, a pesar de las acciones farmacológicas útiles que poseen
estos agentes, fue difícil realizar estudios de mejora para
potenciar los efectos. Además de esto, se conocen efectos
secundarios adversos graves, tales como acidosis láctica, por
biguanida (compárese con Referencia No de Patente 4) y teratogenia
por talidomida (compárese con Referencia No de Patente 3), pero los
estudios para evitar estos problemas no han avanzado, debido a que
sus dianas son poco claras. Por tanto, se demanda la identificación
de las proteínas diana de estos agentes.
De forma convencional, era general un método en
el que se detecta una proteína que se une directamente a un
compuesto de bajo peso molecular y se separa por medios físicos y/o
químicos como un medio para identificar una proteína diana sobre la
que actúa dicho compuesto. Por ejemplo, se conoce un método en el
que se modifica una parte de la estructura de un compuesto y se une
a perlas de afinidad de alto peso molecular y una proteína diana
unida al compuesto se separa y se purifica por gravedad o fuerza
física similar. Además, se realiza un método en el que una etiqueta
a usar como un marcador se une a una parte de la estructura de un
compuesto y la proteína diana unida a dicho compuesto se detecta
químicamente (compárese con Referencia No de Patente 5). En años
recientes, también se han realizado intentos para explorar e
identificar, a partir de una genoteca de ADNc, un fragmento génico
que codifica una proteína que se une al compuesto de interés,
mediante un método de dos híbridos en levadura (compárese con
Referencia No de Patente 6), un método de presentación en fagos
(compárese con Referencia No de Patente 7) y técnicas de biología
molecular similares. Sin embargo, a pesar de los intentos que se
han mencionado anteriormente por diversos métodos, no es frecuente
un caso en el que una proteína diana de un agente se identificó
realmente a partir de los estudios realizados en este campo hasta
ahora. Los motivos de la baja frecuencia de éxito incluyen que es
necesario modificar una parte de la estructura de un compuesto
debido a que perlas o una etiqueta se unen al compuesto a usar como
la sonda en cada caso de los métodos que se han mencionado
anteriormente, de tal forma que es inevitable explorar con respecto
a una proteína que se une a una estructura artificial diferente del
compuesto original (compárese con Referencias No de Patente 1 y 5).
Es decir, esto se convierte en un motivo de identificar
erróneamente, como la proteína diana, una proteína no específica
que se une a una etiqueta, perla, un complejo de los mismos con un
compuesto o sustancia artificial similar que es diferente del agente
que tiene la actividad farmacológica original. Además, aunque es
esencial para el propósito de encontrar la verdadera proteína diana
aplicar la modificación de la estructura de un compuesto a una
región que no ejerza influencia sobre la acción farmacológica de
dicho compuesto, los agentes y compuestos que tienen dianas poco
claras son generalmente pobres en información con respecto a la
correlación entre sus estructuras y actividades farmacológicas, de
tal forma que existen muchos casos en los que se tienen que usar
compuestos modificados en regiones opcionales. Debido a esto, existe
una alta frecuencia de seleccionar un compuesto que ha perdido su
actividad farmacológica original como la sonda. Esencialmente, es
deseable verificar en primer lugar que dicho compuesto al que se ha
añadido una etiqueta o perla por modificación todavía mantiene su
actividad farmacológica original y después usar el mismo como la
sonda, pero ya que la permeabilidad de membrana celular, estabilidad
y diversos parámetros similares ejercen influencias, no es sencillo
determinar la presencia o ausencia de la actividad farmacológica.
Además, ya que la modificación de la estructura de los compuestos
requiere tiempo, costes y técnicas especiales, esto es la causa de
que los métodos que se han mencionado anteriormente difícilmente se
conviertan en un medio de estudio de propósito general. Por otro
lado, es posible verificar la unión de una proteína especificada a
un compuesto marcado sustituyendo un elemento en la molécula de un
compuesto con un radioisótopo (su estructura es igual que antes del
marcado), pero ya que no es una modificación que se pueda fijar, no
es sencillo explorar la proteína diana a partir de un gran número
de proteínas. Además, este método tiene la desventaja de que el
compuesto se convierte en inestable por el marcado y los costes
aumentan. Como otro motivo de la baja proporción de éxito de
exploración de diana de compuesto por los métodos convencionales se
puede ejemplificar un punto que ya que cada uno de los métodos que
se han mencionado anteriormente realiza la detección y separación de
una diana usando la unión directa de un compuesto con una proteína
como el índice, es difícil conseguir el hallazgo de diana cuando la
afinidad de unión entre el compuesto y la proteína diana es baja. De
hecho, en cada uno de los pocos casos de éxito al encontrar una
diana por los métodos que se han mencionado anteriormente, la
afinidad de unión entre el compuesto y la proteína es alta
(compárese con Referencia No de Patente 4). Sin embargo, el grado
de actividad farmacológica de un compuesto y su afinidad de unión
por una proteína diana no tienen siempre una correlación basándose
en el conocimiento obtenido hasta ahora. Más bien, se considera que
la fuerte unión de un compuesto a la proteína diana puede no ser
necesaria para la inducción de acción farmacológica excluyendo la
inhibición irreversible (compárese con Referencia No de Patente 8).
Basándose en los anteriores problemas, se ha dirigido el interés a
un método para identificar proteínas diana de agentes, que no se
podían encontrar por los métodos convencionales.
La chaperona molecular es un grupo de proteínas
que ayuda a la formación de estructura de proteína, tal como
plegamiento o desnaturalización (desplegamiento) de una molécula de
proteína, formación de multímeros y similares (compárese con
Referencia No de Patente 9). Ahora se sabe que un gran número de
moléculas denominadas generalmente proteína de choque térmico, en
las que su expresión está acelerada por estimulación térmica, actúan
como chaperona. Entre las chaperonas moleculares, un grupo de
moléculas denominadas generalmente familia Hsp60 se denomina
particularmente "chaperonina" como una chaperona molecular
típica. Estas chaperonas moleculares representadas por la proteína
de choque térmico interaccionan con proteínas inestables antes de la
finalización de sus estructuras terciarias en su proceso de
traducción y las mantienen estables y también tienen la acción de
mantener y controlar la estructura de proteína de tal forma que las
influencias en la función de proteína intracelular no se provocan
acompañadas por un cambio ambiental y de acelerar la ubiquitinación
y degradación posterior de sustrato que se convierte en un estado
anormal (compárese con Referencia No de Patente 10). Por tanto, la
chaperona tiene una propiedad como una molécula funcional que
reconoce la estructura no natural de una molécula de proteína como
el sustrato. Por otro lado, se ha descrito un método de exploración
para identificar el ligando de proteína diana ya conocida, que usa
chaperona molecular para la determinación del grado de estado
plegado y estado no plegado de la proteína diana en presencia o
ausencia de un candidato de ligando (compárese Referencias No de
Patente 1 a 6).
La insulina se secreta de la célula P de los
islotes pancreáticos de Langerhans y reduce el nivel de azúcar en
sangre actuando principalmente sobre músculos, el hígado y grasa
para almacenar y consumir azúcar sanguíneo por su captación en las
células. La diabetes se induce por la acción insuficiente de esta
insulina y existen dos tipos en estos pacientes, a saber, de tipo
I, que tienen un trastorno en la producción o secreción de
insulina, y de tipo II, en los que es difícil que tenga lugar la
aceleración del metabolismo de glucosa por insulina. Aunque el
nivel de azúcar en sangre se hace mayor que el de personas sanas en
estos dos pacientes, la insulina en sangre pasa a ser absolutamente
escasa en el tipo I, mientras que en el tipo II se genera
resistencia a insulina en la que la captación o el consumo de
azúcar sanguíneo por las células no está acelerado a pesar de la
presencia de insulina. La diabetes de tipo II es una denominada
enfermedad relacionada con el estilo de vida que se induce por
sobrealimentación, poco ejercicio, estrés y causas similares además
de un factor hereditario básico. Actualmente, este paciente de tipo
II está aumentando rápidamente en naciones avanzadas acompañado por
el aumento de la ingesta calórica y ocupa el 95% de los pacientes
con diabetes en Japón. Por tanto, está aumentando la necesidad no
solamente de un agente hipoglucemiante simple, sino también de
tratamiento de diabetes de tipo II para acelerar el metabolismo de
glucosa mediante la mejora de la resistencia a insulina como
agentes para tratar diabetes. Actualmente se prescriben inyecciones
de insulina para el tratamiento de pacientes con diabetes de tipo
I. Por otro lado, como el agente hipoglucemiante prescrito para
pacientes con diabetes de tipo II, se conocen un agente
hipoglucemiante de sistema de sulfonilurea (agente SU) que acelera
la secreción de insulina actuando sobre células \beta del páncreas
y un inhibidor de \alpha-glucosidasa que retrasa
la absorción de glucosa por digestión, además de las inyecciones de
insulina. A pesar de que estos mejoran indirectamente la
resistencia a insulina, en años recientes se ha usado un derivado de
tiazolidina como un agente que mejora más directamente la
resistencia a insulina. Su acción es acelerar la captación de
glucosa en las células y el uso de glucosa en las células. Se ha
demostrado que este derivado de tiazolidina actúa como un agonista
del receptor activado por proliferador de peroxisoma gamma
(PPAR\gamma) (compárese con Referencia No de Patente 11). Sin
embargo, se conoce que el derivado de tiazolidina no solamente
mejora la resistencia a insulina, sino que también tiene efectos
secundarios adversos de inducir la acumulación de grasa y edema
(compárese con Referencia No de Patente 12). Ya que esta inducción
de edema es un efecto secundario adverso grave que da como
resultado hipertrofia cardiaca, se demanda una molécula diana de
fármaco nueva más útil en lugar de PPAR\gamma para la mejora de
la resistencia a insulina. Como un agente líder que produce una
acción de mejora del metabolismo de glucosa diferente de éste, se
conoce un agente hipoglucemiante biguanida que se ha usado durante
mucho tiempo (compárese con Referencia No de Patente 13). Se ha
descrito que este agente biguanida tiene acciones mejorando el
metabolismo de la glucosa por acción glucolítica anaerobia,
supresión de gluconeogénesis, supresión de apetito y supresión de
absorción intestinal de glucosa y, como resultado, la biguanida
mejora la sensibilidad a insulina en el hígado y músculos. Ya que la
biguanida no actúa sobre el páncreas y no aumenta la secreción de
insulina, tiene la característica de que no provoca obesidad y
provoca difícilmente hipoglucemia. La acción de la biguanida no
incluye acciones indeseables que poseen los derivados de
tiazolidina que se han mencionado anteriormente y las preparaciones
de insulina y existen muchos casos en los que en realidad se
prescribe en combinación con los otros agentes hipoglucemiantes que
se han mencionado anteriormente. En combinación con la
reconsideración de años recientes su fuerte acción farmacológica, el
agente biguanida ahora mantiene su posición cerca del derivado de
tiazolidina como agente de mejora de resistencia a insulina. Pero,
por otro lado, se conoce que el agente biguanida tiene el efecto
secundario adverso de provocar acidosis láctica aumentando la
acumulación de ácido láctico (compárese con Referencia No de Patente
14). A pesar de la historia muy antigua de la biguanida como un
agente, una proteína diana distinta, como el caso de PPAR\gamma
del derivado de tiazolidina, todavía no se ha identificado. Ya que
no se ha obtenido información con respecto a la correlación de la
actividad estructural en relación a agentes biguanida y la proteína
diana, ha sido difícil realizar hasta la actualidad no solamente un
estudio disociado sobre el efecto secundario adverso tal como
mejora de acidosis láctica, sino también un estudio de mejora que
pretende mejorar la hipoglucemia como el principal efecto. La
proteína ATP5B es la subunidad \beta de la
F1F0-ATP sintasa, que está codificada en el genoma
y realiza su acción después de que se haya transferido a la
mitocondria (compárese con Referencias No de Patente 15 y 16).
Además, con respecto a las cantidades existentes de ATP5B, se ha
descrito que las cantidades de su expresión génica y la cantidad de
proteína disminuyen en los músculos de pacientes con diabetes de
tipo II en comparación con los de personas sanas (compárese con
Referencias No de Patente 17 y 18 y Referencia de Patente 7).
Además, se ha descrito que el nivel de fosforilación de ATP5B en
músculos de pacientes con diabetes y el nivel de azúcar en sangre
en ayunas tienen una correlación inversa (compárese con Referencia
No de Patente 18 y Referencia de Patente 7) y los que (por ejemplo,
un fragmento de ácido nucleico) que controlan la expresión de
ATP5B, un polipéptido, un anticuerpo, un polinucleótido o un
compuesto que se une a un polipéptido y similares pueden ser
agentes para tratar enfermedades asociadas con diabetes (compárese
Referencia de Patente 7). Existe un informe que describe diversos
polipéptidos (3025 sustancias) incluidos en el proteoma
mitocondrial del corazón humano que incluyen ATP5B y describe que
estos están relacionados con la exploración para un agente para
tratar enfermedades (incluyendo diabetes) asociadas con funciones
mitocondriales (compárese con Referencia de Patente 8). Sin
embargo, no existen informes que indiquen que la proteína ATP5B se
una a
biguanida.
biguanida.
- Referencia de Patente 1:
- Patente de Estados Unidos Nº 5585277
- Referencia de Patente 2:
- Patente de Estados Unidos Nº 5679582
- Referencia de Patente 3:
- Publicación de Solicitud de Patente de Estados Unidos Nº 2002/055123
- Referencia de Patente 4:
- Publicación de Solicitud de Patente de Estados Unidos Nº 2004/191835
- Referencia de Patente 5:
- Patente Japonesa Nº 2952848
- Referencia de Patente 6:
- Patente Europea Nº 0770876
- Referencia de Patente 7:
- Publicación Internacional Nº 03/020963
- Referencia de Patente 8:
- Publicación Internacional Nº 03/087768
\vskip1.000000\baselineskip
- Referencia no de Patente 1:
- "The Journal of Antibiotics" H. Hatori et al., 2004 vol. 57 Nº 7 págs. 456-461
- Referencia no de Patente 2:
- "Nippon Rinsho (Japan Clinics)" Y. Yamacaki et al., 2002 vol. 60 Nº 9 págs. 389–92.
- Referencia no de Patente 3:
- "Drug Discovery Today" Teo SK et al., 2005 vol. 15 Nº 10(2) págs. 107-114
- Referencia no de Patente 4:
- "Drugs" Lalau JD et al., 1999 vol. 58 Nº 1 págs. 55-60/75-82
- Referencia no de Patente 5:
- "Nature Biotechnology" (England) 2000, N. Shimizu et al., vol. 18, págs. 877-881
- Referencia no de Patente 6:
- "Biochemical Pharmacology" 2002, D. Henthorn et al., vol. 63 Nº 9 págs. 1619-1628
- Referencia no de Patente 7:
- "Chemistry & Biology" Sche PP et al., vol. 6 Nº 10: p. 707 -716. PMID: 10508685
- Referencia no de Patente 8:
- "Biochemistry (OUTLINES OF BIOCHEMISTRY)" 1987, Eric E. CONN et al.
- Referencia no de Patente 9:
- "Pharmacology & Therapeutics" 2004, A. Sreedhar et al., vol. 101 Nº 3 págs. 227-257
- Referencia no de Patente 10:
- "Nature" 1992, Gething MJ, Sambrook J. et al., vol. 355 Nº 6355: págs. 33-45
- Referencia no de Patente 11:
- "The Journal of Biological Chemistry", (USA), 1995, vol. 270, págs. 12953 -12956
- Referencia no de Patente 12:
- "Diabetes Frontier", (USA), 1999, vol. 10, págs. 811-818
- Referencia no de Patente 13:
- "Nippon Rinsho (Japan Clinics)" Y. Yamasaki et al., 2002 vol. 60 Nº 9 págs. 389-92
- Referencia no de Patente 14:
- "Drugs" Lalau JD et al., 1999 vol. 58 Nº 1 págs. 55 - 60/75 - 82
- Referencia no de Patente 15:
- "Nature" (USA), 1997, vol. 386, págs. 299 - 302
- Referencia no de Patente 16:
- "Nature" (USA), 1994, vol. 370 (6491), págs. 621- 628
- Referencia no de Patente 17:
- "Diabetes" 2002, vol. 51, págs. 1913 -1920
- Referencia no de Patente 18:
- "The Journal of Biological Chemistry" 2003, vol. 278, págs. 10436 -10442
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención pretende proporcionar un
método para explorar un agente novedoso para tratar diabetes.
Cuando un compuesto actúa y, de este modo,
ejerce influencia sobre la función de una proteína diana, se espera
que la estructura terciaria de dicha proteína se someta a un cambio
por su interacción con el compuesto. Por tanto, se considera que el
factor necesario para la acción farmacológica producida por el
compuesto no sea una simple unión entre el compuesto y la diana,
sino un cambio en la estructura terciaria de la proteína diana por
la acción del compuesto. Por consiguiente, los presentes inventores
han considerado que cuando es posible explorar una proteína usando
dicho cambio como el índice, se puede explorar una proteína diana
verdadera que lleva la acción farmacológica de un compuesto con una
probabilidad superior a medios convencionales de exploración de
diana de compuesto. Además, desarrollando un método para seleccionar
y detectar el cambio que se ha mencionado anteriormente no desde el
lado del compuesto, sino desde el lado de una proteína diana en
respuesta al compuesto, se realizó la identificación de la proteína
diana de dicho compuesto sin necesitar modificación de la estructura
del compuesto que era inevitable por los métodos convencionales. Es
decir, los inventores han observado que una proteína de chaperona
molecular conocida como una molécula funcional que reconoce la
estructura no natural de una proteína como el sustrato reconoce un
cambio de la estructura terciaria de la proteína por un compuesto
(un agente cuya proteína diana es desconocida) y, por lo tanto, han
construido un método para detectar e identificar una proteína diana
de un compuesto (un agente cuya proteína diana es desconocida)
usando, como el índice, un cambio en la unión de una proteína
intracelular con una proteína de chaperona molecular.
Ilustrativamente, los inventores han tenido éxito al detectar un
receptor de estrógenos como la proteína diana del compuesto de bajo
peso molecular 17\beta-estradiol (Ejemplo 2) y
también han tenido éxito al detectar FKBP12 como la proteína diana
de FK506 y FK1706, detectando el receptor de glucocorticoides como
la proteína diana de dexametasona, detectando el receptor de
andrógenos como la proteína diana de dihidrotestosterona, detectando
el receptor de mineralocorticoides como la proteína diana de
androsterona y detectando la hidrofolato reductasa como la proteína
diana de metotrexato (Ejemplo 3). Además, también ha habido éxito al
detectar e identificar la proteína diana de un agente para tratar
diabetes, biguanida, cuya proteína diana era poco clara en el pasado
y se ha encontrado que ésta es ATP5B (Ejemplo 4).
Además, se ha puesto de manifiesto que cuando la
proteína ATP5B que se ha mencionado anteriormente como la subunidad
\beta de F1F0-ATP sintasa que existe en la
membrana mitocondrial, cuya función de unirse a un agente para
tratar diabetes biguanida se ha observado por los inventores, se
expresa de forma excesiva en una célula, se obstruye la activación
de AMP cinasa intracelular (a denominar AMPK en lo sucesivo en este
documento) por biguanida (Ejemplo 5). Basándose en estos hallazgos,
los inventores han puesto de manifiesto que la proteína ATP5B es la
proteína diana en lo que se refiere a la acción farmacológica
(efecto principal) de biguanida y, de este modo, construyeron un
nuevo método de exploración de un agente para tratar diabetes, que
usa dicha proteína. Al hallar que una sustancia obtenida por el
método de exploración de la presente invención ciertamente tiene el
efecto para tratar diabetes y no tiene efectos secundarios adversos,
se proporcionaron una nueva herramienta de exploración y un método
de exploración de un agente para tratar diabetes y una composición
farmacéutica para el tratamiento de la diabetes.
Es decir, la presente invención se refiere
a:
<1> un método para explorar un agente para
tratar diabetes, que comprende
- [1]
- una etapa de permitir que (1) un polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID Nº 2, (2) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID Nº 2 o una secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 2 en la que de 1 a 10 aminoácidos de la misma están delecionados, sustituidos y/o insertados y que también se une a biguanida y/o inhibe la activación de AMPK por biguanida debido a sobre-expresión, (3) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad del 90% o más con la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID Nº 2 y que también se une a biguanida y/o inhibe la activación de AMPK por biguanida debido a sobre-expresión o (4) una célula transformada con un vector que comprende un polinucleótido que codifica el polipéptido descrito en (1) a (3) esté en contacto con una sustancia a ensayar en coexistencia de biguanida y
- [2]
- una etapa de analizar la unión de dicho polipéptido con la sustancia a ensayar.
<2> el método de exploración descrito en
<1>, que comprende además una etapa de confirmar que la
sustancia activa la actividad de AMPK y/o tiene una actividad
terapéutica para diabetes.
\vskip1.000000\baselineskip
En la fecha de prioridad de esta solicitud, se
conocían las propiedades de chaperona molecular como una molécula
funcional que reconoce una estructura no natural de una molécula de
proteína que se convierte en el sustrato (Referencia No de Patente
9 y Referencia No de Patente 10) y un método para identificar un
ligando de una proteína ya conocida usando chaperona molecular
(Referencias de Patente 1 a 6), pero no se conocía ningún
método para identificar una proteína diana de un compuesto de
bajo peso molecular usando chaperona molecular. En la fecha de
prioridad, se conocía la reducción de la cantidad existente de ATP5B
en músculos de pacientes con diabetes de tipo II (compárese con
Referencias No de Patente 17 y 18 y Referencia de Patente 7) y la
correlación inversa entre el nivel de fosforilación de ATP5B en
músculos de pacientes con diabetes y nivel de glucosa en sangre en
ayunas (compárese con Referencia No de Patente 18 y Referencia de
Patente 7), pero la Referencia de Patente 7 describe que la propia
ATP5B y los anticuerpos se convierten en agentes para tratar
enfermedades asociadas con diabetes, pero no estaba claro el modo
de regular la expresión de ATP para generar el efecto terapéutico
de diabetes. Existe un informe que describe diversos polipéptidos
(3025 sustancias) incluidos en el proteoma mitocondrial del corazón
humano que incluyen ATP5B y describe que estos están relacionados
con la exploración de un agente terapéutico para enfermedades que
incluyen diabetes relacionadas con un gran número de funciones
mitocondriales (compárese con Referencia de Patente 8), pero no
existe base de que ATP5B esté relacionada con la exploración de un
agente para tratar diabetes. Además, en una referencia abierta al
público después de la fecha de prioridad de esta solicitud
(Publicación Internacional Nº 2005/090992), se describen
polipéptidos que incluyen ATP5B como dos o más modificadores de la
ruta PTEN y se describe un sistema para detectar la unión de estos
modificadores con un compuesto candidato, pero no se describe o
sugiere una relación entre un agente que se une específicamente al
modificador y la diabetes. Ya que no existen informes en estas
referencias que indiquen que la proteína ATP5B y biguanida se unen
entre sí, la unión de una proteína ATP5B y biguanida es el
conocimiento encontrado por primera vez por los presentes inventores
y el método de exploración de agente para tratar diabetes que usa
ATP5B y tiene el efecto principal similar al de biguanida
(particularmente un método de exploración de agente para tratar
diabetes que usa ATP5B y se realiza en coexistencia de biguanida)
es una invención realizada por primera vez por los presentes
inventores.
\vskip1.000000\baselineskip
Mediante el método de exploración de la presente
invención que usa la herramienta de exploración de la presente
invención (por ejemplo, ATP5B, que es la proteína diana de
biguanida), se puede obtener un compuesto que se convierte en un
agente para tratar diabetes y tiene un nuevo compuesto madre
estructuralmente no análogo, además de un compuesto
estructuralmente análogo o biguanida. Este compuesto de estructura
no análoga puede convertirse en un nuevo agente para tratar
diabetes que no provoca obesidad como una característica de
biguanida y también tiene un efecto de provocar difícilmente
hipoglucemia. Además de esto, mediante el uso de la unión con la
proteína ATP5B como el índice, se hace posible modificar la
estructura molecular del compuesto obtenido mientras que se
mantiene su efecto principal, de tal forma que se hace posible
desarrollar un agente para tratar diabetes que tiene un efecto
principal más elevado y un efecto secundario adverso más reducido en
comparación con los agentes biguanida convencionales.
\vskip1.000000\baselineskip
La Figura 1 es una ilustración que muestra una
banda de ER\alpha en la que su cambio se detectó de un modo
dependiente de E2 por un método de arrastre (pull down) que usó una
proteína de chaperona molecular como la sonda. Los carriles 1 y 2
muestran los resultados usando GST y los carriles 3 a 6, los
resultados del uso de GST-HSPA4.
La Figura 2 es una ilustración que muestra la
unión de ATP5B humana con fenformina. El "+" en el dibujo
muestra un caso de añadir MTX- fenformina y "-", un caso de no
añadir MTX-fenformina. El "Inp." representa la
entrada.
La Figura 3 es una ilustración que muestra la
desaparición de la capacidad de unión a fenformina por la mutación
de ATP5B humana. El "WT" muestra un caso del uso de ATP5B de
tipo silvestre y el "E175V" del uso de ATP5B tipo de mutación
Glu175Val y "D295V" del uso de ATP5B de tipo mutación
Asp295Val. El "+" en el dibujo muestra el caso de añadir
MTX-fenformina y "-", un caso de no añadir
MTX-fenformina. El "Inp." representa la
entrada.
La Figura 4 es una ilustración que muestra la
desaparición de la capacidad de activación de AMPK de fenformina
(PF), por la sobre-expresión de ATP5B humana. El
panel superior muestra un resultado del uso de un anticuerpo
anti-fosfo AMPK y el panel inferior, un resultado
del uso de un anticuerpo anti-AMPKa. El "+" en
el dibujo muestra un caso de añadir fenformina (PF) y "-", un
caso de no añadir fenformina (PF).
La Figura 5 es un gráfico que muestra la unión
de ATP5B humana con MTX-fenformina
(MTX-PF), que depende de la concentración de
fenformina (PF). El eje de ordenada muestra los recuentos (cantidad
de ATP5B).
La Figura 6 es un gráfico en el que, en un
ensayo que muestra la unión de ATP5B humana con fenformina, se
permite que una sustancia a ensayar (fenformina libre; PF) esté en
contacto entre sí y se detectó si ejerce o no influencia sobre la
unión. El eje de ordenada muestra los recuentos (cantidad de
ATP5B).
La Figura 7 es un gráfico en el que, en un
ensayo que muestra la unión de ATP5B humana con fenformina, se
permite que se ponga en contacto una sustancia a ensayar (compuesto
A o compuesto B) y se detectó si ejerce o no influencia sobre la
unión. El eje de ordenada muestra los recuentos (cantidad de
ATP5B).
La Figura 8 es un gráfico que muestra que el
compuesto A y el compuesto B muestran acción hipoglucemiante sin
provocar acumulación in vivo de ácido láctico. Muestra los
cambios periódicos en el valor de azúcar en sangre (A) y del valor
de ácido láctico (B), 0 minutos, 90 minutos y 180 minutos después de
la administración intraperitoneal de compuesto A (cuadrado vacío),
metformina (círculo relleno) o disolvente (rombo relleno) a ratones
db/db. Del mismo modo se muestran cambios periódicos en el valor de
azúcar en sangre (C) y valor de ácido láctico (D) 0 minutos, 90
minutos y 180 minutos después de la administración intraperitoneal
de compuesto B (cuadrado relleno), metformina (círculo vacío) o
disolvente (rombo relleno) a ratones db/db. En cada uno de A y C,
el valor de cada tiempo de medición en el grupo de administración de
disolvente se considera que es 100 basándose en el valor medido en
el minuto 0 y se expresan valores relativos basados en el mismo,
donde el eje de ordenada muestra la velocidad del cambio en el
valor de azúcar en sangre (%). En cada uno de B y D, el valor
medido en el minuto 0 se considera que es 100 y se expresan valores
relativos basados en el mismo, donde el eje de ordenada muestra la
velocidad del cambio en el valor de ácido láctico (%). El símbolo *
indica que el valor p por el ensayo de significación es 0,05 o
menor y **, 0,01 o menor del mismo modo.
\vskip1.000000\baselineskip
A continuación se describe con detalle la
presente invención. Las técnicas de manipulación génica de esta
descripción se pueden realizar de acuerdo con las técnicas conocidas
de forma convencional de "Molecular Cloning" Sambrook, J.
et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989'' y
similares a menos que se indique de otro modo y las técnicas de
manipulación de proteínas se pueden realizar de acuerdo con las
técnicas conocidas de forma convencional de "Tanpaku Jikken
Protocol (Protein experiment Protocol)"
(Shujun-sha, 1997) y similares a menos que se
indique de otro modo.
En este documento se describe un método para
identificar una proteína (proteína diana) cuya estructura terciaria
se cambió en respuesta a un compuesto con el uso de una proteína de
chaperona molecular que es una proteína que tiene una función de
reconocer un cambio en la estructura terciaria de una proteína in
vivo, examinando de forma inclusiva la diferencia en el cambio
de la unión de chaperona molecular con una proteína endógena
(proteína diana) en el momento de añadir o no añadir un compuesto
específico (un agente cuya proteína diana no está clara),
seleccionando de este modo una proteína cuya cantidad de unión
aumenta solamente cuando se añade un agente a ensayar o cuya
cantidad de unión se reduce solamente cuando se añade el agente a
ensayar.
El método de identificación es un método para
identificar una proteína diana de un agente a ensayar, que
comprende
- [1] (1) una etapa de permitir que un agente a ensayar, una proteína de chaperona molecular y una proteína de célula de muestra estén en contacto entre sí y
- (2) una etapa de detectar una proteína que se une a la proteína de chaperona molecular,
- [2] (3) una etapa de permitir que una proteína de chaperona molecular esté en contacto con una proteína de célula de muestra y
- (4) una etapa de detectar una proteína que se une a la proteína de chaperona molecular y
- [3] una etapa de comparar la proteína detectada por (2) con la proteína detectada por (4).
\vskip1.000000\baselineskip
\global\parskip0.900000\baselineskip
La proteína de célula de muestra de acuerdo con
esta descripción quiere decir un grupo de proteínas contenidas
(expresadas) en una célula que se considera que contiene la proteína
diana a explorar (a denominar en lo sucesivo en este documento
"célula de muestra"). De acuerdo con el método de
identificación, no se limita por el orden de puesta en contacto,
condición de la proteína de chaperona molecular (si está aislada,
expresada en una célula o contenida en un extracto celular) y
condición de la proteína de célula de muestra (si se expresa en una
célula intacta o está contenida en un extracto celular), a condición
de que el agente a ensayar, la proteína de chaperona molecular y la
proteína de célula de muestra se pongan en contacto entre sí. Es
decir, el método de identificación incluye un método que usa una
proteína de chaperona molecular aislada y purificada y una proteína
de célula de muestra contenida en un extracto de célula de muestra
(el primer método de identificación), un método que usa una
proteína de chaperona molecular expresada en una célula de muestra
transformada con un vector que comprende una región de longitud
parcial o completa de un polinucleótido que codifica la proteína de
chaperona molecular y una proteína de célula de muestra expresada en
la célula de muestra transformada (célula intacta) (el segundo
método de identificación) y un método que usa una proteína de
chaperona molecular en una condición de estar contenida en el
extracto que se ha mencionado anteriormente de célula transformada
y una proteína de célula de muestra en una condición de estar
contenida en el mismo extracto (el tercer método de
identificación). En el primer método de identificación se aísla la
molécula de chaperona molecular. Por ejemplo, se produce en una
gran cantidad expresando una región de longitud parcial o completa
de la molécula de chaperona molecular o una región de longitud
parcial o completa de la molécula de chaperona molecular fusionada
con GST, Flag, His o etiqueta similar en Escherichia coli o
bacteria similar, levadura, célula de insecto o similares o
mediante un método de síntesis química y después se puede purificar
usando un anticuerpo de la proteína de chaperona molecular,
anticuerpos de diversas etiquetas fusionadas con la proteína de
chaperona molecular o perlas de afinidad o columna de afinidad que
tienen alta afinidad por la etiqueta. Alternativamente, también es
posible producir y purificar la proteína de chaperona molecular
realizando la transcripción y traducción de un fragmento de ADN del
gen de chaperona molecular in vitro. En el primer método de
identificación, la proteína de chaperona molecular purificada se
mezcla y se pone en contacto con un líquido mixto de proteína
extraída de una célula de muestra (a saber, un líquido que contiene
una proteína de célula de muestra) in vitro en una
condición de añadir o no añadir un agente a ensayar y después tanto
la proteína de chaperona molecular como las proteínas que se unen a
la misma se concentran de acuerdo con el método que se ha descrito
anteriormente. Preferiblemente, una proteína obtenida de una célula
de muestra que se une a la proteína de chaperona molecular
solamente cuando un agente a ensayar no se añade o una proteína
obtenida de una célula de muestra que se une a la proteína de
chaperona molecular solamente cuando se añade un agente de ensayar
se puede detectar por los métodos que se han descrito en el Ejemplo
2(2) (3), 3, 4 u 8.
El segundo método de identificación es un método
para identificar una proteína diana de un agente a ensayar, que
comprende
- [1] (1) una etapa de permitir que un agente a ensayar, una proteína de chaperona molecular expresada en una célula de muestra transformada con un vector que comprende un polinucleótido que codifica la proteína de chaperona molecular y una proteína de célula de muestra expresada en la célula transformada que se ha mencionado anteriormente se pongan en contacto entre sí y
- (2) una etapa de detectar una proteína que se une a la proteína de chaperona molecular,
- [2] (3) una etapa de permitir que una proteína de chaperona molecular expresada en una célula de muestra transformada con un vector que comprende un polinucleótido que codifica proteína de chaperona molecular se ponga en contacto con una proteína de célula de muestra expresada en la célula transformada que se ha mencionado anteriormente y
- (4) una etapa de detectar una proteína que se une a la proteína de chaperona molecular y
- [3] una etapa de comparar la proteína detectada por (2) con la proteína detectada por (4).
El tercer método de identificación es un método
para identificar una proteína diana de un agente a ensayar, que
comprende
- [1] (1) una etapa de permitir que un agente a ensayar, una proteína de chaperona molecular en una condición de estar contenida en un extracto celular de una célula de muestra transformada con un vector que comprende un polinucleótido que codifica la proteína de chaperona molecular y una proteína de célula de muestra en una condición de estar contenida en el extracto que se ha mencionado anteriormente estén en contacto entre sí y
- (2) una etapa de detectar una proteína que se une a la proteína de chaperona molecular,
- [2] (3) una etapa de permitir que una proteína de chaperona molecular en una condición de estar contenida en un extracto celular de una célula de muestra transformada con un vector que comprende un polinucleótido que codifica la proteína de chaperona molecular se ponga en contacto con una proteína de célula de muestra en una condición de estar contenida en el extracto que se ha mencionado anteriormente y
- [4] una etapa de detectar una proteína que se une a la proteína de chaperona molecular y
- [3] una etapa de comparar la proteína detectada por (2) con la proteína detectada por (4).
\global\parskip1.000000\baselineskip
El segundo método de identificación y el tercer
método de identificación incluyen una etapa de transformar una
célula que se considerada que contiene la proteína diana a explorar
con un vector que comprende una región de longitud parcial o
completa de un polinucleótido que codifica la proteína de chaperona
molecular y que expresa una región de longitud parcial o completa
de un polipéptido como la proteína de chaperona molecular o una
región de longitud parcial o completa de dicho polipéptido a la que
se fusiona GST, Flag, His o etiqueta similar en dicha célula. En el
segundo método de identificación, un compuesto del que se desea
explorar su proteína diana (a denominar en lo sucesivo en este
documento agente a ensayar) se añade (se pone en contacto) o no se
añade (no añadido) a la célula transformada que se ha mencionado
anteriormente de un estado vivo. De este modo, la proteína de
chaperona molecular que se expresa en la célula de muestra
transformada que se ha mencionado anteriormente, una proteína de
célula de muestra y un agente de muestra o una proteína de chaperona
molecular que se expresa en la célula de muestra transformada que
se ha mencionado anteriormente y la proteína de célula de muestra
se pueden poner en contacto. En el tercer método de identificación,
un agente a ensayar se añade (se pone en contacto) o no se añade
(no añadido) a un líquido mixto de proteína extraído de la célula
transformada que se ha mencionado anteriormente (a saber, un
extracto de célula de muestra que contiene una proteína de
chaperona molecular y una proteína de célula de muestra). De este
modo, la proteína de chaperona molecular en el estado de estar
contenida en un extracto de la célula de muestra transformada que se
ha mencionado anteriormente, la proteína de célula de muestra en un
estado de estar contenida en el mismo extracto y el agente de
muestra o la proteína de chaperona molecular en un estado de estar
contenida en un extracto de la célula de muestra transformada que
se ha mencionado anteriormente y la proteína de célula de muestra en
un estado de estar contenida en el mismo extracto se pueden poner
en contacto. En el segundo método de identificación y el tercer
método de identificación, la proteína que se une a la proteína de
chaperona molecular se concentra de acuerdo con el mismo método que
el primer método de identificación.
\vskip1.000000\baselineskip
Como la proteína de chaperona molecular que se
puede usar en el método de identificación se puede usar cualquier
proteína de chaperona molecular conocida de forma convencional. De
forma ilustrativa, se pueden ejemplificar proteínas típicas que
pertenecen a las respectivas familias de Hsp90 (HtpG; la parte entre
paréntesis muestra el nombre de Escherichia coli), Hsp70
(DnaJ), Hsp60 (GroEL), Hsp40 (DnaJ), Hsp27 (IbpAB), Hsp104 (CIpB) y
GRP78 (DnaK) (A. Sreedhar et al., Pharmacology &
Therapeutics, 2004, vol. 101, Nº 3, págs. 227 - 257; D. S. Latchman
et al., Cardiovascular Research, 2001, vol. 51, págs. 637 -
646). Además, FKBP56 y Hsp32 conocidas como
hemo-oxigenasa-1, sHSP de bajo peso
molecular (proteínas de choque térmico pequeñas) y similares también
se pueden usar como chaperonas (P. Laksanalamai, Extremphiles,
2004, vol. 8, Nº 1, págs. 1 -11).
Como la proteína de chaperona molecular que se
puede usar en el método de identificación, se incluye una chaperona
molecular conocida de forma convencional o un polipéptido que
comprende una secuencia de aminoácidos que representa una proteína
de chaperona molecular conocida de forma convencional en la que de 1
a 10 (preferiblemente de 1 a 7, más preferiblemente de 1 a 5, más
preferiblemente de 1 a 3) aminoácidos de la misma están
delecionados, sustituidos y/o insertados y también se une a una
proteína reconociendo un cambio en la estructura terciaria de dicha
proteína (a denominar en lo sucesivo en este documento "variante
funcionalmente equivalente"). Además, un polipéptido que
comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una homología del
90% o más (preferiblemente del 95% o más, más preferiblemente del
98% o más) con la secuencia de aminoácidos que representa la
proteína de chaperona molecular conocida que se ha descrito
anteriormente también se une a una proteína reconociendo un cambio
en la estructura terciaria de dicha proteína (a denominar en lo
sucesivo en este documento un "polipéptido homólogo"). Además,
los orígenes de la variante funcionalmente equivalente y el
polipéptido homólogo no se limitan a especies de organismos
particulares. Además, no están limitados a polipéptidos naturales, a
condición de que se incluyan en la variante funcionalmente
equivalente o el polipéptido homólogo y un polipéptido modificado
artificialmente mediante ingeniería genética basándose en una
secuencia de aminoácidos que representa una proteína de chaperona
molecular conocida de forma convencional también se incluye en este
documento. En este contexto, la "identidad" que se ha
mencionado anteriormente en esta descripción significa el valor de
identidad obtenido usando los parámetros dispuestos por defecto por
el programa de recuperación NEEDLE (J. Mol. Biol., 1970; 48: 443-
453). Los parámetros que se han mencionado anteriormente son los
siguientes.
Penalización por hueco = 10
Penalización por extensión = 0,5
Matriz = EDNAFULL
Se prefieren como la proteína de chaperona
molecular proteínas representadas por las SEC ID Nº: 3, SEC ID Nº:
4, SEC ID Nº: 5, SEC ID Nº: 6, SEC ID Nº: 7, SEC ID Nº: 8, SEC ID
Nº: 9, SEC ID Nº: 10, SEC ID Nº: 11, SEC ID Nº: 12, SEC ID Nº: 13,
SEC ID Nº: 14, SEC ID Nº: 15, SEC ID Nº: 16, SEC ID Nº: 17, SEC ID
Nº: 18, SEC ID Nº: 19, SEC ID Nº: 20, SEC ID Nº: 21, SEC ID Nº: 22,
SEC ID Nº: 23, SEC ID Nº: 24, SEC ID Nº: 25, SEC ID Nº: 26 y/o SEC
ID Nº: 27 (HSPA1A humano; número de acceso de RefSeq NP_005336,
HSPH1 humano; número de acceso de RefSeq NP_006635, HSPCA humano;
número de acceso de RefSeq NP_005339, HSPD1 humano; número de acceso
de RefSeq NP_955472, DNAJA1 humano; número de acceso de RefSeq
NP_001530, HSPB1 humano; número de acceso de RefSeq NP_001531,
HSPE1 humano; número de acceso de RefSeq NP_002148, HSPA4 humano;
número de acceso de RefSeq NP_002145, HSP90B 1 humano; número de
acceso de RefSeq NP_003290, CCT6B humano; número de acceso de RefSeq
NP_006575, TCP1 humano; número de acceso de RefSeq NP_110379,
HSPA14 humano; número de acceso de RefSeq NP_057383, HSPA9B humano;
número de acceso de RefSeq NP_005338, STCH humano; número de acceso
de RefSeq NP_008879, HYOU1 humano; número de acceso de RefSeq
NP_006380, HSPB5 humano; número de acceso de RefSeq NP_001876, HSPB2
humano; número de acceso de RefSeq NP_001532, DNAJA2 humano; número
de acceso de RefSeq NP_005871, DNAJB1 humano; número de acceso de
RefSeq NP_006136, DNAJB2 humano; número de acceso de RefSeq
NP_006727, HCG3 humano; número de acceso de RefSeq NP_001001394,
DNAJB11 humano; número de acceso de RefSeq NP_057390, DNAJC11
humano; número de acceso de RefSeq NP_060668, DNAJC7 humano; número
de acceso de RefSeq NP_003306, DNAJC6 humano; número de acceso de
RefSeq NP_055602) y un polipéptido que comprende una secuencia de
aminoácidos de las SEC ID Nº: 3, SEC ID Nº: 4, SEC ID Nº: 5, SEC ID
Nº: 6, SEC ID Nº: 7, SEC ID Nº: 8, SEC ID Nº: 9, SEC ID Nº: 10, SEC
ID Nº: 11, SEC ID Nº: 12, SEC ID Nº: 13, SEC ID Nº: 14, SEC ID Nº:
15, SEC ID Nº: 16, SEC ID Nº: 17, SEC ID Nº: 18, SEC ID Nº: 19, SEC
ID Nº: 20, SEC ID Nº: 21, SEC ID Nº: 22, SEC ID Nº: 23, SEC ID Nº:
24, SEC ID Nº: 25, SEC ID Nº: 26 y/o SEC ID Nº: 27 donde de 1 a 10
(preferiblemente de 1 a 7, más preferiblemente de 1 a 5, aún más
preferiblemente de 1 a 3) aminoácidos de las mismas están
delecionados, sustituidos y/o insertados y también se une a una
proteína reconociendo un cambio en la estructura terciaria de la
proteína o un polipéptido que comprende una secuencia de
aminoácidos que tiene una homología del 90% o más (preferiblemente
del 95% o más, más preferentemente del 98% o más) con la secuencia
de aminoácidos representada por las SEC ID Nº: 3, SEC ID Nº: 4, SEC
ID Nº: 5, SEC ID Nº: 6, SEC ID Nº: 7, SEC ID Nº: 8, SEC ID Nº: 9,
SEC ID Nº: 10, SEC ID Nº: 11, SEC ID Nº: 12, SEC ID Nº: 13, SEC ID
Nº: 14, SEC ID Nº: 15, SEC ID Nº: 16, SEC ID Nº: 17, SEC ID Nº: 18,
SEC ID Nº: 19, SEC ID Nº: 20, SEC ID Nº: 21, SEC ID Nº: 22, SEC ID
Nº: 23, SEC ID Nº: 24, SEC ID Nº: 25, SEC ID Nº: 26 y/o SEC ID Nº:
27 y también se une a una proteína reconociendo un cambio en la
estructura terciaria de la proteína. La expresión "se une a una
proteína reconociendo un cambio en la estructura terciaria de la
proteína" significa que la chaperona molecular se une a una
proteína respondiendo a un cambio en la estructura terciaria de la
proteína provocado por su unión con un agente a ensayar o la
chaperona molecular una vez unida a una proteína de estado no
cambiado se separa respondiendo a un cambio en la estructura
terciaria de la proteína provocado por su unión con un agente a
ensayar. Si la chaperona molecular se "une" o no respondiendo a
un cambio en la estructura terciaria de la proteína se puede
verificar del mismo modo que en el método para "detectar una
proteína que se une a una proteína de chaperona molecular" del
método de identificación. Particularmente, con respecto a la
variante funcionalmente equivalente y polipéptido homólogo de un
polipéptido que consiste en una secuencia de aminoácidos
representada por las SEC ID Nº: 3, SEC ID Nº: 4, SEC ID Nº: 5, SEC
ID Nº: 6, SEC ID Nº: 7, SEC ID Nº: 8, SEC ID Nº: 9, SEC ID Nº: 10,
SEC ID Nº: 11, SEC ID Nº: 12, SEC ID Nº: 13, SEC ID Nº: 14, SEC ID
Nº: 15, SEC ID Nº: 16, SEC ID Nº: 17, SEC ID Nº: 18, SEC ID Nº: 19,
SEC ID Nº: 20, SEC ID Nº: 21, SEC ID Nº: 22, SEC ID Nº: 23, SEC ID
Nº: 24, SEC ID Nº: 25, SEC ID Nº: 26 y/o SEC ID Nº: 27, se verifica
que "se une a una proteína reconociendo un cambio en la estructura
terciaria de la proteína" respondiendo a un cambio en la
estructura terciaria de la proteína ATP5B provocado por su unión a
biguanida (agente a ensayar), basándose en la separación de la
proteína de chaperona molecular una vez unida a la proteína ATP5B de
estado no cambiado respondiendo a un cambio en la estructura
terciaria de la proteína ATP5B provocado por su unión a biguanida.
Alternativamente, se verifica por la unión de la chaperona molecular
a una proteína respondiendo a un cambio en la estructura terciaria
de la proteína TARDBP provocado por su unión a talidomida (agente a
ensayar). Estas verificaciones se realizan en las condiciones del
Ejemplo 4 o del Ejemplo 8, usando una variante funcionalmente
equivalente o polipéptido
homólogo a examinar en lugar de la proteína de chaperona molecular usada en el Ejemplo 4 o el Ejemplo 8.
homólogo a examinar en lugar de la proteína de chaperona molecular usada en el Ejemplo 4 o el Ejemplo 8.
En el método de identificación entre las
proteínas de chaperona molecular, el uso de las proteínas
representadas por las SEC ID Nº: 3, SEC ID Nº: 4, SEC ID Nº: 5, SEC
ID Nº: 6, SEC ID Nº: 7, SEC ID Nº: 8, SEC ID Nº: 9, SEC ID Nº: 10,
SEC ID Nº: 11, SEC ID Nº: 12, SEC ID Nº: 13, SEC ID Nº: 14, SEC ID
Nº: 15, SEC ID Nº: 16, SEC ID Nº: 17, SEC ID Nº: 18, SEC ID Nº: 19,
SEC ID Nº: 20, SEC ID Nº: 21, SEC ID Nº: 22, SEC ID Nº: 23, SEC ID
Nº: 24, SEC ID Nº: 25, SEC ID Nº: 26 y/o SEC ID Nº: 27 es
particularmente deseable. Ya que estas proteínas pertenecen a las
respectivas familias que se han mencionado anteriormente de
diferentes chaperonas (Hsp90, Hsp70, Hsp60, Hsp40, HSP27, Hsp104 y
GRP78), se espera que cada una de las mismas tenga una propiedad
característica de cada familia de la proteína de chaperona
molecular.
\vskip1.000000\baselineskip
En el método de identificación se puede producir
de forma sencilla una proteína de chaperona molecular y obtener
mediante un medio de ingeniería genética y/o bioquímico general
usando un polinucleótido que codifica la proteína de chaperona
molecular. Dicho polinucleótido se puede producir de forma sencilla
y obtener mediante una técnica general de ingeniería genética
basándose en la información de secuencia descrita en esta
descripción o información de secuencia conocida de forma
convencional. Por ejemplo, se puede obtener del siguiente modo, pero
se puede obtener no solamente mediante este método, sino también
mediante operaciones conocidas de forma convencional ("Molecular
Cloning" [Sambrook, J. et al., Cold Spring Harbor
Laboratory Press, 1989 y similares]). Por ejemplo, se puede citar
(1) un método que usa PCR, (2) un método que usa una técnica
habitual de ingeniería genética (a saber, un método en el que se
selecciona un transformante que contiene el polipéptido deseado de
los transformantes transformados con una genoteca de ADNc) o (3) un
método de síntesis química. Se pueden realizar los respectivos
métodos de producción del mismo modo como se describe en el
documento WO 01/34785.
En el método que usa PCR, se puede producir un
polinucleótido que codifica una proteína de chaperona molecular,
por ejemplo, mediante el procedimiento descrito en el "Modo para
realizar la invención" 1) Método de producción de gen de
proteína, a) Primer método de producción, de la referencia de
patente que se ha mencionado anteriormente. Por ejemplo, se extrae
ARNm de hígado, cerebro, glándula mamaria o tejido similar humano. A
continuación se sintetiza una primera cadena de ADNc realizando una
reacción de transferasa inversa de este ARNm en presencia de
cebadores aleatorios o cebadores oligo (dT). Se puede obtener un
polinucleótido que codifica la proteína de chaperona molecular o
una parte de la misma sometiendo la primera cadena de ADNc obtenida
de este modo a una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) usando
dos cebadores que se interponen en una región parcial del gen de
interés. Más ilustrativamente, se puede producir un polinucleótido
que codifica una proteína de chaperona molecular mediante el método
descrito en el Ejemplo 1.
En el método que usa una técnica habitual de
ingeniería genética, se puede producir un polinucleótido que
codifica una proteína de chaperona molecular, por ejemplo, mediante
el procedimiento descrito en el "Modo para realizar la
invención" 1) Método de producción del gen de proteína, b)
Segundo método de producción de la referencia de patente que se ha
mencionado anteriormente.
En el método que usa un método de síntesis
química, se puede producir un polinucleótido que codifica una
proteína de chaperona molecular, por ejemplo, mediante el
procedimiento descrito en el "Modo para Realizar la Invención"
1) Método de producción de gen de proteína, c) Tercer método de
producción, d) Cuarto método de producción de la referencia de
patente que se ha mencionado anteriormente. Ilustrativamente, se
puede producir mediante métodos de síntesis peptídica en fase
líquida y fase sólida. La síntesis se puede realizar uniendo
sucesivamente aminoácidos uno por uno o sintetizando un fragmento
polipeptídico que consiste en varios aminoácidos y después uniendo
el mismo. El polipéptido de la presente invención obtenido por estos
medios se puede purificar de acuerdo con diversos métodos conocidos
de forma convencional. La mutación de la secuencia en ocasiones
tiene lugar mediante una mutación natural, pero también se puede
preparar realizando una modificación artificial. Con respecto a los
medios artificiales para preparar los mutantes que se han mencionado
anteriormente, además de las técnicas de ingeniería genética tales
como el método de sustitución específico de base (Methods in
Enzymology, (1987) 154, 350, 367 - 382) de un polinucleótido que
codifica el polipéptido que se ha mencionado anteriormente, por
ejemplo, se pueden citar el método de fosfotriéster, método de
fosfo-amidida y medios de síntesis química
similares (Science, 150, 178, 1968). Es posible obtener un
polinucleótido que acompaña a la sustitución de bases deseada por
su combinación. Alternativamente, es posible generar sustitución de
una base no específica en la molécula de polinucleótido repitiendo
la operación de PCR o añadiendo ión manganeso o similares a su
líquido de reacción.
La proteína de chaperona molecular se puede
expresar in vitro o en una célula a ensayar conectando el
polinucleótido que codifica proteína de chaperona molecular
obtenido como se ha descrito anteriormente cadena abajo de un
promotor apropiado por el método descrito en "Molecular Cloning,
Sambrook, J. et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press,
1989" o similares. Ilustrativamente, añadiendo un polinucleótido
que codifica una secuencia de promotor específica cadena arriba del
codón de inicio del polinucleótido obtenido como se ha descrito
anteriormente y usando esto como el molde, se puede realizar la
expresión de la proteína de chaperona molecular por transcripción y
traducción del gen en un sistema sin células. Alternativamente,
cuando el polinucleótido que codifica proteína de chaperona
molecular se integra en un plásmido vector apropiado y se transforma
una célula hospedadora por el plásmido, se posibilita la expresión
de dicho polipéptido. Todavía alternativamente, se puede preparar y
usar una célula en la que se integra una construcción de este tipo
en ADN cromosómico. Más ilustrativamente, cuando se integra de
nuevo un fragmento que contiene el polinucleótido aislado en un
plásmido de vector apropiado, puede transformar células
hospedadoras de eucariotas y procariotas. Además, cuando se
transfieren un promotor apropiado y una secuencia relacionada con
la expresión génica de estos vectores, se posibilita realizar la
expresión de la proteína de chaperona molecular en las respectivas
células hospedadoras. La célula hospedadora no está limitada
particularmente y puede ser cualquier célula que pueda realizar la
expresión de la proteína de chaperona molecular en una cantidad
suficiente para el propósito de aplicar al método de la presente
invención. Como la célula hospedadora se pueden citar, por ejemplo,
una célula COS de célula de mono (Gluzman, Y. (1981) Cell,
23,175-182), una cepa deficiente en deshidrofolato
reductasa de célula de ovario de hámster chino (CHO) (Urlaub, G. y
Chasin, L. A. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4216 - 4220),
célula HEK293 obtenida de riñón fetal humano y célula 293- EBNA en
la que se transfiere el gen EBNA-1 del virus de
Epstein Barr a la misma célula (fabricado por Invitrogen) y
similares.
El método para expresar un gen transformando una
célula hospedadora se puede realizar, por ejemplo, mediante el
método descrito en el método de producción de proteína recombinante
del "Modo para realizar la invención", 2) de la referencia de
patente que se ha mencionado anteriormente. El vector de expresión a
usar en la producción de una célula de expresión de chaperona
molecular (vector de expresión para expresión de chaperona
molecular) no está limitado particularmente, a condición de que
contenga el polinucleótido deseado. Por ejemplo, se puede citar un
vector de expresión obtenido insertando el polinucleótido de interés
en un vector de expresión conocido de forma convencional
seleccionado de forma opcional en respuesta a la célula hospedadora
a usar. Como el vector de expresión conocido de forma convencional
se pueden citar, por ejemplo, pSV2dhfr que tiene el promotor
temprano de SV40 (Subramani, S. et al. (1981) Mol. Cell.
Biol., 1, 854 - 864), pEF-BOS que tiene el promotor
de factor de elongación humano (Mizushima, S. y Nagata, S. (1990)
Nucleic Acids Res., 18, 5322), pCEP4 que tiene el promotor de
citomegalovirus (Invitrogen), pME18S (Maruyama, K. y Takebe, Y.
(1990) Med. Immunol., 20, 27 - 32), pCDM8 (Seed, B. (1987) Nature,
329, 840 - 842) y similares. La proteína de chaperona molecular se
puede obtener, por ejemplo, transformando una célula hospedadora
deseada con el vector de expresión que se ha mencionado
anteriormente y realizando la expresión del polipéptido que se ha
mencionado anteriormente en dicha célula. Más ilustrativamente,
integrando un polinucleótido deseado en un vector de expresión
bacteriano, se puede producir una proteína de chaperona molecular
deseada en células bacterianas en una gran cantidad. Además, la
proteína de chaperona molecular también se puede producir en una
gran cantidades usando levadura, una célula de insecto o similares.
Además, se puede producir una proteína de chaperona molecular
deseada in vitro mediante un método conocido de forma
convencional usando el polinucleótido que se ha mencionado
anteriormente unido cadena abajo de un cierto promotor. Más
ilustrativamente, se puede producir una proteína de chaperona
molecular deseada in vitro realizando reacciones de
transcripción y traducción in vitro usando, como el molde,
el polinucleótido que se ha mencionado anteriormente unido cadena
abajo del promotor que se ha mencionado anteriormente.
Mediante el cultivo de la célula que se ha
mencionado anteriormente, la proteína de chaperona molecular
producida en las células se pueden detectar, determinar y purificar
adicionalmente. Por ejemplo, es posible detectar y purificar dicha
proteína mediante transferencia de Western o inmunoprecipitación
usando un anticuerpo que se une a la proteína de chaperona
molecular. Alternativamente, expresando dicha proteína como una
proteína de fusión con una proteína marcadora apropiada tal como
glutatión-S-transferasa (GST),
proteína A, \beta-galactosidasa, proteína de
unión a maltosa (MBP), dicha proteína se puede detectar mediante
transferencia de Western o inmunoprecipitación usando un anticuerpo
específico para tal proteína marcadora. Además, la proteína que se
ha mencionado anteriormente se pueden purificar haciendo uso de
estas proteínas marcadoras. Más ilustrativamente, la proteína que se
ha mencionado anteriormente se puede purificar haciendo uso de una
proteína marcadora del siguiente modo. En el método, un
polinucleótido que codifica una proteína de chaperona molecular (por
ejemplo, un polipéptido representado por la SEC ID Nº: 3, 4, 5, 6,
7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23,
24, 25, 26 ó 27) se integra, por ejemplo, en un vector por lo que se
añade un marcador GST o marcador His a la proteína expresada de
interés, más ilustrativamente, el pGEX-6P1
(fabricado por Amersham) descrito en el Ejemplo 1 o un
PET-28a (Novagen) disponible en el mercado, por
ejemplo, y se transfiere a una bacteria y la proteína de chaperona
molecular se puede expresar de este modo como una proteína de tipo
fusión con GST en el caso de la primera y como una proteína de tipo
de fusión con His en el caso de la última. Dicho proteína de tipo
fusión se puede purificar de un extracto de proteína obtenido de la
célula bacteriana que expresa la proteína, haciendo uso de las
propiedades del marcador GST o His. Por ejemplo, cada uno de los
plásmidos de expresión de chaperona preparados en el Ejemplo 1
usando pGEX-6P1 se diseña de tal modo que se añade
el marcador GST al extremo N de la proteína de chaperona molecular.
De este modo, la proteína de chaperona molecular deseada se puede
purificar de una célula en la que dicha proteína se expresó,
haciendo uso del marcador GST. Más ilustrativamente, la proteína de
chaperona molecular fusionada con marcador GST se puede aislar de un
extracto de células rotas uniéndose a perlas de
glutatión-Sepharose (Glutathione Sepharose 4B;
Amersham) y centrifugando el mismo, de acuerdo con el método de
arrastre con GST conocido de forma convencional (N. Matsu et
al. Jikken Kogaku (Experimental Engineering), vol. 13, Nº 6,
página 528, 1994). Por otro lado, con respecto a la purificación de
una proteína de chaperona molecular deseada de una célula que
expresa dicha proteína haciendo uso el marcador His, la proteína de
chaperona molecular fusionada con el marcador His se puede aislar
de un extracto de células rotas uniéndose a
Ni^{2+}-NTA-Agarosa (fabricado por
Funakoshi) y centrifugando el mismo, de acuerdo con el método
conocido de forma convencional (Nakahara et al. Jikken Igaku
Bessatsu Tanpakushitsu no bunshikan sogo sayo jikkenho
(Experimental Medicine, supplement, Experimental methods of the
intermolecular interaction of protein), página 32, 1996).
Alternativamente, cuando la ocasión lo demande, la proteína de
chaperona molecular también se puede purificar mediante un método
que no usa una proteína marcadora, por ejemplo, mediante diversas
operaciones de separación haciendo uso de sus propiedades físicas y
propiedades químicas. Ilustrativamente se pueden ejemplificar la
aplicación de ultrafiltración, centrifugación, filtración en gel,
cromatografía de adsorción, cromatografía de intercambio iónico,
cromatografía de afinidad y cromatografía líquida de alto
rendimiento.
\vskip1.000000\baselineskip
Aunque no están limitados particularmente, los
ejemplos del agente a ensayar incluyen compuestos disponibles en el
mercado (incluyendo péptidos), diversos compuestos conocidos de
forma convencional (incluyendo péptidos) registrados en archivos
químicos, un grupo de compuestos obtenidos por las técnicas de
química de combinación (N. Terrett et al., Drug Discov.
Today, 4 (1): 41, 1999), sobrenadantes de cultivo microbiano,
componentes naturales procedentes de plantas y organismos marinos,
extractos de tejidos animales (incluyendo polinucleótidos y
péptidos) o los que son compuestos química o biológicamente
modificados de los mismos y que tienen distintas acciones
farmacológicas. No solamente las acciones deseables para
tratamientos médicos, sino también las acciones tóxicas para
organismos vivos se incluyen en las acciones farmacológicas.
\vskip1.000000\baselineskip
Se puede usar como extracto celular un líquido
obtenido extrayendo proteína de un tejido diana primario para el
uso en la inducción de la acción farmacológica que posee el agente a
ensayar o de una célula cultivada que mantiene la mayoría de las
propiedades de dicho tejido. Con respecto al método para extraer
proteína de una célula, es deseable usar un método de preparación
en respuesta al propósito. Ilustrativamente, de acuerdo con métodos
de extracción de proteína conocidos de forma convencional, se
selecciona una sustancia ajustada al propósito de SDS,
Triton-X, o CHAPS, CHAPSO y diversos tensioactivos
similares, la célula que se ha mencionado anteriormente se rompe y
se centrifuga usando un tampón que contiene la sustancia y después
se separa el sobrenadante y se recupera para usarse como el
extracto celular del método. Más ilustrativamente, es deseable que
estén contenidos inhibidores de diversas enzimas proteolíticas
procedentes de organismos vivos, tales como PMSF (fenilmetil
sulfonilfluoruro), EGTA (ácido
etilenglicol-bis(\beta-aminoetileter)-N,N,N',N'-tetraacético)
y similares, en el tampón a usar en la ruptura y es deseable
almacenar el mismo en una condición de -80ºC o menos que pueda
mantener de forma estable la proteína congelada hasta su aplicación
al método.
Se considera que cada proteína de chaperona
molecular responde a un gran número de proteínas de sustrato por
molécula. Sin embargo, se considera que la especificidad de sustrato
varía dependiendo de sus tipos. Por tanto, para explorar de forma
inclusiva verdaderamente dianas de compuestos que tienen diversas
estructuras, es deseable disponer proteínas de chaperona molecular
que pertenecen a una gran diversidad de diferentes familias y usar
las mismas simultáneamente como la sonda. Más preferiblemente, como
se muestra en el ejemplo 2 (3), 3, 4 y 8 de la presente invención,
es deseable disponer dos o más proteínas de chaperona molecular
procedentes de diferentes familias de chaperona y usar las mismas
simultáneamente. Además, en el caso de un sistema de ensayo
bioquímico, cuando la proteína a usar como la sonda (proteína de
chaperona molecular) está presente en un gran exceso en comparación
con la proteína a usar como el sustrato, la especificidad de
sustrato de la sonda disminuye, de tal forma que se puede esperar
que se reconozca incluso una proteína diferente de la proteína
original por la sonda cuando es una molécula análoga a dicho
sustrato. Por consiguiente, como el caso del método de arrastre
in vitro mostrado en el Ejemplo 2(2), el uso de un
sistema en el que se puede usar una gran cantidad de la proteína
sonda en la reacción, en comparación con la proteína procedente de
célula a usar como el sustrato, es más deseable para permitir la
exploración de diana inclusiva de compuestos. Además, se ha
descrito que muchas proteínas de chaperona molecular se someten a
sus acciones formando un polímero in vivo. Por consiguiente,
al realizar el método, es más deseable usar tal extracto de células
procedente de muestra de organismo vivo y condiciones de
separación, que una chaperona endógena capaz de formar un complejo
con la proteína de chaperona molecular (sonda) está presente en la
misma como una mezcla, como se muestra en los Ejemplos 2 (2) y 4.
Más ilustrativamente, es deseable usar un sistema en el que se
permita que una proteína de chaperona molecular (proteína de sonda)
reaccione con un extracto celular procedente de una célula que
contiene una chaperona endógena, como el método de arrastre in
vitro mostrado en el Ejemplo 2(2) de la presente
invención.
Para "detectar una proteína que se une a una
proteína de chaperona molecular", se realiza la siguiente
operación. Una proteína de chaperona molecular y una proteína que
se une a la proteína de chaperona molecular se pueden concentrar de
un extracto de célula de muestra extraído de una célula al que se
añadió o no se añadió un agente a ensayar o un extracto de célula
de muestra al que se añadió o no se añadió un agente a ensayar
mediante el método de inmunoprecipitación conocido de forma
convencional usando un anticuerpo de la proteína de chaperona
molecular o un anticuerpo de un marcador fusionado con la proteína
de chaperona molecular. Alternativamente, la proteína de chaperona
molecular y una proteína que se une a la proteína de chaperona
molecular también se pueden concentrar mediante un método conocido
de forma convencional que usa perlas de afinidad o columna de
afinidad que tiene afinidad por el marcador que se ha mencionado
anteriormente. Como un método ilustrativo, se puede ejemplificar un
método de arrastre con GST que usa el péptido purificado uniendo GST
o marcador similar. La proteína que se une a la proteína de
chaperona molecular se detecta separando el líquido concentrado de
proteína de chaperona molecular y su proteína de unión obtenida
anteriormente mediante un método de separación de proteína conocido
de forma convencional. Por ejemplo, después de separar las mismas
por electroforesis en gel de poliacrilamida, la proteína de
chaperona molecular y la proteína obtenida de célula de muestra
unida a la proteína de chaperona molecular se pueden detectar
mediante diversos métodos convencionales detectar proteínas
incluyendo métodos de tinción de proteína ya existentes, tales como
tinción con plata, tinción con Azul Brillante de Coomassie o
Tinción con Gel Negativo (Wako Pure Chemical Industries) ("Idensgi
Cloning no Tame no Tanpakushitsu Kozo Kaiseki (Protein Structure
Analysis for Gene Cloning)" Hisashi Hirano Tokio Kagaku Doujin
1993 pág. 37 - pág. 40). El método a usar no está limitado al
anterior método a condición de que pueda detectar la proteína. Con
respecto a las proteínas detectadas por el anterior método, se
comparan las proteínas que se unen a la proteína de chaperona
molecular en el caso de añadir y de no añadir al agente a ensayar.
Comparando ambos casos, se puede identificar una proteína obtenida
de célula de muestra cuya unión a la proteína de chaperona
molecular cambió en el momento de añadir o de no añadir el agente a
ensayar (a saber, la proteína diana del agente a ensayar). Como el
método para detectar y comparar un grupo de proteínas obtenidas de
células de muestra en el momento de añadir o de no añadir al agente
a ensayar se puede ejemplificar la electroforesis en gel de SDS
poliacrilamida conocida de forma convencional. En ese caso, se puede
realizar una comparación más precisa cuando se desarrolla por una
electroforesis bidimensional. Mediante la comparación de las bandas
desarrolladas por la electroforesis basándose en los resultados del
caso de la adición del agente a ensayar y los resultados del caso
de la no adición del agente a ensayar (a saber, comparando si existe
un caso en el que la cantidad de una banda aumenta solamente en el
momento de la adición del agente a ensayar o un caso en que la
cantidad de una banda aumenta solamente en el momento de la no
adición del agente a ensayar), se puede seleccionar una proteína
cuya cantidad de unión aumenta solamente en el momento de la adición
del agente a ensayar o cuya cantidad de unión disminuye solamente
en el momento de la adición del agente a ensayar. Como la proteína
cuya cantidad de unión aumenta solamente en el momento de la adición
del agente a ensayar o cuya cantidad de unión disminuye solamente
en el momento de la adición del agente a ensayar es deseable
seleccionar una proteína que se una solamente en el momento de la
adición del agente a ensayar o que no se una solamente en el
momento de la adición del agente a ensayar. Posteriormente, se
identifican las proteínas detectadas y seleccionadas mediante el
anterior método. Se determinan las secuencias de aminoácidos
presentes en sus moléculas mediante métodos de purificación de
proteína conocidos de forma convencional y métodos de identificación
de proteína (Schevchenko et al., Analytical Chemistry, vol.
68, pág. 850 - pág. 858, 1996) y basándose en esta información de
secuencia de aminoácidos se puede identificar una proteína cuya
unión con la proteína de chaperona molecular cambia en el momento
de la adición o de la no adición del agente a ensayar (a saber, una
proteína diana del agente a ensayar). Ilustrativamente, la proteína
diana del agente a ensayar se puede identificar recuperando y
purificando la proteína del gel y determinando después su secuencia
de aminoácidos mediante un método de espectro de masas o un método
conocido de forma convencional. Más ilustrativamente, la
identificación de la proteína se puede realizar mediante el análisis
de espectro de masas después de digerir la proteína de interés
separada por la electroforesis en gel de SDS poliacrilamida en
fragmentos usando tripsina o similares y recuperando la mezcla de
péptido formada de este modo del gel (Schevchenko, et al.,
Analytical Chemistry, vol. 68, pág. 850 - pág. 858, 1996).
Alternativamente, después de eluir la proteína de interés del gel
por un método de elución eléctrica o similares o después de
transferir la proteína de interés sobre el gel a una película de
PVDF (fluoruro de polivinilideno) o similares, se convierte en
fragmentos mediante una digestión con enzima o una digestión
enzimática como lo demande la ocasión y, cuando la ocasión lo
demande adicionalmente, los fragmentos peptídicos obtenidos de este
modo se separan por una cromatografía líquida, una electroforesis
capilar o similares y después se puede realizar la identificación de
la proteína mediante un análisis de espectro de masas o un análisis
de secuencia de aminoácidos N-terminal o
C-terminal (H. Hirano, Proteome Kaiseki - Riron to
Hoho - (Proteome Analysis - Theory and Method) Tokyo Kagaku Doujin,
2001). Más ilustrativamente, como se describe en el Ejemplo 4 y
Ejemplo 8, la identificación de la proteína diana separada por la
electroforesis en gel de SDS poliacrilamida se puede realizar
digiriendo la proteína hasta fragmentos usando tripsina o similares,
recuperando la mezcla de péptido formada de este modo del gel y
después realizando un análisis de espectro de masa.
Es posible verificar mediante las técnicas de
análisis de función génica conocidas de forma convencional que la
proteína diana identificada mediante el método es una proteína diana
verdadera que produce acciones farmacológicas del agente a ensayar.
En primer lugar, ilustrativamente, se puede examinar la presencia o
ausencia de unión directa entre el agente a ensayar y la molécula
de proteína diana obtenida de este modo mediante el método mostrado
a continuación. Una parte o la región de longitud completa de un
polipéptido a examinar con respecto a si se une o no al mismo o una
parte o la región de longitud completa de un polipéptido a examinar
al que se fusionó un marcador GST, Flag, His o similares se expresa
en una célula. El polipéptido expresado a examinar se aísla y
purifica de dicha célula mediante un método de purificación por
afinidad usando la afinidad por el marcador GST, Flag, His o
similares o mediante un método de inmunoprecipitación usando un
anticuerpo que responde a dicho marcador. Posteriormente, el
polipéptido purificado de este modo se mezcla con un agente a
ensayar y se aísla el complejo formado por la unión de dicho agente
a ensayar y el polipéptido. A continuación, mediante el examen de
si dicho agente a ensayar está contenido o no en la muestra
realizando un análisis de espectrometría de masas usando un
espectrómetro de masas, después de volver a separar los compuestos
desnaturalizando dicho complejo con un ácido, calor u otra
estimulación y eliminando de este modo la proteína sola, se puede
verificar la unión del péptido a examinar con dicho agente a
ensayar. Además, como otro método, se puede verificar si el
polipéptido a examinar y dicho agente a ensayar se unen entre sí o
no mediante ELISA conocido de forma convencional, transferencia de
Western, ensayo de unión y métodos similares usando, como la sonda,
un agente marcado a ensayar preparado marcando una parte de la
estructura molecular del agente a ensayar. Es deseable que se use
un radioisótopo que no ejerza influencia sobre la unión con la
proteína diana como el marcador del agente a ensayar.
Ilustrativamente, por ejemplo, se puede preparar un compuesto
marcado sustituyendo un elemento en la molécula del agente a
ensayar con un radioisótopo. Mediante el uso de dicho agente marcado
a ensayar como la sonda, se puede verificar la unión de un
polipéptido con dicho agente a ensayar mediante un método de ELISA
en el que el polipéptido a examinar purificado por el método que se
ha mencionado anteriormente se inmoviliza. Alternativamente,
después de separar el polipéptido a examinar mediante una
electroforesis en gel de SDS archilamida conocida de forma
convencional y transfiriendo el mismo a una película de
nitrocelulosa, también se puede verificar la unión de dicho
polipéptido con dicho agente a ensayar mediante un método de
Western con proteína (far western) usando el agente marcado que se
ha mencionado anteriormente a ensayar como la sonda. Además,
después de mezclar el agente marcado a ensayar con el polipéptido a
examinar purificado con el método que se ha mencionado
anteriormente y lavar los mismos por captura sobre un filtro, se
puede verificar la unión de dicho polipéptido con dicho agente a
ensayar mediante un denominado ensayo de unión en el que se detecta
la cantidad total del complejo formado de este modo del compuesto y
péptido midiendo la dosis de radiación obtenida de la sonda
marcada. Además, si está presente o no una estructura de cerradura
en la proteína diana identificada mediante el método de la presente
invención, a la que se puede unir dicho compuesto a ensayar,
mediante una técnica de predicción de estructura terciaria de
proteína conocida de forma convencional (J. Med. Chem., Dec. 30,
2004, 47 (27): 6804 -11). Además, la cantidad de expresión de la
proteína diana que se ha mencionado anteriormente se puede aumentar
o disminuir mediante diversos métodos de ensayo bioquímicos y/o de
ingeniería genética, tales como el ensayo de anulación de gen
conocido de forma convencional a nivel celular usando una técnica
de ARN de interferencia (Tuschl T. et al., Nat. Biotechnol.,
2002, 20 (5): págs. 446 - 448) y un ensayo de
sobre-expresión génica conocido de forma
convencional también a nivel celular, así como la preparación de un
animal knockout de gen o preparación de un animal que
sobre-expresa un gen y ya que el efecto de acelerar
o suprimir el efecto principal o un efecto secundario adverso se
encuentra cuando el efecto principal o el efecto secundario adverso
se ensaya en estas condiciones, se puede confirmar que una proteína
diana codificada por un gen cuya expresión cambió es la proteína
diana verdadera. Aunque el método de identificación puede
identificar la proteína diana de un agente a ensayar que produce
acción farmacológica del agente a ensayar, el método de
identificación es más adecuado como un método para identificar una
proteína diana que produce una acción farmacológica deseada (efecto
principal) entre las acciones farmacológicas del agente a
ensayar.
La herramienta de exploración consiste en lo
siguiente (1) a (3).
- (1)
- Una herramienta de exploración de agente para tratar diabetes que tiene la misma diana medicinal con biguanida (a denominar una herramienta de exploración de tipo polipéptido de la presente invención en lo sucesivo en este documento), que consiste en una proteína ATP5B humana (un polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID Nº: 2), una variante funcionalmente equivalente de ATP5B (un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID Nº: 2 o una secuencia de aminoácidos de la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID Nº: 2 en la que de 1 a 10 (preferiblemente de 1 a 7, más preferiblemente de 1 a 5, aún más preferiblemente de 1 a 3) aminoácidos de la misma están delecionados, sustituidos y/o insertados y también se une a biguanida y/o inhibe la activación de AMPK de biguanida por su sobre-expresión) y una proteína homóloga a ATP5B (un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una homología del 90% o más, preferiblemente del 95% o más, más preferiblemente del 98% o más) con la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID Nº: 2 y también se une a biguanida y/o inhibe la activación de AMPK de biguanida por su sobre-expresión) (a denominar polipéptido para uso de herramienta en lo sucesivo en este documento),
- (2)
- una herramienta de exploración de agente para tratar diabetes que tiene la misma diana medicinal con biguanida (a denominar herramienta de exploración de tipo polipéptido de la presente invención en lo sucesivo en este documento), que consiste en un polinucleótido que codifica el polipéptido para uso de herramienta (a denominar polinucleótido para uso de herramienta en lo sucesivo en este documento) o
- (3)
- una herramienta de exploración de agente para tratar diabetes que tiene la misma diana medicinal con biguanida (a denominar una herramienta de exploración de tipo celular de la presente invención en lo sucesivo en este documento), que consiste en una célula que se transforma con el polinucleótido para uso de herramienta y que expresa de este modo los polipéptidos para uso de herramienta (a denominar célula para uso de herramienta en lo sucesivo en este documento).
\vskip1.000000\baselineskip
El uso de
- (1)
- polipéptidos para uso de herramienta,
- (2)
- polinucleótidos para uso de herramienta o
- (3)
- célula para uso de herramienta para la exploración de un agente para tratar diabetes que tiene la misma diana medicinal con biguanida también se incluye en la presente invención.
\vskip1.000000\baselineskip
De acuerdo con esta descripción, la
"herramienta de exploración" significa una sustancia para el
uso en la exploración (ilustrativamente, el polipéptido,
polinucleótido o célula a usar en la exploración). La "herramienta
de exploración de un agente para tratar diabetes, que tiene la
misma diana medicinal con biguanida" es una célula o polipéptido
que se convierte en el objeto con el que se pone en contacto un
compuesto a ensayar o un polinucleótido para obtener o expresar un
polipéptido que se convierte en el objeto con el que se pone en
contacto un compuesto a ensayar para el uso en la exploración de un
agente para tratar diabetes que tiene la misma diana medicinal con
biguanida mediante el método de exploración de la presente
invención.
Los orígenes de la variante funcionalmente
equivalente de ATP5B y polipéptido homólogo de ATP5B no están
limitados al ser humano. A condición de que se incluya en uno
cualquiera de los polipéptidos para uso de herramienta, se incluyen
en los mismos no solamente los mutantes de la secuencia de
aminoácidos representada por la SEC ID Nº: 2 en ser humano, sino
también los obtenidos de todos los tipos de organismos que varían
desde un vertebrado hasta una bacteria y en los mismos se incluyen
no solamente los polipéptidos naturales, sino también los
polipéptidos modificados artificialmente mediante técnicas de
ingeniería genética basadas en la secuencia de aminoácidos
representada por la SEC ID Nº: 2. Además, a condición de que se una
a biguanida y/o inhiba la activación de AMPK de biguanida por su
sobre- expresión, un polipéptido en el que está contenida una
secuencia marcadora que se describe más adelante en la variante
funcionalmente equivalente de ATP5B o polipéptido homólogo de ATP5B
también se incluye en el polipéptido para uso de herramienta. En el
Ejemplo 5(5) y (6) que se describen más adelante, se puso de
manifiesto que los restos aminoacídicos relacionados en la
estructura periférica del sitio 20, particularmente, Glu 175 y Asp
295 en el caso de ATP5B humana, son importantes para la unión de
ATP5B con biguanida. Por consiguiente, cuando se introduce una
mutación, se puede producir de forma sencilla un polipéptido
modificado que mantiene su actividad de unirse con biguanida
conservando los restos aminoacídicos relacionados con la estructura
periférica del sitio 20, particularmente Glu 175 y Asp 295 en el
caso de ATP5B humana e introduciendo una mutación en una parte
diferente de ésta.
El polipéptido de ATP5B humana es más deseable
entre los polipéptidos para uso de herramienta, ya que la
herramienta de exploración de tipo polipéptido y un polinucleótido
que codifica polipéptido de ATP5B humana (particularmente
preferiblemente en polinucleótido representado por la secuencia de
nucleótidos de la SEC ID Nº: 1) entre los polinucleótidos para uso
de herramienta, como la herramienta de exploración de tipo
polinucleótido de la presente invención y una célula que se
transforma con un vector que comprende un polinucleótido que
codifica ATP5B humana y de este modo expresa ATP5B humana, entre
las células para uso de herramienta, como la herramienta de
exploración de tipo polinucleótido de la presente invención.
El polinucleótido para uso de herramienta se
puede producir de forma sencilla y obtener mediante técnicas de
ingeniería genética generales basándose en la información de
secuencia descrita en esta descripción o información de secuencia
génica conocida de forma convencional. Como tales técnicas, como se
describe en el <Método de producción de proteína de chaperona
molecular> que se ha mencionado anteriormente, se pueden citar
operaciones conocidas de forma convencional "Molecular
Cloning" [Sambrook, J. et al., Cold Spring Harbor
Laboratory Press, 1989 y similares], por ejemplo, (1) un método que
usa PCR, (2) un método que usa una técnica habitual de ingeniería
genética (a saber, un método en el que un transformante que contiene
el polipéptido deseado se selecciona de los transformantes
transformados con una genoteca de ADNc) o (3) un método de síntesis
química. Se pueden realizar los respectivos métodos de producción
del mismo modo que el descrito en el documento WO 01/34785.
En el método que usa PCR, se puede obtener un
polinucleótido para uso de herramienta o una parte del mismo, por
ejemplo, extrayendo ARNm de músculo esquelético, cerebro o tejido
humano similar y usando una primera cadena de ADNc del mismo modo
como el que se ha descrito en el <Método de producción de
proteína de chaperona molecular> que se ha mencionado
anteriormente sometiéndolo a PCR usando dos cebadores que se
interponen en una región parcial del polinucleótido para uso de
herramienta. Más ilustrativamente, el polinucleótido para uso de
herramienta se puede producir, por ejemplo, mediante el método
descrito en el ejemplo 5(1). También por el método que usa
una técnica habitual de ingeniería genética o el método que usa un
método de síntesis química, se puede producir el polinucleótido
para uso de herramienta del mismo modo como el que se describe en
el <Método de producción de proteína de chaperona molecular>
que se ha mencionado anteriormente.
Del mismo modo como se ha descrito en el
<Método de producción de proteína de chaperona molecular> que
se ha mencionado anteriormente, el polinucleótido para uso de
herramienta obtenido del anterior modo se puede expresar in
vitro o en una célula a ensayar conectando el polinucleótido
para uso de herramienta cadena abajo de un promotor apropiado
mediante un método conocido de forma convencional (por ejemplo, el
método descrito en "Molecular Cloning, Sambrook, J. et
al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989" o similares).
El vector de expresión a usar en la producción de la célula para
uso de herramienta (vector de expresión para uso de herramienta) no
está limitado particularmente, a condición de que comprenda el
polinucleótido para uso de herramienta. Por ejemplo, se puede citar
un vector de expresión preparado insertando el polinucleótido para
uso de herramienta en un vector de expresión conocido de forma
convencional seleccionado opcionalmente en respuesta a la célula
hospedadora a usar. El polipéptido para uso de herramienta se puede
obtener, por ejemplo, transformando una célula hospedadora deseada
con el vector de expresión para uso de herramienta y realizando la
expresión del polipéptido para uso de herramienta en dicha célula.
Más ilustrativamente, el polipéptido para uso de herramienta se
puede producir en una gran cantidad en una célula bacteriana
integrando el polinucleótido para uso de herramienta en un vector
de expresión bacteriano. Además, el polipéptido para uso de
herramienta se puede producir in vitro mediante un método
conocido de forma convencional usando el polinucleótido para uso de
herramienta unido cadena abajo de un promotor predeterminado. Más
ilustrativamente, como se describe en el ejemplo 5(4), el
polipéptido para uso de herramienta se puede producir in
vitro realizando reacciones de transcripción y traducción in
vitro usando, como el molde, el polinucleótido para uso de
herramienta que se ha mencionado anteriormente unido cadena abajo
de un promotor y usando el sistema TNT (fabricado por Promega).
La célula para uso de herramienta no está
limitada particularmente a condición de que se transforme con el
vector de expresión para uso de herramienta y comprenda el
polinucleótido para uso de herramienta, de tal forma que puede ser
una célula en la que se integra el polinucleótido para uso de
herramienta en el cromosoma de una célula hospedadora o una célula
que comprende el polinucleótido para uso de herramienta en forma de
un vector de expresión. Como la célula a usar en la transformación
es deseable una célula que responda a biguanida y, más
ilustrativamente, es deseable una célula HeLaS3, una célula obtenida
de hígado o una célula obtenida de músculo esquelético. Como la
célula para uso de herramienta, puede contener un polinucleótido que
comprende una secuencia marcadora que se describe más adelante, a
condición de que se incluya en el polinucleótido para uso de
herramienta. Como la herramienta de exploración de tipo celular de
acuerdo con esta descripción es deseable una célula transformada
con el vector de expresión para uso de herramienta.
La célula transformante deseada obtenida
anteriormente se puede cultivar de acuerdo con un método habitual y
el polipéptido para uso de herramienta se produce mediante dicho
cultivo. Como el medio a usar en dicho cultivo se pueden
seleccionar opcionalmente diversos medios usados de forma generada
en respuesta a la célula hospedadora empleada y, en el caso de la
célula que se ha mencionado anteriormente HeLaS3, por ejemplo, se
puede usar medio esencial mínimo de Eagle (MEM) modificado por
Dulbecco complementado con suero fetal bovino (FBS) o componente
sérico similar y similares.
Si la ocasión lo demanda, el polipéptido para
uso de herramienta producido del anterior modo se puede separar o
purificar mediante diversas operaciones de separación conocidas de
forma convencional usando las propiedades fisiológicas, propiedades
bioquímicas y similares de dicho polipéptido. Además, cuando está
contenida una secuencia marcadora (proteína con etiqueta) en el
polipéptido para uso de herramienta, es posible realizar la
conformación de expresión, purificación y similares de dicho
polipéptido usando la proteína marcadora. Los ejemplos de la
secuencia marcadora incluyen epítopo Flag, marcador
Hexa-Histidina, marcador Hemaglutinina, epítopo
myc, glutatión-S-transferasa (GST),
proteína A, \beta-galactosidasa, proteína de unión
a maltosa (MBP) y similares. Además, también es posible obtener el
polipéptido para uso de herramienta realizando la expresión de un
polipéptido de fusión en el que se inserta una secuencia de
aminoácidos específica que se puede reconocer por enterocinasa,
factor Xa, trombina y proteasas similares entre una secuencia
marcadora y el polipéptido para uso de herramienta, purificándolo
usando la proteína marcadora y después digiriendo y retirando el
resto de secuencia marcadora por estas
proteasas.
proteasas.
Más ilustrativamente, el polipéptido para uso de
herramienta se puede expresar, por ejemplo, usando un vector por el
que el marcador GST o marcador His se añade a la proteína de
interés, más ilustrativamente, un pGEX-6P1
(Amersham) o pET-28a (Novagen) disponible en el
mercado, por ejemplo, como una proteína de tipo fusión con GST en
el primer caso o una proteína de tipo fusión con His en el último
caso. Dichas proteínas de tipo fusión se pueden purificar de los
extractos de proteína obtenidos de las células bacterianas que las
expresan del mismo modo que se ha descrito en el <Método de
producción de proteína de chaperona molecular> que se ha
mencionado anteriormente usando las propiedades del marcador GST o
marcador His.
El "polipéptido que se une a biguanida" de
acuerdo con esta descripción significa un polipéptido que se une a
un compuesto de bajo peso molecular clasificado en biguanida
(metformina, fenformina, buformina o similares) y si el polipéptido
se "une" o no a biguanida se puede verificar mediante el
siguiente método.
Los polipéptidos a examinar con respecto a si se
unen o no al mismo se aíslan y purifican. La expresión de los
polipéptidos y su aislamiento y purificación se pueden realizar
usando los métodos que se han mencionado anteriormente.
Posteriormente, se verifica si se unen o no a fenformina mediante el
método del Ejemplo 5(4). Un polipéptido cuya unión a
fenformina en su concentración de adición de preferiblemente 10
\muM o menos, más preferiblemente 1,0 \muM o menos, aún más
preferiblemente 0,1 \muM o menos, se puede confirmar en las
condiciones de que dicho ejemplo se considere como un polipéptido
que se une a biguanida.
Además, la expresión "inhibe la activación de
AMPK de biguanida por su sobre-expresión"
significa que la activación de AMPK en una célula cuando se
estimula con biguanida en tal condición que un cierto polipéptido
está presente en la célula en una cantidad superior a la habitual,
a saber, grado de fosforilación, se reduce en comparación con las
células del estado habitual. Se puede verificar si "inhibe la
activación de AMPK" o no mediante el método del Ejemplo
5(7). Cuando el aumento en la fosforilación de AMPK por
estimulación con fenformina en una célula que
sobre-expresa el polipéptido a examinar se reduce en
un factor del 50%, preferiblemente del 79%, más preferiblemente del
90% en comparación con el control (una célula que no
sobre-expresa el polipéptido a examinar) en las
condiciones del Ejemplo 5(7), se considera que el polipéptido
a examinar es un polipéptido que inhibe la activación de AMPK de
biguanida por su sobre-expresión.
\vskip1.000000\baselineskip
Los inventores han observado que cuando se
sobre-expresa ATP5B humana (SEC ID Nº: 2) como uno
de los polipéptidos para uso de herramienta en células HeLaS3, se
inhibe la activación de AMPK en dicha célula por tratamiento con
fenformina, metformina o biguanida o similares (Ejemplo
5(7)). Esto significa que la capacidad de activación de AMPK
que contribuye al efecto farmacológico de biguanida cambia mediante
el cambio de la cantidad de proteína ATP5B que existe en la célula
y muestra que ATP5B evidentemente está colocada cadena arriba de
AMPK en términos de la señal intracelular de biguanida. Además, los
inventores han observado que ATP5B se une bioquímicamente a
fenformina como una especie de biguanida (Ejemplo 5(4)).
Basándose en estos hallazgos, se puede concluir que ATP5B es una
proteína diana verdadera que se une a biguanida y contribuye al
efecto farmacológico (efecto principal) de dicho compuesto. De
acuerdo con dichos hallazgos, los inventores han puesto de
manifiesto que recientemente se puede obtener un compuesto capaz de
mostrar un efecto farmacológico similar al efecto de tratamiento de
diabetes de biguanida realizando la exploración de un compuesto de
bajo peso molecular que activa AMPK y, de este modo, han conseguido
un método de exploración de un agente para tratar diabetes.
Los siguientes métodos se incluyen en el método
de exploración de la presente invención. Un método para explorar un
agente para tratar diabetes, que comprende
- [1]
- una etapa de permitir que (1) un polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID Nº: 2, (2) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID Nº: 2 o una secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 2 en la que de 1 a 10 aminoácidos de la misma están delecionados, sustituidos y/o insertados y que también se une a biguanida y/o inhibe la activación de AMPK por biguanida debido a sobre-expresión, (3) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad del 90% o más con la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID Nº: 2 y que también se une a biguanida y/o inhibe la activación de AMPK por biguanida debido a sobre-expresión o (4) una célula transformada con un vector que comprende un polinucleótido que codifica el polipéptido descrito en (1) a (3) esté en contacto con una sustancia a ensayar en coexistencia de biguanida y
- [2]
- una etapa de analizar la unión de dicho polipéptido con la sustancia a ensayar.
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La "exploración" de acuerdo con esta
descripción de la exploración de una sustancia que tiene la
actividad de interés de un gran número de sustancias a ensayar y la
detección de si la sustancia es o no una sustancia que tiene la
propiedad de interés.
El método de exploración de la presente
invención que comprende una etapa de permitir que un polipéptido
para uso de herramienta y una sustancia a ensayar estén en contacto
entre sí en coexistencia de biguanida se puede conseguir midiendo,
en la etapa de detectar la unión del polipéptido para uso de
herramienta y biguanida por un método de ELISA, método de
transferencia de western con proteína, un ensayo de unión o
similares usando una biguanida marcada o modificada y dicho
polipéptido, un cambio en dicha unión que tiene lugar cuando se
permite que esté presente al mismo tiempo una sustancia a ensayar.
Ilustrativamente, se usan diversos medios experimentales
ejemplificados a continuación. Un polipéptido para uso de
herramienta se expresa en una célula. El polipéptido para uso de
herramienta expresado se aísla y purifica de dicha célula mediante
un método de purificación por afinidad usando su afinidad por un
marcador o un método de inmunoprecipitación o similares usando un
anticuerpo que responde al polipéptido para uso de herramienta (por
ejemplo, un anticuerpo anti-ATP5B o un anticuerpo
de marcador). Posteriormente, el polipéptido purificado se mezcla
con una sustancia a ensayar y biguanida y el complejo formado de
este modo se aísla. A continuación, la sustancia a ensayar y
biguanida se vuelven a separar desnaturalizando dicho complejo con
un ácido, calor u otra estimulación, la proteína remanente sola se
retira y después se examina si la unión del polipéptido para uso de
herramienta y biguanida se inhibe por la sustancia a ensayar o no
examinando si un compuesto de biguanida correspondiente está
contenido o no en la misma muestra mediante el análisis de
espectrometría de masas usando un espectrómetro de masas. Además,
como otro medio, se puede verificar la unión del polipéptido para
uso de herramienta y biguanida mediante un método de ELISA conocido
de forma convencional, método de transferencia de western con
proteína, ensayo de unión o método similar usando, como la sonda,
una biguanida marcada preparada marcando una parte de su estructura
molecular. Ilustrativamente, por ejemplo, se prepara un compuesto
marcado sustituyendo un elemento en la molécula de biguanida con un
radioisótopo. Usando dicha biguanida marcada como la sonda, se
verifica la unión del polipéptido para uso de herramienta
purificado y biguanida mediante dicho método ELISA con péptido
inmovilizado. Alternativamente, se separan los polipéptidos para uso
de herramienta mediante electroforesis en gel de SDS acrilamida
conocida de forma convencional y se transfieren a una película de
nitrocelulosa y después también se verifica la unión de dicho
polipéptido con biguanida mediante el método de transferencia de
western con proteína que usa la biguanida marcada que se ha
mencionado anteriormente como la sonda. También alternativamente se
verifica la unión de un polipéptido para uso de herramienta y
biguanida mediante un denominado ensayo de unión en el que se
mezclan biguanida marcada y polipéptido para uso de herramienta
purificado y se lavan por captura sobre un filtro y después se
detecta la cantidad total del complejo formado del compuesto y
péptido midiendo la dosis de radiación obtenida de la sonda marcada.
El marcado de biguanida no se limita a un radioisótopo y es posible
conseguir el propósito modificando una parte de su estructura
molecular en tal intervalo que no ejerza influencias sobre sus
actividades farmacológicas. Por ejemplo, se puede marcar
modificando por la biotinilación de una parte de la estructura
molecular de fenformina, metformina o buformina. Además, en este
caso, la unión del polipéptido para uso de herramienta y biguanida
se verifica mediante el método de ELISA o de transferencia de
western con proteína del mismo modo como se ha descrito
anteriormente con el uso de biotina y avidina y mediante el uso de
anticuerpo marcado con avidina o similares. Preferiblemente se
verifica la unión del polipéptido para uso de herramienta y
biguanida mediante el método del Ejemplo 5(4). En la etapa
que se ha mencionado anteriormente de verificar la unión del
polipéptido para uso de herramienta y biguanida, se examina si la
unión de dicho polipéptido y biguanida está inhibida o no en
presencia de una sustancia a ensayar junto con biguanida. Cuando la
concentración de biguanida es 10 \muM, se selecciona una
sustancia que tenga un valor de CI_{50} de preferiblemente 10
\muM o menos, más preferiblemente una sustancia de 1 \muM o
menos, aún más preferiblemente una sustancia a ensayar de 0,1 \muM
o menos, como un agente para tratar diabetes. Cuando la unión del
polipéptido para uso de herramienta y biguanida se obstruye por la
presencia de una sustancia específica a ensayar, se puede considerar
que este fenómeno es el resultado de la inhibición competitiva de
la unión de biguanida y dicho polipéptido provocada por la unión de
dicha sustancia a ensayar al sitio de unión de biguanida en la
molécula del polipéptido para uso de herramienta. Con respecto a la
verificación de que es evidentemente inhibición de unión competitiva
por la sustancia a ensayar, se puede verificar mediante el examen
de la obstrucción gradual de biguanida a unir a dicho polipéptido,
realizando el cambio gradual de la proporción de concentraciones de
la biguanida y sustancia a ensayar a estar presente al mismo
tiempo. Mediante el mismo método se puede seleccionar una sustancia
que se una al polipéptido para uso de herramienta en competición
con biguanida (a saber, un agente para tratar diabetes). Más
ilustrativamente, se puede seleccionar una sustancia que se una al
polipéptido para uso de herramienta, por ejemplo, mediante el
método mostrado en el Ejemplo 6, que se describe más adelante.
El método de exploración de la presente
invención, que comprende una etapa de permitir que una célula para
uso de herramienta y una sustancia a ensayar estén en contacto entre
sí, es un método en el que se permite que una célula para uso de
herramienta y una sustancia a ensayar estén en contacto entre sí
mezclando las mismas (una etapa de puesta en contacto), una
sustancia que se une directamente a dicho polipéptido y actúa sobre
el mismo (a saber, un agente para tratar diabetes) se analiza
identificando, mediante una espectrometría de masas, los compuestos
separados desnaturalizando un complejo formado por la unión de dicha
sustancia a ensayar y polipéptido después de su aislamiento (una
etapa de analizar la unión) y después se selecciona una sustancia
que se une al polipéptido para uso de herramienta (a saber, un
agente para tratar diabetes). Como el método para analizar la unión
se puede usar el método AS-MS que se ha mencionado
anteriormente y similares. Ilustrativamente, se puede realizar, por
ejemplo, del siguiente modo. En primer lugar, se deja que una célula
para uso de herramienta en la que se expresa un polipéptido para
uso de herramienta transformando una célula con un vector que
comprende el polipéptido para uso de herramienta esté en contacto
con una sustancia a ensayar. Un complejo del polipéptido para uso
de herramienta y la sustancia a ensayar que se une al mismo se
concentra de la célula que se ha mencionado anteriormente mediante
un método de purificación por afinidad usando su afinidad por
marcador GST, Flag, His o similares o un método de
inmunoprecipitación o similares usando un anticuerpo que responde
al polipéptido para uso de herramienta (por ejemplo, un anticuerpo
anti-ATP5B o un anticuerpo de marcador). Es
deseable que se contenga la misma sustancia a ensayar usada
anteriormente para tratar la célula en el líquido de reacción de
esta etapa de concentración. Las sustancias que no se unen a dicho
polipéptido se eliminan por una resina de adsorción de compuesto de
bajo peso molecular o similares y después, la sustancia de bajo
peso molecular en el complejo se separa desnaturalizando el complejo
obtenido de este modo del polipéptido para uso de herramienta y la
sustancia a ensayar que se une al mismo con un ácido, calor u otra
estimulación y se elimina la proteína remanente sola. Se selecciona
una sustancia que se une al polipéptido para uso de herramienta de
sustancias a ensayar identificando las sustancias contenidas en la
misma muestra mediante el análisis de espectrometría de masas usando
un espectrómetro de masas. Ilustrativamente, en una condición de 1
\muM en concentración de la sustancia de ensayo a añadir, se
selecciona una sustancia que tenga preferiblemente el 5% o más, más
preferiblemente el 10% o más, aún más preferiblemente el 50% o más,
como la cantidad total de dichas sustancias recuperadas a ensayar,
en comparación con el control que no pasa por la etapa de adherirse
y eliminar las sustancias a ensayar, como la sustancia que se une al
polipéptido para uso de herramienta.
Permitiendo que se pongan en contacto una célula
para uso de herramienta y una sustancia a ensayar entre sí en
coexistencia de biguanida se puede examinar si la unión del
polipéptido para uso de herramienta y biguanida está inhibida
competitivamente o no por dicha sustancia a ensayar y la sustancia a
ensayar y el polipéptido para uso de herramienta están unidas entre
sí. Ilustrativamente, un complejo del polipéptido de la presente
invención y la biguanida que se une al mismo se concentra de una
célula en coexistencia de biguanida mediante el mismo proceso del
<Método de exploración de ensayo de unión que usa una célula para
uso de herramienta> que se ha mencionado anteriormente.
Posteriormente, se analiza la unión del polipéptido para uso de
herramienta y una sustancia a ensayar. El análisis de la unión se
puede realizar mediante el mismo método descrito en el <Método
de exploración de inhibición competitiva que usa un polipéptido para
uso de herramienta> que se ha mencionado anteriormente. Por
ejemplo, en el caso del uso de biguanida modificada con un marcador
o similares, se puede realizar determinando la unión del polipéptido
para uso de herramienta y biguanida usando el ensayo de unión
conocido de forma convencional o método similar. Cuando la unión del
polipéptido para uso de herramienta y biguanida estaba obstruida
por la presencia de una sustancia a ensayar, se puede considerar
que la unión de biguanida y el polipéptido para uso de herramienta
estaba inhibida competitivamente por la sustancia a ensayar y el
polipéptido para uso de herramienta y la sustancia a ensayar estaban
unidos entre sí.
Es deseable que el método de exploración de la
presente invención comprenda además una etapa, después de analizar
la unión del polipéptido para uso de herramienta y una sustancia a
ensayar y seleccionar la sustancia que se une al polipéptido para
uso de herramienta, de verificar la activación de AMPK por la
sustancia seleccionada a ensayar y/o un etapa de verificar su
posesión de actividad para tratar diabetes.
La etapa de verificar la activación de AMPK por
la sustancia seleccionada se puede realizar, por ejemplo, del
siguiente modo. Se cultiva una célula que expresa el polipéptido
para uso de herramienta (por ejemplo, célula HeLaS3) después de
añadir una sustancia a ensayar o un control de vehículo a la misma.
Usando un lisado celular preparado lisando las células cultivadas
se detecta el nivel de fosforilación (a saber, el nivel de
activación) de AMPK intracelular mediante electroforesis de SDS
conocida de forma convencional y transferencia de Western que usa
un anticuerpo anti-AMPK con fosforilación (por
ejemplo, anticuerpo de
fosfo-AMPK-\alpha (Thr 172)
fabricado por Daiichi Pure Chemicals. Preferiblemente, se puede
verificar la activación de AMPK por la sustancia seleccionada
mediante el método del Ejemplo 5(7). Mediante la comparación
con el control se selecciona una sustancia que acelera la
fosforilación de AMPK como una sustancia que activa AMPK. Como la
sustancia que acelera la fosforilación de AMPK se selecciona una
sustancia que acelera la fosforilación de AMPK en un factor del
50%, preferiblemente del 70%, más preferiblemente del 90% o más, en
comparación con el control.
Como la etapa de verificar la posesión de
actividad para tratar diabetes por la sustancia seleccionada se
puede ilustrar una etapa de realizar un método de evaluación
conocido de forma convencional, por ejemplo, un método para
analizar el efecto para tratar diabetes de una sustancia
seleccionada como se muestra a continuación. La presencia o
ausencia del efecto para tratar diabetes se determina administrando
continuamente un compuesto seleccionado por el método de
exploración de la presente invención a un animal de modelo de
diabetes y verificando su acción hipoglucemiante a demanda de
acuerdo con el modo habitual o realizando la verificación de la
acción supresora de la hiperglucemia después del ensayo de
tolerancia a glucosa oral. Alternativamente, su analiza su efecto
para tratar diabetes de tipo II midiendo la resistencia a insulina
del ser humano y usando la mejora del valor como el índice. La
resistencia a insulina en el ser humano se mide principalmente
mediante dos métodos. Uno es medir el nivel de glucosa en sangre y
la concentración de insulina después del ayuno y el otro es un
método denominado ensayo de tolerancia a glucosa, en el que se
administra por vía oral un líquido con glucosa y se comprueba su
proporción de aclaramiento del torrente sanguíneo. Además, se puede
ejemplificar un método de pinzamiento hiperinsulinémico euglucémico
como un método más preciso. Este método se basa en la teoría de que
la insulina y la glucosa en sangre se mantienen en ciertas
concentraciones y mide periódicamente la cantidad total del líquido
con glucosa administrado y la concentración de insulina usada para
su metabolismo ("Tonyobyo (Diabetes)" O. Nakagawa 1999 vol. 42
(2): páginas 111 -113). La posesión de actividad para tratar
diabetes por la sustancia seleccionada se puede verificar
preferiblemente mediante el método descrito en el Ejemplo 7.
Aunque no se limitan particularmente, los
ejemplos de la sustancia de ensayo a usar en el método de
exploración de la presente invención incluyen compuestos
disponibles en el mercado (incluyendo péptidos), diversos compuestos
conocidos de forma convencional (incluyendo péptidos) registrados
en archivos químicos, un grupo de compuestos obtenidos por las
técnicas de química de combinación (N. Terrett et al., Drug
Discov. Today, 4(1): 41, 1999), sobrenadantes de cultivo
microbiano, componentes naturales obtenidos de plantas y organismos
marinos, extractos de tejidos animales o compuestos (incluyendo
péptidos) preparados modificando química o biológicamente compuestos
(incluyendo péptidos) seleccionados por el método de exploración de
la presente invención.
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Una composición farmacéutica para el uso en el
tratamiento de la diabetes puede comprender una sustancia obtenida
mediante el método de exploración de la presente invención [por
ejemplo, ADN, una proteína (incluyendo anticuerpo o fragmento de
anticuerpo), un péptido o un compuesto diferente de eso] como el
ingrediente activo. Además, un método para tratar diabetes puede
comprender administrar una sustancia obtenida mediante el método de
exploración de la presente invención a una dosis eficaz a un objeto
que requiere tratamiento de diabetes. Además, se puede usar una
sustancia obtenida mediante el método de exploración de la presente
invención para producir una composición farmacéutica para el uso en
el tratamiento de diabetes. El ingrediente activo en la composición
farmacéutica se puede seleccionar mediante el método de exploración
de la presente invención. Como el compuesto seleccionado por el
método de exploración de la presente invención se puede ilustrar el
2-[(E)-(1H-1,2,4-triazol-3-ilimino)metil]fenol
y
6-cloro-9H-purina-2-amina
descritos en los Ejemplos 6(2) y 7, que se describen más
adelante. En este contexto, se puede realizar la verificación de la
presencia del efecto para tratar diabetes usando un método
convencional conocido por los expertos en la materia o un método
modificado del mismo (compárese, la "etapa de verificar que la
sustancia seleccionada tiene actividad para tratar diabetes" que
se ha mencionado anteriormente). Las preparaciones farmacéuticas
para el uso en el tratamiento de diabetes, que comprenden una
sustancia obtenida por el método de exploración de la presente
invención [por ejemplo, ADN, proteína (incluyendo anticuerpo o
fragmento de anticuerpo), un péptido o un compuesto diferente de
eso] como el ingrediente activo se pueden preparar como
composiciones farmacéuticas en respuesta al tipo del ingrediente
activo que se ha mencionado anteriormente, usando vehículos, cargas
y/u otros agentes aditivos farmacológicamente aceptables que se usan
generalmente para preparar las mismas. Como la administración, se
puede ilustrar la administración oral por comprimidos, píldoras,
cápsulas, gránulos, polvo muy fino, polvos, soluciones para uso oral
o similares o administración parenteral mediante inyecciones para
inyección intravenosa, inyección intramuscular, inyección
intra-articular o similares, supositorios,
preparaciones para administración percutánea, preparaciones para
administración a través de la mucosa o similares. Particularmente en
el caso de péptidos que se digieren en el estómago es deseable la
inyección intravenosa o la administración parenteral similar. En la
composición sólida para uso en la administración oral se pueden
mezclar una o más sustancias activas con al menos un diluyente
inerte tal como lactosa, manitol, glucosa, celulosa microcristalina,
hidroxipropilcelulosa, almidón, polivinilpirrolidona, silicato de
magnesio de aluminio o similares. De acuerdo con el modo habitual,
la composición que se ha mencionado anteriormente puede contener
otros aditivos diferentes del diluyente inerte, tales como un
lubricante, un agente disgregante, un agente estabilizante, un
agente solubilizante o de ayuda a la solubilización o similares.
Cuando la ocasión lo demande se pueden recubrir los comprimidos o
las píldoras con un recubrimiento de azúcar o con una película de
una sustancia gástrica o enteral o similares. La composición líquida
para administración oral puede incluir emulsiones, soluciones,
suspensiones, jarabes, elixires o similares y puede contener un
diluyente inerte usado de forma general tal como agua purificada o
etanol. Además del diluyente inerte, la composición que se ha
mencionado anteriormente puede contener otro agente aditivo tal como
un agente humectante, un agente de suspensión, un edulcorante, un
agente aromático o un antiséptico. Las inyecciones para
administración parenteral pueden incluir soluciones acuosas o no
acuosas asépticas, suspensiones o emulsiones. Las soluciones o
suspensiones acuosas pueden incluir agua destilada para inyección,
solución salina fisiológica o similares como un diluyente. Las
soluciones y suspensiones no acuosas pueden incluir propilenglicol,
polietilenglicol, un aceite vegetal (por ejemplo, aceite de oliva),
un alcohol (por ejemplo, etanol), polisorbato 80 o similares como
el diluyente. La composición que se ha mencionado anteriormente
puede contener además un agente humectante, un agente emulsionante,
un agente dispersante, un agente estabilizante, un agente
solubilizante o de ayuda a la solubilización, un antiséptico o
similares. Las composiciones que se han mencionado anteriormente se
pueden esterilizar mediante filtración a través de un filtro de
retención de bacterias, combinando un germicida o irradiación.
Alternativamente, se pueden usar produciendo en primer lugar
composiciones sólidas estériles y disolviendo las mismas en agua
estéril u otro medio estéril para inyección antes de su uso. La
dosis se puede decidir opcionalmente teniendo en cuenta la potencia
de la actividad de la sustancia obtenida por el método de
exploración de la presente invención, síntomas, edad, sexo y
similares de cada objeto al que realizar la administración. Por
ejemplo, en el caso de la administración oral, la dosis generalmente
es de aproximadamente 0,1 a 100 mg, preferiblemente de 0,1 a 50 mg
por día por adulto (60 kg en peso corporal). En el caso de la
administración parenteral en forma de inyecciones, es de 0,01 a 50
mg, preferiblemente de 0,01 a 10 mg.
A continuación se describe la presente invención
con detalle basándose en los ejemplos, pero la presente invención
no está restringida por dichos ejemplos. En este contexto, a menos
que se indique de otro modo, se pueden realizar de acuerdo con los
métodos conocidos de forma convencional ("Molecular Cloning"
Sambrook, J. et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press,
1989 y similares). Además, cuando se usan reactivos y kits
disponibles en el mercado se pueden realizar de acuerdo con las
instrucciones adjuntas a los artículos en el mercado.
Usando oligonucleótidos representados por las
SEC ID Nº: 28 a 77 (números pares para el lado 5', números impares
para el lado 3') como cebadores (por ejemplo, un conjunto de cebador
para HSPA1A humano por la SEC ID Nº: 28 y la SEC ID Nº: 29, lo
mismo se debe aplicar en lo sucesivo en este documento), se
prepararon secuencias de ADNc que codifican las regiones de
longitud completa de 25 especies de proteínas de chaperona (HSPA1A
humano, HSPH1 humano, HSPCA humano, HSPD1 humano, DNAJA1 humano,
HSPB1 humano, HSPE1 humano, HSPA4 humano, HSP90B1 humano, CCT6B
humano, TCP1 humano, HSPA14 humano, HSPA9B humano, STCH humano,
HYOU1 humano, HSPB5 humano, HSPB2 humano, DNAJA2 humano, DNAJB1
humano, DNAJB2 humano, HCG3 humano, DNAJB11 humano, DNAJC11 humano,
DNAJC7 humano, DNAJC6 humano), representadas por las secuencias de
aminoácidos de la SEC ID Nº: 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13,
14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 ó 27 realizando
PCR usando una ADN polimerasa (Pyrobest DNA polymerase, Takara
Shuzo) en condiciones de 3 minutos de reacción de desnaturalización
térmica a 95ºC, 35 repeticiones posteriores de un ciclo que
consiste en 10 segundos a 98ºC, 30 segundos a 60ºC y 1 minuto y 30
segundos a 74ºC y calentamiento final a 74ºC durante 7 minutos,
usando los moldes respectivos; una genoteca de ADNc obtenida de
hígado humano (Clontech) para HSPH1, HSPE1, HSP90B1, HSPA9B y
DNAJC11, una genoteca de ADNc obtenida de cerebro humano (Clontech)
para HSPCA, HSPA1A y HSPD1, una genoteca de ADNc obtenida de célula
HeLa (Clontech) para DNAJA1 y HSPA4, una genoteca de ADNc obtenida
de glándula mamaria humana (Clontech) para HSPB1, una genoteca de
ADNc obtenida de músculo esquelético humano (Clontech) para TCP1,
HSPA14, HYOU1 y HSPB2 y muestras de ADNc disponibles en el mercado
(Ultimate TM ORF Clones, lnvitrogen) para CCT6B, STCH, HSPB5,
DNAJA2, DNAJB1, DNAJB2, HCG3, DNAJB11, DNAJC7 humano y DNAJC6
humano. Se obtuvieron los fragmentos de ADN formados de este modo
de aproximadamente 2,58 kpb (HSPH1), 2,2 kpb (HSPCA), 1,93 kpb
(HSPA1A), 1,72 kpb (HSPD1), 1,19 kpb (DNAJA1), 0,62 kpb (HSPB1),
0,3 kpb (HSPE1), 2,52 kpb (HSPA4), 2,41 kpb (HSP90B1), 2,04 kpb
(HSPA9B), 1,69 kpb (DNAJC11), 1,67 kpb (TCP1), 1,05 kpb (HSPA14),
3,0 kpb (HYOU1), 0,53 kpb (HSPB2), 1,59 kpb (CCT6B), 1,42 kpb
(STCH), 0,53 kpb (HSPB5), 1,24 kpb (DNAJA2), 1,02 kpb (DNAJB1), 0,98
kpb (DNAJB2), 0,44 kpb (HCG3), 1,077 kpb (DNAJB11), 1,46 kbp
(DNAJC7 humano) y 2,74 kbp (DNAJC6). De las secuencias contenidas
en los cebadores, cada una de las muestras de ADNc se diseñó de tal
modo que se añaden los siguientes sitios de enzima de restricción a
ambos extremos de las mismas, se añaden el sitio BglII y
XhoI en el caso del ADNc de HSPH1 y el sitio EcoRV y
sitio NotI en el caso del ADNc de HSPA4, el sitio
EcoRI y sitio XhoI en el caso del ADNc de STCH,
HSPB5, DNAJC6 y DNAJC11, el sitio BglII y sitio NotI
en el caso del ADNc de TCP1 y el sitio BamHI y sitio
NotI en el caso de ADNc de DNAJA2. En el caso de otras
moléculas de ADNc, se diseñaron de tal forma que se añaden el sitio
BglII y el sitio XhoI. Para insertar estas moléculas
de ADNc en un vector de expresión de fusión con GST
pGEX-6P-1 (Amersham Bioscience),
cada uno de los fragmentos de ADNc obtenidos mediante la reacción
de PCR que se ha mencionado anteriormente se digirieron
respectivamente en los sitios de enzima de restricción añadidos
respectivamente. 1) En el caso del ADNc digerido con BamHI (o
BglII) y XhoI, el vector se usó preparando el mismo
en una forma lineal mediante su digestión con las enzimas de
restricción BamHI y XhoI y 2) en el caso del ADNc
digerido con las enzimas de restricción EcoRV y NotI,
el vector se usó tratando el mismo con las enzimas de restricción
SmaI y NotI, 3) en el caso del fragmento de ADNc
digerido con las enzimas de restricción EcoRI y XhoI,
el vector se usó tratando el mismo con las enzimas de restricción
EcoRI y XhoI y 4) en el caso del fragmento de ADNc
digerido con las enzimas de restricción BamHI y NotI,
el vector se usó tratando el mismo con las enzimas de restricción
BamHI y NotI, respectivamente. Una mezcla de cada uno
de los fragmentos de ADNc de chaperona tratados con enzima de
restricción y el vector se mezcló con un líquido de ADN ligasa (kit
de ligación de ADN II; Takara Shuzo) y se trató a 16ºC durante 3
horas, preparando de este modo un plásmido en el cual cada ADNc de
chaperona se insertó en el sitio de clonación múltiple de
pGEX-6P-1. Realizando la
determinación de las secuencias de nucleótidos usando el
oligonucleótido mostrado en la SEC ID Nº: 86 como el cebador y
usando un kit de secuenciación (Applied Biosystems) y un
secuenciador (secuenciador de ADN ABI 3700, Applied Biosystems), se
seleccionaron respectivamente las que son las respectivas secuencias
de nucleótidos descritas (números de acceso de RefSeq NM_005345,
NM_006644, NM_005348, NM_199440, NM_001539, NM_001540, NM_002157,
NM_002154, NM_003299, NM_006584, NM_030752, NM_016299, NM_005347,
NM_006948, NM_006389, NM_001885,
NM_001541, NM_005880, NM_006145, NM_006736, NM_001001394, NM_016306, NM_018198, NM_003315, NM_014787) y en las que se insertaron simultáneamente la región codificante de cada ADNc de chaperona molecular y la fase de traducción de marcador GST del vector pGEX.
NM_001541, NM_005880, NM_006145, NM_006736, NM_001001394, NM_016306, NM_018198, NM_003315, NM_014787) y en las que se insertaron simultáneamente la región codificante de cada ADNc de chaperona molecular y la fase de traducción de marcador GST del vector pGEX.
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Un grupo de plásmidos de expresión de fusión con
GST obtenidos en (1) que se ha mencionado anteriormente preparados
por clonación de 25 especies de chaperona molecular se transfirieron
respectivamente a Escherichia coli BL 21 (Takara Bio)
mediante su transformación con un método de choque térmico. Después
de cultivo con agitación durante una noche usando 2,4 ml de un
líquido de cultivo, todo su volumen se transfirió a 400 ml del
líquido de cultivo y se cultivó a 37ºC durante 3 horas en un
agitador y después se añadió a esto IPTG (Sigma) hasta una
concentración final de 2,5 mM y el cultivo con agitación se realizó
adicionalmente durante 3 horas para inducir las respectivas
proteínas de chaperona de fusión con GST (en lo sucesivo en este
documento, denominadas respectivamente GST-HSPA1A
(aproximadamente 96 kDa), GST-HSPH1 (aproximadamente
123 kDa), GST-HSPCA (aproximadamente 111 kDa),
GST-HSPD1 (aproximadamente 87 kDa),
GST-DNAJA1 (aproximadamente 71 kDa),
GST-HSPB1 (aproximadamente 59 kDa),
GST-HSPE1 (aproximadamente 37 kDa),
GST-HSPA4 (aproximadamente 120 kDa),
GST-HSP90B1 (aproximadamente 118 kDa),
GST-HSPA9B (aproximadamente 100 kDa),
GST-DNAJC11 (aproximadamente 89 kDa),
GST-TCP1 (aproximadamente 86 kDa),
GST-HSPA14 (aproximadamente 81 kDa),
GST-HYOU1 (aproximadamente 137 kDa),
GST-HSPB2 (aproximadamente 46 kDa),
GST-CCT6B (aproximadamente 84 kDa),
GST-STCH (aproximadamente 78 kDa),
GST-HSPB5 (aproximadamente 46 kDa),
GST-DNAJA2 (aproximadamente 72 kDa),
GST-DNAJB1 (aproximadamente 64 kDa),
GST-DNAJB2 (aproximadamente 62 kDa),
GST-HCG3 (aproximadamente 43 kDa),
GST-DNAJB11 (aproximadamente 67 kDa),
GST-DNAJC7 (aproximadamente 81 kDa) y
GST-DNAJC6 (aproximadamente 125 kDa)) (los números
entre paréntesis son respectivamente pesos moleculares esperados).
Las células se recuperaron y cada proteína de chaperona molecular de
fusión con GST se purificó en perlas de glutatión Sepharose de
acuerdo con el método de arrastre con GST conocido de forma
convencional. Como el control, una proteína del resto de marcador
GST sola (a denominar en lo sucesivo en este documento proteína
GST; peso molecular esperado aproximadamente 26 kDa) se indujo por
expresión del Escherichia coli BL 21 transformado con
pGEX-6P-1 y se purificó, del mismo
modo como se ha descrito anteriormente. Realizando la separación
por electroforesis en gel de SDS poliacrilamida y tinción con Azul
Brillante de Coomassie de acuerdo con los métodos conocidos de
forma convencional, se confirmó que se purificaron las respectivas
proteínas que tenían el peso molecular esperado.
\vskip1.000000\baselineskip
Un ADNc de gen que codifica la región de
longitud completa del receptor de estrógenos \alpha (a denominar
en lo sucesivo en este documento ER\alpha) como una especie de los
receptores de hormona esteroidea mostrado por una base de datos
conocida de forma convencional se clonó usando dos especies de
cebadores de ADN (SEC ID Nº: 78 y SEC ID Nº: 79) diseñados de
acuerdo con la secuencia mostrada por el número de acceso de RefSeq
NM_000125. Ilustrativamente, se amplificó un fragmento de ADN de
aproximadamente 1,78 kpb que codificaba la región de longitud
completa de ER\alpha realizando la PCR usando un conjunto de
cebadores de la SEC ID Nº: 78 y la SEC ID Nº: 79 y usando una
genoteca de ADNc obtenida de célula HeLa (Clontech) como el molde.
La reacción de PCR se realizó a 98ºC (1 minuto) y 35 repeticiones
posteriores de un ciclo que consiste en 98ºC (5 segundos), 55ºC (30
segundos) y 72ºC (5 minutos), usando una ADN polimerasa (Pyrobest
DNA Polymerase; Takara Shuzo). El fragmento de ADN obtenido de este
modo se sub-clonó en un vector de expresión
(pcDNA3.1A/5-His-TOPO; Invitrogen)
usando un sistema TOPO TA Cloning (Invitrogen). El cebador
representado por la SEC ID Nº: 79 se diseñó de tal modo que un
epítopo V5 obtenido de vector (obtenido de la proteína V de SV5 de
paramixovirus, Southern JA, J Gen. Virol. 72, 1551 - 1557, 1991) y
un marcador His 6 (lindner P, BioTechniques 22,
140-149, 1997), excluyendo el codón de terminación,
se continúan en la misma fase del triplete del gen de ER\alpha en
el lado 3' después de la clonación. La secuencia de nucleótidos del
fragmento de ADN insertado en el plásmido obtenido de este modo se
determinó usando cebadores que se unen a la región promotora de T7
en el vector (kit TOPO TA Cloning; Invitrogen; SEC ID Nº: 89) y un
kit de secuenciación (Applied Biosystems) y un secuenciador
(secuenciador de ADN ABI 3700; Applied Biosystems). Como resultado,
se confirmó que el ADNc que codifica el ER\alpha humano mostrado
por el número de acceso de RefSeq NM_000125 se inserta en el vector
de expresión que se ha mencionado anteriormente
pcDNA3.1/V5-His-TOPO. En lo sucesivo
en este documento, este plásmido de expresión se denomina
pcDNA-ER.
\vskip1.000000\baselineskip
Usando reactivo Lipofect amine 2000
(Invitrogen), el pcDNA-ER que se ha mencionado
anteriormente se transfirió de forma transitoria a una célula
COS-7 (ATCC) cultivada en una placa de 10 cm hasta
un estado del 70% de confluencia. Después de 30 horas de cultivo y
retirada posterior del medio, las células se lavaron con PBS
enfriado con hielo y después se lisaron añadiendo 1,0 ml de un
tampón A (Tris-HCl 50 mM (pH 7,5), glicerol al 10%,
NaCl 120 mM, EDTA 1 mM, EGTA 0,5 mM, PMSF 0,5 mM,
NP-40 al 0,5%). Este extracto celular se centrifugó
a 1500 rpm durante 5 minutos para retirar el precipitado y se
recogió la fracción soluble del sobrenadante (en lo sucesivo en
este documento, extracto celular de expresión de ER). El ER\alpha
conocido como una proteína diana que muestra el efecto
farmacológico de 17-\beta estradiol (a denominar
E2 en lo sucesivo en este documento) (Green S. & P. Chambon
Trends Genet. 1988 Nov; 4 (11): págs. 309 -314) está contenido en la
fracción soluble de este extracto celular. Además, como un control,
una fracción soluble de extracto celular de célula
COS-7 no transferida (en lo sucesivo en este
documento, extracto celular de COS-7 de control) se
preparó del mismo modo. Se examinó si una proteína diana, ER,
realmente se puede detectar o no mediante el método de
identificación de la presente invención usando una proteína de
chaperona, proteína HSPA4. Una porción de 1 \mug de proteína
GST-HSPA4 o proteína GST (preparada en el Ejemplo
1(2) que se ha mencionado anteriormente) purificada en las
perlas de glutatión Sepharose se mezcló con el extracto celular de
expresión de ER que se ha mencionado anteriormente o extracto
celular de COS-7 de control y se agitó a 4ºC durante
1 hora en una condición de añadir o no añadir 10 \muM de E2.
Después de esto, la proteína que se une a la proteína
GST-HSPA4 o GST en las perlas se
co-precipitó por centrifugación. Esto se suspendió
en el tampón A' que se ha mencionado anteriormente (un tampón
preparado cambiando la concentración de NaCl en el tampón A a 100
mM) y se volvió a co-precipitar por centrifugación.
Después de repetir esta operación 4 veces, las proteínas en el
precipitado se separaron por electroforesis en gel de SDS
poliacrilamida de acuerdo con un método conocido de forma
convencional y las cantidades de ER\alpha como la proteína diana
de E2 se compararon por transferencia de Western usando un
anticuerpo anti-ER\alpha (MC-20;
Santa Cruz). Como resultado (Figura 1), cuando se usó el extracto
celular de expresión de ER, se detectó una banda de ER\alpha de
aproximadamente 70 kDa, que no se detecta cuando se usa el extracto
celular de COS-7 de control, en la condición de no
adición de E2 (carril 5). Por otro lado, la banda de ER\alpha se
detectó sólo ligeramente en la condición de E2 añadido (carril 6).
Basándose en estos resultados, se demostró que la detección de la
proteína diana de un agente a ensayar se puede detectar sin requerir
la modificación del compuesto, comparando la proteína que se une a
una proteína de chaperona molecular en el momento de añadir o de no
añadir dicho agente a ensayar, en realidad, usando la proteína de
chaperona molecular.
\vskip1.000000\baselineskip
En el Ejemplo 2(2) descrito
anteriormente, se demostró que la detección de la proteína diana de
un agente a ensayar se puede detectar comparando la proteína que se
une a una proteína de chaperona molecular en el momento de añadir o
de no añadir dicho agente a ensayar, usando la proteína de chaperona
molecular. En el siguiente ejemplo, se confirmó que el método de
identificación de la presente invención es útil incluso cuando se
usan chaperonas moleculares diferentes de la usada en el Ejemplo
2(2). Es decir, en este Ejemplo (3), se examinó si la
proteína diana ER se puede detectar o no en realidad mediante el
método de identificación de la presente invención del mismo modo
que en el ejemplo 2(2) usando las 25 especies de proteínas de
chaperona del Ejemplo 1(2). El ensayo se realizó del mismo
modo que en el Ejemplo 2(2), excepto porque se usó una mezcla
en la que las 25 especies que se han mencionado anteriormente de
proteínas de fusión con GST (Ejemplo 1(2)) se dividieron en
3 grupos de 8 ó 9 especies de acuerdo con su peso molecular y se
mezclaron en porciones de 0,2 \mug, en lugar del uso de proteína
HSPA4 como la proteína de chaperona o 1,4 \mug de proteína GST y
porque se realizó transferencia de Western usando un anticuerpo
anti-V5 (Invitrogen) que reconoce el epítopo V5
fusionado a ER y las intensidades de señal de las bandas obtenidas
de este modo se convirtieron en números como valores medidos de la
densidad por área unitaria usando el sistema de formación de
imágenes VersaDoc (Bio-Rad). Los detalles de las 8
ó 9 especies mezcladas de proteínas de chaperona de fusión con GST
son 3 grupos; un grupo en el que se mezcló un grupo de chaperonas
que tenían pesos moleculares relativamente altos,
GST-HSPH1, GST-HSPA4,
GST-HSPCA, GST-HYOU1,
GST-DNAJC6, GST-HSP90B1,
GST-HSPA9B y GST-DNAJC11, un grupo
en el que se mezcló un grupo de chaperonas que tenía un grado medio
de pesos moleculares, GST-HSPA1A,
GST-HSPD1, GST-DNAJA1,
GST-TCP1, GST-CCT6B,
GST-HSPA14, GST-DNAJC7 y
GST-STCH y un grupo en el que se mezcló un grupo de
chaperonas que tenían pesos moleculares relativamente bajos,
GST-HSPB1, GST-HSPE1,
GST-DNAJA2, GST-DNAJB11,
GST-DNAJB1, GST-DNAJB2,
GST-HSPB2, GST-HSPB5 y
GST-HCG3. Como resultado (Tabla 1), en cada caso del
uso de los grupos de mezcla de proteína de chaperona se detectó una
banda de ER\alpha de aproximadamente 70 kDa, que no se detecta
cuando se usa el extracto celular de COS-7 de
control, del extracto celular de expresión de ER, en la condición
de no adición de E2, y la banda de ER\alpha se detectó sólo
ligeramente en la condición de E2 añadido. El ER(L),
ER(M) y ER(H) en la tabla muestran los resultados del
uso del grupo que se ha mencionado anteriormente de chaperonas que
tienen pesos moleculares relativamente bajos, un grupo de chaperonas
que tienen un grado medio de pesos moleculares y un grupo de
chaperonas que tienen pesos moleculares relativamente altos,
respectivamente. Basándose en estos resultados, se confirmó que la
detección de la proteína diana de un agente a ensayar se puede
detectar comparando la proteína en el momento de añadir o de no
añadir dicho agente a ensayar, incluso cuando se usa
simultáneamente una gran diversidad de proteínas de chaperona
molecular.
A continuación se muestra que fue posible
identificar diversas proteínas diana de respectivos agentes mediante
el método de identificación de la presente invención usando
diversas chaperonas moleculares, en el Ejemplo 3, Ejemplo 4 y
Ejemplo 8. Con respecto a los que no se describieron con detalle en
cada ejemplo se realizaron ensayos de acuerdo con el Ejemplo 2 que
se ha mencionado anteriormente. En este contexto, las intensidades
de señal de las bandas obtenidas por la transferencia de Western se
convirtieron en números como valores medidos de la densidad por
área unitaria usando el sistema de formación de imágenes VersaDoc
(Bio-Rad).
\vskip1.000000\baselineskip
Se conoce que FKBP 12 es una de las proteínas
diana de FK 506 y FK 1706 (J. Biol. Chem. 1993 Nov 5; 268 (31):
22992 - 22999, Eur. J. Pharmacol. 2005 Feb 10; 509 (1): 11 -19). Se
conoce que el receptor de glucocorticoides (en lo sucesivo en este
documento GR) como una especie de receptores de hormona esteroidea
humana es una proteína diana que muestra el efecto farmacológico de
dexametasona (J. Clin. Invest. 1995 Jun; 95 (6): 2435 - 2441). Se
conoce que la deshidrofolato reductasa humana (a denominar en lo
sucesivo en este documento DHFR) es una proteína diana que muestra
el efecto farmacológico de metotrexato (en lo sucesivo en este
documento MTX) (J. Med. Chem. 2000 Oct 19; 43 (21):
3852-3861). El receptor de andrógenos (en lo
sucesivo en este documento AR), que se conoce como la proteína
diana de 5a-dihidrotestosterona (en lo sucesivo en
este documento DHT) (J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 1993 Dec; 46
(6): 699 - 711) está contenido en la fracción soluble de una célula
obtenida de próstata humana, célula LNCaP (ATCC). El receptor de
mineralocorticoides (en lo sucesivo en este documento MR), que se
conoce como la proteína diana de aldosterona (Science 1987 Jul 17;
237 (4812): 268 - 275), está contenido en la fracción soluble de
una célula obtenida de vaso sanguíneo humano, HUVEC (ATCC).
Mediante la preparación de las siguientes
respectivas fracciones solubles de extracto celular se puede
detectar si las proteínas diana que se han mencionado anteriormente
de respectivos agentes están presentes en dichas fracciones
solubles de extracto celular mediante el método de identificación de
la presente invención usando los respectivos grupos de proteína de
chaperona. En este contexto, entre los agentes, se sintetizaron FK
506 (documento
JP-B-03-038276) y FK
1706 (Patente Europea Nº 346.427) y se usaron otros agentes
adquiridos en Sigma. Cada una de las bandas de FKBP 12, GR y DHFR
se detectó mediante la transferencia de Western usando un
anticuerpo que reconoce el marcador V añadido a las respectivas
proteínas diana del mismo modo en el Ejemplo 2(3) que se ha
mencionado anteriormente y las bandas de AR y MR mediante la
transferencia de Western usando anticuerpos disponibles en el
mercado (N-20 y C-19, Santa
Cruz).
- (a)
- Fracción soluble de extracto celular de célula HeLa S3 (ATCC) en la que se sobre-expresó un ADNc génico que codifica la región de longitud completa de FKBP 12 humano (número de acceso de RefSeq NM_054014) (a denominar en lo sucesivo en este documento extracto celular de expresión de FKBP 12)/un grupo mixto de proteínas respectivas de proteínas de chaperona; GST-HSPH1, GST-HSPA4, GST-HSPCA, GST-HYOU1, GST-DNAJC6, GST-HSP90B1, GST-HSPA9B, GST-HSPA1A y GST-DNAJC11.
- (b)
- Fracción soluble de extracto celular de célula HeLa S3 en la que se sobre-expresó un ADNc de gen que codifica la región de longitud completa de GR (número de acceso de RefSeq NM_001024094) (a denominar en lo sucesivo en este documento extracto celular de expresión de GR)/un grupo mixto de proteínas respectivas de proteínas de chaperona; GST-HSPA1A, GST-HSPH1, GST-HSPCA y GST-HSPA4.
- (c)
- Fracción soluble de extracto celular de célula HeLa S3 en la que se sobre-expresó un ADNc de gen que codifica la región de longitud completa de DHFR (número de acceso de RefSeq NM_000791) (a denominar en lo sucesivo en este documento extracto celular de expresión de DHFR)/un grupo mixto de proteínas respectivas de proteína chaperona; GST-HSPD1, GST-DNAJA1, GST-HSPB1 y GST-HSPE1
- (d)
- Fracción soluble de LNCaP/un grupo mixto de proteínas respectivas de proteínas chaperona; GST-HSPA1A, GST-HSPH1, GST-HSPCA y GST-HSPA4
- (e)
- Fracción soluble de HUVEC/un grupo mixto de proteínas respectivas de proteínas chaperona; GST-HSPA1A, GST-HSPH1, GST-HSPCA y GST-HSPA4
- (f)
- Fracción soluble de extracto celular de célula HeLa (en lo sucesivo en este documento, extracto de célula HeLa de control; control de (a) a (c) que se ha mencionado anteriormente)
\vskip1.000000\baselineskip
Como resultado (Tabla 1), cuando se usaron el
extracto celular de expresión de FKBP 12, el extracto celular de
expresión de GR y el extracto celular de expresión de DHFR, se
detectaron las bandas de FKBP 12, GR y DHFR que no se detectan
cuando se usa el extracto celular de HeLa de control de forma más
clara en la condición añadida de cada agente, en comparación con la
condición no añadida. Además, se detectó la banda de AR más
claramente en la condición no añadida de DHT y se detectó la banda
de MR más claramente en la condición añadida de aldosterona.
Basándose en estos resultados, se confirmó, de manera similar al
caso del Ejemplo 2, que la proteína diana de los agentes a ensayar
se puede detectar comparando proteínas que se unen a proteínas de
chaperona molecular en el momento de añadir o de no añadir dichos
agentes a ensayar mediante el uso de diversas proteínas de
chaperona molecular.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
Usando el método que se ha mencionado
anteriormente mostrado en el Ejemplo 2(2), se realizó un
intento de explorar la proteína diana de biguanida cuya proteína
diana directa no ha estado clara a pesar de su efecto farmacológico
significativo como un agente para tratar diabetes. En primer lugar
se suspendió una célula obtenida de músculo esquelético de rata,
célula L 6 (ATCC) en un medio esencial mínimo (\alphaMEM,
Invitrogen) que contenía suero fetal de ternero al 10% (FCS) y se
cultivó en una placa recubierta con colágeno de 15 cm de diámetro
(Asahi Techno Glass) hasta alcanzar el estado confluente. Las
células resultantes se lavaron dos veces con 15 ml de tampón fosfato
(PBS) enfriado con hielo y después se lisaron añadiendo 2,0 ml del
tampón que se ha mencionado anteriormente A y se recogió el extracto
celular usando un rascador. Este extracto celular se centrifugó a
1500 rpm durante 5 minutos para eliminar el precipitado y se
recogió la fracción soluble del sobrenadante. La fenformina (Sigma),
que es una especie de biguanida y cuya acción hipoglucemiante se ha
reconocido clínicamente (UK Prospective Diabetes Study (UKPDS)
Group: The Lancet, 352, 854 (1998)) se añadió a la fracción soluble
de este extracto celular hasta una concentración final de 50
\muM, o no se añadió a esto, y en tal condición, se realizó el
ensayo de arrastre añadiendo 1 g de la proteína
GST-HSPA4 purificada en las perlas de glutatión
Sepharose del mismo modo que en el Ejemplo 2(2) que se ha
mencionado anteriormente. Después de 1 hora de agitación a 4ºC, la
proteína que se une a GST-HSPA4 en las perlas se
co-precipitó por centrifugación. En este contexto,
para evitar la salida de la proteína de chaperona molecular de las
perlas, la proteína de chaperona molecular y las perlas se usaron
reticulando las mismas químicamente de antemano mediante un método
conocido de forma convencional. Ilustrativamente, la proteína
GST-HSPA4 purificada en las perlas de glutatión
Sepharose se lavó con solución de borato sódico 0,2 M y después se
trató a 4ºC durante 45 minutos suspendiendo en DMP 20 mM. Después de
lavar esto con solución de monoetanolamina 0,2 M para detener la
reacción, esto se lavó añadiendo solución de glutatión 20 mM para
eliminar la proteína de chaperona molecular no reticulada y se usó
la sustancia resultante como la sonda. Después de
co-precipitar la proteína que se une a
GST-HSPA4, esto se suspendió en el tampón A' que se
ha mencionado anteriormente al que se añadió o no se añadió 50
\muM de concentración final de fenformina y se volvió a
co-precipitar por centrifugación. Después de
repetir esta operación 4 veces, las proteínas en el precipitado se
separaron por electroforesis en gel de SDS poliacrilamida, de
acuerdo con un método conocido de forma convencional y las
proteínas se detectaron mediante un método de tinción con plata
conocido de forma convencional. Como resultado, se detectó una gran
banda de proteína de aproximadamente 60 kDa, en la que su cantidad
de unión a la proteína de chaperona molecular está reducida en el
momento de añadir fenformina en comparación con el caso de ninguna
adición. Se considera que dicha proteína es una de la proteína diana
de fenformina, cuya estructura terciaria cambia por la adición de
fenformina. Por tanto, esta banda se recortó, la proteína se digirió
hasta fragmentos usando tripsina y la mezcla de péptidos formada de
este modo se recuperó del gel para realizar la identificación de la
proteína mediante análisis de espectro de masas de acuerdo con el
método conocido de forma convencional (Schevchenko, et al.,
Analytical Chemistry, Vol. 68, páginas 850 a 858, 1996). Como
resultado, se puso de manifiesto que la proteína en dicha banda es
ATP5B (número de acceso de RefSeq NP_599191).
En primer lugar, se realizó la clonación del gen
de ATP5B humana. Mediante la síntesis de los cebadores representados
por la SEC ID Nº: 80 y la SEC ID Nº: 81 y usando dichos cebadores
se realizó un intento de amplificar el ADNc de longitud completa de
ATP5B humana de una genoteca de ADNc obtenida de músculo esquelético
humano (Clontech) por PCR. La reacción de PCR se realizó usando una
ADN polimerasa (TAKARA LA Taq; Takara Shuzo), calentando a 94ºC (3
minutos) y después repitiendo 35 veces un ciclo que consistía en
94ºC (30 segundos), 58ºC (1,5 minutos) y 72ºC (4 minutos) y se
realizó de nuevo la PCR usando el producto de PCR como el molde en
las mismas condiciones. Como resultado de separar el producto de
PCR por una electroforesis en gel de agarosa, se confirmó que se
amplificó un fragmento de ADN de aproximadamente 1600 pares de
bases. Por consiguiente, el mismo fragmento de ADN en el líquido de
reacción se clonó en un vector de expresión
(pcDNA3.1/V5-His-TOPO; Invitrogen)
usando un sistema TOPO TA Cloning (Invitrogen). El cebador usado en
este caso, representado por la SEC ID Nº: 81, se diseñó para
excluir la secuencia de codón de terminación de ATP5B humana de tal
forma que un epítopo V5 obtenido de vector (obtenido de la proteína
V de SV5 de paramixovirus, Southern J. A., J. Gen. Virol. 72,1551 -
1557, 1991) se continúa con el triplete génico de ATP5B humana en la
misma fase en el lado 3' después de la clonación. La secuencia de
nucleótidos del fragmento de ADN insertado en el plásmido obtenido
de este modo se determinó usando cebadores que se unen a la región
promotora de T7 en el vector (kit TOPO TA Cloning; Invitrogen, SEC
ID Nº: 89) y un kit de secuenciación (Applied Biosystems) y un
secuenciador (secuenciador de ADN ABI 3700; Applied Biosystems).
Como resultado, se confirmó que esto es un clon que comprende la
secuencia de ADNc de longitud completa para ATP5B humana mostrada
por la SEC ID Nº: 1. En lo sucesivo en este documento, este plásmido
de expresión se denomina pcDNA-ATP5B. Se
inspeccionó mediante el siguiente ensayo que la ATP5B, que se
encontró mediante el método de identificación de la presente
invención y se consideró que era una proteína diana de biguanida,
es la proteína diana verdadera que produce la acción farmacológica
(efecto principal) de biguanida. En este sentido, ya que todos los
métodos convencionales para explorar proteínas diana de compuestos
usan solamente la unión directa de un compuesto y una proteína como
el índice, se obtiene un gran número de proteínas capaces de unirse
a dicho compuesto, pero la probabilidad de encontrar una proteína
relacionada en realidad con el efecto farmacológico del compuesto
en general es baja. A diferencia de los métodos convencionales, el
método de la presente invención intenta encontrar la diana de un
compuesto usando un cambio estructural terciario de una proteína a
la que se une el compuesto como el índice, de tal forma que se puede
esperar necesariamente que la proteína encontrada de este modo no
es una simple proteína de unión del compuesto, sino una molécula de
proteína cuya función cambia en gran medida por dicho compuesto.
La DHFR que se ha descrito en el Ejemplo 3 que
se ha mencionado anteriormente es una proteína cuya capacidad de
unirse a MTX se conoce (Proc. Natl. Acad. Estados Unidos, vol. 87,
Nº 8: págs. 2955-2959, 1990). Para usar en el
siguiente ejemplo como la herramienta para detectar la unión
bioquímica de ATP5B y biguanida, el ADNc de longitud completa del
gen de DHFR humana (número de acceso de RefSeq NM_000791) se clonó
en las mismas condiciones del Ejemplo 2(1) usando una
genoteca de ADNc de linfocitos humanos (Clontech) como el molde y
usando cebadores de las secuencias de nucleótidos representadas por
la SEC ID Nº: 84 y la SEC ID Nº: 85. Después de clonar el fragmento
de ADNc de DHFR obtenido de este modo de aproximadamente 560 pares
de bases en pcDNA3.1/V5-His-TOPO,
el fragmento de ADNc de DHFR se cortó usando los sitios de enzima de
restricción BamHI y XhoI añadidos a ambos extremos de
los cebadores que se han mencionado anteriormente. Al mismo tiempo,
un vector de expresión de proteína de fusión con GST
pGEX-6P-1 (Amersham) se convirtió a
una forma de cadena recta digiriendo el mismo con las enzimas de
restricción BamHI y XhoI. Una mezcla de ambas se
mezcló con un líquido de ADN ligasa (kit de ligación de ADN II;
Takara Shuzo) y se trató a 16ºC durante 3 horas, preparando de este
modo un plásmido en el que el ADNc de DHFR se inserta en el sitio
de clonación múltiple de pGEX-6P-1
(a denominar en lo sucesivo en este documento
pGEX-DHFR). Realizando la determinación de la
secuencia de nucleótidos del mismo modo que en el ejemplo que se ha
mencionado anteriormente usando el oligonucleótido mostrado en la
SEC ID Nº: 86 como el cebador, se seleccionó un plásmido en el que
se insertaron simultáneamente la región codificante de ADNc de DHFR
y la fase de traducción de marcador GST del vector pGEX.
El pGEX-DHFR preparado en el
Ejemplo 5(2) descrito anteriormente se transfirió a
Escherichia coli BL 21 mediante su transformación por un
método de choque térmico. Después del cultivo con agitación durante
una noche usando 2,4 ml de un líquido de cultivo, todo su volumen
se transfirió a 400 ml del líquido de cultivo y se cultivó a 37ºC
durante 3 horas en un agitador y después se añadió a esto IPTG
(Sigma) hasta una concentración final de 2,5 mM y el cultivo con
agitación se realizó adicionalmente durante 3 horas para inducir la
expresión de una proteína de DHFR de fusión con GST (a denominar en
lo sucesivo en este documento GST-DHFR). Las células
se recuperaron, y el GST-DHFR se purificó en perlas
de glutatión Sepharose de acuerdo con el método de arrastre con GST
conocido de forma convencional. Como el control, una proteína del
resto de marcador GST solo (a denominar en lo sucesivo en este
documento proteína de GST) se indujo por la expresión del
Escherichia coli BL 21 transformado con
pGEX-6P-1 y se purificó, del mismo
modo como se ha descrito anteriormente. Realizando la separación por
electroforesis en gel de SDS poliacrilamida y tinción con Azul
Brillante de Coomassie de acuerdo con los métodos conocidos de
forma convencional, se confirmó que se purificó la proteína que
tiene el peso molecular esperado (GST-DHFR, 45 kDa,
GST proteína; 26 kDa).
Usando la proteína GST-DHFR
preparada en el Ejemplo 5(3) descrito anteriormente, se
examinó la presencia o ausencia de unión bioquímica de biguanida y
proteína ATP5B. Ilustrativamente, usando la propiedad de DHFR de
unirse a metotrexato (MTX), se preparó un compuesto en el que se
fusionó metotrexato con una parte de la estructura molecular de una
especie de biguanida fenformina, diclorhidrato de ácido
(2S)-5-[(3-{[{[amino(imino)metil]amino}(imino)metil]amino}propil)amino]-2-({4-[[(2,4-diaminopteridin-6-il)metil](metil)amino]benzoil}amino)-5-oxo-
pentanoico (a denominar en lo sucesivo en este documento MTX-fenformina), este compuesto se fijó al GST-DHFR purificado en perlas de glutatión Sepharose uniéndose a su resto de MTX y se verificó la presencia o ausencia de la unión con ATP5B en el lado sobresaliente de fenformina por el método de arrastre con GST. En primer lugar, se preparó el MTX-fenformina usando técnicas de síntesis orgánica conocidas de forma convencional de acuerdo con el siguiente esquema de reacción.
pentanoico (a denominar en lo sucesivo en este documento MTX-fenformina), este compuesto se fijó al GST-DHFR purificado en perlas de glutatión Sepharose uniéndose a su resto de MTX y se verificó la presencia o ausencia de la unión con ATP5B en el lado sobresaliente de fenformina por el método de arrastre con GST. En primer lugar, se preparó el MTX-fenformina usando técnicas de síntesis orgánica conocidas de forma convencional de acuerdo con el siguiente esquema de reacción.
[Quím. 1]
Posteriormente, se examinó la unión de
fenformina y ATP5B mediante el método de arrastre con GST usando el
MTX-fenformina purificado que se ha mencionado
anteriormente y proteína GST-DHFR. En primer lugar,
usando 1,0 \mug del pcDNA-ATP5B que se ha
mencionado anteriormente preparado en el Ejemplo 5(1) como el
molde, se preparó proteína ATP5B humana marcada con radioisótopo
mediante transcripción y traducción in vitro mezclando 40
\mul de un sistema TNT (TNT^{R} Quick Coupled
Transcription/Translation System; Promega) y 0,74 MBq de un
radioisótopo (redivue Pro-mix L-[35S]; Amersham) y
se unió al mismo de acuerdo con los protocolos. Una porción de 15
\mul de esta preparación líquida de proteína de ATP5B humana y 1
\mug para cada una de la proteína GST o GST-DHFR,
purificado en las perlas de glutatión Sepharose, se mezclaron y
agitaron a 4ºC durante 1 hora después de añadir 0,3 ml de tampón A
a lo mismo. Después de esto, la proteína que se une a la proteína
GST o GST-DHFR en perlas se
co-precipitó por centrifugación. Después de repetir
esta operación 4 veces, las proteínas en el precipitado se
separaron por electroforesis en gel de SDS poliacrilamida de acuerdo
con un método conocido de forma convencional y la proteína unida a
la sonda se detectó por una autorradiografía. En todas las etapas
de este ensayo, se añadieron 10 \muM en una concentración final
del MTX-fenformina que se ha mencionado
anteriormente o no se añadieron al tampón y se compararon los
resultados. Como resultado, como se muestra en la Figura 1, se
detectó in vitro una banda de proteína ATP5B humana de
aproximadamente 60 kDa sintetizada in vitro en forma de
unión al GST-DHFR, solamente en la condición de
añadir el MTX-fenformina. Esta banda de proteína de
ATP5B humana no se detectó cuando la proteína GST no se mezcló o en
una condición de no añadir el MTX-fenformina. De
este modo, se observó que la ATP5B humana como uno de los
polipéptidos para uso de herramienta se une directamente a
fenformina.
A partir de los resultados del Ejemplo
5(4) que se ha mencionado anteriormente, se confirmó que la
proteína ATP5B humana como uno de los polipéptidos para uso de
herramienta se une directamente a fenformina. Por consiguiente, se
examinó si está presente o no una estructura de cerradura a la que
se pueda unir la biguanida en la superficie de la molécula de
proteína ATP5B en un ordenador basándose en los datos del análisis
de estructura cristalina con rayos X de ATP5B bovina.
Ilustrativamente, la predicción se realizó en una región (sitio) en
la que se considera que la unión de biguanida es posible, en la
superficie proteica de ATP5B como una de las subunidades de
F1F0-ATP sintasa (F1 indica polímero extramembrana y
F0 indica polímero intramembrana). Los datos de estructura
cristalina se obtuvieron del "Banco de Datos de Proteína RCSB"
como una ID de 1BMF. Están contenidas moléculas de heptámero (3
subunidades \alpha (cadenas A, B y C), 3 subunidades \beta
(cadenas D, E y F) y 1 subunidad \gamma (cadena G)) de
F1-ATP sintasa mitocondrial bovina
(F1-ATPasa mitocondrial bovina) en el 1BMF. La
ATP5B es la subunidad \beta de F1-ATPasa como la
región extracelular de F1F0-ATP sintasa (Nature,
1997, 386: 299 - 302, Nature, 1994, 370 (6491): 621 - 628) y la
ATP5B bovina tiene una identidad del 99% con ATP5B humana en
términos de restos aminoacídicos (la ATP5B humana tiene 529 restos y
la ATP5B bovina tiene 482 restos y ATP5B humana es más larga en 46
restos en el extremo N y en 1 resto en el extremo C). Entre las
moléculas de heptámero de la F1-ATP sintasa
mitocondrial bovina que se ha mencionado anteriormente, solamente la
cadena De, que es ATP5B bovina y una de las subunidades \beta y
la cadena A y la cadena C como subunidades \alpha adyacentes a la
misma (a denominar en lo sucesivo en este documento complejo
\alpha\beta\alpha) se usaron en el análisis. Ph4Dock, que es
una función preparada en el software MOE (entorno de operación
molecular) de Chemical Computing Group Inc. (CCG) se usó en el
análisis. El Ph4Dock es una función para explorar automáticamente
una estructura de complejo estable incluyendo su posición de unión
usando un ordenador, proporcionando únicamente una estructura
terciaria de un ligando y un receptor (J. Med Chem. 2004 Dec 30; 47
(27): 6804 -11). Proporcionando información estructural de
metformina y fenformina, que son especies de biguanida e información
estructural del complejo \alpha\beta\alpha usando esta
función, se exploran sitios en el complejo \alpha\beta\alpha,
a los que se unen estos compuestos. Los resultados de realizar la
exploración de los sitios sobre la superficie de la molécula de
proteína ATP5B bovina, que hacen posible la formación de un cuerpo
de complejo estable por la unión de cada uno de metformina y
fenformina y el complejo \alpha\beta\alpha, se muestran en la
siguiente
Tabla 2.
Tabla 2.
\vskip1.000000\baselineskip
La Tabla 2 muestra los sitios a los que se unen
respectivamente la metformina y fenformina y los valores de energía
de la unión en ese momento (U_ele + U_vdw). El sitio en la tabla
indica el sitio de unión y los sitios de unión se numeran en orden
de naturaleza hidrófoba mayor y superior por motivo de conveniencia.
El U_ele representa la energía de interacción electrostática y el
U_vdw, la energía van der Waals, respectivamente, y se dispusieron
20 candidatos y se inscribieron en orden de valores menores de U_ele
+ U_vdw. En el cálculo de la mecánica molecular, se usó el campo de
fuerza mmff94s. En este caso, cuando se supuso que la metformina y
fenformina usan la misma molécula como la diana medicinal, los
sitios de unión a los que se unen metformina y fenformina en común
son solamente el sitio 20 y el sitio 29. Además, ya que la ATP5B
humana preparada en el Ejemplo 5(4) que se ha mencionado
anteriormente realizando la transcripción y traducción in
vitro se une a fenformina, se puede observar que ATP5B se puede
unir a biguanida, no solamente en un estado de complejo sino
también sola por sí misma. Por tanto, cuando se limita a un sitio en
el que ATP5B por sí misma forma un sitio de unión, el sitio 20 en
solitario permanece como el candidato. Basándose en lo anterior, se
predijo que la metformina y fenformina se unen al sitio 20 del
complejo \alpha\beta\alpha. Para inspeccionar la predicción
que se ha descrito anteriormente, a saber, la unión directa de
fenformina al sitio 20, se puede realizar encontrando el resto más
importante para la unión de fenformina y mostrando experimentalmente
que la capacidad de unión desaparece cuando el resto muta. Por
consiguiente, cuando se observó unión de fenformina y el sitio 20,
se predijo la presencia de 3 patrones de modo de unión como
resultado. Se observó que se realiza un reconocimiento molecular
cooperativo en cada uno de estos modos de unión por 3 restos de Glu
125, Glu 241 y Asp 245 (cada número muestra la posición del resto
aminoacídico contando desde el lado amino-terminal
de la molécula de ATP5B bovina) como restos aminoacídicos en la
molécula de ATP5B. Por consiguiente, en realidad se preparó una
ATP5B humana de tipo mutación de acuerdo con el método mostrado en
el siguiente ejemplo, sustituyendo respectivamente Glu 175 y Asp
295 en la molécula de ATP5B humana, que se corresponde al Glu 125 y
Asp 245 entre los 3 restos aminoacídicos que se han mencionado
anteriormente de ATP5B bovina y se examinó su capacidad de unirse a
fenformina.
Usando el plásmido de expresión que se ha
mencionado anteriormente pcDNA-ATP5B como el molde y
usando los respectivos conjuntos de cebadores de las secuencias de
nucleótidos representadas por la SEC ID Nº: 87 y la SEC ID Nº: 81 y
la SEC ID Nº: 80 y la SEC ID Nº: 88, dos fragmentos de ADN de
aproximadamente 530 pares de bases del lado 5' y aproximadamente
1080 pares de bases de lado 3' de ADNc que tienen una mutación en la
que la 175ª posición de aminoácido, Glu, de ATP5B humana estaba
sustituida por Val, se amplificaron por PCR. La reacción de PCR,
solución madre de clonación y determinación de la secuencia de
nucleótidos eran iguales que los métodos mostrados en el Ejemplo
5(1). Usando una mezcla equivalente de los dos productos de
PCR obtenidos de este modo como el molde, se realizó la PCR usando
los cebadores representados por la SEC ID Nº: 80 y la SEC ID Nº: 81
esta vez, obteniendo de este modo un ADNc de longitud completa de
aproximadamente 1600 pares de bases que codifica un ATP5B de tipo
mutación Glu 175 Val. El fragmento de ADNc obtenido de este modo se
clonó en un vector de expresión
(pcDNA3.1N5-His-TOPO, Invitrogen) y
después, la secuencia de nucleótidos insertada en el vector se
identificó usando el cebador sintético representado por la SEC ID
Nº: 90 para confirmar que se formó la mutación Glu 175 Val en
ATP5B. El plásmido de expresión obtenido de este modo se denomina en
lo sucesivo en este documento
pcDNA-ATP5B(E175V). A continuación, usando
conjuntos respectivos de cebadores de las secuencias de nucleótidos
representadas por la SEC ID Nº: 91 y la SEC ID Nº: 81 y la SEC ID
Nº: 80 y la SEC ID Nº: 92, se obtuvo un ADNc de longitud completa
que codifica una ATP5B de tipo de mutación a Asp 295 Val mediante
el mismo método y se preparó un vector de expresión
pcDNA-ATP5B(D295V). Usando los
pcDNA-ATP5B(E175V) y el
pcDNA-ATP5B(D295V) preparados anteriormente,
se inspeccionó la capacidad de unión de la proteína ATP5B de tipo
mutación Glu 175 Val o Asp 295 Val con fenformina mediante el ensayo
de arrastre de acuerdo con el método mostrado en el Ejemplo
5(4) que se ha mencionado anteriormente. Como resultado, como
se muestra en la Figura 3, fue posible confirmar la unión de
fenformina, que se puede confirmar mediante la ATP5B de tipo
silvestre mediante una banda, pero no fue posible confirmar la unión
por la ATP5B de tipo mutación Glu 175 Val o Asp 295 Val debido a
que la banda desapareció. Mediante este hecho, se demostró
experimentalmente que Glu 175 y Asp 295 de la proteína ATP5B humana
son importantes para la unión con fenformina. Además, como se
muestra por los resultados del Ejemplo 5(4), se observó que
la
proteína ATP5B humana como uno de los polipéptidos para uso de herramienta se une directamente a fenformina.
proteína ATP5B humana como uno de los polipéptidos para uso de herramienta se une directamente a fenformina.
Aunque la proteína diana directa de biguanida
todavía no se ha encontrado, se ha puesto de manifiesto que activa
la AMP cinasa intracelular (AMPK) mediante su fosforilación (Zhou,
G. et al. J. Clin. Invest. 2001 Oct; 108 (8):
1167 - 74). Ya que la actividad de AMPK es mejorar el metabolismo de glucosa acelerando la captación de glucosa, se considera que esta activación de AMPK es la ruta de reacción principal que produce el efecto para tratar diabetes que es el efecto farmacológico de biguanida. En el caso de que la ATP5B encontrada por el método de identificación de la presente invención sea la molécula diana verdadera que lleva el efecto farmacológico (efecto principal) de biguanida, la proteína ATP5B se debe colocar más cadena arriba de la activación de AMPK en el sistema de transducción de señal intracelular que se activa por biguanida. Por consiguiente, para inspeccionar por un experimento que la molécula de ATP5B que se une a biguanida realmente se coloca cadena arriba de la activación de AMPK, se examinó si la activación de AMPK por biguanida se somete a una influencia o no en una condición en la que se expresa excesivamente ATP5B en una célula.
1167 - 74). Ya que la actividad de AMPK es mejorar el metabolismo de glucosa acelerando la captación de glucosa, se considera que esta activación de AMPK es la ruta de reacción principal que produce el efecto para tratar diabetes que es el efecto farmacológico de biguanida. En el caso de que la ATP5B encontrada por el método de identificación de la presente invención sea la molécula diana verdadera que lleva el efecto farmacológico (efecto principal) de biguanida, la proteína ATP5B se debe colocar más cadena arriba de la activación de AMPK en el sistema de transducción de señal intracelular que se activa por biguanida. Por consiguiente, para inspeccionar por un experimento que la molécula de ATP5B que se une a biguanida realmente se coloca cadena arriba de la activación de AMPK, se examinó si la activación de AMPK por biguanida se somete a una influencia o no en una condición en la que se expresa excesivamente ATP5B en una célula.
Para el propósito que se ha mencionado
anteriormente, en primer lugar se realizó la clonación de un ADNc
génico que codifica LKB 1 que se ha demostrado que es una de las
enzimas que fosforilan AMPK (Hardie DG, J. Cell Sci. 2004 Nov 1;
117 (Pt 23): págs. 5479 - 5487) y la preparación de un plásmido de
expresión de LKB1. Del mismo modo que en el método descrito en el
Ejemplo 5(1), se prepararon cebadores de oligo de ADN
representados por la SEC ID Nº: 82 y la SEC ID Nº: 83 y se clonó un
ADNc de longitud completa del gen LKB1 humano mediante PCR usando
una genoteca de ADNc obtenida de riñón humano (Clontech) como el
molde. La PCR se realizó en las mismas condiciones del Ejemplo
5(1) que se ha mencionado anteriormente y el fragmento de ADN
amplificado de este modo de aproximadamente 1300 pares de bases se
insertó en el vector de expresión
pcDNA3.1/V5-His-TOPO. Como
resultado de la determinación de la secuencia de nucleótidos del
fragmento de ADN de inserción del plásmido conseguido, se confirmó
que es un clon que consiste en la secuencia de ADNc de longitud
completa de LKB1 humano mostrado por el número de acceso de RefSeq
NM_000455. En lo sucesivo en este documento, este plásmido de
expresión se denomina pcDNA-LKB1. Este plásmido de
expresión pcDNA-LKB1 y el
pcDNA-ATP5B preparado en el Ejemplo 5(1) que
se ha mencionado anteriormente o un vector vacío (pcDNA3.1)
(Invitrogen) se transfirieron a la célula HeLa S3. La célula HeLa
S3 (ATCC) se cultivó en una placa de cultivo de 6 pocillos (diámetro
de pocillo de 35 mm) hasta que alcanzó un estado del 70% de
confluencia, añadiendo 2 ml de medio esencial mínimo DMEM (Gibco)
que contenía suero fetal bovino al 10% (Sigma) a cada pocillo de la
placa de cultivo. El medio se sustituyó por 1 ml por pocillo de un
medio sin suero OPTI MEM I (Invitrogen) y se transfirieron de forma
transitoria 3,0 \mug/pocillo de cada uno del vector vacío
(pcDNA3.1), pcDNA-LKB1 y pcDNA-ATP5B
usando Lipofect amine 2000 (Invitrogen). Después de 12 horas de
cultivo, esto se sustituyó por 2 ml/pocillo de DMEM que contenía
suero fetal bovino al 10% del cual se habían retirado sustancias de
bajo peso molecular por tratamiento con carbono activado y se
cultivaron adicionalmente durante 36 horas. Esto se cultivó
adicionalmente durante 1 hora (1 h) en una condición de añadir
fenformina (Sigma) a una concentración final de 1 mM o el disolvente
(DMSO) en solitario. El medio se desechó y las células se lavaron
con un tampón fosfato (a denominar en lo sucesivo en este documento
PBS, y después, las células se lisaron añadiendo 0,15 ml del tampón
A que se ha mencionado anteriormente (sin embargo, la concentración
de NaCl era 150 mM y se añadieron diversos inhibidores de
fosfatasa; Na_{3}VO_{4} 2 mM, NaF 10 mM,
\beta-glicerofosfato 25 mM, Na_{2}MoO_{4} 0,2
mM, ácido ocadaico 20 nM). La actividad de AMPK en las células se
detectó al nivel de fosforilación de moléculas mediante una
electroforesis en SDS conocida de forma convencional y una
transferencia de Western que usa un anticuerpo
anti-AMPK con fosforilación (anticuerpo de
fosfo-AMPK-\alpha (Thr172),
Daiichi Pure Chemicals). En este caso, para confirmar que no existe
diferencia en la cantidad de proteína de AMPK\alpha (una subunidad
de AMPK que se somete a fosforilación) entre muestras, se realizó
simultáneamente una transferencia de Western que usa un anticuerpo
anti-AMPK\alpha (Daiichi Pure Chemicals). Como
resultado, como se muestra en la Figura 4, se observó que el nivel
de fosforilación de AMPK estaba significativamente acelerado y
activado en cualquiera de la célula transferida con vector vacío
que se ha mencionado anteriormente y la célula en la que se expresó
LKB1 transfiriendo pcDNA-LKB1, cuando se trató con
fenformina, en comparación con el caso de tratar con el disolvente.
Sin embargo, en la célula en la que se expresó ATP5B humana
transfiriendo pcDNA-ATP5B, no se observó activación
de AMPK por tratamiento con fenformina. Cuando el mismo ensayo se
realizó añadiendo 10 mM en concentración final de la metformina
(Sigma) en lugar de fenformina, no se encontró activación de AMPK en
la célula expresada de ATP5B humana similar al caso del tratamiento
con fenformina. Esto significa que la capacidad de activación de
AMPK que contribuye al efecto farmacológico de fenformina,
metformina o biguanida similar cambia cuando la cantidad de
proteína ATP5B que está presente en la célula cambia y demuestra que
ATP5B se coloca evidentemente cadena arriba de AMPK en la señal
intracelular de biguanida. Cuando se tienen en cuenta tanto este
hecho como otro hecho de que se demostró la unión bioquímica de
ATP5B y fenformina mediante el ejemplo que se ha mencionado
anteriormente, se puede concluir que la ATP5B se une a biguanida y
es la proteína diana verdadera que contribuye al efecto
farmacológico de dicho compuesto. En este contexto, el fenómeno en
el que la activación de AMPK por biguanida, a saber, la aceleración
de la fosforilación, estaba obstruida por la
sobre-expresión de ATP5B, se puede explicar por una
de las siguientes teorías. Se puede explicar mediante un mecanismo
en el que ATP5B tiene originalmente una acción de suprimir la
fosforilación de AMPK y la biguanida activa AMPK uniéndose a ATP5B
y evitando de este modo su acción supresora de AMPK.
Alternativamente, se puede explicar que ya que la molécula de ATP5B
que actúa formando un complejo con una molécula endógena se
sobre-expresó en solitario, la biguanida se purgó
(eliminó) uniéndose a un exceso de monómero de ATP5B y, como
resultado, no se encontró aceleración de fosforilación de AMPK
generada originalmente por biguanida mediante un complejo que
incluye ATP5B. En este contexto, tal fenómeno en el que las
acciones de los compuestos están desplazadas entre sí por
sobre-expresión de una proteína diana se conoce
generalmente y también se usa como un medio para identificar que
una proteína especificada es una proteína diana de un compuesto
(Curr. Genet. 2002; 41 (3): pág. 142 - 149, J. Biol. Chem. 2005;
280 (13): pág. 1223 -12238, Proc. Natl. Acad. USA 1996; 93 (21):
11919 - 11924, Yeast, 1998 14 (10): 935 - 942). En cualquiera de
una de las anteriores explicaciones de teorías, no existe ningún
cambio en el hecho de que ATP5B es la proteína diana que contribuye
al efecto farmacológico de biguanida y que la sustancia que se une
a ATP5B tiene el mismo efecto farmacológico (efecto principal) de
biguanida. Basándose en los anteriores resultados, se demostró que
un compuesto que puede inducir el mismo efecto principal del efecto
farmacológico producido por biguanida como un agente para tratar
diabetes usando la misma ruta de señal intracelular (a saber, un
agente para tratar diabetes) se puede seleccionar usando los
polipéptidos para uso de herramienta que incluyen ATP5B como la
proteína diana de biguanida como un agente para tratar diabetes (a
saber, usando como una herramienta de exploración de un agente para
tratar diabetes).
Se muestra un método de exploración que puede
seleccionar una sustancia a ensayar (a saber, un agente para tratar
diabetes) que se une a un polipéptido, usando biguanida y ATP5B como
uno de los polipéptidos para uso de herramienta y usando un cambio
en la unión de dicho polipéptido y biguanida como el índice. La
unión de ATP5B y biguanida se puede detectar de acuerdo con el
Ejemplo 5(4) que se ha mencionado anteriormente. Como se
muestra en la Figura 5, cuando la concentración de
MTX-fenformina (1,0, 10, 100 \muM) a estar
presente aumenta en el método descrito en el Ejemplo 5(4),
se detectó claramente su unión a la proteína ATP5B. Cuando se
añadió fenformina libre (10 \muM) a este sistema como una
sustancia a ensayar, se demostró que la unión de dicha proteína y
MTX-fenformina está obstruida como se muestra en la
Figura 6. Cuando la fenformina añadida en este caso se sustituye
por una sustancia de ensayo que se desea evaluar, se puede examinar
si dicha sustancia de ensayo ejerce o no un cambio en la unión de
la proteína ATP5B y MTX-fenformina (biguanida) y se
puede explorar una sustancia que inhibe competitivamente la unión
de biguanida y un polipéptido de uso de herramienta y se une al
polipéptido para uso de herramienta, a saber, un agente para tratar
diabetes. Cuando, entre las condiciones que se han descrito
anteriormente, la concentración de MTX-fenformina es
de 10 \muM, se selecciona una sustancia que tiene un valor de
CI_{50} de 10 \muM o menor, preferiblemente una sustancia de 1
\muM o menor, más preferiblemente una sustancia de 0,1 \muM o
menor como un agente para tratar diabetes.
\vskip1.000000\baselineskip
De acuerdo con el método de exploración de (1)
que se ha mencionado anteriormente, la exploración se realizó
añadiendo diversos compuestos como las sustancias a ensayar en lugar
de fenformina libre en una condición de 10 \muM en concentración
de MTX-fenformina (MTX-PH) y se
encontraron 2 compuestos,
2-[(E)-(1H-1,2,4-triazol-3-ilimino)metil]fenol
(Maybridge, a denominar compuesto A en lo sucesivo en este
documento) y
6-cloro-9H-purina-2-amina
(Aurora, a denominar compuesto B en lo sucesivo en este documento)
como resultado de esto como compuestos de acierto. Es decir, como
se muestra en la Figura 7, se demostró que estos 2 compuestos
obstruyen la unión de ATP5B y MTX-fenformina por la
adición de 10 \muM de los mismos. Además, cada uno de estos
compuestos mostró una capacidad de activación de AMPK significativa
por el ensayo de detección de capacidad de activación de AMPK
mostrado en el Ejemplo 5(7) que se ha mencionado
anteriormente y esta capacidad de activación desapareció por la
sobre-expresión de ATP5B similar al caso de
fenformina y metformina mostrado en el Ejemplo 5(7) que se
ha mencionado anteriormente. Estos resultados muestran que tanto el
compuesto A como el compuesto B que se han mencionado anteriormente
activan AMPK intracelular interaccionado directamente con el sitio
de unión de biguanida de ATP5B. Al mismo tiempo, se confirmó que
realmente se puede seleccionar un compuesto que tiene la capacidad
de activación de AMPK similar a la de biguanida mediante el método
de exploración de un agente para tratar diabetes que usa el
polipéptido de esta descripción, mostrado en el Ejemplo
6(1).
\vskip1.000000\baselineskip
Como se ha descrito en el Ejemplo 6 que se ha
mencionado anteriormente, el compuesto A y el compuesto B
encontrados por el método de exploración de la presente invención
tiene la capacidad de activar AMPK en células. A continuación, se
examinó si estos compuestos tienen o no la acción hipoglucemiante
in vivo similar al caso de biguanida. Al mismo tiempo,
también se examinó la acción de los 2 compuestos que se han
mencionado anteriormente sobre el aumento del valor de ácido
láctico en sangre como un efecto secundario adverso de biguanida. Un
total de 15 animales de 11 semanas de edad de ratones db/db (BKS.Cg
+ Leprdb/+ Leprdb/Jcl; CLEA Japan) como un ratón modelo de diabetes
se dividieron en 3 grupos, que consistía cada uno en 5 animales.
Cada uno de metformina (Sigma) y el compuesto A que se ha
mencionado anteriormente se disolvieron en un disolvente (Cremophor
al 5%, metil celulosa al 0,2%: MC) hasta una concentración de 30
mg/ml o hasta mg/ml. La metformina se administró a una dosis de 300
mg/kg de peso corporal y el compuesto A a 100 mg/kg de peso corporal
en las cavidades abdominales de 5 animales respectivos del ratón
que se ha mencionado anteriormente y se compararon con un grupo al
que se administró el mismo volumen del vehículo (Cremophor al 5%,
MC al 0,2%) en solitario. Se dejaron en ayunas al mismo tiempo de
la administración y se recogieron muestras sanguíneas de la cola de
cada animal 0 minutos, 90 minutos y 180 minutos después de esto
para medir el nivel de azúcar en sangre y el nivel de ácido láctico
en sangre. Se midió en nivel de azúcar en sangre usando un
analizador simplificado de azúcar en sangre (ACU Check Active II;
Roche) y se midió el nivel de ácido láctico en sangre usando un
analizador simplificado de ácido láctico (Lactate Pro; Arkray
Marketing), respectivamente. Del mismo modo, 12 animales del ratón
db/db de 18 semanas de edad se dividieron en 3 grupos, 4 animales
por cada grupo. Cada uno de metformina (Sigma) y el compuesto B que
se ha mencionado anteriormente se disolvieron en solución salina
fisiológica hasta una concentración de 30 mg/ml o 9 mg/ml. Se
administró metformina a una dosis de 300 mg/kg de peso corporal y
el compuesto A a 100 mg/kg de peso corporal a las cavidades
abdominales de los 4 respectivos animales del ratón que se ha
mencionado anteriormente y se compararon con un grupo al que se
administró el mismo volumen del vehículo (solución salina
fisiológica) en solitario. Del mismo modo que anteriormente, se
dejaron en ayunas al mismo tiempo de la administración y se
midieron respectivamente el nivel de azúcar en sangre y el nivel de
ácido láctico en sangre 0 minutos, 90 minutos y 180 minutos después
de esto del mismo modo que se ha descrito anteriormente. Como
resultado, en comparación con el grupo de administración de
vehículo, la metformina mostró una acción hipoglucemiante
significativa después de 90 minutos y 180 minutos en cada ensayo.
Cada uno del compuesto A y el compuesto B mostraron que la acción
hipoglucemiante después de 90 minutos y 180 minutos tenía una
diferencia significativa (Figura 8A y C). Por otro lado, se observó
un aumento significativo en el nivel de ácido láctico en sangre en
el grupo de administración de metformina después de 90 minutos en
cada ensayo, pero tanto el compuesto A como el compuesto B no
indujeron aumento del nivel de ácido láctico en sangre (Figura 8B y
D). Basándose en este resultado, se confirmó que se puede encontrar
realmente un nuevo agente terapéutico para la diabetes que tiene
una acción hipoglucemiante significativa similar a la de biguanida
mediante el método de exploración de la presente invención. Además,
ya que las dos especies que se han mencionado anteriormente de
compuestos no inducen aumento del nivel de ácido láctico en sangre
conocido como un efecto secundario adverso de biguanida, se
confirmó que la exploración de un nuevo agente terapéutico para
diabetes, que tiene el efecto principal (acción farmacológica de
biguanida; a saber, efecto para tratar diabetes) pero que no tiene
un efecto secundario adverso (a saber, aumento de nivel de ácido
láctico en sangre) se puede realizar mediante el método de
exploración de la presente invención.
El método de exploración de la presente
invención se puede aplicar a la exploración de un agente para tratar
diabetes. Aunque la invención se ha descrito con referencia a
realizaciones específicas de la misma, están incluidos cambios y
modificaciones obvios para los expertos en la materia en el alcance
de la invención.
La explicación de "Secuencia Artificial" se
describe en el encabezado numérico <223> en la siguiente
lista de secuencias. Ilustrativamente, las respectivas secuencias de
nucleótidos representadas por las SEC ID Nº: 28 a 77, 84 a 89, 91 y
92 de la lista de secuencias son secuencias de cebador sintetizadas
artificialmente. Dos o más bandas de proteína que están presentes
solamente cuando se añadió talidomida se detectaron. Estas
proteínas son un grupo de proteínas en las que la unión de dichas
proteínas y la mezcla de proteína de chaperona molecular cambió por
la adición de talidomida, a saber, un grupo de proteínas en las que
sus estructuras terciarias cambió por la adición de talidomida.
Estas bandas se recortaron, las proteínas se digirieron en
fragmentos usando tripsina y, después, las mezclas peptídicas
formadas de este modo se recuperaron del gel y se sometieron a la
identificación de proteínas mediante análisis de espectro de masas
del mismo modo que el método del Ejemplo 4. Como resultado, se puso
de manifiesto que la proteína contenida en una banda de
aproximadamente 45 kDa que está presente solamente cuando se añade
talidomida es TARDBP (número de acceso de RefSeq NP_031401).
\vskip1.000000\baselineskip
Se conoce que TARDBP es un factor de
transcripción que tiene la capacidad de unirse a ADN, ARN y ácidos
nucleicos similares y tiene una acción de suprimir VIH (Ou SH et
al. Virol 1995 June; 69 (6): 3584 - 3596). Ya que se conoce una
acción significativa anti-VIH de talidomida (ME
Franks et al., Lancet 2004; 363 (9423):
1802-1811), no existe incoherencia al pensar que
TARDBP es una proteína diana de talidomida. Aunque todavía no se ha
conocido una proteína como diana directa de talidomida, se ha
descrito que suprime la producción de factor de necrosis tumoral
\alpha (TNF-\alpha) o citosina similar de
células (Franks ME et al., Lancet 2004; 363 (9423): 1802
-1811). Por tanto, se realizó un intento de inspeccionar si la
proteína diana de talidomida, TARDBP, encontrada por el método de
la presente invención en el Ejemplo 8 que se ha mencionado
anteriormente es la molécula diana verdadera que lleva el efecto
principal de talidomida, realizando un experimento que usa un
cambio en la producción de TNF-\alpha de una
célula como el índice.
\vskip1.000000\baselineskip
De acuerdo con la secuencia génica de TARDBP
humano en el número de acceso de RefSeq NM_007375, se sintetizaron
cebadores que tienen las secuencias de nucleótidos representadas por
la SEC ID Nº: 93 y la SEC ID Nº: 94 y se realizó un intento de
amplificar ADNc de longitud completa de TARDBP humano por PCR a
partir de una genoteca de ADNc obtenida de linfocitos humanos
(Clontech) usando dichos cebadores. La PCR se realizó usando una ADN
polimerasa (TAKARA LA Taq; Takara Shuzo) calentando a 94ºC (3
minutos) y después repitiendo 35 veces un ciclo que consiste en
94ºC (30 segundos), 58ºC (1,5 minutos) y 72ºC (4 minutos). Como
resultado de separar el producto de PCR mediante una electroforesis
en gel de agarosa, se confirmó que se amplificó un fragmento de ADN
de aproximadamente 1250 pares de bases. Por consiguiente, este
fragmento de ADN en el líquido de reacción se clonó en un vector de
expresión (pcDNA3.1/V5-His-TOPO;
Invitrogen) usando un sistema TOPO TA Cloning (Invitrogen). El
cebador usado en este caso, representado por la SEC ID Nº: 94, se
diseñó de tal modo que se retiró el codón de terminación de dicho
gen de tal forma que un epítopo V5 obtenido de vector (obtenido de
la proteína V de SV5 de paramixovirus, Southern J A, J. Gen. Virol.
72, 1551 -1557, 1991) y un marcador His 6 (Lindner P, BioTechniques
22, 140 -149, 1997) continúan en la misma fase del triplete génico
de TARDBP en el lado 3' después de la clonación. La secuencia de
nucleótidos del fragmento de ADN insertado en el plásmido obtenido
de este modo se determinó usando los cebadores que se unen a la
región promotora de T7 en el vector (kit TOPO TA Cloning,
Invitrogen, SEC ID Nº: 89) y un kit de secuenciación (Applied
Biosystems) y un secuenciador (secuenciador de ADN ABI 3700,
Applied Biosystems). Como resultado, se confirmó que es un clon que
comprende el ADNc de longitud completa que codifica el TARDBP
humano, mostrado por el número de acceso de RefSeq NM_007375 (SEC ID
Nº: 95). En lo sucesivo en este documento, este plásmido de
expresión se denomina pcDNA-TARDBP.
\vskip1.000000\baselineskip
El pcDNA-TARDBP o un vector
vacío (pcDNA3.1) (Invitrogen) se transfirió a una célula HeLa S3.
Ilustrativamente, la célula HeLa S3 (ATCC) se cultivó en primer
lugar en una placa de cultivo de 12 pocillos hasta que alcanzó un
estado del 70% de confluencia, añadiendo 1 ml de medio esencial
mínimo DMEM (Gibco) que contenía suero fetal bovino al 10% (Sigma)
a cada pocillo de la placa de cultivo. El medio se sustituyó por 0,5
ml por pocillo de un medio sin suero OPTI-MEM I
(Invitrogen) y 0,8 \mug/pocillo del pcDNA-TARDBP o
pcDNA3.1 se transfirieron transitoriamente usando Lipofect amine
2000 (Invitrogen). Después de 12 horas del cultivo, esto se
sustituyó por 1 ml/pocillo de DMEM que contenía suero fetal bovino
al 10% y se cultivó adicionalmente durante 12 horas. Esto se
cultivó adicionalmente durante 16 horas en una condición de añadir o
no añadir ácido ocadaico (Wako Pure Chemical Industries) hasta una
concentración final de 50 nM. En este caso, se añadió 100 \muM de
talidomida a una parte de las células simultáneamente con el
tratamiento con ácido ocadaico. El medio se desechó, las células se
lavaron dos veces con PBS enfriado con hielo y después, estas
células se congelaron y almacenaron a -80ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
Se preparó ARN total a partir de cada célula
congelada en el Ejemplo 9(2) que se ha mencionado
anteriormente, usando un reactivo para uso de extracción de ARN
(Isogen; Nippon Gene) y de acuerdo con las instrucciones adjuntas
al mismo. El ARN total de preparado de este modo después se trató
con una desoxirribonucleasa (Nippon Gene), se sometió a tratamiento
con fenol/cloroformo y precipitación con etanol y se disolvió en
agua estéril. Usando 1 \mug de este ARN total se realizó su
transcripción inversa en un ADNc monocatenario en un sistema de 20
\mul usando un kit para uso de reacción de transcripción inversa
(Kit Advantage^{TM} RT-for-PCR,
Clontech). Se diseñaron y sintetizaron seis oligonucleótidos (SEC ID
Nº: 97 a SEC ID Nº: 102) como cebadores de PCR para la medición de
la cantidad de expresión génica. Se usó una combinación de la SEC ID
Nº: 97 y la SEC ID Nº: 98 para el gen de
\beta-actina humana y la combinación de la SEC ID
Nº: 99 y la SEC ID Nº: 100 para el gen de
TNF-\alpha humano y una combinación de la SEC ID
Nº: 101 y la SEC ID Nº: 102 para el gen de TARDBP humano,
respectivamente. Se realizó la medición en tiempo real de la
amplificación por PCR por el sistema de detección de secuencia
PRISM^{TM} 7700 en un sistema de 25 \mul usando las 6 especies
que se han mencionado anteriormente, 3 conjuntos de cebadores y de
acuerdo con las instrucciones adjuntas al mismo. En cada sistema,
se usaron 5 \mul de ADNc monocatenario, 12,5 \mul de reactivo
SYBR Green 2 x y 7,5 pmol de cada cebador. En este caso, se usó el
ADNc monocatenario almacenado en (2) diluyendo el mismo 100 veces.
En este contexto, se diluyeron 0,1 \mug/\mul de un ADN genómico
humano (Clontech) y se usó una porción de 5 \mul de lo mismo en
lugar del ADNc monocatenario. Se realizó la PCR, después de
calentamiento a 50ºC durante 10 minutos y posteriormente 95ºC
durante 10 minutos, repitiendo 45 ciclos de un proceso que consiste
en 2 etapas de 95ºC durante 15 segundos y 60ºC durante 60 segundos.
Las cantidades de expresión del gen de TNF-\alpha
humano y el gen de TARDBP humano en cada muestra se corrigieron por
la cantidad de expresión del gen de \beta-actina
basándose en la siguiente ecuación.
[Cantidad de
expresión corregida de TNF-\alpha o TARDBP] =
[Cantidad de expresión del gen de TNF-\alpha o
TARDBP (datos sin procesar) / [Cantidad de expresión del gen de
\beta-actina (datos sin
procesar)]
Al comparar las cantidades de expresión de los
genes de TNF-\alpha y TARDBP, se calcularon las
cantidades relativas considerando la cantidad de expresión en una
célula, a la que se transfirió un vector vacío (pcDNA3.1) y que se
trató solamente con el disolvente (DMSO), como 100, con los
resultados mostrados en la Figura 9 y la Figura 10. Los valores en
los dibujos representan el promedio \pm D.T. Como se muestra en la
Figura 9, se confirmó que la cantidad de expresión de TARDBP estaba
acelerada en la célula transferida con pcDNA-TARDBP
(célula de alta expresión de TARDBP) por un factor de
aproximadamente 7 veces en comparación con la célula transferida
con vector vacío (célula de control). Como se muestra en la Figura
10, se observó que la expresión de TNF-\alpha de
la célula de control está aumentada en gran medida (hasta 80 veces)
mediante el tratamiento con ácido ocadaico. Ya que la adición de
talidomida suprimió esta aceleración de la expresión de
TNF-\alpha por ácido ocadaico casi en el 50%, se
confirmó que la acción de talidomida se puede detectar en dicha
célula. Por otro lado, en el caso de la célula de alta expresión de
TARDBP, la acción de acelerar la expresión de
TNF-\alpha por la célula mediante la adición de
ácido ocadaico era prácticamente igual en comparación con la célula
de control, pero no se observó la acción de suprimir la expresión de
TNF-\alpha por la adición de talidomida. Este
resultado se puede explicar de forma sencilla basándose en una
suposición de que la talidomida que originalmente debe actuar se
purgó (retiró) del interior de la célula debido a la unión de
talidomida en la célula y una cantidad excesiva de proteína TARDBP
provocada por la sobre-expresión de TARDBP. Se
conoce que TARDBP es un factor de transcripción que tiene la
actividad de unirse a ADN, ARN y ácidos nucleicos similares. Es
decir, ya que se considera que TARDBP es una molécula en un complejo
funcional que consiste en dos o más factores de transcripción
esenciales para la inducción de la expresión de
TNF-\alpha, se considera que la inducción de la
expresión de TNF-\alpha no está acelerada cuando
la molécula en solitario se sobre-expresa, pero
cuando la función de dicha molécula está inhibida por talidomida, se
pierde la función del complejo de transcripción esencial para la
inducción de la expresión de TNF-\alpha y, como
resultado, se suprime la producción de
TNF-\alpha. Basándose en los anteriores
resultados, se consideró que la proteína TARDBP que se une
chaperona molecular solamente cuando se añade talidomida, encontrada
por el método de identificación de la presente invención, es una
molécula relacionada con el control de la expresión de
TNF-\alpha que se considera que es uno de los
mecanismos moleculares que llevan el efecto farmacológico de
talidomida. Basándose en esto, se demostró que el método de
identificación de la presente invención se puede usar para la
identificación de proteínas diana sin aplicar modificación de
agentes a ensayar, además de la identificación de la ATP5B diana de
biguanida mostrada en el ejemplo que se ha mencionado
anteriormente.
El método de exploración de la presente
invención se puede aplicar a la exploración de un agente para tratar
diabetes. La herramienta de exploración de la presente invención se
puede usar en la exploración que se ha mencionado anteriormente. El
método de identificación de la presente invención es útil como un
método de identificación de proteínas diana que son útiles para
estudiar la mejora de agentes existentes. Aunque la invención se ha
descrito con referencia a realizaciones específicas de la misma, los
cambios y las modificaciones evidentes para los expertos en la
materia están incluidos en el alcance de la invención.
La explicación de "Secuencia artificial" se
describe en el encabezado numérico <223> en la siguiente
lista de secuencias. Ilustrativamente, las respectivas secuencias de
nucleótidos representadas por las SEC ID Nº: 28 a 77, 84 a 89, 91 y
92 de la lista de secuencias son secuencias de cebador sintetizadas
artificialmente.
\global\parskip0.000000\baselineskip
<110> Astellas Pharma Inc.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Un método para la identificación de
dianas farmacológicas y un método para explorar fármaco
antidiabético usando la diana identificada
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> A06034
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> JP2005-234673
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
12-08-2005
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> JP2005-279582
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
27-09-2005
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 102
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn versión 3.2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1590
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(1587)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Inventores: Endoh, Hideki; Yokota,
Hiroyuki; Soga, Shinji; Hayakawa, Masahiko
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 529
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 641
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 858
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 732
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 573
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 397
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 205
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 102
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 840
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 803
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 530
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 556
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 509
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400>14
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 679
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400>15
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 471
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 999
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 175
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 182
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 412
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 340
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 324
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 145
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 358
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 559
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 484
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 913
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
una secuencia de cebador sintetizada artificialmente
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipttggatccat ggccaaagcc gcggcgatcg g
\hfill31
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
una secuencia de cebador sintetizada artificialmente
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipttctcgagct aatctacctc ctcaatggtg ggg
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
una secuencia de cebador sintetizada artificialmente
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipttagatctat gtcggtggtg gggttggacg
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<212>ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
una secuencia de cebador sintetizada artificialmente
\vskip1.000000\baselineskip
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una secuencia de cebador sintetizada artificialmente
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una secuencia de cebador sintetizada artificialmente
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una secuencia de cebador sintetizada artificialmente
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una secuencia de cebador sintetizada artificialmente
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una secuencia de cebador sintetizada artificialmente
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<213> Artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
una secuencia de cebador sintetizada artificialmente
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 89
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptaatacgact cactataggg
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 90
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 90
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggcagaatca tgaatgtcat tg
\hfill22
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<210> 91
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<211> 30
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
una secuencia de cebador sintetizada artificialmente
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 91
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctgaatactt cagagtccaa gaaggtcaag
\hfill30
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 92
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<211> 30
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<212> ADN
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<213> Artificial
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<220>
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<223> Descripción de Secuencia Artificial:
una secuencia de cebador sintetizada artificialmente
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 92
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\hfill30
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 93
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<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 93
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\hfill25
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<210> 94
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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<400> 94
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\hskip-.1em\dddseqskipcattccccag ccagaagact tag
\hfill23
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<210> 95
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1245
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<213> Homo sapiens
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<220>
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<221>CDS
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<222>(1)..(1242)
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens
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<210> 97
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<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 97
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcggactatg acttagttgc gtta
\hfill24
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<210> 98
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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<400> 98
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\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 99
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 99
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccctggtatg agcccatcta tc
\hfill22
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<210> 100
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<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 100
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\hskip-.1em\dddseqskipaaagtagacc tgcccagact cg
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 101
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 101
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaagttcttat ggtgcaggtc
\hfill20
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 102
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<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 102
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgcagtcaca ccatcgtcc
\hfill19
Claims (2)
1. Un método para explorar un agente para tratar
diabetes, que comprende
- [1]
- una etapa de permitir que (1) un polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID Nº: 2, (2) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID Nº: 2 o una secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 2 en la que de 1 a 10 aminoácidos de la misma están delecionados, sustituidos y/o insertados y que también se une a biguanida y/o inhibe la activación de AMPK por biguanida, debido a sobre-expresión, (3) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad del 90% o más con la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID Nº: 2 y que también se une a biguanida y/o inhibe la activación de AMPK por biguanida debido a sobre-expresión o (4) una célula transformada con un vector que comprende un polinucleótido que codifica el polipéptido descrito en (1) a (3) esté en contacto con una sustancia a ensayar en coexistencia de biguanida y
- [2]
- una etapa de analizar la unión de dicho polipéptido con la sustancia a ensayar.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Un método de exploración de acuerdo con la
reivindicación 1, que comprende además una etapa de confirmar que
la sustancia activa la actividad de AMPK y/o tiene una actividad
terapéutica para diabetes.
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