CN117683893A - 一种预测btk抑制剂耐药性的生物标志物及其应用 - Google Patents
一种预测btk抑制剂耐药性的生物标志物及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种预测BTK抑制剂耐药性的生物标志物及其应用，涉及生物医药技术领域。该生物标志物为SMPD1或SPHK1；所述BTK抑制剂耐药性是指弥漫大B细胞淋巴瘤细胞对所述BTK抑制剂的耐药性。该生物标志物可用于预测弥漫大B细胞淋巴瘤细胞对BTK抑制剂敏感性，从而有利于弥漫大B细胞淋巴瘤治疗方案的合理选择。本发明揭示了SMPD1/NF‑κB新通路介导ABC‑DLBCL对BTK抑制剂耐药的途径，为新的靶向药物研发提供了新思路，有望改善BTK抑制剂耐药现状。SMPD1或SPHK1具有成为BTK抑制剂耐药动态监测标志物的潜力，而且有望成为疗效方案中期评价的因素，并对治疗最终结果做出预判。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，特别是涉及一种预测BTK抑制剂耐药性的生物标志物及其应用。
背景技术
非霍奇金淋巴瘤是来源于淋巴造血组织的恶性肿瘤，近年来，发病率呈逐年上升的趋势。弥漫大B细胞淋巴瘤（DLBCL）是最常见的非霍奇金淋巴瘤的亚型，占非霍奇金淋巴瘤的35%，依其细胞起源和基因表达谱不同，又可分为活化B细胞样DLBCL（ABC-DLBCL）、生发中心B细胞样DLBCL（GCB-DLBCL）及未分化型。
DLBCL的基因表达亚群在调控机制和致癌途径上存在很大差异。DLBCL的显著特征是B细胞受体（BCR）的异常活化。其中，ABC-DLBCL细胞的活力强烈依赖于组成型NF-kB激活，这是ABC-DLBCL的标志，并可能有助于其对免疫化疗的抵抗力。各专业指南中以利妥昔单抗联合化疗（R-CHOP样）方案作为DLBCL的规范一线治疗。DLBCL总体5年无进展生存（PFS）率接近60%，而ABC-DLBCL较GCB-DLBCL患者的预后更差，5年PFS%不足50%。与欧美国家不同，东亚地区ABC-DLBCL约占全部DLBCL的70%。对于ABC-DLBCL的耐药机制研究，一直是临床亟待解决的难题。
BTK是B细胞受体（BCR）通路中的关键激酶，可驱动BCR信号级联，导致ABC-DLBCL中下游NF-KB和磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）促生存通路的激活。布鲁顿酪氨酸激酶（BTK）将BCR活性与NF-kB连接起来，对于具有慢性活性BCR信号转导的ABC系的存活至关重要。lbrutinib是一种选择性的BTK共价抑制剂，通过降低NF-KB通路活性来杀死ABC-DLBCL细胞系。但随着R-CHOP联合BTK抑制剂的延长使用，其获得性耐药日益显现出来。BTK抑制剂伊布替尼联合R-CHOP改善了<60岁的ABC-DLBCL患者的预后，尤其是MCD（based on the co-occurrence of MYD88L265P and CD79B mutations）和N1（based on NOTCH1 mutations）基因亚型的患者。但是BTK抑制剂耐药性产生的机制复杂，已报道与BTK基因突变及核内外分子通路改变有关。
鞘磷脂磷酸二酯酶（SMPD1）作为鞘磷脂代谢循环的关键酶，SMPD1能将脂质细胞膜成分鞘磷脂转化为神经酰胺。在癌细胞中，SMPD1介导的神经酰胺生成对于细胞凋亡、增殖和免疫调节及肿瘤转移非常重要，且SMPD1在胶质母细胞瘤、非小细胞肺癌、结直肠癌等中展现出了治疗靶点的潜力。SMPD1及神经酰胺在许多应激和细胞凋亡刺激的信号转导中发挥着关键作用。SMPD1催化产生的神经酰胺导致膜的重组和富含神经酰胺的脂筏形成。这些膜结构域将聚集激活的受体，并在受体簇的位置捕获和富集胞内信号分子，受体和相关信号分子的重组放大细胞的信号传导。神经酰胺作为其他生物活性鞘脂的前体，可被转化为鞘胺醇-1-磷酸（S1P），而鞘氨醇激酶1（SPHK1）作为S1P的主要生成酶，可促进癌症的发生和发展。
SMPD1缺乏通常导致A型和B型尼曼-匹克病的发生，但是人们对其在抗肿瘤免疫反应中的作用却知之甚少，目前SMPD1与ABC-DLBCL BTK抑制剂耐药的相关性尚未见文献报道，SMPD1/NF-κB通路及中间分子SPHK1在ABC-DLBCL中的表达和功能尚不明确，与ABC-DLBCL BTK抑制剂耐药是否存在相关性尚不可知。
发明内容
本发明的目的是提供一种预测BTK抑制剂耐药性的生物标志物及其应用，以解决上述现有技术存在的问题，该生物标志物可用于预测弥漫大B细胞淋巴瘤细胞对BTK抑制剂敏感性，从而有利于弥漫大B细胞淋巴瘤治疗方案的合理选择。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供一种预测BTK抑制剂耐药性的生物标志物，所述生物标志物为SMPD1或SPHK1；
所述BTK抑制剂耐药性是指弥漫大B细胞淋巴瘤细胞对所述BTK抑制剂的耐药性。
进一步地，所述SMPD1或所述SPHK1的表达量升高，提示所述弥漫大B细胞淋巴瘤细胞对所述BTK抑制剂的耐药性提高。
进一步地，所述BTK抑制剂为泽布替尼。
本发明还提供检测上述的生物标志物在弥漫大B细胞淋巴瘤组织或血清中含量的试剂在制备预测弥漫大B细胞淋巴瘤细胞对BTK抑制剂耐药性的产品中的应用。
进一步地，所述产品为试剂或试剂盒。
本发明还提供一种预测弥漫大B细胞淋巴瘤细胞对BTK抑制剂耐药性的产品，包含检测上述的生物标志物在弥漫大B细胞淋巴瘤组织或血清中含量的试剂。
进一步地，所述产品为试剂或试剂盒。
本发明还提供降低SMPD1和/或SPHK1表达量的试剂在制备提高弥漫大B细胞淋巴瘤细胞对BTK抑制剂敏感性的药物中的应用。
进一步地，所述试剂为核苷酸序列如SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.7所示的shRNA。
本发明还提供一种治疗弥漫大B细胞淋巴瘤的组合物，包括降低SMPD1和/或SPHK1表达量的试剂和BTK抑制剂。
本发明公开了以下技术效果：
本发明针对SMPD1在ABC-DLBCL中的表达和作用展开了研究，发现SMPD1在ABC-DLBCL组织及患者血清中高表达，经过体外ABC-DLBCL细胞系中检测SMPD1mRNA和蛋白表达情况，发现SMPD1高表达且促进ABC-DLBCL的肿瘤细胞增殖和耐药；进一步通过敲低/过表达SMPD1，发现SMPD1通过中间分子SPHK1活化NF-κB介导泽布替尼耐药。以上结果说明，SMPD1或SPHK1可以作为生物标志物，用于预测弥漫大B细胞淋巴瘤细胞对BTK抑制剂敏感性，从而有利于弥漫大B细胞淋巴瘤治疗方案的合理选择。
本发明还揭示了SMPD1/NF-κB新通路介导ABC-DLBCL对BTK抑制剂耐药的途径，为新的靶向药物研发提供了新思路，有望改善BTK抑制剂耐药现状。SMPD1/NF-κB信号通路关键分子具有成为BTK抑制剂耐药动态监测标志物的潜力，而且有望成为疗效方案中期评价的因素，并对治疗最终结果做出预判。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为BTK抑制剂耐药ABC-DLBCL细胞系的构建结果；其中，A为BTK抑制剂耐药ABC-DLBCL细胞系SUDHL2-R、U2932-R和OCI-LY10-R的泽布替尼IC50曲线；B为BTK抑制剂敏感与耐药ABC-DLBCL细胞系BTK蛋白表达水平的检测结果；
图2为描述BTK抑制剂敏感ABC-DLBCL细胞系及其抗性克隆的代谢谱变异性的PLS-DA图；其中，A-C分别为SUDHL2-S与SUDHL2-R、U2932-S与U2932-R和OCI-LY10-S与OCI-LY10-R的PLS-DA图；
图3为SMPD1蛋白组织和血清中高表达与临床完全缓解（CR）的相关性分析结果；其中，A为SMPD1在ABC-DLBCL组织和正常组织的表达（IHC），T：ABC-DLBCL组织阳性表达（×200）；N：正常组织阴性表达（×200）；B为SMPD1蛋白高表达（IHC）与临床完全缓解（CR）显著负相关；C为R-CHOP耐药后经泽布替尼联合化疗的ABC-DLBCL患者治疗前、疗后CR、疗后non-CR及正常人血清中SMPD1浓度水平的比较结果；D为受试者工作特征曲线：血清中SMPD1水平评价CR的特异性和敏感性；E为血清中SMPD1高浓度与CR显著负相关；
图4为BTK抑制剂敏感与耐药ABC-DLBCL细胞系SMPD1 mRNA、蛋白表达及在耐药和肿瘤细胞增殖方面的差异研究结果；其中，A为耐药/敏感细胞系的SMPD1转录水平检测结果；B为耐药/敏感细胞系的SMPD1翻译水平检测结果；C为BTK抑制剂敏感与耐药ABC-DLBCL细胞系的泽布替尼IC50曲线；D为BTK抑制剂敏感与耐药ABC-DLBCL细胞系的生长曲线；
图5为BTK抑制剂敏感与耐药ABC-DLBCL细胞系的SMPD1下游信号通路分子检测结果；其中，A为耐药细胞系U2932-R和OCI-LY10-R敲降SMPD1后p-NF-κB p65、NF-κB p65和IκB的表达水平检测结果；B为SMPD1和p-NF-κB p65在ABC-DLBCL肿瘤组织同一位置的表达检测结果；B中标尺均为100μm；
图6为SMPD1/NF-κB通路中间分子之一SPHK1活化NF-κB且在组织和血清中的表达与疗效的相关性研究结果；其中，A为耐药/敏感细胞系的SPHK1转录水平检测结果；B为耐药/敏感细胞系的SPHK1翻译水平检测结果；C为SPHK1在ABC-DLBCL组织和正常组织的表达（IHC）检测结果，T：ABC-DLBCL组织阳性表达（×200）；N：正常组织阴性表达（×200）；D为SPHK1蛋白高表达（IHC）与临床完全缓解（CR）呈现负相关趋势；E为R-CHOP耐药后经泽布替尼联合化疗的ABC-DLBCL患者治疗前、疗后CR、疗后non-CR、正常人血清中SPHK1浓度水平的比较结果；F为受试者工作特征曲线：血清中SPHK1评价CR的特异性和敏感性；G为血清中SPHK1浓度与CR显著负相关；H为耐药/敏感细胞系OCI-LY10-R敲降/过表达SPHK1后，p-NF-κB p65、NF-κB p65、IκB的表达水平检测结果；C中标尺均为100μm。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
实施例1
1.材料和方法
1.1细胞系和患者标本
人ABC-DLBCL细胞系（SUDHL2、U2932和OCI-LY10）购自ATCC细胞库；BTK抑制剂耐药ABC-DLBCL-R细胞系是根据药物浓度梯度递增法构建。本发明使用的BTK抑制剂为泽布替尼。选取首都医科大学附属北京友谊医院和中国医学科学院肿瘤医院2021年1月至2023年6月期间收治的经规范R-CHOP方案治疗失败，接受二线化疗联合BTK抑制剂的R/R（Relapsed/Refractory，R/R）DLBCL患者68例，所有患者的诊断均符合世界卫生组织（WHO）2016年关于淋巴组织肿瘤修订版分类标准。在研究之前，从每个患者和健康志愿者那里获得了书面知情同意。
1.2病例纳入和排除标准
1.2.1病例纳入标准：
（1）经活检证实为DLBCL；
（2）行规范R-CHOP样方案化疗后失败，接受二线化疗联合BTK抑制剂的R/R DLBCL患者。
（3）无严重心肝肾系统疾病；
（4）具有可评估的病灶且预期生存时间>3个月。
复发的定义：复发是指初次化疗获得完全缓解（complete remission，CR）后复发的淋巴瘤。复发/难治性DLBCL目前尚无公认明确定义，本发明参考文献，满足以下任何1项即可诊断：
（1）经标准方案规范化疗4个疗程，肿瘤缩小<50%或病情进展；
（2）经标准方案化疗达CR，但半年内复发；
（3）CR后2次或2次以上复发；
（4）造血干细胞移植后复发。
1.2.2排除标准：
（1）其他类型NHL；
（2）存在化疗禁忌症；
（3）存在精神性疾病；
（4）HIV病史、活动性或慢性丙型或乙型肝炎、妊娠或哺乳期；
（5）病例资料及随访资料不完善者。
1.2方法
1.2.1耐药细胞系建立
采用药物浓度梯度递增法诱导ABC-DLBCL细胞系（SUDHL2、U2932和OCI-LY10）BTK抑制剂泽布替尼耐药。取处于对数生长期的肿瘤细胞，加入起始浓度为2μmol/L（约为亲本细胞株IC50的1/10）的泽布替尼作用24h，弃去培养液，PBS清洗2遍，更换不含药物培养基，细胞恢复生长活性后，传代复以低浓度作用细胞24h，重复上述药物冲击直至细胞能够在此浓度稳定生长。而后倍比提高药物浓度继续培养，每种浓度冲击6次。药物诱导历时8个月，直到耐药细胞IC50达到亲本细胞5倍以上，完成泽布替尼耐药细胞系ABC-DLBCL-R（SUDHL2-R、U2932-R和OCI-LY10-R）的构建。
1.2.2细胞培养
ABC-DLBCL和ABC-DLBCL-R细胞系置于37℃，5% CO2环境的培养箱中培养，培养基为含有10%胎牛血清（Invitrogen，San Diego，CA，USA）、100U/mL青霉素（thermo）和50ug/mL链霉素（thermo）的RPMI-1640培养液，当细胞达对数生长期时进行实验。
1.2.3差异代谢物筛选
对亲本细胞和耐药细胞进行靶向代谢组学检测，筛选差异代谢物。首先建立广泛靶向代谢组学1000余种物质的疾病分子数据库，该数据库包含如脂肪酸，氨基酸、多肽和类似物，核苷、核苷酸和类似物，磷脂酰类等在内的十六类代谢物质，全面覆盖极性与非极性、亲水与疏水性功能代谢物，并广泛覆盖疾病相关的重要通路，如能量代谢、脂质代谢、氨基酸代谢通路等。检测采用液相色谱质谱联用（LC-MS）法，LC/MS部分基于Shimadzu NexeraX2 LC-30AD系统，应用选择性反应/多反应监测（SRM/MRM）技术，以标准品为参照，对特定代谢物群进行有针对性地、特异性地检测与分析，获得目标代谢物的绝对定量结果。继而对亲本和耐药细胞系代谢物进行差异比对和生物信息学分析，筛选获得差异最显著且具有临床意义的代谢物与代谢酶。
1.2.4免疫组织化学染色和ELISA
免疫组织化学和免疫染色使用的抗体如下：抗SMPD1抗体（1:100，ab272729，Abcam）、抗SPHK1（1:100，12071S，CST）。使用PV-9000聚合物检测系统（PV9000，ZSGB-BIO）进行免疫染色可视化。同时，使用SMPD1试剂盒（ELH-SMPD1）、SPHK1试剂盒（ELH-SPHK1）在血清水平验证组织学实验结果，通过ELISA对上述患者和对应匹配健康受试者的血清SMPD1、SPHK1浓度进行双孔检测。
1.2.5小干扰RNA的合成及质粒构建
针对SMPD1、SPHK1基因使用的siRNA和对照的非沉默siRNA由GenePharma（上海，中国）提供，用GenePharma构建了表达SMPD1和SPHK1的慢病毒载体或对照的shRNA。使用的siRNA序列如下：
SMPD1-Homo-9015-F：5’-GCCACACUCAUGUGGAUGAAUTT-3’（SEQ ID NO.1）；
SMPD1-Homo-9015-R：5’-AUUCAUCCACAUGAGUGUGGCTT-3’（SEQ ID NO.2）。
SMPD1-Homo-1740-F：5’-CAGGGCUCGAGAAACCUAUTT-3’（SEQ ID NO.3）；
SMPD1-Homo-1740-R：5’-AUAGGUUUCUCGAGCCCUGTT-3’（SEQ ID NO.4）。
SPHK1-homo-3675-F：5’-GCAGCUUCCUUGAACCAUUAUTT-3’（SEQ ID NO.5）；
SPHK1-homo-3675-R：5’- AUAAUGGUUCAAGGAAGCUGCTT-3’（SEQ ID NO.6）。
作为对照的非沉默siRNA序列为：5’-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3’（SEQ ID NO.7）。使用的shRNA序列如下：
shRNA-SMPD1-1：5’-CAGGGCTCGAGAAACCTATTT-3’（SEQ ID NO.8）；
shRNA-SMPD1-2：5’-GCCACACTCATGTGGATGAATTT-3’（SEQ ID NO.9）。
shRNA-SPHK1-1：5’-GCAGGCAUAUGGAGUAUGATT-3’（SEQ ID NO.10）。
shRNA-SPHK1-2：5’-UCAUACUCCAUAUGCCUGCTT-3’（SEQ ID NO.11）。
scramble序列为5’-GGATCATCATGCTATGCAGTT-3’（SEQ ID NO.12）。
1.2.6转染法与慢病毒转导
使用Lipofetamine2000（Life Technologies，Carlsbad，CA，USA）将siRNA导入目标细胞。用于SMPD1、SPHK1基因敲降的siRNA的最终浓度为100nM。48h后收集细胞进行后续分析。用慢病毒转导ABC-DLBCL细胞，用1μg/mL嘌呤霉素（Sigma-Aldrich）筛选稳定表达SMPD1-shRNA、SPHK1-shRNA的细胞株及对照scramble-shRNA（sh-scramble），培养1周。
1.2.7细胞存活率和集落形成试验
使用细胞计数试剂盒-8（CCK-8，Dojindo，日本）测量细胞活性。将细胞接种于96孔板中，每孔的细胞密度为2000个细胞，一式三份。使用ELX808微板分光光度计（BioTekInstruments，Winooski，VT，USA）测量450 nm处的吸光度。集落形成实验：将细胞接种于500个/孔的6孔板中，一组三份，培养10~14天形成集落。用甲醛冻存，结晶紫染色。对可见的菌落进行计数。
1.2.8蛋白质免疫印迹
总蛋白使用RIPA缓冲液（Applygen，Beijing，China）与蛋白酶抑制剂（Bimake，B14001）和磷酸酶抑制剂（Bimake，B15001）分离。按照规范流程进行蛋白质免疫印迹操作，使用的一抗如下：抗SMPD1（1:1000，ab272729，Abcam）、抗SPHK1（1:1000，12071S，CST）、抗p-NF-κB p65（Ser536）（1:1000，3033S，CST）、抗NF-κB p65（1:1000，8242S，CST）、抗IκBα（1:1000，4812S，CST）。β-actin（1:1000，4970S，CST）用于上样对照。二抗：Horseradish enzymelabeled Goat anti rabbit IgG（H+L）（1:5000，Zb-2301，ZSGB-Bio）。使用超强化学发光（ECL）检测试剂（ThermoFisher）显示信号，采用AMERSHAM ImageQuant 800进行免疫印迹定量分析。
1.2.9 RNA extract and real-time PCR
在泽布替尼处理后，用RNApure组织细胞试剂盒（Cwbiotech，Beijing，China）提取总RNA。以提取的RNA为模板，使用HiFiScript cDNA合成试剂盒（CwBiotech）进行逆转录反应。使用SYBR®Fast qPCR Mix（TaKaRa，Shiga，Japan）和CFX96实时系统（Bio-Rad）进行实时定量RT-PCR分析。将靶基因的相对mRNA表达归一化为内源性参照（β-actin）。本发明所使用的引物序列如下：
SPHK1-F-1：5’-AACTACTTCTGGATGGTCAG-3’（SEQ ID NO.13）；
SPHK1-R-1：5’-TCCTGCAAGTAGACACTAAG-3’（SEQ ID NO.14）；
SPHK1-F-2：5’- GCTGCGAAGTTGAGCGAAAA-3’（SEQ ID NO.15）；
SPHK1-R-2：5’-GGCTGGACCCAGTCGG-3’（SEQ ID NO.16）；
SMPD1-F-1：5’- AAAGCCCAAATGCTGCTGTG-3’（SEQ ID NO.17）；
SMPD1-R-1：5’-ACAGCTCCTGTCTTGTCTGC-3’（SEQ ID NO.18）；
SMPD1-F-2：5’-CTGCGCACCCTCAGAATTGG-3’（SEQ ID NO.19）；
SMPD1-R-2：5’- TGTCTCCTCGATCCTCAGCA-3’（SEQ ID NO.20）；
β-actin-F：5’- GAGCACAGAGCCTCGCCTTT-3’（SEQ ID NO.21）；
β-actin-R：5’-TCATCATCCATGGTGAGCTGG-3’（SEQ ID NO.22）。
1.2.10 GST融合蛋白沉降和质谱分析
pGEX-KG-SMPD1的构建：首先分析并确定SMPD1基因的双酶切位点，之后设计PCR上、下游引物，使用PCR扩增SMPD1基因，通过酶切、回收、连接、转化鉴定等步骤，将SMPD1基因导入pGEX-KG载体（购自生物公司）中，实现pGEX-KG-SMPD1的构建。
将pGEX-KG载体和pGEX-KG-SMPD1质粒，分别转化感受态细胞BL21（DE3），诱导GST融合目的蛋白的表达及纯化，分别获得pGEX-KG空载-GST和pGEX-KG-SMPD1-GST。
取等量的pGEX-KG空载-GST和pGEX-KG-SMPD1-GST融合蛋白溶液，分别加入40 μLGST琼脂糖珠，4℃翻转孵育6小时。在使用1×PBS适当清洗后，分别与细胞裂解液在4℃下翻转孵育过夜，非变性裂解液洗GST琼脂糖珠一次，再使用适量的1×PBS清洗GST琼脂糖珠5次。然后加入2×蛋白上样缓冲液，100℃加热5分钟，瞬时离心获得与SMPD1相互作用的蛋白集合，然后通过SDS-PAGE电泳进行分离。经考马斯亮蓝染液染色并脱色后，以空载组为对照，分别切取两组的差异条带，并将高丰度蛋白和低丰度蛋白分管保存，进行后续的质谱鉴定。
1.2.11免疫共沉淀法
使用含有蛋白酶抑制剂的非变性裂解缓冲液（Applygene）进行总蛋白的分离。将蛋白G琼脂糖珠与抗SMPD1（Abcam）、抗SPHK1（CST），鼠或兔IgG（Applygen）在室温下孵育1h，加入蛋白裂解液，4℃孵育过夜。之后离心收集免疫沉淀物，用PBST洗涤。对混合物进行蛋白质印迹分析。
1.2.12统计分析
使用SPSS 23.0进行统计分析，并使用GraphPad Prism 8.0版和R软件生成图表。每次实验重复三次，实验数据以平均±标准差（SD）表示。采用配对t检验（正态分布）或Wilcoxon配对符号秩检验（非正态分布）比较治疗前后SMPD1、SPHK1表达水平，采用Mann-Whitney U检验比较耐药/敏感细胞系的SMPD1、SPHK1表达水平。通过Pearson相关性检验进行SMPD1、SPHK1表达水平与临床预后的相关性分析。根据OPLS-DA模型选择同时具有多维统计分析VIP>1和单变量统计分析P<0.05的代谢物。
2.结果
2.1 BTK抑制剂耐药ABC-DLBCL细胞系的鞘磷脂代谢明显异常
本发明通过药物浓度梯度递增法对ABC-DLBCL细胞系（SUDHL2、U2932和OCI-LY10）应用BTK抑制剂泽布替尼诱导耐药，建立了三株泽布替尼耐药细胞系（SUDHL2-R、U2932-R和OCI-LY10-R）（见图1中A和B）。通过CCK8法检测泽布替尼对细胞的半数抑制浓度IC50（halfmaximal inhibitory concentration），计算耐药细胞的耐药指数（resistance index，RI），RI=耐药细胞系的IC50/亲代细胞系的IC50。SUDHL2的IC50为17.09μmol/L，SUDHL2-R的IC50为90.29 μmol/L，RI为5.28；U2932的IC50为27.98 μmol/L，U2932-R的IC50为144.0 μmol/L，RI为5.14；OCI-LY10的IC50为22.48 μmol/L，OCI-LY10-R的IC50为117.5 μmol/L，RI为5.23。RI>5则认为耐药细胞系的耐药性符合耐药株的要求，结果显示该三株细胞系均满足耐药细胞系条件（RI＞5）。此外，对ABC-DLBCL细胞系应用泽布替尼构建耐药细胞系后，耐药细胞系SUDHL2-R，U2932-R，OCI-LY10-R的BTK水平显著下调，发生明显抑制，说明BTK抑制剂无法针对耐药细胞BTK靶点再发挥作用（见图1中B）。
应用超高效液相色谱联合质谱技术对亲本ABC-DLBCL细胞系和BTK抑制剂耐药ABC-DLBCL细胞系进行了广泛靶向代谢组学检测，根据OPLS-DA模型选择同时具有多维统计分析VIP>1和单变量统计分析P<0.05的代谢物，作为具有显著性差异的代谢物。对亲本/耐药三组代谢差异物取交集共筛选出42种物质（图2）。进而对三组差异代谢物进行层次聚类的双聚类分析以及KEGG基因组通路和功能分析，发现BTK抑制剂耐药ABC-DLBCL细胞系的鞘磷脂代谢发生显著差异。
2.2 BTK抑制剂治疗后，患者组织和血清中SMPD1水平显著升高且与疗效有关
采用免疫组化方法分析SMPD1在68例R-CHOP耐药后经泽布替尼联合化疗的ABC-DLBCL组织中的表达，结果显示SMPD1定位于细胞浆，且SMPD1表达强度与临床完全缓解（CR）差异有显著意义（P=0.038），呈显著负相关。上述患者血清中SMPD1浓度水平与CR差异同样有显著意义（P=0.008）。提示组织和血清中SMPD1升高对评价疗效有潜在价值（见图3）。
2.3 SMPD1高表达促进ABC-DLBCL的肿瘤细胞增殖和耐药
体外ABC-DLBCL细胞系中检测SMPD1 mRNA和蛋白表达情况显示，耐药细胞系SUDHL2-R、U2932-R和OCI-LY10-R的SMPD1表达水平较敏感细胞系显著上调，提示BTK抑制剂耐药ABC-DLBCL细胞系SMPD1在转录、翻译水平显著增强（见图4中A和B）；耐药细胞系SUDHL2-R、U2932-R和OCI-LY10-R，敲降SMPD1后，IC50较阴性对照显著降低；敏感细胞系SUDHL2、U2932和OCI-LY10过表达SMPD1后，IC50较空载显著升高；提示SMPD1在增强ABC-DLBCL的BTK抑制剂耐药性上发挥了重要作用（见图4中C）；耐药细胞系SUDHL2-R、U2932-R和OCI-LY10-R敲降SMPD1后，细胞增殖较对照组受到显著抑制；敏感细胞系SUDHL2、U2932和OCI-LY10过表达SMPD1后，细胞增殖较对照组显著增强；证明SMPD1促进了ABC-DLBCL的肿瘤细胞增殖（见图4中D）。
2.4 SMPD1通过磷酸化NF-κB上调其活性，进而增强NF-κB核表达，调控ABC-DLBCL耐药
为了研究SMPD1影响ABC-DLBCL治疗反应和预后的分子机制，本发明通过敲降/过表达SMPD1，发现耐药细胞系U2932-R，OCI-LY10-R敲降SMPD1后，p-NF-κB p65下调，NF-κBp65不变，IκB上调；敏感细胞系U2932，OCI-LY10过表达SMPD1后，p-NF-κB p65上调，NF-κBp65不变，IκB下调（见图5中A）；证明SMPD1可能不通过降解IκB途径激活NF-κB，而是通过磷酸化NF-κB上调其活性，进而增强NF-κB核表达，调控ABC-DLBCL耐药；此外，SMPD1和p-NF-κBp65在ABC-DLBCL肿瘤组织中共同高表达（见图5中B），提示SMPD1可能对p-NF-κBp65具有调控作用。
2.5 SMPD1/NF-κB通路通过中间分子SPHK1活化NF-κB且SPHK1与疗效有关
为进一步探索SMPD1相互作用分子，利用生物信息学分析和Western Blot检测的SMPD1相互作用蛋白，寻找具有转录调控作用的分子。其次，通过GST-pull down和质谱（MS）技术，捕获可与SMPD1结合的肽段并测序，将所测肽谱与数据库比对，获得可与SMPD1结合的候选蛋白，通过Co-IP等实验验证SMPD1和下游分子相互作用关系。继而进行回复实验，验证SMPD1相互作用分子对ABC-DLBCL细胞表型和BTK抑制剂敏感性的影响。结果显示，耐药细胞系SUDHL2-R、U2932-R和OCI-LY10-R的SPHK1表达水平较敏感细胞系显著上调，提示BTK抑制剂耐药ABC-DLBCL细胞系SPHK1在转录、翻译水平显著增强。（见图6中A和B）；通过分析SPHK1在ABC-DLBCL组织和正常组织的表达（IHC），发现SPHK1在ABC-DLBCL组织阳性表达（×200）（见图6中C）；而在正常组织则表现为阴性，进一步分析发现SPHK1蛋白高表达（IHC）与临床完全缓解（CR）呈现负相关趋势（见图6中D）；通过R-CHOP耐药后经泽布替尼联合化疗的ABC-DLBCL患者治疗前、疗后CR、疗后non-CR、正常人血清中SPHK1浓度水平的比较，结果提示血清中SPHK1浓度与CR显著负相关（见图6中E、F和G）；耐药细胞系OCI-LY10-R敲降SPHK1后，p-NF-κB p65下调，NF-κB p65不变，IκB上调；敏感细胞系OCI-LY10过表达SPHK1后，p-NF-κBp65上调，NF-κB p65不变，IκB下调，证明SPHK1可能不通过降解IκB途径激活NF-κB，而是通过磷酸化NF-κB上调其活性，进而增强NF-κB核表达，调控ABC-DLBCL耐药（见图6中H）。
综上所述，本发明通过前期BTK抑制剂耐药细胞系的建立以及亲本/耐药细胞代谢差异物的筛选和分析，发现BTK抑制剂耐药的ABC-DLBCL细胞系的SMPD1所在鞘磷脂代谢发生显著差异。之后通过IHC、ELISA方法确定SMPD1对ABC-DLBCL BTK抑制剂耐药发生的影响，进一步通过敲降/过表达SMPD1等实验分析SMPD1介导ABC-DLBCL BTK抑制剂耐药发生的分子机制，确切证实了SMPD1高表达能够促进ABC-DLBCL的肿瘤细胞增殖和耐药，且通过中间分子SPHK1磷酸化NF-κB上调其活性，进而增强NF-κB核表达，调控ABC-DLBCL耐药。本发现将有助于加深对ABC-DLBCL BTK抑制剂耐药机制的理解，改善BTK抑制剂耐药现状，证实了SMPD1及SPHK1是十分具有潜力的BTK抑制剂耐药治疗靶点，为新的靶向药物研发提供新思路。
本发明对ABC-DLBCL BTK抑制剂耐药机制进行了研究，研究结果表明SMPD1/NF-κB信号通路存在，且参与了BTK抑制剂耐药的调控，本研究进一步揭示了SMPD1在抗肿瘤免疫中的作用，这一发现有望改变R/R ABC-DLBCL患者的BTK抑制剂耐药现状，进而改善患者预后。本发明发现了SMPD1与BTK抑制剂耐药之间的关系，提供了一个SMPD1或SPHK1抑制剂与BTK抑制剂联合治疗ABC-DLBCL的治疗方法，推动了ABC-DLBCL BTK抑制剂耐药机制及联合用药的研究。
SMPD1/NF-κB信号通路关键分子异常改变具有BTK抑制剂耐药动态监测标志物的潜力，而且有望成为疗效方案中期评价的因素，并对治疗最终结果做出预判。利用该标志物进行预测，既利于R-CHOP样方案治疗失败后二线治疗的合理选择，兼顾疗效同时，重视治疗性价比，又有望成为疗效方案中期评价的因素，并对治疗最终结果做出预判。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
Claims (10)
1.一种预测BTK抑制剂耐药性的生物标志物，其特征在于，所述生物标志物为SMPD1或SPHK1；
所述BTK抑制剂耐药性是指弥漫大B细胞淋巴瘤细胞对所述BTK抑制剂的耐药性。
2.根据权利要求1所述的生物标志物，其特征在于，所述SMPD1或所述SPHK1的表达量升高提示所述弥漫大B细胞淋巴瘤细胞对所述BTK抑制剂的耐药性提高。
3.根据权利要求1所述的生物标志物，其特征在于，所述BTK抑制剂为泽布替尼。
4.检测权利要求1所述的生物标志物在弥漫大B细胞淋巴瘤组织或血清中含量的试剂在制备预测弥漫大B细胞淋巴瘤细胞对BTK抑制剂耐药性的产品中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述产品为试剂或试剂盒。
6.一种预测弥漫大B细胞淋巴瘤细胞对BTK抑制剂耐药性的产品，其特征在于，包含检测权利要求1所述的生物标志物在弥漫大B细胞淋巴瘤组织或血清中含量的试剂。
7.根据权利要求6所述的产品，其特征在于，所述产品为试剂或试剂盒。
8.降低SMPD1和/或SPHK1表达量的试剂在制备提高弥漫大B细胞淋巴瘤细胞对BTK抑制剂敏感性的药物中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述试剂为核苷酸序列如SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.7所示的shRNA。
10.一种治疗弥漫大B细胞淋巴瘤的组合物，其特征在于，包括降低SMPD1和/或SPHK1表达量的试剂和BTK抑制剂。
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