NO323532B1 - Fremgangsmate for identifisering av kjemoterapeutiske midler ved bruk av transkripsjonsfaktor DP-1 - Google Patents

Fremgangsmate for identifisering av kjemoterapeutiske midler ved bruk av transkripsjonsfaktor DP-1 Download PDF

Info

Publication number
NO323532B1
NO323532B1 NO19951641A NO951641A NO323532B1 NO 323532 B1 NO323532 B1 NO 323532B1 NO 19951641 A NO19951641 A NO 19951641A NO 951641 A NO951641 A NO 951641A NO 323532 B1 NO323532 B1 NO 323532B1
Authority
NO
Norway
Prior art keywords
protein
dna
binding
complex
drtf1
Prior art date
Application number
NO19951641A
Other languages
English (en)
Other versions
NO951641L (no
NO951641D0 (no
Inventor
Nicholas Barrie La Thangue
Original Assignee
Prolifix Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from GB929222715A external-priority patent/GB9222715D0/en
Priority claimed from GB939316206A external-priority patent/GB9316206D0/en
Application filed by Prolifix Ltd filed Critical Prolifix Ltd
Publication of NO951641D0 publication Critical patent/NO951641D0/no
Publication of NO951641L publication Critical patent/NO951641L/no
Publication of NO323532B1 publication Critical patent/NO323532B1/no

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5091—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing the pathological state of an organism
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4738—Cell cycle regulated proteins, e.g. cyclin, CDC, INK-CCR
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6897—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids involving reporter genes operably linked to promoters
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5011—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing antineoplastic activity
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6872—Intracellular protein regulatory factors and their receptors, e.g. including ion channels
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)

Description

Det er fremskaffet et polymikleotid i hovedsak i isolert form,
og som omfatter en sammenhengende sekvens av nukleotider
som er i stand til selektivt å hybridisere til Seq. ID nr. 1 eller
til komplementet av Seq. ID nr. 1, samt et polypeptid i
hovedsak i isolert form og som omfatter: (a) proteinet av
Seq. ID nr. 2; eller (b) en allelisk variant eller artshomolog
derav; eller c) et protein som er minst 70% homologt med (a)
eller (d) et fragment av enhver av (a) til (c) som er i stand til
å danne et kompleks med E2F-1 proteinet eller relatert
familiemedlem; eller (e) et fragment av enhver av (a) til (c)
på minst 15 aminosyrer.
Foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte for identifisering av forsøksvise kjemoterapeutiske midler til behandling av proliferative eller virale sykdommer som angitt i krav 1.
De molekylære hendelser som inntreffer i løpet av celle-cyklusen må integreres med transkripsjonsapparaturen, slik at genekspresjonen kan bli synkronisert med cellecyklusprogresjonen. Nylig har en transkripsjonsfaktor kalt DRTF1 eller E2F blitt identifisert og blitt vist å binde til pRb, som er proteinproduktet av retinoblastoma susceptibilitets-genet, et anti-onkogen eller tumor-suppressorgen (se f.eks. Wagner og Green, Nature 352, 189-190, 1991). Det er en ut-bredt antagelse at den cellulære transkripsjonsfaktor DRTF1/E2F virker som en nøkkelkomponent i cellecykluskon-troll fordi den assosierer med viktige cellecyklusregule-rende proteiner så som retinoblastoma genproduktet (pRb), pl07, cykliner og cyklinavhengige kinaser, og videre blir dens transkripsjonene aktivitet modulert av visse virale onkoproteiner, så som adenovirus Ela, SV40 stort T antigen, og det humane papillomavirus E7-protein.
Det er antatt at transkripsjonsfaktoren DRTF1/E2F spiller en viktig rolle i å integrere cellecyklushendelser med transkripsjonsapparaturen, fordi i løpet av cellecyklusprogresjonen i pattedyrceller undergår den en serie av periodiske interaksjoner med molekyler som er kjent for å være viktige regulatorer av cellulær proliferasjon. For eksempel binder retinoblastoma tumorsuppressor genproduktet (pRb), som negativt regulerer progresjon fra Gl- til S-fase og ofte blir modifisert i tumorceller, til DRTF1/E2F. På lignende måte opptrer det pRB-relaterte protein pl07 i hovedsak i et S-fasekompieks med DRTF1/E2F. Både pRb og pl07 undertrykker den transkripsjonene aktivitet av DRTF1/E2F, noe som sannsynligvis er fundamentalt viktig for regulering av cellulær proliferasjon, fordi DRTFl/E2F-bindende seter (E2F-setet) opptrer i kontrollområdene hos mange gener som er involvert med proliferasjon, så som c-myc og P34<0**>. Videre klarer mutante Rb-proteiner, som er kodet av alleler isolert fra tumorceller, ikke å binde til DRTF1/E2F, og er således ute av stand til å innvirke på E2F seteavhengig transkripsjonen aktivering. Et annet viktig trekk ved DRTF1/E2F er at visse virale onkoproteiner, så som adenovirus Ela, SV40 stort T antigen og human papillomavirus E7, modulerer dens aktivitet ved å atskille pRb og pl07 fra den inaktive transkripsjonsfaktor. Denne effekt krever områder i disse virale proteiner som er nødvendige for transformasjon av vevskulturceller og således for å overvinne vekstkontroll. Således kan disse onkoproteiners evne til å regulere DRTF1/E2F være måten de hopper over de normale mekanismer for cellulær vekstkontroll på, og om-vendt kan transkripsjonen undertrykking ved pRb være basis for pRb-mediert negativ vekstkontroll.
En potensiell mekanisme for å integrere de transkripsjons-regulerende egenskaper av pRb og pl07 med andre cellecyklushendelser ble antydet ved identifisering av cyklin A og den cdc2-relaterte cyklinavhengige kinase p33<cdk2> i DRTF1/- E2F-komplekset. Cyklin A er nødvendig for progresjon gjennom S-fase, en funksjon som muligens kunne bli gitt via dens evne til å rekruttere den cyklinavhengige kinase P330"<*2> til DRTF1/E2F. Til sammen antyder disse data at DRTF1/E2F er en transkripsjonsfaktor hvis hovedrolle kan være å overføre cellecyklushendelser til transkripsjonsapparaturen via molekyler som et pRb, pl07, cykliner og cdks, for således å sikre at genekspresjonen blir synkronisert og integrert med cellecyklusprogresjonen.
I den senere tid har en transkripsjonsfaktor med egenskapene til E2F blitt klonet og sekvensert (Helin et al, Cell 70 (1992), 337-350 og Kealin et al, Cell 70 (1992), 351-364) .
Det er nå overraskende funnet at proteinet betegnet E2F er et kompleks av faktorer, omfattende faktoren klonet av Helin et al. og Kealin et al., samt et nytt protein hvis cDNA-sekvens er angitt nedenfor som Seq. ID nr. 2. Sekvensen av det cDNA som koder for dette protein er vist nedenfor som Seq. ID nr. 1. Det nye protein blir referert til av oppfinnerne som DP-1. Selv om man ikke ønsker å være bundet av noen spesiell teori, er det antatt at faktoren som er klonet av Helin et al. og Kealin et al., kan dimerisere med DP-1. Bevis presentert i de medfølgende eksempler viser at DP-1 og proteinet til Helin et al. (referert til som E2F-1) danner et kompleks som er involvert i reguleringen av transkripsjon.
Det har også blitt funnet at E2F-1 er en av en familie av beslektede transkripsjonsfaktorkomponenter. Medlemmer av denne familie er antatt å samvirke med DP-1 for å danne en serie av de ovennevnte transkripsjonsfaktorer.
Kort beskrivelse av tegningene
Figur 1 viser resultatene av affinitetsrensing av DP-l-proteiner fra F9 EC-celler. Figur 2 viser at DP-1 er et DNA-bindende polypeptid i E2F-komplekset.
Figur 3 viser sekvensspesifikk DNA-binding av DP-1.
Figur 4 viser en sammenligning mellom DP-1 og E2F-1. DP-1-sekvensene i figurene 4b og 4c er henholdsvis SEQ ID nr. 11 og SEQ ID nr. 13, og E2F-l-sekvensene i figurene 4b og 4c er henholdsvis SEQ ID nr. 12 og SEQ ID nr. 13. Figur 5 oppsummerer konstruksjonene som anvendes og de fremskaffede resultater erholdt i forsøk som viser at DP-1 aktiverer E2F-seteavhengig transkripsjon in vivo. Figur 6 viser at DP-1 og E2F-1 eksisterer i samme proteinkompleks in vivo. Figur 7 viser at DP-1 og E2F-1 binder til E2F-setet som et kompleks. Figur 8 viser interaksjonen mellom DP-1 og E2F-1 i gjærceller. Figur 9 viser at det er en funksjonell synergi mellom DP-1 og E2F-1 i Drosophila-celler. Figur 10 viser at DP-1 medvirker til E2F seteavhengig transkripsjon i F9 EC-celler. Figur 11 viser at DP-1 og E2F-1 aktiverer E2F seteavhengig transkripsjon i gjærceller.
Et polynukleotid som innbefatter et DNA som koder for proteinet av Seq. ID nr. 2 eller et fragment derav anvendes for å fremskaffe et protein som anvendes i fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen.
Polynukleotidet kan også omfatte RNA. Det kan også være et polynukleotid som innbefatter i seg syntetiske eller modifiserte nukleotider. Et antall forskjellige typer modifi-kasjoner av oligonukleotider er kjent innen faget. Disse inn-befatter metylfosfonat- og fosforotiolat-stammer, tilsetning av akridin- eller polylysinkjeder ved de 3' og/eller 5<*> ender av molekylet.
Et polynukleotid som beskrevet ovenfor kan bli satt inn i vektorer i en antisenseorientering for å fremskaffe produk-sjon av antisense RNA. Antisense RNA eller andre antisense polynukleotider kan også bli dannet ved syntetiske metoder. Slike antisense polynukleotider kan bli brukt i en metode for å kontrollere nivået av proteinet ifølge Seq. ID nr. 2 i en celle. En slik métode vil innbefatte trinnet å innføre i cellen antisensepolynukleotidet i en mengde som er effektiv til å hemme eller redusere nivået for translasjon av DP-1 mRNA til protein. Cellen kan være en celle som er under vekstfase på en ukontrollert måte, så som en tumor-celle.
Et protein ifølge Seq. ID nr. 2, homologer derav, samt fragmenter av sekvensen og dens homologer med minst 80% aminosyreidentitet med Seq. ID nr. 2 er i stand til å virke som en pattedyrtranskripsjonsfaktor. Et slikt polypeptid i i hovedsak isolert form, kan omfatte:
(a) proteinet ifølge Seq. ID nr. 2, eller
(b) en allelisk variant eller artshomolog derav, eller (c) et protein som er minst 80 % aminosyreidentitet med (a)
eller
(d) et fragment av enhver av (a) til (c) som er i stand til å danne et kompleks med E2F-1-proteinet eller beslektet familiemedlem,
Alle polypeptider innenfor denne definisjon blir referert til nedenfor som et peptid som kan anvendes i fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen.
Et polypeptid som kan anvendes i fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen vil være i hovedsak i isolert form dersom det er i en form hvor det er fritt for andre polypeptider med hvilke det kan være assosiert i det naturlige miljø i krop-pen. Det skal forstås at peptidet kan bli blandet med bæ-rermaterialer eller fortynningsmidler som ikke vil innvirke på det tiltenkte formål med polypeptidet og likevel være ansett som i hovedsak isolert.
Et protein som er minst 80 % identisk med Seq. ID nr. 2 vil være fortrinnsvis minst 90%, og mer foretrukket minst 95% identisk med proteinet ifølge Seq. ID nr. 2. Metoder for å måle proteinidentitet er velkjent i faget.
Generelt vil fragmenter ifølge Seq. ID nr. 2 eller dets alleliske varianter eller artshomologer derav som er i stand til å danne et kompleks med E2F-l-proteinet, være minst 10, fortrinnsvis minst 15, f.eks. minst 20, 25, 30, 40, 50 eller 60 aminosyrer lange.
Det vil være mulig å bestemme hvorvidt fragmenter danner et kompleks med E2F-l-proteinet ved å fremskaffe E2F-l-proteinet og fragmentet under betingelser hvor E2F-l-proteinet og DP-1 normalt danner en transaktiverende transkripsjonsfaktor og å bestemme hvorvidt et kompleks har blitt dannet. Bestemmelsen kan bli foretatt ved f.eks. å måle kompleksets evne til å binde et E2F-bindende sete in vitro, eller alternativt å bestemme molekylvekten av det forsøksvise kompleks ved metoder så som SDS-PAGE.
Foretrukne fragmenter innbefatter dem som er i stand til å danne et transaktiveringskompleks med E2F-1 eller dets relaterte familiemedlemmer. Eksemplene heri beskriver et antall metoder for å analysere funksjonen av DP-l-proteinet og disse kan bli tilpasset til å fastslå hvorvidt eller ikke et polypeptid er i stand til å danne et transaktiveringskompleks med E2F-l-proteinet. For eksempel kan fragmentet bli tilsatt til E2F-1 i nærvær av en reportergenkon-struksjon tilpasset til å bli aktivert av DP-1/E2F-1-komplekset, som beskrevet i figur 10. Et slikt forsøk vil bestemme hvorvidt polypeptidfragmentet har den nødvendige aktivitet.
Et polypeptid som kan anvendes i fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen kan bli merket med en påviselig markør. Den på-viselige markør kan være en hvilken som helst egnet markør som gjør det mulig å påvise polypep-tidet. Passende markø-rer innbefatter radioisotoper, f.eks. <1I5>I, enzymer, antistoff og linkere, så som biotin. Merkede polypeptider kan bli brukt i diagnostiske prosedyrer, så som immunoassays, for å bestemme mengden av DP-l-protein i en prøve.
Et polypeptid eller merket polypeptid kan også bli festet til en fast fase, f.eks. veggen av en immunoassayskål.
En gruppe av foretrukne polypeptider som kan anvendes i fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er slike som er basert på området av aminosyrer 160-220 av Seq. ID nr. 2. Dette område av proteinet har en homologi på omkring 40% med et lignende område av E2F-l-proteinet beskrevet av Helin et al. (ibid) og begge områder er formentlige alfaheliske områder. Selv om det ikke ønskes å være bundet av noen spesiell teori, antar søker at heterodemeriseringen av E2F og proteinet blir fremmet via disse homologe områder. Følgelig er det foretrukket polypeptider basert på dette området.
Foreliggende oppfinnelse fremskaffer et immunoassay som omfatter de trinn som er angitt i krav 1.
Spesielt fremskaffer oppfinnelsen et assay for å identifi-sere formentlige kjemoterapeutiske midler for behandling av proliferativ eller viral sykdom og som omfatter å bringe i kontakt E2F-l-protein eller et derivat derav, et polypeptid av Seq ID nr. 2 og et formentlig kjemoterapeutisk middel, og måle graden av inhibering av dannelse av E2F-1-Seq. ID nr. 2-proteinkomplekset forårsaket av midlet. Det behøver ikke være nødvendig å benytte fullstendig E2F-1 og/eller Seq. ID nr. 2-protein i dette assay så lenge det frem-skaffes tilstrekkelig protein, slik at under betingelsene for assayet ved fravær av midlet danner de en heterodimer. Således gir oppfinnelsen en utvelgelsesmetode for å iden-tifisere formentlige kjemoterapeutiske midler for behandling av proliferative sykdommer, hvilken metode omfatter
(A) å bringe i kontakt
(i) et polypeptid av Seq. ID nr 2,
(ii) (a) E2F-l-proteinet, eller
(b) en allelisk variant eller artshomolog derav, med minst 80 % aminosyreidentitet med E2F-1 over et DNA-bindende område, eller (c) et fragment av (a) eller (b) eller som er i stand til å danne et funksjonelt transaktiverings-
kompleks med proteinet av Seq. ID nr. 2, eller
(d) et fusjonsprotein omfattende (a), (b) eller
(c) ,og
(iii) et formentlig kjemoterapeutisk middel,
under betingelser hvor komponentene (i) og (ii) i fravær av
(iii) danner et kompleks, og
(B) å måle utstrekningen i hvilken komponent (iii) er i stand til å ødelegge nevnte kompleks. I assayet kan en
eller flere av de tre komponenter være merket, f.eks. med en radioaktiv elle kolorimetrisk markør for å muliggjøre måling av resultatet av assayet.
Varianter, homologer og fragmenter av E2F-l-protein er definert på tilsvarende måte som variantene, homologene og fragmentene av DP-l-proteinet.
Komplekset av (i) og (ii) kan måles, f.eks. ved dets evne til å binde et E2F DNA-bindende sete in vitro. Alternativt kan assayet være et in vivo assay, hvor kompleksets evne til å aktivere en promoter omfattende et E2F-bindende område bundet til et reportergen blir målt. In vivo-assayet kan utføres f.eks. under henvising til eksemplene, som viser et slikt assay i gjær-, insekt-, amfibie- eller pattedyrceller.
Kandidater for terapeutiske midler som kan bli målt ved hjelp av assayet, innbefatter fragmenter på 10 eller flere aminosyrer av
(a) proteinet av Seq. ID nr. 2,
(b) en allelisk variant eller artshomolog derav, eller (c) et protein som er minst 80 % identisk med (a).
De følgende eksempler beskriver isoleringen og karakteri-seringen av det aktuelle protein som kan anvendes i fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen fra en murin kilde. Imidlertid er andre kilder, f.eks. mennesker eller andre pattedyr mulig å benytte på lignende måte.
Eksempler
Del A
Affinitetrensincr av DRTF1/ E2F fra F9 EC- celler Polypeptider i affinitetsrenset DRTF1/E2F (omkring 5 pg fra omkring 5xl0<10> F9 EC-celler) ble atskilt ved SDS-geleelek-troforese og farget med Comassie blue, som vist i figur 1 (spor 2); spor 1 viser molekylvektstandardene. DNA-bindende polypeptider i affinitetsrenset DRTF1/E2F ble undersøkt ved kryssbinding til det distale adenovirus E2A promoter E2A-sete (bindingssetedetaljer angitt i figuren) enten ved fravær (spor 4) eller nærvær av konkurrerende villtype (spor 5) eller mutante {spor 6) E2F-bindende seter; molekylvekt-standarder er vist i spor 3. p46-polypeptidet er angitt; den øvre parentes viser en annen gruppe polypeptider som også spesifikt binder til E2F-setet med omtrentlig molekylvekt 55.000.
Metoder: DRTF1/E2F ble affinitetsrenset fra helcelleekstrakter fremstilt fra F9 EC-celler som beskrevet av Shivji og La Thangue (1991) Mol. Cell. Biol. 11, 1686-1695, ved å bruke affinitetsmatriser inneholdende villtype E2F-setet tatt fra adenovirus E2A-promoteren (-71 til -50), innbefattende et ytterligere trinn som involverte påføring av den bindende aktivitet til en matrise inneholdende et mutant E2F-bindende sete (mutert i nukleotider -62 til - 60). Gjen- nomsnittlig ble omkring 5,0 pg protein opprenset fra et helcelleekstrakt fremstilt fra omkring 10<10>F9 EC-celler. UV-kryssbinding av DRTF1/E2F til E2F-setet ble utført ved å bruke omkring 50 ng affinitetsrenset protein. Konkurrering ble utført med omkring 100 ganger molart overskudd av enten villtype (-71 til -50) eller mutante (mutert i nukleotider -62 til -60) oligonukleotider.
Hukleotidsekvens av et cDNA som koder for murin DP- 1 Affinitetsrenset DRTF1 ble utfelt med TCA, underkastet elektroforese gjennom en SDS-polyakrylamidgel og p46 ble elektroeluert, idet renheten av p46 ble bekreftet ved elekroforese og sølvfarging av en liten prøve av det eluerte materiale. p46 be spaltet med en lysylendopeptidase, og peptidene ble renset med høyeffekts væske-kromatografi under anvendelse av "Aquapore AX-300" og "RP-300" i serie i 0,1% TFA med 1 1%/min acetonitrilgradient, Toppfraksjoner ble sekvensert ved automatisk Edman degradering i en 477A/120A gassvæske pulssekvensator (Applied Biosystems Inc.).
Et sett av degenererte oligonukleotidprimere ble synteti-sert på basis av aminosyresekvensen i peptidene 6 (75 til 91) og 5 (235 til 249) som følger: De C-terminale områder av peptid 6 (P N T H F V),
5'-CGCGGATCCCC(ACGT)AA(CT)AC(ACGT)CA(CT)TT(CT)GT-3<1> og peptid 5 (A Q E S Q N), antisensekjede
5<1>CGCGGATCCA(AG)(AG)TT(CT)TG(ACGT)(CG)(AT)-(CT)TC(CT)TG(ACGT)GC-3'; begge nukleotider innbefattet en linkersekvens ved den 5<*> ende. Peptid 5 antisense nukleotid ble brukt til å syntetisere cDNA fra F9 EC-celle RNA, som så ble brukt i en PCR med både peptid 6- og 5-primere. Pro-duktene ble subklonet, sekvensert og cDNA avledet fra DP1-RNA identifiserte ved nærvær av peptidene 21 og 3 to ytterligere peptider fremskaffet ved mikrosekvensering av peptider avledet fra p46, som ligger mellom peptidene 6 og 5. Dette cDNA-fragment ble brukt til å velge ut flere murine cDNA-bibliotek. DP-1 cDNA-kloner ble hyppig rearrangert og den endelige nukleotidsekvens vist i figuren ble fremskaffet fra cDNA isolert fra et F9 cellebibliotek.
DP- 1 er et DNA- bindende polypepid i DRTF1/ E2F og assosierer med pRb in vivo
Peptid 15 (som representerer DP-1 aminosyreresiduum 235 til 249) og peptid A (som representerer DP-1 aminosyreresiduum 3 til 15) ble koblet til KLH og brukt til å immunisere ka-niner. Dannelsen av antistoff og immunoblotting ble utført ved standard prosedyrer. I gel-retardasjonsassay ble omkring 5,0 ng av affinitetsrenset DRTF1/E2F eller omkring 5,0 ug av F9 EC grovcelleekstrakt undersøkt med enten villtype E2A-promoteren (-96 til 69) eller et oligonukleotid inneholdende E2A promotersekvensene -71 til -50 i nærvær av omkring 100 gangers molart overskudd av -62/-60 (E2A-sekvenser -71 til -50 mutert i posisjoner -62, -61 og -60 (ref. 23). Antipeptid A eller preimmunserum ble tilsatt i løpet av preinkuberingsperioden. Immunoutfelling av pRB fra JM helcelleekstrakter ble utført ved standard prosedyrer. Tilstedeværelsen av pRb i IF8 immunopresipitater ble bekreftet ved immunoblotting. Resultatene er vist i figur 2 som følger: a) DP-1 er tilstede i affinitetsrenset DRTF1/E2F: immuno-blot med affinitetsrenset DRTF1/E2F og anti-peptid 15 (aminosyreresiduer 235 til 249). Reaktivitet med p46 og p55 var kun tilstede i det immune (I, spor 2), men ikke i det preimmune (PI, spor 3) serum. Dette var spesifikt, fordi de ble fullstendig hemmet av peptid 15, men ikke et urelatert peptid, peptid 1 (sammenlign spor 6 og 5). Det er sannsynlig at p46 er et derivat av p55 (angitt i spor 3), fordi anti-peptid A {se nedenfor, derivert fra det N-terminale område av DP-1) kun påviste p55 (data ikke vist). Molekyl-vektstandarder er vist i spor 1, og <*> indikerer en ikke-spesifikk reaksjon. b) DP-1 er i det affinitetsrene DRTF1/E2F DNA-bindende kompleks hvor gelretardering ble utført med affinitetsrenset
DRTF1/E2F og adenovirus E2A-promoteren (-96 til +68) i nærvær av immmun (spor 3 til 6) eller preimmun (spor 2) anti-peptid A sammen med enten urelatert peptid 1 (spor 4 og 6) eller peptid 15 (spor 5). Spesifisiteten av bindingsreaksjonen ble bekreftet ved å inkludere 100 ganger molart overskudd av det villtype E2F-bindende sete (E2A-promoter - 71 til -50) i reaksjonen (spor 6); hvor alle andre reaksjoner inneholdt 100 gangers overskudd av det mutante sete.
c) DP-1 er i det DRTF1/E2F DNA-bindende kompleks i F9 EC-celleekstrakter: gelretardering ble utført i F9 EC helcelleekstrakter (hvori DRTF1/E2F utskilles som komplekser a),
b) og c) med et E2F-bindende sete (E2A promotersekvenser - 71 til -50) i nærvær av enten preimmun (spor 2) eller immun
(spor 3) anti-peptidserum. Superskiftet ble forhindret ved å innbefatte peptid A i bindingsreaksjonen (sammenlign duplikate spor 7 og 8 til 9 samt 10).
d) DP-1 assosierer med pRB in vivo: en immunoutfelling ble utført fra JM celleekstrakter med enten det anti-pRb monoklonale antistoff IF8 eller et kontroll monoklonalt antistoff A7. Immunopresipitatene ble behandlet med 1,0% deoksycholat (DOC), og det detegentfrigjorte materiale påviste DRTFl/E2F-aktivitet i en gelretardering som beskrevet ovenfor. DRTFl/E2F-bindende aktivitet ble kun påvist i anti-pRb immunopresipitatene (sammenlign spor 2 og 3). JM celleekstraktet uttømt for anti-pRb hadde reduserte nivåer av pRb-komplekset (sammenlign spor 4 til 5, kompleks angitt med a). Det detergentfrigjorte DRTF1/E2F ble ytterligere undersøkt for reaktivitet med anti-peptid A; hvor det immune, men ikke det preimmune serum dannet et superskift (sammenlign spor 6 til 7, angitt med
DP- 1 er et sekvensspesifikt DNA- bindende protein
Områder av DP-1 cDNA ble amplifikert i en PCR og subklonet i pGEX-2T (14). GST-DP-1<8>,-<2>(M og GST-cdk2 ble aff initetsren-set på glutation-Sepharose som tidligere beskrevet av Bandara et al., (1991), Nature, 352, 249-251. Gelretardering ble utført som beskrevet ovenfor med enten E2A-promoteren eller et oligonukleotid inneholdende E2A-sekvenser fra -82 til -50, hvor det mutante bindende sete hadde nukleotider - 62, -61 og -60 endret. UV-kryssbinding ble utført med omkring 5,0 ug GST fusjonsprotein.
a) GST fusjonsproteinet beskrevet i tegningen, GST-DP-
som inneholder DP-1 proteinsekvens fra aminosyreresiduum 84 til 104, ble uttrykt og affinitetsrenset til ho-mogenitet. Spor 1 viser det affinitetsrensede DP-1""<20<> og spor 2 viser standard molekylvektsmarkører.
b) DP-l-binder til det E2F-bindende sete: affinitetsrenset GST-DP-184*2" {omkring 1,0 ug) ble inkubert med enten E2A-promoteren (spor 2) eller oligonukleotider (WT- og MT-bindende seter, detaljer nederst på figuren) inneholdende E2A-promotersekvens -82 til -50 (spor 5) eller det samme inneholdende et mutant E2F-sete (spor 8). Et kontroll GST fusjonsprotein, GST-cdk2 (omkring 1,0 ug) hadde ingen bindende aktivitet (spor 3, 6 og 9), spor 1, 4 og 7 inneholder intet protein. c) Kryssbinding av DP-1 til DNA: affinitetsrenset GST-DP-l"-2" (spor 4) eller GST-cdk2 (spor 3) ble inkubert med E2A promotersekvensene -82 til -50 (angitt ved bunnen av sporene). Etter kryssbinding ble polypeptidene adskilt med SDS-gelelektroforese, kryssbundet GST-DP-l<ew<M> er angitt av parentesen. Intet fusjonsprotein ble tilsatt i spor 2, og molekylvektstandardene er angitt i spor 1. d) Bindende egenskaper av DP-1 i affinitetsrenset DRTF1/E-2F: binding av renset GST-DP-l"~<iM> eller kontrollfusjons-proteinet GST-cdk2 til E2A-promoteren ble undersøkt, enten alene (spor 5 og 6, omkring 1,0 ug) eller i nærvær av affinitetsrent DRTF1/E2F (spor 3 og 4, omkring 5,0 ng), hvor den bindende aktivitet av samme mengde affinitetsrent DRTF1/E2F blir undersøkt alene i spor 2, E2A-promoteren vist i spor 1. Bemerk at bindingskarakteristikaene for GST-DP-184"2<M og DRTF1/E2F er forskjellige når de undersøkes sammen (sammenlign spor 2, 3 og 5).
Sammenligning mellom DP- 1 og E2F- 1
Dette er vist i figur 4 som følger:
a) Linjediagram av DP-1 og E2F-1 som viser beliggenheten av de DNA-bindende domener (aminosyreresiduer 84 til 204 i DP-1, og 89 til 191 i E2F-1, se referanse 24) og et område med signifikant likhet (aminosyreresiduer 163 til 236 i DAP-1,
og 162 til ,226 i E2F-1) . Bemerk at området med likhet innbefatter sekvenser utenfor det DNA-bindende domene.
b) Overensstemmelse mellom aminosyresekvenser: sammenligning av DP-1 (topp) og E2F (bunn) sekvenser i områder
med likhet. Strekene angir identiske (uthevet) eller lignende (smal) aminosyreresiduer.
c) DP-1- og E2F-1-områdene med likhet danner en amfipatisk a-heliks. Presentasjon av DP-1 (høyre, aminosyrer 167 til
183) og E2F-1 (venstre, aminosyrer 166 til 182) områder med likhet som helisk hjul.
DP- 1 aktiverer E2F seteavhengig transkripsjon in vivo Enten 2,0 eller 6,0 ug av pG4, eller 2,8 eller 8,8 ug av pG-B9 (DP-l-ekspresjonsvektor) ble ko-transfektert med enten p3xWT (5,0 ug), p3xMT (5,0 ug) eller pCMVcat (0,5 ug) i SAOS-2-celler som angitt i figur 5 (konstruksjoner angitt i
a) .
p3xWT- og p3xMT- reporterkonstruksjoner inneholder enten
tre villtype eller tre mutante E2F-bindingsseter tatt fra adenovirus A2A-promoteren (-71 til -50, mutert ved nukleotider -62, -61 og -60), plassert oppstrøms for den minimale herpes simplex-virus thymidin-kinase-promoter, og har tidligere blitt beskrevet. pCMVcat inneholder øknings- og promoterområder (-301 til +72) tatt fra det umiddelbare tidlige gen av human cytomegalovirus. pG-B9 inneholder DP-1-proteinsekvens fra aminosyreresiduer 63 til 429, og ble fremstilt ved å erstatte det Gal4 DNA-bindende domene i pG4mpolyII med DP-1 cDNA B9. Transfeksjon i SAOS-2-celler ble utført og Cat-aktivitet ble bestemt og TLC-plater mengdebestemt med fosforbildeanordning.
Isolasjon av cDNA som koder for DP- 1
DRTF1 ble renset fra F9 EC helcelleekstrakter ved å bruke en høy stringens-prosedyre som involverte sekvensielle påføringer til en DNA-bindende seteaffinitetsmatrise inneholdende enten et villtype eller mutantbindende sete, og å påvise den DNA-bindende aktivitet med gelretardering (26). Det DNA-bindende sete ble tatt fra adenovirus E2A-promoteren (-71 til -51), et område som inneholder et høy-affinitets E2F-bindende sete (23). Denne prosedyre renset rutinemessig en gruppe av polypeptider (fig. 1, spor 2) som var i stand til effektivt å aktivere transkripsjon in vitro på en bindingsseteavhengig måte. Flere polypeptider i det affinitetsrensede materiale bandt spesifikt til villtypen, men ikke til det mutante E2F-sete (figur 1, sammenlign spor 5 og 6). Det mest hyppige polypeptid som spesifikt bandt, hadde en observert molekylvekt på omkring 46kD (figur 1, spor 2, angitt som p46). Deretter ble p46 skåret ut, spaltet med lysylendopeptidase, og de resulterende peptider ble renset og sekvensert; aminosyresekvensen for ti peptider ble erholdt. Oppfinnerne forutsa DNA-sekvensen som koder for to av peptidene, og disse ble så brukt som oligonukleotidprimere for å amplifikere et cDNA-fragment avledet fra F9 Ec RNA. Flere murine cDNA-biblioteker ble utvalgt med det klonede dDNA-fragment og en klon som representerer den fullstendige kodende sekvens av p46 (i det etterfølgende referert til som DP-1) ble endelig isolert fra et F9 EC cDNA-bibliotek.
Molekylære egenskaper av DP- 1
Den fullstendige DP-l-kodede sekvensen ble bestemt fra et 2,4 kb cDNA fragment. Dette cDNA inneholdt en åpen leseramme som koder for 429 i leseramme aminosyreresiduer som inkluderte åtte av peptidene fremskaffet fra sekvensering av p46. cDNA-sekvensen innbefatter sannsynligvis det initierende metionin, fordi et i leseramme terminerings-kodon eksisterer umiddelbart oppstrøms for dette, og videre ville nukleotidene som flankerer og innbefatter dette metionin være et effektivt translateringsinitieringssignal. Den lengste cDNA-klonen foreløpig isolert strekker seg 55 nukleotider 5' fra dette forutsagte initierende metionin. Imidlertid strekker den seg ikke til transkripsjons-initieringssetet, fordi primer utvidelsesanalyse med F9 EC celle RNA har indikert at initieringssetet er 250 nukleotider oppstrøms. Dette cDNA innbefatter også omkring 1,1 kb av 3'utranslatert sekvens, hvorav deler er presentert.
Ved northern analyse av polyadenylert F9 EC RNA ble stør-relsen av DP-1 transkriptet bestemt til å være omkring 2,6 kb. Det ble observert at DP-1 RNA blir kontinuerlig uttrykt i mange forskjellige celletyper når undersøkt ved in situ hybridisering i en mengde vev under murin embryogenese. I løpet av F9 EC celledifferensiering ble det funnet at DP-1 RNA blir marginalt nedregulert ettersom F9 EC stamceller differensierer. Southern analyse indikerte at DP-1 er kodet for av et enkelt gen.
Homologiundersøkelser av de for tiden tilgjengelige pro-teindatabaser (Leeds og Swiss) klarte ikke å påvise noen signifikant likhet mellom DP-1 og noe annet protein. Imidlertid observerte søker at et lite område innen det DNA-bindende domenet av DP-1 hadde signifikant likhet med et analogt område i det DNA-bindende domenet av E2F-1 (se nedenfor), et nylig karakterisert protein som også binder til E2F setet.
Karakterisering av DP- 1
For å bekrefte at DP-1 er en komponent av DRTF1/E2F, og for å bestemme hvorvidt det er til stede i det DRTF1/E2F DNA bindende kompleks, ble et antall antipeptidantisera fremskaffet mot forskjellige områder av DP-1 proteinet (fig. 2). Immunoblotting av affinitetsrenset DRTF1/E2F med anti-peptid 15 viste to polypeptider med observert molekylvekt 46 kD og 55kD (fig. 2a, spor 2). Begge polypeptidene ble spesifikt gjenkjent av antiserumet, fordi reaksjonen ble fullstendig hemmet av peptid 15, men ikke av et urelatert peptid, peptid 1 (fig. 2a, sammenlign sporene 5 og 6) .
Det ble bekreftet at DP-1 var en del av det DRTF1/E2F DNA bindende kompleks ved å bestemme effekten som et annet antipeptidserum (anti-peptid A) hadde i gelretarderings-assays; idet antipeptid 15 ikke kunne bli brukt for disse assays, fordi det kun reagerer med det denaturerte protein. Når antipeptid A ble inkubert med affinitetsrenset DRTF1/ E2F, opptrådte et superskift med det immune men ikke preimmune serum (fig. 2b, sammenlign sporene 2 og 3). Dette superskiftet var spesifikt, fordi det ble fullstendig inhi-bert ved å inkludere peptid A, men ikke det urelaterte peptid 1 (fig. 2b, sammenlign sporene 4 og 5}. Siden all den bindende aktivitet funnet under disse gelretarderings-betingelser var spesifikk for det E2F bindende setet (fig. 2b, sammenlign spor 4 til 6), indikerer disse resultatene at DP-1 er en del av den DRTF1/E2F DNA-bindende aktivitet.
Antipeptidantistoffene forårsaket også et superskift i helcelleekstrakter. I F9 EC celleekstrakter løser DRTF1 seg opp som en serie av DNA-proteinkomplekser, referert til som DRTFla, b og c. Tillegget av antipeptid A, men ikke det preimmune serum, forårsaket et superskift og en etter-følgende reduksjon i DRTFla, b og c (fig. 2c, sammenlign sporene 2 og 3) som kunne bli konkurrert med av peptid A (fig. 2c, sammenlign sporene 7 og 8 med 9 og 10). Lignende effekter var synlige i en mengde helcelleekstrakter avledet fra andre typer celler, innbefattende HeLa. Dette antyder at DP-1 er en komponent av den DNA-bindende aktivitet, DRTF1/E2F, som initielt ble definert i F9 EC celleekstrakter og som også ble karakterisert i HeLa celleekstrakter .
DP- 1 assosierer med retinoblastoma- crenproduktet in vivo DRTF1/E2F binder til pRb både in vitro og in vivo. For å bestemme om DP-1 assosierer med pRb in vivo, ble et immuno-utfellingsforsøk utført med det anti-pRb monoklonale antistoff IF8 fra helcelleekstrakter fremstilt fra den humane leukemicellelinjen JM, som inneholder høye nivåer av DRTFl/E2F-pRb komplekset. Etter immunoutfelling ble den DRTF1/E2F DNA-bindende aktivitet frigjort fra pRb ved å behandle immunkomplekset med en mild detergent. Under disse betingelser ble den DRTF1/E2F DNA-bindende aktivitet frigjort kun fra pRb immunopresipitatet, og ikke antistoff-kontrollimmunopresipitatet (fig. 2d, sammenlign sporene 2 og 3). Tilstedeværelsen av DP-1 i pRb-assosiert DRTF1/E2F ble bekreftet ved å behandle detergentfrigjøringen med antipeptid A, som forårsaket DRTF1/E2F til å superskifte (fig. 2d, sammenlign sporene 6 og 8, angitt med <*>). Dette viser at DP-1 assosierer med pRb in vivo.
DP- 1 binder spesifikt til et E2F sete og har et nytt DNA-bindende domene
For å bestemme hvorvidt DP-1 kunne binde til E2F setet på et sekvensspesifikk måte, ble områder av DP-1 kodende sekvenser uttrykt som glutation-S-transferase {GST) fusjonsproteiner, affinitetsrenset og testet for DNA-bindende aktivitet. Det minste området foreløpig definert, som opp-rettholder DNA-bindende aktivitet, inneholder DP-1 proteinsekvens fra aminosyreresiduer 84 til 204 (fig. 3a; GST-DP-18<"204) ; idet dette bandt til adenovirus E2A promoteren, mens en urelatert GST-fusjon (GST-cdk2) ikke klarte å gjøre dette (fig. 3b; sammenlign sporene 2 og 3). Videre var den DNA-bindende aktivitet spesifikk for E2F setet, fordi GST-DP-1<84>"<204> bandt mer effektivt til vill typen enn til det mutante E2F setet (fig. 3b, sammenlign sporene 5 til 8). Således hadde DP-1 lignende DNA-bindende spesifisitet som DRTF1/E2F i helcelleekstrakter og p46 i affinitetsrent DRTF1/E2F; mens GST fusjonskontrollproteinet manglet enhver DNA-bindende aktivitet (fig. 3b, sammenlign spor 6 til 9). Et anti-GST serum endret mobiliteten av DP-1/DNA-komplekset, noe som bekrefter tilstedeværelsen av GST-DP-1<84>'<204> i det DNA-bindende kompleks. Videre delte GST-DP-1"'<204> en annen egenskap med p46 ved at den kunne bli spesifikt kryssbundet til E2F setet (fig. 3c, sammenlign sporene 3 og 4). DP-1 binder følgelig til E2F setet på en sekvensspesifikk måte, og er således sannsynlig å være et polypeptid i DRTF1/E2F som hjelper til med den DNA-bindende spesifisitet.
Forsøk på å definere det DNA-bindende domenet mer nøyaktig har vist seg ikke å ha lykkes. Dette området av DAP-1 er således sannsynlig å ligge nær den minimale mengde protein som tillater sekvensspesifikk gjenkjennelse og definerer følgelig etter all sannsynlighet det DNA-bindende domenet.
Totalt er det urelatert til enhver annen type DNA-bindende
struktur som foreløpig har blitt identifisert, og representerer således en ny klasse DNA-bindende domene. Et lite område (DP-1 aminosyreresidu 160 til 200) som har signifikant likhet med et område som ligger innenfor det DNA-bindende
domenet av E2F-1 (fig. 4a), hvor 42% av aminosyreresiduene er identiske og 70% likhet (fig. 5b), ble notert. Sekundære strukturforutsigelser antyder at disse områdene innbefatter to a helikser, hvorav én er amfipatisk (representert av et helisk hjul i fig. 4c). Siden DP-1 og E2F-1 binder til samme DNA-sekvens, synes dette like området å være involvert i gjenkjennelse av DNA-sekvensen som utgjør et E2F-bindende sete.
Den potensielle likheten med to andre DNA-bindende proteiner, som regulerer transkripsjonen i løpet av gjærcellesyk-lusen, støtter dette funnet. Således binder de knoppdannen-de og fisjonsdannende gjærcellesyklusregulerende proteiner, kodet for av SW14 og cdclO, til en DNA-sekvens som ligner E2F-setet og inneholder et område innenfor sitt DNA-bindende domene som har trekk som er felles med DP-1/E2F-1 a helisk område beskrevet ovenfor (fig. 4c). Basert på det ovennevnte kan dette SW14/cdcl0 proteindomenet også være involvert i DNA-sekvensgjenkjennelse.
Et annet område med likhet mellom DP-1 og E2F-1 er funnet utenfor det DNA-bindende domenet (DP-1 aminosyreresiduet 210 til 240, med 41% identiske aminosyreresiduer; fig. 4b) som lik det tidligere området kan danne en amfipatisk a-heliks. Dette området kan hjelpe til med DNA-bindende aktivitet.
DP-1"-<204> kan også inneholde en proteindimeriseringsinter-fase, fordi tilsetningen av GST-DP-1'<4*204> til aff initetsren-set DRTF1/E2F resulterte i en senere migrering av protein-DNA kompleks i forhold til enten GST-DP-184*204 eller affinitetsrenset DRTF1 alene, mens et kontroll GST-fusjonsprotein hadde liten effekt (fig. 3d). Det senere migrerende kompleks vil sannsynlig resultere fra interaksjonen mellom GST-DP-1<84>"204 og et annet protein i af f initetrenset DRTF1/E2F gjennom et dimeriseringsdomene inneholdt i DP-l<M>_<m>. Likheten mellom DP-1 og E2F-1 proteinsekvensene innen dette området antyder at E2F-1 er en sterk kandidat for en slik dimeriseringspartner.
DP- 1 aktiviserer transkripsjon in vivo
Det E2A promoterdistale E2F-setet {-71 til -50) virker som en aktiverende sekvens på en mengde celletyper, så som SAOS-2 og F9 EC celler, når det plasseres oppstrøms for den minimale herpes simplex virus tymidinkinasepromoteren. For å bestemme hvorvidt DP-1 kan transaktivere transkripsjon gjennom E2F-setet, ble effekten av å uttrykke den DP-1 kodende sekvens {aminosyreresidue 63 til 429) på den transkripsjonene aktivitet av p3xWT og p3xMT, reporterkonstruksjoner som er drevet av henholdsvis enten tre villtype eller tre mutante E2F-bindende seter (fig. 5a), undersøkt. I SAOS-2 celler stimulerte ko-transfeksjonen av pG-B9 med p3xWT den transkripsjonene aktivitet av p3xWT, mens det ikke var noen effekt på plasmidet pG4 (fig. 5b). Transkripsjonen aktivering med pG-B9 var avhengig av villtype E2F-seter, fordi aktiviteten av enten p3xMT eller pCMVcat ikke ble signifikant påvirket ved samme transfeksjonsbetingelser (fig. 5b og c). Dette viser at DP-1 spesifikt aktiverer transkripsjon gjennom et villtype E2F-sete.
Således er DP-1, et sekvensspesifikt DNA-bindende protein som er til stede i DRTF1/E2F komplekser, undersøkt i ekstrakter fremstilt fra en mengde celletyper og vev.
Både pRb og pl07 binder til DRTF1/E2F på en cellesyklusav-hengig måte som er en interaksjon som forårsaker en reduksjon i den transkripsjonene aktivitet av DRTF1/E2F. Disse kompleksene, sammen med den frie transkripsjonelt aktive form av DRTF1/E2F, kan bli utskilt i ekstrakter fra asynk-rone kulturer av vevskulturceller.
Et slående trekk av DP-1 proteinet er dets lignende organi-sering som E2F-1, som er et nylig beskrevet protein som også har egenskaper lignende DRTF1/E2F. Således ligger deres DNA-bindende domener og områder med likhet i meget nære posisjoner (fig. 4a), selv om resten av proteinene er meget forskjellige. Det synes som om DP-1 og E2F-1 eksisterer sammen i et E2F kompleks, fordi antistoff mot E2F-1 super-skifter komplekser som også inneholder DP-1. Dette ligner på situasjonen som eksisterer i andre transkripsjonsfaktor-aktiviteter, f.eks. AP-1, hvor meget forskjellige proteiner samvirker gjennom relaterte domener. Det er imidlertid antatt at det finnes mer enn én partner for DP-1, fordi selv om DP-1 er til stede i alle DRTF1/E2F komplekser som danner det E2F-bindende setet, indikerer antistoff super-skiftforsøk at E2F-1 ikke er det; kanskje andre E2F-1 lignende polypeptider eksisterer sammen med DP-1 i disse kompleksene.
Del B.
Flere bevislinjer antyder at den cellulære transkripsjonsfaktor DRTF1/E2F spiller en viktig rolle i regulering av cellesyklus hos pattedyrceller. For eksempel blir den DRTF1/E2F DNA-bindende aktivitet periodisk indusert i løpet av cellesyklusprogresjon og har en topp i løpet av S-fase (Mudryj et al., 1992; Shirodkar et al., 1992), og blir negativt regulert under differensiering (La Thangue & Rigby, 1987). Denne bindende aktiviteten korrelerer med den transkripsjonene aktivitet av visse gener som er nødven-dige for cellulær proliferasjon, så som DHFR, DNA-poly-merase a og p34<cdc2>, som inneholder DRTFl/E2F-bindende seter i sine promoterer (Blake & Azizkhan, 1989; Means et al., 1992; Dalton, 1992). Videre binder retinoblastoma tumor suppressor genproduktet, som negativt regulerer celle-syklusprogresjonen fra Gl til S-fase og ofte er mutert i tumorceller, til DRTF1/E2F (Bandara og La Thangue, 1991; Chellapan et al., 1991). Den funksjonelle konsekvens av denne interaksjonen er at pRb forhindrer DRTF1/E2F fra å aktivere transkripsjon (Zamanian and La Thangue, 1992). Flere andre molekyler som er implikert i cellesyklus-kontroll, så som Rb-relatert pl07, cyklinene A og E, og p33ed,t2 assosierer også med DRTF1/E2F under cellesyklusprogresjon {Bandara et al., 1991, 1992; Mudryj et al., 1991; Devoto et al., 1992; Lees et al., 1992). Tatt sammen antyder disse observasjonene at DRTF1/E2F integrerer celle-syklushendelser med transkripsjonsapparaturen, noe som sikrer at cellen danner de passende endringer i geneks-presjon ved den korrekte tid i løpet av cellesyklusprogresjon.
Ytterligere bevis for viktigheten av DRTF1/E2F har kommet fra studier på virkningsmekanismen av virale onkoproteiner. Således regulerer visse onkoproteiner, så som adenovirus Ela, SV40 stort T antigen og human papillomavirus E7, aktiviteten av DRTF1/E2F ved å utskille pRb og andre asso-sierte proteiner ved å omdanne disse fra en transkripsjonelt inaktivt til en aktiv form (Zamanian og La Thangue, 1992; Hiebert et al., 1992; Zamanian og La Thangue, 1993).
Fordi denne effekten krever områder i disse virale onkoproteiner som tidligere er vist å være nødvendige for cellulær immortalisering og transformasjon (Bandara og La Thangue, 1991; Zamanian og La Thangue, 1992), er det sann-synlig at DRTF1/E2F spiller en viktig rolle i disse proses-sene.
Selv om fremskritt har blitt gjort i identifisering av de cellulære proteiner som samvirker med DRTF1/E2F, var rela-tivt lite, inntil nylig, kjent om dets molekylære detaljer. To distinkte polypeptider som begge er DNA-bindende komponenter av DRTF1/E2F har nå blitt molekylært karakterisert. Den første, referert til som E2F-1, ble isolert gjennom sin evne til direkte å binde til pRb, noe som den gjør gjennom et C-terminalt område (Helin et al., 1992; Kaelin et al., 1992). I motsetning til dette ble DP-1 definert som en komponent av DRTF1/E2F DNA-bindende aktivitet etter biokjemisk å rense DRTF1 fra F9 embryonalt karsinom (EC) stamceller, som er et cellesystem hvor DRTF1/E2F er nedregulert i løpet av differensieringsprosessen (La Thangue og Rigby, 1987; La Thangue et al., 1990). cDNA'er som koder for DP-1 ble isolert etter å ha fremskaffet aminosyresekvensen fra affinitetsrenset DP-1 (Girling et al., 1993).
Både E2F-1 og DP-1 inneholder et område som tillater hvert polypeptid å binde på en sekvensspesifikk måte som en homodimer til E2F delen (Helin et al., 1992; Kaelin et al., 1992; Girling et al., 1993). Selv om de DNA-bindende dome-nene ikke er nært relatert til noen tidligere definert DNA-bindende struktur, er de ikke desto mindre fjernt relatert til de DNA-bindende domener i enkelte gjærcellesyklusregulerende transkripsjonsfaktorer (La Thangue og Taylor, 1993). Det funksjonelle forhold mellom DP-1 og E2F-1 har imidlertid forblitt uklart. I dette studium viser søker at DP-1 og E2F-1 eksisterer som et kompleks in vivo som gjenkjenner det E2F-bindende setet. Videre viser in vitro assays at DP-1 og E2F-1 binder effektivt og foretrukket som et kompleks til E2F-setet, som er en interaksjon som krever et område med likhet mellom de to proteinene. Videre antyder rekonstruksjon av DRTF1/E2F i Drosophila og gjærceller at DP-1 og E2F-1 samvirker synergistisk i E2F seteavhengig transkripsjonen aktivering. Disse data indikerer at DP-1 og E2F-1 funksjonelt kan samvirke, og at slik samvirking er sannsynlig å være fysiologisk relevant i pattedyrceller.
DP-1 og E2F-1 eksisterer som et kompleks i HeLa celler. DP-1 er en komponent av DRTF1/E2F som er til stede i murine utviklingsmessig regulerte og cellesyklusregulerte DRTF1/- E2F komplekser, og er således sannsynlig å være en hoved-komponent av DRTF1/E2F DNA-bindende aktiviteter. Videre er DP-1 produktet av et konservert gen, siden det har blitt observert av foreliggende oppfinner at et nært relatert protein blir uttrykt i amfibier og Drosophila. DP-1 synes således å være en hyppig og evolusjonsmessig konservert komponent av DRTF1/E2F. E2F-1, som ble isolert gjennom sin evne til å binde direkte til pRb, samvirker også på en sekvensspesifikk måte med E2F-setet (Helin et al., 1992; Kaelin ét al., 1992). Begge proteinene inneholder et lite område med likhet som overlapper domener tidligere vist å være nødvendige for sekvensspesifikk DNA-bindende aktivitet (Girling et al., 1992).
Det ble undersøkt hvorvidt DP-1 og E2F-1 eksisterer som et kompleks i HeLa celleekstrakter ved å bruke antistoff som spesifikt gjenkjenner hvert protein. Initielt bestemte sø-ker ved gelretardering hvorvidt DP-1 er en komponent av HeLa celle DRTF1/E2F. Som i F9 embryonalt karsinom (EC) celleekstrakter ødela således anti-DP-1 peptid antiserum HeLa celle DRTF1/E2F på en spesifikk måte, siden dets effekter ble konkurrert om ved å inkludere i bindingsreaksjonen det homologe, men ikke et urelatert peptid (fig. 6a, sammenlign sporene 2 til 5 med 6 til 9). Anti-DP-1 antiserum ble brukt for å immunoutfelle DRTF1/E2F fra HeLa celleekstrakter, hvor immunopresipitatet derpå ble frigjort og deretter immunoblottet med et anti-E2F-l monoklonalt antistoff. Den DRTF1/E2F DNA-bindende aktivitet immuno-utf elt med anti-DP-1 (fig. 6b, sammenlign sporene 4 og 7) inneholdt E2F-1 proteinet, fordi immunoblotting av immunopresipitatene med et anti-E2F-l monoklonalt antistoff viste et polypeptid med molekylvekten som er ventet for E2F-1 (fig. 6c, spor 4, indikert med pil). Tilstedeværelsen av E2F-1 var avhengig av anti-DP-1 aktiviteten, siden den ikke var til stede når immunoutfellingen ble utført i nærvær av det homologe peptid (fig. 6c, sammenlign sporene 3 og 4). Således eksisterer DP-1 og E2F-1 som et kompleks i HeLa celleekstrakter.
DP-1 og E2F-1 samvirker in nitro i en DNA-bindende heterodimer
Både DP-1 og E2F-1 inneholder sekvensspesifikke DNA-bindende domener, beliggende i lignende posisjoner hos hvert protein (mellom aminosyreresidue 84 og 204 i DP-1, og 89 til 191 i E2F-1; Girling et al., 1993), som inneholder et område med likhet som strekker seg utenfor det DNA-bindende domenet til aminosyreresiduet 249 i DP-1. I overensstemmelse med tidligere studier (Helin et al., 1992; Kaelin et al., 1992; Girling et al., 1993), var både DP-1 og E2F-1 alene i stand til å binde til E2F-setet, enten i forbindelse med adenovirus E2A-promoteren (figur 7a; spor 2 og 3) eller som et enkelt E2F-sete (noe som kom til syne ved øket eksponering av figur 7a, spor 6; data ikke vist). Den DNA-bindende aktivitet av DP-1 var noe mindre enn den av E2F-1, årsakene til dette er for tiden uklare. Imidlertid, når begge proteiner var tilstede i samme bindingsreaksjon var øket E2F-sete DNA-bindende aktivitet synlig (figur 7a, sammenlign spor 2 og 3 med 4 og 6 og 7 med 8.) Den DNA-bindende aktivitet var mye større enn den som var ventet fra en additiv effekt av de to DNA-bindende aktiviteter, noe som indikerer at sammen gjenkjenner DP-1 og E2F-1 E2F-setet synergistisk.
Tilstedeværelsen av både DP-1 og E2F-1 i det DNA-bindende kompleks ble bekreftet ved å bruke antisera som var spesi-fikke for hvert protein. Et anti-E2F-l-peptid-antiserum superskiftet det DNA-bindende kompleks (figur 7a, sammenlign spor 8 med 10), mens anti-DP-1 peptid antiserumet inhiberte den DNA-bindende aktivitet (figur 7a, sammenlign spor 11 og 12). Imidlertid var effekten av anti-DP-1 antiserumet mindre dramatisk, for hvilket grunnen er uklar, men den kan være relatert til tilgjengeligheten av epitopen, som for dette antistoff ligger nært det DNA-bindende domene av DP-1 (Girling et al., 1993).
Dette assay ble brukt for å bestemme områdene i DP-1 som er nødvendige for å danne et DNA-bindende kompleks med E2F-1. Således ble forskjellige derivater av DP-1 uttrykt som GST-fusjonsproteiner spaltet med trombin, og så undersøkt for en mulig interaksjon med E2F-1. Siden disse derivater av DP-1 var avkortede versjoner av villtypeproteinet, bør enhver av disse som var i stand til å innvirke på E2F-1 for å danne funksjonell DNA-bindende aktivitet resultere i et mindre og således raskere migrerende DNA-bindende kompleks. Videre, dersom kun ett raskere migrerende kompleks var synlig, ville en heterodimer av de to proteiner være den mest sannsynlige forklaring. Faktisk, når enten DP-1""2" eller DP-1"'2" ble blandet med E2F-1 (GST-E2F-189*431 ), ble et raskere migrerende DNA-bindende kompleks dannet i forhold til E2F-1 alene {figur 7b, sammenlign spor 1 med 2 og 3) eller E2F-1/DP-1 (figur 7a), noe som indikerer at disse to derivater av DP-1 var i stand til å innvirke på E2F-1 og at det var sannsynlig at de ville danne en heterodimer. Igjen var den DNA-bindende aktivitet av E2F-l/DP-l"-"9-komplekset større enn den for E2F-1 alene {figur 7b, sammenlign spor 1 med 2 og 3) eller DP-1"<*249>, som hadde lav DNA-bindende aktivitet under de betingelser som ble anvendt i dette assayet (data ikke vist), men som ikke desto mindre spesifikt kan gjenkjenne E2F-setet (Girling et al., 1993). Den DNA-bindende aktivitet av E2F-l/DP-l"~2"-reaksjonen var mindre enn E2F-1/DP-""249, noe som indikerer at området til DP-1 mellom aminosyreresiduet 204 og 249, som viser signifikant likhet med E2F-1 (Girling et al, 1993), også innvirker på den DNA-bindende aktivitet. De synergistiske DNA-bindende effekter av DP-1"*249 og DP-1<8>4*204 var også tydelige når de uspaltede GST fusjonsproteiner ble blandet med E2F-1, selv om på grunn av sin økede størrelse, et raskere migrerende DNA-bindende kompleks ikke oppsto (figur 7b, sammenlign spor 1 med 4 og 5). Ytterligere delesjon av dette område, enten fra N-(DP-114*-<249>) eller C- (DP-184*166) -terminalen, ga derivater av DP-1 som ikke klarte å danne et DNA-bindende kompleks med E2F-1, enten som GST fusjonsproteiner (figur 7b, sammenlign spor 1 med 6 og 7) eller etter spaltning (data ikke vist), noe som indikerer at DP-1"-204 er det minimale område som til nå er definert som er i stand til å danne et DNA-bindende kompleks med E2F-1.
Analyse av den DNA-bindende spesifisitet av E2F-1/DP-1<84>"<24*->komplekset med et panel av bindende seter avledet fra det adenovirus E2A-promoter distale E2F-sete (La Thangue et al., 1990; Shivji og La Thangue, 1991) indikerte at dette var meget likt det for E2F-1 alene (figur 7c, sammenlign spor 3-6 med 8-11) og videre, DRTF1//E2F-sete DNA-bindende aktivitet definert i F9 EC-celleekstrakter (figur 7c, sammenlignende spor 13-16).
For ytterligere å karakterisere interaksjonen mellom DP-1
og E2F-1 ble det anvendt et assay hvor in vitro transkri-
bert og translatert E2F-1 polypeptid kunne binde til DP-1
GST fusjonsproteiner. E2F-l's evne til å innvirke på DP-1
ble undersøkt etter oppsamling av GST-fusjonsproteinet med glutation-agarosekuler og deretter frigjøring av det bundne E2F-1-polypeptid. Både DP-1"*2" og DP-184*204 kunne samvirke med E2F-1, siden mengden av E2F-1 bundet til GST-DP-1<84*249>
og GST-DP-1'<4*204> var tydelig større enn det som bandt til GST-kulene alene (figur 7d, sammenlign spor 2-3 og 6), noe
som er konsistent med deres evne til å danne en DNA-binden-
de heteromer (figur 7b) . DP-1<1>"-<24>' bandt også til E2F-1,
mens DP-184_1SS ikke klarte å gjøre dette (figur 7d, sammen-
lign spor 2 til 4 og 5) . DP-1<146->249 inneholder følgelig et domene som, basert på de tidligere resultater, sannsynlig-
vis er et dimeriseringsdomene som tillater det å innvirke på E2F-1, men mangler tilstrekkelig aminosyresekvens for at heteromeren kan binde til DNA. Den ytterligere informasjon i DP-1<8>4"244 er nødvendig for at komplekset skal binde til DNA. Disse data antyder følgelig at området av DP-1 som er
lik E2F-1 (aminosyre 163 til 236) inneholder et dimeriseringsdomene, og at den ytterligere N-terminale sekvens er nødvendig for DNA-bindende aktivitet. En oppsummering av disse data er gitt i figur 7e.
DP-1 og E2F-1 samvirker i gjærceller.
For å bestemme om DP-1 og E2F-1 samvirker direkte in vivo, tilpasset oppfinnerne et tidligere beskrevet assaysystem i gjærceller (Fields og Song, 1989), som anvendte ekspresjonsvektorer som syntetiserer to hybride proteiner, ett avledet fra DP-1 og det andre fra E2F-1. I det første ble den DP-l-kodende sekvens fusert til det DNA-bindende domene av det bakterielle LexA-protein for å danne pLEX.DP-1, og i det andre ble pGAD.E2F-l, som er den E2F-l-kodende sekvens, fusert til det sure transkripsjonsaJctiverende domene (AAD) av gjær Gal4-proteinet. pLEX.DP-1 klarte ikke å aktivere en reporterkonstruksjon drevet at et LexA-bindende sete, mens et hybridprotein som inneholdt trans-aktiveringsdomenet tatt fra p53-proteinet klarte dette (figur 8). Når pLEX.DP-1 og pGAD.E2F-l ble uttrykt sammen, ble midlertid den transkripsjonene aktivitet av LexA-reporterkonstruksjonen øket vesentlig (omkring 75 ganger) i forhold til dens aktivitet når enten pLEX.DP-1 eller. pGAD.E2F-l ble uttrykt alene (figur 8). Dette resultat kombinert med de tidligere studer presentert i denne beskrivelse, antyder sterkt at DP-1 og E2F-1 samvirket di-rekte in vivo.
DP-1 regulerer E2F seteavhengig transkripsjon in vivo. Økning av nivåene av DP-l-proteinet i en mengde pattedyrceller (f.eks. F9 EC, SAOS-2 og 3T3) og av vekstbetingel-sene klarte ikke signifikant å stimulere den transkripsjonene aktivitet av et E2F seteavhengig reportermateriale (data ikke vist). For å undersøke om DP-1 og E2F-1 funksjonelt samvirker, måtte det følgelig bli foretatt alternative tilnærminger.
( a) Drosophila- assav
En første tilnærming involverte å utvikle et passende assay i Drosophila SL2-celler, som er et cellesystem som har blitt brukt tidligere for å studere aktiviteten av pattedyr-transkripsjonsfaktorer (Courey og Tjian, 1988) . Disse celler var spesielt egnet for denne analyse, fordi den endogene E2F-sete DNA-bindende aktivitet er meget lav når den undersøkes med gelretardering (data ikke vist). For å undersøke den funksjonelle interaksjon mellom DP-1 og E2F-1, bestemte oppfinnerne effekten av hvert protein alene og uttrykt sammen på den transkripsjonene aktivitet av p3xWT, som er en reporterkonstruksjon drevet av tre E2F-seter (figur 9a; Zamanian og La Thangue, 1991). E2F-1 var i stand til å aktivere p3xWT på en doseavhengig måte (figur 9b og c, sammenlign spor 1 og 2), mens DP-1 ikke klarte å gjøre dette (figur 9b og c, sammenlign spor 3 og 4), noe som er resultater som er lignende oppførselen til E2F-1 og DP-1 i pattedyrceller (Helin et al, 1992); Kaelin et al., 1993; og data ikke vist). Imidlertid, når DP-1 og E2F-1 ble uttrykt sammen, var mye større E2F-seteavhengig transkripsjonen aktivering synlig i forhold til hver av dem alene (figur 9b
■og c, sammenlign spor 1, 3 og 5). Dessuten var denne synergistiske effekt titrerbar, fordi det å øke nivået av DP-1
gav mer E2F seteavhengig transkripsjon (figur 9b og c, sammenlign spor 1, 5 og 6), og spesifikk, siden koekspresjonen av en urelatert DNA-binding avledet fra Lal4-proteinet ikke gav noen signifikante effekter (figur 9b og c, sammenlign
spor 5 og 6 med 7 og 8). Videre indikerte lignende forsøk utført med p3xMT at denne aktivering var spesifikk for villtype E2F-setet (data ikke vist). Det synes følgelig som om DP-1 og E2F-1 funksjonelt samvirker i E2F seteavhengig transkripsjon og at denne interaksjon er synergistisk.
( b) F9 EC- celle- assay
I en alternativ tilnærming ble et "dominant negativt" derivat av DP-1 utarbeidet som kunne ødelegge den endogene DRTF1/E2F transkripsjonene aktivitet. DP-1<73*310> ble fremstilt, som mangler aminosyresekvens både fra det N- og C-terminale område. Således, når DP-1<73>"<3>" ble uttrykt i F9 EC-celler som inneholder høye nivåer av E2F seteavhengig transkripsjonen aktivitet (Zammanian og La Thangue, 1992), var en reduksjon i aktiviteten av p3xWT synlig (figur 10c, sammenlign spor 1 og 2 med 7 og 8, mengdebestemt ved bunnen av figuren); idet denne effekt var spesifikk for villtype E2F-setet, fordi aktiviteten av enten det mutante E2F-sete reporter p3xMT eller pCMVcat ikke ble påvirket. Basert på de tidligere resultater var en trolig forklaring for effekten av DP-1<13>"<340> at den modifiserte E2F-1 til å danne en heteromer som ikke var i stand til å aktivere transkripsjon, for således å begrense mengden av tilgjengelig E2F-1. Når E2F-1 ble uttrykt i nærvær av DP-1<73>"<340>, overvant dette den "dominante negative" aktivitet og gjenopprettet delvis den E1F seteavhengige transkripsjonene aktivitet (figur 10, sammenlignende spor 7 og 8 med 9 og 10). E2F-l's evne til å redde E2F transkripsjonen aktivitet er konsistent med den idé at DP-113-"0 endrer E2F-1 til et inaktivttranskripsjons-kompleks og er kompatibel med idéen om at en interaksjon mellom DP-1 og E2F-1 opptrer i pattedyrceller.
DP-1 og E2F-1 aktiverer E2F-seteavhengig transkripsjon i gjærceller.
DP-1 og E2F-1 ble så undersøkt for å bestemme om de funksjonelt innvirker på E2F seteavhengig transkripsjon i gjærceller. For dette ble det benyttet konstruksjoner i hvilke gjærcelle cycl-promoteren ble drevet av E2F-bindende seter tatt fra adenovirus E2A-promoteren. I p4xWT CYC1 driver fire E2F-bindende seter cycl-promoteren (figur Ila), noe som aktiverer transkripsjon omkring 12 ganger over aktiviteten av p4xMT CYC1 (data ikke vist). Denne transskrip-sjonene aktivitet kunne bli ytterligere stimulert ved innføring av E2F-1 ekspresjonsvektoren, pGAD.E2F-l. Således økte pGAD.E2F-l den transkripsjonene aktivitet av p4xWT CYC1 omkring 10 ganger, sammenlignet med den lille effekt som DP-1 ekspresjonsvektoren, pLEX.DP-1, hadde på samme reporterkonstruksjon (figur 11b). Når E2F-1 og DP-1 ble uttrykt sammen, var aktiviteten av p4xWT CYC1 imidlertid enda større, og vanligvis omkring 50 ganger over den grunn-leggende p4xWT CYCl-aktivitet (figur 5b), men aktiviteten av p4xMT CYC1 ble ikke signifikant påvirket av verken E2F-1 eller DP-1 ekspresjonsvektoren (data ikke vist). Dette viser at DP-1 og E2F-1 aktiverer E2F seteavhengig transkripsjon mer effektivt når de er tilstede sammen enn hver for seg, noe som igjen antyder at DP-1 og E2F-1 samvirker synergistisk ved E2F seteavhengig transkripsjonen aktivering.
DP-1 og E2F-1 samvirker i pattedyrceller.
Tidligere studier har indikert at DP-1 er en universell komponent av DRTF1/E2F DNA-bindende aktivitet i F9 EC-celler, fordi alle de DNA-bindende komplekser som opptrer på E2F-setet blir ødelagt av anti-DP-l-antistoff (Girling et al, 1993). Den samme situasjon eksisterer i HeLa-celleekstrakter, hvor alle de DRTF1/E2F DNA-bindende komplekser blir påvirket av anti-DP-1 antistoff (figur 6a). Basert på disse observasjoner og kombinert med studier utført i andre celletyper (Bandara et al, under utarbeidelse), mener oppfinnerne at DP-1 er en hyppig komponent av transkripsjonsfaktor DRTF1/E2F.
I lys av disse observasjoner var man interessert i å bestemme om DP-1 kan samvirke med det andre E2F DNA-bindende protein, E2F-1 (Helin et al, 1992; Kaelin et al, 1992) og videre, etablere hvorvidt slik interaksjon inntreffer under fysiologiske betingelser. Søkers resultater indikerer at DP-1 og E2F-1 eksisterer som et kompleks i HeLa celleekstrakter, og implikerer således at minst en del av den totale DRTF1/E2F DNA-bindende aktivitet sannsynligvis er et heteromerisk kompleks innbefattende DP-1 og E2F-1. Det er for tiden uklart akkurat hvor meget av den DRTF-1/E2F DNA-bindende aktivitet som er et kompleks av DP-1 og E2F-1, fordi forsøkene på å benytte anti-E2F-l antistoff for å påvirke den DNA-bindende aktivitet i gel-retarderingsassay ikke har lyktes (data ikke vist). I tillegg kan det ikke utelukkes at andre proteiner binder til DP-1, i stedet for E2F-1. Faktisk ville dette synes som en sannsynlig mulighet fordi flere polypeptider i affinitetsrenset DRTF1/E2F med distinkte molekylvekter (fra 45 til 55.000) er i stand til spesifikt å binde til E2F-setet (Shivji og La Thangue, 1991; Girling et al, 1993).
En fysisk interaksjon mellom DP-1 og E2F-1 in vi tro og i gjærceller.
Oppfinnerne etablerte at DP-1 og E2F-1 direkte kan samvirke ved å studere deres DNA-bindende egenskaper i gel-retarderingsassays. DP-1 og E2F-1 dannet et heteromert DNA-bindende kompleks med nøyaktig samme DNA-bindende spesifisitet som den som innehas av DRTF1/E2F i grovcelle-ekstrakter (La Thangue et al., 1990). Videre var det inn-lysende at heteromerens DNA-bindende aktivitet var vesentlig større enn for E2F1 eller DP-1 alene, noe som antyder at DP-1 og E2F-1 samvirker synergistisk. En molekylær analyse av området i DP-1 som var nødvendig for å danne et DNA-bindende kompleks med E2F-1, indikerte at området med likhet mellom de to proteiner, sammen med et ytterligere N-terminalt domene var nødvendig. Området med likhet tillot DP-1 og E2F-1 å binde til hverandre, og således er det sannsynlig at dette utgjør et dimeriseringsdomene.
Oppfinnerne bekreftet disse observasjoner i gjærceller ved å bruke et assay som gjør bruk av den modulære organisasjon av transkripsjonsfaktorer (Fields og Song, 1989). Således ble DP-1 fusert til det bakterielle LexA DNA-bindende domene, og i et separat molekyl, E2F-1, til det sure transkripsjonene aktiveringsdomene av gjær Gal4-proteinet. I dette assay blir et funksjonelt aktiveringsdomene lagt til den LexA-avhengige promoter kun dersom det finnes en fysisk interaksjon mellom de to hybride proteiner. Når de to hyb- ride proteiner ble uttrykt sammen, var det en sterk akti-vering av den LexA-avhengige reporter. Således er DP-1 og E2F-1 i stand til fysisk å samvirke i gjærceller. Videre indikerer dette resultat at det er i stand til å gjøre dette ved fravær av DNA-binding, siden den DNA-bindende spesifisitet ble gitt av LexA og fant således sted uav-hengig av det E2F-bindende sete.
Transkripsjonen synergisme av DP-1 og E2F-1 in vivo. Oppfinnerne tok for seg de funksjonelle konsekvenser av interaksjonen mellom DP-1 og E2F-1 for E2F seteavhengig transkripsjon i både Drosophila og gjærceller. Denne tilnærming ble tatt fordi oppfinnernes forsøk på å aktivere transkripsjon ved å innføre villtype DP-1 i pattedyrceller viste seg å ha begrenset suksess, hvor grunnene for dette er uklare, men kan stå i forbindelse med nivået av endogent DP-l-protein.
Begge typer assay, enten de utføres i Drosophila eller gjærceller, indikerte at DP-1 og E2F-1 samvirker synergistisk i E2F seteavhengig transkripsjon, siden når begge proteiner ble uttrykt sammen var transkripsjonen aktivering mer effektiv enn for hvert protein alene. En sannsynlig forklaring på en slik effekt er at den DNA-bindende aktivitet av DP-1/E2F-1 heterodimeren er mer stabil en hver homodimer og således er den transkripsjonene aktivering mer effektiv. Denne idé vil være fullstendig konsistent med de in vitro DNA-bindende data presentert tidligere i denne studie, noe som antydet at DP-1 og E2F-1 samvirket synergistisk. Oppfinnerne kan imidlertid ikke utelukke andre kraftige påvirkninger, så som aktivering av et kryptisk transkripsjonelt aktiveringsdomene i DP-l/E2F-l-heterodimeren, og faktisk har nylige forsøk antydet at det er sann-synlig at en slik mulighet er riktig (Zamanian og La Thangue), upubliserte data.
Som konklusjon har oppfinnerne vist at DP-1 og E2F-1 samvirker i transkripsjonsfaktor DRTF1/E2F for å danne et DNA-bindende kompleks, som er den foretrukne tilstand i forhold til hver homodimer. Siden E2F-1 kan binde til pRb (Helin et al., 1992; Kaelin et al., 1992), er det i et slikt kompleks sannsynlig at E2F-1 vi gi en interfase gjenkjent av pRb, for således å muliggjøre at den transkripsjonene aktivitet av denne spesielle E2F sete DNA-bindende aktivitet blir regulert av pRb. Det er mulig at andre molekyler heterodimeriserer med DP-1 i stedet for (og muligens relatert til) E2F-1, noe som gir en interfase gjenkjent av andre proteiner om hvilke man vet at de samvirker med E2F/DRTF1, så som pl07 (Zamanian og La Thangue, 1993), for således å gjøre det mulig at disse molekyler også kan regulere E2F seteavhengig transkripsjon. Oppfinnerne foreslår følgelig at distinkte heterodimerer gjenkjenner E2F-setet med DP-1 som en felles komponent, noe som tillater forskjellige molekyler, så som pRb og pl07, å integrere sine biologiske aktiviteter med transkripsjonsapparaturen og således å regulere gener drevet av E2F/DRTF1.
Materialer og metoder
Fremstilling av celleekstrakter, gelretardering og immuno-kjemiske teknikker
Det ble fremstilt celleekstrakter som tidligere beskrevet (La Thangue et al., 1990). Gelretardering i F9 EC- og HeLa-celleekstrakter (omkring 6,0 ug) i nærvær av anti-DP-1 ble utført som tidligere beskrevet (Girling et al, 1993), og immunoutfelling med anti-DP-1 fra HeLa-celleekstrakter ble utført ved standard prosedyrer. Immunopresipitatene ble behandlet med 1% DOC, og 1,5% NP40 og det detergentfrigjorte materiale undersøkt for DRTF1/E2F ved gelretardering og tilstedeværelsen av E2F-1 ved immunoblottting med anti-E2F-1 monoklonalt antistoff SQ41 (Kaelin et al., 1992). Anti-DP-1 antistoffene, anti-peptid A og anti-peptid 18 har tidligere blitt beskrevet (Girling et al, 1993). Kanin anti-E2F-1 antiserum (antiserum 134) ble fremskaffet mot et peptid som representerer E2F-1 aminosyresekvens 315 til 323. Sekvensene av bindingssetene benyttet for å påvise DNA-bindingsspesifisitet var avledet fra adenovirus E2A-promoteren (-71 til -50) og var som følger: WT;
TAGTTTTCGCGCTTAAATTTGA; 62/60, TAGTTTTCGATATTAAATTTGA; 63, TAGTTTTCTCGCTTAAATTTGA;'64, TAGTTTTAGCGCTTAAATTTGA. I figur
2a (spor 1 til 4) ble adenovirus E2A-promoteren (-96 til +68 benyttet), i alle andre tilfeller ble det distale E2F-sete i E2A-promoteren (sekvenser -71 til -50) benyttet. Omkring 100 gangers overskudd av konkurrerende bindingsseter ble brukt i gel-retarderingsassayene.
Fusjonsproteiner og in vitro translasjon
DP-1 og E2F-1 ble uttrykt som, og frigjort fra, GST fusjonsproteiner som tidligere beskrevet (Girling et al., 1993). Omkring 100 gangers overskudd av de konkurrerende bindingssetene ble brukt i gelretardasjonsassays med bin-dingssetet tatt fra adenovirus E2A promoteren (-71 til 50). Den villtype E2F-l-kodede sekvens ble transkribert og
videre translatert ved å bruke retikulocyttlysat (Promega) og radiomerket med <35>S metionin. I dimeriseringsassayet
(fig. 2d) ble GST-DP-1 fusjonsprotein inkubert med E2F-1 polypeptid i 30 minutter ved 30°C, oppsamlet med glutation-agarose (Sigma) og vasket gjentatte ganger med 0,1% NP40 i PBSA. Bundet E2F-1 polypeptid ble frigjort ved denaturering i SDS prøvebuffer og oppdelt i en 10% polyakrylamidgel.
Gjærassays
pBTM116 inneholder den fullstendige LexA kodende sekvens (1-202) under kontroll av gjær ADH1.promoteren. pLEX.DP-1 bærer den kodende sekvens for DP-1 (fra aminosyre 59 til C-terminalen) nedstrøms for den LexA-kodende sekvens i pBTM116. pBTM126 bærer villtype murin p53-kodende sekvens (fra aminosyre 1 til 346) nedstrøms for det LexA DNA- bindende domenet. pGAD.L6 er et derivat av pGAD2F (Chien et al., 1991) inneholdende det Gal4 transkripsjonsaktiverende domenet (fra aminosyreresidue 768-881} under kontroll av gjær ADH1 promoteren. pGAD.E2F-l inneholder hele den E2F-1 kodende sekvens (fra aminosyre 1 til 437) nedstrøms for det Gal4 aktiverende domenet. p4xWT CYC1 og p4xMT CYC1 ble avledet fra pLGA178 (Guarente og Mason, 1983). Villtype E2F setet ble tatt fra -71 til -50 området av adenovirus E2A promoteren, og det mutante setet var mutert i nukleotider -62 til -60 (La Thangue et al., 1990). For gjærinter-aksjonsassayet (fig.3) ble de angitte ekspresjonsvektorer transformert i gjærstammen CTY10-5d (MATa ade2 trpl-901 leu2-3, 112 his3-200 gal4 ga!80 URA3::lexAop-lacZ) som inneholder et integrert plasmid som bærer 2 kopier av et 78-bp oligonukleotid, hvor hver kopi inneholder to colEl ope-ratorer eller fire bindende seter for LexA dimerer opp-strøms for transkripsjonsstartsetet av GALl-lacZ. For det gjær E2F seteavhengige transkripsjonsassayet (fig. 5) ble gjærstammen W3031a (MATa ade 2-100 trypl-1 leu2-3 112 his3-11 ura3) brukt som bærer enten p4xWT CYC1 eller p4xMT CYC1 og ble transformert med de angitte ekspresjonsvektorer. galaktosidaseaktivitet av kulturer i midtre logaritmisk vektfase ble mengdebestemt som tidligere beskrevet (Johnson et al., 1986). p-galaktosidaseaktivitet ble målt for minst tre uavhengige transformanter.
Transfeksjon av Drosophila vevskulturceller. Reporterkonstruksjoner ble alle avledet fra pBLcat2 og har tidligere blitt beskrevet (Zamanian og La Thangue, 1992). Åpne og fylte områder betegner henholdsvis villtype og mutante E2F bindingsseter. pDP-1 koder for et fullstendig DP-1 protein, og pG4mpolyII det Gal4 DNA-bindende domenet (Webster et al., 1989). pE2F-l har tidligere blitt beskrevet som pCMV RBAP-1 (Kaelin et al., 1982). Celler ble transfektert med kalsiumfosfatprosedyren og.innhøstet 40 til 45 timer senere, og for hver transfeksjon ble pBluescript KS inkubert for å opprettholde den endelige DNA-konsentrasjonen konstant. Alle transfeksjoner inkluderte en innvendig kontroll pCMV p-gal. Assayet for CAT aktivitet, korreksjon for transfeksjonseffektivitet og mengdebestemmelse av TLC plater har tidligere blitt beskrevet (Zamanian og La Thangue, 1992).
Transfeksjon av pattedyrceller.
Reporterkonstruksjoner ble alle avledet fra pBLcat2, og har tidligere blitt beskrevet (Zamanian og La Thangue, 1992). Åpne og fylte områder betegner henholdsvis villtype og mutante E2F-bindingsseter. Plasmidet pDP-1<73-3*0> koder for et protein som strekker seg mellom aminosyrene 73 til 340 i villtype DP-1 sekvensen fusert nedstrøms for Gal4 sekvensene i pG4MpolyII (Webster et al., 1989). pCMV E2F-1 har tidligere blitt beskrevet som pCMV RBAP-1 (Kaelin et al., 1982). Dyrkning av F9 EC celler og deres transfeksjon har tidligere blitt beskrevet (Zamanian og La Thangue, 1992) . For hver transfeksjon ble pBluescript KS inkubert for å holde den endelige DNA-konsentrasjonen konstant. Alle transf eks joner innbefattet en intern kontroll pCMV (5-gal. Assayet for CAT aktivitet og mengdebestemmelse av TLC plater har tidligere blitt beskrevet (Zamanian og La Thangue, 1992).
Detaljert beskrivelse av tegningene.
Fig. 6
DP-1 og E2F-1 eksisterer i samme proteinkompleks in vivo.
a) DP-1 blir i DRTF1/E2F DNA-bindende komplekser dannet i HeLa celleekstrakter: gelretardering ble utført ved å bruke
F9 EC og HeLa helcelleekstrakter (hvor DRTF1 skiller seg ut som tre distinkte komplekser, a, b og c; angitt i figuren)
med det E2F-bindende setet tatt fra adenovirus E2A promoteren (nukleotid -71 til -50) i nærvær av enten preimmun (PI; sporene 2 og 6) eller immun (I, sporene 3 til 5 og 7 til 9) anti-DP-1 (peptid A) antiserum med tilsetning av enten urelatert peptid 1 (sporene 4 og 8) eller peptid A (sporene 5 og 9). I både F9 EC og HeLa celleekstrakter ble alle de DRTF1/E2F DNA-bindende kompleksene påvirket av anti-DP-1 antistoffet.
b) Anti-DP-1 immunoutfeller DRTF1/E2F DNA-bindende aktivitet: immunoutfelling ble utført fra HeLa celleekstrakter
med anti-DP-1 i nærvær av enten homologt peptid A (sporene 2 til 4) eller urelatert peptid 1 (sporene 5 til 7). Immunopresipitatene ble behandlet med 1% deoksycholat (DOC) og 1,5% NP40, og det detergentfrigjorte materialet ble under-søkt for DRTF1/E2F DNA-bindende aktivitet; hvor det utarmede HeLa celleekstraktet også er indikert (Sn; sporene 2 og 5). Ingen DNA-bindende aktivitet ble frigjort ved fravær av detergent (angitt ved c; sporene 3 og 6).
c) Immunoblotting av DP-1 immunoutfeller med anti-E2F-l: anti-DP-1 immunoutfellinger utført i nærvær av enten peptid
A (spor 3) eller peptid 1 (spor 4) ble immunoblottet med
det anti-E2F-l monoklonale antistoff SQ41, hvor E2F-1 polypeptidet som er til stede i spor 4 er angitt med pilen. Som en positiv kontroll ble omkring 100 ng av E2F-1 fusjonsproteinet GST-E2F-1<89>"<*37> immunoblottet i spor 2. Spor 1 viser
standard molekylvekter.
Figur 7
DP-1 og E2F-1 binder til E2F-setet som et kompleks.
a) DP-1 og E2F-1 samvirker synergistisk i DNA-binding til E2F setet: GST-DP-1<5>9-410 (omkring 25 ng) eller GST-E2F-1<89>"<437>
(omkring 50 ng) ble undersøkt enten alene (sporene 2, 3, 6 og 7) eller sammen (sporene 4 og 8) for binding til adenovirus E2A promoteren (sporene 1 til 4) eller det distale E2F setet tatt fra E2A promoteren (sporene 5 til 8); hvor sporene 1 og 5 viser bindingssetene alene. Merk at et DNA-bindende kompleks var synlig i spor 6 ved øket eksponering (data ikke vist). E2F setespesifisiteten av kompleksene ble bekreftet ved å utføre de passende konkurrerende forsøk (data ikke vist). Effekten av anti-E2F-l (sporene 9 og 10) eller anti-DP-1 (sporene 11 og 12; antipeptid 18; Girling et al., 1993} ble undersøkt på GST-E2F-1<89>"<437> alene (spor 9) eller GST-E2F-1<89>"<437> og GST-DP-1<5>9"110 sammen (sporene 10, 11 og 12). I tillegg inneholder reaksjonene i sporene 11 og 12 enten et urelatert (spor 11) eller de homologe (peptid 18; spor 12) peptider. b) DP-1 og E2F-1 danner DNA-bindende heteromerer: GST-E2F-1<89>"<437> (omkring 50 ng) ble inkubert med kontroll GST fusjonsprotein (omkring 300 ng; spor 1) eller DP-1<94>"<24*> eller DP-1<84>"204 (omkring 150 ng, frigjort etter spaltning med trombin; sporene 2 og 3), GST-DP-184"24<9>, GST-DP-1<84>"<204>, GST-DP-11<48>"<149> eller GST-DP-184"1" (omkring 300 ng, uten spaltning; sporene 4, 5, 6 og 7). c) Sekvensspesifisitet av E2F-le9"4<37>/DP-l<84>"249 heteromeren: DNA-sekvensspesifisiteten av komplekser dannet med enten
GST-E2F-1<89>"<437> (50 ng; sporene 2 til 6) eller GST-E2F-189"437 med DP-1<84>"<249> (henholdsvis 50 ng og 150; sporene 7 til 11) ble bestemt ved å konkurrere med de villtype eller muterte derivater av det distale E2F-setet fra adenovirus E2A promoteren (omkring 100 ganger molart overskudd av bindingssetene indikert). For sammenligning er et lignende forsøk vist i et F9 EC celleekstrakt (spor 12 til 16). Både mono-og heteromere DNA-bindende komplekser hadde meget lignende sekvensspesifiteter til F9 EC Celle DRTF1/E2F. Spor 1 viser proben alene. Detaljer av de konkurrerende bindingssetene er gitt i materialer og metoder.
d) DP-1 inneholder et dimeriseringsdomene: de angitte områder av DP-1 ble uttrykt som GST fusjonsproteiner (sporene
3 til 6) og omkring 2ug inkubert med 5ul av et retikulocyttlysat inneholdende translatert villtype E2F-1<1->"<7>. GST
fusjonsproteiner, eller GST fusjonsprotein alene (spor 2), ble samlet opp med glutationagarosekuler og bundet E2F-1 polypeptid ble frigjort. Spor 1 viser lysatet med E2F-1 polypeptidet. Bemerk at DP-1146--49 binder til E2F-1. e) Oppsummering av dataene og de molekylære egenskapene av DP-1. Den C-terminale grensen for det DNA-bindende domenet, som er kjent å ligge innenfor området indikert med den brutte linjen, har ikke blitt definert.
Figur 8
DP-1 og E2F-1 samvirker i gjærceller.
Oppsummering av resultater. Detaljer av ekspresjons-vekto-rene og reporterkonstruksjonen er beskrevet ovenfor.
Figur 9
Funksjonell synergisme mellom DP-1 og E2F-1 i Drosophila SL2-celler a) Oppsummering av konstruksjoner: p3xWT og p3xMT har tidligere blitt beskrevet (Zamanian og La Thangue, 1992). pDP-1 og pE2F-l inneholder proteiner av full lengde, og pG4MpolyII det Ga14 DNA-bindende domenet.
b) og c). SL2-celler ble transfektert med p3xWT og de angitte ekspresjonsvektorer. Mengdene av ekspresjonsvektor i
hver behandling var som følger: 50 ng (sporene 1, 5, 6, 7 og 8) eller 500 ng (spor 2) for E2F-1, 5ug (sporene 3 og 5)
eller 10pg (sporene 4 og 6) for DP-1, og 3,7pg (spor 7} eller 7,0pg (spor 8) for pG4Mpoly II. Alle verdier er uttrykt i forhold til p3xWT alene, som ble gitt en tilfeldig verdi på 1,0, og er representative for minst tre separate forsøk, b) viser et eksempel på grovdataene som er kvantitativt vist i c).
Figur 10
DP-1 hjelper til med E2F seteavhengig transkripsjon i F9 EC celler.
a) Oppsummering av konstruksjoner
b) F9 EC-celler ble transfektert med p3xWT og de angitte
ekspresjonsvektorene. Alle behandlinger ble utført i
duplikat og korrigert for transfeksjonseffektivitet. Alle ver-dier er uttrykt i forhold til aktiviteten av p3xWT alene, som blir gitt en tilfeldig verdi på 1,0, og er representative for minst tre separate forsøk. Bemerk at DP-1-3-34<0> ødelegger den endogene DRTF1/E2F aktivitet, og at E2F-1 kan redde denne effekten. Dataene er vist grafisk ved bunnen av figuren.
Figur 11
DP-1 og E2F-1 aktiverer E2F seteavhengig transkripsjon i gjærceller.
a) Oppsummering av konstruksjon.
b) (5-galaktosidaseaktivitet ble målt i S.cerevisiae
stamme W3031a som bærer p4xWT CYC1 og den angitte effektor
ekspresjonsvektor. Alle verdier er uttrykt i forhold til aktiviteten av p4xWT CYC1 som ble gitt en tilfeldig verdi på 1,0 og er representative for minst tre separate forsøk.
Referanser for del B
Bandara, L.R. and La Thangue, N.B. (1991) JTature, 351, 494-497.
Bandara, L.R., Adamczewski, J.P., Hunt, T. and La Thangue, N.B.
(1991) Nature, 352, 249-251.
Bandara, L.R., Adamczewski, J.P.,<*>Poon, R.C.Y., Zamanian, M., Hunt, T. and La Thangue, N.B. (1992) J. Cell. Science, 16, 77-85.
Blake, M.C. and Azizkhan, J.C. (1989) Mol. Cell. Biol., 9, 4994-5002.
Chellappan, S.P., Biebert, S., Mudryj, M., Horowitz, J.M. and Nevins J.R. (1991) Cellt 65, 1053-1061.
Chien, C-T., Bart el, P.L., Sternglanz, R. and Pields, S.
(1991) Proe. Nati. Acad. Sei. VSA, 88, 9578-9582.
Courey, A.J. and Tjian, R. (1988) . Cell 55, 687-898.
Dalten, S. (1992) EMBOJ., 11, 1797-1808.
Devoto, S.H., Mudryj., H., Pines, J., Hunter, T., and Nevins J.R. (1992) Cell, 68, 167-176.
Fields, S. and Song, O. (1989) Nature, 340, 245-246.
Girling,R., Partridge, J.F., Bandara, L.R., Burden, N., Totty, N.F., Hsuan, J.J. and La Thangue, N.B. (1993) Jtøcure, 362, 83-87.
Guarente, L. and Mas on, T. (1983) Cell, 32, 1279-1286.
Helin, K., Lees, J.A., Vidal, M., Dysen, N., Harlow, E. and Pattaey, A. (1992) Cell, 70, 337-350.
Hiebert, S.W., Chellappan, S.P., Horowitz, J.M., and Nevins J.R. (1992) Genes and Development, 6, 177-185.
Johnson, A.L., Barker, 0.6. and Johns ton, L.H. (1966) Curr. Genet., 11, 107-112.
Kaelin, W.G,, Krek., W., Sellers, W.R., DeCaprio, J.A., Ajchenbaum, F., Fuchs, C.H., Chittenden, T., Li, Y., Farnham, P.J., Blånar., M.A., Li vinge ton, D.M. and Flemington, E.K.
(1992) Cell, 70,. 351-364.
La Thangue, N.B. and Rigby, P.W.J. (1987) Cell, 49, 507-513.
La Thangue, N.B., Thimmappaya, B. and Rigby, P.W.J. (1990) Nucleic Acids Res., 16, 2929-2938.
La Thangue, N.B. and Taylor, W. (1993) Trends Cell Biol., 3, 75-76.
Lees, E., Faha, B., Dulle, V., Reed, S.I. and Harlow, E. (1992) Genes and Development, 6, 1874-1885.
Means, A.L., Slansky, J.E., McMahon, S.L., Knuth, M.W. and Farnham, P.J. (1992) tfol.Cell.Biol., 12, 1054-1063.
Mudryj, M., Devoto, S.H., Biebért, S.W., Hunter,T., Pines, J.
and Nevins J.R. (1991) Cell, 65, 1243-1253
Shirodkar, S., Ewen, M., DeCaprio, J.A., Morgan, J., Li vings ton, D.M. and Chittenden, T. (1992) Cell, 68, 157-166
Shivjl, M.K., and La Thangue, N.B. (1991) Mol. Cell. Biol., 11, 1686-1695
Webster, N.J.G., Green, S., Tasset, D., Ponglikitmongkol, M. and Chambon, P. (1989). BtSBOJ., 8, 1441-1446.
Zamanian, M. and La Thangue, N.B. (1992) EMBO J., li, 2603-2610.
Zamanian, M. and La Thangue, N.B. (1993) Mol.Biol.Cell., 4, 389-396

Claims (8)

1. Fremgangsmåte for identifisering av forsøksvise kjemoterapeutiske midler til behandling av proliferative eller virale sykdommer, karakterisert ved at den omfatter: (A) å bringe i kontakt med hverandre: (i) et DP-l-polypeptid, hvilket polypeptid omfatter: (a) proteinet med SEQ ID NO: 2; eller (b) et protein som har minst 80% aminosyreidentitet med proteinet med SEQ ID NO: 2; eller (c) et polypeptid som har en observert molekylvekt på omkring 46.000 på en SDS polyakrylamidgel og omfattende et DNA-bindende domene representert av en sekvens som har minst 80% aminosyreidentitet med residuer 84-204 av SEQ ID NO: 2; eller (d) et fragment av ethvert av (a) til (c) og som er i stand til å danne et kompleks med E2F-l-proteinet eller et relatert familiemedlem, (ii) (a) proteinet E2F-1; eller (b) et E2F-1 familiemedlem som har minst 80% aminosyreidentitet med E2F-1 over det DNA-bindende område; eller (c) et fragment av (a) eller (b) som er i stand til å danne et funksjonelt trans-aktiveringskompleks med proteinet av SEQ ID NO: 2; eller (d) et fusjonsprotein omfattende (a), (b) eller (c); og (iii) et forsøksvis kjemoterapeutisk middel; under forhold hvor komponentene (i) og (ii) ved fravær av (iii) danner et kompleks, og (B) måle i hvilken grad komponent (iii) er i stand til å forstyrre eller inhibere aktiviteten av nevnte kompleks.
2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det forsøksvise kjemoterapeutiske middel er et fragment på 10 eller flere aminosyrer av (a) proteinet av SEQ ID NO: 2; eller (b) et protein som har minst 80% sekvensidentitet med proteinet med SEQ ID NO: 2.
3. Fremgangsmåte ifølge krav 2, karakterisert ved at fragmentet er et po-lypeptidfragment som faller innenfor området 160 til 220 av SEQ ID NO: 2.
4. Fremgangsmåte ifølge ethvert av de foregående krav, karakterisert ved at komponent (i) omfatter sekvensen av SEQ ID NO: 2.
5. Fremgangsmåte ifølge ethvert av de foregående krav, karakterisert ved at komplekset av komponenter (i) og (ii) blir målt ved å bestemme egenskapen av nevnte kompleks til å aktivere in vivo en promoter omfattende et E2F-bindende sete, hvor nevnte promoter er opera-tivt knyttet til et reportergen.
6. Fremgangsmåte ifølge krav 5, karakterisert ved at det uføres med gjærcelle.
7. Fremgangsmåte ifølge ethvert av de foregående krav, karakterisert ved at en eller flere komponenter bærer en radioaktiv eller kolorimetrisk markør.
8. Fremgangsmåte ifølge ethvert av de foregående krav, karakterisert ved at nevnte DP-l-polypeptid er et polypeptid som har en observert molekylvekt på omkring 46.000 på en SDS polyakrylamidgel og omfattende et DNA-bindende domene representert av en sekvens som har minst 80% aminosyreidentitet med residuer 84-204 av SEQ ID NO: 2 eller et fragment derav som er i stand til å danne et kompleks med E2F-l-proteinet.
NO19951641A 1992-10-29 1995-04-28 Fremgangsmate for identifisering av kjemoterapeutiske midler ved bruk av transkripsjonsfaktor DP-1 NO323532B1 (no)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GB929222715A GB9222715D0 (en) 1992-10-29 1992-10-29 Transcription factor
GB939316206A GB9316206D0 (en) 1993-08-05 1993-08-05 Transcription factor
PCT/GB1993/002227 WO1994010307A1 (en) 1992-10-29 1993-10-29 Transcription factor dp-1

Publications (3)

Publication Number Publication Date
NO951641D0 NO951641D0 (no) 1995-04-28
NO951641L NO951641L (no) 1995-06-29
NO323532B1 true NO323532B1 (no) 2007-06-04

Family

ID=26301878

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
NO19951641A NO323532B1 (no) 1992-10-29 1995-04-28 Fremgangsmate for identifisering av kjemoterapeutiske midler ved bruk av transkripsjonsfaktor DP-1

Country Status (12)

Country Link
US (2) US5863757A (no)
EP (2) EP0669976B1 (no)
JP (1) JP3633616B2 (no)
KR (1) KR950704484A (no)
AT (1) ATE181360T1 (no)
AU (1) AU675678B2 (no)
CA (1) CA2148258A1 (no)
DE (1) DE69325383T2 (no)
DK (1) DK0669976T3 (no)
NO (1) NO323532B1 (no)
NZ (1) NZ257181A (no)
WO (1) WO1994010307A1 (no)

Families Citing this family (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0732929B1 (en) * 1993-10-29 2008-05-14 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Therapeutic use of cis-element decoys in vivo
GB9413327D0 (en) * 1994-07-01 1994-08-24 Medical Res Council Assay for inhibitors of dp-1
US6045999A (en) * 1994-11-15 2000-04-04 Prolifix Limited Transcription factor E2F-4
US6303335B1 (en) 1994-11-15 2001-10-16 Prolifix Limited Transcription factor E2F-4
GB9502873D0 (en) * 1995-02-14 1995-04-05 Medical Res Council Transcription factor
US5705350A (en) * 1995-08-29 1998-01-06 Duke University Transcription factor complexes in senescent cells
GB9608143D0 (en) * 1996-04-19 1996-06-26 Ver Nl Kanker Inst Assay
US6159691A (en) * 1996-05-15 2000-12-12 Prolifix Limited Assay for a putative regulator of cell cycle progression
GB9610195D0 (en) * 1996-05-15 1996-07-24 Medical Res Council Assay
FR2750705B1 (fr) * 1996-07-04 1998-10-30 Centre Nat Rech Scient Systeme de detection des interactions proteine-proteine
US6713449B1 (en) * 1996-09-30 2004-03-30 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. E2F activity inhibitory compounds
US6387649B1 (en) 1996-09-30 2002-05-14 Prolifix Limited Assay for a regulator of cell cycle progression
GB9626589D0 (en) * 1996-12-20 1997-02-05 Prolifix Ltd Peptides
US5932425A (en) * 1997-02-18 1999-08-03 Signal Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for modulating cellular NF-κB activation
AU9550198A (en) 1997-10-21 1999-05-10 University Court Of The University Of Glasgow, The Jmy, a co-activator for p300/cbp, nucleic acid encoding jmy and uses thereof
AU3478599A (en) * 1998-04-09 1999-11-01 E.I. Du Pont De Nemours And Company Cell cycle regulatory proteins
AU6976300A (en) * 1999-09-16 2001-04-17 Mcgill University Methods for modulating cell proliferation
WO2001021644A2 (en) * 1999-09-24 2001-03-29 Consejo Superior De Investigaciones Cientificas Wheat dp proteins and uses thereof
GB9923306D0 (en) 1999-10-01 1999-12-08 Isis Innovation Diagnostic and therapeutic epitope, and transgenic plant
US20030225012A1 (en) * 2002-05-31 2003-12-04 Isis Pharmaceuticals Inc. Antisense modulation of transcription factor DP-1 expression
GB0212885D0 (en) 2002-06-05 2002-07-17 Isis Innovation Therapeutic epitopes and uses thereof
EP2486935B1 (en) 2004-04-28 2021-04-07 BTG International Limited Epitopes related to Coeliac Disease
US10105437B2 (en) 2004-04-28 2018-10-23 Btg International Limited Epitopes related to coeliac disease

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU3609693A (en) * 1992-01-29 1993-09-01 Duke University Method of assaying for the oncogenic state of cells

Also Published As

Publication number Publication date
EP0905236A1 (en) 1999-03-31
NO951641L (no) 1995-06-29
JP3633616B2 (ja) 2005-03-30
JPH08503128A (ja) 1996-04-09
DE69325383D1 (de) 1999-07-22
AU5343994A (en) 1994-05-24
DK0669976T3 (da) 2000-01-10
EP0669976B1 (en) 1999-06-16
US6150116A (en) 2000-11-21
WO1994010307A1 (en) 1994-05-11
ATE181360T1 (de) 1999-07-15
NO951641D0 (no) 1995-04-28
NZ257181A (en) 1997-07-27
CA2148258A1 (en) 1994-05-11
AU675678B2 (en) 1997-02-13
US5863757A (en) 1999-01-26
DE69325383T2 (de) 1999-11-25
EP0669976A1 (en) 1995-09-06
KR950704484A (ko) 1995-11-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
NO323532B1 (no) Fremgangsmate for identifisering av kjemoterapeutiske midler ved bruk av transkripsjonsfaktor DP-1
Tevosian et al. HBP1: a HMG box transcriptional repressor that is targeted by the retinoblastoma family.
Lee et al. Cloning of p57KIP2, a cyclin-dependent kinase inhibitor with unique domain structure and tissue distribution.
Bengal et al. Functional antagonism between c-Jun and MyoD proteins: a direct physical association
Girling et al. A new component of the transcription factor DRTF1/E2F
Qin et al. The transcription factor E2F-1 is a downstream target of RB action
TRAVER et al. RGS14 is a novel Rap effector that preferentially regulates the GTPase activity of Gαo
Rodriguez et al. Functional characterization of human nucleosome assembly protein-2 (NAP1L4) suggests a role as a histone chaperone
Loyer et al. The RNP protein, RNPS1, associates with specific isoforms of the P34CDC2 related PITSLRE protein kinase in vivo
Welch et al. RanBP3 contains an unusual nuclear localization signal that is imported preferentially by importin-α3
Chakraborty et al. Inefficient homooligomerization contributes to the dependence of myogenin on E2A products for efficient DNA binding
JP2000166555A (ja) Ｉｇｆ―１レセプタ―と相互作用するタンパク質、それをコ―ドする遺伝子及びそれらの使用
EP0898580A1 (en) Methods and means for inhibition of cdk4 activity
JPH11313686A (ja) サイクリン依存性キナ―ゼの阻害剤の結合パ―トナ―、並びにそれらの阻害剤検索および疾病の診断または治療のための使用
JP2006340730A (ja) 転写因子−ｅ２ｆ−５
Sardet et al. E2Fs and the retinoblastoma protein family
CA2370098C (en) Human beta-trcp protein
JP2001510684A (ja) アッセイ、治療法及び治療手段
Shiyanov et al. p27Kip1 induces an accumulation of the repressor complexes of E2F and inhibits expression of the E2F-regulated genes.
US8889408B2 (en) Factor taking part in transcription control
US7160677B1 (en) Transcription factor DP-1
US7141650B2 (en) Cap-binding protein
ZALC et al. RGS14 is a novel Rap effector that preferentially regulates the GTPase activity of Gαo
Eilers MondoA and Mlx: two novel members of the basic helix-loop-helix leucine zipper family of transcription factors
Lele Transcriptional control of the gene for cyclin A1 and kinetic analysis of mutant cyclin A1/CDK complexes associated with infertility

Legal Events

Date Code Title Description
MM1K Lapsed by not paying the annual fees