JP2021101715A - 種間特異的結合ドメイン - Google Patents
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Abstract
Description
395−402)。TcRの抗原特異的鎖は、シグナリングドメインを持たず、その代
わりに保存されたマルチサブユニットシグナル伝達装置CD3に結合する(Call,Cell 111 (2002), 967− 979, Alarcon, Immunol.
Rev. 191 (2003), 38−46, Malissen Immunol.Rev. 191 (2003), 7−27)。TcRライゲーションがシグナル伝達装置
に直接通じる機構は、T細胞生物学の根本的な疑問のままである(Alarcon,上記引用文献;Davis, Cell 110 (2002), 285−287))。持続したT細胞応答が、コレセプターの関与、TcRオリゴマー化及び免疫シナプス中のTcR−pMHC複合体の高次配列を含むことは明らかなようである(Davis& van der Merwe, Curr. Biol. 11 (2001), R289−R291,
Davis, Nat. Immunol. 4 (2003),217− 224)。しかし、非常に早いTcRシグナル伝達は、これらの事象の非存在下で起こり、CD3イプシロン中のリガンドが誘起するコンフォメーション変化を含むかもしれない(Alarcon,上記引用文献,Davis (2002),上記引用文献, Gil, J. Biol. Chem. 276 (2001), 11174−11179, Gil, Cell
109(2002), 901 −912)。シグナル伝達複合体のイプシロン、ガンマ、デルタ及びゼータサブユニットは互いに会合して、CD3イプシロン−ガンマヘテロダイマー、CD3イプシロン−デルタヘテロダイマー及びCD3ゼータ−ゼータホモダイマーを形成する(Call,上記引用文献)。様々な研究は、CD3分子がアルファベータTcRの正常な細胞表面発現及び通常のT細胞発達にとって重要であることを明らかにした(Berkhout,J. Biol. Chem. 263 (1988), 8528−
8536, Wang, J. Exp. Med. 188 (1998), 1375−1
380,Kappes, Curr. Opin. Immunol. 7 (1995), 441−447)。マウスCD3イプシロンガンマヘテロダイマーのエクトドメイン断片の溶液構造は、イプシロンガンマサブユニットが、両方とも、互いに相互作用して異常な側々ダイマーコンフィグレーションを形成するC2セットIgドメインであることを示した(Sun,Cell 105 (2001), 913− 923)。システインに富んだ軸は、CD3の二量体化を進めるのに重要な役割を果たすようであるが(Su,上記引用文献,Borroto, J. Biol. Chem. 273 (1998), 12807−12816)、CD3イプシロン及びCD3ガンマの細胞外ドメインによる相互作用は、これらのタンパク質とTcRベータとの集合に十分である(Manolios,Eur. J. Immunol. 24 (1994), 84−92, Manolios & Li, Immunol. Cell Biol. 73 (1995),532−536)
。未だ議論の的となっているが、TcRの優勢な化学量論は、1つのアルファベータTcR、1つのCD3イプシロンガンマヘテロダイマー、1つのCD3イプシロンデルタヘテロダイマー及び1つのCD3ゼータゼータホモダイマーを含むことが最も可能性がある(
Call,上記引用文献)。免疫応答におけるヒトCD3イプシロンガンマヘテロダイマーの中心的な役割を仮定して、治療抗体OKT3に結合したこの複合体の結晶構造が最近解明された(Kjer−Nielsen,PNAS 101, (2004), 7675
−7680)。
123−132, Kumar,Transplant. Proc. 30 (1998), 1351−1352)、1型糖尿病(Chatenoud (2003),上記引用文献)及び乾癬(Utset,J. Rheumatol. 29 (2002), 1907−1913)における免疫抑制剤として臨床的に広く使用されている。さらに、抗CD3mAbは、部分的なT細胞シグナル伝達及びクローンアネルギーを誘起することがある(Smith,J. Exp. Med. 185 (1997), 1413−1422)。
OKT3は、潜在的なT細胞マイトジェン(Van Wauve, J. Immunol
. 124(1980), 2708−18)並びに潜在的なT細胞キラー(Wong,
Transplantation 50 (1990), 683−9)として、文献に記
載されてきた。OKT3は、時間依存的にこれらの活性の両方を示す。サイトカイン放出につながるT細胞の早期活性化に続き、さらにOKT3を投与すると、公知のT細胞機能の全てを後に阻害する。同種移植組織拒絶の低減又はさらには全廃のために治療レジメンにおいて免疫抑制剤としてそのような広い用途をOKT3が見いだしたのは、この後期のT細胞機能の阻害による。
ielsen, PNAS 101, (2004), 7675−7680)。さらなるエビデンスは、TCR/CD3複合体とのOKT3の結合には、この複合体の他のサブユニットの存在が必要であることを示している(Salmeron,J. Immunol. 147 (1991), 3047−52)。
のようなCD3特異性抗体は、リンホカイン産生(VonWussow, J. Immunol. 127 (1981), 1197; Palacious, J. Immunol. 128 (1982), 337)、増殖(VanWauve, J. Immuno
l. 124 (1980), 2708−18)及びサプレッサーT細胞誘起(Kuni
cka, in "Lymphocyte Typing II" 1 (1986),223)などの種々のT細胞応答を誘起することができる。すなわち、実験条件によって、CD3特異性モノクローナル抗体は、細胞障害性を阻害することも、誘起することもできる(Leewenberg,J. Immunol. 134 (1985), 3770; Ph
illips, J. Immunol. 136 (1986) 1579; Platsoucas,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78 (1981),
4500; Itoh, Cell. Immunol. 108 (1987), 283−96;Mentzer, J. Immunol. 135 (1985), 34; Landegren, J. Exp. Med. 155 (1982), 1579; Choi
(2001), Eur. J. Immunol. 31, 94−106; Xu (20
00), Cell Immunol. 200, 16−26; Kimball(199
5), Transpl. Immunol. 3, 212−221)。
ience 166, 1365及びLaver, (1990) Cell 61 , 55
3−6)。当分野に記載されているCD3イプシロン抗体に結合される立体配座エピトープは、2つの群に分けることができる。主要な群では、前記エピトープは、2つのCD3サブユニット、例えばCD3イプシロン鎖及びCD3ガンマ鎖又はCD3デルタ鎖により形成されている。例えば、最も広く使用されているCD3イプシロンモノクローナル抗体OKT3、WT31、UCHT1、7D6及びLeu−4は、CD3イプシロン鎖により単独にトランスフェクトされた細胞には結合しなかったことが複数の研究で見出された。しかし、これらの抗体は、CD3イプシロンとCD3ガンマ又はCD3デルタの組み合わせにより二重にトランスフェクトされた細胞を染色した(Tunnacliffe,上記引用文献;Law, Int. Immunol. 14 (2002), 389−400
; Salmeron, J. Immunol. 147 (1991), 3047−52;Coulie, Eur. J. Immunol. 21 (1991), 1703−9)。第2のより小さな群では、立体配座エピトープは、CD3イプシロンサブユニット自体の中に形成される。この群のメンバーは、例えば変性CD3イプシロンに対して産出されたmAbAPA1/1である(Risueno, Blood 106 (2005), 601−8)。ひとまとめにすると、当分野に記載されているCD3イプシロン抗体のほとんどは、CD3の2つ以上のサブユニット上に位置する立体配座エピトープを認識する。これらのエピトープの三次元構造を形成する別々のアミノ酸残基は、この結果、CD3イプシロンサブユニット自体の上に位置するか、CD3イプシロンサブユニットとCD3ガンマ又はCD3デルタなどの他のCD3サブユニットの上に位置することがある。
51)。抗CD3モノクローナル抗体UCHT1もチンパンジーのCD3とは反応性であるが、マカクザルのCD3とは反応しない(発明者らのデータ)。その一方で、マカクザル抗原を認識するが、そのヒト対応物を認識しないモノクローナル抗体の例もある。この群の1例は、マカクザル由来のCD3を対象とするモノクローナル抗体FN−18である(Udaet al., J. Med. Primatol. 30 (2001), 14
1−147)。興味深いことに、カニクイザルの約12%の末梢リンパ球が、マカクザル中のCD3抗原の多形性により、抗アカゲザルCD3モノクローナル抗体(FN−18)との反応性を欠くことが見いだされている。Udaらは、FN−18と反応性である動物
から誘導されたCD3と比較し、FN−18と反応性でないカニクイザルのCD3配列中にある2つのアミノ酸の置換を記載した(Udaet al., J Med Primatol. 32 (2003), 105−10; Uda et al., J Med Pri
matol. 33 (2004),34−7)。
体配座、配列又は構造の変化又は修飾につながらないことを意味する。対照的に、従来のCD3結合分子(例えば、国際公開第99/54440号又は国際公開第04/106380号に開示される)により認識されるCD3エピトープは、コンテクスト非依存性エピトープのCD3イプシロン鎖C末端からN末端1−27アミノ酸に局在化するが、その場合、イプシロン鎖の残りの部分に埋め込まれ、イプシロン鎖とCD3ガンマ又はデルタ鎖とのヘテロダイマー化により正しい位置に保持されないと正しいコンフォメーションがとれない。
ド断片のアミノ酸1−27のアラニン変異体への結合を試験した(添付される実施例5参照)。断片の正にN末端での最初の5つのアミノ酸残基及びCD3イプシロンのN末端ポリペプチド断片のアミノ酸1−27の位置23及び25の2つのアミノ酸の個々の変化が、抗体分子の結合に重要であった。残基Q(位置1でのグルタミン)、D(位置2でのアスパラギン酸)、G(位置3でのグリシン)、N(位置4でのアスパラギン)及びE(位置5でのグルタミン酸)を含む、位置1〜5の領域のアミノ酸残基をアラニンに置換すると、前記断片に対する、本発明の、好ましくはヒトの、結合分子の結合が無くなった。その一方で、本発明の、好ましくはヒトの、結合分子の少なくともいくつかでは、言及された断片T(位置23でのスレオニン)及びI(位置25でのイソロイシン)のC末端での2つのアミノ酸残基、は、本発明の、好ましくはヒトの、結合分子への結合エネルギーを低下させた。
片も認識することが見いだされた。したがって、本発明のCD3結合分子の多霊長類特異性が検出された。以下の配列分析は、CD3イプシロンの細胞外ドメインのN末端で高度に相同性のある配列ストレッチを、ヒト及び霊長類が共有することを確認した。
、及び前臨床動物試験に使用できることである。
al., PNAS 100 (2003), 7181)。したがって、チンパンジーで
得られたデータは、一般的にヒトにとって高度に予測的であると考えられる。しかし、絶滅危惧種としての状況により、医学実験に使用できるチンパンジーの数は高度に制限されている。上述のとおり、したがって、動物試験のためのチンパンジーの維持は、コストがかかり、且つ倫理的にも問題である。本発明のCD3イプシロン特異的な、好ましくはヒトの、結合分子(又はそれを含む二重特異性単鎖抗体)を使用すると、得られる動物試験データの質、すなわち適応性を損なわずに、前臨床試験の間の倫理的な支障及び資金面での負担を避けられる。これに照らして、CD3イプシロン特異的な、好ましくはヒトの、結合分子(又はそれを含む二重特異性単鎖抗体)の使用は、チンパンジーでの研究の妥当
な代替物を与える。
の断片を記述する。ポリペプチドは、ダイマー、トリマーなどのマルチマー及び高次のオリゴマー、すなわち2以上のポリペプチド分子からなるものをさらに形成することもある。そのようなダイマー、トリマーなどを形成するポリペプチド分子は、同一でも、異なっていてもよい。したがって、そのようなマルチマーの対応する高次の構造は、ホモ又はヘテロダイマー、ホモ又はヘテロトリマーなどと称される。ヘテロマルチマーの一例は抗体分子であり、その天然の形態で、2つの同一のポリペプチド軽鎖及び2つの同一のポリペプチド重鎖からなる。「ポリペプチド」及び「タンパク質」という用語は、例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化などの翻訳後修飾により修飾が実施される、天然修飾ポリペプチド/タンパク質も意味する。そのような修飾は当分野に周知である。
意味する。本願に記載されるコンストラクトの医学的使用に関する限り、ヒトの患者が同じ分子で治療される。
ボノボ(Pan paniscus)種及びナミチンパンジー(Pantroglody
tes)種を含む動物以外である。「霊長類(primate)」、「霊長類種」、「霊長類(primates)」又はその文法的変形は、原猿(prosimians)及び類人猿(anthropoids)の2つの亜目に分けられ、人間、類人猿(apes)、猿(monkeys)及びキツネザル(lemurs)を含む真獣類の目を意味する。具体的には、本願の「霊長類」は、曲鼻猿亜目(Strepsirrhini)(非メガネザル(non−tarsier)原猿)を含み、前記亜目は、キツネザル下目(Lemuriformes)(それ自体、コビトキツネザル上科(Cheirogaleoidea)及びキツネザル上科(Lemuroidea)を含む)、アイアイ下目(Chiromyiformes)(それ自体、アイアイ科(Daubentoniidae)を含む)及びロリス下目(Lorisiformes)(それ自体、ロリス科(Lorisidae)及びガラゴ科(Galagidae)を含む)を含む。本願の「霊長類」は、直鼻猿亜目(Haplorrhini)もまた含み、前記亜目は、メガネザル下目(Tarsiiformes)(それ自体、メガネザル科(Tarsiidae)を含む)、真猿下目(Simiiformes)(それ自体、広鼻小目(Platyrrhini)又は新世界猿、及びオナガザル科(Cercopithecidea)を含む狭鼻小目(Catarrhini)又は旧世界猿を含む)を含む。
ジア属のほとんど及びアフリカコロブスザルも含むコロブス亜科(Colobinae)に再分される。
apoin);ガボン・タラポアン、ミオピテクス・オゴウエンシス(Miopithecusogouensis));パタスモンキー属(Erythrocebus)内(パタスモンキー、エリスロセブス・パタス(Erythrocebus patas));
クロロセブス属(Chlorocebus)内(ミドリザル、クロロセブス・サバセウス(Chlorocebussabaceus));グリベットモンキー、クロロセブス・アエチオプス(Chlorocebus aethiops);ベールマウンテン・ベル
ベットモンキー、クロロセブス・ドジャムドジャメンシス(Chlorocebusdjamdjamensis);タンタルスモンキー、クロロセブス・タンタルス(Chlorocebus tantalus);ベルベットモンキー、クロロセブス・ピゲリスラ
ス(Chlorocebuspygerythrus);マルブルック、クロロセブス・シノスロス(Chlorocebus cynosuros));又はオナガザル属(C
ercopithecus)内(ドリアスグエノン又はサロンゴモンキー、セルコピテクス・ドリアス(Cercopithecusdryas);ダイアナモンキー、セルコピテクス・ダイアナ(Cercopithecus diana);ロロウェイモンキー、
セルコピテクス・ロロウェイ(Cercopithecusroloway);オオハナジログエノン、セルコピテクス・ニクチタンス(Cercopithecus nict
itans);ブルーモンキー、セルコピテクス・ミティス(Cercopithecusmitis);シルバーモンキー、セルコピテクス・ドゲッティ(Cercopithecus doggetti);ゴールデンモンキー、セルコピテクス・カンジチ(Ce
rcopithecuskandti);サイクスモンキー、セルコピテクス・アルボグラリス(Cercopithecus albogularis);モナモンキー、セル
コピテクス・モナ(Cercopithecusmona);キャンベル・モナモンキー、セルコピテクス・キャンベリ(Cercopithecus campbelli);
ロウ・モナモンキー、セルコピテクス・ロウイ(Cercopithecuslowei);クラウングエノン、セルコピテクス・ポゴニアス(Cercopithecus p
ogonias);ウォルフグエノン、セルコピテクス・ウォルフィ(Cercopithecuswolfi);デント・モナモンキー、セルコピテクス・デンティ(Cercopithecus denti);ショウハナジログエノン、セルコピテクス・ペタウ
リスタ(Cercopithecuspetaurista);アカハラグエノン、セルコペテクス・エリスロガスター(Cercopithecus erythrogast
er);スクラターグエノン、セルコピテクス・スクラテリ(Cercopithecussclateri);アカミミグエノン、セルコピテクス・エリスロティス(Cercopithecus erythrotis);クチヒゲグエノン、セルコピテクス・セ
ファス(Cercopithecuscephus);アカオザル、セルコピテクス・アスカニウス(Cercopithecus ascanius);ロエストグエノン、セ
ルコピテクス・ロエスティ(Cercopithecuslhoesti);プロイッスモンキー、セルコピテクス・プロイッシ(Cercopithecus preussi
);サンテイルド・モンキー、セルコピテクス・ソラタス(Cercopithecussolatus);ハムリンズモンキー(Hamlyn's monkey)又はフクロウグエノン、セルコピテクス・ハムリニ(Cercopithecushamlyni);ブラッザモンキー、セルコピテクス・ネグレクタス(Cercopithecus ne
glectus))である。
Macaca nemestrina);キタブタオザル、マカカ・レオニア(Maca
caleonina);パガイモンキー又はボッコイ(Bokkoi)、マカカ・パゲンシス(Macaca pagensis);シブルー島マカク(Siberut Macaque)、マカカ・シベル(Macacasiberu);ムーアモンキー、マカカ・マウラ(Macaca maura);ウスイロマカク、マカカ・オケレアタ(Macac
a ochreata);トンケアンマカク、マカカ・トンケアナ(Macacaton
keana);ヘックモンキー、マカカ・ヘッキ(Macaca hecki);ゴロン
タロモンキー、マカカ・ニグリシェンス(Macaca nigriscens);スラ
ウェシトサカマカク又はクロザル、マカカ・ニグラ(Macacanigra);シノモルガスサル又はカニクイザル又はオナガザル又はクラ、マカカ・ファシキュラリス(Macaca fascicularis);ベニガオザル又はクマザル、マカカ・アークト
イデス(Macacaarctoides);アカゲザル、マカク・ムラッタ(Macaca mulatta);タイワンザル、マカカ・キュクロピス(Macaca cyclopis);ニホンザル、マカカ・フスカタ(Macacafuscata);トクモンキー、マカカ・シニカ(Macaca sinica);ボンネットモンキー、マカカ・
ラディアタ(Macaca radiata);バーバリーマカク、マカカ・シルバヌス
(Macacasylvanmus);アッサムモンキー、マカカ・アサメンシス(Macaca assamensis);チベットマカク又はミルンエドワーズマカク(Mi
lne−Edwards' Macaque)、マカカ・チベタナ(Macaca thi
betana);アルナチャルモンキー又はムンザラ、マカカ・ムンザラ(Macacamunzala));ロフォセブス属(Lophocebus)内(ホホジロマンガベイ、ロフォセブス・アルビゲナ(Lophocebus albigena);ロフォセブ
ス・アルビゲナ・アルビゲナ(Lophocebusalbigena albigen
a);ロフォセブス・アルビゲナ・オスマニ(Lophocebus albigena osmani);ロフォセブス・アルビゲナ・ジョンストニ(Lophocebusalbigena johnstoni);ブラックマンガベイ、ロフォセブス・アテリムス
(Lophocebus aterrimus);オプデンボッシュ・マンガベイ(Op
denbosch's Mangabey)、ロファセブス・オプデンボッシィ(Lophocebus opdenboschi);ハイランド・マンガベイ、ロファセブス・キ
プンジ(Lophocebuskipunji));ヒヒ属(Papio)内(マントヒヒ、パピオ・ハマドリアス(Papio hamadryas));ギニアヒヒ、パピオ
・パピオ(Papio papio);アヌビスヒヒ、パピオ・アヌビス(Papioa
nubis);キイロヒヒ、パピオ・シノセファルス(Papio cynocepha
lus);チャクマヒヒ、パピオ・ウルシヌス(Papio ursinus));ゲラ
ダヒヒ属(Theropithecus)内(ゲラダヒヒ、テロピテクス・ゲラダ(Theropithecusgelada));マンガベイ属(Cercocebus)内(スーティ・マンガベイ、セルコセブス・アティス(Cercocebus atys);
セルコセブス・アティス・アティス(Cercocebusatys atys);セル
コセブス・アティス・ルヌラトゥス(Cercocebus atys lunulatus);シロエリマンガベイ、セルコセブス・トルクアトゥス(Cercocebustorquatus);アジルマンガベイ、セルコセブス・アギリス(Cercocebus
agilis);ゴールデンマンガベイ、セルコセブス・クリソガスター(Cerco
cebuschrysogaster);ボウシマンガベイ、セルコセブス・ガレリトゥス(Cercocebus galeritus);サンジェマンガベイ、セルコセブス
・サンジェイ(Cercocebussanjei));又はマンドリル属(Mandr
illus)内(マンドリル、マンドリルス・スフィンクス(Mandrillus s
phinx);ドリル、マンドリルス・ロイコファエウス(Mandrillusleucophaeus))由来でよい。
is)(カニクイザルとしても知られ、したがって実施例では「カニクイザル」と称される)及びマカカ・ムラッタ(Macacamulatta)(アカゲザル、「アカゲザル」と称される)である。
angolensis);キングコロブス、コロブス・ポリコモス(Colobus p
olykomos);クマコロブス、コロブス・ベレロサス(Colobusvellerosus);アビシニアコロブス、コロブス・ゲレザ(Colobus guerez
a));ピリオコロブス属(Piliocolobus)内(ウェスタン・アカコロブス、ピリオコロブス・バディウス(Piliocolobusbadius);ピリオコロブス・バディウス・バディウス(Piliocolobus badius badius);ピリオコロブス・バディウス・テミンキー(Piliocolobusbadius
temminckii);ピリオコロブス・バディウス・ワルドロネ(Pilioco
lobus badius waldronae);ペナントアカコロブス、ピリオコロブス・ペナンティ(Piliocolobuspennantii);ピリオコロブス・ペナンティ・ペナンティ(Piliocolobus pennantii pennantii);ピリオコロブス・ペナンティ・エピエニ(Piliocolobuspennantii epieni);ピリオコロブス・ペナンティ・ボウビエリ(Pilioco
lobus pennantii bouvieri);プレウス・アカコロブス(Preuss's Red Colobus)、ピリオコロブス・プレウシ(Piliocolo
bus preussi);トロン・アカコロブス、ピリオコロブス・トロニ(Pili
ocolobustholloni);中央アフリカ・アカコロブス、ピリオコロブス・フォアイ(Piliocolobus foai);ピリオコロブス・フォアイ・フォア
イ(Piliocolobusfoai foai);ピリオコロブス・フォアイ・エリ
オッティ(Piliocolobus foai ellioti);ピリオコロブス・フォアイ・オウスタレティ(Piliocolobusfoai oustaleti);
ピリオコロブス・フォアイ・セムリキエンシス(Piliocolobus foai semlikiensis);ピリオコロブス・フォアイ・パルメンティエロルム(Piliocolobusfoai parmentierorum);ウガンダ・アカコロブ
ス、ピリオコロブス・テフロスケルス(Piliocolobus tephrosce
les);ウジングワ・アカコロブス、ピリオコロブス・ゴロドノルム(Piliocolobusgordonorum);ザンジバル・アカコロブス、ピリオコロブス・キルキ(Piliocolobus kirkii);タナリバーアカコロブス、ピリオコロ
ブス・ルフォミトラトゥス(Piliocolobusrufomitratus));又はプロコロブス属(Procolobus)内(オリーブコロブス、ポロコロブス・ベラス(Procolobus verus))でよい。
cus)内(ネパール・グレイラングール、センノピテクス・スキスタケウス(Semnopithecusschistaceus);カシミール・グレイラングール、センノピテクス・アジャクス(Semnopithecus ajax);タライ・グレイラン
グール、センノピテクス・ヘクター(Semnopithecushector);ハヌ
マンラングール、センノピテクス・エンテラス(Semnopithecus ente
llus);クロアシラングール(Black−Footed GrayLangur)
、センノピテクス・ヒュポレウコス(Semnopithecus hypoleuco
s);南部平野グレイラングール(Southern Plains GrayLangur)、センノピテクス・デゥスミエリ(Semnopithecus dussumie
ri);タフテッド・グレイラングール(Tufted Gray Langur)、センノピテクス・プリアム(Semnopithecuspriam));T.ベツルス(T. vetulus)群又はトラキピテクス属(Trachypithecus)内(カ
オムラサキラングール、トラキピテクス・ベツルス(Trachypithecusvetulus);ニルギリラングール、トラキピテクス・ジョーニ(Trachypithecus johnii));トラキピテクス属のT.クリスタトゥス(T.crist
atus)群内(ジャワ・ルトン、トラキピテクス・アウラトゥス(Trachypithecusauratus);シルバーリーフモンキー又はシルバー・ルトン、トラキピテクス・クリスタトゥス(Trachypithecus cristatus);イン
ドシナ・ルトン、トラキピテクス・ジャーマイニ(Trachypithecusgermaini);テナセリム・ルトン、トラキピテクス・バーベイ(Trachypithecus barbei));トラキピテクス属のT.オブスキュルス(T.obscu
rus)群内(ダスキー・リーフモンキー又はスペクタクルリーフモンキー、トラキピテクス・オブスキュラス(Trachypithecusobscurus);ファイレ・リーフモンキー、トラキピテクス・ファイレイ(Trachypithecus pha
yrei));トラキピテクス属のT.ピレアトゥス(T.pileatus)群内(ボウシラングール、トラキピテクス・ピレアトゥス(Trachypithecuspileatus);ショートリッジ・ラングール、トラキピテクス・ショートリジェイ(Trachypithecus shortridgei);ゴールデンラングール、トラキ
ピテクス・ギー(Trachypithecusgeei));トラキピテクス属のT.フランコイシ(T.francoisi)群内(フランソワ・ルトン、トラキピテクス・フランコイシ(Trachypithecusfrancoisi);ハティン・ラングール、トラキピテクス・ハティンヘンシス(Trachypithecus hatin
hensis);ハクトウラングール、トラキピテクス・ポリオセファラス(Trachypithecuspoliocephalus);ラオス・ラングール、トラキピテクス・ラオタム(Trachypithecus laotum);コシジロラングール、
トラキピテクス・デラコーリ(Trachypithecusdelacouri);インドシナ・クロラングール、トラキピテクス・エベヌゥス(Trachypithecus ebenus));又はリーフモンキー属(Presbytis)内(クロカンムリ
リーフモンキー、プレスビティス・メラロフォス(Presbytismelalophos);シマコノハザル、プレスビティス・フェモラリス(Presbytis fem
oralis);サラワク・スリリ(Sarawak Surili)、プレスビティス
・クリソメラス(Presbytischrysomelas);シロモモ・スリリ(White−thighed Surili)、プレスビティス・シアメンシス(Pres
bytis siamensis);シロビタイ・スリリ(White−fronted
Surili)、プレスビティス・フロンタタ(Presbytis frontata
);ジャワ・スリリ(Javan Surili)、プレスビティス・コマタ(Pres
bytiscomata);トーマスラングール、プレスビティス・トマシ(Presbytis thomasi);ホースラングール、プレスビティス・ホセイ(Presb
ytishosei);クリイロ・リーフモンキー、プレスビティス・ルビクンダ(Presbytis rubicunda);オナガラングール又はジョジャ(Joja)、
プレスビティス・ポテンチアニ(Presbytispotenziani);ナツナ島スリリ(Natuna Island Surili)、プレスビティス・ナツナエ(Presbytis natunae))でよい。
;ハイイロアシドゥクモンキー、ピガスリクス・シネレア(Pygathrixcinerea));シシバナザル属(Rhinopithecus)内(キンシコウ、リノピテクス・ロクセラーナ(Rhinopithecus roxellana);クロキンシ
コウ、リノピテクス・ビエティ(Rhinopithecusbieti);ハイイロシシバナザル、リノピテクス・ブレリチ(Rhinopithecus brelichi
);トンキンシシバナザル、リノピテクス・アバンキュラス(Rhinopithecusavunculus));テングザル属(Nasalis)内(テングザル、ナサリス・ラバトゥス(Nasalis larvatus));又はコバナテングザル属(Si
mias)内(メンタウェーコバナテングザル、シミアス・コンコラー(Simiasconcolor))でよい。
リクス(カリベラ)ヒュミリス(Callithrix(Callibella)hum
ilis);又はセブエラ亜属(Cebuella)に属するピグミーマーモセット、カリスリクス(セブエラ)ピグマエア(Callithrix(Cebuella)pygmaea)を意味する。
aimiri ustus)、サイミリ・ボルビエンシス(Saimiribolivi
ensis)、サイミリ・バンゾリニ(Saimiri vanzolini)を含む。
Lane "Antibodies, A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988及びHa
rlow andLane "Using Antibodies: A Laboratory Manual" Cold Spring Harbor Laboratory Pre
ss, 1999に記載されている。「抗体」という用語は、異なるクラス(すなわち、
IgA、IgG、IgM、IgD及びIgE)及びサブクラス(IgG1、IgG2など)の免疫グロブリン(Ig)も含む。これらの抗体は、例えば、本発明のポリペプチド又は融合タンパク質の免疫沈降法、アフィニティ精製及び免疫局在化並びに、例えば、組換え原核生物或いは真核細胞又は真核生物の培養においてそのようなポリペプチドの存在及び量をモニタリングするために使用できる。
インのみを含む免疫グロブリン単一可変ドメインをさらに含む。例えば、Harlowand Lane (1988) and (1999)の上記引用文献を参照されたい。そのような免疫グロブリン単一可変ドメインは、単離された抗体単一可変ドメインポリペプチドのみでなく、抗体単一可変ドメインポリペプチド配列の1つ以上のモノマーを含むより大きなポリペプチドも包含する。
ーマ技術(Kozbor,Immunology Today 4 (1983), 72)及びヒトモノクローナル抗体を製造する(Cole et al., Monoclona
l Antibodiesand Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc. (1985), 77−96)EBVハイブリドーマ技術がある。BIA
Coreシステムに使用されている表面プラズモン共鳴を利用して、CD3イプシロンなどの、標的ポリペプチドのエピトープに結合するファージ抗体の効率を高めることができる(Schier,Human Antibodies Hybridomas 7 (1996), 97−105; Malmborg, J. Immunol. Methods 183(1995), 7−13)。本発明の文脈において、「抗体」という用語が、本
願中で以下に記載する通りホスト中に発現される抗体コンストラクト、例えば、とりわけウイルス又はプラスミドベクターを介してトランスフェクト及び/又は形質導入される抗体コンストラクトを含むことも想定される。
Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press,1988及びUsing Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press,1999を参照されたい)
。結合ドメインと特異的な抗原との特異的な相互作用の例は、リガンドとそのレセプターとの特異性を含む。そのような定義は、特にその特異的なレセプターとの結合時にシグナルを誘起するリガンドの相互作用を含む。前記定義により特に構成される、前記相互作用の例は、抗体の結合ドメイン(抗原結合部位)との抗原決定基(エピトープ)との相互作用である。
ン抗原をそれぞれ発現するヒト及び非チンパンジー霊長類細胞、例えばマカクザル細胞に対する結合に関して、それぞれのモノクローナル抗体を試験する方法で実施される。適当なアッセイは、以下の実施例に示される。
tory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press,3rd edition 2001)。これは、本願に定義される他の非チンパンジー霊長類のCD3イプシロン、ガンマ及びデルタホモログにも、必要な変更を加えて当てはまる。カリスリクス・ジャカス、サイミリ・シウレウス及びサグイヌス・オイディプスのアミノ酸配列の同定は、添付する実施例に記載されている。カリスリクス・ジャカスのCD3イプシロンの細胞外ドメインのアミノ酸配列は配列番号3に示されており、サグイヌス・オイディプスの配列は配列番号5に、サイミリ・シウレウスの配列は配列番号7に示されている。
53−6)。エピトープに寄与する2つ以上の別々なアミノ酸残基は、1つ以上のポリペ
プチド鎖(複数可)の別々なセクションに存在する。これらの残基は、ポリペプチド鎖(複数可)が三次元構造中に折り畳まれる時分子の表面上で一緒になり、エピトープを構成する。対照的に、連続エピトープ又は直線エピトープは、ポリペプチド鎖の単一の直線セグメントに存在する2つ以上の別々のアミノ酸残基からなる。本発明の中では、「コンテクスト依存性」CD3エピトープは、前記エピトープのコンフォメーションを意味する。CD3のイプシロン鎖に局在化する、そのようなコンテクスト依存性エピトープは、イプシロン鎖の残りの部分に埋め込まれイプシロン鎖とCD3ガンマ又はデルタ鎖とのヘテロダイマー化により正しい位置に保持されないと、その正しいコンフォメーションがとれない。対照的に、本願に提供されるコンテクスト非依存性CD3エピトープは、CD3イプシロンのN末端1−27アミノ酸残基ポリペプチド又はその機能性断片を意味する。このN末端1−27アミノ酸残基ポリペプチド又はその機能性断片は、CD3複合体中でそのネイティブ環境から出される時、その三次元構造完全性及び正しいコンフォメーションを維持する。CD3イプシロンの細胞外ドメインの一部である、N末端1−27アミノ酸残基ポリペプチド又はその機能性断片のコンテクスト非依存性は、国際公開第2004/106380号におけるヒト結合分子の調製方法に関して記載されているCD3イプシロンのエピトープとは完全に異なるエピトープである。前記方法は、単独で発現したリコンビナントCD3イプシロンを使用した。この単独で発現したリコンビナントCD3イプシロンのコンフォメーションは、その天然形態で採り入れられたものとは異なり、すなわちTCR/CD3複合体のCD3イプシロンサブユニットが、TCR/CD3複合体のCD3デルタ又はCD3ガンマサブユニットとの非共有結合複合体の一部として存在する形態である。そのような単独で発現したリコンビナントCD3イプシロンタンパク質が、抗体ライブラリーから抗体を選択するための抗原として使用される場合、この抗原に特異的な抗体はライブラリーから同定されるが、そのようなライブラリーは自己抗原(self−antigens)/自己抗原(autoantigens)に対する特異性を持つ抗体を含まない。これは、単独に発現したリコンビナントCD3イプシロンタンパク質がインビボで存在しない事実による。それは自己抗原ではない。その結果、このタンパク質に特異的な抗体を発現するB細胞の亜集団は、インビボで枯渇していない。そのようなB細胞から構成される抗体ライブラリーならば、単独で発現したリコンビナントCD3イプシロンタンパク質に特異的な抗体の遺伝物質を含むであろう。
−52)。したがって、従来技術の抗CD3分子は、本願に定義されるコンテクスト非依存性N末端1−27アミノ酸残基エピトープ(又はその機能性断片)と結合せず、それに対して作られていない。
、好ましくはヒトの、結合ドメインを生成するために、例えば、ヒト及び非チンパンジー霊長類CD3イプシロン(例えば、マカクザルCD3イプシロン)の両方に結合するモノクローナル抗体が使用できる。
caca radiata)、ウスイロマカク又はスラウェシマカク(マカカ・オケレア
タ、Macacaochreata)、クロザル(マカカ・ニグラ、Macaca ni
gra)、タイワンザル(マカカ・キュクロピス、Macaca cyclopsis)
、スノーモンキー又はニホンザル(マカカ・フスカタ、Macaca fuscata)
、シノモルガスサル又はカニクイザル又はオナガザル又はクラ(マカカ・ファシキュラリス、Macacafascicularis)、シシオザル(マカカ・シレヌス、Macaca silenus)、ブタオザル(マカカ・ネメストリナ、Macaca nemestrina)、アカゲザル(マカク・ムラッタ、Macacamulatta)、チベットマカク(マカカ・チベタナ、Macaca thibetana)、トンケアンモン
キー(マカカ・トンケアナ、Macaca tonkeana)、トクモンキー(マカカ
・シニカ、Macacasinica)、ベニガオザル(Stump−tailed m
acaque)、ベニガオザル(Red−faced macaque)又はクマザル(
マカカ・アークトイデス、Macacaarctoides)又はムーアモンキー(マカカ・マウラ、Macaca maurus)である。最も好ましくは、ヒヒ属のサルは、
マントヒヒ(パピオ・ハマドリアス、Papiohamadryas);ギニアヒヒ(パピオ・パピオ、Papio papio);アヌビスヒヒ(パピオ・アヌビス、Papi
o anubis);キイロヒヒ(パピオ・シノセファルス、Papiocynocep
halus);チャクマヒヒ(パピオ・ウルシヌス、Papio ursinus)であ
る。
は免疫グロブリンFc部などの異種アミノ酸配列に融合された)時に、前記機能性断片が、まだ、その三次元構造完全性を維持するコンテクスト非依存性エピトープであることを意味する。CD3イプシロンの27アミノ酸N末端ポリペプチド又はその機能性断片内の三次元構造の維持は、インビトロでのN末端CD3イプシロンポリペプチド断片に、及びインビボでのT細胞上のネイティブ(CD3イプシロンサブユニット)CD3複合体に、同じ結合親和力で結合する結合ドメインの生成に利用できる。本発明の中で、N末端1−27アミノ酸残基の機能性断片は、本願に提供されるCD3結合分子が、コンテクスト独立的にそのような機能性断片に結合できることを意味する。当業者は、そのような抗CD3結合分子がエピトープのどのアミノ酸残基を認識するのかを測定するエピトープマッピングの方法(例えば、アラニンスキャニング)分析を承知している。
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e antigen on hepatocytes: a sensitive and s
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in hepatitis B. J Clin Pathol, 1995. 48(5): p.470−3)。
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期から回復し、循環するHBsAgから抗HBsに変わる時に、血清変換の特徴である抗体にとって接近可能になる。血清変換が起こらない場合、最大30%の肝細胞が、長期間の非常に活性な抗ウイルス治療の後でも、HBVSタンパク質を発現し続ける。したがって、細胞内で処理されたHBVペプチドを特異的に認識し細胞表面でMHC分子により提示されるTリンパ球を超えて、外部細胞膜中で接近可能なS及びL抗原などの無傷の表面タンパク質に向けられた、他の形態のT細胞関与がありうる。B型肝炎ウイルス小(S)及び大(L)エンベロープタンパク質を認識する単鎖抗体断片を使用して、グラフトT細
胞を感染した肝細胞に向け、これらのT細胞の抗原接触活性化時にサイトカインを分泌し、感染した肝細胞を殺すことを可能にする、人工T細胞レセプターが生成された。
ature 256 (1975), 495−7)。例えば、マウスを、ヒト及び非チン
パンジー霊長類のCD33に対して交互に免疫することができる。これらのマウスから、異種間特異性抗体を産生するハイブリドーマ細胞がハイブリドーマ技術により単離され、上述のとおりFACSにより分析される。本願に記載された異種間特異性を示す二重特異性単鎖抗体などの二重特異性ポリペプチドの生成及び分析は、以下の実施例に示される。異種間特異性を示す二重特異性単鎖抗体の利点は、以下に列挙された点を含む。
(a)配列番号27に示されるCDR−L1、配列番号28に示されるCDR−L2及び配列番号29に示されるCDR−L3;
(b)配列番号117に示されるCDR−L1、配列番号118に示されるCDR−L2及び配列番号119に示されるCDR−L3;
(c)配列番号153に示されるCDR−L1、配列番号154に示されるCDR−L2及び配列番号155に示されるCDR−L3。
る。
−H1、CDR−H2及びCDR−H3を含むVH領域を含む:
(a)配列番号12に示されるCDR−H1、配列番号13に示されるCDR−H2及び配列番号14に示されるCDR−H3;
(b)配列番号30に示されるCDR−H1、配列番号31に示されるCDR−H2及び配列番号32に示されるCDR−H3;
(c)配列番号48に示されるCDR−H1、配列番号49に示されるCDR−H2及び配列番号50に示されるCDR−H3;
(d)配列番号66に示されるCDR−H1、配列番号67に示されるCDR−H2及び配列番号68に示されるCDR−H3;
(e)配列番号84に示されるCDR−H1、配列番号85に示されるCDR−H2及び配列番号86に示されるCDR−H3;
(f)配列番号102に示されるCDR−H1、配列番号103に示されるCDR−H2及び配列番号104に示されるCDR−H3;
(g)配列番号120に示されるCDR−H1、配列番号121に示されるCDR−H2及び配列番号122に示されるCDR−H3;
(h)配列番号138に示されるCDR−H1、配列番号139に示されるCDR−H2及び配列番号140に示されるCDR−H3;
(i)配列番号156に示されるCDR−H1、配列番号157に示されるCDR−H2及び配列番号158に示されるCDR−H3;及び
(j)配列番号174に示されるCDR−H1、配列番号175に示されるCDR−H2及び配列番号176に示されるCDR−H3。
(a)配列番号17又は21に示されるVL領域及び配列番号15又は19に示されるVH領域;
(b)配列番号35又は39に示されるVL領域及び配列番号33又は37に示されるVH領域;
(c)配列番号53又は57に示されるVL領域及び配列番号51又は55に示されるVH領域;
(d)配列番号71又は75に示されるVL領域及び配列番号69又は73に示されるVH領域;
(e)配列番号89又は93に示されるVL領域及び配列番号87又は91に示されるVH領域;
(f)配列番号107又は111に示されるVL領域及び配列番号105又は109に示されるVH領域;
(g)配列番号125又は129に示されるVL領域及び配列番号123又は127に示されるVH領域;
(h)配列番号143又は147に示されるVL領域及び配列番号141又は145に示されるVH領域;
(i)配列番号161又は165に示されるVL領域及び配列番号159又は163に示されるVH領域;及び
(j)配列番号179又は183に示されるVL領域及び配列番号177又は181に示されるVH領域。
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活性化すると、EGFRは、第2のEGFR又はerbBレセプターファミリーの他のメンバーとそれぞれホモダイマー化又はヘテロダイマー化し、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ及び他の転写因子によりシグナル伝達カスケードを開始し、増殖、分化及び修復が起こる(Olayioye,EMBO J. 19 (2000), 3159−67)。EGFRは、結直腸ガン、乳ガン、肺ガン及び頭頸部ガンを含む多くの上皮ガンで過剰発現される(Mendelsohn,J. Clin. Oncol. 21 (2003), 2787−99; Mendelsohn, J. Clin. Oncol. 20 (
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キナーゼシグナル伝達カスケードを標的にするモノクローナル抗体は、抗腫瘍標的としての効力が示されている(Laskin,Cancer Treat. Review 30 (2004), 1−17)。例えば、セツキシマブ(Erbitux)、EGFRに対
するヒト化モノクローナル抗体は、EGFRの細胞外ドメインを競合阻害し、レセプターのリガンド活性化を阻害するが、トポイソメラーゼ阻害剤イリノテカンと組み合わせた転移性大腸ガンの治療用に食品医薬品局(FDA)により2004年に認可された。
e proteoglycane)(MCSP)は、高分子量メラノーマ関連抗原(HM
W‐MAA)又はメラノーマ関連プロテオグリカンとしても知られる、250kDaの糖タンパク質コア及びそれに結合したグリコサミノグリカン鎖を含む450kDaを超える大型の細胞表面プロテオグリカンである(Pluschke,PNAS 93 (1996), 9710; Nishiyama, J. Cell Biol. 114 (1991
),359)。MCSPの正確な作用は、未だ分かっていない。MCSPは、細胞外器質(ECM)との細胞間相互作用を媒介する共に、恐らく、血管形成、組織浸潤、及び細胞伸展に関与する受容体としての機能を果たす可能性があり、恐らく、血管形成、組織浸潤、及び細胞伸展に関与する(Burg,Cancer Res. 59 (1999), 2869; lida, J. Biol. Chem. 276 (2001), 18786
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lida, Cancer Res. 55 (1995), 2177; Campoli
(2004),loc. cit)。MCSPはa4b1によるリガンド結合を増強する
ことができ、MCSPの活性化により、cdc42依存性及びp130cas依存性機構によるインテグリンが媒介する細胞浸潤が増強され得る。MCSPは、コンドロイチン硫酸を介してMT3−MMPと関連し、種々のECMタンパク質を分解し得る。これは、MT3−MMPを特異的に細胞のECM接着部位に局在させることができる。従って、I型コラーゲンの浸潤及びI型ゼラチンの分解には、両分子が必要であると考えられる(lida(2001), loc. cit.)。MSCPは、腫瘍細胞の表面で顕著に発現される、メラノーマの主要なマーカーである。MSCPは、少なくとも90%のメラノーマ病変で発現する(Natali,J. Natl. Cancer Inst. 72 (1
984), 13)。全てのメラノーマ関連抗原の中で、MCSPは最も低度の不均質性
を示す(Natali, CancerRes. 45 (1985), 2883)。通常MCSP陽性である、表在拡大型メラノーマ(発生率:60%)、結節型メラノーマ(発生率:20%)及び悪性黒子性メラノーマ(発生率:10%)の原発腫瘍(RezaZiai 1987 Cancer Res. 47: 2474)とは対照的に、末端性黒子性
メラノーマ(発生率:5%)の原発腫瘍は、しばしばMCSP陰性である(Kagesh
ita,Cancer Res. 51 (1991), 1726)。現在、米国では、毎年53,600件の新たなメラノーマの症例が診断されている(2002年)。全体的なメラノーマ発生率は増加している。
1‐206、配列番号:219‐224、配列番号:237‐242、配列番号:255‐260、配列番号:273‐279、配列番号:382‐384及び387‐389、配列番号:400‐402及び405‐407、配列番号:418‐420及び423‐425、配列番号:436‐438及び441‐443、配列番号:454‐456及び459‐461、配列番号:472‐474及び477‐479、配列番号:490‐492及び495‐497、配列番号:及び508‐510及び513‐515、配列番号:530‐532及び1568乃至1570、配列番号:545‐547及び550‐552、配列番号:559‐561及び564‐566、配列番号:577‐579及び582‐584、配列番号:615‐617及び620‐622、配列番号:633‐635、638、639、及び1571、配列番号:650‐652及び655‐657、配
列番号:668‐670及び673‐675、配列番号:682‐684及び687‐689、配列番号:696‐698及び701‐703、配列番号:710‐712及び715‐717、配列番号:724‐726及び729‐731、配列番号:738‐740及び743‐745、配列番号:752‐754及び757‐759、配列番号:766‐768及び771‐773、配列番号:780‐782及び785‐787、配列番号:794‐796及び799‐801、配列番号:808‐810及び813‐815、配列番号:822‐824及び827‐829、配列番号:836‐838及び841‐843、配列番号:850‐852及び855‐857、配列番号:866‐868及び871‐873、配列番号:884‐886及び889‐891、配列番号:902‐904及び907‐909、配列番号:920‐922及び925‐927、配列番号:938‐940及び943‐945、配列番号:956‐958及び961‐963、配列番号:974‐976及び979‐981、配列番号:992‐994及び997‐999、配列番号:1006‐1008及び1011‐1013、配列番号:1020‐1022及び1025‐1027、配列番号:1034‐1036及び1039‐1041、配列番号:1048‐1050及び1053‐1055、配列番号:1062‐1064及び1067‐1069、配列番号:1076‐1078及び1081‐1083、配列番号:1090‐1092及び1095‐1097、配列番号:1114‐1116及び1119‐1121、配列番号:1128‐1130及び1133‐1135、配列番号:1141‐1143及び1146‐1148、配列番号:1155‐1157及び1160‐1162、配列番号:1169‐1171及び1174‐1176、配列番号:1183‐1185及び1188‐1190、配列番号:1197‐1199及び1202‐1204、配列番号:1211‐1213及び1216‐1218、配列番号:1225‐1227及び1230‐1232、配列番号:1239‐1241及び1244‐1246、配列番号:1253‐1255及び1258‐1260、配列番号:1267‐1269及び1272‐1274、配列番号:1281‐1283及び1286‐1288、配列番号:1295‐1297及び1300‐1302、配列番号:1309‐1311及び1314‐1316、配列番号:1323‐1325及び1328‐1330、配列番号:1343‐1345及び1348‐1350、配列番号:1361‐1363及び1366‐1368、配列番号:1375‐1377及び1380‐1382、配列番号:1389‐1391及び1394‐1396、配列番号:1403‐1405及び1408‐1410、配列番号:1417‐1419及び1422‐1424、配列番号:1431‐1433及び1436‐1438、配列番号:1445‐1447及び1450‐1452、配列番号:1459‐1461及び1464‐1466、配列番号:1473‐1475及び1478‐1480、配列番号:1486‐1491、配列番号:1492‐1497、配列番号:1505‐1507及び1510‐1512、配列番号:1531‐1533及び1536‐1538、配列番号:1573‐1575及び1578‐1580、配列番号:1591‐1593及び1596‐1598、配列番号:1605‐1607及び1610‐1612、及び配列番号:1619‐1621、1624‐1626、配列番号:1634‐1636及び1639‐1641、及び配列番号:1652‐1654、配列番号:1657‐1659、並びに配列番号:1669‐1674、から成る群より選択される一群を含む。
(a)配列番号291、293、295、297、299、301、303、305、307、309、311、313、315、317、319、321、323、325、327、329、331、333、335、337、339、341、343、345若しくは347、393、395、397、411、413、415、429、431、433、447、449、451、465、467、469、483、485、487、501、503、505、519、521、523、1336、1338、1340、538
、540、542、556、570、572、574、588、590、592、626、628、630、643、645、647、661、663、665、679、693、707、721、735、749、763、777、791、805、819、833、847、861、863、877、879、881、895、897、899、913、915、917、931、933、935、949、951、953、967、969、971、985、987、989、1003、1017、1031、1045、1059、1073、1087、1101、1125、1138、1152、1166、1180、1194、1208、1222、1236、1250、1264、1278、1292、1306、1320、1334、1354、1356、1358、1372、1386、1400、1414、1428、1442、1456、1470、1484、1500、1502、1518、1520、1522、1524、1526、1528、1544、1546、1548、1550、1552、1554、1556、1558、1560、1562、1564、1566、1586、1588、1602、1616、1630、1647、1649、又は1663のいずれかで示されるアミノ酸配列;及び、
(b)配列番号292、294、296、298、300、302、304、306、308、310、312、314、316、318、320、322、324、326、328、330、332、334、336、338、340、342、344、346若しくは348、394、396、398、412、414、416、430、432、434、448、450、452、466、468、470、484、486、488、502、504、506、520、522、524、1337、1339、1341、539、541、543、557、571、573、575、589、591、593、627、629、631、644、646、648、662、664、666、680、694、708、722、736、750、764、778、792、806、820、834、848、862、864、878、880、882、896、898、900、914、916、918、932、934、936、950、952、954、968、970、972、986、988、990、1004、1018、1032、1046、1060、1074、1088、1102、1126、1139、1153、1167、1181、1195、1209、1223、1237、1251、1265、1279、1293、1307、1321、1335、1355、1357、1359、1373、1387、1401、1415、1429、1443、1457、1471、1485、1501、1503、1519、1521、1523、1525、1527、1529、1545、1547、1549、1551、1553、1555、1557、1559、1561、1563、1565、1567、1587、1589、1603、1617、1631、1648、1650、又は1664のいずれかで示される核酸配列によってコードされるアミノ酸配列、
から選択される配列を含む。
工学で従来使用される他のベクターがある。当業者に周知の方法を利用して種々のプラスミド及びベクターを構築することができる。例えば、Sambrooket al.(上
記引用文献)及びAusubel, Current Protocols in Molecular Biology, Green PublishingAssociates and Wiley Interscience, N.Y. (1989), (1994
)に記載されている技術を参照されたい。或いは、本発明のポリヌクレオチド及びベクターを、標的細胞への送達のため、リポソーム中に再構築することもできる。以下に詳細に議論されるように、クローニングベクターを使用してDNAの個別の配列を単離することもできる。関連する配列を、特定のポリペプチドの発現が求められる発現ベクター中に移すこともできる。典型的なクローニングベクターは、pBluescriptSK、pGEM、pUC9、pBR322及びpGBT9がある。典型的な発現ベクターにはpTRE、pCAL−n−EK、pESP−1、pOP13CATがある。
、trp又はtacプロモーターがあり、真核生物ホスト細胞での発現を可能にする調節因子の例は、酵母菌中のAOX1又はGAL1プロモーター、又は哺乳類又は他の動物細胞中のCMV−、SV40−、RSV−プロモーター(ラウス肉腫ウイルス)、CMV−エンハンサー、SV−40エンハンサー又はグロビンイントロンがある。
又はそれを媒体中に分泌することが可能なリーダー配列も、列記された核酸配列のコード配列に加えることができ、当分野に周知である。添付される実施例も参照されたい。リーダー配列(複数可)は、翻訳、開始及び停止配列並びに好ましくは、翻訳されたタンパク質又はその一部を細胞膜周辺腔又は細胞外媒体へ分泌するよう指示することのできるリーダー配列と適当な相で組み立てられる。任意に、異種配列は、所望の特性、例えば発現された組換え産物の安定化又は簡易化精製を付与するN末端同定ペプチドを含む融合タンパク質をコードすることができる。上記を参照されたい。この文脈において、Okayama−BergcDNA発現ベクターpcDV1(Pharmacia)、pCDM8、pRc/CMV、pcDNA1、pcDNA3(In−vitrogene)、pEF−DHFR、pEF−ADA又はpEF−neo(Macket al.PNAS(1995
)92,7021−7025及びRaum et al.Cancer Immunol Immunother (2001) 50(3),141−150)又はpSPORT1(GIBCO BRL)などの好適な発現ベクターが当分野に公知である。
サギンウワバ(Trichoplusia)幼虫に外来遺伝子を発現する。言及された核酸分子のコード配列は、ポリヘドリン遺伝子など、ウイルスの非必須領域中にクローニングされ、ポリヘドリンプロモーターの制御下におくことができる。前記コード配列の挿入がうまくいくと、ポリヘドリン遺伝子が不活性化し、コートタンパク質コートを欠く組換えウイルスが産生されるであろう。次いで、組換えウイルスを使用して、エス・フルギペルダ細胞又はイラクサギンウワバ幼虫を感染させ、そこで本発明のタンパク質が発現される(Smith,J. Virol. 46 (1983), 584; Engelhar
d, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 91 (1994), 3224−3227)。
イシンに対する耐性を与えるnpt(Herrera−Estrella,EMBO J
. 2 (1983), 987−995);及びハイグロマイシンに対する耐性を与える
hygro(Marsh, Gene 32 (1984), 481−485)に対する選択の基礎として代謝拮抗剤耐性を含む。追加の選択的遺伝子、すなわち、細胞がトリプトファンの代わりにインドールを利用するのを可能にするtrpB;細胞がヒスチジンの代わりにヒスチノールを利用するのを可能にするhisD(Hartman,Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988), 8047);細胞がマンノースを利用するのを可能にするマンノース−6−ホスフェートイソメラーゼ(国際公開
第94/20627号)及びオルニチンデカルボキシラーゼ阻害剤である2−(ジフルオロメチル)−DLオルニチン、DFMOに対する耐性を与えるODC(オルニチンデカルボキシラーゼ)(McConlogue,1987, In: Current Comm
unications in Molecular Biology, Cold Spri
ng Harbor Laboratoryed.)又はブラストシジンSに対する耐性を与えるアスペルギルス・テルレウス(Aspergillus terreus)由来の
デアミナーゼ(Tamura, Biosci.Biotechnol. Biochem. 59 (1995), 2336−2338)が記載されている。
、記載されたベクターを含む細胞、組織及び生物の簡単で迅速なスクリーニングに特に有用である。
cet 348 (1996),370−374; Muhlhauser, Circ.
Res. 77 (1995), 1077−1086; Onodera, Blood 91 (1998),30−36; Verma, Gene Ther. 5 (1998),
692−699; Nabel, Ann. N.Y. Acad. Sci. 811 (1997),289−292; Verzeletti, Hum. Gene Ther.
9 (1998), 2243−51 ; Wang, Nature Medicine 2
(1996), 714−716;国際公開第94/29469号;国際公開第97/0
0957号、米国特許第5,580,859号;米国特許第5,589,466号;又はSchaper,Current Opinion in Biotechnology 7
(1996), 635−640を参照されたい。記載された核酸分子及びベクターは、細胞への直接導入用にも、或いはリポソーム又はウイルスベクター(例えば、アデノウイルス、レトロウイルス)による導入用にも設計できる。好ましくは、前記細胞は、生殖細胞株細胞、胚細胞又は卵細胞であり、或いはそれらから誘導されており、最も好ましくは前記細胞は幹細胞である。胚性幹細胞の例は、とりわけ、Nagy,Proc. Nat
l. Acad. Sci. USA 90 (1993), 8424−8428に記載されている幹細胞でよい。
きる。
3−168)。
, Springer−Verlag,N.Y. (1982)を参照されたい。少なくとも約90から95%の均質性の実質的に純粋なポリペプチドが好ましく、98から99%以上の均質性が医薬用途に最も好ましい。部分的に又は望まれるとおり均質に一旦精製されると、本発明のポリペプチドを(体外を含む)治療用に又はアッセイ手順の開発及び実施に使用できる。さらに、培養物からの本発明のポリペプチドの回収方法の例は、添付される実施例に詳細に記載される。
医薬キャリアの例は当分野に周知であり、溶液、例えばリン酸緩衝食塩水、水、水中油滴型エマルションなどのエマルション、種々の湿潤剤、無菌液、リポソームなどが挙げられる。そのようなキャリアを含む組成物は、周知の従来法により処方できる。製剤は、炭水化物、緩衝溶液、アミノ酸及び/又は界面活性剤を含むことがある。炭水化物は、非還元糖、好ましくはトレハロース、スクロース、八硫酸エステル、ソルビトール又はキシリトールでよい。そのような製剤は、ポンプシステムがある、及び/又はポンプシステムがない経皮でも皮下でもよい連続投与に使用できる。アミノ酸は、荷電アミノ酸、好ましくはリジン、リジン酢酸塩、アルギニン、グルタミン酸塩及び/又はヒスチジンでよい。界面活性剤は、好ましくは分子量が1.2kDを超える洗剤及び/又は好ましくは分子量が3kDを超えるポリエーテルでよい。好ましい洗剤の非限定的な例は、Tween20、Tween40、Tween60、Tween80又はTween85である。好ましいポリエーテルの非限定的な例は、PEG3000、PEG3350、PEG4000又はPEG5000である。本発明に使用される緩衝系は、pH5〜9を有することが好ましく、クエン酸塩、コハク酸塩、リン酸塩、ヒスチジン及び酢酸塩を含むことがある。本発明の組成物は、例えば、非チンパンジー霊長類、例えばマカクザルへの、本願に記載される異種間特異性を示す本発明のポリペプチドの投与量を増加させることによる用量増加試験により決定できる好適な用量で、被験者に投与することができる。上述のとおり、本願に記載される異種間特異性を示す本発明のポリペプチドは、好都合には、非チンパンジー霊長類における前臨床試験とヒトの薬剤として同一の形態で使用できる。これらの組成物は、他のタンパク質又は非タンパク質薬剤と組み合わせて投与することもできる。これらの薬剤は、本願に定義される本発明のポリペプチドを含む組成物と同時に投与してもよいが、前記ポリペプチドの投与の前又は後に、折良く決められた間隔及び用量で別々に投与することもできる。投与計画は、主治医及び臨床因子により決定されるであろう。医学分野に周知の通り、ある1人の患者への投与量は、患者の体格、体表面積、年齢、投与される特定の化合物、性別、投与の時間及び経路、全般的な健康状態及び同時に投与される他の薬剤など多くの因子による。非経口投与の調剤薬は、無菌の水溶液又は非水溶液、懸濁液及びエマルションを含む。非水溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油、オレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステルである。水性キャリアには、塩水及び緩衝媒体を含む、水、アルコール/水溶液、エマルション又は懸濁液がある。非経口賦形剤には、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロース及び塩化ナトリウム、乳酸リンゲル又は不揮発性油がある。静注用賦形剤には、流体及び栄養補液、電解質補液(リンゲルデキストロースに基づくものなど)等がある。抗菌剤、酸化防止剤、キレート剤、不活性ガスなどの防腐剤及び他の添加物も存在してよい。さらに、本発明の組成物は、好ましくはヒト起源の、血清アルブミン又は免疫グロブリンなどのタンパク質キャリアを含んでよい。本発明の組成物が、本願に定義された本発明のポリペプチドに加え、組成物の意図される用途によって、生物活性薬剤をさらに含むことが想定される。そのような薬剤は、胃腸系に作用する薬剤、細胞増殖抑止剤として作用する薬剤、高尿酸血症を防ぐ薬剤、免疫反応を阻害する薬剤(例えば、コルチコステロイド)、炎症反応を和らげる薬剤、循環系に作用する薬剤及び/又は当分野に工程のサイトカインなどの薬剤であることがある。
ther. 20 (2005), 1 − 12)に記載される通り、細胞障害性アッセイ
により測定することができる。本願での「効能」又は「インビボ効能」は、例えば標準化されたNCI応答基準を利用する、本発明の医薬組成物による治療への応答を意味する。本発明の医薬組成物を使用する治療の成功又はインビボ効能は、その意図された目的のための組成物の効力、すなわち組成物がその望まれる効果を起こす能力、すなわち、例えば腫瘍細胞など病的細胞の消耗を意味する。インビボ効能は、白血球数、ディファレンシャル、蛍光活性化細胞選別、骨髄穿刺法などがあるがこれらに限定されない、それぞれの疾
病のための確立された標準方法により監視できる。それに加え、種々の疾病特異的な臨床化学パラメータ及び他の確立された標準法を使用してよい。さらに、コンピュータによる断層撮影、X線、核磁気共鳴断層撮影(例えば、米国国立ガン研究所の基準に基づく反応評価[ChesonBD, Horning SJ, Coiffier B, Shipp MA, Fisher Rl, Connors JM, Lister TA, Vose J,Grillo−Lopez A, Hagenbeek A, Cabanillas F
, Klippensten D, Hiddemann W, CastellinoR, Harris NL, Armitage JO, Carter W, Hoppe R, Canellos GP. Report of an internationalwork
shop to standardize response criteria for non−Hodgkin'slymphomas. NCI Sponsored International Working Group. J Clin Oncol. 1999
Apr; 17(4):1244])、陽電子放出断層撮影スキャニング、白血球数、デ
ィファレンシャル、蛍光活性化細胞選別、骨髄穿刺、リンパ節生検/組織構造及び種々のリンパ腫特異的な臨床化学的パラメータ(例えば、乳酸デヒドロゲナーゼ)及び他の確立された標準的な方法を利用できる。
05), 1−12)による刊行物にも述べられている。
verse events v3.0 (CTCAE)に述べられている通り、アレルギー
/免疫、血液/骨髄、不整脈、凝固などの基準が含まれる。試験できる臨床検査パラメータには、例えば、血液、臨床化学検査、凝固プロファイル及び尿の分析があり、血清、血漿、リンパ球又は髄液、リカーなどの他の体液の検査がある。例えば、安全性は、身体検査、イメージング技術(すなわち、超音波、X線、CTスキャン、磁気共鳴イメージング(MRI))、技術装置による他の手段(すなわち、心電図)、バイタルサインにより、臨床検査パラメータ測定及び有害事象の記録により評価できる。例えば、本発明の使用及び方法における非チンパンジー霊長類での有害事象は、組織病理学的及び/又は組織化学的方法により調査できる。
意に含まれてもよく、或いは別な医薬組成物に含まれることもある。この後者の場合、前記の別な医薬組成物の投与は、本発明のポリペプチドを含む前記医薬組成物の投与の前でも、同時でも、その後でも好適である。追加の薬剤又は医薬組成物は、非タンパク質化合物でも、タンパク質化合物でもよい。追加の薬剤がタンパク質化合物である場合、タンパク質化合物が、免疫エフェクター細胞のための活性化シグナルを提供できるタンパク質化合物であることが有利である。
アイテム1
ヒト及び非チンパンジー霊長類CD3イプシロン(CD3ε)のエピトープに結合可能な異種間特異性結合ドメインを含むポリペプチド(複数可)の同定方法であって、以下の工程を含む方法:
(a)該ポリペプチド(複数可)を、アミノ酸配列Gln−Asp−Gly−Asn−Glu−Glu−Met−Gly(配列番号381)又はGln−Asp−Gly−Asn−Glu−Glu−Ile−GIy(配列番号382)を含み、そのC末端で固定相に固定されている最大27アミノ酸のCD3εの細胞外ドメインのN末端断片に接触させる工程;
(b)結合したポリペプチド(複数可)を前記断片から溶離する工程;及び
(c)該ポリペプチド(複数可)を(b)溶離液から単離する工程。
Techniques",Academic Press, Inc. (1996)から当業者に公知である。クロマトグラフィ支持体に固定/固定化するには、以下の手段が通常利用される:NHS活性化セファロース(例えば、GELife Science−Am
ershamのHiTrap−NHS)、CnBr−活性化セファロース(例えば、GE
Life Science−Amersham)、NHS活性化デキストランビーズ(Sigma)又は活性化ポリメタクリレート。これらの試薬は、バッチ式手法にも使用できる。さらに、酸化鉄を含むデキストランビーズ(例えばMiltenyiから市販)もバッチ式手法に使用できる。これらのビーズは、溶液からビーズを分離するための磁石と組み合わせて使用できる。ポリペプチドは、NHS活性化カルボキシメチルデキストランの使用によりBiacoreチップ(例えばCM5チップ)に固定化できる。適当な固体支持体のさらなる例は、アミン反応性MultiWellプレート(例えば、NuncImmobilizer(商標)プレート)である。
arbas, Burton,Scott & Silverman; Cold Spri
ng Harbor Laboratory Press, 2001に開示されている標準的な手順に基づき、ファージディスプレイライブラリーを構築できる。抗体ライブラリー中の抗体断片のフォーマットはscFvでよいが、一般的にはFab断片でも、さらには単一ドメイン抗体断片でもよい。抗体断片の単離には、ナイーブ抗体断片ライブラリーを利用できる。後に治療で利用するための潜在的に低い抗原性結合体の選択には、ヒト抗体断片ライブラリーが、ヒト抗体断片の直接選択に有利であることがある。場合によっては、それらは合成抗体ライブラリーの基礎を形成することがある(Knappiket a
l. J Mol. Biol. 2000, 296:57 ff)。対応するフォーマットは、Fab、scFv(以下に記載されるとおり)又はドメイン抗体(dAbs、Holtet al., Trends Biotechnol. 2003, 21 :484 f
fに総評されるとおり)でもよい。
Spring Harbor Laboratory Press, 2001に開示され
ている標準的な手順に基づき構築することができる。
hun, J ImmunolMethods 2004, 290:52 ffに総評され
ている)。
ポリペプチド(複数可)が、第1結合ドメインとして同定された結合ドメイン及び細胞表面抗原に結合可能な第2結合ドメインを含む、アイテム1の方法。
第2結合ドメインがヒト及び非チンパンジー霊長類の細胞表面抗原と結合する、アイテム2の方法。
第1結合ドメインが抗体である、アイテム1から3のいずれかの方法。
抗体が単鎖抗体である、アイテム4の方法。
第2結合ドメインが抗体である、アイテム2から5のいずれかの方法。
CD3εの細胞外ドメインの断片が、配列番号2、4、6又は8に示されるいずれかのアミノ酸配列を有するポリペプチドの1つ以上の断片からなる、アイテム1から6のいずれかの方法。
前記断片の長さが、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27アミノ酸残基である、アイテム7の方法。
同定の方法が、ヒト及び非チンパンジー霊長類CD3εとのエピトープに結合する異種間特異性結合ドメインを含む複数のポリペプチドをスクリーニングする方法である、アイテム1から8のいずれかの方法。
同定の方法が、ヒト及び非チンパンジー霊長類CD3εのエピトープに結合する異種間特異性結合ドメインを含むポリペプチドを精製/単離する方法である、アイテム1から8のいずれかの方法。
異種間特異性結合ドメインの生成のための、アミノ酸配列Gln−Asp−Gly−Asn−Glu−Glu−Met−Gly(配列番号381)又はGln−Asp−Gly−Asn−Glu−Glu−Ile−Gly(配列番号382)を含む最大27アミノ酸のCD3εの細胞外ドメインのN末端断片の使用。本発明の前記使用と調和して、生成した異種間特異性結合ドメインがヒト起源であることが好ましい。
異種間特異性結合ドメインが抗体である、アイテム11による使用。
抗体が単鎖抗体である、アイテム12による使用。
抗体が二重特異性抗体である、アイテム12から13による使用。
、それらに包含される。免疫学における組換え技術及び方法は、例えば、Sambrooket al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press,3
rd edition 2001 ; Lefkovits; Immunology Methods Manual; The Comprehensive Sourcebookof Techniques; Academic Press, 1997; Golemi
s; Protein−Protein Interactions: A MolecularCloning Manual; Cold Spring Laboratory P
ress, 2002に記載されている。本発明により利用されるべき抗体、方法、使用
及び化合物のいずれかに関するさらなる文献は、例えば電子デバイスを利用して公共の図書館及びデータベースから検索できる。例えば、インターネットで利用可能な公共データベース「Medline」は、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/PubMed/medline.htmlで利用できる。さらなるデータベース及びhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/などのアドレス又はhttp://www.embl.de/services/index.htmlでEMBLサービスホームページに列挙されたアドレスは当業者に公知であり、例えばhttp://www.google.comを利用しても得られる。
[図2]一過性導入された293細胞の上清中で、ヒトIgG1のヒンジ及びFcガンマ領域並びにC末端6ヒスチジンタグに融合した成熟ヒトCD3イプシロンのN末端アミノ酸1−27を含むコンストラクトの存在を検出するELISAアッセイで測定された4連のサンプルの平均吸収値である。「27アミノ酸ヒトCD3E」と名称を付けられた第1カラムは、コンストラクトの平均吸収値を示し、「無関係な上清」と名称を付けられた第2のカラムは、ネガティブコントロールとして無関係なコンストラクトによりトランスフェクトされた293細胞の上清の平均値である。コンストラクトで得られた値をネガティブコントロールで得られた値と比較すると、組換えコンストラクトの存在を明らかに示している。
[図3]ヒトIgG1のヒンジ及びFcガンマ領域並びにC末端His6タグに融合した成熟ヒトCD3イプシロン鎖のN末端アミノ酸1−27を含むコンストラクトへの、ペリプラズム発現された単鎖抗体の粗調製物の形態である異種間特異性抗CD3結合分子の結合を検出するELISAアッセイで測定された4連のサンプルの平均吸収値を示す。カラムは、左から右へ、A2JHLP、I2C HLP、E2M HLP、F7O HLP、G
4H HLP、H2C HLP、E1L HLP、F12Q HLP、F6A HLP及びH
1E HLPと称される特異性の平均吸収値を示す。「ネガティブコントロール」と称さ
れる一番右のカラムは、ネガティブコントロールとしてネズミ抗ヒトCD3抗体の単鎖調製物の平均吸収値を示す。抗CD3特異性で得られた値とネガティブコントロールで得られた値を比べると、成熟ヒトCD3イプシロン鎖のN末端1−27アミノ酸への抗CD3特異性の強い結合を明らかに示している。
[図4]異種膜結合タンパク質への霊長類CD3イプシロンのN末端アミノ酸1−27の融合。
[図5]カニクイザルEpCAM並びにそれぞれ、ヒト、マーモセット、タマリン、リスザル及び家畜ブタのCD3イプシロン鎖のN末端1−27アミノ酸からなる組換え膜貫通型融合タンパク質の存在を検出するFACSアッセイで試験された異なるトランスフェクタントのヒストグラムオーバーレイである。ヒストグラムオーバーレイは、左から右へ、上から下へ、それぞれヒト27量体、マーモセット27量体、タマリン27量体、リスザル27量体及びブタ27量体を含むコンストラクトを発現するトランスフェクタントの結果を示す。個別のオーバーレイで、細線はネガティブコントロールとして抗FlagM2
の代わりに2%FCSを含むPBSでインキュベートされたサンプルを表し、太線は抗FlagM2抗体とともにインキュベートされたサンプルを表す。各コンストラクトで、ヒストグラムのオーバーレイは、トランスフェクタントへの抗FlagM2抗体の結合を示し、トランスフェクタントでの組換えコンストラクトの発現を明らかに示している。
[図6A]カニクイザルEpCAMにそれぞれ融合したヒト、マーモセット、タマリン及びリスザルCD3イプシロン鎖のN末端アミノ酸1−27への、ペリプラズム発現された単鎖抗体の粗調製物の形態である異種間特異性抗CD3結合分子の結合を検出するFACSアッセイで測定された種々のトランスフェクタントのヒストグラムオーバーレイである。
ヒストグラムオーバーレイは、左から右へ、上から下へ、H2C HLP、F12Q HLP、E2M HLP及びG4H HLPとそれぞれ称されるCD3特異的結合分子とともに試験されたヒト27量体を含む1−27CD3−EpCAMを発現するトランスフェクタントの結果を示す。
個別のオーバーレイにおいて、細線はネガティブコントロールとしてネズミ抗ヒトCD3抗体の単鎖調製物とともにインキュベートされたサンプルを表し、太線は示されているそれぞれの抗CD3結合分子とともにインキュベートされたサンプルを表す。ブタ27量体トランスフェクタントへの結合の欠如及び図5に示されるコンストラクトの発現レベルを考察すると、ヒストグラムのオーバーレイは、カニクイザルEpCAMに融合したそれぞれヒト、マーモセット、タマリン及びリスザルCD3イプシロン鎖のN末端アミノ酸1−27を含む組換え膜貫通型融合タンパク質を発現する細胞への、完全に異種間特異的なヒト二重特異性単鎖抗体の試験された抗CD3特異性の特異的で強い結合を示し、したがって、抗CD3結合分子の多種霊長類異種間特異性を示す。
[図6B]カニクイザルEpCAMにそれぞれ融合したヒト、マーモセット、タマリン及びリスザルCD3イプシロン鎖のN末端アミノ酸1−27への、ペリプラズム発現された単鎖抗体の粗調製物の形態である異種間特異性抗CD3結合分子の結合を検出するFACSアッセイで測定された種々のトランスフェクタントのヒストグラムオーバーレイである。
ヒストグラムオーバーレイは、左から右へ、上から下へ、H2C HLP、F12Q HLP、E2M HLP及びG4H HLPとそれぞれ称されるCD3特異的結合分子とともに試験されたマーモセット27量体を含む1−27CD3−EpCAMを発現するトランスフェクタントの結果を示す。
個別のオーバーレイにおいて、細線はネガティブコントロールとしてネズミ抗ヒトCD3抗体の単鎖調製物とともにインキュベートされたサンプルを表し、太線は示されているそれぞれの抗CD3結合分子とともにインキュベートされたサンプルを表す。ブタ27量体トランスフェクタントへの結合の欠如及び図5に示されるコンストラクトの発現レベルを考察すると、ヒストグラムのオーバーレイは、カニクイザルEpCAMに融合したそれぞれヒト、マーモセット、タマリン及びリスザルCD3イプシロン鎖のN末端アミノ酸1−27を含む組換え膜貫通型融合タンパク質を発現する細胞への、完全に異種間特異的なヒト二重特異性単鎖抗体の試験された抗CD3特異性の特異的で強い結合を示し、したがって、抗CD3結合分子の多種霊長類異種間特異性を示す。
[図6C]カニクイザルEpCAMにそれぞれ融合したヒト、マーモセット、タマリン及びリスザルCD3イプシロン鎖のN末端アミノ酸1−27への、ペリプラズム発現された単鎖抗体の粗調製物の形態である異種間特異性抗CD3結合分子の結合を検出するFACSアッセイで測定された種々のトランスフェクタントのヒストグラムオーバーレイである。
ヒストグラムオーバーレイは、左から右へ、上から下へ、H2C HLP、F12Q HLP、E2M HLP及びG4H HLPとそれぞれ称されるCD3特異的結合分子とともに試験されたタマリン27量体を含む1−27CD3−EpCAMを発現するトランスフェクタントの結果を示す。
個別のオーバーレイにおいて、細線はネガティブコントロールとしてネズミ抗ヒトCD3
抗体の単鎖調製物とともにインキュベートされたサンプルを表し、太線は示されているそれぞれの抗CD3結合分子とともにインキュベートされたサンプルを表す。ブタ27量体トランスフェクタントへの結合の欠如及び図5に示されるコンストラクトの発現レベルを考察すると、ヒストグラムのオーバーレイは、カニクイザルEpCAMに融合したそれぞれヒト、マーモセット、タマリン及びリスザルCD3イプシロン鎖のN末端アミノ酸1−27を含む組換え膜貫通型融合タンパク質を発現する細胞への、完全に異種間特異的なヒト二重特異性単鎖抗体の試験された抗CD3特異性の特異的で強い結合を示し、したがって、抗CD3結合分子の多種霊長類異種間特異性を示す。
[図6D]カニクイザルEpCAMにそれぞれ融合したヒト、マーモセット、タマリン及びリスザルCD3イプシロン鎖のN末端アミノ酸1−27への、ペリプラズム発現された単鎖抗体の粗調製物の形態である異種間特異性抗CD3結合分子の結合を検出するFACSアッセイで測定された種々のトランスフェクタントのヒストグラムオーバーレイである。
ヒストグラムオーバーレイは、左から右へ、上から下へ、H2C HLP、F12Q HLP、E2M HLP及びG4H HLPとそれぞれ称されるCD3特異的結合分子とともに試験されたリスザル27量体を含む1−27CD3−EpCAMを発現するトランスフェクタントの結果を示す。
個別のオーバーレイにおいて、細線はネガティブコントロールとしてネズミ抗ヒトCD3抗体の単鎖調製物とともにインキュベートされたサンプルを表し、太線は示されているそれぞれの抗CD3結合分子とともにインキュベートされたサンプルを表す。ブタ27量体トランスフェクタントへの結合の欠如及び図5に示されるコンストラクトの発現レベルを考察すると、ヒストグラムのオーバーレイは、カニクイザルEpCAMに融合したそれぞれヒト、マーモセット、タマリン及びリスザルCD3イプシロン鎖のN末端アミノ酸1−27を含む組換え膜貫通型融合タンパク質を発現する細胞への、完全に異種間特異的なヒト二重特異性単鎖抗体の試験された抗CD3特異性の特異的で強い結合を示し、したがって、抗CD3結合分子の多種霊長類異種間特異性を示す。
[図6E]カニクイザルEpCAMにそれぞれ融合したヒト、マーモセット、タマリン及びリスザルCD3イプシロン鎖のN末端アミノ酸1−27への、ペリプラズム発現された単鎖抗体の粗調製物の形態である異種間特異性抗CD3結合分子の結合を検出するFACSアッセイで測定された種々のトランスフェクタントのヒストグラムオーバーレイである。
ヒストグラムオーバーレイは、左から右へ、上から下へ、H2C HLP、F12Q HLP、E2M HLP及びG4H HLPとそれぞれ称されるCD3特異的結合分子とともに試験されたブタ27量体を含む1−27CD3−EpCAMを発現するトランスフェクタントの結果を示す。
個別のオーバーレイにおいて、細線はネガティブコントロールとしてネズミ抗ヒトCD3抗体の単鎖調製物とともにインキュベートされたサンプルを表し、太線は示されているそれぞれの抗CD3結合分子とともにインキュベートされたサンプルを表す。ブタ27量体トランスフェクタントへの結合の欠如及び図5に示されるコンストラクトの発現レベルを考察すると、ヒストグラムのオーバーレイは、カニクイザルEpCAMに融合したそれぞれヒト、マーモセット、タマリン及びリスザルCD3イプシロン鎖のN末端アミノ酸1−27を含む組換え膜貫通型融合タンパク質を発現する細胞への、完全に異種間特異的なヒト二重特異性単鎖抗体の試験された抗CD3特異性の特異的で強い結合を示し、したがって、抗CD3結合分子の多種霊長類異種間特異性を示す。
[図7]トランスフェクトされたネズミEL4 T細胞上でのヒトCD3イプシロンの検
出のためのFACSアッセイ。グラフ解析は、ヒストグラムのオーバーレイを示す。太線は、抗ヒトCD3抗体UCHT−1とともにインキュベートされたトランスフェクトされた細胞を示す。細線は、マウスIgG1アイソタイプコントロールとともにインキュベートされた細胞を表す。抗CD3抗体UCHT−1の結合は、トランスフェクトされたネズミEL4T細胞の細胞表面でのヒトCD3イプシロン鎖の発現を明らかに示す。
[図8A]アラニンスキャニング実験でのアラニン変異体への異種間特異性抗CD3抗体の結合。個別の図で、カラムは、左から右へ、野生型トランスフェクタント(WT)及び位置1から27からの全てのアラニン変異体の対数スケールでの任意単位の計算結合値を示す。結合値は以下の式を利用して計算される:
(式)
この式において、「サンプル値」は、図に示される特定のアラニン変異体に対する特定の抗CD3抗体の結合の程度を示す任意単位の結合の値を意味し、「サンプル」は、特定のアラニンスキャニングトランスフェクタントにアッセイされた特定の抗CD3抗体で得られた幾何平均蛍光値を意味し、「ネガティブコントロール」は、特定のアラニン変異体にアッセイされたネガティブコントロールで得られた幾何平均蛍光値を意味し、UCHT−1は、特定のアラニン変異体にアッセイされたUCHT−1抗体で得られた幾何平均蛍光値を意味し、「野生型」は、野生型トランスフェクタントでアッセイされた特定の抗CD3抗体で得られた幾何平均蛍光値を意味し、xはそれぞれのトランスフェクタントを明示し、yはそれぞれの抗CD3抗体を明示し、wtはそれぞれのトランスフェクタントが野生型であることを明示する。個々のアラニン変異体の位置は、野生型アミノ酸の1文字のコード及び位置の数により標識づけられている。
キメラIgG分子として発現した異種間特異性抗CD3抗体A2J HLPの結果を示す
。位置4(アスパラギン)、位置23(スレオニン)及び位置25(イソロイシン)でのアラニンへの変異体では結合活性の低下が見られる。位置1(グルタミン)、位置2(アスパラギン酸)及び位置3(グリシン)及び位置5(グルタミン酸)でのアラニンへの変異体では結合が完全に失われている。
[図8B]アラニンスキャニング実験でのアラニン変異体への異種間特異性抗CD3抗体の結合。個別の図で、カラムは、左から右へ、野生型トランスフェクタント(WT)及び位置1から27からの全てのアラニン変異体の対数スケールでの任意単位の計算結合値を示す。結合値は以下の式を利用して計算される:
(式)
この式において、「サンプル値」は、図に示される特定のアラニン変異体に対する特定の抗CD3抗体の結合の程度を示す任意単位の結合の値を意味し、「サンプル」は、特定のアラニンスキャニングトランスフェクタントにアッセイされた特定の抗CD3抗体で得られた幾何平均蛍光値を意味し、「ネガティブコントロール」は、特定のアラニン変異体にアッセイされたネガティブコントロールで得られた幾何平均蛍光値を意味し、UCHT−1は、特定のアラニン変異体にアッセイされたUCHT−1抗体で得られた幾何平均蛍光値を意味し、「野生型」は、野生型トランスフェクタントでアッセイされた特定の抗CD3抗体で得られた幾何平均蛍光値を意味し、xはそれぞれのトランスフェクタントを明示し、yはそれぞれの抗CD3抗体を明示し、wtはそれぞれのトランスフェクタントが野生型であることを明示する。個々のアラニン変異体の位置は、野生型アミノ酸の1文字のコード及び位置の数により標識づけられている。
キメラIgG分子として発現した異種間特異性抗CD3抗体E2M HLPの結果を示す
。位置4(アスパラギン)、位置23(スレオニン)及び位置25(イソロイシン)でのアラニンへの変異体では結合活性の低下が見られる。位置1(グルタミン)、位置2(アスパラギン酸)及び位置3(グリシン)及び位置5(グルタミン酸)でのアラニンへの変異体では結合が完全に失われている。
[図8C]アラニンスキャニング実験でのアラニン変異体への異種間特異性抗CD3抗体の結合。個別の図で、カラムは、左から右へ、野生型トランスフェクタント(WT)及び位置1から27からの全てのアラニン変異体の対数スケールでの任意単位の計算結合値を示す。結合値は以下の式を利用して計算される:
(式)
この式において、「サンプル値」は、図に示される特定のアラニン変異体に対する特定の抗CD3抗体の結合の程度を示す任意単位の結合の値を意味し、「サンプル」は、特定のアラニンスキャニングトランスフェクタントにアッセイされた特定の抗CD3抗体で得られた幾何平均蛍光値を意味し、「ネガティブコントロール」は、特定のアラニン変異体にアッセイされたネガティブコントロールで得られた幾何平均蛍光値を意味し、UCHT−1は、特定のアラニン変異体にアッセイされたUCHT−1抗体で得られた幾何平均蛍光値を意味し、「野生型」は、野生型トランスフェクタントでアッセイされた特定の抗CD3抗体で得られた幾何平均蛍光値を意味し、xはそれぞれのトランスフェクタントを明示し、yはそれぞれの抗CD3抗体を明示し、wtはそれぞれのトランスフェクタントが野生型であることを明示する。個々のアラニン変異体の位置は、野生型アミノ酸の1文字のコード及び位置の数により標識づけられている。
キメラIgG分子として発現した異種間特異性抗CD3抗体H2C HLPの結果を示す
。位置4(アスパラギン)でのアラニンへの変異体では結合活性の低下が見られる。位置1(グルタミン)、位置2(アスパラギン酸)及び位置3(グリシン)及び位置5(グルタミン酸)でのアラニングルタミンへの変異体では結合が完全に失われている。
[図8D]アラニンスキャニング実験でのアラニン変異体への異種間特異性抗CD3抗体の結合。個別の図で、カラムは、左から右へ、野生型トランスフェクタント(WT)及び位置1から27からの全てのアラニン変異体の対数スケールでの任意単位の計算結合値を示す。結合値は以下の式を利用して計算される:
(式)
この式において、「サンプル値」は、図に示される特定のアラニン変異体に対する特定の抗CD3抗体の結合の程度を示す任意単位の結合の値を意味し、「サンプル」は、特定のアラニンスキャニングトランスフェクタントにアッセイされた特定の抗CD3抗体で得られた幾何平均蛍光値を意味し、「ネガティブコントロール」は、特定のアラニン変異体にアッセイされたネガティブコントロールで得られた幾何平均蛍光値を意味し、UCHT−1は、特定のアラニン変異体にアッセイされたUCHT−1抗体で得られた幾何平均蛍光値を意味し、「野生型」は、野生型トランスフェクタントでアッセイされた特定の抗CD3抗体で得られた幾何平均蛍光値を意味し、xはそれぞれのトランスフェクタントを明示し、yはそれぞれの抗CD3抗体を明示し、wtはそれぞれのトランスフェクタントが野生型であることを明示する。個々のアラニン変異体の位置は、野生型アミノ酸の1文字の
コード及び位置の数により標識づけられている。
ペリプラズム発現した単鎖抗体として試験される、異種間特異性抗CD3抗体F12Q
HLPの結果を示す。位置1(グルタミン)、位置2(アスパラギン酸)及び位置3(グリシン)及び位置5(グルタミン酸)でのアラニンへの変異体では結合が完全に失われている。
[図9]N末端His6タグがある場合と無い場合のヒトCD3への、異種間特異性抗CD3結合分子H2C HLPの結合を検出するFACSアッセイ。
ヒストグラムオーバーレイは、異種間特異性結合分子H2C HLPの結合を検出するF
ACSアッセイで試験された、野生型ヒトCD3イプシロン鎖(左のヒストグラム)又はN末端His6タグがあるヒトCD3イプシロン鎖(右のヒストグラム)によりトランスフェクトされたEL4細胞株で実施される。サンプルは、ネガティブコントロールとして適当なアイソタイプコントロールと(細線)、ポジティブコントロールとして抗ヒトCD3抗体UCHT−1と(点線)及びキメラIgG分子の形態の異種間特異性抗CD3抗体H2CHLPと(太線)ともにインキュベートされる。
ヒストグラムオーバーレイは、組換え構築体の両方の発現を示すアイソタイプコントロールに比べ、両トランスフェクタントへのUCHT−1抗体の同等な結合を示す。ヒストグラムオーバーレイは、His6ヒトCD3イプシロン鎖でなく、野生型ヒトCD3イプシロン鎖のみへの抗CD3結合分子H2CHLPの結合も示す。これらの結果は、異種間特異性抗CD3結合分子H2C HLPの結合にはフリーのN末端が必須であることを表す
。
[図10]FACS分析による、細胞上でのCD3結合のKD値を測定する、ヒトCD3陽性PBMCへのEGFR−21−63 LH xH2Cの飽和結合。このアッセイは、実施例7に記載されるとおり実施される。
[図11a]ヒトEGFRによりトランスフェクトされたCHO細胞、ヒトCD3+T細胞株HPB−ALL、カニクイザルEGFRによりトランスフェクトされたCHO細胞及びマカクザルT細胞株4119LnPxへの、明示された種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトのFACS結合分析。FACS染色は実施例12に記載のとおり実施される。太線は、2μg/mlの精製タンパク質とともにインキュベートされ、その後抗his抗体及びPE標識検出抗体とともにインキュベートされた細胞を表す。細いヒストグラムの線はネガティブコントロールを表す:細胞は、抗his抗体及び検出抗体とインキュベートされるのみである。
[図11b]ヒトEGFRによりトランスフェクトされたCHO細胞、ヒトCD3+T細胞株HPB−ALL、カニクイザルEGFRによりトランスフェクトされたCHO細胞及びマカクザルT細胞株4119LnPxへの、明示された種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトのFACS結合分析。FACS染色は実施例12に記載のとおり実施される。太線は、2μg/mlの精製タンパク質とともにインキュベートされ、その後抗his抗体及びPE標識検出抗体とともにインキュベートされた細胞を表す。細いヒストグラムの線はネガティブコントロールを表す:細胞は、抗his抗体及び検出抗体とインキュベートされるのみである。
[図11c]ヒトEGFRによりトランスフェクトされたCHO細胞、ヒトCD3+T細胞株HPB−ALL、カニクイザルEGFRによりトランスフェクトされたCHO細胞及びマカクザルT細胞株4119LnPxへの、明示された種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトのFACS結合分析。FACS染色は実施例12に記載のとおり実施される。太線は、2μg/mlの精製タンパク質とともにインキュベートされ、その後抗his抗体及びPE標識検出抗体とともにインキュベートされた細胞を表す。細いヒストグラムの線はネガティブコントロールを表す:細胞は、抗his抗体及び検出抗体とインキュベートされるのみである。
[図11d]ヒトEGFRによりトランスフェクトされたCHO細胞、ヒトCD3+T細胞株HPB−ALL、カニクイザルEGFRによりトランスフェクトされたCHO細胞及びマカクザルT細胞株4119LnPxへの、明示された種間特異的二重特異性単鎖コン
ストラクトのFACS結合分析。FACS染色は実施例12に記載のとおり実施される。太線は、2μg/mlの精製タンパク質とともにインキュベートされ、その後抗his抗体及びPE標識検出抗体とともにインキュベートされた細胞を表す。細いヒストグラムの線はネガティブコントロールを表す:細胞は、抗his抗体及び検出抗体とインキュベートされるのみである。
[図11e]ヒトEGFRによりトランスフェクトされたCHO細胞、ヒトCD3+T細胞株HPB−ALL、カニクイザルEGFRによりトランスフェクトされたCHO細胞及びマカクザルT細胞株4119LnPxへの、明示された種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトのFACS結合分析。FACS染色は実施例12に記載のとおり実施される。太線は、2μg/mlの精製タンパク質とともにインキュベートされ、その後抗his抗体及びPE標識検出抗体とともにインキュベートされた細胞を表す。細いヒストグラムの線はネガティブコントロールを表す:細胞は、抗his抗体及び検出抗体とインキュベートされるのみである。
[図11f]ヒトEGFRによりトランスフェクトされたCHO細胞、ヒトCD3+T細胞株HPB−ALL、カニクイザルEGFRによりトランスフェクトされたCHO細胞及びマカクザルT細胞株4119LnPxへの、明示された種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトのFACS結合分析。FACS染色は実施例12に記載のとおり実施される。太線は、2μg/mlの精製タンパク質とともにインキュベートされ、その後抗his抗体及びPE標識検出抗体とともにインキュベートされた細胞を表す。細いヒストグラムの線はネガティブコントロールを表す:細胞は、抗his抗体及び検出抗体とインキュベートされるのみである。
[図11g]ヒトEGFRによりトランスフェクトされたCHO細胞、ヒトCD3+T細胞株HPB−ALL、カニクイザルEGFRによりトランスフェクトされたCHO細胞及びマカクザルT細胞株4119LnPxへの、明示された種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトのFACS結合分析。FACS染色は実施例12に記載のとおり実施される。太線は、2μg/mlの精製タンパク質とともにインキュベートされ、その後抗his抗体及びPE標識検出抗体とともにインキュベートされた細胞を表す。細いヒストグラムの線はネガティブコントロールを表す:細胞は、抗his抗体及び検出抗体とインキュベートされるのみである。
[図11h]ヒトEGFRによりトランスフェクトされたCHO細胞、ヒトCD3+T細胞株HPB−ALL、カニクイザルEGFRによりトランスフェクトされたCHO細胞及びマカクザルT細胞株4119LnPxへの、明示された種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトのFACS結合分析。FACS染色は実施例12に記載のとおり実施される。太線は、2μg/mlの精製タンパク質とともにインキュベートされ、その後抗his抗体及びPE標識検出抗体とともにインキュベートされた細胞を表す。細いヒストグラムの線はネガティブコントロールを表す:細胞は、抗his抗体及び検出抗体とインキュベートされるのみである。
[図11i]ヒトEGFRによりトランスフェクトされたCHO細胞、ヒトCD3+T細胞株HPB−ALL、カニクイザルEGFRによりトランスフェクトされたCHO細胞及びマカクザルT細胞株4119LnPxへの、明示された種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトのFACS結合分析。FACS染色は実施例12に記載のとおり実施される。太線は、2μg/mlの精製タンパク質とともにインキュベートされ、その後抗his抗体及びPE標識検出抗体とともにインキュベートされた細胞を表す。細いヒストグラムの線はネガティブコントロールを表す:細胞は、抗his抗体及び検出抗体とインキュベートされるのみである。
[図12]示した標的細胞株へ向け直された指定の種間特異的単鎖コンストラクトによって誘起された細胞障害活性を示す図である。A)刺激されたCD4−/CD56−ヒトPBMCがエフェクター細胞として、ヒトEGFRでトランスフェクトされたCHO細胞が標的細胞として用いられる。B)マカクT細胞株4119LnPxがエフェクター細胞として、カニクイザルEGFRでトランスフェクトされたCHO細胞が標的細胞として用い
られる。このアッセイは実施例13で述べるようにして実施される。
[図13a]示した標的細胞株へ向け直された指定の種間特異的単鎖コンストラクトによって誘起された細胞障害活性を示す図である。A)刺激されたCD4−/CD56−ヒトPBMCがエフェクター細胞として、ヒトEGFRでトランスフェクトされたCHO細胞が標的細胞として用いられる。B)マカクT細胞株4119LnPxがエフェクター細胞として、カニクイザルEGFRでトランスフェクトされたCHO細胞が標的細胞として用いられる。このアッセイは実施例13で述べるようにして実施される。
[図13b]示した標的細胞株へ向け直された指定の種間特異的単鎖コンストラクトによって誘起された細胞障害活性を示す図である。A)刺激されたCD4−/CD56−ヒトPBMCがエフェクター細胞として、ヒトEGFRでトランスフェクトされたCHO細胞が標的細胞として用いられる。B)マカクT細胞株4119LnPxがエフェクター細胞として、カニクイザルEGFRでトランスフェクトされたCHO細胞が標的細胞として用いられる。このアッセイは実施例13で述べるようにして実施される。
[図13c]示した標的細胞株へ向け直された指定の種間特異的単鎖コンストラクトによって誘起された細胞障害活性を示す図である。A)刺激されたCD4−/CD56−ヒトPBMCがエフェクター細胞として、ヒトEGFRでトランスフェクトされたCHO細胞が標的細胞として用いられる。B)マカクT細胞株4119LnPxがエフェクター細胞として、カニクイザルEGFRでトランスフェクトされたCHO細胞が標的細胞として用いられる。このアッセイは実施例13で述べるようにして実施される。
[図13d]示した標的細胞株へ向け直された指定の種間特異的単鎖コンストラクトによって誘起された細胞障害活性を示す図である。A)刺激されたCD4−/CD56−ヒトPBMCがエフェクター細胞として、ヒトEGFRでトランスフェクトされたCHO細胞が標的細胞として用いられる。B)マカクT細胞株4119LnPxがエフェクター細胞として、カニクイザルEGFRでトランスフェクトされたCHO細胞が標的細胞として用いられる。このアッセイは実施例13で述べるようにして実施される。
[図13e]示した標的細胞株へ向け直された指定の種間特異的単鎖コンストラクトによって誘起された細胞障害活性を示す図である。A)刺激されたCD4−/CD56−ヒトPBMCがエフェクター細胞として、ヒトEGFRでトランスフェクトされたCHO細胞が標的細胞として用いられる。B)マカクT細胞株4119LnPxがエフェクター細胞として、カニクイザルEGFRでトランスフェクトされたCHO細胞が標的細胞として用いられる。このアッセイは実施例13で述べるようにして実施される。
[図13f]示した標的細胞株へ向け直された指定の種間特異的単鎖コンストラクトによって誘起された細胞障害活性を示す図である。A)刺激されたCD4−/CD56−ヒトPBMCがエフェクター細胞として、ヒトEGFRでトランスフェクトされたCHO細胞が標的細胞として用いられる。B)マカクT細胞株4119LnPxがエフェクター細胞として、カニクイザルEGFRでトランスフェクトされたCHO細胞が標的細胞として用いられる。このアッセイは実施例13で述べるようにして実施される。
[図13g]示した標的細胞株へ向け直された指定の種間特異的単鎖コンストラクトによって誘起された細胞障害活性を示す図である。A)刺激されたCD4−/CD56−ヒトPBMCがエフェクター細胞として、ヒトEGFRでトランスフェクトされたCHO細胞が標的細胞として用いられる。B)マカクT細胞株4119LnPxがエフェクター細胞として、カニクイザルEGFRでトランスフェクトされたCHO細胞が標的細胞として用いられる。このアッセイは実施例13で述べるようにして実施される。
[図13h]示した標的細胞株へ向け直された指定の種間特異的単鎖コンストラクトによって誘起された細胞障害活性を示す図である。A)刺激されたCD4−/CD56−ヒトPBMCがエフェクター細胞として、ヒトEGFRでトランスフェクトされたCHO細胞が標的細胞として用いられる。B)マカクT細胞株4119LnPxがエフェクター細胞として、カニクイザルEGFRでトランスフェクトされたCHO細胞が標的細胞として用いられる。このアッセイは実施例13で述べるようにして実施される。
[図13i]示した標的細胞株へ向け直された指定の種間特異的単鎖コンストラクトによ
って誘起された細胞障害活性を示す図である。A)刺激されたCD4−/CD56−ヒトPBMCがエフェクター細胞として、ヒトEGFRでトランスフェクトされたCHO細胞が標的細胞として用いられる。B)マカクT細胞株4119LnPxがエフェクター細胞として、カニクイザルEGFRでトランスフェクトされたCHO細胞が標的細胞として用いられる。このアッセイは実施例13で述べるようにして実施される。
[図13j]示した標的細胞株へ向け直された指定の種間特異的単鎖コンストラクトによって誘起された細胞障害活性を示す図である。A)刺激されたCD4−/CD56−ヒトPBMCがエフェクター細胞として、ヒトEGFRでトランスフェクトされたCHO細胞が標的細胞として用いられる。B)マカクT細胞株4119LnPxがエフェクター細胞として、カニクイザルEGFRでトランスフェクトされたCHO細胞が標的細胞として用いられる。このアッセイは実施例13で述べるようにして実施される。
[図14]ヒトMCSP D3によりトランスフェクトされたCHO細胞、ヒトCD3+
T細胞株HPB−ALL、カニクイザルMCSPD3によりトランスフェクトされたCHO細胞及びマカクザルT細胞株4119 LnPxへの、明示された種間特異的二重特異
性単鎖コンストラクトのFACS結合分析。FACS染色は、実施例17に記載された
とおり実施される。太線は、2μg/mlの精製タンパク質とともにインキュベートされ、その後抗his抗体及びPE標識検出抗体とともにインキュベートされた細胞を表す:細いヒストグラム線はネガティブコントロールを表す。細胞は、抗his抗体及び検出抗体とインキュベートされるのみである。
[図15]ヒトMCSP D3によりトランスフェクトされたCHO細胞、ヒトCD3+
T細胞株HPB−ALL、カニクイザルMCSPD3によりトランスフェクトされたCHO細胞及びマカクザルT細胞株4119 LnPXへの、明示された種間特異的二重特異
性単鎖コンストラクトのFACS結合分析。FACS染色は、実施例17に記載されたとおり実施される。太線は、2μg/mlの精製タンパク質とともにインキュベートされ、その後抗his抗体及びPE標識検出抗体とともにインキュベートされた細胞を表す。細いヒストグラム線はネガティブコントロールを表す。細胞は、抗his抗体及び検出抗体とインキュベートされるのみである。
[図16]ヒトMCSP D3によりトランスフェクトされたCHO細胞、ヒトCD3+
T細胞株HPB−ALL、カニクイザルMCSPD3によりトランスフェクトされたCHO細胞及びマカクザルT細胞株4119 LnPXへの、明示された種間特異的二重特異
性単鎖コンストラクトのFACS結合分析。FACS染色は、実施例17に記載されたとおり実施される。太線は、2μg/mlのモノマータンパク質とともにインキュベートされ、その後抗his抗体及びPE標識検出抗体とともにインキュベートされた細胞を表す。細いヒストグラム線はネガティブコントロールを表す。細胞は、抗his抗体及び検出抗体とインキュベートされるのみである。
[図17]示される標的細胞株に向け直された、明示された異種間特異性MCSP特異性単鎖コンストラクトにより誘起される細胞障害活性。A)刺激されたCD4−/CD56−ヒトPBMCがエフェクター細胞として使用され、ヒトMCSPD3によりトランスフェクトされたCHO細胞が標的細胞として使用される。B)マカクザルT細胞株4119LnPxがエフェクター細胞として使用され、カニクイザルMCSPD3によりトランスフェクトされたCHO細胞が標的細胞として使用される。アッセイは実施例18に記載のとおり実施される。
[図18]示される標的細胞株に向け直された、明示された異種間特異性MCSP特異性単鎖コンストラクトにより誘起される細胞障害活性。A)及びB)マカクザルT細胞株4119LnPxがエフェクター細胞として使用され、カニクイザルMCSP D3により
トランスフェクトされたCHO細胞が標的細胞として使用される。アッセイは実施例18に記載のとおり実施される。
[図19]示される標的細胞株に向け直された、明示された異種間特異性MCSP特異性単鎖コンストラクトにより誘起される細胞障害活性。A)及びB)刺激されたCD4−/CD56−ヒトPBMCがエフェクター細胞として使用され、ヒトMCSPD3によりト
ランスフェクトされたCHO細胞が標的細胞として使用される。アッセイは実施例18に記載のとおり実施される。
[図20]示される標的細胞株に向け直された、明示された異種間特異性MCSP特異性単鎖コンストラクトにより誘起される細胞障害活性。A)刺激されたCD4−/CD56−ヒトPBMCがエフェクター細胞として使用され、ヒトMCSPD3によりトランスフェクトされたCHO細胞が標的細胞として使用される。B)マカクザルT細胞株4119
LnPxがエフェクター細胞として使用され、カニクイザルMCSPD3によりトラン
スフェクトされたCHO細胞が標的細胞として使用される。アッセイは実施例18に記載のとおり実施される。
[図21]示される標的細胞株に向け直された、明示された異種間特異性MCSP特異性単鎖コンストラクトにより誘起される細胞障害活性。A)刺激されたCD4−/CD56−ヒトPBMCがエフェクター細胞として使用され、ヒトMCSPD3によりトランスフェクトされたCHO細胞が標的細胞として使用される。B)マカクザルT細胞株4119
LnPxがエフェクター細胞として使用され、カニクイザルMCSPD3によりトラン
スフェクトされたCHO細胞が標的細胞として使用される。アッセイは実施例18に記
載のとおり実施される。
[図22−1]50%ヒト血漿とともにそれぞれ37℃及び4℃で24時間インキュベートされた、或いは細胞障害性試験の直前に50%ヒト血漿が添加された、又は血漿が添加されない、明示された単鎖コンストラクトのサンプルにより誘起された、細胞障害活性の測定により試験されるMCSP及びCD3種間特異的二重特異性単鎖抗体の血漿安定性。ヒトMCSPによりトランスフェクトされたCHO細胞が標的細胞株として使用され、刺激されたCD4−/CD56−ヒトPBMCがエフェクター細胞として使用される。アッセイは実施例19に記載されるとおり実施される。
[図22−2]50%ヒト血漿とともにそれぞれ37℃及び4℃で24時間インキュベートされた、或いは細胞障害性試験の直前に50%ヒト血漿が添加された、又は血漿が添加されない、明示された単鎖コンストラクトのサンプルにより誘起された、細胞障害活性の測定により試験されるMCSP及びCD3種間特異的二重特異性単鎖抗体の血漿安定性。ヒトMCSPによりトランスフェクトされたCHO細胞が標的細胞株として使用され、刺激されたCD4−/CD56−ヒトPBMCがエフェクター細胞として使用される。アッセイは実施例19に記載されるとおり実施される。
[図22−3]50%ヒト血漿とともにそれぞれ37℃及び4℃で24時間インキュベートされた、或いは細胞障害性試験の直前に50%ヒト血漿が添加された、又は血漿が添加されない、明示された単鎖コンストラクトのサンプルにより誘起された、細胞障害活性の測定により試験されるMCSP及びCD3種間特異的二重特異性単鎖抗体の血漿安定性。ヒトMCSPによりトランスフェクトされたCHO細胞が標的細胞株として使用され、刺激されたCD4−/CD56−ヒトPBMCがエフェクター細胞として使用される。アッセイは実施例19に記載されるとおり実施される。
[図23a]従来のコンテクスト依存性CD3エピトープを認識するCD3結合分子CD19×CD3の静脈内注入の開始フェーズの間における、循環するCD19‐陽性標的B細胞(黒三角)を実質的に持たないB‐NHL患者(表4の特許番号1、7、23、30、31、及び33)の末梢血液中の絶対T細胞数(白四角)の最初の低下及び回復(すなわち、再分布)を示す図である。絶対細胞数は、血液1マイクロリットル中1000個の細胞の単位として表される。最初のデータポイントは注入開始直前のベースライン数を示す。CD19×CD3の投与量は患者番号の横のカッコ内に示す。
[図23b]従来のコンテクスト依存性CD3エピトープを認識するCD3結合分子CD19×CD3の静脈内注入の開始フェーズの間における、循環するCD19‐陽性標的B細胞(黒三角)を実質的に持たないB‐NHL患者(表4の特許番号1、7、23、30、31、及び33)の末梢血液中の絶対T細胞数(白四角)の最初の低下及び回復(すなわち、再分布)を示す図である。絶対細胞数は、血液1マイクロリットル中1000個の細胞の単位として表される。最初のデータポイントは注入開始直前のベースライン数を示
す。CD19×CD3の投与量は患者番号の横のカッコ内に示す。
[図23c]従来のコンテクスト依存性CD3エピトープを認識するCD3結合分子CD19×CD3の静脈内注入の開始フェーズの間における、循環するCD19‐陽性標的B細胞(黒三角)を実質的に持たないB‐NHL患者(表4の特許番号1、7、23、30、31、及び33)の末梢血液中の絶対T細胞数(白四角)の最初の低下及び回復(すなわち、再分布)を示す図である。絶対細胞数は、血液1マイクロリットル中1000個の細胞の単位として表される。最初のデータポイントは注入開始直前のベースライン数を示す。CD19×CD3の投与量は患者番号の横のカッコ内に示す。
[図23d]従来のコンテクスト依存性CD3エピトープを認識するCD3結合分子CD19×CD3の静脈内注入の開始フェーズの間における、循環するCD19‐陽性標的B細胞(黒三角)を実質的に持たないB‐NHL患者(表4の特許番号1、7、23、30、31、及び33)の末梢血液中の絶対T細胞数(白四角)の最初の低下及び回復(すなわち、再分布)を示す図である。絶対細胞数は、血液1マイクロリットル中1000個の細胞の単位として表される。最初のデータポイントは注入開始直前のベースライン数を示す。CD19×CD3の投与量は患者番号の横のカッコ内に示す。
[図23e]従来のコンテクスト依存性CD3エピトープを認識するCD3結合分子CD19×CD3の静脈内注入の開始フェーズの間における、循環するCD19‐陽性標的B細胞(黒三角)を実質的に持たないB‐NHL患者(表4の特許番号1、7、23、30、31、及び33)の末梢血液中の絶対T細胞数(白四角)の最初の低下及び回復(すなわち、再分布)を示す図である。絶対細胞数は、血液1マイクロリットル中1000個の細胞の単位として表される。最初のデータポイントは注入開始直前のベースライン数を示す。CD19×CD3の投与量は患者番号の横のカッコ内に示す。
[図23f]従来のコンテクスト依存性CD3エピトープを認識するCD3結合分子CD19×CD3の静脈内注入の開始フェーズの間における、循環するCD19‐陽性標的B細胞(黒三角)を実質的に持たないB‐NHL患者(表4の特許番号1、7、23、30、31、及び33)の末梢血液中の絶対T細胞数(白四角)の最初の低下及び回復(すなわち、再分布)を示す図である。絶対細胞数は、血液1マイクロリットル中1000個の細胞の単位として表される。最初のデータポイントは注入開始直前のベースライン数を示す。CD19×CD3の投与量は患者番号の横のカッコ内に示す。
[図24](A)最初の投与量として1日目は5μg/m2/24時間とし、すぐに投与
量を15μg/m2/24時間に増加して連続して行ったCD19×CD3の静脈注入の
下、循環するCD19‐陽性標的B細胞(黒三角)を持たないB‐NHL患者番号19(表4)で繰り返し発生するT細胞再分布(白四角)、及びCNS症状の発症を示す図である。絶対細胞数は、血液1マイクロリットル中1000個の細胞の単位として表される。最初のデータポイントは注入開始直前のベースライン数を示す。5μg/m2/24時間
で開始した治療によって引き起こされた再分布の第一のエピソードからの循環するT細胞の回復後、5から15μg/m2/24時間への段階的な投与量の増加によってT細胞再
分布の第二のエピソードが引き起こされ、これは、主として錯乱及び見当識障害であるCNS症状の発症を伴った。
(B)CD19×CD3を1.5μg/m2で繰り返し静脈内ボーラス注入した場合のB
‐NHL患者で繰り返し発生するT細胞再分布を示す図であり、この患者はCNS症状を発症した。絶対細胞数は、血液1マイクロリットル中1000個の細胞の単位として表される。各ボーラス投与の注入時間は2乃至4時間とした。垂直の矢印はボーラス注入の開始を示す。各ボーラス投与の最初のデータポイントは、ボーラス注入開始直前のT細胞数を示す。各ボーラス注入は、T細胞再分布のエピソードを引き起こし、続いて次のボーラス注入の前にT細胞数は回復した。最後に、この患者では、T細胞再分布の第三のエピソードがCNS症状の発症を伴った。
[図25]CD19×CD3注入のランプイニシエーション(ramp initiat
ion)、すなわち、治療の最初の24時間はほぼ0から15μg/m2/24時間まで
流量を均等に徐々に増加させるという場合における、循環するCD19‐陽性標的B細胞
(黒三角)を持たないB‐NHL患者番号20(表4)の複雑なT細胞再分布パターン(白四角)を示す図である。絶対細胞数は、血液1マイクロリットル中1000個の細胞の単位として表される。最初のデータポイントは注入開始直前のベースライン数を示す。CD19×CD3の投与量は患者番号の横のカッコ内に示す。CD19×CD3への第一の曝露によって引き起こされた最初の再分布後に循環血液中に再出現するT細胞の一部は、ランプフェーズの間のさらに増加を続けるCD19×CD3のレベルに誘発されて循環血液中から再消滅する。
[図26]著しい数の循環するCD19‐陽性標的B(リンパ腫)細胞(黒三角)を持つB‐NHL患者番号13(表4)をCD19×CD3で治療した際のT及びB細胞数を示す図である。絶対細胞数は、血液1マイクロリットル中1000個の細胞の単位として表される。最初のデータポイントは注入開始直前のベースライン数を示す。CD19×CD3の投与量は患者番号の横のカッコ内に示す。T細胞(白四角)はCD19×CD3の注入開始と共に循環から完全に消滅し、循環するCD19‐陽性標的B(リンパ腫)細胞(黒三角)が末梢血液から除去されるまで再出現しない。
[図27]循環するCD19‐陽性標的B細胞(黒三角)を実質的に持たず、CD19×CD3注入をこの薬剤の安定化に必要であるHSAを追加することなく開始すると共にCNS症状を発症したB‐NHL患者番号24(表4)で繰り返し発生するT細胞再分布(白四角)を示す図である(上側の図)。最初の再分布からの循環するT細胞の第一の回復後、安定化させるHSAが存在しないために不均一となった薬剤流量によってT細胞再分布の第二のエピソードが引き起こされ、これは、主として錯乱及び見当識障害であるCNS症状の発症を伴った。同一の患者にて、薬剤安定化のためのHSAを追加して含有するCD19×CD3溶液で正しく治療を再度開始すると、T細胞再分布の繰り返しは観察されず(下側の図)、この患者はいずれのCNS症状をも再度発症することはなかった。絶対細胞数は、血液1マイクロリットル中1000個の細胞の単位として表される。最初のデータポイントは注入開始直前のベースライン数を示す。CD19×CD3の投与量は患者番号の横のカッコ内に示す。
[図28]コンテクスト依存性CD3エピトープへの一価の結合によって誘発される内皮細胞へのT細胞の接着のモデルを示す図である。従来のCD3結合分子は、CD3イプシロン上のそのコンテクスト依存性エピトープに対する一価の相互作用によってCD3のコンフォメーションのアロステリックな変化を、続いてCD3イプシロンの細胞質ドメインへのNck2の動員を引き起こすことができる(Gilet al. (2002) Ce
ll 109: 901)。Nck2はPINCH及びILKを介してインテグリンと直接結合していることから(Legate et al.(2006) Nat Rev Mol Cell Biol 7: 20)、従来のCD3結合分子(実施例20のCD19×CD
3のような)がCD3イプシロン上のそのコンテクスト依存性エピトープに結合することによるCD3のコンフォメーションのアロステリックな変化に続いてNck2がCD3イプシロンの細胞質ドメインへ動員されると、内側からのシグナル伝達(inside‐out‐signalling)を通してT細胞表面上のインテグリンがより接着性の高いアイソフォームへと一時的に変換され、T細胞の内皮細胞への接着性を高めることができる。
[図29]実施例21で述べるようにカニクイザルのインビボでの研究に使用されたCD33‐AF5 VH‐VL×I2C VH‐VL試験物質の細胞障害活性を示す図である。CD33陽性標的細胞の特異的な溶解を、CD33‐AF5VH‐VL×I2C VH‐
VLの濃度を上昇させる標準的な51クロム放出アッセイによって測定した。アッセイは18時間行った。マカクT細胞株4119LnPxをエフェクター細胞源として用いた。カニクイザルCD33でトランスフェクトされたCHO細胞を標的細胞とした。標的細胞に対するエフェクター細胞の比(E:T比)は10:1とした。標的細胞溶解の最大半減(half‐maximaltarget cell lysis)に要するCD33‐AF5 VH‐VL×I2C VH‐VLの濃度(EC50)は、用量反応曲線より2.7ng/mlの値であると算出された。
[図30A]実施例21で述べるCD33‐AF5 VH‐VL×I2C VH‐VLの連続する静脈注入による、カニクイザル末梢血液からの投与量依存及び時間依存のCD33陽性単球の除去を示す図である。カラム上に示した処理時間後の循環するCD33陽性単球の絶対数のベースライン(すなわち100%)に対するパーセントを、投与量レベルごと、2匹のカニクイザルの各々に対して示す。投与量レベル(すなわち、注入流量)をカラムの下に示す。30μg/m2/24時間の投与量で7日間処理した動物1及び2では
、循環するCD33陽性単球の除去は観察されなかった。60μg/m2/24時間の投
与量で7日間処理した動物3及び4では、循環するCD33陽性単球数がそれぞれベースラインの68%及び40%へ減少した。240μg/m2/24時間では、循環するCD
33陽性単球は3日間の処理の後に末梢血液からほぼ完全に除去された(動物5及び6)。1000μg/m2/24時間では、循環するCD33陽性単球は1日の処理の後にす
でに末梢血液から完全に除去されていた(動物7及び8)。
[図30B−1]120μg/m2/24時間でCD33‐AF5VH‐VL×I2C VH‐VLを14日間連続注入した場合の、2匹のカニクイザルの末梢血液中のT細胞数及びCD33単球数の推移を示す図である。絶対細胞数は、血液1マイクロリットル中1
000個の細胞の単位として表される。最初のデータポイントは注入開始直前のベースライン数を示す。注入を開始して最初の12時間のCD33単球の最初の動員後、その後の注入の過程において末梢血液中のCD33単球(黒三角)は、それぞれのベースライン数に対して3分の2(動物10)及び50%(動物9)が除去されている。循環するT細胞数(白四角)は、最初に限定的な低下を示し、続いて循環するCD33陽性単球標的細胞が依然として存在している間に回復している。
[図30B−2]120μg/m2/24時間でCD33‐AF5VH‐VL×I2C VH‐VLを14日間連続注入した場合の、2匹のカニクイザルの末梢血液中のT細胞数及びCD33単球数の推移を示す図である。絶対細胞数は、血液1マイクロリットル中1000個の細胞の単位として表される。最初のデータポイントは注入開始直前のベースライン数を示す。注入を開始して最初の12時間のCD33単球の最初の動員後、その後の注入の過程において末梢血液中のCD33単球(黒三角)は、それぞれのベースライン数に対して3分の2(動物10)及び50%(動物9)が除去されている。循環するT細胞数(白四角)は、最初に限定的な低下を示し、続いて循環するCD33陽性単球標的細胞が依然として存在している間に回復している。
[図31]実施例22で述べるようにカニクイザルのインビボでの研究に使用されたMCSP‐G4 VH‐VL×I2C VH‐VL試験物質の細胞障害活性を示す図である。MCSP陽性標的細胞の特異的な溶解を、MCSP‐G4VH‐VL×I2C VH‐VL
の濃度を上昇させる標準的な51クロム放出アッセイによって測定した。アッセイは18時間行った。マカクT細胞株4119LnPxをエフェクター細胞源として用いた。カニクイザルMCSPでトランスフェクトされたCHO細胞を標的細胞とした。標的細胞に対するエフェクター細胞の比(E:T比)は10:1とした。標的細胞溶解の最大半減に要するMCSP‐G4VH‐VL×I2C VH‐VLの濃度(EC50)は、用量反応曲線
より1.9ng/mlの値であると算出された。
[図32−1]実質的にコンテクスト非依存性CD3エピトープを認識するCD3結合分子MCSP‐G4 VH‐VL×I2C VH‐VLの静脈内注入の開始フェーズの間における、カニクイザル末梢血液中の絶対T細胞数の低下及びそれに続く回復(すなわち、再分布)という最初のエピソードが発生していないことを示す図である。絶対細胞数は、血液1マイクロリットル中1000個の細胞の単位として表される。最初のデータポイントは注入開始直前のベースライン数を示す。MCSP‐G4VH‐VL×I2C VH‐V
Lの投与量は動物番号の横のカッコ内に示す。カニクイザルの循環血液中にMCSP陽性標的細胞が存在しないことが既知である場合、標的細胞の媒介によるCD3の架橋を通してのT細胞の再分布(すなわち、絶対T細胞数の低下及びそれに続く回復という最初のエピソード)は誘発されない。さらに、T細胞がCD3結合部位との相互作用を通すことでしか受けることができないシグナルによるT細胞の再分布(すなわち、絶対T細胞数の低
下及びそれに続く回復という最初のエピソード)の誘発は、実質的にコンテクスト非依存性CD3エピトープを認識するMCSP‐G4VH‐VL×I2C VH‐VLのような
CD3結合分子を用いることで避けることができる。
[図32−2]実質的にコンテクスト非依存性CD3エピトープを認識するCD3結合分子MCSP‐G4 VH‐VL×I2C VH‐VLの静脈内注入の開始フェーズの間における、カニクイザル末梢血液中の絶対T細胞数の低下及びそれに続く回復(すなわち、再分布)という最初のエピソードが発生していないことを示す図である。絶対細胞数は、血液1マイクロリットル中1000個の細胞の単位として表される。最初のデータポイントは注入開始直前のベースライン数を示す。MCSP‐G4VH‐VL×I2C VH‐V
Lの投与量は動物番号の横のカッコ内に示す。カニクイザルの循環血液中にMCSP陽性標的細胞が存在しないことが既知である場合、標的細胞の媒介によるCD3の架橋を通してのT細胞の再分布(すなわち、絶対T細胞数の低下及びそれに続く回復という最初のエピソード)は誘発されない。さらに、T細胞がCD3結合部位との相互作用を通すことでしか受けることができないシグナルによるT細胞の再分布(すなわち、絶対T細胞数の低下及びそれに続く回復という最初のエピソード)の誘発は、実質的にコンテクスト非依存性CD3エピトープを認識するMCSP‐G4 VH‐VL×I2C VH‐VLのようなCD3結合分子を用いることで避けることができる。
[図33−1]指定の種間特異的二重特異性コンストラクトの、ヒトCD33でトランスフェクトされたCHO細胞、ヒトCD3+T細胞株HPB‐ALL、マカクCD33でトランスフェクトされたCHO細胞、及びマカクPBMCのそれぞれに対するFACS結合分析を示す図である。FACS染色は実施例23.4で述べるようにして実施する。太線は、5μg/mlの精製した二重特異性単鎖コンストラクト又は種間特異的二重特異性抗体コンストラクトを発現するトランスフェクトされた細胞の細胞培養物の上清と共にインキュベートされた細胞を表す。黒塗りのヒストグラムはネガティブコントロールを表す。ネガティブコントロールにはトランスフェクトされていないCHO細胞の上清を用いた。種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの各々について、ヒストグラムのオーバーレイはヒト及びマカクCD33並びにヒト及びマカクCD3へのコンストラクトの特異的な結合を示している。
[図33−2]指定の種間特異的二重特異性コンストラクトの、ヒトCD33でトランスフェクトされたCHO細胞、ヒトCD3+T細胞株HPB‐ALL、マカクCD33でトランスフェクトされたCHO細胞、及びマカクPBMCのそれぞれに対するFACS結合分析を示す図である。FACS染色は実施例23.4で述べるようにして実施する。太線は、5μg/mlの精製した二重特異性単鎖コンストラクト又は種間特異的二重特異性抗体コンストラクトを発現するトランスフェクトされた細胞の細胞培養物の上清と共にインキュベートされた細胞を表す。黒塗りのヒストグラムはネガティブコントロールを表す。ネガティブコントロールにはトランスフェクトされていないCHO細胞の上清を用いた。種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの各々について、ヒストグラムのオーバーレイはヒト及びマカクCD33並びにヒト及びマカクCD3へのコンストラクトの特異的な結合を示している。
[図33−3]指定の種間特異的二重特異性コンストラクトの、ヒトCD33でトランスフェクトされたCHO細胞、ヒトCD3+T細胞株HPB‐ALL、マカクCD33でトランスフェクトされたCHO細胞、及びマカクPBMCのそれぞれに対するFACS結合分析を示す図である。FACS染色は実施例23.4で述べるようにして実施する。太線は、5μg/mlの精製した二重特異性単鎖コンストラクト又は種間特異的二重特異性抗体コンストラクトを発現するトランスフェクトされた細胞の細胞培養物の上清と共にインキュベートされた細胞を表す。黒塗りのヒストグラムはネガティブコントロールを表す。ネガティブコントロールにはトランスフェクトされていないCHO細胞の上清を用いた。種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの各々について、ヒストグラムのオーバーレイはヒト及びマカクCD33並びにヒト及びマカクCD3へのコンストラクトの特異的な結合を示している。
[図33−4]指定の種間特異的二重特異性コンストラクトの、ヒトCD33でトランスフェクトされたCHO細胞、ヒトCD3+T細胞株HPB‐ALL、マカクCD33でトランスフェクトされたCHO細胞、及びマカクPBMCのそれぞれに対するFACS結合分析を示す図である。FACS染色は実施例23.4で述べるようにして実施する。太線は、5μg/mlの精製した二重特異性単鎖コンストラクト又は種間特異的二重特異性抗体コンストラクトを発現するトランスフェクトされた細胞の細胞培養物の上清と共にインキュベートされた細胞を表す。黒塗りのヒストグラムはネガティブコントロールを表す。ネガティブコントロールにはトランスフェクトされていないCHO細胞の上清を用いた。種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの各々について、ヒストグラムのオーバーレイはヒト及びマカクCD33並びにヒト及びマカクCD3へのコンストラクトの特異的な結合を示している。
[図33−5]指定の種間特異的二重特異性コンストラクトの、ヒトCD33でトランスフェクトされたCHO細胞、ヒトCD3+T細胞株HPB‐ALL、マカクCD33でトランスフェクトされたCHO細胞、及びマカクPBMCのそれぞれに対するFACS結合分析を示す図である。FACS染色は実施例23.4で述べるようにして実施する。太線は、5μg/mlの精製した二重特異性単鎖コンストラクト又は種間特異的二重特異性抗体コンストラクトを発現するトランスフェクトされた細胞の細胞培養物の上清と共にインキュベートされた細胞を表す。黒塗りのヒストグラムはネガティブコントロールを表す。ネガティブコントロールにはトランスフェクトされていないCHO細胞の上清を用いた。種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの各々について、ヒストグラムのオーバーレイはヒト及びマカクCD33並びにヒト及びマカクCD3へのコンストラクトの特異的な結合を示している。
[図33−6]指定の種間特異的二重特異性コンストラクトの、ヒトCD33でトランスフェクトされたCHO細胞、ヒトCD3+T細胞株HPB‐ALL、マカクCD33でトランスフェクトされたCHO細胞、及びマカクPBMCのそれぞれに対するFACS結合分析を示す図である。FACS染色は実施例23.4で述べるようにして実施する。太線は、5μg/mlの精製した二重特異性単鎖コンストラクト又は種間特異的二重特異性抗体コンストラクトを発現するトランスフェクトされた細胞の細胞培養物の上清と共にインキュベートされた細胞を表す。黒塗りのヒストグラムはネガティブコントロールを表す。ネガティブコントロールにはトランスフェクトされていないCHO細胞の上清を用いた。種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの各々について、ヒストグラムのオーバーレイはヒト及びマカクCD33並びにヒト及びマカクCD3へのコンストラクトの特異的な結合を示している。
[図33−7]指定の種間特異的二重特異性コンストラクトの、ヒトCD33でトランスフェクトされたCHO細胞、ヒトCD3+T細胞株HPB‐ALL、マカクCD33でトランスフェクトされたCHO細胞、及びマカクPBMCのそれぞれに対するFACS結合分析を示す図である。FACS染色は実施例23.4で述べるようにして実施する。太線は、5μg/mlの精製した二重特異性単鎖コンストラクト又は種間特異的二重特異性抗体コンストラクトを発現するトランスフェクトされた細胞の細胞培養物の上清と共にインキュベートされた細胞を表す。黒塗りのヒストグラムはネガティブコントロールを表す。ネガティブコントロールにはトランスフェクトされていないCHO細胞の上清を用いた。種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの各々について、ヒストグラムのオーバーレイはヒト及びマカクCD33並びにヒト及びマカクCD3へのコンストラクトの特異的な結合を示している。
[図33−8]指定の種間特異的二重特異性コンストラクトの、ヒトCD33でトランスフェクトされたCHO細胞、ヒトCD3+T細胞株HPB‐ALL、マカクCD33でトランスフェクトされたCHO細胞、及びマカクPBMCのそれぞれに対するFACS結合分析を示す図である。FACS染色は実施例23.4で述べるようにして実施する。太線は、5μg/mlの精製した二重特異性単鎖コンストラクト又は種間特異的二重特異性抗体コンストラクトを発現するトランスフェクトされた細胞の細胞培養物の上清と共にイン
キュベートされた細胞を表す。黒塗りのヒストグラムはネガティブコントロールを表す。ネガティブコントロールにはトランスフェクトされていないCHO細胞の上清を用いた。種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの各々について、ヒストグラムのオーバーレイはヒト及びマカクCD33並びにヒト及びマカクCD3へのコンストラクトの特異的な結合を示している。
[図33−9]指定の種間特異的二重特異性コンストラクトの、ヒトCD33でトランスフェクトされたCHO細胞、ヒトCD3+T細胞株HPB‐ALL、マカクCD33でトランスフェクトされたCHO細胞、及びマカクPBMCのそれぞれに対するFACS結合分析を示す図である。FACS染色は実施例23.4で述べるようにして実施する。太線は、5μg/mlの精製した二重特異性単鎖コンストラクト又は種間特異的二重特異性抗体コンストラクトを発現するトランスフェクトされた細胞の細胞培養物の上清と共にインキュベートされた細胞を表す。黒塗りのヒストグラムはネガティブコントロールを表す。ネガティブコントロールにはトランスフェクトされていないCHO細胞の上清を用いた。種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの各々について、ヒストグラムのオーバーレイはヒト及びマカクCD33並びにヒト及びマカクCD3へのコンストラクトの特異的な結合を示している。
[図33−10]指定の種間特異的二重特異性コンストラクトの、ヒトCD33でトランスフェクトされたCHO細胞、ヒトCD3+T細胞株HPB‐ALL、マカクCD33でトランスフェクトされたCHO細胞、及びマカクPBMCのそれぞれに対するFACS結合分析を示す図である。FACS染色は実施例23.4で述べるようにして実施する。太線は、5μg/mlの精製した二重特異性単鎖コンストラクト又は種間特異的二重特異性抗体コンストラクトを発現するトランスフェクトされた細胞の細胞培養物の上清と共にインキュベートされた細胞を表す。黒塗りのヒストグラムはネガティブコントロールを表す。ネガティブコントロールにはトランスフェクトされていないCHO細胞の上清を用いた。種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの各々について、ヒストグラムのオーバーレイはヒト及びマカクCD33並びにヒト及びマカクCD3へのコンストラクトの特異的な結合を示している。
[図33−11]指定の種間特異的二重特異性コンストラクトの、ヒトCD33でトランスフェクトされたCHO細胞、ヒトCD3+T細胞株HPB‐ALL、マカクCD33でトランスフェクトされたCHO細胞、及びマカクPBMCのそれぞれに対するFACS結合分析を示す図である。FACS染色は実施例23.4で述べるようにして実施する。太線は、5μg/mlの精製した二重特異性単鎖コンストラクト又は種間特異的二重特異性抗体コンストラクトを発現するトランスフェクトされた細胞の細胞培養物の上清と共にインキュベートされた細胞を表す。黒塗りのヒストグラムはネガティブコントロールを表す。ネガティブコントロールにはトランスフェクトされていないCHO細胞の上清を用いた。種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの各々について、ヒストグラムのオーバーレイはヒト及びマカクCD33並びにヒト及びマカクCD3へのコンストラクトの特異的な結合を示している。
[図33−12]指定の種間特異的二重特異性コンストラクトの、ヒトCD33でトランスフェクトされたCHO細胞、ヒトCD3+T細胞株HPB‐ALL、マカクCD33でトランスフェクトされたCHO細胞、及びマカクPBMCのそれぞれに対するFACS結合分析を示す図である。FACS染色は実施例23.4で述べるようにして実施する。太線は、5μg/mlの精製した二重特異性単鎖コンストラクト又は種間特異的二重特異性抗体コンストラクトを発現するトランスフェクトされた細胞の細胞培養物の上清と共にインキュベートされた細胞を表す。黒塗りのヒストグラムはネガティブコントロールを表す。ネガティブコントロールにはトランスフェクトされていないCHO細胞の上清を用いた。種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの各々について、ヒストグラムのオーバーレイはヒト及びマカクCD33並びにヒト及びマカクCD3へのコンストラクトの特異的な結合を示している。
[図34−1]示した標的細胞株へ再指向された指定の種間特異的CD33特異的単鎖コ
ンストラクトによって誘発された細胞障害活性を測定するクロム放出アッセイの結果を示す図である。示したエフェクター細胞も用いた。このアッセイは実施例23.5で述べるようにして実施する。この図より、各コンストラクトについて、ヒト及びマカクCD33でトランスフェクトされたCHO細胞のそれぞれに対するヒト及びマカクエフェクター細胞の細胞障害活性の強力な増加が明らかに示される。
[図34−2]示した標的細胞株へ再指向された指定の種間特異的CD33特異的単鎖コンストラクトによって誘発された細胞障害活性を測定するクロム放出アッセイの結果を示す図である。示したエフェクター細胞も用いた。このアッセイは実施例23.5で述べるようにして実施する。この図より、各コンストラクトについて、ヒト及びマカクCD33でトランスフェクトされたCHO細胞のそれぞれに対するヒト及びマカクエフェクター細胞の細胞障害活性の強力な増加が明らかに示される。
[図34−3]示した標的細胞株へ再指向された指定の種間特異的CD33特異的単鎖コンストラクトによって誘発された細胞障害活性を測定するクロム放出アッセイの結果を示す図である。示したエフェクター細胞も用いた。このアッセイは実施例23.5で述べるようにして実施する。この図より、各コンストラクトについて、ヒト及びマカクCD33でトランスフェクトされたCHO細胞のそれぞれに対するヒト及びマカクエフェクター細胞の細胞障害活性の強力な増加が明らかに示される。
[図34−4]示した標的細胞株へ再指向された指定の種間特異的CD33特異的単鎖コンストラクトによって誘発された細胞障害活性を測定するクロム放出アッセイの結果を示す図である。示したエフェクター細胞も用いた。このアッセイは実施例23.5で述べるようにして実施する。この図より、各コンストラクトについて、ヒト及びマカクCD33でトランスフェクトされたCHO細胞のそれぞれに対するヒト及びマカクエフェクター細胞の細胞障害活性の強力な増加が明らかに示される。
[図34−5]示した標的細胞株へ再指向された指定の種間特異的CD33特異的単鎖コンストラクトによって誘発された細胞障害活性を測定するクロム放出アッセイの結果を示す図である。示したエフェクター細胞も用いた。このアッセイは実施例23.5で述べるようにして実施する。この図より、各コンストラクトについて、ヒト及びマカクCD33でトランスフェクトされたCHO細胞のそれぞれに対するヒト及びマカクエフェクター細胞の細胞障害活性の強力な増加が明らかに示される。
[図34−6]示した標的細胞株へ再指向された指定の種間特異的CD33特異的単鎖コンストラクトによって誘発された細胞障害活性を測定するクロム放出アッセイの結果を示す図である。示したエフェクター細胞も用いた。このアッセイは実施例23.5で述べるようにして実施する。この図より、各コンストラクトについて、ヒト及びマカクCD33でトランスフェクトされたCHO細胞のそれぞれに対するヒト及びマカクエフェクター細胞の細胞障害活性の強力な増加が明らかに示される。
[図34−7]示した標的細胞株へ再指向された指定の種間特異的CD33特異的単鎖コンストラクトによって誘発された細胞障害活性を測定するクロム放出アッセイの結果を示す図である。示したエフェクター細胞も用いた。このアッセイは実施例23.5で述べるようにして実施する。この図より、各コンストラクトについて、ヒト及びマカクCD33でトランスフェクトされたCHO細胞のそれぞれに対するヒト及びマカクエフェクター細胞の細胞障害活性の強力な増加が明らかに示される。
[図34−8]示した標的細胞株へ再指向された指定の種間特異的CD33特異的単鎖コンストラクトによって誘発された細胞障害活性を測定するクロム放出アッセイの結果を示す図である。示したエフェクター細胞も用いた。このアッセイは実施例23.5で述べるようにして実施する。この図より、各コンストラクトについて、ヒト及びマカクCD33でトランスフェクトされたCHO細胞のそれぞれに対するヒト及びマカクエフェクター細胞の細胞障害活性の強力な増加が明らかに示される。
[図35a]指定の種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの、ヒトCAIXでトランスフェクトされたCHO細胞、ヒトCD3+T細胞株HPB‐ALL、マカクCAIXでトランスフェクトされたCHO細胞、及びマカクT細胞株4119LnPxのそれぞれに
対するFACS結合分析を示す図である。FACS染色は実施例24.5で述べるようにして実施した。太線は、2μg/mlの精製した二重特異性単鎖コンストラクトと共にインキュベートされた細胞を表す。黒塗りのヒストグラムはネガティブコントロールを表す。T細胞株への結合に対するネガティブコントロールには、トランスフェクトされていないCHO細胞の上清を用いた。CAIXでトランスフェクトされたCHO細胞への結合に対するネガティブコントロールには、関連性のない標的特異性を有する単鎖コンストラクトを用いた。種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの各々について、ヒストグラムのオーバーレイはヒト及びマカクCAIX並びにヒト及びマカクCD3へのコンストラクトの特異的な結合を示している。
[図35b]指定の種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの、ヒトCAIXでトランスフェクトされたCHO細胞、ヒトCD3+T細胞株HPB‐ALL、マカクCAIXでトランスフェクトされたCHO細胞、及びマカクT細胞株4119LnPxのそれぞれに対するFACS結合分析を示す図である。FACS染色は実施例24.5で述べるようにして実施した。太線は、2μg/mlの精製した二重特異性単鎖コンストラクトと共にインキュベートされた細胞を表す。黒塗りのヒストグラムはネガティブコントロールを表す。T細胞株への結合に対するネガティブコントロールには、トランスフェクトされていないCHO細胞の上清を用いた。CAIXでトランスフェクトされたCHO細胞への結合に対するネガティブコントロールには、関連性のない標的特異性を有する単鎖コンストラクトを用いた。種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの各々について、ヒストグラムのオーバーレイはヒト及びマカクCAIX並びにヒト及びマカクCD3へのコンストラクトの特異的な結合を示している。
[図35c]指定の種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの、ヒトCAIXでトランスフェクトされたCHO細胞、ヒトCD3+T細胞株HPB‐ALL、マカクCAIXでトランスフェクトされたCHO細胞、及びマカクT細胞株4119LnPxのそれぞれに対するFACS結合分析を示す図である。FACS染色は実施例24.5で述べるようにして実施した。太線は、2μg/mlの精製した二重特異性単鎖コンストラクトと共にインキュベートされた細胞を表す。黒塗りのヒストグラムはネガティブコントロールを表す。T細胞株への結合に対するネガティブコントロールには、トランスフェクトされていないCHO細胞の上清を用いた。CAIXでトランスフェクトされたCHO細胞への結合に対するネガティブコントロールには、関連性のない標的特異性を有する単鎖コンストラクトを用いた。種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの各々について、ヒストグラムのオーバーレイはヒト及びマカクCAIX並びにヒト及びマカクCD3へのコンストラクトの特異的な結合を示している。
[図35d]指定の種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの、ヒトCAIXでトランスフェクトされたCHO細胞、ヒトCD3+T細胞株HPB‐ALL、マカクCAIXでトランスフェクトされたCHO細胞、及びマカクT細胞株4119LnPxのそれぞれに対するFACS結合分析を示す図である。FACS染色は実施例24.5で述べるようにして実施した。太線は、2μg/mlの精製した二重特異性単鎖コンストラクトと共にインキュベートされた細胞を表す。黒塗りのヒストグラムはネガティブコントロールを表す。T細胞株への結合に対するネガティブコントロールには、トランスフェクトされていないCHO細胞の上清を用いた。CAIXでトランスフェクトされたCHO細胞への結合に対するネガティブコントロールには、関連性のない標的特異性を有する単鎖コンストラクトを用いた。種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの各々について、ヒストグラムのオーバーレイはヒト及びマカクCAIX並びにヒト及びマカクCD3へのコンストラクトの特異的な結合を示している。
[図35e]指定の種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの、ヒトCAIXでトランスフェクトされたCHO細胞、ヒトCD3+T細胞株HPB‐ALL、マカクCAIXでトランスフェクトされたCHO細胞、及びマカクT細胞株4119LnPxのそれぞれに対するFACS結合分析を示す図である。FACS染色は実施例24.5で述べるようにして実施した。太線は、2μg/mlの精製した二重特異性単鎖コンストラクトと共にイ
ンキュベートされた細胞を表す。黒塗りのヒストグラムはネガティブコントロールを表す。T細胞株への結合に対するネガティブコントロールには、トランスフェクトされていないCHO細胞の上清を用いた。CAIXでトランスフェクトされたCHO細胞への結合に対するネガティブコントロールには、関連性のない標的特異性を有する単鎖コンストラクトを用いた。種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの各々について、ヒストグラムのオーバーレイはヒト及びマカクCAIX並びにヒト及びマカクCD3へのコンストラクトの特異的な結合を示している。
[図35f]指定の種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの、ヒトCAIXでトランスフェクトされたCHO細胞、ヒトCD3+T細胞株HPB‐ALL、マカクCAIXでトランスフェクトされたCHO細胞、及びマカクT細胞株4119LnPxのそれぞれに対するFACS結合分析を示す図である。FACS染色は実施例24.5で述べるようにして実施した。太線は、2μg/mlの精製した二重特異性単鎖コンストラクトと共にインキュベートされた細胞を表す。黒塗りのヒストグラムはネガティブコントロールを表す。T細胞株への結合に対するネガティブコントロールには、トランスフェクトされていないCHO細胞の上清を用いた。CAIXでトランスフェクトされたCHO細胞への結合に対するネガティブコントロールには、関連性のない標的特異性を有する単鎖コンストラクトを用いた。種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの各々について、ヒストグラムのオーバーレイはヒト及びマカクCAIX並びにヒト及びマカクCD3へのコンストラクトの特異的な結合を示している。
[図35g]指定の種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの、ヒトCAIXでトランスフェクトされたCHO細胞、ヒトCD3+T細胞株HPB‐ALL、マカクCAIXでトランスフェクトされたCHO細胞、及びマカクT細胞株4119LnPxのそれぞれに対するFACS結合分析を示す図である。FACS染色は実施例24.5で述べるようにして実施した。太線は、2μg/mlの精製した二重特異性単鎖コンストラクトと共にインキュベートされた細胞を表す。黒塗りのヒストグラムはネガティブコントロールを表す。T細胞株への結合に対するネガティブコントロールには、トランスフェクトされていないCHO細胞の上清を用いた。CAIXでトランスフェクトされたCHO細胞への結合に対するネガティブコントロールには、関連性のない標的特異性を有する単鎖コンストラクトを用いた。種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの各々について、ヒストグラムのオーバーレイはヒト及びマカクCAIX並びにヒト及びマカクCD3へのコンストラクトの特異的な結合を示している。
[図36a]示した標的細胞株へ再指向された指定の種間特異的CAIX特異的単鎖コンストラクトによって誘発された細胞障害活性を測定するクロム放出アッセイの結果を示す図である。示したエフェクター細胞も用いた。このアッセイは実施例24.6で述べるようにして実施する。この図より、各コンストラクトについて、ヒト及びマカクCAIXでトランスフェクトされたCHO細胞のそれぞれに対するヒト及びマカクエフェクター細胞の細胞障害活性の強力な増加が明らかに示される。
[図36b]示した標的細胞株へ再指向された指定の種間特異的CAIX特異的単鎖コンストラクトによって誘発された細胞障害活性を測定するクロム放出アッセイの結果を示す図である。示したエフェクター細胞も用いた。このアッセイは実施例24.6で述べるようにして実施する。この図より、各コンストラクトについて、ヒト及びマカクCAIXでトランスフェクトされたCHO細胞のそれぞれに対するヒト及びマカクエフェクター細胞の細胞障害活性の強力な増加が明らかに示される。
[図36c]示した標的細胞株へ再指向された指定の種間特異的CAIX特異的単鎖コンストラクトによって誘発された細胞障害活性を測定するクロム放出アッセイの結果を示す図である。示したエフェクター細胞も用いた。このアッセイは実施例24.6で述べるようにして実施する。この図より、各コンストラクトについて、ヒト及びマカクCAIXでトランスフェクトされたCHO細胞のそれぞれに対するヒト及びマカクエフェクター細胞の細胞障害活性の強力な増加が明らかに示される。
[図37]ヒトT細胞をエフェクター細胞として用いた、指定のEpCAM特異的単鎖コ
ンストラクトによって誘発されるヒトEpCAMでトランスフェクトされたCHO細胞に対する細胞障害活性を示す図である。このアッセイは実施例のセクションで述べるようにして実施した。この図より、各コンストラクトによる細胞障害活性の強力な増加が明らかに示される。
エフェクター細胞:刺激されたCD4/CD56除去ヒトPBMC
標的細胞:ヒトEpCAMでトランスフェクトされたCHO
[図38a]指定の二重特異性単鎖コンストラクトの、ヒトEpCAMでトランスフェクトされたCHO細胞(2a)、EpCAM及びCD3陰性細胞株としてのトランスフェクトされていないCHO細胞(2b)、ヒトPBMC(2c)、及びマカクT細胞株4119LnPx(2d)のそれぞれに対するFACS結合分析を示す図である。細胞は、それぞれの二重特異性単鎖コンストラクトを含有する上清と共にインキュベートした。FACS染色は実施例のセクションで述べるようにして実施する。種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの各々について、ヒストグラムのオーバーレイはヒトEpCAM、並びにヒト及びマカクCD3へのコンストラクトの特異的な結合を示している。
a:CHO‐EpCAM(ヒト)
b:CHO(トランスフェクトされていない)
c:ヒトPBMC
d:マカク4119LnPx(CD3+)
[図38b]指定の二重特異性単鎖コンストラクトの、ヒトEpCAMでトランスフェクトされたCHO細胞(2a)、EpCAM及びCD3陰性細胞株としてのトランスフェクトされていないCHO細胞(2b)、ヒトPBMC(2c)、及びマカクT細胞株4119LnPx(2d)のそれぞれに対するFACS結合分析を示す図である。細胞は、それぞれの二重特異性単鎖コンストラクトを含有する上清と共にインキュベートした。FACS染色は実施例のセクションで述べるようにして実施する。種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの各々について、ヒストグラムのオーバーレイはヒトEpCAM、並びにヒト及びマカクCD3へのコンストラクトの特異的な結合を示している。
a:CHO‐EpCAM(ヒト)
b:CHO(トランスフェクトされていない)
c:ヒトPBMC
d:マカク4119LnPx(CD3+)
[図38c]指定の二重特異性単鎖コンストラクトの、ヒトEpCAMでトランスフェクトされたCHO細胞(2a)、EpCAM及びCD3陰性細胞株としてのトランスフェクトされていないCHO細胞(2b)、ヒトPBMC(2c)、及びマカクT細胞株4119LnPx(2d)のそれぞれに対するFACS結合分析を示す図である。細胞は、それぞれの二重特異性単鎖コンストラクトを含有する上清と共にインキュベートした。FACS染色は実施例のセクションで述べるようにして実施する。種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの各々について、ヒストグラムのオーバーレイはヒトEpCAM、並びにヒト及びマカクCD3へのコンストラクトの特異的な結合を示している。
a:CHO‐EpCAM(ヒト)
b:CHO(トランスフェクトされていない)
c:ヒトPBMC
d:マカク4119LnPx(CD3+)
[図38d]指定の二重特異性単鎖コンストラクトの、ヒトEpCAMでトランスフェクトされたCHO細胞(2a)、EpCAM及びCD3陰性細胞株としてのトランスフェクトされていないCHO細胞(2b)、ヒトPBMC(2c)、及びマカクT細胞株4119LnPx(2d)のそれぞれに対するFACS結合分析を示す図である。細胞は、それぞれの二重特異性単鎖コンストラクトを含有する上清と共にインキュベートした。FACS染色は実施例のセクションで述べるようにして実施する。種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの各々について、ヒストグラムのオーバーレイはヒトEpCAM、並びにヒト及びマカクCD3へのコンストラクトの特異的な結合を示している。
a:CHO‐EpCAM(ヒト)
b:CHO(トランスフェクトされていない)
c:ヒトPBMC
d:マカク4119LnPx(CD3+)
[図39a]指定の種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの、ヒトEGFRvIIIでトランスフェクトされたCHO細胞、ヒトCD3+T細胞株HPB‐ALL、カニクイザルEGFRvIIIでトランスフェクトされたCHO細胞、及びマカクT細胞株4119LnPxに対するFACS結合分析を示す図である。FACS染色は実施例26.3で述べるようにして実施する。太線は、2μg/mlの精製した単量体タンパク質と共にインキュベートされ、続いて抗his抗体及びPE標識検出抗体と共にインキュベートされた細胞を表す。細線のヒストグラムは、ネガティブコントロール:抗his抗体及び検出抗体と共にインキュベートされただけである細胞を表す。
[図39b]指定の種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの、ヒトEGFRvIIIでトランスフェクトされたCHO細胞、ヒトCD3+T細胞株HPB‐ALL、カニクイザルEGFRvIIIでトランスフェクトされたCHO細胞、及びマカクT細胞株4119LnPxに対するFACS結合分析を示す図である。FACS染色は実施例26.3で述べるようにして実施する。太線は、2μg/mlの精製した単量体タンパク質と共にインキュベートされ、続いて抗his抗体及びPE標識検出抗体と共にインキュベートされた細胞を表す。細線のヒストグラムは、ネガティブコントロール:抗his抗体及び検出抗体と共にインキュベートされただけである細胞を表す。
[図39c]指定の種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの、ヒトEGFRvIIIでトランスフェクトされたCHO細胞、ヒトCD3+T細胞株HPB‐ALL、カニクイザルEGFRvIIIでトランスフェクトされたCHO細胞、及びマカクT細胞株4119LnPxに対するFACS結合分析を示す図である。FACS染色は実施例26.3で述べるようにして実施する。太線は、2μg/mlの精製した単量体タンパク質と共にインキュベートされ、続いて抗his抗体及びPE標識検出抗体と共にインキュベートされた細胞を表す。細線のヒストグラムは、ネガティブコントロール:抗his抗体及び検出抗体と共にインキュベートされただけである細胞を表す。
[図39d]指定の種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの、ヒトEGFRvIIIでトランスフェクトされたCHO細胞、ヒトCD3+T細胞株HPB‐ALL、カニクイザルEGFRvIIIでトランスフェクトされたCHO細胞、及びマカクT細胞株4119LnPxに対するFACS結合分析を示す図である。FACS染色は実施例26.3で述べるようにして実施する。太線は、2μg/mlの精製した単量体タンパク質と共にインキュベートされ、続いて抗his抗体及びPE標識検出抗体と共にインキュベートされた細胞を表す。細線のヒストグラムは、ネガティブコントロール:抗his抗体及び検出抗体と共にインキュベートされただけである細胞を表す。
[図39e]指定の種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの、ヒトEGFRvIIIでトランスフェクトされたCHO細胞、ヒトCD3+T細胞株HPB‐ALL、カニクイザルEGFRvIIIでトランスフェクトされたCHO細胞、及びマカクT細胞株4119LnPxに対するFACS結合分析を示す図である。FACS染色は実施例26.3で述べるようにして実施する。太線は、2μg/mlの精製した単量体タンパク質と共にインキュベートされ、続いて抗his抗体及びPE標識検出抗体と共にインキュベートされた細胞を表す。細線のヒストグラムは、ネガティブコントロール:抗his抗体及び検出抗体と共にインキュベートされただけである細胞を表す。
[図39f]指定の種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの、ヒトEGFRvIIIでトランスフェクトされたCHO細胞、ヒトCD3+T細胞株HPB‐ALL、カニクイザルEGFRvIIIでトランスフェクトされたCHO細胞、及びマカクT細胞株4119LnPxに対するFACS結合分析を示す図である。FACS染色は実施例26.3で述べるようにして実施する。太線は、2μg/mlの精製した単量体タンパク質と共にインキュベートされ、続いて抗his抗体及びPE標識検出抗体と共にインキュベートされ
た細胞を表す。細線のヒストグラムは、ネガティブコントロール:抗his抗体及び検出抗体と共にインキュベートされただけである細胞を表す。
[図40a]示した標的細胞株へ再指向された指定の種間特異的単鎖コンストラクトによって誘発された細胞障害活性を示す図である。A)刺激されたCD4−/CD56−ヒトPBMCをエフェクター細胞として、ヒトEGFRvIIIでトランスフェクトされたCHO細胞を標的細胞として用いる。B)マカクT細胞株4119LnPxをエフェクター細胞として、カニクイザルEGFRvIIIでトランスフェクトされたCHO細胞を標的細胞として用いる。このアッセイは実施例26.3で述べるようにして実施する。
[図40b]示した標的細胞株へ再指向された指定の種間特異的単鎖コンストラクトによって誘発された細胞障害活性を示す図である。A)刺激されたCD4−/CD56−ヒトPBMCをエフェクター細胞として、ヒトEGFRvIIIでトランスフェクトされたCHO細胞を標的細胞として用いる。B)マカクT細胞株4119LnPxをエフェクター細胞として、カニクイザルEGFRvIIIでトランスフェクトされたCHO細胞を標的細胞として用いる。このアッセイは実施例26.3で述べるようにして実施する。
[図40c]示した標的細胞株へ再指向された指定の種間特異的単鎖コンストラクトによって誘発された細胞障害活性を示す図である。A)刺激されたCD4−/CD56−ヒトPBMCをエフェクター細胞として、ヒトEGFRvIIIでトランスフェクトされたCHO細胞を標的細胞として用いる。B)マカクT細胞株4119LnPxをエフェクター細胞として、カニクイザルEGFRvIIIでトランスフェクトされたCHO細胞を標的細胞として用いる。このアッセイは実施例26.3で述べるようにして実施する。
[図40d]示した標的細胞株へ再指向された指定の種間特異的単鎖コンストラクトによって誘発された細胞障害活性を示す図である。A)刺激されたCD4−/CD56−ヒトPBMCをエフェクター細胞として、ヒトEGFRvIIIでトランスフェクトされたCHO細胞を標的細胞として用いる。B)マカクT細胞株4119LnPxをエフェクター細胞として、カニクイザルEGFRvIIIでトランスフェクトされたCHO細胞を標的細胞として用いる。このアッセイは実施例26.3で述べるようにして実施する。
[図40e]示した標的細胞株へ再指向された指定の種間特異的単鎖コンストラクトによって誘発された細胞障害活性を示す図である。A)刺激されたCD4−/CD56−ヒトPBMCをエフェクター細胞として、ヒトEGFRvIIIでトランスフェクトされたCHO細胞を標的細胞として用いる。B)マカクT細胞株4119LnPxをエフェクター細胞として、カニクイザルEGFRvIIIでトランスフェクトされたCHO細胞を標的細胞として用いる。このアッセイは実施例26.3で述べるようにして実施する。
[図40f]示した標的細胞株へ再指向された指定の種間特異的単鎖コンストラクトによって誘発された細胞障害活性を示す図である。A)刺激されたCD4−/CD56−ヒトPBMCをエフェクター細胞として、ヒトEGFRvIIIでトランスフェクトされたCHO細胞を標的細胞として用いる。B)マカクT細胞株4119LnPxをエフェクター細胞として、カニクイザルEGFRvIIIでトランスフェクトされたCHO細胞を標的細胞として用いる。このアッセイは実施例26.3で述べるようにして実施する。
[図40g]示した標的細胞株へ再指向された指定の種間特異的単鎖コンストラクトによって誘発された細胞障害活性を示す図である。A)刺激されたCD4−/CD56−ヒトPBMCをエフェクター細胞として、ヒトEGFRvIIIでトランスフェクトされたCHO細胞を標的細胞として用いる。B)マカクT細胞株4119LnPxをエフェクター細胞として、カニクイザルEGFRvIIIでトランスフェクトされたCHO細胞を標的細胞として用いる。このアッセイは実施例26.3で述べるようにして実施する。
[図41a]指定の種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの、ヒトIgEでトランスフェクトされたJ558L細胞、ヒトCD3+T細胞株HPB‐ALL、マカクIgEでトランスフェクトされたJ558L細胞、及びマカクT細胞株4119LnPxに対するFACS結合分析を示す図である。FACS染色は実施例27.2で述べるようにして実施する。太線は、指定の種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトでトランスフェクトされたCHO細胞の細胞培養物の上清と共にインキュベートされ、続いて抗his抗体及び
PE標識検出抗体と共にインキュベートされた細胞を表す。細線のヒストグラムは、ネガティブコントロール:抗his抗体及び検出抗体と共にインキュベートされただけである細胞を表す。
[図41b]指定の種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの、ヒトIgEでトランスフェクトされたJ558L細胞、ヒトCD3+T細胞株HPB‐ALL、マカクIgEでトランスフェクトされたJ558L細胞、及びマカクT細胞株4119LnPxに対するFACS結合分析を示す図である。FACS染色は実施例27.2で述べるようにして実施する。太線は、指定の種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトでトランスフェクトされたCHO細胞の細胞培養物の上清と共にインキュベートされ、続いて抗his抗体及びPE標識検出抗体と共にインキュベートされた細胞を表す。細線のヒストグラムは、ネガティブコントロール:抗his抗体及び検出抗体と共にインキュベートされただけである細胞を表す。
[図41c]指定の種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの、ヒトIgEでトランスフェクトされたJ558L細胞、ヒトCD3+T細胞株HPB‐ALL、マカクIgEでトランスフェクトされたJ558L細胞、及びマカクT細胞株4119LnPxに対するFACS結合分析を示す図である。FACS染色は実施例27.2で述べるようにして実施する。太線は、指定の種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトでトランスフェクトされたCHO細胞の細胞培養物の上清と共にインキュベートされ、続いて抗his抗体及びPE標識検出抗体と共にインキュベートされた細胞を表す。細線のヒストグラムは、ネガティブコントロール:抗his抗体及び検出抗体と共にインキュベートされただけである細胞を表す。
[図42a]示した標的細胞株へ再指向された指定の種間特異的単鎖コンストラクトによって誘発された細胞障害活性を示す図である。A)刺激されたCD4−/CD56−ヒトPBMCをエフェクター細胞として、ヒトIgEでトランスフェクトされたJ558L細胞を標的細胞として用いる。B)マカクT細胞株4119LnPxをエフェクター細胞として、マカクIgEでトランスフェクトされたJ558L細胞を標的細胞として用いる。このアッセイは実施例27.2で述べるようにして実施する。
[図42b]示した標的細胞株へ再指向された指定の種間特異的単鎖コンストラクトによって誘発された細胞障害活性を示す図である。A)刺激されたCD4−/CD56−ヒトPBMCをエフェクター細胞として、ヒトIgEでトランスフェクトされたJ558L細胞を標的細胞として用いる。B)マカクT細胞株4119LnPxをエフェクター細胞として、マカクIgEでトランスフェクトされたJ558L細胞を標的細胞として用いる。このアッセイは実施例27.2で述べるようにして実施する。
[図42c]示した標的細胞株へ再指向された指定の種間特異的単鎖コンストラクトによって誘発された細胞障害活性を示す図である。A)刺激されたCD4−/CD56−ヒトPBMCをエフェクター細胞として、ヒトIgEでトランスフェクトされたJ558L細胞を標的細胞として用いる。B)マカクT細胞株4119LnPxをエフェクター細胞として、マカクIgEでトランスフェクトされたJ558L細胞を標的細胞として用いる。このアッセイは実施例27.2で述べるようにして実施する。
[図42d]示した標的細胞株へ再指向された指定の種間特異的単鎖コンストラクトによって誘発された細胞障害活性を示す図である。A)刺激されたCD4−/CD56−ヒトPBMCをエフェクター細胞として、ヒトIgEでトランスフェクトされたJ558L細胞を標的細胞として用いる。B)マカクT細胞株4119LnPxをエフェクター細胞として、マカクIgEでトランスフェクトされたJ558L細胞を標的細胞として用いる。このアッセイは実施例27.2で述べるようにして実施する。
[図42e]示した標的細胞株へ再指向された指定の種間特異的単鎖コンストラクトによって誘発された細胞障害活性を示す図である。A)刺激されたCD4−/CD56−ヒトPBMCをエフェクター細胞として、ヒトIgEでトランスフェクトされたJ558L細胞を標的細胞として用いる。B)マカクT細胞株4119LnPxをエフェクター細胞として、マカクIgEでトランスフェクトされたJ558L細胞を標的細胞として用いる。
このアッセイは実施例27.2で述べるようにして実施する。
[図42f]示した標的細胞株へ再指向された指定の種間特異的単鎖コンストラクトによって誘発された細胞障害活性を示す図である。A)刺激されたCD4−/CD56−ヒトPBMCをエフェクター細胞として、ヒトIgEでトランスフェクトされたJ558L細胞を標的細胞として用いる。B)マカクT細胞株4119LnPxをエフェクター細胞として、マカクIgEでトランスフェクトされたJ558L細胞を標的細胞として用いる。このアッセイは実施例27.2で述べるようにして実施する。
[図42g]示した標的細胞株へ再指向された指定の種間特異的単鎖コンストラクトによって誘発された細胞障害活性を示す図である。A)刺激されたCD4−/CD56−ヒトPBMCをエフェクター細胞として、ヒトIgEでトランスフェクトされたJ558L細胞を標的細胞として用いる。B)マカクT細胞株4119LnPxをエフェクター細胞として、マカクIgEでトランスフェクトされたJ558L細胞を標的細胞として用いる。このアッセイは実施例27.2で述べるようにして実施する。
[図43]指定の種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの、ヒトCD44でトランスフェクトされたCHO細胞、ヒトCD3+T細胞株HPB‐ALL、マカクCD44でトランスフェクトされたCHO細胞、及びマカクPBMCのそれぞれに対するFACS結合分析を示す図である。FACS染色は実施例28.6で述べるようにして実施した。太線は、5μg/mlの精製した二重特異性単鎖コンストラクトと共にインキュベートされた細胞を表す。黒塗りのヒストグラムはネガティブコントロールを表す。ネガティブコントロールには、2%FCSを含むPBSを用いた。種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの各々について、ヒストグラムのオーバーレイはヒト及びマカクCD44並びにヒト及びマカクCD3へのコンストラクトの特異的な結合を示している。
[図44]指定の種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの、v6エクソンが欠損したヒトCD44でトランスフェクトされたCHO細胞に対するFACS結合分析を示す図である。FACS染色は実施例28.6で述べるようにして実施する。CD44の発現のコントロールとして、v6エクソンが欠損したヒトCD44でトランスフェクトされたCHO細胞、及び完全長ヒトCD44でトランスフェクトされたCHO細胞を抗CD44抗体と共にインキュベートした。太線は、5μg/mlの精製した二重特異性単鎖コンストラクト、又は示した抗CD44抗体(5μg/ml)と共にインキュベートされた細胞を表す。黒塗りのヒストグラムはネガティブコントロールを表す。ネガティブコントロールには、2%FCSを含むPBSを用いた。種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの各々について、ヒストグラムのオーバーレイは、v6エクソンが欠損したヒトCD44へのコンストラクトの結合の欠如を示している。v6エクソンが欠損したヒトCD44でトランスフェクトされたCHO細胞上にCD44が存在することは、これらの細胞及び完全長ヒトCD44でトランスフェクトされた細胞に対する抗CD44抗体の結合が同等であることによって示された。FACS結合分析により、CD44のv6エクソンに対する種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの特異性が示された。
[図45]実施例28.1で述べるように、ヒトCD44でトランスフェクトされたCHO細胞へ再指向された指定の種間特異的CD44特異的単鎖コンストラクトによって誘発された細胞障害活性を測定するクロム放出アッセイの結果を示す図である。エフェクター細胞として、刺激されCD4及びCD56が除去されたヒトPBMCを10:1のE:T比で用いた。このアッセイは実施例28.7で述べるようにして実施する。この図より、各コンストラクトについて、ヒトCD44でトランスフェクトされたCHO細胞に対するヒトエフェクター細胞の細胞障害活性の強力な増加が示された。
[図46−1]指定の種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの、ヒトCD30でトランスフェクトされたCHO細胞、ヒトCD30+B細胞株MEC‐1、ヒトCD3+T細胞株HPB‐ALL、マカクCD30でトランスフェクトされたCHO細胞、及びマカクPBMCのそれぞれに対するFACS結合分析を示す図である。FACS染色は実施例29.5で述べるようにして実施した。太線は、5μg/mlの精製した二重特異性単鎖コンストラクトと共にインキュベートされた細胞を表す。黒塗りのヒストグラムはネガティ
ブコントロールを表す。ネガティブコントロールには、2%FCSを含むPBSを用いた。種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの各々について、ヒストグラムのオーバーレイは、ヒト及びマカクCD30並びにヒト及びマカクCD3へのコンストラクトの特異的な結合を示している。
[図46−2]指定の種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの、ヒトCD30でトランスフェクトされたCHO細胞、ヒトCD30+B細胞株MEC‐1、ヒトCD3+T細胞株HPB‐ALL、マカクCD30でトランスフェクトされたCHO細胞、及びマカクPBMCのそれぞれに対するFACS結合分析を示す図である。FACS染色は実施例29.5で述べるようにして実施した。太線は、5μg/mlの精製した二重特異性単鎖コンストラクトと共にインキュベートされた細胞を表す。黒塗りのヒストグラムはネガティブコントロールを表す。ネガティブコントロールには、2%FCSを含むPBSを用いた。種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの各々について、ヒストグラムのオーバーレイは、ヒト及びマカクCD30並びにヒト及びマカクCD3へのコンストラクトの特異的な結合を示している。
[図47]示した標的細胞株へ再指向された指定の種間特異的CD30特異性単鎖コンストラクトによって誘発された細胞障害活性を測定するクロム放出アッセイの結果を示す図である。示したエフェクター細胞も用いた。このアッセイは実施例29.6で述べるようにして実施した。この図より、各コンストラクトについて、ヒト及びマカクCD30に対して陽性である細胞それぞれに対するヒト及びマカクエフェクター細胞の細胞障害活性の強力な増加が明らかに示される。
[図48]指定の種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの、ヒトHER2でトランスフェクトされたCHO細胞、ヒトCD3+T細胞株HPB‐ALL、マカクHER2でトランスフェクトされたCHO細胞、及びマカクT細胞株4119LnPxのそれぞれに対するFACS結合分析を示す図である。FACS染色は実施例30.5で述べるようにして実施した。太線は、2μg/mlの精製した二重特異性単鎖コンストラクトと共にインキュベートされた細胞を表す。細線はネガティブコントロールを表す。ネガティブコントロールには、2%FCSを含むPBSを用いた。種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの各々について、ヒストグラムのオーバーレイは、ヒト及びマカクHER2並びにヒト及びマカクCD3へのコンストラクトの特異的な結合を示している。
[図49]示した標的細胞株へ再指向された指定の種間特異的HER2特異性単鎖コンストラクトによって誘発された細胞障害活性を測定するクロム放出アッセイの結果を示す図である。示したエフェクター細胞も用いた。このアッセイは実施例30.6で述べるようにして実施した。この図より、各コンストラクトについて、ヒト及びマカクHER2でトランスフェクトされたCHO細胞それぞれに対するヒト及びマカクエフェクター細胞の細胞障害活性の強力な増加が明らかに示される。
[図50]E292F3 HL×I2C HLと称する種間特異的二重特異性単鎖分子の精製をモニタリングするSDS PAGEゲル及びウエスタンブロットを示す図である。図
に示すように、溶離液からのサンプル、細胞培養物の上清(SN)、及びカラムのフロースルー(FT)を分析した。サイズのレファレンスとしてタンパク質マーカー(M)を適用した。SDSPAGEゲルにおける50及び60kDaの間の分子量の強いタンパク質バンドは、実施例31.2で述べる1段階の精製法によって非常に高い純度まで種間特異的二重特異性単鎖分子が効率的に精製されていることを示す。ヒスチジン6タグを検出す
るウエスタンブロットにより、溶離液中のタンパク質バンドがこの種間特異的二重特異性単鎖分子であることが確認される。さらに、この高感度な検出法においてフロースルーサンプルのシグナルが非常に弱いものであることは、この精製法によって二重特異性単鎖分子がほぼ完全に捕獲されることを示している。
[図51]V207C12 HL×H2C HLと称する種間特異的二重特異性単鎖分子の精製をモニタリングするSDS PAGEゲル及びウエスタンブロットを示す図である。
図に示すように、溶離液からのサンプル、細胞培養物の上清(SN)、及びカラムのフロースルー(FT)を分析した。サイズのレファレンスとしてタンパク質マーカー(M)を
適用した。SDSPAGEゲルにおける50及び60kDaの間の分子量の強いタンパク質バンドは、実施例31.2で述べる1段階の精製法によって非常に高い純度まで種間特異的二重特異性単鎖分子が効率的に精製されていることを示す。ヒスチジン6タグを検出
するウエスタンブロットにより、溶離液中のタンパク質バンドがこの種間特異的二重特異性単鎖分子であることが確認される。さらに、この高感度な検出法においてフロースルーサンプルのシグナルが非常に弱いものであることは、この精製法によって二重特異性単鎖分子がほぼ完全に捕獲されることを示している。
[図52]AF5HL×F12QHLと称する種間特異的二重特異性単鎖分子の精製をモニタリングするSDS PAGEゲル及びウエスタンブロットを示す図である。図に示す
ように、溶離液からのサンプル、細胞培養物の上清(SN)、及びカラムのフロースルー(FT)を分析した。サイズのレファレンスとしてタンパク質マーカー(M)を適用した。SDSPAGEゲルにおける50及び60kDaの間の分子量の強いタンパク質バンドは、実施例31.2で述べる1段階の精製法によって非常に高い純度まで種間特異的二重特異性単鎖分子が効率的に精製されていることを示す。ヒスチジン6タグを検出するウエ
スタンブロットにより、溶離液中のタンパク質バンドがこの種間特異的二重特異性単鎖分子であることが確認される。この高感度な検出法におけるフロースルーサンプル中のシグナルは、上清中の二重特異性単鎖分子の濃度が高いためにアフィニティカラムが飽和したことで説明される。
[図53]50%マカクザル血清中のAF5HL×I2CHLの標準曲線である。上側の図は実施例32.2で述べるアッセイに対して作成された標準曲線を示す。
下側の図は、50%マカクザル血清中のAF5HL×I2CHLの品質管理サンプルに対する結果を示す。高QC及び中QCサンプルに対する回収率は90%超であり、低QCサンプルに対しては80%超である。
従って、このアッセイにより、血清サンプル中のAF5HL×I2CHLに対して10ng/ml乃至200ng/mlの範囲(希釈前)の検出が可能である。
[図54]50%マカクザル血清中のMCSP‐G4 HL×I2C HLの標準曲線である。上側の図は実施例32.2で述べるアッセイに対して作成された標準曲線を示す。
下側のグラフは、50%マカクザル血清中のMCSP‐G4 HL×I2C HLの品質管理サンプルに対する結果を示す。高QC及び中QCサンプルに対する回収率は98%超であり、低QCサンプルに対しては85%超である。
従って、このアッセイにより、血清サンプル中のMCSP‐G4 HL×I2C HLに対して10ng/ml乃至200ng/mlの範囲(希釈前)の検出が可能である。
[図55]カニクイザルEpCAMに融合した指定の種のCD3イプシロンのN末端アミノ酸1‐27でトランスフェクトされたCHO細胞に対する抗Flag抗体のFACS結合分析を示す図である。FACS染色は実施例33.1で述べるようにして実施した。太線は、抗Flag抗体と共にインキュベートされた細胞を表す。黒塗りのヒストグラムはネガティブコントロールを表す。ネガティブコントロールには、2%FCSを含むPBSを用いた。ヒストグラムより、すべてのトランスフェクタントに対して抗Flag抗体の結合が強く同等であることが示され、このことは、トランスフェクトされたコンストラクトの発現が強く同等であることを示している。
[図56]カニクイザルEpCAMに融合した指定の種のCD3イプシロンのN末端アミノ酸1‐27を発現するCHO細胞に対するI2CIgG1コンストラクトのFACS結合分析を示す図である。FACS染色は実施例33.3で述べるようにして実施する。太線は、I2C IgG1コンストラクトを発現する細胞の細胞培養物の上清50μlと共
にインキュベートされた細胞を表す。黒塗りのヒストグラムはネガティブコントロールを表す。ネガティブコントロールには、カニクイザルEpCAMに融合したブタのCD3イプシロンのN末端アミノ酸1‐27を発現する細胞を用いた。ネガティブコントロールと比較して、ヒストグラムは、ヒト、マーモセット、タマリン、及びリスザルのCD3イプシロンのN末端アミノ酸1‐27に対してI2CIgG1コンストラクトが結合することを明らかに示している。
[図57]実施例6.1及び5.1でそれぞれ述べるN末端His6タグ付き及びタグ無しのヒトCD3に対する実施例33.2で述べるI2CIgG1コンストラクトのFACS結合分析を示す図である。太線は、図に示すように、抗ヒトCD3抗体UCHT‐1、ペンタ‐His抗体(Qiagen)、及びI2C IgG1コンストラクトを発現する
細胞の細胞培養物の上清のそれぞれと共にインキュベートされた細胞を表す。黒塗りのヒストグラムは、ネガティブコントロールとして関連性のないマウスIgG1抗体と共にインキュベートされた細胞を表す。
上段の2つのヒストグラムのオーバーレイは、アイソタイプコントロールと比較して、両方のトランスフェクタントに対するUCHT‐1抗体の結合が同等であることを表しており、両組み換えコンストラクトの発現を示している。中段の2つのヒストグラムのオーバーレイは、ペンタhis抗体が、His6‐ヒトCD3イプシロン鎖(His6‐CD3)を発現する細胞とは結合するが、野生型CD3イプシロン鎖(WT‐CD3)を発現する細胞とは結合しないことを示す。下段のヒストグラムのオーバーレイは、I2CIgG1コンストラクトが、野生型ヒトCD3イプシロン鎖とは結合するが、His6‐ヒトCD3イプシロン鎖とは結合しないことを示す。これらの結果から、種間特異的抗CD3結合分子I2CのCD3イプシロン鎖への結合には遊離のN末端が不可欠であることが示される。
[図58a]指定の種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの、ヒトMCSP D3で
トランスフェクトされたCHO細胞、ヒトCD3+T細胞株HPB‐ALL、マカクMCSPD3でトランスフェクトされたCHO細胞、及びマカクT細胞株4119LnPxのそれぞれに対するFACS結合分析を示す図である。FACS染色は実施例17で述べるようにして実施した。太線は、それぞれ、2μg/mlの精製した二重特異性単鎖コンストラクト、又は二重特異性単鎖コンストラクトを含む細胞上清と共にインキュベートされた細胞を表す。黒塗りのヒストグラムはネガティブコントロールを表す。T細胞株への結合についてのネガティブコントロールには、トランスフェクトされていないCHO細胞の上清を用いた。MCSPD3でトランスフェクトされたCHO細胞への結合についてのネガティブコントロールには、関連性のない標的特異性を有する単鎖コンストラクトを用いた。種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの各々について、ヒストグラムのオーバーレイは、ヒト及びマカクMCSPD3並びにヒト及びマカクCD3へのコンストラクトの特異的な結合を示している。
[図58b]指定の種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの、ヒトMCSP D3で
トランスフェクトされたCHO細胞、ヒトCD3+T細胞株HPB‐ALL、マカクMCSPD3でトランスフェクトされたCHO細胞、及びマカクT細胞株4119LnPxのそれぞれに対するFACS結合分析を示す図である。FACS染色は実施例17で述べるようにして実施した。太線は、それぞれ、2μg/mlの精製した二重特異性単鎖コンストラクト、又は二重特異性単鎖コンストラクトを含む細胞上清と共にインキュベートされた細胞を表す。黒塗りのヒストグラムはネガティブコントロールを表す。T細胞株への結合についてのネガティブコントロールには、トランスフェクトされていないCHO細胞の上清を用いた。MCSPD3でトランスフェクトされたCHO細胞への結合についてのネガティブコントロールには、関連性のない標的特異性を有する単鎖コンストラクトを用いた。種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの各々について、ヒストグラムのオーバーレイは、ヒト及びマカクMCSPD3並びにヒト及びマカクCD3へのコンストラクトの特異的な結合を示している。
[図58c]指定の種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの、ヒトMCSP D3で
トランスフェクトされたCHO細胞、ヒトCD3+T細胞株HPB‐ALL、マカクMCSPD3でトランスフェクトされたCHO細胞、及びマカクT細胞株4119LnPxのそれぞれに対するFACS結合分析を示す図である。FACS染色は実施例17で述べるようにして実施した。太線は、それぞれ、2μg/mlの精製した二重特異性単鎖コンストラクト、又は二重特異性単鎖コンストラクトを含む細胞上清と共にインキュベートされた細胞を表す。黒塗りのヒストグラムはネガティブコントロールを表す。T細胞株への結
合についてのネガティブコントロールには、トランスフェクトされていないCHO細胞の上清を用いた。MCSPD3でトランスフェクトされたCHO細胞への結合についてのネガティブコントロールには、関連性のない標的特異性を有する単鎖コンストラクトを用いた。種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの各々について、ヒストグラムのオーバーレイは、ヒト及びマカクMCSPD3並びにヒト及びマカクCD3へのコンストラクトの特異的な結合を示している。
[図58d]指定の種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの、ヒトMCSP D3で
トランスフェクトされたCHO細胞、ヒトCD3+T細胞株HPB‐ALL、マカクMCSPD3でトランスフェクトされたCHO細胞、及びマカクT細胞株4119LnPxのそれぞれに対するFACS結合分析を示す図である。FACS染色は実施例17で述べるようにして実施した。太線は、それぞれ、2μg/mlの精製した二重特異性単鎖コンストラクト、又は二重特異性単鎖コンストラクトを含む細胞上清と共にインキュベートされた細胞を表す。黒塗りのヒストグラムはネガティブコントロールを表す。T細胞株への結合についてのネガティブコントロールには、トランスフェクトされていないCHO細胞の上清を用いた。MCSPD3でトランスフェクトされたCHO細胞への結合について
のネガティブコントロールには、関連性のない標的特異性を有する単鎖コンストラクトを用いた。種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの各々について、ヒストグラムのオーバーレイは、ヒト及びマカクMCSPD3並びにヒト及びマカクCD3へのコンストラクトの特異的な結合を示している。
[図58e]指定の種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの、ヒトMCSP D3で
トランスフェクトされたCHO細胞、ヒトCD3+T細胞株HPB‐ALL、マカクMCSPD3でトランスフェクトされたCHO細胞、及びマカクT細胞株4119LnPxのそれぞれに対するFACS結合分析を示す図である。FACS染色は実施例17で述べるようにして実施した。太線は、それぞれ、2μg/mlの精製した二重特異性単鎖コンストラクト、又は二重特異性単鎖コンストラクトを含む細胞上清と共にインキュベートされた細胞を表す。黒塗りのヒストグラムはネガティブコントロールを表す。T細胞株への結合についてのネガティブコントロールには、トランスフェクトされていないCHO細胞の上清を用いた。MCSPD3でトランスフェクトされたCHO細胞への結合についてのネガティブコントロールには、関連性のない標的特異性を有する単鎖コンストラクトを用いた。種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの各々について、ヒストグラムのオーバーレイは、ヒト及びマカクMCSPD3並びにヒト及びマカクCD3へのコンストラクトの特異的な結合を示している。
[図58f]指定の種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの、ヒトMCSP D3で
トランスフェクトされたCHO細胞、ヒトCD3+T細胞株HPB‐ALL、マカクMCSPD3でトランスフェクトされたCHO細胞、及びマカクT細胞株4119LnPxのそれぞれに対するFACS結合分析を示す図である。FACS染色は実施例17で述べるようにして実施した。太線は、それぞれ、2μg/mlの精製した二重特異性単鎖コンストラクト、又は二重特異性単鎖コンストラクトを含む細胞上清と共にインキュベートされた細胞を表す。黒塗りのヒストグラムはネガティブコントロールを表す。T細胞株への結合についてのネガティブコントロールには、トランスフェクトされていないCHO細胞の上清を用いた。MCSPD3でトランスフェクトされたCHO細胞への結合についてのネガティブコントロールには、関連性のない標的特異性を有する単鎖コンストラクトを用いた。種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの各々について、ヒストグラムのオーバーレイは、ヒト及びマカクMCSPD3並びにヒト及びマカクCD3へのコンストラクトの特異的な結合を示している。
[図58g]指定の種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの、ヒトMCSP D3で
トランスフェクトされたCHO細胞、ヒトCD3+T細胞株HPB‐ALL、マカクMCSPD3でトランスフェクトされたCHO細胞、及びマカクT細胞株4119LnPxのそれぞれに対するFACS結合分析を示す図である。FACS染色は実施例17で述べるようにして実施した。太線は、それぞれ、2μg/mlの精製した二重特異性単鎖コンス
トラクト、又は二重特異性単鎖コンストラクトを含む細胞上清と共にインキュベートされた細胞を表す。黒塗りのヒストグラムはネガティブコントロールを表す。T細胞株への結合についてのネガティブコントロールには、トランスフェクトされていないCHO細胞の上清を用いた。MCSPD3でトランスフェクトされたCHO細胞への結合についてのネガティブコントロールには、関連性のない標的特異性を有する単鎖コンストラクトを用いた。種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの各々について、ヒストグラムのオーバーレイは、ヒト及びマカクMCSPD3並びにヒト及びマカクCD3へのコンストラクトの特異的な結合を示している。
[図58h]指定の種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの、ヒトMCSP D3で
トランスフェクトされたCHO細胞、ヒトCD3+T細胞株HPB‐ALL、マカクMCSPD3でトランスフェクトされたCHO細胞、及びマカクT細胞株4119LnPxのそれぞれに対するFACS結合分析を示す図である。FACS染色は実施例17で述べるようにして実施した。太線は、それぞれ、2μg/mlの精製した二重特異性単鎖コンストラクト、又は二重特異性単鎖コンストラクトを含む細胞上清と共にインキュベートされた細胞を表す。黒塗りのヒストグラムはネガティブコントロールを表す。T細胞株への
結合についてのネガティブコントロールには、トランスフェクトされていないCHO細胞の上清を用いた。MCSP D3でトランスフェクトされたCHO細胞への結合について
のネガティブコントロールには、関連性のない標的特異性を有する単鎖コンストラクトを用いた。種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの各々について、ヒストグラムのオーバーレイは、ヒト及びマカクMCSPD3並びにヒト及びマカクCD3へのコンストラクトの特異的な結合を示している。
[図58i]指定の種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの、ヒトMCSP D3で
トランスフェクトされたCHO細胞、ヒトCD3+T細胞株HPB‐ALL、マカクMCSPD3でトランスフェクトされたCHO細胞、及びマカクT細胞株4119LnPxのそれぞれに対するFACS結合分析を示す図である。FACS染色は実施例17で述べるようにして実施した。太線は、それぞれ、2μg/mlの精製した二重特異性単鎖コンストラクト、又は二重特異性単鎖コンストラクトを含む細胞上清と共にインキュベートされた細胞を表す。黒塗りのヒストグラムはネガティブコントロールを表す。T細胞株への結合についてのネガティブコントロールには、トランスフェクトされていないCHO細胞の上清を用いた。MCSPD3でトランスフェクトされたCHO細胞への結合についてのネガティブコントロールには、関連性のない標的特異性を有する単鎖コンストラクトを用いた。種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの各々について、ヒストグラムのオーバーレイは、ヒト及びマカクMCSPD3並びにヒト及びマカクCD3へのコンストラクトの特異的な結合を示している。
[図58j]指定の種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの、ヒトMCSP D3で
トランスフェクトされたCHO細胞、ヒトCD3+T細胞株HPB‐ALL、マカクMCSPD3でトランスフェクトされたCHO細胞、及びマカクT細胞株4119LnPxのそれぞれに対するFACS結合分析を示す図である。FACS染色は実施例17で述べるようにして実施した。太線は、それぞれ、2μg/mlの精製した二重特異性単鎖コンストラクト、又は二重特異性単鎖コンストラクトを含む細胞上清と共にインキュベートされた細胞を表す。黒塗りのヒストグラムはネガティブコントロールを表す。T細胞株への結合についてのネガティブコントロールには、トランスフェクトされていないCHO細胞の上清を用いた。MCSPD3でトランスフェクトされたCHO細胞への結合についてのネガティブコントロールには、関連性のない標的特異性を有する単鎖コンストラクトを用いた。種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの各々について、ヒストグラムのオーバーレイは、ヒト及びマカクMCSPD3並びにヒト及びマカクCD3へのコンストラクトの特異的な結合を示している。
[図58k]指定の種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの、ヒトMCSP D3で
トランスフェクトされたCHO細胞、ヒトCD3+T細胞株HPB‐ALL、マカクMCSPD3でトランスフェクトされたCHO細胞、及びマカクT細胞株4119LnPxの
それぞれに対するFACS結合分析を示す図である。FACS染色は実施例17で述べるようにして実施した。太線は、それぞれ、2μg/mlの精製した二重特異性単鎖コンストラクト、又は二重特異性単鎖コンストラクトを含む細胞上清と共にインキュベートされた細胞を表す。黒塗りのヒストグラムはネガティブコントロールを表す。T細胞株への結合についてのネガティブコントロールには、トランスフェクトされていないCHO細胞の上清を用いた。MCSPD3でトランスフェクトされたCHO細胞への結合についてのネガティブコントロールには、関連性のない標的特異性を有する単鎖コンストラクトを用いた。種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの各々について、ヒストグラムのオーバーレイは、ヒト及びマカクMCSPD3並びにヒト及びマカクCD3へのコンストラクトの特異的な結合を示している。
[図58l]指定の種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの、ヒトMCSP D3で
トランスフェクトされたCHO細胞、ヒトCD3+T細胞株HPB‐ALL、マカクMCSPD3でトランスフェクトされたCHO細胞、及びマカクT細胞株4119LnPxのそれぞれに対するFACS結合分析を示す図である。FACS染色は実施例17で述べるようにして実施した。太線は、それぞれ、2μg/mlの精製した二重特異性単鎖コンストラクト、又は二重特異性単鎖コンストラクトを含む細胞上清と共にインキュベートされた細胞を表す。黒塗りのヒストグラムはネガティブコントロールを表す。T細胞株への結合についてのネガティブコントロールには、トランスフェクトされていないCHO細胞の上清を用いた。MCSPD3でトランスフェクトされたCHO細胞への結合についてのネガティブコントロールには、関連性のない標的特異性を有する単鎖コンストラクトを用いた。種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの各々について、ヒストグラムのオーバーレイは、ヒト及びマカクMCSPD3並びにヒト及びマカクCD3へのコンストラクトの特異的な結合を示している。
[図59a]示した標的細胞株へ再指向された指定の種間特異的MCSP D3特異性単
鎖コンストラクトによって誘発された細胞障害活性示す図である。エフェクター細胞、及び標的に対するエフェクターの比も示したものを用いた。このアッセイは実施例18で述べるようにして実施する。この図より、各コンストラクトによる細胞障害活性の強力な種間特異的な増加が明らかに示される。
[図59b]示した標的細胞株へ再指向された指定の種間特異的MCSP D3特異性単
鎖コンストラクトによって誘発された細胞障害活性示す図である。エフェクター細胞、及び標的に対するエフェクターの比も示したものを用いた。このアッセイは実施例18で述べるようにして実施する。この図より、各コンストラクトによる細胞障害活性の強力な種間特異的な増加が明らかに示される。
[図59c]示した標的細胞株へ再指向された指定の種間特異的MCSP D3特異性単
鎖コンストラクトによって誘発された細胞障害活性示す図である。エフェクター細胞、及び標的に対するエフェクターの比も示したものを用いた。このアッセイは実施例18で述べるようにして実施する。この図より、各コンストラクトによる細胞障害活性の強力な種間特異的な増加が明らかに示される。
[図59d]示した標的細胞株へ再指向された指定の種間特異的MCSP D3特異性単
鎖コンストラクトによって誘発された細胞障害活性示す図である。エフェクター細胞、及び標的に対するエフェクターの比も示したものを用いた。このアッセイは実施例18で述べるようにして実施する。この図より、各コンストラクトによる細胞障害活性の強力な種間特異的な増加が明らかに示される。
[図60a]指定の種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの、ヒトCD33でトランスフェクトされたCHO細胞、ヒトCD3+T細胞株HPB‐ALL、マカクCD33でトランスフェクトされたCHO細胞、及びマカクPBMCのそれぞれに対するFACS結合分析を示す図である。FACS染色は実施例36.2で述べるようにして実施した。太線は、種間特異的二重特異性抗体コンストラクトを発現するトランスフェクトされた細胞の細胞培養物の上清と共にインキュベートされた細胞を表す。黒塗りのヒストグラムはネガティブコントロールを表す。ネガティブコントロールには、トランスフェクトされてい
ないCHO細胞の上清を用いた。種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの各々について、ヒストグラムのオーバーレイは、ヒト及びマカクCD33並びにヒト及びマカクCD3へコンストラクトが特異的に結合していることを示している。
[図60b]指定の種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの、ヒトCD33でトランスフェクトされたCHO細胞、ヒトCD3+T細胞株HPB‐ALL、マカクCD33でトランスフェクトされたCHO細胞、及びマカクPBMCのそれぞれに対するFACS結合分析を示す図である。FACS染色は実施例36.2で述べるようにして実施した。太線は、種間特異的二重特異性抗体コンストラクトを発現するトランスフェクトされた細胞の細胞培養物の上清と共にインキュベートされた細胞を表す。黒塗りのヒストグラムはネガティブコントロールを表す。ネガティブコントロールには、トランスフェクトされていないCHO細胞の上清を用いた。種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの各々について、ヒストグラムのオーバーレイは、ヒト及びマカクCD33並びにヒト及びマカクCD3へコンストラクトが特異的に結合していることを示している。
[図61]示した標的細胞株へ再指向された指定の種間特異的CD33特異性単鎖コンストラクトによって誘発された細胞障害活性を測定するクロム放出アッセイの結果を示す図である。エフェクター細胞も示したものを用いた。このアッセイは実施例36.3で述べるようにして実施する。この図より、各コンストラクトについて、ヒト及びマカクCD33でトランスフェクトされたCHO細胞のそれぞれに対するヒト及びマカクエフェクター細胞の細胞障害活性の強力な増加が明らかに示される。
[図62]PBS/5% HSA、及びPBS/5% HSAプラス単鎖EpCAM/CD3二重特異性抗体コンストラクトを、1.6、2.0、3.0、及び4.5μg/kgの投与量で週1回の静脈内ボーラス注入を行った場合のチンパンジーのT細胞再分布を示す図である。各ボーラス投与の注入時間は2時間とした。垂直の矢印はボーラス注入の開始を示す。各ボーラス投与の最初のデータポイントは、ボーラス注入開始直前のT細胞数を示す。従来のコンテクスト依存性CD3エピトープを認識する単鎖EpCAM/CD3二重特異性抗体コンストラクトの各ボーラス注入によってT細胞再分布のエピソードが引き起こされ、続いて次のボーラス注入の前にT細胞はベースライン値へ回復した。
[図63]選択されたクローンからのFlagタグscFvタンパク質断片を含む周辺質製剤のCD3特異的ELISA分析を示す図である。可溶性scFvタンパク質断片の周辺質製剤を、可溶性ヒトCD3イプシロン(aa1‐27)‐Fc融合タンパク質でコーティングしてPBS3%BSAでさらにブロックしておいたELISAプレートのウェルに添加した。検出は、モノクローナル抗Flag‐ビオチン標識抗体、続いてペルオキシダーゼ結合ストレプトアビジンで行った。ELISAの発色はABTS基質溶液で行った。OD値(y軸)は、ELISAリーダーにより405nmで測定した。x軸にクローン名を示す。
[図64]選択されたクローンからのFlagタグscFvタンパク質断片を含む周辺質製剤のCD3特異的ELISA分析を示す図である。図63と同じ可溶性scFvタンパク質断片の周辺質製剤を、可溶性ヒトCD3イプシロン(aa1‐27)‐Fc融合タンパク質ではなくhuIgG1(Sigma)でコーティングしてPBS中の3%BSAでブロックしておいたELISAプレートのウェルに添加した。
検出は、モノクローナル抗Flag‐ビオチン標識抗体、続いてペルオキシダーゼ結合ストレプトアビジンで行った。ELISAの発色はABTS基質溶液で行った。OD値(y軸)は、ELISAリーダーにより405nmで測定した。x軸にクローン名を示す。
[図65a]指定の種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの、ヒトCD44でトランスフェクトされたCHO細胞、ヒトCD3+T細胞株HPB‐ALL、マカクCD44でトランスフェクトされたCHO細胞、及びマカクT細胞株4119LnPxのそれぞれに対するFACS結合分析を示す図である。指定の種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトのCD44に対する特異性を強調するために、コントロールとしてヒトCD44delv6でトランスフェクトされたCHO細胞を用いた。FACS染色は実施例39.3で述べるようにして実施する。太線は、二重特異性単鎖コンストラクトを含む細胞上清と共に
インキュベートされた細胞を表す。黒塗りのヒストグラムはネガティブコントロールを表す。T細胞株への結合についてのネガティブコントロールには、トランスフェクトされていないCHO細胞の上清を用いた。CD44及びCD44delv6でトランスフェクトされたCHO細胞への結合についてのネガティブコントロールには、関連性のない標的特異性を有する単鎖コンストラクトを用いた。種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの各々について、ヒストグラムのオーバーレイは、ヒト及びマカクCD44並びにヒト及びマカクCD3へコンストラクトが特異的に結合していることを示している。各コンストラクトについてのヒストグラムのオーバーレイは、ヒトCD44delv6でトランスフェクトされたCHO細胞に対して特異的に結合していないことを示している。
[図65b]指定の種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの、ヒトCD44でトランスフェクトされたCHO細胞、ヒトCD3+T細胞株HPB‐ALL、マカクCD44でトランスフェクトされたCHO細胞、及びマカクT細胞株4119LnPxのそれぞれに対するFACS結合分析を示す図である。指定の種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトのCD44に対する特異性を強調するために、コントロールとしてヒトCD44delv6でトランスフェクトされたCHO細胞を用いた。FACS染色は実施例39.3で述べるようにして実施する。太線は、二重特異性単鎖コンストラクトを含む細胞上清と共にインキュベートされた細胞を表す。黒塗りのヒストグラムはネガティブコントロールを表す。T細胞株への結合についてのネガティブコントロールには、トランスフェクトされていないCHO細胞の上清を用いた。CD44及びCD44delv6でトランスフェクトされたCHO細胞への結合についてのネガティブコントロールには、関連性のない標的特異性を有する単鎖コンストラクトを用いた。種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの各々について、ヒストグラムのオーバーレイは、ヒト及びマカクCD44並びにヒト及びマカクCD3へコンストラクトが特異的に結合していることを示している。各コンストラクトについてのヒストグラムのオーバーレイは、ヒトCD44delv6でトランスフェクトされたCHO細胞に対して特異的に結合していないことを示している。
[図65c]指定の種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの、ヒトCD44でトランスフェクトされたCHO細胞、ヒトCD3+T細胞株HPB‐ALL、マカクCD44でトランスフェクトされたCHO細胞、及びマカクT細胞株4119LnPxのそれぞれに対するFACS結合分析を示す図である。指定の種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトのCD44に対する特異性を強調するために、コントロールとしてヒトCD44delv6でトランスフェクトされたCHO細胞を用いた。FACS染色は実施例39.3で述べるようにして実施する。太線は、二重特異性単鎖コンストラクトを含む細胞上清と共にインキュベートされた細胞を表す。黒塗りのヒストグラムはネガティブコントロールを表す。T細胞株への結合についてのネガティブコントロールには、トランスフェクトされていないCHO細胞の上清を用いた。CD44及びCD44delv6でトランスフェクトされたCHO細胞への結合についてのネガティブコントロールには、関連性のない標的特異性を有する単鎖コンストラクトを用いた。種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの各々について、ヒストグラムのオーバーレイは、ヒト及びマカクCD44並びにヒト及びマカクCD3へコンストラクトが特異的に結合していることを示している。各コンストラクトについてのヒストグラムのオーバーレイは、ヒトCD44delv6でトランスフェクトされたCHO細胞に対して特異的に結合していないことを示している。
[図65d]指定の種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの、ヒトCD44でトランスフェクトされたCHO細胞、ヒトCD3+T細胞株HPB‐ALL、マカクCD44でトランスフェクトされたCHO細胞、及びマカクT細胞株4119LnPxのそれぞれに対するFACS結合分析を示す図である。指定の種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトのCD44に対する特異性を強調するために、コントロールとしてヒトCD44delv6でトランスフェクトされたCHO細胞を用いた。FACS染色は実施例39.3で述べるようにして実施する。太線は、二重特異性単鎖コンストラクトを含む細胞上清と共にインキュベートされた細胞を表す。黒塗りのヒストグラムはネガティブコントロールを表す。T細胞株への結合についてのネガティブコントロールには、トランスフェクトされて
いないCHO細胞の上清を用いた。CD44及びCD44delv6でトランスフェクトされたCHO細胞への結合についてのネガティブコントロールには、関連性のない標的特異性を有する単鎖コンストラクトを用いた。種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの各々について、ヒストグラムのオーバーレイは、ヒト及びマカクCD44並びにヒト及びマカクCD3へコンストラクトが特異的に結合していることを示している。各コンストラクトについてのヒストグラムのオーバーレイは、ヒトCD44delv6でトランスフェクトされたCHO細胞に対して特異的に結合していないことを示している。
[図65e]指定の種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの、ヒトCD44でトランスフェクトされたCHO細胞、ヒトCD3+T細胞株HPB‐ALL、マカクCD44でトランスフェクトされたCHO細胞、及びマカクT細胞株4119LnPxのそれぞれに対するFACS結合分析を示す図である。指定の種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトのCD44に対する特異性を強調するために、コントロールとしてヒトCD44delv6でトランスフェクトされたCHO細胞を用いた。FACS染色は実施例39.3で述べるようにして実施する。太線は、二重特異性単鎖コンストラクトを含む細胞上清と共にインキュベートされた細胞を表す。黒塗りのヒストグラムはネガティブコントロールを表す。T細胞株への結合についてのネガティブコントロールには、トランスフェクトされていないCHO細胞の上清を用いた。CD44及びCD44delv6でトランスフェクトされたCHO細胞への結合についてのネガティブコントロールには、関連性のない標的特異性を有する単鎖コンストラクトを用いた。種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの各々について、ヒストグラムのオーバーレイは、ヒト及びマカクCD44並びにヒト及びマカクCD3へコンストラクトが特異的に結合していることを示している。各コンストラクトについてのヒストグラムのオーバーレイは、ヒトCD44delv6でトランスフェクトされたCHO細胞に対して特異的に結合していないことを示している。
[図66]示した標的細胞株へ再指向された指定の種間特異的CD44特異性単鎖コンストラクトによって誘発された細胞障害活性を示す図である。エフェクター細胞、及び標的に対するエフェクターの比も示したものを用いた。このアッセイは実施例39.4で述べるようにして実施する。この図より、各々の二重特異性コンストラクトによる細胞障害活性を媒介する効力が明らかに示される。
[図67]実施例41で述べる指定の種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトのFACS結合分析を示す図である。
[図68]実施例41で述べる指定の種間特異的結合分子によって誘発された細胞障害活性を示す図である。
以下の非ヒト霊長類、カリスリクス・ジャカス、サグイヌス・オイディプス及びサイミリ・シウレウスの血液サンプルを、CD3イプシロン同定に使用した。新鮮なヘパリン処理全血サンプルを、製造業者のプロトコルに従い(QIAampRNA Blood Mini Kit、Qiagen)トータル細胞RNAの単離のために調製した。抽出したm
RNAは、発表されているプロトコルに従いcDNAに転写した。簡単に言うと、10μlの沈殿したRNAを、1.2μlの10×ヘキサヌクレオチドミックス(Roche)と70℃で10分間インキュベートし、氷上で保存した。4μlの5×superscriptIIバッファ、0.2μlの0.1Mジチオスレイトール、0.8μlのsuperscript II(Invitrogen)、1.2μlのデソキシリボヌクレオシ
ド三リン酸(25μM)、0.8μlのRNaseInhibitor(Roche)及び1.8μlのDNase・RNaseフリーウォーター(Roche)からなる反応ミックスを加えた。反応ミックスを、室温で10分間インキュベートし、次いで42℃で5
0分間、90℃で5分間インキュベートした。反応を氷上で冷却してから、0.8μlのRNaseH(1U/μl、Roche)を加え、37℃で20分間インキュベートした。
CTGC−3'(配列番号377);リバースプライマー5'−CGGATGGGCTCATAGTCTG−3'(配列番号378)。増幅された550bpバンドをゲル精製し(
GelExtraction Kit、Qiagen)、配列決定した(Sequise
rve、Vaterstetten/ドイツ、配列表参照)。
ヌクレオチド
CAGGACGGTAATGAAGAAATGGGTGATACTACACAGAACCCATATAAAGTTTCCATCTCAGGAACCACAGTAACACTGACATGCCCTCGGTATGATGGACATGAAATAAAATGGCTCGTAAATAGTCAAAACAAAGAAGGTCATGAGGACCACCTGTTACTGGAGGACTTTTCGGAAATGGAGCAAAGTGGTTATTATGCCTGCCTCTCCAAAGAGACTCCCGCAGAAGAGGCGAGCCATTATCTCTACCTGAAGGCAAGAGTGTGTGAGAACTGCGTGGAGGTGGAT
QDGNEEMGDTTQNPYKVSISGTTVTLTCPRYDGHEIKWLVNSQNKEGHEDHLLLEDFSEMEQSGYYACLSKETPAEEASHYLYLKARVCENCVEVD
ヌクレオチド
CAGGACGGTAATGAAGAAATGGGTGATACTACACAGAACCCATATAAAGTTTCCATCTCAGGAACCACAGTAACACTGACATGCCCTCGGTATGATGGACATGAAATAAAATGGCTTGTAAATAGTCAAAACAAAGAAGGTCATGAGGACCACCTGTTACTGGAGGATTTTTCGGAAATGGAGCAAAGTGGTTATTATGCCTGCCTCTCCAAAGAGACTCCCGCAGAAGAGGCGAGCCATTATCTCTACCTGAAGGCAAGAGTGTGTGAGAACTGCGTGGAGGTGGAT
QDGNEEMGDTTQNPYKVSISGTTVTLTCPRYDGHEIKWLVNSQNKEGHEDHLLLEDFSEMEQSGYYACLSKETPAEEASHYLYLKARVCENCVEVD
ヌクレオチド
CAGGACGGTAATGAAGAGATTGGTGATACTACCCAGAACCCATATAAAGTTTCCATCTCAGGAACCACAGTAACACTGACATGCCCTCGGTATGATGGACAGGAAATAAAATGGCTCGTAAATGATCAAAACAAAGAAGGTCATGAGGACCACCTGTTAC
TGGAAGATTTTTCAGAAATGGAACAAAGTGGTTATTATGCCTGCCTCTCCAAAGAGACCCCCACAGAAGAGGCGAGCCATTATCTCTACCTGAAGGCAAGAGTGTGTGAGAACTGCGTGGAGGTGGAT
QDGNEEIGDTTQNPYKVSISGTTVTLTCPRYDGQEIKWLVNDQNKEGHEDHLLLEDFSEMEQSGYYACLSKETPTEEASHYLYLKARVCENCVEVD
2.1 異種可溶性タンパク質への融合による、そのナイーブCD3コンテクストから
分離されるCD3イプシロンのN末端を利用するマウスの免疫
balb/c x c57黒交配の10週齢のF1マウスを、ヒト及び/又はサイミリ・シウレウスの成熟CD3イプシロン鎖の最もN末端アミノ酸1−27を持つCD3イプシロンFc融合タンパク質(1−27CD3−Fc)で免疫した。このために、マウスあたり300μlのPBS中の40μgの1−27CD3Fc融合タンパク質を、10nmolのチオアート修飾CpG−オリゴヌクレオチド(5'−tccatgacgttcct
gatgct−3')とともに腹腔内に注射した。マウスには、21日後、42日後、任
意に63日後に追加免疫を同様に与えた。最初の追加免疫の10日後に、血液サンプルをとり、1−27CD3Fc融合タンパク質に対する抗体血清力価をELISAにより試験した。追加的に、CD3陽性ヒトT細胞株HPBallに対する力価も、標準プロトコルによりフローサイトメトリーで試験した。血清力価は、非免疫動物よりも免疫動物で著しく高かった。
リー及びファージディスプレイの構築
最後の注射の3日後、マウスの脾臓細胞を、標準プロトコルによりトータルRNAの調製のために摘出した。
プライマーを設計した。
CT;MVH2 GAG GTC CAG CTC GAG CAG TCT GGA CCT;
MVH3 CAGGTC CAA CTC GAG CAG CCT GGG GCT;MVH4
GAG GTT CAG CTC GAG CAG TCT GGG GCA;MVH5 GA(AG)GTG AAG CTC GAG GAG TCT GGA GGA;MVH6 GAG
GTG AAG CTT CTC GAG TCT GGA GGT;MVH7 GAAGTG
AAG CTC GAG GAG TCT GGG GGA;MVH8 GAG GTT CAG CTC GAG CAG TCT GGA GCT)をそれぞれ、1つの3'−VHプライマー(3'MuVHBstEll tga gga gac ggtgac cgt ggt ccc
ttg gcc cca g)と組み合わせた:VK鎖断片のPCR増幅のために、7つの異なる5'−VKファミリー特異性プライマー(MUVK1CCA GTT CCG AGC
TCG TTG TGA CTC AGG AAT CT;MUVK2 CCA GTT CCG
AGC TCG TGT TGA CGCAGC CGC CC;MUVK3 CCA GTT CCG AGC TCG TGC TCA CCC AGT CTC CA;MUVK4 CCA GTT CCG AGCTCC AGA TGA CCC AGT CTC CA;MUVK5
CCA GAT GTG AGC TCG TGA TGA CCC AGA CTC CA;MUVK6CCA GAT GTG AGC TCG TCA TGA CCC AGT CTC CA;MUVK7 CCA GTT CCG AGC TCG TGA TGA CACAGT CT
C CA)を、それぞれ、1つの3'−VKプライマー(3'MuVkHindIII/B
siW1tgg tgc act agt cgt acg ttt gat ctc aag ctt ggt ccc)と組み合わせた。
ンのライブラリーサイズを得た。表現型発現の1時間後、陽性形質転換体を、100mlの液体スーパーブロス(SB)培地中で一晩、pComb3H5BHisベクターによりコードされるカルベニシリン耐性に関して選択した。次いで、細胞を遠心分離により採取し、市販のプラスミド調製キット(Qiagen)を利用してプラスミド調製を実施した。
の総VH−VKscFv(単鎖可変断片)ライブラリーサイズを得た。
クローニングされたscFvレパートリーを持つファージライブラリーを、PEG8000/NaCl沈殿及び遠心分離によりそれぞれの培養上清から採取した。およそ1011から1012のscFvファージ粒子を、0.4mlのPBS/0.1%BSAに再懸濁し、105から107のJurkat細胞(CD3陽性ヒトT細胞株)と共に氷上で1時間ゆっくりと攪拌しながらインキュベートした。これらのJurkat細胞は、事前に、ウシ
胎児血清(10%)、グルタミン及びペニシリン/ストレプトマイシンを富化したRPMI培地中で生育し、遠心分離により採取し、PBSで洗浄して、PBS/1%FCS(アジ化ナトリウム含有)に再懸濁した。Jurkat細胞に特異的に結合しないscFvファージは、最大5回のPBS/1%FCS(アジ化ナトリウム含有)による洗浄工程により除去した。洗浄の後、細胞をHCl−グリシンpH2.2(10分間インキュベート、その後ボルテックス処理)に再懸濁して結合体を細胞から溶出し、2MのTris pH
12で中和の後、溶出液を、新鮮な未感染大腸菌XL1Blue培養液(OD600>0.5)の感染に使用した。ヒトscFv断片をコードする、ファージミドコピーによりうまくトランスフェクトされた大腸菌細胞を含む大腸菌培養液を、再びカルベニシリン耐性で選択し、次いでVCMS13ヘルパーファージに感染させて、抗体ディスプレイ及びインビトロ選択の第2ラウンドを開始した。通常、4から5ラウンドの選択を実施した。
4から5ラウンドのパニングに相当するプラスミドDNAを、選択の後大腸菌培養液から単離した。可溶性scFvタンパク質の産生のため、VH−VL−DNA断片をプラスミドから切除した(Xhol−Spel)。これらの断片を、元々のpComb3H5BHisとは、発現コンストラクト(例えばscFv)がscFvとHis6−タグの間にFlagタグ(TGDYKDDDDK)を含む点で異なるプラスミドpComb3H5BFlag/His中で、同じ制限部位によりクローニングし、追加のファージタンパク質を排除した。ライゲーションの後、プラスミドDNAの各プール(異なるパニングのラウンド)を、100μlヒートショックコンピテント大腸菌TG1又はXL1−Blue中に形質転換し、カルベニシリンLBアガーに播種した。単一のコロニーを100μlのLBcarb(50ug/ml)に選び入れた。
分な量産生する。好適なシグナル配列により、scFv鎖はペリプラズムにエクスポートされ、機能的コンフォメーションに折り畳まれる。
単離したscFvの結合を、真核細胞上でフローサイトメトリーにより試験したが、真核細胞は、その表面で、そのN末端でCD3イプシロンの最初の27N末端アミノ酸を提示する異種タンパク質を発現する。
は、サイミリ・シウレウス(リスザル)(CD3イプシロンN末端アミノ酸配列:QDGNEEIGDTTQNPYKVSISGTTVTLT)、カリスリクス・ジャカス(CD3イプシロンN末端アミノ酸配列:QDGNEEMGDTTQNPYKVSISGTTVTLT)及びサグイヌス・オイディプス(CD3イプシロンN末端アミノ酸配列:QDGNEEMGDTTQNPYKVSISGTTVTLT)に対して同様に調製した。
含む50μlのPBS中で5μg/mlの精製コンストラクトと共にインキュベートする。コンストラクトの結合は、2%FCSを含む50μlのPBS中で2μg/mlで抗His抗体(Penta−HisAntibody、BSA不含、Qiagen GmbH
、ヒルデン、ドイツ)により検出された。第2工程試薬として、2%FCSを含む50μl PBS中に1:100で希釈されたR−フィコエリスリン結合アフィニティ精製F(
ab')2断片、ヤギ抗マウスIgG(Fc−ガンマ断片特異性)(Dianova、ハ
ンブルグ、ドイツ)を使用した。サンプルを、FACSscan(BDbiosciences、ハイデルブルグ、ドイツ)で測定した。
マウス抗CD3scFvのVH領域を、ヒト抗体生殖細胞株アミノ酸配列に対して整列させた。非ヒトVHに最も近い相同性を有する、ヒト抗体生殖細胞株VH配列を選び、2つのアミノ酸配列の直接整列を実施した。ヒトVHフレームワーク領域とは異なる、非ヒトVHのフレームワーク残基が多くあった(「異なるフレームワーク位置」)。これらの残基のいくつかは、標的への抗体の結合及び活性に寄与しているかも知れない。
単離した。このようにして、十分なVHDNA断片を増幅した。このVH断片は、それぞれの異なるフレームワーク位置で、それぞれに異なる量のヒト及びマウス残基を有するVH断片のプールであった(ヒト化VHのプール)。同じ手順を、マウス抗CD3scFvのVL領域にも実施した(ヒト化VLのプール)。
の組換え融合タンパク質の生成(1−27CD3−Fc)
3.1 1−27CD−3Fcのクローニング及び発現
ヒト免疫グロブリンIgG1のヒンジ及びFcガンマ領域並びに6ヒスチジンタグに融合したヒトCD3イプシロン鎖の1−27N末端アミノ酸のコード配列は、標準プロトコルによる遺伝子合成により得た(組換え融合タンパク質のcDNA配列及びアミノ酸配列は、配列番号350及び349に記されている)。遺伝子合成断片は、コンストラクトの真核細胞発現のためのコザック部位をまず含み、次いで19アミノ酸免疫グロブリンリーダーペプチド、次いでフレームを合わせて成熟ヒトCD3イプシロン鎖の細胞外部分の最初の27アミノ酸のコード配列、次いでフレームを合わせてヒトIgG1のヒンジ領域及びFcガンマ部分のコード配列、次いでフレームを合わせて6ヒスチジンタグのコード配列及び終止コドンを含むように設計した(図1)。遺伝子合成断片は、融合タンパク質をコードするcDNAの最初及び最後に制限部位を導入するようにも設計した。導入された制限部位、5'末端でのEcoRI及び3'末端でのSallは、以下のクローニング手順で利用する。遺伝子合成断片を、標準プロトコルに従い、EcoRI及びSallによりpEF−DHFRと称されるプラスミド中にクローニングした(pEF−DHFRは、Macket al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 (1995) 7021−7025に記載されている)。配列実証済みプラスミドを、製造業者の
プロトコルに従い、FreeStyle293 Expression System(Invitrogen GmbH、カールスルーエ、ドイツ)でのトランスフェクションに
使用した。3日後、トランスフェクタントの細胞培養上清を採取し、ELISAアッセイで組換えコンストラクトの存在を試験した。ヤギ抗ヒトIgG、Fcガンマ断片特異性抗体(JacksonImmunoResearch Europe Ltd.ニューマーケット、サフォーク、英国から入手)をPBS中に希釈し5μg/mlとし、MaxiSorp 96ウェルELISAプレート(NuncGmbH & Co.KG、ヴィースバー
デン、ドイツ)にウェルあたり100μlで、4℃で一晩コーティングした。ウェルを、0.05%Tween20を含むPBS(PBS/Tween)で洗浄し、室温(RT)で60分間PBS中3%BSA(ウシアルブミン、V分画、Sigma−AldrichChemie GmbH、タウフキルヒェン、ドイツ)でブロックした。その後、ウェル
をPBS/Tweenで再び洗浄し、次いで60分間RTで細胞培養上清とともにインキュベートした。洗浄の後、ウェルを、1%BSAを含むPBSに1:500で希釈したペルオキシダーゼ結合抗His6抗体(RocheDiagnostics GmbH,R
oche Applied Science、マンハイム、ドイツ)とともに60分間RT
でインキュベートした。その後、ウェルを200μlのPBS/Tweenで洗浄し、100μlのSIGMAFASTOPD(SIGMAFAST OPD(o−フェニレンジ
アミンジヒドロクロライド)基質溶液(Sigma−Aldrich Chemie GmbH、タウフキルヒェン、ドイツ)を、製造業者のプロトコルに従い加えた。100μlの1MH2SO4を加えて反応を停止した。呈色反応を、PowerWaveXマイクロプレート分光光度計(BioTekInstruments,Inc、ウィヌースキ、バーモント州、米国)で、490nmで測定し、620nmでのバックグラウンド吸収を差し引いた。図2に示されるとおり、ネガティブコントロールとして使用した模擬トランスフェクションHEK293細胞の無関係な上清に比べ、コンストラクトの存在がはっきりと検出できた。
1−27CD3−Fcへの、CD3イプシロンに特異的なペリプラズム発現した異種間特異性単鎖抗体の粗調製物の結合を、ELISAアッセイで試験した。ヤギ抗ヒトIgG、Fc−ガンマ断片特異性抗体(JacksonImmunoResearch Eur
ope Ltd.ニューマーケット、サフォーク、英国)をPBS中に希釈し5μg/m
lとし、MaxiSorp 96ウェルELISAプレート(NuncGmbH & Co
.KG、ヴィースバーデン、ドイツ)にウェルあたり100μlで、4℃で一晩コーティングした。ウェルを、0.05%Tween20を含むPBS(PBS/Tween)で洗浄し、RTで60分間PBS中3%BSA(ウシアルブミン、V分画、Sigma−AldrichChemie GmbH、タウフキルヒェン、ドイツ)でブロックした。そ
の後、ウェルをPBS/Tweenで洗浄し、次いで60分間RTで1−27CD3−Fcコンストラクトを発現する細胞の上清とともにインキュベートした。ウェルを、PBS/Tweenで洗浄し、ペリプラズム発現した異種間特異性単鎖抗体の粗調製物とともに室温で60分間インキュベートした。PBS/Tweenで洗浄した後、ウェルを1%BSAを含むPBSに1:10000で希釈したペルオキシダーゼ結合抗FlagM2抗体(Sigma−Aldrich Chemie GmbH、タウフキルヒェン、ドイツ)とともに60分間RTでインキュベートした。その後、ウェルをPBS/Tweenで洗浄し、100μlのSIGMAFASTOPD(OPD(o−フェニレンジアミンジヒドロクロライド))基質溶液(Sigma−Aldrich Chemie GmbH、タウフキルヒェン、ドイツ)とともに、製造業者のプロトコルに従いインキュベートした。100μlの1MH2SO4を加えて呈色反応を停止し、PowerWaveXマイクロプレート分光光度計(BioTekInstruments,Inc、ウィヌースキ、バーモント州、米国)で、490nmで測定し、620nmでのバックグラウンド吸収を差し引いた。マウス抗CD3単鎖抗体に比べ、1−27CD3−Fcコンストラクトへの、CD3イプシロンに特異的な異種間特異性ヒト単鎖抗体の強い結合を観察した(図3)。
D3イプシロンのN末端アミノ酸1−27の組換え膜貫通型融合タンパク質の生成(1−27CD3−EpCAM)
4.1 1−27CD3−EpCAMのクローニング及び発現
異なる非チンパンジー霊長類(マーモセット、タマリン、リスザル)及びブタから、CD3イプシロンを単離した。Flagタグ付きカニクイザルEpCAMのN末端に融合した、成熟ヒト、コモンマーモセット(カリスリックス・ジャカス)、ワタボウシタマリン(サグイヌス・オイディプス)、コモンリスザル(サイミリ・シウレウス)及び家畜ブタ(サス・スクローファ、SusScrofa;ネガティブコントロールとして使用)のCD3イプシロン鎖の1−27N末端アミノ酸のコード配列を、標準プロトコルに従い、遺伝子合成により得た。組換え融合タンパク質のcDNA配列及びアミノ酸配列は、配列番号351から360に示されている。遺伝子合成断片は、第1に、標的発現ベクターにすでに存在する19アミノ酸免疫グロブリンリーダーペプチドのコード配列と正しいリーデ
ィングフレームでの融合を可能にするBsrGI部位を含むように、次いで、フレームを合わせて成熟CD3イプシロン鎖の細胞外部分のN末端1−27アミノ酸のコード配列を、次いで、フレームを合わせてFlagタグのコード配列を、次いで、フレームを合わせて、成熟カニクイザルEpCAM膜貫通型融合タンパク質のコード配列を含むように設計した(図4)。遺伝子合成断片を、融合タンパク質をコードするcDNAの末端に制限部位を導入するように設計した。導入された制限部位、5'末端でのBsrGI及び3'末端でのSallを、以下のクローニング手順に利用した。遺伝子合成断片を、BsrGI及びSallにより、標準プロトコルに従い、19アミノ酸免疫グロブリンリーダーペプチドのコード配列をすでに含む、pEF−DHFRと称されるプラスミドの誘導体中にクローニングした(pEF−DHFRは、Macket al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 (1995) 7021−7025に記載されている)。
g/mlで抗Flag M2抗体(Sigma−Aldrich ChemieGmbH、タウフキルヒェン、ドイツ)と共にインキュベートした。結合した抗体を、R−フィコエリスリン結合アフィニティ精製F(ab')2断片、2%FCSを含むPBS中で1:1
00のヤギ抗マウスIgG、Fc−ガンマ断片特異的(Jackson ImmunoR
esearchEurope Ltd.ニューマーケット、サフォーク、英国)により検
出した。サンプルを、FACSCalibur(BD biosciences、ハイデ
ルベルグ、ドイツ)で測定した。カニクイザルEpCAM及び、それぞれ、ヒト、マーモセット、タマリン、リスザル及びブタのCD3イプシロン鎖の1−27N末端アミノ酸からなるFlagタグ付き組換え膜貫通型融合タンパク質の、トランスフェクトされた細胞上での発現は、はっきりと検出可能であった(図5)。
カニクイザルEpCAMに融合した、それぞれヒト、マーモセット、タマリン及びリスザルCD3イプシロン鎖の1−27N末端アミノ酸への、ペリプラズム発現した異種間特異性抗CD3単鎖抗体の粗調製物の結合を、標準プロトコルに従いFACSアッセイで試験した。その目的のため、2.5×105の細胞を、ペリプラズム発現した異種間特異性
抗CD3単鎖抗体(上述のとおり、標準プロトコルに従い調製した)の粗調製物及びネガティブコントロールとしての単鎖マウス抗ヒトCD3抗体とともにインキュベートした。二次抗体として、Penta−His抗体(QiagenGmbH、ヒルデン、ドイツ)を、2%FCSを含む50μlPBS中で5μg/mlで使用した。抗体の結合は、2%FCSを含むPBS中に1:100で希釈されたR−フィコエリスリン結合アフィニティ精製F(ab')2断片、ヤギ抗マウスIgG、Fc−ガンマ断片特異的(Jackso
n ImmunoResearch Europe Ltd.、ニューマーケット、サフォ
ーク、英国)により検出した。サンプルを、FACSCalibur(BDbiosciences、ハイデルベルグ、ドイツ)で測定した。図6(AからE)に示されるとおり、カニクイザルEpCAMに融合した、それぞれヒト、マーモセット、タマリン及びリスザルのCD3イプシロンの1−27N末端アミノ酸からなる組換え膜貫通型タンパク質を発現するトランスフェクタントへの、単鎖抗体の結合が観察された。異種間特異性単鎖抗体の、ネガティブコントロールとして使用したカニクイザルEpCAMに融合したブタの1−27N末端CD3イプシロンからなる融合タンパク質への結合は全く見られなかった。抗CD3単鎖抗体の多霊長類異種間特異性が示された。抗FlagM2抗体と異種間特異性単鎖抗体で得られたシグナルは同等であり、異種間特異性単鎖抗体のCD3イプシロ
ンのN末端アミノ酸1−27への強い結合活性を示している。
ス細胞のアラニンスキャニングによる異種間特異性抗CD3単鎖抗体の結合分析
5.1 ヒト野生型CD3イプシロンのクローニング及び発現
ヒトCD3イプシロン鎖のコード配列は、標準プロトコルに従い遺伝子合成により得た(ヒトCD3イプシロン鎖のcDNA配列及びアミノ酸配列は、配列番号362及び361に記す)。遺伝子合成断片は、コンストラクトの真核細胞発現のためのコザック部位及びヒトCD3イプシロンをコードするcDNAの最初と最後に制限部位を含むように設計した。導入された制限部位、5'末端でのEcoRI及び3'末端でのSallを以下のクローニング手順で利用した。次いで、以下の標準プロトコルに従い、pEFNEOと称されるプラスミド中で、EcoRI及びSallにより、遺伝子合成断片をクローニングした。pEF NEOは、pEF−DHFR(Mack et al. Proc.Natl.
Acad. Sci. USA 92 (1995) 7021−7025)から、従来の分子クローニングにより、DHFRのcDNAをネオマイシン耐性のcDNAに置換することにより誘導した。配列実証済みプラスミドを使用して、10%FCS、1%ペニシリン/ストレプトマイシン、1%HEPES、1%ピルビン酸、1%非必須アミノ酸(全て、BiochromAG、ベルリン、ドイツ)を補った安定化Lグルタミンを含むRPMI中で、37℃、湿度95%、CO27%で培養したマウスT細胞株EL4(ATCCNo
.TIB−39)にトランスフェクトした。トランスフェクションは、SuperFect Transfection Reagent(Qiagen GmbH、ヒルデン、ド
イツ)及び2μgのプラスミドDNAにより、製造業者のプロトコルに従って実施した。24時間後、細胞をPBSで洗浄し、再び上述の細胞培養培地で、選択のために600μg/mlのG418(PAALaboratories GmbH、パッシング、オース
トリア)とともに培養した。トランスフェクションの16から20日後に、耐性細胞の増殖が観察された。さらに7から14日後、標準プロトコルに従い、ヒトCD3イプシロンの発現に関して、FACS分析により細胞を試験した。2.5×105の細胞を、2%F
CSを含むPBS中で5μg/mlで、抗ヒトCD3抗体UCHT−1(BD bios
ciences、ハイデルベルグ、ドイツ)と共にインキュベートした。抗体の結合は、2%FCSを含むPBS中に1:100で希釈されたR−フィコエリスリン結合アフィニティ精製F(ab')2断片、ヤギ抗マウスIgG、Fc−ガンマ断片特異的(Jack
son ImmunoResearch Europe Ltd.、ニューマーケット、サ
フォーク、英国)により検出した。サンプルを、FACSCalibur(BDbiosciences、ハイデルベルグ、ドイツ)で測定した。トランスフェクトされたEL4細胞上での、ヒト野生型CD3イプシロンの発現が図7に示されている。
異種間特異性抗CD3単鎖抗体の結合を検出する改善された手段を提供するために、H2C HLP、A2J HLP及びE2M HLPを、マウスIgG1及びヒトラムダ定常
部とともにIgG1抗体中に変換した。それぞれのIgG抗体の重鎖及び軽鎖をコードするcDNA配列は、標準プロトコルに従い、遺伝子合成により得た。各特異性の遺伝子合成断片は、まず、コンストラクトの真核細胞発現を可能にするコザック部位を含むように、次いで、19アミノ酸免疫グロブリンリーダーペプチド(配列番号364及び363)を、次いで、フレームを合わせて、それぞれの重鎖可変領域又はそれぞれの軽鎖可変領域のコード配列を、次いで、フレームを合わせて、それぞれ、マウスIgG1の重鎖定常領域のコード配列(配列番号366及び365)又はヒトラムダ軽鎖定常領域のコード配列(配列番号368及び367)を含むように設計した。制限部位は、融合タンパク質をコードするcDNAの最初と最後に導入した。制限部位、5'末端でのEcoRI及び3'末端でのSallを以下のクローニング手順に利用した。遺伝子合成断片は、標準プロトコルに従い、EcoRI及びSallにより、重鎖コンストラクト用にpEFDHFR(M
ack et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 (19
95) 7021−7025)と称されるプラスミド中に、軽鎖コンストラクト用にはp
EFADA(pEF ADAは、Raum et al., Cancer Immunol Immunother., 50(3), (2001), 141−150に記載されて
いる)と称されるプラスミド中にクローニングした。配列実証済みプラスミドを、製造業者のプロトコルに従い、FreeStyle293 Expression System(Invitrogen GmbH、カールスルーエ、ドイツ)中で、それぞれの軽鎖及
び重鎖コンストラクトの同時導入に使用した。3日後、トランスフェクタントの細胞培養上清を採取し、アラニンスキャニング実験に使用した。
ーニング及び発現
ヒトCD3イプシロン鎖をコードする27cDNA断片であって、ヒトCD3イプシロンの野生型配列の1つのコドンを、成熟ヒトCD3イプシロン鎖の細胞外領域のアミノ酸1−27の各アミノ酸のアラニン(GCC)をコードするコドンに置換した断片を、遺伝子合成により得た。置換したコドンの他は、cDNA断片は、上述のヒト野生型CD3cDNA断片と同一であった。各コンストラクト中で、上述のヒト野生型CD3cDNA断片に比べ、1つのコドンのみを置換した。制限部位、EcoRI及びSallを、野生型コンストラクトに比べて同一の部位でcDNA断片中に導入した。全てのアラニンスキャニングコンストラクトを、pEFNEO中にクローニングし、配列実証済みプラスミドを、EL4細胞中にトランスフェクトした。トランスフェクション及びトランスフェクタントの選択は、上述のとおり実施した。その結果、発現したコンストラクトのパネルが得られ、ヒトCD3イプシロン鎖の第1アミノ酸、位置1でのグルタミン(Q、Gln)をアラニンに置換した。アラニンに置換された最後のアミノ酸は、成熟ヒト野生型CD3イプシロンの位置27でのスレオニン(T、Thr)である。グルタミン1からスレオニン27の間の各アミノ酸で、野生型アミノ酸をアラニンに置換した、それぞれのトランスフェクタントを生成した。
2)に記載されたキメラIgG抗体及びCD3イプシロンに特異的な異種間特異性単鎖抗体を、アラニンスキャニング実験で試験した。3)に記載されたヒトCD3イプシロンのアラニン変異体コンストラクトでトランスフェクトされたEL4細胞株への抗体の結合は、標準プロトコルに従い、FACSアッセイにより試験した。2.5×105のそれぞ
れのトランスフェクタントの細胞を、キメラIgG抗体を含む細胞培養上清50μl又はペリプラズム発現した単鎖抗体の粗調製物50μlとともにインキュベートした。ペリプラズム発現した単鎖抗体の粗調製物と共にインキュベートしたサンプルでは、抗FlagM2抗体(Sigma−Aldrich Chemie GmbH、タウフキルヒェン、ドイツ)を、二次抗体として、2%FCSを含む50μlPBS中で5μg/mlで使用した。キメラIgG抗体と共にインキュベートしたサンプルでは、二次抗体は必要なかった。全てのサンプルで、抗体分子の結合は、2%FCSを含むPBS中に1:100で希釈されたR−フィコエリスリン結合アフィニティ精製F(ab')2断片、ヤギ抗マウスI
gG、Fc−ガンマ断片特異的(Jackson ImmunoResearch Europe Ltd.、ニューマーケット、サフォーク、英国)により検出した。サンプルを
、FACSCalibur(BDbiosciences、ハイデルベルグ、ドイツ)で測定した。ヒトCD3イプシロンのアラニン変異体によりトランスフェクトされたEL4細胞株への、キメラIgG分子又は異種間特異性単鎖抗体の異なる結合が検出された。ネガティブコントロールとして、アイソタイプコントロール又は関係ない特異性のペリプラズム発現した単鎖抗体の粗調製物をそれぞれ使用した。UCHT−1抗体を、ヒトCD3イプシロンのアラニン変異体の発現レベルのポジティブコントロールとして使用した。成熟CD3イプシロン鎖のアミノ酸、位置15でのチロシン、位置17でのバリン、位置1
9でのイソロイシン、位置24でのバリン又は位置26でのロイシンのアラニン変異体によりトランスフェクトされたEL4細胞株は、非常に低い発現レベルのため(データ示さず)評価しなかった。異種間特異性単鎖抗体及びキメラIgGフォーマットの単鎖抗体の、ヒトCD3イプシロンのアラニン変異体によりトランスフェクトされたEL4細胞株への結合を、任意単位での相対結合と、全てのそれぞれの幾何平均蛍光サンプル値からそれぞれのネガティブコントロールの幾何平均蛍光値を引いた値とともに、図8A−8Dに示す。発現レベルの違いを補償するため、あるトランスフェクタントの全サンプル値を、それぞれのトランスフェクタントのUCHT−1抗体の幾何平均蛍光値で割った。ある特異性の野生型サンプル値の比較のため、それぞれの特異性の全サンプル値を、野生型サンプル値で最終的に割り、野生型サンプル値を結合の任意単位1に設定した。利用した計算は、以下の式に詳細に示される。
[数1]
この式において、「サンプル値」は、図8Aから8Dに示される特定のアラニン変異体に対する特定の抗CD3抗体の結合の程度を示す任意単位の結合の値を意味し、「サンプル」は、特定のアラニンスキャニングトランスフェクタントにアッセイされた特定の抗CD3抗体で得られた幾何平均蛍光値を意味し、「ネガティブコントロール」は、特定のアラニン変異体にアッセイされたネガティブコントロールで得られた幾何平均蛍光値を意味し、UCHT−1は、特定のアラニン変異体にアッセイされたUCHT−1抗体で得られた幾何平均蛍光値を意味し、「野生型」は、野生型トランスフェクタントでアッセイされた特定の抗CD3抗体で得られた幾何平均蛍光値を意味し、xはそれぞれのトランスフェクタントを明示し、yはそれぞれの抗CD3抗体を明示し、wtはそれぞれのトランスフェクタントが野生型であることを明示する。
鎖のアミノ酸、位置4でのアスパラギン、位置23でのスレオニン、位置25でのイソロイシンに対して、著しい結合の低下を示した。IgG抗体A2JHLPの結合の完全な喪失が、成熟CD3イプシロン鎖のアミノ酸、位置1でのグルタミン、位置2でのアスパラギン酸、位置3でのグリシン及び位置5でのグルタミン酸に対して見られた。IgG抗体E2MHLPは、成熟CD3イプシロン鎖のアミノ酸、位置4でのアスパラギン、位置23でのスレオニン及び位置25でのイソロイシンに対して、著しい結合の低下を示した。IgG抗体E2MHLPは、成熟CD3イプシロン鎖のアミノ酸、位置1でのグルタミン、位置2でのアスパラギン酸、位置3でのグリシン及び位置5でのグルタミン酸に対して、結合の完全な喪失を示した。IgG抗体H2CHLPは、成熟CD3イプシロン鎖のアミノ酸、位置4でのアスパラギンに対して中程度の結合の低下を示し、成熟CD3イプシロン鎖のアミノ酸、位置1でのグルタミン、位置2でのアスパラギン酸、位置3でのグリシン及び位置5でのグルタミン酸に対して、結合の完全な喪失を示した。単鎖抗体F12QHLPは、成熟CD3イプシロン鎖のアミノ酸、位置1でのグルタミン、位置2でのアスパラギン酸、位置3でのグリシン及び成熟CD3イプシロン鎖の位置5でのグルタミン酸に対して、基本的に完全な結合の喪失を示した。
6.1 N末端6ヒスチジンタグ(His6タグ)の付いたヒトCD3イプシロン鎖の
クローニング及び発現
N末端His6タグの付いたヒトCD3イプシロン鎖をコードするcDNA断片を遺伝子合成により得た。遺伝子合成断片は、まず、コンストラクトの真核細胞発現のためのコザック部位、次いで、フレームを合わせて、19アミノ酸免疫グロブリンリーダーペプチドのコード配列、次いで、フレームを合わせて、His6タグのコード配列、次いで、フレームを合わせて、成熟ヒトCD3イプシロン鎖のコード配列を含むように設計した(コンストラクトのcDNA配列及びアミノ酸配列は、配列番号380及び379に記す)。遺伝子合成断片は、cDNAの最初及び最後に制限部位を含むようにも設計した。導入された制限部位、5'末端でのEcoRI及び3'末端でのSallを、以下のクローニング手順で利用した。次いで、遺伝子合成断片を、EcoRI及びSallにより、標準プロトコルに従い、pEF−NEO(上述)と称されるプラスミド内にクローニングした。配列実証済みプラスミドを使用して、ネズミT細胞株EL4にトランスフェクトした。トランスフェクション及びトランスフェクタントの選択は、上述のとおり実施した。細胞培養の34日後、トランスフェクタントを、以下に記載されるアッセイに使用した。
、異種間特異性抗CD3結合分子H2C HLPの結合
CD3イプシロンに特異的な結合特異性H2C HLPを持つ、キメラIgG抗体を、
N末端His6タグの付いた、又は付いていないヒトCD3イプシロンへの結合に関して試験した。それぞれ、His6ヒトCD3イプシロン及び野生型ヒトCD3イプシロンによりトランスフェクトされたEL4細胞株への抗体の結合を、標準プロトコルに従いFACSアッセイにより試験した。2.5×105のトランスフェクタントの細胞を、キメラ
IgG抗体を含む細胞培養上清50μl又は2%FCSを含むPBS中の5μg/mlのそれぞれの対照抗体50μlとともにインキュベートした。ネガティブコントロールとして適当なアイソタイプコントロールを、又はコンストラクトの発現のポジティブコントロールとしてCD3特異性抗体UCHT−1をそれぞれ使用した。抗体の結合は、2%FCSを含むPBS中に1:100で希釈されたR−フィコエリスリン結合アフィニティ精製F(ab')2断片、ヤギ抗マウスIgG、Fc−ガンマ断片特異的(Jackson ImmunoResearch Europe Ltd.、ニューマーケット、サフォーク、英国)により検出した。サンプルを、FACSCalibur(BDbiosciences、ハイデルベルグ、ドイツ)で測定した。野生型ヒトCD3イプシロンにトランスフェクトされたEL4細胞株に比べ、N末端His6タグの付いたヒトCD3イプシロンへの、結合特異性H2CHLPを持つキメラIgGの結合の明らかな低下が検出された。これらの結果は、CD3イプシロンのフリーのN末端が、ヒトCD3イプシロン鎖への、異種間特異性抗CD3結合特異性H2CHLPの結合に必須であることを示した(図9)。
7.1 表面プラズモン共鳴測定
ヒトCD3イプシロン鎖のN末端のアミノ酸1−27への、完全に異種間特異的な二重特異性単鎖抗体EGFR−21−63 LH xH2C HLPの結合親和性を測定するた
め、ヒトIgG1のFc部に融合した成熟ヒトCD3イプシロン鎖のN末端アミノ酸1−27からなる組換え融合タンパク質(1−27CD3−Fc)で、表面プラズモン共鳴測定を実施した。このために、BiacoreCarboxymethyl−Dextran CM5チップ(Biacore、ウプサラ、スウェーデン)を、Biacore 2000(登録商標)システム(Biacore、ウプサラ、スウェーデン)に取り付けた。1フローセルを、N−(3−ジメチルアミノプロピル)−N'−エチルカルボジイミド塩
酸塩/N−ヒドロキシスクシンイミド溶液で、標準プロトコルに従い活性化した。融合タンパク質1−27CD3−Fcの溶液をその後加えると、Biacoreチップのデキス
トラン層へのタンパク質の安定な共有結合が生じた。結合していないタンパク質を徹底的な洗浄により除去し、次いで、エタノールアミン溶液の添加により、未反応の残存NHS活性化カルボキシ基をブロックした。カップリングの前のシグナルに比べ、応答単位として測定されるより高いシグナルにより、タンパク質カップリングの成功を確認した。対照セルを、タンパク質溶液を加えずに上述のとおり調製した。
ックフォード、イリノイ州、米国)中で、HBS−EPバッファ(Biacore、ウプサラ、スウェーデン)に対して徹底的に透析した。透析後のタンパク質濃度は、UV280nm吸収により測定し、43μg/mlの濃度となった。
ナイーブヒトCD3への結合強度に関して種間特異的二重特異性抗体分子の親和性を試験するため、追加の飽和FACS結合分析を実施した。選択した二重特異性抗体分子EGFR−21−63LH x H2C HLPを使用し、1:1.5の係数及び出発濃度63.
3μg/mlで希釈列を設定した。二重特異性抗体分子を、これらの異なる濃度で、それぞれ1.25×105のヒトPBMCとともに4℃で1時間インキュベートし、次いで、
4℃でPBS中で2回洗浄した。結合した二重特異性抗体分子の検出は、Penta−His抗体(QiagenGmbH、ヒルデン、ドイツ)を、2%FCSを含む50μlPBS中で5μg/mlで使用して実施した。4℃で45分間インキュベーション及び2回の洗浄工程の後、Penta−His抗体の結合を、2%FCSを含むPBS中に1:100で希釈されたR−フィコエリスリン結合アフィニティ精製F(ab')2断片、ヤギ
抗マウスIgG、Fc−ガンマ断片特異性(Jackson ImmunoResear
ch Europe Ltd.、ニューマーケット、サフォーク、英国)により検出した。フローサイトメトリーは、FACS−CantoII装置で実施し、FACS Diva
ソフトウェアを利用して、データを取得し分析した(Becton Dickinson biosciences、ハイデルベルグ)。FACS染色及び蛍光強度の測定は、CurrentProtocols in Immunology(Coligan, Kru
isbeek, Margulies, Shevach and Strober,Wiley−lnterscience,2002)に記載のとおり実施した。取得した蛍光強度平均値を、使用した二重特異性抗体分子濃度の関数としてプロットし、生物数学ソフトウェアPrismにより、片側結合分析(双曲線)で分析した。ソフトウェアは、質量作用の法則に従う、リガンド(二重特異性抗体分子)のレセプター(CD3陽性PBMCサブフラクション)への結合を記載する、対応するKD値を計算した。基礎となる式は以下のとおりである:Y=Bmaxx X/(Kd+X)、ここでBmaxは最大結合である
。KDは、半最大結合に達するのに要するリガンドの濃度である。FACS染色は2連で
実施し、R2値は0.95より高かった。
FR−21−63 LH x H2C HLPの親和性と同等であることが証明された。
5'EGFR AG Xbal 5'−GGTCTAGAGCATGCGACCCTCCGG
GACGGCCGGG−3'
3'EGFR AG Sall 5'−TTTTAAGTCGACTCATGCTCCAAT
AAATTCACTGCT−3'
2001;50: 141−150)中にライゲーションし、大腸菌中に形質転換した。上述の手順を標準的なプロトコルに従い実施した(Sambrook,Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 3rd edition, Cold Spring Harbour LaboratoryPress, Col
d Spring Harbour, New York (2001))。配列実証済みヌ
クレオチド配列を持つクローン(配列番号370、アミノ酸配列番号369)を、コンストラクトの真核細胞発現のためにDHFR欠損CHO細胞中にトランスフェクトした。DHFR欠損CHO細胞中の真核細胞タンパク質発現は、KaufmannR.J. (1
990) Methods Enzymol. 185, 537−566により記載されるとおり実施した。コンストラクトの遺伝子増幅は、メトトレキサート(MTX)の濃度を20nMMTXまでの最終濃度に上昇させることにより誘導した。
カニクイザルEGFRの細胞外ドメインのcDNA配列を、以下の反応条件を利用し、カニクイザル結腸cDNA(カタログ番号C1534090−Cy−BC;BioCatGmbH、ハイデルベルグ、ドイツから入手)への1組の2つのPCRにより得た:94℃で3分間で1サイクル、次いで94℃で1分間で35サイクル、53℃で1分間及び72℃で2分間、次いで72℃で3分間で停止サイクル。以下のプライマーを使用した:
1.フォワードプライマー;5'−CGCTCTGCCCGGCGAGTCGGGC−3'リバースプライマー;5'−CCGTCTTCCTCCATCTCATAGC−3'
2.フォワードプライマー;5'−ACATCCGGAGGTGACAGATCACGG
CTCGTGC−3'
リバースプライマー;5'−CAGGATATCCGAACGATGTGGCGCCTT
CGC−3'
末端でのXbal及び3'末端でのSallを以下のクローニング手順に利用した。次い
で、遺伝子合成断片を、Xbal及びSallにより、pEF−DHFR(pEF−DHFRはMacket al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 (1995) 7021−7025に記載されている)と称されるプラスミド中にクロー
ニングした。このプラスミドの配列実証済みクローンを使用して、上述のとおりCHO/dhfr−細胞にトランスフェクトした。
10.1 異種間特異性結合分子のクローニング
一般的に、ヒト及び非チンパンジー霊長類CD3イプシロンに対して異種間特異的な結合特異性を有するドメイン並びにヒト及び非チンパンジー霊長類EGFRに対して異種間特異的な結合特異性を有するドメインをそれぞれ含む、二重特異性単鎖抗体分子を、以下の表1に記載のとおり設計した。
最後に好適な制限部位を導入するようにも設計した。導入された制限部位は、以下のクローニング手順で使用した。遺伝子合成断片は、好適なN及びC末端制限部位を導入するようにも設計した。遺伝子合成断片を、これらの制限部位により、標準プロトコルに従い(Sambrook、Molecular Cloning; A Laboratory Manual、 3rd edition、 Cold Spring Harbour LaboratoryPress, Cold Spring Harbour、 New Yor
k (2001))、pEF−DHFR(pEF−DHFRはRaum et al.、 CancerImmunol Immunother. 50(2001) 141−150
に記載されている)と称されるプラスミドにクローニングした。配列実証済みヌクレオチド配列を有するクローンを、コンストラクトの真核細胞発現のために、ジヒドロ葉酸還元酵素(DHFR)欠損チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞中にトランスフェクトした。
レクトロポレーションにより安定導入又は一過性導入し、或いは、標準プロトコルに従い一過性にHEK293(ヒト胎児由来腎臓細胞、ATCC番号CRL1573)にトランスフェクトした。
二重特異性単鎖抗体分子は、チャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO)中で発現した。DHFR欠損CHO細胞での真核生物タンパク質発現は、KaufmannR.J.
(1990) Methods Enzymol. 185, 537−566に記載されているとおり実施した。コンストラクトの遺伝子増幅は、MTXの最終濃度を20nMまで上昇させて誘導した。静置培養の2回の継代後、細胞を、ヌクレオシドを含まないHyQPH CHO液体大豆培地により(4.0mMのL−グルタミン及び0.1%のプルロニ
ックF−68、HyCloneを含む)回転瓶中で7日間生育してから、採取した。細胞を遠心分離により除去し、発現したタンパク質を含む上清を−20℃で保存した。或いは、コンストラクトを、HEK293細胞中で一過性発現させた。トランスフェクションは製造業者のプロトコルに従い、293fectin試薬(Invitrogen、12347−019番)により実施した。
ニティクロマトグラフィ(「IMAC」)を実施した。バッファA(20mMリン酸ナトリウムバッファ、pH7.2、0.1M NaCl)によりカラムを平衡化し、細胞培養
上清(500ml)を、3ml/分の流速で、カラム(10ml)に注いだ。カラムをバッファAで洗浄して結合してないサンプルを除いた。結合したタンパク質を、バッファB(20mMリン酸ナトリウムバッファ、pH7.2、0.1M NaCl、0.5M イミダゾール)の2段階勾配を利用して、以下のとおり溶離した:
工程1:6カラム容積の20%バッファB
工程2:6カラム容積の100%バッファB
取用カラム(GE/Amersham)で、ゲル濾過クロマトグラフィを実施した。溶離したタンパク質サンプル(流速1ml/分)を、検出のため、標準的なSDS−PAGE及びウェスタンブロットにかけた。精製の前に、分子量測定のために(分子量マーカーキット、Sigma、MWGF−200)カラムを平衡化した。タンパク質濃度は、OD280nmを利用して測定した。
びアルカリホスファターゼ(AP)標識ヤギ抗マウスIg(Sigma)及び基質としてのBCIP/NBT(Sigma)を作用させた。精製した二重特異性単鎖抗体に相当する52kDでシングルバンドを検出した。
完全に種間特異的二重特異性単鎖抗体の結合定数KDの決定
成熟ヒトCD3イプシロン鎖のN末端のアミノ酸1−27への、霊長類EGFR及び霊長類CD3に異種間特異的な二重特異性単鎖抗体分子の結合親和性を測定するため、表面プラズモン共鳴測定を、ヒトIgG1のFc部に融合したヒトCD3イプシロン鎖のN末端アミノ酸1−27からなる組換え融合タンパク質で実施した(1−27CD3−Fc)。このために、BiacoreCarboxymethyl−Dextran CM5チ
ップ(Biacore、ウプサラ、スウェーデン)を、Biacore 2000(登録
商標)システム(Biacore、ウプサラ、スウェーデン)に取り付けた。フローセルを、N−(3−ジメチルアミノプロピル)−N'−エチルカルボジイミド塩酸塩/N−ヒ
ドロキシスクシンイミド溶液で、標準プロトコルに従い活性化した。融合タンパク質1−27CD3−Fcの溶液をその後加えると、Boacoreチップのデキストラン層へのタンパク質の安定な共有結合が生じた。結合していないタンパク質を徹底的な洗浄により除去し、次いで、エタノールアミン溶液の添加により、未反応の残存NHS活性化カルボキシ基をブロックした。カップリングの前のシグナルに比べ、応答単位として測定されるより高いシグナルの検出により、タンパク質カップリングの成功を確認した。対照セルを、タンパク質溶液を加えずに上述のとおり調製した。
析
それぞれ、ヒト及びカニクイザルのEGFR及びCD3へ結合能に関して、種間特異的二重特異性抗体コンストラクトの機能性を試験するために、FACS分析を実施した。この目的のため、実施例8に記載したヒトEGFRによりトランスフェクトされたCHO細胞及びヒトCD3陽性T細胞白血病細胞株HPB−ALL(DSMZ、ブラウンシュヴァイク、ACC483)を使用し、ヒト抗原への結合を試験した。カニクイザル抗原の結合反応性は、実施例9に記載された生成したカニクイザルEGFRトランスフェクタント及びマカクザルT細胞株4119LnPx(Fickenscher教授による提供に感謝、HygieneInstitute, Virology, Erlangen−Nuernberg;Knappe A, et al., and Fickenscher H.,Blood2000,95,3256−61に発表)を使用して試験した。それぞれの細胞集団の20万の細胞を、種間特異的二重特異性抗体コンストラクト(2μg/ml)の精製タンパク質50μlとともに氷上で30分間インキュベートした。或いは、一過的に産生したタンパク質の細胞培養上清を使用した。細胞をPBSで2回洗浄し、コンストラクトの結合を、マウスPentaHis抗体(Qiagen;2%FCSを含む50μlPBSで1:20に希釈)により検出した。洗浄の後、結合した抗His抗体を、2%FCSを含むPBSに1:100で希釈された、フィコエリスリンに結合したFcガンマ特異性抗体(Dianova)により検出した。新鮮な培地をネガティブコントロールとして使用した。
ルグ)を利用してデータを取得し分析した。FACS染色及び蛍光強度の測定は、Current Protocols in Immunology(Coligan, Kruisbeek, Margulies, Shevach and Strober, Wil
ey−lnterscience, 2002)に記載のとおり実施した。
生成した二重特異性単鎖抗体の生理活性を、実施例8及び9に記載されたEGFR陽性細胞株を利用して、インビトロ細胞障害アッセイにおいてクロム51(51Cr)の放出により分析した。エフェクター細胞として、刺激を受けたヒトCD8陽性T細胞又はマカクT細胞株4119LnPxをそれぞれ使用した。
ペトリ皿(直径145mm、Greiner)を、市販の抗CD3特異性抗体により、最終濃度1μg/mlで1時間37℃でプレコートした。未結合のタンパク質を、PBSでの1洗浄工程で除去した。新鮮なPBMCを、標準プロトコルに従い、Ficoll勾配遠心分離により末梢血(30〜50ml、ヒトの血液)から単離した。3〜5×107
PBMCを、プレコートされたペトリ皿に、120mlのRPMI 1640/10% FCS/IL−2 20U/ml(Proleukin、Chiron)に加え、2日間刺
激した。3日目に、細胞を回収し、RPMI1640で1回洗浄した。IL−2を20
U/mlの最終濃度で加え、1日間再び培養した。CD4+T細胞及びCD56+NK細胞の除去により、CD8+細胞障害性Tリンパ球(CTL)を単離した。
ws(登録商標)用Prism4(バージョン4.02、GraphPad Softw
are Inc.、サンディエゴ、カリフォルニア州、米国)で実施した。S字状の用量
応答曲線のR2値は、該ソフトウェアにより測定して、通常0.90を超えた。分析プロ
グラムにより計算されたEC50値を、生理活性の比較に使用した。
及び発現
ヒトMCSPのC末端の膜貫通及び先端切断型細胞外ドメイン(アミノ酸1538〜2322)のコード配列を、標準プロトコルに従い遺伝子合成により得た(ヒトMCSP(
ヒトD3と称される)のC末端の、膜貫通及び先端切断型細胞外ドメインの発現のための組換えコンストラクトのcDNA配列及びアミノ酸配列は配列番号374及び373に記す)。遺伝子合成断片は、まず、コンストラクトの真核細胞発現を可能にするコザック部位、次いで、19アミノ酸免疫グロブリンリーダーペプチドのコード配列、次いで、フレームを合わせて、FLAGタグ、次いで、フレームを合わせて、クローニング目的のいくつかの制限部位を含み9アミノ酸人工リンカー(SRTRSGSQL)をコードする配列、次いで、フレームを合わせて、ヒトMCSPのC末端膜貫通及び先端切断型細胞外ドメインのコード配列及び終止コドンを含むように設計した。DNA断片の最初と最後に制限部位を導入した。制限部位、5'末端でのEcoRI及び3'末端でのSallを以下のクローニング手順で使用した。断片をEcoRI及びSallにより消化し、pEF−DHFR(pEF−DHFRはMacket al. Proc. Natl. Acad. S
ci. USA 92 (1995) 7021−7025に記載されている)に以下の標準プロトコルでクローニングした。配列実証済みプラスミドを使用し、CHO/dhfr−細胞(ATCCNo.CRL9096)にトランスフェクトした。細胞を、10%FCS、1%ペニシリン/ストレプトマイシン(全て、Biochrom AG、ベルリン、ド
イツから入手)及び細胞培養グレード試薬(Sigma−AldrichChemie
GmbH、タウフキルヒェン、ドイツ)のストック溶液から10μg/mlのアデノシン、10μg/mlのデオキシアデノシン及び10μg/mlのチミジンの最終濃度にヌクレオシドを補い安定化グルタミンを含むRPMI1640中で、37℃、湿度95%、CO27%でインキュベーター中で培養した。トランスフェクションは、PolyFect
Transfecton Reagent(Qiagen GmbH、ヒルデン、ドイツ)及び5μgのプラスミドDNAを製造業者のプロトコルに従い使用して実施した。24時間培養の後、細胞をPBSで1回洗浄し、安定化グルタミン及び1%ペニシリン/ストレプトマイシンを含むRPMI1640中で再び培養した。このように、細胞培地はヌクレオシドを含んでおらず、選択はトランスフェクトされた細胞に行われた。トランスフェクションのおよそ14日後、耐性細胞の増殖が観察された。さらに7から14日後、トランスフェクタントを、FACSによりコンストラクトの発現に関して試験した。2.5×105の細胞を、2%FCSを含むPBS中で5μg/mlに希釈された抗Flag M2抗体(Sigma−AldrichChemie GmbH、タウフキルヒェン、ドイツ)
50μlとともにインキュベートした。抗体の結合を、2%FCSを含むPBS中に1:100で希釈されたR−フィコエリスリン結合アフィニティ精製F(ab')2断片、ヤ
ギ抗マウスIgG、Fc−ガンマ断片特異的(ImmunoResearch Euro
pe Ltd.、ニューマーケット、サフォーク、英国)により検出した。サンプルを、
FACSCalibur(BDbiosciences、ハイデルベルグ、ドイツ)で測定した。
グ及び発現
マカクザルMCSP(マカクD3と称される)C末端の膜貫通及び先端切断型細胞外ドメインのcDNA配列を、以下の反応条件により、マカクザル皮膚cDNA(カタログ番号C1534218−Cy−BC;BioCatGmbH、ハイデルベルグ、ドイツ)への1組の3つのPCRにより得た:94℃で3分間で1サイクル、40サイクルを94℃で0.5分間、52℃で0.5分間、そして72℃で1.75分間、72℃で3分間の停止サイクル。以下のプライマーを使用した:
フォワードプライマー:5'−GATCTGGTCTACACCATCGAGC−3'
リバースプライマー:5'−GGAGCTGCTGCTGGCTCAGTGAGG−3'
フォワードプライマー:5'−TTCCAGCTGAGCATGTCTGATGG−3'
リバースプライマー:5'−CGATCAGCATCTGGGCCCAGG−3'
フォワードプライマー:5'−GTGGAGCAGTTCACTCAGCAGGACC−
3'
リバースプライマー:5'−GCCTTCACACCCAGTACTGGCC−3'
フォワードプライマー:5'−tcccgtacgagatctggatcccaatt
ggatggcggactcgtgctgttctcacacagagg−3'リバース
プライマー:5'−agtgggtcgactcacacccagtactggccat
tcttaagggcaggg−3'
nol Immunother. 50(2001) 141−150に記載されている)
のEcoRI/Mfel断片を含むBlueScriptプラスミド中にクローニングした。遺伝子合成断片は、免疫グロブリンリーダーペプチド及びFlagタグのコード配列並びにマカクザルMCSPのC末端膜貫通及び先端切断型細胞外ドメインをコードするcDNA断片の5'末端にフレームを合わせて人工リンカー(SRTRSGSQL)を含ん
でいた。このベクターを使用して、CHO/dhfr−細胞(ATCCNo.CRL 9
096)にトランスフェクトした。細胞を、10%FCS、1%ペニシリン/ストレプトマイシン(全て、Biochrom AG、ベルリン、ドイツから入手)及び細胞培養グ
レード試薬(Sigma−AldrichChemie GmbH、タウフキルヒェン、
ドイツ)のストック溶液から10μg/mlのアデノシン、10μg/mlのデオキシアデノシン及び10μg/mlのチミジンの最終濃度にヌクレオシドを補い安定化グルタミンを含むRPMI1640中で、37℃、湿度95%CO27%でインキュベーター中で
培養した。トランスフェクションは、PolyFectTransfecton Rea
gent(Qiagen GmbH、ヒルデン、ドイツ)及び5μgのプラスミドDNA
を製造業者のプロトコルに従い使用して実施した。24時間培養の後、細胞をPBSで1回洗浄し、安定化グルタミン及び1%ペニシリン/ストレプトマイシンを含むRPMI1640中で再び培養した。このように、細胞培地はヌクレオシドを含んでおらず、選択はトランスフェクトされた細胞に行われた。トランスフェクションのおよそ14日後、耐性細胞の増殖が観察された。さらに7から14日後、トランスフェクタントを、FACSにより組換えコンストラクトの発現に関して試験した。2.5×105の細胞を、2%FC
Sを含むPBS中で5μg/mlに希釈された抗Flag−M2抗体(Sigma−AldrichChemie GmbH、タウフキルヒェン、ドイツ)50μlとともにイン
キュベートした。結合した抗体を、2%FCSを含むPBS中に1:100で希釈されたR−フィコエリスリン結合アフィニティ精製F(ab')2断片、ヤギ抗マウスIgG、
Fc−ガンマ断片特異的(Jackson ImmunoResearch Europe
Ltd.、ニューマーケット、サフォーク、英国)により検出した。サンプルを、FA
CSCalibur(BDbiosciences、ハイデルベルグ、ドイツ)で測定した。
ヒト及び非チンパンジー霊長類CD3イプシロンに異種間特異的な結合ドメイン並びにヒト及び非チンパンジー霊長類MCSPに異種間特異的な結合ドメインをそれぞれ含む二重特異性単鎖抗体分子を、以下の表2に記載のとおり設計する。
VL)ドメイン及びヒト及びマカクザルCD3に異種間特異的なVH及びVLドメインを含む上述のコンストラクトを、遺伝子合成により得た。遺伝子合成断片を、まずコンスト
ラクトの真核細胞発現のためのコザック部位を含むように、次いで、19アミノ酸免疫グロブリンリーダーペプチドを、次いで、フレームを合わせて、それぞれの二重特異性単鎖抗体分子のコード配列を、次いで、フレームを合わせて、ヒスチジン6タグのコード配列
及び終止コドンを含むように、設計した。遺伝子合成断片を、好適なN末端及びC末端制限部位を導入するようにも設計した。遺伝子合成断片を、これらの制限部位により、pEF−DHFRと称されるプラスミド(pEF−DHFRは、Raumet al., Cancer Immunol Immunother., 50(2001) 141−150に記載されている)中に、標準プロトコルに従い(Sambrook,Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 3rd edition, Cold Spring Harbour LaboratoryPress, Col
d Spring Harbour, New York (2001))クローニングした
。コンストラクトを、エレクトロポレーションによりDHFR欠損CHO細胞(ATCCNo.CRL 9096)に安定導入又は一過性導入し、或いはHEK293(ヒト胎児
由来腎臓細胞、ATCC番号 CRL−1573)に標準プロトコルに従い一過性導入さ
せた。
れるとおりに実施した。コンストラクトの遺伝子増幅は、メトトレキサート(MTX)の濃度を、20nmのMTX最終濃度まで上昇することにより誘導した。静置培養の2回の継代後、細胞を、ヌクレオシドを含まないHyQPH CHO液体大豆培地により(4.
0mMのL−グルタミン及び0.1%のプルロニックF−68、HyCloneを含む)回転瓶中で7日間生育してから、採取した。細胞を遠心分離により除去し、発現したタンパク質を含む上清を−20℃で保存した。
ニティクロマトグラフィ(「IMAC」)を実施した。バッファA(20mMリン酸ナトリウムバッファ、pH7.2、0.1M NaCl)によりカラムを平衡化し、細胞培養
上清(500ml)を、3ml/分の流速で、カラム(10ml)に注いだ。カラムをバッファAで洗浄して結合してないサンプルを除いた。結合したタンパク質を、バッファB(20mMリン酸ナトリウムバッファ、pH7.2、0.1M NaCl、0.5M イミダゾール)の2段階勾配を利用して、以下のとおり溶離した:
工程1:6カラム容積の20%バッファB
工程2:6カラム容積の100%バッファB
取用カラム(GE/Amersham)で、ゲル濾過クロマトグラフィを実施した。溶離したタンパク質サンプル(流速1ml/分)を、検出のため、標準的なSDS−PAGE及びウェスタンブロットにかけた。精製の前に、分子量測定のために(分子量マーカーキット、Sigma、MWGF−200)カラムを平衡化した。タンパク質濃度は、OD280nmを利用して測定した。
ヤギ抗マウスIg抗体(Sigma)を二次抗体として使用し、基質としてBCIP/NBT(Sigma)を使用した。精製した二重特異性単鎖抗体に相当する52kDでシングルバンドを検出した。
ストレプトマイシン及び細胞培養グレード試薬(Sigma−AldrichChemie GmbH、タウフキルヒェン、ドイツ)のストック溶液から10μg/mlのアデノ
シン、10μg/mlのデオキシアデノシン及び10μg/mlのチミジンの最終濃度にヌクレオシドを補い安定化グルタミンを含む3mlのRPMI1640 all medium中で、37℃、湿度95%、CO27%でインキュベーター中で、トランスフェクシ
ョンの1日前に培養した。トランスフェクションは、製造業者のプロトコルに従い、Fugene6 Tranfection Reagent(Roche、番号11815091001)により実施した。94μlのOptiMEM培地(Invitrogen)及び6μlのFugene6を混合し、室温で5分間インキュベートする。その後、コンストラクト当たり1.5μgのDNAを加え、混合し、室温で15分間インキュベートした。その間、DHFR欠損CHO細胞を、1×PBSで洗浄し、1.5mlのRPMI1640 all mediumに再懸濁した。トランスフェクションミックスを、600μlのRPMI 1640 all mediumで希釈し、細胞に加え、37℃で、湿度95
%、CO27%で一晩インキュベートした。トランスフェクションの翌日、各アプローチ
のインキュベーション容積を5mlのRPMIall mediumに増量した。インキ
ュベーションの3日後に上清を採取した。
析
それぞれヒト及びマカクザルMCSP D3及びCD3に結合する能力に関して種間特
異的二重特異性抗体コンストラクトの機能性を試験するため、FACS分析を実施した。この目的のため、ヒトMCSPD3でトランスフェクトされたCHO細胞(実施例14に記載のとおり)及びヒトCD3陽性T細胞白血病細胞株HPB−ALL(DSMZ、ブラウンシュヴァイク、ACC483)を使用して、ヒト抗原への結合を試験した。マカクザル抗原への結合反応性は、生成したマカクザルMCSPD3トランスフェクタント(実施例15に記載のとおり)及びマカクザルT細胞株4119LnPx(Fickenscher教授による提供に感謝、Hygiene Institute,Virology, Erlangen−Nuernberg;Knappe A, et al., and F
ickenscher H.,Blood 2000,95,3256−61に発表)を使用して試験した。それぞれの細胞株の20万の細胞を、種間特異的二重特異性抗体コンス
トラクト(2μg/ml)の精製タンパク質50μl又は種間特異的二重特異性抗体コンストラクトを発現するトランスフェクトされた細胞の細胞培養上清とともに氷上で30分間インキュベートした。細胞を、2%FCSを含むPBSで2回洗浄し、コンストラクトの結合を、マウス抗His抗体(PentaHis抗体;Qiagen,2%FCSを含む50μlPBSで1:20に希釈)により検出した。洗浄の後、結合した抗His抗体を、2%FCSを含むPBSに1:100で希釈された、フィコエリスリンに結合したFcガンマ特異性抗体(Dianova)により検出した。トランスフェクトされていないCHO細胞の上清を、T細胞株への結合のネガティブコントロールとして使用した。無関係な標的特異性を持つ単鎖コンストラクトを、MCSP−D3にトランスフェクトされたCHO細胞への結合のネガティブコントロールとして使用した。
ルグ)を利用してデータを取得し分析した。FACS染色及び蛍光強度の測定は、Current Protocols in Immunology(Coligan, Kruisbeek, Margulies, Shevach and Strober, Wil
ey−lnterscience, 2002)に記載のとおり実施した。
に列記した単鎖分子の二重特異性結合は、図14、15、16及び58に示されるとおり、明らかに検出可能であった。FACS分析において、全コンストラクトが、それぞれのネガティブコントロールに比べ、CD3及びMCSP−D3への結合を示した。ヒト及びマカクザルCD3及びMCSPD3抗原に対する二重特異性抗体の異種間特異性が示された。
作製された二重特異性単鎖抗体の生物活性を、実施例14及び15で述べるMCSP
D3陽性細胞株を用いるクロム51(51Cr)放出インビトロ細胞障害性アッセイによって分析した。それぞれの図に示すように、エフェクター細胞としては、刺激されたヒトCD4/CD56除去PBMC、刺激されたヒトPBMC、又はマカクT細胞株4119LnPxを用いる。
ペトリ皿(直径145mm、Greiner bio‐one GmbH,クレムスミュンスター)のコーティングを、最終濃度1μg/mlの市販の抗CD3特異的抗体(例:OKT3,Othoclone)により37℃にて1時間行った。非結合タンパク質をPBSによる1段階の洗浄によって除去した。新鮮なPBMCを、Ficoll勾配遠心分離により標準的なプロトコルに従って末梢血液(30乃至50mlのヒト血液)から単離した。安定化グルタミン/10%FCS/IL‐220U/ml(Proleukin,Chiron)を含む120mlのRPMI1640中、3‐5×107個のPBMCをあ
らかじめコーティングしたペトリ皿に添加し、2日間刺激した。3日目に細胞を回収し、RPMI1640で1回洗浄した。IL‐2を添加して最終濃度を20U/mlとし、上記と同じ細胞培地中にて細胞を再度1日培養した。標準的なプロトコルに従ってCD4+T細胞及びCD56+NK細胞を除去することにより、CD8+細胞障害性Tリンパ球(CTLs)を濃縮した。
10:1で実施した。種間特異的二重特異性単鎖抗体分子1μg/ml及びその3倍希釈物20個を適用した。種間特異的二重特異性単鎖抗体分子を含む上清を用いる場合、マカク、及びヒト細胞障害性アッセイに対してそれぞれ、2倍希釈物21個、及び3倍希釈物20個を適用した。アッセイの時間は18時間とし、細胞障害性は、最大溶解(トリトンXの添加)と自然溶解(エフェクター細胞なし)との差に関連する上清中の放出されたクロムの相対値として測定した。測定はすべて4個の反復サンプルで行った。上清中のクロムの放射能の測定は、Wizard3"ガンマカウンター(Perkin Elmer L
ife Sciences GmbH,ケルン,ドイツ)を用いて実施した。実験データの解析は、Windows(登録商標)用Prism4(バージョン4.02、GraphPadSoftware Inc.,サンディエゴ,カリフォルニア州,米国)を用いて
実施した。このソフトウェアによって決定されるS字型用量反応曲線のR2値は、通常>
0.90である。この解析プログラムによって算出されるEC50値を用いて生物活性を比較した。
に対する細胞障害活性を示している。
作製された二重特異性単鎖抗体のヒト血漿中での安定性を、50%ヒト血漿中、37℃及び4℃にて24時間の二重特異性単鎖抗体のインキュベーション、及びこれに続く生物活性の試験を行うことによって分析した。生物活性は、MCSP陽性CHO細胞株(実施例14又は15に従い、クローンとしてMCSPを発現)を標的として、刺激されたヒトCD8陽性T細胞をエフェクター細胞として用いるクロム51(51Cr)放出インビトロ細胞障害性アッセイによって分析した。
‐L×H2C H‐L、及びG4 H‐L×F12QH‐Lの生物活性は、血漿を添加しない又は生物活性の試験の直前に血漿を添加したコントロールと比較して著しく低下するということはなかった。
従来のCD3結合分子による治療開始に続くB細胞非ホジキンリンパ腫(B‐NHL)の患者のT細胞再分布
従来のCD19×CD3結合分子は、二重特異性タンデムscFv型(bispecific tandem scFv format)のCD3結合分子である(Loffler
(2000, Blood, Volume 95, Number 6)、又は国際公開第
99/54440号)。これは、(i)正常及び悪性ヒトB細胞の表面上のCD19、並びに(ii)ヒトT細胞上のCD3に指向される2つの異なる結合部分から成る。T細胞上のCD3をB細胞上のCD19と架橋させることにより、このコンストラクトは、T細胞の細胞障害活性によって正常及び悪性B細胞の再指向された溶解を誘発する。そのような従来のCD3結合分子によって認識されるCD3エピトープは、CD3イプシロン鎖上に局在化しており、そこでは、イプシロン鎖の残りの部分内に埋め込まれてCD3ガンマ鎖又はデルタ鎖のいずれかとのイプシロン鎖のヘテロ二量体化によって正しい位置に保持される場合は、正しいコンフォメーションしか取れない。この非常にコンテクスト依存性であるエピトープと従来のCD3結合分子(例えば、Loffler(2000, Bl
ood, Volume 95, Number 6)、又は国際公開第99/54440号を参照)との相互作用は、完全に一価の形態で架橋をまったく伴わずに発生する場合であっても、CD3のコンフォメーションにアロステリックな変化を誘発し、CD3イプシロンの細胞質ドメイン内に通常は隠れているプロリンリッチ領域の露出を引き起こし得る。一旦露出されると、このプロリンリッチ領域はシグナル伝達分子Nck2を動員することができ、この分子はさらなる細胞内シグナルを誘発する能力を有する。これは、T細胞表面上のいくつかのCD3分子の架橋、例えば、B細胞の表面上のいくつかのCD19分子によるT細胞上のいくつかのCD3分子と結合したいくつかの抗CD3分子の架橋、を必ず必要とする完全なT細胞活性化には不十分ではあるが、それでも、従来のCD3結合分子とそのCD3イプシロン上のコンテクスト依存性エピトープとの完全に一価である相互作用は、シグナル伝達という点でT細胞に対して不活性ではない。理論に束縛されるものではないが、一価の従来のCD3結合分子(本技術分野で公知である)は、CD3架橋のための循環する標的細胞が存在しない場合であっても、ヒトに注入されるとある程度のT細胞の反応を誘発する場合がある。一価の従来のCD19×CD3結合分子を、実質的に循環するCD19陽性B細胞を持たないB‐NHL患者へ静脈内注入した場合のこれに対する重要なT細胞の反応は、治療開始後のT細胞の再分布である。フェーズI臨床試験では、CD19×CD3結合分子の静脈内注入の開始フェーズの間に、循環するCD19陽性標的B細胞を持たないすべての個人にこのT細胞の反応が発生し、これは実質的にCD19×CD3結合分子の投与量に依存しないことが分かった(図23)。しかし、CD19×CD3結合分子への曝露の急な増加が、治療開始時におけるCD19×CD3結合分子へのT細胞の最初の曝露とほぼ同一のT細胞の再分布反応をこれらの患者に引き起こすことが分かり(図24A)、そしてCD19×CD3結合分子への曝露のゆるやかな増加でさえも循環するT細胞への再分布効果を持ち得る(図25)。さらに、循環する標的細胞の非存在下におけるこの実質的に投与量に依存しないT細胞の再分布反応は、CD19×CD3結合分子(例:国際公開第99/54440号に開示のもの)のような従来のCD3結合分子により、治療を受けた全個人のうちの100%で引き起こされるため、治療の開始と関連する有害なイベントに対する主たるリスク因子であることが分かった。
は、参加するすべての施設の独立倫理委員会によって承認され、管轄の監督当局へ届けられた。CTスキャンによって実証される測定可能な疾患(≧1.5cmの病変部を少なくとも1つ)を持つことを研究に含める条件とした。患者は、携帯用ミニポンプシステムにより、従来のCD19×CD3結合分子を一定の流量(すなわち投与量レベル)にて4週間超にわたって連続静脈内注入された。患者は治療の最初の2週間は入院し、その後退院して自宅で治療を続けた。4週間後に疾患の進行の証拠が見られない患者は、さらに4週間の治療の継続が提供された。これまでのところ、最大耐投与量(MTD)には達しない6つの異なる投与量レベル、0.5、1.5、5、15、30、及び60μg/m2/2
4時間についての試験を行った。この研究プロトコルによってDLT(投与量規制毒性)として定義される有害なイベントが観察されなかった場合、コホートは各々3人の患者から構成した。最初の3人の患者のうち1人でDLTが見られた場合、コホートは患者6人に拡大し、2人目のDLTがない場合、ここで投与量をさらに増加させた。従って、患者3人のコホートでDLTが見られないか、又は患者6人のコホートでDLTが1人である投与量レベルを安全と見なした。研究治療はDLTを発症したすべての患者で停止した。15及び30μg/m2/24時間では、いくつかの追加のコホートにて最初の24時間
の治療開始モードを変えた試験:(i)最初の24時間の5μg/m2/24時間の後、
15μg/m2/24時間の維持投与量まで段階的に増加(患者コホート15‐ステップ
)、(ii)ほぼ0から15又は30μg/m2/24時間まで流量を均等に連続的に増
加(患者コホート15‐ランプ及び30‐ランプ)、並びに(iii)一番最初から維持投与量で開始(患者コホート15‐フラット、30‐フラット、及び60‐フラット)、を行った。投与量レベルが0.5、1.5、及び5μg/m2/24時間の患者コホート
は、すべて一番最初から維持投与量で開始した(すなわち、フラットな開始)。
患者コホート15‐ランプ、15‐フラット、30‐ランプ、30‐フラット、及び60‐フラットでは、血液サンプル(6ml)は、CD19×CD3結合分子(国際公開第99/54440号に開示)の注入前、及び注入開始後0.75、2、6、12、24、30、48時間、さらには治療の第8、15、17、22、24、29、36、43、50、57日、並びに従来のCD19×CD3結合分子注入終了の4週間後に、EDTA含有Vacutainer(商標)チューブ(BectonDickinson)を用いて採取し、4℃で分析へ送った。患者コホート15‐ステップでは、血液サンプル(6ml)は、CD19×CD3結合分子の注入前、及び注入開始後6、24、30、48時間、さらには治療の第8、15、22、29、36、43、50、57日、並びにCD19×CD3結合分子注入終了の4週間後に採取した。投与量レベル0.5、1.5、及び5μg/m2/24時間では、血液サンプル(6ml)は、CD19×CD3結合分子の注入
前、及び注入開始後6、24、48時間、さらには治療の第8、15、22、29、36、43、50、57日、並びにCD19×CD3結合分子注入終了の4週間後に採取した。作業上の理由からこれらの時間点が僅かに変更される場合もあった。リンパ球亜集団のFACS分析は、血液サンプル採取後24乃至48時間以内に実施した。血液サンプル中の白血球亜集団の絶対数は、CoulterCounter(商標)(Coulter)上での分画血液分析(differentialblood analysis)によっ
て測定した。
PBMC(末梢血液単核細胞)の単離は、Ficoll(商標)勾配分離プロトコルを適合させることで実施した。あらかじめBiocoll(商標)溶液(Biochrom)3mlを充填した10mlのLeucosep(商標)チューブ(Greiner)へ血
液を室温で移した。遠心分離は、スイングアウトローター(swing‐outrotor)により、1700×g及び22℃で15分間、減速なしで行った。Biocoll(商標)層の上にあるPBMCを単離し、FACSバッファー(PBS/2% FBS[ウ
シ胎仔血清;Biochrom])で1回洗浄し、遠心分離し、FACSバッファー中へ再懸濁した。すべての洗浄工程における遠心分離は、スイングアウトローターにより、800×g及び4℃で4分間行った。必要に応じて、単離したPBMCを3mlの赤血球溶解バッファー(8.29gNH4Cl、1.00g KHCO3、0.037gEDTA、
ad 1.0l H2Obidest、pH7.5)中にて5分間室温でインキュベートし、続い
てFACSバッファーで洗浄することにより赤血球の溶解を行った。
モノクローナル抗体をInvitrogen(1カタログ番号MHCD1301、2カタログ番号MHCD1401)、Dako(5カタログ番号C7224)、又はBecto
nDickinson(3カタログ番号555516、4カタログ番号345766)より入手し、製造元の推奨事項に従って使用した。5×105‐1×106個の細胞を以下の抗体の組み合わせによって染色した:抗CD131/抗CD142(FITC)×抗CD563(PE)×抗CD34(PerCP)×抗CD195(APC)。細胞をV字型96ウェ
ルマルチタイタープレート(Greiner)中でペレット化し、上清を除去した。細胞のペレットを、FACSバッファーで希釈した特異的な抗体を含む全量100μl中に再懸濁した。インキュベーションを暗所にて4℃で30分間行った。続いて、FACSバッファーでサンプルを2回洗浄し、フローサイトメトリー分析のために細胞ペレットをFACSバッファー中へ再懸濁した。
4色BD FACSCalibur(商標)(Becton Dickinson)を用いてデータの収集を行った。各測定について、同定されたリンパ球亜集団の1×104個
の細胞を得た。プログラムCellQuest Pro(商標)(Becton Dickinson)を用いて統計的解析を実施することにより、リンパ球亜集団のパーセントを得ると共に、細胞表面分子の発現強度を分類した。続いて、FACSによって測定された全リンパ球(すなわち、CD13/14染色によるいずれの骨髄系細胞も除いたBプラスTプラスNK細胞)に対する単一のリンパ球のサブセットのパーセントを分画血液分析からのリンパ球数と相関させることにより、T細胞(CD3+、CD56-、CD13/14-)及びB細胞(CD19+、CD13/14-)の絶対細胞数を算出した。
より実施した。すべての既知の病変(脾腫を含む)の消滅及び/又はサイズの正常化、プラス骨髄浸潤の場合は骨髄中のリンパ腫細胞のクリアランスを完全寛解(CR)とみなした。ベースラインである既定の各標的病変の2つの最大直径の積の総和(SPD)からの少なくとも50%の減少を部分寛解(PR)と定義し;少なくとも25%の減少を最小応答(MR)と見なした。進行性疾患(PD)は、ベースラインからのSPDの増加が≧50%と定義した。ベースラインからのSPDの偏差が+50%と−25%との間である状態を安定疾患(SD)と見なした。
時間からそれ以上では、末梢血液からの循環するCD19陽性B(リンパ腫)細胞の除去が一貫して観察された。15μg/m2/24時間及び30μg/m2/24時間で、最初の他覚的な臨床応答(PR及びCR)が記録され、さらにはBリンパ腫細胞が浸潤骨髄から部分的及び完全に除去されるケースもあった。最後に、60μg/m2/24時間では
、応答率は100%まで上昇し(PR及びCR)、評価可能なすべてのケースにおいて、骨髄中のBリンパ腫細胞のクリアランスは完全であった。
15μg/m2/24時間の維持投与量へ急に増加させた。対応するT細胞再分布パター
ンにより、5μg/m2/24時間での注入の開始と共に循環するT細胞数は急速に減少
し、続いて、実質的に循環するCD19陽性B細胞が存在しない循環血液中にT細胞が早期に再出現したことが分かる。結果として、CD19×CD3結合分子の投与量が24時間後に5から15μg/m2/24時間へ増加された際には、末梢T細胞数は完全に回復
していた。従って、図24Aに示すように、投与工程がT細胞再分布の第二のエピソードを引き起こすことが可能であった。この患者では、この繰り返されるT細胞再分布はCNS副作用(代表的な症状:錯乱及び見当識障害)と関連しており、このために注入が中止された。繰り返されるT細胞再分布とこのようなCNS有害イベントとの関係は、各々2乃至4時間のボーラス注入を、通常はこれに続いて2日間の治療を行わない間隔を置いて繰り返すことにより、CD19×CD3結合分子(例:国際公開第99/54440号に開示)の投与を受けたB‐NHLの患者での過去のフェーズI臨床試験でも観察された(図24B)。各回のボーラス注入すべてが、循環するT細胞数の急速な減少及び次のボーラス注入の前のT細胞の回復から成るT細胞再分布の1つのエピソードを引き起こした。まとめると、繰り返されるT細胞再分布と関連するCNS有害イベントは、21人の患者のうち5人で観察された。図24Bは、ボーラス注入試験において、第三のT細胞再分布エピソードの後にCNS症状を発症した1人の患者の代表的な例を示す。通常、ボーラス注入試験においてCNS有害イベントを起こした患者は、循環するB細胞数も低かった。
9×CD3結合分子の注入を受けた。その結果としての不均一な薬剤の流れによって1回のみではなく繰り返されるT細胞再分布のエピソードが引き起こされ(図27A)、CNS症状の発症により注入を中止しなければならない結果となった。しかし、同じ患者で、薬剤の安定化のためのHSAを追加して含有するCD19×CD3結合分子溶液(例:国際公開第99/54440号に開示)により正しく再開したところ、繰り返されるT細胞再分布は観察されず、この患者が再度CNS症状を発症することはなかった(図27B)。この患者も実質的に循環するB細胞を有していなかったため、観察されたように、薬剤への曝露の僅かな変化に対してさえも、循環するT細胞は急速な再分布動態で反応することが可能であった。実質的に循環する標的細胞を持たない患者におけるT細胞再分布と関連するCNS有害イベントは、内皮細胞へのT細胞の接着性の一時的な上昇、それに続く血管壁への循環するT細胞の同時発生的な大量の接着、そしてその結果としての観察されたような循環血液中のT細胞数の低下によって説明することができる。血管壁へのT細胞の同時発生的な大量の接着は、内皮透過性の上昇及び内皮細胞の活性化を引き起こすことができる。内皮透過性の上昇の結果、血管内コンパートメントからCNS間質を含む間質コンパートメントへ体液が移動する。T細胞の接着による内皮細胞の活性化は凝血促進効果をもたらすことができ(Monacoet al. J Leukoc Biol 71 (2002) 659‐668)、血流(脳血流を含む)の乱れを伴うことが、特に毛細血
管の微小循環に関して考えられる。従って、実質的に循環する標的細胞を持たない患者におけるT細胞再分布と関連するCNS有害イベントは、T細胞の内皮細胞への接着による毛細血管漏出及び/又は毛細血管の微小循環の乱れによる結果であり得る。T細胞再分布の1回のエピソードに起因する内皮ストレス(endothelialstress)に対しては、大部分の患者が耐容性を示すが、一方、繰り返されるT細胞再分布に起因する高められた内皮ストレスは、CNS有害イベントを引き起こすことが多い。T細胞再分布の2回以上のエピソードは、循環するT細胞のベースライン数が低い患者の場合にのみ、そのリスクが低い場合がある。しかし、T細胞再分布の1回のエピソードに起因する限定的な内皮ストレスも、CD19×CD3結合分子のボーラス注入試験における21人の患者のうちの1人で観察されたように、このようなイベントに対する感受性の高い稀なケースでは、CNS有害イベントを引き起こす場合がある。
aコホート4は、3種類の異なる治療開始スケジュールの研究のために拡大した。
b8週間の治療後はPRであるが、治療を行わない7週間の間隔を空けた後、同一の投与
量での4週間の追加の治療サイクル後にCRとなった。
n.e.:治療期間が7日未満のため評価不可。
n.d.:測定せず(浸潤していたが、治療の最後に第二の生検を実施せず)。
n.i.:治療開始時に浸潤していなかった。
標的抗原としてCD33を認識する本発明の二重特異性CD3結合分子は、カニクイザルの末梢血液から循環するCD33陽性単球を除去する。
CD33‐AF5 VH‐VL×I2C VH‐VL(アミノ酸配列:配列番号415)を、配列番号416のコードヌクレオチド配列を用いたCHO細胞内での発現によって産生させた。(i)コザック(Kozak)コンセンサス配列内に埋め込まれた開始コドンを含むN末端免疫グロブリン重鎖リーダーのコード配列、及び(ii)停止コドンが続くC末端His6タグのコード配列の両方を、配列番号416のヌクレオチド配列へフレーム
を揃えて結合し、その後、遺伝子合成によって得られたこのDNA断片を発現ベクターpEF‐DHFRのマルチクローニング部位へ挿入した(Raumet al. Cancer Immunol Immunother 50 (2001) 141‐150)。DH
FR欠失CHO細胞の安定なトランスフェクション、CD3結合分子CD33‐AF5VH‐VL×I2C VH‐VLを培養物の上清中へ分泌するDHFR陽性トランスフェク
タントの選択、及び発現レベルを高めるためのメトトレキサートによる遺伝子増幅は記述(Macket al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 (1995) 7021‐7025)に従って実施した。カニクイザルの処理のための試験物
質は、20リットルの発酵槽中で作製した。3回の作製工程の回収物からのタンパク質精製は、CD33‐AF5VH‐VL×I2C VH‐VLのC末端His6タグを標的と
するIMACアフィニティクロマトグラフィ、及びこれに続く分取用分子ふるいクロマトグラフィ(SEC)に基づいて行った。最終的な内毒素を含まない試験物質の総収量は60mgであった。カニクイザルに使用するためのCD33‐AF5VH‐VL×I2C
VH‐VLの分析用SECプロファイルより、この試験物質がほとんど単量体のみから構成されていることが分かった。この試験物質の効力は、カニクイザルCD33でトランスフェクトされたCHO細胞を標的細胞として、マカクT細胞株4119LnPxをエフェクター細胞源として用いた実施例23.5で述べる細胞障害性アッセイにより測定した(図29)。エフェクターT細胞による標的細胞溶解の最大半減に要するCD33‐AF5VH‐VL×I2C VH‐VLの濃度(EC50)は、2.7ng/mlであると測定
された。
を、種々の流量(すなわち投与量レベル)によるCD3結合分子CD33‐AF5VH‐VL×I2C VH‐VLの連続静脈内注入によって処理し、循環するCD33陽性単球
の末梢血液からの除去を調べた。この状況は、循環するCD19陽性標的B細胞を持つB‐NHL患者を従来のCD3結合分子CD19×CD3(B細胞上のCD19及びT細胞上のCD3に特異的)で治療するものと同等である(例えば、国際公開第99/5444
0号を参照)。末梢血液からの循環するCD19陽性標的B細胞の除去は、B‐NHLのようなCD19陽性B細胞マリグノーマ(malignomas)を持つ患者における従来のCD3結合分子(国際公開第99/54440号に記載のCD19×CD3)の一般的な臨床効果に対する有効なサロゲートであることが分かっている。同様に、循環するCD33陽性単球の末梢血液からの除去は、AML(急性骨髄性白血病)のようなCD33陽性骨髄性マリグノーマを持つ患者におけるCD33‐AF5VH‐VL×I2C VH
‐VLのような本発明のCD33指向性二重特異性CD3結合分子の一般的な臨床効果に対する有効なサロゲートであると見なされる。
べき個々の各投与量レベルに要する量(すなわち、CD33‐AF5 VH‐VL×I2
C VH‐VLの流量)で投与溶液へ添加することで開始した。注入リザーバーは、順応
及び処理の全フェーズを通して毎日取り替えた。予定された処理期間は7日間であったが、ただし、120μg/m2/24時間の投与量レベルについては動物に14日間の処理
を受けさせた。
血液サンプル(1ml)は、MCSP‐G4 VH‐VL×I2C VH‐VLの連続注入前、及び注入開始後0.75、2、6、12、24、30、48、72時間、並びに7及び14日間の処理の後(及び、120μg/m2/24時間の投与量レベルでは9日間
の処理の後)に、EDTA含有Vacutainer(商標)チューブ(Becton
Dickinson)を用いて採取し、4℃で分析へ送った。作業上の理由からこれらの時間点が僅かに変更される場合もあった。リンパ球亜集団のFACS分析は、血液サンプル採取後24乃至48時間以内に実施した。血液サンプル中の白血球亜集団の絶対数は、通常の獣医学研究室にて分画血液分析によって測定した。
PBMC(末梢血液単核細胞)の単離は、Ficoll(商標)勾配分離プロトコルを適合させることで実施した。あらかじめBiocoll(商標)溶液(Biochrom)1mlを充填した5mlのFalcon(商標)チューブへ血液を室温で移した。遠心分離は、スイングアウトローターにより、1700×g及び22℃で15分間、減速なしで行った。Biocoll(商標)層の上にあるPBMCを単離し、FACSバッファー(PBS/2%FBS[ウシ胎仔血清;Biochrom])で1回洗浄し、遠心分離し、FACSバッファー中へ再懸濁した。すべての洗浄工程における遠心分離は、スイングアウトローターにより、800×g及び4℃で4分間行った。必要に応じて、単離したPBMCを3mlの赤血球溶解バッファー(8.29gNH4Cl、1.00g KHCO3
、0.037gEDTA、ad 1.0l H2Obidest、pH7.5)中にて5分間室温
でインキュベートし、続いてFACSバッファーで洗浄することにより赤血球の溶解を行った。
カニクイザル抗原と反応性を持つモノクローナル抗体をBecton Dickins
on(1カタログ番号345784、2カタログ番号556647、3カタログ番号552
851、6カタログ番号557710)、BeckmanCoulter(4カタログ番号IM2470)、及びMiltenyi(5カタログ番号130‐091‐732)より
入手し、製造元の推奨事項に従って使用した。5×105‐1×106個の細胞を以下の抗体の組み合わせによって染色した:抗CD141(FITC)×抗CD562(PE)×抗CD33(PerCP)×抗CD194(APC)、及び抗CD141(FITC)×抗C
D335(PE)×抗CD166(Alexa Fluor 647(商標))。細胞をV字型96ウェルマルチタイタープレート(Greiner)中でペレット化し、上清を除去した。細胞のペレットを、FACSバッファーで希釈した特異的な抗体を含む全量100μl中に再懸濁した。インキュベーションを暗所にて4℃で30分間行った。続いて、FACSバッファーでサンプルを2回洗浄し、フローサイトメトリー分析のために細胞ペレットをFACSバッファー中へ再懸濁した。
4色BD FACSCalibur(商標)(Becton Dickinson)を用いてデータの収集を行った。各測定について、同定されたリンパ球亜集団の1×104個
の細胞を得た。プログラムCellQuest Pro(商標)(Becton Dickinson)を用いて統計的解析を実施することにより、リンパ球亜集団のパーセントを得ると共に、細胞表面分子の発現強度を分類した。続いて、FACSによって測定された全リンパ球(すなわち、CD14染色による骨髄系細胞を除いたBプラスTプラスNK細胞)に対する単一のリンパ球のサブセットのパーセントを分画血液分析からのリンパ球数と相関させることにより、T細胞(CD3+、CD56-、CD14-)の絶対細胞数を算
出した。CD33陽性単球の絶対数は、分画血液分析からの単球数を、FACSによって測定された全単球(CD14+)に対するCD33陽性単球(CD33+、CD14+)の
対応する比と掛け合わせることによって算出した。
循環するCD33陽性単球の絶対数のパーセントを図30Aに示す。
かったが、CD33陽性単球数の減少へ向かう最初の傾向は、60μg/m2/24時間
での7日間の処理後に明らかとなった。240μg/m2/24時間では、循環するCD
33陽性単球は、3日間の処理後に末梢血液からほぼ完全に除去された。1000μg/m2/24時間ではさらに素早くそこまで到達しており、循環するCD33陽性単球の末
梢血液からの除去は、1日の処理後にすでに完了していた。この発見は、CD33‐AF5VH‐VL×I2C VH‐VLを120μg/m2/24時間で14日間連続注入して処理した2匹のカニクイザルにおいて、循環するCD33陽性単球がそれぞれの対応するベースラインと比較して3分の2及び50%除去されたことを示す図30Bの結果によって確認された。
)の存在下でのCD33‐AF5VH‐VL×I2C VH‐VLによる治療の開始フェ
ーズの間のT細胞再分布は、図26に示す相当数の循環する標的細胞(すなわち、CD19陽性B細胞)を持つB‐NHL患者における国際公開第99/54440号に記載の従来のCD19×CD3コンストラクトによる治療の開始フェーズの間のT細胞再分布と比べてそれほど明白ではないように思われる。CD19×CD3の注入の開始と共に循環からT細胞が完全に消滅し、末梢血液から循環するCD19陽性標的B細胞が除去されるまで再出現しないのに対し(図26)、CD33‐AF5VH‐VL×I2C VH‐VL
による注入の開始時の循環するT細胞の最初の消滅は不完全であり、循環するCD33陽性標的細胞の存在下ですでにT細胞数は回復している(図30B)。このことから、本発明のCD3結合分子(ヒト及び非チンパンジー霊長類CD3ε(イプシロン)鎖のエピトープに対して指向され、作製され、配列番号2、4、6、若しくは8で提供されるアミノ酸配列の一部、又は断片、又は完全長である)は、コンテクスト非依存性CD3エピトープを認識することによって、国際公開第99/54440号で提供される結合分子のようなコンテクスト依存性CD3エピトープを認識する従来のCD3結合分子よりも有利なT細胞再分布プロファイルを示すことが確認される。
本発明の代表的な種間特異的CD3結合分子による処理の開始に続くカニクイザルにおけるT細胞再分布の低減
MCSP‐G4 VH‐VL×I2C VH‐VL(アミノ酸配列:配列番号313)を、配列番号314のコードヌクレオチド配列を用いたCHO細胞内での発現によって産生させた。(i)コザックコンセンサス配列内に埋め込まれた開始コドンを含むN末端免疫グロブリン重鎖リーダーのコード配列、及び(ii)停止コドンが続くC末端His6タグのコード配列の両方を、配列番号314のヌクレオチド配列へフレームを揃えて結合し、その後、遺伝子合成によって得られたこのDNA断片を発現ベクターpEF‐DHFRのマルチクローニング部位へ挿入した(Raumet al. Cancer Immuno
l Immunother 50 (2001) 141‐150)。DHFR欠失CHO細胞の安定なトランスフェクション、CD3結合分子MCSP‐G4VH‐VL×I2C
VH‐VLを培養物の上清中へ分泌するDHFR陽性トランスフェクタントの選択、及び発現レベルを高めるためのメトトレキサートによる遺伝子増幅は記述(Macket a
l. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 (1995) 7021‐7025)に従って実施した。カニクイザルの処理のための試験物質は、200リットルの発酵槽中で作製した。回収物からのタンパク質精製は、MCSP‐G4VH‐VL×I2C VH‐VLのC末端His6タグを標的とするIMACアフィニティクロマトグ
ラフィ、及びこれに続く分取用分子ふるいクロマトグラフィ(SEC)に基づいて行った。最終的な内毒素を含まない試験物質の総収量は40mgであった。この試験物質は、70%の単量体、30%の二量体、及び少量混入したこれより高い多量体から構成されていた。この試験物質の効力は、カニクイザルMCSPでトランスフェクトされたCHO細胞を標的細胞として、マカクT細胞株4119LnPxをエフェクター細胞源として用いた実施例18で述べる細胞障害性アッセイにより測定した(図31)。エフェクターT細胞による標的細胞溶解の最大半減に要するMCSP‐G4VH‐VL×I2C VH‐VL
の濃度(EC50)は、1.9ng/mlであると測定された。
を、種々の流量(すなわち投与量レベル)によるCD3結合分子MCSP‐G4VH‐VL×I2C VH‐VLの連続静脈内注入によって処理し、循環する標的細胞の非存在下
での処理の開始に続く循環するT細胞の再分布を調べた。CD3結合分子MCSP‐G4VH‐VL×I2C VH‐VLはカニクイザルMCSP及びカニクイザルCD3の両方
を認識することができるが、MCSPを発現する循環する血液細胞は存在しない。従って、循環血液中での考えられる唯一の相互作用は、MCSP‐G4VH‐VL×I2C V
H‐VLのCD3特異的アームとT細胞上のCD3との結合である。この状況は、実施例20で述べるように、循環するCD19陽性標的B細胞を持たないB‐NHL患者を従来のCD3結合分子(B細胞上のCD19及びT細胞上のCD3に特異的なCD19×CD3)で治療するものと同等である。
き個々の各投与量レベルに要する量(すなわち、MCSP‐G4 VH‐VL×I2C VH‐VLの流量)で投与溶液へ添加することで開始した。注入リザーバーは、順応及び処理の全フェーズを通して毎日取り替えた。処理期間は7日間とした。
血液サンプル(1ml)は、MCSP‐G4 VH‐VL×I2C VH‐VLの連続注入前、及び注入開始後0.75、2、6、12、24、30、48、72時間、並びに7日間の処理の後に、EDTA含有Vacutainer(商標)チューブ(BectonDickinson)を用いて採取し、4℃で分析へ送った。作業上の理由からこれらの時間点が僅かに変更される場合もあった。リンパ球亜集団のFACS分析は、血液サンプル採取後24乃至48時間以内に実施した。血液サンプル中の白血球亜集団の絶対数は、通常の獣医学研究室にて分画血液分析によって測定した。
PBMC(末梢血液単核細胞)の単離は、Ficoll(商標)勾配分離プロトコルを適合させることで実施した。あらかじめBiocoll(商標)溶液(Biochrom)1mlを充填した5mlのFalcon(商標)チューブへ血液を室温で移した。遠心分離は、スイングアウトローターにより、1700×g及び22℃で15分間、減速なしで行った。Biocoll(商標)層の上にあるPBMCを単離し、FACSバッファー(PBS/2%FBS[ウシ胎仔血清;Biochrom])で1回洗浄し、遠心分離し、FACSバッファー中へ再懸濁した。すべての洗浄工程における遠心分離は、スイングアウトローターにより、800×g及び4℃で4分間行った。必要に応じて、単離したPBMCを3mlの赤血球溶解バッファー(8.29gNH4Cl、1.00g KHCO3
、0.037gEDTA、ad 1.0l H2Obidest、pH7.5)中にて5分間室温
でインキュベートし、続いてFACSバッファーで洗浄することにより赤血球の溶解を行った。
カニクイザル抗原との反応性を持つモノクローナル抗体をBecton Dickin
son(1カタログ番号345784、2カタログ番号556647、3カタログ番号55
2851)、及びBeckman Coulter(4カタログ番号IM2470)より入
手し、製造元の推奨事項に従って使用した。5×105‐1×106個の細胞を以下の抗体の組み合わせによって染色した:抗CD141(FITC)×抗CD562(PE)×抗CD33(PerCP)×抗CD194(APC)。細胞をV字型96ウェルマルチタイタープレート(Greiner)中でペレット化し、上清を除去した。細胞のペレットを、FACSバッファーで希釈した特異的抗体を含む全量100μl中に再懸濁した。インキュベーションを暗所にて4℃で30分間行った。続いて、FACSバッファーでサンプルを2回洗浄し、フローサイトメトリー分析のために細胞ペレットをFACSバッファー中へ再懸濁した。
4色BD FACSCalibur(商標)(Becton Dickinson)を用いてデータの収集を行った。各測定について、同定されたリンパ球亜集団の1×104個
の細胞を得た。プログラムCellQuest Pro(商標)(Becton Dickinson)を用いて統計的解析を実施することにより、リンパ球亜集団のパーセントを得ると共に、細胞表面分子の発現強度を分類した。続いて、FACSによって測定された全リンパ球(すなわち、CD14染色による骨髄系細胞を除いたBプラスTプラスNK細胞)に対する単一のリンパ球のサブセットのパーセントを分画血液分析からのリンパ球数と相関させることにより、T細胞(CD3+、CD56-、CD14-)の絶対細胞数を算
出した。
CSP‐G4VH‐VL×I2C VH‐VLで処理した際の開始フェーズの間のT細胞
再分布を図32に示す。これらの動物は、処理の開始フェーズの間のT細胞再分布は全く示さず、すなわち、T細胞数は、処理の開始と共に減少するどころかむしろ増加した。循環する標的細胞を持たない全患者の100%で、コンテクスト依存性CD3エピトープに対する従来のCD3結合分子(例:国際公開第99/54440号に記載のCD19×CD3コンストラクト)での治療開始時にT細胞再分布が一貫して観察されることを考えると、ヒト及び非チンパンジー霊長類CD3イプシロン鎖に対して指向され作製された配列番号2、4、6、若しくは8のいずれか1つ、又はこれらの断片のアミノ酸配列で定義される本発明のCD3結合分子により、循環する標的細胞の非存在下において治療開始時に非常に低いT細胞再分布を観察することができることが実証された。これは、国際公開第99/54440号に記載のコンストラクトのようなコンテクスト依存性CD3エピトープに対して指向されたCD3結合分子とは明らかに対照的である。(とりわけ)配列番号2、4、6、若しくは8のいずれか1つ(又はこれらの配列の断片)で与えられるコンテクスト非依存性CD3エピトープに対する結合分子が、(有害で望ましくない)T細胞再分布のこの著しい低下をもたらす。CD3結合分子による治療の開始フェーズの間のT細胞再分布はCNS有害イベントの主たるリスク因子であることから、本明細書で提供されコンテクスト非依存性CD3エピトープを認識する能力を有するCD3結合分子は、本技術分野で公知でありコンテクスト依存性CD3エピトープに対して指向されるCD3結合分子に対して優れる大きな利点を持つ。実際、MCSP‐G4VH‐VL×I2C VH
‐VLで処理したカニクイザルでCNS症状の徴候を示したものはなかった。
であるサブドメインを形成することから、本明細書で提供するCD3結合分子は、国際公開第99/54440号で提供される分子のようにコンテクスト依存性CD3エピトープを認識する従来のCD3結合分子(国際公開第99/54440号で提供される分子のような)と比べてそれ程のCD3コンフォメーションのアロステリックな変化を誘発しない。結果として(やはり理論に束縛されるものではないが)、本明細書で提供されるCD3結合分子による細胞内NcK2動員の誘発も低減され、その結果T細胞インテグリンのアイソフォームへの変換が減少し、内皮細胞へのT細胞の接着も低下する。本発明のCD3結合分子の製剤(本明細書で定義するコンテクスト非依存性エピトープに対して指向され作製された)は、実質的に単量体分子から成ることが好ましい。このような単量体分子は、T細胞再分布の回避、従って治療の開始フェーズの間のCNS有害イベントのリスクの回避においてさらにより効率的(二量体又は多量体分子と比べて)である。
23.1 ヒトCD33を発現するCHO細胞の作製
GenBank(受託番号NM_001772)で公開されているヒトCD33のコード配列は、標準的なプロトコルに従う遺伝子合成によって得た。遺伝子合成断片は、まずコンストラクトの真核生物発現のためのコザック部位(Kozaksite)を含み、続いて19アミノ酸免疫グロブリンリーダーペプチドを、続いてフレームを揃えて成熟ヒトCD33タンパク質のコード配列を、続いてフレームを揃えてセリングリシンジペプチドのコード配列、ヒスチジン6‐タグ、及び停止コドンを含むように設計した(コンストラ
クトのcDNA及びアミノ酸配列を配列番号525及び526に挙げる)。遺伝子合成断片は、断片の最初と最後に制限部位が導入されるようにも設計した。導入された制限部位は、5'末端にはEcoRI及び3'末端にはSalIであり、以下のクローン化の手順に利用した。遺伝子合成断片は、EcoRI及びSalIを介して、pEF‐DHFR(pEF‐DHFRについては、Raumet al. Cancer Immunol Immunother 50 (2001) 141‐150、に記載されている)と称するプラ
スミドへ標準的なプロトコルに従ってクローン化した。前記の手順は標準的なプロトコルに従って実施した(Sambrook,Molecular Cloning; A La
boratory Manual, 3rd edition, Cold Spring Harbour LaboratoryPress, Cold Spring Harbour, New York (2001))。配列が確認されたヌクレオチド配列を有するク
ローンを、コンストラクトの真核生物発現のためにDHFR欠失CHO細胞へトランスフェクトした。DHFR欠失CHO細胞中での真核生物タンパク質発現は、KaufmannR.J. (1990) Methods Enzymol. 185, 537‐566
、の記載に従って実施した。コンストラクトの遺伝子増幅は、メトトレキサート(MTX)の濃度を最大20nMMTXまでの最終濃度へ上昇させることによって誘発した。
マカクCD33のcDNA配列は、標準的なプロトコルに従って調製したマカクザル骨髄からのcDNAに3回のPCRをセットで施すことによって得た。以下の反応条件:94℃で3分間の1サイクル、続いて94℃で1分間、53℃で1分間、及び72℃で2分間の35サイクル、続いて72℃で3分間の最終サイクル、を用い、並びに以下のプライマー:
3.フォワードプライマー:5'‐gaggaattcaccatgccgctgctg
ctactgctgcccctgctgtgggcaggggccctggctatgg‐3'
リバースプライマー:5'‐gatttgtaactgtatttggtacttcc‐
3'
4.フォワードプライマー:5'‐attccgcctccttggggatcc‐3'
リバースプライマー:5'‐gcataggagacattgagctggatgg‐3'
5.フォワードプライマー:5'‐gcaccaacctgacctgtcagg‐3'
リバースプライマー:5'‐agtgggtcgactcactgggtcctgacc
tctgagtattcg‐3'
を用いた。
mmunol Immunother 50 (2001) 141‐150、に記載されている)と称するプラスミドへクローン化した。上述のように、このプラスミドの配列が確認されたクローンを用いて、CHO/dhfr−細胞をトランスフェクトした。
種間特異的結合分子のクローン化
全般的には、ヒト及び非チンパンジー霊長類CD3イプシロンに対して種間特異的である結合特異性を持つドメイン、並びにヒト及び非チンパンジー霊長類CD33に対して種間特異的である結合特異性を持つドメインを各々が含む二重特異性抗体分子を、以下の表6に挙げるように設計した。
停止コドンを含むように設計した。遺伝子合成断片は、断片の最初と最後に適切な制限部位が導入されるようにも設計した。導入された制限部位は、以下のクローン化の手順に利用した。遺伝子合成断片は、これらの制限部位を介して、pEF‐DHFR(pEF‐DHFRについては、Raumet al. Cancer Immunol Immunother 50 (2001) 141‐150、に記載されている)と称するプラスミドへ
標準的なプロトコルに従ってクローン化した。前記の手順は標準的なプロトコルに従って実施した(Sambrook,Molecular Cloning; A Labora
tory Manual, 3rd edition, Cold Spring Harbour LaboratoryPress, Cold Spring Harbour, N
ew York (2001))。配列が確認されたヌクレオチド配列を有するクローンを、コンストラクトの真核生物発現のためにDHFR欠失CHO細胞へトランスフェクトし
た。DHFR欠失CHO細胞中での真核生物タンパク質発現は、KaufmannR.J. (1990) Methods Enzymol. 185, 537‐566、の記載
に従って実施した。コンストラクトの遺伝子増幅は、メトトレキサート(MTX)の濃度を最大20nMMTXまでの最終濃度へ上昇させることによって誘発した。
M MTXの最終濃度まで増加する濃度のMTXを添加することによって誘発した。2継
代の静置培養後、ヌクレオシドを含まないHyQPF CHO液体大豆培地(0.1% Pluronic F‐68含有L‐グルタミン 4.0mMを含む;HyClone)により、ローラーボトル中、回収まで7日間細胞を増殖させた。細胞を遠心分離で除去し、発現されたタンパク質を含む上清を−20℃で保存した。別の選択肢として、コンストラクトを一過性にHEK293細胞中で発現させた。トランスフェクションは、293fectin試薬(Invitrogen,#12347‐019)を用い、製造元のプロトコルに従って実施した。
た。ZnCl2を充填したFractogel EMD Chelate(登録商標)(M
erck)を用い、製造元が提供するプロトコルに従って固定化金属アフィニティクロマトグラフィ(「IMAC」)を実施した。バッファーA(20mMリン酸ナトリウムバッファー pH 7.2、0.1M NaCl)でカラムを平衡状態とし、細胞培養物の上清
(500ml)を流速3ml/分でカラム(10ml)に適用した。バッファーAでカラムを洗浄して非結合サンプルを除去した。結合したタンパク質を、バッファーB(20mMリン酸ナトリウムバッファー pH 7.2、0.1M NaCl、0.5M イミダゾール)の以下に示す2段階の勾配:
段階1:6カラム分の容量の20%バッファーB
段階2:6カラム分の容量の100%バッファーB
を用いて溶離させた。段階2からの溶離したタンパク質画分をさらなる精製のためにプールした。化学薬品はすべて研究グレードであり、Sigma(ダイゼンホッフェン)又はMerck(ダルムシュタット)より購入した。
クエン酸塩、200mM リジン、5% グリセロール、pH7.2)で平衡状態とした
HiLoad16/60 Superdex 200 分取グレードカラム(GE/アマー
シャム)上で実施した。溶離したタンパク質サンプル(流速1ml/分)を標準的なSDS‐PAGE及びウエスタンブロットによる検出に掛けた。精製の前に、分子量測定のためにカラムを校正した(分子量マーカーキット、SigmaMW GF‐200)。タン
パク質濃度は、OD280nmを用いて測定した。
kDaである。コンストラクトはすべてこの方法に従って精製した。
分析
ヒト及びマカクCD33並びにCD3のそれぞれに結合する能力に関して種間特異的二重特異性抗体コンストラクトの機能を試験するために、FACS分析を実施した。この目的のために、実施例23.1で述べるようにヒトCD33でトランスフェクトされたCHO細胞、及びヒトCD3陽性T細胞白血病細胞株HPB‐ALL(DSMZ,ブラウンシュバイク,ACC483)を用いてヒト抗原への結合について試験した。マカク抗原に対する結合反応性は、実施例23.2で述べる作製されたマカクCD33トランスフェクタント、及びマカクPBMC(マカクPBMCの調製は、標準的なプロトコルに従い、マカクザルからの末梢血液のFicoll勾配遠心分離によって行った)を用いて試験した。PBMCのそれぞれの細胞株の200,000個の細胞を、種間特異的二重特異性抗体コンストラクト(5μg/ml)の精製タンパク質50μlと共に、又は種間特異的二重特異性抗体コンストラクトを発現するトランスフェクトされた細胞の細胞培養物の上清と共に、30分間氷上にてインキュベートした。細胞を2%FCSを含むPBSで2回洗浄し、マウス抗His抗体(PentaHis抗体;Qiagen;2%FCSを含むPBS50μl中にて1:20に希釈)でコンストラクトの結合を検出した。洗浄後、結合した抗His抗体を、2%FCSを含むPBSで1:100に希釈したフィコエリトリンに結合したFcガンマ特異的抗体(Dianova)で検出した。トランスフェクトされていないCHO細胞の上清をネガティブコントロールとして用いた。
Current Protocols in Immunology(Coligan,K
ruisbeek, Margulies, Shevach and Strober,
Wiley‐Interscience, 2002)に記載のようにして実施した。
作製された二重特異性抗体の生物活性を、実施例23.1及び23.2で述べるCD33陽性細胞株を用いるクロム51(51Cr)放出インビトロ細胞障害性アッセイによって分析した。それぞれの図に示すように、エフェクター細胞としては、刺激されたヒトCD4/CD56除去PBMC、又はマカクT細胞株4119LnPxを用いた。
ペトリ皿(直径85mm、Nunc)を、最終濃度1μg/mlの市販の抗CD3特異的
抗体(例:OKT3,Othoclone)により37℃にて1時間コーティングした。非結合タンパク質をPBSによる1段階の洗浄によって除去した。新鮮なPBMCを、Ficoll勾配遠心分離により標準的なプロトコルに従って末梢血液(30乃至50mlのヒト血液)から単離した。安定化グルタミン/10%FCS/IL‐220U/ml(Proleukin,Chiron)を含む50mlのRPMI1640中、3‐5×107個のPBMCを、あらかじめコーティングしたペトリ皿に添加し、2日間刺激した。
3日目に細胞を回収し、RPMI1640で1回洗浄した。IL‐2を添加して最終濃度を20U/mlとし、上記と同じ細胞培地中にて細胞を再度1日培養した。
e Sciences GmbH,ケルン,ドイツ)を用いて実施した。実験データの解析は、Windows(登録商標)用Prism4(バージョン4.02、GraphPadSoftware Inc.,サンディエゴ,カリフォルニア州,米国)を用いて実施
した。このソフトウェアによって決定されるS字型用量反応曲線のR2値は、通常>0.
90である。この解析プログラムによって算出されるEC50値を用いて生物活性を比較した。
24.1 ヒトCAIXを発現するCHO細胞の作製
GenBank(受託番号NM_001216)で公開されているヒトCAIXのコード配列は、標準的なプロトコルに従う遺伝子合成によって得た。遺伝子合成断片は、そのリーダーペプチドを含むヒトCAIXタンパク質のコード配列を含むように設計した(コンストラクトのcDNA及びアミノ酸配列を配列番号604及び605に挙げる)。遺伝子合成断片は、断片の最初と最後に制限部位が導入されるようにも設計した。導入された制限部位は、5'末端にはXbaI及び3'末端にはSalIであり、以下のクローン化の手順に利用した。遺伝子合成断片は、XbaI及びSalIを介して、pEF‐DHFR(pEF‐DHFRについては、Raumet al. Cancer Immunol Immunother 50 (2001) 141‐150、に記載されている)と称する
プラスミドへ標準的なプロトコルに従ってクローン化した。前記の手順は標準的なプロトコルに従って実施した(Sambrook,Molecular Cloning; A
Laboratory Manual, 3rd edition, Cold Sprin
g Harbour LaboratoryPress, Cold Spring Har
bour, New York (2001))。配列が確認されたヌクレオチド配列を有
するクローンを、コンストラクトの真核生物発現のためにDHFR欠失CHO細胞へトランスフェクトした。DHFR欠失CHO細胞中での真核生物タンパク質発現は、KaufmannR.J. (1990) Methods Enzymol. 185, 537‐
566、の記載に従って実施した。コンストラクトの遺伝子増幅は、メトトレキサート(
MTX)の濃度を最大20nMMTXまでの最終濃度へ上昇させることによって誘発した。
GenBank(受託番号XM_001088481)で公開されているマカクCAIXのコード配列は、標準的なプロトコルに従う遺伝子合成によって得た。遺伝子合成断片は、そのリーダーペプチドを含むマカクCAIXタンパク質のコード配列を含むように設計した(コンストラクトのcDNA及びアミノ酸配列を配列番号606及び607に挙げる)。遺伝子合成断片は、断片の最初と最後に制限部位が導入されるようにも設計した。導入された制限部位は、5'末端にはXbaI及び3'末端にはSalIであり、以下のクローン化の手順に利用した。遺伝子合成断片は、XbaI及びSalIを介して、pEF‐DHFR(pEF‐DHFRについては、Raumet al. Cancer Imm
unol Immunother 50 (2001) 141‐150、に記載されている)と称するプラスミドへ標準的なプロトコルに従ってクローン化した。前記の手順は標準的なプロトコルに従って実施した(Sambrook,Molecular Cloni
ng; A Laboratory Manual, 3rd edition, Cold
Spring Harbour LaboratoryPress, Cold Spring Harbour, New York (2001))。配列が確認されたヌクレオチド配列を有するクローンを、コンストラクトの真核生物発現のためにDHFR欠失CHO細胞へトランスフェクトした。DHFR欠失CHO細胞中での真核生物タンパク質発現は、KaufmannR.J. (1990) Methods Enzymol. 185,
537‐566、の記載に従って実施した。コンストラクトの遺伝子増幅は、メトトレキサート(MTX)の濃度を最大20nMMTXまでの最終濃度へ上昇させることによって誘発した。
種間特異的結合分子のクローン化
全般的には、ヒト及び非チンパンジー霊長類CD3イプシロンに対して種間特異的である結合特異性を持つドメイン、並びにヒト及び非チンパンジー霊長類CAIXに対して種間特異的である結合特異性を持つドメインを各々が含む二重特異性単鎖抗体分子を、以下の表7に挙げるように設計した。
VLの組み合わせを含む前記のコンストラクトを、遺伝子合成によって得た。遺伝子合成断片は、まずコンストラクトの真核生物発現のためのコザック部位を含み、続いて19アミノ酸免疫グロブリンリーダーペプチドを、続いてフレームを揃えて対応する二重特異性単鎖抗体分子のコード配列を、続いてフレームを揃えて6ヒスチジンタグのコード配列及び停止コドンを含むように設計した。遺伝子合成断片は、断片の最初と最後に適切な制限部位が導入されるようにも設計した。導入された制限部位は、以下のクローン化の手順に利用した。遺伝子合成断片は、これらの制限部位を介して、pEF‐DHFR(pEF‐DHFRについては、Raumet al. Cancer Immunol Immunother 50 (2001) 141‐150、に記載されている)と称するプラスミド
へ標準的なプロトコルに従ってクローン化した。前記の手順は標準的なプロトコルに従って実施した(Sambrook,Molecular Cloning; A Labor
atory Manual, 3rd edition, Cold Spring Harbour LaboratoryPress, Cold Spring Harbour,
New York (2001))。配列が確認されたヌクレオチド配列を有するクローンを、コンストラクトの真核生物発現のためにDHFR欠失CHO細胞へトランスフェクトした。DHFR欠失CHO細胞中での真核生物タンパク質発現は、KaufmannR.J. (1990) Methods Enzymol. 185, 537‐566、の記
載に従って実施した。コンストラクトの遺伝子増幅は、メトトレキサート(MTX)の濃度を最大20nMMTXまでの最終濃度へ上昇させることによって誘発した。
二重特異性単鎖抗体分子は、チャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO)中で発現させた。DHFR欠失CHO細胞中の真核生物タンパク質発現は、KaufmannR.J.
(1990) Methods Enzymol. 185, 537‐566、の記載に
従って実施した。コンストラクトの遺伝子増幅は、20nM MTXの最終濃度まで増加
する濃度のMTXを添加することによって誘発した。2継代の静置培養後、ヌクレオシドを含まないHyQPF CHO液体大豆培地(0.1% Pluronic F‐68含有
L‐グルタミン 4.0mMを含む;HyClone)により、ローラーボトル中、回収
まで7日間細胞を増殖させた。細胞を遠心分離で除去し、発現されたタンパク質を含む上清を−20℃で保存した。別の選択肢として、コンストラクトを一過性にHEK293細胞中で発現させた。トランスフェクションは、293fectin試薬(Invitrogen,#12347‐019)を用い、製造元のプロトコルに従って実施した。
た。ZnCl2を充填したFractogel EMD Chelate(登録商標)(M
erck)を用い、製造元が提供するプロトコルに従って固定化金属アフィニティクロマトグラフィ(「IMAC」)を実施した。バッファーA(20mMリン酸ナトリウムバッファー pH 7.2、0.1M NaCl)でカラムを平衡状態とし、細胞培養物の上清
(500ml)を流速3ml/分でカラム(10ml)に適用した。バッファーAでカラムを洗浄して非結合サンプルを除去した。結合したタンパク質を、バッファーB(20mMリン酸ナトリウムバッファー pH 7.2、0.1M NaCl、0.5M イミダゾール)の以下に示す2段階の勾配:
段階1:6カラム分の容量の20%バッファーB
段階2:6カラム分の容量の100%バッファーB
を用いて溶離させた。段階2からの溶離したタンパク質画分をさらなる精製のためにプールした。化学薬品はすべて研究グレードであり、Sigma(ダイゼンホッフェン)又はMerck(ダルムシュタット)より購入した。
ジン、5% グリセロール、pH7.2)で平衡状態としたHiLoad16/60 Superdex 200 分取グレードカラム(GE/アマーシャム)上で実施した。溶離したタンパク質サンプル(流速1ml/分)を標準的なSDS‐PAGE及びウエスタンブロットによる検出に掛けた。精製の前に、分子量測定のためにカラムを校正した(分子量マーカーキット、SigmaMW GF‐200)。タンパク質濃度は、OD280nm
を用いて測定した。
分析
ヒト及びマカクCAIX並びにCD3のそれぞれに結合する能力に関して種間特異的二重特異性抗体コンストラクトの機能を試験するために、FACS分析を実施した。この目的のために、実施例24.1で述べるようにヒトCAIXでトランスフェクトされたCHO細胞、及びヒトCD3陽性T細胞白血病細胞株HPB‐ALL(DSMZ,ブラウンシュバイク,ACC483)を用いてヒト抗原への結合について試験した。マカク抗原に対する結合反応性は、実施例24.2で述べる作製されたマカクCAIXトランスフェクタント、及びマカクT細胞株4119LnPx(Prof.Fickenscher,Hygiene Institute, Virology, Erlangen‐Nuern
berg、よりご提供頂いた;Knappe A, et al., and Ficken
scherH., Blood 2000, 95, 3256‐61、にて発表)を用いて試験した。それぞれの細胞株の200,000個の細胞を、種間特異的二重特異性抗体コンストラクト(2μg/ml)の精製タンパク質50μlと共に、又は種間特異的二重特異性抗体コンストラクトを発現するトランスフェクトされた細胞の細胞培養物の上清と共に、30分間氷上にてインキュベートした。2%FCSを含むPBSで細胞を2回洗浄し、マウス抗His抗体(PentaHis抗体;Qiagen;2%FCSを含むPBS50μl中にて1:20に希釈)でコンストラクトの結合を検出した。洗浄後、結合した抗His抗体を、2%FCSを含むPBSで1:100に希釈したフィコエリトリンに結合したFcガンマ特異的抗体(Dianova)で検出した。トランスフェクトされていないCHO細胞の上清を、T細胞株への結合に対するネガティブコントロールとして用いた。関連性のない標的特異性を有する単鎖コンストラクトを、CAIXでトランスフェクトされたCHO細胞への結合に対するネガティブコントロールとして用いた。
tソフトウェアを用いてデータの取得及び解析を行った(BectonDickinson biosciences,ハイデルベルク)。FACS染色及び蛍光強度の測定は、
Current Protocols in Immunology(Coligan,K
ruisbeek, Margulies, Shevach and Strober,
Wiley‐Interscience, 2002)に記載のようにして実施した。
作製された二重特異性単鎖抗体の生物活性を、実施例24.1及び24.2で述べるCAIX陽性細胞株を用いるクロム51(51Cr)放出インビトロ細胞障害性アッセイによって分析した。それぞれの図に示すように、エフェクター細胞としては、刺激されたヒトCD4/CD56除去PBMC、刺激されたヒトPBMC、又はマカクT細胞株4119LnPxを用いた。
ペトリ皿(直径145mm、Greiner)を、最終濃度1μg/mlの市販の抗CD3特異的抗体(例:OKT3,Othoclone)により37℃にて1時間コーティングした。非結合タンパク質をPBSによる1段階の洗浄によって除去した。新鮮なPBMCを、Ficoll勾配遠心分離により標準的なプロトコルに従って末梢血液(30乃至50mlのヒト血液)から単離した。安定化グルタミン/10%FCS/IL‐220U/ml(Proleukin,Chiron)を含む120mlのRPMI1640中、3‐5×107個のPBMCを、あらかじめコーティングしたペトリ皿に添加し、2日
間刺激した。3日目に細胞を回収し、RPMI1640で1回洗浄した。IL‐2を添加して最終濃度を20U/mlとし、上記と同じ細胞培地中にて細胞を再度1日培養した。
ペトリ皿(直径145mm、Greiner)を、最終濃度1μg/mlの市販の抗CD3特異的抗体(例:OKT3,Othoclone)により37℃にて1時間コーティングした。非結合タンパク質をPBSによる1段階の洗浄によって除去した。新鮮なPBMCを、Ficoll勾配遠心分離により標準的なプロトコルに従って末梢血液(30乃至50mlのヒト血液)から単離した。安定化グルタミン/10%FCS/IL‐220U/ml(Proleukin,Chiron)を含む120mlのRPMI1640中、3‐5×107個のPBMCを、あらかじめコーティングしたペトリ皿に添加し、2日間
刺激した。3日目に細胞を回収し、RPMI1640で1回洗浄した。IL‐2を添加して最終濃度を20U/mlとし、上記と同じ細胞培地中にて細胞を再度1日培養した。CD4+T細胞及びCD56+NK細胞を標準的なプロトコルに従って除去することにより、CD8+細胞障害性Tリンパ球(CTLs)を濃縮した。
し)との差に関連する上清中の放出されたクロムの相対値として測定した。測定はすべて4個の反復サンプルで行った。上清中のクロムの放射能の測定は、Wizard3"ガン
マカウンター(Perkin Elmer Life Sciences GmbH,ケルン,ドイツ)を用いて実施した。実験データの解析は、Windows(登録商標)用Prism4(バージョン4.02、GraphPadSoftware Inc.,サンデ
ィエゴ,カリフォルニア州,米国)を用いて実施した。このソフトウェアによって決定されるS字型用量反応曲線のR2値は、通常>0.90である。この解析プログラムによっ
て算出されるEC50値を用いて生物活性を比較した。
EpCAM特異的二重特異性抗体の構築
EpCAM特異的二重特異性抗体の構築のための基礎は、完全ヒトEpCAM特異的抗体HD69とした(Raum et al. CancerImmunol Immunother (2001) 50: 141以降)。VH及びVLは、標準的な方法に従ってH
D69 DNAからPCR増幅した。VH及びVLは、標準的なプロトコルに従って順に
プラスミドへクローン化され、それによって機能的scFv(配向VH‐リンカー‐VL)を形成した。このscFvコンストラクトは、次に、二重特異性抗体フォーマットへの機能的なクローン化に有用であるN末端BsrG1及びC末端BspE1制限部位を導入するプライマーを用いてPCR増幅した(5'‐HD69‐BsrG1:5'‐gacaggtgtacactccgaggtgcagctgctcgagtctgg‐3';3'‐HD69‐BspE1:5'‐tgatagtccggatttgatctccagct
tggtcc‐3')。次にこのPCR生成物を、ヒト及びマカクCD3に対して種間特
異的であるCD3特異的VH及びVLの組み合わせを各々が1つ含む3種類の適切な発現ベクターへクローン化し(それぞれ、H2CHL、F12Q HL、及びI2C)、それ
によって、3種類の機能的二重特異性コンストラクト、HD69 HL×H2C HL、HD69 HL×F12Q HL、及びHD69HL×I2C HLがコードされた。続いて
これらのコンストラクトを、標準的な手順に従い安定なトランスフェクションのためにエレクトロポレーションによってDHFR欠失CHO細胞へトランスフェクトし、結果として各々が3種類の二重特異性産物のうちの1つを発現するプールである3種類のトランスフェクトされた細胞のプールを得た。
表)を標的細胞として用いるクロム51放出インビトロ細胞障害性アッセイによって分析した。エフェクター細胞としては、刺激されたヒトCD8陽性T細胞を用いた。図37に示すように、作製した二重特異性単鎖抗体コンストラクトはすべて、ヒトCD8+細胞によって誘発されたヒトEpCAM陽性標的細胞に対する細胞障害活性を示した。ネガティブコントロールとしては、トランスフェクトされていないCHO細胞の培養物の上清を用い、これは検出可能な細胞障害性を示さなかった。
langen‐Nuernberg、よりご提供頂いた;Knappe A, et al
., and FickenscherH., Blood 2000, 95, 3256‐61、にて発表)を用いて試験した。それぞれの細胞株の200,000個の細胞を、CD3種間特異的二重特異性抗体コンストラクトを発現するトランスフェクトされた細胞の細胞培養物の上清と共に、30分間氷上にてインキュベートした。2%FCSを含むPBSで細胞を2回洗浄し、マウス抗His抗体(PentaHis抗体;Qiagen;2%FCSを含むPBS50μl中にて1:20に希釈)でコンストラクトの結合を検出した。洗浄後、結合した抗His抗体を、2%FCSを含むPBSで1:100に希釈したフィコエリトリンに結合したFcガンマ特異的抗体(Dianova)で検出した。トランスフェクトされていないCHO細胞の上清を、T細胞株への結合に対するネガティブコントロールとして用いた。
Current Protocols in Immunology(Coligan,K
ruisbeek, Margulies, Shevach and Strober,
Wiley‐Interscience, 2002)に記載のようにして実施した。
26.1 ヒトEGFRvIIIでトランスフェクトされたCHO細胞の作製及び発現
細胞外ドメインの267個のアミノ酸が欠失した変異上皮成長因子受容体(デルタEGFR、de2‐7EGFR、又はEGFRvIIIは同義で用いる)のC末端、膜貫通及
び細胞質ドメインのコード配列(KuanCT, Wikstrand CJ, Bign
er DD: EGF mutant receptor vIII as a molecular target in cancertherapy; Endocr Relat Cancer. 2001 Jun;8(2):83‐96)を、標準的なプロトコルに従う遺伝子合成によって得た。遺伝子合成断片は、まずコンストラクトの真核生物発現のためのコザック部位を含み、続いて24アミノ酸リーダーペプチドのコード配列を、続いてフレームを揃えてヒトC末端細胞外ドメイン、膜貫通及び細胞質ドメインのコード配列、並びに停止コドンを含むように設計した。遺伝子合成断片は、DNA断片の最初と最後に制限部位が導入されるようにも設計した。クローン化の目的のために、XbaI及びSalI制限酵素認識部位を、それぞれ5'末端及び3'末端に付加した。合成遺伝子DNAは続いてXbaI及びSalIによって消化され、適切に消化された発現ベクターpEF‐DHFRへ連結され、大腸菌へ形質転換される。確認されたヌクレオチド配列を有するクローン(組換えコンストラクトのcDNA配列及びアミノ酸配列を配列番号599及び598に挙げる)を、コンストラクトの真核生物発現のためにDHFR欠失CHO細胞へトランスフェクトした。DHFR欠失CHO細胞中での真核生物タンパク質発現は上記で述べるようにして実施した。
実施例26.1と同様に、カニクイザルEGFRvIII変異体を、細胞外ドメインの267個のアミノ酸の欠失及び融合部位への新規なアミノ酸グリシンの挿入(アミノ酸番号6)によって作製した。遺伝子合成断片は、まずコンストラクトの真核生物発現のためのコザック部位を含み、続いて24アミノ酸リーダーペプチドのコード配列を、続いてフレームを揃えてカニクイザルC末端細胞外ドメイン、膜貫通及び細胞質ドメイン(いずれもヒト)のコード配列、並びに停止コドンを含むように設計した。遺伝子合成断片は、DNA断片の最初と最後に制限部位が導入されるようにも設計した。導入された制限部位、5'末端のXbaI及び3'末端のSalIは、以下のクローン化の手順に利用した。標準的なプロトコルに従い、断片をXbaI/SalIで消化し、pEF‐DHFRへクローン化した。配列が確認されているプラスミドを用いてCHO/dhfr−細胞(ATCCNo.CRL9096;いずれもBiochrom AG,ベルリン,ドイツから入手し
た10%FCS、1%ペニシリン/ストレプトマイシン、及びSigma‐AldrichChemie GmbH,タウフキルヘン(Taufkirchen),ドイツから入
手した細胞培養グレード試薬のストック液からのヌクレオシドを補充して最終濃度を10μg/mlアデノシン、10μg/mlデオキシアデノシン、及び10μg/mlチミジンとした、BiochromAG,ベルリン,ドイツから入手した安定化グルタミンを含むRPMI1640中、インキュベーター内で37℃、湿度95%、及び7%CO2にて
培養)をトランスフェクトした。トランスフェクションは、PolyFectトランスフェクション試薬(QiagenGmbH,ヒルデン,ドイツ)及び5μgのプラスミドDNAを用い、製造元のプロトコルに従って実施した。24時間の培養後、細胞をPBSで1回洗浄し、ヌクレオシド及び透析FCS(BiochromAG,ベルリン,ドイツより入手)を補充しないこと以外は前述と同様の細胞培地で再度培養した。従って、細胞培地はヌクレオシドを含有せず、それによって選別はトランスフェクトされた細胞に適用された。トランスフェクションからおよそ14日の後、耐性細胞の成長が観察された。さらに7乃至14日後、トランスフェクタントはFACSの試験によりコンストラクトの発現について陽性を示した。
全般的には、ヒト及び非チンパンジー霊長類CD3抗原に対して結合特異性を持つドメイン、並びにヒト及び非チンパンジー霊長類EGFRvIII抗原に対して結合特異性を持つドメインを各々が含む二重特異性単鎖抗体分子を、以下の表9に挙げるように設計した。
l. 185, 537‐566、の記載に従って実施した。コンストラクトの遺伝子増幅は、メトトレキサート(MTX)の濃度を最大20nMMTXまでの最終濃度へ上昇させることによって誘発した。別の選択肢として、コンストラクトを、標準的なプロトコルに従ってDHFR欠失CHO細胞へ一過性にトランスフェクトした。
で述べるようにしてアッセイを行った。
27.1 ヒト及びマカク膜結合型IgEのクローン化及び発現
ラムダ軽鎖を合成、分泌する自然重鎖欠損変異骨髄腫細胞株であるマウス細胞株J558L(Interlab Project, IstitutoNazionale pe
r la Ricerca sul Cancro,ジェノバ,イタリア、より入手、ECACC 88032902)を用い、ヒト及びマカクIgEのそれぞれの膜結合型重鎖変異
体で補完した。そのようなコンストラクトを作製するために、標準的なプロトコルに従う遺伝子合成によって合成分子を得た(コンストラクトのヌクレオチド配列を配列番号595及び594に挙げる)。これらのコンストラクトでは、ヒト及びマカクCD3イプシロン鎖に対するコード配列が、それぞれIgEのヒト膜貫通領域と融合していた。VH鎖の組み込まれた特異性は、ハプテン(4‐ヒドロキシ‐3‐ニトロ‐フェニル)アセチル)(NP)に対して指向されている。遺伝子合成断片は、コンストラクトの真核生物発現のためのコザック部位、及び免疫グロブリンリーダー、及びDNAの最初と最後に制限部位を含むようにも設計した。導入された制限部位は、5'末端にEcoRI及び3'末端にSalIであり、pEF‐DHFRと称する発現プラスミドへのクローン化工程に利用した。配列の確認後(マカク:XM_001116734アカゲザル(macaca mul
atta)IgイプシロンC領域、mRNA;ヒト:NC_000014 ヒト(Hom
o sapiens)第14番染色体、全配列、NationalCenter for
Biotechnology Information、http://www.ncb
i.nlm.nih.gov/entrez)、このプラスミドを用いて上述のようにしてCHO/dhfr−細胞をトランスフェクトした。DHFR欠失CHO細胞中での真核生物タンパク質発現は、KaufmannR.J. (1990) Methods En
zymol. 185, 537‐566、の記載に従って実施する。コンストラクトの遺伝子増幅は、メトトレキサート(MTX)の濃度を最大20nMMTXまでの最終濃度へ上昇させることによって誘発する。
全般的には、ヒト及び非チンパンジー霊長類CD3抗原に対して結合特異性を持つドメイン、並びにヒト及び非チンパンジー霊長類IgE抗原に対して結合特異性を持つドメインを各々が含む二重特異性単鎖抗体分子を、以下の表10に挙げるように設計した。
37‐566、の記載に従って実施した。コンストラクトの遺伝子増幅は、メトトレキサート(MTX)の濃度を最大20nMMTXまでの最終濃度へ上昇させることによって誘発した。別の選択肢として、コンストラクトを、標準的なプロトコルに従ってDHFR欠失CHO細胞へ一過性にトランスフェクトした。
28.1 ヒトCD44を発現するCHO細胞の作製
GenBank(受託番号AJ251595)で公開されているヒトCD44のコード配列で、CD44v6エクソンも含むものを、標準的なプロトコルに従う遺伝子合成によって得た。遺伝子合成断片は、まずコンストラクトの真核生物発現のためのコザック部位を含み、続いてヒトCD44タンパク質のコード配列及び停止コドンを含むように設計した(コンストラクトのcDNA及びアミノ酸配列を配列番号608及び609に挙げる)。遺伝子合成断片は、断片の最初と最後に制限部位が導入されるようにも設計した。導入された制限部位は、5'末端にはEcoRI及び3'末端にはSalIであり、以下のクローン化の手順に利用した。遺伝子合成断片は、EcoRI及びSalIを介して、pEF‐DHFR(pEF‐DHFRについては、Raumet al. Cancer Imm
unol Immunother 50 (2001) 141‐150、に記載された)と称するプラスミドへ標準的なプロトコルに従ってクローン化した。前記の手順は標準的なプロトコルに従って実施した(Sambrook,Molecular Cloning
; A Laboratory Manual, 3rd edition, Cold Sp
ring Harbour LaboratoryPress, Cold Spring
Harbour, New York (2001))。配列が確認されたヌクレオチド配
列を有するクローンを、コンストラクトの真核生物発現のためにDHFR欠失CHO細胞へトランスフェクトした。DHFR欠失CHO細胞中での真核生物タンパク質発現は、KaufmannR.J. (1990) Methods Enzymol. 185, 5
37‐566、の記載に従って実施した。コンストラクトの遺伝子増幅は、メトトレキサート(MTX)の濃度を最大20nMMTXまでの最終濃度へ上昇させることによって誘発した。
GenBank(受託番号AJ251595)で公開されているヒトCD44のコード配列で、v6エクソンをコードする配列が欠失したものを、標準的なプロトコルに従う遺伝子合成によって得た。遺伝子合成断片は、まずコンストラクトの真核生物発現のためのコザック部位を含み、続いてv6エクソンを持たないヒトCD44タンパク質のコード配列及び停止コドンを含むように設計した(コンストラクトのcDNA及びアミノ酸配列を配列番号610及び611に挙げる)。遺伝子合成断片は、断片の最初と最後に制限部位が導入されるようにも設計した。導入された制限部位は、5'末端にはEcoRI及び3'末端にはSalIであり、以下のクローン化の手順に利用した。遺伝子合成断片は、EcoRI及びSalIを介して、pEF‐DHFR(pEF‐DHFRについては、Rau
met al. Cancer Immunol Immunother 50 (2001)
141‐150、に記載されている)と称するプラスミドへ標準的なプロトコルに従っ
てクローン化した。前記の手順は標準的なプロトコルに従って実施した(Sambrook,Molecular Cloning; A Laboratory Manual,
3rd edition, Cold Spring Harbour Laborator
yPress, Cold Spring Harbour, New York (2001))。配列が確認されたヌクレオチド配列を有するクローンを、コンストラクトの真核生物発現のためにDHFR欠失CHO細胞へトランスフェクトした。DHFR欠失CHO細胞中での真核生物タンパク質発現は、KaufmannR.J. (1990) Methods Enzymol. 185, 537‐566、の記載に従って実施した。コンス
トラクトの遺伝子増幅は、メトトレキサート(MTX)の濃度を最大20nMMTXまでの最終濃度へ上昇させることによって誘発した。
GenBank(受託番号XM_001115359)で公開されているマカクCD44のコード配列で、CD44v6エクソンも含むものを、標準的なプロトコルに従う遺伝子合成によって得た。(コンストラクトのcDNA及びアミノ酸配列を配列番号612及び613に挙げる)。用いたコンストラクトにおいて、コード配列は、CD44タンパク質のシグナルペプチドの5番目のアミノ酸のコドンの第1位での点変異以外はマカクCD44に対応しており、その結果、ヒト配列に対応するアルギニンからトリプトファンへの変異が得られる。遺伝子合成断片は、コンストラクトの真核生物発現のためのコザック部位、及び断片の最初と最後に制限部位が導入されるようにも設計した。導入された制限部位は、5'末端にはEcoRI及び3'末端にはSalIであり、以下のクローン化の手順に利用した。遺伝子合成断片は、次に、EcoRI及びSalIを介して、pEF‐DHFR(pEF‐DHFRについては、Raumet al. Cancer Immuno
l Immunother 50 (2001) 141‐150、に記載されている)と称するプラスミドへクローン化した。このプラスミドの配列が確認されたクローンを用いて、上述のようにCHO/dhfr−細胞をトランスフェクトした。
全般的には、ヒト及び非チンパンジー霊長類CD3イプシロンに対して種間特異的である結合特異性を持つドメイン、並びにヒト及び非チンパンジー霊長類CD44v6に対して種間特異的である結合特異性を持つドメインを各々が含む二重特異性単鎖抗体分子を、以下の表11に挙げるように設計する。
断片は、まずコンストラクトの真核生物発現のためのコザック部位を含み、続いて19アミノ酸免疫グロブリンリーダーペプチドを、続いてフレームを揃えて対応する二重特異性単鎖抗体分子のコード配列を、続いてフレームを揃えてヒスチジン6‐タグのコード配列
及び停止コドンを含むように設計した。遺伝子合成断片は、断片の最初と最後に適切な制限部位が導入されるようにも設計した。導入された制限部位は、以下のクローン化の手順に利用した。遺伝子合成断片は、これらの制限部位を介して、pEF‐DHFR(pEF‐DHFRについては、Raumet al. Cancer Immunol Immunother 50 (2001) 141‐150、に記載されている)と称するプラスミ
ドへ標準的なプロトコルに従ってクローン化した。前記の手順は標準的なプロトコルに従って実施した(Sambrook,Molecular Cloning; A Labo
ratory Manual, 3rd edition, Cold Spring Harbour LaboratoryPress, Cold Spring Harbour,
New York (2001))。配列が確認されたヌクレオチド配列を有するクロー
ンを、コンストラクトの真核生物発現のためにDHFR欠失CHO細胞へトランスフェクトした。DHFR欠失CHO細胞中での真核生物タンパク質発現は、KaufmannR.J. (1990) Methods Enzymol. 185, 537‐566、の
記載に従って実施した。コンストラクトの遺伝子増幅は、メトトレキサート(MTX)の濃度を最大20nMMTXまでの最終濃度へ上昇させることによって誘発した。
二重特異性単鎖抗体分子は、チャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO)中で発現させた。DHFR欠失CHO細胞中の真核生物タンパク質発現は、KaufmannR.J.
(1990) Methods Enzymol. 185, 537‐566、の記載に
従って実施した。コンストラクトの遺伝子増幅は、20nM MTXの最終濃度まで増加
する濃度のMTXを添加することによって誘発した。2継代の静置培養後、ヌクレオシドを含まないHyQPF CHO液体大豆培地(0.1% Pluronic F‐68含有
L‐グルタミン 4.0mMを含む;HyClone)により、ローラーボトル中、回収
まで7日間細胞を増殖させた。細胞を遠心分離で除去し、発現されたタンパク質を含む上清を−20℃で保存した。別の選択肢として、コンストラクトを一過性にHEK293細胞中で発現させた。トランスフェクションは、293fectin試薬(Invitrogen,#12347‐019)を用い、製造元のプロトコルに従って実施した。
た。ZnCl2を充填したFractogel EMD Chelate(登録商標)(M
erck)を用い、製造元が提供するプロトコルに従って固定化金属アフィニティクロマトグラフィ(「IMAC」)を実施した。バッファーA(20mMリン酸ナトリウムバッファー pH 7.2、0.1M NaCl)でカラムを平衡状態とし、細胞培養物の上清
(500ml)を流速3ml/分でカラム(10ml)に適用した。バッファーAでカラムを洗浄して非結合サンプルを除去した。結合したタンパク質を、バッファーB(20mMリン酸ナトリウムバッファー pH 7.2、0.1M NaCl、0.5M イミダゾール)の以下に示す2段階の勾配:
段階1:6カラム分の容量の20%バッファーB
段階2:6カラム分の容量の100%バッファーB
を用いて溶離させた。段階2からの溶離したタンパク質画分をさらなる精製のためにプールした。化学薬品はすべて研究グレードであり、Sigma(ダイゼンホッフェン)又はMerck(ダルムシュタット)より購入した。
perdex 200 分取グレードカラム(GE/アマーシャム)上で実施した。溶離したタンパク質サンプル(流速1ml/分)を標準的なSDS‐PAGE及びウエスタンブロットによる検出に掛けた。精製の前に、分子量測定のためにカラムを校正した(分子量マーカーキット、SigmaMW GF‐200)。タンパク質濃度は、OD280nm
を用いて測定した。
分析
ヒト及びマカクCD44並びにCD3のそれぞれに結合する能力に関して種間特異的二重特異性抗体コンストラクトの機能を試験するために、FACS分析を実施した。この目的のために、実施例28.1で述べるようにヒトCD44でトランスフェクトされたCHO細胞、及びヒトCD3陽性T細胞白血病細胞株HPB‐ALL(DSMZ,ブラウンシュバイク,ACC483)を用いてヒト抗原への結合について試験した。マカク抗原に対する結合反応性は、実施例28.3で述べる作製されたマカクCD44トランスフェクタント、及びマカクPBMC(マカクPBMCの調製は、標準的なプロトコルに従い、マカクザルからの末梢血液のFicoll勾配遠心分離によって行った)を用いて試験した。CD44のv6エクソンに対する特異性は、実施例28.2で述べるようにして作製されたv6エクソンを持たないヒトCD44を発現するトランスフェクトされたCHO細胞を用いて試験した。それぞれの細胞株又はマカクPBMCの200,000個の細胞を、種間特異的二重特異性抗体コンストラクト(5μg/ml)の精製タンパク質50μlと共に、又は市販の抗CD44抗体(BectonDickinson bioscienc
es,ハイデルベルク;同じく5μg/ml)の50μlと共に、30分間氷上にてインキュベートした。細胞を2%FCSを含むPBSで2回洗浄し、マウス抗His抗体(PentaHis抗体;Qiagen;2%FCSを含むPBS50μl中にて1:20に希釈)でコンストラクトの結合を検出した。市販の抗CD44抗体と共にインキュベートしたサンプルについては抗His抗体を省略した。洗浄後、結合した抗His抗体又は抗CD44抗体を、2%FCSを含むPBSで1:100に希釈したフィコエリトリンに結合したFcガンマ特異的抗体(Dianova)で検出した。2%FCSを含むPBSをネガティブコントロールとして用いた。
Current Protocols in Immunology(Coligan,K
ruisbeek, Margulies, Shevach and Strober,
Wiley‐Interscience, 2002)に記載のようにして実施した。
作製された二重特異性単鎖抗体の生物活性を、実施例28.1で述べるCD44陽性細胞株を用いるクロム51(51Cr)放出インビトロ細胞障害性アッセイによって分析した。エフェクター細胞としては、刺激されたヒトCD4/CD56除去PBMCを用いた。
ペトリ皿(直径145mm、Greiner)を、最終濃度1μg/mlの市販の抗CD3特異的抗体(例:OKT3,Othoclone)により37℃にて1時間コーティングした。非結合タンパク質をPBSによる1段階の洗浄によって除去した。新鮮なPBMCを、Ficoll勾配遠心分離により標準的なプロトコルに従って末梢血液(30乃至50mlのヒト血液)から単離した。安定化グルタミン/10%FCS/IL‐220U/ml(Proleukin,Chiron)を含む120mlのRPMI1640中、3‐5×107個のPBMCを、あらかじめコーティングしたペトリ皿に添加し、2日間
刺激した。3日目に細胞を回収し、RPMI1640で1回洗浄した。IL‐2を添加して最終濃度を20U/mlとし、上記と同じ細胞培地中にて細胞を再度1日培養した。
Life Sciences GmbH,ケルン,ドイツ)を用いて実施した。実験データの解析は、Windows(登録商標)用Prism4(バージョン4.02、GraphPadSoftware Inc.,サンディエゴ,カリフォルニア州,米国)を用い
て実施した。このソフトウェアによって決定されるS字型用量反応曲線のR2値は、通常
>0.90である。この解析プログラムによって算出されるEC50値を用いて生物活性を比較した。
29.1 ヒトCD30を発現するCHO細胞の作製
GenBank(受託番号M83554)で公開されているヒトCD30のコード配列を、標準的なプロトコルに従う遺伝子合成によって得た。遺伝子合成断片は、まずコンストラクトの真核生物発現のためのコザック部位を含み、続いて19アミノ酸免疫グロブリンリーダーペプチドを、続いてフレームを揃えて成熟ヒトCD30タンパク質のコード配列及び停止コドンを含むように設計した(コンストラクトのcDNA及びアミノ酸配列を配列番号1103及び1104に挙げる)。遺伝子合成断片は、断片の最初と最後に制限部位が導入されるようにも設計した。導入された制限部位は、5'末端にはEcoRI及
び3'末端にはSalIであり、以下のクローン化の手順に利用した。内部制限部位を遺
伝子合成断片のコード配列のサイレント変異によって除去した(BsrGI:ヌクレオチド243TからCへ;SalI:ヌクレオチド327 AからGへ;SalI:ヌクレオ
チド852 AからGへ;EcoRI:ヌクレオチド1248 TからCへ)。遺伝子合成断片は、EcoRI及びSalIを介して、pEF‐DHFR(pEF‐DHFRについては、Raumet al. Cancer Immunol Immunother 50 (2001) 141‐150、に記載されている)と称するプラスミドへ標準的なプロ
トコルに従ってクローン化した。前記の手順は標準的なプロトコルに従って実施した(Sambrook,Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 3rd edition, Cold Spring Harbour LaboratoryPress, Cold Spring Harbour, New York (2001))。配列が確認されたヌクレオチド配列を有するクローンを、コンストラクトの真核生物発現のためにDHFR欠失CHO細胞へトランスフェクトした。DHFR欠失CHO細胞中での真核生物タンパク質発現は、KaufmannR.J. (1990
) Methods Enzymol. 185, 537‐566、の記載に従って実施した。コンストラクトの遺伝子増幅は、メトトレキサート(MTX)の濃度を最大20nMMTXまでの最終濃度へ上昇させることによって誘発した。
マカクCD30のcDNA配列を、標準的なプロトコルに従って調製したマカクザル骨髄からのcDNAに4回のPCRをセットで施すことによって得た。以下の反応条件:94℃で2分間の1サイクル、続いて94℃で1分間、55℃で1分間、及び72℃で1分間の35サイクル、続いて72℃で3分間の最終サイクル、を用い、並びに以下のプライマー:
6.フォワードプライマー:5'‐cctcgccgcgctgggactgc‐3'
リバースプライマー:5'‐ggtgccactggagggttccttgc‐3'
7.フォワードプライマー:5'‐gcttcttccattctgtctgcccag
cagg‐3'
リバースプライマー:5'‐ggtaggggacacagcgggcacaggagt
tgg‐3'
8.フォワードプライマー:5'‐cctggcatgatctgtgccacatca
gcc‐3'
リバースプライマー:5'‐gcgttgagctcctcctgggtctgg‐3'
9.フォワードプライマー:5'‐cctcccrgcccaagctagagcttg
tgg‐3'
リバースプライマー:5'‐cgactctagagcggccgctcactttcc
agaggcagctgtgggcaaggggtcttctttcccttcc‐3'
を用いた。
ミドへクローン化した。上述のように、このプラスミドの配列が確認されたクローンを用いて、CHO/dhfr−細胞をトランスフェクトした。
種間特異的結合分子のクローン化
全般的には、ヒト及び非チンパンジー霊長類CD3イプシロンに対して種間特異的である結合特異性を持つドメイン、並びにヒト及び非チンパンジー霊長類CD30に対して種間特異的である結合特異性を持つドメインを各々が含む二重特異性単鎖抗体分子を、以下の表12に挙げるように設計した。
DHFRについては、Raumet al. Cancer Immunol Immunother 50 (2001) 141‐150、に記載されている)と称するプラスミド
へ標準的なプロトコルに従ってクローン化した。前記の手順は標準的なプロトコルに従って実施した(Sambrook,Molecular Cloning; A Labor
atory Manual, 3rd edition, Cold Spring Harbour LaboratoryPress, Cold Spring Harbour,
New York (2001))。配列が確認されたヌクレオチド配列を有するクローンを、コンストラクトの真核生物発現のためにDHFR欠失CHO細胞へトランスフェクトした。DHFR欠失CHO細胞中での真核生物タンパク質発現は、KaufmannR.J. (1990) Methods Enzymol. 185, 537‐566、の記
載に従って実施した。コンストラクトの遺伝子増幅は、メトトレキサート(MTX)の濃度を最大20nMMTXまでの最終濃度へ上昇させることによって誘発した。
二重特異性単鎖抗体分子は、チャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO)中で発現させた。DHFR欠失CHO細胞中の真核生物タンパク質発現は、KaufmannR.J.
(1990) Methods Enzymol. 185, 537‐566、の記載に
従って実施した。コンストラクトの遺伝子増幅は、20nM MTXの最終濃度まで増加
する濃度のMTXを添加することによって誘発した。2継代の静置培養後、ヌクレオシドを含まないHyQPF CHO液体大豆培地(0.1% Pluronic F‐68含有
L‐グルタミン 4.0mMを含む;HyClone)により、ローラーボトル中、回収
まで7日間細胞を増殖させた。細胞を遠心分離で除去し、発現されたタンパク質を含む上清を−20℃で保存した。別の選択肢として、コンストラクトを一過性にHEK293細胞中で発現させた。トランスフェクションは、293fectin試薬(Invitrogen,#12347‐019)を用い、製造元のプロトコルに従って実施した。
た。ZnCl2を充填したFractogel EMD Chelate(登録商標)(M
erck)を用い、製造元が提供するプロトコルに従って固定化金属アフィニティクロマトグラフィ(「IMAC」)を実施した。バッファーA(20mMリン酸ナトリウムバッファー pH 7.2、0.1M NaCl)でカラムを平衡状態とし、細胞培養物の上清
(500ml)を流速3ml/分でカラム(10ml)に適用した。バッファーAでカラムを洗浄して非結合サンプルを除去した。結合したタンパク質を、バッファーB(20mMリン酸ナトリウムバッファー pH 7.2、0.1M NaCl、0.5M イミダゾール)の以下に示す2段階の勾配:
段階1:6カラム分の容量の20%バッファーB
段階2:6カラム分の容量の100%バッファーB
を用いて溶離させた。段階2からの溶離したタンパク質画分をさらなる精製のためにプールした。化学薬品はすべて研究グレードであり、Sigma(ダイゼンホッフェン)又はMerck(ダルムシュタット)より購入した。
を用いて測定した。
分析
ヒト及びマカクCD30並びにCD3のそれぞれに結合する能力に関して種間特異的二重特異性抗体コンストラクトの機能を試験するために、FACS分析を実施した。この目的のために、実施例29.1で述べるようにヒトCD30でトランスフェクトされたCHO細胞、ヒトCD30陽性B細胞株MEC‐1(DSMZ,ブラウンシュバイク,ACC497)、及びヒトCD3陽性T細胞白血病細胞株HPB‐ALL(DSMZ,ブラウンシュバイク,ACC483)を用いてヒト抗原への結合について試験した。マカク抗原に対する結合反応性は、実施例29.2で述べる作製されたマカクCD30トランスフェクタント、及びマカクT細胞株4119LnPx(Prof.Fickenscher,Hygiene Institute, Virology, Erlangen‐Nuer
nberg、よりご提供頂いた;Knappe A, et al., and Ficke
nscherH., Blood 2000, 95, 3256‐61、にて発表)を用いて試験した。それぞれの細胞株の200,000個の細胞を、種間特異的二重特異性抗体コンストラクト(5μg/ml)の精製タンパク質50μlと共に、30分間氷上にてインキュベートした。細胞を2%FCSを含むPBSで2回洗浄し、マウスPentaHis抗体(Qiagen;2%FCSを含むPBS50μl中にて1:20に希釈)でコンストラクトの結合を検出した。洗浄後、結合した抗His抗体を、2%FCSを含むPBSで1:100に希釈したフィコエリトリンに結合したFcガンマ特異的抗体(Dianova)で検出した。2%FCSを含むPBSをネガティブコントロールとして用いた。
Current Protocols in Immunology(Coligan,K
ruisbeek, Margulies, Shevach and Strober,
Wiley‐Interscience, 2002)に記載のようにして実施した。
作製された二重特異性単鎖抗体の生物活性を、実施例29.2で述べたヒトCD30陽性B細胞株MEC‐1(DSMZ,ブラウンシュバイク,ACC497)及びマカクCD30でトランスフェクトされたCHO細胞を用いるクロム51(51Cr)放出インビトロ細胞障害性アッセイによって分析した。エフェクター細胞としては、刺激されたヒトCD4/CD56除去PBMC、又はマカクT細胞株4119LnPxをそれぞれ用いた。
ペトリ皿(直径145mm、Greiner bio‐one GmbH,クレムスミュンスター)を、最終濃度1μg/mlの市販の抗CD3特異的抗体(例:OKT3,Othoclone)により37℃にて1時間コーティングした。非結合タンパク質をPBSによる1段階の洗浄によって除去した。新鮮なPBMCを、Ficoll勾配遠心分離により標準的なプロトコルに従って末梢血液(30乃至50mlのヒト血液)から単離した。安定化グルタミン/10%FCS/IL‐220U/ml(Proleukin,Chiron)を含む120mlのRPMI1640中、3‐5×107個のPBMCを、あら
かじめコーティングしたペトリ皿に添加し、2日間刺激した。3日目に細胞を回収し、RPMI1640で1回洗浄した。IL‐2を添加して最終濃度を20U/mlとし、上記と同じ細胞培地中にて細胞を再度1日培養した。
ンター(Perkin Elmer Life Sciences GmbH,ケルン,ドイツ)を用いて実施した。実験データの解析は、Windows(登録商標)用Prism4(バージョン4.02、GraphPadSoftware Inc.,サンディエゴ
,カリフォルニア州,米国)を用いて実施した。このソフトウェアによって決定されるS字型用量反応曲線のR2値は、通常>0.90である。この解析プログラムによって算出
されるEC50値を用いて生物活性を比較した。
30.1 ヒトHER2を発現するCHO細胞の作製
GenBank(受託番号X03363)で公開されているヒトHER2のコード配列を、標準的なプロトコルに従う遺伝子合成によって得た。遺伝子合成断片は、そのリーダ
ーペプチドを含むヒトHER2タンパク質のコード配列が含まれるように設計した(コンストラクトのcDNA及びアミノ酸配列を配列番号1107及び1108に挙げる)。遺伝子合成断片は、断片の最初と最後に制限部位が導入されるようにも設計した。導入された制限部位は、5'末端にはXbaI及び3'末端にはSalIであり、以下のクローン化の手順に利用した。遺伝子合成断片は、XbaI及びSalIを介して、pEF‐DHFR(pEF‐DHFRについては、Raumet al. Cancer Immunol Immunother 50 (2001) 141‐150、に記載されている)と称す
るプラスミドへ標準的なプロトコルに従ってクローン化した。前記の手順は標準的なプロトコルに従って実施した(Sambrook,Molecular Cloning; A
Laboratory Manual, 3rd edition, Cold Spring Harbour LaboratoryPress, Cold Spring Har
bour, New York (2001))。配列が確認されたヌクレオチド配列を有
するクローンを、コンストラクトの真核生物発現のためにDHFR欠失CHO細胞へトランスフェクトした。DHFR欠失CHO細胞中での真核生物タンパク質発現は、KaufmannR.J. (1990) Methods Enzymol. 185, 537‐
566、の記載に従って実施した。コンストラクトの遺伝子増幅は、メトトレキサート(MTX)の濃度を最大20nMMTXまでの最終濃度へ上昇させることによって誘発した。
上述のヒトHER2のコード配列を、GenBank(受託番号XP_001090430)で公開されているようにマカクHER2タンパク質のアミノ酸123乃至1038をコードするように修飾した。このキメラタンパク質に対するコード配列は、標準的なプロトコルに従う遺伝子合成によって得た(コンストラクトのcDNA及びアミノ酸配列を配列番号1109及び1110に挙げる)。遺伝子合成断片は、コンストラクトの真核生物発現のためのコザック部位、及び断片の最初と最後に制限部位を含むようにも設計した。導入された制限部位は、5'末端にはXbaI及び3'末端にはSalIであり、以下のクローン化の手順に利用した。遺伝子合成断片は、XbaI及びSalIを介して、pEF‐DHFR(pEF‐DHFRについては、Raumet al. Cancer Im
munol Immunother 50 (2001) 141‐150、に記載されている)と称するプラスミドへクローン化した。このプラスミドの配列が確認されたクローンを用いて、上述のようにCHO/dhfr−細胞をトランスフェクトした。
種間特異的結合分子のクローン化
全般的には、ヒト及び非チンパンジー霊長類CD3イプシロンに対して種間特異的である結合特異性を持つドメイン、並びにヒト及びマカクHER2に対して種間特異的である結合特異性を持つドメインを各々が含む二重特異性単鎖抗体分子を、以下の表13に挙げるように設計する。
ドへ標準的なプロトコルに従ってクローン化した。前記の手順は標準的なプロトコルに従って実施した(Sambrook,Molecular Cloning; A Labo
ratory Manual, 3rd edition, Cold Spring Harbour LaboratoryPress, Cold Spring Harbour,
New York (2001))。配列が確認されたヌクレオチド配列を有するクロー
ンを、コンストラクトの真核生物発現のためにDHFR欠失CHO細胞へトランスフェクトした。DHFR欠失CHO細胞中での真核生物タンパク質発現は、KaufmannR.J. (1990) Methods Enzymol. 185, 537‐566、の
記載に従って実施した。コンストラクトの遺伝子増幅は、メトトレキサート(MTX)の濃度を最大20nMMTXまでの最終濃度へ上昇させることによって誘発した。
二重特異性単鎖抗体分子は、チャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO)中で発現させた。DHFR欠失CHO細胞中の真核生物タンパク質発現は、KaufmannR.J.
(1990) Methods Enzymol. 185, 537‐566、の記載に
従って実施した。コンストラクトの遺伝子増幅は、20nM MTXの最終濃度まで増加
する濃度のMTXを添加することによって誘発した。2継代の静置培養後、ヌクレオシドを含まないHyQPF CHO液体大豆培地(0.1% Pluronic F‐68含有
L‐グルタミン 4.0mMを含む;HyClone)により、ローラーボトル中、回収
まで7日間細胞を増殖させる。細胞を遠心分離で除去し、発現されたタンパク質を含む上清を−80℃で保存した。トランスフェクションは、293fectin試薬(Invitrogen,#12347‐019)を用い、製造元のプロトコルに従って実施した。
た。ZnCl2を充填したFractogel EMD Chelate(登録商標)(M
erck)を用い、製造元が提供するプロトコルに従って固定化金属アフィニティクロマトグラフィ(「IMAC」)を実施した。バッファーA(20mMリン酸ナトリウムバッファー pH 7.2、0.1M NaCl)でカラムを平衡状態とし、細胞培養物の上清
(500ml)を流速3ml/分でカラム(10ml)に適用した。バッファーAでカラムを洗浄して非結合サンプルを除去した。結合したタンパク質を、バッファーB(20mMリン酸ナトリウムバッファー pH 7.2、0.1M NaCl、0.5M イミダゾール)の以下に示す2段階の勾配:
段階1:6カラム分の容量の20%バッファーB
段階2:6カラム分の容量の100%バッファーB
を用いて溶離させた。段階2からの溶離したタンパク質画分をさらなる精製のためにプールした。化学薬品はすべて研究グレードであり、Sigma(ダイゼンホッフェン)又はMerck(ダルムシュタット)より購入した。
を用いて測定した。
分析
ヒト及びマカクHER2並びにCD3のそれぞれに結合する能力に関して種間特異的二重特異性抗体コンストラクトの機能を試験するために、FACS分析を実施した。この目的のために、実施例30.1で述べるようにヒトHER2でトランスフェクトされたCHO細胞、及びヒトCD3陽性T細胞白血病細胞株HPB‐ALL(DSMZ,ブラウンシュバイク,ACC483)を用いてヒト抗原への結合について試験する。マカク抗原に対する結合反応性は、実施例30.2で述べる作製されたマカクHER2トランスフェクタント、及びマカクT細胞株4119LnPx(Prof.Fickenscher,Hygiene Institute, Virology, Erlangen‐Nuern
berg、よりご提供頂いた;Knappe A, et al., and Ficken
scherH., Blood 2000, 95, 3256‐61、にて発表)を用いて試験した。それぞれの細胞株の200,000個の細胞を、種間特異的二重特異性抗体コンストラクト(2μg/ml)の精製タンパク質50μlと共に、30分間氷上にてインキュベートした。2%FCSを含むPBSで細胞を2回洗浄し、マウス抗His抗体(PentaHis抗体;Qiagen;2%FCSを含むPBS50μl中にて1:20に希釈)でコンストラクトの結合を検出した。洗浄後、結合した抗His抗体を、2%FCSを含むPBSで1:100に希釈したフィコエリトリンに結合したFcガンマ特異的抗体(Dianova)で検出した。2%FCSを含むPBSを、T細胞株並びにHER2でトランスフェクトされたCHO細胞への結合に対するネガティブコントロールとして用いた。
tソフトウェアを用いてデータの取得及び解析を行った(BectonDickinson biosciences,ハイデルベルク)。FACS染色及び蛍光強度の測定は、
Current Protocols in Immunology(Coligan,K
ruisbeek, Margulies, Shevach and Strober,
Wiley‐Interscience, 2002)に記載のようにして実施した。
作製された二重特異性単鎖抗体の生物活性を、実施例30.1及び30.2で述べるHER2陽性B細胞株を用いるクロム51(51Cr)放出インビトロ細胞障害性アッセイによって分析した。エフェクター細胞としては、それぞれの図に示すように、刺激されていないヒトCD56除去PBMC、又はマカクT細胞株4119LnPxを用いた。
新鮮なPBMCを、Ficoll勾配遠心分離により標準的なプロトコルに従って末梢血液(30乃至50mlのヒト血液)から単離した。CD56+NK細胞の除去は標準的なプロトコルに従って実施した。
験データの解析は、Windows(登録商標)用Prism4(バージョン4.02、GraphPadSoftware Inc.,サンディエゴ,カリフォルニア州,米国
)を用いて実施した。このソフトウェアによって決定されるS字型用量反応曲線のR2値
は、通常>0.90である。この解析プログラムによって算出されるEC50値を用いて生物活性を比較した。
31.1 単離されたN末端アミノ酸1‐27に対応するコンテクスト非依存性ヒトC
D3イプシロンエピトープを提示するアフィニティカラムの作製
上述のヒト免疫グロブリンIgG1のヒンジ及びFcガンマ領域と融合したヒトCD3イプシロン鎖の1‐27N末端アミノ酸から成るコンストラクト1‐27CD3‐Fc(
実施例3;組換え融合タンパク質のcDNA配列及びアミノ酸配列を配列番号350及び349に挙げる)の発現のためのプラスミドを、このコンストラクトの真核生物発現のためにDHFR欠失CHO細胞へトランスフェクトした。DHFR欠失CHO細胞中での真核生物タンパク質発現は、KaufmannR.J. (1990) Methods E
nzymol. 185, 537‐566、の記載に従って実施した。コンストラクトの遺伝子増幅は、メトトレキサート(MTX)の濃度を最大20nMMTXまでの最終濃度へ上昇させることによって誘発した。2継代の静置培養後、ヌクレオシドを含まないHyQ PF CHO液体大豆培地(0.1% Pluronic F‐68含有L‐グルタミン4.0mMを含む;HyClone)により、ローラーボトル中、回収まで7日間細胞を増殖させた。細胞を遠心分離で除去し、発現されたタンパク質を含む上清を−20℃で保存した。融合タンパク質の単離のために、ウシ、ウマ、及びマウス血清タンパク質との交差反応が最小限である市販のアフィニティ精製ヤギ抗ヒトIgGfc断片特異的抗体(JacksonImmunoResearch Europe Ltd.)を用いて、ヤギ抗ヒトfcアフィニティカラムを標準的なプロトコルに従って調製した。このアフィニティカラムを用いて、AktaExplorer System(GE アマーシャム)上にて細胞培養物の上清から融合タンパク質を単離し、クエン酸で溶離した。溶離液を中和し、濃縮した。アミンを含まないカップリングバッファーに対する透析の後、精製された融合タンパク質を、N‐ヒドロキシスクシンイミドNHS活性化1mlHiTrapカラム(GE アマーシャム)へカップリングさせた。
分子の精製
種間特異的二重特異性単鎖分子を発現する細胞の細胞培養物の上清200mlに0.2μmの滅菌ろ過を施し、Akta ExplorerSystem(GE アマーシャム)を用いてCD3ペプチドアフィニティカラムへ適用した。
。ランニングバッファーは1×MES‐SDS‐Puffer(Invitrogen)とした。タンパク質スタンダードとしては、15μlの染色SharpProtein
Standard(Invitrogen)を適用した。電気泳動は、最大200ボルト120mAにて60分間行った。ゲルを脱塩水で洗浄し、クーマシーで1時間染色した。ゲルの脱染は脱塩水中で3時間行う。画像の撮影は、SyngeneGelドキュメンテーションシステムで行う。
セルロース膜上にエレクトロブロットした。この膜をPBS中の2%ウシ血清アルブミンでブロックし、ビオチン化マウスPentaHis抗体(Qiagen)と共にインキュベートした。二次試薬としては、ストレプトアビジンアルカリホスファターゼ複合体(DAKO)を用いた。ブロットは、BCIP/NBT基質溶液(Pierce)で発色させ
た。
32.1 薬物動態アッセイに用いる1‐27CD3‐Fcの作製
ヒト免疫グロブリンIgG1のヒンジ及びFcガンマ領域と融合したヒトCD3イプシロン鎖の1‐27N末端アミノ酸のコード配列を、標準的なプロトコルに従う遺伝子合成によって得た(組換え融合タンパク質のcDNA配列及びアミノ酸配列を配列番号1111及び1112に挙げる)。遺伝子合成断片は、まずコンストラクトの真核生物発現のためのコザック部位を含み、続いて19アミノ酸免疫グロブリンリーダーペプチドを、続いてフレームを揃えて成熟ヒトCD3イプシロン鎖の細胞外部分の最初の27個のアミノ酸のコード配列を、続いてフレームを揃えてヒトIgG1のヒンジ領域及びFcガンマ部分のコード配列、並びに停止コドンを含むように設計した。遺伝子合成断片は、この融合タンパク質をコードするcDNAの最初と最後に制限部位が導入されるようにも設計した。導入された制限部位は、5'末端にはEcoRI及び3'末端にはSalIであり、以下のクローン化の手順に利用した。遺伝子合成断片は、EcoRI及びSalIを介して、pEF‐DHFR(pEF‐DHFRについては、Raumet al. Cancer Im
munol Immunother 50 (2001) 141‐150、に記載されている)と称するプラスミドへ標準的なプロトコルに従ってクローン化した。前記の手順は標準的なプロトコルに従って実施した(Sambrook,Molecular Clon
ing; A Laboratory Manual, 3rd edition, Cold
Spring Harbour LaboratoryPress, Cold Spri
ng Harbour, New York (2001))。配列が確認されたヌクレオチド配列を有するクローンを、コンストラクトの真核生物発現のためにDHFR欠失CHO細胞へトランスフェクトした。DHFR欠失CHO細胞中での真核生物タンパク質発現は、KaufmannR.J. (1990) Methods Enzymol. 185,
537‐566、の記載に従って実施した。コンストラクトの遺伝子増幅は、メトトレ
キサート(MTX)の濃度を最大20nMMTXまでの最終濃度へ上昇させることによって誘発した。2継代の静置培養後、ヌクレオシドを含まないHyQ PF CHO液体大豆培地(0.1% Pluronic F‐68含有L‐グルタミン4.0mMを含む;HyClone)により、ローラーボトル中、回収まで7日間細胞を増殖させた。細胞を遠心分離で除去し、発現されたタンパク質を含む上清を−20℃で保存した。融合タンパク質の単離のために、ウシ、ウマ、及びマウス血清タンパク質との交差反応が最小限である市販のアフィニティ精製ヤギ抗ヒトIgGfc断片特異的抗体(JacksonImmunoResearch Europe Ltd.)を用いて、ヤギ抗ヒトfcアフィニティカラムを標準的なプロトコルに従って調製した。このアフィニティカラムを用いて、AktaExplorer System(GE アマーシャム)上にて細胞培養物の上清から融合タンパク質を単離し、クエン酸で溶離した。溶離液を中和し、濃縮した。
このアッセイは、Sektor Imagerデバイス(MSD)上で測定するカーボン
プレート上のルテニウム標識検出を用いるECL‐ELISA法に基づくものである。第一の工程では、カーボンプレート(MSDHigh Bind Plate 96ウェル Cat:L15xB‐3)を、50ng/mlの実施例32.1で述べる精製した1‐27
CD3‐Fcにより5μl/ウェルでコーティングした。次に、プレートを25℃で一晩乾燥した。続いて、PBS中の5%BSA(Paesel&Lorei#100568)150μl/ウェルにより、25℃で1時間、攪拌しながら(700rpm)インキュベーター中にてプレートをブロックした。次の工程では、PBS中の0.05%Tweenによりプレートを3回洗浄した。PBS中50%のマカク血清中での検量線を、このアッセイで検出すべきそれぞれの種間特異的二重特異性単鎖分子100ng/mlから始めて段階的な1:4希釈によって作成した。品質管理(QC)サンプルを、PBS中50%のマカク血清中にて、予想されるサンプル血清濃度に応じて、それぞれの種間特異的二重特異性単鎖分子の1ng/mlから50ng/mlまでの範囲で調製した。スタンダード、QC、又は未知サンプルを10μl/ウェルでカーボンプレートへ移し、25℃で90分間、振とうしながら(700rpm)インキュベーター中でインキュベートした。続いてPBS中の0.05%Tweenによりプレートを3回洗浄した。検出には、25μl/ウェルのペンタ‐His‐ビオチン抗体(Qiagen、PBS中の0.05%Tween中200μg/ml)を添加し、25℃で1時間、振とうしながら(700rpm)インキュベーター中でインキュベートした。第二の検出工程では、ストレプトアビジン‐スルホタグ溶液(Streptavidin‐SulfoTagsolution)(MSD;Cat:R32AD‐1;Lot:W0010903)を添加し、25℃で1時間、振とうしながら(700rpm)インキュベーター中でインキュベートした。続いてPBS中の0.05%Tweenによりプレートを3回洗浄した。最後に、150μl/ウェルのMSDReading Buffer(MSD、Cat:R9ZC‐1)を添加し、
プレートをSektor Imagerデバイスで読み取った。
33.1 1‐27CD3‐EpCAMのクローン化及び発現
種々の非チンパンジー霊長類(マーモセット、タマリン、リスザル)及びブタからCD3イプシロンを単離した。ヒト成体、コモンマーモセット(Callithrixjacchus)、ワタボウシタマリン(Saguinus oedipus)、コモンリスザ
ル(Saimiri sciureus)、及び家畜ブタ(Sus scrofa;ネガティブコントロールとして用いた)のCD3イプシロン鎖のN末端アミノ酸1‐27がFlagタグカニクイザルEpCAMのN末端へ融合したもののコード配列を、標準的なプロトコルに従う遺伝子合成によって得た(組換え融合タンパク質のcDNA配列及びアミノ酸配列を配列番号351乃至360に挙げる)。遺伝子合成断片は、標的発現ベクターに既に存在する19アミノ酸免疫グロブリンリーダーペプチドのコード配列との正しいリーディングフレーム内での融合を可能とするためのBsrGI部位をまず含み、続いてフレームを揃えて成熟CD3イプシロン鎖の細胞外部分のN末端1‐27アミノ酸のコード配列を、続いてフレームを揃えてFlagタグのコード配列を、続いてフレームを揃えて成熟カニクイザルEpCAM膜貫通タンパク質のコード配列を含むように設計した。遺伝子合成断片は、融合タンパク質をコードするcDNAの最初と最後に制限部位が導入されるようにも設計した。導入された制限部位は、5'末端にはBsrGI及び3'末端にはSalIであり、以下のクローン化の手順に利用した。遺伝子合成断片は、次にBsrGI及
びSalIを介して、19アミノ酸免疫グロブリンリーダーペプチドのコード配列をすでに含んでいるpEF‐DHFR(pEF‐DHFRについては、Raumet al. Cancer Immunol Immunother 50 (2001) 141‐150
、に記載されている)と称するプラスミドの誘導体へ標準的なプロトコルに従ってクローン化した。配列が確認されたプラスミドを用いて、コンストラクトの真核生物発現のためにDHFR欠失CHO細胞をトランスフェクトした。DHFR欠失CHO細胞中での真核生物タンパク質発現は、KaufmannR.J. (1990) Methods En
zymol. 185, 537‐566、の記載に従って実施した。コンストラクトの遺伝子増幅は、メトトレキサート(MTX)の濃度を最大20nMMTXまでの最終濃度へ上昇させることによって誘発した。
個の細胞を、2%FCSを含むPBS中5μg/mlの抗FlagM2抗体(Sigma‐Aldrich ChemieGmbH,タウフキルヘン,ドイツ)50μlと共に数
多くインキュベートした。結合した抗体は、R‐フィコエリトリンと結合したアフィニティ精製F(ab')2断片、ヤギ抗マウスIgG、Fc‐ガンマ断片特異的、を2%FC
Sを含むPBS中1:100に希釈したもの(JacksonImmunoResearch Europe Ltd.,ニューマーケット,サフォーク,英国)で検出した。フローサイトメトリーはFACS‐Calibur装置上で実施し、CellQuestソフトウェアを用いてデータの取得及び解析を行った(BectonDickinson b
iosciences,ハイデルベルク)。FACS染色及び蛍光強度の測定は、Current Protocols in Immunology(Coligan,Krui
sbeek, Margulies, Shevach and Strober, Wil
ey‐Interscience, 2002)に記載のようにして実施した。
種間特異的単鎖抗CD3抗体の結合の検出法を改良するために、I2C VHVL特異
性を、マウスIgG1及びマウスカッパ定常領域を有するIgG1抗体へ転換する。IgG抗体の重鎖をコードするcDNA配列を、標準的なプロトコルに従う遺伝子合成によって得た。遺伝子合成断片は、まずコンストラクトの真核生物発現のためのコザック部位を含み、続いて19アミノ酸免疫グロブリンリーダーペプチドを、続いてフレームを揃えて重鎖可変領域又は軽鎖可変領域のコード配列を、続いてフレームを揃えてGenBank(受託番号AB097849)で公開されているマウスIgG1の重鎖定常領域のコード配列又はGenBank(受託番号D14630)で公開されているマウスカッパ軽鎖定常領域のコード配列をそれぞれ含むように設計した。
munol Immunother 50 (2001) 141‐150、に記載されている)と称するプラスミドへ、及び軽鎖コンストラクトに対してはpEFADA(pEFADAについては、Raumet al. Cancer Immunol Immunoth
er 50 (2001) 141‐150、に記載されている)と称するプラスミドへ標
準的なプロトコルに従ってクローン化した。配列が確認されたプラスミドを用いて、軽鎖及び重鎖コンストラクトのそれぞれを、コンストラクトの真核生物発現のためにDHFR欠失CHO細胞へ共トランスフェクトした。DHFR欠失CHO細胞中での真核生物タンパク質発現は、KaufmannR.J. (1990) Methods Enzymo
l. 185, 537‐566、の記載に従って実施した。コンストラクトの遺伝子増幅は、メトトレキサート(MTX)の濃度を最大20nMMTXまでの最終濃度へ、及びデオキシコホルマイシン(dCF)の濃度を最大300nM dCFまでの最終濃度へ上昇
させることによって誘発した。2継代の静置培養後、細胞培養物の上清を回収して続いての実験に用いた。
実施例33.1で述べるカニクイザルEp‐CAMに融合したヒト、マーモセット、タマリン、及びリスザルのCD3イプシロン鎖のN末端アミノ酸1‐27のそれぞれに対する作製したI2CIgG1コンストラクトの結合を、標準的なプロトコルに従ってFACSアッセイで試験した。この目的のために、2.5×105個の細胞を、実施例33.2
で述べるI2C IgG1コンストラクトを含む細胞培養物の上清50μl共に数多くイ
ンキュベートした。抗体の結合は、R‐フィコエリトリンと結合したアフィニティ精製F(ab')2断片、ヤギ抗マウスIgG、Fc‐ガンマ断片特異的、を2%FCSを含む
PBS中1:100に希釈したもの(JacksonImmunoResearch E
urope Ltd.,ニューマーケット,サフォーク,英国)で検出した。フローサイ
トメトリーはFACS‐Calibur装置上で実施し、CellQuestソフトウェアを用いてデータの取得及び解析を行った(BectonDickinson bios
ciences,ハイデルベルク)。FACS染色及び蛍光強度の測定は、Current Protocols in Immunology(Coligan,Kruisbe
ek, Margulies, Shevach and Strober, Wiley‐
Interscience, 2002)に記載のようにして実施した。
D3イプシロンのN末端アミノ酸1‐27に対する種間特異的特異性I2Cの強い結合活性を示している。
CD3イプシロンに特異的である実施例33.2で述べる結合特異性I2Cを持つキメラIgG1抗体を、N末端His6タグを持つ及び持たないヒトCD3イプシロンに対する結合について試験した。実施例6.1で述べるHis6‐ヒトCD3イプシロンで、及び実施例5.1で述べる野生型ヒトCD3イプシロンでそれぞれトランスフェクトされたEL4細胞株に対する抗体の結合を、FACSアッセイにより標準的なプロトコルに従って試験した。トランスフェクタントの2.5×105個の細胞を、I2C IgG1コンストラクトを含む細胞培養物の上清50μl共に、又は2%FCSを含むPBS中5μg/mlのそれぞれのコントロール抗体50μlと共にインキュベートした。ネガティブコントロールとしては適切なアイソタイプコントロールを、コンストラクトの発現に対するポ
ジティブコントロールとしてはCD3特異的抗体UCHT‐1をそれぞれ用いた。His6タグの検出は、ペンタHis抗体(Qiagen)で行った。抗体の結合は、R‐フィコエリトリンと結合したアフィニティ精製F(ab')2断片、ヤギ抗マウスIgG、F
c‐ガンマ断片特異的、を2%FCSを含むPBS中1:100に希釈したもの(JacksonImmunoResearch Europe Ltd.,ニューマーケット,サフォーク,英国)で検出した。フローサイトメトリーはFACS‐Calibur装置上で実施し、CellQuestソフトウェアを用いてデータの取得及び解析を行った(BectonDickinson biosciences,ハイデルベルク)。FACS
染色及び蛍光強度の測定は、Current Protocols in Immunol
ogy(Coligan,Kruisbeek, Margulies, Shevach
and Strober, Wiley‐Interscience, 2002)に記載のようにして実施した。
ヒト抗体生殖系列VH配列VH3 3‐72(http://vbase.mrc‐c
pe.cam.ac.uk/)を、CDRH1(配列番号1486)、CDRH2(配列番号1487)、及びCDRH3(配列番号1488)に対するフレームワークコンテクストとして選択した。同様に、ヒト抗体生殖系列VH配列VH33‐73(http://vbase.mrc‐cpe.cam.ac.uk/)を、CDRH1(配列番号1492)、CDRH2(配列番号1493)、及びCDRH3(配列番号1494)に対するフレームワークコンテクストとして選択した。各々のヒトVHについて、およそ15乃至20ヌクレオチドの末端区間でオーバーラップするいくつかの縮重オリゴヌクレオチドを合成する必要があった。このために、第二のプライマーはすべてアンチセンスプライマーであった。VH33‐72に対しては以下のオリゴヌクレオチドを用いた:
5'VH72‐A‐XhoI
GAAGTGAAGCTTCTCGAGTCTGGAGGAGGCTTGGTGCAACCTGGAGGATCCMTGARACTCTCTTGTGCTGCT
3'VH72‐B
CTGGCGGACCCAGTCCATCCAGGCATCACTAAAAGTGAATCCAGAAGCAGCACAAGAGAG
5'VH72‐C
GACTGGGTCCGCCAGKCTCCAGRGAAGGGGCTTGAGTGGGTTGSTGAAATTAGAAACAAAGCCAAT
3'VH72‐D
TTTGGAATCATCTCTTGAGATGGTGAACCTCCCTTTCACAGACTCATCATAATATGTTGCATGATTATTGGCTTTGTTTCT
5'VH72‐E
AGAGATGATTCCAAAARTAGMSTGTACCTGCAAATGAWMAGCTTAARARCTGAAGACACTGSCSTTTATTACTGTACTGGG
3'VH72‐F‐BstEII
GACCGTGGTGACCAGAGTCCCCTGGCCCCAGTTAGCAAACTCCCCAGTACAGTAATA
5'VH73‐A‐XhoI
CAAGTTCAGCTGCTCGAGTCTGGAGGAGGCTTGGTGCAACCTGGAGGATCC
3'VH73‐B
CCAGTTCATCCAGTAGTTACTGAAAGTGAATCCAGAGGCARCACAGGAGAGTTTCAKGGATCCTCCAGGTTG
5'VH73‐C
TACTGGATGAACTGGGTCCGCCAGKCTYCAGRGAAGGGGCTTGAGTGGGTTGSTGAAATTAGATTGAAATCTAAT
3'VH73‐D
TTTGGAATCATCTCTTGAGATGGTGAACCTCCCTTTCACAGACTCCGCATAATGTGTTGCATAATTATTAGATTTCAATCT
5'VH73‐E
AGAGATGATTCCAAAARTASTGYCTACCTGCAAATGAACARCTTAARARCTGAAGACACTGSCRTTTATTACTGTACGGGA
3'VH73‐F‐BstEII
GACCGTGGTGACCGTGGTCCCTTGGCCCCAGTAAGCAAATTGTCCCACTCCCGTACAGTAATA
各セット内では、同量のプライマー(例:20μlPCR反応に対して1μlの各プライマー(プライマーストック20乃至100μM))を混合し、PCRバッファー、ヌクレオチド、及びTaqポリメラーゼから成るPCR混合物へ添加した。この混合物をPCRサイクラー中にて94℃で3分間、65℃で1分間、62℃で1分間、59℃で1分間、56℃で1分間、52℃で1分間、50℃で1分間、及び72℃で10分間インキュベートした。続いて生成物をアガロースゲル電気泳動に掛け、標準的な方法に従って200乃至400のサイズの生成物をゲルから単離した。
込まれたプライマーを用いる標準的なPCR反応のテンプレートとして用いた。適切なサイズのDNA断片(VHに対してはおよそ350ヌクレオチド)を、標準的な方法に従うアガロースゲル電気泳動によって単離した。この方法により、十分なVHDNA断片が増幅された。
pe.cam.ac.uk/)を、CDRL1(配列番号1489)、CDRL2(配列番号1490)、及びCDRL3(配列番号1491)に対するフレームワークコンテクストとして選択した。同様に、ヒト抗体生殖系列VL配列VL77a(http://vbase.mrc‐cpe.cam.ac.uk/)を、CDRL1(配列番号1495)、CDRL2(配列番号1496)、及びCDRL3(配列番号1497)に対するフ
レームワークコンテクストとして選択した。各々のヒトVLについて、およそ15乃至20ヌクレオチドの末端区間でオーバーラップするいくつかの縮重オリゴヌクレオチドを合成する必要があった。このために、第二のプライマーはすべてアンチセンスプライマーであった。後のクローン化に必要であるオリゴヌクレオチド内の制限部位を除去した。VkIIA18に対しては以下のオリゴヌクレオチドを用いた:
5'Vk2A18‐A‐SacICCTGATGAGCTCGTGATGACCCAAA
CTCCACTCTCCCTGYCTGTCASTCYTGGASAKCMAGCTTCCATCTCTTGC
3'Vk2A18‐B
CCAATATAAATAGGTGTTTCCATTGTTGTGTACCAGGTTCTGACTAGATCTGCAAGAGATGGAAGC
5'Vk2A18‐C
ACCTATTTATATTGGTWCCTGCAGAAGYCAGGCCAGTCTCCAMAGCTCCTGATTTATAGGGCTTCCATC
3'Vk2A18‐D
CTTGAGTGTGAAATCTGTCYCTGATCCACTGCCACTGAACCTGTCTGGGACCCCAGAAAATCGGATGGAAGCCCTATA
5'Vk2A18‐E
ACAGATTTCACACTCAAGATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATSTGGGAGTTTATTWCTGCTTTCAAGGTACACAT
3'Vk2A18‐F‐BsiWI/SpeI
CCCGATACTAGTCGTACGTTTGATTTCCAGCTTGGTGCCTTGACCGAACGTCCACGGAACATGTGTACCTTGAAAGCA
5'Vlam7a‐A‐SacI
CCTGCAGAGCTCGTTGTGACTCAGGAAYCTKCACTCACCRYATCACCTGGTGRAACAGTCACACTCACTTGT
3'Vlam7a‐B
CCAGTTGGCATAGTTACTTGTTGTAACAGCCCCAGTACTTGAGCGACAAGTGAGTGTGACTGT
5'Vlam7a‐C
AACTATGCCAACTGGKTCCAASAAAAACCAGRTCAKKYAYYCMSTGSTCTAATAKRTGGTACCAACAACCGA
3'Vlam7a‐D
GGTGAGGGCAGCCTTGYCTCCAAKCAGGGAGCCTGAGAATCTGGCAGGARYMCMTGGTGCTCGGTTGTTGGTACC
5'Vlam7a‐E
AAGGCTGCCCTCACCMTCWCAGGGGYACAGMCTGAGGATGAGGCARWATATTWCTGTGCTCTATGGTACAGC
3'Vlam7a‐F‐BsiWI/SpeI
CCAGTAACTAGTCGTACGTAGGACAGTCAGTTTGGTTCCTCCACCGAACACCCAATGGTTGCTGTACCATAGAGCACA
各セット内では、同量のプライマー(例:20μlPCR反応に対して1μlの各プライマー(プライマーストック20乃至100μM))を混合し、PCRバッファー、ヌクレオチド、及びTaqポリメラーゼから成るPCR混合物へ添加した。この混合物をPCRサイクラー中にて94℃で3分間、65℃で1分間、62℃で1分間、59℃で1分間、56℃で1分間、52℃で1分間、50℃で1分間、及び72℃で10分間インキュベー
トした。続いて生成物をアガロースゲル電気泳動に掛け、標準的な方法に従って200乃至400のサイズの生成物をゲルから単離した。
込まれたプライマーを用いる標準的なPCR反応のテンプレートとして用いた。適切なサイズのDNA断片(VLに対してはおよそ330ヌクレオチド)を、標準的な方法に従うアガロースゲル電気泳動によって単離した。この方法により、十分なVLDNA断片が増幅された。
、ヒト/ヒト化VLのレパートリー)と、並びに最終的なVH3 3‐73に基づくVH PCR生成物(すなわち、ヒト/ヒト化VHのレパートリー)を最終的なVL77aに基づくVL PCR生成物(すなわち、ヒト/ヒト化VLのレパートリー)と、ファージデ
ィスプレイベクターpComb3H5Bhis中で組み合わせて機能的scFvsの2種類の異なるライブラリーを形成し、そこから、繊維状ファージ上での提示後、以下で述べるようにして抗Muc‐1バインダーを選別し、スクリーニングし、同定し、確認した:軽鎖断片(SacI‐SpeIで消化)450ngをファージミドpComb3H5Bhis(SacI‐SpeIで消化;長断片)1400ngとライゲートさせた。次に、得られたコンビナトリアル抗体ライブラリーを、300μlのエレクトロコンピテント大腸菌XL1Blue細胞へエレクトロポレーションによって形質転換し(2.5kV、0.2cmギャップキュベット、25μFD、200オーム、Biorad gene‐pu
lser)、独立したクローンが107を超えるライブラリーサイズを得た。1時間の表
現型の発現の後、pComb3H5Bhisベクターによってコードされたカルベニシリン耐性に対して陽性である形質転換体を100mlの液体スーパーブロス(SB)培地中で一晩選別した。次に、細胞を遠心分離によって回収し、市販のプラスミド調製キット(Qiagen)を用いてプラスミドの調製を行った。
‐VL scFv(単鎖可変断片)の全ライブラリーサイズを得た。
GenBank(受託番号J05581)で公開されているヒトMUC‐1のコード配列を、標準的なプロトコルに従う遺伝子合成によって得た。遺伝子合成断片は、まずコンストラクトの真核生物発現のためのコザック部位を含み、続いてヒトMUC‐1タンパク質のコード配列及び停止コドンを含むように設計した(コンストラクトのcDNA及びアミノ酸配列を配列番号1498及び1499に挙げる)。この遺伝子合成断片には、GenBankに受託されているバージョンでは1回分しか含まれないMUC‐1の内部反復
配列(ヌクレオチド382から441)が16回分含まれており、生理的に発現されるMUC‐1の複数の反復を反映している。遺伝子合成断片は、断片の最初と最後に制限部位が導入されるようにも設計した。導入された制限部位は、5'末端にはEcoRI及び3'末端にはSalIであり、以下のクローン化の手順に利用した。内部XmaI制限部位を遺伝子合成断片中のコード配列のサイレント変異によって除去した(ヌクレオチド441CからTへ;これは第一の反復の最後のヌクレオチドであり、従って続く15の反復配列において全く同様に変異された;並びに、ヌクレオチド2160 GからCへ)。遺伝子
合成断片は、EcoRI及びSalIを介して、pEF‐DHFR(pEF‐DHFRについては、Raumet al. Cancer Immunol Immunother
50 (2001) 141‐150、に記載されている)と称するプラスミドへ標準的なプロトコルに従ってクローン化した。前記の手順は標準的なプロトコルに従って実施した(Sambrook,Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 3rd edition, Cold Spring Harbour LaboratoryPress, Cold Spring Harbour, New Yo
rk (2001))。配列が確認されたヌクレオチド配列を有するクローンを、コンス
トラクトの真核生物発現のためにDHFR欠失CHO細胞へトランスフェクトした。DHFR欠失CHO細胞中での真核生物タンパク質発現は、KaufmannR.J. (1
990) Methods Enzymol. 185, 537‐566、の記載に従って実施した。コンストラクトの遺伝子増幅は、メトトレキサート(MTX)の濃度を最大20nMMTXまでの最終濃度へ上昇させることによって誘発した。
G1又はXLI blueへ形質転換し、カルベニシリンLB‐寒天へ播種した。単一コ
ロニーを100μlのLBカルベニシリン(carb)(50μg/ml)中へ取り出し
た。
vを産生する。適切なシグナル配列のために、scFv鎖は周辺質へ放出され、そこで機能的コンフォメーションへフォールドする。
地(例:10ml)中で増殖させ、回収後PBS中(例:1ml)へ再溶解した。−70℃での凍結及び37℃での解凍を4ラウンド行うことにより、細菌の外膜を温度ショックで破壊し、scFvsを含む可溶性周辺質タンパク質を上清中へ遊離させた。遠心分離によって無傷の細胞及び細胞片を除去した後、抗Muc‐1scFvsを含む上清を回収し、それを用いてMuc‐1特異的バインダーの同定を以下のようにして行った:
scFvsのMuc‐1に対する結合を、Muc‐1でトランスフェクトされたCHO細胞上でのフローサイトメトリーで試験し;ネガティブコントロールとしてトランスフェクトされていないCHO細胞を用いた。
質製剤と共に、又は2%FCSを含むPBS50μl中5μg/mlの精製scFvと共にインキュベートした。scFvの結合は、抗His抗体(Penta‐His抗体、BSA非含有、QiagenGmbH,ヒルデン,ドイツ連邦共和国)により2%FCSを含むPBS50μl中2μg/mlにて検出した。第二の工程の試薬としては、R‐フィコエリトリンと結合したアフィニティ精製F(ab')2断片、ヤギ抗マウスIgG(F
c‐ガンマ断片特異的)を2%FCSを含むPBS50μl中1:100に希釈したもの(Dianova,ハンブルク,ドイツ連邦共和国)を用いる。サンプルは、FACSscan(BDbiosciences,ハイデルベルク,ドイツ連邦共和国)上で測定した。
配列番号185)、又は本発明のその他のいずれかのCD3特異的scFvと連結することで、組換え二重特異性単鎖抗体へ変換し、その結果としてドメイン配置がVHMuc1‐(Gly4Ser1)3‐VLMuc1‐Gly4Ser1‐VHCD3‐(Gly4Ser1)3‐VLCD3又は別のドメイン配置であるコンストラクトを得た。CHO細胞中での発現のために、(i)コザックコンセンサス配列内に埋め込まれた開始コドンを含むN末端免疫グロブリン重鎖リーダーのコード配列、及び(ii)停止コドンが続くC末端His6タグのコー
ド配列の両方を、二重特異性単鎖抗体をコードするヌクレオチド配列へフレームを揃えて結合し、その後、遺伝子合成によって得られたこのDNA断片を発現ベクターpEF‐DHFR(Raumet al. Cancer Immunol Immunother 5
0 (2001) 141‐150)のマルチクローニング部位へ挿入した。DHFR欠失CHO細胞の安定なトランスフェクション、二重特異性単鎖抗体を培養物の上清中へ分泌するDHFR陽性トランスフェクタントの選別、及び発現レベルを高めるためのメトトレキサートによる遺伝子増幅は記述(Macket al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 (1995) 7021‐7025)に従って実施した。そ
の他の最新の手順はすべて標準的なプロトコルに従って実施した(Sambrook,Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 3rd edition, Cold Spring Harbour LaboratoryPress, Cold Spring Harbour, New York (2001))。
Current Protocols in Immunology(Coligan,K
ruisbeek, Margulies, Shevach and Strober,
Wiley‐Interscience, 2002)に記載のようにして実施した。
8含有L‐グルタミン 4.0mMを含む;HyClone)に適応させたCHO細胞を
、ヌクレオシドを含まないHyQ PF CHO液体大豆培地(0.1%Pluronic
F‐68含有L‐グルタミン 4.0mMを含む;HyClone)によりローラーボトル中にて7日間増殖させた。遠心分離により培養物の上清を細胞から除去し、精製まで−20℃で保存した。培養物の上清からの二重特異性単鎖抗体の精製のためのクロマトグラフィ装置としては、Akta(登録商標)ExplorerSystem(GE Hea
lth Systems)及びUnicorn(登録商標)Softwareを用いた。
ZnCl2を充填したFractogelEMD Chelate(登録商標)(Merck)を用い、製造元が提供するプロトコルに従って固定化金属アフィニティクロマトグラフィ(「IMAC」)を実施した。バッファーA(20mMリン酸ナトリウムバッファー
pH 7.2、0.1M NaCl)でカラムを平衡状態とし、細胞培養物の上清(50
0ml)を流速3ml/分でカラム(10ml)に適用した。バッファーAでカラムを洗浄して非結合サンプルを除去した。結合したタンパク質を、バッファーB(20mMリン酸ナトリウムバッファー pH 7.2、0.1M NaCl、0.5M イミダゾール)の以下に従う2段階の勾配:
段階1:6カラム分の容量の20%バッファーB
段階2:6カラム分の容量の100%バッファーB
を用いて溶離させた。段階2からの溶離したタンパク質画分をさらなる精製のためにプールした。化学薬品はすべて研究グレードであり、Sigma(ダイゼンホッフェン)又はMerck(ダルムシュタット)より購入した。
たタンパク質サンプル(流速1ml/分)を標準的なSDS‐PAGE及びウエスタンブロットによる検出に掛けた。精製の前に、分子量測定のためにカラムを校正した(分子量マーカーキット、SigmaMW GF‐200)。タンパク質濃度は、OD280nm
を用いて測定した。
ペトリ皿(直径145mm、Nunc)を、最終濃度1μg/mlの市販の抗CD3特異的抗体(例:OKT3,Othoclone)により37℃で1時間コーティングした。非結合タンパク質をPBSによる1段階の洗浄によって除去した。新鮮なPBMCを、Ficoll勾配遠心分離により標準的なプロトコルに従って末梢血液(30乃至50mlのヒト血液)から単離した。安定化グルタミン/10%FCS/IL‐220U/ml(Proleukin,Chiron)を含む120mlのRPMI1640中、3‐5×107個のPBMCを、あらかじめコーティングしたペトリ皿に添加し、2日間刺激した
。3日目に細胞を回収し、RPMI1640で1回洗浄した。IL‐2を添加して最終濃度を20U/mlとし、上記と同じ細胞培地中にて細胞を再度1日培養した。
Life Sciences GmbH,ケルン,ドイツ)を用いて実施した。実験データ
の解析は、Windows(登録商標)用Prism4(バージョン4.02、GraphPadSoftware Inc.,サンディエゴ,カリフォルニア州,米国)を用い
て実施した。このソフトウェアによって決定されるS字型用量反応曲線のR2値は、通常
>0.90である。この解析プログラムにより、効力の尺度としてのEC50値を算出した。
36.1 CD33及びCD3種間特異的二重特異性単鎖分子の作製
全般的には、ヒト及びマカクCD3イプシロンに対して種間特異的である結合特異性を持つドメイン、並びにヒト及びマカクCD33に対して種間特異的である結合特異性を持つドメインを各々が含む二重特異性単鎖抗体分子を、以下の表14に挙げるように設計した。
列及び停止コドンを含むように設計した。遺伝子合成断片は、断片の最初と最後に適切な制限部位が導入されるようにも設計した。導入された制限部位は、以下のクローン化の手順に利用した。遺伝子合成断片は、これらの制限部位を介して、pEF‐DHFR(pEF‐DHFRについては、Raumet al. Cancer Immunol Immunother 50 (2001) 141‐150、に記載されている)と称するプラス
ミドへ標準的なプロトコルに従ってクローン化した。前記の手順は標準的なプロトコルに従って実施した(Sambrook,Molecular Cloning; A Lab
oratory Manual, 3rd edition, Cold Spring Harbour LaboratoryPress, Cold Spring Harbour, New York (2001))。配列が確認されたヌクレオチド配列を有するクロ
ーンを、コンストラクトの真核生物発現のためにDHFR欠失CHO細胞へトランスフェクトした。DHFR欠失CHO細胞中での真核生物タンパク質発現は、KaufmannR.J. (1990) Methods Enzymol. 185, 537‐566、
の記載に従って実施した。コンストラクトの遺伝子増幅は、メトトレキサート(MTX)の濃度を最大20nMMTXまでの最終濃度へ上昇させることによって誘発した。2継代の静置培養後、細胞培養物の上清を回収して続いての実験に用いた。
分析
ヒト及びマカクCD33並びにCD3のそれぞれに結合する能力に関して種間特異的二重特異性抗体コンストラクトの機能を試験するために、FACS分析を実施する。この目的のために、実施例23.1で述べるようにヒトCD33でトランスフェクトされたCHO細胞、及びヒトCD3陽性T細胞白血病細胞株HPB‐ALL(DSMZ,ブラウンシュバイク,ACC483)を用いてヒト抗原への結合について試験した。マカク抗原に対する結合反応性は、実施例23.2で述べる作製されたマカクCD33トランスフェクタント、及びマカクPBMC(マカクPBMCの調製は、標準的なプロトコルに従い、マカクザルからの末梢血液のFicoll勾配遠心分離によって行った)を用いて試験した。それぞれの細胞株又はPBMCの200000個の細胞を、種間特異的二重特異性抗体コンストラクトを発現するトランスフェクトされた細胞の細胞培養物の上清50μlと共に、30分間氷上にてインキュベートした。細胞を2%FCSを含むPBSで2回洗浄し、マウス抗His抗体(PentaHis抗体;Qiagen;2%FCSを含むPBS50μl中にて1:20に希釈)でコンストラクトの結合を検出した。洗浄後、結合した抗His抗体を、2%FCSを含むPBSで1:100に希釈したフィコエリトリンに結合したFcガンマ特異的抗体(Dianova)で検出した。トランスフェクトされていないCHO細胞の上清をネガティブコントロールとして用いた。
Current Protocols in Immunology(Coligan,K
ruisbeek, Margulies, Shevach and Strober,
Wiley‐Interscience, 2002)に記載のようにして実施した。
作製された二重特異性単鎖抗体の生物活性を、実施例23.1及び23.2で述べるCD33陽性細胞株を用いるクロム51(51Cr)放出インビトロ細胞障害性アッセイによって分析した。それぞれの図に示すように、エフェクター細胞としては、刺激されたヒトCD4/CD56除去PBMC、又はマカクT細胞株4119LnPxを用いた。
らかじめコーティングしたペトリ皿に添加し、2日間刺激した。3日目に細胞を回収し、RPMI1640で1回洗浄した。IL‐2を添加して最終濃度を20U/mlとし、上記と同じ細胞培地中にて細胞を再度1日培養した。
(Perkin Elmer Life Sciences GmbH,ケルン,ドイツ)を用いて実施した。実験データの解析は、Windows(登録商標)用Prism4(バージョン4.02、GraphPadSoftware Inc.,サンディエゴ,カリ
フォルニア州,米国)を用いて実施した。このソフトウェアによって決定されるS字型用量反応曲線のR2値は、通常>0.90である。この解析プログラムによって算出される
EC50値を用いて生物活性を比較した。
3結合分子への曝露による循環するチンパンジーT細胞の再分布
雄のチンパンジー一匹に、単鎖EpCAM/CD3二重特異性抗体コンストラクト(Schlereth (2005) CancerRes 65: 2882)の静脈内注入による用量増加試験を施した。従来の単鎖CD19/CD3二重特異性抗体コンストラクト(Loffler (2000, Blood,Volume 95, Number 6)
、又は国際公開第99/54440号)と同様に、該EpCAM/CD3コンストラクトのCD3アームも、従来のヒト及びチンパンジーCD3のコンテクスト依存性エピトープに対して指向されている。第0日には、この動物は試験物質を含まない50mlのPBS/5%HSAを受け、続いて、PBS/5%HSAプラス1.6、2.0、3.0、及び4.5μg/kg単鎖EpCAM/CD3二重特異性抗体コンストラクトの50mlをそれぞれ第7、14、21、及び28日に受けた。注入時間は各投与につき2時間とした。各週の注入では、チンパンジーを2乃至3mg/kgのTelazolの筋肉内投与によって鎮静化させ、挿管し、平均血圧が安定したイソフルラン/O2による麻酔状態とした
。第二の静脈内カテーテルを逆側の肢に配置し、循環する血液細胞のFACS分析のために図62に示す時間点で(ヘパリン処理)全血サンプルを採取した。標準的な赤血球溶解の後、チンパンジーCD2(BectonDickinson)と反応するFITC標識抗体でT細胞を染色し、全リンパ球に対するT細胞のパーセントをフローサイトメトリーで測定した。図62に示すように、単鎖EpCAM/CD3二重特異性抗体コンストラクトの投与すべてにおいて循環するT細胞の急激な低下が誘発されており、これは、実質的に循環する標的B(リンパ腫)細胞を持たないB‐NHL患者内において単鎖CD19/CD3二重特異性抗体コンストラクトで観察されたものと同様であった。ヒト及びチンパンジーの循環血液中にはEpCAM‐陽性標的細胞が存在しないことから、単鎖EpCAM/CD3二重特異性抗体コンストラクトへの曝露による循環するT細胞の低下は、標的細胞を介しての架橋の非存在下でのコンストラクトのCD3アームと従来のコンテクスト依存性CD3エピトープとの純粋な相互作用を通してT細胞が受けるシグナルのみに起因し得る。実質的に循環する標的B(リンパ腫)細胞を持たないB‐NHL患者において単鎖CD19/CD3二重特異性抗体コンストラクトへの曝露を通して誘発されるT細胞の再分布と同様に、単鎖EpCAM/CD3二重特異性抗体コンストラクトへの曝露による
チンパンジーでのT細胞の再分布は、コンテクスト依存性CD3エピトープへの結合イベントに続くCD3のコンフォメーションの変化、そしてさらにその結果としての一時的な血管内皮へのT細胞の接着性の上昇によって説明することができる(実施例20参照)。この発見により、コンテクスト依存性CD3エピトープへ指向された従来のCD3結合分子は、この相互作用のみを通して、末梢血液T細胞の再分布パターン引き起こすことができ、このことが実施例20で述べるようにヒトのCNS有害イベントのリスクと関連していることが確認される。
38.1 大腸菌XL1 Blue内でのscFvコンストラクトの細菌発現
前述のように、VL及びVHセグメントを含むpComb3H5Bhis/Flagで形質転換された大腸菌XL1 Blueは、遺伝子III断片の切除及び1mMIPTG
による誘発の後、十分な量の可溶性scFvを産生する。scFv鎖は周辺質へ放出され、そこで機能的コンフォメーションへフォールドする。
i)国際公開第2004/106380号に記載の、ScFvs 4‐10、3‐106
、3‐114、3‐148、4‐48、3‐190、及び3‐271
ii)本明細書で述べる、ヒト抗CD3イプシロン結合クローンH2C、F12Q、及びI2CからのScFvs
/mlを補充したSB培地で増殖させ、回収後にPBSへ再溶解した。−70℃での凍結及び37℃での解凍を4ラウンド行うことにより、細菌の外膜を温度ショックで破壊し、scFvsを含む可溶性周辺質タンパク質を上清中へ遊離させた。遠心分離によって無傷の細胞及び細胞片を除去した後、ヒト抗ヒトCD3‐scFvsを含む上清を回収し、それをさらなる分析に用いた。scFvを含むこれらの粗上清を、今後周辺質製剤(PPP)と称する。
ELISA実験を、96ウェルプラスチックプレート(Nunc,maxisorb)のウェルへヒトCD3イプシロン(aa 1‐27)‐Fc融合タンパク質を通常は4℃
にて一晩コーティングすることによって行った。次に抗原コーティング溶液を除去し、ウェルをPBS/0.05%Tween20で1回洗浄し、続いてPBS/3%BSAで少なくとも1時間ブロックした。ブロッキング溶液の除去後、PPP及びコントロール溶液をウェルに添加し、室温にて通常は1時間インキュベートした。次にウェルをPBS/0.05%Tween20で3回洗浄した。固定化抗原に結合したscFvsの検出は、ビオチン標識抗FLAGタグ抗体(M2抗Flag‐Bio,Sigma、通常は最終濃度1μg/mlPBS)を用いて行い、ペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジン(Dianova、1μg/ml PBS)で検出した。ABTS基質溶液を添加することでシグ
ナルを発色させ、405nmの波長で測定した。ブロッキング剤及び/又はヒトCD3イプシロン(aa1‐27)‐Fc融合タンパク質のヒトIgG1部分に対する試験サンプルの非特異的結合は、ヒトIgG1(Sigma)でコーティングしたELISAプレート上にて同一の試薬及び同一のタイミングによる同一のアッセイを実施することによって分析した。ネガティブコントロールとしてPBSを用いた。
シロン(aa 1‐27)‐Fc融合タンパク質に対して強い結合シグナルを示している
。ヒトscFvs3‐106、3‐114、3‐148、3‐190、3‐271、4‐10、及び4‐48(国際公開第2004/106380号に記載)は、ネガティブコントロールレベルを超えるような有意な結合はまったく示していない。
ェルに対するscFvs H2C、F12Q、及びI2Cの陽性結合が、BSA(ブロッ
キング剤として使用)及び/又はヒトCD3イプシロン(aa1‐27)‐Fc融合タンパク質のヒトIgG1 Fc‐ガンマ部分によるものであり得るという可能性を排除する
ために、第二のELISA実験を平行して実施した。この第二のELISA実験では、ヒトCD3イプシロン(aa1‐27)‐Fc融合タンパク質の代わりにIgG1(Sigma)でコーティングしたこと以外は、すべてのパラメータを第一のELISA実験と同一とした。図64に示すように、試験したscFvsはいずれも、BSA及び/又はヒトIgG1に対してバックグラウンドレベルを超えるような有意な結合をまったく示さなかった。
2Cは、ヒトCD3イプシロンのN末端の27アミノ酸に対する特異的な結合を明らかに示すと結論付けることができる。
39.1 種間特異的結合分子のクローン化
全般的には、ヒト及びマカクCD3イプシロンに対して種間特異的である結合特異性を持つドメイン、並びにヒト及びマカクCD44に対して種間特異的である結合特異性を持つドメインを各々が含む二重特異性単鎖抗体分子を、以下の表15に挙げるように設計する。
ドンを含むように設計した。遺伝子合成断片は、適切なN末端及びC末端制限部位が導入されるようにも設計した。遺伝子合成断片は、これらの制限部位を介して、pEF‐DH
FR(pEF‐DHFRについては、Raumet al. Cancer Immuno
l Immunother 50 (2001) 141‐150、に記載されている)と称するプラスミドへ標準的なプロトコル(Sambrook,Molecular Clo
ning; A Laboratory Manual, 3rd edition, Cold Spring Harbour LaboratoryPress, Cold Spr
ing Harbour, New York (2001))に従ってクローン化した。配列が確認されたヌクレオチド配列を有するクローンを、コンストラクトの真核生物発現のためにジヒドロ葉酸レダクターゼ(DHFR)欠失チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞へトランスフェクトした。
二重特異性コンストラクトは、DHFR欠失CHO細胞中で一過性に発現させた。簡潔に述べると、コンストラクトあたり4×105個の細胞を、10%ウシ胎仔血清、1%ペ
ニシリン/ストレプトマイシン、及び細胞培養グレード試薬のストック液からのヌクレオシド(Sigma‐AldrichChemie GmbH,タウフキルヘン,ドイツ)
を補充して最終濃度を10μg/mlアデノシン、10μg/mlデオキシアデノシン、及び10μg/mlチミジンとした安定化グルタミンを含む3mlのRPMI1640全培地(allmedium)中、インキュベーター内で37℃、湿度95%、及び7%CO2にてトランスフェクションの一日前に培養した。トランスフェクションは、Fuge
neHDトランスフェクション試薬(Roche,#04709691001)を用いて製造元のプロトコルに従って行った。94μlのOptiMEM培地(Invitrogen)及び6μlのFugeneHDを混合し、室温で5分間インキュベートした。続いて、コンストラクトあたり1.5μgのDNAを添加し、混合し、室温で15分間インキュベートした。その間、DHFR欠失CHO細胞を1×PBSで洗浄し、1.5mlのRPMI1640全培地に再懸濁した。トランスフェクション混合物を600μlのRPMI1640全培地で希釈し、細胞へ添加し、37℃、湿度95%、及び7%CO2にて一
晩インキュベートした。トランスフェクションの翌日、各手法のインキュベーション容量をRPMI1640全培地5mlへ拡張した。3日間のインキュベーションの後、上清を回収した。
分析
ヒト及びマカクCD44並びにCD3のそれぞれへ結合する能力に関して種間特異的二重特異性抗体コンストラクトの機能を試験するために、FACS分析を実施した。この目的のために、ヒトCD44でトランスフェクトされたCHO細胞(実施例28.1で述べるように)、及びヒトCD3陽性T細胞白血病細胞株HPB‐ALL(DSMZ,ブラウンシュバイク,ACC483)を用いてヒト抗原への結合について試験した。マカク抗原に対する結合反応性は、作製されたマカクCD44トランスフェクタント(実施例28.3で述べる)、及びマカクT細胞株4119LnPx(Prof.Fickenscher,Hygiene Institute, Virology, Erlangen‐N
uernberg、よりご提供頂いた;Knappe A, et al., and Fi
ckenscherH., Blood 2000, 95, 3256‐61、にて発表)を用いて試験した。種間特異的二重特異性抗体コンストラクトのCD44に対する特異性を示すために、ヒトCD44delv6(v6エクソンを欠失させたCD44)に対する結合を、ヒトCD44delv6(作製法は実施例28.2で述べる)でトランスフェクトしたCHO細胞を用いて試験した。それぞれの細胞株の200,000個の細胞を、種間特異的二重特異性抗体コンストラクトを発現するトランスフェクトされた細胞の細胞上清50μlと共に、30分間氷上にてインキュベートした。2%FCSを含むPBSで細胞を2回洗浄し、マウス抗His抗体(PentaHis抗体;Qiagen;2%FCSを含むPBS50μl中にて1:20に希釈)でコンストラクトの結合を検出した。洗
浄後、結合した抗His抗体を、2%FCSを含むPBSで1:100に希釈したフィコエリトリンに結合したFcガンマ特異的抗体(Dianova)で検出した。トランスフェクトされていないCHO細胞の上清を、T細胞株への結合に対するネガティブコントロールとして用いた。関連性のない標的特異性を有する単鎖コンストラクトを、CD44及びCD44delv6でトランスフェクトされたCHO細胞への結合に対するネガティブコントロールとして用いた。
Current Protocols in Immunology(Coligan,K
ruisbeek, Margulies, Shevach and Strober,
Wiley‐Interscience, 2002)に記載のようにして実施した。
作製された二重特異性単鎖抗体の生物活性を、実施例28.1で述べるヒトCD44陽性細胞株を用いるクロム51(51Cr)放出インビトロ細胞障害性アッセイによって分析した。それぞれの図に示すように、エフェクター細胞としては、刺激されたヒトCD4/CD56除去PBMC、刺激されたヒトPBMCを用いた。
ペトリ皿(直径145mm、Greiner bio‐one GmbH,クレムスミュンスター)のコーティングは、最終濃度1μg/mlの市販の抗CD3特異的抗体(例:OKT3,Othoclone)により37℃にて1時間行った。非結合タンパク質をPBSによる1段階の洗浄によって除去した。新鮮なPBMCを、Ficoll勾配遠心分離により標準的なプロトコルに従って末梢血液(30乃至50mlのヒト血液)から単離した。安定化グルタミン/10%FCS/IL‐220U/ml(Proleukin,Chiron)を含む120mlのRPMI1640中、3‐5×107個のPBMCを、
あらかじめコーティングしたペトリ皿に添加し、2日間刺激した。3日目に細胞を回収し、RPMI1640で1回洗浄した。IL‐2を添加して最終濃度を20U/mlとし、上記と同じ細胞培地中にて細胞を再度1日培養した。標準的なプロトコルに従ってCD4+T細胞及びCD56+NK細胞を除去することにより、CD8+細胞障害性Tリンパ球(CTLs)を濃縮した。
(Perkin Elmer Life Sciences GmbH,ケルン,ドイツ)を
用いて実施した。実験データの解析は、Windows(登録商標)用Prism4(バージョン4.02、GraphPadSoftware Inc.,サンディエゴ,カリ
フォルニア州,米国)を用いて実施した。このソフトウェアによって決定されるS字型用量反応曲線のR2値は、通常>0.90である。この解析プログラムによって算出される
EC50値を用いて生物活性を比較した。
40.1 HCVエンベロープ糖タンパク質E2(HCV遺伝子型1a及び1b)を発
現するCHO細胞の作製
C型肝炎ウイルス(HCV)エンベロープ糖タンパク質E2(HCV遺伝子型1a及び1b、それぞれのサブタイプのHCV単離物;標準的なプロトコルに従って配列を決定)のコード配列を、各々ヒトCD4膜貫通及び細胞内ドメインとの翻訳融合タンパク質として、標準的なプロトコルに従う遺伝子合成によって得た。遺伝子合成断片は、まずコンストラクトの真核生物発現のためのコザック部位を含み、続いて14アミノ酸シグナルペプチドのコード配列を、続いてHCVE2エンベロープ糖タンパク質の最初の278個(遺伝子型1a)又は279個(遺伝子型1b)のアミノ酸のコード配列、2倍のmycエピトープ配列、及び成熟タンパク質の372乃至433のアミノ酸に対応するヒトCD4膜貫通及び細胞内ドメインのコード配列(GenBank受託番号M12807で公開)、並びに停止コドンを含むように設計した(コンストラクトのcDNA及びアミノ酸配列を、それぞれ遺伝子型1a及び1bである配列番号HCV‐1乃至HCV‐4に挙げた)。遺伝子合成断片は、断片の最初と最後に制限部位が導入されるようにも設計した。導入された制限部位は、5'末端にはEcoRI及び3'末端にはSalIであり、以下のクローン化の手順に利用した。遺伝子合成断片は、EcoRI及びSalIを介して、pEF‐DHFR(pEF‐DHFRについては、Raumet al. Cancer Immu
nol Immunother 50 (2001) 141‐150、に記載されている)と称するプラスミドへ標準的なプロトコルに従ってクローン化した。前記の手順は標準的なプロトコルに従って実施した(Sambrook,Molecular Clonin
g; A Laboratory Manual, 3rd edition, Cold S
pring Harbour LaboratoryPress, Cold Spring
Harbour, New York (2001))。配列が確認されたヌクレオチド配列を有するクローンを、コンストラクトの真核生物発現のためにDHFR欠失CHO細胞へトランスフェクトした。DHFR欠失CHO細胞中での真核生物タンパク質発現は、KaufmannR.J. (1990) Methods Enzymol. 185, 5
37‐566、の記載に従って実施した。コンストラクトの遺伝子増幅は、メトトレキサート(MTX)の濃度を最大20nMMTXまでの最終濃度へ上昇させることによって誘発した。最終的に、表面に発現されたHCV E2ドメイン遺伝子型1aを有するCHO
細胞株、及び表面に発現されたHCVE2ドメイン遺伝子型1bを有するCHO細胞株、の2種類の細胞株が作製された。
全般的には、ヒト及びマカクCD3イプシロンに対して種間特異的である結合特異性を持つドメイン、並びにHCVに対しての結合特異性を持つドメインを含む二重特異性タンデム単鎖抗体断片を、以下の表16に挙げるように設計した。
計した。遺伝子合成断片は、断片の最初と最後に適切な制限部位が導入されるようにも設計した。導入された制限部位は、以下のクローン化の手順に利用した。遺伝子合成断片は、これらの制限部位を介して、pEF‐DHFR(pEF‐DHFRについては、Raumet al. Cancer Immunol Immunother 50 (2001)
141‐150、に記載されている)と称するプラスミドへ標準的なプロトコルに従っ
てクローン化した。前記の手順は標準的なプロトコルに従って実施した(Sambrook,Molecular Cloning; A Laboratory Manual,
3rd edition, Cold Spring Harbour Laborator
yPress, Cold Spring Harbour, New York (2001))。配列が確認されたヌクレオチド配列を有するクローンを、二重特異性タンデム単鎖抗体断片の真核生物発現のためにDHFR欠失CHO細胞へトランスフェクトした。DHFR欠失CHO細胞中での真核生物タンパク質発現は、KaufmannR.J. (1
990) Methods Enzymol. 185, 537‐566、の記載に従って実施した。コンストラクトの遺伝子増幅は、メトトレキサート(MTX)の濃度を最大20nMMTXまでの最終濃度へ上昇させることによって誘発した。
二重特異性タンデム単鎖抗体断片は、チャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO)中で発現させた。DHFR欠失CHO細胞中の真核生物タンパク質発現は、KaufmannR.J. (1990) Methods Enzymol. 185, 537‐566、
の記載に従って実施した。コンストラクトの遺伝子増幅は、20nM MTXの最終濃度
まで増加する濃度のMTXを添加することによって誘発した。2継代の静置培養後、ヌクレオシドを含まないHyQPF CHO液体大豆培地(0.1% Pluronic F‐
68含有L‐グルタミン 4.0mMを含む;HyClone)により、ローラーボトル
中、回収まで7日間細胞を増殖させた。細胞を遠心分離で除去し、発現されたタンパク質を含む上清を−20℃で保存した。別の選択肢として、コンストラクトを一過性にHEK293細胞中で発現させた。トランスフェクションは、293fectin試薬(Invitrogen,#12347‐019)を用い、製造元のプロトコルに従って実施する。
た。ZnCl2を充填したFractogel EMD Chelate(登録商標)(M
erck)を用い、製造元が提供するプロトコルに従って固定化金属アフィニティクロマトグラフィ(「IMAC」)を実施した。バッファーA(20mMリン酸ナトリウムバッファー pH 7.2、0.1M NaCl)でカラムを平衡状態とし、細胞培養物の上清
(500ml)を流速3ml/分でカラム(10ml)に適用した。バッファーAでカラムを洗浄して非結合サンプルを除去した。結合したタンパク質を、バッファーB(20mMリン酸ナトリウムバッファー pH 7.2、0.1M NaCl、0.5M イミダゾール)の以下に示す2段階の勾配:
段階1:6カラム分の容量の20%バッファーB
段階2:6カラム分の容量の100%バッファーB
を用いて溶離させた。段階2からの溶離したタンパク質画分をさらなる精製のためにプールした。化学薬品はすべて研究グレードであり、Sigma(ダイゼンホッフェン)又はMerck(ダルムシュタット)より購入した。
を用いて測定した。
サイトメトリー結合分析
HCV抗原並びにヒト及びマカクCD3のそれぞれに結合する能力に関して種間特異的二重特異性タンデム単鎖抗体断片の機能を試験するために、FACS分析を実施した。この目的のために、実施例40.1で述べる2種類の異なるHCV遺伝子型(1a及び1b)からのHCV抗原E2でトランスフェクトされたCHO細胞、ヒトCD3陽性T細胞白血病細胞株HPB‐ALL(DSMZ,ブラウンシュバイク,ACC483)、及びマカクT細胞株4119LnPxを用いてそれぞれの抗原への結合について試験した。それぞれの細胞株の200,000個の細胞を、種間特異的二重特異性抗体コンストラクトを発現するトランスフェクトされた細胞の細胞培養物の上清50μlと共に、30分間氷上にてインキュベートした。細胞を2%FCSを含むPBSで2回洗浄し、マウス抗His抗体(PentaHis抗体;Qiagen;2%FCSを含むPBS50μl中にて1:
20に希釈)で二重特異性タンデム単鎖抗体断片の結合を検出した。洗浄後、結合した抗His抗体を、2%FCSを含むPBSで1:100に希釈したフィコエリトリンに結合したFcガンマ特異的抗体(Dianova)で検出した。
Current Protocols in Immunology(Coligan,K
ruisbeek, Margulies, Shevach and Strober,
Wiley‐Interscience, 2002)に記載のようにして実施した。
性
二重特異性タンデム単鎖抗体断片の生物活性を、実施例40.1で述べるHCV抗原陽性細胞株を用いるクロム51(51Cr)放出インビトロ細胞障害性アッセイによって分析した。エフェクター細胞としては、異なるドナー2人から採取した刺激されたヒトCD4/CD56除去PBMCを用いた。
らかじめコーティングしたペトリ皿に添加し、2日間刺激した。3日目に細胞を回収し、RPMI1640で1回洗浄した。IL‐2を添加して最終濃度を20U/mlとし、上記と同じ細胞培地中にて細胞を再度1日培養した。
in Elmer Life Sciences GmbH,ケルン,ドイツ)を用いて実施した。実験データの解析は、Windows(登録商標)用Prism4(バージョン4
.02、GraphPadSoftware Inc.,サンディエゴ,カリフォルニア
州,米国)を用いて実施した。
41.1 B型肝炎ウイルス(HBV)
およそ15乃至20ヌクレオチドの末端区間で互いにオーバーラップし、第二のプライマーがすべてアンチセンスプライマーである以下の縮重オリゴヌクレオチドを用いて、CDRH1(配列番号1634)、CDRH2(配列番号1635)、及びCDRH3(配列番号1636)に対するヒトVH配列コンテクストを得た:
5'C8‐VH‐A‐XhoI
CCACTTCTCGAGTCTGGCGSCGRASTGMWGMAGCCTGGCGSCTCCSTGMRGSTGTCCTGCRMGGCCTCCGGC
3'C8‐VH‐B
CCCTGGAGCCTGCCGCACCCAGGACATGGCGTAGCCGGWGAAGGTGWAGCCGGAGGCCKYGCAGGA
5'C8‐VH‐C
CGGCAGGCTCCAGGGMAGGGACTGGAATGGRTGRGCTCCATCTCCGGCTCCGGCGGCTCCACCTACTACGCCGACTCCGTGAAGGGCCGG
3'C8‐VH‐D
CTTGGCGCAGTAGTACASGGCGGTGTCCTCGGMCCGCAGGGAGYTCAKCTSCAKGTACASGGTGYTCKTGGAGKTGTCCCGGSTSATTGTGAMCCGGCCCTTCACGGA
3'C8‐VH‐E‐BstEII
GACCGTGGTGACCAGGGTGCCCTGGCCCCAGTTGCCCAGAGGGAAGTAGTAGATGGAGGAGCCGTAGTATTCCTGCCGGCCAGGAGGCTTGGCGCAGTAGTA
を組み込まれたプライマー(プライマー5'C8‐VH‐A‐XhoI及びプライマー3'C8‐VH‐E‐BstEII)を用いる標準的なPCR反応のテンプレートとして用いた。適切なサイズのDNA断片(VHに対してはおよそ350ヌクレオチド)を、標準的な方法に従うアガロースゲル電気泳動によって単離した。この方法により、十分なVHDNA断片が増幅された。
DRH1(配列番号1634)、CDRH2(配列番号1635)、及びCDRH3(配列番号1636)に付随するCDRL1(配列番号1639)、CDRL2(配列番号1640)、及びCDRL3(配列番号1641)に対するヒトVL配列コンテクストを得た:
5'C8‐Vl‐A‐SacI
CCTCAAGAGCTCGCCCTGAYGCAGCCTSCCTCCGTGTCCGTGKCCCYTGGCMAGACCGCCMGCATCACCTGCGGCGGCAAC
3'C8‐Vl‐B
CAGCACAGGGGMCTGTCCTGGCTTCTGCTGATACCAGTGCACGGACTTGGAGCCGATGTTGTTGCCGCCGCAGGTGAT
5'C8‐Vl‐CCAGAAGCCAGGACAGKCCCCTGTGCTGGTCR
TATACGACGACTCCGACCGCCCTTCCGGCATCCCTGAGCGGTTCTCCGGCTCC
3'C8‐Vl‐D
GACCTGGCAGTAGTAGTCGGCCTCGTCCMYGGCCTSCRCCCSGGAGATGGTCAGGGTGRCGGTGKTGCCGGAGYTGGAGCCGGAGAACCG
3'C8‐Vl‐E‐BsiWI/SpeI
CCCGATACTAGTCGTACGCAGCACGGTCAGCTTTGTTCCGCCGCCAAACACCACCAGGTCGGAGGAGGAGTCCCAGACCTGGCAGTAGTAGTCGGC
を組み込まれたプライマー(プライマー5'C8‐Vl‐A‐SacI及びプライマー3'C8‐Vl‐E‐BsiWI/SpeI)を用いる標準的なPCR反応のテンプレートとして用いた。適切なサイズのDNA断片(VLに対してはおよそ330ヌクレオチド)を、標準的な方法に従うアガロースゲル電気泳動によって単離した。この方法により、十分なVLDNA断片が増幅された。
、そのそれぞれの最終的なVL PCR生成物(すなわち、ヒト/ヒト化VLのレパート
リー)と、ファージディスプレイベクターpComb3H5Bhis中で組み合わせて機能的scFv抗体断片のライブラリーを形成し、そこから、繊維状ファージ上でのディスプレイ後、以下で述べるようにして抗HBSバインダーを選別し、スクリーニングし、同定し、確認した。
.2cmギャップキュベット、25μFD、200オーム、Biorad gene‐p
ulser)、独立したクローンが107を超えるライブラリーサイズを得た。1時間の
表現型の発現の後、pComb3H5Bhisベクターによってコードされたカルベニシリン耐性に対して陽性である形質転換体を100mlの液体スーパーブロス(SB)培地中で一晩選別した。次に、細胞を遠心分離によって回収し、市販のプラスミド調製キット(Qiagen)を用いてプラスミドの調製を行った。
‐VL scFv抗体断片の全ライブラリーサイズを得た。
5'C9‐VH‐A‐XhoI
CCACTTCTCGAGTCTGGGGSAGRGGTGRWGMAGCCTGGGRSGTCCSTGARASTCTCCTGTGCAGCCTCTGGA
3'C9‐VH‐B
CCACTCCAGCCCCTKGCCTGGAGCCTGGCGGACCCAGTGTATGCCATAATTACTGAAGGTGWATCCAGAGGCTGCACAGGA
5'C9‐VH‐C
GCTCCAGGCMAGGGGCTGGAGTGGRTGGSACTTATATCATATGATGGAAATAAGAAATTCTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGA
3'C9‐VH‐D
GTAATATACAGCCGTGTCCTCAGRTCTCAGGCTGCTCAKTTSCAKATMCACCGTGYTCKTAGAAGTGTCTCTGGTSATGGYGAMTCGGCCCTTCACGGAGTC
3'C9‐VH‐E‐BstEII
GACCGTGGTGACCAGGGTTCCCTGGCCCCAGTAGTCAAATTCCCCCCAGTACAAGGCAATACCCCCAGATTTCGCACAGTAATATACAGCCGTGTC
5'C9‐Vl‐A‐SacI
CCTCAAGAGCTCGWACTGACTCAGCCACCCTCGGTGTCAGYGGCCCCAGGACAGAMGGYCAYGATTTCCTGTGGGGGAAAC3'C9‐Vl‐B
GCCTGGCWKCTGCTGATACCAGTGCACGGTTGTACTTCCAATGTTGTTTCCCCCACAGGAAAT
5'C9‐Vl‐C
TGGTATCAGCAGMWGCCAGGCMMGGCCCCTRWGCTGSTCRTCTATGATGATAACGAGCGACCCTCAGGGATCCCTGASCGATTCTCTGGCTCC
3'C9‐Vl‐D
CACTTGACAATAATAGTCGGCCTCATCCCCGGYTTSGASCCYGKTGATGSYCAGGGTGGCCGAGGTCCCAGASTTGGAGCCAGAGAATCG
3'C9‐Vl‐E‐BsiWI/SpeI
CCCGATACTAGTCGTACGTAGGACGGTCAGCTTCGTCCCTCCGCCGAATACCACATGATCACTACCACTATCCCACACTTGACAATAATAGTC
従ってブロックした。
し、ゆっくり攪拌しながらさらに10分間インキュベートした。両方の大腸菌培養物を次に混合し、ヒトscFv抗体断片をコードするファージミドコピーでの形質導入に成功し
た細胞をカルベニシリン耐性について再度選別し、続いてVCMS13ヘルパーファージで感染させることで、抗体提示及びインビトロ選別の第二ラウンドを開始した。通常は、合計で4乃至5ラウンドの選別を実施した。
Hisへ同じ制限部位を介してクローン化し、さらなるファージタンパク質を除去した。ライゲーションの後、プラスミドDNAの各プール(パニングのラウンドが異なる)を、100μlのヒートショックコンピテント(heatshock competent)
大腸菌TG1又はXLI blueへ形質転換し、カルベニシリンLB‐寒天へ播種した
。単一コロニーを100μlのLBカルベニシリン(50μg/ml)中へ取り出した。
v抗体断片を産生する。適切なシグナル配列のために、scFv抗体断片は周辺質へ放出され、そこで機能的コンフォメーションへフォールドする。
(例:10ml)中で増殖させ、回収後PBS中(例:1ml)へ再溶解した。−70℃での凍結及び37℃での解凍を4ラウンド行うことにより、細菌の外膜を温度ショックで破壊し、scFv抗体断片を含む可溶性周辺質タンパク質を上清中へ遊離させた。遠心分離によって無傷の細胞及び細胞片を除去した後、抗HBSscFv抗体断片を含む上清を回収し、それを用いてHBS特異的バインダーの同定を以下のようにして行った:
s. Gastroenterology 2008; 134:239‐47)を用いる
間接免疫蛍光法を標準的なプロトコル(例:CurrentProtocols in Immunology, Coligan, Kruisbeek, Margulies, Shevach and Strober, Wiley‐Interscience,2
002, unit 21.3)に従って実施した。感染させていないHepG2細胞をネガティブコントロールとして用いた。細胞表面にHBS抗原を最適に提示させるためのHepG2.2.15細胞の培養条件は、Bohneet al.によって報告された(B
ohne F, Chmielewski M, Ebert G, et al. T cel
ls redirected againsthepatitis B virus sur
face proteins eliminate infected hepatocytes. Gastroenterology2008; 134:239‐47)。
ードするヌクレオチド配列へフレームを揃えて結合し、その後、遺伝子合成によって得られたこのDNA断片を発現ベクターpEF‐DHFR(Raumet al. Cancer Immunol Immunother 50 (2001) 141‐150)のマル
チクローニング部位へ挿入した。DHFR欠失CHO細胞の安定なトランスフェクション、二重特異性単鎖抗体を培養物の上清中へ分泌するDHFR陽性トランスフェクタントの選別、及び発現レベルを高めるためのメトトレキサートによる遺伝子増幅は記述(Macket al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 (1995)
7021‐7025)に従って実施した。その他の最新の手順はすべて標準的なプロト
コルに従って実施した(Sambrook,Molecular Cloning; A
Laboratory Manual, 3rd edition, Cold Sprin
g Harbour LaboratoryPress, Cold Spring Har
bour, New York (2001))。
ィコエリトリンに結合したFcガンマ特異的抗体(Dianova)によって検出した。トランスフェクトされていないCHO細胞の上清をネガティブコントロールとして用いた。
biosciences,ハイデルベルク)。FACS染色及び蛍光強度の測定は、C
urrent Protocols in Immunology(Coligan,Kr
uisbeek, Margulies, Shevach and Strober, W
iley‐Interscience, 2002)に記載のようにして実施する。HB
S抗原への結合は、上述のようにしてELISAによって試験した。結合した二重特異性タンデム単鎖抗体断片の検出は、モノクローナルマウス抗His6抗体(Qiagen 抗PentaHis、通常は最終濃度1μg/ml PBS)を用い、続いてペルオキシダ
ーゼ標識ポリクローナルヤギ抗マウスFab断片抗体(Dianova、1μg/mlPBS)を用いて行った。
胞培養物の上清(500ml)を流速3ml/分でカラム(10ml)に適用した。バッファーAでカラムを洗浄して非結合サンプルを除去した。結合したタンパク質を、バッファーB(20mMリン酸ナトリウムバッファー pH 7.2、0.1M NaCl、0.
5M イミダゾール)の以下に従う2段階の勾配:
段階1:6カラム分の容量の20%バッファーB
段階2:6カラム分の容量の100%バッファーB
を用いて溶離させた。段階2からの溶離したタンパク質画分をさらなる精製のためにプールした。化学薬品はすべて研究グレードであり、Sigma(ダイゼンホッフェン)又はMerck(ダルムシュタット)より購入する。
を用いて測定する。
る記述のようにHepG2.2.15細胞を標的細胞として用い(Bohne F, Chmielewski M, Ebert G, et al. Tcells redirec
ted against hepatitis B virus surface proteins eliminated infectedhepatocytes. Gastr
oenterology 2008; 134:239‐47)、キメラT細胞受容体で形質導入されたT細胞ではなく、刺激されたヒトCD4/CD56除去PBMC又はマカクT細胞株4119LnPxをエフェクター細胞として用いる非放射性細胞障害性アッセイによって測定した。用量反応曲線を得るために、細胞障害性アッセイにおける各二重特異性タンデム単鎖抗体断片の濃度を(Bohneet al.による記述のE:T比ではな
く)、固定したE:T比(例:10:1又は5:1)で滴定した。
ペトリ皿(直径85mm、Nunc)を、最終濃度1μg/mlの市販の抗CD3特異的抗体(例:OKT3,Othoclone)により37℃で1時間コーティングした。非結合タンパク質をPBSによる1段階の洗浄によって除去した。新鮮なPBMCを、Ficoll勾配遠心分離により標準的なプロトコルに従って末梢血液(30乃至50mlのヒト血液)から単離した。安定化グルタミン/10%FCS/IL‐220U/ml(Proleukin,Chiron)を含む50mlのRPMI1640中、3‐5×107個のPBMCを、あらかじめコーティングしたペトリ皿に添加し、2日間刺激した。3
日目に細胞を回収し、RPMI1640で1回洗浄した。IL‐2を添加して最終濃度を20U/mlとし、上記と同じ細胞培地中にて細胞を再度1日培養した。
エゴ,カリフォルニア州,米国)を用いて実施した。このソフトウェアによって決定されるS字型用量反応曲線のR2値は、通常>0.90である。この解析プログラムにより、
EC50値を効力の尺度として算出した。
およそ15乃至20ヌクレオチドの末端区間で互いにオーバーラップし、第二のプライ
マーがすべてアンチセンスプライマーである以下の縮重オリゴヌクレオチドを用いて、CDRH1(配列番号1652)、CDRH2(配列番号1653)、及びCDRH3(配列番号1654)に対するヒトVH配列コンテクストを得る:
5'HC1‐VH‐A‐XhoI
CAGCTACTCGAGTSGGGCGSAGGACTGKTGMAGCCTKSGGRGTCCCTGAGWCTCTCCTGCGCTG
3'HC1‐VH‐B
CCACTCCAGCCCCTTCCCAGGGGMCTGGCGGAYCCAGGTCCAGAAGTAACCACTWAAGGTAMMACCAKAGRCAGCGCAGGAGAGWCTCAGGGAC5'HC1‐VH‐C
CTGGGAAGGGGCTGGAGTGGRTTRGTGAAAGCAATTATAGTGGAAGTACCAGGTACAACCCGTCCCTCAAGAGTCGAKTCACCATATCA
3'HC1‐VH‐D
ATACAGCCGTGTCCKCGGCTSTCASAGAAYTCAKCTKCAGGKAGARCKKGTTCTKGGAGKTGTCTMYTGATATGGTGAMTCGACTCTTG
5'HC1‐VH‐E
AGCCGMGGACACGGCTGTATATTACTGTGCGAGAGGTTGGGCGGTGGACGGTATGGACGTCTGGGGCCGAGGGACCTTGGTCACCGTC
3'HC1‐VH‐F‐BstEII
GAGACGGTGACCAAGGTCCCTCGGCCCCAGACGTCCATACC
を組み込まれたプライマー(プライマー5'HC1‐VH‐A‐XhoI及びプライマー
3'HC1‐VH‐F‐BstEII)を用いる標準的なPCR反応のテンプレートとし
て用いた。適切なサイズのDNA断片(VHに対してはおよそ350ヌクレオチド)を、標準的な方法に従うアガロースゲル電気泳動によって単離した。この方法により、十分なVHDNA断片が増幅された。
5'HC1‐Vl‐A‐SacI
ACTAGCGAGCTCGWGCTGACACAGCCACCCTCG
5'HC1‐Vl‐B
GCTGACACAGCCACCCTCGGYGTCAGKGACCCCAGGACAGASGGYCASGATCTCCTGCTCTGGAGATGCATTGCCAAAGCAATATGC
3'HC1‐Vl‐C
CCCTGAGGGCCTCTCATTATCTTTATATATCASCAACWYAGGGGCCKKGCCTGGCWKCTGCTGATACCAGTAAGCATATTGCTTTGGCAATGC
5'HC1‐Vl‐D
GATAATGAGAGGCCCTCAGGGRTCCCTGASCGATTCTCTGGCTCCARGTCAGGGACATCAGYCTCGTTGRCCATCAGTGGASTCMRGKCAGAAGACGAGGCTGACTA
3'HC1‐Vl‐E‐BsiWI/SpeI
GCTACTACTAGTCGTACGTAGGACGGTCAGCTGGGTCCCTCCGCCGAACACCCAGGAAGAACCACTGCTGTCTGCTGATTGACAGTAATAGTCAGCCTCGTCTTCTG
を組み込まれたプライマー(プライマー5'HC1‐Vl‐A‐SacI及びプライマー
3'HC1‐Vl‐E‐BsiWI/SpeI)を用いる標準的なPCR反応のテンプレ
ートとして用いた。適切なサイズのDNA断片(VLに対してはおよそ330ヌクレオチド)を、標準的な方法に従うアガロースゲル電気泳動によって単離した。この方法により、十分なVLDNA断片が増幅された。
、そのそれぞれの最終的なVL PCR生成物(すなわち、ヒト/ヒト化VLのレパート
リー)と、ファージディスプレイベクターpComb3H5Bhis中で組み合わせて機能的scFv抗体断片のライブラリーを形成し、そこから、繊維状ファージ上での提示後、以下で述べるようにして抗HBSバインダーを選別し、スクリーニングし、同定し、確認した。
ulser)、独立したクローンが107を超えるライブラリーサイズを得た。1時間の
表現型の発現の後、pComb3H5Bhisベクターによってコードされたカルベニシリン耐性に対して陽性である形質転換体を100mlの液体スーパーブロス(SB)培地中で一晩選別した。次に、細胞を遠心分離によって回収し、市販のプラスミド調製キット(Qiagen)を用いてプラスミドの調製を行った。
H‐VL scFv(単鎖可変断片)ライブラリーサイズを得た。
乃至107個のCHO細胞と共に氷上で1時間ゆっくり攪拌しながらインキュベートした
。このHCV抗原でトランスフェクトされたCHO細胞を前もって遠心分離によって回収し、PBSで洗浄し、PBS/1%FCS(Naアジド含有)中に再懸濁させた。HCV抗原でトランスフェクトされたCHO細胞と特異的に結合しないscFv抗体断片を提示するファージ粒子を、PBS/1%FCS(Naアジド含有)による最大5回の洗浄工程によって除去した。洗浄後、細胞をpH2.2のHCl‐グリシン中に再懸濁させることによって(10分間のインキュベーションとそれに続くボルテックス攪拌)結合要素を細胞から溶離させ、pH12の2Mトリスによる中和の後、その溶離液を新鮮な感染させていない大腸菌XL1Blue培養物(OD600>0.5)の感染に用いた。ヒト/ヒト化scFv抗体断片をコードするファージミドコピーでの形質導入に成功した大腸菌細胞を含む大腸菌培養物をカルベニシリン耐性について再度選別し、続いてVCMS13ヘルパーファージで感染させることで、抗体提示及びインビトロ選別の第二ラウンドを開始した。通常は、合計で4乃至5ラウンドの選別を実施した。
g/Hisへ、同じ制限部位を介してクローン化し、さらなるファージタンパク質を除去した。ライゲーションの後、プラスミドDNAの各プール(パニングのラウンドが異なる)を、100μlのヒートショックコンピテント(heatshock compete
nt)大腸菌TG1又はXLI blueへ形質転換し、カルベニシリンLB‐寒天へ播
種した。単一コロニーを100μlのLBカルベニシリン(50μg/ml)中へ取り出した。
v抗体断片を産生する。適切なシグナル配列のために、scFv抗体断片は周辺質へ放出
され、そこで機能的コンフォメーションへフォールドする。
地(例:10ml)中で増殖させ、回収後PBS中(例:1ml)へ再溶解した。−70℃での凍結及び37℃での解凍を4ラウンド行うことにより、細菌の外膜を温度ショックで破壊し、scFv抗体断片を含む可溶性周辺質タンパク質を上清中へ遊離させる。遠心分離によって無傷の細胞及び細胞片を除去した後、抗HCVscFv抗体断片を含む上清を回収し、それを用いてHCV抗原特異的バインダーの同定を以下のようにして行った:scFv抗体断片のHCVに対する結合を、HCV抗原でトランスフェクトされたCHO細胞上でのフローサイトメトリーで試験し(実施例40.1参照);ネガティブコントロールとしてトランスフェクトされていないCHO細胞を用いた。
cFv抗体断片と共に、又は2%FCSを含むPBS50μl中5μg/mlの精製scFv抗体断片と共にインキュベートした。scFv抗体断片の結合は、抗His抗体(Penta‐His抗体、BSA非含有、QiagenGmbH,ヒルデン,ドイツ連邦共和国)により2%FCSを含むPBS50μl中2μg/mlにて検出した。第二の工程の試薬としては、R‐フィコエリトリンと結合したアフィニティ精製F(ab')2断片
、ヤギ抗マウスIgG(Fc‐ガンマ断片特異的)を2%FCSを含むPBS50μl中1:100に希釈したもの(Dianova,ハンブルク,ドイツ連邦共和国)を用いた。サンプルは、FACSscan(BDbiosciences,ハイデルベルク,ドイツ連邦共和国)上で測定した。
ドするヌクレオチド配列へフレームを揃えて結合し、その後、遺伝子合成によって得られたこのDNA断片を発現ベクターpEF‐DHFR(Raumet al. Cancer
Immunol Immunother 50 (2001) 141‐150)のマルチ
クローニング部位へ挿入した。DHFR欠失CHO細胞の安定なトランスフェクション、二重特異性タンデム単鎖抗体断片を培養物の上清中へ分泌するDHFR陽性トランスフェクタントの選別、及び発現レベルを高めるためのメトトレキサートによる遺伝子増幅は記述(Macket al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 (1995) 7021‐7025)に従って実施した。その他の最新の手順はすべて標準
的なプロトコルに従って実施した(Sambrook,Molecular Cloni
ng; A Laboratory Manual, 3rd edition, Cold
Spring Harbour LaboratoryPress, Cold Spring Harbour, New York (2001))。
結合は、HCV抗原でトランスフェクトされたCHO細胞上で試験した(実施例40.1参照)。それぞれの細胞株の200,000個の細胞を、50μlの細胞培養物の上清と共に30分間氷上にてインキュベートした。細胞を2%FCSを含むPBSで2回洗浄し、マウス抗His抗体(PentaHis抗体;Qiagen;2%FCSを含むPBS50μl中にて1:20に希釈)により、結合した二重特異性タンデム単鎖抗体断片を検出した。洗浄後、結合した抗His抗体を、2%FCSを含むPBSで1:100に希釈したフィコエリトリンに結合したFcガンマ特異的抗体(Dianova)によって検出した。トランスフェクトされていないCHO細胞の上清をネガティブコントロールとして用いた。
Current Protocols in Immunology(Coligan,K
ruisbeek, Margulies, Shevach and Strober,
Wiley‐Interscience, 2002)に記載のようにして実施した。
養物の上清(500ml)を流速3ml/分でカラム(10ml)に適用した。バッファーAでカラムを洗浄して非結合サンプルを除去した。結合したタンパク質を、バッファーB(20mMリン酸ナトリウムバッファー pH 7.2、0.1M NaCl、0.5M イミダゾール)の以下に従う2段階の勾配:
段階1:6カラム分の容量の20%バッファーB
段階2:6カラム分の容量の100%バッファーB
を用いて溶離させた。段階2からの溶離したタンパク質画分をさらなる精製のためにプールした。化学薬品はすべて研究グレードであり、Sigma(ダイゼンホッフェン)又はMerck(ダルムシュタット)より購入する。
を用いて測定した。
ペトリ皿(直径85mm、Nunc)を、最終濃度1μg/mlの市販の抗CD3特異的抗体(例:OKT3,Othoclone)により37℃で1時間コーティングした。非結合タンパク質をPBSによる1段階の洗浄によって除去した。新鮮なPBMCを、Ficoll勾配遠心分離により標準的なプロトコルに従って末梢血液(30乃至50mlのヒト血液)から単離した。安定化グルタミン/10%FCS/IL‐220U/ml(Proleukin,Chiron)を含む50mlのRPMI1640中、3‐5×107個のPBMCを、あらかじめコーティングしたペトリ皿に添加し、2日間刺激した。3
日目に細胞を回収し、RPMI1640で1回洗浄した。IL‐2を添加して最終濃度を20U/mlとし、上記と同じ細胞培地中にて細胞を再度1日培養した。
験データの解析は、Windows(登録商標)用Prism4(バージョン4.02、GraphPadSoftware Inc.,サンディエゴ,カリフォルニア州,米国
)を用いて実施した。このソフトウェアによって決定されるS字型用量反応曲線のR2値
は、通常>0.90である。この解析プログラムにより、EC50値を効力の尺度として算
出した。
Claims (40)
- ヒト及び非チンパンジー霊長類CD3ε(イプシロン)鎖のエピトープと結合する能力を有する結合ドメインを含むポリペプチドであって、該エピトープが、配列番号2、4、6、又は8から成る群に含まれるアミノ酸配列の一部である、ポリペプチド。
- 前記のヒト及び非チンパンジー霊長類CD3ε(イプシロン)鎖のエピトープと結合する能力を有する結合ドメインが、ヒト由来である、請求項1に記載のポリペプチド。
- ヒト及び非チンパンジー霊長類CD3ε鎖のエピトープと結合する能力を有する第一の結合ドメイン、並びに細胞表面抗原と結合する能力を有する第二の結合ドメインを含む、請求項1乃至2のいずれか1項に記載のポリペプチド。
- 前記の第二の結合ドメインが、ヒト及び非チンパンジー霊長類の細胞表面抗原と結合する、請求項3に記載のポリペプチド。
- ヒト及び非チンパンジー霊長類CD3ε鎖のエピトープと結合する能力を有する前記の第一の結合ドメインが:
(a)配列番号27に示すCDR‐L1、配列番号28に示すCDR‐L2、及び配列番号29に示すCDR‐L3;
(b)配列番号117に示すCDR‐L1、配列番号118に示すCDR‐L2、及び配列番号119に示すCDR‐L3;並びに、
(c)配列番号153に示すCDR‐L1、配列番号154に示すCDR‐L2、及び配列番号155に示すCDR‐L3、
より選択されるCDR‐L1、CDR‐L2、及びCDR‐L3を有するVL領域を含む、請求項1乃至4のいずれか1項に記載のポリペプチド。 - ヒト及び非チンパンジー霊長類CD3ε鎖のエピトープと結合する能力を有する前記の第一の結合ドメインが:
(a)配列番号12に示すCDR‐H1、配列番号13に示すCDR‐H2、及び配列番号14に示すCDR‐H3;
(b)配列番号30に示すCDR‐H1、配列番号31に示すCDR‐H2、及び配列番号32に示すCDR‐H3;
(c)配列番号48に示すCDR‐H1、配列番号49に示すCDR‐H2、及び配列番号50に示すCDR‐H3;
(d)配列番号66に示すCDR‐H1、配列番号67に示すCDR‐H2、及び配列番号68に示すCDR‐H3;
(e)配列番号84に示すCDR‐H1、配列番号85に示すCDR‐H2、及び配列番号86に示すCDR‐H3;
(f)配列番号102に示すCDR‐H1、配列番号103に示すCDR‐H2、及び配列番号104に示すCDR‐H3;
(g)配列番号120に示すCDR‐H1、配列番号121に示すCDR‐H2、及び配列番号122に示すCDR‐H3;
(h)配列番号138に示すCDR‐H1、配列番号139に示すCDR‐H2、及び配列番号140に示すCDR‐H3;
(i)配列番号156に示すCDR‐H1、配列番号157に示すCDR‐H2、及び配列番号158に示すCDR‐H3;
(j)配列番号174に示すCDR‐H1、配列番号175に示すCDR‐H2、及び配列番号176に示すCDR‐H3、
より選択されるCDR‐H1、CDR‐H2、及びCDR‐H3を有するVH領域を含む、請求項1乃至4のいずれか1項に記載のポリペプチド。 - ヒト及び非チンパンジー霊長類CD3ε鎖のエピトープと結合する能力を有する前記の第一の結合ドメインが、配列番号35、39、125、129、161、又は165で示されるVL領域から成る群より選択されるVL領域を含む、請求項1乃至5のいずれか1項に記載のポリペプチド。
- ヒト及び非チンパンジー霊長類CD3ε鎖のエピトープと結合する能力を有する前記の結合ドメインが、配列番号15、19、33、37、51、55、69、73、87、91、105、109、123、127、141、145、159、163、177、又は181で示されるVH領域から成る群より選択されるVH領域を含む、請求項1乃至4及び6のいずれか1項に記載のポリペプチド。
- ヒト及び非チンパンジー霊長類CD3ε鎖のエピトープと結合する能力を有する前記の第一の結合ドメインが:
(a)配列番号17又は21に示すVL領域、及び配列番号15又は19に示すVH領域;
(b)配列番号35又は39に示すVL領域、及び配列番号33又は37に示すVH領域;
(c)配列番号53又は57に示すVL領域、及び配列番号51又は55に示すVH領域;
(d)配列番号71又は75に示すVL領域、及び配列番号69又は73に示すVH領域;
(e)配列番号89又は93に示すVL領域、及び配列番号87又は91に示すVH領域;
(f)配列番号107又は111に示すVL領域、及び配列番号105又は109に示すVH領域;
(g)配列番号125又は129に示すVL領域、及び配列番号123又は127に示すVH領域;
(h)配列番号143又は147に示すVL領域、及び配列番号141又は145に示すVH領域;
(i)配列番号161又は165に示すVL領域、及び配列番号159又は163に示すVH領域;
(j)配列番号179又は183に示すVL領域、及び配列番号177又は181に示すVH領域、
から成る群より選択されるVL領域及びVH領域を含む、請求項1乃至8のいずれか1項に記載のポリペプチド。 - ヒト及び非チンパンジー霊長類CD3ε鎖のエピトープと結合する能力を有する前記の第一の結合ドメインが、配列番号23、25、41、43、59、61、77、79、95、97、113、115、131、133、149、151、167、169、185、又は187から成る群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項9に記載のポリペプチド。
- 前記の細胞表面抗原が、腫瘍抗原である、請求項3乃至10のいずれか1項に記載のポリペプチド。
- 前記の細胞表面抗原が、EGFR、EGFRvIII、MCSP、カルボニックアンヒドラーゼIX、CD30、CD33、CD44v6、EpCAM、Her2/neu、MUC1、IgE、HBV、及びHCVより選択される、請求項3乃至10のいずれか1項に記載のポリペプチド。
- 前記のポリペプチドが二重特異性単鎖抗体分子である、請求項3乃至12のいずれか1項に記載のポリペプチド。
- 前記の二重特異性単鎖抗体分子が、第二の結合ドメイン中のCDR H1、CDR H2、CDR H3、CDR L1、CDR L2、及びCDR L3として、以下に示す配列の一群:
配列番号:189‐194、配列番号:201‐206、配列番号:219‐224、配列番号:237‐242、配列番号:255‐260、配列番号:273‐279、配列番号:382‐384及び387‐389、配列番号:400‐402及び405‐407、配列番号:418‐420及び423‐425、配列番号:436‐438及び441‐443、配列番号:454‐456及び459‐461、配列番号:472‐474及び477‐479、配列番号:490‐492及び495‐497、配列番号:及び508‐510及び513‐515、配列番号:530‐532及び1568乃至1570、配列番号:545‐547及び550‐552、配列番号:559‐561及び564‐566、配列番号:577‐579及び582‐584、配列番号:615‐617及び620‐622、配列番号:633‐635、638、639、及び1571、配列番号:650‐652及び655‐657、配列番号:668‐670及び673‐675、配列番号:682‐684及び687‐689、配列番号:696‐698及び701‐703、配列番号:710‐712及び715‐717、配列番号:724‐726及び729‐731、配列番号:738‐740及び743‐745、配列番号:752‐754及び757‐759、配列番号:766‐768及び771‐773、配列番号:780‐782及び785‐787、配列番号:794‐796及び799‐801、配列番号:808‐810及び813‐815、配列番号:822‐824及び827‐829、配列番号:836‐838及び841‐843、配列番号:850‐852及び855‐857、配列番号:866‐868及び871‐873、配列番号:884‐886及び889‐891、配列番号:902‐904及び907‐909、配列番号:920‐922及び925‐927、配列番号:938‐940及び943‐945、配列番号:956‐958及び961‐963、配列番号:974‐976及び979‐981、配列番号:992‐994及び997‐999、配列番号:1006‐1008及び1011‐1013、配列番号:1020‐1022及び1025‐1027、配列番号:1034‐1036及び1039‐1041、配列番号:1048‐1050及び1053‐1055、配列番号:1062‐1064及び1067‐1069、配列番号:1076‐1078及び1081‐1083、配列番号:1090‐1092及び1095‐1097、配列番号:1114‐1116及び1119‐1121、配列番号:1128‐1130及び1133‐1135、配列番号:1141‐1143及び1146‐1148、配列番号:1155‐1157及び1160‐1162、配列番号:1169‐1171及び1174‐1176、配列番号:1183‐1185及び1188‐1190、配列番号:1197‐1199及び1202‐1204、配列番号:1211‐1213及び1216‐1218、配列番号:1125‐1227及び1230‐1232、配列番号:1239‐1241及び1244‐1246、配列番号:1253‐1255及び1258‐1260、配列番号:1267‐1269及び1272‐1274、配列番号:1281‐1283及び1286‐1288、配列番号:1295‐1297及び1300‐1302、配列番号:1309‐1311及び1314‐1316、配列番号:1323‐1325及び1328‐1330、配列番号:1343‐1345及び1348‐1350、配列番号:1361‐1363及び1366‐1368、配列番号:1375‐1377及び1380‐1382、配列番号:1389‐1391及び1394‐1396、配列番号:1403‐1405及び1408‐1410、配列番号:1417‐1419及び1422‐1424、配列番号:1431‐1433及び1436‐1438、配列番号:1445‐1447及び1450‐1452、配列番号:1459‐1461及び1464‐1466、配列番号:1473‐1475及び1478‐1480、配列番号:1486‐1491、配列番号:1492‐1497、配列番号:1505‐1507及び1510‐1512、配列番号:1531‐1533及び1536‐1538、配列番号:1573‐1575及び1578‐1580、配列番号:1591‐1593及び1596‐1598、配列番号:1605‐1607及び1610‐1612、配列番号:1619‐1621及び1624‐1626、配列番号:1634‐1636及び1639‐1641、及び配列番号:1652‐1654、配列番号:1657‐1659、並びに配列番号:1669‐1674、
から成る群より選択される一群を含む、請求項13に記載のポリペプチド。 - 前記の二重特異性単鎖抗体分子が:
(a)配列番号291、293、295、297、299、301、303、305、307、309、311、313、315、317、319、321、323、325、327、329、331、333、335、337、339、341、343、345、347、393、395、397、411、413、415、429、431、433、447、449、451、465、467、469、483、485、487、501、503、505、519、521、523、1336、1338、1340、538、540、542、556、570、572、574、588、590、592、626、628、630、643、645、647、661、663、665、679、693、707、721、735、749、763、777、791、805、819、833、847、861、863、877、879、881、895、897、899、913、915、917、931、933、935、949、951、953、967、969、971、985、987、989、1003、1017、1031、1045、1059、1073、1087、1101、1125、1138、1152、1166、1180、1194、1208、1222、1236、1250、1264、1278、1292、1306、1320、1334、1354、1356、1358、1372、1386、1400、1414、1428、1442、1456、1470、1484、1500、1502、1518、1520、1522、1524、1526、1528、1544、1546、1548、1550、1552、1554、1556、1558、1560、1562、1564、1566、1586、1588、1602、1616、1630、1647、1649、又は1663のいずれかで示されるアミノ酸配列;及び、
(b)配列番号292、294、296、298、300、302、304、306、308、310、312、314、316、318、320、322、324、326、328、330、332、334、336、338、340、342、344、346、348、394、396、398、412、414、416、430、432、434、448、450、452、466、468、470、484、486、488、502、504、506、520、522、524、1337、1339、1341、539、541、543、557、571、573、575、589、591、593、627、629、631、644、646、648、662、664、666、680、694、708、722、736、750、764、778、792、806、820、834、848、862、864、878、880、882、896、898、900、914、916、918、932、934、936、950、952、954、968、970、972、986、988、990、1004、1018、1032、1046、1060、1074、1088、1102、1126、1139、1153、1167、1181、1195、1209、1223、1237、1251、1265、1279、1293、1307、1321、1335、1355、1357、1359、1373、1387、1401、1415、1429、1443、1457、1471、1485、1501、1503、1519、1521、1523、1525、1527、1529、1545、1547、1549、1551、1553、1555、1557、1559、1561、1563、1565、1567、1587、1589、1603、1617、1631、1648、1650、又は1664のいずれかで示される核酸配列によってコードされるアミノ酸配列、
から選択される配列を含む、請求項13に記載のポリペプチド。 - 請求項1乃至15のいずれか1項に記載のポリペプチドをコードする核酸配列。
- 請求項16に記載の核酸配列を含むベクター。
- 前記のベクターが、請求項16に記載の前記の核酸配列と操作可能に連結される制御配列をさらに含む、請求項17に記載のベクター。
- 前記のベクターが発現ベクターである、請求項18に記載のベクター。
- 請求項17乃至19のいずれか1項に記載のベクターで形質転換又はトランスフェクトされたホスト。
- 請求項1乃至15のいずれか1項に記載のポリペプチドを作製するためのプロセスであって、該プロセスが、請求項1乃至15のいずれか1項に記載のポリペプチドの発現を可能とする条件下にて請求項20に記載のホストを培養すること、及び作製されたポリペプチドを該培養物から回収すること、を含む、プロセス。
- 請求項1乃至15のいずれか1項に記載のポリペプチド、又は請求項21のプロセスに従って作製されたポリペプチドを含む医薬組成物。
- 担体、安定化剤、及び/又は賦形剤の適切な製剤をさらに含む、請求項22に記載の医薬組成物。
- 増殖性疾患、腫瘍性疾患、若しくは免疫障害から選択される疾患の予防、治療、又は寛解のための、請求項1乃至15のいずれか1項に記載のポリペプチド、又は請求項21のプロセスに従って作製されたポリペプチドを含む医薬組成物。
- 担体、安定化剤、及び/又は賦形剤の適切な製剤をさらに含む、請求項24に記載の医薬組成物。
- 増殖性疾患、腫瘍性疾患、若しくは免疫障害から選択される疾患の予防、治療、又は寛解のための医薬組成物を作製するための、請求項1乃至15のいずれか1項に記載のポリペプチド、又は請求項21に従って作製されたポリペプチドの使用。
- 前記の腫瘍性疾患が悪性疾患である、請求項26に記載の使用。
- 前記の医薬組成物が、追加の薬剤と組み合わせての投与に適している、請求項26又は27に記載の使用。
- 前記の薬剤が、非タンパク質化合物又はタンパク質化合物である、請求項28に記載の使用。
- 前記のタンパク質化合物又は非タンパク質化合物が、請求項22若しくは23に記載の医薬組成物と同時に又は非同時に投与される、請求項29に記載の使用。
- 疾患の予防、治療、又は寛解をそれを必要とする対象において行うための方法であって、
該方法が、請求項22又は23の医薬組成物の効果量を投与する工程を含む、方法。 - 前記の疾患が、増殖性疾患、腫瘍性疾患、又は免疫障害である、請求項31に記載の方法。
- 前記の腫瘍性疾患が悪性疾患である、請求項32に記載の方法。
- 前記の医薬組成物が、追加の薬剤と組み合わせて投与される、請求項31乃至33のいずれか1項に記載の方法。
- 前記の薬剤が、非タンパク質化合物又はタンパク質化合物である、請求項34に記載の方法。
- 前記のタンパク質化合物又は非タンパク質化合物が、請求項22若しくは23に記載の医薬組成物と同時に又は非同時に投与される、請求項35に記載の方法。
- 前記の対象がヒトである、請求項31乃至36のいずれか1項に記載の方法。
- 請求項1乃至15のいずれか1項に記載のポリペプチド、請求項16に記載の核酸分子、請求項17乃至19のいずれか1項に記載のベクター、又は請求項20に記載のホストを含むキット。
- ヒト及び非チンパンジー霊長類CD3ε(CD3イプシロン)のエピトープと結合する能力を有する種間特異的結合ドメインを含むポリペプチドを同定するための方法であって、
該方法は:
(a)該ポリペプチドを、アミノ酸配列Gln‐Asp‐Gly‐Asn‐Glu‐Glu‐Met‐Gly(配列番号381)又はGln‐Asp‐ Gly‐Asn‐Glu‐Glu‐Ile‐Gly(配列番号382)を含む最大27アミノ酸であり、そのC末端を介して固相に固定されている、CD3εの細胞外ドメインのN末端断片と接触させる工程と:
(b)該結合したポリペプチドを該断片から溶離させる工程と:
(c)該ポリペプチドを(b)の溶離液から単離する工程と、
を含む、方法。 - 前記のポリペプチドが、第一の結合ドメインとして同定された結合ドメインを、及び細胞表面抗原と結合する第二の結合ドメインを含む、請求項39に記載の方法。
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