ES2748347T3 - Moléculas de unión a CD37 e inmunoconjugados de las mismas - Google Patents

Moléculas de unión a CD37 e inmunoconjugados de las mismas Download PDF

Info

Publication number
ES2748347T3
ES2748347T3 ES11754195T ES11754195T ES2748347T3 ES 2748347 T3 ES2748347 T3 ES 2748347T3 ES 11754195 T ES11754195 T ES 11754195T ES 11754195 T ES11754195 T ES 11754195T ES 2748347 T3 ES2748347 T3 ES 2748347T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
antibody
hucd37
cells
seq
cell
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES11754195T
Other languages
English (en)
Inventor
Jutta Deckert
Peter Park
Daniel Tavares
Lingyun Rui
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Debiopharm International SA
Original Assignee
Debiopharm International SA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Debiopharm International SA filed Critical Debiopharm International SA
Application granted granted Critical
Publication of ES2748347T3 publication Critical patent/ES2748347T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/39558—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against tumor tissues, cells, antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/68033—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a maytansine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
    • A61K47/6817—Toxins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6849—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a receptor, a cell surface antigen or a cell surface determinant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6867—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell the tumour determinant being from a cell of a blood cancer
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2896—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against molecules with a "CD"-designation, not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/566—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor using specific carrier or receptor proteins as ligand binding reagents where possible specific carrier or receptor proteins are classified with their target compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/54—F(ab')2
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/626—Diabody or triabody
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/734—Complement-dependent cytotoxicity [CDC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/70596—Molecules with a "CD"-designation not provided for elsewhere in G01N2333/705

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

Un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se unen específicamente a CD37, en donde dichos anticuerpo o fragmento del mismo comprenden una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 57 o 58 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 74.

Description

DESCRIPCIÓN
Moléculas de unión a CD37 e inmunoconjugados de las mismas
Campo de la invención
El campo de la invención se refiere, en general, a anticuerpos, a fragmentos de unión a antígeno de los mismos, a polipéptidos y a inmunoconjugados que se unen a CD37, así como a métodos de uso de dichas moléculas de unión a CD37 para el tratamiento de enfermedades, tales como neoplasias malignas de linfocitos B.
Antecedentes de la invención
El antígeno leucocitario CD37 ("CD37"), también conocido como GP52-40, tetraspanina-26 o TSPAN26, es una proteína transmembrana de la superfamilia de la tetraspanina (Maecker et al., 1997 FASEB J. 11:428-442). Es una proteína altamente glucosilada con cuatro dominios transmembrana que se expresa en los linfocitos B durante los estadios de pre-B a linfocito B maduro periférico, pero está ausente en la diferenciación terminal en células plasmáticas. (Link et al., 1987, J Pathol. 152:12-21). El antígeno CD37 se expresa tan solo débilmente en linfocitos T, células mieloides y granulocitos (Schwartz-Albiez et al. 1988, J. Immunol., 140(3)905-914). Sin embargo, CD37 también se expresa en linfocitos B malignos, tales como aquellos fundadores del linfoma de Hodgkin (NHL) y la leucemia linfoide crónica (CLL) (Moore et al. 1986, J Immunol. 137(9):3013-8). Este perfil de expresión sugiere que CD37 representa una diana terapéutica prometedora para las neoplasias malignas de linfocitos B.
Aunque sigue sin aclararse el papel fisiológico exacto de CD37, los estudios sugieren un papel potencial en la proliferación de linfocitos T (van Spriel et al. 2004, J Immunol., 172(5):2953-61). Como parte de la familia de tetraspanina de glucoproteínas de la superficie celular, CD37 también puede complejarse con otras proteínas superficiales (Angelisová 1994, Immunogenetics., 39(4):249-56). Se desarrollaron ratones deficientes para la expresión de CD37 y no se revelaron cambios en el desarrollo y la composición celular de los órganos linfoides. Tan solo se observaron niveles reducidos de IgG1 y alteraciones de las respuestas contra antígenos dependientes de linfocitos T (Knobeloch et al. 2000, Mol Cell Biol., 20(15):5363-9).
Los anticuerpos están surgiendo como un método prometedor para tratar dichos cánceres. En particular, son deseables anticuerpos que son capaces de inducir la apoptosis en células diana. Además, también son deseables anticuerpos que tienen actividad de citotoxicidad dependiente de complemento (CDC) y de citotoxicidad dependiente de anticuerpo (ADCC).
En la actualidad, se emplea un anticuerpo anti-CD20 denominado rituximab para tratar las neoplasias malignas de linfocitos B (Leget et al., 1998, Curr. Opin. Oncol., 10:548-551). Sin embargo, solo un subconjunto de pacientes responden al tratamiento con rituximab e incluso los pacientes que responden al tratamiento con rituximab tienen recidivas y frecuentemente desarrollan resistencia al tratamiento con rituximab. Además, también se están ensayando agentes de unión a CD37 como agentes terapéuticos potenciales para las neoplasias malignas de linfocitos B. Trubion Pharmaceuticals desarrolló los agentes de unión a c D37 -SMIP-016 y TRU-016 (Zhao et al., 2007, Blood, 110:2569-2577). SMIP-016 es un polipéptido monocatenario que incluye regiones variables de un hibridoma y regiones constantes humanas modificadas por ingeniería genética. TRU-016 es una versión humanizada de la proteína SMIP anti-CD37. Véase, por ejemplo, la Solicitud Publicada de los Estados Unidos n.° 2007/0009519. TRU-016 se está ensayando clínicamente para el tratamiento de la leucemia linfocítica crónica (CLL). Boehringer Ingelheim también ha divulgado un agente de unión a CD37 en la Solicitud Internacional Publicada n.° WO 2009/019312. Sin embargo, no se ha descrito actividad CDC para ninguno de estos agentes de unión y no se ha descrito actividad proapoptótica in vitro en ausencia de agentes reticulantes.
Se ha probado la radioinmunoterapia (RIT) usando un anticuerpo anti-CD37 radiomarcado MB-1 en dos ensayos separados. Se administraron dosis terapéuticas de 131I-MB-1 a seis pacientes con NHL recidivante (Press et al. 1989 J Clin Oncol. 7(8):1027-38, Press et al. 1993, N Engl J Med. 329(17):1219-24). Los seis pacientes lograron una remisión completa (CR) con una duración de cuatro a treintaiún meses. En otro ensayo, se administró 131I-M B-1 a diez pacientes con NHL recidivante (Kaminski et al. 1992 J Clin Oncol. 10(11):1696-711). Un total de cuatro pacientes tuvo una respuesta que varió en su duración de dos a seis meses, aunque solo se informó de un caso de CR. Sin embargo, no se pudo tratar a todos los pacientes debido a la biodistribución desfavorable del radiomarcador, lo que aumentó la preocupación de exposición a la radiación de órganos vitales no diana. De hecho, se observaron toxicidades relacionadas con la RIT en estos ensayos, incluyendo una mielosupresión grave y toxicidad cardiopulmonar. Aunque estos datos clínicos sugieren que los radioinmunoconjugados anti-CD37 pueden ser eficaces, estas terapias son laboriosas de administrar y en caso de recidiva, los pacientes que se hayan sometido a la RIT no pueden tratarse con RIT, debido a los riesgos asociados con las altas dosis de radiación.
Para superar las limitaciones de la RIT, se han desarrollado conjugados de anticuerpo-agente citotóxico (ACC), también denominados conjugados de anticuerpo-fármaco (ADC). Estos son inmunoconjugados que incluyen un agente citotóxico unido covalentemente a un anticuerpo a través de un enlazador químico que puede posibilitar el suministro específico de fármacos citotóxicos a células que expresan una proteína reconocida por el anticuerpo. Sin embargo, las proteínas que no se internalizan no se consideran dianas favorables para dichos agentes terapéuticos. CD37 es estructuralmente similar a CD20, ya que ambos antígenos contienen cuatro dominios transmembrana, aunque CD20 no forma parte de la familia de tetraspanina (Tedder et al. 1989, J. Immun. 142: 2560-2568). Se ha estudiado la capacidad de anticuerpos contra diversos antígenos de linfocitos B, incluyendo CD37 y CD20, de sufrir endocitosis y degradación (Press et al. 1989, Cancer Res. 49(17):4906-12 y Press et al. 1994, Blood. 83(5):1390-7). El anticuerpo MB-1 anti-CD37 se retuvo en la superficie celular y se internalizó lentamente en células de linfoma Daudi in vitro. El anticuerpo MB-1 también tuvo una baja tasa de endocitosis y metabolismo intracelular en células de paciente de NHL in vitro. Se obtuvieron resultados similares con el anticuerpo anti-CD20, 1F5, que también se retuvo principalmente en la superficie de células de linfoma y se internalizó mal. Se han estudiado ADC de anticuerpos para CD20, pero no han demostrado una potencia significativamente fuerte, especialmente cundo no se usan enlazadores disulfuro o estables a ácidos (véase, por ejemplo, Polson et al., 2009, Cancer Res., 69(6):2358-2364). En vista de estas observaciones, CD37 no se ha considerado una diana favorable para los conjugados de anticuerpo-fármaco.
Por lo tanto, existe la necesidad de agentes de unión a CD37, incluyendo anticuerpos, fragmentos de unión a antígeno de los mismos y conjugados de anticuerpo-fármaco (inmunoconjugados) como medios para tratar neoplasias malignas de linfocitos B. La presente invención aborda esta necesidad.
Breve sumario de la invención
En el presente documento se describen nuevos anticuerpos que se unen a CD37 humano, inmunoconjugados que comprenden estos anticuerpos y métodos para usarlos. También se proporcionan nuevos polipéptidos, tales como anticuerpos que se unen a CD37 humano, fragmentos de dichos anticuerpos y otros polipéptidos relacionados con dichos anticuerpos. También se proporcionan polinucleótidos que comprenden secuencias de ácido nucleico que codifican los polipéptidos, así como vectores que comprenden los polinucleótidos. Además, se proporcionan células que comprenden los polipéptidos y/o polinucleótidos de la invención. También se proporcionan composiciones (por ejemplo, composiciones farmacéuticas) que comprenden los anticuerpos o inmunoconjugados contra CD37. Además, también se proporcionan métodos para producir y usar los nuevos anticuerpos o inmunoconjugados contra CD37, tales como métodos para usar los nuevos anticuerpos o inmunoconjugados contra CD37 para inhibir el crecimiento tumoral y/o tratar el cáncer.
Se proporcionan anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno que se unen específicamente a CD37 y son capaces de inducir citotoxicidad dependiente de complemento (CDC). En algunas realizaciones, el anticuerpo también es capaz de inducir apoptosis y/o citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpo (ADCC).
El anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo se define por las reivindicaciones adjuntas en el presente documento.
En algunas realizaciones, el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo se une específicamente a CD37 y se une específicamente al polipéptido de SEQ ID NO: 180. En una realización específica, el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno no se une al polipéptido de la SEQ ID NO: 184.
El anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo de la invención se une específicamente a CD37 y el anticuerpo o el fragmento del mismo puede inhibir competitivamente a un anticuerpo seleccionado entre el grupo que consiste en: (a) un anticuerpo que comprende el polipéptido de SEQ ID NO: 55 y el polipéptido de SEQ ID NO: 72; (b) un anticuerpo que comprende el polipéptido de S e Q iD NO: 59 y el polipéptido de SEQ ID NO: 75; (c) un anticuerpo que comprende el polipéptido de Se Q iD NO: 61 y el polipéptido de SEQ ID NO: 77; (d) un anticuerpo que comprende el polipéptido de SEQ ID NO: 64 y el polipéptido de Se Q iD NO: 80; (e) un anticuerpo que comprende el polipéptido de SEQ ID NO: 66 y el polipéptido de Se Q ID NO: 82; (f) un anticuerpo que comprende el polipéptido de SEQ ID NO: 68 y el polipéptido de SEQ ID NO: 84; y (g) un anticuerpo que comprende el polipéptido de SEQ ID NO: 70 y el polipéptido de SEQ ID NO: 86.
La divulgación enseña un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo producido por hibridomas seleccionados entre el grupo que consiste en la denominación de depósito de la ATCC PTA-10664, depositada en la ATCC el 18 de febrero de 2010, la denominación de depósito de la At CC PTA-10665, depositada en la ATCC el 18 de febrero de 2010, la denominación de depósito de la ATCC PTA-10666, depositada en la ATCC el 18 de febrero de 2010, la denominación de depósito de la ATCC PTA-10667, depositada en la ATCC el 18 de febrero de 2010, la denominación de depósito de la ATCC PTA-10668, depositada en la ATCC el 18 de febrero de 2010, la denominación de depósito de la ATCC PTA-10669, depositada en la ATCC el 18 de febrero de 2010 y la denominación de depósito de la ATCC PTA-10670, depositada en la ATCC el 18 de febrero de 2010.
La divulgación enseña un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente a CD37 y el anticuerpo comprende secuencias de polipéptido seleccionadas entre el grupo que consiste en: (a) las SEQ ID NO: 4, 5 y 6 y las SEQ ID NO: 28, 29 y 30; (b) las SEQ ID NO: 7, 8 y 9 y las SEQ ID NO: 31, 32 y 33; (c) las SEQ ID NO: 10, 11 y 12 y las SEQ ID NO: 34, 35 y 36; (d) las SEQ ID NO: 13, 14 y 15 y las SEQ ID NO: 37, 38 y 39; (e) las SEQ ID NO: 13, 14 y 15 y las SEQ ID NO: 37, 40 y 39; (f) las SEQ ID NO: 16, 17 y 18 y las SEQ ID NO: 41, 42 y 43; (g) las SEQ ID NO: 19, 20 y 21 y las SEQ ID NO: 44, 45 y 46; (h) las SEQ ID NO: 19, 20 y 21 y las SEQ ID NO: 44, 47 y 46; (i) las SEQ ID NO: 22, 23 y 24 y las SEQ ID NO: 48, 49 y 50; (j) las SEQ ID NO: 22, 23 y 24 y las SEQ ID NO: 48, 51 y 50; (k) las SEQ ID NO: 25, 26 y 27 y las SEQ ID NO: 52, 53 y 54; y (1) variantes de (a) a (k) que comprenden 1, 2, 3 o 4 sustituciones de aminoácidos conservativas.
La divulgación enseña anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos que comprenden secuencias de polipéptidos que son al menos un 90 % idénticas, al menos un 95 % idénticas, al menos un 99 % idénticas o completamente idénticas a secuencias de polipéptido seleccionadas entre el grupo que consiste en: (a) la SEQ ID NO: 55 y la SEQ ID NO: 72; (b) la SEQ ID NO: 56 y la SEQ ID NO: 73; (c) la SEQ ID NO: 57 y la SEQ ID NO: 74; (d) la SEQ ID NO: 58 y la SEQ ID NO: 74; (e) la SEQ ID NO: 59 y la SEQ ID NO: 75; (f) la SEQ ID NO: 60 y la SEQ ID NO: 76; (g) la SEQ ID NO: 61 y la SEQ ID NO: 77; (h) la SEQ ID NO: 62 y la SEQ ID NO: 78; (i) la SEQ ID NO: 63 y la SEQ ID NO: 79; (j) la SEQ ID NO: 64 y la SEQ ID NO: 80; (k) la SEQ ID NO: 65 y la SEQ ID NO: 81; (l) la SEQ ID NO: 66 y la SEQ ID NO: 82; (m) la SEQ ID NO: 67 y la SEQ ID NO: 83; (n) la SEQ ID NO: 68 y la SEQ ID NO: 84; (o) la SEQ ID NO: 69 y la SEQ ID NO: 85; (p) la SEQ ID NO: 70 y la SEQ ID NO: 86; y (q) la SEQ ID NO: 71 y la SEQ ID NO: 87. En algunas realizaciones, el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo es murino, no humano, humanizado, quimérico, revestido o humano.
En algunas realizaciones, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo es capaz de inducir la apoptosis de una célula que expresa CD37 in vitro en ausencia de agentes reticulantes. En algunas realizaciones, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno es capaz de inducir citotoxicidad dependiente de complemento (CDC). En otras realizaciones adicionales, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno es capaz de inducir citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpo (ADCC).
En otras realizaciones, el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo es humano o humanizado, específicamente, se une a CD37 y es capaz de inducir la apoptosis de una célula que expresa CD37 in vitro en ausencia de agentes reticulantes. En realizaciones adicionales, el anticuerpo humano o humanizado o el fragmento de unión a antígeno del mismo también es capaz de inducir citotoxicidad dependiente de complemento (CDC) y/o es capaz de inducir citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpo (ADCC).
En otras realizaciones más, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo se une a CD37 humano y a CD37 de macaco.
En algunas realizaciones, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo es un anticuerpo de longitud completa o un fragmento de unión a antígeno. El anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno puede comprender un Fab, Fab', F(ab')2, Fd, Fv monocatenario o scFv, Fv ligado a disulfuro, dominio V-NAR, IgNar, intracuerpo, IgGACH2, minicuerpos, F(ab')3, tetracuerpos, triacuerpos, diacuerpo, anticuerpo de un solo dominio, DVD-IG, Fcab, mAb2, (scFv)2 o scFv-Fc.
La divulgación enseña un agente de unión a CD37 que es un polipéptido que se une específicamente a CD37 y el polipéptido comprende secuencias seleccionadas entre el grupo que consiste en: (a) las SEQ ID NO: 4, 5 y 6 y las SEQ ID NO: 28, 29 y 30; (b) las SEQ ID NO: 7, 8 y 9 y las SEQ ID NO: 31, 32 y 33; (c) las SEQ ID NO: 10, 11 y 12 y las SEQ ID NO: 34, 35 y 36; (d) las SEQ ID NO: 13, 14 y 15 y las SEQ ID NO: 37, 38 y 39; (e) las SEQ ID NO: 13, 14 y 15 y las SEQ ID NO: 37, 40 y 39; (f) las SEQ ID NO: 16, 17 y 18 y las SEQ ID NO: 41, 42 y 43; (g) las SEQ ID NO: 19, 20 y 21 y las SEQ ID NO: 44, 45 y 46; (h) las SEQ ID NO: 19, 20 y 21 y las SEQ ID NO: 44, 47 y 46; (i) las SEQ ID NO: 22, 23 y 24 y las SEQ ID NO: 48, 49 y 50; (j) las SEQ ID NO: 22, 23 y 24 y las SEQ ID NO: 48, 51 y 50; (k) las SEQ ID NO: 25, 26 y 27 y las SEQ ID NO: 52, 53 y 54; y (1) variantes de (a) a (k) que comprenden 1, 2, 3 o 4 sustituciones de aminoácidos conservativas.
La divulgación enseña un agente de unión a CD37 que es un polipéptido que se une específicamente a CD37 y el polipéptido comprende secuencias que son al menos un 90 % idénticas, al menos un 95 % idénticas, al menos un 99 % o completamente idénticas a secuencias seleccionadas entre el grupo que consiste en: (a) la SEQ ID NO: 55 y la SEQ ID NO: 72; (b) la SEQ ID NO: 56 y la SEQ ID NO: 73; (c) la SEQ ID NO: 57 y la SEQ ID NO: 74; (d) la SEQ ID NO: 58 y la SEQ ID NO: 74; (e) la SEQ ID NO: 59 y la SEQ ID NO: 75; (f) la SEQ ID NO: 60 y la SEQ ID NO: 76; (g) la SEQ ID NO: 61 y la SEQ ID NO: 77; (h) la SEQ ID NO: 62 y la SEQ ID NO: 78; (i) la SEQ ID NO: 63 y la SEQ ID NO: 79; (j) la SEQ ID NO: 64 y la SEQ ID NO: 80; (k) la SEQ ID NO: 65 y la SEQ ID NO: 81; (l) la SEQ ID NO: 66 y la SEQ ID NO: 82; (m) la SEQ ID NO: 67 y la SEQ ID NO: 83; (n) la SEQ ID NO: 68 y la SEQ ID NO: 84; (o) la SEQ ID NO: 69 y la SEQ ID NO: 85; (p) la SEQ ID NO: 70 y la SEQ ID NO: 86; y (q) la SEQ ID NO: 71 y la SEQ ID NO: 87. También pueden producirse células que producen el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo y usarse de acuerdo con los métodos descritos en el presente documento. Los métodos proporcionan métodos para producir un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo o un polipéptido que comprenden (a) cultivar una célula que produce dicho agente de unión a CD37; y (b) aislar el anticuerpo, el fragmento de unión a antígeno del mismo o el polipéptido de la célula cultivada.
En algunas realizaciones, el agente de unión a CD37 es un inmunoconjugado que tiene la fórmula (A) - (L) - (C), en donde: (A) es un agente de unión a CD37; (L) es un enlazador; y (C) es un agente citotóxico; y en donde el enlazador (L) enlaza (A) a (C).
En algunas realizaciones, el agente de unión a CD37 es un inmunoconjugado que tiene la fórmula (A) - (L) - (C), en donde: (A) es un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno que se une específicamente a CD37; (L) es un enlazador no escindible; y (C) es un agente citotóxico; y en donde el enlazador (L) enlaza (A) a (C).
En algunas realizaciones, el agente de unión a CD37 es un inmunoconjugado que tiene la fórmula (A) - (L) - (C), en donde: (A) es un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno que se une específicamente a CD37; (L) es un enlazador; y (C) es un maitansinoide; y en donde el enlazador (L) enlaza (A) a (C).
El enlazador del inmunoconjugado puede ser un enlazador no escindible. El enlazador puede seleccionarse entre el grupo que consiste en un enlazador escindible, un enlazador no escindible, un enlazador hidrófilo y un enlazador a base de ácido dicarboxílico. El enlazador puede seleccionarse entre el grupo que consiste en: 4-(2-piridiltio)pentanoato de N-succinimidilo (SPP); 4-(2-piridiltio)butanoato de N-succinimidilo (SPDB) o 4-(2-piridiltio)-2-sulfobutanoato de N-succinimidilo (sulfo-SPDB); 4-(maleimidometil)ciclohexanocarboxilato de N-succinimidilo (SMCC); 4-(maleimidometil)ciclohexanocarboxilato de N-sulfosuccinimidilo (sulfoSMCC); 4-(yodoacetil)-aminobenzoato de N-succinimidilo (SIAB); y [(N-maleimidopropionamido)-tetraetilenglicol] éster de N-succinimidilo (NHS-PEG4-maleimida). El enlazador puede ser [(N-maleimidopropionamido)-tetraetilenglicol] éster de N-succinimidilo (NHS-PEG4-maleimida).
El agente citotóxico puede seleccionarse entre el grupo que consiste en un maitansinoide, análogo de maitansinoide, doxorrubicina, una doxorrubicina modificada, benzodiazepina, taxoide, CC-1065, análogo de CC-1065, duocarmicina, análogo de duocarmicina, caliqueamicina, dolastatina, análogo de dolastatina, aristatina, derivado de tomaimicina y derivado de leptomicina o un profármaco del agente. El agente citotóxico puede ser un maitansinoide. El agente citotóxico puede ser N(2')-desacetil-N(2')-(3-mercapto-1-oxopropil}-maitansina (DM1) o N(2')-desacetil-N2-(4-mercapto-4-metil-1-oxopentil)-maitansina (DM4).
En el presente documento también se proporciona una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo contra CD37 o un fragmento de unión a antígeno del mismo, como se define en las reivindicaciones y un vehículo farmacéuticamente aceptable. La composición farmacéutica puede comprender un segundo agente anticáncer. También se enseña en el presente documento un reactivo diagnóstico que comprende un agente de unión a CD37 que está marcado. El marcador puede seleccionarse entre el grupo que consiste en un radiomarcador, un fluoróforo, un cromóforo, un agente para la obtención de imágenes o un ion metálico.
En el presente documento también se enseña un kit que comprende un agente de unión a CD37.
Los métodos descritos en el presente documento incluyen métodos para inhibir el crecimiento de una célula que expresa CD37 que comprenden poner en contacto la célula con un agente de unión a CD37 o una composición farmacéutica que comprende el mismo.
Los métodos también proporcionan métodos para tratar a un paciente que tiene cáncer que comprenden administrar al paciente una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente de unión a CD37 o una composición farmacéutica que comprende el mismo al sujeto.
Los métodos pueden comprender administrar un segundo agente anticáncer al sujeto. El segundo agente anticáncer puede ser un agente quimioterapéutico.
El cáncer puede ser un cáncer seleccionado entre el grupo que consiste en linfomas de linfocitos B, NHL, leucemia/linfoma linfoblástico de linfocitos B precursores y neoplasias de linfocitos B maduros, leucemia linfocítica crónica de linfocitos B (CLL)/linfoma linfocítico de células pequeñas (SLL), leucemia prolinfocítica de linfocitos B, linfoma linfoplasmacítico, linfoma de células del manto (MCL), linfoma folicular (FL), (FL) de grado bajo, de grado intermedio y de alto grado, linfoma cutáneo del centro folicular, linfoma de linfocitos B de zona marginal, linfoma de linfocitos B de zona marginal de tipo MALT, linfoma de linfocitos B de zona marginal nodal, linfoma de linfocitos B de zona marginal de tipo esplénico, tricoleucemia, linfoma difuso de linfocitos B grandes, linfoma de Burkitt, plasmacitoma, mieloma de células plasmáticas, trastorno linfoproliferativo posterior a trasplante, macroglobulinemia de Waldenstrom y linfoma anaplásico de células grandes (ALCL).
En el presente documento también se enseñan polinucleótidos aislados que comprenden una secuencia que codifica un polipéptido al menos un 90 % idéntico, al menos un 95 % idéntico, al menos un 99 % idéntico o completamente idéntico a una secuencia seleccionada entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 55-87. El polinucleótido puede comprender una secuencia que es al menos un 90 %, al menos un 95 % idéntica, al menos un 99 % idéntica o completamente idéntica a las SEQ ID NO: 121-151.
En el presente documento también se proporcionan vectores y células hospedadoras que comprenden dichos polinucleótidos y vectores.
Breve descripción de los dibujos/las figuras
La figura 1 representa los histogramas para la unión de anticuerpos a células de control 300-19 no transfectadas (paneles de la izquierda) y a células 300-19 que expresan CD37 (paneles de la derecha). Se muestran histogramas para la tinción con 10 nM de muCD37-3, muCD37-12, muCD37-38 y la ausencia de anticuerpo primario.
La figura 2 representa los histogramas para la unión de anticuerpos a células de control 300-19 no transfectadas (paneles de la izquierda) y a células 300-19 que expresan CD37 (paneles de la derecha). Se muestran histogramas para la tinción con 10 nM de muCD37-50, muCD37-51, muCD37-56 y muCD37-57.
La figura 3 representa la unión de (A) muCD37-3 y muCD37-12 y (B) muCD37-8, muCD37-10 y muCD37-14 a células WSU-DLCL-2, según se evalúa mediante citometría de flujo. Se representa la intensidad media de fluorescencia (IMF) para cada concentración de anticuerpo usada. Se usaron las curvas de unión para determinar la CE50 de la unión de anticuerpo, que corresponde a la Kd aparente de cada anticuerpo.
La figura 4 representa los resultados de un ensayo de anexina-V para medir la inducción de la apoptosis usando células de linfoma Ramos incubadas con una concentración 10 nM de (A) rituximab, muCD37-3, muCD37-8, muCD37-10, muCD37-12 o muCD37-14 y (B) rituximab, huCD37-3, muCD37-38, muCD37-50, muCD37-51, muCD37-56 o muCD37-57. Por comparación, se usan muestras de control de células no tratadas en ausencia de anticuerpo (sin Ab).
La figura 5 representa los resultados de ensayos de proliferación de WST-8 en células de linfoma SU-DHL-4 incubadas con diversas concentraciones de anticuerpos muCD37-3, muCD37-38, muCD37-50, muCD37-51 y muCD37-16 durante 5 días.
La figura 6 representa una lista de restos superficiales de CD37-3 y sustituciones en las versiones revestidas para (A) VL de CD37-3 y (B) VH de CD37-3.
La figura 7 representa una lista de restos superficiales de CD37-50 y sustituciones en la versión revestida para (A) VL de CD37-50 y (B) VH de CD37-50.
La figura 8 representa alineamientos de secuencias revestidas para la región variable de CD37-3 y CD37-50 con sus homólogos murinos: A) dominio variable de cadena ligera de CD37-3; B) dominio variable de cadena pesada de CD37-3. C) dominio variable de cadena ligera de CD37-50; D) dominio variable de cadena pesada de CD37-50. Los guiones "-" indican identidad con la secuencia murina.
La figura 9 representa (A) ensayos de unión directa de muCD37-3, chCD37-3, muCD37-12 y chCD37-12 a células Ramos, según se evalúa mediante citometría de flujo y (B) ensayos de unión competitiva con muCD37-3, chCD37-3, huCD37-3v1.0 y huCD37-3v1.01 a células BJAB en presencia de una concentración 2 nM de conjugados de muCD37-3-PE.
La figura 10 representa la unión de anticuerpos anti-CD37 a células 300-19 que expresan el antígeno CD37 de macaco, según se evalúa mediante citometría de flujo: (A) unión de muCD37-3, muCD37-12, muCD37-38, muCD37-50, muCD37-51, muCD37-56, muCD37-57, WR17 y TRU-016 y (B) unión de huCD37-3, huCD37-38, huCD37-50, huCD37-51, huCD37-56 y huCD37-57. Se usaron las curvas de unión para determinar la CE50 de la unión de anticuerpo, que corresponde a la Kd aparente de cada anticuerpo.
La figura 11 representa los resultados de un ensayo de Anexina-V para medir la inducción de la apoptosis en células de linfoma Ramos incubadas con diversas concentraciones de (A) huCD37-3, huCD37-38, huCD37-50 y (B) huCD37-51, huCD37-56, huCD36-57 y rituximab. Se usan en la comparación muestras de control de células tratadas con un anticuerpo de control de isotipo IgG1 humano (control de huIgG).
La figura 12 representa los resultados de ensayos de proliferación de WST-8 en (A) células de linfoma SU-DHL-4 y (B) DOHH-2 incubadas con diversas concentraciones de anticuerpos muCD37-3, chCD37-3, huCD37-3v1.0 y huCD37-3v1.01 durante 5 días.
La figura 13 representa los resultados de ensayos de proliferación de WST-8 en (A) células de linfoma Granta-519 y (B) SU-DHL-4 incubadas con diversas concentraciones de los anticuerpos huCD37-3, TRU-016 o rituximab durante 5 días.
La figura 14 representa los resultados de ensayos de CDC en células de linfoma Ramos incubadas con (A) huCD37-3, huCD37-38, chCD37-12 o un anticuerpo de control de isotipo huIgG1 y (B) huCD37-38, huCD37-50, huCD37-51, huCD37-56, huCD37-57, chCD37-12 o un anticuerpo de control de isotipo huIgG1 en presencia de suero humano al 5 % como fuente de complemento.
La figura 15 representa los resultados de un ensayo de ADCC en células de linfoma Daudi incubadas con (A) huCD37-3, huCD37-38, huCD37-50, TRU-016 y (B) huCD37-51, huCD37-56, huCD37-57, TRU-016 o un anticuerpo de control de isotipo IgG1 humano en presencia de células NK humanas purificadas como células efectoras.
La figura 16 representa el alineamiento de las secuencias de aminoácidos de CD37 de longitud completa murino, humano y de macaco. Los guiones "-" indican identidad con la secuencia murina. Se marcan mediante subrayado los dominios extracelulares grandes y pequeños. La figura 17 representa el alineamiento del dominio extracelular grande de las secuencias de CD37 humano, recombinante, murino de tipo silvestre, de macaco y quimérico. Los guiones "-" indican identidad con la secuencia humana. Se proporcionan las posiciones de los sitios de restricción diseñados y los restos afectados están subrayados.
La figura 18 representa la unión de un panel de anticuerpos para CD37 a células transfectadas con (A) CD37 humano de tipo silvestre y (B) la variante hCD37-M3, según se evalúa mediante citometría de flujo usando 1,5 |jg/ml de cada anticuerpo.
La figura 19 representa la unión de un panel de anticuerpos contra CD37 a células transfectadas con (A) la variante hCD37-M1 y (B) la variante hCD37-M45, según se evalúa mediante citometría de flujo usando 1,5 |jg/ml de cada anticuerpo.
La figura 20 representa la unión de (A) huCD37-3 en comparación con huCD37-3-SMCC-DM1, huCD37-3-SPP-DM1 y huCD37-3-sulfo-mal-DM4 y (B) huCD37-38 en comparación con huCD37-38-SMCC-DM 1 a células BJAB según se evalúa mediante citometría de flujo. Se usaron las curvas de unión para determinar la CE50 de la unión de anticuerpo o conjugado, que corresponde a la Kd aparente de cada uno.
La figura 21 representa los resultados de (A) un ensayo de Anexina-V para medir la inducción de la apoptosis y (B) los resultados de un ensayo de CDC. Se llevaron a cabo ensayos en células de linfoma Ramos incubadas con diversas concentraciones de huCD37-3, huCD37-3-SMCC-DM1, anticuerpo de control huIgG1, conjugado de control huIgG1-SMCC-DM1 o rituximab. Se llevaron a cabo ensayos de CDC en presencia de suero humano al 5 % como fuente de complemento.
La figura 22 representa los resultados de ensayos de ADCC en (A) células de linfoma Daudi incubadas con huCD37-3, huCD37-3-SMCC-DM1, huCD37-3-PEG4-mal-DM1, TRU-016 o un anticuerpo de control de isotipo huIgG1 y (B) células de linfoma Ramos incubadas con huCD37-3, huCD37-3-SMCC-DM1, huCD37-3-PEG4-mal-DM1 o un anticuerpo de control de isotipo huIgG1 en presencia de células NK humanas purificadas como células efectoras.
La figura 23 representa los resultados de un análisis del ciclo celular usando tinción de yoduro de propidio en (A) células BJAB y (B) células RL incubadas con huCD37-3, huCD37-3-SMCC-DM1 o un conjugado de control sin unión huIgG1-SMCC-DM1 a una concentración de 10 nM durante 20 horas.
La figura 24 representa los resultados de un ensayo de citotoxicidad de WST-8 en (A) células Daudi incubadas con huCD37-3-SMCC-DM1, huCD37-38-SMCC-DM1, huCD37-50-SMCC-DM1, huCD37-51-SMCC-DM1, huCD37-56-SMCC-DM1, huCD37-57-SMCC-DM1 y (B) células Granta-519 incubadas con huCD37-3-SMCC-DM1, huCD37-38-SMCC-DM1, huCD37-50-SMCC-DM1, huCD37-51-SMCC-DM1 o un conjugado de control sin unión huIgG1-SMCC-DM1 a concentraciones en el intervalo de 3 x 10-8 M a 1 x 10-11 M durante 5 días.
La figura 25 representa los resultados de un modelo de xenoinjerto establecido usando células de linfoma BJAB implantadas por vía subcutánea en ratones SCID. Se trató a los animales una vez en el día 12 después de la inoculación de las células con 10 mg/kg de (A) Ab huCD37-3, huCD37-3-SMCC-DM1, Ab huCD37-50, huCD37-50-SMCC-DM1 o (B) Ab huCD37-38, huCD37-38-SMCC-DM1, Ab huCD37-56, huCD37-56-SMCC-DM1. Se representa el volumen tumoral medio de los diferentes grupos de tratamiento frente al tiempo después de la inoculación de células tumorales.
La figura 26 representa resultados de un estudio de xenoinjerto establecido usando células de linfoma BJAB implantadas por vía subcutánea en ratones SCID. Se trató a los animales una vez en el día 9 después de la inoculación de las células con 10 mg/kg de Ab huCD37-3, huCD37-3-SMCC-DM1, huCD37-3-sulfo-mal-DM4 o 5 mg/kg de huCD37-3-SPP-DM1. Se representa el volumen tumoral medio de los diferentes grupos de tratamiento frente al tiempo después de la inoculación de células tumorales.
La figura 27 representa resultados de un modelo de xenoinjerto establecido usando células de linfoma difuso de linfocitos B grandes SU-DHL-4, implantadas por vía subcutánea en ratones SCID. Se trató a los animales una vez en el día 17 después de la inoculación de las células con 10 mg/kg de Ab huCD37-3, huCD37-3-SMCC-DM1, huCD37-3-sulfo-mal-DM4 o 5 mg/kg de huCD37-3-SPP-DM1. Se representa la mediana del volumen tumoral de los diferentes grupos de tratamiento frente al tiempo después de la inoculación de células tumorales.
La figura 28 representa los resultados de un modelo de xenoinjerto establecido usando células de linfoma BJAB implantadas por vía subcutánea en ratones SCID. Se trató a los animales una vez en el día 9 después de la inoculación de las células con 10 mg/kg de Ab huCD37-3, huCD37-3-SMCC-DM1 o huCD37-3-PEG4-mal-DM1. Se representa el volumen tumoral medio de los diferentes grupos de tratamiento frente al tiempo después de la inoculación de células tumorales.
La figura 29 representa los resultados de un modelo de xenoinjerto establecido usando células de linfoma difuso de linfocitos B grandes SU-DHL-4, implantadas por vía subcutánea en ratones SCID. Se trató a los animales una vez en el día 15 después de la inoculación de las células con 10 mg/kg de Ab huCD37-3, huCD37-3-SMCC-DM1 o huCD37-3-PEG4-mal-DM1. Se representa el volumen tumoral medio de los diferentes grupos de tratamiento frente al tiempo después de la inoculación de células tumorales.
La figura 30 representa los resultados de un ensayo que usa un modelo de xenoinjerto establecido con células de linfoma folicular de linfocitos B DoHH2 implantadas por vía subcutánea en ratones SCID. Se trató a los animales comenzando en el día 12 después de la inoculación con (i) una sola dosis de 10 mg/kg de anticuerpo huCD37-3, (ii) una sola dosis de 10 mg/kg de conjugado huCD37-3-SMCC-DM1, (iii) seis dosis de 2 mg/kg de Rituximab dos veces a la semana durante tres semanas, (iv) un régimen de una sola dosis de 40 mg/kg de ciclofosfamida y 0,5 mg/kg de vincristina, junto con cinco dosis diarias de 0,2 mg/kg de prednisona (CVP) o (v) un control de vehículo. Se representa la mediana del volumen tumoral de los diferentes grupos de tratamiento frente al tiempo después de la inoculación de células tumorales.
La figura 31 representa los resultados de un ensayo que usa un modelo de xenoinjerto establecido con células de CLL JVM3 implantas por vía subcutánea en ratones SCID. Se trató a los animales comenzando en el día 7 después de la inoculación con (i) una sola dosis de 10 mg/kg de anticuerpo huCD37-3, (ii) una dosis de 5 mg/kg de conjugado huCD37-3-SMCC-DM1, (iii) una dosis de 10 mg/kg de conjugado huCD37-3-SMCC-DM1, (iv) seis dosis de 5 mg/kg de ofatumumab dos veces a la semana durante tres semanas, (v) una sola dosis de 50 mg/kg de bendamustina o (vi) un control de vehículo. Se representa la mediana del volumen tumoral de los diferentes grupos de tratamiento frente al tiempo después de la inoculación de células tumorales.
La figura 32 representa los niveles de expresión de CD37 y CD20 medidos en diversas líneas celulares tumorales de NHL y CLL (A) y la citotoxicidad in vitro de huCD37-3-SMCC-DM1 medida en estas líneas celulares (B).
Descripción detallada de la invención
La presente invención proporciona una nueva clase de moléculas de unión a CD37 que tiene alta potencia en las tres actividades citotóxicas a continuación contra células que expresan CD37 (por ejemplo, positivas): inducción de la apoptosis, ADCC y CDC. Además, los inmunoconjugados de anticuerpos anti-CD37 eliminan inesperadamente bien a células que expresan CD37, como se demuestra usando modelos de tumor in vivo.
I. Definiciones
Para facilitar la comprensión de la presente invención, a continuación se define una serie de términos y expresiones.
El término CD37, como se usa en el presente documento, se refiere a un CD37 nativo, a menos que se indique otra cosa. CD37 también se denomina GP52-40, antígeno CD37 de leucocitos y tetraspanina-26. El término "CD37" abarca CD37 sin procesar "de longitud completa", así como cualquier forma de CD37 que sea el resultado de su procesamiento en la célula. El término también abarca variantes de origen natural de CD37, por ejemplo, variantes de corte y empalme, variantes alélicas e isoformas. Los polipéptidos de CD37 descritos en el presente documento pueden aislarse de diversas fuentes, tales como de tipos de tejido humano o de otra fuente o prepararse por métodos recombinantes o sintéticos.
El término "anticuerpo" significa una molécula de inmunoglobulina que reconoce y se une específicamente a una diana, tal como una proteína, polipéptido, péptido, hidrato de carbono, polinucleótido, lípido o combinaciones de los anteriores a través de al menos un sitio de reconocimiento de antígeno en la región variable de la molécula de inmunoglobulina. Como se usa en el presente documento, el término "anticuerpo" abarca anticuerpos policlonales intactos, anticuerpos monoclonales intactos, fragmentos de anticuerpo (tales como fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 y Fv), mutantes de Fv monocatenario (scFv), anticuerpos multiespecíficos, tales como anticuerpos biespecíficos generados a partir de al menos dos anticuerpos intactos, anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados, anticuerpos humanos, proteínas de fusión que comprenden una porción de determinación de antígeno de un anticuerpo y cualquier otra molécula de inmunoglobulina modificada que comprende un sitio de reconocimiento de antígeno y las regiones variables de cadena pesada y ligera definidas, en tanto que los anticuerpos muestren la actividad biológica deseada. Un anticuerpo puede ser de cualquiera de las cinco clases principales de inmunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM o subclases (isotipos) de las mismas (por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2), basándose en la identidad de sus dominios constantes de cadena pesada, citados como alfa, delta, épsilon, gamma y mu, respectivamente. Las diferentes clases de inmunoglobulinas tienen diferentes y bien conocidas estructuras de subunidad y configuraciones tridimensionales. Los anticuerpos pueden estar desnudos o conjugados a otras moléculas, tales como toxinas, radioisótopos, etc.
Un anticuerpo "de bloqueo" o un anticuerpo "antagonista" es uno que inhibe o reduce la actividad biológica del agente al que se une, tal como CD37. En algunas realizaciones, los anticuerpos de bloqueo o anticuerpos antagonistas inhiben sustancial o completamente la actividad biológica del antígeno. La actividad biológica puede reducirse en un 10 %, 20 %, 30 %, 50 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % o incluso un 100 %.
La expresión "anticuerpo anti-CD37" o "un anticuerpo que se une a CD37" se refiere a un anticuerpo que es capaz de unirse a CD37 con una afinidad suficiente, de tal forma que es útil como agente diagnóstico y/o terapéutico para usar CD37 como diana. El alcance de la unión de un anticuerpo anti-CD37 a una proteína distinta de CD37 no relacionada puede ser menor de aproximadamente un 10 % de la unión del anticuerpo a CD37 como se mide, por ejemplo, mediante radioinmunoensayo (RIA). En determinadas realizaciones, un anticuerpo que se une a c D37 tiene una constante de disociación (Kd) de <1 pM, < 100 nM, < 10 nM, < 1 nM o < 0,1 nM. La expresión "fragmento de anticuerpo" se refiere a una porción de un anticuerpo intacto y se refiere a las regiones variables determinantes antigénicas de un anticuerpo intacto. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen, pero sin limitación, fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 y Fv, anticuerpos lineales, anticuerpos monocatenarios y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpo. Un "anticuerpo monoclonal" se refiere a una población homogénea de anticuerpos implicada en el reconocimiento altamente específico y la unión a un solo determinante antigénico o epítopo. Esto contrasta con los anticuerpos policlonales, que normalmente incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes antigénicos. La expresión "anticuerpo monoclonal" abarca anticuerpos monoclonales tanto intactos como de longitud completa, así como fragmentos de anticuerpo (tales como Fab, Fab', F(ab')2, Fv), mutantes monocatenarios (scFv), proteínas de fusión que comprenden una porción de anticuerpo y cualquier otra molécula de inmunoglobulina modificada que comprende un sitio de reconocimiento de antígeno. Además, "anticuerpo monoclonal" se refiere a dichos anticuerpos preparados de diversos modos, incluyendo, pero sin limitación, mediante hibridoma, selección de fagos, expresión recombinante y animales transgénicos.
La expresión "anticuerpo humanizado" se refiere a formas de anticuerpos no humanos (por ejemplo, murinos) que son cadenas de inmunoglobulina específicas, inmunoglobulinas quiméricas o fragmentos de las mismas que contienen secuencias no humanas mínimas (por ejemplo, murinas). Normalmente, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas en las que se reemplazan los restos de la región determinante de la complementariedad (CDR) por restos de las CDR de una especie no humana (por ejemplo, rata, conejo, hámster) que tienen la especificidad, afinidad y capacidad deseadas (Jones et al., 1986, Nature, 321:522-525; Riechmann et al., 1988, Nature, 332:323-327; Verhoeyen et al., 1988, Science, 239:1534-1536). En algunos casos, se reemplazan los restos de la región marco (FR) de Fv de una inmunoglobulina humana por los restos correspondientes en un anticuerpo de una especie no humana que tiene la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. El anticuerpo humanizado puede modificarse adicionalmente mediante la sustitución de restos adicionales, ya sea en la región marco de Fv y/o dentro de los restos no humanos reemplazados para refinar y optimizar la especificidad, afinidad y/o capacidad del anticuerpo. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente la totalidad de al menos uno y normalmente dos o tres, dominios variables que contienen todas o sustancialmente todas las regiones CDR que corresponden a la inmunoglobulina no humana, mientras que todas o sustancialmente todas las regiones FR son aquellas de una secuencia consenso de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado también puede comprender al menos una porción de una región o dominio constante de inmunoglobulina (Fc), normalmente de una inmunoglobulina humana. Se describen ejemplos de métodos usados para generar anticuerpos humanizados en la Patente de los Estados Unidos 5.225.539.
Una "región variable" de un anticuerpo se refiere a la región variable de la cadena ligera del anticuerpo o a la región variable de la cadena pesada del anticuerpo, ya sea sola o en combinación. Cada una de las regiones variables de la cadena pesada y ligera consiste en cuatro regiones marco (FR) conectadas por tres regiones determinantes de complementariedad (CDR), también conocidas como regiones hipervariables. Las CDR en cada cadena se mantienen próximas entre sí por medio de las FR y, con las CDR de la otra cadena, contribuyen a la formación del sitio de unión a antígeno de los anticuerpos. Hay al menos dos técnicas para determinar las CDR: (1) una estrategia basada en la variabilidad de secuencia de especies cruzadas (es decir, Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, (5.a ed., 1991, National Institutes of Health, Bethesda Md.)); y (2) una estrategia basada en estudios cristalográficos de complejos de antígeno-anticuerpo (Al-lazikani et al (1997) J. Molec. Biol. 273:927-948)). Además, en ocasiones se utilizan en la técnica combinaciones de estas dos estrategias para determinar las CDR.
El sistema de numeración de Kabat se usa cuando se hace referencia a un resto en el dominio variable (aproximadamente los restos 1-107 de la cadena ligera y los restos 1-113 de la cadena pesada (por ejemplo, Kabat et al., Sequences of Immunological Interest. 5.a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)).
La numeración de la posición de aminoácido como en Kabat, se refiere al sistema de numeración usado para los dominios variables de cadena pesada o los dominios variables de cadena ligera de la compilación de anticuerpos en Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5.a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991). Utilizando este sistema de numeración, la secuencia de aminoácidos lineal real puede contener menos aminoácidos o aminoácidos adicionales correspondientes a un acortamiento o inserción en, una FR o CDR del dominio variable. Por ejemplo, un dominio variable de cadena pesada puede incluir una única inserción de aminoácido (resto 52a de acuerdo con Kabat) después del resto 52 de H2 y restos insertados (por ejemplo, los restos 82a, 82b y 82c, etc. de acuerdo con Kabat) después del resto 82 de FR de la cadena pesada. La numeración de Kabat de los restos puede determinarse para un anticuerpo dado por alineación en las regiones de homología de la secuencia del anticuerpo con una secuencia numerada de Kabat "convencional". Chothia se refiere, en cambio, a la ubicación de los bucles estructurales (Chothia y Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)). El extremo del bucle CDR-H1 de Chothia, cuando se numera usando la convención de numeración de Kabat, varía entre H32 y H34, dependiendo de la longitud del bucle (esto se debe a que el esquema de numeración de Kabat ubica las inserciones en H35A y H35B; en caso de que no se encuentren presentes ni 35A ni 35B, el bucle termina en 32; si solo está presente 35A, el bucle termina en 33; en caso de que estén presentes 35A y 35B, el bucle termina en 34). Las regiones hipervariables de AbM representan un compromiso entre las CDR de Kabat y los bucles estructurales de Chothia y se usan por el programa informático de modelado de anticuerpos AbM de Oxford Molecular.
Bucle Kabat AbM Chothia
L1 L24-L34 L24-L34 L24-L34
L2 L50-L56 L50-L56 L50-L56
L3 L89-L97 L89-L97 L89-L97
H1 H31-H35B H26-H35B H26-H32..34
(numeración de Kabat)
H1 H31-H35 H26-H35 H26-H32
(numeración de Chothia)
H2 H50-H65 H50-H58 H52-H56
H3 H95-H102 H95-H102 H95-H102
La expresión "anticuerpo humano" significa un anticuerpo producido por un ser humano o un anticuerpo que tiene una secuencia de aminoácidos correspondiente a un anticuerpo producido por un ser humano producido usando cualquier técnica conocida en la materia. Esta definición de un anticuerpo humano incluye anticuerpos intactos o de longitud completa, fragmentos de los mismos y/o anticuerpos que comprenden al menos un polipéptido de cadena pesada y/o ligera humana, tales como, por ejemplo, un anticuerpo que comprende polipéptidos de cadena ligera murina y de cadena pesada humana.
La expresión "anticuerpos quiméricos" se refiere a anticuerpos en donde la secuencia de aminoácidos de la molécula de inmunoglobulina procede de dos o más especies. Normalmente, la región variable de las cadenas tanto pesadas como ligeras corresponde a la región variable de anticuerpos procedentes de otras especies de mamífero (por ejemplo, ratón, rata, conejo, etc.) con la especificidad, afinidad y capacidad deseadas, mientras que las regiones constantes son homólogas a las secuencias en anticuerpos procedentes de otra (normalmente humana) para evitar generar una respuesta inmunitaria en dicha especie.
Los términos "epítopo" o "determinante antigénico" se usan indistintamente en el presente documento y se refieren a una porción de un antígeno que puede reconocerse y a la que se une específicamente un anticuerpo particular. Cuando el antígeno es un polipéptido, los epítopos pueden formarse tanto a partir de aminoácidos contiguos como a partir de aminoácidos no contiguos yuxtapuestos mediante el plegamiento terciario de una proteína. Los epítopos formados a partir de aminoácidos contiguos normalmente se conservan tras la desnaturalización de la proteína, mientras que los epítopos formados mediante el plegamiento terciario normalmente se pierden tras la desnaturalización de la proteína. Un epítopo típicamente incluye al menos 3, y más habitualmente, al menos 5 u 8-10 aminoácidos en una conformación espacial única.
"Afinidad de unión" se refiere generalmente a la fuerza de la suma total de interacciones no covalentes entre un solo sitio de unión de una molécula (por ejemplo, un anticuerpo) y su compañero de unión (por ejemplo, un antígeno). A menos que se indique otra cosa, como se usa en el presente documento, la "afinidad de unión" se refiere a la afinidad de unión intrínseca que refleja una interacción 1:1 entre miembros de un par de unión (por ejemplo, anticuerpo y antígeno). La afinidad de una molécula X por su ligando Y puede estar representada en general por la constante de disociación (Kd). La afinidad puede medirse mediante métodos comunes conocidos en la técnica, incluyendo los descritos en el presente documento. Los anticuerpos de baja afinidad generalmente se unen al antígeno lentamente y tienden a disociarse fácilmente, mientras que los anticuerpos de alta afinidad generalmente se unen al antígeno más rápido y tienden a permanecer unidos durante más tiempo. Se conoce una diversidad de métodos de medición de la afinidad de unión en la técnica, cualquiera de los cuales puede usarse para los fines de la presente invención. A continuación se describen realizaciones ilustrativas específicas.
"O mejor", cuando se usa en el presente documento en referencia a la afinidad de unión, se refiere a una unión más fuerte entre una molécula y su compañero de unión. "O mejor", cuando se usa en el presente documento, se refiere a una unión más fuerte, representada por un valor numérico de Kd menor. Por ejemplo, en un anticuerpo que tiene una afinidad por un antígeno de "0,6 nM o mejor", la afinidad del anticuerpo por el antígeno es < 0,6 nM, es decir, 0,59 nM, 0,58 nM, 0,57 nM etc. o cualquier valor menor de 0,6 nM.
Por "se une específicamente", se entiende generalmente que un anticuerpo se une a un epítopo a través de su dominio de unión a antígeno y que la unión implica cierta complementariedad entre el dominio de unión a antígeno y el epítopo. De acuerdo con esta definición, se dice que un anticuerpo "se une específicamente" a un epítopo cuando se une a dicho epítopo, a través de su dominio de unión a antígeno, con mayor facilidad que a un epítopo aleatorio no relacionado. El término "especificidad" se usa en el presente documento para calificar la afinidad relativa con la que un anticuerpo concreto se une a un epítopo concreto. Por ejemplo, puede considerarse que un anticuerpo "A" tiene una mayor especificidad por un epítopo que el anticuerpo "B", o puede decirse que el anticuerpo "A" se une al epítopo "C" con una mayor especificidad que la que tiene por el epítopo relacionado "D".
Por "se une preferencialmente", se entiende que el anticuerpo se une específicamente a un epítopo más fácilmente de lo que se uniría a un epítopo relacionado, similar, homólogo o análogo. Por lo tanto, un anticuerpo que se "une preferencialmente" a un epítopo dado tendría más probabilidades de unirse a ese epítopo que a un epítopo relacionado, a pesar de que dicho anticuerpo puede reaccionar de manera cruzada con el epítopo relacionado. Se dice que un anticuerpo "inhibe de manera competitiva" la unión de un anticuerpo de referencia a un epítopo dado si se une preferencialmente a dicho epítopo hasta tal punto que bloquea, en cierto modo, la unión del anticuerpo de referencia al epítopo. La inhibición competitiva puede determinarse mediante cualquier método conocido en la técnica, por ejemplo, ensayos ELISA de competición. Puede decirse que un anticuerpo inhibe de manera competitiva la unión del anticuerpo de referencia a un epítopo dado en al menos un 90 %, al menos un 80 %, al menos un 70 %, al menos un 60 % o al menos un 50 %.
La expresión "sustancialmente similar", o "sustancialmente el mismo", como se usa en el presente documento, indica un grado de similitud suficientemente elevado entre dos valores numéricos (normalmente uno asociado con un anticuerpo de la invención y el otro asociado con un anticuerpo de referencia/comparación), de tal forma que un experto en la materia podría considerar que la diferencia entre los dos valores tendría una significación biológica y/o estadística pequeña o nula en el contexto de la característica biológica medida por dichos valores (por ejemplo, valores de Kd). La diferencia ente dichos dos valores puede ser menor de aproximadamente un 50 %, menor de aproximadamente un 40 %, menor de aproximadamente un 30 %, menor de aproximadamente un 20 % o menor de aproximadamente un 10 %, en función del valor para el anticuerpo de referencia/comparación.
Un polipéptido, anticuerpo, polinucleótido, vector, célula o composición que está "aislada" es un polipéptido, anticuerpo, polinucleótido, vector, célula o composición que se encuentra en una forma no encontrada en la naturaleza.
Los polipéptidos, anticuerpos, polinucleótidos, vectores, células o composiciones aislados incluyen aquellos que se han purificado hasta tal punto que ya no se encuentran en una forma en la que se encuentran en la naturaleza. En algunas realizaciones, un anticuerpo, polinucleótido, vector, célula o composición que está aislada es sustancialmente pura.
Como se usa en el presente documento, "sustancialmente puro" se refiere a un material que es al menos un 50 % puro (es decir, libre de contaminantes), al menos un 90 % puro, al menos un 95 % puro, al menos un 98 % puro o al menos un 99 % puro.
El término "inmunoconjugado" o "conjugado", como se usa en el presente documento, se refiere a un compuesto o un derivado del mismo que está unido a un agente de unión a células (es decir, un anticuerpo anti-CD37 o un fragmento del mismo) y se define mediante una fórmula genérica: C-L-A, en donde C = citotoxina, L = enlazador y A = agente de unión celular (por ejemplo, anticuerpo o fragmento de anticuerpo anti-CD37. Los inmunoconjugados también pueden definirse mediante la fórmula genérica en orden inverso: A-L-C.
Un "enlazador" es cualquier resto químico que es capaz de enlazar un compuesto, normalmente un fármaco, tal como un maitansinoide, a un agente de unión a células, tal como un anticuerpo anti-CD37 o un fragmento del mismo de un modo covalente estable. Los enlazadores pueden ser susceptibles o sustancialmente resistentes a la escisión inducida por ácidos, la escisión inducida por luz, la escisión inducida por peptidasas, la escisión inducida por esterasas y la escisión de enlaces disulfuro, en condiciones en las que el compuesto o el anticuerpo sigue siendo activo. Se conocen bien en la técnica enlazadores adecuados e incluyen, por ejemplo, grupos disulfuro, grupos tioéter, grupos lábiles a ácidos, grupos fotolábiles, grupos lábiles a peptidasas y grupos lábiles a esterasas. Los enlazadores también incluyen enlazadores cargados y formas hidrófilas de los mismos, como se describe en el presente documento y se conoce en la técnica.
Los términos "cáncer" y "canceroso" se refieren a o describen la afección fisiológica en mamíferos en la que una población de células se caracteriza por un crecimiento celular desregulado. Los ejemplos de cáncer incluyen, pero sin limitación, carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma y leucemia. "Tumor" y "neoplasia" se refieren a una o más células que resultan de un crecimiento o proliferación celular excesivo, ya sea benigna (no cancerosa) o maligna (cancerosa), incluyendo lesiones precancerosas. Los ejemplos de "cáncer" o enfermedades "tumorigénicas" que pueden tratarse y/o prevenirse incluyen linfomas de linfocitos B, incluyendo NHL, leucemia/linfoma linfoblástico de linfocitos B precursores y neoplasias de linfocitos B maduros, tal como leucemia linfocítica crónica de linfocitos B (CLL)/linfoma linfocítico de células pequeñas (SLL), leucemia prolinfocítica de linfocitos B, linfoma linfoplasmacítico, linfoma de células del manto (MCL), linfoma folicular (FL), incluyendo FL de grado bajo, de grado intermedio y de alto grado, linfoma cutáneo del centro folicular, linfoma de linfocitos B de zona marginal, (de tipo MALT, nodal y de tipo esplénico), tricoleucemia, linfoma difuso de linfocitos B grandes, linfoma de Burkitt, plasmacitoma, mieloma de células plasmáticas, trastorno linfoproliferativo posterior a trasplante, macroglobulinemia de Waldenstrom y linfoma anaplásico de células grandes (ALCL).
Las expresiones "célula cancerosa", "célula tumoral" y sus equivalentes gramaticales se refieren a la población total de células procedentes de un tumor o una lesión precancerosa, incluyendo tanto células no tumorigénicas, que comprenden la mayor parte de la población de células tumorales y células madre tumorigénicas (células madre del cáncer). Como se usa en el presente documento, la expresión "célula tumoral" se modificará con la expresión "no tumorigénica" cuando haga referencia únicamente a aquellas células tumorales que carecen de la capacidad de renovarse y de diferenciarse, a fin de distinguir estas células tumorales de las células madre de cáncer.
El término "sujeto" se refiere a cualquier animal (por ejemplo, un mamífero), incluyendo, pero sin limitación, seres humanos, primates no humanos, roedores y similares, que va a ser el receptor de un tratamiento particular. Normalmente, los términos "sujeto" y "paciente" se usan indistintamente en el presente documento en referencia a un sujeto humano.
La administración "en combinación con" uno o más agentes terapéuticos adicionales incluye administración simultánea (concurrente) y consecutiva en cualquier orden.
La expresión "formulación farmacéutica" se refiere a una preparación que se encuentra en una forma tal que permite que sea eficaz la actividad biológica del principio activo y que no contiene componentes adicionales que sean inaceptablemente tóxicos para un sujeto al que se vaya a administrar la formulación. La formulación puede ser estéril. Una "cantidad eficaz" de un anticuerpo como se divulga en el presente documento es una cantidad suficiente para llevar a cabo un fin específicamente indicado. Una "cantidad eficaz" puede determinarse empíricamente y de una manera rutinaria, en relación con el fin indicado.
La expresión "cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a una cantidad de un anticuerpo u otro fármaco eficaz para "tratar" una enfermedad o trastorno en un sujeto o mamífero. En el caso del cáncer, la cantidad terapéuticamente eficaz del fármaco puede reducir el número de células cancerosas; reducir el tamaño del tumor; inhibir (es decir, frenar hasta cierto punto o detener) la infiltración de células cancerosas en los órganos periféricos; inhibir (es decir, frenar hasta cierto punto o detener) la metástasis tumoral; inhibir, hasta cierto punto, el crecimiento tumoral; y/o aliviar hasta cierto punto uno o más de los síntomas asociados con el cáncer. Véase la definición en el presente documento de "tratar". En la medida en que el fármaco puede evitar el crecimiento y/o destruir las células cancerosas existentes, puede ser citostático y/o citotóxico. Una "cantidad profilácticamente eficaz" se refiere a una cantidad que es eficaz, a dosificaciones y durante periodos de tiempo necesarios, para lograr el resultado profiláctico deseado. Normalmente, pero no necesariamente, dado que se usa una dosis profiláctica en sujetos antes de o en una etapa más temprana de la enfermedad, la cantidad profilácticamente eficaz será menor que la cantidad terapéuticamente eficaz.
El término "marcador", cuando se usa en el presente documento, se refiere a un compuesto o composición detectable que se conjuga directamente o indirectamente al anticuerpo a fin de generar un anticuerpo "marcado". El marcador puede ser detectable por sí mismo (por ejemplo, marcadores de radioisótopos o marcadores fluorescentes) o, en el caso de un marcador enzimático, puede catalizar la alteración química de un compuesto o composición sustrato que es detectable.
Un "agente quimioterapéutico" es un compuesto químico útil en el tratamiento del cáncer, independientemente del mecanismo de acción. Los agentes quimioterapéuticos incluyen, por ejemplo, antagonistas de CD20, tales como Rituximab y ciclofosfamida, doxorrubicina, vincristina, prednisona, fludarabina, etopósido, metotrexato, lenalidomida, clorambucilo, bentamustina y/o versiones modificadas de dichos agentes quimioterapéuticos.
Los términos tales como "tratar" o "tratamiento" o "para tratar" o "aliviar" o "para aliviar" se refieren tanto a 1) medidas terapéuticas que curan, ralentizan, alivian los síntomas de y/o detienen la progresión de una patología o trastorno diagnosticado y 2) medidas profilácticas o preventivas que previenen y/o frenan el desarrollo de una patología o trastorno diana. Por lo tanto, aquellos que necesitan tratamiento incluyen los que ya tienen el trastorno; los propensos a tener el trastorno; y aquellos en los que se va a prevenir el trastorno. En determinadas realizaciones, un sujeto se "trata" exitosamente contra el cáncer de acuerdo con los métodos de la presente invención en caso de que el paciente muestre uno o más de los siguientes: una reducción en el número de o la ausencia completa de células cancerosas; una reducción en el tamaño tumoral; inhibición de o ausencia de infiltración de células cancerosas en los órganos periféricos, incluyendo, por ejemplo, la dispersión del cáncer a los tejidos blandos y el hueso; la inhibición de o la ausencia de metástasis tumoral; la inhibición o la ausencia de crecimiento tumoral; el alivio de uno o más síntomas asociados con el cáncer específico; una morbilidad y mortalidad reducidas; mejora en la calidad de vida; reducción en la tumorigenicidad, la frecuencia tumorigénica o la capacidad tumorigénica, de un tumor; una reducción en el número o la frecuencia de células madre de cáncer en un tumor; la diferenciación de células tumorigénicas en un estado no tumorigénico; o alguna combinación de efectos.
"Polinucleótido", o "ácido nucleico", como se usa indistintamente en el presente documento, se refiere a polímeros de nucleótidos de cualquier longitud e incluye ADN y ARN. Los nucleótidos pueden ser desoxirribonucleótidos, ribonucleótidos, nucleótidos o bases modificadas y/o sus análogos o cualquier sustrato que pueda incorporarse en un polímero mediante una ADN o ARN polimerasa. Un polinucleótido puede comprender nucleótidos modificados, tal como nucleótidos metilados y sus análogos. En caso de estar presente, pueden impartirse modificaciones en la estructura de nucleótidos antes o después del ensamblaje del polímero. La secuencia de nucleótidos puede estar interrumpida por componentes no nucleotídicos. Un polinucleótido puede modificarse adicionalmente después de la polimerización, tal como mediante conjugación con un componente de marcado. Otros tipos de modificaciones incluyen, por ejemplo, "remates", sustitución de uno o más de los nucleótidos de origen natural con un análogo, modificaciones internucleotídicas tales como, por ejemplo, aquellas con enlaces no cargados (por ejemplo, metil fosfonatos, fosfotriésteres, fosfoamidatos, carbamatos, etc.) y con enlaces cargados (por ejemplo, fosforotioatos, fosforoditioatos, etc.), aquellas que contienen restos colgantes, tales como, por ejemplo, proteínas (por ejemplo, nucleasas, toxinas, anticuerpos, péptidos de señal, poli-L-lisina, etc.), aquellas con intercaladores (por ejemplo, acridina, psoraleno, etc.), aquellas que contienen quelantes (por ejemplo, metales, metales radioactivos, boro, metales oxidativos, etc.), aquellas que contienen alquilantes, aquellas con enlaces modificados (por ejemplo, ácidos nucleicos, alfa anoméricos, etc.), así como formas no modificadas de los polinucleótidos. Además, puede reemplazarse cualquiera de los grupos hidroxilo normalmente presentes en los azúcares, por ejemplo, por grupos fosfonato, grupos fosfato, protegerse con grupos protectores convencionales o activarse para preparar enlaces adicionales a nucleótidos adicionales o pueden conjugarse a soportes sólidos. El OH 5' y 3' terminal puede fosforilarse o sustituirse con aminas o restos de grupos de remate orgánico de 1 a 20 átomos de carbono. Otros hidroxilos también pueden derivatizarse con grupos protectores estándar. Los polinucleótidos también pueden contener formas análogas de azúcares de ribosa o desoxirribosa que son normalmente conocidos en la técnica, incluyendo, por ejemplo, 2'-O-metil-, 2'-O-alil, 2'-fluoroo 2'-azido-ribosa, análogos de azúcares carbocíclicos, azúcares alfa-anoméricos, azúcares epiméricos, tales arabinosa, xilosas o lixosas, azúcares de piranosa, azúcares de furanosa, sedoheptulosas, análogos acíclicos y análogos de nucleósidos abásicos, tales como ribósido de metilo. Pueden reemplazarse uno o más enlaces fosfodiéster por grupos de unión alternativos. Estos grupos de unión alternativos incluyen, pero sin limitación, realizaciones en donde el fosfato se reemplaza por P(O)S ("tioato"), P(S)S ("ditioato"), "(O)NR2 ("amidato"), P(O)R, P(O)OR', CO o CH2 ("formacetal"), en donde cada R o R' es independientemente H o alquilo (C1-20) sustituido o sin sustituir que contiene opcionalmente un enlace éter (-O-), arilo, alquenilo, cicloalquilo, cicloalquenilo o araldilo. No todos los enlaces en un polinucleótido necesitan ser idénticos. La descripción anterior se aplica a todos los polinucleótidos citados en el presente documento, incluyendo ADN y ARN.
El término "vector" significa una construcción, que es capaz de suministrar y opcionalmente de expresar, uno o más genes o secuencias de interés en una célula hospedadora. Los ejemplos de vectores incluyen, pero sin limitación, vectores víricos, vectores de expresión de ADN o ARN desnudo, vectores de plásmido, cósmido o fago, vectores de expresión de ADN o ARN asociados con agentes de condensación catiónicos, vectores de expresión de ADN o ARN encapsulados en liposomas y ciertas células eucariotas, tales como células productoras.
Los términos "polipéptido", "péptido" y "proteína" se utilizan indistintamente en el presente documento para referirse a polímeros de aminoácidos de cualquier longitud. El polímero puede ser lineal o ramificado, puede comprender aminoácidos modificados y puede estar interrumpido por no aminoácidos. Los términos también abarcan un polímero de aminoácidos que se ha modificado de manera natural o por intervención; por ejemplo, formación de enlaces disulfuro, glucosilación, lipidación, acetilación, fosforilación o cualquier otra manipulación o modificación, tal como conjugación con un componente de marcaje. En la definición también se incluyen, por ejemplo, polipéptidos que contienen uno o más análogos de un aminoácido (incluyendo, por ejemplo, aminoácidos no naturales, etc.), así como otras modificaciones conocidas en la materia. Se entiende que, debido a que los polipéptidos de la presente invención están basados en anticuerpos, en determinadas realizaciones, los polipéptidos pueden producirse como cadenas individuales o como cadenas asociadas.
Los términos "idéntico" o porcentaje de "identidad", en el contexto de dos o más ácidos nucleicos o polipéptidos, se refieren a dos o más secuencias o subsecuencias que son iguales o tienen un porcentaje específico de 'restos de nucleótidos o aminoácidos que son iguales, cuando se comparan y alinean (introduciendo huecos en caso necesario) para lograr una correspondencia máxima, sin tomar en consideración cualquier sustitución de aminoácidos conservativa como parte de la identidad de secuencia. El porcentaje de identidad puede medirse usando programas informáticos o algoritmos de comparación de secuencias o mediante inspección visual. Se conocen diversos algoritmos y programas informáticos que pueden usarse para obtener alineamientos de secuencias de aminoácidos o nucleótidos. Un ejemplo no limitante de dicho algoritmo de alineamiento de secuencias es el algoritmo descrito en Karlin et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci., 87:2264-2268, como se modifica en Karlin et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci., 90:5873-5877 e incorporado en los programas NBLAST y XBLAST (Altschul et al., 1991, Nucleic Acids Res., 25:3389-3402). En determinadas realizaciones, puede usarse Gapped Blast como se describe en Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402. BLAST-2, WU-BLAST-2 (Altschul et al., 1996, Methods in Enzymology, 266:460-480), ALIGN, ALIGN-2 (Genentech, South San Francisco, California) o Megalign (DNASTAR) son programas informáticos disponibles públicamente adicionales que pueden usarse para alinear secuencias. En determinadas realizaciones, el porcentaje de identidad entre dos secuencias de nucleótidos se determina usando el programa GAP en el programa informático GCG (por ejemplo, usando una matriz NWSgapdna.CMP y una ponderación por hueco de 40, 50, 60, 70 o 90 y una ponderación por longitud de 1,2, 3, 4, 5 o 6). En ciertas realizaciones alternativas, el programa GAP en el paquete informático GCG, que incorpora el algoritmo de Needleman y Wunsch (J. Mol. Biol. (48):444-453 (1970)) puede usarse para determinar el porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos (por ejemplo, usando o bien una matriz Blossum 62 o una matriz PAM250 y una ponderación por hueco de 16, 14, 12, 10, 8, 6 o 4 y una ponderación por longitud de 1,2, 3, 4, 5). Como alternativa, en determinadas realizaciones, el porcentaje de identidad entre secuencias de nucleótidos o aminoácidos se determina usando el algoritmo de Myers y Miller (CABIOS, 4:11-17 (1989)). Por ejemplo, puede determinarse el porcentaje de identidad usando el programa ALIGN (versión 2.0) y usando una PAM120 con tabla de restos, una penalización por longitud de hueco de 12 y una penalización por hueco de 4. Pueden determinarse por un experto en la materia parámetros adecuados para un alineamiento máximo mediante programas informáticos de alineamiento particulares. En determinadas realizaciones, se usan los parámetros por defecto del programa de alineamiento. En determinadas realizaciones, el porcentaje de identidad "X" de una primera secuencia de aminoácidos respecto de una segunda secuencia de aminoácidos se calcula como 100 x (Y/Z), donde Y es el número de restos de aminoácido puntuados como coincidencias idénticas en el alineamiento de las secuencias primera y segunda (alineadas mediante inspección visual o un programa de alineamiento de secuencias particular) y Z es el número total de restos en la segunda secuencia. En caso de que la longitud de una primera secuencia sea mayor que la segunda secuencia, el porcentaje de identidad de la primera secuencia respecto de la segunda secuencia será mayor que el porcentaje de identidad de la segunda secuencia respecto de la primera secuencia.
Como un ejemplo no limitante, puede determinarse, en ciertas realizaciones, si un polinucleótido particular tiene un cierto porcentaje de identidad de secuencia (por ejemplo, es al menos un 80 % idéntica, al menos un 85 % idéntica, al menos un 90 % idéntica y en algunas realizaciones, al menos un 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica) respecto de una secuencia de referencia, usando el programa Bestfit (Wisconsin Sequence Analysis Package, versión 8 para Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, WI 53711). Bestfit usa el algoritmo de homología local de Smith y Waterman, Advances in Applied Mathematics 2: 482489 (1981), para hallar el mejor segmento de homología entre dos secuencias. Cuando se usa Bestfit o cualquier otro programa de alineamiento de secuencias para determinar si una secuencia particular es, por ejemplo, un 95 % idéntica a una secuencia de referencia de acuerdo con la presente invención, se ajustan los parámetros de tal forma que se calcula el porcentaje de identidad a lo largo de la longitud completa de la secuencia de nucleótidos de referencia y que se permiten huecos en la homología de hasta el 5 % del número total de nucleótidos en la secuencia de referencia.
En algunas realizaciones, dos ácidos nucleicos o polipéptidos de la invención son sustancialmente idénticos, lo que significa que tienen al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 % y en algunas realizaciones al menos un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % de identidad de restos de nucleótidos o aminoácidos, cuando se comparan y alinean para una correspondencia máxima, medida usando un algoritmo de comparación de secuencias o por inspección visual. La identidad puede existir a lo largo de una región de las secuencias que tiene al menos aproximadamente 10, aproximadamente 20, aproximadamente 40-60 restos de longitud o cualquier valor integral intermedio y puede ser a lo largo de una región con una longitud superior a 60-80 restos, por ejemplo, al menos aproximadamente 90-100 restos y en algunas realizaciones, las secuencias son sustancialmente idénticas a lo largo de la longitud completa de las secuencias que se están comparando, tal como, por ejemplo, la región codificante de una secuencia de nucleótidos.
Una "sustitución de aminoácidos conservativa" es una en la que se reemplaza un resto de aminoácido por otro resto de aminoácido que tenga una cadena lateral similar. Se han definido en la técnica familias de restos de aminoácidos que tienen cadenas laterales similares, incluyendo cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina), cadenas laterales ácidas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares no cargadas (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano), cadenas laterales beta-ramificadas (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina). Por ejemplo, la sustitución de una tirosina por una fenilalanina es una sustitución conservativa. En algunas realizaciones, las sustituciones conservativas en las secuencias de los polipéptidos y anticuerpos de la invención no suprimen la unión del polipéptido o anticuerpo que contiene la secuencia de anticuerpo para los antígenos, es decir, el CD37 a la que se une el polipéptido o anticuerpo. Los métodos para identificar sustituciones conservativas de nucleótidos y aminoácidos que no eliminan la unión a antígeno son bien conocidas en la materia (véase, por ejemplo, Brummell et al., Biochem. 32: 1180-1 187 (1993); Kobayashi et al. Protein Eng. 12(10):879-884 (1999); y Burks et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:.412-417 (1997)).
Como se usa en la presente divulgación y en las reivindicaciones, las formas en singular "un", "uno/a", y "el" o "la", incluyen formas en plural a menos que el contexto dicte claramente otra cosa.
Se entiende que siempre que se describan realizaciones en el presente documento con el lenguaje "que comprende", se proporcionan también realizaciones análogas descritas en términos de "que consisten en" y/o "que consisten esencialmente en".
La expresión "y/o" como se utiliza en una frase tal como "A y/o B" en el presente documento pretende incluir tanto "A como B", "A o B", "A" y "B." Asimismo, la expresión "y/o" tal como se utiliza en una frase tal como "A, B y/o C" pretende abarcar cada una de las siguientes realizaciones: A, B y C; A, B o C; A o C; A o B; B o C; A y C; A y B; B y C; A (solo); B (solo); y C (solo).
II. Agentes de unión a CD37
La presente invención proporciona agentes que se unen específicamente a CD37. Estos agentes se citan en el presente documento como "agentes de unión a CD37". Se conocen en la técnica las secuencias de aminoácidos de longitud completa para CD37 de ser humano, macaco y murina y también se proporcionan en el presente documento como se representan por las SEQ ID NO: 1-3, respectivamente.
CD37 humano:
MSAQESCLSLIKYFLFVFNLFFFVLGSLIFCFGIWILIDKTSFVSFVGLAFVPLQIWSKVL
AISGIFTMGIAFFGCVGAFKEFRCFFGFYFGMFFFFFATQITFGIFISTQRAQFERSFRDVVEKTIQ
KYGTNPEETAAEESWDYVQFQFRCCGWHYPQDWFQVFIFRGNGSEAHRVPCSCYNFSATNDSTI
EDKVIEPQESREGHEARSRHSADICAVPAESHIYREGCAQGEQKWEHNNEISIVGICEGVGEEEEG
FMTESIFECRNEDHVYNREAYR (SEQ ID NO:l)
CD37 de macaco:
MSAQESCLSLIKYFLFVFNLFFFVILGSLIFCFGIWILIDKTSFVSFVGLAFVPLQIWSKV
LAISGVFTMGLALLGCVGALKELRCLLGLYFGMLLLLFATQITLGILISTQRAQLERSLQDIVEKTI
QRYHTNPEETAAEESWDYVQFQLRCCGWHSPQDWFQVLTLRGNGSEAHRVPCSCYNLSATNDS
TILDKVILPQLSRLGQLARSRHSTDICAVPANSHIYREGCARSLQKWLHNNLISIVGICLGVGLLEL
GFMTLSIFLCRNLDHVYNRLRYR (SEQ ID NO:2)
CD37 murino (NP_031671):
MSAQESCLSLIKYFLFVFNLFFFVLGGLIFCFGTWILIDKTSFVSFVGLSFVPLQTWSKV
FAVSGVFTMAFAFFGCVGAFKEFRCFFGFYFGMFFFFFATQITFGIFISTQRVRFERRVQEFVFR
TIQSYRTNPDETAAEESWDYAQFQFRCCGWQSPRDWNKAQMFKANESEEPFVPCSCYNSTATN
DSTVFDKLFFSQLSRLGPRAKLRQTADICALPAKAHIYREGCAQSLQKWLHNNIISIVGICLGVGL
LELGFMTLSIFLCRNLDHVYDRLARYR (SEQ ID N0:3)
En determinadas realizaciones, los agentes de unión a CD37 son anticuerpos o inmunoconjugados. En algunas realizaciones, los agentes de unión a CD37 son anticuerpos humanizados.
En determinadas realizaciones, los agentes de unión a CD37 tienen uno o más de los siguientes efectos: inhiben la proliferación de células tumorales, reducen la tumorigenicidad de un tumor reduciendo la frecuencia de células madre de cáncer en el tumor, inhiben el crecimiento tumoral, aumentan la supervivencia, desencadenan la muerte celular de las células tumorales, diferencian a las células tumorigénicas a un estado no tumorigénico o previenen la metástasis de las células tumorales.
En determinadas realizaciones, los agentes de unión a CD37 son capaces de inducir citotoxicidad dependiente de complemento. Por ejemplo, el tratamiento de células con los agentes de unión a CD37 puede dar como resultado una actividad CDC que reduce la viabilidad celular a menos de aproximadamente un 80 %, menos de aproximadamente un 70 %, menos de aproximadamente un 60 %, menos de aproximadamente un 50 %, menos de aproximadamente un 40 % o menos de aproximadamente un 35 % de la viabilidad celular de las células no tratadas. El tratamiento de las células con los agentes de unión a CD37 también puede dar como resultado una actividad CDC que reduce la viabilidad a aproximadamente un 70-80 %, aproximadamente un 60-70 %, aproximadamente un 50-60 %, aproximadamente un 40-50 % o aproximadamente un 30-40 % de la viabilidad celular de las células no tratadas. En algunas realizaciones particulares, los agentes de unión a CD37 son capaces de inducir citotoxicidad dependiente de complemento en células Ramos.
En determinadas realizaciones, los agentes de unión a CD37 son capaces de inducir citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpo (ADCC). Por ejemplo, el tratamiento de células con los agentes de unión a c D37 puede dar como resultado una actividad ADCC que produce al menos aproximadamente un 15%, al menos aproximadamente un 20 %, al menos aproximadamente un 25 %, al menos aproximadamente un 30 %, al menos aproximadamente un 35 %, al menos aproximadamente un 40 %, al menos aproximadamente un 45 %, al menos aproximadamente un 50 % o al menos aproximadamente un 60 % de lisis celular. El tratamiento de células con el agente de unión a CD37 puede dar como resultado una actividad ADCC que produce aproximadamente un 10-20 %, aproximadamente un 20-30 %, aproximadamente un 30-40 % o aproximadamente un 40-50 % de lisis celular. El tratamiento de células con el agente de unión a CD37 también puede dar como resultado una actividad ADCC que produce aproximadamente un 10-50%, aproximadamente un 20-50 %, aproximadamente un 30-50 % o aproximadamente un 40-50 % de lisis celular. En algunas realizaciones particulares, los agentes de unión a CD37 son capaces de inducir ADCC en células Daudi, Ramos y/o Granata-519.
En algunas realizaciones, los agentes de unión a CD37 son capaces de inducir apoptosis. Por ejemplo, el tratamiento de células con los agentes de unión a CD37 puede inducir apoptosis en al menos aproximadamente un 15 %, al menos aproximadamente un 20 %, al menos aproximadamente un 25 %, al menos aproximadamente un 30 %, al menos aproximadamente un 35 %, al menos aproximadamente un 40 %, al menos aproximadamente un 45 %, al menos aproximadamente un 50 % o al menos aproximadamente un 55 % de las células. En algunas realizaciones particulares, los agentes de unión a CD37 son capaces de inducir apoptosis en células Ramos y/o células Raji. En algunas realizaciones, los agentes de unión a CD37 son capaces de reducir el volumen tumoral. La capacidad del agente de unión a CD37 para reducir el volumen tumoral puede evaluarse, por ejemplo, midiendo un valor de % de T/C, que es la mediana de volumen tumoral de sujetos tratados dividida entre la mediana de volumen tumoral de los sujetos de control. En algunas realizaciones, el tratamiento con un agente de unión a CD37 da como resultado un valor de % de T/C que es menor de aproximadamente un 55 %, menor de aproximadamente un 50 %, menor de aproximadamente un 45 %, menor de aproximadamente un 40 %, menor de aproximadamente un 35 %, menor de aproximadamente un 30 %, menor de aproximadamente un 25 %, menor de aproximadamente un 20 %, menor de aproximadamente un 15 %, menor de aproximadamente un 10 % o menor de aproximadamente un 5 %. En algunas realizaciones particulares, el agente de unión a CD37 puede reducir el tamaño tumoral en un modelo de xenoinjerto de BJAB y/o un modelo de xenoinjerto de SU-DHL-4.
En determinadas realizaciones, los inmunoconjugados u otros agentes que se unen específicamente a CD37 humano desencadenan la muerte celular por medio de un agente citotóxico. Por ejemplo, en determinadas realizaciones, se conjuga un anticuerpo para un anticuerpo anti-CD37 humano a un maitansinoide que se activa en células tumorales que expresan el c D37 mediante internalización de proteínas. En ciertas realizaciones alternativas, el agente o el anticuerpo no está conjugado.
En determinadas realizaciones, los agentes de unión a CD37 son capaces de inhibir el crecimiento tumoral. En determinadas realizaciones, los agentes de unión a CD37 son capaces de inhibir el crecimiento tumoral in vivo (por ejemplo, en un modelo de xenoinjerto de ratón y/o en un ser humano que tiene cáncer).
La divulgación enseña los anticuerpos anti-CD37 CD37-3, CD37-12, CD37-38, CD37-50, CD37-51, CD37-56 y CD37-57 y fragmentos, variantes y derivados de los mismos. La divulgación también enseña agentes de unión a c D37 que se unen específicamente al mismo epítopo de CD37 que un anticuerpo seleccionado entre el grupo que consiste en CD37-3, c D37-12, CD37-38, CD37-50, CD37-51, CD37-56 y CD37-57. Los agentes de unión a CD37 también incluyen agentes de unión a CD37 que inhiben de manera competitiva a un anticuerpo seleccionado entre el grupo que consiste en CD37-3, CD37-12, CD37-38, CD37-50, CD37-51, CD37-56 y CD37-57.
En algunas enseñanzas particulares, la unión de los agentes de unión a CD37 a CD37 no requiere de los aminoácidos 109-138 de CD37 humano. Por lo tanto, algunos agentes de unión a CD37 se unen a un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 180. En otras enseñanzas, la unión de los agentes de unión a CD37 a CD37 se altera mediante la mutación de los aminoácidos 202-243 de CD37 humano. Por lo tanto, algunos agentes de unión a CD37 no se unen a un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 184.
En algunas enseñanzas, los agentes de unión a CD37 se unen a un polipéptido de SEQ ID NO: 180 y a un polipéptido de SEQ ID NO: 183, pero no se unen a un polipéptido de SEQ ID nO: 184.
En algunas enseñanzas, los agentes de unión a CD37 se unen a un polipéptido de SEQ ID NO: 190. En algunas realizaciones, los agentes de unión a CD37 se unen a un polipéptido de s Eq ID NO: 190 y a un polipéptido de SEQ ID NO: 189. En algunas enseñanzas, los agentes de unión a CD37 se unen a un polipéptido de SEQ ID NO: 190 y a un polipéptido de SEQ ID NO: 188.
En algunas enseñanzas, el agente de unión a CD37 se une a un polipéptido de SEQ ID NO: 192, pero no se une a un polipéptido de SEQ ID NO: 194. En algunas enseñanzas, el agente de unión a CD37 se une a un polipéptido de SEQ ID No : 193, pero no se une a un polipéptido de SEQ ID NO: 194.
Los fragmentos peptídicos de CD37 a los que se unen ciertos agentes de unión a CD37 incluyen, pero sin limitación, fragmentos de CD37 que comprenden, consisten esencialmente de o consisten en los aminoácidos 200-243 de la SEQ ID NO: 1, los aminoácidos 202-220 de la SEQ ID NO: 1 o los aminoácidos 221-243 de la SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, el agente de unión a CD37 se une específicamente a un epítopo de CD37 humano que comprende los aminoácidos 202-243 de la SEQ ID NO: 1. En algunas enseñanzas, la unión del agente de unión a CD37 a CD37 requiere de los aminoácidos 202-243 de la SEQ ID NO: 1. En algunas enseñanzas, la unión del agente de unión a CD37 a CD37 requiere de los aminoácidos 200-220 de la SEQ ID NO: 1. En algunas enseñanzas, la unión del agente de unión a CD37 a CD37 requiere de los aminoácidos 221-243 de la SEQ ID NO: 1.
La invención también enseña agentes de unión a CD37 que incluyen agentes de unión a CD37 que comprenden las secuencias de CDR de cadena pesada y ligera de CD37-3, CD37-12, CD37-38, CD37-50, CD37-51, CD37-56 o CD37-57. Las CDR de cadena pesada y ligera de CD37-38, CD37-50, CD37-51, CD37-56 y CD37-57 contienen secuencias relacionadas. Por lo tanto, los agentes de unión a CD37 también pueden comprender secuencias de CDR de cadena pesada que comprenden una secuencia consenso obtenida mediante el alineamiento de CD37-38, CD37-50, CD37-51, CD37-56 y CD37-57. Las secuencias de CDR de CD37-3, CD37-12, CD37-38, CD37-50, CD37-51, CD37-56 y CD37-57, así como la secuencia consenso de CD37-38, CD37-50, CD37-51, CD37-56 y CD37-57 se describen en las tablas 1 y 2 a continuación.
T l 1 n i min i DR n ri l
Figure imgf000016_0001
(continuación)
Figure imgf000017_0001
T l 2 n i min i DR n li r ri l
Figure imgf000017_0002
La divulgación enseña anticuerpos anti-CD37 o fragmentos de unión a antígeno que se unen específicamente a CD37 que comprenden las CDR de CD37-3, CD37-12, CD37-50, CD37-51, CD37-56 o CD37-57 con hasta cuatro (es decir, 0, 1, 2, 3 o 4) sustituciones de aminoácidos conservativas por cada CDR.
Los polipéptidos pueden comprender una de las cadenas ligeras variables o cadenas pesadas variables individuales descritas en el presente documento. Los anticuerpos y polipéptidos también pueden comprender tanto una cadena ligera variable como una cadena pesada variable. Las secuencias de las cadenas ligeras variables y las cadenas pesadas variables de los anticuerpos CD37-3, CD37-12, CD37-50, CD37-51, CD37-56 y CD37-57 murinos, quiméricos y humanizados se proporcionan en las tablas 3 y 4 a continuación.
T l n i min i n ri l
Figure imgf000017_0003
(continuación)
Figure imgf000018_0001
T l 4 ni min i n li r ri l
Figure imgf000018_0002
(continuación)
Figure imgf000019_0001
También se enseñan polipéptidos que comprenden: (a) un polipéptido que tiene al menos aproximadamente un 90 % de identidad de secuencia respecto de las SEQ ID NO: 55-71; y/o (b) un polipéptido que tiene al menos aproximadamente un 90 % de identidad de secuencia respecto de las SEQ ID NO: 72-87; En ciertas enseñanzas, el polipéptido comprende un polipéptido que tiene al menos aproximadamente un 95 %, al menos aproximadamente un 96 %, al menos aproximadamente un 97 %, al menos aproximadamente un 98 % o al menos aproximadamente un 99 % de identidad de secuencia respecto de las SEQ ID NO: 55-87. Por lo tanto, en ciertas enseñanzas, el polipéptido comprende (a) un polipéptido que tiene al menos aproximadamente un 95 % de identidad de secuencia respecto de las SEQ ID NO: 55-71 y/o (b) un polipéptido que tiene al menos aproximadamente un 95 % de identidad de secuencia respecto de las SEQ ID NO: 72-87. En determinadas realizaciones, el polipéptido comprende (a) un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO: 55-71; y/o (b) un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO: 72-87. En ciertas enseñanzas, el polipéptido es un anticuerpo y/o el polipéptido se une específicamente a CD37. En ciertas enseñanzas, el polipéptido es un anticuerpo murino, quimérico o humanizado que se une específicamente a CD37. En ciertas enseñanzas, el polipéptido que tiene un cierto porcentaje de identidad de secuencia respecto de las SEQ ID NO: 55-87 difiere de las SEQ ID NO: 55-87 únicamente por sustituciones de aminoácidos conservativas.
Los polipéptidos pueden comprender una de las cadenas ligeras o las cadenas pesadas individuales descritas en el presente documento. Los anticuerpos y polipéptidos también pueden comprender tanto una cadena ligera como una cadena pesada. Las secuencias de cadena ligera y cadena variable de los anticuerpos CD37-3, CD37-12, CD37-50, CD37-51, CD37-56 y CD37-57 murinos, quiméricos y humanizados se proporcionan en las tablas 5 y 6 a continuación.
T l n i min i n l n i m l
Figure imgf000020_0001
(continuación)
Figure imgf000021_0001
(continuación)
Figure imgf000022_0001
(continuación)
Figure imgf000023_0001
T l n i min i n li r lni m l
Figure imgf000023_0002
(continuación)
Figure imgf000024_0001
(continuación)
Figure imgf000025_0001
También se enseñan polipéptidos que comprenden: (a) un polipéptido que tiene al menos aproximadamente un 90 % de identidad de secuencia respecto de las SEQ ID NO: 88-104; y/o (b) un polipéptido que tiene al menos aproximadamente un 90 % de identidad de secuencia respecto de las SEQ ID NO: 105-120; En ciertas enseñanzas, el polipéptido comprende un polipéptido que tiene al menos aproximadamente un 95 %, al menos aproximadamente un 96 %, al menos aproximadamente un 97 %, al menos aproximadamente un 98 % o al menos aproximadamente un 99 % de identidad de secuencia respecto de las SEQ ID NO: 88-120. Por lo tanto, en ciertas enseñanzas, el polipéptido comprende (a) un polipéptido que tiene al menos aproximadamente un 95 % de identidad de secuencia respecto de las SEQ ID NO: 88-104 y/o (b) un polipéptido que tiene al menos aproximadamente un 95 % de identidad de secuencia respecto de las SEQ ID NO: 105-120. En determinadas realizaciones, el polipéptido comprende (a) un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO: 88-104; y/o (b) un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO: 105-120. En determinadas realizaciones, el polipéptido es un anticuerpo y/o el polipéptido se une específicamente a CD37. En determinadas realizaciones, el polipéptido es un anticuerpo murino, quimérico o humanizado que se une específicamente a CD37. En ciertas enseñanzas, el polipéptido que tiene un cierto porcentaje de identidad de secuencia respecto de las SEQ ID NO: 88-120 difiere de las SEQ ID NO: 88-120 únicamente por sustituciones de aminoácidos conservativas.
En ciertas enseñanzas, el anticuerpo anti-CD37 puede ser el anticuerpo producido a partir de un hibridoma seleccionado entre el grupo que consiste en la denominación de depósito de la ATCC PTA-10664, depositada en la ATCC el 18 de febrero de 2010, la denominación de depósito de la ATCC PTA-10665, depositada en la ATCC el 18 de febrero de 2010, la denominación de depósito de la ATCC PTA-10666, depositada en la ATCC el 18 de febrero de 2010, la denominación de depósito de la ATCC PTA-10667, depositada en la ATCC el 18 de febrero de 2010, la denominación de depósito de la ATCC PTA-10668, depositada en la ATCC el 18 de febrero de 2010, la denominación de depósito de la ATCC PTA-10669, depositada en la ATCC el 18 de febrero de 2010 y la denominación de depósito de la ATCC PTA-10670, depositada en la ATCC el 18 de febrero de 2010 (ATCC en 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 20110). En determinadas realizaciones, el anticuerpo comprende las VH-CDR y las VL-CDR del anticuerpo producido a partir de un hibridoma seleccionado entre el grupo que consiste en PTA-10665, PTA-10666, PTA-10667, PTA-10668, PTA-10669 y PTA-10670.
En ciertas enseñanzas, el anticuerpo anti-CD37 puede comprender una cadena ligera codificada por el plásmido de ADN recombinante phuCD37-3LC (denominación de depósito de la ATCC PTA-10722, depositada en la ATCC el 18 de marzo de 2010). En determinadas realizaciones, el anticuerpo anti-CD37 puede comprender una cadena pesada codificada por el plásmido de ADN recombinante phuCD37-3HCv.1.0 (denominación de depósito de la ATCC PTA-10723, depositada en la ATCC el 18 de marzo de 2010). En determinadas realizaciones, el anticuerpo anti-CD37 puede comprender una cadena ligera codificada por el plásmido de ADN recombinante phuCD37-3LC (PTA-10722) y una cadena pesada codificada por el plásmido de ADN recombinante phuCD37-3HCv.1.0 (PTA-10723). En determinadas realizaciones, el anticuerpo anti-CD37 puede comprender las VL-CDR codificadas por el plásmido de ADN recombinante phuCD37-3LC (PtA-10722) y las VH-CDR codificadas por el plásmido de AdN recombinante phuCD37-3HCv.1.0 (PTA-10723).
Pueden prepararse anticuerpos monoclonales usando métodos de hibridoma, tales como aquellos descritos por Kohler y Milstein (1975) Nature 256:495. Usando el método de hibridoma, un ratón, hámster u otro animal hospedador adecuado, se inmuniza como se ha descrito anteriormente para provocar la producción por parte de los linfocitos de anticuerpos que se unirán específicamente a un antígeno de inmunización. También pueden inmunizarse linfocitos in vitro. Después de la inmunización, se aíslan los linfocitos y se fusionan con una línea celular de mieloma adecuada usando, por ejemplo, polietilenglicol, para formar células de hibridoma que después pueden extraerse por selección de los linfocitos y las células de mieloma no fusionados. Los hibridomas que producen anticuerpos monoclonales dirigidos específicamente contra un antígeno seleccionado, según se determina mediante inmunoprecipitación, inmunotransferencia o mediante un ensayo de unión in vitro (por ejemplo, radioinmunoensayo (RIA); ensayo inmunosorbente ligado a enzimas (ELISA)) pueden propagarse posteriormente ya sea en cultivo in vitro usando métodos convencionales (Coding, Monoclonal antibodies, Principles and Practice, Academic Press, 1986) o in vivo como tumores de ascitis en un animal. Después, pueden purificarse los anticuerpos monoclonales del medio de cultivo o del fluido de ascitis como se ha descrito anteriormente para los anticuerpos policlonales.
Como alternativa, también pueden producirse anticuerpos monoclonales usando métodos de ADN recombinante como se describe en la Patente de los Estados Unidos 4.816.567. Los polinucleótidos que codifican un anticuerpo monoclonal se aíslan de linfocitos B maduros o células de hibridoma, tal como mediante RT-PCR, usando cebadores oligonucleotídicos que amplifican de manera específica los genes que codifican las cadenas pesada y ligera del anticuerpo y su secuencia se determina usando procedimientos convencionales. Los polinucleótidos aislados que codifican las cadenas pesada y ligera se clonan posteriormente en vectores de expresión adecuados, que cuando se transfectan en células hospedadoras, tales como células de E. coli, células COS de simio, células de ovario de hámster chino (CHO) o células de mieloma que de otro modo no producen proteína inmunoglobulina, se generan los anticuerpos monoclonales por las células hospedadoras. Asimismo, pueden aislarse anticuerpos monoclonales recombinantes o fragmentos de los mismos de la especie deseada a partir de bibliotecas de presentación en fagos que expresan CDR de la especie deseada como se ha descrito (McCafferty et al., 1990, Nature, 348:552-554; Clackson et al., 1991, Nature, 352:624-628; y Marks et al., 1991, J. Mol. Biol., 222:581-597).
Los polinucleótidos que codifican un anticuerpo monoclonal pueden modificarse adicionalmente de varias maneras diferentes usando tecnología de ADN recombinante para generar anticuerpos alternativos. En algunas realizaciones, los dominios constantes de las cadenas ligera y pesada de, por ejemplo, un anticuerpo monoclonal de ratón pueden sustituirse 1) por aquellas regiones de, por ejemplo, un anticuerpo humano para generar un anticuerpo quimérico o 2) por un polipéptido no de inmunoglobulina para generar un anticuerpo de fusión. En algunas realizaciones, se truncan o eliminan las regiones constantes para generar el fragmento de anticuerpo deseado de un anticuerpo monoclonal. Puede usarse mutagénesis dirigida al sitio o de alta densidad de la región variable para optimizar la especificidad, la afinidad, etc. de un anticuerpo monoclonal.
En algunas realizaciones, el anticuerpo monoclonal contra CD37 humano es un anticuerpo humanizado. En determinadas realizaciones, dichos anticuerpos se usan terapéuticamente para reducir la antigenicidad y las respuestas de HAMA (anticuerpo humano anti-ratón) cuando se administran a un sujeto humano. Se pueden producir anticuerpos humanizados usando diversas técnicas conocidas en la técnica. En ciertas realizaciones alternativas, el anticuerpo para CD37 es un anticuerpo humano.
Pueden prepararse directamente anticuerpos humanos usando diversas técnicas conocidas en la materia. Pueden generase linfocitos B humanos inmortalizados in vitro o aislarse de un individuo inmunizado que produce un anticuerpo dirigido contra un antígeno diana (véase, por ejemplo, Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, págs. 77 (1985); Boemer et al., 1991, J. Immunol., 147 (1):86-95; y Patente de los Estados Unidos 5.750.373). Asimismo, el anticuerpo humano puede seleccionarse a partir de una fagoteca, donde dicha fagoteca expresa anticuerpos humanos, como se describe, por ejemplo, en Vaughan et al., 1996, Nat. Biotech., 14:309-314, Sheets et al., 1998, Proc. Nat'l. Acad. Sci., 95:6157-6162, Hoogenboom y Winter, 1991, J. Mol. Biol., 227:381 y Marks et al., 1991, J. Mol. Biol., 222:581). Las técnicas para la generación y el uso de fagotecas también se describen en las Patentes de los Estados Unidos n.° 5.969.108, 6.172.197, 5.885.793, 6.521.404; 6.544.731; 6.555.313; 6.582.915; 6.593.081; 6.300.064; 6.653.068; 6.706.484; y 7.264.963; y Rothe et al., 2007, J. Mol. Bio., doi:10.1016/j.jmb.2007.12.018 (cada uno de los cuales se incorpora por referencia en su totalidad). Se conocen en la técnica estrategias de maduración por afinidad y estrategias de reordenamiento de cadena (Marks et al., 1992, Bio/Technology 10:779-783) y pueden emplearse para generar anticuerpos humanos de alta afinidad.
También pueden producirse anticuerpos humanizados en ratones transgénicos que contienen locus de inmunoglobulina humanos que son capaces, tras la inmunización, de producir el repertorio completo de anticuerpos humanos en ausencia de producción de inmunoglobulina endógena. Esta estrategia se describe en las Patentes de los Estados Unidos 5.545.807; 5.545.806; 5.569.825; 5.625.126; 5.633.425; y 5.661.016.
La presente invención también enseña anticuerpos biespecíficos que reconocen específicamente a CD37. Los anticuerpos biespecíficos son anticuerpos que son capaces de reconocer específicamente y unirse a al menos dos epítopos diferentes. Los diferentes epítopos pueden encontrarse o bien en la misma molécula (por ejemplo, el mismo CD37) o en diferentes moléculas, de tal forma que, por ejemplo, los anticuerpos pueden reconocer específicamente y unirse a CD37, así como a, por ejemplo, 1) una molécula efectora en un leucocito, tal como un receptor de linfocitos T (por ejemplo, CD3) o un receptor de Fc (por ejemplo, CD64, CD32 o CD16) o 2) un agente citotóxico, como se describe en más detalle más adelante.
Los anticuerpos biespecíficos ejemplares pueden unirse a dos epítopos diferentes, teniendo al menos uno de ellos su origen en un polipéptido de la invención. Como alternativa, puede combinarse un brazo anti-antigénico de una molécula de inmunoglobulina con un brazo que se une a una molécula desencadenante en un leucocito, tal como una molécula de receptor de linfocitos T (por ejemplo, CD2, CD3, CD28 o B7) o receptores de Fc para IgG a fin de centrar los mecanismos de defensa celular a la célula que expresa el antígeno particular. También pueden usarse anticuerpos biespecíficos para dirigir agentes citotóxicos a células que expresan un antígeno particular. Estos anticuerpos poseen un brazo de unión a antígeno y un brazo que se une a un agente citotóxico o a un quelante de radionúclidos, tal como EOTUBE, DPTA, DOTA o TETA. Las técnicas para producir anticuerpos biespecíficos son comunes en la especialidad (Millstein et al., 1983, Nature 305:537-539; Brennan et al., 1985, Science 229:81; Suresh et al, 1986, Methods in Enzymol. 121:120; Traunecker et al., 1991, EMBO J. 10:3655-3659; Shalaby et al., 1992, J. Exp. Med. 175:217-225; Kostelny et al., 1992, J. Immunol. 148:1547-1553; Gruber et al., 1994, J. Immunol. 152:5368; y Patente de los Estados Unidos 5.731.168). También se contemplan anticuerpos con más de dos valencias. Por ejemplo, pueden prepararse anticuerpos triespecíficos (Tutt et al., J. Immunol. 147:60 (1991)). Por lo tanto, en ciertas enseñanzas, los anticuerpos para CD37 son multiespecíficos.
En ciertas enseñanzas, se proporciona un fragmento de anticuerpo para, por ejemplo, aumentar la penetración tumoral. Se conocen varias técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpo. Tradicionalmente, estos fragmentos se obtienen mediante digestión proteolítica de anticuerpos intactos (por ejemplo, Morimoto et al., 1993, Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117; Brennan et al., 1985, Science, 229:81). En determinadas realizaciones, los fragmentos de anticuerpo se producen de manera recombinante. Pueden expresarse fragmentos de anticuerpo Fab, Fv y scFv en y secretarse de E. coli u otras células hospedadoras, permitiendo por tanto la producción de grandes cantidades de estos fragmentos. Dichos fragmentos de anticuerpo también pueden aislarse de las fagotecas analizadas anteriormente. Los fragmentos de anticuerpo también pueden ser anticuerpos lineales, como se describe en la Patente de los Estados Unidos 5.641.870, por ejemplo, y pueden ser monoespecíficos o biespecíficos. Otras técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpos serán evidentes para los expertos en la técnica.
De acuerdo con la presente invención, pueden adaptarse las técnicas para la producción de anticuerpos monocatenarios específicos para CD37 (véase la Patente de los Estados Unidos n.° 4.946.778). Además, pueden adaptarse métodos para la construcción de bibliotecas de expresión de Fab (Huse, et al., Science 246:1275-1281 (1989)) para permitir una rápida y eficaz identificación de fragmentos Fab monoclonales con la especificidad deseada por CD37 o derivados, fragmentos, análogos u homólogos de los mismos. Pueden producirse fragmentos de anticuerpo mediante técnicas de la especialidad que incluyen, pero sin limitación: (a) un fragmento F(ab')2 producido mediante digestión con pepsina de una molécula de anticuerpo; (b) un fragmento Fab generado reduciendo los puentes disulfuro de un fragmento F(ab')2, (c) un fragmento Fab generado mediante el tratamiento de una molécula de anticuerpo con papaína y un agente reductor y (d) fragmentos Fv.
Puede ser deseable además, especialmente en el caso de fragmentos de anticuerpo, modificar un anticuerpo para aumentar su semivida sérica. Esto puede lograrse, por ejemplo, mediante la incorporación de un epítopo de unión a receptor silvestre en el fragmento de anticuerpo mediante la mutación de la región adecuada en el fragmento de anticuerpo o incorporando el epítopo en un marcador peptídico que posteriormente se fusiona al fragmento de anticuerpo en cualquiera de los extremos o en medio (por ejemplo, mediante síntesis de ADN o peptídica).
Los anticuerpos heteroconjugados también se encuentran dentro del ámbito de la presente invención. Los anticuerpos heteroconjugados están compuestos por dos anticuerpos unidos covalentemente. Dichos anticuerpos se han propuesto, por ejemplo, para dirigir células inmunitarias a células no deseadas (Patente de los Estados Unidos n.° 4.676.980). Se contempla que los anticuerpos pueden prepararse in vitro utilizando métodos conocidos en la química de proteínas sintéticas, incluyendo aquellos que implican agentes de entrecruzamiento. Por ejemplo, pueden construirse inmunotoxinas usando una reacción de intercambio de disulfuro o formando un enlace tioéter. Los ejemplos de reactivos adecuados para este fin incluyen iminotiolato y metil-4-mercaptobutirmidato.
Para los fines de la presente invención, ha de apreciarse que los anticuerpos modificados pueden comprender cualquier tipo de región variable que posibilita la asociación del anticuerpo con los polipéptidos de un CD37 humano. En este sentido, la región variable puede comprender o proceder de cualquier tipo de mamífero que pueda inducirse para montar una respuesta humoral y generar inmunoglobulina contra el antígeno asociado con tumores deseado. Por tanto, la región variable de los anticuerpos modificados puede ser, por ejemplo, de origen humano, murino, de primate no humano (por ejemplo, monos cinomolgos, macacos, etc.) o lupino. En algunas realizaciones, las regiones variables y constantes de las inmunoglobulinas modificadas son humanas. En otras realizaciones, pueden modificarse las regiones variables de anticuerpos compatibles (normalmente procedentes de una fuente no humana) o diseñarse específicamente para mejorar las propiedades de unión o reducir la inmunogenicidad de la molécula. A este respecto, pueden humanizarse o alterarse de otro modo las regiones variables útiles en la presente invención mediante la inclusión de secuencias de aminoácido importadas.
En ciertas enseñanzas, se alteran los dominios variables en las cadenas tanto pesadas como ligeras mediante al menos el reemplazo parcial de una o más CDR y, en caso necesario, mediante el reemplazo parcial de regiones marco y cambio de secuencia. Aunque las CDR pueden proceder de un anticuerpo de la misma clase o incluso subclase que el anticuerpo del que proceden las regiones marco, se prevé que las CDR procederán de un anticuerpo de una clase diferente y posiblemente, de un anticuerpo de una especie diferente. No siempre es necesario reemplazar todas las CDR por las CDR completas de la región variable donante para transferir la capacidad de unión a antígeno de un dominio variable a otro. En cambio, en algunos casos, tan solo es necesario transferir aquellos restos que son necesarios para mantener la actividad del sitio de unión a antígeno. Dadas las explicaciones expuestas en las Patentes de los Estados Unidos n.° 5.585.089, 5.693.761 y 5.693.762, se encontrará dentro de la competencia de los expertos en la materia, llevando a cabo experimentación rutinaria o mediante pruebas de ensayo y error, obtener un anticuerpo funcional con inmunogenicidad reducida.
Sin tener en consideración las alteraciones en la región variable, los expertos en la materia apreciarán que los anticuerpos modificados enseñados en el presente documento comprenderán anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos de longitud completa o fragmentos inmunorreactivos de los mismos) en los que al menos una fracción de uno o más de los dominios de región constante se ha eliminado o alterado de otro modo a fin de proporcionar características bioquímicas, tales como localización tumoral aumentada o semivida en suero reducida cuando se compara con un anticuerpo con aproximadamente la misma inmunogenicidad que comprende una región constante nativa o no alterada. En algunas realizaciones, la región constante de los anticuerpos modificados comprenderá una región constante humana. Las modificaciones en la región constante compatibles con la presente invención comprenden adiciones, eliminaciones o sustituciones de uno o más aminoácidos en uno o más dominios. Es decir, los anticuerpos modificados divulgados en el presente documento pueden comprender alteraciones o modificaciones en uno o más de los tres dominios constantes de cadena pesada (CH1, CH2 o CH3) y/o en el dominio constante de cadena ligera (CL). En algunas enseñanzas, se contemplan regiones constantes modificadas en donde uno o más dominios están parcial o completamente eliminados. En algunas realizaciones, los anticuerpos modificados comprenderán construcciones o variantes con dominios eliminados en donde se ha eliminado completamente el dominio CH2 (construcciones ACH2). En algunas enseñanzas, el dominio de región constante omitido se reemplazará mediante un espaciador de aminoácidos corto (por ejemplo, 10 restos) que proporciona cierto grado de la flexibilidad molecular conferida normalmente por la región constante ausente.
Aparte de su consideración, se sabe en la técnica que la región constante media varias funciones efectoras. Por ejemplo, la unión del componente C1 de complemento a los anticuerpos activa el sistema de complemento. La activación del complemento es importante en la opsonización y la lisis de patógenos celulares. La activación del complemento también estimula la respuesta inflamatoria y también puede estar implicada en la hipersensibilidad autoinmunitaria. Además, los anticuerpos se unen a las células a través de la región Fc, uniéndose un sitio de receptor de Fc en la región Fc del anticuerpo a un receptor de Fc (FcR) en una célula. Hay una serie de receptores de Fc que son específicos para diferentes clases de anticuerpo, incluyendo IgG (receptores gamma), IgE (receptores eta), IgA (receptores alfa) e IgM (receptores mu). La unión del anticuerpo a receptores de Fc en las superficies celulares desencadena una serie de respuestas biológicas importantes y diversas, incluyendo el atrapamiento y la destrucción de partículas recubiertas de anticuerpo, la eliminación de complejos inmunitarios, la lisis de células diana recubiertas con anticuerpo por células eliminadoras (denominada citotoxicidad mediada por células dependiente del anticuerpo o ADCC), la liberación de mediadores inflamatorios, la transferencia placentaria y el control de la producción de inmunoglobulina.
En ciertas enseñanzas, los anticuerpos de unión a CD37 proporcionan funciones efectoras alteradas que, a su vez, afectan al perfil biológico del anticuerpo administrado. Por ejemplo, la eliminación o inactivación (a través de mutaciones puntuales u otros medios) de un dominio de región constante puede reducir la unión al receptor de Fc del anticuerpo modificado circulante, aumentando de este modo la localización en el tumor. En otros casos, puede darse el caso de que las modificaciones de la región constante, coherentes con la presente invención, moderan la unión a complemento y por lo tanto, reducen la semivida sérica y la asociación no específica de una citotoxina conjugada. Pueden usarse otras modificaciones más de la región constante para eliminar enlaces disulfuro o restos de oligosacáridos que permiten una localización mejorada debido a una especificidad antigénica aumentada o a la flexibilidad del anticuerpo. De manera similar, pueden efectuarse fácilmente modificaciones en la región constante de acuerdo con la presente invención usando técnicas de ingeniería bioquímica o molecular bien conocidas dentro de las capacidades del experto en la materia.
En ciertas enseñanzas, un agente de unión a CD37 que es un anticuerpo no tiene una o más funciones efectoras. Por ejemplo, en algunas realizaciones, el anticuerpo no tiene actividad de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC) y/o actividad de citotoxicidad dependiente de complemento (CDC). En determinadas realizaciones, el anticuerpo no se une a un receptor de Fc y/o a factores de complemento. En determinadas realizaciones, el anticuerpo no tiene función efectora.
Obsérvese que en ciertas enseñanzas, pueden modificarse los anticuerpos modificados para fusionar el dominio CH3 directamente a la región bisagra de los anticuerpos modificados respectivos. En otras construcciones, puede ser deseable proporcionar un espaciador peptídico entre la región bisagra y los dominios CH2 y/o CH3 modificados. Por ejemplo, pueden expresarse construcciones compatibles, en donde se ha eliminado el dominio CH2 y el dominio CH3 restante (modificado o sin modificar) se une a la región bisagra con un espaciador de 5-20 aminoácidos. Puede añadirse dicho espaciador, por ejemplo, para asegurarse de que los elementos reguladores del dominio constante siguen libres y accesibles o de que la región bisagra sigue siendo flexible. Sin embargo, cabe destacar que los espaciadores de aminoácidos pueden, en algunos casos, resultar inmunogénicos y provocar una respuesta inmunitaria no deseada contra la construcción. Por consiguiente, en determinadas realizaciones, cualquier espaciador añadido a la construcción será relativamente no inmunogénico o incluso se omitirá por completo, a fin de mantener las cualidades bioquímicas deseadas de los anticuerpos modificados.
Aparte de la eliminación de dominios completos de la región constante, se apreciará que los anticuerpos de la presente invención pueden proporcionarse mediante la eliminación o sustitución parcial de unos pocos o incluso un solo aminoácido. Por ejemplo, la mutación de un solo aminoácido en áreas seleccionadas del dominio CH2 puede ser suficiente para reducir sustancialmente la unión a Fc y de este modo, aumentar la localización tumoral. De manera similar, puede ser deseable eliminar simplemente aquella parte de uno o más dominios de región constante que controla la función efectora (por ejemplo, unión a CLQ de complemento) que se va a modular. Dichas eliminaciones parciales de las regiones constantes pueden mejorar características seleccionadas del anticuerpo (semivida en suero), mientras se dejan intactas otras funciones deseables asociadas con el dominio de región constante en cuestión. Además, como se ha hecho alusión anteriormente, las regiones constantes de los anticuerpos divulgados pueden modificarse mediante la mutación o sustitución de uno o más aminoácidos que mejora el perfil de la construcción resultante. A este respecto, puede ser posible alterar la actividad proporcionada por un sitio de unión conservado (por ejemplo, unión a Fc) a la vez que se mantiene sustancialmente la configuración y el perfil inmunogénico del anticuerpo modificado. Ciertas realizaciones pueden comprender la adición de uno o más aminoácidos a la región constante para potenciar características deseadas, tales como reducir o aumentar la función efectora o proporcionar mayor unión a citotoxinas o carbohidratos. En dichas realizaciones, puede ser deseable insertar o replicar secuencias específicas procedentes de dominios de región constante seleccionados.
La presente invención enseña además variantes y equivalentes que son sustancialmente homólogas a los anticuerpos quiméricos, humanizados y humanos o a fragmentos de anticuerpo de los mismos, expuestos en el presente documento. Estas pueden comprender, por ejemplo, mutaciones de sustituciones conservativas, es decir, la sustitución de uno o más aminoácidos por aminoácidos similares. Por ejemplo, una sustitución conservativa se refiere a la sustitución de un aminoácido por otro en la misma clase general, tal como, por ejemplo, un aminoácido ácido por otro aminoácido ácido, un aminoácido básico por otro aminoácido básico o un aminoácido neutro por otro aminoácido neutro. Se conoce bien en la técnica lo que se entiende por una sustitución de aminoácidos conservativa.
Los polipéptidos como se enseñan pueden ser polipéptidos recombinantes, polipéptidos naturales o polipéptidos sintéticos que comprenden un anticuerpo o un fragmento del mismo, contra un c D37 humano. Se reconocerá en la técnica que pueden variarse algunas secuencias de aminoácidos de la invención sin un efecto significativo en la estructura o la función de la proteína. Por lo tanto, la invención enseña además variaciones de los polipéptidos que muestran una actividad sustancial o que incluyen regiones de un anticuerpo o fragmento del mismo, contra la proteína CD37. Dichos mutantes incluyen eliminaciones, inserciones, inversiones, repeticiones y sustituciones de tipo.
Los polipéptidos y análogos pueden modificarse adicionalmente para que contengan restos químicos adicionales que normalmente no forman parte de la proteína. Dichos restos derivatizados pueden mejorar la solubilidad, la semivida biológica o la absorción de la proteína. Los restos también pueden reducir o eliminar cualquier efecto secundario de las proteínas y similares. Puede encontrarse una revisión de dichos restos en REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 20.a ed., Mack Publishing Co., Easton, PA (2000).
Los polipéptidos aislados descritos en el presente documento pueden producirse mediante cualquier método conocido en la técnica. Dichos métodos varían desde métodos sintéticos directos de proteínas para construir una secuencia de ADN que codifica secuencias de polipéptido aisladas y expresar dichas secuencias en un hospedador transformado adecuado. En algunas realizaciones, se construye una secuencia de ADN usando tecnología de ADN recombinante aislando o sintetizando una secuencia de ADN que codifica una proteína de tipo silvestre de interés. Opcionalmente, la secuencia puede mutagenizarse mediante mutagénesis de sitio específico para proporcionar análogos funcionales de la misma. Véase, por ejemplo, Zoeller et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 81:5662-5066 (1984) y la Patente de los Estados Unidos n.° 4.588.585.
En algunas enseñanzas, se construirá una secuencia de ADN que codifica un polipéptido de interés mediante síntesis química usando un sintetizador de oligonucleótidos. Dichos oligonucleótidos pueden diseñarse basándose en la secuencia de aminoácidos del polipéptido deseado y seleccionando aquellos codones que están favorecidos en la célula hospedadora en la que se producirá el polipéptido recombinante de interés. Pueden aplicarse métodos convencionales para sintetizar una secuencia de polinucleótidos aislada que codifica un polipéptido aislado de interés. Por ejemplo, puede usarse una secuencia de aminoácidos completa para construir un gen retrotraducido. Además, puede sintetizarse un oligómero de ADN que contiene una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido aislado particular. Por ejemplo, pueden sintetizarse y posteriormente ligarse varios oligonucleótidos pequeños que codifican porciones del polipéptido deseado. Los oligonucleótidos individuales contienen normalmente salientes 5' o 3' para el ensamblaje complementario.
Una vez ensamblados (mediante síntesis, mutagénesis dirigida al sitio u otro método), se insertarán las secuencias de polinucleótido que codifican un polipéptido aislado particular de interés en un vector de expresión y se unirán operativamente a una secuencia de control de la expresión adecuada para la expresión de la proteína en un hospedador deseado. Puede confirmarse el ensamblaje adecuado mediante secuenciación de nucleótidos, mapeo de restricción y expresión de un polipéptido biológicamente activo en un hospedador adecuado. Como es bien conocido en la técnica, a fin de obtener altos niveles de expresión de un gen transfectado en un hospedador, el gen ha de estar ligado operativamente a secuencias de control de la expresión transcripcional y traduccional que son funcionales en el hospedador de expresión elegido.
En ciertas enseñanzas, se usan vectores de expresión recombinantes para amplificar y expresar ADN que codifica anticuerpos o fragmentos de los mismos, contra CD37 humano. Los vectores de expresión recombinante son construcciones de ADN replicables que tienen fragmentos de ADN sintéticos o procedentes de ADNc que codifican una cadena de polipéptido de un anticuerpo anti-CD37 o un fragmento del mismo, unidos operativamente a elementos reguladores transcripcionales o traduccionales procedentes de genes de mamífero, microbianos, víricos o de insecto. Una unidad transcripcional comprende generalmente un conjunto de (1) un elemento o elementos genéticos que tienen un papel regulador en la expresión génica, por ejemplo, promotores o potenciadores transcripcionales, (2) una secuencia estructural o codificante que se transcribe en ARNm y se traduce en proteína y (3) secuencias de inicio y terminación de la transcripción y la traducción adecuadas, como se describe en más detalle a continuación. Dichos elementos reguladores pueden incluir una secuencia operadora para controlar la transcripción. Además, pueden incorporarse la capacidad para replicarse en un hospedador, normalmente conferida por un origen de replicación y un gen de selección para facilitar el reconocimiento de transformantes. Las regiones de ADN se enlazan operativamente cuando están funcionalmente relacionadas entre sí. Por ejemplo, el ADN para un péptido de señal (líder de secreción) está unida operativamente a ADN para un polipéptido si se expresa como un precursor que participa en la secreción del polipéptido; un promotor está ligado operativamente a una secuencia codificante en caso de que controle la transcripción de la secuencia; o un sitio de unión al ribosoma está unido operativamente a una secuencia codificante si se posiciona de manera que permite la traducción. Los elementos estructurales previstos para su uso en sistemas de expresión en levaduras incluyen una secuencia líder que permite la secreción extracelular de la proteína traducida por una célula hospedadora. Como alternativa, cuando se expresa una proteína recombinante sin una secuencia líder o de transporte, puede incluir un resto de metionina N-terminal. Opcionalmente, este resto puede escindirse posteriormente de la proteína recombinante expresada para proporcionar un producto final.
La elección de la secuencia de control de la expresión y del vector de expresión dependerá de la elección del hospedador. Puede emplearse una gran variedad de combinaciones de hospedador/vector de expresión. Los vectores de expresión útiles para hospedadores eucariotas incluyen, por ejemplo, vectores que comprenden secuencias de control de la expresión de SV40, virus del papiloma bovino, adenovirus y citomegalovirus. Los vectores de expresión útiles para hospedadores bacterianos incluyen plásmidos bacterianos conocidos, tales como plásmidos de Escherichia coli, incluyendo pCR 1, pBR322, pMB9 y sus derivados, plásmidos de mayor intervalo de hospedadores, tales como fagos M13 y filamentoso de ADN monocatenario.
Las células hospedadoras para la expresión de un polipéptido o anticuerpo de unión a CD37 (o una proteína CD37 para su uso como antígeno) incluyen procariotas, levadura, células de insecto o eucariotas superiores, bajo el control de promotores adecuados. Los procariotas incluyen organismos gramnegativos o grampositivos, por ejemplo, E. coli o bacilos. Las células eucariotas superiores incluyen líneas celulares establecidas de origen de mamífero, como se describe más adelante. También podrían emplearse sistemas de traducción sin células. Se describen vectores de clonación y expresión adecuados para su uso con hospedadores bacterianos, fúngicos, de levadura y de mamífero por Pouwels et al. (Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, N.Y., 1985), cuya divulgación relevante se incorpora al presente documento por referencia. Puede encontrarse información adicional relativa a los métodos de producción de proteínas, incluyendo de producción de anticuerpos, por ejemplo, en la Publicación de Patente de los Estados Unidos n.° 2008/0187954, las Patentes de los Estados Unidos n.° 6.413.746 y 6.660.501 y la Publicación Internacional de Patente n.° WO 04009823.
También se emplean ventajosamente diversos sistemas de cultivo de células de mamífero o insecto para expresar proteínas recombinantes. Puede llevarse a cabo la expresión de proteínas recombinantes en células de mamífero debido a que dichas proteínas generalmente están plegadas correctamente, modificadas de manera adecuada y son completamente funcionales. Los ejemplos de líneas celulares hospedadoras de mamífero adecuadas incluyen las líneas COS-7 de células de riñón de mono, descritas por Gluzman (Cell 23:175, 1981) y otras líneas celulares capaces de expresar un vector adecuado, incluyendo, por ejemplo, células L, C127, 3T3, de ovario de hámster chino (CHO), HeLa y líneas celulares BHK. Los vectores de expresión de mamífero pueden comprender elementos no transcritos, tales como un origen de replicación, un promotor adecuado y un potenciador ligado al gen que se va a expresar y otras secuencias 5' o 3' flanqueantes no transcritas y secuencias 5' o 3' no traducidas, tales como sitios de unión a ribosomas necesarios, un sitio de poliadenilación, sitios donantes y aceptores de corte y empalme y secuencias de terminación de la transcripción. Se revisan los sistemas de baculovirus para la producción de proteínas heterólogas en células de insectos por Luckow y Summers, Bio/Technology 6:47 (1988).
Las proteínas producidas por un hospedador transformado pueden purificarse de acuerdo con cualquier método adecuado. Dichos métodos convencionales incluyen cromatografía (por ejemplo, cromatografía en columna de intercambio iónico, de afinidad y de separación por tamaños), centrifugación, solubilidad diferencial o mediante cualquier otra técnica convencional para la purificación de proteínas. Pueden unirse a la proteína marcadores de afinidad, tales como hexahistidina, dominio de unión a maltosa, secuencia de envoltura de la gripe y glutatión-S-transferasa para permitir una fácil purificación mediante pase a lo largo de una columna de afinidad adecuada. También pueden caracterizarse físicamente las proteínas aisladas usando técnicas tales como proteólisis, resonancia magnética nuclear y cristalografía de rayos x.
Por ejemplo, primeramente pueden concentrarse los sobrenadantes de sistemas que secretan proteína recombinante en el medio de cultivo usando un filtro de concentración de proteínas comercialmente disponible, por ejemplo, una unidad de ultrafiltración Amicon o Millipore Pellicon. Después de la etapa de concentración, puede aplicarse el concentrado a una matriz de purificación adecuada. Como alternativa, puede emplearse una resina de intercambio aniónico, por ejemplo, una matriz o sustrato que tiene grupos dietilaminoetilo (DEAE) colgantes. Las matrices pueden ser de acrilamida, agarosa, dextrano, celulosa u otros tipos comúnmente empleados en la purificación de proteínas. Como alternativa, puede emplearse una etapa de intercambio catiónico. Los intercambiadores catiónicos adecuados incluyen varias matrices insolubles que comprenden grupos sulfopropilo o carboximetilo. Finalmente, pueden emplearse una o más etapas de cromatografía líquida de alto rendimiento en fase reversa (RP-HPLC) que emplea medio de RP-HPLC hidrófobo, por ejemplo, gel de sílice que tiene grupos metilo u otros grupos alifáticos colgantes, para purificar adicionalmente un agente de unión a CD37. También pueden emplearse algunas o todas las etapas de purificación anteriores, en diversas combinaciones, para proporcionar una proteína recombinante homogénea.
La proteína recombinante producida en cultivo bacteriano puede aislarse, por ejemplo, mediante extracción inicial de los sedimentos celulares, seguido de una o más etapas de concentración, precipitación salina, intercambio iónico acuoso o cromatografía de exclusión por tamaños. Puede emplearse cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) para las etapas de purificación final. Las células microbianas empleadas en la expresión de una proteína recombinante pueden romperse mediante cualquier método convencional, incluyendo ciclado de congelación-descongelación, sonicación, ruptura mecánica o el uso de agentes de lisis celular.
Los métodos conocidos en la técnica para purificar anticuerpos y otras proteínas incluyen también, por ejemplo, los descritos en las Publicaciones de Patente de los Estados Unidos n.° 2008/0312425, 2008/0177048 y 2009/0187005.
En ciertas enseñanzas, el agente de unión a CD37 es un polipéptido que no es un anticuerpo. Se conoce en la técnica una variedad de métodos para identificar y producir polipéptidos distintos de anticuerpos que se unen con alta afinidad a una proteína diana. Véase, por ejemplo, Skerra, Curr. Opin. Biotechnol., 18:295-304 (2007), Hosse et al., Protein Science, 15:14-27 (2006), Gill et al., Curr. Opin. Biotechnol., 17:653-658 (2006), Nygren, FEBS J., 275:2668-76 (2008) y Skerra, FEBS J., 275:2677-83 (2008), cada uno de los cuales se incorpora al presente documento por referencia en su totalidad. En ciertas enseñanzas, se ha usado la tecnología de presentación en fagos para identificar/producir el polipéptido de unión a CD37. En ciertas enseñanzas, el polipéptido comprende un armazón de proteína de un tipo seleccionado entre el grupo que consiste en proteína A, una lipocalina, un dominio de fibronectina, un dominio de repetición consenso de anquirina y tiorredoxina.
En algunas enseñanzas, el agente es una molécula no proteica. En ciertas enseñanzas, el agente es una molécula pequeña. Los expertos en la materia conocen bibliotecas de química combinatorias y técnicas útiles en la identificación de agentes de unión a CD37 no proteicos. Véase, por ejemplo, Kennedy et al., J. Comb. Chem, 10:345-354 (2008), Dolle et al, J. Comb. Chem., 9:855-902 (2007) y Bhattacharyya, Curr. Med. Chem., 8:1383-404 (2001). En ciertas enseñanzas adicionales, el agente es un carbohidrato, un glucosaminoglucano, una glucoproteína o un proteoglucano.
En ciertas enseñanzas, el agente es un aptámero de ácido nucleico. Los aptámeros son moléculas de polinucleótido que se han seleccionado (por ejemplo, de grupos aleatorios o mutagenizados) basándose en su capacidad para unirse a otra molécula. En algunas enseñanzas, el aptámero comprende un polinucleótido de ADN. En ciertas enseñanzas alternativas, el aptámero comprende un polinucleótido de ARN. En ciertas enseñanzas, el aptámero comprende uno o más restos de ácido nucleico modificados. Se conocen bien en la técnica métodos para generar y explorar aptámeros de ácido nucleico para la unión a proteínas. Véase, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos n.° 5.270.163, la Patente de los Estados Unidos n.° 5.683.867, la Patente de los Estados Unidos n.° 5.763.595, la Patente de los Estados Unidos n.° 6.344.321, la Patente de los Estados Unidos n.° 7.368.236, la Patente de los Estados Unidos n.° 5.582.981, la Patente de los Estados Unidos n.° 5.756.291, la Patente de los Estados Unidos n.° 5.840.867, la Patente de los Estados Unidos n.° 7.312.325, la Patente de los Estados Unidos n.° 7.329.742, la Publicación de Patente Internacional n.° WO 02/077262, la Publicación de Patente Internacional n.° WO 03/070984, la Publicación de Solicitud de Patente de los Estados Unidos n.° 2005/0239134, la Publicación de Solicitud de Patente de los Estados Unidos n.° 2005/0124565 y la Publicación de Solicitud de Patente de los Estados Unidos n.° 2008/0227735.
111. Inmunoconjugados
La presente invención también se refiere a conjugados (también denominados en el presente documento como inmunoconjugados), que comprenden los anticuerpos anti-CD37, fragmentos de anticuerpo y sus equivalentes funcionales como se divulgan en el presente documento, unidos o conjugados a un fármaco o profármaco. Se conocen en la técnica fármacos o profármacos adecuados. Los fármacos o profármacos pueden ser agentes citotóxicos. El agente citotóxico usado en el conjugado citotóxico de la presente invención puede ser cualquier compuesto que da como resultado la muerte de una célula o induce la muerte celular o de cierto modo, reduce la viabilidad celular e incluye, por ejemplo, maitansinoides y análogos de maitansinoides. Otros agentes citotóxicos adecuados son, por ejemplo, las benzodiazepinas, taxoides, CC-1065 y análogos de CC-1065, duocarmicinas y análogos de duocarmicina, enediínas, tales como caliqueamicinas, dolastatina y análogos de dolastatina, incluyendo auristatinas, derivados de tomamicina, derivados de leptomicina, metotrexato, cisplatino, carboplatino, daunorrubicina, doxorrubicina, vincristina, vinblastina, melfalano, mitomicina C, clorambucilo y morfolino doxorrubicina.
Dichos conjugados pueden prepararse usando un grupo enlazador para enlazar un fármaco o profármaco al anticuerpo o equivalente funcional. Se conocen bien en la técnica grupos enlazadores adecuados e incluyen, por ejemplo, grupos disulfuro, grupos tioéter, grupos lábiles a ácidos, grupos fotolábiles, grupos lábiles a peptidasas y grupos lábiles a esterasas.
El fármaco o profármaco puede, por ejemplo, estar enlazado al anticuerpo anti-CD37 o el fragmento del mismo a través de un enlace disulfuro. La molécula enlazadora o el agente reticulante comprende un grupo químico reactivo que puede reaccionar con el anticuerpo anti-CD37 o el fragmento del mismo. Los grupos químicos reactivos para la reacción con el agente de unión a células puede ser ésteres de N-succinimidilo y ésteres de N-sulfosuccinimidilo. Además, la molécula enlazadora comprende un grupo químico reactivo, que puede ser un grupo ditiopiridilo que puede reaccionar con el fármaco para formar un enlace disulfuro. Las moléculas enlazadoras incluyen, por ejemplo, 3-(2-piridilditio)propionato de W-succinimidilo (SPDP) (véase, por ejemplo, Carlsson et al., Biochem. J., 173: 723-737 (1978)), 4-(2-piridilditio)butanoato de W-succinimidilo (SPDB) (véase, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos n.° 4.563.304), 4-(2-piridiltio)2-sulfobutanoato de N-succinimidilo (sulfo-SPDB) (véase la Publicación de los Estados Unidos n.° 20090274713), 4-(2-piridiltio)pentanoato de N-succinimidilo (SPP) (véase, por ejemplo, el Número de registro CAS 341498-08-6), 2-iminotiolano o anhídrido acetilsuccínico. Por ejemplo, el anticuerpo o el agente de unión a células puede modificarse con reactivos reticulantes y el anticuerpo o el agente de unión a células que contiene grupos tiol libres o protegidos derivados de este modo se hace reaccionar posteriormente con un maitansinoide que contiene disulfuro o tiol para producir conjugados. Los conjugados pueden purificarse mediante cromatografía, incluyendo, pero sin limitación, HPLC, exclusión por tamaños, adsorción, intercambio iónico y captura de afinidad, diálisis o filtración de flujo tangencial.
En otro aspecto de la presente invención, el anticuerpo anti-CD37 está ligado a fármacos citotóxicos a través de enlaces disulfuro y un espaciador de polietilenglicol para mejorar la potencia, la solubilidad o la eficacia del inmunoconjugado. Dichos enlazadores escindibles hidrófilos se describen en el documento WO2009/0134976. El beneficio adicional de este diseño de enlazador es la alta relación de monómero deseada y la agregación mínima del conjugado de anticuerpo-fármaco. En este aspecto se contemplan específicamente conjugados de agentes de unión a células y se describen fármacos unidos mediante espaciadores de polietilenglicol portadores de grupo disulfuro (-S-S-) ((CH2CH2O)n=i-i4) con un estrecho intervalo de carga de fármaco de 2-8 que muestran una actividad biológica relativamente elevada contra células cancerosas y tienen las propiedades bioquímicas deseadas de alto rendimiento de conjugación y alta relación de monómero con agregación de proteínas mínima.
En este aspecto se contempla específicamente un conjugado de anticuerpo anti-CD37-fármaco de fórmula (I) o un conjugado de fórmula (I'):
CB-[Xl-(-CH2-CH2O-)n-Y-D]m (I)
[D-Y-(-CH2-CH2O-)n-Xl]m-CB (I')
en donde:
CB representa un anticuerpo o fragmento anti-CD37;
D representa un fármaco;
X representa una unidad alifática, aromática o heterocíclica unida al agente de unión a células a través de un enlace tioéter, un enlace amida, un enlace carbamato o un enlace éter;
Y representa una unidad alifática, aromática o heterocíclica unida al fármaco mediante un enlace disulfuro; l es 0 o 1 ;
m es un número entero de 2 a 8; y
n es un número entero de 1 a 24.
En algunas realizaciones, m es un número entero de 2 a 6.
En algunas realizaciones, m es un número entero de 3 a 5.
En algunas realizaciones, n es un número entero de 2 a 8. Como alternativa, como se divulga en, por ejemplo, las Patentes de los Estados Unidos n.° 6.441.163 y 7.368.565, el fármaco puede modificarse en primer lugar para introducir un éster reactivo adecuado para reaccionar con un agente de unión a células. La reacción de estos fármacos que contienen un resto enlazador activado con un agente de unión a células proporciona otro método para producir un conjugado de agente de unión a células-fármaco. También pueden unirse maitansinoides a un anticuerpo o fragmento anti-CD37 usando grupos enlazadores de PEG, por ejemplo, como se expone en la Patente de los Estados Unidos 6.716.821. Estos grupos enlazadores no escindibles de PEG son solubles tanto en agua como en disolventes no acuosos y pueden usarse para unir uno o más agentes citotóxicos a un agente de unión a células. Los grupos enlazadores de PEG ejemplares incluyen enlazadores de PEG heterobifuncionales que reaccionan con agente citotóxicos y agentes de unión a células en extremos opuestos de los enlazadores a través de un grupo funcional sulfhidrilo o disulfuro en un extremo y un éster activo en el otro extremo. Como ejemplo general de esta síntesis de un conjugado citotóxico usando un grupo enlazador de PEG, se hace referencia nuevamente a la Patente de los Estados Unidos 6.716.821, que se incorpora íntegramente por referencia al presente documento. La síntesis comienza con la reacción de uno o más agentes citotóxicos que portan un resto de PEG reactivo con un agente de unión a células, dando como resultado el desplazamiento del éster activo terminal de cada resto de PEG reactivo por un resto de aminoácido del agentes de unión a células, para dar un conjugado citotóxico que comprende uno o más agentes citotóxicos unidos covalentemente a un agente de unión a células a través de un grupo enlazador de PEG. Como alternativa, puede modificarse el agente de unión a células con el reticulante de PEG bifuncional para introducir un resto disulfuro reactivo (tal como un piridildisulfuro), que posteriormente puede tratarse con un maitansinoide que contiene tiol para proporcionar un conjugado. En otro método, puede modificarse el agente de unión a células con el reticulante de PEG bifuncional para introducir un resto tiol que posteriormente puede tratarse con un maitansinoide que contiene disulfuro reactivo (tal como un piridildisulfuro), para proporcionar un conjugado.
También pueden prepararse conjugados de anticuerpo-maitansinoide con enlaces no escindibles. Dichos reticulantes se describen en la técnica (véase la Publicación de los Estados Unidos n.° 20050169933) e incluyen, pero sin limitación, 4-(maleimidometil)ciclohexanocarboxilato de W-succinimidilo (SMCC). En algunas realizaciones, el anticuerpo se modifica con reactivos reticulantes, tales como 4-(N-maleimidometil)-ciclohexano-1-carboxilato de succinimidilo (SMCC), sulfo-SMCC, éster de maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida (MBS), sulfo-MBS o yodoacetato de succinimidilo, como se describe en las referencias, para introducir 1-10 grupos reactivos (Yoshitake et al, Eur. J. Biochem., 101:395-399 (1979); Hashida et al, J. Applied Biochem., 56-63 (1984); y Liu et al, Biochem., 18:690-697 (1979)). Después, se hizo reaccionar el anticuerpo modificado con el derivado de maitansinoide que contiene tiol para producir un conjugado. El conjugado puede purificarse mediante filtración en gel a través de una columna Sephadex G25 o mediante diálisis o filtración de flujo tangencial. Los anticuerpos modificados se tratan con el maitansinoide que contiene tiol (1 a 2 equivalentes molares/grupo maleimido) y los conjugados de anticuerpo-maitansinoide se purifican mediante filtración en gel a través de una columna Sephadex G-25, cromatografía en una columna cerámica de hidroxiapatita, diálisis o filtración de flujo tangencial o una combinación de métodos de los mismos. Normalmente, se enlaza una media de 1-10 maitansinoides por anticuerpo. Un método es modificar anticuerpos con 4-(N-maleimidometil)-ciclohexano-1-carboxilato de succinimidilo (SMCC) para introducir grupos maleimido, seguido de reacción del anticuerpo modificado con un maitansinoide que contiene tiol para proporcionar un conjugado enlazado por tioéter. Nuevamente, se obtienen como resultado conjugados con 1 a 10 moléculas de fármaco por anticuerpo. Los conjugados con maitansinoide de anticuerpos, fragmentos de anticuerpo u otras proteínas se preparan del mismo modo.
En otro aspecto de la invención, el anticuerpo anti-CD37 está unido al fármaco a través de un enlace no escindible a través de la intermediación de un espaciador de PEG. También se conocen bien en la técnica reactivos reticulantes adecuados que comprenden cadenas de PEG hidrófilas que forman enlazadores entre un fármaco y el anticuerpo o fragmento anti-CD37 o se encuentran disponibles comercialmente (por ejemplo, de Quanta Biodesign, Powell, Ohio). También pueden sintetizarse reticulantes que contienen PEG a partir de PEG de por sí disponibles comercialmente usando técnicas de química sintética convencionales conocidas por los expertos en la materia. Puede hacerse reaccionar los fármacos con reticulantes que contienen PEG para dar compuestos con la siguiente fórmula, Z-X|-(-CH2-CH2-O-)n-Yp-D, mediante métodos descritos en detalle en la Publicación de Patente de los Estados Unidos 20090274713 y en el documento WO2009/0134976, que después pueden reaccionar con el agente de unión a células para proporcionar un conjugado. Como alternativa, puede modificarse el agente de unión a células con el reticulante de PEG bifuncional para introducir un grupo reactivo con tiol (tal como una maleimida o haloacetamida) que posteriormente puede tratarse con un maitansinoide que contiene tiol para proporcionar un conjugado. En otro método, puede modificarse el agente de unión a células con el reticulante de PEG bifuncional para introducir un reto tiol que posteriormente puede tratarse con un maitansinoide reactivo con tiol (tal como un maitansinoide que porta una maleimida o haloacetamida), para proporcionar un conjugado.
Por consiguiente, otro aspecto de la presente invención es un conjugado de anticuerpo anti-CD37-fármaco de fórmula (II) o de fórmula (II'):
CB-[Xl-(-CH2-CH2-O-)n-Yp-D]m (II)
[D-Yp-(-CH2-CH2-O-)n-Xl]m-CB (II')
en donde, CB representa un anticuerpo o fragmento anti-CD37;
D representa un fármaco;
X representa una unidad alifática, aromática o heterocíclica unida al agente de unión a células a través de un enlace tioéter, un enlace amida, un enlace carbamato o un enlace éter;
Y representa una unidad alifática, aromática o heterocíclica unida al fármaco a través de un enlace covalente seleccionado entre el grupo que consiste en un enlace tioéter, un enlace amida, un enlace carbamato, un enlace éter, un enlace amina, un enlace carbono-carbono y un enlace hidrazona;
l es 0 o 1;
p es 0 o 1;
m es un número entero de 2 a 15; y
n es un número entero de 1 a 2000.
En algunas realizaciones, m es un número entero de 2 a 8; y en algunas realizaciones, n es un número entero de 1 a 24.
En algunas realizaciones, m es un número entero de 2 a 6.
En algunas realizaciones, m es un número entero de 3 a 5.
En algunas realizaciones, n es un número entero de 2 a 8. Los ejemplos de enlazadores que contienen PEG adecuados incluyen enlazadores que tienen un resto de éster de W-succinimidilo o de éster de W-sulfosuccinimidilo para la reacción con el anticuerpo anti-CD37 o un fragmento del mismo, así como un resto a base de maleimido o haloacetilo para la reacción con el compuesto. Puede incorporarse un espaciador de PEG en cualquier reticulante conocido en la técnica mediante los métodos descritos en el presente documento.
Muchos de los enlazadores divulgados en el presente documento se describen en detalle en las Publicaciones de Patente de los Estados Unidos n.° 20050169933 y 20090274713 y en el documento WO2009/0134976.
La presente invención incluye aspectos en donde se enlazan aproximadamente de 2 a aproximadamente 8 moléculas de fármaco ("carga de fármaco"), por ejemplo, maitansinoide, a un anticuerpo anti-CD37 o un fragmento del mismo, siendo el efecto antitumoral del conjugado mucho más eficaz en comparación con una carga de fármaco de un número menor o mayor de fármacos unidos al mismo agente de unión a células. "Carga de fármaco", como se usa en el presente documento, se refiere al número de moléculas de fármaco (por ejemplo, un maitansinoide) que puede unirse a un agente de unión a células (por ejemplo, un anticuerpo anti-CD37 o un fragmento del mismo). En un aspecto, el número de moléculas de fármaco que puede unirse a un agente de unión a células puede ser una media de aproximadamente 2 a aproximadamente 8 (por ejemplo, 1,9, 2,0, 2,1,2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3,0, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4,0, 4,1,4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,9, 8,0, 8,1). Puede usarse W2-desacetil-W2-(3-mercapto-1-oxopropil)-maitansina (DM1) y W2-desacetil-N2-(4-mercapto-4-metil-1-oxopentil)maitansina (DM4).
Por lo tanto, en un aspecto, un inmunoconjugado comprende 1 maitansinoide por anticuerpo. En otro aspecto, un inmunoconjugado comprende 2 maitansinoides por anticuerpo. En otro aspecto, un inmunoconjugado comprende 3 maitansinoides por anticuerpo. En otro aspecto, un inmunoconjugado comprende 4 maitansinoides por anticuerpo. En otro aspecto, un inmunoconjugado comprende 5 maitansinoides por anticuerpo. En otro aspecto, un inmunoconjugado comprende 6 maitansinoides por anticuerpo. En otro aspecto, un inmunoconjugado comprende 7 maitansinoides por anticuerpo. En otro aspecto, un inmunoconjugado comprende 8 maitansinoides por anticuerpo.
En un aspecto, un inmunoconjugado comprende de aproximadamente 1 a aproximadamente 8 maitansinoides por anticuerpo. En otro aspecto, un inmunoconjugado comprende de aproximadamente 2 a aproximadamente 7 maitansinoides por anticuerpo. En otro aspecto, un inmunoconjugado comprende de aproximadamente 2 a aproximadamente 6 maitansinoides por anticuerpo. En otro aspecto, un inmunoconjugado comprende de aproximadamente 2 a aproximadamente 5 maitansinoides por anticuerpo. En otro aspecto, un inmunoconjugado comprende de aproximadamente 3 a aproximadamente 5 maitansinoides por anticuerpo. En otro aspecto, un inmunoconjugado comprende de aproximadamente 3 a aproximadamente 4 maitansinoides por anticuerpo.
En un aspecto, una composición que comprende inmunoconjugados tiene una media de aproximadamente 2 a aproximadamente 8 (por ejemplo, 1,9, 2,0, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3,0, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4,0, 4,1,4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0, 6,1,6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,9, 8,0, 8,1) moléculas de fármaco (por ejemplo, maitansinoides) unidas por anticuerpo. En un aspecto, una composición que comprende inmunoconjugados tiene una media de aproximadamente 1 a aproximadamente 8 moléculas de fármaco (por ejemplo, maitansinoides) por anticuerpo. En un aspecto, una composición que comprende inmunoconjugados tiene una media de aproximadamente 2 a aproximadamente 7 moléculas de fármaco (por ejemplo, maitansinoides) por anticuerpo. En un aspecto, una composición que comprende inmunoconjugados tiene una media de aproximadamente 2 a aproximadamente 6 moléculas de fármaco (por ejemplo, maitansinoides) por anticuerpo. En un aspecto, una composición que comprende inmunoconjugados tiene una media de aproximadamente 2 a aproximadamente 5 moléculas de fármaco (por ejemplo, maitansinoides) por anticuerpo. En un aspecto, una composición que comprende inmunoconjugados tiene una media de aproximadamente 3 a aproximadamente 5 moléculas de fármaco (por ejemplo, maitansinoides) por anticuerpo. En un aspecto, una composición que comprende inmunoconjugados tiene una media de aproximadamente 3 a aproximadamente 4 moléculas de fármaco (por ejemplo, maitansinoides) por anticuerpo.
En un aspecto, una composición que comprende inmunoconjugados tiene una media de aproximadamente 2 ± 0,5, aproximadamente 3 ± 0,5, aproximadamente 4 ± 0,5, aproximadamente 5 ± 0,5, aproximadamente 6 ± 0,5, aproximadamente 7 ± 0,5 o aproximadamente 8 ± 0,5 moléculas de fármaco (por ejemplo, maitansinoides) unidas por anticuerpo. En un aspecto, una composición que comprende inmunoconjugados tiene una media de aproximadamente 3,5 ± 0,5 moléculas de fármaco (por ejemplo, maitansinoides) por anticuerpo.
El anticuerpo anti-CD37 o el fragmento del mismo puede modificarse haciendo reaccionar un reactivo reticulante bifuncional con el anticuerpo anti-CD37 o el fragmento del mismo, dando como resultado de este modo la unión covalente de una molécula enlazadora al anticuerpo anti-CD37 o fragmento del mismo. Como se usa en el presente documento, un "reactivo reticulante bifuncional" es cualquier resto químico que enlaza covalentemente un agente de unión a células a un fármaco, tales como los fármacos descritos en el presente documento. En otro método, se proporciona por medio del fármaco una porción del resto enlazador. A este respecto, el fármaco comprende un resto enlazador que forma parte de una molécula enlazadora más grande que se usa para unir el agente de unión a células al fármaco. Por ejemplo, para formar el maitansinoide DM1, se modifica la cadena lateral en el grupo hidroxilo C-3 para que tenga un grupo sulfhidrilo libre (SH). Esta forma tiolada de la maitansina puede reaccionar con un agente de unión a células modificado para formar un conjugado. Por lo tanto, el enlazador final se ensambla para formar dos componentes, uno de los cuales se proporciona por el reactivo reticulante, mientras que el otro se proporciona por la cadena lateral de DM1.
Las moléculas de fármaco también pueden unirse a las moléculas de anticuerpo por medio de una molécula transportadora intermedia, tal como seroalbúmina.
Como se usa en el presente documento, la expresión "unido a un agente de unión a células" o "unido a un anticuerpo o fragmento anti-CD37" se refiere a que la molécula conjugada comprende al menos un derivado de fármaco unido a un agente de unión a células de anticuerpo o fragmento anti-CD37 por medio de un grupo enlazador adecuado o un precursor del mismo. Un grupo enlazador es SMCC.
En determinadas realizaciones, los agentes citotóxicos útiles en la presente invención son maitansinoides y análogos de maitansinoides. Los ejemplos de maitansinoides adecuados incluyen ésteres de maitansinol y análogos del maitansinol. Se incluye cualquier fármaco que inhiba la formación de microtúbulos y que son altamente tóxicos para las células de mamífero, como el maitansinol y los análogos del maitansinol.
Los ejemplos de ésteres de maitansinol adecuados incluyen aquellos que tienen un anillo aromático modificado y aquellos que tienen modificaciones en otras posiciones. Dichos maitansinoides adecuados se divulgan en las Patentes de los Estados Unidos n.° 4.424.219; 4.256.746; 4.294.757; 4.307.016; 4.313.946; 4.315.929; 4.331.598; 4.361.650; 4.362.663; 4.364.866; 4.450.254; 4.322.348; 4.371.533; 5.208.020; 5.416.064; 5.475.092; 5.585.499; 5.846.545; 6.333.410; 7.276.497 y 7.473.796.
En una realización específica, los inmunoconjugados de la invención utilizan el maitansinoide que contiene tiol (DM1), denominado formalmente N2'-desacetil-N2'-(3-mercapto-1-oxopropil)-maitansina, como el agente citotóxico. DM1 se representa por la siguiente fórmula estructural (III):
Figure imgf000035_0001
En otra realización, los conjugados de la presente invención utilizan el maitansinoide que contiene tiol N^-desacetil-N2'(4-metil-4-mercapto-1-oxopentil)-maitansina (por ejemplo, DM4) como agente citotóxico. DM4 se representa por la siguiente fórmula estructural (IV):
Figure imgf000036_0001
Otro maitansinoide que comprende una cadena lateral que contiene un enlace tiol impedido estéricamente es N2'-desacetil-N-2'(4-mercapto-1-oxopentil)-maitansina (denominado DM3), representado por la siguiente fórmula estructural (V):
Figure imgf000036_0002
Cada uno de los maitansinoides enseñados en las Patentes de los Estados Unidos n.° 5.208.020 y 7.276.497, también puede usarse en el conjugado de la presente invención. En este sentido, se incorpora al presente documento por referencia la divulgación completa de los documentos 5.208.020 y 7.276.697.
Muchas posiciones en los maitansinoides pueden servir como la posición para enlazar químicamente el resto enlazador. Por ejemplo, se espera que sean útiles la posición C-3 que tiene un grupo hidroxilo, la posición C-14 modificada con hidroximetilo, la posición C-15 modificada con hidroxi y la posición C-20 que tiene un grupo hidroxi. En algunas realizaciones, la posición C-3 sirve como la posición para unir químicamente el resto enlazador y en algunas realizaciones particulares, la posición C-3 del maitansinol sirve como la posición para ligar químicamente el resto enlazador.
A continuación se muestran representaciones estructurales de algunos conjugados:
Figure imgf000037_0001
Ab- M -HMI
Figure imgf000038_0001
Ah-SF^Jlí-IW^ (X II)
Figure imgf000039_0001
Se proporcionan varias descripciones para producir dichos conjugados de anticuerpo-maitansinoide en las Patentes de los Estados Unidos n.° 6.333.410, 6.441.163, 6.716.821 y 7.368.565.
En general, puede incubarse una solución de un anticuerpo en tampón acuoso con un exceso molar de maitansinoides que tienen un resto disulfuro que porta un grupo reactivo. La mezcla de reacción puede inactivarse mediante la adición de un exceso de amina (tal como etanolamina, taurina, etc.). El conjugado de maitansinoide-anticuerpo puede purificarse posteriormente mediante filtración en gel.
Puede determinarse el número de moléculas de maitansinoide por molécula de anticuerpo midiendo espectrofotométricamente la relación de la absorbancia a 252 nm y 280 nm. El número medio de moléculas de maitansinoide/anticuerpo puede ser, por ejemplo, de aproximadamente 1-10, 2-5, 3-4 o aproximadamente 3,5. En un aspecto, el número medio de moléculas de maitansinoide/anticuerpo es de aproximadamente 3,5 ± 0,5.
También pueden usarse compuestos de antraciclina, así como derivados, intermedios y versiones modificadas de los mismos, para preparar inmunoconjugados anti-CD37. Por ejemplo, se puede usar doxorrubicina, derivados de doxorrubicina, intermedios de doxorrubicina y doxorrubicinas modificadas en los conjugados anti-CD37. Se describen compuestos ejemplares en el documento WO 2010/009124, que se incorpora al presente documento por referencia en su totalidad. Dichos compuestos incluyen, por ejemplo, compuestos de la siguiente fórmula:
Figure imgf000039_0002
en donde R1 es un átomo de hidrógeno, hidroxi o grupo metoxi y R2 es un grupo alcoxi C1-C5 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
Pueden evaluarse conjugados de anticuerpos con maitansinoide u otros fármacos por su capacidad para suprimir la proliferación de varias líneas celulares no deseadas in vitro. Por ejemplo, pueden usarse fácilmente líneas celulares, tales como la línea celular de linfoma humano Daudi y la línea celular de linfoma humano Ramos, para la evaluación de la citotoxicidad de estos compuestos. Las células que se van a evaluar pueden exponerse a los compuestos durante 4 a 5 días y se miden las fracciones de células medidas en ensayos directos por métodos conocidos. Después, pueden calcularse valores de CI50 a partir de los resultados de los ensayos.
Los inmunoconjugados pueden, de acuerdo con algunas realizaciones descritas en el presente documento, internalizarse en las células. El inmunoconjugado, por lo tanto, puede ejercer un efecto terapéutico cuando se capta o se internaliza, por una célula que expresa CD37. En algunas realizaciones particulares, el inmunoconjugado que comprende un anticuerpo, fragmento de anticuerpo o polipéptido, unido a un agente citotóxico mediante un enlazador escindible y el agente citotóxico se escinde del anticuerpo, fragmento de anticuerpo o polipéptido, en donde se internaliza por una célula que expresa CD37.
En algunas realizaciones, los inmunoconjugados son capaces de reducir el volumen tumoral. Por ejemplo, en algunas realizaciones, el tratamiento con un inmunoconjugado da como resultado un valor de % de T/C que es menor de aproximadamente un 50 %, menor de aproximadamente un 45 %, menor de aproximadamente un 40 %, menor de aproximadamente un 35 %, menor de aproximadamente un 30 %, menor de aproximadamente un 25 %, menor de aproximadamente un 20 %, menor de aproximadamente un 15 %, menor de aproximadamente un 10 % o menor de aproximadamente un 5 %. En algunas realizaciones particulares, los inmunoconjugados pueden reducir el tamaño tumoral en un modelo de xenoinjerto de BJAB y/o un modelo de xenoinjerto de SU-DHL-4.
En otra enseñanza de la divulgación, pueden unirse moléculas de ARNpi a los anticuerpos de la presente invención en lugar de a un fármaco. Los ARNpi pueden ligarse a los anticuerpos de la presente invención mediante métodos comúnmente usados para la modificación de oligonucleótidos (véase, por ejemplo, las Publicaciones de Patente de los Estados Unidos 20050107325 y 20070213292). Por lo tanto, el ARNpi en su forma de 3' o 5'-fosforamidita puede hacerse reaccionar con un extremo del reticulante que porta una funcionalidad hidroxilo para dar un enlace éster entre el ARNpi y el reticulante. De manera similar, la reacción de la fosforamidita de ARNpi con un reticulante que porta un grupo amino terminal da como resultado el enlace del reticulante al ARNpi a través de una amina. Como alternativa, el ARNpi puede derivatizarse mediante métodos químicos convencionales para introducir un grupo tiol. Este ARNpi que contiene tiol puede hacerse reaccionar con un anticuerpo, que se ha modificado para introducir un resto disulfuro o maleimida activo, para producir un conjugado escindible o no escindible. Pueden enlazarse entre 1 - 20 moléculas de ARNpi a un anticuerpo mediante este método.
III. Polinucleótidos
En ciertas enseñanzas, la divulgación abarca polinucleótidos que comprenden polinucleótidos que codifican un polipéptido que se une específicamente a CD37 o un fragmento de dicho polipéptido. Por ejemplo, la divulgación enseña un polinucleótido que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un anticuerpo para un CD37 humano o codifica un fragmento de dicho anticuerpo. Los polinucleótidos de la divulgación pueden encontrarse en forma de ARN o en forma de ADN. El ADN incluye ADNc, aDn genómico y ADN sintético; y puede ser monocatenario o bicatenario y en caso de ser monocatenario, puede ser la hebra codificante o la hebra no codificante (antisentido).
En ciertas enseñanzas, los polinucleótidos están aislados. En ciertos aspectos de la divulgación, los polinucleótidos son sustancialmente puros.
La divulgación enseña un polinucleótido que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido que comprende una secuencia seleccionada entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 4-120.
La divulgación enseña además un polinucleótido que comprende una secuencia seleccionada entre las mostradas en las tablas 7-10 a continuación.
T l n i lin l i n ri l
Figure imgf000040_0001
(continuación)
Figure imgf000041_0001
(continuación)
Figure imgf000042_0001
T l n i lin l i n li r ri l
Figure imgf000042_0002
(continuación)
Figure imgf000043_0001
(continuación)
Figure imgf000044_0001
T l n i lin l i n lni m l
Figure imgf000045_0001
(continuación)
Figure imgf000046_0001
(continuación)
Figure imgf000047_0001
(continuación)
Figure imgf000048_0001
(continuación)
Figure imgf000049_0002
T l 1 n i lin l i n li r lni m l
Figure imgf000049_0001
(continuación)
Figure imgf000050_0001
(continuación)
Figure imgf000051_0001
También se enseña un polinucleótido que tiene al menos aproximadamente un 95 %, al menos aproximadamente un 96 %, al menos aproximadamente un 97 %, al menos aproximadamente un 98 % o al menos aproximadamente un 99% de identidad de secuencia respecto de las SEQ ID NO: 121-170. Por lo tanto, en ciertas enseñanzas, el polipéptido comprende (a) un polipéptido que tiene al menos aproximadamente un 95 % de identidad de secuencia respecto de las SEQ ID NO: 121-135 o 152-161 y/o (b) un polipéptido que tiene al menos aproximadamente un 95 % de identidad de secuencia respecto de las SEQ ID NO: 136-151 o 162-170. En ciertas enseñanzas, el polipéptido comprende (a) un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO: 121-135 o 152-161; y/o (b) un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO: 136-151 o 162-170.
En algunas enseñanzas, el polinucleótido codifica la cadena ligera codificada por el plásmido de ADN recombinante phuCD37-3LC (denominación de depósito de la ATCC PTA-10722, depositado en la ATCC el 18 de marzo de 2010) o una cadena ligera que es al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 % o al menos aproximadamente un 99 % idéntica a la cadena ligera codificada por phuCD37-3LC (PTA-10722). En algunas realizaciones, el polinucleótido codifica la cadena pesada codificada por el plásmido de ADN recombinante phuCD37-3HCv.1.0 (denominación de depósito de la ATCC PTA-10723, depositado en la ATCC el 18 de marzo de 2010) o una cadena pesada que es al menos aproximadamente un 85%, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 % o al menos aproximadamente un 99 % idéntica a la cadena pesada codificada por phuCD37-3HCv.1.0 (PTA-10723). En ciertas enseñanzas, el polinucleótido es el plásmido de ADN recombinante phuCD37-3LC (PTA-10722) o el plásmido de ADN recombinante phuCD37-3HCv.1.0 (PTA-10723).
En ciertas enseñanzas, los polinucleótidos comprenden la secuencia codificante para el polipéptido maduro fusionado en la misma fase de lectura a un polinucleótido que ayuda, por ejemplo, en la expresión y la secreción de un polipéptido de una célula hospedadora (por ejemplo, una secuencia líder que funciona como secuencia secretora para controlar el transporte de un polipéptido de la célula). El polipéptido que tiene una secuencia líder es una preproteína y puede tener la secuencia líder escindida por la célula hospedadora para formar la forma madura del polipéptido. Los polinucleótidos también pueden codificar una proproteína que es la proteína madura más restos de aminoácido 5' adicionales. Una proteína madura que tiene una prosecuencia es una proproteína y es una forma inactiva de la proteína. Una vez que se ha escindido la prosecuencia, permanece una proteína madura activa.
En ciertas enseñanzas, los polinucleótidos comprenden la secuencia codificante para el polipéptido maduro fusionada en la misma fase de lectura a una secuencia marcadora que permite, por ejemplo, la purificación del polipéptido codificado. Por ejemplo, la secuencia marcadora puede ser un marcador de hexa-histidina suministrado por un vector pQE-9 para posibilitar la purificación del polipéptido maduro fusionado al marcador en el caso de un hospedador bacteriano o la secuencia marcadora puede ser un marcador de hemaglutinina (HA) procedente de la proteína hemaglutinina gripal cuando se usa un hospedador de mamífero (por ejemplo, células COS-7).
La presente divulgación enseña además variantes de los polinucleótidos descritos anteriormente en el presente documento que codifican, por ejemplo, fragmentos, análogos y derivados.
Las variantes de polinucleótido pueden contener alteraciones en las regiones codificantes, las regiones no codificantes o ambas. En algunos aspectos de la divulgación, las variantes de polinucleótido contienen alteraciones que producen sustituciones, adiciones o eliminaciones silentes, pero no alteran las propiedades o actividades del polipéptido codificado. En algunos aspectos de la divulgación, se producen variantes de nucleótidos por medio de sustituciones silentes debido a la degeneración del código genético. Pueden producirse variantes de polinucleótidos por diversos motivos, por ejemplo, para optimizar la expresión de codones para un hospedador particular (cambio de codones en el ARNm humano por aquellos preferidos por un hospedador bacteriano, tal como E. coli).
También se proporcionan vectores y células que comprenden los polinucleótidos descritos en el presente documento.
IV. Métodos de uso y composiciones farmacéuticas
Los agentes de unión a CD37 (incluyendo anticuerpos e inmunoconjugados) de la invención son útiles en una variedad de aplicaciones que incluyen, pero sin limitación, métodos de tratamiento terapéuticos, tales como el tratamiento del cáncer, tales como neoplasias malignas de linfocitos B. En ciertas enseñanzas, los agentes son útiles para inhibir el crecimiento tumoral, inducir la diferenciación, reducir el volumen tumoral y/o reducir la tumorigenicidad de un tumor. Los métodos de uso pueden ser métodos in vitro, ex vivo, o in vivo. En determinadas realizaciones, el agente o anticuerpo o inmunoconjugado de unión a CD37 es un antagonista del CD37 humano al que se une.
En una enseñanza, los anticuerpos e inmunoconjugados anti-CD37 de la divulgación son útiles para detectar la presencia de CD37 en una muestra biológica. El término "detectar" como se usa en el presente documento abarca la detección cuantitativa o cualitativa. En ciertos aspectos de la divulgación, una muestra biológica comprende una célula o un tejido. En ciertas enseñanzas, dichos tejidos incluyen tejidos normales y/o cancerosos que expresan CD37 a niveles mayores en relación con otros tejidos, por ejemplo, linfocitos B y/o tejidos asociados con linfocitos B.
En una enseñanza, la divulgación proporciona un método para detectar la presencia de CD37 en una muestra biológica. En ciertas enseñanzas, el método comprende poner en contacto la muestra biológica con un anticuerpo anti-CD37 en condiciones permisivas para la unión del anticuerpo anti-CD37 a CD37, y detectar si se forma un complejo entre el anticuerpo anti-CD37 y CD37.
En un aspecto, la divulgación describe un método para diagnosticar un trastorno asociado con el aumento de la expresión de CD37. En ciertos aspectos de la divulgación, el método comprende poner en contacto una célula de ensayo con un anticuerpo anti-CD37; determinando el nivel de expresión (ya sea cuantitativa o cualitativamente) de CD37 mediante la célula de ensayo, detectando la unión del anticuerpo anti-CD37 a CD37; y comparar el nivel de expresión de CD37 por la célula de ensayo con el nivel de expresión de CD37 por una célula de control (por ejemplo, una célula normal del mismo origen de tejido que la célula de ensayo o una célula que expresa CD37 a niveles comparables a dicha célula normal), en donde un mayor nivel de expresión de CD37 por la célula de ensayo en comparación con la célula de control indica la presencia de un trastorno asociado con la expresión aumentada de CD37. En ciertas enseñanzas, la célula de ensayo se obtiene de un individuo que se sospecha que tiene un trastorno asociado con la expresión aumentada de CD37. En ciertas enseñanzas, el trastorno es un trastorno proliferativo celular, tal como un cáncer o un tumor.
En ciertas enseñanzas, un método de diagnóstico o detección, tal como los descritos anteriormente, comprende detectar la unión de un anticuerpo anti-CD37 a CD37 expresado en la superficie de una célula o en una preparación de membrana obtenida de una célula que expresa CD37 en su superficie. En ciertas enseñanzas, el método comprende poner en contacto una célula con un anticuerpo anti-CD37 en condiciones permisivas para la unión del anticuerpo anti-CD37 a CD37, y detectar si se forma un complejo entre el anticuerpo anti-CD37 y CD37 en la superficie celular. Un ensayo ejemplar para detectar la unión de un anticuerpo anti-CD37 a CD37 expresado sobre la superficie de una célula es un ensayo "FACS".
Pueden usarse otros métodos específicos para detectar la unión de los anticuerpos anti-CD37 a CD37. Dichos métodos incluyen, pero sin limitación, ensayos de unión a antígeno que se conocen bien en la técnica, tales como transferencias de Western, radioinmunoensayos, ELISA (ensayo inmunosorbente ligado a enzimas), inmunoensayos en "sándwich", ensayos de inmunoprecipitación, ensayos inmunológicos fluorescentes, inmunoensayos de proteína A e inmunohistoquímica (IHC).
En ciertas enseñanzas, los anticuerpos anti-CD37 están marcados. Los marcadores incluyen, pero sin limitación, marcadores o restos que se detectan directamente (tales como marcadores fluorescentes, cromofóricos, densos a los electrones, quimioluminiscentes y radiactivos), así como restos, tales como enzimas o ligandos, que se detectan indirectamente, por ejemplo, mediante una reacción enzimática o interacción molecular.
En ciertas enseñanzas, los anticuerpos anti-CD37 se inmovilizan sobre una matriz insoluble. La inmovilización implica separar el anticuerpo anti-CD37 de cualquier CD37 que permanezca libre en solución. Esto se logra convencionalmente o bien insolubilizando el anticuerpo anti-CD37 antes del procedimiento de ensayo, como mediante adsorción en una matriz o superficie insoluble en agua (Bennich et al., Patente de los Estados Unidos n.° 3.720.760) o mediante acoplamiento covalente (por ejemplo, usando reticulación de glutaraldehído) o insolubilizando el anticuerpo anti-CD37 después de la formación de un complejo entre el anticuerpo anti-CD37 y CD37, por ejemplo, mediante inmunoprecipitación.
Puede llevarse a cabo cualquiera de las enseñanzas de diagnóstico o detección usando un inmunoconjugado de la invención en lugar de o además de un anticuerpo anti-CD37.
En c ie rtas enseñ an zas , la en fe rm e d a d tra ta d a con el agen te o an ta g o n is ta de un ión a C D 37 (p o r e jem p lo , un a n ticu e rp o a n ti-C D 37 ) es un cáncer. En c ie rta s en señ an zas , el c á n c e r se ca ra c te riza po r cé lu la s que exp re sa n C D 37 a las que se une el a g en te de un ión a C D 37 (p o r e jem p lo , an ticue rpo ).
La presente divulgación enseña métodos para tratar el cáncer que comprenden administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente de unión a CD37 a un sujeto (por ejemplo, un sujeto que necesita tratamiento). En ciertos aspectos de la divulgación, el cáncer es una neoplasia maligna de linfocitos B. En ciertas enseñanzas, el cáncer se selecciona entre el grupo que consiste en linfomas de linfocitos B, NHL, leucemia/linfoma linfoblástico de linfocitos B precursores y neoplasias de linfocitos B maduros, leucemia linfocítica crónica de linfocitos B (CLL)/linfoma linfocítico de células pequeñas (SLL), leucemia prolinfocítica de linfocitos B, linfoma linfoplasmacítico, linfoma de células del manto (MCL), linfoma folicular (FL), (FL) de grado bajo, de grado intermedio y de alto grado, linfoma cutáneo del centro folicular, linfoma de linfocitos B de zona marginal, linfoma de linfocitos B de zona marginal de tipo MALT, linfoma de linfocitos B de zona marginal nodal, linfoma de linfocitos B de zona marginal de tipo esplénico, tricoleucemia, linfoma difuso de linfocitos B grandes, linfoma de Burkitt, plasmacitoma, mieloma de células plasmáticas, trastorno linfoproliferativo posterior a trasplante, macroglobulinemia de Waldenstrom y linfoma anaplásico de células grandes (ALCL). En ciertas enseñanzas, el sujeto es un ser humano.
La presente divulgación enseña además métodos para inhibir el crecimiento tumoral usando los anticuerpos u otros agentes descritos en el presente documento. En ciertas enseñanzas, el método para inhibir el crecimiento tumoral comprende poner en contacto la célula con un agente de unión a CD37 (por ejemplo, anticuerpo) in vitro. Por ejemplo, se cultiva una línea celular inmortalizada o una línea celular de cáncer que expresa CD37 en un medio al que se añade el anticuerpo u otro agente para inhibir el crecimiento tumoral. En algunas enseñanzas, se aíslan células tumorales de una muestra de un paciente, tal como, por ejemplo, una biopsia de tejido, efusión pleural o muestra de sangre y se cultivan en medio al que se añade un agente de unión a CD37 para inhibir el crecimiento tumoral.
En algunas enseñanzas, el método para inhibir el crecimiento tumoral comprende poner en contacto el tumor o las células tumorales con el agente de unión a CD37 (por ejemplo, anticuerpo) in vivo. En ciertas enseñanzas, la puesta en contacto de un tumor o una célula tumoral con un agente de unión a CD37 se lleva a cabo en un modelo animal. Por ejemplo, pueden administrarse agentes de unión a CD37 a xenoinjertos que expresan uno o más CD37 que han crecido en ratones inmunocomprometidos (por ejemplo, ratones NOD/SCID) para inhibir el crecimiento tumoral. En algunas enseñanzas, se aíslan células madre de cáncer de una muestra de paciente, tal como, por ejemplo, una biopsia de tejido, efusión pleural o muestra de sangre y se inyectan en ratones inmunocomprometidos a los que después se les administra un agente de unión a CD37 para inhibir el crecimiento tumoral. En algunas enseñanzas, el agente de unión a CD37 se administra al mismo tiempo o poco después de la introducción de células tumorigénicas en el animal para prevenir el crecimiento tumoral. En algunas enseñanzas, el agente de unión a CD37 se administra como agente terapéutico después de que las células tumorigénicas hayan crecido hasta un tamaño específico. En ciertas enseñanzas, el método para inhibir el crecimiento tumoral comprende administrar a un sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente de unión a CD37. En ciertos aspectos de la divulgación, el sujeto es un ser humano. En ciertas enseñanzas, el sujeto tiene un tumor o se le ha extirpado un tumor.
En ciertas enseñanzas, el tumor expresa CD37, al que se une el agente o anticuerpo de unión a CD37. En determinadas realizaciones, el tumor sobreexpresa CD37 humano.
Además, la divulgación enseña un método para reducir la tumorigenicidad de un tumor en un sujeto, que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente de unión a CD37 al sujeto. En ciertas enseñanzas, el tumor comprende células madre de cáncer. En ciertas enseñanzas, la frecuencia de células madre de cáncer en el tumor se reduce mediante la administración del agente.
La divulgación enseña además métodos para diferenciar células tumorigénicas en células no tumorigénicas que comprenden poner en contacto las células tumorigénicas con un agente de unión a CD37 (por ejemplo, mediante la administración del agente de unión a CD37 a un sujeto que tiene un tumor que comprende las células tumorigénicas o al que se le ha extirpado dicho tumor.
También se proporciona el uso de los agentes, polipéptidos o anticuerpos de unión a CD37 descritos en el presente documento para inducir la diferenciación de células, incluyendo, pero sin limitación células tumorales. Por ejemplo, se prevén métodos para inducir la diferenciación en células que comprenden poner en contacto las células con una cantidad eficaz de un agente de unión a CD37 (por ejemplo, un anticuerpo anti-CD37) descrito en el presente documento. También se enseñan métodos para inducir la diferenciación de células en un tumor en un sujeto que comprenden administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente, polipéptido o anticuerpo de unión a CD37 al sujeto. En ciertas enseñanzas, el tumor es un tumor pancreático. En otras enseñanzas concretas, el tumor es un tumor de colon. En algunas enseñanzas, los métodos de tratamiento comprenden administrar una cantidad terapéuticamente eficaz del agente, polipéptido o anticuerpos de unión a CD37 al sujeto.
La presente invención enseña además composiciones farmacéuticas que comprenden uno o más de los agentes de unión a CD37 descritos en el presente documento. En ciertas enseñanzas, las composiciones farmacéuticas comprenden además un vehículo farmacéuticamente aceptable. Estas composiciones farmacéuticas resultan útiles en la inhibición del crecimiento tumoral y el tratamiento del cáncer en pacientes humanos.
En ciertas enseñanzas, se preparan formulaciones para su almacenamiento y uso combinando un anticuerpo o agente purificado de la presente invención con un vehículo farmacéuticamente aceptable (por ejemplo, portador, excipiente) (Remington, The Science and Practice of Pharmacy, 20.a edición, Mack Publishing, 2000). Los vehículos farmacéuticamente aceptables adecuados incluyen, pero sin limitación, tampones no tóxicos, tales como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; sales, tales como cloruro de sodio; antioxidantes, incluyendo ácido ascórbico y metionina; conservantes (por ejemplo, cloruro de octadecildimetilbencil amonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio; cloruro de bencetonio; fenol, alcohol butílico o bencílico; alquil parabenos, tales como metil o propil parabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; y m-cresol); polipéptidos de bajo peso molecular (por ejemplo, de menos de aproximadamente 10 restos de aminoácidos); proteínas tales como albúmina de suero, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina o lisina; carbohidratos, tales como monosacáridos, disacáridos, glucosa, manosa o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; azúcares tales como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; contraiones formadores de sales tales como sodio; complejos metálicos (por ejemplo, complejos de Zn-proteína); y/o tensioactivos no iónicos, tales como TWEEN o polietilenglicol (PEG).
Las composiciones farmacéuticas enseñadas por la presente invención pueden administrarse de diversas maneras para tratamiento local o sistémico. La administración puede ser tópica (tal como membranas mucosas, incluyendo administración vaginal y rectal), tal como parches transdérmicos, pomadas, lociones, cremas, geles, gotas, supositorios, pulverizaciones, líquidos y polvos; pulmonar (por ejemplo, por inhalación o insuflación de polvos o aerosoles, incluyendo por nebulizador; intratraqueal, intranasal, epidérmica y transdérmica); oral; o parenteral incluyendo inyección o infusión intravenosa, intraarterial, subcutánea, intraperitoneal o intramuscular; o administración intracraneal (por ejemplo, intratecal o intraventricular).
Puede combinarse un anticuerpo o inmunoconjugado de la invención en una formulación de combinación farmacéutica o pauta posológica como terapia combinada, con un segundo compuesto que tiene propiedades anticáncer. El segundo compuesto de la formulación de combinación farmacéutica o pauta posológica puede tener actividades complementarias al ADC de la combinación, de tal forma que no se afectan negativamente entre sí. También se proporcionan composiciones farmacéuticas que comprenden el agente de unión a CD37 y el segundo agente anticáncer. Por ejemplo, pueden administrarse agentes de unión a CD37 en combinación con antagonistas de CD20, tales como Rituximab.
Para el tratamiento de la enfermedad, la dosis adecuada de un anticuerpo o agente de la presente invención depende del tipo de enfermedad que se vaya a tratar, la gravedad y evolución de la enfermedad, la sensibilidad de la enfermedad, de si el anticuerpo o el agente se administra con fines terapéuticos o preventivos, la terapia previa, el historial clínico del paciente y similares, todos según el criterio del médico tratante. El anticuerpo o el agente puede administrarse una vez o a lo largo de una serie de tratamientos que duran desde varios días hasta varios meses o hasta que se efectúa la cura o se logra la disminución de la patología (por ejemplo, reducción en el tamaño tumoral). Pueden calcularse pautas posológicas óptimas a partir de mediciones de la acumulación de fármaco en el cuerpo del paciente y variarán dependiendo de la potencia relativa de un anticuerpo o agente individual. El médico a cargo de la administración puede determinar fácilmente dosis óptimas, metodologías de dosificación y tasas de repetición. En determinadas realizaciones, la dosis es de 0,01 |jg a 100 mg por kg de peso corporal y puede administrarse una vez o más al día, semanalmente, mensualmente o anualmente. En determinadas realizaciones, se administra el anticuerpo u otro agente de unión a CD37 una vez cada dos semanas o una vez cada tres semanas. En determinadas realizaciones, la dosis del anticuerpo u otro agente de unión a CD37 es de aproximadamente 0,1 mg a aproximadamente 20 mg por kg de peso corporal. El médico a cargo del tratamiento puede estimar las tasas de repetición para la dosificación basándose en los tiempos de residencia medidos y las concentraciones del fármaco en los fluidos corporales o los tejidos.
La terapia combinada puede proporcionar "sinergia" y mostrarse "sinérgica", es decir, el efecto conseguido cuando los principios activos se utilizan juntos es mayor que la suma de los efectos resultantes de utilizar los compuestos de forma separada. Se puede conseguir un efecto sinérgico cuando los principios activos se: (1) coformulan y administran o suministran, de manera simultánea en una formulación de dosificación unitaria; (2) dispensan de manera alternante o en paralelo como formulaciones separadas; o (3) mediante algún otro régimen. Cuando se administran en terapia alterna, puede conseguirse un efecto sinérgico cuando los compuestos se administran o suministran de forma secuencial, por ejemplo, mediante diferentes inyecciones en jeringas distintas. En general, durante la terapia alterna, se administra de forma secuencial una dosificación eficaz de cada principio activo, es decir, en serie, mientras que en la terapia de combinación, se administran juntas las dosificaciones eficaces de dos o más principios activos.
VI. Kits que comprenden agentes de unión a CD37
La presente invención enseña kits que comprenden los anticuerpos, inmunoconjugados u otros agentes descritos en el presente documento y que pueden usarse para llevar a cabo los métodos descritos en el presente documento. En ciertas enseñanzas, un kit comprende al menos un anticuerpo purificado contra CD37 en uno o más envases. En algunas realizaciones, los kits contienen todos los componentes necesarios y/o suficientes para llevar a cabo un ensayo de detección, incluyendo todos los controles, instrucciones para llevar a cabo los ensayos y cualquier programa informático necesario para el análisis y presentación de los resultados. Un experto en la materia reconocerá fácilmente que los anticuerpos, inmunoconjugados u otros agentes divulgados de la presente invención pueden incorporarse fácilmente en uno de los formatos de kit establecidos que se conocen bien en la técnica.
Además, se enseñan kits que comprenden un agente de unión a CD37 (por ejemplo, un anticuerpo de unión a CD37), así como un segundo agente anticáncer. En ciertas enseñanzas, el segundo agente anticáncer es un agente quimioterapéutico (por ejemplo, rituximab).
Las realizaciones de la presente divulgación pueden definirse además por referencia a los siguientes ejemplos no limitantes, que describen en detalle la preparación de ciertos anticuerpos de la presente divulgación y métodos para usar los anticuerpos de la presente divulgación. Resultará evidente para los expertos en la técnica que pueden realizarse muchas modificaciones, tanto en los materiales como en los métodos, sin desviarse del alcance de la presente divulgación.
Ejemplos
Los siguientes ejemplos incluyen moléculas de acuerdo con la presente invención y referencia a otras moléculas con fines ilustrativos de antecedentes.
Líneas celulares y crecimiento
Línea celular Origen Fuente
Ramos Linfoma de Burkitt DSMZ (ACC 603)
Raji Linfoma de Burkitt DSMZ (ACC 319)
Daudi Linfoma de Burkitt DSMZ (ACC 78)
Namalwa Linfoma de Burkitt ATCC (CRL-1432)
BJAB B-NHL Un presente de Elliot Kieff (Harvard)
WSU-DLCL-2 B-NHL, linfoma difuso de linfocitos B grandes DSMZ (ACC 575)
RL B-NHL, linfoma difuso de linfocitos B grandes DSMZ (ACC 613)
SU-DHL-4 B-NHL, linfoma histiocítico difuso DSMZ (ACC 495)
DOHH-2 linfoma inmunoblástico de linfocitos B refractario linfoma folicular DSMZ (ACC 47)
Granta-519 B-NHL, linfoma de células del manto DSMZ (ACC 342)
Todas las líneas celulares se cultivaron en medio RPMI-1640 complementado con suero fetal bovino al 10%, glutamina 2 mM y penicilina-estreptomicina al 1 % (todos los reactivos de Invitrogen) a 37 °C en una incubadora humidificada con CO2 al 5 %. Las células se pasaron diluyendo en medio fresco dos veces a la semana y se mantuvieron a entre 0,2 a 1 x 106 células/ml.
Ejemplo 1
Producción de anticuerpos anti-CD37 murinos
Se construyó un plásmido de expresión pSRa-CD37 que contenía la secuencia codificante completa (CDS) de CD37 flanqueada por sitios de restricción de XbaI y BamHI que permitieron la expresión de CD37 humano. Las células 300­ 19, una línea celular pre-B procedente de un ratón Balb/c (M. G. Reth et al. 1985, Nature, 317: 353-355), se transfectaron con este plásmido de expresión para expresar de manera estable altos niveles de CD37 humano en la superficie celular y se usaron para la inmunización de ratones Balb/c VAF. Se inmunizó subcutáneamente a ratones con aproximadamente 5x106 células 300-19 que expresan CD37 por ratón cada 2-3 semanas mediante protocolos de inmunización estándar usados en ImmunoGen, Inc. Se reforzó a los ratones inmunizados con otra dosis de antígeno tres días antes de sacrificarlos para la generación del hibridoma. Se recogió el bazo de los ratones de acuerdo con protocolos animales convencionales y se trituró entre dos portaobjetos estériles microscópicos congelados para obtener una suspensión de células individuales en medio RPMI-1640. Se sedimentaron las células de bazo, se lavaron y se fusionaron con células de mieloma murino P3X63Ag8.653 (J. F. Kearney et al. 1979, J Immunol, 123: 1548-1550) usando polietilenglicol-1500 (Roche 783641). Las células fusionadas se resuspendieron en medio de selección RPMI-1640 que contenía hipoxantina-aminopterina-timidina (HAT) (Sigma H-0262) y se seleccionaron para crecimiento en placas de cultivo de fondo plano de 96 pocillos (Coming-Costar 3596, 200 pl de suspensión celular por pocillo) a 37 °C con CO2 al 5 %. Después de 5 días de incubación, se retiraron de cada pocillo 100 pl de sobrenadante de cultivo y se repusieron con 100 pl de medio RPMI-1640 que contenía suplemento de hipoxantina-timidina (HT) (Sigma H-0137). Se continuó la incubación a 37 °C con un 5 % de CO2 hasta que los clones de hibridoma estaban listos para la exploración de anticuerpos. También pueden usarse otras técnicas de inmunización y producción de hibridoma, incluyendo las descritas en J. Langone y H. Vunakis (Eds., Methods in Enzymology, Vol. 121, "Immunochemical Techniques, Part I"; Academic Press, Florida) y E. Harlow y D. Lane ("Antibodies: A Laboratory Manual";1988; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York).
Exploración y selección de hibridoma
Se exploraron los sobrenadantes de cultivo del hibridoma mediante citometría de flujo para la secreción de anticuerpos monoclonales de ratón que se unen a las células 300-19 que expresan CD37, pero no a las células 300-19 no transfectadas. Se incubaron 100 pl de los sobrenadantes de hibridoma durante 3 h con células 300-19 que expresaban CD37 o las células 300-19 no transfectadas (1 x105 células por muestra) en 100 pl de tampón de FACS (medio RPMI-1640 complementado con suero normal de cabra al 2%). Después, se sedimentaron las células, se lavaron y se incubaron durante 1 h con 100 pl de anticuerpo de cabra anti-IgG de ratón conjugado a PE (Jackson Laboratory, 6 pg/ml en tampón de FACS). Las células se sedimentaron nuevamente, se lavaron con tampón de FACS y se resuspendieron en 200 pl de PBS que contenía formaldehído al 1 %. Las muestras se adquirieron usando un citómetro de flujo FACSCalibur con el muestreador multipocillo HTS o un citómetro de flujo FACS Array y se analizaron usando CellQuest Pro (todos de BD Biosciences, San Diego, EE. UU.).
Los clones de hibridoma que dieron un resultado positivo se subclonaron mediante dilución limitante. Un subclon de cada hibridoma, que mostró la misma reactividad contra CD37 que las células precursoras mediante citometría de flujo, se seleccionó para su análisis posterior. Los subclones estables se cultivaron y se identificó el isotipo de cada anticuerpo anti-CD37 secretado usando reactivos de isotipado comerciales (Roche 1493027).
Se llevó a cabo un total de 45 experimentos de fusión separados a lo largo de esta investigación. Un solo experimento de fusión produjo rutinariamente entre aproximadamente 200 y 1000 clones de hibridoma. Se exploraron todos los clones de hibridoma resultantes respecto de su unión a CD37 mediante citometría de flujo y un total de 184 clones de hibridoma mostró unión específica a CD37.
Purificación de anticuerpos
Se purificaron anticuerpos de sobrenadantes de subclones de hibridoma usando métodos convencionales, tales como, por ejemplo, cromatografía de proteína A o G (HP Proteína A o G HiTrap, 1 ml, Amersham Biosciences). Brevemente, se preparó el sobrenadante para cromatografía mediante la adición de 1/10 de volumen de tampón Tris/HCl 1 M, pH 8,0. El sobrenadante con el pH ajustado se filtró a través de una membrana de filtro de 0,22 pm y se cargó en una columna equilibrada con tampón de unión (PBS, pH 7,3). La columna se lavó con tampón de unión hasta que se obtuvo un valor basal estable sin absorbancia a 280 nm. El anticuerpo se eluyó con tampón de ácido acético 0,1 M que contenía NaCl 0,15 M, pH 2,8, usando un caudal de 0,5 ml/min. Se recogieron fracciones de aproximadamente 0,25 ml y se neutralizaron mediante la adición de 1/10 de volumen de Tris/HCl 1 M, pH 8,0. Las fracciones pico se dializaron dos veces durante la noche contra PBS 1x y se esterilizaron mediante filtración a través de una membrana de filtro de 0,2 pm. El anticuerpo purificado se cuantificó mediante la absorbancia a A280.
Las fracciones de proteína A purificadas se refinaron adicionalmente usando cromatografía de intercambio iónico (IEX) con cromatografía de amonio cuaternario (Q) para los anticuerpos murinos. Brevemente, se intercambió el tampón de las muestras de la purificación de proteína A en tampón de unión (Tris 10 mM, cloruro de sodio 10 mM, pH 8,0) y se filtraron a través de un filtro de 0,22 pm. Después, se cargó la muestra preparada en una resina Q Fast Flow (GE LifeSciences) que se equilibró con tampón de unión a un caudal de 120 cm/h. Se seleccionó el tamaño de la columna para tener capacidad suficiente para unirse a todo el MAb en la muestra. Después, la columna se lavó con tampón de unión hasta que se obtuvo un valor basal estable sin absorbancia a 280 nm. El anticuerpo se eluyó iniciando un gradiente de 10 mM a 500 mM de cloruro de sodio en 20 volúmenes de columna (VC). Las fracciones de pico se recogieron basándose en la medición de la absorbancia a 280 nm (A280). Se evaluó el porcentaje de monómero con cromatografía de exclusión por tamaños (SEC) en un gel TSK G3000SWXL, 7,8 x 300 mm con una columna de guarda SWXL, 6,0 x 40 mm (Tosoh Bioscience, Montgomeryville, PA) usando un sistema Agilent HPLC 1100 (Agilent, Santa Clara, CA). Se agruparon las fracciones con un contenido de monómero superior al 95 %, se intercambió el tampón a PBS (pH 7,4) usando un sistema TFF y se esterilizaron por filtración a través de una membrana de filtro de 0,2 pm. Se determinó la concentración de IgG del anticuerpo purificado mediante A280 usando un coeficiente de extinción de 1,47. También se usaron métodos alternativos, tales como hidroxiapatita cerámica (CHT) para refinar los anticuerpos con buena selectividad. Se usó resina CHT de tipo II con un tamaño de partícula de 40 pm (Bio-Rad Laboratories) con un protocolo similar, como se describe para la cromatografía IEX. El tampón de unión para la CHT corresponde a fosfato de sodio 20 mM, pH 7,0 y el anticuerpo se eluyó con un gradiente de fosfato de sodio 20-160 mM a lo largo de 20 VC.
Ejemplo 2
Caracterización de la unión mediante citometría de flujo
Se evaluó la especificidad de unión mediante citometría de flujo usando anticuerpos purificados. Los histogramas de FACS que demuestran la unión de muCD37-3, muCD37-12, muCD37-38, muCD37-50, muCD37-51, muCD37-56 y muCD37-57 a células 300-19 que expresan CD37 y la ausencia de unión a las células 300-19 precursoras se muestran en la figura 1 y la figura 2. Todos los anticuerpos murinos se incubaron durante 3 h con células 300-19 que expresaban CD37 o las células 300-19 no transfectadas (1 x105 células por muestra) en 100 pl de tampón de FACS (medio RPMI-1640 complementado con suero normal de cabra al 2%). Después, se sedimentaron las células, se lavaron y se incubaron durante 1 h con 100 |jl de anticuerpo de cabra anti-IgG de ratón conjugado a FITC (Jackson Laboratory, 6 jg/ml en tampón de FACS). Las células se sedimentaron nuevamente, se lavaron con tampón de FACS y se resuspendieron en 200 jl de PBS que contenía formaldehído al 1 %. Las muestras se adquirieron usando un citómetro de flujo FACSCalibur con el muestreador multipocillo HTS o un citómetro de flujo FACS Array y se analizaron usando CellQuest Pro (todos de BD Biosciences, San Diego, EE. UU.).
Los histogramas de FACS de células 300-19 que expresan CD37 incubadas con muCD37-3, muCD37-12, muCD37-38, muCD37-50, muCD37-51, muCD37-56 o muCD37-57 mostraron un desplazamiento fluorescente, mientras que las células 300-19 precursoras no. Asimismo, no se detectó un desplazamiento de fluorescencia significativo cuando se incubó cualquiera de las líneas celulares únicamente con anticuerpo de cabra anti-IgG de ratón conjugado a FITC solo (figura 1, parte inferior).
Para verificar que los anticuerpos también pueden unirse a CD37 expresado de manera endógena, se llevaron a cabo experimentos de unión con células de linfoma WSU-DLCL-2 positivas para CD37 y los anticuerpos muCD37-3, muCD37-12, muCD37-8, muCD37-10 o muCD37-14. Se incubaron células WSU-DLCL-2 con diversas concentraciones de anticuerpos murinos y se procesaron como se ha descrito anteriormente para su análisis por citometría de flujo. Los análisis de datos se llevaron a cabo usando CellQuest Pro (BD Biosciences, San Diego, Ee . UU.) y para cada muestra, se exportó y representó la intensidad media de fluorescencia para FL1 (IMF) frente a la concentración de anticuerpo en una gráfica semilogarítmica (figura 3). Se generó una curva de respuesta a la dosis mediante regresión no lineal y el valor de CE50 de cada curva, que corresponde a la constante de disociación aparente (Kd) de cada anticuerpo, se calculó usando GraphPad Prism v4 (GraphPad Software, San Diego, CA). Se observó un fuerte desplazamiento de la fluorescencia para todos los anticuerpos ensayados y los valores de Kd corresponden a 0,52 nM, 1,7 nM, 2,7 nM, 1,1 nM o 0,91 nM para los anticuerpos muCD37-3, muCD37-8, muCD37-10, muCD37-12 o muCD37-14, respectivamente.
Asimismo, también se observó una fuerte unión cuando se usaron células de linfoma BJAB positivas para CD37 para el mismo ensayo de citometría de flujo descrito anteriormente. Se calcularon los valores de Kd como se ha descrito anteriormente y corresponden a 0,2 nM, 0,4 nM, 0,6 nM, 0,4 nM y 1 nM para muCD37-3, muCD37-38, muCD37-50, muCD37-51, muCD37-56 y muCD37-57, respectivamente.
Ejemplo 3
Actividad proapoptótica de anticuerpos murinos
Los anticuerpos murinos anti-CD37 indujeron la apoptosis de células de linfoma Ramos y Raji. Se midió el grado de apoptosis mediante análisis de citometría de flujo después de la tinción con conjugados de FITC de anexina V (Invitrogen) y con TO-PRO-3 (Invitrogen). En células normales sanas, la fosfatidilserina se expresa en el interior de la bicapa de membrana y la transición de la fosfatidilserina de la cara interna a la externa de la membrana plasmática es una de las señales de apoptosis detectables más temprana. La anexina V se une a fosfatidilserina en el exterior pero no en el interior de la bicapa de la membrana celular de células intactas. Por lo tanto, el grado de unión de anexina V es un indicador de la inducción de apoptosis. TO-PRO-3 es un tinte de ácido nucleico de cianina monomérico que solo puede penetrar la membrana plasmática cuando se rompe la integridad de membrana, como sucede en las etapas tardías de la apoptosis. Son distinguibles tres poblaciones de células en la citometría de flujo bicolor: células no apoptóticas (negativas a anexina V y negativas a TO-PRO-3), células apoptóticas tempranas (positivas a anexina V y negativas a TO-PRO-3) y células necróticas o células apoptóticas tardías (positivas a anexina V y positivas a TO-PRO-3).
Se sembraron células en crecimiento exponencial a aproximadamente 2 x 105 células/ml en placas de 24 pocillos en medio RMPI-1640 complementado con suero fetal bovino al 10 % (FBS), L-glutamina 2 mM y 50 jg/ml de gentamicina (indicado más adelante como medio RMPI-1640 completo). Las células se cultivaron generalmente en medio RMPI-1640 completo, a menos que se indique lo contrario. Las células se incubaron con 10 nM de anticuerpos anti-CD37 durante 20 a 24 h a 37 °C en una incubadora humidificada con un 5 % de CO2. Después, se sedimentaron las células, se lavaron dos veces con 500 jl de PBS, se resuspendieron en 100 jl de tampón de unión (Hepes-NaOH 10 mM, pH 7,4, NaCl 140 mM, CaCl22,5 mM) y se tiñeron con 5 jl de anexina V-FITC durante 15 min sobre hielo. Después, se añadieron a la mezcla 400 jl de tampón de unión con 1 jM de TO-PRO-3 y se midió inmediatamente la fluorescencia asociada a células de FITC y TO-PRO-3 mediante citometría de flujo. Se recogieron por cada muestra cinco mil eventos. Las gráficas de puntos para la fluorescencia de TO-PRO-3 (FL4-H, eje y) y la fluorescencia de anexina V-FITC (FL1-H; eje x) se generaron usando el programa informático BD CellQuest.
Se determinó para cada muestra el porcentaje de células positivas para anexina V (que incluye células tanto positivas como negativas para TO-PRO-3) a partir de estas gráficas y se muestra en la figura 4 para células Ramos. Se ensayaron varios anticuerpos aislados de la presente exploración de anticuerpos respecto de su actividad antiapoptótica en comparación con Rituximab. Inesperadamente, algunos de los anticuerpos murinos anti-CD37, tales como muCD37-3 y muCD37-12, mostraron una actividad proapoptótica muy fuerte. Aproximadamente un 39 % de las células Ramos expuestas a muCD37-3 y un 46 % de las células Ramos expuestas a muCD37-12 fueron positivas para anexina V. Por el contrario, el tratamiento con el anticuerpo anti-CD20 rituximab dio como resultado solo un 13 % de células positivas para anexina V, mientras que las muestras de control no tratadas contenían un 5 % de células positivas a anexina V. Varios de los anticuerpos murinos anti-CD37 aislados no mostraron actividad antiapoptótica alguna. Por ejemplo, el tratamiento de células Ramos con muCD37-8, muCD37-10 o muCD37-14 dio como resultado un aumento menor o nulo en el porcentaje de células positivas para anexina V en comparación con las no tratadas. Esto es a pesar de su afinidad de unión comparable a CD37, como se muestra en la figura 3.
Se aislaron y exploraron anticuerpos adicionales respecto de su capacidad para inducir apoptosis en células Ramos. De los diversos anticuerpos aislados que se unieron a CD37 con alta afinidad, solo algunos tuvieron actividad proapoptótica. Los resultados de un ensayo de anexina V se muestran en la figura 4B. Los anticuerpos murinos muCD37-38, muCD37-50, muCD37-51, muCD37-56 y muCD37-57 fueron capaces de inducir apoptosis y dieron como resultado un 38 - 45 % de células Ramos positivas para anexina V, en comparación con un 5 % en las muestras de control no tratadas. De manera similar al ensayo anterior, el tratamiento con el anticuerpo anti-CD20 rituximab dio como resultado tan solo un 18 % de células positivas para anexina V.
Además, se evaluó la capacidad de los anticuerpos murinos para inducir apoptosis en células de linfoma Raji. Como se ha observado para células Ramos, de los diversos anticuerpos aislados que se unieron a CD37 con alta afinidad, solo algunos tuvieron actividad proapoptótica. El tratamiento con muCD37-3 o muCD37-12 dio como resultado un 36 % o 49 % de células positivas para anexina V, respectivamente. Por el contrario, el tratamiento con el anticuerpo anti-CD20 rituximab dio como resultado solo un 20 % de células positivas para anexina V, mientras que las muestras de control no tratadas contenían un 4 % de células positivas a anexina V.
Asimismo, aproximadamente un 60 % de las células Raji tratadas con muCD37-3, muCD37-38, muCD37-50, muCD37-51, muCD37-56 o muCD37-57 fueron células positivas para anexina V, en comparación con un 15 % de células no tratadas.
Ejemplo 4
Ensayos de proliferación
Se midió la capacidad de los anticuerpos anti-CD37 para inhibir el crecimiento celular usando ensayos de citotoxicidad in vitro. Se sembraron células diana a razón de 5.000 células por pocillo en 100 pl en medio RPMi completo (RPMI-1640, suero fetal bovino al 10 %, glutamina 2 mM, 1 % de penicilina/estreptomicina, todos los reactivos de Invitrogen). Se diluyeron los anticuerpos en medio RPMI completo usando diluciones en serie de factor 3 y se añadieron 100 pl por pocillo. La concentración final varió típicamente de 3 x 10-8 M a 4,6 x 10-12 M. Las células se incubaron a 37 °C en una incubadora humidificada con un 5 % de CO2 durante 4 a 5 días. Se determinó la viabilidad de las células restantes mediante ensayo WST-8 colorimétrico (Dojindo Molecular Technologies, Inc., Rockville, MD, EE. UU.). WST-8 se reduce por las deshidrogenasas en las células vivas en un producto de formazano de color naranja que es soluble en medio de cultivo tisular. La cantidad de formazano producida es directamente proporcional al número de células vivas. Se añadió WST-8 al 10 % del volumen final y se incubaron las placas a 37 °C en una incubadora humidificada con un 5 % de CO2 durante 2-4 horas adicionales. Las placas se analizaron midiendo la absorbancia a 450 nm (A450) en un lector de placas multipocillo. Se restó de todos los valores la absorbancia A450 de fondo de los pocillos con medio y solo WST-8. Se calculó el porcentaje de viabilidad dividiendo cada valor de muestra tratada entre el valor medio de los pocillos con células no tratadas. Porcentaje de viabilidad = 100* (A450 de muestra tratada - A450 de fondo)/ (A450 de muestra no tratada - A450 de fondo). Se representó el valor de porcentaje de viabilidad frente a la concentración de anticuerpo en una gráfica semilogarítmica para cada tratamiento.
Los resultados de un ensayo de proliferación típico que usa anticuerpos murinos anti-CD37 y células de linfoma SU-DHL-4 se presentan en la figura 5. Resulta evidente, que varios anticuerpos murinos fueron capaces de inhibir sustancialmente la proliferación de células SU-DHL-4 y de una manera dependiente de la dosis, mientras que otros no tuvieron dicho efecto. Por ejemplo, el tratamiento con muCD37-3 redujo la viabilidad celular a un 34 % a la concentración de anticuerpo máxima ensayada con una CE50 de 0,17 nM. De manera similar, el tratamiento con muCD37-38 redujo la viabilidad celular a un 25 % a la concentración de anticuerpo máxima ensayada con una CE50 de 0,19 nM. Asimismo, el tratamiento con muCD37-50 o muCD37-51 redujo la viabilidad celular a un 38% a la concentración de anticuerpo máxima ensayada con una CE50 de 0,25 nM o 0,5 nM, respectivamente. Por el contrario, el tratamiento con, por ejemplo, CD37-16 no redujo la viabilidad celular de una manera dependiente de la dosis. Ejemplo 5
Clonación y secuenciación de las regiones VL y VH del anticuerpo CD37-3
Se preparó ARN celular total a partir de 5 x 106 células del hibridoma CD37-3 usando un kit RNeasy (QIAgen) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Posteriormente, se sintetizó el ADNc a partir del ARN total usando el kit de síntesis de ADNc SuperScript II (Invitrogen).
El procedimiento para la primera ronda de reacción de PCR degenerada en el ADNc procedente de células de hibridoma se basó en los métodos descritos en Wang et al. ((2000) J Immunol Methods. 233:167-77) y Co et al. ((1992) J Immunol. 148:1149-54). Las secuencias de VH se amplificaron mediante la PCR usando los siguientes cebadores degenerados: EcoMH1 CTTCCGGAATTCSARGTNMAGCTGSAGSAGTC (SEQ ID NO: 171), EcoMH2 CTTCCGGAATTCSARGTNMAGCTGSAGSAGTCWGG (SEQ ID NO: 172) y BamIgG1 GGAGGATCCATAGACAGATGGGGGTGTCGTTTTGGC (SEQ ID NO: 173). Las secuencias de VL se amplificaron mediante la PCR usando los siguientes cebadores degenerados: SacIMK GGAGCTCGAYATTGTGMTSACMCARWCTMCA (SEQ ID NO: 174) y HindKL TATAGAGCTCAAGCTTGGATGGTGGGAAGATGGATACAGTTGGTGC (SEQ ID NO: 175). (Las bases mixtas se definen del siguiente modo: N=G+A+T+C, S=G+C, Y=C+T, M=A+C, R=A+G, W=A+T). Las mezclas de reacción de la PCR se ejecutaron posteriormente en un gel de agarosa de bajo punto de fusión al 1 %, se cortaron las bandas de 300 a 400 pb, se purificaron usando columnas Zymo DNA mini y se remitieron a Agencourt Biosciences para su secuenciación. Se usaron los cebadores para PCR 5' y 3' respectivos como cebadores de secuenciación para generar los ADNc de la región variable de ambas direcciones. Las secuencias de aminoácidos de las regiones VH y VL se predijeron a partir de los resultados de secuenciación del ADN.
Debido a que los cebadores degenerados usados para clonar las secuencias de ADNc de VL y VH alteran las secuencias en el extremo 5', se necesitaron esfuerzos de secuenciación adicionales para verificar las secuencias completas. Se usaron las secuencias de ADNc preliminares para efectuar búsquedas en el sitio NCBI IgBlast (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/) para las secuencias de línea germinal murinas de las que proceden las secuencias de anticuerpo. Después, se diseñaron cebadores para la PCR para hibridarlos a la secuencia líder ligada a la línea germinal del anticuerpo murino, de tal forma que esta nueva reacción de la PCR pudiera proporcionar una secuencia de ADNc de región variable completa, no alterada por los cebadores para la PCR. Las reacciones PCR, las purificaciones de bandas y la secuenciación se llevaron a cabo como se ha descrito anteriormente.
Determinación de masa para la confirmación de secuencia
Se combinó la información de secuencia de ADNc para la región variable con la secuencia de la región constante de línea germinal para obtener secuencias de ADNc de anticuerpo de longitud completa. Después, se calcularon los pesos moleculares de la cadena pesada y la cadena ligera y se compararon con los pesos moleculares obtenidos mediante análisis de CL/EM del anticuerpo CD37-3 murino. Las mediciones de peso molecular son coherentes con las secuencias de ADNc tanto para la cadena ligera como la pesada de CD37-3.
Quimerización
La secuencia variable para la región variable de cadena ligera se clona en los sitios de EcoRI y BsiWI en el plásmido pchCD37-3LCZ. La región variable de cadena pesada se clona en los sitios de HindIII y Apa1 en el plásmido pchCD37-3HCN. Se construyeron plásmidos equivalentes para chCD37-12. Estos plásmidos se usaron para expresar anticuerpos quiméricos en células HEK-293T usando un procedimiento de fosfato de calcio convencional (BD Biosciences, kit de transfección de mamífero CalPhos, n.° de cat 631312). El sobrenadante se purificó usando procedimientos de cromatografía de Proteína A convencionales, como se ha descrito anteriormente, pero las etapas de cromatografía de refinado se llevaron a cabo usando resina de intercambio iónico (IEX) de flujo rápido de carboximetilo (CM) (GE Lifesciences) y fosfato de potasio 10 mM, tampón de unión de cloruro de sodio 10 mM (pH 7,5) o los métodos de CHT alternativos descritos anteriormente.
Ejemplo 6
Humanización de anticuerpos
Se humanizaron los anticuerpos CD37-3 y huCD37-50 siguiendo los métodos de revestimiento descritos previamente, tales como, por ejemplo, en Roguska et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 91(3):969-973 (1994) y Roguska et al., Protein Eng. 9(10):895-904 (1996), que se incorporan al presente documento por referencia en su totalidad. El revestimiento implica generalmente la identificación de los restos superficiales marco de la región variable en las cadenas tanto ligeras como pesadas y el reemplazo de estos por equivalentes humanos. Las CDR murinas están conservadas en el anticuerpo revestido. Las CDR ejemplares de los anticuerpos CD37-3 y CD37-50 se definen como se indica en la tabla 11. Además de la definición de CDR2 de cadena pesada empleada para el revestimiento, la tabla proporciona CDR2 de cadena pesada definidas según Kabat ejemplares para CD37-3 y CD37-50 tanto murino como humano. La secuencia subrayada marca la porción de la CDR2 de cadena pesada de Kabat que no se considera una CDR para el revestimiento.
Tabla 11
Figure imgf000059_0001
(continuación)
Figure imgf000060_0001
Se proporcionan a modo de ejemplo en la tabla 11 las CDR de cadena ligera y pesada de CD37-3 y CD7-50, como se han definido para el revestimiento. La lisina 53 en la CDR2 de cadena ligera de CD37-50 se reemplazó por asparagina en CD37-50 humanizado (mostrada en cursiva), por lo que se proporcionan ambas versiones de la CDR2 de LC. También se proporciona la definición de Kabat para la CDR2 de cadena ligera para CD37-3 tanto murino como humano. La secuencia subrayada marca la porción de la CDR2 de cadena pesada de Kabat que no se considera una CDR para el revestimiento.
Las posiciones de restos de la superficie se definen como cualquier posición con su accesibilidad relativa del 30 % o mayor (Pedersen J.T. et. Al, J. Mol. Biol. 1994; 235: 959-973). Después, se alinean los restos de la superficie con secuencias superficiales de línea germinal humana para identificar la secuencia de superficie humana más homóloga. Para CD37-3, las secuencias de línea germinal humana usadas como superficies de reemplazo fueron IGKV1/OR2-0*01 y IGHV4-34*09 para VL y VH, respectivamente. Para CD37-50, las secuencias de línea germinal humana usadas como superficies de reemplazo fueron IGKV3/OR2-268*01 y IGHV4-31*03 para VL y VH, respectivamente. Como puede observarse de las listas en la figura 6, se reemplazó un total de siete restos de superficie en la cadena ligera y siete en la cadena pesada por los homólogos humanos en CD37-3. Como se observa en la figura 7 para CD37-50, los restos de superficie totales que se reemplazaron por los homólogos humanos son siete y cinco en la VL y la VH, respectivamente. En CD37-3, el resto 61 de la cadena pesada se encuentra próximo a CDR-H2 y debido a que su sustitución por el resto de prolina humano podría dar como resultado una afinidad de unión reducida, se generó una segunda versión revestida con el resto de serina murino conservado. Debido a que estos anticuerpos se ensayaron como conjugados citotóxicos, se reemplazó la lisina 53 de la CDR2 de cadena ligera de CD37-50 por una asparagina para evitar el riesgo de que la conjugación con lisina tuviese un impacto en la afinidad de unión. La figura 8 muestra el alineamiento de las secuencias revestidas para el dominio variable de CD37-3 y CD37-50, tanto de cadena ligera como de cadena pesada con sus homólogos murinos.
Expresión recombinante del anticuerpo huCD37-3
Se optimizaron los codones de las secuencias de región variable para huCD37-3 y CD37-50 y se sintetizaron por Blue Heron Biotechnology. Las secuencias están flanqueadas por sitios de enzimas de restricción para la clonación en fase con las respectivas secuencias constantes en plásmidos de expresión en mamíferos monocatenarios. La región variable de cadena ligera se clona en los sitios de EcoRI y BsiWI en el plásmido pAbKZeo. La región variable de cadena pesada se clona en los sitios de HindIII y Apa1 en el plásmido pAbGlNeo. Estos plásmidos pueden usarse para expresar los anticuerpos recombinantes en transfecciones en células de mamífero transitorias o estables. Se llevaron a cabo transfecciones transitorias para expresar anticuerpos recombinantes en células HEK-293T usando un procedimiento con PEI modificado (Durocher, Y. et al., Nucleic Acids Res. 30:E9 (2002)). El sobrenadante se purificó mediante etapas de cromatografía de proteína A y de refinado usando procedimientos convencionales como se ha descrito anteriormente para anticuerpos quimerizados.
Expresión de TRU-016
A fin de comparar la actividad de los anticuerpos anti-CD37 aislados, se clonaron y expresaron los anticuerpos anti-CD37 previamente identificados. La secuencia de ADN para el SMIP anti-CD37 se extrajo del documento US2007/0059306 usando la SEQ ID NO: 51. La secuencia estaba flanqueada por los sitios de enzimas de restricción HindIII y Xho1 para su clonación en los plásmidos de expresión en mamíferos pAbGlNeo. La expresión y purificación se llevó a cabo como se ha descrito anteriormente para huCD37-3.
Ejemplo 7
A fin id a d de un ión de los a n ticu e rp o s q u im é rico s
Se ensayó la afinidad de unión de los anticuerpos quiméricos chCD37-3 y chCD37-12 a células Ramos en comparación con sus homólogos murinos. Se llevaron a cabo ensayos de citometría de flujo usando células Ramos y los anticuerpos muCD37-3, chCD37-3, muCD37-12 y chCD37-12 y se analizaron como se describe en el ejemplo 2 usando anticuerpos secundarios de cabra anti-murino y anti-humano conjugados a FITC. La figura 9A ilustra las curvas de respuesta a la dosis generadas mediante regresión no lineal para cada anticuerpo. Se calculó el valor para la constante de disociación aparente (Kd) de cada anticuerpo usando GraphPad Prism v4 (GraphPad Software, San Diego, CA). Resulta evidente que la quimerización no afectó en gran medida a la afinidad de unión de cualquiera de los anticuerpos, ya que la Kd para muCD37-3, chCD37-3, muCD37-12 y chCD37-12 corresponde a 0,4 nM, 0,8 nM, 0,8 nM y 1,2 nM, respectivamente.
Afinidad de unión de huCD37-3v1.0 y huCD37-3v1.01
Se usaron ensayos de citometría de flujo usando células BJAB y un formato competitivo para evaluar la afinidad de unión de las versiones quiméricas y humanizadas de CD37-3. Las células BJAB se incubaron con una concentración 1 nM de anticuerpo muCD37-3 marcado con PE y la competición se midió añadiendo diversas cantidades de muCD37-3, chCD37-3, huCD37-3v1.0 o huCD37-3v1.01. Las muestras se incubaron durante 3 h a 4 °C. Después, las células se sedimentaron, se lavaron con tampón de FACS y se resuspendieron en 200 pl de PBS que contenía formaldehído al 1 %. Las muestras se adquirieron usando un citómetro de flujo FACSCalibur con el muestreador multipocillo HTS y se analizaron usando CellQuest Pro (todos de BD Biosciences, San Diego, EE. UU.). La fluorescencia media de PE resultante se representó frente a la cantidad de anticuerpo competidor usado en una gráfica semilogarítmica. La figura 9B ilustra las curvas de respuesta a la dosis generadas mediante regresión no lineal para cada anticuerpo. Se calculó el valor para la constante de disociación aparente (Kd) de cada anticuerpo usando GraphPad Prism v4 (GraphPad Software, San Diego, CA). Resulta evidente que la quimerización o humanización no afectó a la afinidad de unión de CD37-3, ya que todas las versiones compiten igualmente bien por la unión con el anticuerpo precursor murino. La CE50 de competición de unión para muCD37-3, chCD37-3, huCD37-3v1.0 o huCD37-3v1.01 corresponde a 0,8 nM, 0,7 nM, 1 nM y 0,6 nM, respectivamente.
Afinidad de unión de los anticuerpos humanizados
Los anticuerpos humanizados huCD37-38, huCD37-50, huCD37-51, huCD37-56 y chCD37-57 se ensayaron respecto de su afinidad de unión a células BJAB en comparación con sus homólogos murinos. Se llevaron a cabo ensayos de citometría de flujo usando anticuerpos de cabra anti-murino y anti-humano conjugados a FITC, se analizaron como se describe en el ejemplo 2 y se generaron curvas de respuesta a la dosis mediante regresión no lineal para cada anticuerpo. Se calculó el valor para la constante de disociación aparente (Kd) de cada anticuerpo usando GraphPad Prism v4 (GraphPad Software, San Diego, CA). Resulta evidente que la humanización no afectó en gran medida a la afinidad de unión de cualquiera de los anticuerpos. La Kd para muCD37-3 y huCD37-3 corresponde a 0,2 nM, mientras que la Kd para muCD37-38 y huCD37-38 corresponde a 0,4 nM y 0,3 nM, respectivamente. De manera similar, la Kd para muCD37-50 y huCD37-50 corresponde a 0,6 nM y 0,2 nM, respectivamente, mientras que la Kd para muCD37-51 y huCD37-51 corresponde a 0,6 nM y 0,8 nM, respectivamente. Finalmente, la Kd para muCD37-56 y huCD37-56 corresponde a 0,4 nM y 0,2 nM, respectivamente, mientras que la Kd para muCD37-57 y huCD37-57 corresponde a 1,0 nM y 0,3 nM, respectivamente.
Ejemplo 8
Expresión de CD37 de macaco
Se obtuvo la secuencia de AA de CD37 de CD37 de macaco de Genbank (GI: 718718). Se optimizaron los codones de la secuencia y se sintetizó por Blue Heron Biotechnology. Se construyó un plásmido de expresión pSRa-CD37mac que contenía la secuencia codificante completa (CDS) de CD37 de macaco flanqueada por sitios de restricción de Xbal y BamHI que permitieron la expresión de CD37 de macaco. Las células 300-19, una línea celular pre-B procedente de un ratón Balb/c (M. G. Reth et al. 1985, Nature, 317: 353-355), se transfectó con este plásmido de expresión para expresar de manera estable CD37 de macaco en la superficie celular.
Afinidad de unión de anticuerpos murinos a CD37 de macaco
Los anticuerpos murinos muCD37-3, muCD37-12, muCD37-38, huCD37-50, muCD37-51, muCD37-56 y muCD37-57 se ensayaron respecto de su capacidad para unirse a células 300-19/CD37mac que expresaban CD37 de macaco. Se llevaron a cabo ensayos de citometría de flujo usando anticuerpos de cabra anti-murino o de cabra anti-humano conjugados a FITC, analizados como se describe en el ejemplo 2. La unión se comparó con la del anticuerpo anti-Cd37 WR17 anteriormente descrito y del SMIP anti-CD37 TRU-016. Como puede observarse a partir de la figura 10A, varios anticuerpos aislados anti-CD37, muCD37-38, huCD37-50, muCD37-51, muCD37-56 y muCD37-57 pueden unirse al antígeno CD37 procedente de macaco. Por el contrario, muCD37-3, muCD37-12, el anticuerpo anti-CD37 WR17 anteriormente descrito y el SMIP anti-CD37 TRU-016 son incapaces de unirse al antígeno CD37 procedente de macaco.
A fin id a d de un ión de a n ticu e rp o s h u m a n iza d o s a C D 37 de m aca co
Los anticuerpos humanizados huCD37-38, huCD37-50, huCD37-51, huCD37-56 y huCD37-57 se ensayaron respecto de su afinidad de unión a células 300-19/CD37mac que expresaban CD37 de macaco. Se llevaron a cabo ensayos de citometría de flujo usando anticuerpos de cabra anti-humano conjugados a FTTC, se analizaron como se describe en el ejemplo 2 y se generaron curvas de respuesta a la dosis mediante regresión no lineal para cada anticuerpo. Se calculó el valor para la constante de disociación aparente (Kd) de cada anticuerpo usando GraphPad Prism v4 (GraphPad Software, San Diego, CA). Resulta evidente a partir de la figura 10B, que varios anticuerpos humanizados aislados se unen a CD37 de macaco, mientras que huCD37-3 no lo hace. El valor de Kd para huCD37-38, huCD37-50, huCD37-51, huCD37-56 y huCD37-57 corresponde a 1,1 nM, 1,8 nM, 14 nM, 5 nM y 2 nM, respectivamente. Por lo tanto, la humanización no afecta a la especificidad de unión de los anticuerpos aislados.
Ejemplo 9
Actividad proapoptótica de anticuerpos quiméricos y humanizados
Se evaluó la actividad proapoptótica de los anticuerpos quiméricos y humanizados en células Ramos. Las células se incubaron con una concentración 10 nM de anticuerpos o un anticuerpo de control de isotipo de huIgG durante 20 horas, seguido de tinción con anexina-V-FITC y TO-PRO-3 y análisis por citometría de flujo. ChCD37-12 conservó la fuerte actividad proapoptótica de muCD37-12. Aproximadamente un 40 % de las células Ramos son positivas para anexina V después del tratamiento con muCD37-12 o chCD37-12, en comparación con un 4 % de las células de control no tratadas. De manera similar, aproximadamente un 40 % de las células Ramos son positivas para anexina V después del tratamiento con el anticuerpo huCD37-3, huCD37-38, huCD37-50, huCD37-51, huCD37-56 o huCD37-57, en comparación con un 4 % de las células tratadas con control de isotipo o no tratadas. Por el contrario, el tratamiento con el anticuerpo anti-CD20 rituximab dio como resultado solo un 13% de células positivas para anexina V. Este resultado demuestra que la fuerte actividad proapoptótica de los anticuerpos murinos anti-CD37 aislados se conserva en este caso por los anticuerpos quiméricos o humanizados procedentes de los mismos. Por lo tanto, la propiedad funcional única de este grupo de anticuerpos anti-CD37, la fuerte actividad proapoptótica en ausencia de reticulación, no se ve afectada negativamente por la quimerización o humanización.
Actividad proapoptótica de huCD37-3 y TRU-016
Se comparó la actividad proapoptótica de huCD37-3 contra células de linfoma Ramos y Raji con el SMIP anti-CD37 TRU-016. TRU-016 se ha descrito como un compuesto sin actividad proapoptótica a menos que se reticule con un anticuerpo secundario. Resulta evidente que los anticuerpos anti-CD37 ejemplares huCD37-3 y chCD37-38 tienen una actividad proapoptótica mucho más fuerte contra ambas líneas celulares de linfoma. El tratamiento con huCD37-3 o chCD37-38 dio como resultado un 40 % o 49 % de células Ramos positivas para anexina V, en comparación con un 3 % de las células de control no tratadas. El tratamiento con rituximab dio como resultado tan solo un 15 % de células Ramos positivas para anexina V. Por el contrario, el tratamiento con TRU-016 no aumentó el porcentaje de células Ramos positivas para anexina V. Asimismo, El tratamiento con huCD37-3 o chCD37-38 dio como resultado un 34 % o 30 % de células Raji positivas para anexina V, en comparación con un 7 % de las células de control no tratadas. El tratamiento con rituximab dio como resultado tan solo un 19 % de células Raji positivas para anexina V. Por el contrario, el tratamiento con TRU-016 no aumentó el porcentaje de células Ramos positivas para anexina V.
Respuesta a la dosis para la actividad proapoptótica de los anticuerpos humanizados
Se incubaron diversas cantidades de cada anticuerpo con células Ramos durante 20 h, seguido de tinción para anexina V-FITC y TO-PRO-3 y análisis por citometría de flujo. Se representó el porcentaje de células positivas para anexina V frente a la concentración de anticuerpo en una gráfica semilogarítmica y se calcularon los valores de CE50 a partir de las curvas ajustadas usando análisis de regresión no lineal. Resulta evidente que todos los anticuerpos humanizados tienen una fuerte actividad proapoptótica, con un porcentaje máximo de células positivas para anexina V de al menos el 40 %. Figura 11. La Ce 50 para esta actividad corresponde a 0,08, 0,08 y 0,11 nM para huCD37-3, huCD37-38 y huCD37-50, respectivamente. Además, la CE50 para esta actividad corresponde a 0,41, 0,57 y 1,01 nM para huCD37-51, huCD37-56 y huCD37-57, respectivamente. Por el contrario, el tratamiento con el anticuerpo anti-CD20 rituximab dio como resultado un porcentaje máximo de células positivas para anexina V de tan solo el 15 %, en comparación con un 4 % de las células tratadas con el anticuerpo de control de isotipo.
Ejemplo 10
Ensayos de proliferación para los anticuerpos anti-CD37 quiméricos y humanizados
Se midió la capacidad de los anticuerpos quiméricos y humanizados anti-CD37 para inhibir el crecimiento celular usando ensayos de citotoxicidad in vitro, como se describe en el ejemplo 4. Los resultados de un ensayo de proliferación típico usando células de linfoma SU-DHL-4 y DOHH-2 se presentan en la figura 12. Resulta evidente, que todos los anticuerpos murinos fueron capaces de inhibir sustancialmente la proliferación de células SU-DHL-4 y de una manera dependiente de la dosis. Por ejemplo, el tratamiento con muCD37-3 redujo la viabilidad de las células SU-DHL-4 en un 35% con una CE50 de 0,07 nM. De manera similar, el tratamiento con chCD37-3, huCD37-3v1.0 o huCD37-3v1.01 redujo la viabilidad de las células SU-DHL-4 a aproximadamente el 30 % a la mayor concentración de anticuerpo ensayada, con una CE50 de 0,03 nM, 0,06 nM o 0,03 nM, respectivamente. Asimismo, todos los anticuerpos murinos fueron capaces de inhibir sustancialmente la proliferación de las células de linfoma folicular DOHH-2 y de una manera dependiente de la dosis. Por ejemplo, el tratamiento con muCD37-3 redujo la viabilidad de las células DOHH-2 en un 45 % con una CE50 de 0,05 nM. De manera similar, el tratamiento con chCD37-3, huCD37-3v1.0 o huCD37-3v1.01 redujo la viabilidad de las células DOHH-2 a aproximadamente el 35%, con una CE50 de 0,06 nM, 0,07 nM o 0,05 nM, respectivamente. Este resultado demuestra que las diversas versiones del anticuerpo CD37-3 tienen una actividad antiproliferativa similar, que no se ve afectada por la quimerización o la humanización.
Se evaluaron anticuerpos anti-CD37 humanizados adicionales en ensayos de citotoxicidad in vitro similares. Todos los anticuerpos humanizados ensayados fueron capaces de inhibir sustancialmente la proliferación de células SU-DHL-4 y de una manera dependiente de la dosis. Por ejemplo, el tratamiento con huCD37-38 redujo la viabilidad de las células SU-DHL-4 en un 24 % con una CE50 de 0,42 nM, mientras que el tratamiento con huCD37-50 redujo la viabilidad de las células SU-DHL-4 en un 31 % con una CE50 de 0,39 nM. Por el contrario, el tratamiento con el anticuerpo anti-CD20 rituximab redujo la viabilidad de las células SU-DHL-4 a un 35% con una CE50 de 1,6 nM. Además, el tratamiento con huCD37-51 o huCD37-56 redujo la viabilidad de las células SU-DHL-4 en un 24 % con una CE50 de 0,60 nM o 0,68 nM, respectivamente. Además, el tratamiento con huCD37-57 redujo la viabilidad de las células SU-DHL-4 en un 31 % con una CE50 de 0,42 nM. El tratamiento con un anticuerpo de control de isotipo no tuvo efecto en la viabilidad de las células SU-DHL-4.
Actividad antiproliferativa de huCD37-3 en comparación con otros anticuerpos
Para caracterizar adicionalmente la actividad antiproliferativa de los anticuerpos anti-CD37 aislados, se comparó el efecto del anticuerpo ilustrativo huCD37-3 con la del compuesto SMIP anti-CD37 TRU-16. La inmunohistoquímica usando micromatrices de tumor confirmó que CD37 y CD20 mostraron patrones de expresión y prevalencias similares en los subtipos de NHL. Véase la tabla 12 a continuación. Por lo tanto, también se efectuaron comparaciones con el anticuerpo anti-CD20 rituximab. El panel de líneas celulares incluyó células de linfoma Granta-519, SU-DHL-4, Namalwa y Daudi. Figura 13.
Tabla 12: Tinción de CD37 en micromatrices de tumor de linfoma en com aración con la tinción de CD20
Figure imgf000063_0001
En todos los casos, el tratamiento con huCD37-3 dio como resultado una reducción en la viabilidad celular de una manera dependiente de la dosis. Por ejemplo, el tratamiento con huCD37-3 redujo la viabilidad de células Granta-519 a aproximadamente un 37 %, con una CE50 de 0,062 nM. El tratamiento con rituximab redujo la viabilidad de células Granta-519 a aproximadamente un 47 %, con una CE50 de 0,36 nM. El tratamiento con huCD37-3 redujo la viabilidad de las células SU-DHL-4 a aproximadamente un 17 % con una CE50 de 0,053 nM. El tratamiento con rituximab redujo la viabilidad de las células SU-DHL-4 a aproximadamente el 20 %, con una CE50 de 0,2 nM. Sorprendentemente, el tratamiento con TRU-016 no redujo la viabilidad de las células Granta-519 o SU-DHL-4 en un grado significativo o de una manera dependiente de la dosis. En ejemplos adicionales, el tratamiento con huCD37-3 redujo la viabilidad de células Namalwa a aproximadamente un 47 %, con una CE50 de 0,1 nM y redujo la viabilidad de células Daudi a aproximadamente el 68 %, con una CE50 de 0,25 nM. El tratamiento con Rituximab no tuvieron un efecto en células Namalwa, pero redujo la viabilidad de células Daudi a aproximadamente el 69 %, con una CE50 de 2,6 nM. Sorprendentemente, el tratamiento con TRU-016 no redujo la viabilidad de las células Namalwa o Daudi en un grado significativo o de una manera dependiente de la dosis. Finalmente, el tratamiento con huCD37-3 redujo la viabilidad de las células Ramos a aproximadamente un 53 % con una CE50 de 0,08 nM, mientras que ni el tratamiento con TRU-016 ni con rituximab tuvo efecto alguno en la viabilidad de células ramos. Este resultado resalta la unicidad de la actividad antiproliferativa de los anticuerpos anti-CD37 aislados.
Ejemplo 11
A c tiv id a d C D C de los a n ticu e rp o s an ti-C D 37
Para evaluar la actividad de citotoxicidad dependiente de complemento (CDC) de los anticuerpos anti-CD37 quiméricos y humanizados, se llevaron a cabo ensayos a base de células de acuerdo con un método publicado (Gazzano-Santoro H, J Immunol Methods. 1997202(2):163-71). Se separaron los anticuerpos en partes alícuotas por duplicado a 50 pl/pocillo en una placa de cultivo tisular de fondo plano de 96 pocillos a diversas concentraciones, normalmente en el intervalo de 5 pg/ml (= 3,3 x 10-8 M) a 2,3 ng/ml (= 1,5 x 10-11 M) en medio RHBP (RPMI-1640, HEPES 20 mM, BSA al 0,1 %, 1 % de penicilina/estreptomicina). Se añadieron células diana a los anticuerpos a razón de 5 x 104 células en 100 pl de medio RHBP por pocillo. Se reconstituyó complemento humano liofilizado (Sigma-Aldrich, St. Louis, EE. UU.) con 1 ml de agua purificada estéril por vial y se diluyó 5 veces hasta un volumen madre del 20 % con medio RHBP inmediatamente antes de su uso. Se añadieron 50 pl/pocillo de solución de complemento a cada pocillo para una concentración final del 5 %. Las placas se incubaron durante 2 h a 37 °C en una incubadora humidificada con un 5 % de CO2 para permitir la lisis mediada por complemento. Después de este tiempo de incubación, se añadió reactivo Alamar Blue (Invitrogen) a cada pocillo a una concentración final del 10 % para medir la viabilidad de las células restantes. La placa se incubó durante 16 a 20 horas a 37 °C antes de medir la fluorescencia (en unidades relativas de fluorescencia, URF) a EX540/EM590 nm. Los controles incluyeron pocillos triplicados con medio y complemento pero sin células (solo medio, 0 % de viabilidad) y pocillos con células y complemento pero sin anticuerpo (solo células, 100 % de viabilidad). Se determinó el porcentaje de viabilidad celular específica para cada muestra mediante la siguiente fórmula: Porcentaje de viabilidad = (muestra - solo medio)/ (solo células - solo medio).
En la figura 14 se presenta el resultado de un ensayo de CDC ejemplar usando células Ramos. Sorprendentemente, chCD37-12 tiene una potente actividad de CDC contra células Ramos. Redujo la viabilidad de las células ramos a un 32 % a la máxima concentración de anticuerpo ensayada con una CE50 de 0,037 pg/ml. Además, varios anticuerpos aislados mostraron actividad CDC contra Ramos en diverso grado. El tratamiento con huCD37-3, huCD37-38, huCD37-50 dio como resultado una reducción en la viabilidad celular al 59 %, 50 % y 45 %, respectivamente. El tratamiento con huCD37-51, huCD37-56 o huCD37-56 redujo de manera moderada la viabilidad celular de las células Ramos a aproximadamente el 70 - 80 % a la concentración máxima de anticuerpo ensayada.
Ejemplo 12
Actividad ADCC de los anticuerpos anti-CD37
Se usó un ensayo de liberación de lactato deshidrogenasa (LDH) para medir la citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpo (ADCC) de líneas de células tumorales usando linfocitos citolíticos naturales (NK) recién aislados como células efectoras (Shields RL, J Biol Chem. 2001 276(9):6591-604). En primer lugar, se aislaron células NK de sangre humana de un donante normal (Research Blood Components, Inc., Brighton, MA) usando un protocolo modificado para el kit de aislamiento de NK II (Miltenyi Biotech, 130-091-152). La sangre se diluyó 2 veces con PBS 1x. Se dispusieron cuidadosamente en capas 25 ml de sangre diluida sobre 25 ml de Ficoll Paque en un tubo cónico de 50 ml y se centrifugó a 400 g durante 45 min a TA. Las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) se recogieron de la interfaz, se transfirieron a un nuevo tubo cónico de 50 ml y se lavaron una vez con PBS 1x. Las PBMC se resuspendieron en 2 ml de tampón de aislamiento de NK (PBS 1x, BSA al 0,5 %, EDTA 2 mM) y después se añadieron 500 pl de cóctel de biotina-anticuerpo a la suspensión celular. El cóctel de biotina-anticuerpo contiene anticuerpos biotinilados que se unen a los linfocitos, excepto a las células NK, lo que da como resultado una selección negativa de células NK. La mezcla se incubó a 4 °C durante 10 min y después se añadieron 1,5 ml de tampón de aislamiento de NK y 1 ml de microperlas anti-biotina. La mezcla de células-anticuerpo se incubó durante otros 15 min a 4 °C. A continuación, se lavaron las células una vez con 50 ml de tampón de aislamiento de NK y se resuspendieron en 3 ml de tampón de aislamiento de NK. Después, se montó una columna de MACS LS en el separador autoMACS (Miltenyi Biotech) y se prelavó con 3 ml de tampón de aislamiento de NK. La suspensión celular se aplicó automáticamente sobre la columna, se lavó y se recogió la fracción efluente con células NK no marcadas en un nuevo tubo cónico de 50 ml. Las células NK resultantes se sembraron en 30 ml de medio RPMI completo (RPMI-1640 complementado con suero fetal bovino al 5 %, 1 % de penicilina/estreptomicina, HEPES 1 mM, piruvato de sodio 1 mM, solución de aminoácidos no esenciales MEM 100X al 1 %) durante una noche. El ensayo posterior y todas las diluciones se llevaron a cabo en medio RHBP (medio RPMI-1640 complementado con HEPES 20 mM, pH 7,4, BSA al 0,1 % y penicilina-estreptomicina al 1 %).
Se separaron en partes alícuotas varias concentraciones de anticuerpos en medio RHBP por duplicado a 50 pl/pocillo en una placa de 96 pocillos de fondo redondo. Las células diana se resuspendieron a razón de 106 células/ml en medio RHBP y se añadieron 100 pl/pocillo a cada pocillo que contenía diluciones de anticuerpo. Se incubó la placa que contenía células diana y diluciones de anticuerpo durante 30 min a 37 °C. Después, se añadieron a los pocillos las células NK que contenían las células diana a 50 pl/pocillo. La relación típica fue de 1 célula diana por cada 3-4 células NK. Se configuraron los siguientes controles para cada experimento: solo células NK, solo células diana (liberación espontánea de LDH), células diana con células NK (liberación de LDH independiente de anticuerpo), células diana con Triton X-100 al 10 % (liberación máxima de LDH). Las mezclas se incubaron a 37 °C durante 4 h para permitir la lisis celular. Las placas se centrifugaron durante 10 min a 1200 rpm y se transfirieron cuidadosamente 100 pl del sobrenadante a una nueva placa de 96 pocillos de fondo plano. Se añadió a cada pocillo la mezcla de reacción de LDH (100 |jl/pocillo) del kit de detección de citotoxicidad (Roche 1644 793) y se incubó a temperatura ambiente durante 5 a 30 min. Se midió la densidad óptica de las muestras a 490 nm (DO490). Se determinó el porcentaje de lisis específica de cada muestra usando la siguiente fórmula: porcentaje de lisis específica = (valor de la muestra -liberación espontánea)/ (liberación máxima - liberación espontánea) *100.
La incubación con anticuerpos humanizados da lugar a una buena actividad ADCC contra células de linfoma Daudi, Ramos y Granta-519 en presencia de células efectoras NK humanas. Se comparó su actividad ADCC contra células de linfoma Daudi con la actividad ADCC de TRU-016 (figura 15).
El tratamiento con los anticuerpos huCD37-3, huCD37-38 o huCD37-50 dio como resultado aproximadamente un 41 %, 39% o 40% de lisis de células Daudi, con un valor de CE50 de 0,42 ng/ml, 1,31 ng/ml o 2,42 ng/ml, respectivamente. Esta actividad fue similar a la resultante del tratamiento con TRU-016, observándose un 42 % de lisis de células Daudi y un valor de CE50 de 0,93 ng/ml. Además, el tratamiento con huCD37-51, huCD37-56 y huCD37-57 dio como resultado aproximadamente un 39 %, 36 % o 36 % de lisis de células Daudi, con un valor de CE50 de 5,7 ng/ml, 4,3 ng/ml o 7,9 ng/ml, respectivamente.
Se comparó la actividad ADCC de los anticuerpos aislados contra células de linfoma Ramos con la actividad ADCC de TRU-016. El tratamiento con los anticuerpos huCD37-3, huCD37-38 o huCD37-50 dio como resultado aproximadamente un 43 %, 42 % o 46 % de lisis de células Ramos, con un valor de CE50 de 0,95 ng/ml, 2,0 ng/ml o 3,0 ng/ml, respectivamente. Esta actividad fue similar a la resultante del tratamiento con TRU-016, observándose un 59 % de lisis de células Ramos y un valor de CE50 de 1,53 ng/ml. Además, el tratamiento con huCD37-51, huCD37-56 y huCD37-57 dio como resultado aproximadamente un 53 %, 43 % o 44 % de lisis de células Ramos, con un valor de CE50 de 5,7 ng/ml, 4,3 ng/ml o 7,9 ng/ml, respectivamente.
En experimentos adicionales, se comparó la actividad ADCC de huCD37-3 y chCD37-38 contra células Granta-519 con la actividad ADCC de TRU-016. El tratamiento con los anticuerpos huCD37-3 o chCD37-38 dio como resultado una lisis celular de aproximadamente el 19 % o 18 % de células Granta-519 con un valor de CE50 de 0,13 ng/ml o 0,73 ng/ml, respectivamente. El tratamiento con TRU-016 dio como resultado una lisis celular observada de células Granta-519 del 16 %, con un valor de CE50 de 0,83 ng/ml.
Ejemplo 13
Mapeo de epítopos
La localización de los requisitos de aminoácidos para los epítopos de diferentes anticuerpos anti-CD37 puede ayudar a relacionar características funcionales comunes o únicas con las interacciones moleculares específicas. El dominio extracelular de CD37 contiene dos bucles extracelulares, un bucle pequeño de aproximadamente 18 restos y uno mayor que consta de aproximadamente 135 aminoácidos. No se han descrito los requisitos de epítopos para los anticuerpos contra CD37 anteriormente publicados. Para caracterizar adicionalmente los anticuerpos contra CD37 aislados de la presente invención, se construyeron varias variantes de antígeno de CD37 con sustitución de AA en el bucle extracelular más grande.
Clonación y expresión de variante de CD37
Se construyeron plásmidos de expresión de mamífero que contenían las secuencias de ADNc de CD37 completo humano o de macaco, se optimizaron sus codones y se sintetizaron por Blue Heron Biotechnologies y se flanquearon por los sitios de restricción de XbaI y BanHI para facilitar la clonación en el sitio de clonación múltiple del vector pSRa. Debido a que las secuencias de CD37 de humano y de macaco son altamente homólogas (figura 16), la expresión de estas construcciones pudo distinguir los anticuerpos con reactividad cruzada de ser humano y de macaco de aquellos que reconocían epítopos que requerían al menos una de las 11 diferencias de aminoácidos de CD37 extracelulares entre estas dos especies, como se describe en el ejemplo 8.
Para caracterizar adicionalmente los epítopos del anticuerpo CD37, se construyó una serie de construcciones de CD37 murinas y humanas quiméricas. Debido al tamaño y la alta homología del bucle extracelular pequeño de CD37, los esfuerzos de localización de epítopos se limitaron al bucle extracelular grande. Se rediseñó un casete de EcoRV para Pst1 que codificaba los restos I108 a Q235 del bucle extracelular grande para segmentarse adicionalmente en 5 secciones incorporando 4 sitios de restricción únicos que podrían estar conservadas entre las secuencias de CD37 de humano, murino y de macaco (figura 17). Se crearon las siguientes construcciones de CD37 humanas y quiméricas de ratón:
hC D 37-M 1
M SAQESCLSLIKYFLFVFNLFFFVLGSLIFCFGIW ILIDKTSFVSFVGLAFVPLQIW SKVLAISGIFTM
GIALLGCVGALKELRCLLGLYFGM LLLLFATQITLGILISTQRVRLERRVQELVLRTIQSYRTNPDE
TAAEESW DYVQFQLRCCGW HYPQDW FQVLILRGNGSEAHRVPCSCYNLSATNDSTILDKVILPQ
LSRLGHLARSRHSADICAVPAESHIYREGCAQGLQKW LHNNLISIVGICLGVGLLELGFM TLSIFL
CRNLDHVYNRLARYR (SEQ ID NO: 180)
hCD37-M2
M SAQESCLSLIKYFLFVFNLFFFVLGSLIFCFGIW ILIDKTSFVSFVGLAFVPLQIW SKVLAISGIFTM
GIALLGCVGALKELRCLLGLYFGM LLLLFATQITLGILISTQRAQLERSLRDVVEKTIQKYGTNPEE
TAAEESW DYAQFQLRCCGW QSPRDW NKAQM LKANESEEPRVPCSCYNLSATNDSTILDKVILPQ
LSRLGHLARSRHSADICAVPAESHIYREGCAQGLQKW LHNNLISIVGICLGVGLLELGFM TLSIFL
CRNLDHVYNRLARYR (SEQ ID NO:181)
hCD37-M3
M SAQESCLSLIKYFLFVFNLFFFVLGSLIFCFGIW ILIDKTSFVSFVGLAFVPLQIW SKVLAISGIFTM
GIALLGCVGALKELRCLLGLYFGM LLLLFATQITLGILISTQRAQLERSLRDVVEKTIQKYGTNPEE
TAAEESW DYVQFQLRCCGW HYPQDW FQVLILRGNGSEAHRVPCSCYNSTATNDSTVFDKLFFS
QLSRLGHLARSRHSADICAVPAESHIYREGCAQGLQKW LHNNLISIVGICLGVGLLELGFM TLSIF
LCRNLDHVYNRLARYR (SEQ ID NO: 182)
hCD37-M45
M SAQESCLSLIKYFLFVFNLFFFVLGSLIFCFGIW ILIDKTSFVSFVGLAFVPLQIW SKVLAISGIFTM
GIALLGCVGALKELRCLLGLYFGM LLLLFATQITLGILISTQRAQLERSLRDVVEKTIQKYGTNPEE
TAAEESW DYVQFQLRCCGW HYPQDW FQVLILRGNGSEAHRVPCSCYNLSATNDSTILDKVILPQ
LSRLGPRAKLRQTADICALPAKAHIYREGCAQSLQKW LHNNLISIVGICLGVGLLELGFM TLSIFL
CRNLDHVYNRLARYR (SEQ ID NO: 183)
muCD37-R176
ISTQRVRLERRVQELVLRTIQSYRTNPDETAAEESW DYAQFQLRCCGW QSPRDW NKAQM LKAN
ESEEPRVPCSCYNSTATNDSTVFDKLFFSQLSRLGPRAKLRQTADICALPAKAHIYREGCAQSLQ
(SEQ ID NO: 184).
A fin de reservar uno de dichos sitios de restricción, Kpn1, se incluyó R176 humano en todas las construcciones quiméricas murinas/humanas. Los casetes de CD37 murinos y humanos se encargaron de Blue Heron y se clonaron en el vector pSRa junto con un fragmento del extremo 5' de la construcción de CD37 humana original generada mediante la PCR para incorporar el sitio de EcoRV y el fragmento de restricción de Pst1 a XbaI del extremo 3' tomado de la construcción de CD37 de macaco original. Después, se construyeron los casetes de CD37 murinos y humanos quiméricos usando digestiones y ligamientos de restricción estándar aprovechando los sitios de restricción comunes únicos.
La variante hCD37-M1 se creó insertando un fragmento de restricción de EcoRV-SacII que codificaba los AA S109 a A138 de la secuencia de CD37 murino análoga. De manera similar, la variante hCD37-M3 se creó insertando un fragmento de restricción de KpnI-Blp1 que codificaba los AA V177 a L201 de la secuencia de CD37 murino análoga. La variante hCD37-M45 se creó insertando un fragmento de restricción de Blp1-PstI que codificaba los AA S202 a 1243 de la secuencia de CD37 murino análoga. Los clones resultantes se verificaron mediante digestión con enzimas de restricción, seguido de secuenciación de ADN.
Se obtuvieron líneas celulares estables mediante transfección de los plásmidos de expresión de variante de CD37 humano quimérico en células 300-19 usando procedimientos de electroporación convencionales. Brevemente, se electroporaron 5 x 106 células 300-19 en medio RPMI-1640 frío usando un dispositivo BioRad Gene Pulser ajustado a 260V y 960 |j F. Posteriormente, se diluyeron las células y se sembraron en placas de 96 pocillos en medio RpMI-1640 complementado con FBS al 10 % y p-mercaptoetanol 50 j M. Después de 24 horas, se añadió G418 (Invitrogen) a una concentración final de 2 mg/ml para seleccionar respecto de células transfectadas. Después de 2 semanas, se aislaron colonias individuales, se analizó su expresión superficial de CD37 mediante citometría de flujo y se expandieron.
Unión de anticuerpos a variantes de CD37
Se analizó la unión de diversos anticuerpos anti-CD37 a células que expresan CD37 humano de tipo silvestre mediante citometría de flujo usando 1,5 jg/ml de cada anticuerpo. Se compararon los anticuerpos aislados de la presente invención con el anticuerpo WR17 anti-CD37 disponible comercialmente, así como con el SMIP TRU-016. Como puede observarse en la figura 18A, todos los anticuerpos se unieron a células que expresan CD37 de tipo silvestre. Asimismo, todos los anticuerpos ensayados se unieron a la variante hCD37-M3 (figura 18B). Por el contrario, los anticuerpos aislados de la presente invención se unieron a la variante hCD37-M1, mientras que TRU-016 y WR17 fueron incapaces de unirse a la variante hCD37-M1 (figura 19A). Los anticuerpos CD37-50 y CD37-51 y Tr U-016 también fueron capaces de unirse a la variante hCD37-M45. WR17 mostró unión parcial a la variante hCD37-M45, mientras que los otros anticuerpos, CD37-3, CD37-12, CD37-38, CD37-56 y CD37-57 fueron incapaces de unirse (figura 19B). Esto sugiere que todos los anticuerpos aislados de la presente invención no requieren los 12 restos de AA en la variante hCD37-M1 que se cambiaron a los restos de AA murinos correspondientes para su unión al antígeno de CD37. Por el contrario, los anticuerpos CD37-3, CD37-12, CD37-38, CD37-56 y CD37-57 requieren al menos uno de los 10 restos de AA en la variante hCD37-M45 que se cambiaron a los restos de AA murinos correspondientes para la unión al antígeno de CD37.
Este resultado inesperado indica que los anticuerpos aislados de la presente invención representan una nueva clase de anticuerpos anti-CD37 con una combinación única de características funcionales.
Además, se construyen construcciones similares siguiendo el mismo diseño. Las construcciones contienen diversas combinaciones de secuencias murinas, humanas y/o de macaco que codifican el bucle extracelular grande de CD37 (véase la figura 17). Los ejemplos de construcciones con una sola sección humana insertada en el bucle extracelular grande murino son:
hCD37mECD-H1:
M SAQESCLSLIKYFLFVFNLFFFVLGSLIFCFGIW ILIDKTSFVSFVGLAFVPLQIW SKVLAISGIFTM
GIA FFG CV G A FK EFRCFFG FY FG M FFFFFA TQ ITFG IFISTQ RA Q FERSFRD V V EK TIQ K Y G TN PEE
TAAEESW DYAQFQFRCCGW QSPRDW NKAQM FKANESEEPRVPCSCYNSTATNDSTVFDKFFFS
QFSRFGPRAKFRQ TADICAFPAKAHIYREGCAQSLQKW FHN NFISIVGICFGVG FFEFGFM TFSIF
FCRNFDHV YNRFA RY (SEQ ID NO: 185)
hCD37mECD-H2:
M SAQESCFSFIKYFFFVFNFFFFVFGSFIFCFGIW IFIDKTSFVSFVG FAFVPFQIW SKV FAISG IFrM
G IA FFG CV G A FKEFRCFFGFYFGM FFFFFATQITFGIFISTQRVRFERRVQEFVFRTIQSYRTNPDE
TAAEESW DYVQFQLRCCGW HYPQDW FQVLILRGNGSEAHRVPCSCYNSTATNDSTVFDKLFFS
QFSRFGPRAKFRQ TADICAFPAKAHIYREGCAQSFQ KW FHNN FISIV GICFG VGFFEFGFM TFSIF
FCRNFDHVYNRFARYR (SEQ ID NO: 186)
hC D 37 m E C D -H 3 :
M SAQESCLSLIKYFLFVFNLFFFVLGSLIFCFGIW ILIDKTSFVSFVGLAFVPLQIW SKVLAISGIFTM
G IA FFG CV G A FK EFRCFFGFYFGM FFFFFATQITFGIFISTQRVRFERRVQEFVFRTIQSYRTNPDE
TAAEESW DYAQFQFRCCGW QSPRDW NKAQM FKANESEEPRVPCSCYNFSATNDSTIFDKVIFPQ
LSRLGPRAKERQTADICALPAKAHIYREGCAQSEQKW EHNNEISIVGICEGVGLEEEGFM TLSIFL
CRNEDHVYNREARYR (SEQ ID NO: 187)
hCD37mECD-H4:
M SAQESCLSLIKYFLFVFNLFFFVLGSLIFCFGIW ILIDKTSFVSFVGLAFVPLQIW SKVLAISGIFrM
GIALLGCVGALKELRCLLGLYFGM LLLLFATQITLGILISTQRVRLERRVQELVLRTIQSYRTNPDE
TAAEESW DYAQFQLRCCGW QSPRDW NKAQM LKANESEEPRVPCSCYNSTATNDSTVFDKLFFS
QLSRLGHLARSRHSADICALPAKAHIYREGCAQSLQKW LHNNLISIVGICLGVGLLELGFM TLSIF
LCRNLDHVYNRLARYR (SEQ ID NO: 188)
hCD37mECD-H5
M SAQESCLSLIKYFLFVFNLFFFVLGSLIFCFGIW ILIDKTSFVSFVGLAFVPLQIW SKVLAISGIFrM
GIALLGCVGALKELRCLLGLYFGM LLLLFATQITLGILISTQRVRLERRVQELVLRTIQSYRTNPDE
TAAEESW DYAQFQLRCCGW QSPRDW NKAQM LKANESEEPRVPCSCYNSTATNDSTVFDKLFFS
QLSRLGPRAKLRQTADICAVPAESHIYREGCAQGLQKW LHNNLISIVGICLGVGLLELGFM TLSIF
LCRNLDHVYNRLARYR (SEQ ID NO: 189)
y hCD37mECD-H45
M SAQESCLSLIKYFLFVFNLFFFVLGSLIFCFGIW ILIDKTSFVSFVGLAFVPLQIW SKVLAISGIFrM
GIALLGCVGALKELRCLLGLYFGM LLLLFATQITLGILISTQRVRLERRVQELVLRTIQSYRTNPDE
TAAEESW DYAQFQLRCCGW QSPRDW NKAQM LKANESEEPRVPCSCYNSTATNDSTVFDKLFFS
QLSRLGHLARSRHSADICAVPAESHIYREGCAQGLQKW LHNNLISIVGICLGVGLLELGFM TLSIF
LCRNLDHVYNRLARYR (SEQ ID NO: 190).
Los ejemplos adicionales son construcciones con una sola sección de macaco insertada en la secuencia del bucle extracelular grande, tales como:
hCD37-Mac12:
M SAQESCLSLIKYFLFVFNLFFFVLGSLIFCFGIW ILIDKTSFVSFVGLAFVPLQIW SKVLAISGIFrM
GIALLGCVGALKELRCLLGLYFGM LLLLFATQITLGILISTQRAQLERSLQDIVEKTIQRYHTNPEE
TAAEESW DYVQFQLRCCGW HSPQDW FQVLTLRGNGSEAHRVPCSCYNLSATNDSTILDKVILPQ
LSRLGHLARSRHSADICAVPAESHIYREGCAQGLQKW LHNNLISIVGICLGVGLLELGFM TLSIFL
CRNLDHVYNRLARYR (SEQ ID NO: 191)
hC D 37-M ac4 :
M SAQESCLSLIKYFLFVFNLFFFVLGSLIFCFGIW ILIDKTSFVSFVGLAFVPLQIW SKVLAISGIFTM
G IA FFG CV GA FKEFRCLFG FYFGM FFFFFATQITFGIFISTQ RAQ FERSFRDV VEKTIQ KYGTN PEE
TAAEESW DYVQFQLRCCGW HYPQDW FQVLILRGNGSEAHRVPCSCYNLSATNDSTILDKVILPQ
LSRLGQLARSRHSTDICAVPAESHIYREGCAQGLQKW LHNNLISIVGICLGVGLLELGFM TLSIFLC
RNLDHVYNRLARYR (SEQ ID NO: 192)
hCD37-Mac5:
M SAQESCLSLIKYFLFVFNLFFFVLGSLIFCFGIW ILIDKTSFVSFVGLAFVPLQIW SKVLAISGIFTM
GIALLGCVGALKELRCLLGLYFGM LLLLFATQITLGILISTQRAQLERSLRDVVEKTIQKYGTNPEE
TAAEESW DYVQFQLRCCGW HYPQDW FQVLILRGNGSEAHRVPCSCYNLSATNDSTILDKVILPQ
LSRLGHLARSRHSADICAVPANSHIYREGCARSLQKW LHNNLISIVGICLGVGLLELGFM TLSIFLC
RNLDHVYNRLARYR (SEQ ID NO: 193)
y hCD37-Mac45:
M SAQESCLSLIKYFLFVFNLFFFVLGSLIFCFGIW ILIDKTSFVSFVGLAFVPLQIW SKVLAISGIFTM
GIALLGCVGALKELRCLLGLYFGM LLLLFATQITLGILISTQRAQLERSLRDVVEKTIQKYGTNPEE
TAAEESW DYVQFQLRCCGW HYPQDW FQVLILRGNGSEAHRVPCSCYNLSATNDSTILDKVILPQ
LSRLGQLARSRHSTDICAVPANSHIYREGCARSLQKW LHNNLISIVGICLGVGLLELGFM TLSIFLC
RNLDHVYNRLARY (SEQ ID NO: 194).
Además, se generaron mutaciones puntuales individuales en la secuencia del bucle extracelular grande humano para identificar restos importantes para la unión del anticuerpo.
La unión de agentes de unión a CD37 a células que expresan las SEQ ID NO: 185-194 se analiza mediante citometría de flujo como se ha descrito anteriormente.
Ejemplo 14
Preparación de huCD37-3-SPP-DM1
El enlazador de 4-(2-piridiltio)pentanoato de N-succinimidilo (SPP) se disolvió en etanol. El anticuerpo huCD37-3 se incubó a 5 mg/ml con un exceso molar de 7 veces de enlazador SPP durante aproximadamente 100 minutos a temperatura ambiente en tampón de fosfato potásico 50 mM (pH 6,5) que contenía NaCl 50 mM, EDTA 2 mM y etanol al 5 %. La mezcla de reacción se purificó usando una columna SEPHADEX™ G25F equilibrada con el tampón de fosfato de potasio anteriormente mencionado. Las fracciones que contenían anticuerpo se agruparon y se usaron para las etapas posteriores.
Se disolvió el maitansinoide DM1 en dimetilacetamida (DMA, la concentración final es del 3 %) y se añadió gota a gota un exceso molar de 1,7 veces en relación con el enlazador al anticuerpo modificado con SPP. Después de incubar durante una noche a temperatura ambiente, se purificó el anticuerpo conjugado mediante cromatografía en una columna SEPHADEX™ g 25F equilibrada en suero salino tamponado con fosfato (PBS), pH 6,5. Después, se dializó el conjugado huCD37-3-SPP-DM1 en tampón que contenía histidina 10 mM, glicina 250 mM, sacarosa al 1 % a pH 5,5. Se determinó el número de moléculas de DM1 unidas por molécula de anticuerpo usando los coeficientes de extinción anteriormente comunicados para el anticuerpo y d M1 (Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93, 8618-8623 (1996)). Se determinó el porcentaje de maitansinoide libre después de la reacción de conjugación inyectando 20-50 |jg de conjugado en una columna HiSep equilibrada en acetonitrilo al 25 % en tampón de acetato de amonio 100 mM, pH 7,0 y eluyendo en acetonitrilo. Se midió el área de pico de las especies de maitansinoide libres (eluidas en el gradiente e identificadas por comparación del tiempo de elución con patrones conocidos) usando un detector de absorbancia configurado a una longitud de onda de 252 nm y se comparó con el área de pico relacionada con el maitansinoide unido (eluido en el pico de conjugado en las fracciones de flujo pasante de la columna) para calcular el porcentaje de especies de maitansinoide libres totales. Se obtuvieron conjugados con 3,5-4 moléculas de DM1 por anticuerpo huCD37-3, estando < 1 % presente como maitansinoide no conjugado.
Preparación de huCD37-3-SMCC-DM1
Se disolvió el enlazador de 4-(N-maleimidometil)-cidohexano-1-carboxilato de succinimidilo (SMCC, Pierce Biotechnology, Inc.) en DMA. Se modificó el anticuerpo huCD37-3 con SMCC para introducir maleimidas en el anticuerpo mediante la incubación del anticuerpo a 5 mg/ml en fosfato de potasio 50 mM, NaCl 50 mM, EDTA 2 mM, pH 6,5 con un exceso 10 molar de SMCC. Después de aproximadamente 100 minutos a temperatura ambiente, se purificó la mezcla de reacción usando una columna SEPHADEX™ G25 equilibrada con el mismo tampón de fosfato de potasio. Las fracciones que contenían anticuerpo se agruparon y se usaron para las etapas posteriores.
Se hizo reaccionar el anticuerpo modificado con SMCC con una solución 10 mM de DM 1 a un exceso de 1,7 molar en relación con el enlazador de maleimida. La reacción se agitó a temperatura ambiente durante aproximadamente 18 horas. La mezcla de reacción de conjugación se filtró a través de una columna de filtración en gel SEPHADEX™ G25 equilibrada con PBS 1 x a pH 6,5. Después, se dializó el conjugado huCD37-3-SMCC-DM1 en tampón que contenía histidina 10 mM, glicina 250 mM, sacarosa al 1 % a pH 5,5. Se determinó como se ha descrito anteriormente el número de moléculas de DM1 unidas por molécula de anticuerpo y el porcentaje de especies de maitansinoide libres totales. Se obtuvieron conjugados con 3,5-4 moléculas de DM1 por anticuerpo huCD37-3, estando < 1 % presente como maitansinoide no conjugado.
Preparación de huCD37-3-sulfo-mal-DM4
Se prepararon soluciones de DM4 tiol y el enlazador heterobifuncional de ácido 1-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)-4-(2,5-dioxopirrolidin-1-iloxi)-4-oxobutano-2-sulfónico (3-sulfo-mal) en N,N-dimetilacetamida (DMA) a concentraciones de 30-60 mM. Se mezclaron entre sí el enlazador y DM4 en DMA que contenía hasta un 40 % v/v de tampón succinato 200 mM, EDTA 2 mM, pH 5,0 para dar una relación de DM4 a enlazador de 1,6 y una concentración final de DM4 igual a 15 mM. Después del mezclado, se dejó la reacción durante 2 h y se añadió a una mezcla de anticuerpo huCD37-3 en tampón fosfato (pH 7,5) en condiciones finales de conjugación de 4 mg/ml de Ab, tampón fosfato al 90 %/DMA al 10 %, pH 7,5. Se dejó proceder la reacción de conjugación a temperatura ambiente durante 2 h. El conjugado huCD37-3-sulfo-mal-DM4 se purificó del exceso de DM4 sin reaccionar y los productos de enlazador no conjugados mediante diálisis en PBS, seguido de una diálisis final en tampón que contiene histidina 10 mM, glicina 250 mM, sacarosa al 1 % a pH 5,5. El conjugado se filtró a través de un filtro de 0,22 pm para su almacenamiento final. Se determinó como se ha descrito anteriormente el número de moléculas de DM4 por molécula de anticuerpo huCD37-3 (promedio) en el conjugado final y el porcentaje de especies de maitansinoide libres totales. Se obtuvieron conjugados con 3,5-4 moléculas de DM4 por anticuerpo huCD37-3, estando < 1 % presente como maitansinoide no conjugado.
Preparación de huCD37-3-PEG4-mal-DM1
Se disolvió el reactivo de N-hidroxisuccinimidil-(polietilenglicol)4-(N-maleimidometil)-DM1 (NHS-PEG4-mal-DM1) en DMA. Se incubó el anticuerpo huCD37-3 a 5 mg/ml en fosfato de potasio 50 mM, NaCl 150 mM, EDTA 2 mM, pH 7,5 con un exceso molar de 7 veces de NHS-PEG4-mal-DM1 (10 % de DMA total). Después de aproximadamente 2 horas a temperatura ambiente, se purificó la mezcla de reacción usando una columna SEPHADEX™ G25 equilibrada en PBS 1x, pH 7,4. Se agruparon las fracciones que contenían anticuerpo y se dializaron en tampón que contenía histidina 10 mM, glicina 250 mM, sacarosa al 1 %, pH 5,5. Se determinó como se ha descrito anteriormente el número de moléculas de DM1 unidas por anticuerpo y el porcentaje de especies de maitansinoide libres totales. Se obtuvieron conjugados con 3,5-4 moléculas de DM4 por anticuerpo huCD37-3, estando < 1 % presente como maitansinoide no conjugado.
Ejemplo 15
Afinidad de unión de conjugados de maitansinoide
Se ensayó mediante citometría de flujo como se ha descrito en el ejemplo anterior la afinidad de unión del huCD37-3 ilustrativo tras la conjugación con SMCC-DM1, SPP-DM1 o sulfo-mal-DM4. Se calculó el valor para las constantes de disociación aparentes (Kd) a partir de las curvas de unión mostradas en la figura 20A y corresponden a 0,26 nM para los conjugados huCD37-3, 0,46 para huCD37-3-SMCC-DM1, 0,56 nM para huCD37-3-SPP-DM1 y 0,89 nM para huCD37-3-sulfo-mal-DM4. Este resultado demuestra que la conjugación con SMCC-DM1, SPP-DM1 o sulfo-mal-DM4 no altera notablemente la afinidad del anticuerpo ilustrativo huCD37-3.
Se ensayó mediante citometría de flujo como se ha descrito en el ejemplo anterior la afinidad de unión de huCD37-38 tras la conjugación con SMCC-DM1. Se calculó el valor para las constantes de disociación aparentes (Kd) a partir de las curvas de unión mostradas en la figura 20B y corresponden a 1,04 nM para los conjugados huCD37-38 y 1,2 nM para huCD37-38-SMCC-DM1. Este resultado demuestra que la conjugación con SMCC-DM1 no altera notablemente la afinidad del anticuerpo huCD38. Asimismo, se ensayó por citometría de flujo la afinidad de unión de huCD37-50, huCD37-51, huCD37-56 y huCD37-57 tras la conjugación a SMCC-DM1. Se calculó el valor para las constantes de disociación aparentes (Kd) a partir de las curvas de unión y corresponden a 0,43 nM para huCD37-50, 0,70 nM para huCD37-50-SMCC-DM1, 2,0 nM para huCD37-51, 1,6 nM para huCD37-51-SMCC-DM1, 0,3 nM para huCD37-56, 0,34 nM para huCD37-56-SMCC-DM1, 0,30 para huCD37-57 y 0,34 para huCD37-57-SMCC-DM1. Este resultado demuestra que la conjugación con SMCC-DM1 tampoco altera notablemente la afinidad de los anticuerpos huCD37-50, huCD37-51, huCD37-56 o huCD37-57.
Afinidad de unión de conjugados con PEG4-mal-DM1
Se ensayó la afinidad de unión de los anticuerpos huCD37-3 y huCD37-50 ilustrativos tras la conjugación a PEG4-mal-DM1 mediante citometría de flujo, como se ha descrito en el ejemplo anterior. Se calculó el valor para las constantes de disociación aparentes (Kd) a partir de curvas de unión y corresponden a 0,28 nM para huCD37-3, 0,35 nM para huCD37-3-PEG4-mal-DM1, 0,68 nM para huCD37-50 y 1,1 nM para los conjugados huCD37-50-PEG4-mal-DM1. Este resultado demuestra que la conjugación con PEG4-mal-DM1 no altera notablemente la afinidad de los anticuerpos huCD37-3 o huCD50 ejemplares.
Actividad proapoptótica de los conjugados huCD37-3-SMCC-DM1
Se evaluó la actividad proapoptótica de huCD37-3 tras la conjugación a SMCC-DM1 mediante tinción de anexina V en células Ramos, como se ha descrito anteriormente. El tratamiento con anticuerpo huCD37-3 o con conjugado huCD37-3-SMCC-DM 1 dio como resultado aproximadamente un 40 % de células Ramos positivas para anexina V, con un valor de CE50 de aproximadamente 0,09 nM (figura 21A). Las células Ramos tratadas con un anticuerpo de control sin unión o un conjugado de control de SMCC-DM1 sin unión contenían solo hasta un 4 % de células positivas para anexina V. En comparación, el tratamiento con el anticuerpo anti-CD20 rituximab dio como resultado tan solo un 16% de células positivas para anexina V, con un valor de CE50 de aproximadamente 2 nM. Por el contrario, el tratamiento con TRU-016 no aumentó el porcentaje de células Ramos positivas para anexina V. Esto demuestra que la fuerte actividad proapoptótica del anticuerpo humano anti-CD37, huCD37-3 se conserva tras la conjugación a SMCC-DM1.
Actividad CDC de los conjugados huCD37-3-SMCC-DM1
Se evaluó la actividad CDC de huCD37-3 tras la conjugación a SMCC-DM1 en células Ramos en presencia de complemento humano al 5 %. El tratamiento con huCD37-3 o huCD37-3-SMCC-DM1 dio como resultado una reducción en la viabilidad celular del 53 % y 73 %, respectivamente (figura 21B). Por lo tanto, la actividad CDC del anticuerpo huCD37-3 se mantiene después de la conjugación con el maitansinoide.
Actividad ADCC de los conjugados
Se evaluó la actividad ADCC de huCD37-3 tras la conjugación a SMCC-DM1 o PEG4-mal-DM1 en células Daudi y Ramos en presencia de células efectoras NK mediante un ensayo de liberación de LDH, como se ha descrito anteriormente. Como puede observarse en la figura 22A, los conjugados huCD37-3-SMCC-DM1 o huCD37-3-PEG4-mal-DM1 tienen una actividad ADCC similar a la del anticuerpo huCD37-3 no conjugado en células Daudi. El tratamiento con huCD37-3, huCD37-3 SMCC-DM1 o huCD37-3-PEG4-mal-DM1 dio como resultado aproximadamente un 41 %, 39% o 36% de lisis de células Daudi, con un valor de CE50 de 0,42 ng/ml, 1,13 ng/ml o 0,91 ng/ml, respectivamente. Se obtuvieron resultados similares usando células Ramos como células diana. Como antes, los conjugados huCD37-3-SMCC-DM1 o huCD37-3-PEG4-mal-DM1 tienen una actividad ADCC comparable a la del anticuerpo huCD37-3 no conjugado en células Ramos (figura 22B). El tratamiento con huCD37-3, huCD37-3 SMCC-DM1 o huCD37-3-PEG4-mal-DM1 dio como resultado aproximadamente un 43 %, 41 % o 42 % de lisis de células Ramos, con un valor de CE50 de 0,95 ng/ml, 1,33 ng/ml o 1,57 ng/ml, respectivamente. Por lo tanto, la potente actividad ADCC del anticuerpo huCD37-3 se mantiene después de la conjugación con el maitansinoide.
Inducción de la detención del ciclo celular por huCD37-3-SMCC-DM1
Se evaluó el potencial de los anticuerpos y conjugados de anti-CD37 para inducir la detención del ciclo celular en líneas celulares mediante tinción con yoduro de propidio (PI), seguido de análisis por citometría de flujo. Se recogieron células en crecimiento exponencial mediante centrifugación a 1.300 rpm durante 5 minutos a TA y se resuspendieron a 0,5 x 106 células/ml en medio RMPI completo. Las células se transfirieron a 1 ml por pocillo en una placa de 24 pocillos (Falcon 3077) hasta obtener 0,5 x 106 células/ensayo. Los compuestos de ensayo se añadieron a cada pocillo a una concentración final de 10 nM. Se añadió medio RMPI completo a los pocillos de control no tratados. Las células se incubaron durante una noche durante 16 a 20 h a 37 °C en una incubadora humidificada con un 5 % de CO2. Al día siguiente, se recogieron las células transfiriéndolas a tubos de poliestireno de 5 ml, se lavaron una vez con 3 ml de PBS y se fijaron en 1 ml de etanol al 70 % durante 30 minutos sobre hielo. Después, se lavaron las muestras nuevamente con 3 ml de PBS una vez y se resuspendieron en 0,5 ml de PBS. Se añadió RNasa a la muestra a 5 pl/ml y se incubó a 37 °C durante 30 minutos. Después, se tiñeron las muestras con yoduro de propidio a una concentración final de 50 pg/ml. Las muestras se adquirieron a las 24 horas de la tinción con PI. Las muestras se ejecutaron en un dispositivo FACS Calibur (BD Biosciences, San Diego). El parámetro FL2-A se ajustó a escala lineal y el FL2 PTM se ajustó para posicionar el pico de G1 a aproximadamente 200. Las muestras se adquirieron a un bajo caudal y se recogieron 10.000 eventos por muestra. Se determinó la distribución de células en las diferentes fases del ciclo celular usando el programa ModFit (versión 5.11, Verity Software House Inc., EE. UU.). Este programa utiliza técnicas de ajuste de picos para modelar automáticamente los datos de PI y proporciona los datos cuantitativos deseados. Los datos se analizaron con ajustes del programa convencionales.
Se evaluó el efecto de huCD37-3 y huCD37-3-SMCC-DM1 en la detención del ciclo celular de células de linterna BJAB y RL después de una incubación de 16-20 horas con compuesto a una concentración de 10 nM seguido de tinción con yoduro de propidio (PI) y análisis por citometría de flujo. La incubación con huCD37-3-SMCC-DM1 dio como resultado un aumento en el porcentaje de células en fase G2/M del 13 % para células de linterna BJAB no tratadas al 95 % para las células tratadas con huCD37-3-SMCC-DM1 (figura 23A). De manera similar, la incubación con huCD37-3-SMCC-DM1 dio como resultado un aumento en el porcentaje de células en fase G2/M del 12 % para células de linfoma RL no tratadas al 33 % para las células tratadas con huCD37-3-SMCC-DM1 (figura 23B). Por el contrario, el anticuerpo huCD37-3 no tuvo efecto en el ciclo celular de las células BJAB o RL. Además, un conjugado de SMCC-DM1 sin unión ensayado a la misma concentración tampoco tuvo efecto en el ciclo celular de ninguno de los dos tipos de células. Esto demostró que los conjugados con maitansinoide elaborados con anticuerpos anti-CD37 aislados provocaron la detención específica del ciclo celular de líneas celulares de linterna positivas para CD37.
Ejemplo 16
Ensayos de citotoxicidad in vitro
Se midió la capacidad de los conjugados de anticuerpo anti-CD37 para inhibir el crecimiento celular usando ensayos de citotoxicidad in vitro como se ha descrito en el ejemplo 10 para anticuerpos. Brevemente, se sembraron células diana a razón de 5.000 células por pocillo en 100 pl en medio RpMI completo (RPMI-1640, suero fetal bovino al 10 %, glutamina 2 mM, 1 % de penicilina/estreptomicina, todos los reactivos de Invitrogen). Se diluyeron los conjugados en medio RPMI completo usando diluciones en serie de factor 3 y se añadieron 100 pl por pocillo. La concentración final varió típicamente de 3 x 10-8 M a 4,6 x 10-12 M. Las células se incubaron a 37 °C en una incubadora humidificada con un 5 % de CO2 durante 4 a 5 días. Se determinó la viabilidad de las células restantes mediante un ensayo colorimétrico de WST-8 como se ha descrito para los ensayos de anticuerpo y se midió la absorbancia a 450 nm (A450) en un lector de placas multipocillo (Dojindo Molecular Technologies, Inc., Rockville, MD, EE. UU.). Se calculó el porcentaje de viabilidad dividiendo cada valor de muestra tratada entre el valor medio de los pocillos con células no tratadas. Se representó el valor de porcentaje de viabilidad frente a la concentración de anticuerpo-conjugado en una gráfica semilogarítmica para cada tratamiento.
Citotoxicidad in vitro de conjugados con SMCC-DM1 de diversos anticuerpos
Se comparó la citotoxicidad in vitro de conjugados con SMCC-DM1 preparados con diversos anticuerpos anti-CD37 con la actividad de un conjugado de huIgG-SMCC-DM1 no específico. Se muestran los resultados de un ensayo de citotoxicidad típico en la figura 24A para células Daudi incubadas con huCD37-3-SMCC-DM1, huCD37-38-SMCC-DM1, huCD37-50-SMCC-DM1, huCD37-51-SMCC-DM1, huCD37-56-SMCC-DM 1, huCD37-57-SMCC-DM1 o un conjugado de control huIgGl-SMCC-DM1 sin unión. Todos los conjugados específicos dieron como resultado una eliminación celular específica, en comparación con el conjugado de control y redujeron completamente la viabilidad celular a la concentración máxima ensayada. Los valores de CE50 corresponden a 0,067 nM, 0,098 nM, 0,13 nM, 0,20 nM, 0,31 nM y 0,35 nM para los conjugados con SMCC-DM1 de huCD37-3, huCD37-38, huCD37-50, huCD37-51, huCD37-56 y huCD37-57, respectivamente. Por el contrario, los conjugados con SMCC-DM1 de un anticuerpo de control de isotipo sin unión dieron como resultado una eliminación celular con un valor de CE50 de tan solo 20 nM. Asimismo, la figura 24B muestra los resultados de un ensayo de citotoxicidad típico usando células Granta-519 incubadas con huCD37-3-SMCC-DM1, huCD37-38-SMCC-DM1, huCD37-50-SMCC-DM1, huCD37-51-SMCC-DM1 o un conjugado de control huIgGl-SMCC-DM1 sin unión durante 5 días. El tratamiento con todos los complejos específicos con SMCC-DM1 redujo completamente la viabilidad a la concentración máxima ensayada, con una CE50 de 0,047 nM, 0,074 nM, 0,12 nM y 0,25 nM para los conjugados con SMCC-DM1 de huCD37-3, huCD37-38, huCD37-50 y huCD37-51, respectivamente. Por el contrario, los conjugados con SMCC-DM1 de un anticuerpo de control de isotipo sin unión dieron como resultado una eliminación celular con un valor de CE50 de tan solo 20 nM.
Citotoxicidad in vitro de los conjugados huCD37-3-SMCC-DM1, -SPP-DM1 y sulfo-mal-DM4
Se comparó la citotoxicidad in vitro de los conjugados huCD37-3-SMCC-DM1, -SPP-DM1 y sulfo-mal-DM4 contra células Daudi, Granta-519 y BJAB con la actividad de un conjugado no específico huIgG-MCC-DM1. Todos los conjugados ensayados redujeron completamente la viabilidad de células Daudi a la concentración máxima ensayada, con un valor de CE50 de 0,065 nM, 0,12 nM y 0,14 nM para huCD37-3-SMCC-DM1, huCD37-3-SPP-DM1 y huCD37-3-sulfo-mal-DM4, respectivamente. Por el contrario, el conjugado no específico huIgG-SMCC-DM1 tuvo una CE50 de 19 nM. Asimismo, todos los conjugados ensayados redujeron completamente la viabilidad de células Granta-519 a la concentración máxima ensayada, con un valor de CE50 de 0,047 nM, 0,13 nM y 0,088 nM para huCD37-3-SMCC-DM1, huCD37-3-SPP-DM1 y huCD37-3-sulfo-mal-DM4, respectivamente. Por el contrario, el conjugado no específico huIgG-SMCC-DM1 tuvo una CE50 de 19 nM. Finalmente, todos los conjugados ensayados redujeron completamente la viabilidad de células BJAB a la concentración máxima ensayada, con un valor de CE50 de 0,041 nM, 0,11 nM y 0,11 nM para huCD37-3-SMCC-DM1, huCD37-3-SPP-DM1 y huCD37-3-sulfo-mal-DM4, respectivamente. Por el contrario, el conjugado no específico huIgG-SMCC-DM1 tuvo una CE50 de 16 nM.
Citotoxicidad in vitro de los conjugados huCD37-3-SMCC-DM1 y huCD37-3-PEG4-mal-DM1
Se comparó la citotoxicidad in vitro de los conjugados huCD37-3-SMCC-DM1 y huCD37-3-PEG4-mal-DM1 frente a un panel de líneas celulares de linfoma con la actividad de un conjugado no específico huIgG-SMCC-DM1. El tratamiento con los conjugados de huCD37-3 redujo completamente la viabilidad de células Daudi a la concentración máxima ensayada, con una CE50 de 0,036 nM o 0,018 nM para los conjugados huCD37-3-SMCC-DM1 o huCD37-3-PEG4-mal-DM1, respectivamente. Por el contrario, los conjugados de control de isotipo sin unión redujeron la viabilidad con una CE50 de 16 nM o mayor de 30 nM para huIgG-SMCC-DM1 o huIgG-PEG4-mal-DM1, respectivamente. Asimismo, el tratamiento con los conjugados de huCD37-3 redujo completamente la viabilidad de células Granta-519 a la concentración máxima ensayada, con una CE50 de 0,014 nM o 0,012 nM para los conjugados huCD37-3-SMCC-DM1 o huCD37-3-PEG4-mal-DM1, respectivamente. Por el contrario, los conjugados de control de isotipo sin unión redujeron la viabilidad con una CE50 de 6,5 nM o mayor de 12 nM para huIgG-SMCC-DM1 o huIgG-PEG4-mal-DM1, respectivamente.
Se comparó la citotoxicidad in vitro de los conjugados huCD37-3-SMCC-DM1 y huCD37-3-PEG4-mal-DM1 frente a un panel de líneas celulares de linfoma con la actividad de un conjugado no específico huIgG-SMCC-DM1. El tratamiento con los conjugados de huCD37-3 redujo completamente la viabilidad de células BJAB a la concentración máxima ensayada, con una CE50 de 0,019 nM o 0,010 nM para los conjugados huCD37-3-SMCC-DM1 o huCD37-3-PEG4-mal-DM1, respectivamente. Por el contrario, los conjugados de control de isotipo sin unión redujeron la viabilidad con una CE50 de 13 nM o 17 nM para huIgG-SMCC-DM1 o huIgG-PEG4-mal-DM1, respectivamente. Asimismo, el tratamiento con los conjugados de huCD37-3 redujo completamente la viabilidad de células SU-DHL-4 a la concentración máxima ensayada, con una CE50 de 0,031 nM o 0,024 nM para los conjugados huCD37-3-SMCC-DM1 o huCD37-3-PEG4-mal-DM1, respectivamente. Por el contrario, los conjugados de control de isotipo sin unión redujeron la viabilidad con una CE50 de más de 30 nM para huIgG-SMCC-DM1 o huIgG-PEG4-mal-DM1. El conjugado huCD37-3-SMCC-DM1 también mostró potencia contra la línea celular de FL DOHH-2, así como líneas celulares de CLL, tales como JVM-2 y JVM-3 (figura 32B).
El tratamiento con los conjugados de huCD37-3 redujo completamente la viabilidad de células Raji a la concentración máxima ensayada, con una CE50 de 0,071 nM o 0,045 nM para los conjugados huCD37-3-SMCC-DM1 o huCD37-3-PEG4-mal-DM1, respectivamente. Por el contrario, los conjugados de control de isotipo sin unión redujeron la viabilidad con una CE50 de 24 nM o 47 nM para huIgG-SMCC-DM1 o huIgG-PEG4-mal-DM1, respectivamente. A continuación, se ensayaron los mismos conjugados en un clon de Raji resistente a la vincristina denominado Raji-VCR. Como se ha observado para la célula Raji precursora, ambos conjugados mostraron eliminación celular específica. El tratamiento con los conjugados de huCD37-3 redujo completamente la viabilidad de células Raji-VCR a la concentración máxima ensayada, con una CE50 de 0,11 nM o 0,037 nM para los conjugados huCD37-3-SMCC-DM1 o huCD37-3-PEG4-mal-DM1, respectivamente. Por el contrario, los conjugados de control de isotipo sin unión redujeron la viabilidad con una CE50 de 46 nM o 100 nM para huIgG-SMCC-DM1 o huIgG-PEG4-mal-DM1, respectivamente.
El tratamiento con los conjugados de huCD37-3 redujo completamente la viabilidad de células Namalwa a la concentración máxima ensayada, con una CE50 de 0,033 nM o 0,024 nM para los conjugados huCD37-3-SMCC-DM1 o huCD37-3-PEG4-mal-DM1, respectivamente. Por el contrario, los conjugados de control de isotipo sin unión redujeron la viabilidad con una CE50 de 20 nM o mayor de 30 nM para huIgG-SMCC-DM1 o huIgG-PEG4-mal-DM1, respectivamente. Asimismo, el tratamiento con los conjugados de huCD37-3 redujo completamente la viabilidad de células Ramos a la concentración máxima ensayada, con una CE50 de 0,16 nM o 0,069 nM para los conjugados huCD37-3-SMCC-DM1 o huCD37-3-PEG4-mal-DM1, respectivamente. Por el contrario, los conjugados de control de isotipo sin unión redujeron la viabilidad con una CE50 de 20 nM para huIgG-SMCC-DM1 y mayor de 30 nM para huIgG-PEG4-mal-DM1.
Citotoxicidad in vitro de huCD37-3-SMCC-DM1 en células Molt-4 negativas para el antígeno
Para verificar adicionalmente la especificidad de la citotoxicidad de huCD37-3-SMCC-DM1, se comparó su actividad con un conjugado no específico huIgG-MCC-DM1 contra una línea celular de leucemia linfoblástica aguda de linfocitos T Molt-4 que no expresa CD37. Se usó una concentración aumentada de ambos conjugados en este experimento para capturar la relativamente escasa citotoxicidad no específica. HuCD37-3-SMCC-DM1 y el conjugado no específico mostraron la misma citotoxicidad, con una CE50 de 38 nM y 42 nM, respectivamente.
Resumen de la citotoxicidad in vitro de los conjugados de anticuerpo anti-CD37 y maitansinoide
Tomando en conjunto estos resultados de citotoxicidad, resulta evidente que los conjugados preparados con los anticuerpos anti-CD37 aislados mostraron citotoxicidad específica contra un panel de líneas celulares de linfoma CD37 positivas (figura 32B). En cada caso ensayado, se observa una buena ventana de especificidad para cada línea celular que expresa CD37, lo que sugiere que la citotoxicidad es el resultado de la unión específica del anticuerpo anti-CD37 a células diana. Además, huCD37-3-SMCC-DM1 y el conjugado no específico mostraron una citotoxicidad igualmente escasa contra células Molt-4 negativas para el antígeno. Esto demuestra que la citotoxicidad observada para este conjugado ejemplar depende de la expresión de CD37. El anticuerpo huCD37-3 también fue activo contra muchas líneas celulares, incluyendo DOHH-2, Granata-519, SU-DHL-4, JVM-2 y JVM-3. Por el contrario, el compuesto SMIP anti-CD37 TRU-016 no tuvo un efecto directo en la supervivencia de cualquiera de estas líneas celulares. El anticuerpo anti-CD20 mostró una actividad menos directa que huCD37-3 en la mayoría de estas líneas celulares, a pesar de los a menudo mayores niveles de expresión de CD20, como se mide mediante citometría de flujo cuantitativa (figura 32A).
Ejemplo 17
Eficacia in vivo de los anticuerpos anti-CD37 y sus conjugados con SMCC-DM1 en un modelo de xenoinjerto de BJAB Se ensayaron anticuerpos anti-CD37 y sus conjugados con SMCC-DM1 en un modelo de xenoinjerto establecido usando células de linfoma BJAB implantadas por vía subcutánea en ratones SCID. Se asignaron aleatoriamente los animales según el volumen tumoral en grupos de tratamiento cuando los tumores alcanzaron un volumen tumoral medio de aproximadamente 120 mm3 y se trataron una vez en el día 12 después de la inoculación de las células con 10 mg/kg de (A) Ab huCD37-3, huCD37-3-SMCC-DM1, Ab huCD37-50, huCD37-50-SMCC-DM1 o (B) Ab huCD37-38, huCD37-38-SMCC-DM1, Ab huCD37-56, huCD37-56-SMCC-DM1. Se representa el volumen tumoral medio de los diferentes grupos de tratamiento frente al tiempo después de la inoculación de células tumorales en la figura 25. Resulta evidente que el tratamiento con cualquiera de los anticuerpos dio como resultado una reducción moderada en el volumen tumoral medio, mientras que el tratamiento con cualquiera de los conjugados con SMCC-DM1 dio como resultado una reducción más significativa en el volumen tumoral medio. Además, para cada tratamiento, se calculó un valor de % de T/C, que corresponde a la mediana del volumen tumoral para cada grupo, dividida entre la mediana del volumen tumoral del grupo tratado con vehículo. Se considera como activo un tratamiento con un valor de % de T/C inferior al 42 %, mientras que se considera altamente activo un tratamiento con un valor de % de T/C inferior al 12 %. El tratamiento con todos los conjugados con SMCC-DM1 ensayados dio como resultado una reducción significativa en la mediana del volumen tumoral. El valor de % de T/C en el día 29 después de la inoculación de células correspondió al 20 %, 20 %, 9 % o 4 % para huCD37-3-SMCC-DM1, huCD37-50-SMCC-DM1, huCD37-38-SMCC-DM1 o huCD37-56-SMCC-DM1, respectivamente.
Eficacia in vivo de los conjugados del anticuerpo huCD37-3 con sulfo-mal-DM4, -SPP-DM1 y SMCC-DM1 en un modelo de xenoinjerto de BJAB
A fin de evaluar la eficacia in vivo de conjugados con maitansinoide adicionales, se compararon los conjugados con sulfo-mal-DM4 y SPP-DM1 del anticuerpo huCD37-3 ejemplar con los conjugados con SMCC-DM1 en un modelo de xenoinjerto usando células de linfoma BJAB implantadas por vía intravenosa en ratones SCID.
Se asignaron aleatoriamente los animales según el volumen tumoral en grupos de tratamiento cuando los tumores alcanzaron un volumen tumoral medio de aproximadamente 120 mm3 y se trataron una vez en el día 9 después de la inoculación de las células con 10 mg/kg de Ab huCD37-3, huCD37-3-SMCC-DM1, huCD37-3-sulfo-mal-DM4 o 5 mg/kg de huCD37-3-SPP-DM1. Se representa el volumen tumoral medio de los diferentes grupos de tratamiento frente al tiempo después de la inoculación de células tumorales en la figura 26. Resulta evidente que el tratamiento con cualquiera de los conjugados dio como resultado una reducción significativa en el volumen tumoral medio. Se calculó el valor de % de T/C como se ha descrito anteriormente para cada tratamiento usando la mediana del volumen tumoral para cada grupo de tratamiento. El valor de % de T/C en el día 21 después de la inoculación de células correspondió al 49%, 5%, 7% o 4% para huCD37-3, huCD37-3-SMCC-DM1, huCD37-3-sulfomal-DM4 o huCD37-3-SPP-DM1, respectivamente. Al final del estudio en el día 121, el tratamiento con huCD37-3-sulfo-mal-DM4 dio como resultado 3 de 8 supervivientes libres de tumores (TFS), mientras que el tratamiento con huCD37-3-SPP-DM1 dio como resultado 1 de 8 TFS. No se observaron TFS en los grupos de anticuerpo huCD37-3, huCD37-3-SMCC-DM1 o vehículo de PBS. Esto indicó que los conjugados con maitansinoide del anticuerpo huCD37-3, tal como, por ejemplo, los conjugados SMCC-DM1, sulfo-mal-DM4 o SPP-DM1, fueron altamente activos en el modelo de BJAB.
Eficacia in vivo de los conjugados del anticuerpo huCD37-3 con sulfo-mal-DM4, -SPP-DM1 y SMCC-DM1 en un modelo de xenoinjerto de SU-DHL-4
Se utilizó un segundo modelo de xenoinjerto usando células de linfoma difuso de linfocitos B grandes SU-DHL-4 implantadas por vía subcutánea en ratones SCID para evaluar la eficacia in vivo de los conjugados con sulfo-mal-DM4 y SPP-DM1 del anticuerpo ejemplar huCD37-3, en comparación con los conjugados con SMCC-DM1. Se asignaron aleatoriamente los animales según el peso corporal a grupos de tratamiento cuando se establecieron los tumores y se trataron una vez en el día 17 después de la inoculación de células con 10 mg/kg de Ab huCD37-3, huCD37-3-SMCC-DM1, huCD37-3-sulfo-mal-DM4 o 5 mg/kg de huCD37-3-SPP-DM1. Se representa la mediana del volumen tumoral de los diferentes grupos de tratamiento frente al tiempo después de la inoculación de células tumorales en la figura 27. Resulta evidente que el tratamiento con el anticuerpo huCD37-3 dio como resultado una reducción en la mediana del volumen tumoral, mientras que el tratamiento con cualquiera de los conjugados dio como resultado una reducción más significativa en la mediana del volumen tumoral. Se calculó el valor de % de T/C como se ha descrito anteriormente para cada tratamiento. El valor de % de T/C en el día 37 después de la inoculación de células correspondió al 32 %, 1 %, 1% o 3% para huCD37-3, huCD37-3-SMCC-DM1, huCD37-3-sulfo-mal-DM4 o huCD37-3-SPP-DM1, respectivamente. Al final del estudio en el día 125, el tratamiento con huCD37-3-SMCC-DM1 o huCD37-3-sulfo-mal-DM4 dio como resultado 8 de 10 supervivientes libres de tumores (TFS), mientras que el tratamiento con huCD37-3SPP-DM1 dio como resultado 9 de 10 TFS. No se observaron TFS en los grupos de anticuerpo huCD37-3 o de control de vehículo de PBS. Esto indicó que el anticuerpo huCD37-3 en sí era activo con una sola dosis de 10 mg/kg en el modelo de SU-DHL-4. Además, los conjugados con maitansinoide, tal como, por ejemplo, los conjugados SMCC-DM1, sulfo-mal-DM4 o SPP-DM1, añadieron eficacia al anticuerpo y dan como resultado una potencia aún mayor en este modelo.
Eficacia in vivo de los conjugados del anticuerpo huCD37-3 con PEG4-mal-DM1 y SMCC-DM1 en un modelo de xenoinjerto de BJAB
Se ensayaron el anticuerpo huCD37-3 y sus conjugados con PEG4-mal-DM1 y SMCC-DM1 en un modelo de xenoinjerto establecido usando células de linfoma BJAB implantadas por vía subcutánea en ratones SCID. Se asignaron aleatoriamente los animales según el volumen tumoral en grupos de tratamiento cuando los tumores alcanzaron un volumen tumoral medio de aproximadamente 120 mm3 y se trataron una vez en el día 9 después de la inoculación de las células con 10 mg/kg de Ab huCD37-3, huCD37-3-SMCC-DM1 o huCD37-3-PEG4-mal-DM1. Como se observa en la figura 28, el tratamiento con cualquiera de los conjugados dio como resultado una reducción significativa en el volumen tumoral medio. Se calculó el valor de % de T/C como se ha descrito anteriormente para cada tratamiento usando la mediana del volumen tumoral para cada grupo de tratamiento. El valor de % de T/C en el día 24 después de la inoculación de células correspondió al 48 %, 16 % o 5 % para huCD37-3, huCD37-3-SMCC-DM1 o huCD37-3-PEG4-mal-DM1, respectivamente. En el día 74 después de la inoculación celular, el tratamiento con huCD37-3-SMCC-DM1 dio como resultado 1 de 9 supervivientes libres de tumores (TFS), mientras que el tratamiento con huCD37-PEG4-mal-DM1 dio como resultado 1 de 9 TFS. No se observaron TFS en los grupos de anticuerpo huCD37-3 o de control de vehículo de PBS. Además, huCD37-3-SMCC-DM1 también fue activo en una sola dosis de 5 mg/kg en este modelo con un valor de % de T/C en el día 24 después de la inoculación de células del 34 %. Esto indicó que los conjugados con maitansinoide del anticuerpo huCD37-3, tal como, por ejemplo, los conjugados con SMCC-DM1 o PEG4-mal-DM1, fueron altamente activos en el modelo de BJAB.
Eficacia in vivo de los conjugados del anticuerpo huCD37-3 con PEG4-mal-DM1 y SMCC-DM1 en un modelo de xenoinjerto de SU-DHL-4
Se ensayaron el anticuerpo huCD37-3 y sus conjugados con PEG4-mal-DM1 y SMCC-DM1 en un modelo de xenoinjerto establecido usando células de linfoma difuso de linfocitos B grandes SU-DHL-4 implantadas por vía subcutánea en ratones SCID. Se asignaron aleatoriamente los animales según el peso corporal a grupos de tratamiento y se trataron una vez en el día 15 después de la inoculación de células con 10 mg/kg de Ab huCD37-3, huCD37-3-SMCC-DM1 o huCD37-3-PEG4-mal-DM1. Se representa el volumen tumoral medio de los diferentes grupos de tratamiento frente al tiempo después de la inoculación de células tumorales en la figura 29. Resulta evidente que el tratamiento con el anticuerpo huCD37-3 dio como resultado una reducción en el volumen tumoral medio, mientras que el tratamiento con cualquiera de los conjugados dio como resultado una reducción más significativa en el volumen tumoral medio. Se calculó el valor de % de T/C como se ha descrito anteriormente para cada tratamiento usando la mediana del volumen tumoral para cada grupo de tratamiento. El valor de % de T/C en el día 38 después de la inoculación de células correspondió al 34 %, 4 % o 2 % para huCD37-3, huCD37-3-SMCC-DM1 o huCD37-3-PEG4-mal-DM1, respectivamente. En el día 74 después de la inoculación celular, el tratamiento con huCD37-3-SMCC-DM1 dio como resultado 8 de 10 supervivientes libres de tumores (TFS), mientras que el tratamiento con huCD37-3-PEG4-mal-DM1 dio como resultado 10 de 10 TFS. No se observaron TFS en los grupos de anticuerpo huCD37-3 o de control de vehículo de PBS. Esto indicó que el anticuerpo huCD37-3 en sí era activo con una sola dosis de 10 mg/kg en el modelo de SU-DHL-4. Además, los conjugados con maitansinoide, tal como, por ejemplo, los conjugados con SMCC-DM1 o PEG4-mal-DM1, mostraron una eficacia mejorada en comparación con la eficacia del anticuerpo no conjugado y dieron como resultado una potencia aún mayor en este modelo. El conjugado huCD37-3-SMCC-DM1 también mostró una fuerte eficacia a dosis únicas de 2,5 o 5 mg/kg en este modelo, con valores de % de T/C en el día 37 después de la inoculación de células del 18 % y 6 %, respectivamente.
Eficacia in vivo del anticuerpo huCD37-3, el conjugado huCD37-3-SMCC-DM1, el anticuerpo Rituximab y un régimen de ciclofosfamida, vincristina y prednisona (CVP) en un modelo de xenoinjerto de DoHH2
Se ensayaron el anticuerpo huCD37-3 y su conjugado con SMCC-DM1 en un modelo de xenoinjerto establecido usando células de linfoma folicular DoHH2 implantadas por vía subcutánea en ratones SCID. Los animales se asignaron aleatoriamente según el volumen tumoral en grupos de tratamiento y los tratamientos comenzaron en el día 12 después de la inoculación con una sola dosis de 10 mg/kg de anticuerpo huCD37-3 o de conjugado huCD37-3-SMCC-DM1; seis dosis de 2 mg/kg de Rituximab dos veces a la semana durante tres semanas; con un régimen de una sola dosis de 40 mg/kg de ciclofosfamida y 0,5 mg/kg de vincristina, junto con cinco dosis diarias de 0,2 mg/kg de prednisona (CVP). Se representó la mediana del volumen tumoral de los diferentes grupos de tratamiento frente al tiempo después de la inoculación de células tumorales en la figura 30. El tratamiento con el anticuerpo huCD37-3 dio como resultado una reducción en la mediana del volumen tumoral, mientras que el tratamiento con el conjugado huCD37-3-SMCC-DM1 dio como resultado una reducción más significativa en la mediana del volumen tumoral. El conjugado huCD37-3-SMCC-DM1 dio como resultado una mediana de reducción tumoral similar al tratamiento con Rituximab y una mediana de reducción tumoral más duradera, en comparación con el tratamiento con CVP. El retraso de crecimiento tumoral (valor de T-C) se definió como la mediana de tiempo (en días), necesaria para que los tumores

Claims (22)

REIVINDICACIONES
1. Un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se unen específicamente a CD37, en donde dichos anticuerpo o fragmento del mismo comprenden una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 57 o 58 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 74.
2. El anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo, o el fragmento de unión a antígeno del mismo, es un anticuerpo monoclonal de longitud completa capaz de inducir citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpo (ADCC).
3. El anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo de las reivindicaciones 1 o 2, en donde el anticuerpo o el fragmento unión a antígeno del mismo comprenden una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 57 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 74.
4. El anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo de las reivindicaciones 1 o 2, en donde el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno comprenden una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 58 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 74.
5. El anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en donde dichos anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo están revestidos.
6. Una célula aislada que produce el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5.
7. Un inmunoconjugado que tiene la fórmula (A) -(L) -(C), en donde:
(A) es un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5;
(L) es un enlazador; y
(C) es un agente citotóxico; y
en donde dicho enlazador (L) enlaza (A) a (C).
8. El inmunoconjugado de la reivindicación 7, que además comprende dos, tres, cuatro, de dos a seis o de tres a cuatro (C) por cada (A).
9. El inmunoconjugado de las reivindicaciones 7 u 8, en donde dicho enlazador se selecciona entre el grupo que consiste en un enlazador escindible, un enlazador no escindible, un enlazador hidrófilo, un enlazador a base de ácido dicarboxílico, 4-(2-piridiltio)pentanoato de N-succinimidilo (SPP); 4-(2-piridiltio)butanoato de N-succinimidilo (SPDB) o 4-(2-piridiltio)-2-sulfobutanoato de N-succinimidilo (sulfo-SPDB); 4-(maleimidometil)ciclohexanocarboxilato de N-succinimidilo (SMCC); 4-(maleimidometil)ciclohexanocarboxilato de N-sulfosuccinimidilo (sulfoSMCC); 4-(yodoacetil)-aminobenzoato de N-succinimidilo (SIAB); y [(N-maleimidopropionamido)-tetraetilenglicol] éster de N-succinimidilo (NHS-PEG4-maleimida).
10. El inmunoconjugado de la reivindicación 9, en donde dicho enlazador es SMCC.
11. El inmunoconjugado de una cualquiera de las reivindicaciones 7-10, en donde dicho agente citotóxico se selecciona entre el grupo que consiste en un maitansinoide, análogo de maitansinoide, doxorrubicina, una doxorrubicina modificada, benzodiazepina, taxoide, CC-1065, análogo de CC-1065, duocarmicina, análogo de duocarmicina, caliqueamicina, dolastatina, análogo de dolastatina, auristatina, derivado de tomamicina, derivado de leptomicina, un profármaco del agente citotóxico, N(2')-desacetil-N(2')-(3-mercapto-1-oxopropil}-maitansina (DM1) o N(2')-desacetil-N2-(4-mercapto-4-metil-1-oxopentil)-maitansina (DM4).
12. El inmunoconjugado de una cualquiera de las reivindicaciones 7-11, en donde dicho agente citotóxico es un maitansinoide.
13. El inmunoconjugado de la reivindicación 7, en donde (A) es un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo que comprenden el polipéptido de la SEQ ID NO: 57 y el polipéptido de la SEQ ID NO: 74, en donde (L) es SMCC y en donde (C) es DM1.
14. El inmunoconjugado de la reivindicación 7, en donde (A) es un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo que comprenden el polipéptido de la SEQ ID NO: 58 y el polipéptido de la SEQ ID NO: 74, en donde (L) es SMCC y en donde (C) es DM1.
15. El inmunoconjugado de la reivindicación 7, en donde (A) es un anticuerpo que comprende una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 90 o la SEQ ID NO: 91 y una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 107, en donde (L) es SMCC y en donde (C) es DM1.
16. Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5 o el inmunoconjugado de una cualquiera de las reivindicaciones 7-15 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
17. Una composición farmacéutica que comprende el inmunoconjugado de una cualquiera de las reivindicaciones 7­ 15, en donde el inmunoconjugado tiene una media de aproximadamente 3 a aproximadamente 4 (C) por (A) o una media de aproximadamente 3,5 (C) por (A).
18. Un kit que comprende el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, el inmunoconjugado de una cualquiera de las reivindicaciones 7-15 o la composición farmacéutica de las reivindicaciones 16 o 17.
19. Un método in vitro para inhibir el crecimiento de una célula que expresa CD37, que comprende poner en contacto la célula con el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5 o el inmunoconjugado de una cualquiera de las reivindicaciones 7-15.
20. El anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, el inmunoconjugado de una cualquiera de las reivindicaciones 7-15 o la composición farmacéutica de las reivindicaciones 16 o 17 para su uso en el tratamiento del cáncer.
21. El anticuerpo, el fragmento de unión a antígeno del mismo, el inmunoconjugado o una composición farmacéutica para su uso en el método de la reivindicación 20, en donde dicho cáncer se selecciona entre el grupo que consiste en linfomas de linfocitos B, NHL, leucemia/linfoma linfoblástico de linfocitos B precursores y neoplasias de linfocitos B maduros, leucemia linfocítica crónica de linfocitos B (CLL)/linfoma linfocítico de células pequeñas (SLL), leucemia prolinfocítica de linfocitos B, linfoma linfoplasmacítico, linfoma de células del manto (MCL), linfoma folicular (FL), (FL) de grado bajo, de grado intermedio y de alto grado, linfoma cutáneo del centro folicular, linfoma de linfocitos B de zona marginal, linfoma de linfocitos B de zona marginal de tipo MALT, linfoma de linfocitos B de zona marginal nodal, linfoma de linfocitos B de zona marginal de tipo esplénico, tricoleucemia, linfoma difuso de linfocitos B grandes, linfoma de Burkitt, plasmacitoma, mieloma de células plasmáticas, trastorno linfoproliferativo posterior a trasplante, macroglobulinemia de Waldenstrom, leucemia, linfoma y linfoma anaplásico de células grandes (ALCL).
22. El anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno, inmunoconjugado o composición farmacéutica para su uso de acuerdo con las reivindicaciones 20 o 21, en donde dicho cáncer es leucemia o linfoma.
ES11754195T 2010-03-12 2011-03-11 Moléculas de unión a CD37 e inmunoconjugados de las mismas Active ES2748347T3 (es)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US31362810P 2010-03-12 2010-03-12
US32731410P 2010-04-23 2010-04-23
US41264410P 2010-11-11 2010-11-11
PCT/US2011/028172 WO2011112978A1 (en) 2010-03-12 2011-03-11 Cd37-binding molecules and immunoconjugates thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2748347T3 true ES2748347T3 (es) 2020-03-16

Family

ID=44563875

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES11754195T Active ES2748347T3 (es) 2010-03-12 2011-03-11 Moléculas de unión a CD37 e inmunoconjugados de las mismas

Country Status (27)

Country Link
US (5) US8765917B2 (es)
EP (2) EP2544719B1 (es)
JP (5) JP5932672B2 (es)
KR (2) KR101644674B1 (es)
CN (2) CN106046159B (es)
AR (1) AR080513A1 (es)
AU (3) AU2011226672B2 (es)
BR (1) BR112012023010A8 (es)
CA (2) CA3015111C (es)
CY (1) CY1122091T1 (es)
DK (1) DK2544719T3 (es)
ES (1) ES2748347T3 (es)
HR (1) HRP20191688T1 (es)
HU (1) HUE046360T2 (es)
IL (2) IL221682A (es)
LT (1) LT2544719T (es)
MX (1) MX338932B (es)
MY (2) MY177062A (es)
NZ (2) NZ703481A (es)
PL (1) PL2544719T3 (es)
PT (1) PT2544719T (es)
RS (1) RS59389B1 (es)
RU (2) RU2610662C9 (es)
SG (3) SG183542A1 (es)
SI (1) SI2544719T1 (es)
TW (2) TWI638662B (es)
WO (1) WO2011112978A1 (es)

Families Citing this family (73)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8088387B2 (en) 2003-10-10 2012-01-03 Immunogen Inc. Method of targeting specific cell populations using cell-binding agent maytansinoid conjugates linked via a non-cleavable linker, said conjugates, and methods of making said conjugates
US7612181B2 (en) 2005-08-19 2009-11-03 Abbott Laboratories Dual variable domain immunoglobulin and uses thereof
US7960139B2 (en) 2007-03-23 2011-06-14 Academia Sinica Alkynyl sugar analogs for the labeling and visualization of glycoconjugates in cells
SI2281006T1 (sl) 2008-04-30 2017-12-29 Immunogen, Inc. Premreževalci in njihova uporaba
US8680020B2 (en) 2008-07-15 2014-03-25 Academia Sinica Glycan arrays on PTFE-like aluminum coated glass slides and related methods
US10087236B2 (en) 2009-12-02 2018-10-02 Academia Sinica Methods for modifying human antibodies by glycan engineering
US11377485B2 (en) 2009-12-02 2022-07-05 Academia Sinica Methods for modifying human antibodies by glycan engineering
LT2544719T (lt) 2010-03-12 2019-10-25 Debiopharm Int Sa Cd37 surišančios molekulės, ir jų imunokonjugatai
WO2011130332A1 (en) 2010-04-12 2011-10-20 Academia Sinica Glycan arrays for high throughput screening of viruses
JP5718483B2 (ja) 2011-02-01 2015-05-13 華為技術有限公司Ｈｕａｗｅｉ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏ．，Ｌｔｄ． 省電力方法、アクセスポイント装置、及び局装置
WO2012135517A2 (en) 2011-03-29 2012-10-04 Immunogen, Inc. Preparation of maytansinoid antibody conjugates by a one-step process
US8795673B2 (en) 2011-03-29 2014-08-05 Immunogen, Inc. Preparation of maytansinoid antibody conjugates by a one-step process
JP6018622B2 (ja) 2011-04-01 2016-11-02 イミュノジェン， インコーポレイテッド Ｃｄ３７結合性分子及びその免疫複合体
CN109276713A (zh) * 2011-12-13 2019-01-29 诺帝克纳诺维科特股份公司 嵌合的治疗性抗-cd37抗体hh1
PE20150091A1 (es) * 2012-02-24 2015-02-16 Stem Centrx Inc Anticuerpos anti-sez6 y metodos de empleo
RU2014140119A (ru) * 2012-03-30 2016-05-27 Иммьюноджен, Инк. Способы повышения эффективности терапии на основе cd37
US10130714B2 (en) 2012-04-14 2018-11-20 Academia Sinica Enhanced anti-influenza agents conjugated with anti-inflammatory activity
CA2880701A1 (en) 2012-08-18 2014-02-27 Academia Sinica Cell-permeable probes for identification and imaging of sialidases
CN105209592A (zh) 2012-10-04 2015-12-30 伊缪诺金公司 使用pvdf膜纯化细胞结合剂细胞毒性剂缀合物
WO2014089177A2 (en) 2012-12-04 2014-06-12 Massachusetts Institute Of Technology Compounds, conjugates and compositions of epipolythiodiketopiperazines and polythiodiketopiperazines
US9168300B2 (en) 2013-03-14 2015-10-27 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. MET-binding agents and uses thereof
WO2014159580A1 (en) * 2013-03-14 2014-10-02 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Met-binding agents and uses thereof
US10086054B2 (en) 2013-06-26 2018-10-02 Academia Sinica RM2 antigens and use thereof
US9981030B2 (en) 2013-06-27 2018-05-29 Academia Sinica Glycan conjugates and use thereof
SG11201600587VA (en) * 2013-08-01 2016-02-26 Agensys Inc Antibody drug conjugates (adc) that bind to cd37 proteins
KR102298172B1 (ko) 2013-09-06 2021-09-06 아카데미아 시니카 변화된 글리코실 그룹을 갖는 당지질을 사용한 인간 iNKT 세포 활성화
WO2015081891A1 (en) * 2013-12-06 2015-06-11 Baikang (Suzhou) Co., Ltd Bioreversable promoieties for nitrogen-containing and hydroxyl-containing drugs
WO2015109180A2 (en) 2014-01-16 2015-07-23 Academia Sinica Compositions and methods for treatment and detection of cancers
US10150818B2 (en) 2014-01-16 2018-12-11 Academia Sinica Compositions and methods for treatment and detection of cancers
EP3129767B1 (en) 2014-03-27 2021-09-01 Academia Sinica Reactive labelling compounds and uses thereof
WO2015175533A2 (en) * 2014-05-13 2015-11-19 Immunogen, Inc. Anti-cd37 immunoconjugate dosing regimens
US10118969B2 (en) 2014-05-27 2018-11-06 Academia Sinica Compositions and methods relating to universal glycoforms for enhanced antibody efficacy
WO2015184002A1 (en) 2014-05-27 2015-12-03 Academia Sinica Anti-her2 glycoantibodies and uses thereof
CA2950415A1 (en) 2014-05-27 2015-12-03 Academia Sinica Anti-cd20 glycoantibodies and uses thereof
CN107074945B (zh) 2014-05-27 2021-08-24 中央研究院 增进抗体功效的通用糖型的组合物及方法
WO2015184001A1 (en) 2014-05-28 2015-12-03 Academia Sinica Anti-tnf-alpha glycoantibodies and uses thereof
MA42561A (fr) 2014-09-02 2018-04-25 Immunogen Inc Procédés de formulation de compositions de conjugués anticorps-médicament
EA034138B1 (ru) 2014-09-03 2020-01-09 Иммуноджен, Инк. Цитотоксические бензодиазепиновые производные
TW201613930A (en) 2014-09-03 2016-04-16 Immunogen Inc Cytotoxic benzodiazepine derivatives
WO2016040369A2 (en) 2014-09-08 2016-03-17 Academia Sinica HUMAN iNKT CELL ACTIVATION USING GLYCOLIPIDS
AU2015327824B2 (en) 2014-10-02 2021-01-07 City Of Hope Multivalent meditopes, meditope-binding antibodies and uses thereof
SG11201703599VA (en) 2014-11-19 2017-06-29 Immunogen Inc Process for preparing cell-binding agent-cytotoxic agent conjugates
US9975965B2 (en) 2015-01-16 2018-05-22 Academia Sinica Compositions and methods for treatment and detection of cancers
US10495645B2 (en) 2015-01-16 2019-12-03 Academia Sinica Cancer markers and methods of use thereof
MX2017015039A (es) * 2015-06-08 2018-08-09 Debiopharm Int Sa Combinaciones de inmunoconjugado anti-cd37 y anticuerpo anti-cd20.
LT3313845T (lt) 2015-06-29 2020-12-10 Immunogen, Inc. Cisteino inžinerijos antikūnų konjugatai
CA2995243A1 (en) 2015-08-28 2017-03-09 Debiopharm International, S.A. Antibodies and assays for detection of cd37
US20170189548A1 (en) 2015-11-25 2017-07-06 Immunogen, Inc. Pharmaceutical formulations and methods of use thereof
CN107405408B (zh) * 2015-12-21 2021-07-02 江苏恒瑞医药股份有限公司 一种抗体药物偶联物的制备方法
SG11201806478PA (en) 2016-02-05 2018-08-30 Immunogen Inc Efficient process for preparing cell-binding agent-cytotoxic agent conjugates
WO2017156192A1 (en) 2016-03-08 2017-09-14 Academia Sinica Methods for modular synthesis of n-glycans and arrays thereof
US10918627B2 (en) 2016-05-11 2021-02-16 Massachusetts Institute Of Technology Convergent and enantioselective total synthesis of Communesin analogs
JP7213549B2 (ja) 2016-08-22 2023-01-27 シーエイチオー ファーマ インコーポレイテッド 抗体、結合性断片、および使用の方法
EP3535297B1 (en) 2016-11-02 2022-08-10 Debiopharm International, S.A. Methods for improving anti-cd37 immunoconjugate therapy
CN110392685B (zh) 2016-11-23 2023-07-04 伊缪诺金公司 苯并二氮卓衍生物的选择性磺化
WO2018160539A1 (en) 2017-02-28 2018-09-07 Immunogen, Inc. Maytansinoid derivatives with self-immolative peptide linkers and conjugates thereof
AU2018236450A1 (en) 2017-03-16 2019-10-03 The General Hospital Corporation Chimeric antigen receptors targeting CD37
CA3057907A1 (en) 2017-03-31 2018-10-04 Genmab Holding B.V. Bispecific anti-cd37 antibodies, monoclonal anti-cd37 antibodies and methods of use thereof
US20180346488A1 (en) 2017-04-20 2018-12-06 Immunogen, Inc. Cytotoxic benzodiazepine derivatives and conjugates thereof
US11932650B2 (en) 2017-05-11 2024-03-19 Massachusetts Institute Of Technology Potent agelastatin derivatives as modulators for cancer invasion and metastasis
US10640508B2 (en) 2017-10-13 2020-05-05 Massachusetts Institute Of Technology Diazene directed modular synthesis of compounds with quaternary carbon centers
EP3732178A1 (en) 2017-12-28 2020-11-04 ImmunoGen, Inc. Benzodiazepine derivatives
JP2021510740A (ja) 2018-01-24 2021-04-30 ゲンマブ ビー．ブイ． ポリペプチド変種およびそれらの用途
CA3098486A1 (en) 2018-05-03 2019-11-07 Genmab B.V. Antibody variant combinations and uses thereof
AU2019277836A1 (en) 2018-05-30 2021-01-21 Debiopharm International, S.A. Anti-CD37 immunoconjugate dosing regimens
CA3104390A1 (en) 2018-06-22 2019-12-26 Genmab A/S Method for producing a controlled mixture of two or more different antibodies
WO2019243636A1 (en) 2018-06-22 2019-12-26 Genmab Holding B.V. Anti-cd37 antibodies and anti-cd20 antibodies, compositions and methods of use thereof
KR20210116429A (ko) 2018-10-04 2021-09-27 젠맵 홀딩 비.브이. 이중특이적 항-cd37 항체를 포함하는 제약 조성물
KR20220027828A (ko) 2019-04-26 2022-03-08 이뮤노젠 아이엔씨 캄프토테신 유도체
US11535634B2 (en) 2019-06-05 2022-12-27 Massachusetts Institute Of Technology Compounds, conjugates, and compositions of epipolythiodiketopiperazines and polythiodiketopiperazines and uses thereof
EP4055046A1 (en) 2019-11-06 2022-09-14 Genmab B.V. Antibody variant combinations and uses thereof
CN115427814A (zh) 2020-02-21 2022-12-02 根马布有限公司 用于定量糖蛋白的方法
WO2023198884A1 (en) 2022-04-14 2023-10-19 Debiopharm Research & Manufacturing S.A. Ligand-drug-conjugates with improved pharmacokinetic and drug release properties

Family Cites Families (138)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3720760A (en) 1968-09-06 1973-03-13 Pharmacia Ab Method for determining the presence of reagin-immunoglobulins(reagin-ig)directed against certain allergens,in aqueous samples
US4307016A (en) 1978-03-24 1981-12-22 Takeda Chemical Industries, Ltd. Demethyl maytansinoids
US4256746A (en) 1978-11-14 1981-03-17 Takeda Chemical Industries Dechloromaytansinoids, their pharmaceutical compositions and method of use
JPS55102583A (en) 1979-01-31 1980-08-05 Takeda Chem Ind Ltd 20-acyloxy-20-demethylmaytansinoid compound
JPS55162791A (en) 1979-06-05 1980-12-18 Takeda Chem Ind Ltd Antibiotic c-15003pnd and its preparation
JPS5645483A (en) 1979-09-19 1981-04-25 Takeda Chem Ind Ltd C-15003phm and its preparation
EP0028683A1 (en) 1979-09-21 1981-05-20 Takeda Chemical Industries, Ltd. Antibiotic C-15003 PHO and production thereof
JPS5645485A (en) 1979-09-21 1981-04-25 Takeda Chem Ind Ltd Production of c-15003pnd
WO1982001188A1 (en) 1980-10-08 1982-04-15 Takeda Chemical Industries Ltd 4,5-deoxymaytansinoide compounds and process for preparing same
US4450254A (en) 1980-11-03 1984-05-22 Standard Oil Company Impact improvement of high nitrile resins
US4313946A (en) 1981-01-27 1982-02-02 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Chemotherapeutically active maytansinoids from Trewia nudiflora
US4315929A (en) 1981-01-27 1982-02-16 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Method of controlling the European corn borer with trewiasine
US4563304A (en) 1981-02-27 1986-01-07 Pharmacia Fine Chemicals Ab Pyridine compounds modifying proteins, polypeptides or polysaccharides
JPS57192389A (en) 1981-05-20 1982-11-26 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid
US4588585A (en) 1982-10-19 1986-05-13 Cetus Corporation Human recombinant cysteine depleted interferon-β muteins
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4676980A (en) 1985-09-23 1987-06-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Target specific cross-linked heteroantibodies
US5681718A (en) 1986-03-14 1997-10-28 Celltech Limited Methods for enhanced production of tissue plasminogen activator in cell culture using alkanoic acids or salts thereof
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
IL89220A (en) 1988-02-11 1994-02-27 Bristol Myers Squibb Co Immunoconjugates of anthracycline, their production and pharmaceutical preparations containing them
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
US5750373A (en) 1990-12-03 1998-05-12 Genentech, Inc. Enrichment method for variant proteins having altered binding properties, M13 phagemids, and growth hormone variants
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5208020A (en) 1989-10-25 1993-05-04 Immunogen Inc. Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
US5705337A (en) 1990-06-11 1998-01-06 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: chemi-SELEX
US5270163A (en) 1990-06-11 1993-12-14 University Research Corporation Methods for identifying nucleic acid ligands
US5496938A (en) 1990-06-11 1996-03-05 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Nucleic acid ligands to HIV-RT and HIV-1 rev
US6344321B1 (en) 1990-06-11 2002-02-05 Gilead Sciences, Inc. Nucleic acid ligands which bind to hepatocyte growth factor/scatter factor (HGF/SF) or its receptor c-met
US5683867A (en) 1990-06-11 1997-11-04 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: blended SELEX
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
US6172197B1 (en) 1991-07-10 2001-01-09 Medical Research Council Methods for producing members of specific binding pairs
WO1992003918A1 (en) 1990-08-29 1992-03-19 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5840867A (en) 1991-02-21 1998-11-24 Gilead Sciences, Inc. Aptamer analogs specific for biomolecules
US5582981A (en) 1991-08-14 1996-12-10 Gilead Sciences, Inc. Method for identifying an oligonucleotide aptamer specific for a target
ATE275198T1 (de) 1991-12-02 2004-09-15 Medical Res Council Herstellung von antikörpern auf phagenoberflächen ausgehend von antikörpersegmentbibliotheken.
CA2076465C (en) 1992-03-25 2002-11-26 Ravi V. J. Chari Cell binding agent conjugates of analogues and derivatives of cc-1065
US5756291A (en) 1992-08-21 1998-05-26 Gilead Sciences, Inc. Aptamers specific for biomolecules and methods of making
US5595756A (en) 1993-12-22 1997-01-21 Inex Pharmaceuticals Corporation Liposomal compositions for enhanced retention of bioactive agents
US5977316A (en) 1995-01-17 1999-11-02 The Board Of Trustees Of The University Of Kentucky Monoclonal antibody 1A7 and related polypeptides
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US5641870A (en) 1995-04-20 1997-06-24 Genentech, Inc. Low pH hydrophobic interaction chromatography for antibody purification
CA2229043C (en) 1995-08-18 2016-06-07 Morphosys Gesellschaft Fur Proteinoptimierung Mbh Protein/(poly)peptide libraries
US6696248B1 (en) 1995-08-18 2004-02-24 Morphosys Ag Protein/(poly)peptide libraries
US20030054360A1 (en) 1999-01-19 2003-03-20 Larry Gold Method and apparatus for the automated generation of nucleic acid ligands
ES2353268T3 (es) 1999-07-02 2011-02-28 Morphosys Ag Generacion de elementos de union especifica que se unen a (poli)peptidos codificados por fragmentos de adn genomico o est.
EP2289549A3 (en) 1999-10-01 2011-06-15 Immunogen, Inc. Immunoconjugates for treating cancer
US7303749B1 (en) 1999-10-01 2007-12-04 Immunogen Inc. Compositions and methods for treating cancer using immunoconjugates and chemotherapeutic agents
IL153764A0 (en) * 2000-07-12 2003-07-06 Idec Pharma Corp Treatment of b cell malignancies using combination of b cell depleting antibody and immune modulating antibody related applications
US6333410B1 (en) 2000-08-18 2001-12-25 Immunogen, Inc. Process for the preparation and purification of thiol-containing maytansinoids
EP1330544A4 (en) 2000-09-26 2005-04-06 Univ Duke RNA APTAMERS AND METHOD OF IDENTIFYING SAID APTAMERS
US7829084B2 (en) * 2001-01-17 2010-11-09 Trubion Pharmaceuticals, Inc. Binding constructs and methods for use thereof
US7754208B2 (en) 2001-01-17 2010-07-13 Trubion Pharmaceuticals, Inc. Binding domain-immunoglobulin fusion proteins
WO2002060484A1 (en) 2001-01-31 2002-08-08 Idec Pharmaceuticals Corporation Use of cd23 antagonists for the treatment of neoplastic disorders
US20030103971A1 (en) * 2001-11-09 2003-06-05 Kandasamy Hariharan Immunoregulatory antibodies and uses thereof
JP4463475B2 (ja) * 2001-01-31 2010-05-19 バイオジェン アイデック インコーポレイテッド 腫瘍疾患の治療における免疫調節性抗体の使用
US6441163B1 (en) 2001-05-31 2002-08-27 Immunogen, Inc. Methods for preparation of cytotoxic conjugates of maytansinoids and cell binding agents
JP2005500034A (ja) 2001-06-20 2005-01-06 プロション バイオテク リミテッド 受容体型タンパク質チロシンキナーゼ活性化を遮断する抗体、そのスクリーニング方法、及びその使用
US7786264B2 (en) 2001-11-08 2010-08-31 Beijing Wantai Biological Pharmacy Enterprise Co., Ltd Monoclonal antibody against hepatitis E virus or its fragment with binding activity and use thereof
WO2003048306A2 (en) * 2001-11-16 2003-06-12 Idec Pharmaceuticals Corporation Polycistronic expression of antibodies
US6716821B2 (en) 2001-12-21 2004-04-06 Immunogen Inc. Cytotoxic agents bearing a reactive polyethylene glycol moiety, cytotoxic conjugates comprising polyethylene glycol linking groups, and methods of making and using the same
AU2003217379A1 (en) 2002-02-15 2003-09-09 Somalogic, Inc. Methods and reagents for detecting target binding by nucleic acid ligands
GB0216648D0 (en) 2002-07-18 2002-08-28 Lonza Biologics Plc Method of expressing recombinant protein in CHO cells
CA2505717A1 (en) * 2002-11-15 2004-06-03 Immunomedics, Inc. Use of multi-specific, non-covalent complexes for targeted delivery of therapeutics
US20050124565A1 (en) 2002-11-21 2005-06-09 Diener John L. Stabilized aptamers to platelet derived growth factor and their use as oncology therapeutics
EP1572242B1 (en) 2002-12-13 2014-04-16 Immunomedics, Inc. Immunoconjugates with an intracellularly-cleavable linkage
US7534427B2 (en) 2002-12-31 2009-05-19 Immunomedics, Inc. Immunotherapy of B cell malignancies and autoimmune diseases using unconjugated antibodies and conjugated antibodies and antibody combinations and fusion proteins
ES2702942T3 (es) 2003-04-17 2019-03-06 Alnylam Pharmaceuticals Inc Agentes de ARNi modificados
KR101412271B1 (ko) 2003-05-09 2014-06-25 듀크 유니버시티 Ｃｄ２０-특이적 항체 및 이를 이용한 방법
US8088387B2 (en) 2003-10-10 2012-01-03 Immunogen Inc. Method of targeting specific cell populations using cell-binding agent maytansinoid conjugates linked via a non-cleavable linker, said conjugates, and methods of making said conjugates
US7276497B2 (en) 2003-05-20 2007-10-02 Immunogen Inc. Cytotoxic agents comprising new maytansinoids
US7754209B2 (en) 2003-07-26 2010-07-13 Trubion Pharmaceuticals Binding constructs and methods for use thereof
WO2005024042A2 (en) 2003-09-04 2005-03-17 The Regents Of The University Of California Aptamers and methods for their in vitro selection and uses thereof
EP1725585A2 (en) 2004-03-10 2006-11-29 Lonza Ltd Method for producing antibodies
FR2867784B1 (fr) 2004-03-17 2006-06-09 Commissariat Energie Atomique Aptameres selectionnes a partir de cellules vivantes tumorales et leurs applications
US20050239134A1 (en) 2004-04-21 2005-10-27 Board Of Regents, The University Of Texas System Combinatorial selection of phosphorothioate single-stranded DNA aptamers for TGF-beta-1 protein
US7241598B2 (en) 2004-06-29 2007-07-10 The Chinese University Of Hong Kong Frame-shifting PCR for germline immunoglobulin genes retrieval and antibody engineering
WO2006085961A2 (en) 2004-06-30 2006-08-17 Centocor, Inc. Anti-mcp-1 antibodies, compositions, methods and uses
KR20070072510A (ko) 2004-08-30 2007-07-04 론자 바이올로직스 피엘씨 항체 정제를 위한 친화도- 및 이온 교환- 크로마토그래피
WO2006074397A2 (en) 2005-01-05 2006-07-13 Biogen Idec Ma Inc. Cripto binding molecules
KR101363120B1 (ko) 2005-02-10 2014-02-13 베일러 리서치 인스티튜트 항-인터페론 알파 모노클로날 항체 및 사용 방법
US8318906B2 (en) 2005-04-15 2012-11-27 The Regents Of The University Of California EMP2 antibodies and their therapeutic uses
WO2006117910A1 (ja) 2005-04-28 2006-11-09 Mochida Pharmaceutical Co., Ltd. 抗血小板膜糖蛋白質ⅵモノクローナル抗体
CN101223448B (zh) 2005-05-20 2012-01-18 健泰科生物技术公司 来自自身免疫病受试者的生物学样品的预处理
EP1904101A4 (en) 2005-06-08 2011-06-15 Univ Duke ANTI-CD19 ANTIBODY THERAPY FOR TRANSPLANTATION
UA97469C2 (uk) * 2005-07-25 2012-02-27 Емерджент Продакт Дівелопмент Сіетл, Елелсі Гуманізована специфічна до cd37 зв'язувальна молекула імуноглобуліну
US20080279850A1 (en) 2005-07-25 2008-11-13 Trubion Pharmaceuticals, Inc. B-Cell Reduction Using CD37-Specific and CD20-Specific Binding Molecules
US20070213292A1 (en) 2005-08-10 2007-09-13 The Rockefeller University Chemically modified oligonucleotides for use in modulating micro RNA and uses thereof
EP1806365A1 (en) * 2006-01-05 2007-07-11 Boehringer Ingelheim International GmbH Antibody molecules specific for fibroblast activation protein and immunoconjugates containing them
BRPI0711249A2 (pt) 2006-05-30 2012-03-13 Genentech, Inc. Anticorpos, polinucleotídeos, vetores, células hospedeira, métodos para fabricar um anticorpo, para detectar a presença de cd2 em uma amostra biológica, para tratar uma disfunção proliferativa de células b, para inibir proliferaçõa de células b, para tratar câncer, para fabricar um composto conjugado anti-corpo-droga. imunoconjugados,composições farmacêuticas, formulações farmacêuticas, conjugado anticorpo-droga, compostos conjugados anti-corpo-droga, teste para detectar células b e artigo de fabricação
NZ573646A (en) 2006-06-12 2012-04-27 Wyeth Llc Single-chain multivalent binding proteins with effector function
MX2009001110A (es) 2006-08-03 2009-05-11 Vaccinex Inc Anticuerpos monoclonales anti-il-6 y usos de los mismos.
US20100150948A1 (en) 2006-10-24 2010-06-17 Trubion Pharmaceuticals, Inc. Materials and methods for improved immunoglycoproteins
US7846434B2 (en) 2006-10-24 2010-12-07 Trubion Pharmaceuticals, Inc. Materials and methods for improved immunoglycoproteins
US7691980B2 (en) 2007-01-09 2010-04-06 Bio-Rad Laboratories, Inc. Enhanced capacity and purification of antibodies by mixed mode chromatography in the presence of aqueous-soluble nonionic organic polymers
CN101687915B8 (zh) * 2007-04-03 2018-08-03 安进研发（慕尼黑）股份有限公司 跨物种特异性CD3-ε结合结构域
WO2009023386A2 (en) * 2007-07-06 2009-02-19 Trubion Pharmaceuticals, Inc. Binding peptides having a c-terminally disposed specific binding domain
PE20090499A1 (es) * 2007-08-09 2009-05-18 Boehringer Ingelheim Int Anticuerpos anti-cd37
GB2454915B (en) 2007-11-23 2012-02-15 Schlumberger Holdings Spooling apparatus for well intervention system
WO2009085573A2 (en) 2007-12-28 2009-07-09 Spring Bioscience Corporation Quality control cell device for immunohistochemistry assay and methods of use thereof
US8093364B2 (en) 2008-01-18 2012-01-10 Bio-Rad Laboratories, Inc. Enhanced purification of antibodies and antibody fragments by apatite chromatography
NZ603059A (en) * 2008-04-11 2014-07-25 Emergent Product Dev Seattle Cd37 immunotherapeutic and combination with bifunctional chemotherapeutic thereof
US7740844B2 (en) 2008-04-29 2010-06-22 Taiwan Liposome Co. Ltd Anti-VEGF monoclonal antibody
SI2281006T1 (sl) 2008-04-30 2017-12-29 Immunogen, Inc. Premreževalci in njihova uporaba
BRPI0911442A2 (pt) 2008-04-30 2019-03-12 Immunogen, Inc. conjugados potentes e ligantes hidrofílicos
JP2011524421A (ja) 2008-06-16 2011-09-01 イミュノジェン・インコーポレーテッド 新規の相乗効果
CN102159248B (zh) 2008-07-15 2013-09-11 健泰科生物技术公司 蒽环类衍生物缀合物、它们的制备方法以及它们作为抗肿瘤化合物的用途
KR20110083730A (ko) 2008-11-13 2011-07-20 이머전트 프로덕트 디벨롭먼트 시애틀, 엘엘씨 Ｃｄ37 면역치료제 병용 요법 및 이의 용도
JP5812418B2 (ja) * 2009-04-17 2015-11-11 イムナス・ファーマ株式会社 Ａβオリゴマーに特異的に結合する抗体およびその利用
EP2486023A4 (en) 2009-10-06 2014-05-07 Immunogen Inc EFFICIENT CONJUGATES AND HYDROPHILIC BINDER
PT2519543T (pt) 2009-12-29 2016-10-07 Emergent Product Dev Seattle Proteínas de ligação de heterodímero e suas utilizações
US9175086B2 (en) 2010-02-10 2015-11-03 Immunogen, Inc. CD20 antibodies and uses thereof
EP2533810B1 (en) 2010-02-10 2016-10-12 ImmunoGen, Inc. Cd20 antibodies and uses thereof
LT2544719T (lt) 2010-03-12 2019-10-25 Debiopharm Int Sa Cd37 surišančios molekulės, ir jų imunokonjugatai
KR20130108069A (ko) 2010-04-15 2013-10-02 알퍼 바이오테크, 엘엘씨 Ｈｅｒ2 항원에 대한 모노클로날 항체 및 그를 위한 용도
US8795673B2 (en) 2011-03-29 2014-08-05 Immunogen, Inc. Preparation of maytansinoid antibody conjugates by a one-step process
JP6018622B2 (ja) 2011-04-01 2016-11-02 イミュノジェン， インコーポレイテッド Ｃｄ３７結合性分子及びその免疫複合体
US20130058947A1 (en) 2011-09-02 2013-03-07 Stem Centrx, Inc Novel Modulators and Methods of Use
CN109276713A (zh) 2011-12-13 2019-01-29 诺帝克纳诺维科特股份公司 嵌合的治疗性抗-cd37抗体hh1
RU2014140119A (ru) 2012-03-30 2016-05-27 Иммьюноджен, Инк. Способы повышения эффективности терапии на основе cd37
JP2015517512A (ja) 2012-05-16 2015-06-22 ベーリンガー インゲルハイム インターナショナル ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング Ｃｄ３７抗体の更なる薬剤との併用
US20140120083A1 (en) 2012-11-01 2014-05-01 Infinity Pharmaceuticals, Inc. Treatment of cancers using pi3 kinase isoform modulators
CA2884313C (en) 2012-12-13 2023-01-03 Immunomedics, Inc. Dosages of immunoconjugates of antibodies and sn-38 for improved efficacy and decreased toxicity
WO2014143807A2 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Stromatt Scott Anti-cd37 antibody and bcr pathway antagonist combination therapy for treatment of b-cell malignancies and disorders
WO2014197411A1 (en) 2013-06-05 2014-12-11 Merck Sharp & Dohme Corp. Compositions and methods for treating cancer
ES2741643T3 (es) 2013-06-07 2020-02-11 Nordic Nanovector Asa Terapia de combinación que comprende un anticuerpo anti-CD20 y el anticuerpo monoclonal HH1 radiomarcado
EP3043775B1 (en) 2013-09-11 2020-11-04 Eagle Biologics, Inc. Liquid protein formulations containing viscosity-lowering agents
CN114632158A (zh) 2013-11-07 2022-06-17 豪夫迈·罗氏有限公司 抗cd20抗体与btk抑制剂的组合疗法
WO2015116729A2 (en) 2014-01-28 2015-08-06 Emergent Product Development Seattle, Llc Anti-cd37 antibody and anti-cd20 antibody combination therapy for treatment of b-cell malignancies and disorders
WO2015175533A2 (en) 2014-05-13 2015-11-19 Immunogen, Inc. Anti-cd37 immunoconjugate dosing regimens
MX2017015039A (es) 2015-06-08 2018-08-09 Debiopharm Int Sa Combinaciones de inmunoconjugado anti-cd37 y anticuerpo anti-cd20.
CA2995243A1 (en) 2015-08-28 2017-03-09 Debiopharm International, S.A. Antibodies and assays for detection of cd37
EP3535297B1 (en) 2016-11-02 2022-08-10 Debiopharm International, S.A. Methods for improving anti-cd37 immunoconjugate therapy
AU2019277836A1 (en) 2018-05-30 2021-01-21 Debiopharm International, S.A. Anti-CD37 immunoconjugate dosing regimens

Also Published As

Publication number Publication date
CY1122091T1 (el) 2020-11-25
TWI638662B (zh) 2018-10-21
US9346887B2 (en) 2016-05-24
JP5932672B2 (ja) 2016-06-08
CA3015111C (en) 2022-05-17
KR101764572B1 (ko) 2017-08-03
BR112012023010A2 (pt) 2017-02-07
HRP20191688T1 (hr) 2019-12-27
JP2018138053A (ja) 2018-09-06
MY173839A (en) 2020-02-24
CN102971012A (zh) 2013-03-13
IL252398A0 (en) 2017-07-31
TW201206481A (en) 2012-02-16
JP2016127867A (ja) 2016-07-14
US11466095B2 (en) 2022-10-11
BR112012023010A8 (pt) 2017-12-26
KR101644674B1 (ko) 2016-08-02
TWI593424B (zh) 2017-08-01
IL252398B (en) 2018-10-31
MY177062A (en) 2020-09-03
CA2792618A1 (en) 2011-09-15
EP2544719A1 (en) 2013-01-16
JP2015091267A (ja) 2015-05-14
AR080513A1 (es) 2012-04-11
SG183542A1 (en) 2012-10-30
CN106046159A (zh) 2016-10-26
PL2544719T3 (pl) 2020-01-31
US20190218303A1 (en) 2019-07-18
RU2017102767A (ru) 2019-01-18
AU2015246118B2 (en) 2017-07-20
CN102971012B (zh) 2016-05-04
SI2544719T1 (sl) 2019-11-29
SG10201501803YA (en) 2015-05-28
US10202460B2 (en) 2019-02-12
EP2544719B1 (en) 2019-07-03
TW201607558A (zh) 2016-03-01
DK2544719T3 (da) 2019-10-14
PT2544719T (pt) 2019-10-17
WO2011112978A1 (en) 2011-09-15
SG10202001677QA (en) 2020-04-29
KR20130016272A (ko) 2013-02-14
RS59389B1 (sr) 2019-11-29
NZ703481A (en) 2016-02-26
US20110256153A1 (en) 2011-10-20
EP2544719A4 (en) 2013-10-09
KR20150021112A (ko) 2015-02-27
US20160326258A1 (en) 2016-11-10
US20130295104A1 (en) 2013-11-07
NZ602176A (en) 2015-01-30
LT2544719T (lt) 2019-10-25
AU2017248441A1 (en) 2017-11-02
RU2012139045A (ru) 2014-04-20
AU2015246118A1 (en) 2015-11-12
AU2011226672A1 (en) 2012-09-27
MX2012010514A (es) 2013-03-20
RU2610662C2 (ru) 2017-02-14
RU2017102767A3 (es) 2020-06-08
US20230287137A1 (en) 2023-09-14
CA2792618C (en) 2018-09-25
JP2020141693A (ja) 2020-09-10
AU2011226672B2 (en) 2015-07-23
RU2742743C2 (ru) 2021-02-10
EP3620467A1 (en) 2020-03-11
IL221682A (en) 2017-06-29
JP6133340B2 (ja) 2017-05-24
CA3015111A1 (en) 2011-09-15
MX338932B (es) 2016-05-06
JP2013524777A (ja) 2013-06-20
US8765917B2 (en) 2014-07-01
RU2610662C9 (ru) 2017-07-24
HUE046360T2 (hu) 2020-03-30
CN106046159B (zh) 2020-06-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11466095B2 (en) CD37-binding molecules and immunoconjugates thereof
ES2813549T3 (es) Inmunoconjugados que comprenden un anticuerpo del receptor 1 de folato
US20160017053A1 (en) Non-Antagonistic EGFR-Binding Molecules and Immunoconjugates Thereof
AU2017279600B2 (en) Folate Receptor 1 Antibodies and Immunoconjugates and Uses Thereof