JP2013524777A - Cd37結合分子及びそのイムノコンジュゲート - Google Patents
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Abstract
Description
本発明の理解を容易にするために、多くの用語及びフレーズを以下に定義する。
のアルゴリズムを組み込んだGCGソフトウエアパッケージにおけるGAPプログラムを用いることにより2つのアミノ酸配列の間のパーセント同一性を求めることができる(例えばBlossum62マトリックス又はPAM250マトリックス及びギャップウエイト16、14、12、10、8、6又は4及びレングスウエイト1、2、3、4、5を用いる)。あるいは特定の実施形態においては、ヌクレオチド又はアミノ酸配列の間のパーセント同一性はMyers and Miller (CABIOS, 4:11-17 (1989))のアルゴリズムを用いながら求める。例えばパーセント同一性はALIGNプログラム(バージョン2.0)を用いながら、そして、残基表を伴ったPAM120、ギャップレングスペナルティー12及びギャップペナルティー4を用いながら、求めることができる。特定のアライメントソフトウエアによる最大のアライメントのための適切なパラメーターは当業者が決定できる。特定の実施形態においては、アライメントソフトウエアのデフォルトパラメーターを使用する。特定の実施形態においては、第1のアミノ酸配列の第2の配列に対するパーセンテージ同一性「X」は100×(Y/Z)として計算され、式中、Yは第1及び第2の配列のアライメント(目視検査によるか特定の配列アライメントプログラムによりアラインした場合)における同一マッチとして採点されたアミノ酸残基の数であり、そしてZは第2の配列中の残基の総数である。第1の配列の長さが第2の配列より長い場合、第2の配列に対する第1の配列のパーセント同一性は第1の配列に対する第2の配列のパーセント同一性より長くなることになる。
本発明はCD37に特異的に結合する剤を提供する。これらの剤は本明細書においては、「CD37結合剤」と称する。ヒト、マカカ、及びネズミCD37に関する完全長アミノ酸配列は当該分野で知られており、そしてそれぞれ配列番号1〜3で示されるとおり、本明細書において提供される。
化抗体である。
腫瘍細胞の増殖の阻害、腫瘍内の癌幹細胞の発生頻度を低減することにより腫瘍の腫瘍形成性の低減、腫瘍生育の阻害、生存率の増大、腫瘍細胞の細胞死のトリガー、腫瘍形成性細胞から非腫瘍形成性状態への分化、又は腫瘍細胞の転移の防止、の1つ以上を有する。
2010年2月18日にATCCに寄託されたATCC受託番号PTA−10664、2010年2月18日にATCCに寄託されたATCC受託番号PTA−10665、2010年2月18日にATCCに寄託されたATCC受託番号PTA−10666、2010年2月18日にATCCに寄託されたATCC受託番号PTA−10667、2010年2月18日にATCCに寄託されたATCC受託番号PTA−10668、2010年2月18日にATCCに寄託されたATCC受託番号PTA−10669、及び、2010年2月18日にATCCに寄託されたATCC受託番号PTA−10670よりなる群から選択されるハイブリドーマにより生産される抗体であることができる(ATCC、10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 20110))。特定の実施形態においては、抗体はPTA−10665、PTA−10666、PTA−10667、PTA−10668、PTA−10669及びPTA−10679よりなる群から選択されるハイブリドーマから生産された抗体のVH−CDR及びVL−CDRを含む。
、ある塩基性アミノ酸の別の塩基性アミノ酸による、又は、ある中性アミノ酸の別の中性アミノ酸による置換を指す。保存的アミノ酸置換が意図するものは当該分野で良く知られている。
本発明は又、薬物又はプロドラッグに連結又はコンジュゲートされた本明細書に開示された抗CD37抗体、抗体フラグメント、及びそれらの機能的等価物を含むコンジュゲート(本明細書においてはイムノコンジュゲートとも称する)に関する。適当な薬物又はプロドラッグは当該分野で知られている。薬物又はプロドラッグは細胞傷害剤であることができる。本発明の細胞傷害コンジュゲートにおいて使用される細胞傷害剤は、細胞死をもたらすか、又は細胞死を誘導するか、又は一部の態様においては細胞の生存性を低下させる何れかの化合物であることができ、そして例えばマイタンシノイド及びマイタンシノイド類縁体を包含する。他の適当な細胞傷害剤は例えばベンゾジアゼピン、タキソイド、CC−1065及びCC−1065類縁体、デュオカルマイシン及びデュオカルマイシン類縁体、エネジイン、例えばカリケアマイシン、ドラスタチン及びドラスタチン類縁体、例えばオーリスタチン、トマイマイシン誘導体、レプトマイシン誘導体、メトトレキセート、シスプラチン、カルボプラチン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、メルファラン、マイトマイシンC、クロラムブシル及びモルホリノドキソルビシンである。
CB−[Xl−(−CH2−CH2O−)n−Y−D]m (I)
[D−Y−(−CH2−CH2O−)n−Xl]m−CB (I’)
であり、
式中:
CB−[Xl−(−CH2−CH2−O−)n−Yp−D]m (II)
[D−Yp−(−CH2−CH2−O−)n−Xl]m−CB (II’)
であり、式中、CBは抗CD37抗体又はフラグメントを示し;
III.ポリヌクレオチド
本発明のCD37結合剤(抗体、イムノコンジュゲート及びポリペプチドを包含)はB細胞悪性疾患のような癌の治療のような施療的治療方法を包含するがこれに限定されない種々の用途において有用である。特定の実施形態においては、剤は腫瘍生育を阻害し、分化を誘導し、腫瘍体積を低減し、及び/又は腫瘍の腫瘍形成性を低減するために有用である。使用方法はインビトロ、エクスビボ、又はインビボの方法であることができる。特定の実施形態においては、CD37結合剤又は抗体又はイムノコンジュゲート又はポリペプチドはそれが結合するヒトCD37の拮抗剤である。
非毒性緩衝物質、例えばリン酸塩、クエン酸塩及び他の有機酸;塩類、例えば塩化ナトリウム;抗酸化剤、例えばアスコルビン酸及びメチオニン;保存料(例えばオクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド;塩化ヘキサメトニウム;塩化ベンザルコニウム;塩化ベンゼトニウム;フェノール、ブチル又はベンジルアルコール;アルキルパラベン、例えばメチル又はプロピルパラベン;カテコール;レゾルシノール;シクロヘキサノール;3−ペンタノール;及びm−クレゾール);低分子量ポリペプチド(例えば約10アミノ酸残基未満);蛋白、例えば血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリン;親水性重合体、例えばポリビニルピロリドン;アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、又はリジン;炭水化物、例えば単糖類、2糖類、グルコース、マンノース、デキストリン;キレート形成剤、例えばEDTA;糖類、例えばスクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトール;塩形成対イオン、例えばナトリウム;金属複合体(例えばZn−蛋白複合体);及びノニオン性界面活性剤、例えばTWEEN又はポリエチレングリコール(PEG)を包含するがこれらに限定されない。
本発明は本明細書に記載した抗体、イムノコンジュゲート又は他の剤を含み、そして本明細書に記載した方法を実施するために使用できるキットを提供する。特定の実施形態においては、キットは容器1つ以上の中にCD37に対する精製された抗体少なくとも1つを含む。一部の実施形態においては、キットは対照、アッセイ実施のための説明書、及び結果の分析及び表示のための何れかの必要なソフトウエアの全てを含む検出アッセイを実施するために必要及び/又は十分な成分の全てを含有する。本発明の開示した抗体、イムノコンジュゲート及び他の剤は当該分野で良く知られている確立されたキットフォーマットの1つに容易に組み込むことができることが当業者の知る通りである。
(実施例1)
ヒトCD37の発現を可能とするXbaI及びBamHI制限部位によりフランキングされた全CD37CD配列(CDS)を含有する発現プラスミドpSRa−CD37を構築した。Balb/cマウスから誘導した前B細胞である300−19細胞(M. G. Reth等、1985, Nature, 317: 353-355)をこの発現プラスミドでトランスフェクトすることにより細胞表面上に高レベルのヒトCD37のを安定に発現させ、そしてBalb/cVAFマウスの免疫化のために使用した。マウスはImmunoGen,Incにおいて使用されている標準的免疫化プロトコルにより2〜3週毎マウス当たり約4x106個のCD37発現300−19細胞により皮下免疫した。免疫化したマウスは、ハイブリドーマ形成のために屠殺する3日前に抗原の別の用量によりブーストした。マウスの脾臓を標準的動物プロトコルに従って採集し、そして2枚の滅菌フロスト処理顕微鏡用スライドの間で磨砕することによりRPMI−1640培地中の単細胞懸濁液を得た。脾細胞をペレット化し、洗浄し、ポリエチレングリコール−1500(Roche783641)を用いることによりネズミミエローマP3X63Ag8.653細胞(J.F. Kearney等、1979, J Immunol, 123: 1548-1550)と融合させた。ヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジン(HAT)(SigmaH−0262)を含有するRPMI−1640選択培地に融合細胞を再懸濁し、そして37℃5%CO2下に96穴平底培養プレート(Corning−Costar3596、ウェル当たり細胞懸濁液200μL)中における生育に関して選択した。5日間インキュベートしたの地、培養上澄み100μLを各ウェルから取り出し、ヒポキサンチン−チミジン(HT)補給物(SigmaH−0137)を含有するRPMI−1640培地100μLと置き換えた。ハイブリドーマクローンが抗体スクリーニングに使用できるようになるまで、37℃5%CO2下にインキュベーションを継続した。J.Langone and H. Vunakis (Eds., Methods in Enzymology, Vol. 121,"Immunochemical Techniques, Part I"; Academic Press, Florida)及びE.Harlow and D. Lane ("Antibodies: A Laboratory Manual";1988; ColdSpring Harbor Laboratory Press, New York)に記載されているものを含むその他の免疫化およびハイブリドーマ生産の手法もまた使用できる。
CD37発現300−19細胞には結合するが非トランスフェクトの300−19細胞には結合しないマウスモノクローナル抗体の分泌に関してフローサイトメトリーによりハイブリドーマの培養上澄みをスクリーニングした。ハイブリドーマ上澄み100μLを100μLのFACS緩衝液(2%正常ヤギ血清を添加したRPMI−1640培地)中CD37発現300−19細胞又は非トランスフェクトの300−19細胞(試料当たり1x105個)の何れかと共に3時間インキュベートした。次に細胞をペレット化し、洗浄し、PEコンジュゲートヤギ抗マウスIgG抗体(Jackson Laboratory,FACS緩衝液中6μg/ml)と共に1時間インキュベートした。細胞を再度ペレット化し、FACS緩衝液で洗浄し、1%ホルムアルデヒド含有PBS200μL中に再懸濁した。試料はHTSマルチウェルサンプラーを用いたFACSCaliburフローサイトメトリー又はFACSアレイフローサイトメトリーを用いながら獲得し、そしてCellQuest Pro(全ての入手元はBD Biosciences,Sandiego,US)を用いて分析した。
抗体を例えばプロテインA又はGクロマトグラフィー(HiTrapプロテインA又はGHP、1mL、Amersham Biosciences)のような標準的方法を用いながらハイブリドーマサブクローン上澄みから精製した。要すれば、1/10容量の1MTris/HCl緩衝液、pH8.0を添加することにより上澄みをクロマトグラフィー用に調製した。pH調節上澄みを0.22μmのメンブレンフィルターで濾過し、そして結合緩衝液(PBS、pH7.3)で平衡化したカラムにロードした。カラムは280nmにおける吸光度が無く安定なベースラインが得られるまで結合緩衝液で洗浄した。0.5mL/分の流量を用いながら、0.15MNaClを含有する0.1M酢酸緩衝液、pH2.8で抗体を溶離した。約0.25mLの画分を採取し、1/10容量の1MTris/HCl、pH8.0を添加することにより中和した。ピーク画分を1xPBSに対して2回一夜透析し、0.2μmのメンブレンフィルターを通して濾過することにより滅菌した。精製された抗体はA280の吸光度により定量した。
(実施例2)
精製された抗体を用いながらフローサイトメトリーにより結合特異性を試験した。CD37発現300−19細胞へのmuCD37−3、muCD37−12、muCD37−38、muCD37−50、muCD37−51、muCD37−56及びmuCD37−57の結合及び親300−19細胞への結合が無いことを示すFACSヒストグラムを図1及び図2に示す。100μLのFACS緩衝液(2%正常ヤギ血清を添加したRPMI−1640培地)中のCD37発現300−19細胞又は非トランスフェクト300−19細胞(試料当たり細胞1x105個)の何れかと共に3時間、全てのネズミ抗体をインキュベートした。次に、細胞をペレット化し、洗浄し、100μLのFITC−コンジュゲートヤギ抗マウスIgG抗体(Jackson Laboratory,FACS緩衝液中6μg/ml)と共に1時間インキュベートした。
細胞を再度ペレット化し、FACS緩衝液で洗浄し、1%ホルムアルデヒド含有PBS200μL中に再懸濁した。試料はHTSマルチウェルサンプラーを用いたFACSCaliburフローサイトメトリー又はFACSアレイフローサイトメトリーを用いながら獲得し、そしてCellQuest Pro(全ての入手元はBD Biosciences,Sandiego,US)を用いて分析した。
(実施例3)
ネズミ抗CD37抗体はRamos及びRajiリンパ腫細胞系統のアポトーシスを誘導している。アポトーシスの程度はアネキシン−V(Invitrogen)のFITCコンジュゲートによる、及びTO−PRO−3(Invitrogen)による染色の後のフローサイトメトリー分析により計測した。健康正常細胞においては、ホスファチジルセリンは膜2層の内部上で発現され、そして原形質膜の内側から外側のリーフレットへのホスファチジルセリンの通過はアポトーシスの最も早期の検出可能なシグナルの1つである。アネキシン−Vは未損傷の細胞の細胞膜2層の外側上のホスファチジルセリンと結合するが内側上では結合しない。したがってアネキシン−V結合の程度はアポトーシスの誘導のインジケーターとなる。TO−PRO−3はアポトーシスの後期の段階起こるような膜の一体性が損なわれた場合にのみ、原形質膜を通過できる単量体シアニン核酸染色物である。細胞の3集団、即ち:非アポトーシス細胞(アネキシン−V陰性及びTO−PRO−3陰性)、早期アポトーシス細胞(アネキシン−V陽性及びTO−PRO−3陰性)及び壊死細胞又は後期アポトーシス細胞(アネキシン−V陽性及びTO−PRO−3陽性)が2色フローサイトメトリーにおいて識別可能である。
(実施例4)
抗CD37抗体が細胞の成育を阻害する能力をインビトロの細胞傷害アッセイを用いて計測した。完全RPMI培地(RPMI−1640、10%ウシ胎児血清、2mMグルタミン、1%ペニシリン−ストレプトマイシン、全試薬入手元Invitrogen)100μL中ウェル当たり5000細胞で標的細胞をプレーティングした。3倍連続希釈により完全RPMI培地中に抗体を添加し、そして100μLをウェル当たり添加した。最終濃度は典型的には3x10−8M〜4.6x10−12Mとなった。細胞を4〜5日間、湿潤5%CO2インキュベーター中37℃においてインキュベートした。残存細胞の生存性は比色WST−8アッセイ(Dojindo Molecular Technologies, Inc., Rockville, MD, US)により測定した。WST−8は生細胞中デヒドロゲナーゼにより還元されて組織培養基中可溶なオレンジ色のホルマザン生成物となる。生成されたホルマザンの量は生細胞数に直接比例する。WST−8を更に2〜4時間、湿潤5%CO2インキュベーター中37℃においてインキュベートした。マルチウェルプレートリーダー中450nmにおける吸光度(A450)を計測することによりプレートを分析した。培地及びWST−8のみを有するウェルのバックグラウンドA450を全ての数値から差し引いた。未投与細胞の入ったウェルの平均値で各投与試料値を割ることによりパーセント生存性を計算した。パーセント生存性=100*(A450投与試料−A450バックグラウンド)/(A450未投与試料−A450バックグラウンド)。各投与に関し片対数プロットにおいて抗体濃度に対してパーセント生存性値をプロットした。
(実施例5)
製造元のプロトコルに従ってRNeasyキット(QIAgen)を用いながらCD37−3ハイブリドーマ5x106細胞から全細胞RNAを調製した。その後SuperScriptIIcDNA合成キット(Invitrogen)を用いて全RNAからcDNAを合成した。
完全長抗体cDNA配列を得るために、可変領域に関するcDNA配列情報を生殖細胞系統定常領域配列に組み合わせた。次に重鎖及び軽鎖の分子量を計算し、ネズミCD37−3抗体のLC/MS分析で得られた分子量と比較した。分子量計測はCD37−3の軽鎖及び重鎖の両方に関するcDNA配列と合致している。
軽鎖可変領域の可変配列をpchCD37−3LCZプラスミド中のEcoRI及びBsiWI部位にクローニングする。重鎖可変領域はpchCD37−3HCNプラスミドのHindIII及びApa1部位にクローニングする。等価なプラスミドをchCD37−12に関して構築した。これらのプラスミドを用いて、標準的なリン酸カルシウム法(BD Biosciences, CalPhos Mammalian Transfection Kit, Cat # 631312)によりHEK-293T細胞中でキメラ抗体を発現した。上澄みは上記した標準的プロテインAクロマトグラフィー操作法を用いて精製したが、カルボキシメチル(CM)ファーストフローイオン交換(IEX)樹脂(GE Lifesciences)及び10mMリン酸カリウム、10mM塩化ナトリウム結合緩衝液(pH7.5)又は上記した代替のCHT法の何れかを用いた最終精製クロマトグラフィー工程を実施した。
(実施例6)
例えば参照により全体が本明細書に組み込まれるRoguska等、Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 91(3):969-973 (1994) 及びRoguska等、ProteinEng. 9(10):895-904 (1996)に記載のリサーフィシング方法に従ってCD37−3及びhuCD37−50抗体をヒト化した。リサーフィシングでは一般的に軽鎖及び重鎖の両方における可変領域フレームワーク表面残基の識別及びそれらをヒト等価物で置き換えることを行う。ネズミCDRはリサーフィシングされた抗体において温存される。CD37−3及びCD37−50の例示されるCDRは表1に示す通りに定義される。リサーフィシングのために使用される重鎖CDR2の定義に加えて、表にはネズミ及びヒトのCD37−3及びCD37−50の両方に関する例示されるKabat定義重鎖CDR2が示されている。下線を付した配列はリサーフィシングのためのCDRとは考えられないKabatの重鎖CDR2の部分をマークしている。
huCD37−3及びCD37−50に関する可変領域配列をコドン最適化し、Blue Heron Biotechnologyにより合成した。配列は単鎖哺乳類発現プラスミドにおける該当する定常配列とインフレームにクローニングするための制限酵素部位によりフランキングされている。軽鎖可変領域をpAbKZeoプラスミド中のEcoRI及びBsiWI部位にクローニングする。重鎖可変領域はpAbG1NeoプラスミドのHindIII及びApa1部位にクローニングする。これらのプラスミドを用いて、一過性又は安定な哺乳類細胞トランスフェクションにおいて組み換え抗体を発現させることができる。HEK293T細胞において組み換え抗体を発現するための一過性のトランスフェクションは変更されたPEI操作法(Durocher, Y.等、Nucleic Acids Res. 30:E9 (2002))を用いて実施した。上澄みはキメラ化抗体に関して上記した通り標準的操作法を用いながらプロテインA及び最終精製クロマトグラフィー工程により精製した。
単離された抗CD37抗体の活性を比較するために、以前に識別されている抗CD37抗体をクローニングして発現させた。抗CD37SMIPのDNA配列は配列番号51を用いてUS2007/0059306から引き出した。pAbG1Neo哺乳類発現プラスミド中へのクローニングのため、配列はHindIII及びXho1制限酵素部位によりフランキングされている。発現及び精製はhuCD37−3に関して上記した通り実施した。
(実施例7)
キメラ抗体chCD37−3及びchCD37−12を、それらのネズミ対応物との比較においてRamos細胞へのそれらの結合親和性についてアッセイした。実施例2に記載した通り、2次FITCコンジュゲートヤギ抗ネズミ及び抗ヒト抗体を用いながら、Ramos細胞及びmuCD37−3、chCD37−3、muCD37−12及びchCD37−12抗体を用いたフローサイトメトリー結合アッセイを実施し、そして分析した。図9Aは各抗体に関する非直線回帰により作成した用量応答曲線を示す。各抗体の見かけの解離定数(Kd)の値はGraphPad Prismv4(GraphPad software,San Diego,CA)を用いながら計算した。muCD37−3、chCD37−3、muCD37−12及びchCD37−12のKdはそれぞれ0.4nM、0.8nM、0.8nM及び1.2nMに相当しているため、何れの抗体の結合親和性にもキメラ化が大きく影響しなかったことがわかった。
BJAB細胞を及び競合的結合フォーマット用いたフローサイトメトリー結合アッセイを用いてキメラ及びヒト化バージョンのCD37−3の結合親和性を評価した。BJAB細胞を1nM濃度のPE標識muCD37−3抗体と共にインキュベートし、種々の量のmuCD37−3、chCD37−3、huCD37−3v1.0又はhuCD37−3v1.01を添加することにより競合を計測した。試料を4℃で3時間インキュベートした。次に、細胞をペレット化し、FACS緩衝液で洗浄し、1%ホルムアルデヒド含有PBS200μL中に再懸濁した。試料はHTSマルチウェルサンプラーを用いたFACSCaliburフローサイトメトリーを用いながら獲得し、そしてCellQuest Pro(全ての入手元はBD Biosciences,Sandiego,US)を用いて分析した。得られた平均PE蛍光を片対数プロットで使用した競合抗体の量に対してプロットした。図9Bは各抗体の非直線回帰により形成した用量応答曲線を示す。各抗体の見かけの解離定数(Kd)の値はGraphPad Prismv4(GraphPad software,San Diego,CA)を用いながら計算した。全てのバージョンがネズミ親抗体との結合に関して等しく良好に競合しているため、CD37−3の結合親和性にはキメラ化又はヒト化が影響しないと観察された。
muCD37−3、chCD37−3、huCD37−3v1.0又はhuCD37−3v1.01の競合的結合のEC50はそれぞれ0.8nM、0.7nM、1nM及び0.6nMに相当している。
ヒト化抗体huCD37−38、huCD37−50、huCD37−51、huCD37−56及びchCD37−58を、それらのネズミ対応物との比較においてBJAB細胞へのそれらの結合親和性についてアッセイした。フローサイトメトリー結合試験を2次FITCコンジュゲートヤギ抗ネズミ及び抗ヒト抗体を用いながら実施し、実施例2に記載の通り分析し、そして各抗体に関する非直線回帰により用量応答曲線を作成した。各抗体の見かけの解離定数(Kd)の値はGraphPad Prismv4(GraphPad software,San Diego,CA)を用いながら計算した。ヒト化は何れの抗体の結合親和性にも大きく影響しなかったと観察された。muCD37−3及びhuCD37−3のKdは0.2nMに相当し、muCD37−38及びhuCD37−38のKdはそれぞれ0.4nM及び0.3nMに相当した。同様に、muCD37−50及びhuCD37−50のKdはそれぞれ0.6nM及び0.2nMに相当し、muCD37−51及びhuCD37−51のKdはそれぞれ0.6nM及び0.8nMに相当した。最後にmuCD37−56及びhuCD37−56のKdはそれぞれ0.4nM及び0.2nMに相当し、muCD37−57及びhuCD37−57のKdはそれぞれ1.0nM及び0.3nMに相当した。
(実施例8)
マカクCD37のCD37AA配列をGenbankから入手した(GI:718718)。配列をコドン最適化し、Blue Heron Biotechnologyにより合成した。マカクCD37の発現を可能にするXbaI及びBamHI制限部位によりフランキングされたマカク由来の全CD37コーディング配列(CDS)を含有する発現プラスミドpSRa−CD37macを構築した。300−19細胞、即ちBalb/cマウスから誘導した前B細胞系統(M. G. Reth等、1985, Nature, 317: 353-355)をこの発現プラスミドでトランスフェクトすることにより、細胞表面上にマカクCD37を安定に発現させた。
ネズミmuCD37−3、muCD37−12、muCD37−38、muCD37−50、muCD37−51、muCD37−56及びmuCD37−57を、マカクCD37を発現する300−19/CD37mac細胞に結合するそれらの能力に関してアッセイした。フローサイトメトリー結合試験を2次FITCコンジュゲートヤギ抗ネズミ又はヤギ抗ヒト抗体を用いながら実施し、実施例2に記載の通り分析した。結合を以前に記載した抗CD37抗体WR17及び抗CD37SMIPTRU−016と比較した。図10Aから明らかな通り、数種の単離された抗CD37抗体、muCD37−38、huCD37−50、muCD37−51、muCD37−56及びmuCD37−57はマカク誘導CD37抗原に結合することができる。一方、muCD37−3、muCD37−12、以前に記載した抗CD37抗体WR17及び抗CD37SMIPTRU−016はマカク誘導CD37抗原に結合することが不可能である。
ヒト化抗体huCD37−38、huCD37−50、huCD37−51、huCD37−56及びhuCD37−57を、マカクCD37を発現する300−19/CD37mac細胞に結合するそれらの能力に関してアッセイした。フローサイトメトリー結合試験を2次FITCコンジュゲートヤギ抗ヒト抗体を用いながら実施し、実施例2に記載の通り分析し、そして各抗体に関する非直線回帰により用量応答曲線を作成した。各抗体の見かけの解離定数(Kd)の値はGraphPad Prismv4(GraphPad software,San Diego,CA)を用いながら計算した。図10Bから明らかな通り、数種の単離されたヒト化抗体はマカクCD37に結合するが、huCD37−3は結合しない。huCD37−38、huCD37−50、huCD37−51、huCD37−56及びhuCD37−57に関するKd値はそれぞれ、1.1nM、1.8nM、14nM、5nM、及び2nMに相当する。従って、ヒト化は単離された抗体の結合特異性には影響しない。
(実施例9)
キメラ及びヒト化抗体の前アポトーシス活性をRamos細胞において評価した。細胞を10nM濃度の抗体又はhuIgGアイソタイプ対照抗体と共に20時間インキュベートした後に、アネキシン−V−FITCおよびTO−PRO−3染色及びフローサイトメトリー分析を行った。ChCD37−12はmuCD37−12の強力な前アポトーシス活性を保持していた。約40%のRamos細胞がmuCD37−12又はchCD37−12の何れかの投与後アネキシン−V陽性だったのに対し未投与対照細胞では4%であった。同様に約40%のRamos細胞がhuCD37−3、huCD37−38、huCD37−50、huCD37−51、huCD37−56及びhuCD37−57抗体の投与後アネキシン−V陽性だったのに対し、アイソタイプ対照投与又は未投与の細胞では4%であった。一方、抗CD37抗体リツキシマブの投与は僅か13%のアネキシン陽性細胞をもたらした。この結果は本発明において単離したネズミ抗CD37抗体の強力な前アポトーシス活性は、それらから誘導されたキメラ又はヒト化抗体により保持されていることを示している。従って、抗CD37抗体のこのグループのユニークな機能的特性、即ち架橋剤非存在下の強力な前アポトーシス活性はキメラ化又はヒト化により不の影響を受けない。
Ramos及びRajiリンパ腫細胞に対するhuCD37−3の前アポトーシス活性を抗CD37SMIPTRU−016と比較した。TRU−016は二次抗体に交差結合しない限り前アポトーシス活性を有さない化合物として報告されている。例示される抗CD37抗体huCD37−3及びchCD37−38は両方のリンパ腫細胞系統に対して遥かに強力な前アポトーシス活性を有することが明らかになっている。huCD37−3又はchCD37−38の投与は40%又は49%のアネキシン−V陽性Ramos細胞をもたらしたのに対し、未投与対照細胞では3%であった。リツキシマブ投与は僅か15%のみのアネキシン−V陽性Ramos細胞をもたらした。一方TRU−016投与はアネキシン陽性Ramos細胞のパーセンテージを増大させなかった。同様にhuCD37−3又はchCD37−38の投与は34%又は30%のアネキシン−V陽性Raji細胞をもたらしたが、未投与対照細胞では7%であった。リツキシマブ投与は僅か19%のアネキシン−V陽性Raji細胞をもたらした。一方TRU−016投与はアネキシン陽性Ramos細胞のパーセンテージを増大させなかった。
種々の量の各抗体を20時間Ramos細胞と共にインキュベートした後にアネキシン−V−FITCおよびTO−PRO−3染色及びフローサイトメトリー分析を行った。アネキシン−V陽性細胞のパーセンテージを片対数プロットで抗体濃度に対してプロットし、そして非直線回帰分析を用いながらフィットした曲線からEC50値を計算した。全てのヒト化抗体は強力な前アポトーシス活性を有することが観察され、アネキシン−V陽性細胞の最大パーセントは少なくとも40%であった。図11。この活性に関するEC50は、huCD37−3、huCD37−38及びhuCD37−50についてそれぞれ0.08.0.08及び0.11nMに相当する。更に、この活性に関するEC50は、huCD37−51、huCD37−56及びhuCD37−57についてそれぞれ0.41、0.57及び1.01nMに相当する。一方、抗CD20抗体リツキシマブの投与は僅か15%のアネキシン−V陽性細胞の最大パーセンテージをもたらし、これに対し、アイソタイプ対照抗体を投与された細胞では4%であった。
(実施例10)
キメラ及びヒト化抗CD37抗体が細胞生育を阻害する能力を実施例4に記載した通りインビトロの細胞傷害アッセイを用いて計測した。SU−DHL−4及びDOHH−2リンパ腫細胞を用いた典型的な増殖アッセイの結果を図12に示す。全ての抗体が実質的に、そして用量依存性の態様においてSU−DHL−4細胞の増殖を阻害できたことがわかる。例えばmuCD37−3の投与はSU−DHL−4細胞の生存性を35%まで低減し、EC50は0.07nMであった。同様にchCD37−3、huCD37−3v1.0又はhuCD37−3v1.01の投与は試験した最高抗体濃度において約30%までSU−DHL−4細胞の生存性を低減し、EC50はそれぞれ0.03nM、0.06nM、又は0.03nMであった。同様に全ての抗体が実質的に、そして用量依存性の態様においてDOHH−2濾胞性リンパ腫の増殖を阻害することができた。例えば、CD37−3投与は45%までDOHH−2細胞の生存性を低減し、EC50は0.05nMであった。同様にchCD37−3、huCD37−3v1.0又はhuCD37−3v1.01の投与は試験した約35%までDOHH−2細胞の生存性を低減し、EC50はそれぞれ0.06nM、0.07nM、又は0.05nMであった。この結果は種々のバージョンのCD37−3抗体がキメラ化又はヒト化により影響されない同様の抗増殖活性を有することを示している。
抗CD37抗体の抗増殖活性を更に特性化するために、本発明者等は例示されるhuCD37−3抗体の作用を抗CD37SMIPTRU−016化合物のものと比較した。腫瘍マイクロアレイを用いた免疫化学によれば、NHLのサブタイプにおいてCD37及びCD20は同様の発現パターン及びを示したことが確認された。以下の表12を参照できる。即ち抗CD37抗体リツキシマブとも比較した。細胞系統のパネルはGranta−519、SU−DHL−4、Namalwa及びDaudiリンパ腫細胞を包含している。図13.
(実施例11)
キメラ及びヒト化抗CD37抗体の補体依存性細胞傷害(CDC)活性を評価するために、公開されている方法(Gazzano-Santoro H, J Immunol Methods. 1997 202(2):163-71)に従って細胞系試験を実施した。抗体をRHBP(RPMI−1640、20mMHEPES、0.1%BSA、1%ペニシリン−ストレプトマイシン)培地中典型的には5μg/mL(=3.3x10−8M)から2.3ng/mL(=1.5x10−11M)の範囲の種々の濃度において平底96穴組織培養プレートに50μL/ウェルで2連に分注した。標的細胞をウェル当たり100μLのRHBP中、5x104細胞で抗体に添加した。凍結乾燥したヒト補体(Sigma−Aldrich、St.Louis、US)をバイアル当たり滅菌精製水1mLを用いて再建し、そして使用直前にRHBP培地で20%保存液となるように5倍希釈した。補体溶液50μL/ウェルを終濃度5%となるように各ウェルに添加した。プレートを5%CO2湿潤インキュベーター中37℃で2時間インキュベートすることにより補体媒介溶解を可能とした。このインキュベーション時間の後、残存細胞の生存性を計測するためにAlamar Blue試薬(Invitrogen)を終濃度10%となるように各ウェルに添加した。プレートを37℃で16〜20時間インキュベートした後、EX540/EM590nmにおいて蛍光(相対蛍光単位、RFUによる)を計測した。対照には、培地と補体を有するが細胞を有さない3連のウェル(培地のみ、0%生存性)及び細胞と補体を有するが抗体を有さないウェル(細胞のみ、100%生存性)を使用した。各試料に関する特異的細胞生存性のパーセンテージを以下の式、即ち:パーセント生存性=(試料−培地のみ)/(細胞のみ−培地のみ)により求めた。
(実施例12)
ラクテートデヒドロゲナーゼ(LDH)はエフェクター細胞としての新しく単離されたヒトナチュラルキラー(NK)細胞を用いた腫瘍細胞の抗体依存性細胞媒介性細胞傷害(ADCC)を計測するために使用されている(Shields RL, J Biol Chem. 2001 276(9):6591-604)。NK単離キットII(Miltenyi Biotech,130−091−152)に関する修正プロトコルを用いながら正常者ドナー由来のヒト血液(ResearchBlood Components, Inc., Brighton, MA)から最初に単離した。血液を1xPBSで2倍希釈した。希釈血液25mLを50mL三角試験管中の25mLのFicoll Paque上に慎重に重層し、RTで45分間400Gで遠心分離した。末梢血単核球(PBMC)を界面から収集し、新しい50mL三角試験管に移し、そして1xPBSで1回洗浄した。PBMCをNK単離緩衝液(1xPBS、0.5%BSA、2mMEDTA)2mL中に再懸濁し、次にビオチン抗体カクテル500μLを細胞懸濁液に添加した。ビオチン抗体カクテルは、NK細胞以外のリンパ球に結合してNK細胞の負の選択をもたらすビオチニル化抗体を含有する。混合物を10分間4℃でインキュベートし、次にNK単離緩衝液1.5mL及び抗ビオチンマイクロビーズ1mLを添加した。細胞−抗体混合物を4℃で更に15分インキュベートした。次に、細胞を1回50mLのNK単離緩衝液で洗浄し、3mLのNK単離緩衝液に再懸濁した。次にMACSLCカラムを自動MACS分離機(Miltenyi Biotech)上に搭載し、NK単離緩衝液3mLで予備洗浄した。細胞懸濁液を自動的にカラムにアプライし、洗浄し、そして未標識NK細胞を有する溶出画分を新しい50mL容量の三角試験管に収集した。得られたNK細胞を、一夜、完全RPMI培地(5%ウシ胎児血清、1%ペニシリン−ストレプトマイシン、1mMHEPES、1mMピルビン酸ナトリウム、1%100XMEM非必須アミノ酸溶液を添加したRPMI−1640)30mL中にプレーティングした。その後のアッセイ及び全ての希釈はRHBP培地(20mMHEPES、pH7.4、0.1%BSA及び1%ペニシリン−ストレプトマイシンを添加したRPMI−1640培地)中で実施した。
NK細胞単独、標的細胞単独(自発的LDH放出)、標的細胞とNK細胞(抗体非依存性LDH放出)、標的細胞と10%TritonX−100(最大LDH放出)を各実験に対して設定した。混合物を4時間3℃でインキュベートすることにより細胞溶解を可能とした。プレートを1200rpmで20分間遠心分離し、上澄み100μLを慎重に新しい平底96穴プレートに移した。細胞傷害検出キット(Roche 1644793)から入手したLDH反応混合物(100μL/ウェル)を各ウェルに添加し、5〜30分間室温でインキュベートした。試料の光学密度を490nmで計測した(OD490)。各試料のパーセント特異的溶解は、以下の式、即ち:パーセント特異的溶解=(試料の値−自発的放出)/(最大放出−自発的放出)*100を用いて求めた。
(実施例13)
種々異なるCD37抗体にのエピトープに関するアミノ酸の要件の位置決めは共通又はユニークな機能的特性を特定の分子相互作用に結びつける場合の材料となりえる。CD37の細胞外ドメインは2つの細胞外ループ、約18残基の小型ループ及び約135アミノ酸よりなるより大型のものを含有する。エピトープの要件は以前に公開されているCD37抗体に関しては説明されていない。本発明の単離されたCD37抗体を更に特性化するために、本発明者等はより大きい細胞外ループにおけるAA置換を有する数種のCD37抗原変異体を構築した。
全ヒト又はマカカのCD37cDNA配列、Blue Heron Biotechnologiesにより最適化及び合成され、pSRaベクターのマルチクローニング部位へのクローニングを容易にするためにXbaI及びBamHI制限部位にフランキングされたコドンを含む哺乳類発現プラスミドを構築した。ヒト及びマカカのCD37配列は高度に相同であるため(図16)、これらのコンストラクトの発現は、実施例8に説明するとおりこれら2つの種の間の11細胞外CD37アミノ酸の相違の少なくとも1つを必要とするエピトープを認識するものから、ヒト及びマカカの交差反応性の抗体を区別可能とするはずである。
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ヒトCD37の野生型及び変異体を発現する細胞への種々のCD37抗体の結合を各抗体1.5μg/mlを用いながらフローサイトメトリーにより分析した。本発明の単離された抗体を市販のCD37抗体WR17、並びにTRU−016SMIPと比較した。図18Aより解るとおり、全ての抗体が野生型CD37発現細胞に結合した。同様に試験した全ての抗体がhCD37−M3変異体に結合した(図18B)。一方、本発明の単離された抗体はhCD37−M1変異体に結合したが、TRU−016およびWR17はhCD37−M1変異体に結合できなかった(図19A)。CD37−50及びCD37−51抗体及びTRU−016はhCD37−M45変異体にも結合することができた。WR17はhCD37−M45変異体への部分的結合を示し、他の抗体であるCD37−3、CD37−12、CD37−38、CD37−56及びCD37−57は結合できなかった(図19B)。これは、本発明の単離された抗体の全てはがCD37−抗原への結合のために相当するネズミAA残基に変化したhCD37−M1変異体中の12AA残基を必要としないことを示唆している。一方CD37−3、CD37−12、CD37−38、CD37−56及びCD37−57抗体はCD37−抗原への結合のために相当するネズミAAに片かしらhCD37−M45変異体中の10AA残基の少なくとも1つを必要とする。
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である。
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である。更に、抗体結合のために重要な残基を識別するために、ヒト大型細胞外ループ中に1点突然変異が形成される。
(実施例14)
N−スクシンイミジル4−(2−ピリジルジチオ)ペンタノエート(SPP)リンカーをエタノールに溶解した。50mMNaCl、2mMEDTA及び5%エタノールを含有する50mMリン酸カリウム緩衝液(pH6.5)中室温で約100分、7倍モル過剰のSPPと共に5mg/mlでhuCD37−3抗体をインキュベートした。上記したリン酸カリウム緩衝液で平衡化させたSEPHADEXTMG25Fカラムを用いて反応混合物を精製した。抗体含有画分をプールし、その後の工程に使用した。
スクシンイミジル4−(N−マレイミドメチル)シクロヘキサン−1-カルボキシレート(SMCC、Pierce Biotechnology,Inc)リンカーをDMA中に溶解した。10モル過剰量のSMCCと共に50mMリン酸カリウム、50mMNaCl、2mMEDTA、pH6.5中、5mg/mlで抗体をインキュベートすることにより、huCD37−3抗体をSMCCで修飾してマレイミドを抗体内に導入した。周囲温度で約100分間の後、同じリン酸化リ緩衝液で平行化したSEPHADEXTMG25Fカラムを用いて反応混合物を精製した。抗体含有画分をプールし、その後の工程のために使用した。
DM4チオール及びヘテロ2官能性リンカー1−(2.5−ジオキソ−2.5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル)−4−(2,5−ジオキシピロリジン−1−イルオキシ)−4−オキソブタンー2−スルホン酸(3−スルホ−mal)の溶液を30〜60mMの濃度でN,N−ジメチルアセトアミド(DMA)中に作成した。200mMスクシネート緩衝液、2mMEDTA、pH5.0の40%v/vまでを含有するDMA中でリンカーとDM4を混合してリンカーに対するDM4の比を1.6とし、DM4の終濃度を15mMとした。混合の後、反応を2時間放置し、4mg/mlAb、90%リン酸緩衝液/10%DMA、pH7.5の最終コンジュゲーション条件下にリン酸塩緩衝液(pH7.5)中のhuCD37−3抗体の混合物に添加した。コンジュゲーション反応を2時間周囲温度において進行させた。huCD37−3−スルホ−mal−DM4コンジュゲートを過剰の未反応のDM4及び未コンジュゲートのリンカー産物から精製し、PBS中の透析、ついで10mMヒスチジン、250mMグリシン、1%スクロース含有する緩衝液、pH5.5中に最終透析した。コンジュゲートを0.22μmのフィルターを通して濾過し、最終保存用とした。最終コンジュゲートにおけるhuCD37−3抗体分子当たりのDM4分子の数(平均)、総遊離マイタンシノイド物質種のパーセンテージは上記した通り求めた。huCD37−3抗体当たり3.5〜4個のDM4分子を有するコンジュゲートが得られ、<1%が未コンジュゲートのマイタンシノイドとして存在していた。
N−ヒドロキシスクシンイミジル−(ポリエチレングリコール)4−(N−マレイミドメチル)-DM1(NHS−PEG4−mal−DM1)試薬をDMA中に溶解した。huCD37−3抗体を7倍モル過剰量のNHS−PEG4−mal−DM1(合計10%DMA)と共に、50mMリン酸カリウム、150mMNaCl、2mMEDTA、pH7.5中、5mg/mlでインキュベートした。周囲温度で約2時間の後、1xPBS、pH7.4で平衡化させたSEPHADEXTMG25カラムを用いて反応混合物を精製した。抗体含有画分をプールし、10mMヒスチジン、250mMグリシン、1%スクロースを含有する緩衝液、pH5.5中に透析した。抗体当たり連結したDM1分子の数及び総遊離マイタンシノイド分子種のパーセンテージを上記した通り求めた。
huCD37−3抗体当たり3.5〜4個のDM4分子を有するコンジュゲートが得られ、<1%が未コンジュゲートのマイタンシノイドとして存在していた。
(実施例15)
マイタンシノイドコンジュゲートの結合親和性
huCD37−57については0.30、そしてhuCD37−57−SMCC−DM1については0.34であった。この結果はSMCC−DM1コンジュゲーションもまたhuCD37−50、huCD37−51、huCD37−56又はhuCD37−57抗体の親和性を顕著には改変しないことを示している。
PEG4−mal−DM1へのコンジュゲーションの後の例示されるhuCD37−3及びhuCD37−50の結合親和性を上記実施例において記載したとおりフローサイトメトリーによりアッセイした。結合曲線から見かけの解離定数(Kd)の値を計算したところ、huCD37−については0.28nM、huCD37−3−PEG4−mal−DM1については0.35nM、huCD37−50については0.68nMそしてhuCD37−50−PEG4−mal−DM1コンジュゲートについては1.1nMに相当した。この結果はPEG4−mal−DM1コンジュゲーションが例示されるhuCD37−3又はhuCD50抗体の親和性を顕著には改変しないことを示している。
SMCC−DM1へのコンジュゲーションの後のhuCD37−3の前アポトーシス活性を上記したRamos細胞上のアネキシン−V染色により評価した。huCD37−3抗体又はhuCD37−3−SMCC−DM1コンジュゲートの何れかの投与は約40%のアネキシン−V陽性Ramos細胞をもたらし、EC50値は約0.09nMであった(図21A)。非結合紺個抗体又は非結合SMCC−DM1対照コンジュゲートを投与したRamos細胞は僅か4%までのアネキシン−V陽性細胞を含有していた。これと比較して、抗CD20抗体リツキシマブの投与は僅か16%のアネキシン−V陽性細胞をもたらし、EC50値は約2nMであった。一方、TRU−016投与はアネキシン−V陽性Ramos細胞のパーセンテージを増大させなかった。これはヒト抗CD37抗体huCD37−3の強力な前アポトーシス活性がSMCC−DM1へのコンジュゲーションの後にも維持されていることを示している。
SMCC−DM1へのコンジュゲーションの後のhuCD37−3のCDC活性を5%ヒト補体存在下Ramos細胞において評価した。huCD37−3又はhuCD37−3−SMCC−DM1の投与はそれぞれ53%及び73%までの細胞生存性の低下をもたらした(図21B)。従って、例示されるhuCD37−3抗体のCDC活性はマイタンシノイドコンジュゲーションの後も維持されている。
SMCC−DM1又はPEG4−mal−DM1へのコンジュゲーションの後のhuCD37−3のADCC活性を、上記した通りLDH放出によりヒトNKエフェクター相棒の存在下のDaudi及びRamos細胞において評価した。図22Aより明らかな通り、huCD37−3−SMCC−DM1又はhuCD37−3−PEG4−mal−DM1コンジュゲートはDaudi細胞に対する未コンジュゲートのhuCD37−3抗体と同様のADCC活性を有している。huCD37−3、huCD37−3−SMCC−DM1又はhuCD37−3−PEG4−mal−DM1の投与はそれぞれ約41%、39%又は36%のDaudi細胞溶解をもたらし、EC50値は0.42ng/mL、1.13ng/mL又は0.91ng/mLであった。同様の結果が標的細胞としてRamos細胞を用いた場合にも得られた。前と同様、huCD37−3−SMCC−DM1又はhuCD37−3−PEG4−mal−DM1コンジュゲートはRamos細胞に対して未コンジュゲートのhuCD37−3抗体に匹敵するADCC活性を有している(図22B)。huCD37−3、huCD37−3−SMCC−DM1又はhuCD37−3−PEG4−mal−DM1の投与はそれぞれ約43%、41%又は42%のRamos細胞溶解をもたらし、EC50値は0.95ng/mL、1.33ng/mL又は1.57ng/mLであった。従って、例示されるhuCD37−3抗体の強力なADCC活性はマイタンシノイドコンジュゲーションの後も維持されている。
細胞系統において細胞周期の停止を誘導する抗CD37抗体及びコンジュゲートの能力をヨウ化プロピジウム(PI)染色とその後のフローサイトメトリー分析により評価した。指数的に生育している細胞をRTで5分間1300rpmで遠心分離することにより採取し、そして完全RPMI培地中、0.5x106細胞/mlに懸濁した。細胞を0.5x106細胞/アッセイとなるように24穴プレート(Falcon3077)にウェル当たり1mLで移した。被験化合物を終濃度10nMで各ウェルに添加した。完全RPMI培地を未投与対照ウェルに添加した。細胞を湿潤5%CO2インキュベーター中37℃で16〜20時間一夜インキュベートした。翌日、5mLポリスチレン試験管に移すことにより細胞を採取し、3mLのPBSで1回洗浄し、そして氷り上30分間0%エタノール1mL中に固定した。次に試料を再度3mLのPBSで1回洗浄し、0.5mLPBS中に再懸濁した。RNaseを5μg/mlで試料に添加し、そして30分間37℃でインキュベートした。次に試料を終濃度50μg/mlでヨウ化プロピジウムで染色した。試料はPI染色の24時間以内に獲得した。試料をFACSCalibur(BD Biosciences,San Diego)上で泳動させた。FL2−Aパラメーターは直線スケールにセットし、そしてFL2PTMは200近傍にG1ピークが位置するように調節した。試料は低流量で獲得し、試料当たり10,000イベントを収集した。細胞周期の種々異なる期における細胞の分布をModFitソフトウエア(バージョン5.11、Vriety Software House Inc.,USA)を用いて求めた。このプログラムはPIデータを自動的にモデル化するためのピークフィッティング手法を利用しており、所望の定量的データを与える。データは標準的なプログラム設定で分析した。
これは単離された抗CD37抗体で作成されたマイタンシノイドコンジュゲートがCD37−陽性リンパ腫細胞系統の特異的細胞周期停止をもたらしたことを示している。
(実施例16)
細胞生育を阻害する抗CD37抗体コンジュゲートの能力を抗体に関して実施例10で記載したとおりインビトロの細胞傷害アッセイにおいて計測した。要すれば、完全RPMI培地(RPMI−1640、10%ウシ胎児血清、2mMグルタミン、1%ペニシリン−ストレプトマイシン、全試薬入手元Invitrogen)100μL中ウェル当たり5000細胞で標的細胞をプレーティングした。3倍連続希釈により完全RPMI培地中にコンジュゲートを添加し、そして100μLをウェル当たり添加した。最終濃度は典型的には3x10−8M〜4.6x10−12Mとなった。細胞を4〜5日間、湿潤5%CO2インキュベーター中37℃においてインキュベートした。残存細胞の生存性は比色WST−8アッセイにより抗体アッセイに関して記載した通り測定し、マルチウェルプレートリーダー(Dojindo Molecular Technologies, Inc., Rockville, MD, US)中450nmにおける吸光度(A450)を計測した。パーセント生存性は未投与細胞の入ったウェルの平均値で各投与試料の値を割ることにより計算した。各投与に関し片対数プロットにおいて抗体濃度に対してパーセント生存性値をプロットした。
種々の抗CD37抗体で作成したSMCC−DM1コンジュゲートのインビトロの細胞毒性を非特異的huIgG−SMCC−DM1コンジュゲートの活性と比較した。huCD37−3−SMCC−DM1、huCD37−38−SMCC−DM1、huCD37−50−SMCC−DM1、huCD37−51−SMCC−DM1、huCD37−56−SMCC−DM1、huCD37−57−SMCC−DM1、又は未結合huIgG1−SMCC−DM1対照コンジュゲートとともにインキュベートしたDaudi細胞について典型的な細胞傷害アッセイの結果を図24Aに示す。全ての特異的コンジュゲートが対照コンジュゲートと比較して特異的細胞殺傷をもたらしており、そして試験した最高濃度において細胞の生存性を完全に低減した。EC50はhuCD37−3、huCD37−38、huCD37−50、huCD37−51、huCD37−56及びhuCD37−57のSMCC−DM1コンジュゲートに関してそれぞれ0.067nM、0.098nM、0.13nM、0.20nM、0.31nM及び0.35nMに相当している。一方、非結合アイソタイプ対照抗体のSMCC−DM1コンジュゲートは僅か20nMのEC50値の細胞殺傷をもたらした。
0.47nM、0.074nM、0.12nM及び0.25nMであった。一方、非結合アイソタイプ対照抗体のSMCC−DM1コンジュゲートは僅か20nMのEC50値の細胞殺傷をもたらした。
Daudi、Granta−519及びBJAB細胞に対するhuCD37−3−SMCC−DM1、−SPP−DM1、及びスルホ−mal−DM4コンジュゲートのインビトロの細胞傷害を非特異的huIgG1−SMCC−DM1コンジュゲートの活性と比較した。試験した全コンジュゲートが試験した最高濃度において完全にDaudi細胞の生存性を低減しており、EC50値はhuCD37−3−SMCC−DM1、huCD37−3−SPP−DM1、及びhuCD37−3−スルホ−mal−DM4について、それぞれ0.065nM、0.12nM及び0.14nM、であった。一方、非特異的huIgG1−SMCC−DM1コンジュゲートは19nMのEC50を有していた。同様に、試験した全コンジュゲートが試験した最高濃度において完全にGranta−519細胞の生存性を低減しており、EC50値はhuCD37−3−SMCC−DM1、huCD37−3−SPP−DM1、及びhuCD37−3−スルホ−mal−DM4について、それぞれ0.047nM、0.13nM及び0.088nMであった。一方、非特異的huIgG1−SMCC−DM1コンジュゲートは19nMのEC50を有していた。最後に、試験した全コンジュゲートが試験した最高濃度において完全にBJAB細胞の生存性を低減しており、EC50値はhuCD37−3−SMCC−DM1、huCD37−3−SPP−DM1、及びhuCD37−3−スルホ−mal−DM4について、それぞれ0.041nM、0.11nM及び0.11nMであった。一方、非特異的huIgG1−SMCC−DM1コンジュゲートは16nMのEC50を有していた。
リンパ腫細胞系統のパネルに対するhuCD37−3−SMCC−DM1及びhuCD37−3−PEG4−mal−DM1コンジュゲートのインビトロ細胞毒性を非特異的huIgG1−SMCC−DM1コンジュゲートの活性と比較した。huCD37−3コンジュゲートの投与は試験した最高濃度においてDaudi細胞の生存性を完全に低減し、EC50はhuCD37−3−SMCC−DM1又はhuCD37−3−PEG4−mal−DM1コンジュゲートについてそれぞれ0.036nM又は0.018nMであった。一方、非結合アイソタイプ対照コンジュゲートは、huCD37−3−SMCC−DM1又はhuCD37−3−PEG4−mal−DM1についてそれぞれ16nM又は30nM超のEC50で生存性を低減した。同様に、huCD37−3コンジュゲートの投与は試験した最高濃度においてGranta−519細胞の生存性を完全に低減し、EC50はhuCD37−3−SMCC−DM1又はhuCD37−3−PEG4−mal−DM1コンジュゲートについてそれぞれ0.014nM又は0.012nMであった。一方、非結合アイソタイプ対照コンジュゲートは、huCD37−3−SMCC−DM1又はhuCD37−3−PEG4−mal−DM1についてそれぞれ6.0nM又は12nM超のEC50で生存性を低減した。
huCD37−3−SMCC−DM1の細胞傷害の特異性を更に確認するために、その活性を、非CD37発現Molt−4T細胞急性リンパ芽球性白血病細胞系統に対する非特異的huIgG−MCC−DM1コンジュゲートと比較した。比較的乏しい非特異的細胞傷害を捕らえるために両方のコンジュゲートを高濃度で本実験では使用した。huCD37−3−SMCC−DM1及び非特異的コンジュゲートはそれぞれ38nM及び42nMのEC50で同じ細胞傷害を示した。
これらの細胞傷害の結果を総括すれば、単離された抗CD37抗体を用いて作成したコンジュゲートはCD37陽性リンパ腫細胞系統のパネルに対して特異的な細胞傷害性を示したことは明らかである(図32B)。試験した各々の場合において、各CD37発現細胞系統について良好な特異性のウインドウが観察され、細胞傷害性が標的細胞への特異的抗CD37抗体結合の結果であることを示唆している。更に又、huCD37−3−SMCC−DM1及び非特異的コンジュゲートは抗原陰性Molt−4細胞に対して同じく乏しい細胞傷害性を示した。これは、この例示されるコンジュゲートで観察される細胞傷害がCD37発現依存性であることを示している。huCD37−3抗体は又、DOHH−2、Granta−519、SU−DHL−4、JVM−2及びJVM−3を包含する多くの細胞系統に対しても活性であった。一方、抗CD37SMIPTRU−016化合物はこれらの細胞系統の何れの生存に対しても直接の作用を有さなかった。抗CD20抗体は、定量的フローサイトメトリーにおいて計測される通りしばしばより高値のCD20発現レベルにも関わらずこれらの細胞系統の大部分においてhuCD37−3よりも低値の直接的活性を示していた(図32A)。
(実施例17)
抗CD37抗体及びそのSMCC−DM1コンジュゲートを、SCIDマウスに皮下移植されたBJABリンパ腫を用いながら樹立された異種移植片モデルにおいて試験した。平均腫瘍体積約120mm3に腫瘍が達した時点で動物を腫瘍体積により投与群に無作為に割り付け、そして、(A)huCD37-3Ab、huCD37-3−SMCC−DM1、huCD37-50Ab、huCD37-50−SMCC−DM1又は(B)huCD37-38Ab、huCD37-38−SMCC−DM1、huCD37-56Ab、huCD37-56−SMCC−DM1の何れか10mg/kgを、細胞接種後第12日に1回投与した。種々異なる投与群の平均腫瘍体積を図25において腫瘍細胞接種後の時間に対してプロットする。何れの抗体の投与も、平均腫瘍体積の中程度の低減をもたらしたのに対し、SMCC−DM1コンジュゲートの何れかの投与は平均腫瘍体積のより顕著な低減をもたらした。更に又、各投与につき、ベヒクル投与群のメジアン腫瘍体積で割った各投与群のメジアン腫瘍体積に相当する%T/C値を計算した。42%より低値の%T/C値を有する投与を活性とみなし、
12%未満の%T/Cを有する投与を高度に活性と見なす。試験した全てのSMCC−DM1コンジュゲートの投与はメジアン腫瘍体積の顕著な低減をもたらした。細胞接種後第29日の%T/CはhuCD37−3−SMCC−DM1、huCD37−50−SMCC−DM1、huCD37−38−SMCC−DM1、又はhuCD37−56−SMCC−DM1についてそれぞれ20%、20%、9%又は4%に相当した。
例示されるhuCD37−3抗体のスルホ−mal−DM4及びSPP−DM1コンジュゲートを、SCIDマウスに静脈内移植したBJABリンパ腫細胞を用いた異種移植片モデルにおいてSMCC−DM1コンジュゲートと比較した。
、細胞接種後第9日に1回投与した。種々異なる投与群の平均腫瘍体積を図26において腫瘍細胞接種後の時間に対してプロットする。何れのコンジュゲートの投与も、平均腫瘍体積の顕著な低減をもたらした。各投与群のメジアン腫瘍体積を用いながら各投与につき上記したとおり%T/C値を計算した。細胞接種後第21日の%T/CはhuCD37−3Ab、huCD37−3−SMCC−DM1、huCD37−3−スルホ−mal−DM4又はhuCD37−3−SPP−DM1について、それぞれ49%、5%、7%又は4%であった。第121日の試験終了時に、huCD37−3−スルホ−mal−DM4投与は8匹中3匹の無腫瘍生存動物(TFS)をもたらしたのに対し、huCD37−3−SPP−DM1投与は8匹中1匹のTFSであった。huCD37−3抗体、huCD37−3−SMCC−DM1又はPBSベヒクル対照群ではTFSは観察されなかった。これはhuCD37−3抗体のマイタンシノイドコンジュゲート、例えばSMCC−DM1、スルホ−mal−DM4又はSPP−DM1コンジュゲートがBJABモデルにおいて高度に活性であったことを示している。
SCIDマウスに皮下移植されたSU−DHL−4びまん性大細胞型B細胞リンパ腫細胞を用いた第2の異種移植片モデルを利用して、例示されるhuCD37−3抗体のスルホ−mal−DM4及びSPP−DM1コンジュゲートのインビボ薬効をSMCC−DM1コンジュゲートと比較しながら評価した。腫瘍樹立時に動物を体重により投与群に無作為に割り付け、そして、huCD37−3Ab、huCD37−3−SMCC−DM1、huCD37−3−スルホ−mal−DM4の10mg/kg又はhuCD37−3−SPP−DM1の5mg/kgの何れかを細胞接種後第17日に1回投与した。種々異なる投与群のメジアン腫瘍体積を図27において腫瘍細胞接種後の時間に対してプロットする。huCD37−3抗体の投与はメジアン腫瘍体積の低減をもたらし、コンジュゲートの何れの投与も、メジアン腫瘍体積のより顕著な低減をもたらした。各投与につき上記したとおり%T/C値を計算した。細胞接種後第37日の%T/CはhuCD37−3、huCD37−3−SMCC−DM1、huCD37−3−スルホ−mal−DM4又はhuCD37−3−SPP−DM1について、それぞれ32%、1%、1%又は3%であった。第125日の試験終了時、huCD37−3−SMCC−DM1又はhuCD37−3−スルホ−mal−DM4投与は10匹中8匹の無腫瘍生存動物(TFS)をもたらし、huCD37−3−SPP−DM1投与は10匹中9匹のTFSであった。huCD37−3抗体又はPBSベヒクル対照群ではTFSは観察されなかった。これはhuCD37−3抗体そのものがSU−DHL−4モデルにおいて単回10mg/kg用量で活性であったことを示している。更に又、マイタンシノイドコンジュゲート、例えばSMCC−DM1、スルホ−mal−DM4又はSPP−DM1コンジュゲートは抗体に薬効を追加し、そしてこのモデルにおいて更に高値の力価をもたらしている。
huCD37−抗体及びそのPEG4−mal−DM1及びSMCC−DM1コンジュゲートを、SCIDマウスに皮下移植されたBJABリンパ腫細胞を用いて樹立された異種移植片モデルにおいて試験した。平均腫瘍体積約120mm3に腫瘍が達した時点で動物を腫瘍体積により投与群に無作為に割り付け、そして、huCD37−3Ab、huCD37−3−SMCC−DM1、又はhuCD37−3−PEG4−mal−DM1の何れか10mg/kgを細胞移植後第9日に1回投与した。図28から解るとおり、何れのコンジュゲートの投与も平均腫瘍体積の顕著な低減をもたらした。各投与群のメジアン腫瘍体積を用いながら各投与につき上記したとおり%T/C値を計算した。細胞接種後第24日の%T/CはhuCD37−3、huCD37−3−SMCC−DM1又はhuCD37−3−PEG4−mal−DM1についてそれぞれ48%、16%又は5%であった。細胞接種後第74日において、huCD37−3−SMCC−DM1投与は9匹中1匹の無腫瘍生存動物(TFS)をもたらし、huCD37−3−PEG4−mal−DM1投与は9匹中1匹のTFSであった。huCD37−3抗体又はPBSベヒクル対照群ではTFSは観察されなかった。更に又、huCD37−3−SMCC−DM1はこのモデルにおいて5mg/kgの単回用量でも活性であり、細胞接種後第24日の%T/C値は34%であった。これはhuCD37−3抗体のマイタンシノイドコンジュゲート、例えばSMCC−DM1又はPEG4−mal−DM1コンジュゲートはBJABモデルにおいて高度に活性であったことを示している。
huCD37−抗体及びそのPEG4−mal−DM1及びSMCC−DM1コンジュゲートを、SCIDマウスに皮下移植されたSU−DHL−4びまん性大細胞型B細胞リンパ腫細胞を用いて樹立された異種移植片モデルにおいて試験した。動物を体重により投与群に無作為に割り付け、そして、huCD37−3Ab、huCD37−3−SMCC−DM1、又はhuCD37−3−PEG4−mal−DM1の何れか10mg/kgを細胞移植後第15日に1回投与した。種々異なる投与群の平均腫瘍体積を図29において腫瘍細胞接種後の時間に対してプロットする。huCD37−3抗体の投与は平均腫瘍体積の低減をもたらし、何れのコンジュゲートの投与も平均腫瘍体積のより顕著な低減をもたらしたことがわかる。各投与群のメジアン腫瘍体積を用いながら各投与につき上記したとおり%T/C値を計算した。細胞接種後第38日の%T/CはhuCD37−3、huCD37−3−SMCC−DM1又はhuCD37−3−PEG4−mal−DM1についてそれぞれ34%、4%又は2%であった。細胞接種後第74日において、huCD37−3−SMCC−DM1投与は10匹中8匹の無腫瘍生存動物(TFS)をもたらし、huCD37−3−PEG4−mal−DM1投与は10匹中10匹のTFSであった。huCD37−3抗体又はPBSベヒクル対照群ではTFSは観察されなかった。これはhuCD37−3抗体そのものがSU−DHL−4モデルにおいて単回10mg/kg用量で活性であったことを示している。更に又、マイタンシノイドコンジュゲート、例えばSMCC−DM1、PEG4−mal−DM4又はSPP−DM1コンジュゲートは抗体への未コンジュゲート抗体薬効と比較して増強した薬効を示し、そしてこのモデルにおいて更に高値の力価をもたらしている。huCD37−3−SMCC−DM1コンジュゲートもまた、このモデルにおいて2.5又は5mg/kgの単回用量において強力な薬効を示しており、細胞接種後第37日の%T/C値はそれぞれ18%及び6%であった。
huCD37−3抗体及びそのSMCC−DM1コンジュゲートを、SCIDマウスに皮下移植されたDoHH2濾胞性リンパ腫を用いて樹立された異種移植片モデルにおいて試験した。動物は腫瘍体積により投与群に無作為に割り付け、そして10mg/kgのhuCD37−3抗体又はhuCD37−3−SMCC−DM1コンジュゲートの単回投与;3週間週当たり2回リツキシマブ2mg/kgの6回投薬;又は単回4mg/kg用量のシクロホスファミド及び0.5mg/kgのビンクリスチンと共に5回毎日0.2mg/kg用量のプレドニソン(CVP)の投薬法の何れかを用いて接種後第12日に投与を開始した。種々異なる投与群のメジアン腫瘍体積を、図30において腫瘍細胞接種後の時間に対してプロットした。huCD37−3抗体の投与はメジアン腫瘍体積の低減をもたらし、huCD37−3−SMCC−DM1コンジュゲートの投与はリツキシマブ投与と同様のメジアン腫瘍低減及びCVP投与と比較した場合により持続性のあるメジアン腫瘍低減をもたらした。所定の大きさに到達するまでの投与群(T)及び対照群(C)の腫瘍にとって必要なメジアン時間(日数)として腫瘍生育遅延(T−C値)を定義し、そして、無腫瘍生存動物を除く各投与群について計算した。800mm3に到達するためのメジアン投与腫瘍のT−C値は、huCD37−3、huCD37−3−SMCC−DM1、リツキシマブ及びCVPについて、それぞれ8、25、24及び13日に相当した。細胞接種後第130日の試験終了時、huCD37−3−SMCC−DM1投与は9匹中1匹の無腫瘍生存動物(TFS)をもたらした。huCD37−抗体、リツキシマブ、CVP又はPBSベヒクル対照群ではTFSは観察されなかった。SMCC−DM1コンジュゲートはDoHH2モデルにおいて、リツキシマブに匹敵する腫瘍生育遅延及び未コンジュゲート抗体及びCVP投与と比較して増強された腫瘍生育遅延を示した。
huCD37−3抗体及びそのSMCC−DM1コンジュゲートを、SCIDマウスに皮下移植されたJVM−3慢性リンパ性白血病細胞を用いて樹立された異種移植片モデルにおいて試験した。動物は腫瘍体積により投与群に無作為に割り付け、そして単回投薬の10mg/kgのhuCD37−3抗体、5又は10mg/kg用量のhuCD37−3-SMCC−DM1コンジュゲート、3週間週当たり2階のオファツムマブ5mg/kgの6回投薬、又は、単回50mg/kg投薬のベンダムスチンの何れかを用いて接種後第7日に投与を開始した。種々異なる投与群のメジアン腫瘍体積を、図31において腫瘍細胞接種後の時間に対してプロットした。huCD37−3抗体の投与はメジアン腫瘍体積の低減をもたらし、huCD37−3−SMCC−DM1コンジュゲートの投与はメジアン腫瘍体積のより顕著な低減をもたらした。各投与群のメジアン腫瘍体積を用いながら各投与につき上記したとおり%T/C値を計算した。細胞接種後第20日の%T/CはhuCD37−3、5mg/kgのhuCD37−3−SMCC−DM1、10mg/kgのhuCD37−3−SMCC−DM1、オファツムマブ及びベンダムスチンについてそれぞれ31%、19%、10%、35%及び38%に相当した。細胞接種後第76日の試験終了時に、huCD37およびオファツムマブ抗体投与は共に
10匹中1匹の無腫瘍生存動物(TFS)をもたらし、5及び10mg/kgにおけるhuCD37−3−SMCC−DM1はそれぞれ10匹中1匹及び2匹のTFSであった。ベンダムスチン又はPBSベヒクル対照群ではTFSは観察されなかった。これはhuCD37−3抗体そのものがJVM−3モデルにおいて単回10mg/kg用量で活性であったことを示している。マイタンシノイドコンジュゲート、huCD37−3−SMCC−DM1は未コンジュゲート抗体と比較して増強された薬効を示した。更に又、huCD37−3−SMCC−DM1マイタンシノイドコンジュゲートの投与はこのモデルにおいてオファツムマブやベンダムスチン投与よりも寧ろ高値の力価をもたらした。
CD37はマイタンシノイドイムノコンジュゲートの標的として評価されてこなかったが、CD20は評価されてきた。CD37とCD20は、両方の抗原とも4つの膜貫通ドメインと1つは小型、そして1つは大型の細胞外ループを含有する細胞表面蛋白であるため、構造的には東洋である。何れかの抗原に対する抗体は緩徐に内在化し、そして緩徐〜中程度の速度の細胞内代謝を有することがわかっている(Press等、1989, Cancer Res. 49(17):4906-12, and Press等、1994, Blood.83(5):1390-7))。CD抗体のイムノコンジュゲートが以前より評価されている。1つの例においては、抗CD20抗体の切断不可能なMCC−DM1コンジュゲートが未コンジュゲートの抗体と同じ薬効を示し、そして同じ抗体の切断可能なSPP−DM1コンジュゲートがSCIDマウスにおけるGranta−519異種移植片モデルにおいて向上した薬効を示している(PolsonAG, Cancer Res 2009;69:2358-64)。同様に、酸安定性アミドリンカーを用いて作成されたリツキシマブのカリケアマイシンコンジュゲートはヌードマウスにおけるRamos異種移植片モデルにおいては向上したインビボの薬効を示していない。酸不安定性のジメチルヒドラジドAc−Butリンカーを用いて作成されたリツキシマブのカリケアマイシンコンジュゲートのみがこの試験において向上したインビボの薬効を示している(DiJosephJF, Cancer Immunol Immunotherapy 2007;56:1107-1117)。
Claims (66)
- 抗体又はその抗原結合フラグメントが補体依存性細胞傷害(CDC)を誘導することができる、CD37に特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメント。
- 該抗体が又、アポトーシスを誘導することもできる、請求項1記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
- 該抗体が又、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害(ADCC)を誘導することもできる、請求項1又は2記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
- 下記:
(a)配列番号55のポリペプチド及び配列番号72のポリペプチドを含む抗体;
(b)配列番号59のポリペプチド及び配列番号75のポリペプチドを含む抗体;
(c)配列番号61のポリペプチド及び配列番号77のポリペプチドを含む抗体;
(d)配列番号64のポリペプチド及び配列番号80のポリペプチドを含む抗体;
(e)配列番号66のポリペプチド及び配列番号82のポリペプチドを含む抗体;
(f)配列番号68のポリペプチド及び配列番号84のポリペプチドを含む抗体;及び、
(g)配列番号70のポリペプチド及び配列番号86のポリペプチドを含む抗体;
よりなる群から選択される抗体と同じCD37エピトープに特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメント。 - CD37に特異的に結合し、そして配列番号180のポリペプチドに特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメント。
- 該抗体又はそのフラグメントが配列番号184のポリペプチドに結合しない、請求項5記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
- CD37に特異的に結合し、そして配列番号184のポリペプチドに特異的に結合しない抗体又はその抗原結合フラグメント。
- 抗体又はその抗原結合フラグメントが下記:
(a)配列番号55のポリペプチド及び配列番号72のポリペプチドを含む抗体;
(b)配列番号59のポリペプチド及び配列番号75のポリペプチドを含む抗体;
(c)配列番号61のポリペプチド及び配列番号77のポリペプチドを含む抗体;
(d)配列番号64のポリペプチド及び配列番号80のポリペプチドを含む抗体;
(e)配列番号66のポリペプチド及び配列番号82のポリペプチドを含む抗体;
(f)配列番号68のポリペプチド及び配列番号84のポリペプチドを含む抗体;及び、
(g)配列番号70のポリペプチド及び配列番号86のポリペプチドを含む抗体;
よりなる群から選択される抗体を競合的に阻害するCD37に特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメント。 - 2010年2月18日にATCCに寄託されたATCC受託番号PTA−10664、2010年2月18日にATCCに寄託されたATCC受託番号PTA−10665、2010年2月18日にATCCに寄託されたATCC受託番号PTA−10666、2010年2月18日にATCCに寄託されたATCC受託番号PTA−10667、2010年2月18日にATCCに寄託されたATCC受託番号PTA−10668、2010年2月18日にATCCに寄託されたATCC受託番号PTA−10669、及び、2010年2月18日にATCCに寄託されたATCC受託番号PTA−10670よりなる群から選択されるハイブリドーマにより生産される抗体又はその抗原結合フラグメント。
- 抗体が下記:
(a)配列番号4、5及び6及び配列番号28、29及び30;
(b)配列番号7、8及び9及び配列番号31、32及び33;
(c)配列番号10、11及び12及び配列番号34、35及び36;
(d)配列番号13、14及び15及び配列番号37、38及び39;
(e)配列番号13、14及び15及び配列番号37、40及び39;
(f)配列番号16、17及び18及び配列番号41、42及び43;
(g)配列番号19、20及び21及び配列番号44、45及び46;
(h)配列番号19、20及び21及び配列番号44、47及び46;
(i)配列番号22、23及び24及び配列番号48、49及び50;
(j)配列番号22、23及び24及び配列番号48、51及び50;
(k)配列番号25、26及び27及び配列番号52、53及び54;及び、
(l)保存的アミノ酸置換1、2、3又は4つを含む(a)〜(k)の変異体;
よりなる群から選択されるポリペプチド配列を含むCD37に特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメント。 - 抗体が下記:
(a)配列番号55及び配列番号72;
(b)配列番号56及び配列番号73;
(c)配列番号57及び配列番号74;
(d)配列番号58及び配列番号74;
(e)配列番号59及び配列番号75;
(f)配列番号60及び配列番号76;
(g)配列番号61及び配列番号77;
(h)配列番号62及び配列番号78;
(i)配列番号63及び配列番号79;
(j)配列番号64及び配列番号80;
(k)配列番号65及び配列番号81;
(l)配列番号66及び配列番号82;
(m)配列番号67及び配列番号83;
(n)配列番号68及び配列番号84;
(o)配列番号69及び配列番号85;
(p)配列番号70及び配列番号86;及び
(q)配列番号71及び配列番号87;
よりなる群から選択されるポリペプチド配列に少なくとも90%同一であるポリペプチド配列を含む請求項10記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。 - ポリペプチド配列が下記:
(a)配列番号55及び配列番号72;
(b)配列番号56及び配列番号73;
(c)配列番号57及び配列番号74;
(d)配列番号58及び配列番号74;
(e)配列番号59及び配列番号75;
(f)配列番号60及び配列番号76;
(g)配列番号61及び配列番号77;
(h)配列番号62及び配列番号78;
(i)配列番号63及び配列番号79;
(j)配列番号64及び配列番号80;
(k)配列番号65及び配列番号81;
(l)配列番号66及び配列番号82;
(m)配列番号67及び配列番号83;
(n)配列番号68及び配列番号84;
(o)配列番号69及び配列番号85;
(p)配列番号70及び配列番号86;及び
(q)配列番号71及び配列番号87;
よりなる群から選択されるポリペプチド配列に少なくとも95%同一である請求項11記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。 - ポリペプチド配列が下記:
(a)配列番号55及び配列番号72;
(b)配列番号56及び配列番号73;
(c)配列番号57及び配列番号74;
(d)配列番号58及び配列番号74;
(e)配列番号59及び配列番号75;
(f)配列番号60及び配列番号76;
(g)配列番号61及び配列番号77;
(h)配列番号62及び配列番号78;
(i)配列番号63及び配列番号79;
(j)配列番号64及び配列番号80;
(k)配列番号65及び配列番号81;
(l)配列番号66及び配列番号82;
(m)配列番号67及び配列番号83;
(n)配列番号68及び配列番号84;
(o)配列番号69及び配列番号85;
(p)配列番号70及び配列番号86;及び
(q)配列番号71及び配列番号87;
よりなる群から選択されるポリペプチド配列に少なくとも99%同一である請求項12記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。 - 該抗体又はその抗原結合フラグメントがネズミ、非ヒト、ヒト化、キメラ、リサーフィシング化又はヒトのものである請求項1〜13の何れか1項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
- 該抗体又は抗体フラグメントが架橋剤の非存在下にインビトロでCD37を発現する細胞のアポトーシスを誘導することができる請求項4〜14の何れか1項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
- 該抗体又は抗原結合フラグメントが補体依存性細胞傷害(CDC)を誘導することができる請求項4〜14の何れか1項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
- 該抗体が抗体依存性細胞媒介性細胞傷害(ADCC)を誘導することができる請求項4〜14の何れか1項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
- ヒト又はヒト化抗体又はその抗原結合フラグメントが架橋剤の非存在下にインビトロでCD37を発現する細胞のアポトーシスを誘導することができる、CD37に特異的に結合するヒト又はヒト化抗体又はその抗原結合フラグメント。
- 該ヒト又はヒト化抗体又はその抗原結合フラグメントが又、補体依存性細胞傷害(CDC)を誘導することもできる請求項18記載のヒト又はヒト化抗体又はその抗原結合フラグメント。
- 該ヒト又はヒト化抗体又はその抗原結合フラグメントが又、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害(ADCC)を誘導することもできる請求項18又は請求項19記載のヒト又はヒト化抗体又はその抗原結合フラグメント。
- 該抗体がヒトCD37又はマカクCD37に結合する請求項1〜20の何れか1項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
- 完全長抗体である請求項1〜21の何れか1項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
- 抗原結合フラグメントである請求項1〜21の何れか1項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
- 該抗体又はその抗原結合フラグメントがFab、Fab’、F(ab’)2、Fd、単鎖Fv即ちscFv、ジスルフィド連結Fv、V−NARドメイン、IgNar、イントラボディー、IgGΔCH2、ミニボディー、F(ab')3、テトラボディー、トリアボディー、ダイアボディー、単ドメイン抗体、DVD−Ig、Fcab、mAb2、(scFv)2、又はscFv−Fcを含む請求項1〜21の何れか1項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
- 該ポリペプチドが下記:
(a)配列番号4、5及び6及び配列番号28、29及び30;
(b)配列番号7、8及び9及び配列番号31、32及び33;
(c)配列番号10、11及び12及び配列番号34、35及び36;
(d)配列番号13、14及び15及び配列番号37、38及び39;
(e)配列番号13、14及び15及び配列番号37、40及び39;
(f)配列番号16、17及び18及び配列番号41、42及び43;
(g)配列番号19、20及び21及び配列番号44、45及び46;
(h)配列番号19、20及び21及び配列番号44、47及び46;
(i)配列番号22、23及び24及び配列番号48、49及び50;
(j)配列番号22、23及び24及び配列番号48、51及び50;
(k)配列番号25、26及び27及び配列番号52、53及び54;及び、
(l)保存的アミノ酸置換1、2、3又は4つを含む(a)〜(k)の変異体;
よりなる群から選択される配列を含むCD37に特異的に結合するポリペプチド。 - 該ポリペプチドが下記:
(a)配列番号55及び配列番号72;
(b)配列番号56及び配列番号73;
(c)配列番号57及び配列番号74;
(d)配列番号58及び配列番号74;
(e)配列番号59及び配列番号75;
(f)配列番号60及び配列番号76;
(g)配列番号61及び配列番号77;
(h)配列番号62及び配列番号78;
(i)配列番号63及び配列番号79;
(j)配列番号64及び配列番号80;
(k)配列番号65及び配列番号81;
(l)配列番号66及び配列番号82;
(m)配列番号67及び配列番号83;
(n)配列番号68及び配列番号84;
(o)配列番号69及び配列番号85;
(p)配列番号70及び配列番号86;及び
(q)配列番号71及び配列番号87;
よりなる群から選択される配列に少なくとも90%同一である配列を含む請求項25記載のポリペプチド。 - 配列が下記:
(a)配列番号55及び配列番号72;
(b)配列番号56及び配列番号73;
(c)配列番号57及び配列番号74;
(d)配列番号58及び配列番号74;
(e)配列番号59及び配列番号75;
(f)配列番号60及び配列番号76;
(g)配列番号61及び配列番号77;
(h)配列番号62及び配列番号78;
(i)配列番号63及び配列番号79;
(j)配列番号64及び配列番号80;
(k)配列番号65及び配列番号81;
(l)配列番号66及び配列番号82;
(m)配列番号67及び配列番号83;
(n)配列番号68及び配列番号84;
(o)配列番号69及び配列番号85;
(p)配列番号70及び配列番号86;及び
(q)配列番号71及び配列番号87;
よりなる群から選択される配列に少なくとも95%同一である請求項26記載のポリペプチド。 - 配列が下記:
(a)配列番号55及び配列番号72;
(b)配列番号56及び配列番号73;
(c)配列番号57及び配列番号74;
(d)配列番号58及び配列番号74;
(e)配列番号59及び配列番号75;
(f)配列番号60及び配列番号76;
(g)配列番号61及び配列番号77;
(h)配列番号62及び配列番号78;
(i)配列番号63及び配列番号79;
(j)配列番号64及び配列番号80;
(k)配列番号65及び配列番号81;
(l)配列番号66及び配列番号82;
(m)配列番号67及び配列番号83;
(n)配列番号68及び配列番号84;
(o)配列番号69及び配列番号85;
(p)配列番号70及び配列番号86;及び
(q)配列番号71及び配列番号87;
よりなる群から選択される配列に少なくとも99%同一である請求項27記載のポリペプチド。 - 請求項1〜24の何れか1項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント又は請求項25〜28の何れか1項に記載のポリペプチドを生産する単離された細胞。
- (a)請求項29記載の細胞を培養すること;及び(b)該培養された細胞から抗体、その抗原結合フラグメント、又はポリペプチドを単離することを含む、請求項1〜24の何れか1項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント又は請求項25〜28の何れか1項に記載のポリペプチドを作成する方法。
- 式(A)−(L)−(C)を有し、式中:
(A)は請求項1〜24の何れか1項に記載の抗体又は抗原結合フラグメント又は請求項25〜28の何れか1項に記載のポリペプチドであり;
(L)はリンカーであり;そして、
(C)は細胞傷害剤であり;そして、
ここで該リンカー(L)は(A)を(C)に連結させる、イムノコンジュゲート。 - 式(A)−(L)−(C)を有し、式中:
(A)はCD37に特異的に結合する抗体又は抗原結合フラグメントであり;
(L)は切断不可能なリンカーであり;そして、
(C)は細胞傷害剤であり;そして、
ここで該リンカー(L)は(A)を(C)に連結させる、イムノコンジュゲート。 - 式(A)−(L)−(C)を有し、式中:
(A)はCD37に特異的に結合する抗体又は抗原結合フラグメントであり;
(L)はリンカーであり;そして、
(C)はマイタンシノイドであり;そして、
ここで該リンカー(L)は(A)を(C)に連結させる、イムノコンジュゲート。 - 該リンカーが切断不可能なリンカーである請求項33記載のイムノコンジュゲート。
- 第2の(C)を更に含む請求項31〜34の何れか1項に記載のイムノコンジュゲート。
- 第3の(C)を更に含む請求項35記載のイムノコンジュゲート。
- 第4の(C)を更に含む請求項36記載のイムノコンジュゲート。
- 2〜6個の(C)を含む請求項31〜34の何れか1項に記載のイムノコンジュゲート。
- 3〜4個の(C)を含む請求項31〜34の何れか1項に記載のイムノコンジュゲート。
- 該リンカーが切断可能なリンカー、切断不可能なリンカー、親水性リンカー、及びジカルボン酸系リンカーよりなる群から選択される請求項31〜39の何れか1項に記載のイムノコンジュゲート。
- 該リンカーがN−スクシンイミジル4−(2−ピリジルジチオ)ペンタノエート(SPP);N−スクシンイミジル4−(2−ピリジルジチオ)ブタノエート(SPDB)又はN−スクシンイミジル4−(2−ピリジルジチオ)−2−スルホブタノエート(スルホ−SPDB);N−スクシンイミジル4−(マレイミドメチル)シクロヘキサンカルボキシレート(SMCC);N−スルホスクシンイミジル4−(マレイミドメチル)シクロヘキサンカルボキシレート(スルホSMCC);N−スクシンイミジル4−(ヨードアセチル)−アミノベンゾエート(SIAB);及びN−スクシンイミジル−[(N−マレイミドプロピオンアミド)−テトラエチレングリコール]エステル(NHS−PEG4−マレイミド)よりなる群から選択される請求項40記載のイムノコンジュゲート。
- 該リンカーがN−スクシンイミジル−[(N−マレイミドプロピオンアミド)−テトラエチレングリコール]エステル(NHS−PEG4−マレイミド)である請求項41記載のイムノコンジュゲート。
- 該細胞傷害剤がマイタンシノイド、マイタンシノイド類縁体、ドキソルビシン、修飾されたドキソルビシン、ベンゾジアゼピン、タキソイド、CC−1065、CC−1065類縁体、デュオカルマイシン、デュオカルマイシン類縁体、カリケアマイシン、ドラスタチン、ドラスタチン類縁体、アリスタチン、トマイマイシン誘導体、及びレプトマイシン誘導体又は該剤のプロドラッグよりなる群から選択される請求項31〜32及び35〜42の何れか1項に記載のイムノコンジュゲート。
- 該細胞傷害剤がマイタンシノイドである請求項43記載のイムノコンジュゲート。
- 該細胞傷害剤がN(2’)−デアセチル−N(2’)−(3−メルカプト−1−オキソプロピル)−マイタンシン(DM1)又はN(2’)−デアセチル−N2−(4−メルカプト−4−メチル−1−オキソペンチル)−マイタンシン(DM4)である請求項44記載のイムノコンジュゲート。
- 請求項1〜24の何れか1項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント、請求項25〜28の何れか1項に記載のポリペプチド、又は請求項31〜45の何れか1項に記載のイムノコンジュゲート及び製薬上許容しうる担体を含む医薬組成物。
- イムノコンジュゲートが(A)当たり(C)を平均で約3〜約4個有する請求項31〜45の何れか1項に記載のイムノコンジュゲートを含む医薬組成物。
- イムノコンジュゲートが(A)当たり(C)を平均で約3.5個有する請求項41記載の医薬組成物。
- イムノコンジュゲートが(A)当たり(C)を平均で約3.5±0.5個有する請求項41記載の医薬組成物。
- 第2の抗癌剤を更に含む請求項46〜49の何れか1項に記載の医薬組成物。
- 標識された請求項1〜24の何れか1項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント、請求項25〜28の何れか1項に記載のポリペプチド、又は請求項31〜45の何れか1項に記載のイムノコンジュゲートを含む診断試薬。
- 該標識が放射標識、蛍光団、発色団、画像化剤及び金属イオンよりなる群から選択される請求項51記載の診断試薬。
- 請求項1〜24の何れか1項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント、請求項25〜28の何れか1項に記載のポリペプチド、請求項31〜45の何れか1項に記載のイムノコンジュゲート、又は請求項46〜50の何れか1項に記載の医薬組成物を含むキット。
- 対象に対して請求項1〜24の何れか1項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント、請求項25〜28の何れか1項に記載のポリペプチド、請求項31〜45の何れか1項に記載のイムノコンジュゲート、又は請求項46〜50の何れか1項に記載の医薬組成物に細胞を接触させることを含むCD37を発現する細胞の成育を阻害するための方法。
- 対象に対して請求項1〜24の何れか1項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント、請求項25〜28の何れか1項に記載のポリペプチド、請求項31〜45の何れか1項に記載のイムノコンジュゲート、又は請求項46〜50の何れか1項に記載の医薬組成物の治療有効量を癌を有する患者に投与することを含む該患者を治療するための方法。
- 対象に対して第2の抗癌剤を投与することを更に含む請求項55記載の方法。
- 該第2の抗癌剤が化学療法剤である請求項56記載の方法。
- 該癌がB細胞リンパ腫、NHL、前駆性B細胞リンパ芽球性白血病/リンパ腫及び成熟B細胞新生物、B細胞慢性リンパ性白血病(CLL)/小リンパ球性リンパ腫(SLL)、B細胞前リンパ球性白血病、リンパプラズマ細胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫(MCL)、濾胞性リンパ腫(FL)、低悪性度、中悪性度及び高悪性度(FL)、皮膚濾胞中心リンパ腫、辺縁帯B細胞リンパ腫、MALT型辺縁帯B細胞リンパ腫、結節性辺縁帯B細胞リンパ腫、脾臓型辺縁帯B細胞リンパ腫、ヘアリー細胞白血病、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫、ブルキットリンパ腫、プラズマ細胞腫、プラズマ細胞骨髄腫、移植後のリンパ増殖性障害、バルデンストレームマクログロブリン血症、及び未分化大細胞リンパ腫(ALCL)よりなる群から選択される請求項55〜57の何れか1項に記載の方法。
- 配列番号55〜87よりなる群から選択される配列に少なくとも90%同一であるポリペプチドをコードする配列を含む単離されたポリヌクレオチド。
- 該配列が配列番号55〜87よりなる群から選択される配列に少なくとも95%同一である請求項59記載の単離されたポリヌクレオチド。
- 該配列が配列番号55〜87よりなる群から選択される配列に少なくとも99%同一である請求項60記載の単離されたポリヌクレオチド。
- ポリヌクレオチドが配列番号121〜151に少なくとも90%同一である配列を含む請求項59〜61の何れか1項に記載の単離されたポリヌクレオチド。
- ポリヌクレオチドが配列番号121〜151に少なくとも95%同一である配列を含む請求項62記載の単離されたポリヌクレオチド。
- ポリヌクレオチドが配列番号121〜151に少なくとも99%同一である配列を含む請求項63記載の単離されたポリヌクレオチド。
- 請求項59〜64の何れか1項に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
- 請求項65記載のベクターを含む宿主細胞。
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