JP2016127867A - Ｃｄ３７結合分子及びそのイムノコンジュゲート - Google Patents

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Abstract

【課題】ＣＤ３７結合分子及びそのイムノコンジュゲートの提供。【解決手段】ＣＤ３７に結合する抗体及びイムノコンジュゲートを包含するがこれらに限定されない新しい抗癌剤を提供する。剤、抗体、又はイムノコンジュゲートの使用方法、例えば腫瘍成育を抑制する方法もまた提供する。ヒトＣＤ３７に結合する新しい抗体、これらの抗体を含むイムノコンジュゲート、及びそれらの使用方法を本明細書に記載する。新しいポリペプチド、例えばヒトＣＤ３７に結合する抗体、そのような抗体のフラグメント、及びそのような抗体に関連する他のポリペプチドも提供される。ポリペプチドをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチド、並びにポリヌクレオチドを含むベクターも提供される。【選択図】なし

Description

本発明はＣＤ３７に結合する抗体、その抗原結合フラグメント、ポリペプチド及びイムノコンジュゲート、並びに、Ｂ細胞悪性疾患のような疾患の治療のためにそのようなＣＤ３７結合分子を使用する方法に関する。
白血球抗原ＣＤ３７（「ＣＤ３７」）は、ＧＰ５２−４０、テトラスパニン−２６又はＴＳＰＡＮ２６としても知られており、テトラスパニンスーパーファミリーの膜貫通蛋白である(Maecker等、1997FASEBJ. 11:428-442)。これは前Ｂ〜末梢成熟Ｂ細胞の段階の間にＢ細胞上に発現されるが、末期分化〜プラズマ細胞上には非存在である、４膜貫通ドメインを有する高度にグリコシル化された蛋白である(Link等、1987,JPathol.152:12-21)。ＣＤ３７抗原はＴ細胞、骨髄様細胞及び顆粒球上には僅かに発現されるのみである(Schwartz-Albiez等、1988,J.Immunol.,140(3)905-914)。しかしながらＣＤ３７は又非ホジキン型リンパ腫（ＮＨＬ）及び慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）を呈するような悪性Ｂ細胞上にも発現されれる(Moore等、1986,JImmunol.137(9):3013-8)。この発現プロファイル
はＣＤ３７がＢ細胞悪性疾患のための有望な治療標的となることを示唆している。
ＣＤ３７の厳密な生理学的役割は不明であるが、研究によればＴ細胞増殖における潜在的役割が示唆されている(van Spriel等、2004,JImmunol., 172(5):2953-61)。細胞表面糖蛋白のテトラスパニンファミリーの部分として、ＣＤ３７は他の表面蛋白とも複合体形成する場合がある(Angelisova1994,Immunogenetics.,39(4):249-56)。ＣＤ３７発現欠損マウスを発生させたところ、リンパ様臓器の発達及び細胞組成には変化が無いことが判明した。ＩｇＧ１の低下したレベル及びＴ細胞依存性抗原への応答の改変のみが観察されている(Knobeloch等、2000,MolCellBiol., 20(15):5363-9)。
抗体はそのような癌を治療するための有望な方法となりつつある。特に標的細胞におけるアポトーシスを誘導することができる抗体が望ましい。更に又、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）活性及び抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を有する抗体もまた望ましい。
現在、リツキシマブと称される抗ＣＤ２０抗体がＢ細胞悪性疾患を治療するために使用されている(Leget等、1998, Curr. Opin.Oncol.,10:548-551)。しかしながら患者のサブセットのみがリツキシマブ治療に応答しており、そしてリツキシマブを使用している応答患者であっても最終的には回帰し、そしてしばしばリツキシマブ治療に対する耐性を発生させる。更に又、ＣＤ３７結合剤もＢ細胞悪性疾患のための潜在的治療薬として試験されている。Ｔｒｕｂｉｏｎ ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌはＣＤ３７結合剤、ＳＭＩＰ−０１６及びＴＲＵ−０１６を開発している(Zhao等、2007,Blood,110:2569-2577)。Ｓ
ＭＩＰ−０１６はハイブリドーマ由来の可変領域及び操作されたヒト定常領域を包含する単鎖ポリペプチドである。ＴＲＵ−０１６は抗ＣＤ３７ＳＭＩＰ蛋白のヒト化バージョンである。例えば米国特許出願公開２００７／０００９５１９を参照できる。ＴＲＵ−０１６は慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）の治療に関して臨床試験中である。Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍもまた国際公開出願ＷＯ２００９／０１９３１２においてＣＤ３７結合剤を開示している。しかしながら、これらの結合剤の何れに関しても、ＣＤＣ活性は記載されておらず、そして架橋剤非存在下のインビトロ前アポトーシス活性も記載されていない。
ラジオイムノセラピー（ＲＩＴ）は２つの別個の治験において放射標識抗ＣＤ３７抗体ＭＢ−１を使用しながら試みられている。１３１Ｉ−ＭＢ−１の治療用量を６人の回帰ＮＨＬ患者に投与している(Press等、1989JClin Oncol. 7(8):1027-38, Press等、1993, NEngl J Med.329(17):1219-24)。６人の患者全てが４〜３１ヶ月の期間で完全な軽快（ＣＲ）を達成している別の治験においては１３１Ｉ−ＭＢ−１が１０人の回帰ＮＨＬ患者に投与されている(Kaminski等、1992JClinOncol. 10(11):1696-711)。ＣＲは僅か１例のみの報告であったが、合計４人の患者が２〜６ヶ月の期間の範囲の応答を有していた。しかしながら、生存非標的臓器の放射線曝露に関する問題を生じさせた放射標識の望ましくない生体分布のために全ての患者を治療できたわけではなかった。実際はこれらの治験においては重度の骨髄抑制及び心配毒性を包含するＲＩＴ関連毒性が観察された。これらの臨床データは抗ＣＤ３７ラジオイムノコンジュゲートが有効である可能性を示唆しているものの、これらの治療薬は投与が面倒であり、そして回帰時にはＲＩＴ後の患者は高線量照射に伴う危険性のためにＲＩＴで再治療できない。
ＲＩＴの限界を克服すべく、抗体−細胞傷害剤コンジュゲート（ＡＣＣ）、別称、抗体−薬剤コンジュゲート（ＡＤＣ）が開発されている。これらは、抗体により認識される蛋白を発現する細胞への細胞傷害薬の特異的送達を可能にする化学リンカーを介して抗体に共有結合された細胞傷害剤を包含するイムノコンジュゲートである。しかしながら内在化不良の蛋白はそのような治療薬の望ましい標的であるとは考えられない。ＣＤ３７とＣＤ２０は、両抗原とも４つの膜貫通ドメインを含有することから構造的に同様であるが、ＣＤ２０はテトラスパニンファミリーの部分ではない(Tedder等、1989,J.Immun. 142: 2560-2568)。ＣＤ３７及びＣＤ２０を包含する数種のＢ細胞抗原に対する抗体はエンドサイトーシス及び分解を起こすそれらの能力に関して研究されている(Press等、1989,CancerRes.49(17):4906-12, and Press等、1994, Blood. 83(5):1390-7)。抗ＣＤ３７抗体ＭＢ−１は細胞表面に保持され、そしてインビトロではＤａｕｄｉリンパ腫細胞中に緩徐に内在化される。ＭＢ−１抗体はまたインビトロのＮＨＬ患者細胞中では低速のエンドサイトーシス及び細胞内代謝を有している。同様の結果は、同じくリンパ腫細胞表面上に主に保持され、内在化が不良である抗ＣＤ２０抗体ＩＦ５でも得られている。ＣＤ２０抗体のＡＤＣは以前に研究されているが、特に非ジスルフィド又は酸安定性のリンカーを使用する場合には、有意に強力な力価を示していない（例えばPolson等、2009,CancerRes.,69(6):2358-2364参照）。これらの観察結果に鑑みて、ＣＤ３７は抗体−薬品コンジュゲートのための望ましい標的とは考えられていない。
従って、Ｂ細胞悪性疾患を治療するための手段としての抗体、その抗原結合フラグメント、及び抗体−薬品コンジュゲート（イムノコンジュゲート）を包含するＣＤ３７結合剤の必要性が存在している。本発明はその必要性に着目している。
米国特許出願公開２００７／０００９５１９ 国際公開出願ＷＯ２００９／０１９３１２
Maecker等、1997FASEB J. 11:428-442 Link等、1987,J Pathol. 152:12-21 Schwartz-Albiez等、1988,J. Immunol., 140(3)905-914 Moore等、1986,J Immunol. 137(9):3013-8 vanSpriel等、2004, J Immunol., 172(5):2953-61 Angelisova1994, Immunogenetics., 39(4):249-56 Knobeloch等、2000,Mol Cell Biol., 20(15):5363-9 Leget等、1998,Curr. Opin. Oncol., 10:548-551 Zhao等、2007,Blood, 110:2569-2577 Press等、1989 J Clin Oncol. 7(8):1027-38 Press等、1993, N Engl J Med. 329(17):1219-24 Kaminski等、1992 J Clin Oncol. 10(11):1696-711 Tedder等、1989, J. Immun. 142: 2560-2568 Press等、1989, Cancer Res. 49(17):4906-12 Press等、1994, Blood. 83(5):1390-7 Polson等、2009, Cancer Res., 69(6):2358-2364
ヒトＣＤ３７に結合する新しい抗体、これらの抗体を含むイムノコンジュゲート、及びそれらの使用方法を本明細書に記載する。新しいポリペプチド、例えばヒトＣＤ３７に結合する抗体、そのような抗体のフラグメント、及びそのような抗体に関連する他のポリペプチドも提供される。ポリペプチドをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチド、並びにポリヌクレオチドを含むベクターも提供される。本発明のポリペプチド及び／又はポリヌクレオチドを含む細胞も更に提供される。新規なＣＤ３７抗体又はイムノコンジュゲートを含む組成物（例えば医薬組成物）も提供される。更に又、新規なＣＤ３７抗体又はイムノコンジュゲートを作成及び使用する方法、例えば腫瘍生育を抑制及び／又は癌を治療するために新規なＣＤ３７抗体又はイムノコンジュゲートを使用する方法も提供される。
ＣＤ３７に特異的に結合し、そして補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を誘導することができる抗体又はその抗原結合フラグメントが提供される。一部の実施形態においては、抗体は又アポトーシス及び／又は抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を誘発することもできる。
抗体又はその抗原結合フラグメントは、（ａ）配列番号５５のポリペプチド及び配列番号７２のポリペプチドを含む抗体；（ｂ）配列番号５９のポリペプチド及び配列番号７５のポリペプチドを含む抗体；（ｃ）配列番号６１のポリペプチド及び配列番号７７のポリペプチドを含む抗体；（ｄ）配列番号６４のポリペプチド及び配列番号８０のポリペプチドを含む抗体；（ｅ）配列番号６６のポリペプチド及び配列番号８２のポリペプチドを含む抗体；（ｆ）配列番号６８のポリペプチド及び配列番号８４のポリペプチドを含む抗体；及び、（ｇ）配列番号７０のポリペプチド及び配列番号８６のポリペプチドを含む抗体；よりなる群から選択される抗体と同じＣＤ３７エピトープに特異的に結合するものであることができる。
一部の実施形態においては、抗体又はその抗原結合フラグメントはＣＤ３７に特異的に結合し、そして配列番号１８０のポリペプチドに特異的に結合する。特定の実施形態においては、抗体又はその抗原結合フラグメントは配列番号１８４のポリペプチドに結合しない。
一部の実施形態においては、抗体又はその抗原結合フラグメントはＣＤ３７に特異的に結合し、そして抗体又はそのフラグメントは、（ａ）配列番号５５のポリペプチド及び配列番号７２のポリペプチドを含む抗体；（ｂ）配列番号５９のポリペプチド及び配列番号７５のポリペプチドを含む抗体；（ｃ）配列番号６１のポリペプチド及び配列番号７７のポリペプチドを含む抗体；（ｄ）配列番号６４のポリペプチド及び配列番号８０のポリペプチドを含む抗体；（ｅ）配列番号６６のポリペプチド及び配列番号８２のポリペプチドを含む抗体；（ｆ）配列番号６８のポリペプチド及び配列番号８４のポリペプチドを含む抗体；及び、（ｇ）配列番号７０のポリペプチド及び配列番号８６のポリペプチドを含む抗体；よりなる群から選択される抗体を競合的に阻害する。
特定の実施形態においては、抗体又はその抗原結合フラグメントは２０１０年２月１８日にＡＴＣＣに寄託されたＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１０６６４、２０１０年２月１８日にＡＴＣＣに寄託されたＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１０６６５、２０１０年２月１８日にＡＴＣＣに寄託されたＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１０６６６、２０１０年２月１８日にＡＴＣＣに寄託されたＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１０６６７、２０１０年２月１８日にＡＴＣＣに寄託されたＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１０６６８、２０１０年２月１８日にＡＴＣＣに寄託されたＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１０６６９、及び、２０１０年２月１８日にＡＴＣＣに寄託されたＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１０６７０よりなる群から選択されるハイブリドーマにより生産される。
一部の実施形態においては、抗体又はその抗原結合フラグメントはＣＤ３７に特異的に結合し、そして抗体は（ａ）配列番号４、５及び６及び配列番号２８、２９及び３０；（ｂ）配列番号７、８及び９及び配列番号３１、３２及び３３；（ｃ）配列番号１０、１１及び１２及び配列番号３４、３５及び３６；（ｄ）配列番号１３、１４及び１５及び配列番号３７、３８及び３９；（ｅ）配列番号１３、１４及び１５及び配列番号３７、４０及び３９；（ｆ）配列番号１６、１７及び１８及び配列番号４１、４２及び４３；（ｇ）配列番号１９、２０及び２１及び配列番号４４、４５及び４６；（ｈ）配列番号１９、２０及び２１及び配列番号４４、４７及び４６；（ｉ）配列番号２２、２３及び２４及び配列番号４８、４９及び５０；（ｊ）配列番号２２、２３及び２４及び配列番号４８、５１及び５０；（ｋ）配列番号２５、２６及び２７及び配列番号５２、５３及び５４；及び、（ｌ）保存的アミノ酸置換１、２、３又は４つを含む（ａ）〜（ｋ）の変異体；よりなる群から選択されるポリペプチド配列を含む。
その他の実施形態において、抗体又はその抗原結合フラグメントは（ａ）配列番号５５及び配列番号７２；（ｂ）配列番号５６及び配列番号７３；（ｃ）配列番号５７及び配列番号７４；（ｄ）配列番号５８及び配列番号７４；（ｅ）配列番号５９及び配列番号７５；（ｆ）配列番号６０及び配列番号７６；（ｇ）配列番号６１及び配列番号７７；（ｈ）配列番号６２及び配列番号７８；（ｉ）配列番号６３及び配列番号７９；（ｊ）配列番号６４及び配列番号８０；（ｋ）配列番号６５及び配列番号８１；（ｌ）配列番号６６及び配列番号８２；（ｍ）配列番号６７及び配列番号８３；（ｎ）配列番号６８及び配列番号８４；（ｏ）配列番号６９及び配列番号８５；（ｐ）配列番号７０及び配列番号８６；及び（ｑ）配列番号７１及び配列番号８７；よりなる群から選択されるポリペプチド配列に少なくとも９０％同一であるか、少なくとも９５％同一であるか、少なくとも９９％同一であるか、又は同一であるポリペプチド配列を含む。
一部の実施形態においては、抗体又はその抗原結合フラグメントはネズミ、非ヒト、ヒト化、キメラ、リサーフィシング化又はヒトのものである。
一部の実施形態においては、抗体又は抗体フラグメントは架橋剤の非存在下にインビトロでＣＤ３７を発現する細胞のアポトーシスを誘導することができる。一部の実施形態においては、抗体又は抗原結合フラグメントは補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を誘導できる。更にその他の実施形態において、抗体又は抗原結合フラグメントは抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を誘導できる。
他の実施形態において、抗体又はその抗原結合フラグメントは、ヒト又はヒト化のものであり、ＣＤ３７に特異的に結合し、そして架橋剤の非存在下にインビトロでＣＤ３７を発現する細胞のアポトーシスを誘導することができる。その他の実施形態において、ヒト又はヒト化抗体又はその抗原結合フラグメントは又、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を誘導でき、及び／又は、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を誘導できる。
更に他の実施形態において、抗体又はその抗原結合フラグメントはヒトＣＤ３７及びマカクＣＤ３７に結合する。
一部の実施形態においては抗体又はその抗原結合フラグメントは完全長抗体又は抗原結合フラグメントである。抗体又はその抗原結合フラグメントはＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、単鎖Ｆｖ即ちｓｃＦｖ、ジスルフィド連結Ｆｖ、Ｖ−ＮＡＲドメイン、ＩｇＮａｒ、イントラボディー、ＩｇＧΔＣＨ２、ミニボディー、Ｆ（ａｂ'）３、テトラボディー、トリアボディー、ダイアボディー、単ドメイン抗体、ＤＶＤ−Ｉｇ、Ｆｃａｂ、ｍＡｂ２、（ｓｃＦｖ）２、又はｓｃＦｖ−Ｆｃを含むことができる。
他の実施形態において、ＣＤ３７結合剤はＣＤ３７に特異的に結合するポリペプチドであり、そしてポリペプチドは（ａ）配列番号４、５及び６及び配列番号２８、２９及び３０；（ｂ）配列番号７、８及び９及び配列番号３１、３２及び３３；（ｃ）配列番号１０、１１及び１２及び配列番号３４、３５及び３６；（ｄ）配列番号１３、１４及び１５及び配列番号３７、３８及び３９；（ｅ）配列番号１３、１４及び１５及び配列番号３７、４０及び３９；（ｆ）配列番号１６、１７及び１８及び配列番号４１、４２及び４３；（ｇ）配列番号１９、２０及び２１及び配列番号４４、４５及び４６；（ｈ）配列番号１９、２０及び２１及び配列番号４４、４７及び４６；（ｉ）配列番号２２、２３及び２４及び配列番号４８、４９及び５０；（ｊ）配列番号２２、２３及び２４及び配列番号４８、５１及び５０；（ｋ）配列番号２５、２６及び２７及び配列番号５２、５３及び５４；及び、（ｌ）保存的アミノ酸置換１、２、３又は４つを含む（ａ）〜（ｋ）の変異体；よりなる群から選択される配列を含む。
他の実施形態において、ＣＤ３７結合剤はＣＤ３７に特異的に結合するポリペプチドであり、そしてポリペプチドは（ａ）配列番号５５及び配列番号７２；（ｂ）配列番号５６及び配列番号７３；（ｃ）配列番号５７及び配列番号７４；（ｄ）配列番号５８及び配列番号７４；（ｅ）配列番号５９及び配列番号７５；（ｆ）配列番号６０及び配列番号７６；（ｇ）配列番号６１及び配列番号７７；（ｈ）配列番号６２及び配列番号７８；（ｉ）配列番号６３及び配列番号７９；（ｊ）配列番号６４及び配列番号８０；（ｋ）配列番号６５及び配列番号８１；（ｌ）配列番号６６及び配列番号８２；（ｍ）配列番号６７及び配列番号８３；（ｎ）配列番号６８及び配列番号８４；（ｏ）配列番号６９及び配列番号８５；（ｐ）配列番号７０及び配列番号８６；及び（ｑ）配列番号７１及び配列番号８７；よりなる群から選択される配列に少なくとも９０％同一であるか、少なくとも９５％同一であるか、少なくとも９９％同一であるか、又は同一である配列を含む。
抗体又はその抗原結合フラグメント又はポリペプチドを生産する細胞もまた本明細書に記載した方法に従って作成及び使用することができる。方法は（ａ）そのようなＣＤ３７結合剤を生産する細胞を培養すること；及び（ｂ）培養細胞から抗体、その抗原結合フラグメント、又はポリペプチドを単離することを含む抗体又はその抗原結合フラグメント又はポリペプチドの作成方法を提供する。
一部の実施形態においては、ＣＤ３７結合剤は式（Ａ）−（Ｌ）−（Ｃ）を有するイムノコンジュゲートであり、式中：（Ａ）はＣＤ３７結合剤であり；（Ｌ）はリンカーであり；そして、（Ｃ）は細胞傷害剤であり；そして、リンカー（Ｌ）は（Ａ）を（Ｃ）に連結させる。
一部の実施形態においては、ＣＤ３７結合剤は式（Ａ）−（Ｌ）−（Ｃ）を有するイムノコンジュゲートであり、式中：（Ａ）はＣＤ３７に特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメントであり；（Ｌ）は切断不可能なリンカーであり；そして、（Ｃ）は細胞傷害剤であり；そして、リンカー（Ｌ）は（Ａ）を（Ｃ）に連結させる。
一部の実施形態においては、ＣＤ３７結合剤は式（Ａ）−（Ｌ）−（Ｃ）を有するイムノコンジュゲートであり、式中：（Ａ）はＣＤ３７に特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメントであり；（Ｌ）はリンカーであり；そして、（Ｃ）はマイタンシノイドであり；そして、リンカー（Ｌ）は（Ａ）を（Ｃ）に連結させる。
イムノコンジュゲートリンカーは切断不可能なリンカーであることができる。リンカーは切断可能なリンカー、切断不可能なリンカー、親水性リンカー、及びジカルボン酸系リンカーよりなる群から選択することができる。リンカーはＮ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルジチオ）ペンタノエート（ＳＰＰ）；Ｎ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルジチオ）ブタノエート（ＳＰＤＢ）又はＮ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルジチオ）−２−スルホブタノエート（スルホ−ＳＰＤＢ）；Ｎ−スクシンイミジル４−（マレイミドメチル）シクロヘキサンカルボキシレート（ＳＭＣＣ）；Ｎ−スルホスクシンイミジル４−（マレイミドメチル）シクロヘキサンカルボキシレート（スルホＳＭＣＣ）；Ｎ−スクシンイミジル４−（ヨードアセチル）−アミノベンゾエート（ＳＩＡＢ）；及びＮ−スクシンイミジル−［（Ｎ−マレイミドプロピオンアミド）−テトラエチレングリコール］エステル（ＮＨＳ−ＰＥＧ４−マレイミド）よりなる群から選択することができる。リンカーはＮ−スクシンイミジル−［（Ｎ−マレイミドプロピオンアミド）−テトラエチレングリコール］エステル（ＮＨＳ−ＰＥＧ４−マレイミド）であることができる。
細胞傷害剤はマイタンシノイド、マイタンシノイド類縁体、ドキソルビシン、修飾されたドキソルビシン、ベンゾジアゼピン、タキソイド、ＣＣ−１０６５、ＣＣ−１０６５類縁体、デュオカルマイシン、デュオカルマイシン類縁体、カリケアマイシン、ドラスタチン、ドラスタチン類縁体、アリスタチン、トマイマイシン誘導体、及びレプトマイシン誘導体又は剤のプロドラッグよりなる群から選択することができる。細胞傷害剤はマイタンシノイドであることができる。該細胞傷害剤はＮ（２’）−デアセチル−Ｎ（２’）−（３−メルカプト−１−オキソプロピル）−マイタンシン（ＤＭ１）又はＮ（２’）−デアセチル−Ｎ２−（４−メルカプト−４−メチル−１−オキソペンチル）−マイタンシン（ＤＭ４）であることができる。
本明細書において同様に提供されるものは、ＣＤ３７結合剤及び製薬上許容しうる担体を含む医薬組成物である。医薬組成物は第２の抗癌剤を含むことができる。
標識されたＣＤ３７結合剤を含む診断試薬も本明細書において提供される。標識は放射標識、蛍光団、発色団、画像化剤及び金属イオンよりなる群から選択される。
更に提供されるものはＣＤ３７結合剤を含むキットである。
本明細書に記載する方法はＣＤ３７結合剤又はそれを含む医薬組成物に細胞を接触させることを含むＣＤ３７を発現する細胞の成育を阻害するための方法を包含する。
方法は又、ＣＤ３７結合剤又はそれを含む医薬組成物の治療有効量を患者に投与することを含む癌を有する患者を治療するための方法を提供する。
方法は対象に第２の抗癌剤を投与することを含むことができる。第２の抗癌剤は化学療法剤であることができる。
癌はＢ細胞リンパ腫、ＮＨＬ、前駆性Ｂ細胞リンパ芽球性白血病／リンパ腫及び成熟Ｂ細胞新生物、Ｂ細胞慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）／小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、リンパプラズマ細胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）、低悪性度、中悪性度及び高悪性度（ＦＬ）、皮膚濾胞中心リンパ腫、辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、ＭＡＬＴ型辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、結節性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、脾臓型辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、ヘアリー細胞白血病、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、ブルキットリンパ腫、プラズマ細胞腫、プラズマ細胞骨髄腫、移植後のリンパ増殖性障害、バルデンストレームマクログロブリン血症、及び未分化大細胞リンパ腫（ＡＬＣＬ）よりなる群から選択される癌であることができる。
配列番号５５〜８７よりなる群から選択される配列に少なくとも９０％同一であるか、少なくとも９５％同一であるか、少なくとも９９％同一であるか、又は同一であるポリペプチドをコードする配列を含む単離されたポリヌクレオチドもまた本明細書において提供される。ポリヌクレオチドは配列番号１２１〜１５１に少なくとも９０％、少なくとも９５％同一であるか、少なくとも９９％同一であるか、又は同一である配列を含むことができる。
ベクター及びこのようなポリヌクレオチド及びベクターを含む宿主細胞もまた本明細書において提供される。
したがって、本発明は、以下の項目を提供する：
（項目１）
抗体又はその抗原結合フラグメントが補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を誘導することができる、ＣＤ３７に特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメント。
（項目２）
該抗体が又、アポトーシスを誘導することもできる、項目１記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
（項目３）
該抗体が又、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を誘導することもできる、項目１又は２記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
（項目４）
下記：
（ａ）配列番号５５のポリペプチド及び配列番号７２のポリペプチドを含む抗体；
（ｂ）配列番号５９のポリペプチド及び配列番号７５のポリペプチドを含む抗体；
（ｃ）配列番号６１のポリペプチド及び配列番号７７のポリペプチドを含む抗体；
（ｄ）配列番号６４のポリペプチド及び配列番号８０のポリペプチドを含む抗体；
（ｅ）配列番号６６のポリペプチド及び配列番号８２のポリペプチドを含む抗体；
（ｆ）配列番号６８のポリペプチド及び配列番号８４のポリペプチドを含む抗体；及び、（ｇ）配列番号７０のポリペプチド及び配列番号８６のポリペプチドを含む抗体；
よりなる群から選択される抗体と同じＣＤ３７エピトープに特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメント。
（項目５）
ＣＤ３７に特異的に結合し、そして配列番号１８０のポリペプチドに特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメント。
（項目６）
該抗体又はそのフラグメントが配列番号１８４のポリペプチドに結合しない、項目５記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
（項目７）
ＣＤ３７に特異的に結合し、そして配列番号１８４のポリペプチドに特異的に結合しない抗体又はその抗原結合フラグメント。
（項目８）
抗体又はその抗原結合フラグメントが下記：
（ａ）配列番号５５のポリペプチド及び配列番号７２のポリペプチドを含む抗体；
（ｂ）配列番号５９のポリペプチド及び配列番号７５のポリペプチドを含む抗体；
（ｃ）配列番号６１のポリペプチド及び配列番号７７のポリペプチドを含む抗体；
（ｄ）配列番号６４のポリペプチド及び配列番号８０のポリペプチドを含む抗体；
（ｅ）配列番号６６のポリペプチド及び配列番号８２のポリペプチドを含む抗体；
（ｆ）配列番号６８のポリペプチド及び配列番号８４のポリペプチドを含む抗体；及び、（ｇ）配列番号７０のポリペプチド及び配列番号８６のポリペプチドを含む抗体；
よりなる群から選択される抗体を競合的に阻害するＣＤ３７に特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメント。
（項目９）
２０１０年２月１８日にＡＴＣＣに寄託されたＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１０６６４、２０１０年２月１８日にＡＴＣＣに寄託されたＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１０６６５、２０１０年２月１８日にＡＴＣＣに寄託されたＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１０６６６、２０１０年２月１８日にＡＴＣＣに寄託されたＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１０６６７、２０１０年２月１８日にＡＴＣＣに寄託されたＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１０６６８、２０１０年２月１８日にＡＴＣＣに寄託されたＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１０６６９、及び、２０１０年２月１８日にＡＴＣＣに寄託されたＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１０６７０よりなる群から選択されるハイブリドーマにより生産される抗体又はその抗原結合フラグメント。
（項目１０）
抗体が下記：
（ａ）配列番号４、５及び６及び配列番号２８、２９及び３０；
（ｂ）配列番号７、８及び９及び配列番号３１、３２及び３３；
（ｃ）配列番号１０、１１及び１２及び配列番号３４、３５及び３６；
（ｄ）配列番号１３、１４及び１５及び配列番号３７、３８及び３９；
（ｅ）配列番号１３、１４及び１５及び配列番号３７、４０及び３９；
（ｆ）配列番号１６、１７及び１８及び配列番号４１、４２及び４３；
（ｇ）配列番号１９、２０及び２１及び配列番号４４、４５及び４６；
（ｈ）配列番号１９、２０及び２１及び配列番号４４、４７及び４６；
（ｉ）配列番号２２、２３及び２４及び配列番号４８、４９及び５０；
（ｊ）配列番号２２、２３及び２４及び配列番号４８、５１及び５０；
（ｋ）配列番号２５、２６及び２７及び配列番号５２、５３及び５４；及び、
（ｌ）保存的アミノ酸置換１、２、３又は４つを含む（ａ）〜（ｋ）の変異体；
よりなる群から選択されるポリペプチド配列を含むＣＤ３７に特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメント。
（項目１１）
抗体が下記：
（ａ）配列番号５５及び配列番号７２；
（ｂ）配列番号５６及び配列番号７３；
（ｃ）配列番号５７及び配列番号７４；
（ｄ）配列番号５８及び配列番号７４；
（ｅ）配列番号５９及び配列番号７５；
（ｆ）配列番号６０及び配列番号７６；
（ｇ）配列番号６１及び配列番号７７；
（ｈ）配列番号６２及び配列番号７８；
（ｉ）配列番号６３及び配列番号７９；
（ｊ）配列番号６４及び配列番号８０；
（ｋ）配列番号６５及び配列番号８１；
（ｌ）配列番号６６及び配列番号８２；
（ｍ）配列番号６７及び配列番号８３；
（ｎ）配列番号６８及び配列番号８４；
（ｏ）配列番号６９及び配列番号８５；
（ｐ）配列番号７０及び配列番号８６；及び
（ｑ）配列番号７１及び配列番号８７；よりなる群から選択されるポリペプチド配列に少なくとも９０％同一であるポリペプチド配列を含む項目１０記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
（項目１２）
ポリペプチド配列が下記：
（ａ）配列番号５５及び配列番号７２；
（ｂ）配列番号５６及び配列番号７３；
（ｃ）配列番号５７及び配列番号７４；
（ｄ）配列番号５８及び配列番号７４；
（ｅ）配列番号５９及び配列番号７５；
（ｆ）配列番号６０及び配列番号７６；
（ｇ）配列番号６１及び配列番号７７；
（ｈ）配列番号６２及び配列番号７８；
（ｉ）配列番号６３及び配列番号７９；
（ｊ）配列番号６４及び配列番号８０；
（ｋ）配列番号６５及び配列番号８１；
（ｌ）配列番号６６及び配列番号８２；
（ｍ）配列番号６７及び配列番号８３；
（ｎ）配列番号６８及び配列番号８４；
（ｏ）配列番号６９及び配列番号８５；
（ｐ）配列番号７０及び配列番号８６；及び
（ｑ）配列番号７１及び配列番号８７；
よりなる群から選択されるポリペプチド配列に少なくとも９５％同一である項目１１記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
（項目１３）
ポリペプチド配列が下記：
（ａ）配列番号５５及び配列番号７２；
（ｂ）配列番号５６及び配列番号７３；
（ｃ）配列番号５７及び配列番号７４；
（ｄ）配列番号５８及び配列番号７４；
（ｅ）配列番号５９及び配列番号７５；
（ｆ）配列番号６０及び配列番号７６；
（ｇ）配列番号６１及び配列番号７７；
（ｈ）配列番号６２及び配列番号７８；
（ｉ）配列番号６３及び配列番号７９；
（ｊ）配列番号６４及び配列番号８０；
（ｋ）配列番号６５及び配列番号８１；
（ｌ）配列番号６６及び配列番号８２；
（ｍ）配列番号６７及び配列番号８３；
（ｎ）配列番号６８及び配列番号８４；
（ｏ）配列番号６９及び配列番号８５；
（ｐ）配列番号７０及び配列番号８６；及び
（ｑ）配列番号７１及び配列番号８７；
よりなる群から選択されるポリペプチド配列に少なくとも９９％同一である項目１２記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
（項目１４）
該抗体又はその抗原結合フラグメントがネズミ、非ヒト、ヒト化、キメラ、リサーフィシング化又はヒトのものである項目１〜１３の何れか１項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
（項目１５）
該抗体又は抗体フラグメントが架橋剤の非存在下にインビトロでＣＤ３７を発現する細胞のアポトーシスを誘導することができる項目４〜１４の何れか１項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
（項目１６）
該抗体又は抗原結合フラグメントが補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を誘導することができる項目４〜１４の何れか１項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
（項目１７）
該抗体が抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を誘導することができる項目４〜１４の何れか１項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
（項目１８）
ヒト又はヒト化抗体又はその抗原結合フラグメントが架橋剤の非存在下にインビトロでＣＤ３７を発現する細胞のアポトーシスを誘導することができる、ＣＤ３７に特異的に結合するヒト又はヒト化抗体又はその抗原結合フラグメント。
（項目１９）
該ヒト又はヒト化抗体又はその抗原結合フラグメントが又、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を誘導することもできる項目１８記載のヒト又はヒト化抗体又はその抗原結合フラグメント。
（項目２０）
該ヒト又はヒト化抗体又はその抗原結合フラグメントが又、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を誘導することもできる項目１８又は項目１９記載のヒト又はヒト化抗体又はその抗原結合フラグメント。
（項目２１）
該抗体がヒトＣＤ３７又はマカクＣＤ３７に結合する項目１〜２０の何れか１項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
（項目２２）
完全長抗体である項目１〜２１の何れか１項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
（項目２３）
抗原結合フラグメントである項目１〜２１の何れか１項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
（項目２４）
該抗体又はその抗原結合フラグメントがＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、単鎖Ｆｖ即ちｓｃＦｖ、ジスルフィド連結Ｆｖ、Ｖ−ＮＡＲドメイン、ＩｇＮａｒ、イントラボディー、ＩｇＧΔＣＨ２、ミニボディー、Ｆ（ａｂ'）３、テトラボディー、トリア
ボディー、ダイアボディー、単ドメイン抗体、ＤＶＤ−Ｉｇ、Ｆｃａｂ、ｍＡｂ２、（ｓｃＦｖ）２、又はｓｃＦｖ−Ｆｃを含む項目１〜２１の何れか１項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
（項目２５）
該ポリペプチドが下記：
（ａ）配列番号４、５及び６及び配列番号２８、２９及び３０；
（ｂ）配列番号７、８及び９及び配列番号３１、３２及び３３；
（ｃ）配列番号１０、１１及び１２及び配列番号３４、３５及び３６；
（ｄ）配列番号１３、１４及び１５及び配列番号３７、３８及び３９；
（ｅ）配列番号１３、１４及び１５及び配列番号３７、４０及び３９；
（ｆ）配列番号１６、１７及び１８及び配列番号４１、４２及び４３；
（ｇ）配列番号１９、２０及び２１及び配列番号４４、４５及び４６；
（ｈ）配列番号１９、２０及び２１及び配列番号４４、４７及び４６；
（ｉ）配列番号２２、２３及び２４及び配列番号４８、４９及び５０；
（ｊ）配列番号２２、２３及び２４及び配列番号４８、５１及び５０；
（ｋ）配列番号２５、２６及び２７及び配列番号５２、５３及び５４；及び、
（ｌ）保存的アミノ酸置換１、２、３又は４つを含む（ａ）〜（ｋ）の変異体；
よりなる群から選択される配列を含むＣＤ３７に特異的に結合するポリペプチド。
（項目２６）
該ポリペプチドが下記：
（ａ）配列番号５５及び配列番号７２；
（ｂ）配列番号５６及び配列番号７３；
（ｃ）配列番号５７及び配列番号７４；
（ｄ）配列番号５８及び配列番号７４；
（ｅ）配列番号５９及び配列番号７５；
（ｆ）配列番号６０及び配列番号７６；
（ｇ）配列番号６１及び配列番号７７；
（ｈ）配列番号６２及び配列番号７８；
（ｉ）配列番号６３及び配列番号７９；
（ｊ）配列番号６４及び配列番号８０；
（ｋ）配列番号６５及び配列番号８１；
（ｌ）配列番号６６及び配列番号８２；
（ｍ）配列番号６７及び配列番号８３；
（ｎ）配列番号６８及び配列番号８４；
（ｏ）配列番号６９及び配列番号８５；
（ｐ）配列番号７０及び配列番号８６；及び
（ｑ）配列番号７１及び配列番号８７；
よりなる群から選択される配列に少なくとも９０％同一である配列を含む項目２５記載のポリペプチド。
（項目２７）
配列が下記：
（ａ）配列番号５５及び配列番号７２；
（ｂ）配列番号５６及び配列番号７３；
（ｃ）配列番号５７及び配列番号７４；
（ｄ）配列番号５８及び配列番号７４；
（ｅ）配列番号５９及び配列番号７５；
（ｆ）配列番号６０及び配列番号７６；
（ｇ）配列番号６１及び配列番号７７；
（ｈ）配列番号６２及び配列番号７８；
（ｉ）配列番号６３及び配列番号７９；
（ｊ）配列番号６４及び配列番号８０；
（ｋ）配列番号６５及び配列番号８１；
（ｌ）配列番号６６及び配列番号８２；
（ｍ）配列番号６７及び配列番号８３；
（ｎ）配列番号６８及び配列番号８４；
（ｏ）配列番号６９及び配列番号８５；
（ｐ）配列番号７０及び配列番号８６；及び
（ｑ）配列番号７１及び配列番号８７；
よりなる群から選択される配列に少なくとも９５％同一である項目２６記載のポリペプチド。
（項目２８）
配列が下記：
（ａ）配列番号５５及び配列番号７２；
（ｂ）配列番号５６及び配列番号７３；
（ｃ）配列番号５７及び配列番号７４；
（ｄ）配列番号５８及び配列番号７４；
（ｅ）配列番号５９及び配列番号７５；
（ｆ）配列番号６０及び配列番号７６；
（ｇ）配列番号６１及び配列番号７７；
（ｈ）配列番号６２及び配列番号７８；
（ｉ）配列番号６３及び配列番号７９；
（ｊ）配列番号６４及び配列番号８０；
（ｋ）配列番号６５及び配列番号８１；
（ｌ）配列番号６６及び配列番号８２；
（ｍ）配列番号６７及び配列番号８３；
（ｎ）配列番号６８及び配列番号８４；
（ｏ）配列番号６９及び配列番号８５；
（ｐ）配列番号７０及び配列番号８６；及び
（ｑ）配列番号７１及び配列番号８７；
よりなる群から選択される配列に少なくとも９９％同一である項目２７記載のポリペプチド。
（項目２９）
項目１〜２４の何れか１項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント又は項目２５〜２８の何れか１項に記載のポリペプチドを生産する単離された細胞。
（項目３０）
（ａ）項目２９記載の細胞を培養すること；及び（ｂ）該培養された細胞から抗体、その抗原結合フラグメント、又はポリペプチドを単離することを含む、項目１〜２４の何れか１項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント又は項目２５〜２８の何れか１項に記載のポリペプチドを作成する方法。
（項目３１）
式（Ａ）−（Ｌ）−（Ｃ）を有し、式中：
（Ａ）は項目１〜２４の何れか１項に記載の抗体又は抗原結合フラグメント又は項目２５〜２８の何れか１項に記載のポリペプチドであり；
（Ｌ）はリンカーであり；そして、
（Ｃ）は細胞傷害剤であり；そして、
ここで該リンカー（Ｌ）は（Ａ）を（Ｃ）に連結させる、イムノコンジュゲート。
（項目３２）
式（Ａ）−（Ｌ）−（Ｃ）を有し、式中：
（Ａ）はＣＤ３７に特異的に結合する抗体又は抗原結合フラグメントであり；
（Ｌ）は切断不可能なリンカーであり；そして、
（Ｃ）は細胞傷害剤であり；そして、
ここで該リンカー（Ｌ）は（Ａ）を（Ｃ）に連結させる、イムノコンジュゲート。
（項目３３）
式（Ａ）−（Ｌ）−（Ｃ）を有し、式中：
（Ａ）はＣＤ３７に特異的に結合する抗体又は抗原結合フラグメントであり；
（Ｌ）はリンカーであり；そして、
（Ｃ）はマイタンシノイドであり；そして、
ここで該リンカー（Ｌ）は（Ａ）を（Ｃ）に連結させる、イムノコンジュゲート。
（項目３４）
該リンカーが切断不可能なリンカーである項目３３記載のイムノコンジュゲート。
（項目３５）
第２の（Ｃ）を更に含む項目３１〜３４の何れか１項に記載のイムノコンジュゲート。
（項目３６）
第３の（Ｃ）を更に含む項目３５記載のイムノコンジュゲート。
（項目３７）
第４の（Ｃ）を更に含む項目３６記載のイムノコンジュゲート。
（項目３８）
２〜６個の（Ｃ）を含む項目３１〜３４の何れか１項に記載のイムノコンジュゲート。
（項目３９）
３〜４個の（Ｃ）を含む項目３１〜３４の何れか１項に記載のイムノコンジュゲート。
（項目４０）
該リンカーが切断可能なリンカー、切断不可能なリンカー、親水性リンカー、及びジカルボン酸系リンカーよりなる群から選択される項目３１〜３９の何れか１項に記載のイムノコンジュゲート。
（項目４１）
該リンカーがＮ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルジチオ）ペンタノエート（ＳＰＰ）；Ｎ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルジチオ）ブタノエート（ＳＰＤＢ）又はＮ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルジチオ）−２−スルホブタノエート（スルホ−ＳＰＤＢ）；Ｎ−スクシンイミジル４−（マレイミドメチル）シクロヘキサンカルボキシレート（ＳＭＣＣ）；Ｎ−スルホスクシンイミジル４−（マレイミドメチル）シクロヘキサンカルボキシレート（スルホＳＭＣＣ）；Ｎ−スクシンイミジル４−（ヨードアセチル）−アミノベンゾエート（ＳＩＡＢ）；及びＮ−スクシンイミジル−［（Ｎ−マレイミドプロピオンアミド）−テトラエチレングリコール］エステル（ＮＨＳ−ＰＥＧ４−マレイミド）よりなる群から選択される項目４０記載のイムノコンジュゲート。
（項目４２）
該リンカーがＮ−スクシンイミジル−［（Ｎ−マレイミドプロピオンアミド）−テトラエチレングリコール］エステル（ＮＨＳ−ＰＥＧ４−マレイミド）である項目４１記載のイムノコンジュゲート。
（項目４３）
該細胞傷害剤がマイタンシノイド、マイタンシノイド類縁体、ドキソルビシン、修飾されたドキソルビシン、ベンゾジアゼピン、タキソイド、ＣＣ−１０６５、ＣＣ−１０６５類縁体、デュオカルマイシン、デュオカルマイシン類縁体、カリケアマイシン、ドラスタチン、ドラスタチン類縁体、アリスタチン、トマイマイシン誘導体、及びレプトマイシン誘導体又は該剤のプロドラッグよりなる群から選択される項目３１〜３２及び３５〜４２の何れか１項に記載のイムノコンジュゲート。
（項目４４）
該細胞傷害剤がマイタンシノイドである項目４３記載のイムノコンジュゲート。
（項目４５）
該細胞傷害剤がＮ（２’）−デアセチル−Ｎ（２’）−（３−メルカプト−１−オキソプロピル）−マイタンシン（ＤＭ１）又はＮ（２’）−デアセチル−Ｎ２−（４−メルカプト−４−メチル−１−オキソペンチル）−マイタンシン（ＤＭ４）である項目４４記載のイムノコンジュゲート。
（項目４６）
項目１〜２４の何れか１項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント、項目２５〜２８の何れか１項に記載のポリペプチド、又は項目３１〜４５の何れか１項に記載のイムノコンジュゲート及び製薬上許容しうる担体を含む医薬組成物。
（項目４７）
イムノコンジュゲートが（Ａ）当たり（Ｃ）を平均で約３〜約４個有する項目３１〜４５の何れか１項に記載のイムノコンジュゲートを含む医薬組成物。
（項目４８）
イムノコンジュゲートが（Ａ）当たり（Ｃ）を平均で約３．５個有する項目４１記載の医薬組成物。
（項目４９）
イムノコンジュゲートが（Ａ）当たり（Ｃ）を平均で約３．５±０．５個有する項目４１記載の医薬組成物。
（項目５０）
第２の抗癌剤を更に含む項目４６〜４９の何れか１項に記載の医薬組成物。
（項目５１）
標識された項目１〜２４の何れか１項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント、項目２５〜２８の何れか１項に記載のポリペプチド、又は項目３１〜４５の何れか１項に記載のイムノコンジュゲートを含む診断試薬。
（項目５２）
該標識が放射標識、蛍光団、発色団、画像化剤及び金属イオンよりなる群から選択される項目５１記載の診断試薬。
（項目５３）
項目１〜２４の何れか１項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント、項目２５〜２８の何れか１項に記載のポリペプチド、項目３１〜４５の何れか１項に記載のイムノコンジュゲート、又は項目４６〜５０の何れか１項に記載の医薬組成物を含むキット。
（項目５４）
対象に対して項目１〜２４の何れか１項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント、項目２５〜２８の何れか１項に記載のポリペプチド、項目３１〜４５の何れか１項に記載のイムノコンジュゲート、又は項目４６〜５０の何れか１項に記載の医薬組成物に細胞を接触させることを含むＣＤ３７を発現する細胞の成育を阻害するための方法。
（項目５５）
対象に対して項目１〜２４の何れか１項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント、項目２５〜２８の何れか１項に記載のポリペプチド、項目３１〜４５の何れか１項に記載のイムノコンジュゲート、又は項目４６〜５０の何れか１項に記載の医薬組成物の治療有効量を癌を有する患者に投与することを含む該患者を治療するための方法。
（項目５６）
対象に対して第２の抗癌剤を投与することを更に含む項目５５記載の方法。
（項目５７）
該第２の抗癌剤が化学療法剤である項目５６記載の方法。
（項目５８）
該癌がＢ細胞リンパ腫、ＮＨＬ、前駆性Ｂ細胞リンパ芽球性白血病／リンパ腫及び成熟Ｂ細胞新生物、Ｂ細胞慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）／小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、リンパプラズマ細胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）、低悪性度、中悪性度及び高悪性度（ＦＬ）、皮膚濾胞中心リンパ腫、辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、ＭＡＬＴ型辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、結節性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、脾臓型辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、ヘアリー細胞白血病、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、ブルキットリンパ腫、プラズマ細胞腫、プラズマ細胞骨髄腫、移植後のリンパ増殖性障害、バルデンストレームマクログロブリン血症、及び未分化大細胞リンパ腫（ＡＬＣＬ）よりなる群から選択される項目５５〜５７の何れか１項に記載の方法。
（項目５９）
配列番号５５〜８７よりなる群から選択される配列に少なくとも９０％同一であるポリペプチドをコードする配列を含む単離されたポリヌクレオチド。
（項目６０）
該配列が配列番号５５〜８７よりなる群から選択される配列に少なくとも９５％同一である項目５９記載の単離されたポリヌクレオチド。
（項目６１）
該配列が配列番号５５〜８７よりなる群から選択される配列に少なくとも９９％同一である項目６０記載の単離されたポリヌクレオチド。
（項目６２）
ポリヌクレオチドが配列番号１２１〜１５１に少なくとも９０％同一である配列を含む項目５９〜６１の何れか１項に記載の単離されたポリヌクレオチド。
（項目６３）
ポリヌクレオチドが配列番号１２１〜１５１に少なくとも９５％同一である配列を含む項目６２記載の単離されたポリヌクレオチド。
（項目６４）
ポリヌクレオチドが配列番号１２１〜１５１に少なくとも９９％同一である配列を含む項目６３記載の単離されたポリヌクレオチド。
（項目６５）
項目５９〜６４の何れか１項に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
（項目６６）
項目６５記載のベクターを含む宿主細胞。
図１は非トランスフェクト３００−１９対照細胞（左パネル）及びＣＤ３７発現３００−１９細胞（右パネル）への抗体結合に関するヒストグラムを示す。ヒストグラムは１０ｎＭのｍｕＣＤ３７−３、ｍｕＣＤ３７−１２、ｍｕＣＤ３７−３８及び一次抗体非存在の場合の染色に関するものである。 図２は非トランスフェクト３００−１９対照細胞（左パネル）及びＣＤ３７発現３００−１９細胞（右パネル）への抗体結合に関するヒストグラムを示す。ヒストグラムは１０ｎＭのｍｕＣＤ３７−５０、ｍｕＣＤ３７−５１、ｍｕＣＤ３７−５６及びｍｕＣＤ３７−５７を用いた染色に関するものである。 図３はフローサイトメトリーによりアッセイした場合のＷＳＵ−ＤＬＣＬ−２細胞への（Ａ）ｍｕＣＤ３７−３及びｍｕＣＤ３７−１２及び（Ｂ）ｍｕＣＤ３７−８、ｍｕＣＤ３７−１０及びｍｕＣＤ３７−１４の結合を示す。 図４は１０ｎＭの濃度の（Ａ）リツキシマブ、ｍｕＣＤ３７−３、ｍｕＣＤ３７−８、ｍｕＣＤ３７−１０、ｍｕＣＤ３７−１２又はｍｕＣＤ３７−１４及び（Ｂ）リツキシマブｈｕＣＤ３７−３、ｍｕＣＤ３７−３８、ｍｕＣＤ３７−５０、ｍｕＣＤ３７−５１、ｍｕＣＤ３７−５６又はｍｕＣＤ３７−５７と共にインキュベートしたＲａｍｏｓリンパ腫細胞を用いたアポトーシスの誘導を計測するためのアネキシン−Ｖアッセイの結果を示す。抗体非存在下（ｎｏ Ａｂ）の未投与細胞の対照試料を比較において使用する。 図５は５日間、種々の濃度のｍｕＣＤ３７−３、ｍｕＣＤ３７−３８、ｍｕＣＤ３７−５０、ｍｕＣＤ３７−５１及びｍｕＣＤ３７−１６抗体とともにインキュベートしたＳＵ−ＤＨＬ−４リンパ腫細胞に対するＷＳＴ−８増殖アッセイの結果を示す。 図６は（Ａ）ＣＤ３７-３ＶＬ及び（Ｂ）ＣＤ３７-３ＶＨに関するリサーフィシング化バージョンにおけるＣＤ３７-３の表面残基及び置換のリストを示す。 図７は（Ａ）ＣＤ３７-５０ＶＬ及び（Ｂ）ＣＤ３７-５０ＶＨに関するリサーフィシング化されたバージョンにおけるＣＤ３７-５０の表面残基及び置換のリストを示す。 図８はＣＤ３７−３及びＣＤ３７-５０の可変領域に関するリサーフィシング化配列の、それらのネズミ対応物：Ａ）ＣＤ３７-３軽鎖可変ドメイン；Ｂ）ＣＤ３７−３重鎖可変ドメイン；Ｃ）ＣＤ３７−５０軽鎖可変ドメイン；Ｄ）ＣＤ３７−５０重鎖可変ドメインに対するアライメントを示す。ダッシュ「−」はネズミ配列との同一性を示す。 図９は（Ａ）フローサイトメトリーでアッセイした場合のＲａｍｏｓ細胞に対するｍｕＣＤ３７−３、ｃｈＣＤ３７−３、ｍｕＣＤ３７−１２及びｃｈＣＤ３７−１２の直接結合アッセイ、及び（Ｂ）２ｎＭの濃度のｍｕＣＤ３７−３−ＰＥコンジュゲートの存在下のＢＪＡＢ細胞へのｍｕＣＤ３７−３、ｃｈＣＤ３７−３、ｍｕＣＤ３７−３ｖ１．０及びｈｕＣＤ３７−３ｖ１．０を用いた競合的結合アッセイを示す。 図１０はフローサイトメトリー：（Ａ）ｍｕＣＤ３７−３、ｍｕＣＤ３７−１２、ｍｕＣＤ３７−３８、ｍｕＣＤ３７−５０、ｍｕＣＤ３７−５１、ｍｕＣＤ３７−５６、ｍｕＣＤ３７−５７、ＷＲ１７及びＴＲＵ−０１６の結合、及び（Ｂ）ｈｕＣＤ３７−３、ｈｕＣＤ３７−３８、ｈｕＣＤ３７−５０、ｈｕＣＤ３７−５１、ｈｕＣＤ３７−５６及びｈｕＣＤ３７−５７の結合によりアッセイしたマカクＣＤ３７抗原を発現する３００−１９細胞への抗ＣＤ３７抗体の結合を示す。結合曲線を用いることにより、各抗体の見かけのＫｄに相当する抗体結合のＥＣ５０を求めた。 図１１は種々の濃度の（Ａ）ｈｕＣＤ３７−３、ｈｕＣＤ３７−３８、ｈｕＣＤ３７−５０及び（Ｂ）ｈｕＣＤ３７−５１、ｈｕＣＤ３７−５６、ｈｕＣＤ３７−５７及びリツキシマブと共にインキュベートしたＲａｍｏｓリンパ腫細胞に対するアポトーシスの誘導を計測するためのアネキシン−Ｖアッセイの結果を示す。ヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照抗体（ｈｕＩｇＧ対照）を投与した細胞の対照試料を比較において使用する。 図１２は５日間種々の濃度のｍｕＣＤ３７−３、ｃｈＣＤ３７−３、ｈｕＣＤ３７−３ｖ１．０及びｈｕＣＤ３７−３ｖ１．０１と共にインキュベートした（Ａ）ＳＵ−ＤＨＬ−４及び（Ｂ）ＤＯＨＨ−２リンパ腫細胞に対するＷＳＴ−８増殖アッセイの結果を示す。 図１３は５日間種々の濃度のｈｕＣＤ３７−３、ＴＲＵ−０１６又はリツキシマブ抗体と共にインキュベートした（Ａ）Ｇｒａｎｔａ−５１９及び（Ｂ）ＳＵ−ＤＨＬ−４リンパ腫細胞に対するＷＳＴ−８増殖アッセイの結果を示す。 図１４は補体の原料としての５％ヒト血清の存在下（Ａ）ｈｕＣＤ３７−３、ｈｕＣＤ３７−３８、ｃｈＣＤ３７-１２又はｈｕＩｇＧ１アイソタイプ対照抗体、及び（Ｂ）ｈｕＣＤ３７−３８、ｈｕＣＤ３７−５０、ｈｕＣＤ３７−５１、ｈｕＣＤ３７−５６及びｈｕＣＤ３７−５７、ｈｕＣＤ３７−１２又はｈｕＩｇＧ１アイソタイプ対照抗体と共にインキュベートしたＲａｍｏｓリンパ腫細胞に対するＣＤＣアッセイの結果を示す。 図１５はエフェクター細胞としての精製ヒトＮＫ細胞の存在下（Ａ）ｈｕＣＤ３７−３、ｈｕＣＤ３７−３８、ｃｈＣＤ３７-５０、ＴＲＵ−０１６及び（Ｂ）ｈｕＣＤ３７−５１、ｈｕＣＤ３７−５６、ｈｕＣＤ３７−５７、ＴＲＵ−０１６又はヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照抗体と共にインキュベートしたＤａｕｄｉリンパ腫細胞に対するＡＤＣＣアッセイの結果を示す。 図１６は完全長のネズミ、ヒト、及びマカカのＣＤ３７アミノ酸配列のアライメントを示す。ダッシュ「−」はネズミ配列との同一性を示す。小型及び大型の細胞外ドメインには下線を付す。 図１７はヒト、組み換え体及び野生型のネズミ、マカカ及びキメラのＣＤ３７配列の大型細胞外ドメインのアライメントを示す。 図１８は各抗体１．５μｇ／ｍｌを用いながらフローサイトメトリーによりアッセイした場合の、（Ａ）ヒトＣＤ３７野生型、及び（Ｂ）ｈＣＤ３７−Ｍ３変異体でトランスフェクトした細胞へのＣＤ３７抗体のパネルの結合を示す。 図１９は各抗体１．５μｇ／ｍｌを用いながらフローサイトメトリーによりアッセイした場合の、（Ａ）ｈＣＤ３７−Ｍ１変異体、及び（Ｂ）ｈＣＤ３７−Ｍ４５変異体でトランスフェクトした細胞へのＣＤ３７抗体のパネルの結合を示す。 図２０はフローサイトメトリーによりアッセイした場合のＢＪＡＶ細胞への結合について、（Ａ）ｈｕＣＤ３７−３をｈｕＣＤ３７-３−ＳＭＣＣ−ＤＭ１、ｈｕＣＤ３７-３−ＳＰＰ−ＤＭ１及びｈｕＣＤ３７-３−スルホ−ｍａｌ−ＤＭ２と比較した場合、及び（Ｂ）ｈｕＣＤ３７−３８をｈｕＣＤ３７-３８−ＳＭＣＣ−ＤＭ１と比較した場合を示している。結合曲線を用いることにより、各々の見かけのＫｄに相当する抗体又はコンジュゲートの結合のＥＣ５０を求めた。 図２１は（Ａ）アポトーシスの誘導を計測するためのアネキシン−Ｖアッセイの結果、及び（Ｂ）ＣＤＣアッセイの結果を示す。アッセイは種々の濃度のｈｕＣＤ３７−３、ｈｕＣＤ３７−３−ＳＭＣＣ−ＤＭ１、ｈｕＩｇＧ１対照抗体、ｈｕＩｇＧ１−ＳＭＣＣ−ＤＭ１対照コンジュゲート、又はリツキシマブと共にインキュベートしたＲａｍｏｓリンパ腫細胞に対して実施した。ＣＤＣアッセイは補体の原料としての５％ヒト血清の存在下に実施した。 図２２はエフェクター細胞としての精製ヒトＮＫ細胞の存在下（Ａ）ｈｕＣＤ３７−３、ｈｕＣＤ３７−３−ＳＭＣＣ−ＤＭ１、ｈｕＣＤ３７−３−ＰＥＧ４−ｍａｌ−ＤＭ１、ＴＲＵ−０１６又はｈｕＩｇＧ１アイソタイプ対照抗体と共にインキュベートしたＤａｕｄｉリンパ腫細胞、及び（Ｂ）ｈｕＣＤ３７−３、ｈｕＣＤ３７−３−ＳＭＣＣ−ＤＭ１、ｈｕＣＤ３７−３−ＰＥＧ４−ｍａｌ−ＤＭ１又はｈｕＩｇＧ１アイソタイプ対照抗体と共にインキュベートしたＲａｍｏｓリンパ腫細胞に対するＡＤＣＣアッセイの結果を示す。 図２３は２０時間１０ｎＭ濃度においてｈｕＣＤ３７−３、ｈｕＣＤ３７−３−ＳＭＣＣ−ＤＭ１、又は非結合ｈｕＣＤ３７−３−ＳＭＣＣ−ＤＭ１対照コンジュゲートと共にインキュベートした（Ａ）ＢＪＡＢ細胞及び（Ｂ）ＲＬ細胞に対するヨウ化プロプリジウム染色を用いた細胞臭気分析の結果を示す。 図２４は５日間３ｘ１０−８Ｍ〜１ｘ１０−１１Ｍの範囲の濃度において（Ａ）ｈｕＣＤ３７-３−ＳＭＣＣ−ＤＭ１、ｈｕＣＤ３７-３８−ＳＭＣＣ−ＤＭ１、ｈｕＣＤ３７-５０−ＳＭＣＣ−ＤＭ１、ｈｕＣＤ３７-５１−ＳＭＣＣ−ＤＭ１、ｈｕＣＤ３７-５６−ＳＭＣＣ−ＤＭ１、ｈｕＣＤ３７-５７−ＳＭＣＣ−ＤＭ１とともにインキュベートしたＤａｕｄｉ細胞、及び（Ｂ）ｈｕＣＤ３７-３−ＳＭＣＣ−ＤＭ１、ｈｕＣＤ３７-３８−ＳＭＣＣ−ＤＭ１、ｈｕＣＤ３７-５０−ＳＭＣＣ−ＤＭ１、ｈｕＣＤ３７-５１−ＳＭＣＣ−ＤＭ１、又は非結合ｈｕＩｇＧ１−ＳＭＣＣ−ＤＭ１対照コンジュゲートと共にインキュベートしたＧｒａｎｔａ−５１９細胞に対するＷＳＴ−８細胞傷害アッセイの結果を示す。 図２５はＳＣＩＤマウス内に皮下移植したＢＪＡＢリンパ腫細胞を用いた樹立異種移植片モデルの結果を示す。動物には、（Ａ）ｈｕＣＤ３７-３Ａｂ、ｈｕＣＤ３７-３−ＳＭＣＣ−ＤＭ１、ｈｕＣＤ３７-５０Ａｂ、ｈｕＣＤ３７-５０−ＳＭＣＣ−ＤＭ１又は（Ｂ）ｈｕＣＤ３７-３８Ａｂ、ｈｕＣＤ３７-３８−ＳＭＣＣ−ＤＭ１、ｈｕＣＤ３７-５６Ａｂ、ｈｕＣＤ３７-５６−ＳＭＣＣ−ＤＭ１の何れか１０ｍｇ／ｋｇを、細胞接種後第１２日に１回投与した。種々異なる投与群の平均腫瘍体積を腫瘍細胞接種後の時間に対してプロットする。 図２６はＳＣＩＤマウス内に皮下移植したＢＪＡＢリンパ腫細胞を用いた樹立異種移植片試験の結果を示す。１０ｍｇ／ｋｇのｈｕＣＤ３７-３Ａｂ、ｈｕＣＤ３７-３−ＳＭＣＣ−ＤＭ１、ｈｕＣＤ３７-３−スルホ−ｍａｌ−ＤＭ４又は５ｍｇ／ｋｇのｈｕＣＤ３７-３−ＳＰＰ−ＤＭ１の何れかを、細胞接種後第９日に１回、動物に投与した。種々異なる投与群の平均腫瘍体積を腫瘍細胞接種後の時間に対してプロットする。 図２７はＳＣＩＤマウス内に皮下移植したＳＵ−ＤＨＬ−４びまん性大型Ｂ細胞リンパ腫細胞を用いた樹立異種移植片モデルの結果を示す。１０ｍｇ／ｋｇのｈｕＣＤ３７-３Ａｂ、ｈｕＣＤ３７-３−ＳＭＣＣ−ＤＭ１、ｈｕＣＤ３７-３−スルホ−ｍａｌ−ＤＭ４又は５ｍｇ／ｋｇのｈｕＣＤ３７-３−ＳＰＰ−ＤＭ１の何れかを、細胞接種後第１７日に１回、動物に投与した。種々異なる投与群のメジアン腫瘍体積を腫瘍細胞接種後の時間に対してプロットする。 図２８はＳＣＩＤマウス内に皮下移植したＢＪＡＢリンパ腫細胞を用いた樹立異種移植片試験の結果を示す。１０ｍｇ／ｋｇのｈｕＣＤ３７-３Ａｂ、ｈｕＣＤ３７-３−ＳＭＣＣ−ＤＭ１又はｈｕＣＤ３７-３−ＰＥＧ４−ｍａｌ−ＤＭ４の何れかを、細胞接種後第９日に１回、動物に投与した。種々異なる投与群の平均腫瘍体積を腫瘍細胞接種後の時間に対してプロットする。 図２９はＳＣＩＤマウス内に皮下移植したＳＵ−ＤＨＬ−４びまん性大型Ｂ細胞リンパ腫細胞を用いた樹立異種移植片モデルの結果を示す。１０ｍｇ／ｋｇのｈｕＣＤ３７-３Ａｂ、ｈｕＣＤ３７-３−ＳＭＣＣ−ＤＭ１又はｈｕＣＤ３７-３−ＰＥＧ４−ｍａｌ−ＤＭ４の何れかを、細胞接種後第１５日に１回、動物に投与した。種々異なる投与群の平均腫瘍体積を腫瘍細胞接種後の時間に対してプロットする。 図３０はＳＣＩＤマウス内に皮下移植したＤｏＨＨ２濾胞性Ｂ細胞リンパ腫細胞による樹立異種移植片モデルを用いたアッセイの結果を示す。動物には、接種後第１２日から、（ｉ）ｈｕＣＤ３７−３抗体１０ｍｇ／ｋｇの単回投薬、（ｉｉ）ｈｕＣＤ３７−３−ＳＭＣＣ−ＤＭ１コンジュゲート１０ｍｇ／ｋｇの単回投薬、（ｉｉｉ）３週間の期間、週２回リツキシマブ２ｍｇ／ｋｇの６回投薬、（ｉｖ）単回４０ｍｇ／ｋｇ投薬のシクロホスファミド及び０．５ｍｇ／ｋｇのビンクリスチンと、これに平行して５回の毎日０．２ｍｇ／ｋｇ投薬のプレドニゾン（ＣＶＰ）の投薬法、又は（ｖ）ベヒクル対照、の投与を開始した。種々異なる投与群のメジアン腫瘍体積を腫瘍細胞接種後の時間に対してプロットする。 図３１はＳＣＩＤマウス内に皮下移植したＪＶＭ３ＣＬＬ細胞による樹立異種移植片モデルを用いたアッセイの結果を示す。動物には、接種後第７日から、（ｉ）ｈｕＣＤ３７−３抗体１０ｍｇ／ｋｇの単回投薬、（ｉｉ）ｈｕＣＤ３７−３−ＳＭＣＣ−ＤＭ１コンジュゲート５ｍｇ／ｋｇ、（ｉｉｉ）ｈｕＣＤ３７−３−ＳＭＣＣ−ＤＭ１コンジュゲート１０ｍｇ／ｋｇ、（ｉｖ）３週間の期間、週２回オファツムマブ５ｍｇ／ｋｇの６回投薬、（ｖ）単回５０ｍｇ／ｋｇ投薬のベンダムスチン、又は（ｖｉ）ベヒクル対照、の投与を開始した。種々異なる投与群のメジアン腫瘍体積を腫瘍細胞接種後の時間に対してプロットする。 図３２は種々のＮＨＬ及びＣＬＬ腫瘍細胞系統において計測したＣＤ３７及びＣＤ２０の発現レベル（Ａ）及びこれらの細胞系統において計測したｈｕＣＤ３７−３−ＳＭＣＣ−ＤＭ１のインビトロの細胞傷害性（Ｂ）を示す。
本発明はＣＤ３７発現（例えば陽性）細胞に対抗する以下の３つの細胞傷害活性：アポトーシスの誘導、ＡＤＣＣ及びＣＤＣにおいて高い力価を有するＣＤ３７結合分子の新しいクラスを提供する。更に又、インビボの腫瘍モデルを用いて明らかにされる通り、抗ＣＤ３７抗体のイムノコンジュゲートは意外にも良好にＣＤ３７発現細胞を殺傷する。
１．定義
本発明の理解を容易にするために、多くの用語及びフレーズを以下に定義する。
ＣＤ３７という用語は、本明細書において使用する場合、特段の記載が無い限り、何れかのネイティブのＣＤ３７を指す。ＣＤ３７は又ＧＰ５２−４０、白血球抗原ＣＤ３７、及びテトラスパニン−２６とも称される。「ＣＤ３７」という用語は「完全長」の未プロセシングのＣＤ３７並びに細胞中でのプロセシングの結果として生じるＣＤ３７の何れかの形態を包含する。用語は又ＣＤ３７の天然に存在する変異体、例えばスプライス変異体、対立遺伝子変異体及びアイソフォームを包含する。本明細書に記載するＣＤ３７ポリペプチドは種々の原料、例えばヒト組織型から、又は、他の原料から単離することができ、或いは、組み換え又は合成の方法により調製できる。
「抗体」という用語は、免疫グロブリン分子の可変領域内部の抗原認識部位少なくとも１つを介して、蛋白、ポリペプチド、ペプチド、炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質又はこれらの組み合わせのような標的を認識して特異的に結合する免疫グロブリン分子を意味する。本明細書において使用する場合、「抗体」という用語は未損傷のポリクローナル抗体、未損傷のモノクローナル抗体、抗体フラグメント（例えばＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖフラグメント）、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）突然変異体、少なくとも２つの未損傷抗体から形成された二重特異性抗体のような多重特異性抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、抗体の抗原決定部分を含む融合蛋白、及び、抗体が所望の生物学的活性を呈する限りにおいて、抗原認識部位を含むいずれかの他の修飾された免疫グロブリン分子を包含する。抗体は、それぞれアルファ、デルタ、イプシロン、ガンマ及びミューと称される自身の重鎖定常ドメインのアイデンティティーに基づいて、免疫グロブリンの５主要クラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭ、又はそのサブクラス（アイソタイプ）（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２）の何れかであることができる。異なるクラスの免疫グロブリンは異なる良く知られたサブユニット構造及び三次元配置を有する。抗体はネイキッドであるか、毒素、放射性同位体等のような他の分子にコンジュゲートされていることができる。
「ブロッキング」抗体又は「拮抗剤」抗体とはＣＤ３７のような自身が結合する抗原の生物学的活性を阻害又は低減するものである。一部の実施形態においてはブロッキング抗体又は拮抗剤抗体は抗原の生物学的活性を実質的に、又は完全に阻害する。生物学的活性は１０％、２０％、３０％、５０％、７０％、８０％、９０％、９５％、又は１００％までも低減することができる。
「抗ＣＤ３７抗体」又は「ＣＤ３７に結合する抗体」という用語はＣＤ３７をターゲティングする場合において診断薬及び／又は治療剤として抗体が有用であるように、十分な親和性を持ってＣＤ３７に結合することができる抗体を指す。未関連の非ＣＤ３７への抗ＣＤ３７抗体の結合の程度は、例えばラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）により計測した場合にＣＤ３７への抗体の結合の約１０％未満であることができる。特定の実施形態においてはＣＤ３７に結合する抗体は≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、又は≦０．１ｎＭの解離定数（Ｋｄ）を有する。
「抗体フラグメント」という用語は未損傷の抗体の一部分を指し、そして未損傷の抗体の抗原決定可変領域を指す。抗体フラグメントの例は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖフラグメント、線状抗体、単鎖抗体、及び抗体フラグメントから形成された多重特異性抗体を包含するがこれらに限定されない。
「モノクローナル抗体」とは単一の抗原決定基、即ちエピトープの高度に特異的な認識及び結合に関与する均質な抗体集団を指す。これは種々異なる抗原決定基に対して指向された種々異なる抗体を典型的には包含しているポリクローナル抗体とは対照的である。「モノクローナル抗体」という用語は未損傷及び完全長のモノクローナル抗体、並びに抗体フラグメント（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ）、単鎖（ｓｃＦｖ）突然変異体、抗体部分を含む融合蛋白、及び抗原認識部位を含む何れかの他の修飾された免疫グロブリン分子を包含する。更に又、「モノクローナル抗体」とはハイブリドーマ、ファージ選択、組み換え発現、及びトランスジェニック動物による方法を包含するがこれらに限定されない態様の何れかにより作成された抗体を指す。
「ヒト化抗体」という用語は最小限の非ヒト（例えばネズミ）配列を含有する特異的な免疫グロブリン鎖、キメラ免疫グロブリン、又はそのフラグメントである非ヒト（例えばネズミ）抗体の形態を指す。典型的にはヒト化抗体は所望の特異性、親和性及び能力を有する非ヒト種（例えばマウス、ラット、ウサギ、ハムスター）のＣＤＲに由来する残基により、相補性決定領域（ＣＤＲ）由来の残基が置き換えられているヒト免疫グロブリンである(Jones等、1986,Nature,321:522-525; Riechmann等、1988, Nature,332:323-327; Verhoeyen等、1988,Science,239:1534-1536)。一部の例においては、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域（ＦＲ）残基が所望の特異性、親和性及び能力を有する非ヒト種由来抗体中の相当する残基で置き換えられている。ヒト化抗体は更に抗体の特異性、親和性及び／又は能力を精鋭化及び最適化するためにＦｖフレームワーク内及び／又は置き換えられた非ヒト残基内部における追加的残基の置換により修飾できる。一般的にヒト化抗体は、非ヒト免疫グロブリンに相当するＣＤＲ領域の全て又は実質的に全てを含有する可変ドメイン少なくとも１つ、そして典型的には２つ又は３つの実質的に全てを含むことになり、一方ＦＲ領域の全て又は実質的に全てはヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものである。ヒト化抗体は又、免疫グロブリン定常領域又はドメイン（Ｆｃ）の少なくとも一部分、典型的にはヒト免疫グロブリンのものを含むこともできる。ヒト化抗体を形成するために使用される方法の例は米国特許５，２２５，５３９に記載されている。
抗体の「可変領域」とは単独又は組み合わせにおいて、抗体軽鎖の可変領域又は抗体重鎖の可変領域を指す。重鎖及び軽鎖の可変領域は各々、超可変領域としても知られている３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）により連結された４つのフレームワーク領域（ＦＲ）よりなる。各鎖におけるＣＤＲはＦＲにより近接して共に保持されており、そして他の鎖のＣＤＲと共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与している。ＣＤＲを決定するためには少なくとも２つの手法、即ち：（１）種間の配列変動性に基づくアプローチ（即ちKabat等、SequencesofProteins of Immunological Interest, (5th ed.,1991, National InstitutesofHealth, Bethesda Md.)）；及び（２）抗原−抗体複合体の結晶学的研究に基づいたアプローチ（Al-lazikaniet al(1997)J. Molec. Biol. 273:927-948)）が存在する。更に又、これらの２つのアプローチの組み合わせがＣＤＲを決定するために当該分野で使用される場合もある。
Ｋａｂａｔナンバリングシステムは一般的に可変ドメイン内の残基（概ね、軽鎖の残基１〜１０７及び重鎖の残基１〜１１３）を指す場合に使用される（例えばKabat等、SequencesofImmunological Interest. 5th Ed. Public HealthService, NationalInstitutesofHealth, Bethesda, Md. (1991)）。
Ｋａｂａｔの場合のアミノ酸位置のナンバリングはKabat等、Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest,5th Ed.Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda,Md.(1991)における抗体のコンピレーションの重鎖可変ドメイン又は軽鎖可変ドメインに対して使用されるナンバリングシステムである。このナンバリングシステムを使用すると、実際の線状アミノ酸配列は可変ドメインのＦＲ又はＣＤＲの短鎖化、又はそれへの挿入に相当する、より少数又は追加のアミノ酸を含有する場合がある。例えば、重鎖可変ドメインはＨ２の残基５２の後の単一のアミノ酸の挿入（Ｋａｂａｔによる残基５２ａ）及び重鎖ＦＲ残基８２の後の挿入残基（例えばＫａｂａｔによる残基８２ａ、８２ｂ及び８２ｃ等）を包含する場合がある。残基のＫａｂａｔナンバリングは「標準的」Ｋａｂａｔナンバリングされた配列との、抗体の配列の相同性の領域におけるアライメントにより所定の抗体について決定することができる。Ｃｈｏｔｈｉａは代わりに構造ループの箇所を指している（ChothiaandLeskJ. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)）。Ｋａｂａｔのナンバリング法を用いてナンバリングした場合のＣｈｏｔｈｉａのＣＤＲ−Ｈ１ループの終点はループの長さによりＨ３２とＨ３４の間で変動する（その理由はＫａｂａｔのナンバリング法はＨ３５ＡとＨ３５Ｂに挿入を置いており；３５Ａと３５Ｂの何れも存在しない場合はループは３２で終点となり；３５Ａのみが存在する場合は、ループは３３で終点隣；３５Ａと３５Ｂの両方が存在する場合は、ループは３４で終点となる）。ＡｂＭ超可変領域はＫａｂａｔのＣＤＲとＣｈｏｔｈｉａの構造ループの間の妥協点を示しており、Ｏｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ’ｓ ＡｂＭ抗体モデリングソフトウエアにより使用されている。
「ヒト抗体」という用語は、ヒトにより作成された抗体、又は当該分野で知られている何れかの手法を用いて人工的に生成された抗体に相当するアミノ酸配列を有する抗体を意味する。ヒト抗体のこの定義は、未損傷又は完全長の抗体、そのフラグメント、及び／又は少なくとも１つのヒト重鎖及び／又は軽鎖のポリペプチドを含む抗体、例えばネズミ軽鎖及びヒト重鎖のポリペプチドを含む抗体を包含する。
「キメラ抗体」という用語は免疫グロブリン分子のアミノ酸配列が２つ以上の種から誘導されている抗体を指す。典型的には、軽鎖及び重鎖の両方の可変領域は、所望の特異性、親和性及び能力を有する哺乳類の１種（例えばマウス、ラット、ウサギ等）から誘導された抗体の可変領域に相当し、そして、定常領域はその種における免疫応答を誘発することを回避するために別のもの（通常はヒト）から誘導された抗体中の配列に相同である。
「エピトープ」又は「抗原決定基」という用語は、本明細書においては互換的に使用され、そして特定の抗体により認識され、そして特異的に結合されることができる抗原の部分を指す。抗原がポリペプチドである場合、エピトープは蛋白の３次折り畳みにより並置された連続アミノ酸及び非連続アミノ酸の両方から形成できる。連続アミノ酸から形成されたエピトープは典型的には蛋白変性時に保持されるのに対し、３次折り畳みにより形成されるエピトープは典型的には蛋白変性時に消失する。エピトープは典型的には少なくとも３つ、そしてより普通には少なくとも５又は８〜１０個のアミノ酸をユニークな空間的コンホーメーションにおいて包含している。
「結合親和性」とは一般的に、分子（例えば抗体）の単一の結合部位とその結合相手（例えば抗原）との間の非共有結合的な相互作用の総計の強度を指す。特段の記載が無い限り、本明細書において使用する場合、「結合親和性」とは結合対のメンバー（例えば抗体と抗原）の間の１：１相互作用を反映する内因性の結合親和性を指す。分子Ｘのその相手Ｙに対する親和性は一般的に解離定数（Ｋｄ）により表すことができる。親和性は本明細書に記載する者を含めて当該分野で知られている一般的方法により計測できる。低親和性の抗体は一般的に緩徐に抗原に結合し、そして容易に解離する傾向があるのに対し、高親和性の抗体は一般的に急速に抗原に結合し、そしてより長時間結合したままとなる傾向を有する。結合親和性を計測するための種々の方法が当該分野で知られており、それらのいずれも本発明の目的のために使用できる。特定の例示される実施形態は後述するとおりである。
「より良好」とは本明細書において使用する場合、分子とその結合相手との間のより強い結合を指す。「より良好」とは本明細書において使用する場合、より小さい数のＫｄ値により表されるより強い結合を指す。例えば、「０．６ｎMより良好」な抗原に対する親和性を有する抗体について、その抗原に対する抗体の親和性は＜０．６ｎＭ、即ち０．５９ｎＭ、０．５８ｎＭ、０．５７ｎＭ、等、又は０．６ｎＭ未満の何れかの値である。
「特異的に結合する」とは、一般的に、抗体がその抗原結合ドメインを介してエピトープに結合すること、及び、結合が抗原結合ドメインとエピトープの間の何らかの相補性を必要とすることを意味する。この定義によれば、抗体は、それがランダムの未関連エピトープに結合するよりも更に容易にその抗原結合ドメインを介してエピトープに結合する場合にそのエピトープに「特異的に結合する」と言うことができる。「特異的に」という用語は本明細書においては、特定の抗体を特定のエピトープに結合させている相対的な親和性を評定するために使用する。例えば抗体「Ａ」はあるエピトープに対して抗体「Ｂ」よりも高値の特異性を有すると考えてよく、或いは、抗体「Ａ」はそれが関連するエピトープ「Ｄ」に対して有するよりも高値の特異性でエピトープ「Ｃ」部に結合すると考えてよい。
「優先的に結合する」とは、抗体があるエピトープに対し、関連する同様の相同又は類縁のエピトープに結合するよりも、より容易に特異的に結合することを意味する。即ち、あるエピトープに「優先的に結合する」抗体は、そのような抗体が関連エピトープに交差反応してもよいが、関連エピトープよりもそのエピトープにより結合しやすい。
抗体は、レファレンス抗体のあるエピトープへの結合をある程度までブロックする域にまでそのエピトープに優先的に結合する場合に、そのエピトープへのレファレンス抗体の結合を「競合的に阻害する」と言える。競合的阻害は当該分野で知られている何れかの方法、例えば競合的ＥＬＩＳＡアッセイにより測定してよい。抗体は、レファレンス抗体のあるエピトープへの結合を少なくとも９０％、少なくとも８０％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、又は少なくとも５０％競合的に阻害すると言ってよい。
「実質的に同様」又は「実質的に同じ」というフレーズは、本明細書において使用する場合、当業者が２つの値の間の差が、その値（例えばＫｄ値）により計測される生物学的特性の範囲内において生物学的及び／又は統計学的な有意性を殆ど又は全く有さないと考えるような、２つの数値（一般的に１つは本発明の抗体に関連するものであり、もう１つはレファレンス／コンパレーター抗体に関連するもの）の間の十分高度な同様性を意味する。該２つの値の間の差は、レファレンス／コンパレーター抗体の値の関数として、約５０％未満、約４０％未満、約３０％未満、約２０％未満、約１０％未満であることができる。
「単離された」ポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞又は組成物は、自然界で観察されない形態となっているポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞又は組成物である。単離されたポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞又は組成物はそれらが自然界で観察される形態にはそれらがもはやなりえない程度にまで精製されているものを包含する。一部の実施形態においては、単離された抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、又は組成物は実質的に純粋である。
本明細書において使用する場合、「実質的に純粋」とは少なくとも５０％純粋（即ち夾雑物が存在しない）、少なくとも９０％純粋、少なくとも９５％純粋、少なくとも９８％純粋、少なくとも９９％純粋である物質を指す。
「イムノコンジュゲート」又は「コンジュゲート」という用語は本明細書において使用する場合、細胞結合剤（即ち抗ＣＤ３７抗体又はそのフラグメント）に連結された化合物又はその誘導体を指し、そして包括的な式：Ｃ−Ｌ−Ａにより定義され、式中、Ｃ＝細胞傷害物質、Ｌ＝リンカー、そしてＡ＝細胞結合剤又は抗ＣＤ３７抗体又は抗体フラグメントである。イムノコンジュゲートは又、逆順序の包括的な式：Ａ−Ｌ−Ｃによっても定義できる。
「リンカー」とは安定な共有結合の態様において抗ＣＤ３７抗体又はそのフラグメントのような細胞結合剤に、通常はマイタンシノイドのような薬物を連結することができる何れかの化学的部分である。リンカーは化合物又は抗体が活性であり続けられる条件において、酸誘導切断、光誘導切断、ペプチダーゼ誘導切断、エステラーゼ誘導切断、及びジスルフィド結合切断に対して感受性であるか、又は実質的に抵抗性であることができる。適当なリンカーは当該分野で良く知られており、そして例えばジスルフィド基、チオエーテル基、酸不安定基、光不安定基、ペプチダーゼ不安定基及びエステラーゼ不安定基を包含する。リンカーは又本明細書に記載する、そして当該分野で知られている荷電リンカー、及びその親水性形態を包含する。
「癌」及び「癌性の」という用語は細胞集団が制御不可能な細胞生育を特徴とする哺乳類における生理学的状態を指すか、これを説明するものである。癌の例は癌腫、リンパ腫、芽腫、肉腫、及び白血病を包含するが、これらに限定されない。「腫瘍」及び「新生物」は前癌患部を包含する良性（非癌性）又は悪性（癌性）の何れかの過剰な細胞の生育又は増殖に起因する１つ以上の細胞を指す。治療及び／又は防止することができる「癌」又は「腫瘍形成性」疾患の例は、Ｂ細胞リンパ腫、例えばＮＨＬ、前駆性Ｂ細胞リンパ芽球性白血病／リンパ腫及び成熟Ｂ細胞新生物、例えばＢ細胞慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）／小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、リンパプラズマ細胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）、例えば低悪性度、中悪性度及び高悪性度（ＦＬ）、皮膚濾胞中心リンパ腫、辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫（ＭＡＬＴ型、結節型性及び脾臓型）、ヘアリー細胞白血病、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、ブルキットリンパ腫、プラズマ細胞腫、プラズマ細胞骨髄腫、移植後のリンパ増殖性障害、バルデンストレームマクログロブリン血症、及び未分化大細胞リンパ腫（ＡＬＣＬ）を包含する。
「癌細胞」、「腫瘍細胞」という用語及び文法的等価表現は、腫瘍細胞集団の塊状物を含む非腫瘍形成性細胞及び腫瘍形成性幹細胞（癌幹細胞）の両方を包含する腫瘍又は前癌性の患部から誘導された細胞の総集団を指す。本明細書において使用する場合、「腫瘍細胞」という用語は、癌幹細胞からそれらの腫瘍細胞を区別できるように更新及び分化する能力を欠いている腫瘍細胞のみを指す場合には、「非腫瘍形成性」という用語により修飾されることになる。
「対象」という用語は、特定の治療のレシピエントとなるべきヒト、非ヒト霊長類、げっ歯類等を包含するがこれらに限定されない何れかの動物（例えば哺乳類）を指す。典型的には、「対象」及び「患者」という用語は、ヒト対象に言及する場合には本明細書においては互換的に使用される。
１つ以上の他の治療剤「と組み合わせた」投与とは、同時（並行）及び何れかの順序における連続投与を包含する。
「医薬品製剤」という用語は活性成分の生物学的活性を有効とする形態にあり、そして、製剤を投与する対象に対して許容できない程度毒性である追加的成分を含有しない調製物を指す。製剤は滅菌されることができる。
本明細書に開示する抗体の「有効量」とは特に記載された目的を実施するために十分な量である。「有効量」は記載された目的に関連して、実験的に、そして定型的な態様において決定できる。
「治療有効量」という用語は対象又は哺乳類における疾患又は障害を「治療」するために有効な抗体又は他の薬物の量を指す。癌の場合は、薬物の治療有効量はがん細胞の数を低減し；腫瘍の大きさを低減し；周辺臓器内部への癌細胞の浸潤を阻害し（即ちある程度まで緩徐化するか停止させ）；腫瘍の転移を阻害し（即ちある程度まで緩徐化するか停止させ）；腫瘍の生育をある程度まで阻害し；及び／又は癌に関連する症状の１つ以上をある程度まで緩和することができる。本明細書における「治療すること」の定義を参照できる。薬物が既存の癌細胞を生育を防止できる限り、それらは細胞増殖抑制性及び／又は細胞傷害性であることができる。「予防有効量」とは所望の予防結果を達成するために、必要な投薬量において必要な期間に渡り、有効な量を指す。必然的にではないが典型的には、予防用量は疾患の前、又は早期の段階において対象において使用されるため、予防有効量は治療有効量より低値となる。
「標識」という用語は本明細書において使用する場合、「標識された」抗体を形成するべく抗体に直接又は間接的にコンジュゲートされる検出可能な化合物又は組成物を指す。「標識はそれ自体検出されることができる（例えば放射性同位体標識又は蛍光標識）か、又は、酵素標識の場合は、検出可能な基質化合物又は組成物の化学的改変を触媒することができる。
「化学療法剤」とは作用機序に関わらず、癌の治療において有用な化学的化合物である。化学療法剤は例えば、ＣＤ２０の拮抗剤、例えばリツキシマブ及びシクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、プレドニソン、フルダラビン、エトポシド、メトトレキセート、レナリドミド、クロラムブシル、ベンタムスチン、及び／又はこのような化学療法剤の修飾されたバージョンを包含する。
「治療すること」又は「治療」又は「治療するため」又は「軽減すること」又は「軽減するため」等の用語は、１）診断された病理学的状態又は障害の症状の治癒、緩徐化、減少、及び／又は進行の停止を行う治療手段、及び２）ターゲティングされた病理学的状態又は障害の発症を防止及び／又は緩徐化する予防的又は防止的な手段の両方を指す。即ち、治療を必要とするものは、障害を既に有する者；障害を有し易い者；及び障害を防止すべき者を包含する。特定の実施形態においては、対象は患者が以下：癌細胞の数の減少又は完全な非存在；腫瘍の大きさの低減；例えば軟組織及び骨内部への癌の拡張を包含する周辺臓器内部への癌細胞の浸潤の阻害又は非存在；腫瘍転移の阻害又は非存在；腫瘍生育の阻害又は非存在；特定の癌に関連する症状１つ以上の緩解；罹患率及び死亡率の低減；クオリティーオブライフの向上；腫瘍の腫瘍形成性、腫瘍形成頻度、又は腫瘍形成能力の低減；腫瘍中の癌幹細胞の数又は頻度の低減；腫瘍形成性細胞の非腫瘍形成性状態への分化；又は作用の何らかの組み合わせの１つ以上を呈する場合に本発明の方法に従って癌に関して良好に「治療される。
本明細書において互換的に使用される「ポリヌクレオチド」又は「核酸」とは、何れかの長さのヌクレオチドの重合体を指し、そしてＤＮＡ及びＲＮＡを包含する。ヌクレオチドはデオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾されたヌクレオチド又は塩基、及び／又はそれらの類縁体、又はＤＮＡ又はＲＮＡポリメラーゼにより重合体内に取り込まれることができる何れかの基質であることができる。ポリヌクレオチドは修飾されたヌクレオチド、例えばメチル化ヌクレオチド及びそれらの類縁体を含むことができる。存在する場合、ヌクレオチド構造の修飾は重合体の組み立ての前又は後に行うことができる。ヌクレオチドの配列は非ヌクレオチド成分により中断されていることができる。ポリヌクレオチドは重合の後に、例えば標識成分とのコンジュゲーションにより更に修飾されることができる。他の型の修飾は、例えば「キャップ」、天然に存在するヌクレオチド１つ以上の類縁体による置換、ヌクレオチド間修飾、例えば未荷電連結部（例えばメチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホアミデート、カーバメート等）及び荷電連結部（例えばホスホロチオエート、ホスホロジチオエート等）を有するもの、例えば蛋白のような懸垂部分を含有するもの（例えばヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチド、ポリ−Ｌ−リジン等）、インターカレーターを有する者（例えばアクリジン、ソラレン等）、キレート形成剤を含有するもの（例えば金属、放射活性金属、ホウ素、酸化性金属等）、アルキル化剤を含有するもの、修飾された連結部を有するもの（例えばアルファアノマー核酸等）並びにポリヌクレオチドの未修飾の形態を包含する。更に又、糖に元から存在するヒドロキシル基の何れかを例えばホスホネート基、ホスフェート基で置き換えるか、標準的な保護基で保護するか、又は活性化して別のヌクレオチドへの別の連結部を調製することができ、又は固体支持体にコンジュゲートすることができる。５’及び３’末端のＯＨはホスホリル化するか、又は、アミン又は炭素原子１〜２０個の有機キャッピング基部分で置換することができる。他のヒドロキシルもまた、標準的な保護基に誘導体化することができる。ポリヌクレオチドは又、当該分野で一般的に知られているリボース又はデオキシリボースの糖の類縁体型、例えば２’−Ｏ−メチル−、２’−Ｏ−アリル、２’−フルオロ−又は２’−アジド−リボース、カルボキシル糖類縁体、アルファアノマー型糖、エピマー型糖、例えばアラビノース、キシロース又はリキソース、ピラノース糖、フラノース糖、セドヘプツロース、非環式類縁体及び無塩基のヌクレオシド類縁体、例えばメチルリボーシドを含有できる。１つ以上のホスホジエステル連結部を代替の連結基で置き換えることができる。このような代替の連結基はホスフェートがＰ（Ｏ）Ｓ（チオエート）、Ｐ（Ｓ）Ｓ（ジチオエート）、（Ｏ）ＮＲ２（アミデート）、Ｐ（Ｏ）Ｒ、Ｐ（Ｏ）ＯＲ’、ＣＯ又はＣＨ２（ホルムアセタール）である実施形態を包含するがこれらに限定されず、式中各々のＲ又はＲ’は独立してＨ又は置換又は未置換の場合によりエーテル（−Ｏ−）連結部を含有するアルキル（１−２０Ｃ）、アリール、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニル又はアラルキルである。ポリヌクレオチド中の全ての連結部が必ずしも同一である必要はない。以上の記載はＲＮＡ及びＤＮＡを包含する本明細書において言及する全てのポリヌクレオチドに適用される。
「ベクター」という用語は宿主細胞中に１つ以上の遺伝子又は配列を送達及び場合により発現することができるコンストラクトを意味する。ベクターの例はウィルスベクター、ネイキッドＤＮＡ又はＲＮＡ発現ベクター、プラスミド、コスミド又はファージベクター、カチオン性縮合剤に会合したＤＮＡ又はＲＮＡ発現ベクター、リポソーム内にカプセル化されたＤＮＡ又はＲＮＡ発現ベクター、及び特定の真核生物の細胞、例えばプロデューサー細胞を包含するがこれらに限定されない。
「ポリペプチド」、「ペプチド」及び「蛋白」という用語は本明細書においては何れかの長さのアミノ酸の重合体を指すために互換的に使用される。重合体は直鎖又は分枝鎖であることができ、修飾されたアミノ酸を含むことができ、そして非アミノ酸により中断されることができる。用語は又、天然に、又は介入、例えばジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、ホスホリル化、又は他の何れかの操作又は修飾、例えば標識成分とのコンジュゲーションにより修飾されているアミノ酸重合体を包含する。同様に包含されるものは、例えばアミノ酸の類縁体１つ以上（例えば非天然のアミノ酸等を包含）並びに他の当該分野で知られている修飾を含有するポリペプチドである。本発明のポリペプチドは抗体に基づいているため、特定の実施形態においては、ポリペプチドは単鎖又は会合している鎖として存在することができる。
２つ以上の核酸又はポリペプチドの文脈における「同一」又はパーセント「同一性」という用語は、配列同一性の部分として如何なる保存的アミノ酸置換も考慮しない場合に、最大相応が得られるように比較してアライン（必要に応じてギャップを導入）した場合に、同じであるか、又は同じであるヌクレオチド又はアミノ酸残基の特定のパーセンテージを有する２つ以上の配列又はサブ配列を指す。パーセント同一性は配列比較ソフトウエア又はアルゴリズムを用いながら、又は目視による検査により計測できる。アミノ酸又はヌクレオチド配列のアライメントを得るために使用できる種々のアルゴリズム及びソフトウエアが当該分野で知られている。そのような配列アライメントアルゴリズムの非限定的な例は、Karlin等、1993,Proc.Natl. Acad. Sci., 90:5873-5877により変更され、ＮＢＬＡＳＴ及びＸＢＬＡＳＴプログラム(Altschul等、1991,NucleicAcidsRes., 25:3389-3402)に組み込まれたKarlin et al, 1990, Proc. Natl.Acad.Sci.,87:2264-2268に記載されているアルゴリズムである。特定の実施形態においてはＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴをAltschul等、1997,NucleicAcidsRes. 25:3389-3402に記載の通り使用できる。ＢＬＡＳＴ−２、ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２ (Altschul等、1996,MethodsinEnzymology, 266:460-480)、ＡＬＩＧＮ、ＡＬＩＧＮ−２ (Genentech, SouthSanFrancisco,California)又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）は配列をアラインするために使用できる別の好適に入手できるソフトウエアプログラムである。特定の実施形態においては、２つのヌクレオチド配列の間のパーセント同一性は、ＧＣＧソフトウエアにおけるＧＡＰプログラムを用いながら（例えばＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰマトリックス及びギャップウエイト４０、５０、６０、７０又は９０及びレングスウエイト１、２、３、４、５及び６を用いながら）求められる。特定の代替の実施形態においては、NeedlemanandWunsch(J. Mol. Biol. (48):444-453 (1970))のアルゴリズムを組み込んだＧＣＧソフトウエアパッケージにおけるＧＡＰプログラムを用いることにより２つのアミノ酸配列の間のパーセント同一性を求めることができる（例えばＢｌｏｓｓｕｍ６２マトリックス又はＰＡＭ２５０マトリックス及びギャップウエイト１６、１４、１２、１０、８、６又は４及びレングスウエイト１、２、３、４、５を用いる）。あるいは特定の実施形態においては、ヌクレオチド又はアミノ酸配列の間のパーセント同一性はMyersandMiller (CABIOS, 4:11-17 (1989))のアルゴリズムを用いながら求める。例えばパーセント同一性はＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）を用いながら、そして、残基表を伴ったＰＡＭ１２０、ギャップレングスペナルティー１２及びギャップペナルティー４を用いながら、求めることができる。特定のアライメントソフトウエアによる最大のアライメントのための適切なパラメーターは当業者が決定できる。特定の実施形態においては、アライメントソフトウエアのデフォルトパラメーターを使用する。特定の実施形態においては、第１のアミノ酸配列の第２の配列に対するパーセンテージ同一性「Ｘ」は１００×（Ｙ／Ｚ）として計算され、式中、Ｙは第１及び第２の配列のアライメント（目視検査によるか特定の配列アライメントプログラムによりアラインした場合）における同一マッチとして採点されたアミノ酸残基の数であり、そしてＺは第２の配列中の残基の総数である。第１の配列の長さが第２の配列より長い場合、第２の配列に対する第１の配列のパーセント同一性は第１の配列に対する第２の配列のパーセント同一性より長くなることになる。
非限定的な例として、何れかの特定のポリヌクレオチドが、レファレンス配列に対して特定のパーセント配列同一性を有する（例えば少なくとも８０％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、そして一部の実施形態においては少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一）かは、特定の実施形態においては、Ｂｅｓｔｆｉｔプログラムを用いて測定できる（WisconsinSequenceAnalysis Package, Version 8 for Unix（登録商標）, Genetics ComputerGroup,UniversityResearch Park, 575 ScienceDrive, Madison, WI 53711）。Ｆｅｓｔｆｉｔは２つの配列の間の相同性の最良セグメントを見つけるためにSmithandWaterman, Advances in Applied Mathematics 2: 482 489 (1981)のローカルホモロジーアルゴリズムを使用している。Ｂｅｓｔｆｉｔ及び何れかの他の配列アライメントプログラムを用いることにより本発明に従って特定の配列がレファレンス配列に対して例えば９５％同一であるかどうかを調べる場合、パラメーターは、同一性のパーセンテージがレファレンスヌクレオチド配列の完全長に渡って計算されるように、そしてレファレンス配列におけるヌクレオチドの総数の５％までの相同性におけるギャップが許容されるように設定する。
一部の実施形態においては、本発明の２つの核酸又はポリペプチドは、配列比較アルゴリズムを用いるか、又は目視検査により計測した場合に最大相応が得られるように比較してアラインした場合に、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、そして一部の実施形態においては少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％のヌクレオチド又はアミノ酸残基の同一性を有することを意味するべく、実質的に同一という。同一性は少なくとも約１０、約２０、約４０〜６０残基長の、又はその間の何れかの整数値である配列の領域に渡って存在することができ、そして６０〜８０残基より長い領域、例えば少なくとも約９０〜１００残基に渡ることもでき、そして一部の実施形態においては、配列は例えばヌクレオチド配列のコドン領域のように、比較される配列の完全長に渡って実質的に同一である。
「保存的アミノ酸置換」とは１つのアミノ酸残基が同様の側鎖を有する別のアミノ酸残基で置き換えられているものである。同様の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは当該分野で定義されており、例えば、塩基性側鎖（例えばリジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えばアスパラギン酸、グルタミン酸）、未荷電極性側鎖（例えばグリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えばアラニン、バアリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、ベータ分枝側鎖（例えばスレオニン、バリン、イソロイシン）及び芳香族側鎖（例えばチロシン、ゲニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を包含する。例えば、チロシンに対するフェニルアラニンの置換は保存的置換である。一部の実施形態においては、本発明のポリペプチド及び抗体の配列における保存的置換は、そのアミノ酸配列を含有するポリペプチド又は抗体の、ポリペプチド又は抗体が結合する抗原、即ちＣＤ３７への結合を消失させない。抗原結合を排除しないヌクレオチド及びアミノ酸の保存的置換を識別するための方法は当該分野で良く知られている（例えばBrummell等、Biochem.32:1180-1 187 (1993); Kobayashi等、Protein Eng. 12(10):879-884 (1999)；及びBurks等、Proc.Natl.Acad. Sci. USA 94:.412-417 (1997)を参照）
。
本開示及び請求項において使用する場合、「ある〜」、そして「その〜」という単数標記は、特段の記載が無い限り複数標記も包含するものとする。
「含む」という表現で実施形態を本明細書に記載する場合は常時、「よりなる」及び／又は「より本質的になる」と言う用語において説明する別様の類似の実施形態も提供されるものと理解しなければならない。
本明細書において「Ａ及び／又はＢ」等のフレーズにおいて使用する場合の「及び／又は」という用語は「Ａ及びＢ」、「Ａ又はＢ」、「Ａ」及び「Ｂ」の何れをも包含することを意図している。同様に「Ａ、Ｂ及び／又はＣ」というフレーズにおいて使用する場合の「及び／又は」という用語は、以下の実施形態：Ａ、Ｂ及びＣ；Ａ、Ｂ又はＣ；Ａ又はＣ；Ａ又はＢ；Ｂ又はＣ；Ａ及びＣ」；Ａｏｙｏｂｉ Ｂ；Ｂ及びＣ；Ａ（単独）；Ｂ（単独）；及びＣ（単独）の各々を包含することを意図している。
ＩＩ．ＣＤ３７結合剤
本発明はＣＤ３７に特異的に結合する剤を提供する。これらの剤は本明細書においては、「ＣＤ３７結合剤」と称する。ヒト、マカカ、及びネズミＣＤ３７に関する完全長アミノ酸配列は当該分野で知られており、そしてそれぞれ配列番号１〜３で示されるとおり、本明細書において提供される。
ヒトＣＤ３７：
MSAQESCLSLIKYFLFVFNLFFFVLGSLIFCFGIWILIDKTSFVSFVGLAFVPLQIWSKVLAISGIFTMGIALLGCVGALKELRCLLGLYFGMLLLLFATQITLGILISTQRAQLERSLRDVVEKTIQKYGTNPEETAAEESWDYVQFQLRCCGWHYPQDWFQVLILRGNGSEAHRVPCSCYNLSATNDSTILDKVILPQLSRLGHLARSRHSADICAVPAESHIYREGCAQGLQKWLHNNLISIVGICLGVGLLELGFMTLSIFLCRNLDHVYNRLAYR(SEQIDNO:1)
マカカＣＤ３７：
MSAQESCLSLIKYFLFVFNLFFFVILGSLIFCFGIWILIDKTSFVSFVGLAFVPLQIWSKVLAISGVFTMGLALLGCVGALKELRCLLGLYFGMLLLLFATQITLGILISTQRAQLERSLQDIVEKTIQRYHTNPEETAAEESWDYVQFQLRCCGWHSPQDWFQVLTLRGNGSEAHRVPCSCYNLSATNDSTILDKVILPQLSRLGQLARSRHSTDICAVPANSHIYREGCARSLQKWLHNNLISIVGICLGVGLLELGFMTLSIFLCRNLDHVYNRLRYR(SEQIDNO:2)
ネズミＣＤ３７（ＮＰ＿０３１６７１）
MSAQESCLSLIKYFLFVFNLFFFVLGGLIFCFGTWILIDKTSFVSFVGLSFVPLQTWSKVLAVSGVLTMALALLGCVGALKELRCLLGLYFGMLLLLFATQITLGILISTQRVRLERRVQELVLRTIQSYRTNPDETAAEESWDYAQFQLRCCGWQSPRDWNKAQMLKANESEEPFVPCSCYNSTATNDSTVFDKLFFSQLSRLGPRAKLRQTADICALPAKAHIYREGCAQSLQKWLHNNIISIVGICLGVGLLELGFMTLSIFLCRNLDHVYDRLARYR(SEQIDNO:3)
一部の実施形態においては、ＣＤ３７結合剤は抗体、イムノコンジュゲート又はポリペプチドである。一部の実施形態においては、ＣＤ３７結合剤はヒト 化抗体である。
特定の実施形態においては、ＣＤ３７結合剤は以下の作用、即ち：
腫瘍細胞の増殖の阻害、腫瘍内の癌幹細胞の発生頻度を低減することにより腫瘍の腫瘍形成性の低減、腫瘍生育の阻害、生存率の増大、腫瘍細胞の細胞死のトリガー、腫瘍形成性細胞から非腫瘍形成性状態への分化、又は腫瘍細胞の転移の防止、の１つ以上を有する。
特定の実施形態においては、ＣＤ３７結合剤は補体依存性細胞傷害を誘導することができる。例えば、ＣＤ３７結合剤の細胞への投与は未投与細胞の細胞生存性の約８０％未満、約７０％未満、約６０％未満、約５０％未満、約４０％未満又は約３５％未満まで細胞生存性を低減させるＣＤＣ活性をもたらすことができる。ＣＤ３７結合剤の細胞への投与は又、未投与細胞の細胞生存性の約７０〜８０％、約６０〜７０％、約５０〜６０％、約４０〜５０％、又は約３０〜４０％まで細胞生存性を低減させるＣＤＣ活性をもたらすことができる。一部の特定の実施形態においては、ＣＤ３７結合剤はＲａｍｏｓ細胞において補体依存性細胞傷害を誘発することが可能である。
特定の実施形態においては、ＣＤ３７結合剤は抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を誘導することができる。例えば、ＣＤ３７結合剤の細胞への投与は少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、又は少なくとも約６０％の細胞溶解を生じさせるＡＤＣＣ活性をもたらすことができる。ＣＤ３７結合剤の細胞への投与は約１０〜２０％、約２０〜３０％、約３０〜４０％、又は約４０〜５０％の細胞溶解を生じさせるＡＤＣＣ活性をもたらすことができる。ＣＤ３７結合剤の細胞への投与は又、約１０〜５０％、約２０〜５０％、約３０〜５０％、又は約４０〜５０％の細胞溶解を生じさせるＡＤＣＣ活性をもたらすことができる。一部の特定の実施形態においては、ＣＤ３７結合剤はＤａｕｄｉ、Ｒａｍｏｓ及び／又はＧｒａｎｔａ−５１９細胞においてＡＤＣＣを誘導することができる。
一部の実施形態においては、ＣＤ３７結合剤はアポトーシスを誘導することができる。例えば、ＣＤ３７結合剤の細胞への投与は少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、又は少なくとも約５５％の細胞においてアポトーシスを誘導できる。
一部の実施形態においては、ＣＤ３７結合剤は腫瘍の体積を低減することができる。腫瘍の体積を低減するＣＤ３７結合剤の能力は、例えば、対照対象のメジアン腫瘍体積で投与対象のメジアン腫瘍体積を割った値である％Ｔ／Ｃ値を計測することにより評価できる。一部の実施形態においてはＣＤ３７結合剤の投与は約５５％未満、約５０％未満、約４５％未満、約４０％未満、約３５％未満、約３０％未満、約２５％未満、約２０％未満、約１５％未満、約１０％未満又は約５％未満である％Ｔ／Ｃ値をもたらす。一部の特定の実施形態においては、ＣＤ３７結合剤はＢＪＡＢ異種移植片モデル及び／又はＳＵ−ＤＨＬ−４異種移植片モデルにおいて腫瘍の大きさを低減することができる。
特定の実施形態においては、非とＣＤ３７に特異的に結合するイムノコンジュゲート又は他の剤は細胞傷害剤を介して細胞死をトリガーする。例えば、特定の実施形態においては、ヒトＣＤ３７抗体に対する抗体は、蛋白内在化によりＣＤ３７を発現している腫瘍細胞において活性化されるマイタンシノイドにコンジュゲートされる。特定の代替の実施形態においては、剤又は抗体はコンジュゲートされない。
特定の実施形態においては、ＣＤ３７結合剤は腫瘍生育を阻害することができる。特定の実施形態においては、ＣＤ３７結合剤はインビボで（例えば異種移植片マウスモデル及び／又は癌を有するヒトにおいて）腫瘍生育を阻害することができる。
ＣＤ３７結合剤はＣＤ３７抗体であるＣＤ３７−３、ＣＤ３７−１２、ＣＤ３７−３８、ＣＤ３７−５０、ＣＤ３７−５１、ＣＤ３７−５６及びＣＤ３７−５７及びそのフラグメント、変異体及び誘導体を包含する。ＣＤ３７結合剤は又ＣＤ３７−３、ＣＤ３７−１２、ＣＤ３７−３８、ＣＤ３７−５０、ＣＤ３７−５１、ＣＤ３７−５６及びＣＤ３７−５７よりなる群から選択される抗体と同じＣＤ３７エピトープに特異的に結合するＣＤ３７結合剤を包含する。ＣＤ３７結合剤は又ＣＤ３７−３、ＣＤ３７−１２、ＣＤ３７−３８、ＣＤ３７−５０、ＣＤ３７−５１、ＣＤ３７−５６及びＣＤ３７−５７よりなる群から選択される抗体を競合的に阻害するＣＤ３７結合剤を包含する。
一部の特定の実施形態においてはＣＤ３７へのＣＤ３７結合剤の結合はヒトＣＤ３７アミノ酸１０９〜１３８を必要としない。即ち、ＣＤ３７結合剤は配列番号１８０のアミノ酸配列を含むポリペプチドに結合する。他の実施形態において、ＣＤ３７へのＣＤ３７結合剤の結合はヒトＣＤ３７アミノ酸２０２〜２４３の突然変異により途絶される。即ち、一部のＣＤ３７結合剤は配列番号１８４のアミノ酸配列を含むポリペプチドに結合しない。
一部の実施形態においては、ＣＤ３７結合剤は配列番号１８０のポリペプチド及び配列番号１８３のポリペプチドには結合するが、配列番号１８４のポリペプチドには結合しない。
一部の実施形態においては、ＣＤ３７結合剤は配列番号１９０のポリペプチドに結合する。一部の実施形態においては、ＣＤ３７結合剤は配列番号１９０のポリペプチド及び配列番号１８９のポリペプチドに結合する。一部の実施形態においては、ＣＤ３７結合剤は配列番号１９０のポリペプチド及び配列番号１８８のポリペプチドに結合する。
一部の実施形態においては、ＣＤ３７結合剤は配列番号１９２のポリペプチドに結合するが、配列番号１９４のポリペプチドには結合しない。一部の実施形態においては、ＣＤ３７結合剤は配列番号１９３のポリペプチドに結合するが、配列番号１９４のポリペプチドには結合しない。
特定のＣＤ３７結合剤が結合するＣＤ３７ペプチドフラグメントは、配列番号１のアミノ酸２００〜２４３、配列番号１のアミノ酸２０２〜２２０、又は配列番号１のアミノ酸２２１〜２４３を含むか、本質的にこれよりなるか、これよりなるＣＤ３７フラグメントを包含するがこれらに限定されない。一部の実施形態においては、ＣＤ３７結合剤は配列番号１のアミノ酸２０２〜２４３を含むヒトＣＤ３７エピトープに特異的に結合する。一部の実施形態においては、ＣＤ３７へのＣＤ３７結合剤の結合は配列番号１のアミノ酸２０２〜２４３を必要とする。一部の実施形態においては、ＣＤ３７へのＣＤ３７結合剤の結合は配列番号１のアミノ酸２００〜２２０を必要とする。一部の実施形態においては、ＣＤ３７へのＣＤ３７結合剤の結合は配列番号１のアミノ酸２２１〜２４３を必要とする。
ＣＤ３７結合剤は又、ＣＤ３７−３、ＣＤ３７−１２、ＣＤ３７−３８、ＣＤ３７−５０、ＣＤ３７−５１、ＣＤ３７−５６又はＣＤ３７−５７の重鎖及び軽鎖ＣＤＲ配列を含むＣＤ３７結合剤を包含する。ＣＤ３７−３８、ＣＤ３７−５０、ＣＤ３７−５１、ＣＤ３７−５６及びＣＤ３７−５７の重鎖及び軽鎖ＣＤＲは関連する配列を含有する。従ってＣＤ３７結合剤は又、ＣＤ３７−３８、ＣＤ３７−５０、ＣＤ３７−５１、ＣＤ３７−５６及びＣＤ３７−５７のアライメントにより得られるコンセンサス配列を含む重鎖及び軽鎖のＣＤＲ配列も含むことができる。ＣＤ３７−３、ＣＤ３７−１２、ＣＤ３７−３８、ＣＤ３７−５０、ＣＤ３７−５１、ＣＤ３７−５６及びＣＤ３７−５７のＣＤＲ配列並びにＣＤ３７−３８、ＣＤ３７−５０、ＣＤ３７−５１、ＣＤ３７−５６及びＣＤ３７−５７のコンセンサス配列を以下の表１及び２に示す。
ＣＤ３７結合分子はＣＤＲ当たり４つまで（即ち０、１、２、３又は４つ）の保存的アミノ酸置換を有するＣＤ３７−３、ＣＤ３７−１２、ＣＤ３７−５０、ＣＤ３７−５１、ＣＤ３７−５６又はＣＤ３７−５７を含むＣＤ３７に特異的に結合する抗体又は抗原結合フラグメントであることができる。
ポリペプチドは本明細書に記載する個々の可変軽鎖又は可変重鎖の１つを含むことができる。抗体及びポリペプチドは又、可変軽鎖及び可変重鎖の両方を含むこともできる。ネズミ、キメラ、及びヒト化ＣＤ３７−３、ＣＤ３７−１２、ＣＤ３７−５０、ＣＤ３７−５１、ＣＤ３７−５６又はＣＤ３７−５７抗体の可変軽鎖及び可変重鎖を以下の表３及び４に示す。
同様に提供されるものは（ａ）配列番号５５〜７１と少なくとも約９０％の配列同一性を有するポリペプチド；及び／又は（ｂ）配列番号７２〜８７と少なくとも約９０％の配列同一性を有するポリペプチドを含むポリペプチドである。特定の実施形態においては、ポリペプチドは配列番号５５〜７１と少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％又は少なくとも約９９％の配列同一性を有するポリペプチドを含む。即ち、特定の実施形態においては、ポリペプチドは（ａ）配列番号５５〜７１と少なくとも約９５％の配列同一性を有するポリペプチド；及び／又は（ｂ）配列番号７２〜８７と少なくとも約９５％の配列同一性を有するポリペプチドを含む。特定の実施形態においてはポリペプチドは（ａ）配列番号５５〜７１のアミノ酸配列を有するポリペプチド；及び／又は（ｂ）配列番号７２〜８７のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。特定の実施形態においては、ポリペプチドは抗体であり、及び／又は、ポリペプチドはＣＤ３７に特異的に結合する。特定の実施形態においては、ポリペプチドはＣＤ３７に特異的に結合するネズミ、キメラ、又はヒト化抗体である。特定の実施形態においては、配列番号５５〜８７と配列同一性の特定のパーセンテージを有するポリペプチドは、保存的アミノ酸置換のみにより、配列番号５５〜８７と異なっている。
ポリペプチドは本明細書に記載する個々の軽鎖又は重鎖の１つを含むことができる。抗体及びポリペプチドは軽鎖及び重鎖の両方を含むこともできる。ネズミ、キメラ及びヒト化ＣＤ３７−３、ＣＤ３７−１２、ＣＤ３７−５０、ＣＤ３７−５１、ＣＤ３７−５６及びＣＤ３７−５７抗体の軽鎖及び可変鎖の配列を以下の表５及び６に示す。
同様に提供されるものは（ａ）配列番号８８〜１０４と少なくとも約９０％の配列同一性を有するポリペプチド；及び／又は（ｂ）配列番号１０５〜１２０と少なくとも約９０％の配列同一性を有するポリペプチドを含むポリペプチドである。特定の実施形態においては、ポリペプチドは配列番号８８〜１０４と少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％又は少なくとも約９９％の配列同一性を有するポリペプチドを含む。即ち、特定の実施形態においては、ポリペプチドは（ａ）配列番号８８〜１０４と少なくとも約９５％の配列同一性を有するポリペプチド；及び／又は（ｂ）配列番号１０５〜１２０と少なくとも約９５％の配列同一性を有するポリペプチドを含む。特定の実施形態においてはポリペプチドは（ａ）配列番号８８〜１０４のアミノ酸配列を有するポリペプチド；及び／又は（ｂ）配列番号１０５〜１２０のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。特定の実施形態においては、ポリペプチドは抗体であり、及び／又は、ポリペプチドはＣＤ３７に特異的に結合する。特定の実施形態においては、ポリペプチドはＣＤ３７に特異的に結合するネズミ、キメラ、又はヒト化抗体である。特定の実施形態においては、配列番号８８〜１２０と配列同一性の特定のパーセンテージを有するポリペプチドは、保存的アミノ酸置換のみにより、配列番号８８〜１２０と異なっている。
特定の実施形態においては、ＣＤ３７抗体は
２０１０年２月１８日にＡＴＣＣに寄託されたＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１０６６４、２０１０年２月１８日にＡＴＣＣに寄託されたＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１０６６５、２０１０年２月１８日にＡＴＣＣに寄託されたＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１０６６６、２０１０年２月１８日にＡＴＣＣに寄託されたＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１０６６７、２０１０年２月１８日にＡＴＣＣに寄託されたＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１０６６８、２０１０年２月１８日にＡＴＣＣに寄託されたＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１０６６９、及び、２０１０年２月１８日にＡＴＣＣに寄託されたＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１０６７０よりなる群から選択されるハイブリドーマにより生産される抗体であることができる（ATCC、10801UniversityBoulevard, Manassas, Virginia 20110)）。特定の実施形態においては、抗体はＰＴＡ−１０６６５、ＰＴＡ−１０６６６、ＰＴＡ−１０６６７、ＰＴＡ−１０６６８、ＰＴＡ−１０６６９及びＰＴＡ−１０６７９よりなる群から選択されるハイブリドーマから生産された抗体のＶＨ−ＣＤＲ及びＶＬ−ＣＤＲを含む。
特定の実施形態においては、ＣＤ３７抗体は組み換えプラスミドＤＮＡｐｈｕＣＤ３７−３ＬＣ（２０１０年３月１８日にＡＴＣＣに寄託されたＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１０７２２）によりコードされる軽鎖を含むことができる。特定の実施形態においては、ＣＤ３７抗体は組み換えプラスミドＤＮＡｐｈｕＣＤ３７−３ＨＣｖ．１．０．（２０１０年３月１８日にＡＴＣＣに寄託されたＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１０７２３）によりコードされる重鎖を含むことができる。特定の実施形態においては、ＣＤ３７抗体は組み換えプラスミドＤＮＡｐｈｕＣＤ３７−３ＬＣ（ＰＴＡ−１０７２２）によりコードされる軽鎖及び組み換えプラスミドＤＮＡｐｈｕＣＤ３７−３ＨＣｖ．１．０．（ＰＴＡ−１０７２３）によりコードされる重鎖を含むことができる。特定の実施形態においては、ＣＤ３７抗体は組み換えプラスミドＤＮＡｐｈｕＣＤ３７−３ＬＣ（ＰＴＡ−１０７２２）によりコードされるＶＬ−ＣＤＲ及び組み換えプラスミドＤＮＡｐｈｕＣＤ３７−３ＨＣｖ．１．０．（ＰＴＡ−１０７２３）によりコードされるＶＨ−ＣＤＲを含むことができる。
モノクローナル抗体はハイブリドーマ法、例えばKohler and Milstein (1975) Nature 256:495に記載のものを用いながら調製できる。ハイブリドーマ法を用いながら、マウス、ハムスター又は他の適切な宿主動物を上記した通り免疫化することにより免疫化抗原に特異的に結合するすることになる抗体のリンパ球による生産を誘発する。リンパ球はインビトロで免疫化することもできる。免疫化の後、リンパ球を単離し、そして例えばポリエチレングリコールを用いながら適当なミエローマ細胞系統と融合することによりハイブリドーマを形成し、これを次に未融合のリンパ球及びミエローマ細胞から選別する。免疫沈降、イムノブロッティングによるか、又はインビトロの結合試験（例えばラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）；酵素結合免疫吸着試験（ＥＬＩＳＡ））により決定される選択された抗原に対して特異的に指向されたモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマは、その後、インビトロの培養で標準的な方法を用いながら（Goding,MonoclonalAntibodies:Principles and Practice, Academic Press, 1986）又はインビボで動物中の腹水腫瘍として増殖され得る。次にモノクローナル抗体は、上記においてポリクローナル抗体に関して説明したとおり、培地又は腹水から精製されえる。
或いは、モノクローナル抗体は又、米国特許４，８１６，５６７に記載の通り組み換えＤＮＡ法を用いて作成することもできる。モノクローナル抗体をコードするポリヌクレオチドを、抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子を特異的に増幅するオリゴヌクレオチドプライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲ等により成熟Ｂ細胞又はハイブリドーマから単離し、そしてその配列を従来の操作法を用いながら決定する。次に重鎖及び軽鎖をコードする単離されたポリヌクレオチドを適当な発現ベクター内にクローニングし、そしてこれが、別様には免疫グロブリン蛋白を生産しないＥ・コリ細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、又はミエローマ細胞のような宿主細胞内にトランスフェクトされた場合に、モノクローナル抗体が宿主細胞により形成される。更に又、所望の種の組み換えモノクローナル抗体又はそのフラグメントは記載された所望の種のＣＤＲを発現するファージディスプレイライブラリから単離で切る（McCafferty等、1990,Nature,348:552-554; Clackson等、1991, Nature,352:624-628；及びMarks等、1991, J.Mol.Biol.,222:581-597）。
モノクローナル抗体をコードするポリヌクレオチドは更に、組み換えＤＮＡ技術を用いながら多くの種々異なる態様において修飾することにより代替の抗体を形成することができる。一部の実施形態においては、例えばマウスモノクローナル抗体の軽鎖及び重鎖の定常ドメインを、１）キメラ抗体を形成するために例えばヒト抗体のこれらの領域に対して、又は２）融合抗体を形成するために非免疫グロブリンポリペプチドに対して、置換することができる。一部の実施形態においては、定常領域をトランケーションするか除去することにより、モノクローナル抗体の所望の抗体フラグメントを形成する。可変領域の部位指向性又は高密度の突然変異誘発を用いることによりモノクローナル抗体の特異性、親和性等を最適化することができる。
一部の実施形態においては、ヒトＣＤ３７ン意対するモノクローナル抗体はヒト化抗体である。特定の実施形態においては、そのような抗体を治療上使用することにより、ヒト対象への投与時の抗原性及びＨＡＭＡ（ヒト抗マウス抗体）応答を低減する。ヒト化抗体は当該分野で知られている種々の手法を用いながら生産することができる。特定の代替実施形態においては、ＣＤ３７に対する抗体はヒト抗体である。
ヒト抗体は当該分野で知られている種々の手法を用いながら直接調製することができる。インビトロで免疫化された、又は標的抗原に対して指向された抗体を生産する免疫化個体から単離された不朽化ヒトＢリンパ球を形成できる（例えばCole等、MonoclonalAntibodiesand Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77(1985); Boemer等、1991, J.Immunol., 147(1):86-95;及び米国特許５，７５０，３７３参照）。更に又、ヒト抗体は例えばVaughan等、1996,Nat.Biotech.,14:309-314, Sheets等、1998, Proc. Nat’l. Acad. Sci.,95:6157-6162,Hoogenboom andWinter, 1991, J. Mol. Biol., 227:381, and Marks等、1991,J. Mol.Biol., 222:581に記載のように、ファージライブラリがヒト抗体を発現するそのファージライブラリから選択できる。抗体ファージライブラリの形成及び使用のための手法は又、米国特許５，９６９，１０８，６，１７２，１９７，５，８８５，７９３，６，５２１，４０４；６，５４４，７３１；６，５５５，３１３；６，５８２，９１５；６，５９３，０８１；６，３００，０６４；６，６５３，０６８；６，７０６，４８４；及び７，２６４，９６３;及びRothe等、2007,J.Mol. Bio., doi:10.1016/j.jmb.2007.12.018にも記載されている（これらの各々は参照により全体が本明細書に組み込まれる）。アフィニティー成熟法及び鎖シャフリング法（Marks等、1992,Bio/Technology10:779-783；参照により全体が本明細書に組み込まれる）が当該分野で知られ手織り、そして高親和性のヒト抗体を形成するために使用できる。
ヒト化抗体は又、内因性免疫グロブリン生産の非存在下でヒト抗体の完全レパートリーを生産することが免疫化により可能であるヒト免疫グロブリン遺伝子座を含有するトランスジェニックマウスにおいて作成することができる。このアプローチは米国特許５，５４５，８０７；５，５４５，８０６；５，５６９，８２５；５，６２５，１２６；５，６３３，４２５；及び５，６６１，０１６に記載されている。
本発明は又ＣＤ３７を特異的に認識する二重特異性抗体も包含する。二重特異性抗体は少なくとも２つの異なるエピトープを特異的に認識して結合することができる抗体である。異なるエピトープは同じ分子（例えば同じＣＤ３７）内、又は、例えば抗体がＣＤ３７、並びに１）Ｔ細胞受容体（例えばＣＤ３）又はＦｃ受容体（例えばＣＤ６４、ＣＤ３２又はＣＤ１６）のような白血球上のエフェクター分子、又は２）後に詳述する細胞傷害剤を特異的に認識して結合する両方の場合のように、異なる分子上にあることができる。
例示される二重特異性抗体は２つの異なるエピトープに結合することができ、その少なくとも１つは本発明のポリペプチド中で生じる。或いは、免疫グロブリン分子の抗抗原性アームは、Ｔ細胞受容体分子（例えばＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ２８又はＢ７）又はＩｇＧに対するＦｃ受容体のような白血球上のトリガリング分子に結合するアームと組み合わせることにより特定の抗原を発現する細胞に細胞防御機序を集中させることができる。二重特異性抗体は又特定の抗原を発現する細胞に細胞傷害剤を指向させるために使用できる。これらの抗体は抗原結合アーム及び細胞傷害剤又はＥＯＴＵＢＥ、ＤＰＴＡ、ＤＯＴＡ又はＴＥＴＡのような放射性各種キレート形成剤に結合するアームを保有している。二重特異性抗体を作成するための手法は当該分野で一般的である（Millstein等、1983,Nature305:537-539; Brennan等、1985, Science 229:81;Suresh et al, 1986, MethodsinEnzymol.121:120; Traunecker等、1991, EMBO J.10:3655-3659; Shalaby等、1992, J.Exp.Med. 175:217-225; Kostelny等、1992, J.Immunol. 148:1547-1553; Gruber等、1994,J.Immunol. 152:5368;及び米国特許５，７３１，１６８）。２価より高価の抗体もまた意図される。例えば３重特異性抗体を調製できる（Tutt等、J.Immunol.147:60(1991)）。即ち、特定の実施形態においては、ＣＤ３７に対する抗体は多重特異性である。
特定の実施形態においては、例えば腫瘍貫通性を増大させるための抗体フラグメントが提供される。抗体フラグメントの生産のための種々の手法が知られている。伝統的にはこれらのフラグメントは未損傷の抗体の蛋白分解性の消化を介して誘導される（例えばMorimoto等、1993,Journalof Biochemical and Biophysical Methods24:107-117; Brennan等、1985,Science, 229:81）。特定の実施形態においては、抗体フラグメントは組み換えにより生産される。Ｆａｂ、Ｆｖ及びｓｃＦｖ抗体フラグメントは全てＥ・コリ又は他の宿主細胞中で発現され、これらより分泌されることができ、これによりこれらのフラグメントの大量の生産が可能となる。そのような抗体フラグメントは上記考察した抗体ファージライブラリから単離することもできる。抗体フラグメントは又例えば米国特許５，６４１，８７０に記載の通り線状抗体であることもでき、そして単一特異性又は二重特異性であることができる。抗体フラグメントの生産のための他の手法は当業者の知る通りである。
本発明によればＣＤ３７に特異的な単鎖抗体の生産のために手法を適合させることができる（米国特許４，９４６，７７８参照）。更に又、方法をＦａｂ発現ライブラリの構築（Huse,等、Science246:1275-1281(1989)）のために適合させることによりＣＤ３７に対して所望の特異性を有するモノクローナルＦａｂフラグメント、その誘導体、フラグメント、類縁体又は相同体の迅速で効果的な識別が可能となる。抗体フラグメントは当該分野の手法により生産でき、例えば限定しないが（ａ）抗体分子のペプシン消化により生産されるＦ（ａｂ’）２フラグメント；（ｂ）Ｆ（ａｂ’）２フラグメントのジスルフィド架橋を還元することにより形成されるＦａｂフラグメント、（ｃ）パパイン及び還元剤による抗体分子の処理により形成されるＦａｂフラグメント、及び（ｄ）Ｆｖフラグメントが包含されるがこれらに限定されない。
特に抗体フラグメントの場合は、その血清中半減期を増大させるために抗体を修飾することが更に望ましい場合がある。これは例えば抗体フラグメントにおける適切な領域の突然変異による抗体フラグメント内へのサルベージ受容体結合エピトープの取り込みにより、又は、エピトープをペプチドタグ内に取り込み、次にこれを末端又は中央の何れかにおいて抗体フラグメントに融合させること（例えばＤＮＡ又はペプチド合成による）により達成できる。
ヘテロコンジュゲート抗体も又、本発明の範囲に包含される。ヘテロコンジュゲート抗体は２つの共有結合的に連結された抗体より成る。そのような抗体は例えば望ましくない細胞に免疫細胞をターゲティングするために提案されている（米国特許４，６７６，９８０）。合成蛋白化学における知られた方法、例えば架橋剤を使用するものを用いながらインビトロで抗体を調整することが可能であることも意図している。例えば、ジスルフィド交換反応を用いて、又はチオエーテル結合を形成することにより、免疫毒素を構築することができる。この目的のための適当な試薬の例は、イミノチオレート及びメチル−４−メルカプトブチルイミデートを包含する。
本発明の目的のためには、修飾された抗体はヒトＣＤ３７のポリペプチドとの抗体の会合をもたらす可変領域の何れかの型を含むことができることは当然である。この点に関し、可変領域は、体液性応答を生じさせ、そして所望の腫瘍会合抗原に対する免疫グロブリンを発生させるように誘導することができる哺乳類の何れかの型を含むか、これから誘導することができる。即ち、修飾された抗体の可変領域は例えば、ヒト、ネズミ、非ヒト霊長類（例えばカニクイザル、マカク等）又はオオカミ起源のものであることができる。一部の実施形態においては、修飾された免疫グロブリンの可変領域及び定常領域の両方がヒトのものである。他の実施形態において、適合性抗体（通常は非ヒト原料から誘導）の可変領域を、操作又は特別調整することにより結合特性を向上させるか、又は分子の免疫原性を低減することができる。この点に関し、本発明において有用な可変領域はヒト化されるか、又は別様にインポートされたアミノ酸配列の包含を介して改変することができる。
特定の実施形態においては、重鎖及び軽鎖の両方における可変ドメインはＣＤＲ１つ以上の少なくとも部分的な置き換えにより、そして必要に応じて部分的なフレームワーク領域の置き換え及び配列変化により、改変される。ＣＤＲはフレームワーク領域の誘導元の抗体と同じクラス、更にはサブクラスの抗体から誘導できるが、異なるクラスの抗体から、そして恐らくは異なる種に由来する抗体から、ＣＤＲを誘導することも意図される。ある可変ドメインの抗原結合能力を別のものに転移させるためにドナーの可変領域由来の完全なＣＤＲでＣＤＲの全てを置き換えることが常時必要なわけではない。寧ろ、一部の場合においては、抗原結合部位の活性を維持するために必要な残基を転移させる必要があるのみである。米国特許５，５８５，０８９、５，６９３，７６１及び５，６９３，７６２に記載されている説明によれば、これは、定型的な実験を実施することによるか、又は、低減された免疫原性を有する機能的抗体を得るための試行錯誤の試験を行うことにより、当業者の能力の範囲内で十分行える。
可変領域の改変にも関わらず、当業者の知る通り、本発明の修飾された抗体は、ネイティブ又は未改変の定常領域を含むほぼ同じ免疫原性の抗体と比較した場合に増強された腫瘍局在化又は低減された血清中半減期のような所望の生化学的特性を提供できるように、定常領域ドメインの１つ以上の少なくとも部分が欠失又は別様に改変されている抗体（例えば完全長抗体又はその免疫反応性フラグメント）を含むことになる。一部の実施形態においては、修飾された抗体の定常領域はヒト定常領域を含むことになる。本発明と適合する定常領域への修飾は、１つ以上のドメインにおける１つ以上アミノ酸の付加、欠失又は置換を含む。即ち、本明細書に開示された修飾された抗体は３つの重鎖定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２又はＣＨ３）の１つ以上に対する、及び／又は軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）に対する改変又は修飾を含むことができる。一部の実施形態においては、１つ以上のドメインが部分的又は全体的に欠失している修飾された定常領域が意図される。一部の実施形態においては、修飾された抗体は全ＣＨ２ドメインが除去されているドメイン欠失のコンストラクト又は変異体を含むことになる（ΔＣＨ２コンストラクト）。一部の実施形態においては、省かれた定常領域ドメインは、非存在定常領域により典型的には付与される分子柔軟性の一部を与える短いアミノ酸スペーサー（例えば１０残基）により置き換えられることになる。
それらの配置の他に、定常領域は数種のエフェクター機能を媒介することも当該分野で知られている。例えば抗体への補体のＣ１成分の結合は補体系を活性化させる。補体の活性化は細胞病原体のオプソニン作用及び溶解において重要である。補体の活性化は又、炎症応答を刺激し、そして自己免疫過敏症に関与する場合もある。更に又、抗体はＦｃ領域を介して細胞に結合し、その際、細胞上のＦｃ受容体（ＦｃＲ）に結合する抗体Ｆｃ領域上にＦｃ受容体部位がある。ＩｇＧ（ガンマ受容体）、ＩｇＥ（イータ受容体）、ＩｇＡ（アルファ受容体）及びＩｇＭ（ミュウ受容体）を包含する抗体の種々異なるクラスに対して特異的な多くのＦｃ受容体が存在する。細胞表面上のＦｃ受容体への抗体の結合は多くの重要で多様な生物学的応答、例えば抗体被覆粒子の囲い込みと破壊、免疫複合体のクリアランス、抗体被覆標的細胞のキラー細胞による溶解（抗体依存性細胞媒介性細胞傷害、即ちＡＤＣＣと称される）、炎症メディエーターの放出、胎盤転移及び免疫グロブリン生産の制御をトリガーする。
特定の実施形態においては、ＣＤ３７結合抗体は改変されたエフェクター機能をもたらし、次にこれが投与された抗体の生物学的プロファイルに影響する。例えば定常領域ドメインの欠失又は不活性化（点突然変異又は他の手段を介する）は循環中の修飾された抗体のＦｃ受容体結合を低減し、これにより腫瘍の局在化を増強することができる。他の例においては、本発明と矛盾しない定常領域の修飾は補体結合を緩和し、そしてこれにより血清中半減期及びコンジュゲートした細胞毒の非特異的会合を低減する。定常領域の更に別の修飾は、増大した抗原特異性又は抗体柔軟性に起因する増強された局在化をもたらすジスルフィド連結部又はオリゴ糖部分を排除するために使用できる。同様に、本発明に従った定常領域の修飾は、当業者の知見の範囲内に十分含まれる良く知られた生化学的又は分子操作の手法を用いながら容易に作成できる。
特定の実施形態においては、抗体であるＣＤ３７結合剤は１つ以上のエフェクター機能を有さない。例えば、一部の実施形態においては、抗体は抗体依存性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性を有さず、及び／又は、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）活性を有さない。特定の実施形態においては、抗体はＦｃ受容体及び／又は補体因子に結合しない。特定の実施形態においては、抗体はエフェクター機能を有さない。
特定の実施形態においては、修飾された抗体は、それぞれの修飾された抗体のヒンジ領域に直接ＣＨ３ドメインを融合するように操作されることができることになる。別のコンストラクトにおいては、ヒンジ領域及び修飾されたＣＨ２及び／又はＣＨ３ドメインの間にペプチドスペーサーを与えることが望ましい場合がある。例えば、適合性のあるコンストラクトはＣＨ２ドメインが欠失しており、そして残りのＣＨ３ドメイン（修飾又は未修飾）が５〜２０アミノ酸スペーサーでヒンジ領域に連結されているように発現させることができる。そのようなスペーサーは例えば定常ドメインの調節エレメントが使用可能な状態のままであること、又は、ヒンジ領域が柔軟性を維持していることを確保するために、付加させることができる。しかしながら、アミノ酸スペーサーは一部の場合においては免疫原性であることがわかっており、そしてコンストラクトに対する望ましくない免疫応答を誘発することに留意しなければならない。したがって、特定の実施形態においては、コンストラクトに付加された何れのスペーサーも、修飾された抗体の所望の生化学的品質を維持するために比較的非免疫原性となるか、又は全体が省略されることになる。
全定常領域ドメインの欠失のほかに、当然ながら、本発明の抗体は数個、更には単一のアミノ酸の部分的欠失又は置換により与えられる場合もある。例えば、ＣＨ２ドメインの選択された区域内の単一のアミノ酸の突然変異がＦｃ結合を実質的に低減し、そしてこれにより腫瘍局在化を増強するために十分であることができる。同様に修飾すべきエフェクター機能（例えば補体ＣＬＱ結合）を制御する定常領域ドメイン１つ以上の部分を単に欠失させることが望ましい場合がある。そのような定常領域の部分的欠失は抗体の選択された特性（血清中半減期）を向上させつつ、対象の定常領域ドメインに関連する他の所望の機能は未損傷のままとすることができる。更に又、前述の通り、開示された抗体の定常領域は結果として生じるコンストラクトのプロファイルを増強させる突然変異又はアミノ酸１つ以上の置換を介して修飾できる。この点に関し、保存された結合部位により与えられる活性（例えばＦｃ結合）を途絶しつつ、修飾された抗体の配置及び免疫原性プロファイルを実質的に維持することが可能となる。特定の実施形態は、エフェクター機能の低下又は上昇のような所望の特性を増強するか、又はより多くの細胞毒又は炭水化物の結合を可能とするために、定常領域へのアミノ酸１つ以上の付加を含むことができる。そのような実施形態において、選択された定常領域ドメインから誘導される特定の配列を挿入又は複製することが望ましい場合がある。
本発明は更に本明細書に記載したキメラ、ヒト化及びヒトの抗体又はその抗体フラグメントに実質的に相同である変異体及び等価物を包含する。これらは例えば、保存的置換突然変異、即ち、アミノ酸１つ以上の同様のアミノ酸による置換を含むことができる。例えば保存的置換はあるアミノ酸の同じ一般的クラス内の別のものによる、例えばある酸性アミノ酸の別の酸性アミノ酸による、ある塩基性アミノ酸の別の塩基性アミノ酸による、又は、ある中性アミノ酸の別の中性アミノ酸による置換を指す。保存的アミノ酸置換が意図するものは当該分野で良く知られている。
本発明のポリペプチドはヒトＣＤ３７に対する抗体又はそのフラグメントを含む組み換えポリペプチド、天然ポリペプチド、又は合成のポリペプチドであることができる。当該分野で知られるとおり、本発明の一部のアミノ酸配列は蛋白の構造又は機能に大きく影響することなく変動させることができる。即ち、本発明は更にＣＤ３７蛋白に対する抗体又はそのフラグメントの実質的な活性を示すか、又はその領域を含む、ポリペプチドの変形例も包含する。そのような突然変異体は欠失、挿入、反転、反復及び型置換を包含する。
ポリペプチド及び類縁体は更に、通常では蛋白の部分ではない追加的な化学部分を含有するように修飾できる。これらの誘導体化された部分は蛋白の溶解性、生物学的半減期、又は吸収を向上させることができる。部分は又、蛋白の何らかの望ましくない副作用等を低減又は排除することもできる。これらの部分の概説はREMINGTON'SPHARMACEUTICALSCIENCES, 20th ed., Mack Publishing Co.,Easton, PA (2000)に記載されている。
本明細書に記載する単離されたポリペプチドは当該分野で知られている何れかの適当な方法により生産できる。そのような方法は直接の蛋白合成の方法から、単離されたポリペプチド配列をコードし、これらの配列を適当な形質転換宿主中で発現するＤＮＡ配列を構築することまで様々である。一部の実施形態においてはＤＮＡ配列は目的の野生型蛋白をコードするＤＮＡ配列を単離又は合成することにより組み換え技術を用いながら構築される。場合により、配列を部位特異的突然変異誘発により突然変異誘発することによりその機能的類縁体を得ることができる。例えばZoeller等、Proc.Nat’l.Acad. Sci. USA 81:5662-5066 (1984) 及び米国特許４，５８８，５８５を参照できる。
一部の実施形態においては目的のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列はオリゴヌクレオチド合成器を用いた化学合成により構築される。そのようなオリゴヌクレオチドは、所望のポリペプチドのアミノ酸配列に基づいて、そして目的の組み換えポリペプチドが生産されることになる宿主細胞にとって好都合なコドンを選択しながら、設計することができる。標準的な方法は目的の単離されたポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド配列を合成するために適用できる。例えば完全なアミノ酸配列を用いて戻し翻訳された遺伝子を構築できる。更に又、特定の単離されたポリペプチドに関してコードしているヌクレオチド配列を含有するＤＮＡオリゴマーを合成できる。例えば、所望のポリペプチドの部分に関してコードしている数種の小型のオリゴヌクレオチドを合成し、次にライゲーションすることができる。個々のオリゴヌクレオチドは典型的には相補的組み立てのための５’又は３’オーバーハングを含有する。
組み立て（合成、部位指向性突然変異誘発又は他の方法による）の後、目的の特定の単離されたポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を発現ベクター内に挿入し、そして所望の宿主中での蛋白の発現のために適切である発現制御配列に作動可能に連結することになる。適当な組み立ては、ヌクレオチド配列決定、制限マッピング、及び適当な宿主における生物学的に活性なポリペプチドの発現により確認できる。当該分野で良く知られている通り、宿主中でのトランスフェクトされた遺伝子の高い発現レベルを得るためには、遺伝子は選択された発現宿主中で機能的である転写及び翻訳発現制御配列に作動可能に連結していなければならない。
特定の実施形態においては、組み換え発現ベクターはヒトＣＤ３７に対する抗体又はそのフラグメントをコードするＤＮＡを増幅して発現させるために使用される。組み換え発現ベクターは哺乳類、微生物、ウィルス又は昆虫の遺伝子から誘導された適当な転写又は翻訳調節エレメントに作動可能に連結した抗ＣＤ３７抗体又はそのフラグメントのポリペプチド鎖をコードする合成又はｃＤＮＡ誘導のＤＮＡフラグメントを有する複製可能なＤＮＡコンストラクトである。転写ユニットは一般的に、（１）遺伝子エレメント又は遺伝子発現において調節的役割を有するエレメント、例えば転写プロモーター又はエンハンサー、（２）ｍＲＮＡに転写され、そして蛋白に翻訳される構造又はコーディング配列、及び（３）以下に詳述する適切な転写及び翻訳の開始および終止配列の組み立て物を含む。そのような調節エレメントは転写を制御するためのオペレーター配列を包含できる。複製起点により通常は付与される宿主において複製するための能力、及び形質転換体の認識を容易にする選択遺伝子もまた組み込まれる。ＤＮＡ領域はそれらが相互に機能的に関連している場合に作動可能に連結されている。例えばシグナルペプチド（分泌リーダー）に関するＤＮＡはそれがポリペプチドの分泌に参画する前駆体としてそれが発現される場合はポリペプチドに関するＤＮＡに作動可能に連結しており；プロモーターはそれが配列の転写を制御する場合はコーディング配列に作動可能に連結しており；或いは、リボソーム結合部位はそれが翻訳を可能とするように位置づけられていればコーディング配列に作動可能に連結している。コウボ発現系において使用するために意図された構造エレメントは宿主細胞による翻訳蛋白の細胞外分泌を可能にするリーダー配列を包含する。或いは、リーダー又はトランスポート配列の非存在下で組み換え蛋白が発現される場合、それはＮ末端メチオニン残基を包含できる。この残基は場合により後に、発現された組み換え蛋白から切断されて、最終産物を与える。
発現制御配列及び発現ベクターの選択は宿主の選択に依存することになる。広範な種類の発現宿主／ベクターの組み合わせを使用できる。真核生物宿主のための有用な発現ベクターは、例えばＳＶ４０、ウシパピローマウィルス、アデノウィルス及びサイトメガロウィルスに由来する発現制御配列を含むベクターを包含する。細菌宿主のための有用な発現ベクターは、知られた細菌プラスミド、例えばエシェリシア・コリ由来のプラスミド、例えばｐＣＲ１、ｐＢＲ３２２、ｐＭＢ９及びそれらの誘導体、広範宿主範囲のプラスミド、例えばＭ１３及びフィラメント様１本鎖ＤＮＡファージを包含する
ＣＤ３７結合ポリペプチド又は抗体（又は抗原として使用するためのＣＤ３７蛋白）の発現のための適当な宿主細胞は、適切なプロモーターの制御下の、原核生物、コウボ、昆虫及びより高等な真核生物の細胞を包含する。原核生物はグラム陰性又はグラム陽性の生物、例えばＥ・コリ又はバチルスを包含する。より高等な真核生物の細胞は後述するような哺乳類起源の樹立された細胞系統を包含する。無細胞翻訳系もまた使用される。細菌、カビ、コウボ、及び哺乳類細胞の宿主を用いた適切なクローニング及び発現ベクターはPouwels等、(CloningVectors:A Laboratory Manual, Elsevier, N.Y.,1985)により記載さ
れており、その該当開示は参照により本明細書に組み込まれる。抗体生産を包含する蛋白生産の方法に関する別の情報は、例えば米国特許出願公開２００８／０１８７９５４、米国特許６，４１３，７４６及び６，６６０，５０１及び国際特許公開ＷＯ０４００９８２３に記載されており、これらの各々は参照により全体が本明細書に組み込まれる。
種々の哺乳類及び昆虫細胞の培養系も又、組み換え蛋白を発現させるために好都合に使用される。哺乳類細胞中の組み換え蛋白の発現は、そのような蛋白が一般的に正しく折り畳まれ、適切に修飾され、そして完全に機能することから、実施することができる。適当な哺乳類宿主細胞系統の例は、Gluzman(Cell23:175, 1981)により記載されているサル
腎臓細胞のＣＯＳ−７系統、及び適切なベクターを発現することができる他の細胞系統、例えばＬ細胞、Ｃ１２７，３Ｔ３、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）、ＨｅＬａ及びＢＨＫ細胞系統を包含する。哺乳類発現ベクターは非転写エレメント、例えば複製起点、発現すべき遺伝子に連結された適当なプロモーター及びエンハンサー、及び５’又は３’フランキング非転写配列、及び５’又は３’非翻訳配列、例えば必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスドナー及びアクセプター部位、及び転写終止配列を含むことができる。昆虫細胞中の非相同蛋白の生産のためのバキュロウィルス系はLuckowandSummers,Bio/Technology 6:47 (1988)において考察されている。
形質転換された宿主により生産される蛋白は何れかの適当な方法に従って精製できる。そのような標準的な方法はクロマトグラフィー（例えばイオン交換、アフィニティー及びサイジングカラムクロマトグラフィー）、遠心分離、溶解度差、又は何れかの他の標準的な蛋白精製手法を包含する。アフィニティータグ、例えばヘキサヒスチジン、マルトース結合ドメイン、インフルエンザ被膜配列及びグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼを蛋白に結合することにより、適切なアフィニティーカラム上を通過させることによる容易な精製が可能となる。単離された蛋白は又、蛋白分解、核磁気共鳴及びＸ線結晶分析のような手法を用いながら物理的に特性化することができる。
例えば、培地中に組み換え蛋白を分泌する系からの上澄みを先ず、市販の蛋白濃縮フィルター、例えばＡｍｉｃｏｎ又はＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｐｅｌｌｉｃｏｎの限外濾過ユニットを用いながら濃縮することができる。濃縮工程の後、濃縮液を適当な精製マトリックスに適用することができる。或いは、アニオン交換樹脂、例えば懸垂ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）基を有するマトリックス又は基材を使用できる。マトリックスはアクリルアミド、アガロース、デキストラン、セルロース又は蛋白精製において一般的に使用されている他の型であることができる。或いは、カチオン交換皇帝を使用できる。適当なカチオン交換剤はスルホプロピル又はカルボキシメチル基を含む種々の不溶性マトリックスを包含する。最後に、疎水性ＲＰ−ＨＰＬＣ媒体、例えば懸垂メチル又は他の脂肪族基を有するシリカゲルを用いた１つ以上の逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）工程を用いてＣＤ３７−結合剤を更に精製することができる。種々の組み合わせににおける上記した精製工程の一部又は全てを用いて均質な組み換え蛋白を得ることもできる。
細菌培養物中に生産された組み換え蛋白は、例えば細胞ペレットからの初期抽出、その後の１回以上の濃縮、塩析、水性イオン交換又はサイズエクスクルージョンクロマトグラフィーの工程により単離できる。高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を最終精製工程のために使用できる。組み換え蛋白の発現において使用した微生物細胞は、何れかの好都合な方法、例えば凍結解凍のサイクリング、超音波処理、機械的破壊又は細胞溶解剤の使用により破壊できる。
抗体及び他の蛋白を精製するために当該分野で知られている方法は又、例えば米国特許出願公開２００８／０３１２４２５、２００８／０１７７０４８及び２００９／０１８７００５に記載されているものを包含し、これらの各々は参照により全体が本明細書に組み込まれる。
特定の実施形態においては、ＣＤ３７結合剤は抗体ではないポリペプチドである。蛋白標的に高親和性で結合する非抗体ポリペプチドを識別して生産するための種々の方法が当該分野で知られている。例えばSkerra,Curr.Opin.Biotechnol., 18:295-304 (2007), Hosse等、Protein Science,15:14-27(2006),Gill等、Curr. Opin.Biotechnol., 17:653-658 (2006), Nygren, FEBS J.,275:2668-76(2008), andSkerra, FEBS J., 275:2677-83(2008)に記載されており、これらの各々は参照により全体が本明細書に組み込まれる。特定の実施形態においては、ＣＤ３７結合ポリペプチドを識別／生産するためにファージディスプレイ技術が用いられている。特定の実施形態においては、ポリペプチドはプロテインＡ、リポカリン、フィブロネクチンドメイン、アンキリンコンセンサスリピートドメイン及びチオレドキシンよりなる群から選択される型の蛋白スカホールドを含む。
一部の実施形態においては、剤は非蛋白分子である。特定の実施形態においては、剤は小分子である。非蛋白ＣＤ３７結合剤の識別において有用なコンビナトリアル化学ライブラリ及び手法は当該分野で知られている。例えばKennedy等、J.Comb.Chem, 10:345-354(2008), Dolle et al, J. Comb.Chem., 9:855-902 (2007),andBhattacharyya, Curr. Med. Chem., 8:1383-404 (2001)を参照でき、これらの各々は参照により全体が本明細書に組み込まれる。特定の別の実施形態においては、剤は炭水化物、グリコサミノグリカン、糖蛋白、又はプロテオグリカンである。
特定の実施形態においては、剤は核酸アプタマーである。アプタマーは別の分子に結合する自身の能力に基づいて（例えばランダム又は突然変異誘発物質化プールから）選択されているポリヌクレオチド分子である。一部の実施形態においては、アプタマーはＤＮＡポリヌクレオチドを含む。特定の大体の実施形態においては、アプタマーはＲＮＡポリヌクレオチドを含む。特定の実施形態においては、アプタマーは１つ以上の修飾された核酸残基を含む。蛋白への結合に関して核酸アプタマーを作成及びスクリーニングする方法は当該分野で良く知られている。例えば米国特許５，２７０，１６３、米国特許５，６８３，８６７、米国特許５，７６３，５９５、米国特許６，３４４，３２１、米国特許７，３６８，２３６、米国特許５，５８２，９８１、米国特許５，７５６，２９１、米国特許５，８４０，８６７、米国特許７，３１２，３２５、米国特許７，３２９，７４２、国際特許公開ＷＯ０２／０７７２６２、国際特許公開ＷＯ０３／０７０９８４、米国特許出願公開２００５／０２３９１３４、米国特許出願公開２００５／０１２４５６５及び米国特許出願公開２００８／０２２７７３５を参照でき、これらの各々は参照により全体が本明細書に組み込まれる。
ＩＩＩ．イムノコンジュゲート
本発明は又、薬物又はプロドラッグに連結又はコンジュゲートされた本明細書に開示された抗ＣＤ３７抗体、抗体フラグメント、及びそれらの機能的等価物を含むコンジュゲート（本明細書においてはイムノコンジュゲートとも称する）に関する。適当な薬物又はプロドラッグは当該分野で知られている。薬物又はプロドラッグは細胞傷害剤であることができる。本発明の細胞傷害コンジュゲートにおいて使用される細胞傷害剤は、細胞死をもたらすか、又は細胞死を誘導するか、又は一部の態様においては細胞の生存性を低下させる何れかの化合物であることができ、そして例えばマイタンシノイド及びマイタンシノイド類縁体を包含する。他の適当な細胞傷害剤は例えばベンゾジアゼピン、タキソイド、ＣＣ−１０６５及びＣＣ−１０６５類縁体、デュオカルマイシン及びデュオカルマイシン類縁体、エネジイン、例えばカリケアマイシン、ドラスタチン及びドラスタチン類縁体、例えばオーリスタチン、トマイマイシン誘導体、レプトマイシン誘導体、メトトレキセート、シスプラチン、カルボプラチン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、メルファラン、マイトマイシンＣ、クロラムブシル及びモルホリノドキソルビシンである。
そのようなコンジュゲートは抗体又は機能的等価物に薬物又はプロドラッグを連結するために連結基を用いることにより調製できる。適当な連結基は当該分野で良く知られており、そして、例えばジスルフィド基、チオエーテル基、酸不安定基、光不安定基、ペプチダーゼ不安定基及びエステラーゼ不安定基を包含する。
薬物又はプロドラッグは例えばジスルフィド結合を介して抗ＣＤ３７抗体又はそのフラグメントに連結できる。リンカー分子又は架橋剤は抗ＣＤ３７抗体又はそのフラグメントと反応することができる反応性の化学基を含む。細胞結合剤との反応のための反応性化学基はＮ−スクシンイミジルエステル及びＮ−スルホスクシンイミジルエステルであることができる。更に又、リンカー分子は薬物と反応してジスルフィド結合を形成できるジチオピリジル基であることができる反応性の化学基を含む。リンカー分子は、例えば−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）（例えばＣａｒｌｓｓｏｎ等、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．、１７３：７２３−７３７（１９７８）参照）、Ｎ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルジチオ）ブタノエート（ＳＰＤＢ）（例えば米国特許４，５６３，３０４参照）、Ｎ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルジチオ）２−スルホブタノエート（スルホ−ＳＰＤＢ）（米国特許公開２００９０２７４７１３参照）、Ｎ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルジチオ）ペンタノエート（ＳＰＰ）（例えばＣＡＳ登録番号３４１４９８−０８−６参照）、２−イミノチオラン又は無水アセチルコハク酸を包含する。例えば、抗体又は細胞結合剤は架橋試薬で修飾することができ、そしてこのようにして誘導された遊離又は保護されたチオール基を含有する抗体又は細胞結合剤を次に、ジスルフィド又はチオール含有マイタンシノイドと反応させることによりコンジュゲートを生成する。コンジュゲートはクロマトグラフィー、例えば限定しないがＨＰＬＣ、サイズエクスクルージョン、吸着、イオン交換及びアフィニティーキャプチャー、透析又はタンジェンシャルフロー濾過により精製できる。
本発明の別の側面において、抗ＣＤ３７抗体は、イムノコンジュゲートの力価、溶解性又は薬効を増強する場合に、ジスルフィド結合及びポリエチレングリコールを介して細胞傷害薬に連結される。そのような切断可能な親水性のリンカーはＷＯ２００９／０１３４９７６に記載されている。このリンカー設計の追加的な利点は、所望の高い単量体比及び最小限の抗体薬物コンジュゲート凝集である。この側面において得に意図されるものは、細胞結合剤のコンジュゲートであり、そして２〜８の薬物負荷の狭小な範囲を有するポリエチレングリコールスペーサー（（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ＝１−１４）を担持するジスルフィド結合（−Ｓ−Ｓ−）を介して連結した薬物は、癌細胞に対して比較的高い強力な生物学的活性を示し、そして高いコンジュゲート州立及び高い単量体比と最小限の蛋白凝集という望ましい生化学的特性を有すると記載されている。
この側面において特に意図されるものは式（Ｉ）の抗ＣＤ３７抗体薬物コンジュゲート又は式（Ｉ’）のコンジュゲート：
ＣＢ−［Ｘｌ−（−ＣＨ２−ＣＨ２Ｏ−）ｎ−Ｙ−Ｄ］ｍ （Ｉ）
［Ｄ−Ｙ−（−ＣＨ２−ＣＨ２Ｏ−）ｎ−Ｘｌ］ｍ−ＣＢ （Ｉ’）
であり、
式中：
ＣＢは抗ＣＤ３７抗体又はフラグメントを示し；
Ｄは薬物を示し；
Ｘはチオエーテル結合、アミド結合、カーバメート結合、又はエーテル結合を介して細胞結合剤に結合された脂肪族、芳香族又はヘテロ環の単位を示し；
Ｙはジスルフィド結合を介して薬物に結合された脂肪族、芳香族又はヘテロ環の単位を示し；
ｌは０又は１であり；
ｍは２〜８の整数であり；そして、
ｎは１〜２４の整数である。
一部の実施形態においては、ｍは２〜６の整数である。
一部の実施形態においては、ｍは３〜５の整数である。
一部の実施形態においては、ｎは２〜８の整数である。或いは、例えば米国特許６，４４１，１６３及び７，３６８，５６５に開示されている通り、細胞結合剤との反応に適する反応性エステルを導入するために先ず薬物を修飾することができる。活性化されたリンカー部分を含有するこれらの薬物の細胞結合剤との反応は、細胞結合剤薬物コンジュゲートを生成する別の方法を提供する。マイタンシノイドは例えば米国特許６，７１６，８２１に記載のＰＥＧ連結基を用いながら抗ＣＤ３７抗体又はフラグメントに連結することもできる。これらのＰＥＧ切断不可能な連結基は水及び非水性の溶媒の両方に可溶であり、そして１つ以上の細胞傷害剤を細胞結合剤に連結するために使用できる。例示されるＰＥＧ連結基は、一端において官能性のスルヒドリル又はジスルフィド基、及び、他端において活性エステルを介してリンカーの両側末端で細胞傷害剤及び細胞結合剤と反応するヘテロ２官能性ＰＥＧリンカーを包含する。ＰＥＧ連結基を用いる細胞傷害コンジュゲートの合成の一般的例として、ここでも米国特許６，７１６，８２１を参照でき、これは参照により全体が本明細書に組み込まれる。合成の開始は反応性のＰＥＧ部分を担持している細胞傷害剤１つ以上の細胞結合剤との反応であり、これにより細胞結合剤のアミノ酸残基による各反応性ＰＥＧ部分の末端活性エステルの置き換えが起こり、これによりＰＥＧ連結基を介して細胞結合剤に共有結合下細胞傷害剤１つ以上を含む細胞傷害コンジュゲートが生じる。或いは、細胞結合剤を２官能性ＰＥＧ架橋剤で修飾することにより反応性のジスルフィド部分（例えばピリジルジスルフィド）を導入することができ、これを次にチオール含有マイタンシノイドで処理することによりコンジュゲートを得ることができる。別の方法においては、細胞結合を２官能性のＰＥＧ架橋剤で修飾することによりチオール部分を導入することができ、次にこれを反応性ジスルフィド含有マイタンシノイド（例えばピリジルジスルフィド）で処理することによりコンジュゲートを得ることができる。
切断不可能なの連結を有する抗体−マイタンシノイドコンジュゲートもまた調製できる。そのような架橋剤は当該分野で報告されており（米国特許公開２００５０１６９９３３参照）、そして、Ｎ−スクシンイミジル４−（マレイミドメチル）シクロヘキサンカルボキシレート（ＳＭＣＣ）を包含するがこれに限定されない。一部の実施形態においては、抗体は、１〜１０個の反応性の基を導入するために文献記載の通り、スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、スルホ−ＳＭＣＣ、マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）、スルホ−ＭＢＳ又はスクシンイミジル−ヨードアセテートのような架橋剤で修飾される（Yoshitakeetal, Eur. J. Biochem., 101:395-399 (1979); Hashida etal, J. Applied Biochem.,56-63(1984)；及びLiu et al, Biochem., 18:690-697 (1979)）。次に修飾された抗体をチオール含有マイタンシノイド誘導体と反応させることによりコンジュゲートを生成する。コンジュゲートはＳｅｐｈａｄｅｘＧ２５カラムを通したゲル濾過により、又は、透析又はタンジェンシャルフロー濾過により精製できる。修飾された抗体をチオール含有マイタンシノイド（１〜２モル等量／マレイミド基）で処理し、そして、抗体−マイタンシノイドコンジュゲートをＳｅｐｈａｄｅｘＧ２５カラムを通したゲル濾過、セラミックヒドロキシアパタイトカラム上のクロマトグラフィー、透析又はタンジェンシャルフロー濾過又はこれらの方法の組み合わせにより精製する。典型的には、抗体当たり平均で１〜１０個のマイタンシノイドを連結する。１つの方法はスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）で抗体を修飾することによりマレイミド基を導入し、その後、修飾された抗体をチオール含有マイタンシノイドと反応させることによりチオエーテル連結コンジュゲートとする。ここでも抗体分子当たり１〜１０薬物分子を有するコンジュゲートが生じる。抗体、抗体フラグメント及び他の蛋白のマイタンシノイドコンジュゲートを同じ態様において製造する。
本発明の別の側面においては、ＰＥＧスペーサーを間においた切断不可能な結合を介して薬物にＣＤ３７抗体を連結させる。薬物と抗ＣＤ３７抗体又はフラグメントの間のリンカーを形成する親水性ＰＥＧ鎖を含む適当な架橋試薬は、当該分野で良く知られており、或いは、市販されている（例えばQuantaBiodesign,Powell, Ohio）。適当なＰＥＧ含有架橋剤は又、当該分野で知られている標準的合成化学手法を用いながら市販のＰＥＧ自体から合成することもできる。薬物を米国特許出願公開２００９０２７４７１３及びＷＯ２００９／０１３４９７６に詳述されている方法により２官能性ＰＥＧ含有架橋剤と反応させることにより次の式、即ちＺ−Ｘｌ−（−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−）ｎ−Ｙｐ−Ｄの化合物とし、次にこれを細胞結合剤と反応させることによりコンジュゲートとすることができる。或いは、細胞結合を２官能性ＰＥＧ架橋剤で修飾することによりチオール反応性基（例えばマレイミド又はハロアセトアミド）を導入し、次にこれをチオール含有マイタンシノイドで処理することによりコンジュゲートとすることができる。別の方法においては、細胞結合を２官能性ＰＥＧ架橋剤で修飾することによりチオール部分を導入し、次にこれをチオール反応性マイタンシノイド（例えばマレイミド又はハロアセトアミドを担持したマイタンシノイド）で処理することによりコンジュゲートとすることができる。
従って本発明の別の側面は式（ＩＩ）又は式（ＩＩ’）の抗ＣＤ３７抗体薬物コンジュゲート：
ＣＢ−［Ｘｌ−（−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−）ｎ−Ｙｐ−Ｄ］ｍ （ＩＩ）
［Ｄ−Ｙｐ−（−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−）ｎ−Ｘｌ］ｍ−ＣＢ （ＩＩ’）
であり、式中、ＣＢは抗ＣＤ３７抗体又はフラグメントを示し；
Ｄは薬物を示し；
Ｘはチオエーテル結合、アミド結合、カーバメート結合、又はエーテル結合を介して細胞結合剤に結合された脂肪族、芳香族又はヘテロ環の単位を示し；
Ｙはチオエーテル結合、アミド結合、カーバメート結合、エーテル結合、アミン結合、炭素−炭素結合及びヒドラゾン結合よりなる群から選択される共有結合を介して薬物に結合された脂肪族、芳香族又はヘテロ環の単位を示し；
ｌは０又は１であり；
ｐは０又は１であり；
ｍは２〜１５の整数であり；そして、
ｎは１〜２０００の整数である。
一部の実施形態においては、ｍは２〜８の整数であり；そして、
一部の実施形態においては、ｎは１〜２４の整数である。
一部の実施形態においては、ｍは２〜６の整数である。
一部の実施形態においては、ｍは３〜５の整数である。
一部の実施形態においては、ｎは２〜８の整数である。適当なＰＥＧ含有リンカーの例は、抗ＣＤ３７抗体又はそのフラグメントとの反応のためのＮ−スクシンイミジルエステル又はＮ−スルホスクシンイミジルエステル、並びに化合物との反応のためのマレイミド−又はハロアセチル系の部分を有するリンカーを包含する。ＰＥＧスペーサーは本明細書に記載する方法により当該分野で知られている何れかの架橋剤内に取り込むことができる。
本明細書に開示するリンカーの多くは米国特許特許公開 ２００５０１６９９３３及び２００９０２７４７１３、及びＷＯ２００９／０１３４９７６に詳述されており；その内容は参照により全体が本明細書に組み込まれる。
本発明は、約２〜約８個の薬物分子（「薬物負荷」）、例えばマイタンシノイドが抗ＣＤ３７抗体又はそのフラグメントに連結しており、コンジュゲートの抗腫瘍採用が同じ細胞結合剤に連結した薬物の数が低値又は高値である薬物負荷と比較して遥かに効果的である側面を包含する。「薬物負荷」とは本明細書において使用する場合、細胞結合剤（例えば抗ＣＤ３７抗体又はそのフラグメント）に結合できる薬物分子（例えばマイタンシノイド）の数を指す。１つの側面において、細胞結合剤に結合することができる薬物分子の数は平均で約２〜約８個（例えば１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４．０、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５．０、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８．０、８．１個）であることができる。Ｎ２’−デアセチル−Ｎ２’−（３−メルカプト−１−オキソプロピル）−マイタンシン（ＤＭ１）及びＮ２’−デアセチル−Ｎ２’−（４−メルカプト−４−メチル−１−オキソペンチル）マイタンシン（ＤＭ４）を使用できる。
即ち、１つの側面において、イムノコンジュゲートは抗体あたり１個のマイタンシノイドを含む。別の側面においてイムノコンジュゲートは抗体当たり２個のマイタンシノイドを含む。別の側面においてイムノコンジュゲートは抗体当たり３個のマイタンシノイドを含む。別の側面においてイムノコンジュゲートは抗体当たり４個のマイタンシノイドを含む。別の側面においてイムノコンジュゲートは抗体当たり５個のマイタンシノイドを含む。別の側面においてイムノコンジュゲートは抗体当たり６個のマイタンシノイドを含む。別の側面においてイムノコンジュゲートは抗体当たり７個のマイタンシノイドを含む。別の側面においてイムノコンジュゲートは抗体当たり８個のマイタンシノイドを含む。
１つの側面において、イムノコンジュゲートは抗体あたり約１〜約８個のマイタンシノイドを含む。別の側面において、イムノコンジュゲートは抗体あたり約２〜約７個のマイタンシノイドを含む。別の側面において、イムノコンジュゲートは抗体あたり約２〜約６個のマイタンシノイドを含む。別の側面において、イムノコンジュゲートは抗体あたり約２〜約５個のマイタンシノイドを含む。別の側面において、イムノコンジュゲートは抗体あたり約３〜約５個のマイタンシノイドを含む。別の側面において、イムノコンジュゲートは抗体あたり約３〜約４個のマイタンシノイドを含む。
１つの特徴において、イムノコンジュゲートを含む組成物は抗体当たり結合した薬物分子（例えばマイタンシノイド）を平均で約２〜約８個（例えば１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４．０、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５．０、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８．０、８．１個）有する。１つの側面において、イムノコンジュゲートを含む組成物は抗体あたり平均で約１〜約８個の薬物分子（例えばマイタンシノイド）を有する。１つの側面において、イムノコンジュゲートを含む組成物は抗体あたり平均で約２〜約７個の薬物分子（例えばマイタンシノイド）を有する。１つの側面において、イムノコンジュゲートを含む組成物は抗体あたり平均で約２〜約６個の薬物分子（例えばマイタンシノイド）を有する。１つの側面において、イムノコンジュゲートを含む組成物は抗体あたり平均で約２〜約５個の薬物分子（例えばマイタンシノイド）を有する。１つの側面において、イムノコンジュゲートを含む組成物は抗体あたり平均で約３〜約５個の薬物分子（例えばマイタンシノイド）を有する。１つの側面において、イムノコンジュゲートを含む組成物は抗体あたり平均で約３〜約４個の薬物分子（例えばマイタンシノイド）を有する。
１つの側面において、イムノコンジュゲートを含む組成物は抗体当たり結合した薬物分子（例えばマイタンシノイド）を平均で約２±０．５個、約３±０．５個、約４±０．５個、約５±０．５個、約６±０．５個、約７±０．５個、又は約８±０．５個有する。１つの側面において、イムノコンジュゲートを含む組成物は抗体当たり平均で約３．５±０．５個の薬物分子（例えばマイタンシノイド）有する。
抗ＣＤ３７抗体又はそのフラグメントは２官能性架橋試薬を抗ＣＤ３７抗体又はそのフラグメントに反応させ、これにより抗ＣＤ３７抗体又はそのフラグメントへのリンカー分子の共有結合を起こすことにより修飾できる。本明細書において使用する場合、「２官能性架橋試薬」とは本明細書に記載する薬物のような薬物に細胞結合剤を共有結合させる何れかの化学部分である。別の方法においては、連結部分の一部分は薬物により与えられる。この点に関し、薬物は薬物に細胞結合剤を連結するために使用されるより大きいリンカー分子の部分である連結部分を含む。例えば、マイタンシノイドＤＭ１を形成するためには、マイタンシンのＣ−３ヒドロキシル基における側鎖を遊離のスルヒドリル基（ＳＨ）を有するように修飾する。マイタンシンのこのチオール化された型は修飾された細胞結合剤と反応してコンジュゲートを形成できる。従って、再修理かは２つの成分から組み立てられ、その１つは架橋試薬から与えられ、もう１つはＤＭ１に由来する側鎖により与えられる。
薬物分子は血清アルブミンのような中間的担体分子を介して抗体分子に連結することができる。
本明細書において使用する場合、「細胞結合剤に連結した」又は「抗ＣＤ３７抗体又はフラグメントに連結した」という表現は適当な連結基を介して細胞結合剤抗ＣＤ３７抗体又はフラグメントに結合した少なくとも１つの薬剤誘導体を含むコンジュゲート又はその前駆体を指す。１つの連結基はＳＭＣＣである。
特定の実施形態においては、本発明において有用な細胞傷害剤はマイタンシノイド及びマイタンシノイド類縁体である。適当なマイタンシノイドの例はマイタンシノールのエステル及びマイタンシノール類縁体を包含する。マイタンシノール及びマイタンシノール類縁体のように微小管形成を阻害し、そして哺乳類細胞に対して高度に毒性である如何なる薬物も包含される。
適当なマイタンシノールエステルの例は修飾された芳香族環を有するもの、及び他の位置における修飾を有するものを包含する。このような適当なマイタンシノイドは米国特許４，４２４，２１９；４，２５６，７４６；４，２９４，７５７；４，３０７，０１６；４，３１３，９４６；４，３１５，９２９；４，３３１，５９８；４，３６１，６５０；４，３６２，６６３；４，３６４，８６６；４，４５０，２５４；４，３２２，３４８；４，３７１，５３３；５，２０８，０２０；５，４１６，０６４；５，４７５，０９２；５，５８５，４９９；５，８４６，５４５；６，３３３，４１０；７，２７６，４９７及び７，４７３，７９６に開示されている。
特定の実施形態においては、本発明のイムノコンジュゲートは細胞傷害剤として、正式名称はＮ２’−デアセチル−Ｎ２’−（３−メルカプト−１−オキソプロピル）−マイタンシンであるチオール含有マイタンシノイド（ＤＭ１）を利用する。ＤＭ１は下記構造式（ＩＩＩ）により表わされる。
別の実施形態においては、本発明のコンジュゲートは細胞傷害剤として、チオール含有マイタンシノイドＮ２’−デアセチル−Ｎ２’−（４−メチル−４−メルカプト−１−オキソプロピル）−マイタンシン（例えばＤＭ４）を利用する。ＤＭ４は下記構造式（ＩＶ）により表わされる。
立体障害チオール結合を含有する側鎖を含む別のマイタンシノイドは下記構造式（Ｖ）で表わされるＮ２’−デアセチル−Ｎ２’−（４−メルカプト−１−オキソペンチル）−マイタンシン（ＤＭ３と称する）である。
米国特許５，２０８，０２０及び７，２７６，４９７において教示されているマイタンシノイドの各々もまた、本発明におけるコンジュゲートにおいて使用できる。この点に関し、５，２０８，０２０及び７，２７６，６９７の全開示は参照により本明細書に組み込まれる。
マイタンシノイドの多くの位置が連結部分を化学的に連結するための位置として機能する。例えばヒドロキシル基を有するＣ−３位、ヒドロキシメチルで修飾されたＣ−１４位、ヒドロキシルで修飾されたＣ−１５位及びヒドロキシ基を有するＣ−２０位が全て有用であると期待される。一部の実施形態においては、Ｃ−３位は連結部分を化学的に連結するための位置として機能し、そして一部の実施形態においては、マイタンシノールのＣ−３位が連結部分を化学的に連結するための位置として機能する。
一部のコンジュゲートの構造図を以下に示す。
このような抗体マイタンシノイドコンジュゲートを生成するための幾つかの説明が米国特許６，３３３，４１０、６，４４１，１６３、６，７１６，８２１及び７，３６８，５６５に記載されており、これらの各々は参照により全体が本明細書に組み込まれる。
一般的に、水性緩衝液中の抗体の溶液を、反応性の基を担持したジスルフィド部分を有するマイタンシノイドのモル過剰量と共にインキュベートすることができる。過剰なアミン（例えばエタノールアミン、タウリン等）を添加することにより反応混合物をクエンチングできる。次にマイタンシノイド−抗体コンジュゲートをゲル濾過により精製できる。
抗体分子当たりに結合しているマイタンシノイド分子の数は、２５２ｎｍ及び２８０ｎｍの吸光度の比を分光光学的に計測することにより求めることができる。マイタンシノイド分子／抗体の平均数は、例えば１〜１０、２〜５、３〜４、又は約３．５であることができる。１つの側面において、マイタンシノイド分子の平均数は約３．５±０．５である。
アントラサイクリン化合物、並びにその誘導体、中間体及び修飾されたバージョンもまた抗ＣＤ３７イムノコンジュゲートを調製するために使用できる。例えば、ドキソルビシン、ドキソルビシン誘導体、ドキソルビシン中間体、及び修飾されたドキソルビシンを抗ＣＤ３７コンジュゲートに使用できる。例示される化合物はＷＯ２０１０／００９１２４に記載されており、これらは参照により全体が本明細書に組み込まれる。このような化合物は例えば下記式：
［式中Ｒ１は水素原子、ヒドロキシ又はメトキシ基であり、そしてＲ２はＣ１−Ｃｓアルコキシ基である］の化合物又は製薬上許容しうるその塩を包含する。
マイタンシノイド又は他の薬物との抗体のコンジュゲートがインビトロで種々の望ましくない細胞系統の増殖を抑制する能力を評価することができる。例えば、ヒトリンパ腫細胞系統Ｄａｕｄｉ及びヒトリンパ腫細胞系統Ｒａｍｏｓのような細胞系統が、これらの化合物の細胞傷害性を評価するために容易に使用できる。評価すべき細胞を４〜５日間化合物に曝露し、そして細胞の生存割合を知られた方法により直接アッセイにおいて計測できる。次にＩＣ５０値をアッセイ結果から計算できる。
本明細書に記載する一部の実施形態によればイムノコンジュゲートは細胞内に内在化できる。従って、イムノコンジュゲートはＣＤ３７発現細胞により取り込まれるか、内在化される際に、治療作用を呈することができる。一部の特定の実施形態において、イムノコンジュゲートは切断可能なリンカーにより細胞傷害剤に連結された抗体、抗体フラグメント又はポリペプチドを含み、そして細胞傷害剤は、それがＣＤ３７発現細胞により内在化される場合に抗体、抗体フラグメント又はポリペプチドから切断される。
一部の実施形態においては、イムノコンジュゲートは腫瘍体積を低減することができる。例えば、一部の実施形態においては、イムノコンジュゲートの投与により、約５０％未満、約４５％未満、約４０％未満、約３５％未満、約３０％未満、約２５％未満、約２０％未満、約１５％未満、約１０％未満、又は約５％未満である％Ｔ／Ｃ値がもたらされる。一部の特定の実施形態においては、イムノコンジュゲートはＢＪＡＢ異種移植片もｄる及び／又はＳＵ−ＤＨＬ−４異種移植片モデルにおいて腫瘍の大きさを低減できる。
本発明の別の側面においてｓｉＲＮＡ分子を薬物の代わりに本発明の抗体に連結できる。ｓｉＲＮＡはオリゴヌクレオチドの修飾に一般的に使用されている方法により本発明の抗体に連結できる（例えば米国特許出願公開２００５０１０７３２５及び２００７０２１３２９２を参照）。即ち、３’又は５’−ホスホロミダイト型のｓｉＲＮＡをヒドロキシル官能性を担持している架橋剤の一方の末端と反応させ、ｓｉＲＮＡと架橋剤との間にエステル結合を形成することができる。同様に末端アミノ基を担持する架橋剤とｓｉＲＮＡホスホロアミダイトを反応させることによりアミンを介したｓｉＲＮＡへの架橋剤の連結が起こる。或いは、ｓｉＲＮＡを標準的な科学的方法により誘導体化することによりチオール基を導入することができる。このチオール含有ｓｉＲＮＡを、予め活性ジスルフィド又はマレイミド部分を導入するように修飾されている抗体と反応させれば、切断可能な、又は切断不可能なコンジュゲートが得られる。この方法で１〜２０個のｓｉＲＮＡ分子を抗体に連結できる。
ＩＩＩ．ポリヌクレオチド
特定の実施形態においては、本発明はＣＤ３７に特異的に結合するポリペプチド、又はそのようなポリペプチドのフラグメントをコードするポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを包含する。例えば、本発明はヒトＣＤ３７に対する抗体をコードする、又はそのような抗体のフラグメントをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドを提供する。本発明のポリヌクレオチドはＲＮＡの形態又はＤＮＡの形態であることができる。ＤＮＡはｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、及び合成ＤＮＡを包含し；そして２本鎖又は１本鎖であることができ、そして１本鎖である場合はコーディング鎖又は非コーディング（アンチセンス）鎖であることができる。
特定の実施形態においては、ポリヌクレオチドは単離されている。特定の実施形態においては、ポリヌクレオチドは実質的に純粋である。
本発明は配列番号４〜１２０よりなる群から選択される配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを提供する。
本発明は更に、以下の表７〜１０に示すものから選択される配列を含むポリヌクレオチドを提供する。
同様に提供されるものは、配列番号１２１〜１７０に少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％の配列同一性を有するポリヌクレオチドである。即ち、特定の実施形態においては、ポリペプチドは（ａ）配列番号１２１〜１３５又は１５２〜１６１に少なくとも約９５％の配列同一性を有するポリペプチド、及び／又は（ｂ）配列番号１３６〜１５１又は１６２〜１７０に少なくとも約９５％の配列同一性を有するポリペプチドを含む。特定の実施形態においては、ポリペプチドは（ａ）配列番号１２１〜１３５又は１５２〜１６１のアミノ酸配列を有するポリペプチド、及び／又は（ｂ）配列番号１３６〜１５１又は１６２〜１７０のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。
特定の実施形態においては、ポリヌクレオチドは組み換えプラスミドＤＮＡｐｈｕＣＤ３７−３ＬＣ（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１０７２２、２０１０年３月１８日にＡＴＣＣに寄託）によりコードされる軽鎖、又は、ｐｈｕＣＤ３７−３ＬＣ（ＰＴＡ−１０７２２）によりコードされる軽鎖に少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、又は少なくとも約９９％である軽鎖をコードする。一部の実施形態においては、ポリヌクレオチドは組み換えプラスミドＤＮＡｐｈｕＣＤ３７−３ＨＣｖ．１．０．（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１０７２３、２０１０年３月１８日にＡＴＣＣに寄託）によりコードされる重鎖、又はｐｈｕＣＤ３７−３ＨＣｖ．１．０．（ＰＴＡ−１０７２３）によりコードされる重鎖に少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、又は少なくとも約９９％同一である重鎖をコードする。特定の実施形態においては、ポリヌクレオチドは組み換えプラスミドＤＮＡｐｈｕＣＤ３７−３ＬＣ（ＰＴＡ−１０７２２）又は組み換えプラスミドｐｈｕＣＤ３７−３ＨＣｖ．１．０．（ＰＴＡ−１０７２３）である。
特定の実施形態においては、ポリヌクレオチドは、例えば宿主細胞からのポリペプチドの発現及び分泌を支援する、ポリヌクレオチドに同じ読み枠で融合した成熟ポリペプチドに関するコーディング配列を含む（例えば細胞からのポリペプチドの輸送を制御するための分泌配列として機能するリーダー配列）。リーダー配列を有するポリペプチドは、プレ蛋白であり、そして宿主細胞により切断されてポリペプチドの成熟型を形成するリーダー配列を有することができる。ポリヌクレオチドは又、成熟蛋白プラス追加５’アミノ酸残基であるプロ蛋白に対してもコードできる。プロ配列を有する成熟蛋白はプロ蛋白であり、そして蛋白の不活性型である。プロ配列が切断されると活性な成熟蛋白が残存する。
特定の実施形態においては、ポリヌクレオチドは例えばコードされたポリペプチドの精製を可能にするマーカー配列に同じ読み枠で融合した成熟ポリペプチドに関するコーディング配列を含む。例えば、マーカー配列は、細菌宿主の場合はマーカーに融合した成熟ポリペプチドの精製を可能にするｐＱＥ−９ベクターにより与えられるヘキサヒスチジンタグであることができ、又は、哺乳類宿主（例えばＣＯＳ−７細胞）を使用する場合は、インフルエンザヘマグルチニン蛋白から誘導されたヘマグルチニン（ＨＡ）タグであることができる。
本発明は更に例えばフラグメント、類縁体及び誘導体をコードする上記下ポリヌクレオチドの変異体に関する。
ポリヌクレオチド変異体はコーディング領域、非コーディング領域、又は両方において改変を含有できる。一部の実施形態においては、ポリヌクレオチド変異体はサイレントな置換、負荷、又は欠失をもたらすが、コードされたポリペプチドの特性又は活性を改変しない改変を含有する。一部の実施形態においては、ヌクレオチド変異体は遺伝子コードの縮重によるサイレントな置換により生成される。ポリヌクレオチド変異体は種々の理由のため、例えば特定の宿主に対してコドンの発現を最適化する（ヒトｍＲＮＡ中のコドンをＥ・コリのような細菌宿主により好まれるものに変える）ために生産することもできる。
本明細書に記載するポリヌクレオチドを含むベクター及び細胞も提供される。
ＩＶ．使用方法及び医薬組成物
本発明のＣＤ３７結合剤（抗体、イムノコンジュゲート及びポリペプチドを包含）はＢ細胞悪性疾患のような癌の治療のような施療的治療方法を包含するがこれに限定されない種々の用途において有用である。特定の実施形態においては、剤は腫瘍生育を阻害し、分化を誘導し、腫瘍体積を低減し、及び／又は腫瘍の腫瘍形成性を低減するために有用である。使用方法はインビトロ、エクスビボ、又はインビボの方法であることができる。特定の実施形態においては、ＣＤ３７結合剤又は抗体又はイムノコンジュゲート又はポリペプチドはそれが結合するヒトＣＤ３７の拮抗剤である。
１つの側面において、本発明の抗ＣＤ３７抗体及びイムノコンジュゲートは生物学的試料中のＣＤ３７の存在を検出するために有用である。「検出する」という用語は本明細書において使用する場合、定量的又は定性的な検出を包含する。特定の実施形態においては、生物学的試料は細胞又は組織を含む。特定の実施形態においては、そのような組織は、他の組織と相対比較してより高値のレベルでＣＤ３７を発現する正常及び／又は癌性の組織、例えばＢ細胞及び／又はＢ細胞関連組織を包含する。
１つの側面において、本発明は生物学的試料中のＣＤ３７の存在を検出する方法を提供する、特定の実施形態においては、方法は、ＣＤ３７への抗ＣＤ３７抗体の結合を可能にする条件下で抗ＣＤ３７抗体に生物学的試料を接触させること、及び、抗ＣＤ３７抗体とＣＤ３７との間に複合体が形成されているかどうか検出することを含む。
１つの側面において、本発明はＣＤ３７の増大した発現に関連する障害を診断する方法を提供する。特定の実施形態においては、方法は、抗ＣＤ３７抗体に被験細胞を接触させること；ＣＤ３７への抗ＣＤ３７抗体の結合を検出することにより被験細胞によるＣＤ３７の発現のレベルを（定量的又は定性的に）測定すること；及び被験細胞によるＣＤ３７の発現のレベルを対照細胞（例えば被験細胞と同じ組織起源の正常細胞、又は、そのような正常細胞に匹敵するレベルでＣＤ３７を発現している細胞）によるＣＤ３７の発現のレベルと比較することを含み、ここで対照細胞と比較した場合に被験細胞によるより高レベルのＣＤ３７の発現は、ＣＤ３７の増大した発現に関連する障害の存在を示している。特定の実施形態においては、被験細胞はＣＤ３７の増大した発現に関連する障害を有すると疑われる個体から得られる。特定の実施形態においては、障害は細胞増殖障害、例えば癌又は腫瘍である。
特定の実施形態においては、上記した者のような診断又は検出の方法は、細胞の表面上に発現されているか、又は自身の表面上にＣＤ３７を発現している細胞から得られた膜調製物中の、ＣＤ３７への抗ＣＤ３７抗体の結合を検出することを含む。特定の実施形態においては、方法は、ＣＤ３７への抗ＣＤ３７抗体の結合を可能にする条件下で抗ＣＤ３７抗体に細胞を接触させること、及び細胞表面上の抗ＣＤ３７抗体とＣＤ３７との間に複合体が形成されているかどうか検出することを含む。細胞表面に発現されたＣＤ３７への抗ＣＤ３７抗体の結合を検出するための例示されるアッセイは「ＦＡＣＳ」アッセイである。
特定の別の方法を用いてＣＤ３７への抗ＣＤ３７抗体の結合を検出することができる。そのような方法は、当該分野で良く知られている抗原結合試験、例えばウエスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素連結免疫吸着試験）。「サンドイッチ」イムノアッセイ、免疫沈降アッセイ、蛍光イムノアッセイ、プロテインＡイムノアッセイ及び免疫組織化学（ＩＨＣ）を包含するがこれらに限定されない。
特定の実施形態においては、抗ＣＤ３７抗体を標識する。標識は、直接検出される標識又は部分（例えば蛍光、発色団、電子稠密、化学ルミネセント、及び放射活性の標識）並びに例えば酵素的反応又は分子相互作用を介して間接的に検出される酵素又はリガンドのような部分を包含するがこれらに限定されない。
特定の実施形態においては、抗ＣＤ３７抗体は不溶性マトリックス上に固定化される。固定化とは溶液中に遊離で残存する如何なるＣＤ３７からも抗ＣＤ３７抗体を分離することを意味する。これは従来より、水不溶性マトリックス又は表面に吸着することによる（Bennich等、米国特許３，７２０，７６０）か、又は共有結合カップリング（例えばグル
タルアルデヒド架橋を用いる）による等して、アッセイ操作の前に抗ＣＤ３７抗体を不溶化することによるか、又は例えば免疫沈降により抗ＣＤ３７抗体と架橋との間の複合体の形成の後に抗ＣＤ３７抗体を不溶化することによるかの、いずれかにより達成される。
診断又は検出の上記した実施形態の何れも、抗ＣＤ３７抗体の代わりに、又はそれに追加して、本発明のイムノコンジュゲートを使用しながら実施できる。
特定の実施形態においては、ＣＤ３７結合剤又は拮抗剤（例えば抗ＣＤ３７抗体）で治療される疾患は癌である。特定の実施形態においては、癌はＣＤ３７結合剤（例えば抗体）が結合する相手であるＣＤ３７発現細胞により特徴付けられる。
本発明は対象（例えば治療を要する対象）にＣＤ３７結合剤の治療有効量を投与することを含む癌の治療の方法を提供する。特定の実施形態においては、癌はＢ細胞悪性疾患である。特定の実施形態においては、癌はＢ細胞リンパ腫、ＮＨＬ、前駆性Ｂ細胞リンパ芽球性白血病／リンパ腫及び成熟Ｂ細胞新生物、Ｂ細胞慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）／小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、リンパプラズマ細胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）、低悪性度、中悪性度及び高悪性度（ＦＬ）、皮膚濾胞中心リンパ腫、辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、ＭＡＬＴ型辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、結節性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、脾臓型辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、ヘアリー細胞白血病、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、ブルキットリンパ腫、プラズマ細胞腫、プラズマ細胞骨髄腫、移植後のリンパ増殖性障害、バルデンストレームマクログロブリン血症、及び未分化大細胞リンパ腫（ＡＬＣＬ）よりなる群から選択される。特定の実施形態においては、対象はヒトである。
本発明は更に本明細書に記載する抗体又は他の剤を用いた腫瘍生育を阻害するための方法を提供する。特定の実施形態においては、腫瘍生育を阻害する方法はインビトロでＣＤ３７結合剤（例えば抗体）に細胞を接触させることを含む。例えば、ＣＤ３７を発現する不朽化細胞系統又は癌細胞を培地中で培養し、これに抗体又は他の剤を添加して腫瘍生育を阻害する。一部の実施形態においては、患者試料、例えば生検組織、胸水又は血液試料から腫瘍細胞を単離し、培地中で培養し、これにＣＤ３７結合剤を添加して腫瘍生育を阻害する。
一部の実施形態においては、腫瘍生育を阻害する方法はインビボでＣＤ３７結合剤（例えば抗体）に腫瘍又は腫瘍細胞を接触させることを含む。特定の実施形態においては、ＣＤ３７結合剤に腫瘍又は腫瘍細胞を接触させることは動物モデルにおいて行われる。例えば免疫無防備状態のマウス（例えばＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス）中で成育させておいた１つ以上のＣＤ３７を発現する異種移植片にＣＤ３７結合剤を投与することにより腫瘍生育を阻害することができる。一部の実施形態においては癌幹細胞を患者試料、例えば生検組織、胸水又は血液試料から単離し、免疫無防備状態のマウスに注射し、次にＣＤ３７結合剤を投与することにより腫瘍細胞生育を阻害する。一部の実施形態においては、ＣＤ３７結合剤は動物内への腫瘍形成性細胞の導入と同時かその直後に投与することにより腫瘍生育を防止する。一部の実施形態においては、ＣＤ３７結合剤は腫瘍形成性細胞が特定の大きさまで成育した後に治療薬として投与される。
特定の実施形態においては、腫瘍生育を阻害する方法はＣＤ３７結合剤の治療有効量を対象に投与することを含む。特定の実施形態においては、対象はヒトである。特定の実施形態においては、対象は腫瘍を有するか、腫瘍を除去している。
特定の実施形態においては腫瘍はＣＤ３７結合剤又は抗体が結合するＣＤ３７を発現する。特定の実施形態においては、腫瘍はヒトＣＤ３７を過剰発現する。
更に又、本発明は対象にＣＤ３７結合剤の治療有効量を投与することを含む対象中の腫瘍の腫瘍形成性を低減する方法を提供する。特定の実施形態においては、腫瘍は癌幹細胞を含む。特定の実施形態においては、腫瘍中の癌幹細胞の発生頻度は剤の投与により低減される。
本発明は更にＣＤ３７結合剤に腫瘍形成性細胞を接触することを含む非腫瘍形成性細胞への腫瘍形成性細胞の文化の方法を提供する（例えば腫瘍形成性細胞を含む腫瘍を有するか、又はそのような腫瘍を除去している対象にＣＤ３７結合剤を投与することによる）。
腫瘍細胞を包含するがこれに限定されない細胞の分化を誘導するための本明細書に記載したＣＤ３７結合剤、ポリペプチド、又は抗体の使用もまた提供される。例えば、本明細書に記載したＣＤ３７結合剤（例えば抗ＣＤ３７抗体）の有効量に細胞を接触させることを含む細胞を分化するように誘導する方法が想定される。対象にＣＤ３７結合剤、ポリペプチド又は抗体の治療有効量を投与することを含む対象中の腫瘍中の細胞を分化するように誘導する方法もまた提供される。特定の実施形態においては、腫瘍は膵臓腫瘍である。特定の実施形態においては、腫瘍は結腸腫瘍である。一部の実施形態においては、治療方法は対象にＣＤ３７結合剤、ポリペプチド又は抗体の治療有効量を投与することを含む。
本発明は更に、本明細書に記載したＣＤ３７結合剤の１つ以上を含む医薬組成物を提供する。特定の実施形態においては、医薬組成物は更に製薬上許容しうるベヒクルを含む。これらの医薬組成物はヒト患者において腫瘍生育を阻害し、そして癌を治療する場合に使用できる。
特定の実施形態においては、製剤は、製薬上許容しうるベヒクル（例えば担体、賦形剤）に本発明の精製された抗体又は剤を混合することにより保存及び使用のために調製される（Remington,TheScience and Practice of Pharmacy 20th Edition MackPublishing,
2000）。適当な製薬上許容しうるベヒクルは
非毒性緩衝物質、例えばリン酸塩、クエン酸塩及び他の有機酸;塩類、例えば塩化ナトリ
ウム；抗酸化剤、例えばアスコルビン酸及びメチオニン；保存料（例えばオクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム；塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えばメチル又はプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；及びｍ−クレゾール）；低分子量ポリペプチド（例えば約１０アミノ酸残基未満）；蛋白、例えば血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリン；親水性重合体、例えばポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、又はリジン；炭水化物、例えば単糖類、２糖類、グルコース、マンノース、デキストリン；キレート形成剤、例えばＥＤＴＡ；糖類、例えばスクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトール；塩形成対イオン、例えばナトリウム；金属複合体（例えばＺｎ−蛋白複合体）；及びノニオン性界面活性剤、例えばＴＷＥＥＮ又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を包含するがこれらに限定されない。
本発明の医薬組成物は局所又は全身投与の何れかのために如何なる数の方法においても投与できる。投与は局所（例えば経膣及び肛門送達を包含する経粘膜）、例えば経皮パッチ、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、ドロップ、座剤、スプレー、液体及び粉末；肺（例えば粉末又はエアロゾルの吸入又は吸収、例えばネブライザーによるもの；気管内、鼻内、表皮及び経皮）；経口;又は非経腸、例えば静脈内、動脈内、皮下、腹腔内又は筋肉内の注射又は輸液；又は頭蓋内（例えば髄腔内又は脳室内）投与であることができる。
本発明のイムノコンジュゲートの抗体は、医薬複合製剤又は複合療法としての投薬法において、抗癌特性を有する第２の化合物と組み合わせることができる。医薬複合製剤又は投薬法の第２の化合物はそれらが相互に悪影響を及ぼさないように複合物のＡＤＣに対して補完的活性を有することができる。ＣＤ３７結合剤及び第２の抗癌剤を含む医薬組成物も提供される。例えば、ＣＤ３７結合剤はリツキシマブのようなＣＤ２０拮抗剤と組み合わせて投与できる。
疾患の治療のためには、本発明の抗体又は剤の適切な用量は、治療すべき疾患の型、疾患の重症度及び経過、疾患の応答性、抗体又は剤が治療又は予防目的の何れで投与されるか、以前の治療、患者の病歴等に応じたものとなり、全て担当医の判断による。抗体又は剤は、１回、又は数日から数か月まで継続する一連の治療に渡り、或いは、治癒が成功するか、又は疾患の縮小（例えば腫瘍の大きさの減少）が達成されるまで投与することができる。最適な投薬計画は患者の身体における薬物の蓄積の計測から計算でき、そして個々の抗体又は剤の相対的力価に応じて変動することになる。投薬医師は最適な用量、投薬法および反復率を容易に決定できる。特定の実施形態においては、用量はｋｇ体重当たり０．０１μｇ〜１００ｍｇであり、そして毎日、毎週、毎月又は毎年１回以上投与できる。特定の実施形態においては、抗体又は他のＣＤ３７結合剤を２週間に１回、又は３週間に１回投与する。特定の実施形態においては、抗体又は他のＣＤ３７結合剤の用量はｋｇ体重当たり約０．１ｍｇ〜約２０ｍｇである。担当医は体液又は組織中の薬物の滞留時間及び濃度の計測値に基づいて投薬の反復率を推定できる。
複合療法は「相乗作用」をもたらすことができ、「相乗作用的」であることがわかっており、即ち、活性成分を共に使用した場合に達成される作用が、化合物を別個に使用した場合に得られる作用の総和より大きい。相乗作用は、活性成分が（１）共同製剤され、そして複合単位剤型において同時に投与又は送達されるか；（２）別個の製剤として交互又は並行して送達されるか；又は（３）何らかの他の投薬法による場合に、達成できる。交互治療において送達される場合、相乗作用は、化合物が逐次的に、例えば別個のシリンジにおける異なる注射により投与又は送達される場合に達成できる。一般的に、交互治療中は、各活性成分の有効用量を逐次的、即ち連続して投与するが、複合療法の場合は、２つ以上の活性成分の有効用量を共に投与する。
ＶＩ．ＣＤ３７結合剤を含むキット
本発明は本明細書に記載した抗体、イムノコンジュゲート又は他の剤を含み、そして本明細書に記載した方法を実施するために使用できるキットを提供する。特定の実施形態においては、キットは容器１つ以上の中にＣＤ３７に対する精製された抗体少なくとも１つを含む。一部の実施形態においては、キットは対照、アッセイ実施のための説明書、及び結果の分析及び表示のための何れかの必要なソフトウエアの全てを含む検出アッセイを実施するために必要及び／又は十分な成分の全てを含有する。本発明の開示した抗体、イムノコンジュゲート及び他の剤は当該分野で良く知られている確立されたキットフォーマットの１つに容易に組み込むことができることが当業者の知る通りである。
更に提供されるものはＣＤ３７結合剤（例えばＣＤ３７結合抗体）並びに第２の抗癌剤を含むキットである。特定の実施形態においては、第２の抗癌剤は化学療法剤（例えばリツキシマブ）である。
本発明の実施形態は以下の非限定的な例を参照することにより更に明確化でき、これらは本開示の特定の抗体の調製及び本開示の抗体を用いるための方法を詳細に説明している。物質及び方法の両方に対する多くの変更が本開示の範囲から逸脱することなく実施できることは当業者の知る通りである。
本明細書に記載した実施例及び実施形態は説明を目的としているのみであり、そしてそれに基づく種々の改変または変更が当業者に示唆されることになり、そして本出願の精神及び範囲に包含されるべきであると理解しなければならない。
全ての細胞系統は湿潤５％ＣＯ２インキュベーター中３７℃で１０％ウシ胎児血清、２ｍＭグルタミン及び１％ペニシリン−ストレプトマイシン（全試薬Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎより入手）を添加したＲＰＭＩ−１６４０培地中で生育させた。細胞は週２回振せん培地中に希釈することにより継代し、そして０．２〜１ｘ１０６細胞／ｍｌに維持した。
（実施例１）
ネズミＣＤ３７抗体の生産
ヒトＣＤ３７の発現を可能とするＸｂａＩ及びＢａｍＨＩ制限部位によりフランキングされた全ＣＤ３７ＣＤ配列（ＣＤＳ）を含有する発現プラスミドｐＳＲａ−ＣＤ３７を構築した。Ｂａｌｂ／ｃマウスから誘導した前Ｂ細胞である３００−１９細胞（M.G.Reth等、1985, Nature, 317: 353-355）をこの発現プラスミドでトランスフェクトすることにより細胞表面上に高レベルのヒトＣＤ３７のを安定に発現させ、そしてＢａｌｂ／ｃＶＡＦマウスの免疫化のために使用した。マウスはＩｍｍｕｎｏＧｅｎ，Ｉｎｃにおいて使用されている標準的免疫化プロトコルにより２〜３週毎マウス当たり約４ｘ１０６個のＣＤ３７発現３００−１９細胞により皮下免疫した。免疫化したマウスは、ハイブリドーマ形成のために屠殺する３日前に抗原の別の用量によりブーストした。マウスの脾臓を標準的動物プロトコルに従って採集し、そして２枚の滅菌フロスト処理顕微鏡用スライドの間で磨砕することによりＲＰＭＩ−１６４０培地中の単細胞懸濁液を得た。脾細胞をペレット化し、洗浄し、ポリエチレングリコール−１５００（Ｒｏｃｈｅ７８３６４１）を用いることによりネズミミエローマＰ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３細胞（J.F.Kearney等、1979,J Immunol, 123: 1548-1550）と融合させた。ヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジン（ＨＡＴ）（ＳｉｇｍａＨ−０２６２）を含有するＲＰＭＩ−１６４０選択培地に融合細胞を再懸濁し、そして３７℃５％ＣＯ２下に９６穴平底培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ−Ｃｏｓｔａｒ３５９６、ウェル当たり細胞懸濁液２００μＬ）中における生育に関して選択した。５日間インキュベートしたの地、培養上澄み１００μＬを各ウェルから取り出し、ヒポキサンチン−チミジン（ＨＴ）補給物（ＳｉｇｍａＨ−０１３７）を含有するＲＰＭＩ−１６４０培地１００μＬと置き換えた。ハイブリドーマクローンが抗体スクリーニングに使用できるようになるまで、３７℃５％ＣＯ２下にインキュベーションを継続した。J.LangoneandH. Vunakis (Eds., Methods in Enzymology, Vol.121,"ImmunochemicalTechniques, Part I"; Academic Press, Florida)及びE.Harlowand D. Lane("Antibodies:A Laboratory Manual";1988; ColdSpring HarborLaboratoryPress, New York)に記載されているものを含むその他の免疫化およびハイブリドーマ生産の手法もまた使用できる。
ハイブリドーマのスクリーニング及び選択
ＣＤ３７発現３００−１９細胞には結合するが非トランスフェクトの３００−１９細胞には結合しないマウスモノクローナル抗体の分泌に関してフローサイトメトリーによりハイブリドーマの培養上澄みをスクリーニングした。ハイブリドーマ上澄み１００μＬを１００μＬのＦＡＣＳ緩衝液（２％正常ヤギ血清を添加したＲＰＭＩ−１６４０培地）中ＣＤ３７発現３００−１９細胞又は非トランスフェクトの３００−１９細胞（試料当たり１ｘ１０５個）の何れかと共に３時間インキュベートした。次に細胞をペレット化し、洗浄し、ＰＥコンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＦＡＣＳ緩衝液中６μｇ／ｍｌ）と共に１時間インキュベートした。細胞を再度ペレット化し、ＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、１％ホルムアルデヒド含有ＰＢＳ２００μＬ中に再懸濁した。試料はＨＴＳマルチウェルサンプラーを用いたＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメトリー又はＦＡＣＳアレイフローサイトメトリーを用いながら獲得し、そしてＣｅｌｌＱｕｅｓｔ Ｐｒｏ（全ての入手元はＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎｄｉｅｇｏ，ＵＳ）を用いて分析した。
陽性所見のハイブリドーマクローンを限界希釈によりサブクローニングした。フローサイトメトリーにより親細胞と同じＣＤ３７に対する反応性を示した各ハイブリドーマから１つのサブクローンを選択して後の分析に付した。安定なサブクローンを培養し、各分泌抗ＣＤ３７抗体のアイソタイプを市販のアイソタイピング試薬（Ｒｏｃｈｅ１４９３０２７）を用いて識別した。
合計４５回の別個の融合実験を本検討過程に渡って実施した。単一の融合実験は定型的には約２００〜１０００個のハイブリドーマクローンをもたらした。得られたハイブリドーマクローンの全てをフローサイトメトリーによりＣＤ３７結合に関してスクリーニングしたところ、合計で１８４個のハイブリドーマクローンがＣＤ３７への特異的結合を示した。
抗体精製
抗体を例えばプロテインＡ又はＧクロマトグラフィー（ＨｉＴｒａｐプロテインＡ又はＧＨＰ、１ｍＬ、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）のような標準的方法を用いながらハイブリドーマサブクローン上澄みから精製した。要すれば、１／１０容量の１ＭＴｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ８．０を添加することにより上澄みをクロマトグラフィー用に調製した。ｐＨ調節上澄みを０．２２μｍのメンブレンフィルターで濾過し、そして結合緩衝液（ＰＢＳ、ｐＨ７．３）で平衡化したカラムにロードした。カラムは２８０ｎｍにおける吸光度が無く安定なベースラインが得られるまで結合緩衝液で洗浄した。０．５ｍＬ／分の流量を用いながら、０．１５ＭＮａＣｌを含有する０．１Ｍ酢酸緩衝液、ｐＨ２．８で抗体を溶離した。約０．２５ｍＬの画分を採取し、１／１０容量の１ＭＴｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ８．０を添加することにより中和した。ピーク画分を１ｘＰＢＳに対して２回一夜透析し、０．２μｍのメンブレンフィルターを通して濾過することにより滅菌した。精製された抗体はＡ２８０の吸光度により定量した。
プロテインＡ精製画分は、更にネズミ抗体に対する第４アンモニウム（Ｑ）クロマトグラフィーを用いたイオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＸ）を用いて最終精製した。要すれば、プロテインＡ精製からの試料を結合緩衝液（１０ｍＭＴｒｉｓ、１０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ８．０）に緩衝液交換し、そして０．２２μｍのフィルターを通して濾過した。調製した試料を次に、１２０ｃｍ／ｈｒの流量で結合緩衝液で平衡化されたＱファーストフロー樹脂（ＧＥ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ）上にロードした。カラムのサイズは試料中の全てのＭＡｂに結合するために十分な容量を有するように選択した。次にカラムを２８０ｎｍにおける吸光度が無く安定なベースラインが得られるまで結合緩衝液で洗浄した。２０カラム容量（ＣＶ）中１０ｍＭから５００ｍＭの塩化ナトリウムの勾配を開始することにより抗体を溶離した。ピーク画分は２８０ｎｍの吸光度測定（Ａ２８０）に基づいて収集した。単量体のパーセンテージはＡｇｉｌｅｎｔＨＰＬＣ１１００システム（Ａｇｉｌｅｎｔ，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｌａ，ＣＡ）を用いながら、ＳＷＸＬガードカラム、６．０ｘ４０ｍｍ（Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，ＰＡ）を用いたＴＳＫｇｅｌＧ３０００ＳＷＸＬ，７．８ｘ３００ｍｍ上のサイズエクスクルージョンクロマトグラフィー（ＳＥＣ）で評価した。９５％超の単量体含有量を有する画分をプールし、ＴＦＦシステムを用いてＰＢＳ（ｐＨ７．４）に緩衝液交換し、そして０．２μｍのメンブレンフィルターを通して濾過することにより滅菌した。精製された抗体のＩｇＧ濃度は１．４７の消衰係数を用いながらＡ２８０により求めた。セラミックヒドロキシアパタイト（ＣＨＴ）のような代替の方法もまた良好な選択性で抗体を最終精製するために使用した。Ｉ粒径４０μｍのＩＩ型ＣＨＴ樹脂（ＢｉｏＲａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）もＥＸクロマトグラフィーに関して記載したものと同様のプロトコルで使用した。ＣＨＴの結合緩衝液は２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０に相当し、そして抗体は２０ＣＶに渡って２０〜１６０ｍＭリン酸ナトリウムの勾配により溶離した。
（実施例２）
フローサイトメトリーによる結合の特性化
精製された抗体を用いながらフローサイトメトリーにより結合特異性を試験した。ＣＤ３７発現３００−１９細胞へのｍｕＣＤ３７−３、ｍｕＣＤ３７−１２、ｍｕＣＤ３７−３８、ｍｕＣＤ３７−５０、ｍｕＣＤ３７−５１、ｍｕＣＤ３７−５６及びｍｕＣＤ３７−５７の結合及び親３００−１９細胞への結合が無いことを示すＦＡＣＳヒストグラムを図１及び図２に示す。１００μＬのＦＡＣＳ緩衝液（２％正常ヤギ血清を添加したＲＰＭＩ−１６４０培地）中のＣＤ３７発現３００−１９細胞又は非トランスフェクト３００−１９細胞（試料当たり細胞１ｘ１０５個）の何れかと共に３時間、全てのネズミ抗体をインキュベートした。次に、細胞をペレット化し、洗浄し、１００μＬのＦＩＴＣ−コンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＦＡＣＳ緩衝液中６μｇ／ｍｌ）と共に１時間インキュベートした。細胞を再度ペレット化し、ＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、１％ホルムアルデヒド含有ＰＢＳ２００μＬ中に再懸濁した。試料はＨＴＳマルチウェルサンプラーを用いたＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメトリー又はＦＡＣＳアレイフローサイトメトリーを用いながら獲得し、そしてＣｅｌｌＱｕｅｓｔ Ｐｒｏ（全ての入手元はＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎｄｉｅｇｏ，ＵＳ）を用いて分析した。
ｍｕＣＤ３７−３、ｍｕＣＤ３７−１２、ｍｕＣＤ３７−３８、ｍｕＣＤ３７−５０、ｍｕＣＤ３７−５１、ｍｕＣＤ３７−５６及びｍｕＣＤ３７−５７と共にインキュベートしたＣＤ３７発現３００−１９細胞のＦＡＣＳヒストグラムは蛍光シフトを示したのに対し、親３００−１９細胞は示さなかった。更に又、何れの細胞系統もＦＩＴＣ−コンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＧ抗体のみと共にインキュベートした場合は有意な蛍光シフトは検出されなかった（図１下）。
内因性に発現されたＣＤ３７にも抗体が結合するかどうかを確認するために、ＣＤ３７陽性ＷＳＵ−ＤＬＣＬ−２リンパ腫細胞及びｍｕＣＤ３７−３、ｍｕＣＤ３７−１２、ｍｕＣＤ３７−８、ｍｕＣＤ３７−１０又はｍｕＣＤ３７−１４抗体を用いて結合実験を行った。ＷＳＵ−ＤＬＣＬ−２細胞を種々の濃度のネズミ抗体と共にインキュベートし、そして上記した通りフローサイトメトリー分析用に処理した。データ分析はＣｅｌｌＱｕｅｓｔ Ｐｒｏ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎｄｉｅｇｏ，ＵＳ）を用いて実施し、そして各試料についてＦＬ１（ＭＦ１）に関する平均の蛍光強度をエキスポートし、そして片対数プロットにおいて抗体濃度に対してプロットした（図３）。用量応答曲線を非直線回帰により作成し、そして各抗体の見かけの解離定数（Ｋｄ）に相当する各曲線のＥＣ５０値をＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍｖ４（ＧｒａｐｈＰａｄ ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いながら計算した。試験した全ての抗体に関して蛍光における強いシフトが観察され、Ｋｄ値はｍｕＣＤ３７−３、ｍｕＣＤ３７−８、ｍｕＣＤ３７−１０、ｍｕＣＤ３７−１２又はｍｕＣＤ３７−１４抗体に関してそれぞれ、０．５２ｎＭ、１．７ｎＭ、２．７ｎＭ、１．１ｎＭ、又は０．９２ｎＭに相当している。
同様に、ＣＤ３７陽性ＢＪＡＢリンパ腫細胞を上記したものと同じフローサイトメトリーアッセイに関して使用した場合にも強力な結合が観察された。Ｋｄ値を上記した通り計算した所、ｍｕＣＤ３７−３、ｍｕＣＤ３７−３８、ｍｕＣＤ３７−５０、ｍｕＣＤ３７−５１、ｍｕＣＤ３７−５６及びｍｕＣＤ３７−５７抗体に関してそれぞれ、０．２ｎＭ、０．４ｎＭ、０．６ｎＭ、０．４ｎＭ、及び１ｎＭに相当している。
（実施例３）
ネズミ抗体の前アポトーシス活性
ネズミ抗ＣＤ３７抗体はＲａｍｏｓ及びＲａｊｉリンパ腫細胞系統のアポトーシスを誘導している。アポトーシスの程度はアネキシン−Ｖ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＦＩＴＣコンジュゲートによる、及びＴＯ−ＰＲＯ−３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）による染色の後のフローサイトメトリー分析により計測した。健康正常細胞においては、ホスファチジルセリンは膜２層の内部上で発現され、そして原形質膜の内側から外側のリーフレットへのホスファチジルセリンの通過はアポトーシスの最も早期の検出可能なシグナルの１つである。アネキシン−Ｖは未損傷の細胞の細胞膜２層の外側上のホスファチジルセリンと結合するが内側上では結合しない。したがってアネキシン−Ｖ結合の程度はアポトーシスの誘導のインジケーターとなる。ＴＯ−ＰＲＯ−３はアポトーシスの後期の段階起こるような膜の一体性が損なわれた場合にのみ、原形質膜を通過できる単量体シアニン核酸染色物である。細胞の３集団、即ち：非アポトーシス細胞（アネキシン−Ｖ陰性及びＴＯ−ＰＲＯ−３陰性）、早期アポトーシス細胞（アネキシン−Ｖ陽性及びＴＯ−ＰＲＯ−３陰性）及び壊死細胞又は後期アポトーシス細胞（アネキシン−Ｖ陽性及びＴＯ−ＰＲＯ−３陽性）が２色フローサイトメトリーにおいて識別可能である。
指数的に生育している細胞を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、２ｍＭＬ−グルタミン、及び５０μｇ／ｍｌゲンタマイシンを添加したＲＭＰＩ−１６４０培地（以下、完全ＲＭＰＩ−１６４０培地と称する）中２４穴プレート中に約２ｘ１０−５細胞／ｍＬでプレーティングした。細胞は一般的に、特段の記載が無い限り、完全ＲＭＰＩ−１６４０培地中で生育する。細胞を湿潤５％ＣＯ２インキュベーター中３７℃で２０〜２４時間、抗ＣＤ３７抗体１０ｎＭと共にインキュベートした。次に細胞をペレット化し、５００μＬのＰＢＳで２回洗浄し、１００μＬの結合緩衝液（１０ｍＭＨｅｐｅｓ−ＮａＯＨ、ｐＨ７．４、１４０ｍＭＮａＣｌ、２．５ｍＭＣａＣｌ２）中に再懸濁し、氷上１５分間、アネキシン−Ｖ−ＦＩＴＣ５μＬで染色した。次に１μＭのＴＯ−ＰＲＯ−３を含有する結合緩衝液４００μＬを混合物に添加し、そしてＦＩＴＣ及びＴＯ−ＰＲＯ−３の細胞会合蛍光をフローサイトメトリーにより迅速に計測した。各試料に関して５０００のイベントを収集した。ＴＯ−ＰＲＯ−３の蛍光（ＦＬ４−Ｈ；ｙ軸）及びアネキシン−Ｖ−ＦＩＴＣの蛍光（ＦＬ１−Ｈ：ｘ軸）のドットプロットをＢＤ ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウエアを用いて作成した。
これらのプロットから各試料に関してアネキシン−Ｖ陽性細胞（ＴＯ−ＰＲＯ−３陽性及び陰性細胞の両方を包含する）のパーセントを求め、そして、Ｒａｍｏｓ細胞に関するものを図４に示した。本発明者等の抗体スクリーンから単離された数種の抗体をリツキシマブとの比較において前アポトーシス活性について試験した。意外にも、単離されたネズミ抗ＣＤ３７抗体の一部、例えばｍｕＣＤ３７−３及びｍｕＣＤ３７−１２は極めて強力な前アポトーシス活性を示した。ｍｕＣＤ３７−３に曝露されたＲａｍｏｓ細胞の約３８％及びｍｕＣＤ３７−１２に曝露されたＲａｍｏｓ細胞の４６％がアネキシン−Ｖ陽性であった。一方、抗ＣＤ３７抗体リツキシマブの投与は僅か１３％のアネキシン−Ｖ陽性をもたらし、未投与対照試料は５％のアネキシン−Ｖ陽性細胞を含有していた。単離されたネズミ抗ＣＤ３７抗体の数種は前アポトーシス活性を示さなかった。例えば、ｍｕＣＤ３７−８、ｍｕＣＤ３７−１０又はｍｕＣＤ３７−１４のＲａｍｏｓ細胞への投与は未投与細胞と比較してアネキシン−Ｖ陽性のパーセントを殆ど、又は全く増大させなかった。これは図３に示す通りそれらのＣＤ３７への結合親和性が同等程度であったことと矛盾している。
追加の抗体を単離し、Ｒａｍｏｓ細胞においてアポトーシスを誘導するそれらの能力についてスクリーニングした。高い親和性でＣＤ３７に結合した多くの単離された抗体のうち、僅か一部のみが前アポトーシス活性を有していた。アネキシン−Ｖアッセイの結果を図４Ｂに示す。ネズミ抗体ｍｕＣＤ３７−３８、ｍｕＣＤ３７−５０、ｍｕＣＤ３７−５１、ｍｕＣＤ３７−５６及びｍｕＣＤ３７−５７はアポトーシスを誘導することができ、そして未投与対照試料における５％と比較して、３８〜４５％のアネキシン−Ｖ陽性Ｒａｍｏｓ細胞をもたらした。前のアッセイと同様に、抗ＣＤ３７抗体リツキシマブの投与は僅か１８％のみのアネキシン−Ｖ陽性細胞をもたらした。
更に又、ネズミ抗体をそれらがＲａｊｉリンパ腫細胞においてアポトーシスを湯どうする能力に関して試験した。Ｒａｍｏｓ細胞において観察されたとおり、高い親和性でＣＤ３７に結合した多くの単離された抗体のうち、僅か一部のみが前アポトーシス活性を有していた。ｍｕＣＤ３７−３又はｍｕＣＤ３７−１２の投与はそれぞれ３６％又は４９％のアネキシン−Ｖ陽性細胞をもたらした。一方、抗ＣＤ３７抗体リツキシマブは僅か２０％のアネキシン−Ｖ陽性細胞をもたらし、未投与対照試料は４％のアネキシン−Ｖ陽性細胞を含有していた。
同様に、ｍｕＣＤ３７−３、ｍｕＣＤ３７−３８、ｍｕＣＤ３７−５０、ｍｕＣＤ３７−５１、ｍｕＣＤ３７−５６又はｍｕＣＤ３７−５７を投与したＲａｊｉ細胞の約６０％がアネキシン−Ｖ陽性細胞であったのに対し、未投与細胞では１５％であった。
（実施例４）
増殖アッセイ
抗ＣＤ３７抗体が細胞の成育を阻害する能力をインビトロの細胞傷害アッセイを用いて計測した。完全ＲＰＭＩ培地（ＲＰＭＩ−１６４０、１０％ウシ胎児血清、２ｍＭグルタミン、１％ペニシリン−ストレプトマイシン、全試薬入手元Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）１００μＬ中ウェル当たり５０００細胞で標的細胞をプレーティングした。３倍連続希釈により完全ＲＰＭＩ培地中に抗体を添加し、そして１００μＬをウェル当たり添加した。最終濃度は典型的には３ｘ１０−８Ｍ〜４．６ｘ１０−１２Ｍとなった。細胞を４〜５日間、湿潤５％ＣＯ２インキュベーター中３７℃においてインキュベートした。残存細胞の生存性は比色ＷＳＴ−８アッセイ（DojindoMolecular Technologies, Inc., Rockville, MD,US）により測定した。ＷＳＴ−８は生細胞中デヒドロゲナーゼにより還元されて組織培養基中可溶なオレンジ色のホルマザン生成物となる。生成されたホルマザンの量は生細胞数に直接比例する。ＷＳＴ−８を更に２〜４時間、湿潤５％ＣＯ２インキュベーター中３７℃においてインキュベートした。マルチウェルプレートリーダー中４５０ｎｍにおける吸光度（Ａ４５０）を計測することによりプレートを分析した。培地及びＷＳＴ−８のみを有するウェルのバックグラウンドＡ４５０を全ての数値から差し引いた。未投与細胞の入ったウェルの平均値で各投与試料値を割ることによりパーセント生存性を計算した。パーセント生存性＝１００＊（Ａ４５０投与試料−Ａ４５０バックグラウンド）／（Ａ４５０未投与試料−Ａ４５０バックグラウンド）。各投与に関し片対数プロットにおいて抗体濃度に対してパーセント生存性値をプロットした。
ネズミＣＤ３７抗体及びＳＵ−ＤＨＬ−４リンパ腫細胞を用いた典型的な増殖アッセイの結果を図５に示す。数種のネズミ抗体が実質的に、そして用量依存性の態様においてＳＵ−ＤＨＬ−４細胞の増殖を阻害することができたのに対し、他のものはこのような作用を有していなかった。例えばｍｕＣＤ３７−３の投与は試験した最高抗体濃度において３４％まで細胞生存性を低減し、ＥＣ５０は０．１７ｎＭであった。同様にｍｕＣＤ３７−３８の投与は試験した最高抗体濃度において２５％まで細胞生存性を低減し、ＥＣ５０は０．１９ｎＭであった。同様にｍｕＣＤ３７−５０及びｍｕＣＤ３７−５１の投与は試験した最高抗体濃度において３８％まで細胞生存性を低減し、ＥＣ５０はそれぞれ０．２５ｎＭ又は０．５ｎＭであった。一方例えばＣＤ３７−１６の投与は用量依存的態様において細胞生存性を低減しなかった。
（実施例５）
ＣＤ３７−３抗体のＶＬ及びＶＨ領域のクローニング及び配列決定
製造元のプロトコルに従ってＲＮｅａｓｙキット（ＱＩＡｇｅｎ）を用いながらＣＤ３７−３ハイブリドーマ５ｘ１０６細胞から全細胞ＲＮＡを調製した。その後ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩｃＤＮＡ合成キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて全ＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。
ハイブリドーマ細胞から誘導したｃＤＮＡ上の第１ラウンドの変性ＰＣＲ反応のための操作法はWang等、((2000) J ImmunolMethods.233:167-77) and Co等、（（１９９２）ＪＩｍｍｕｎｏｌ．１４８：１１４９−５４）に記載の方法に基づいた。ＶＨ配列は以下の変性プライマー：ＥｃｏＭＨ１ＣＴＴＣＣＧＧＡＡＴＴＣＳＡＲＧＴＮＭＡＧＣＴＧＳＡＧＳＡＧＴＣ（配列番号１７１），ＥｃｏＭＨ２ＣＴＴＣＣＧＧＡＡＴＴＣＳＡＲＧＴＮＭＡＧＣＴＧＳＡＧＳＡＧＴＣＷＧＧ（配列番号１７２）及びＢａｍＩｇＧ１ＧＧＡＧＧＡＴＣＣＡＴＡＧＡＣＡＧＡＴＧＧＧＧＧＴＧＴＣＧＴＴＴＴＧＧＣ（配列番号１７３）を用いたＰＣＲにより増幅した。ＶＬ配列は以下の変性プライマー：ＳａｃＩＭＫＧＧＡＧＣＴＣＧＡＹＡＴＴＧＴＧＭＴＳＡＣＭＣＡＲＷＣＴＭＣＡ（配列番号１７４）及びＨｉｎｄＫＬＴＡＴＡＧＡＧＣＴＣＡＡＧＣＴＴＧＧＡＴＧＧＴＧＧＧＡＡＧＡＴＧＧＡＴＡＣＡＧＴＴＧＧＴＧＣ（配列番号１７５）を用いたＰＣＲにより増幅した。（混合塩基は以下の通り、即ち：Ｎ＝Ｇ＋Ａ＋Ｔ＋Ｃ，Ｓ＝Ｇ＋Ｃ，Ｙ＝Ｃ＋Ｔ，Ｍ＝Ａ＋Ｃ，Ｒ＝Ａ＋Ｇ，Ｗ＝Ａ＋Ｔと定義した）。次にＰＣＲ反応混合物を１％低融点アガロースゲル上で泳動させ、３００〜４００ｂｐバンドを切り出し、ＺｙｍｏＤＮＡ未にカラムを用いて精製し、そしてＡｇｅｎｃｏｕｒｔ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ｆｏｒ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇに送付した。それぞれの５’及び３’ＰＣＲプライマーを配列決定プライマーとして使用することにより両方の方向から可変領域ｃＤＮＡを形成した。ＶＨ及びＶＬ領域のアミノ酸配列はＤＮＡ配列決定の結果から予測した。
ＶＬ及びＶＨｃＤＮＡ配列をクローニングするために使用した変性プライマーは５’末端の配列を改変するため、完全な配列を確認するためには追加的な配列決定作業が必要であった。予備ｃＤＮＡ配列を使用しながら、抗体配列の誘導元のネズミ生殖細胞系統の配列に関してＮＣＢＩのＩｇＢｌａｓｔサイト（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/）を検索した。次にＰＣＲプライマーにより改変されない完全な可変領域句ＤＮＡ配列を新しいＰＣＲ反応がもたらすように、ネズミ抗体の生殖細胞系統連結リーダー配列にアニーリングするようにそのＰＣＲプライマーを設計した。ＰＣＲ反応、バンドの精製及び配列決定は上記したとおり実施した。
配列確認のための質量測定
完全長抗体ｃＤＮＡ配列を得るために、可変領域に関するｃＤＮＡ配列情報を生殖細胞系統定常領域配列に組み合わせた。次に重鎖及び軽鎖の分子量を計算し、ネズミＣＤ３７−３抗体のＬＣ／ＭＳ分析で得られた分子量と比較した。分子量計測はＣＤ３７−３の軽鎖及び重鎖の両方に関するｃＤＮＡ配列と合致している。
キメラ化
軽鎖可変領域の可変配列をｐｃｈＣＤ３７−３ＬＣＺプラスミド中のＥｃｏＲＩ及びＢｓｉＷＩ部位にクローニングする。重鎖可変領域はｐｃｈＣＤ３７−３ＨＣＮプラスミドのＨｉｎｄＩＩＩ及びＡｐａ１部位にクローニングする。等価なプラスミドをｃｈＣＤ３７−１２に関して構築した。これらのプラスミドを用いて、標準的なリン酸カルシウム法（BDBiosciences,CalPhos Mammalian Transfection Kit, Cat # 631312）によりＨＥＫ-２９３Ｔ細胞中でキメラ抗体を発現した。上澄みは上記した標準的プロテインＡクロマトグラフィー操作法を用いて精製したが、カルボキシメチル（ＣＭ）ファーストフローイオン交換（ＩＥＸ）樹脂（ＧＥ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ）及び１０ｍＭリン酸カリウム、１０ｍＭ塩化ナトリウム結合緩衝液（ｐＨ７．５）又は上記した代替のＣＨＴ法の何れかを用いた最終精製クロマトグラフィー工程を実施した。
（実施例６）
抗体のヒト化
例えば参照により全体が本明細書に組み込まれるRoguska等、Proc. Natl. Acad. Sci.,USA, 91(3):969-973(1994) 及びRoguska等、ProteinEng. 9(10):895-904 (1996)に記載のリサーフィシング方法に従ってＣＤ３７−３及びｈｕＣＤ３７−５０抗体をヒト化した。リサーフィシングでは一般的に軽鎖及び重鎖の両方における可変領域フレームワーク表面残基の識別及びそれらをヒト等価物で置き換えることを行う。ネズミＣＤＲはリサーフィシングされた抗体において温存される。ＣＤ３７−３及びＣＤ３７−５０の例示されるＣＤＲは表１に示す通りに定義される。リサーフィシングのために使用される重鎖ＣＤＲ２の定義に加えて、表にはネズミ及びヒトのＣＤ３７−３及びＣＤ３７−５０の両方に関する例示されるＫａｂａｔ定義重鎖ＣＤＲ２が示されている。下線を付した配列はリサーフィシングのためのＣＤＲとは考えられないＫａｂａｔの重鎖ＣＤＲ２の部分をマークしている。
リサーフィシングに関して定義されたＣＤ３７−３及びＣＤ７−５０の軽鎖及び重鎖のＣＤＲを表１１に例示として示す。ネズミＣＤ３７−５０軽鎖ＣＤＲ２におけるリジン５３はＬＣＣＤＲ２の両方のバージョンが得られるようにヒト化ＣＤ３７−５０においてアスパラギンで置き換えた。重鎖ＣＤＲ２に関するＫａｂａｔの定義は、ネズミ及びヒトのＣＤ３７−３の両方に関しても与えられる。下線を付した配列はリサーフィシングのためのＣＤＲとは考えられないＫａｂａｔの重鎖ＣＤＲ２の部分をマークしている。
表面残基部分はその相対的アクセス性が３０％以上の何れかの位置として定義される（Pedersen J.T. et. Al, J. Mol.Biol.1994; 235: 959-973）。次に表面残基をヒト生殖細胞系統表面配列とアラインすることにより最も相同なヒト表面配列を識別する。ＣＤ３７−３に関しては、置き換え表面として使用したヒト生殖細胞系統配列はＶＬ及びＶＨに関してそれぞれＩＧＫＶ１／ＯＲ２−０＊０１及びＩＧＨＶ４−３０＊０９とした。ＣＤ３７−５０に関しては、置き換え表面として使用したヒト生殖細胞系統配列はＶＬ及びＶＨに関してそれぞれＩＧＫＶ３／ＯＲ２−２６８＊０１及びＩＧＨＶ４−３１＊０３とした。図６から明らかな通り、合計で、軽鎖で７個の表面残基及び重鎖で７個がＣＤ３７−３におけるヒト対応物で置き換えられた。ＣＤ３７−５０に関する図７においてわかるとおり、ヒト対応物で置き換えられた全表面残基はＶＨ及びＶＨにおいてそれぞれ７個及び５個であった。ＣＤ３７−３においては、重鎖残基６１はＣＤＲ−Ｈ２に近接しており、そしてヒト残基プロリンへのその置換は低減した結合親和性をもたらす場合があるため、保持されているネズミセリン残基を用いて第１のリサーフィシングされたバージョンを形成した。これらの抗体は細胞傷害コンジュゲートとして試験中であるため、ＣＤ３７−５０軽鎖ＣＤＲ２リジン５３をアスパラギンで置き換えることによりリジンコンジュゲートが結合親和性に影響するという懸念を回避した。図８は軽鎖及び重鎖の両方のＣＤ３７−３及びＣＤ３７−５０可変ドメインに関するリサーフィシングされた配列の、それらのネズミ対応物とのアライメントを示す。
ｈｕＣＤ３７−３抗体の組み換え発現
ｈｕＣＤ３７−３及びＣＤ３７−５０に関する可変領域配列をコドン最適化し、Ｂｌｕｅ Ｈｅｒｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙにより合成した。配列は単鎖哺乳類発現プラスミドにおける該当する定常配列とインフレームにクローニングするための制限酵素部位によりフランキングされている。軽鎖可変領域をｐＡｂＫＺｅｏプラスミド中のＥｃｏＲＩ及びＢｓｉＷＩ部位にクローニングする。重鎖可変領域はｐＡｂＧ１ＮｅｏプラスミドのＨｉｎｄＩＩＩ及びＡｐａ１部位にクローニングする。これらのプラスミドを用いて、一過性又は安定な哺乳類細胞トランスフェクションにおいて組み換え抗体を発現させることができる。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞において組み換え抗体を発現するための一過性のトランスフェクションは変更されたＰＥＩ操作法（Durocher,Y.等、NucleicAcids Res. 30:E9 (2002)）を用いて実施した。上澄みはキメラ化抗体に関して上記した通り標準的操作法を用いながらプロテインＡ及び最終精製クロマトグラフィー工程により精製した。
ＴＲＵ−０１６の発現
単離された抗ＣＤ３７抗体の活性を比較するために、以前に識別されている抗ＣＤ３７抗体をクローニングして発現させた。抗ＣＤ３７ＳＭＩＰのＤＮＡ配列は配列番号５１を用いてＵＳ２００７／００５９３０６から引き出した。ｐＡｂＧ１Ｎｅｏ哺乳類発現プラスミド中へのクローニングのため、配列はＨｉｎｄＩＩＩ及びＸｈｏ１制限酵素部位によりフランキングされている。発現及び精製はｈｕＣＤ３７−３に関して上記した通り実施した。
（実施例７）
キメラ抗体の結合親和性
キメラ抗体ｃｈＣＤ３７−３及びｃｈＣＤ３７−１２を、それらのネズミ対応物との比較においてＲａｍｏｓ細胞へのそれらの結合親和性についてアッセイした。実施例２に記載した通り、２次ＦＩＴＣコンジュゲートヤギ抗ネズミ及び抗ヒト抗体を用いながら、Ｒａｍｏｓ細胞及びｍｕＣＤ３７−３、ｃｈＣＤ３７−３、ｍｕＣＤ３７−１２及びｃｈＣＤ３７−１２抗体を用いたフローサイトメトリー結合アッセイを実施し、そして分析した。図９Ａは各抗体に関する非直線回帰により作成した用量応答曲線を示す。各抗体の見かけの解離定数（Ｋｄ）の値はＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍｖ４（ＧｒａｐｈＰａｄ ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いながら計算した。ｍｕＣＤ３７−３、ｃｈＣＤ３７−３、ｍｕＣＤ３７−１２及びｃｈＣＤ３７−１２のＫｄはそれぞれ０．４ｎＭ、０．８ｎＭ、０．８ｎＭ及び１．２ｎＭに相当しているため、何れの抗体の結合親和性にもキメラ化が大きく影響しなかったことがわかった。
ｈｕＣＤ３７−３ｖ１．０及びｈｕＣＤ３７−３ｖ１．０１の結合親和性
ＢＪＡＢ細胞を及び競合的結合フォーマット用いたフローサイトメトリー結合アッセイを用いてキメラ及びヒト化バージョンのＣＤ３７−３の結合親和性を評価した。ＢＪＡＢ細胞を１ｎＭ濃度のＰＥ標識ｍｕＣＤ３７−３抗体と共にインキュベートし、種々の量のｍｕＣＤ３７−３、ｃｈＣＤ３７−３、ｈｕＣＤ３７−３ｖ１．０又はｈｕＣＤ３７−３ｖ１．０１を添加することにより競合を計測した。試料を４℃で３時間インキュベートした。次に、細胞をペレット化し、ＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、１％ホルムアルデヒド含有ＰＢＳ２００μＬ中に再懸濁した。試料はＨＴＳマルチウェルサンプラーを用いたＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメトリーを用いながら獲得し、そしてＣｅｌｌＱｕｅｓｔ Ｐｒｏ（全ての入手元はＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎｄｉｅｇｏ，ＵＳ）を用いて分析した。得られた平均ＰＥ蛍光を片対数プロットで使用した競合抗体の量に対してプロットした。図９Ｂは各抗体の非直線回帰により形成した用量応答曲線を示す。各抗体の見かけの解離定数（Ｋｄ）の値はＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍｖ４（ＧｒａｐｈＰａｄ ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いながら計算した。全てのバージョンがネズミ親抗体との結合に関して等しく良好に競合しているため、ＣＤ３７−３の結合親和性にはキメラ化又はヒト化が影響しないと観察された。ｍｕＣＤ３７−３、ｃｈＣＤ３７−３、ｈｕＣＤ３７−３ｖ１．０又はｈｕＣＤ３７−３ｖ１．０１の競合的結合のＥＣ５０はそれぞれ０．８ｎＭ、０．７ｎＭ、１ｎＭ及び０．６ｎＭに相当している。
ヒト化抗体の結合親和性
ヒト化抗体ｈｕＣＤ３７−３８、ｈｕＣＤ３７−５０、ｈｕＣＤ３７−５１、ｈｕＣＤ３７−５６及びｃｈＣＤ３７−５８を、それらのネズミ対応物との比較においてＢＪＡＢ細胞へのそれらの結合親和性についてアッセイした。フローサイトメトリー結合試験を２次ＦＩＴＣコンジュゲートヤギ抗ネズミ及び抗ヒト抗体を用いながら実施し、実施例２に記載の通り分析し、そして各抗体に関する非直線回帰により用量応答曲線を作成した。各抗体の見かけの解離定数（Ｋｄ）の値はＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍｖ４（ＧｒａｐｈＰａｄ ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いながら計算した。ヒト化は何れの抗体の結合親和性にも大きく影響しなかったと観察された。ｍｕＣＤ３７−３及びｈｕＣＤ３７−３のＫｄは０．２ｎＭに相当し、ｍｕＣＤ３７−３８及びｈｕＣＤ３７−３８のＫｄはそれぞれ０．４ｎＭ及び０．３ｎＭに相当した。同様に、ｍｕＣＤ３７−５０及びｈｕＣＤ３７−５０のＫｄはそれぞれ０．６ｎＭ及び０．２ｎＭに相当し、ｍｕＣＤ３７−５１及びｈｕＣＤ３７−５１のＫｄはそれぞれ０．６ｎＭ及び０．８ｎＭに相当した。最後にｍｕＣＤ３７−５６及びｈｕＣＤ３７−５６のＫｄはそれぞれ０．４ｎＭ及び０．２ｎＭに相当し、ｍｕＣＤ３７−５７及びｈｕＣＤ３７−５７のＫｄはそれぞれ１．０ｎＭ及び０．３ｎＭに相当した。
（実施例８）
マカクＣＤ３７の発現
マカクＣＤ３７のＣＤ３７ＡＡ配列をＧｅｎｂａｎｋから入手した（ＧＩ：７１８７１８）。配列をコドン最適化し、Ｂｌｕｅ Ｈｅｒｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙにより合成した。マカクＣＤ３７の発現を可能にするＸｂａＩ及びＢａｍＨＩ制限部位によりフランキングされたマカク由来の全ＣＤ３７コーディング配列（ＣＤＳ）を含有する発現プラスミドｐＳＲａ−ＣＤ３７ｍａｃを構築した。３００−１９細胞、即ちＢａｌｂ／ｃマウスから誘導した前Ｂ細胞系統（M.G.Reth等、1985, Nature, 317: 353-355）をこの
発現プラスミドでトランスフェクトすることにより、細胞表面上にマカクＣＤ３７を安定に発現させた。
マカクＣＤ３７へのネズミ抗体の結合親和性
ネズミｍｕＣＤ３７−３、ｍｕＣＤ３７−１２、ｍｕＣＤ３７−３８、ｍｕＣＤ３７−５０、ｍｕＣＤ３７−５１、ｍｕＣＤ３７−５６及びｍｕＣＤ３７−５７を、マカクＣＤ３７を発現する３００−１９／ＣＤ３７ｍａｃ細胞に結合するそれらの能力に関してアッセイした。フローサイトメトリー結合試験を２次ＦＩＴＣコンジュゲートヤギ抗ネズミ又はヤギ抗ヒト抗体を用いながら実施し、実施例２に記載の通り分析した。結合を以前に記載した抗ＣＤ３７抗体ＷＲ１７及び抗ＣＤ３７ＳＭＩＰＴＲＵ−０１６と比較した。図１０Ａから明らかな通り、数種の単離された抗ＣＤ３７抗体、ｍｕＣＤ３７−３８、ｈｕＣＤ３７−５０、ｍｕＣＤ３７−５１、ｍｕＣＤ３７−５６及びｍｕＣＤ３７−５７はマカク誘導ＣＤ３７抗原に結合することができる。一方、ｍｕＣＤ３７−３、ｍｕＣＤ３７−１２、以前に記載した抗ＣＤ３７抗体ＷＲ１７及び抗ＣＤ３７ＳＭＩＰＴＲＵ−０１６はマカク誘導ＣＤ３７抗原に結合することが不可能である。
マカクＣＤ３７へのヒト化抗体の結合親和性
ヒト化抗体ｈｕＣＤ３７−３８、ｈｕＣＤ３７−５０、ｈｕＣＤ３７−５１、ｈｕＣＤ３７−５６及びｈｕＣＤ３７−５７を、マカクＣＤ３７を発現する３００−１９／ＣＤ３７ｍａｃ細胞に結合するそれらの能力に関してアッセイした。フローサイトメトリー結合試験を２次ＦＩＴＣコンジュゲートヤギ抗ヒト抗体を用いながら実施し、実施例２に記載の通り分析し、そして各抗体に関する非直線回帰により用量応答曲線を作成した。各抗体の見かけの解離定数（Ｋｄ）の値はＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍｖ４（ＧｒａｐｈＰａｄ ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いながら計算した。図１０Ｂから明らかな通り、数種の単離されたヒト化抗体はマカクＣＤ３７に結合するが、ｈｕＣＤ３７−３は結合しない。ｈｕＣＤ３７−３８、ｈｕＣＤ３７−５０、ｈｕＣＤ３７−５１、ｈｕＣＤ３７−５６及びｈｕＣＤ３７−５７に関するＫｄ値はそれぞれ、１．１ｎＭ、１．８ｎＭ、１４ｎＭ、５ｎＭ、及び２ｎＭに相当する。従って、ヒト化は単離された抗体の結合特異性には影響しない。
（実施例９）
キメラ及びヒト化抗体の前アポトーシス活性
キメラ及びヒト化抗体の前アポトーシス活性をＲａｍｏｓ細胞において評価した。細胞を１０ｎＭ濃度の抗体又はｈｕＩｇＧアイソタイプ対照抗体と共に２０時間インキュベートした後に、アネキシン−Ｖ−ＦＩＴＣおよびＴＯ−ＰＲＯ−３染色及びフローサイトメトリー分析を行った。ＣｈＣＤ３７−１２はｍｕＣＤ３７−１２の強力な前アポトーシス活性を保持していた。約４０％のＲａｍｏｓ細胞がｍｕＣＤ３７−１２又はｃｈＣＤ３７−１２の何れかの投与後アネキシン−Ｖ陽性だったのに対し未投与対照細胞では４％であった。同様に約４０％のＲａｍｏｓ細胞がｈｕＣＤ３７−３、ｈｕＣＤ３７−３８、ｈｕＣＤ３７−５０、ｈｕＣＤ３７−５１、ｈｕＣＤ３７−５６及びｈｕＣＤ３７−５７抗体の投与後アネキシン−Ｖ陽性だったのに対し、アイソタイプ対照投与又は未投与の細胞では４％であった。一方、抗ＣＤ３７抗体リツキシマブの投与は僅か１３％のアネキシン陽性細胞をもたらした。この結果は本発明において単離したネズミ抗ＣＤ３７抗体の強力な前アポトーシス活性は、それらから誘導されたキメラ又はヒト化抗体により保持されていることを示している。従って、抗ＣＤ３７抗体のこのグループのユニークな機能的特性、即ち架橋剤非存在下の強力な前アポトーシス活性はキメラ化又はヒト化により不の影響を受けない。
ｈｕＣＤ３７−３及びＴＲＵ−０１６の前アポトーシス活性
Ｒａｍｏｓ及びＲａｊｉリンパ腫細胞に対するｈｕＣＤ３７−３の前アポトーシス活性を抗ＣＤ３７ＳＭＩＰＴＲＵ−０１６と比較した。ＴＲＵ−０１６は二次抗体に交差結合しない限り前アポトーシス活性を有さない化合物として報告されている。例示される抗ＣＤ３７抗体ｈｕＣＤ３７−３及びｃｈＣＤ３７−３８は両方のリンパ腫細胞系統に対して遥かに強力な前アポトーシス活性を有することが明らかになっている。ｈｕＣＤ３７−３又はｃｈＣＤ３７−３８の投与は４０％又は４９％のアネキシン−Ｖ陽性Ｒａｍｏｓ細胞をもたらしたのに対し、未投与対照細胞では３％であった。リツキシマブ投与は僅か１５％のみのアネキシン−Ｖ陽性Ｒａｍｏｓ細胞をもたらした。一方ＴＲＵ−０１６投与はアネキシン陽性Ｒａｍｏｓ細胞のパーセンテージを増大させなかった。同様にｈｕＣＤ３７−３又はｃｈＣＤ３７−３８の投与は３４％又は３０％のアネキシン−Ｖ陽性Ｒａｊｉ細胞をもたらしたが、未投与対照細胞では７％であった。リツキシマブ投与は僅か１９％のアネキシン−Ｖ陽性Ｒａｊｉ細胞をもたらした。一方ＴＲＵ−０１６投与はアネキシン陽性Ｒａｍｏｓ細胞のパーセンテージを増大させなかった。
ヒト化抗体の前アポトーシス活性の用量応答
種々の量の各抗体を２０時間Ｒａｍｏｓ細胞と共にインキュベートした後にアネキシン−Ｖ−ＦＩＴＣおよびＴＯ−ＰＲＯ−３染色及びフローサイトメトリー分析を行った。アネキシン−Ｖ陽性細胞のパーセンテージを片対数プロットで抗体濃度に対してプロットし、そして非直線回帰分析を用いながらフィットした曲線からＥＣ５０値を計算した。全てのヒト化抗体は強力な前アポトーシス活性を有することが観察され、アネキシン−Ｖ陽性細胞の最大パーセントは少なくとも４０％であった。図１１。この活性に関するＥＣ５０は、ｈｕＣＤ３７−３、ｈｕＣＤ３７−３８及びｈｕＣＤ３７−５０についてそれぞれ０．０８．０．０８及び０．１１ｎＭに相当する。更に、この活性に関するＥＣ５０は、ｈｕＣＤ３７−５１、ｈｕＣＤ３７−５６及びｈｕＣＤ３７−５７についてそれぞれ０．４１、０．５７及び１．０１ｎＭに相当する。一方、抗ＣＤ２０抗体リツキシマブの投与は僅か１５％のアネキシン−Ｖ陽性細胞の最大パーセンテージをもたらし、これに対し、アイソタイプ対照抗体を投与された細胞では４％であった。
（実施例１０）
キメラ及びヒト化抗ＣＤ３７抗体の増殖アッセイ
キメラ及びヒト化抗ＣＤ３７抗体が細胞生育を阻害する能力を実施例４に記載した通りインビトロの細胞傷害アッセイを用いて計測した。ＳＵ−ＤＨＬ−４及びＤＯＨＨ−２リンパ腫細胞を用いた典型的な増殖アッセイの結果を図１２に示す。全ての抗体が実質的に、そして用量依存性の態様においてＳＵ−ＤＨＬ−４細胞の増殖を阻害できたことがわかる。例えばｍｕＣＤ３７−３の投与はＳＵ−ＤＨＬ−４細胞の生存性を３５％まで低減し、ＥＣ５０は０．０７ｎＭであった。同様にｃｈＣＤ３７−３、ｈｕＣＤ３７−３ｖ１．０又はｈｕＣＤ３７−３ｖ１．０１の投与は試験した最高抗体濃度において約３０％までＳＵ−ＤＨＬ−４細胞の生存性を低減し、ＥＣ５０はそれぞれ０．０３ｎＭ、０．０６ｎＭ、又は０．０３ｎＭであった。同様に全ての抗体が実質的に、そして用量依存性の態様においてＤＯＨＨ−２濾胞性リンパ腫の増殖を阻害することができた。例えば、ＣＤ３７−３投与は４５％までＤＯＨＨ−２細胞の生存性を低減し、ＥＣ５０は０．０５ｎＭであった。同様にｃｈＣＤ３７−３、ｈｕＣＤ３７−３ｖ１．０又はｈｕＣＤ３７−３ｖ１．０１の投与は試験した約３５％までＤＯＨＨ−２細胞の生存性を低減し、ＥＣ５０はそれぞれ０．０６ｎＭ、０．０７ｎＭ、又は０．０５ｎＭであった。この結果は種々のバージョンのＣＤ３７−３抗体がキメラ化又はヒト化により影響されない同様の抗増殖活性を有することを示している。
別のヒト化抗ＣＤ３７抗体を同様のインビトロの細胞傷害アッセイにおいて試験した。試験した全てのヒト化抗体が実質的に、そして用量依存性の態様においてＳＵ−ＤＨＬ−４細胞の増殖を阻害できた。例えばｈｕＣＤ３７−３８の投与はＳＵ−ＤＨＬ−４細胞の生存性を２４％まで低減し、ＥＣ５０は０．４２ｎＭであり、ｈｕＣＤ３７−５０の投与はＳＵ−ＤＨＬ−４細胞の生存性を３１％まで低減し、ＥＣ５０は０．３９ｎＭであった。一方抗ＣＤ３７抗体リツキシマブの投与はＳＵ−ＤＨＬ−４細胞の生存性を３５％まで低減し、ＥＣ５０は１．６ｎＭであった。更に、ｈｕＣＤ３７−５１及びｈｕＣＤ３７−５６の投与はＳＵ−ＤＨＬ−４細胞の生存性を２４％まで低減し、ＥＣ５０はそれぞれ０．６０ｎＭ及び０．６８ｎＭであった。更にｈｕＣＤ３７−５７の投与は３１％までＳＵ−ＤＨＬ−４細胞の生存性を低減し、ＥＣ５０は０．４２ｎＭであった。アイソタイプ対照抗体の投与はＳＵ−ＤＨＬ−４細胞の生存性に影響しなかった。
他の抗体と比較した場合のｈｕＣＤ３７−３の抗増殖活性
抗ＣＤ３７抗体の抗増殖活性を更に特性化するために、本発明者等は例示されるｈｕＣＤ３７−３抗体の作用を抗ＣＤ３７ＳＭＩＰＴＲＵ−０１６化合物のものと比較した。腫瘍マイクロアレイを用いた免疫化学によれば、ＮＨＬのサブタイプにおいてＣＤ３７及びＣＤ２０は同様の発現パターン及びを示したことが確認された。以下の表１２を参照できる。即ち抗ＣＤ３７抗体リツキシマブとも比較した。細胞系統のパネルはＧｒａｎｔａ−５１９、ＳＵ−ＤＨＬ−４、Ｎａｍａｌｗａ及びＤａｕｄｉリンパ腫細胞を包含している。図１３．
全ての細胞においてｈｕＣＤ３７−３投与は用量依存的な態様において細胞生存性の低減をもたらした。例えばｈｕＣＤ３７−３の投与は約３７％までＧａｎｔａ−５１９の生存性を低減し、ＥＣ５０は０．０６２ｎＭであった。リツキシマブの投与は約４７％までＧａｎｔａ−５１９の生存性を低減し、ＥＣ５０は０．３６ｎＭであった。ｈｕＣＤ３７−３の投与は約１７％までＳＵ−ＤＨＬ−４の生存性を低減し、ＥＣ５０は０．０５３ｎＭであった。リツキシマブの投与は約２０％までＳＵ−ＤＨＬ−４細胞の生存性を低減し、ＥＣ５０は０．２ｎＭであった。これとは対照的に、ＴＲＵ−０１６の投与は有意な程度にまでは、そして用量依存的な態様においても、Ｇｒａｎｔａ−５１９及びＳＵ−ＤＨＬ−４細胞の生存性を低減しなかった。別の例においては、ｈｕＣＤ３７−３の投与は約４７％までＮａｍａｌｗａ細胞の生存性を低減し、ＥＣ５０は０．１ｎＭであり、そして約６８％までＤａｕｄｉ細胞の生存性を低減し、ＥＣ５０は０．２５ｎＭであった。リツキシマブの投与はＮａｍａｌｗａ細胞に対しては作用を有さなかったが、Ｄａｕｄｉ細胞の生存性は約６９％まで低減し、ＥＣ５０は２．６ｎＭであった。これとは対照的に、ＴＲＵ−０１６の投与は有意な程度にまでは、そして用量依存的な態様においても、Ｎａｍａｌａ及びＤａｕｄｉ細胞の生存性を低減しなかった。最後にｈｕＣＤ３７−３の投与は約５３％までＲａｍｏｓ細胞の生存性を低減し、ＥＣ５０は０．０８ｎＭであり、そしてＴＲＵ−０１６及びリツキシマブの何れもＲａｍｏｓ細胞の生存性には全く作用しなかった。この結果は単離された抗ＣＤ３７抗体の抗増殖活性のユニークさを過小評価している。
（実施例１１）
ＣＤ３７抗体のＣＤＣ活性
キメラ及びヒト化抗ＣＤ３７抗体の補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）活性を評価するために、公開されている方法（Gazzano-Santoro H, JImmunolMethods. 1997 202(2):163-71
）に従って細胞系試験を実施した。抗体をＲＨＢＰ（ＲＰＭＩ−１６４０、２０ｍＭＨＥＰＥＳ、０．１％ＢＳＡ、１％ペニシリン−ストレプトマイシン）培地中典型的には５μｇ／ｍＬ（＝３．３ｘ１０−８Ｍ）から２．３ｎｇ／ｍＬ（＝１．５ｘ１０−１１Ｍ）の範囲の種々の濃度において平底９６穴組織培養プレートに５０μＬ／ウェルで２連に分注した。標的細胞をウェル当たり１００μＬのＲＨＢＰ中、５ｘ１０４細胞で抗体に添加した。凍結乾燥したヒト補体（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＵＳ）をバイアル当たり滅菌精製水１ｍＬを用いて再建し、そして使用直前にＲＨＢＰ培地で２０％保存液となるように５倍希釈した。補体溶液５０μＬ／ウェルを終濃度５％となるように各ウェルに添加した。プレートを５％ＣＯ２湿潤インキュベーター中３７℃で２時間インキュベートすることにより補体媒介溶解を可能とした。このインキュベーション時間の後、残存細胞の生存性を計測するためにＡｌａｍａｒ Ｂｌｕｅ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を終濃度１０％となるように各ウェルに添加した。プレートを３７℃で１６〜２０時間インキュベートした後、ＥＸ５４０／ＥＭ５９０ｎｍにおいて蛍光（相対蛍光単位、ＲＦＵによる）を計測した。対照には、培地と補体を有するが細胞を有さない３連のウェル（培地のみ、０％生存性）及び細胞と補体を有するが抗体を有さないウェル（細胞のみ、１００％生存性）を使用した。各試料に関する特異的細胞生存性のパーセンテージを以下の式、即ち：パーセント生存性＝（試料−培地のみ）／（細胞のみ−培地のみ）により求めた。
Ｒａｍｏｓ細胞を使用した例示されるＣＤＣアッセイの結果を図１４に示す。意外にもｃｈＣＤ３７−１２はＲａｍｏｓ細胞に対して強力なＣＤＣ活性を有していた。これは試験した最高抗体濃度で２％までＲａｍｏｓ細胞の生存性を低減し、ＥＣ５０は０．０３７μｇ／ｍｌであった。更に幾つかの単離された抗体は種々の程度にまでＲａｍｏｓ細胞に対してＣＤＣ活性を示した。ｈｕＣＤ３７−３、ｈｕＣＤ３７−３８、ｈｕＣＤ３７−５０の投与はそれぞれ５９％５０％及び４５％まで細胞生存性の低減をもたらした。ｈｕＣＤ３７−５１、ｈｕＣＤ３７−５６又はｈｕＣＤ３７−５６の投与は試験した最高抗体濃度で約７０〜８０％までＲａｍｏｓ細胞の生存性を中程度に低減した。
（実施例１２）
ＣＤ３７抗体のＡＤＣＣ活性
ラクテートデヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）はエフェクター細胞としての新しく単離されたヒトナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を用いた腫瘍細胞の抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を計測するために使用されている（ShieldsRL, J Biol Chem. 2001 276(9):6591-604）。ＮＫ単離キットＩＩ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ，１３０−０９１−１５２）に関する修正プロトコルを用いながら正常者ドナー由来のヒト血液（ResearchBloodComponents, Inc., Brighton,MA）から最初に単離した。血液を１ｘＰＢＳで２倍希釈した。希釈血液２５ｍＬを５０ｍＬ三角試験管中の２５ｍＬのＦｉｃｏｌｌ Ｐａｑｕｅ上に慎重に重層し、ＲＴで４５分間４００Ｇで遠心分離した。末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を界面から収集し、新しい５０ｍＬ三角試験管に移し、そして１ｘＰＢＳで１回洗浄した。ＰＢＭＣをＮＫ単離緩衝液（１ｘＰＢＳ、０．５％ＢＳＡ、２ｍＭＥＤＴＡ）２ｍＬ中に再懸濁し、次にビオチン抗体カクテル５００μＬを細胞懸濁液に添加した。ビオチン抗体カクテルは、ＮＫ細胞以外のリンパ球に結合してＮＫ細胞の負の選択をもたらすビオチニル化抗体を含有する。混合物を１０分間４℃でインキュベートし、次にＮＫ単離緩衝液１．５ｍＬ及び抗ビオチンマイクロビーズ１ｍＬを添加した。細胞−抗体混合物を４℃で更に１５分インキュベートした。次に、細胞を１回５０ｍＬのＮＫ単離緩衝液で洗浄し、３ｍＬのＮＫ単離緩衝液に再懸濁した。次にＭＡＣＳＬＣカラムを自動ＭＡＣＳ分離機（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ）上に搭載し、ＮＫ単離緩衝液３ｍＬで予備洗浄した。細胞懸濁液を自動的にカラムにアプライし、洗浄し、そして未標識ＮＫ細胞を有する溶出画分を新しい５０ｍＬ容量の三角試験管に収集した。得られたＮＫ細胞を、一夜、完全ＲＰＭＩ培地（５％ウシ胎児血清、１％ペニシリン−ストレプトマイシン、１ｍＭＨＥＰＥＳ、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、１％１００ＸＭＥＭ非必須アミノ酸溶液を添加したＲＰＭＩ−１６４０）３０ｍＬ中にプレーティングした。その後のアッセイ及び全ての希釈はＲＨＢＰ培地（２０ｍＭＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、０．１％ＢＳＡ及び１％ペニシリン−ストレプトマイシンを添加したＲＰＭＩ−１６４０培地）中で実施した。
ＲＨＢＰ培地中の種々の濃度の抗体を丸底９６穴プレート中５０μＬ／ウェルで２連に分注した。標的細胞をＲＨＢＰ培地中１０６細胞／ｍＬで再懸濁し、抗体希釈物を含有する各ウェルに１０μＬ／ウェルで添加した。標的細胞及び抗体希釈物を含有するプレートを３７℃で３０分間インキュベートした。次に５０μＬ／ウェルで標的細胞を含有するウェルにＮＫ細胞を添加した。典型的な比は３〜４ＮＫ細胞に対して１標的細胞とした。以下の対照、即ち：ＮＫ細胞単独、標的細胞単独（自発的ＬＤＨ放出）、標的細胞とＮＫ細胞（抗体非依存性ＬＤＨ放出）、標的細胞と１０％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（最大ＬＤＨ放出）を各実験に対して設定した。混合物を４時間３℃でインキュベートすることにより細胞溶解を可能とした。プレートを１２００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、上澄み１００μＬを慎重に新しい平底９６穴プレートに移した。細胞傷害検出キット（Ｒｏｃｈｅ １６４４７９３）から入手したＬＤＨ反応混合物（１００μＬ／ウェル）を各ウェルに添加し、５〜３０分間室温でインキュベートした。試料の光学密度を４９０ｎｍで計測した（ＯＤ４９０）。各試料のパーセント特異的溶解は、以下の式、即ち：パーセント特異的溶解＝（試料の値−自発的放出）／（最大放出−自発的放出）＊１００を用いて求めた。
ヒト化抗体とのインキュベーションは、ヒトＮＫエフェクター細胞の存在下でＤａｕｄｉ、Ｒａｍｏｓ及びＧｒａｎｔａ−５１９リンパ腫細胞に対して良好なＡＤＣＣ活性をもたらす。Ｄａｕｄｉリンパ腫細胞に対するそれらのＡＤＣＣ活性をＴＲＵ−０１６に対するＡＤＣＣ活性と比較した（図１５）。
ｈｕＣＤ３７−３、ｈｕＣＤ３７−３８又はｈｕＣＤ３７−５０の投与はそれぞれ約４１％、３９％又は４０％のＤａｕｄｉ細胞溶解をもたらし、ＥＣ５０値は０．４２ｎｇ／ｍＬ、１．１３ｎｇ／ｍＬ、又は２．４２ｎｇ／ｍＬであった。この活性はＴＲＵ−０１６投与で得られたものと同様であり、４２％のＤａｕｄｉ細胞溶解が観察され、ＥＣ５０値は０．９３ｎｇ／ｍＬであった。更に又、ｈｕＣＤ３７−５１、ｈｕＣＤ３７−５６及びＣＤ３７−５７の投与はそれぞれ約３９％、３６％又は３６％のＤａｕｄｉ細胞溶解をもたらし、ＥＣ５０値は５．７ｎｇ／ｍＬ、４．３ｎｇ／ｍＬ、又は７．９ｎｇ／ｍＬであった。
Ｒａｍｏｓリンパ腫細胞に対する単離された抗体のＡＤＣＣ活性をＴＲＵ−０１６のＡＤＣＣ活性と比較した。ｈｕＣＤ３７−３、ｈｕＣＤ３７−３８又はｈｕＣＤ３７−５０の投与はそれぞれ約４３％、４２％又は４６％のＲａｍｏｓ細胞溶解をもたらし、ＥＣ５０値は０．９５ｎｇ／ｍＬ、２．０ｎｇ／ｍＬ、又は３．０ｎｇ／ｍＬであった。この活性はＴＲＵ−０１６投与で得られたものと同様であり、５９％のＲａｍｏｓ細胞溶解が観察され、ＥＣ５０値は１．５３ｎｇ／ｍＬであった。更に又、ｈｕＣＤ３７−５１、ｈｕＣＤ３７−５６及びＣＤ３７−５７の投与はそれぞれ約５３％、４３％又は４４％のＲａｍｏｓ細胞溶解をもたらし、ＥＣ５０値は５．７ｎｇ／ｍＬ、４．３ｎｇ／ｍＬ、又は７．９ｎｇ／ｍＬであった。
追加的な実験において、Ｇｒａｎｔａ−５１９細胞に対するｈｕＣＤ３７−３及びｈｕＣＤ３７−３８のＡＤＣＣ活性をＴＲＵ−０１６のＡＤＣＣ活性と比較した。ｈｕＣＤ３７−３又はｈｕＣＤ３７−３８抗体の投与はそれぞれ約１９％又は１８％のＧｒａｎｔａ−５１９細胞溶解をもたらし、ＥＣ５０値は０．１３ｎｇ／ｍＬ又は０．７３ｎｇ／ｍＬであった。ＴＲＵ−０１６投与は１６％のＧｒａｎｔａ−５１９細胞溶解をもたらし、ＥＣ５０値は０．８３ｎｇ／ｍＬであった。
（実施例１３）
エピトープマッピング
種々異なるＣＤ３７抗体にのエピトープに関するアミノ酸の要件の位置決めは共通又はユニークな機能的特性を特定の分子相互作用に結びつける場合の材料となりえる。ＣＤ３７の細胞外ドメインは２つの細胞外ループ、約１８残基の小型ループ及び約１３５アミノ酸よりなるより大型のものを含有する。エピトープの要件は以前に公開されているＣＤ３７抗体に関しては説明されていない。本発明の単離されたＣＤ３７抗体を更に特性化するために、本発明者等はより大きい細胞外ループにおけるＡＡ置換を有する数種のＣＤ３７抗原変異体を構築した。
ＣＤ３７変異体のクローニング及び発現
全ヒト又はマカカのＣＤ３７ｃＤＮＡ配列、Ｂｌｕｅ Ｈｅｒｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓにより最適化及び合成され、ｐＳＲａベクターのマルチクローニング部位へのクローニングを容易にするためにＸｂａＩ及びＢａｍＨＩ制限部位にフランキングされたコドンを含む哺乳類発現プラスミドを構築した。ヒト及びマカカのＣＤ３７配列は高度に相同であるため（図１６）、これらのコンストラクトの発現は、実施例８に説明するとおりこれら２つの種の間の１１細胞外ＣＤ３７アミノ酸の相違の少なくとも１つを必要とするエピトープを認識するものから、ヒト及びマカカの交差反応性の抗体を区別可能とするはずである。
ＣＤ３７抗体エピトープを更に特性化するために、一連のネズミオヨビヒトのキメラＣＤ３７コンストラクトを構築した。小型ＣＤ３７細胞外ループの大きさ及び高度な相同性のため、エピトープの位置決めの作業は大型の細胞外ループに制限された。ヒト、ネズミ、及びマカカのＣＤ３７配列の間で保存されているはずである４つのユニークな制限部位を取り込むことにより更に５セクションにセグメント化されるように大型細胞外ループの残基Ｉ１０８〜Ｑ２３５をコードするＥｃｏＲＶからＰｓｔ１までのカセットを再設計した（図１７）。以下のヒト及びマウスのキメラＣＤ３７コンストラクトを作成した。
ｈｕＣＤ３７−Ｍ１
MSAQESCLSLIKYFLFVFNLFFFVLGSLIFCFGIWILIDKTSFVSFVGLAFVPLQIWSKVLAISGIFTMGIALLGCVGALKELRCLLGLYFGMLLLLFATQITLGILISTQRVRLERRVQELVLRTIQSYRTNPDETAAEESWDYVQFQLRCCGWHYPQDWFQVLILRGNGSEAHRVPCSCYNLSATNDSTILDKVILPQLSRLGHLARSRHSADICAVPAESHIYREGCAQGLQKWLHNNLISIVGICLGVGLLELGFMTLSIFLCRNLDHVYNRLARYR(SEQIDNO:180)
ｈｕＣＤ３７−Ｍ２
MSAQESCLSLIKYFLFVFNLFFFVLGSLIFCFGIWILIDKTSFVSFVGLAFVPLQIWSKVLAISGIFTMGIALLGCVGALKELRCLLGLYFGMLLLLFATQITLGILISTQRAQLERSLRDVVEKTIQKYGTNPEETAAEESWDYAQFQLRCCGWQSPRDWNKAQMLKANESEEPRVPCSCYNLSATNDSTILDKVILPQLSRLGHLARSRHSADICAVPAESHIYREGCAQGLQKWLHNNLISIVGICLGVGLLELGFMTLSIFLCRNLDHVYNRLARYR(SEQIDNO:181)
ｈｕＣＤ３７−Ｍ３
MSAQESCLSLIKYFLFVFNLFFFVLGSLIFCFGIWILIDKTSFVSFVGLAFVPLQIWSKVLAISGIFTMGIALLGCVGALKELRCLLGLYFGMLLLLFATQITLGILISTQRAQLERSLRDVVEKTIQKYGTNPEETAAEESWDYVQFQLRCCGWHYPQDWFQVLILRGNGSEAHRVPCSCYNSTATNDSTVFDKLFFSQLSRLGHLARSRHSADICAVPAESHIYREGCAQGLQKWLHNNLISIVGICLGVGLLELGFMTLSIFLCRNLDHVYNRLARYR(SEQIDNO:182)
ｈｕＣＤ３７−Ｍ４５
MSAQESCLSLIKYFLFVFNLFFFVLGSLIFCFGIWILIDKTSFVSFVGLAFVPLQIWSKVLAISGIFTMGIALLGCVGALKELRCLLGLYFGMLLLLFATQITLGILISTQRAQLERSLRDVVEKTIQKYGTNPEETAAEESWDYVQFQLRCCGWHYPQDWFQVLILRGNGSEAHRVPCSCYNLSATNDSTILDKVILPQLSRLGPRAKLRQTADICALPAKAHIYREGCAQSLQKWLHNNLISIVGICLGVGLLELGFMTLSIFLCRNLDHVYNRLARYR(SEQIDNO:183)
ｍｕＣＤ３７−Ｒ１７６
ISTQRVRLERRVQELVLRTIQSYRTNPDETAAEESWDYAQFQLRCCGWQSPRDWNKAQMLKANESEEPRVPCSCYNSTATNDSTVFDKLFFSQLSRLGPRAKLRQTADICALPAKAHIYREGCAQSLQ(SEQIDNO:184)
１つのそのような制限部位Ｋｐｎ１を温存するために、ヒトＲ１７６をネズミ／ヒトキメラコンストラクトの全てに包含させた。ネズミ及びヒトＣＤ３７カセットはＢｌｕｅ Ｈｅｒｏｎに注文し、そして元のマカカＣＤ３７コンストラクトから得たＥｃｏＲＶ部位及び３’末端のＰｓｔ１〜Ｘｂａｌ制限フラグメントを取り込むためにＰＣＲにより形成された元のヒトＣＤ３７コンストラクトの５’末端フラグメントと共にｐＳＲａベクター内にクローニングした。次に共通のユニークな制限部位を利用しながら標準的な制限消化及びライゲーションを用いてネズミ及びヒトのキメラＣＤ３７カセットを構築した。
ｈｕＣＤ３７−Ｍ１変異体は、類縁のネズミＣＤ３７配列のＡＡＳ１０９〜Ａ１３８をコードするＥｃｏＲＶ−ＳａｃＩＩ制限フラグメントを挿入することにより作成した。同様にｈｕＣＤ３７−Ｍ３変異体は、類縁のネズミＣＤ３７配列のＡＡＶ１７７〜Ｌ２０１をコードするＫｐｎＩ−Ｂｉｌ１制限フラグメントを挿入することにより作成した。ｈｕＣＤ３７−Ｍ４５変異体は、類縁のネズミＣＤ３７配列のＡＡＳ２０２〜Ｉ２４３をコードするＢｌｐ１−ＰｓｔＩ制限フラグメントを挿入することにより作成した。得られたクローンを制限酵素消化により確認し、その後ＤＮＡ配列決定した。
標準的なエレクトロポレーション操作法を用いながら３００−１９細胞内へのネズミ及びヒトのキメラＣＤ３７変異体発現プラスミドのトランスフェクションにより安定な細胞系統を得た。要すれば、２６０Ｖ及び９６０μＦにセットしたＢｉｏＲａｄ Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒを用いながら冷ＲＰＭＩ−１６４０培地中で５ｘ１０６個の３００−１９細胞のエレクトロポレーションを行った。その後、１０％ＦＢＳ及び５０μＭのβ−メルカプトエタノールを添加したＲＰＭＩ−１６４０培地中、細胞を希釈して９６穴プレートにプレーティングした。２４時間後、Ｇ４１８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を終濃度２ｍｇ／ｍｌで添加することによりトランスフェクトされた細胞を選択した。２週間後、単コロニーを単離し、フローサイトメトリーによりＣＤ３７表面発現を分析し、そして増殖させた。
ＣＤ３７変異体への抗体の結合
ヒトＣＤ３７の野生型及び変異体を発現する細胞への種々のＣＤ３７抗体の結合を各抗体１．５μｇ／ｍｌを用いながらフローサイトメトリーにより分析した。本発明の単離された抗体を市販のＣＤ３７抗体ＷＲ１７、並びにＴＲＵ−０１６ＳＭＩＰと比較した。図１８Ａより解るとおり、全ての抗体が野生型ＣＤ３７発現細胞に結合した。同様に試験した全ての抗体がｈＣＤ３７−Ｍ３変異体に結合した（図１８Ｂ）。一方、本発明の単離された抗体はｈＣＤ３７−Ｍ１変異体に結合したが、ＴＲＵ−０１６およびＷＲ１７はｈＣＤ３７−Ｍ１変異体に結合できなかった（図１９Ａ）。ＣＤ３７−５０及びＣＤ３７−５１抗体及びＴＲＵ−０１６はｈＣＤ３７−Ｍ４５変異体にも結合することができた。ＷＲ１７はｈＣＤ３７−Ｍ４５変異体への部分的結合を示し、他の抗体であるＣＤ３７−３、ＣＤ３７−１２、ＣＤ３７−３８、ＣＤ３７−５６及びＣＤ３７−５７は結合できなかった（図１９Ｂ）。これは、本発明の単離された抗体の全てはがＣＤ３７−抗原への結合のために相当するネズミＡＡ残基に変化したｈＣＤ３７−Ｍ１変異体中の１２ＡＡ残基を必要としないことを示唆している。一方ＣＤ３７−３、ＣＤ３７−１２、ＣＤ３７−３８、ＣＤ３７−５６及びＣＤ３７−５７抗体はＣＤ３７−抗原への結合のために相当するネズミＡＡに片かしらｈＣＤ３７−Ｍ４５変異体中の１０ＡＡ残基の少なくとも１つを必要とする。
この予想外の結果は、本発明の単離された抗体が機能的特性のユニークな組み合わせを有するＣＤ３７−抗体の新しいクラスとなることを示している。
更に又、同様のコンストラクトを同じ設計に従って構築する。コンストラクトはＣＤ３７の大型細胞外ループをコードするネズミ、ヒト及び／又はマカカの配列の種々の組み合わせを含有する（図１７参照）。ネズミ大型細胞外ループ配列内に挿入された単一のヒトセクションを有するコンストラクトの例は以下の通り、即ち：
ｈＣＤ３７ｍＥＣＤ−Ｈ１：
MSAQESCLSLIKYFLFVFNLFFFVLGSLIFCFGIWILIDKTSFVSFVGLAFVPLQIWSKVLAISGIFTMGIALLGCVGALKELRCLLGLYFGMLLLLFATQITLGILISTQRAQLERSLRDVVEKTIQKYGTNPEETAAEESWDYAQFQLRCCGWQSPRDWNKAQMLKANESEEPRVPCSCYNSTATNDSTVFDKLFFSQLSRLGPRAKLRQTADICALPAKAHIYREGCAQSLQKWLHNNLISIVGICLGVGLLELGFMTLSIFLCRNLDHVYNRLARY(SEQIDNO: 185)
ｈＣＤ３７ｍＥＣＤ−Ｈ２：
MSAQESCLSLIKYFLFVFNLFFFVLGSLIFCFGIWILIDKTSFVSFVGLAFVPLQIWSKVLAISGIFTMGIALLGCVGALKELRCLLGLYFGMLLLLFATQITLGILISTQRVRLERRVQELVLRTIQSYRTNPDETAAEESWDYVQFQLRCCGWHYPQDWFQVLILRGNGSEAHRVPCSCYNSTATNDSTVFDKLFFSQLSRLGPRAKLRQTADICALPAKAHIYREGCAQSLQKWLHNNLISIVGICLGVGLLELGFMTLSIFLCRNLDHVYNRLARYR(SEQIDNO: 186)
ｈＣＤ３７ｍＥＣＤ−Ｈ３：
MSAQESCLSLIKYFLFVFNLFFFVLGSLIFCFGIWILIDKTSFVSFVGLAFVPLQIWSKVLAISGIFTMGIALLGCVGALKELRCLLGLYFGMLLLLFATQITLGILISTQRVRLERRVQELVLRTIQSYRTNPDETAAEESWDYAQFQLRCCGWQSPRDWNKAQMLKANESEEPRVPCSCYNLSATNDSTILDKVILPQLSRLGPRAKLRQTADICALPAKAHIYREGCAQSLQKWLHNNLISIVGICLGVGLLELGFMTLSIFLCRNLDHVYNRLARYR(SEQIDNO: 187)
ｈＣＤ３７ｍＥＣＤ−Ｈ４：
MSAQESCLSLIKYFLFVFNLFFFVLGSLIFCFGIWILIDKTSFVSFVGLAFVPLQIWSKVLAISGIFTMGIALLGCVGALKELRCLLGLYFGMLLLLFATQITLGILISTQRVRLERRVQELVLRTIQSYRTNPDETAAEESWDYAQFQLRCCGWQSPRDWNKAQMLKANESEEPRVPCSCYNSTATNDSTVFDKLFFSQLSRLGHLARSRHSADICALPAKAHIYREGCAQSLQKWLHNNLISIVGICLGVGLLELGFMTLSIFLCRNLDHVYNRLARYR(SEQIDNO: 188)
ｈＣＤ３７ｍＥＣＤ−Ｈ５：
MSAQESCLSLIKYFLFVFNLFFFVLGSLIFCFGIWILIDKTSFVSFVGLAFVPLQIWSKVLAISGIFTMGIALLGCVGALKELRCLLGLYFGMLLLLFATQITLGILISTQRVRLERRVQELVLRTIQSYRTNPDETAAEESWDYAQFQLRCCGWQSPRDWNKAQMLKANESEEPRVPCSCYNSTATNDSTVFDKLFFSQLSRLGPRAKLRQTADICAVPAESHIYREGCAQGLQKWLHNNLISIVGICLGVGLLELGFMTLSIFLCRNLDHVYNRLARYR(SEQIDNO: 189)
及びｈＣＤ３７ｍＥＣＤ−Ｈ４５：
MSAQESCLSLIKYFLFVFNLFFFVLGSLIFCFGIWILIDKTSFVSFVGLAFVPLQIWSKVLAISGIFTMGIALLGCVGALKELRCLLGLYFGMLLLLFATQITLGILISTQRVRLERRVQELVLRTIQSYRTNPDETAAEESWDYAQFQLRCCGWQSPRDWNKAQMLKANESEEPRVPCSCYNSTATNDSTVFDKLFFSQLSRLGHLARSRHSADICAVPAESHIYREGCAQGLQKWLHNNLISIVGICLGVGLLELGFMTLSIFLCRNLDHVYNRLARYR(SEQIDNO: 190)
である。
更に例示されるものはヒト大型細胞外ループ配列に挿入された単一のマカカセクションを有するコンストラクト、例えば以下のもの：
ｈＣＤ３７−Ｍａｃ１２：
MSAQESCLSLIKYFLFVFNLFFFVLGSLIFCFGIWILIDKTSFVSFVGLAFVPLQIWSKVLAISGIFTMGIALLGCVGALKELRCLLGLYFGMLLLLFATQITLGILISTQRAQLERSLQDIVEKTIQRYHTNPEETAAEESWDYVQFQLRCCGWHSPQDWFQVLTLRGNGSEAHRVPCSCYNLSATNDSTILDKVILPQLSRLGHLARSRHSADICAVPAESHIYREGCAQGLQKWLHNNLISIVGICLGVGLLELGFMTLSIFLCRNLDHVYNRLARYR(SEQIDNO: 191)
ｈＣＤ３７−Ｍａｃ４：
MSAQESCLSLIKYFLFVFNLFFFVLGSLIFCFGIWILIDKTSFVSFVGLAFVPLQIWSKVLAISGIFTMGIALLGCVGALKELRCLLGLYFGMLLLLFATQITLGILISTQRAQLERSLRDVVEKTIQKYGTNPEETAAEESWDYVQFQLRCCGWHYPQDWFQVLILRGNGSEAHRVPCSCYNLSATNDSTILDKVILPQLSRLGQLARSRHSTDICAVPAESHIYREGCAQGLQKWLHNNLISIVGICLGVGLLELGFMTLSIFLCRNLDHVYNRLARYR(SEQIDNO: 192)
ｈＣＤ３７−Ｍａｃ５：
MSAQESCLSLIKYFLFVFNLFFFVLGSLIFCFGIWILIDKTSFVSFVGLAFVPLQIWSKVLAISGIFTMGIALLGCVGALKELRCLLGLYFGMLLLLFATQITLGILISTQRAQLERSLRDVVEKTIQKYGTNPEETAAEESWDYVQFQLRCCGWHYPQDWFQVLILRGNGSEAHRVPCSCYNLSATNDSTILDKVILPQLSRLGHLARSRHSADICAVPANSHIYREGCARSLQKWLHNNLISIVGICLGVGLLELGFMTLSIFLCRNLDHVYNRLARYR(SEQIDNO: 193)
及びｈＣＤ３７−Ｍａｃ４５：
MSAQESCLSLIKYFLFVFNLFFFVLGSLIFCFGIWILIDKTSFVSFVGLAFVPLQIWSKVLAISGIFTMGIALLGCVGALKELRCLLGLYFGMLLLLFATQITLGILISTQRAQLERSLRDVVEKTIQKYGTNPEETAAEESWDYVQFQLRCCGWHYPQDWFQVLILRGNGSEAHRVPCSCYNLSATNDSTILDKVILPQLSRLGQLARSRHSTDICAVPANSHIYREGCARSLQKWLHNNLISIVGICLGVGLLELGFMTLSIFLCRNLDHVYNRLARY(SEQIDNO: 194)
である。更に、抗体結合のために重要な残基を識別するために、ヒト大型細胞外ループ中に１点突然変異が形成される。
配列番号１８５〜１９４を発現する細胞へのＣＤ３７結合剤の結合は、上記した通りフローサイトメトリーで分析される。
（実施例１４）
ｈｕＣＤ３７−３−ＳＰＰ−ＤＭ１の調製
Ｎ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルジチオ）ペンタノエート（ＳＰＰ）リンカーをエタノールに溶解した。５０ｍＭＮａＣｌ、２ｍＭＥＤＴＡ及び５％エタノールを含有する５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５）中室温で約１００分、７倍モル過剰のＳＰＰと共に５ｍｇ／ｍｌでｈｕＣＤ３７−３抗体をインキュベートした。上記したリン酸カリウム緩衝液で平衡化させたＳＥＰＨＡＤＥＸＴＭＧ２５Ｆカラムを用いて反応混合物を精製した。抗体含有画分をプールし、その後の工程に使用した。
マイタンシノイドＤＭ１をジメチルアセトアミド（ＤＭＡ、終濃度は３％）に溶解し、リンカーに対して１．７倍モル過剰量をＳＰＰ修飾抗体に滴下した。室温で一夜インキュベートした後、コンジュゲートした抗体をリン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ），ｐＨ６．５中で平衡化させたＳＥＰＨＡＤＥＸＴＭＧ２５Ｆカラム上のクロマトグラフィーにより精製した。次にｈｕＣＤ３７−３−ＳＰＰ−ＤＭ１コンジュゲートを１０ｍＭヒスチジン、２５０ｍＭグリシン、１％スクロースを含有する緩衝液、ｐＨ５．５中に透析した。抗体及びＤＭ１に関する以前に報告されている消衰係数を用いながら抗体分子当たりに連結したＤＭ１分子の数を求めた（Liu等、Proc.Natl.Acad. Sci. USA, 93, 8618-8623 (1996)
）。コンジュゲート反応の後に存在する遊離のマイタンシノイドのパーセンテージは、１００ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液、ｐＨ７．０中の２５％アセトニトリル中で平行化されたＨｉＳｅｐカラム上に２０〜５０μｇのコンジュゲートを注入し、そしてアセトニトリル中に溶離することにより求めた。２５２ｎｍの波長にセットした吸光度検知器を用いて総遊離マイタンシノイド分子種（勾配溶離し、そして既知標準物質との溶離時間の比較により同定）のピーク面積を計測し、そして結合マイタンシノイド（カラムのフロースルー画分中コンジュゲートピーク中に溶離）に関連するピーク面積と比較することにより総遊離マイタンシノイド分子種のパーセンテージを計算した。ｈｕＣＤ３７−３抗体当たり３．５〜４個のＤＭ１分子を有するコンジュゲートが得られ、＜１％が未コンジュゲートのマイタンシノイドとして存在していた。
ｈｕＣＤ３７−３-ＳＭＣＣ−ＤＭ１の調製
スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１-カルボキシレー
ト（ＳＭＣＣ、Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ）リンカーをＤＭＡ中に溶解した。１０モル過剰量のＳＭＣＣと共に５０ｍＭリン酸カリウム、５０ｍＭＮａＣｌ、２ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ６．５中、５ｍｇ／ｍｌで抗体をインキュベートすることにより、ｈｕＣＤ３７−３抗体をＳＭＣＣで修飾してマレイミドを抗体内に導入した。周囲温度で約１００分間の後、同じリン酸化リ緩衝液で平行化したＳＥＰＨＡＤＥＸＴＭＧ２５Ｆカラムを用いて反応混合物を精製した。抗体含有画分をプールし、その後の工程のために使用した。
マレイミドリンカーに対して１．７モル過剰量のＤＭ１の１０ｍＭ溶液とＳＭＣＣ−修飾抗体を反応させた。反応物を約１８時間周囲温度で攪拌した。ｐＨ６．５の１ｘＰＢＳで平衡化させたＳＥＰＨＡＤＥＸＴＭＧ２５ゲル濾過カラムを通しながらコンジュゲーション反応混合物を濾過した。次にｈｕＣＤ３７−３−ＳＭＣＣ−ＤＭ１コンジュゲートを１０ｍＭヒスチジン、２５０ｍＭグリシン、１％スクロースを含有する緩衝液、ｐＨ５．５中に透析した。抗体分子当たり連結しているＤＭ１分子の数及び総遊離マイタンシノイド分子種のパーセンテージは上記した通り求めた。ｈｕＣＤ３７−３抗体当たり３．５〜４個のＤＭ１分子を有するコンジュゲートが得られ、＜１％が未コンジュゲートのマイタンシノイドとして存在していた。
ｈｕＣＤ３７−３-スルホ−ｍａｌ−ＤＭ４の調製
ＤＭ４チオール及びヘテロ２官能性リンカー１−（２．５−ジオキソ−２．５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）−４−（２，５−ジオキシピロリジン−１−イルオキシ）−４−オキソブタンー２−スルホン酸（３−スルホ−ｍａｌ）の溶液を３０〜６０ｍＭの濃度でＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）中に作成した。２００ｍＭスクシネート緩衝液、２ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ５．０の４０％ｖ／ｖまでを含有するＤＭＡ中でリンカーとＤＭ４を混合してリンカーに対するＤＭ４の比を１．６とし、ＤＭ４の終濃度を１５ｍＭとした。混合の後、反応を２時間放置し、４ｍｇ／ｍｌＡｂ、９０％リン酸緩衝液／１０％ＤＭＡ、ｐＨ７．５の最終コンジュゲーション条件下にリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．５）中のｈｕＣＤ３７−３抗体の混合物に添加した。コンジュゲーション反応を２時間周囲温度において進行させた。ｈｕＣＤ３７−３−スルホ−ｍａｌ−ＤＭ４コンジュゲートを過剰の未反応のＤＭ４及び未コンジュゲートのリンカー産物から精製し、ＰＢＳ中の透析、ついで１０ｍＭヒスチジン、２５０ｍＭグリシン、１％スクロース含有する緩衝液、ｐＨ５．５中に最終透析した。コンジュゲートを０．２２μｍのフィルターを通して濾過し、最終保存用とした。最終コンジュゲートにおけるｈｕＣＤ３７−３抗体分子当たりのＤＭ４分子の数（平均）、総遊離マイタンシノイド物質種のパーセンテージは上記した通り求めた。ｈｕＣＤ３７−３抗体当たり３．５〜４個のＤＭ４分子を有するコンジュゲートが得られ、＜１％が未コンジュゲートのマイタンシノイドとして存在していた。
ｈｕＣＤ３７−３-ＰＥＧ４−ｍａｌ−ＤＭ１の調製
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル−（ポリエチレングリコール）４−（Ｎ−マレイミドメチル）-ＤＭ１（ＮＨＳ−ＰＥＧ４−ｍａｌ−ＤＭ１）試薬をＤＭＡ中に溶解した。ｈｕＣＤ３７−３抗体を７倍モル過剰量のＮＨＳ−ＰＥＧ４−ｍａｌ−ＤＭ１（合計１０％ＤＭＡ）と共に、５０ｍＭリン酸カリウム、１５０ｍＭＮａＣｌ、２ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ７．５中、５ｍｇ／ｍｌでインキュベートした。周囲温度で約２時間の後、１ｘＰＢＳ、ｐＨ７．４で平衡化させたＳＥＰＨＡＤＥＸＴＭＧ２５カラムを用いて反応混合物を精製した。抗体含有画分をプールし、１０ｍＭヒスチジン、２５０ｍＭグリシン、１％スクロースを含有する緩衝液、ｐＨ５．５中に透析した。抗体当たり連結したＤＭ１分子の数及び総遊離マイタンシノイド分子種のパーセンテージを上記した通り求めた。ｈｕＣＤ３７−３抗体当たり３．５〜４個のＤＭ４分子を有するコンジュゲートが得られ、＜１％が未コンジュゲートのマイタンシノイドとして存在していた。
（実施例１５）


マイタンシノイドコンジュゲートの結合親和性
ＳＭＣＣ−ＤＭ１、ＳＰＰ−ＤＭ１又はスルホ−ｍａｌ−ＤＭ４へのコンジュゲーションの後の例示されるｈｕＣＤ３７−３の結合親和性を上記実施例において記載したとおりフローサイトメトリーによりアッセイした。図２０Ａに示す結合曲線から見かけの解離定数（Ｋｄ）の値を計算したところ、ｈｕＣＤ３７−３については０．２６ｎＭ、ｈｕＣＤ３７−３−ＳＭＣＣ−ＤＭ１については０．４６ｎＭ、ｈｕＣＤ３７−３−ＳＰＰ−ＤＭ１については０．５６ｎＭ、そしてｈｕＣＤ３７−３−スルホ−ｍａｌ−ＤＭ４については０．８９ｎＭに相当した。この結果は ＳＭＣＣ−ＤＭ１、ＳＰＰ−ＤＭ１又はスルホ−ｍａｌ−ＤＭ４コンジュゲーションが例示されるｈｕＣＤ３７−３抗体の親和性を顕著には改変しないことを示している。
ＳＭＣＣ−ＤＭ１へのｈｕＣＤ３７−３８の結合親和性を上記実施例において記載したとおりフローサイトメトリーによりアッセイした。図２０Ｂに示す結合曲線から見かけの解離定数（Ｋｄ）の値を計算したところ、ｈｕＣＤ３７−３８については１．０４ｎＭ、そしてｈｕＣＤ３７−３８−ＳＭＣＣ−ＤＭ１コンジュゲートについては１．２ｎＭに相当した。この結果はＳＭＣＣ−ＤＭ１コンジュゲーションがｈｕＣＤ３８抗体の親和性を顕著には改変しないことを示している。同様にＳＭＣＣ−ＤＭ１へのコンジュゲーションの後のｈｕＣＤ３７−５０、ｈｕＣＤ３７−５１、ｈｕＣＤ３７−５６及びｈｕＣＤ３７−５７の結合親和性をフローサイトメトリーによりアッセイした。結合曲線から見かけの解離定数（Ｋｄ）の値を計算したところ、ｈｕＣＤ３７−５０については０．４３ｎＭ、ｈｕＣＤ３７−５０−ＳＭＣＣ−ＤＭ１については０．７０ｎＭ、ｈｕＣＤ３７−５１については２．０ｎＭ、ｈｕＣＤ３７−５１−ＳＭＣＣ−ＤＭ１については１．６ｎＭ、ｈｕＣＤ３７−５６については０．３７ｎＭ、ｈｕＣＤ３７−５６−ＳＭＣＣ−ＤＭ１については０．３４ｎＭ、ｈｕＣＤ３７−５７については０．３０、そしてｈｕＣＤ３７−５７−ＳＭＣＣ−ＤＭ１については０．３４であった。この結果はＳＭＣＣ−ＤＭ１コンジュゲーションもまたｈｕＣＤ３７−５０、ｈｕＣＤ３７−５１、ｈｕＣＤ３７−５６又はｈｕＣＤ３７−５７抗体の親和性を顕著には改変しないことを示している。
ＰＥＧ４−ｍａｌ−ＤＭ１コンジュゲートの結合親和性
ＰＥＧ４−ｍａｌ−ＤＭ１へのコンジュゲーションの後の例示されるｈｕＣＤ３７−３及びｈｕＣＤ３７−５０の結合親和性を上記実施例において記載したとおりフローサイトメトリーによりアッセイした。結合曲線から見かけの解離定数（Ｋｄ）の値を計算したところ、ｈｕＣＤ３７−については０．２８ｎＭ、ｈｕＣＤ３７−３−ＰＥＧ４−ｍａｌ−ＤＭ１については０．３５ｎＭ、ｈｕＣＤ３７−５０については０．６８ｎＭそしてｈｕＣＤ３７−５０−ＰＥＧ４−ｍａｌ−ＤＭ１コンジュゲートについては１．１ｎＭに相当した。この結果はＰＥＧ４−ｍａｌ−ＤＭ１コンジュゲーションが例示されるｈｕＣＤ３７−３又はｈｕＣＤ５０抗体の親和性を顕著には改変しないことを示している。
ｈｕＣＤ３７−３−ＳＭＣＣ−ＤＭ１コンジュゲートの前アポトーシス活性
ＳＭＣＣ−ＤＭ１へのコンジュゲーションの後のｈｕＣＤ３７−３の前アポトーシス活性を上記したＲａｍｏｓ細胞上のアネキシン−Ｖ染色により評価した。ｈｕＣＤ３７−３抗体又はｈｕＣＤ３７−３−ＳＭＣＣ−ＤＭ１コンジュゲートの何れかの投与は約４０％のアネキシン−Ｖ陽性Ｒａｍｏｓ細胞をもたらし、ＥＣ５０値は約０．０９ｎＭであった（図２１Ａ）。非結合紺個抗体又は非結合ＳＭＣＣ−ＤＭ１対照コンジュゲートを投与したＲａｍｏｓ細胞は僅か４％までのアネキシン−Ｖ陽性細胞を含有していた。これと比較して、抗ＣＤ２０抗体リツキシマブの投与は僅か１６％のアネキシン−Ｖ陽性細胞をもたらし、ＥＣ５０値は約２ｎＭであった。一方、ＴＲＵ−０１６投与はアネキシン−Ｖ陽性Ｒａｍｏｓ細胞のパーセンテージを増大させなかった。これはヒト抗ＣＤ３７抗体ｈｕＣＤ３７−３の強力な前アポトーシス活性がＳＭＣＣ−ＤＭ１へのコンジュゲーションの後にも維持されていることを示している。
ｈｕＣＤ３７−３−ＳＭＣＣ−ＤＭ１コンジュゲートのＣＤＣ活性
ＳＭＣＣ−ＤＭ１へのコンジュゲーションの後のｈｕＣＤ３７−３のＣＤＣ活性を５％ヒト補体存在下Ｒａｍｏｓ細胞において評価した。ｈｕＣＤ３７−３又はｈｕＣＤ３７−３−ＳＭＣＣ−ＤＭ１の投与はそれぞれ５３％及び７３％までの細胞生存性の低下をもたらした（図２１Ｂ）。従って、例示されるｈｕＣＤ３７−３抗体のＣＤＣ活性はマイタンシノイドコンジュゲーションの後も維持されている。
コンジュゲートのＡＤＣＣ活性
ＳＭＣＣ−ＤＭ１又はＰＥＧ４−ｍａｌ−ＤＭ１へのコンジュゲーションの後のｈｕＣＤ３７−３のＡＤＣＣ活性を、上記した通りＬＤＨ放出によりヒトＮＫエフェクター相棒の存在下のＤａｕｄｉ及びＲａｍｏｓ細胞において評価した。図２２Ａより明らかな通り、ｈｕＣＤ３７−３−ＳＭＣＣ−ＤＭ１又はｈｕＣＤ３７−３−ＰＥＧ４−ｍａｌ−ＤＭ１コンジュゲートはＤａｕｄｉ細胞に対する未コンジュゲートのｈｕＣＤ３７−３抗体と同様のＡＤＣＣ活性を有している。ｈｕＣＤ３７−３、ｈｕＣＤ３７−３−ＳＭＣＣ−ＤＭ１又はｈｕＣＤ３７−３−ＰＥＧ４−ｍａｌ−ＤＭ１の投与はそれぞれ約４１％、３９％又は３６％のＤａｕｄｉ細胞溶解をもたらし、ＥＣ５０値は０．４２ｎｇ／ｍＬ、１．１３ｎｇ／ｍＬ又は０．９１ｎｇ／ｍＬであった。同様の結果が標的細胞としてＲａｍｏｓ細胞を用いた場合にも得られた。前と同様、ｈｕＣＤ３７−３−ＳＭＣＣ−ＤＭ１又はｈｕＣＤ３７−３−ＰＥＧ４−ｍａｌ−ＤＭ１コンジュゲートはＲａｍｏｓ細胞に対して未コンジュゲートのｈｕＣＤ３７−３抗体に匹敵するＡＤＣＣ活性を有している（図２２Ｂ）。ｈｕＣＤ３７−３、ｈｕＣＤ３７−３−ＳＭＣＣ−ＤＭ１又はｈｕＣＤ３７−３−ＰＥＧ４−ｍａｌ−ＤＭ１の投与はそれぞれ約４３％、４１％又は４２％のＲａｍｏｓ細胞溶解をもたらし、ＥＣ５０値は０．９５ｎｇ／ｍＬ、１．３３ｎｇ／ｍＬ又は１．５７ｎｇ／ｍＬであった。従って、例示されるｈｕＣＤ３７−３抗体の強力なＡＤＣＣ活性はマイタンシノイドコンジュゲーションの後も維持されている。
ｈｕＣＤ３７−３−ＳＭＣＣ−ＤＭ１による細胞周期停止の導入
細胞系統において細胞周期の停止を誘導する抗ＣＤ３７抗体及びコンジュゲートの能力をヨウ化プロピジウム（ＰＩ）染色とその後のフローサイトメトリー分析により評価した。指数的に生育している細胞をＲＴで５分間１３００ｒｐｍで遠心分離することにより採取し、そして完全ＲＰＭＩ培地中、０．５ｘ１０６細胞／ｍｌに懸濁した。細胞を０．５ｘ１０６細胞／アッセイとなるように２４穴プレート（Ｆａｌｃｏｎ３０７７）にウェル当たり１ｍＬで移した。被験化合物を終濃度１０ｎＭで各ウェルに添加した。完全ＲＰＭＩ培地を未投与対照ウェルに添加した。細胞を湿潤５％ＣＯ２インキュベーター中３７℃で１６〜２０時間一夜インキュベートした。翌日、５ｍＬポリスチレン試験管に移すことにより細胞を採取し、３ｍＬのＰＢＳで１回洗浄し、そして氷り上３０分間０％エタノール１ｍＬ中に固定した。次に試料を再度３ｍＬのＰＢＳで１回洗浄し、０．５ｍＬＰＢＳ中に再懸濁した。ＲＮａｓｅを５μｇ／ｍｌで試料に添加し、そして３０分間３７℃でインキュベートした。次に試料を終濃度５０μｇ／ｍｌでヨウ化プロピジウムで染色した。試料はＰＩ染色の２４時間以内に獲得した。試料をＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ）上で泳動させた。ＦＬ２−Ａパラメーターは直線スケールにセットし、そしてＦＬ２ＰＴＭは２００近傍にＧ１ピークが位置するように調節した。試料は低流量で獲得し、試料当たり１０，０００イベントを収集した。細胞周期の種々異なる期における細胞の分布をＭｏｄＦｉｔソフトウエア（バージョン５．１１、Ｖｒｉｅｔｙ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｈｏｕｓｅ Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）を用いて求めた。このプログラムはＰＩデータを自動的にモデル化するためのピークフィッティング手法を利用しており、所望の定量的データを与える。データは標準的なプログラム設定で分析した。
ｈｕＣＤ３７−３及びｈｕＣＤ３７−３−ＳＭＣＣ−ＤＭ１のＢＪＡＢ及びＲＬリンパ腫細胞に対する作用は、１０ｎＭ濃度の何れかの化合物と共に１６〜２０時間インキュベーションし、ついでヨウ化プロピジウム（ＰＩ）染色及びフローサイトメトリー分析した後に評価した。ｈｕＣＤ３７−３−ＳＭＣＣ−ＤＭ１とのインキュベーションは、未投与のＢＪＡＢリンパ腫細胞の１３％からｈｕＣＤ３７−３−ＳＭＣＣ−ＤＭ１投与細胞の９５％までＧ２／Ｍ期における細胞のパーセンテージを増大させた（図２３Ａ）。同様にｈｕＣＤ３７−３−ＳＭＣＣ−ＤＭ１とのインキュベーションは、未投与のＲＬリンパ腫細胞の１２％からｈｕＣＤ３７−３−ＳＭＣＣ−ＤＭ１投与細胞の３３％までＧ２／Ｍ期における細胞のパーセンテージを増大させた（図２３Ｂ）。一方ｈｕＣＤ３７−３抗体はＢＪＡＢ及びＲＬ細胞の何れの細胞周期に対しても作用を有していなかった。更に又、同じ濃度で試験した非結合ＳＭＣＣ−ＤＭ１コンジュゲートもまた何れの細胞型の細胞周期に対しても作用を有していなかった。
これは単離された抗ＣＤ３７抗体で作成されたマイタンシノイドコンジュゲートがＣＤ３７−陽性リンパ腫細胞系統の特異的細胞周期停止をもたらしたことを示している。
（実施例１６）
インビトロ細胞傷害アッセイ
細胞生育を阻害する抗ＣＤ３７抗体コンジュゲートの能力を抗体に関して実施例１０で記載したとおりインビトロの細胞傷害アッセイにおいて計測した。要すれば、完全ＲＰＭＩ培地（ＲＰＭＩ−１６４０、１０％ウシ胎児血清、２ｍＭグルタミン、１％ペニシリン−ストレプトマイシン、全試薬入手元Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）１００μＬ中ウェル当たり５０００細胞で標的細胞をプレーティングした。３倍連続希釈により完全ＲＰＭＩ培地中にコンジュゲートを添加し、そして１００μＬをウェル当たり添加した。最終濃度は典型的には３ｘ１０−８Ｍ〜４．６ｘ１０−１２Ｍとなった。細胞を４〜５日間、湿潤５％ＣＯ２インキュベーター中３７℃においてインキュベートした。残存細胞の生存性は比色ＷＳＴ−８アッセイにより抗体アッセイに関して記載した通り測定し、マルチウェルプレートリーダー（DojindoMolecularTechnologies, Inc., Rockville, MD, US）中４５０ｎｍにおける吸光度（Ａ４５０）を計測した。パーセント生存性は未投与細胞の入ったウェルの平均値で各投与試料の値を割ることにより計算した。各投与に関し片対数プロットにおいて抗体濃度に対してパーセント生存性値をプロットした。
種々の抗体のＳＭＣＣ−ＤＭ１コンジュゲートのインビトロ細胞毒性
種々の抗ＣＤ３７抗体で作成したＳＭＣＣ−ＤＭ１コンジュゲートのインビトロの細胞毒性を非特異的ｈｕＩｇＧ−ＳＭＣＣ−ＤＭ１コンジュゲートの活性と比較した。ｈｕＣＤ３７−３−ＳＭＣＣ−ＤＭ１、ｈｕＣＤ３７−３８−ＳＭＣＣ−ＤＭ１、ｈｕＣＤ３７−５０−ＳＭＣＣ−ＤＭ１、ｈｕＣＤ３７−５１−ＳＭＣＣ−ＤＭ１、ｈｕＣＤ３７−５６−ＳＭＣＣ−ＤＭ１、ｈｕＣＤ３７−５７−ＳＭＣＣ−ＤＭ１、又は未結合ｈｕＩｇＧ１−ＳＭＣＣ−ＤＭ１対照コンジュゲートとともにインキュベートしたＤａｕｄｉ細胞について典型的な細胞傷害アッセイの結果を図２４Ａに示す。全ての特異的コンジュゲートが対照コンジュゲートと比較して特異的細胞殺傷をもたらしており、そして試験した最高濃度において細胞の生存性を完全に低減した。ＥＣ５０はｈｕＣＤ３７−３、ｈｕＣＤ３７−３８、ｈｕＣＤ３７−５０、ｈｕＣＤ３７−５１、ｈｕＣＤ３７−５６及びｈｕＣＤ３７−５７のＳＭＣＣ−ＤＭ１コンジュゲートに関してそれぞれ０．０６７ｎＭ、０．０９８ｎＭ、０．１３ｎＭ、０．２０ｎＭ、０．３１ｎＭ及び０．３５ｎＭに相当している。一方、非結合アイソタイプ対照抗体のＳＭＣＣ−ＤＭ１コンジュゲートは僅か２０ｎＭのＥＣ５０値の細胞殺傷をもたらした。
同様に、図２４Ｂは５日間ｈｕＣＤ３７−３−ＳＭＣＣ−ＤＭ１、ｈｕＣＤ３７−３８−ＳＭＣＣ−ＤＭ１、ｈｕＣＤ３７−５０−ＳＭＣＣ−ＤＭ１、ｈｕＣＤ３７−５１−ＳＭＣＣ−ＤＭ１、又は未結合ｈｕＩｇＧ１−ＳＭＣＣ−ＤＭ１対照コンジュゲートとともにインキュベートしたＧｒａｎｔａ−５１９細胞を用いた典型的な細胞傷害アッセイの結果を示す。全ての特異的ＳＭＣＣ−ＤＭ１の投与は試験した最高濃度において生存性を完全に低減しており、ＥＣ５０値はｈｕＣＤ３７−３−ＳＭＣＣ−ＤＭ１、ｈｕＣＤ３７−３８−ＳＭＣＣ−ＤＭ１、ｈｕＣＤ３７−５０−ＳＭＣＣ−ＤＭ１、及びｈｕＣＤ３７−５１−ＳＭＣＣ−ＤＭ１のＳＭＣＣ−ＤＭ１コンジュゲートについてそれぞれ０．４７ｎＭ、０．０７４ｎＭ、０．１２ｎＭ及び０．２５ｎＭであった。一方、非結合アイソタイプ対照抗体のＳＭＣＣ−ＤＭ１コンジュゲートは僅か２０ｎＭのＥＣ５０値の細胞殺傷をもたらした。
ｈｕＣＤ３７−３−ＳＭＣＣ−ＤＭ１、−ＳＰＰ−ＤＭ１及びスルホ−ｍａｌ−ＤＭ４コンジュゲートのインビトロの細胞傷害性
Ｄａｕｄｉ、Ｇｒａｎｔａ−５１９及びＢＪＡＢ細胞に対するｈｕＣＤ３７−３−ＳＭＣＣ−ＤＭ１、−ＳＰＰ−ＤＭ１、及びスルホ−ｍａｌ−ＤＭ４コンジュゲートのインビトロの細胞傷害を非特異的ｈｕＩｇＧ１−ＳＭＣＣ−ＤＭ１コンジュゲートの活性と比較した。試験した全コンジュゲートが試験した最高濃度において完全にＤａｕｄｉ細胞の生存性を低減しており、ＥＣ５０値はｈｕＣＤ３７−３−ＳＭＣＣ−ＤＭ１、ｈｕＣＤ３７−３−ＳＰＰ−ＤＭ１、及びｈｕＣＤ３７−３−スルホ−ｍａｌ−ＤＭ４について、それぞれ０．０６５ｎＭ、０．１２ｎＭ及び０．１４ｎＭ、であった。一方、非特異的ｈｕＩｇＧ１−ＳＭＣＣ−ＤＭ１コンジュゲートは１９ｎＭのＥＣ５０を有していた。同様に、試験した全コンジュゲートが試験した最高濃度において完全にＧｒａｎｔａ−５１９細胞の生存性を低減しており、ＥＣ５０値はｈｕＣＤ３７−３−ＳＭＣＣ−ＤＭ１、ｈｕＣＤ３７−３−ＳＰＰ−ＤＭ１、及びｈｕＣＤ３７−３−スルホ−ｍａｌ−ＤＭ４について、それぞれ０．０４７ｎＭ、０．１３ｎＭ及び０．０８８ｎＭであった。一方、非特異的ｈｕＩｇＧ１−ＳＭＣＣ−ＤＭ１コンジュゲートは１９ｎＭのＥＣ５０を有していた。最後に、試験した全コンジュゲートが試験した最高濃度において完全にＢＪＡＢ細胞の生存性を低減しており、ＥＣ５０値はｈｕＣＤ３７−３−ＳＭＣＣ−ＤＭ１、ｈｕＣＤ３７−３−ＳＰＰ−ＤＭ１、及びｈｕＣＤ３７−３−スルホ−ｍａｌ−ＤＭ４について、それぞれ０．０４１ｎＭ、０．１１ｎＭ及び０．１１ｎＭであった。一方、非特異的ｈｕＩｇＧ１−ＳＭＣＣ−ＤＭ１コンジュゲートは１６ｎＭのＥＣ５０を有していた。
ｈｕＣＤ３７−３−ＳＭＣＣ−ＤＭ１及びｈｕＣＤ３７−３−ＰＥＧ４−ｍａｌ−ＤＭ１コンジュゲートのインビトロ細胞傷害
リンパ腫細胞系統のパネルに対するｈｕＣＤ３７−３−ＳＭＣＣ−ＤＭ１及びｈｕＣＤ３７−３−ＰＥＧ４−ｍａｌ−ＤＭ１コンジュゲートのインビトロ細胞毒性を非特異的ｈｕＩｇＧ１−ＳＭＣＣ−ＤＭ１コンジュゲートの活性と比較した。ｈｕＣＤ３７−３コンジュゲートの投与は試験した最高濃度においてＤａｕｄｉ細胞の生存性を完全に低減し、ＥＣ５０はｈｕＣＤ３７−３−ＳＭＣＣ−ＤＭ１又はｈｕＣＤ３７−３−ＰＥＧ４−ｍａｌ−ＤＭ１コンジュゲートについてそれぞれ０．０３６ｎＭ又は０．０１８ｎＭであった。一方、非結合アイソタイプ対照コンジュゲートは、ｈｕＣＤ３７−３−ＳＭＣＣ−ＤＭ１又はｈｕＣＤ３７−３−ＰＥＧ４−ｍａｌ−ＤＭ１についてそれぞれ１６ｎＭ又は３０ｎＭ超のＥＣ５０で生存性を低減した。同様に、ｈｕＣＤ３７−３コンジュゲートの投与は試験した最高濃度においてＧｒａｎｔａ−５１９細胞の生存性を完全に低減し、ＥＣ５０はｈｕＣＤ３７−３−ＳＭＣＣ−ＤＭ１又はｈｕＣＤ３７−３−ＰＥＧ４−ｍａｌ−ＤＭ１コンジュゲートについてそれぞれ０．０１４ｎＭ又は０．０１２ｎＭであった。一方、非結合アイソタイプ対照コンジュゲートは、ｈｕＣＤ３７−３−ＳＭＣＣ−ＤＭ１又はｈｕＣＤ３７−３−ＰＥＧ４−ｍａｌ−ＤＭ１についてそれぞれ６．０ｎＭ又は１２ｎＭ超のＥＣ５０で生存性を低減した。
リンパ腫細胞系統のパネルに対するｈｕＣＤ３７−３−ＳＭＣＣ−ＤＭ１及びｈｕＣＤ３７−３−ＰＥＧ４−ｍａｌ−ＤＭ１コンジュゲートのインビトロ細胞毒性を非特異的ｈｕＩｇＧ１−ＳＭＣＣ−ＤＭ１コンジュゲートの活性と比較した。ｈｕＣＤ３７−３コンジュゲートの投与は試験した最高濃度においてＢＪＡＢ細胞の生存性を完全に低減し、ＥＣ５０はｈｕＣＤ３７−３−ＳＭＣＣ−ＤＭ１又はｈｕＣＤ３７−３−ＰＥＧ４−ｍａｌ−ＤＭ１コンジュゲートについてそれぞれ０．０１９ｎＭ又は０．０１０ｎＭであった。一方、非結合アイソタイプ対照コンジュゲートは、ｈｕＣＤ３７−３−ＳＭＣＣ−ＤＭ１又はｈｕＣＤ３７−３−ＰＥＧ４−ｍａｌ−ＤＭ１についてそれぞれ１３ｎＭ又は１７ｎＭのＥＣ５０で生存性を低減した。同様に、ｈｕＣＤ３７−３コンジュゲートの投与は試験した最高濃度においてＳＵ−ＤＨＬ−４細胞の生存性を完全に低減し、ＥＣ５０はｈｕＣＤ３７−３−ＳＭＣＣ−ＤＭ１又はｈｕＣＤ３７−３−ＰＥＧ４−ｍａｌ−ＤＭ１コンジュゲートについてそれぞれ０．０３１ｎＭ又は０．０２４ｎＭであった。一方、非結合アイソタイプ対照コンジュゲートは、ｈｕＣＤ３７−３−ＳＭＣＣ−ＤＭ１又はｈｕＣＤ３７−３−ＰＥＧ４−ｍａｌ−ＤＭ１の両方について３０ｎＭ超のＥＣ５０で生存性を低減した。ｈｕＣＤ３７−３−ＳＭＣＣ−ＤＭ１コンジュゲートは又、ＦＬ細胞系統ＤＯＨＨ−２並びにＣＬＬ細胞系統、例えばＪＶＭ−２及びＪＶＭ−３に対して力価を示した（図３２Ｂ）。
ｈｕＣＤ３７−３コンジュゲートの投与は試験した最高濃度においてＲａｊｉ細胞の生存性を完全に低減し、ＥＣ５０はｈｕＣＤ３７−３−ＳＭＣＣ−ＤＭ１又はｈｕＣＤ３７−３−ＰＥＧ４−ｍａｌ−ＤＭ１コンジュゲートについてそれぞれ０．０７１ｎＭ又は０．０４５ｎＭであった。一方、非結合アイソタイプ対照コンジュゲートは、ｈｕＣＤ３７−３−ＳＭＣＣ−ＤＭ１又はｈｕＣＤ３７−３−ＰＥＧ４−ｍａｌ−ＤＭ１についてそれぞれ２４ｎＭ又は４７ｎＭのＥＣ５０で生存性を低減した。次に同じコンジュゲートを、Ｒａｊｉ−ＶＣＲと称されるビンクリスチン耐性Ｒａｊｉクローンにおいて試験した。親Ｒａｊｉ細胞に関して観察されたとおり、両方のコンジュゲートは特異的細胞殺傷を示した。ｈｕＣＤ３７−３コンジュゲートの投与は試験した最高濃度においてＲａｊｉ−ＶＣＲ細胞の生存性を完全に低減し、ＥＣ５０はｈｕＣＤ３７−３−ＳＭＣＣ−ＤＭ１又はｈｕＣＤ３７−３−ＰＥＧ４−ｍａｌ−ＤＭ１コンジュゲートについてそれぞれ０．１１ｎＭ又は０．０３７ｎＭであった。一方、非結合アイソタイプ対照コンジュゲートは、ｈｕＣＤ３７−３−ＳＭＣＣ−ＤＭ１又はｈｕＣＤ３７−３−ＰＥＧ４−ｍａｌ−ＤＭ１についてそれぞれ４６ｎＭ又は１００ｎＭのＥＣ５０で生存性を低減した。
ｈｕＣＤ３７−３コンジュゲートの投与は試験した最高濃度においてＮａｍａｌｗａ細胞の生存性を完全に低減し、ＥＣ５０はｈｕＣＤ３７−３−ＳＭＣＣ−ＤＭ１又はｈｕＣＤ３７−３−ＰＥＧ４−ｍａｌ−ＤＭ１コンジュゲートについてそれぞれ０．０３３ｎＭ又は０．０２４ｎＭであった。一方、非結合アイソタイプ対照コンジュゲートは、ｈｕＣＤ３７−３−ＳＭＣＣ−ＤＭ１又はｈｕＣＤ３７−３−ＰＥＧ４−ｍａｌ−ＤＭ１についてそれぞれ２０ｎＭ又は３０ｎＭ超のＥＣ５０で生存性を低減した。同様に、ｈｕＣＤ３７−３コンジュゲートの投与は試験した最高濃度においてＲａｍｏｓ細胞の生存性を完全に低減し、ＥＣ５０はｈｕＣＤ３７−３−ＳＭＣＣ−ＤＭ１又はｈｕＣＤ３７−３−ＰＥＧ４−ｍａｌ−ＤＭ１コンジュゲートについてそれぞれ０．１６ｎＭ又は０．０６９ｎＭであった。一方、非結合アイソタイプ対照コンジュゲートは、ｈｕＣＤ３７−３−ＳＭＣＣ−ＤＭ１については２０ｎＭ、そしてｈｕＣＤ３７−３−ＰＥＧ４−ｍａｌ−ＤＭ１については３０ｎＭ超のＥＣ５０で生存性を低減した。
抗原陰性Ｍｏｌｔ−４細胞に対するｈｕＣＤ３７−３−ＳＭＣＣ−ＤＭ１のインビトロ細胞傷害
ｈｕＣＤ３７−３−ＳＭＣＣ−ＤＭ１の細胞傷害の特異性を更に確認するために、その活性を、非ＣＤ３７発現Ｍｏｌｔ−４Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病細胞系統に対する非特異的ｈｕＩｇＧ−ＭＣＣ−ＤＭ１コンジュゲートと比較した。比較的乏しい非特異的細胞傷害を捕らえるために両方のコンジュゲートを高濃度で本実験では使用した。ｈｕＣＤ３７−３−ＳＭＣＣ−ＤＭ１及び非特異的コンジュゲートはそれぞれ３８ｎＭ及び４２ｎＭのＥＣ５０で同じ細胞傷害を示した。
抗ＣＤ３７抗体マイタンシノイドコンジュゲートのインビトロ細胞傷害のまとめ
これらの細胞傷害の結果を総括すれば、単離された抗ＣＤ３７抗体を用いて作成したコンジュゲートはＣＤ３７陽性リンパ腫細胞系統のパネルに対して特異的な細胞傷害性を示したことは明らかである（図３２Ｂ）。試験した各々の場合において、各ＣＤ３７発現細胞系統について良好な特異性のウインドウが観察され、細胞傷害性が標的細胞への特異的抗ＣＤ３７抗体結合の結果であることを示唆している。更に又、ｈｕＣＤ３７−３−ＳＭＣＣ−ＤＭ１及び非特異的コンジュゲートは抗原陰性Ｍｏｌｔ−４細胞に対して同じく乏しい細胞傷害性を示した。これは、この例示されるコンジュゲートで観察される細胞傷害がＣＤ３７発現依存性であることを示している。ｈｕＣＤ３７−３抗体は又、ＤＯＨＨ−２、Ｇｒａｎｔａ−５１９、ＳＵ−ＤＨＬ−４、ＪＶＭ−２及びＪＶＭ−３を包含する多くの細胞系統に対しても活性であった。一方、抗ＣＤ３７ＳＭＩＰＴＲＵ−０１６化合物はこれらの細胞系統の何れの生存に対しても直接の作用を有さなかった。抗ＣＤ２０抗体は、定量的フローサイトメトリーにおいて計測される通りしばしばより高値のＣＤ２０発現レベルにも関わらずこれらの細胞系統の大部分においてｈｕＣＤ３７−３よりも低値の直接的活性を示していた（図３２Ａ）。
（実施例１７）
ＢＪＡＢ異種移植片モデルにおける抗ＣＤ３７抗体及びそのＳＭＣＣ−ＤＭ１コンジュゲートのインビボの薬効
抗ＣＤ３７抗体及びそのＳＭＣＣ−ＤＭ１コンジュゲートを、ＳＣＩＤマウスに皮下移植されたＢＪＡＢリンパ腫を用いながら樹立された異種移植片モデルにおいて試験した。平均腫瘍体積約１２０ｍｍ３に腫瘍が達した時点で動物を腫瘍体積により投与群に無作為に割り付け、そして、（Ａ）ｈｕＣＤ３７-３Ａｂ、ｈｕＣＤ３７-３−ＳＭＣＣ−ＤＭ１、ｈｕＣＤ３７-５０Ａｂ、ｈｕＣＤ３７-５０−ＳＭＣＣ−ＤＭ１又は（Ｂ）ｈｕＣＤ３７-３８Ａｂ、ｈｕＣＤ３７-３８−ＳＭＣＣ−ＤＭ１、ｈｕＣＤ３７-５６Ａｂ、ｈｕＣ
Ｄ３７-５６−ＳＭＣＣ−ＤＭ１の何れか１０ｍｇ／ｋｇを、細胞接種後第１２日に１回
投与した。種々異なる投与群の平均腫瘍体積を図２５において腫瘍細胞接種後の時間に対してプロットする。何れの抗体の投与も、平均腫瘍体積の中程度の低減をもたらしたのに対し、ＳＭＣＣ−ＤＭ１コンジュゲートの何れかの投与は平均腫瘍体積のより顕著な低減をもたらした。更に又、各投与につき、ベヒクル投与群のメジアン腫瘍体積で割った各投与群のメジアン腫瘍体積に相当する％Ｔ／Ｃ値を計算した。４２％より低値の％Ｔ／Ｃ値を有する投与を活性とみなし、
１２％未満の％Ｔ／Ｃを有する投与を高度に活性と見なす。試験した全てのＳＭＣＣ−ＤＭ１コンジュゲートの投与はメジアン腫瘍体積の顕著な低減をもたらした。細胞接種後第２９日の％Ｔ／ＣはｈｕＣＤ３７−３−ＳＭＣＣ−ＤＭ１、ｈｕＣＤ３７−５０−ＳＭＣＣ−ＤＭ１、ｈｕＣＤ３７−３８−ＳＭＣＣ−ＤＭ１、又はｈｕＣＤ３７−５６−ＳＭＣＣ−ＤＭ１についてそれぞれ２０％、２０％、９％又は４％に相当した。
ＢＪＡＢ異種移植片モデルにおけるｈｕＣＤ３７−３抗体、スルホ−ｍａｌ−ＤＭ４、−ＳＰＰ−ＤＭ１及びＳＭＣＣ−ＤＭ１コンジュゲートのインビボの薬効
例示されるｈｕＣＤ３７−３抗体のスルホ−ｍａｌ−ＤＭ４及びＳＰＰ−ＤＭ１コンジュゲートを、ＳＣＩＤマウスに静脈内移植したＢＪＡＢリンパ腫細胞を用いた異種移植片モデルにおいてＳＭＣＣ−ＤＭ１コンジュゲートと比較した。
平均腫瘍体積約１２０ｍｍ３に腫瘍が達した時点で動物を腫瘍体積により投与群に無作為に割り付け、そして、ｈｕＣＤ３７−３Ａｂ、ｈｕＣＤ３７−３−ＳＭＣＣ−ＤＭ１、ｈｕＣＤ３７−３−スルホ−ｍａｌ−ＤＭ４の１０ｍｇ／ｋｇ又はｈｕＣＤ３７−３−ＳＰＰ−ＤＭ１の５ｍｇ／ｋｇの何れかを
、細胞接種後第９日に１回投与した。種々異なる投与群の平均腫瘍体積を図２６において腫瘍細胞接種後の時間に対してプロットする。何れのコンジュゲートの投与も、平均腫瘍体積の顕著な低減をもたらした。各投与群のメジアン腫瘍体積を用いながら各投与につき上記したとおり％Ｔ／Ｃ値を計算した。細胞接種後第２１日の％Ｔ／ＣはｈｕＣＤ３７−３Ａｂ、ｈｕＣＤ３７−３−ＳＭＣＣ−ＤＭ１、ｈｕＣＤ３７−３−スルホ−ｍａｌ−ＤＭ４又はｈｕＣＤ３７−３−ＳＰＰ−ＤＭ１について、それぞれ４９％、５％、７％又は４％であった。第１２１日の試験終了時に、ｈｕＣＤ３７−３−スルホ−ｍａｌ−ＤＭ４投与は８匹中３匹の無腫瘍生存動物（ＴＦＳ）をもたらしたのに対し、ｈｕＣＤ３７−３−ＳＰＰ−ＤＭ１投与は８匹中１匹のＴＦＳであった。ｈｕＣＤ３７−３抗体、ｈｕＣＤ３７−３−ＳＭＣＣ−ＤＭ１又はＰＢＳベヒクル対照群ではＴＦＳは観察されなかった。これはｈｕＣＤ３７−３抗体のマイタンシノイドコンジュゲート、例えばＳＭＣＣ−ＤＭ１、スルホ−ｍａｌ−ＤＭ４又はＳＰＰ−ＤＭ１コンジュゲートがＢＪＡＢモデルにおいて高度に活性であったことを示している。
ＳＵ−ＤＨＬ−４異種移植片モデルにおけるｈｕＣＤ３７−３抗体、スルホ−ｍａｌ−ＤＭ４、−ＳＰＰ−ＤＭ１及びＳＭＣＣ−ＤＭ１コンジュゲートのインビボの薬効
ＳＣＩＤマウスに皮下移植されたＳＵ−ＤＨＬ−４びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫細胞を用いた第２の異種移植片モデルを利用して、例示されるｈｕＣＤ３７−３抗体のスルホ−ｍａｌ−ＤＭ４及びＳＰＰ−ＤＭ１コンジュゲートのインビボ薬効をＳＭＣＣ−ＤＭ１コンジュゲートと比較しながら評価した。腫瘍樹立時に動物を体重により投与群に無作為に割り付け、そして、ｈｕＣＤ３７−３Ａｂ、ｈｕＣＤ３７−３−ＳＭＣＣ−ＤＭ１、ｈｕＣＤ３７−３−スルホ−ｍａｌ−ＤＭ４の１０ｍｇ／ｋｇ又はｈｕＣＤ３７−３−ＳＰＰ−ＤＭ１の５ｍｇ／ｋｇの何れかを細胞接種後第１７日に１回投与した。種々異なる投与群のメジアン腫瘍体積を図２７において腫瘍細胞接種後の時間に対してプロットする。ｈｕＣＤ３７−３抗体の投与はメジアン腫瘍体積の低減をもたらし、コンジュゲートの何れの投与も、メジアン腫瘍体積のより顕著な低減をもたらした。各投与につき上記したとおり％Ｔ／Ｃ値を計算した。細胞接種後第３７日の％Ｔ／ＣはｈｕＣＤ３７−３、ｈｕＣＤ３７−３−ＳＭＣＣ−ＤＭ１、ｈｕＣＤ３７−３−スルホ−ｍａｌ−ＤＭ４又はｈｕＣＤ３７−３−ＳＰＰ−ＤＭ１について、それぞれ３２％、１％、１％又は３％であった。第１２５日の試験終了時、ｈｕＣＤ３７−３−ＳＭＣＣ−ＤＭ１又はｈｕＣＤ３７−３−スルホ−ｍａｌ−ＤＭ４投与は１０匹中８匹の無腫瘍生存動物（ＴＦＳ）をもたらし、ｈｕＣＤ３７−３−ＳＰＰ−ＤＭ１投与は１０匹中９匹のＴＦＳであった。ｈｕＣＤ３７−３抗体又はＰＢＳベヒクル対照群ではＴＦＳは観察されなかった。これはｈｕＣＤ３７−３抗体そのものがＳＵ−ＤＨＬ−４モデルにおいて単回１０ｍｇ／ｋｇ用量で活性であったことを示している。更に又、マイタンシノイドコンジュゲート、例えばＳＭＣＣ−ＤＭ１、スルホ−ｍａｌ−ＤＭ４又はＳＰＰ−ＤＭ１コンジュゲートは抗体に薬効を追加し、そしてこのモデルにおいて更に高値の力価をもたらしている。
ＢＪＡＢ異種移植片モデルにおけるｈｕＣＤ３７−３抗体、ＰＥＧ４−ｍａｌ−ＤＭ４及びＳＭＣＣ−ＤＭ１コンジュゲートのインビボの薬効
ｈｕＣＤ３７−抗体及びそのＰＥＧ４−ｍａｌ−ＤＭ１及びＳＭＣＣ−ＤＭ１コンジュゲートを、ＳＣＩＤマウスに皮下移植されたＢＪＡＢリンパ腫細胞を用いて樹立された異種移植片モデルにおいて試験した。平均腫瘍体積約１２０ｍｍ３に腫瘍が達した時点で動物を腫瘍体積により投与群に無作為に割り付け、そして、ｈｕＣＤ３７−３Ａｂ、ｈｕＣＤ３７−３−ＳＭＣＣ−ＤＭ１、又はｈｕＣＤ３７−３−ＰＥＧ４−ｍａｌ−ＤＭ１の何れか１０ｍｇ／ｋｇを細胞移植後第９日に１回投与した。図２８から解るとおり、何れのコンジュゲートの投与も平均腫瘍体積の顕著な低減をもたらした。各投与群のメジアン腫瘍体積を用いながら各投与につき上記したとおり％Ｔ／Ｃ値を計算した。細胞接種後第２４日の％Ｔ／ＣはｈｕＣＤ３７−３、ｈｕＣＤ３７−３−ＳＭＣＣ−ＤＭ１又はｈｕＣＤ３７−３−ＰＥＧ４−ｍａｌ−ＤＭ１についてそれぞれ４８％、１６％又は５％であった。細胞接種後第７４日において、ｈｕＣＤ３７−３−ＳＭＣＣ−ＤＭ１投与は９匹中１匹の無腫瘍生存動物（ＴＦＳ）をもたらし、ｈｕＣＤ３７−３−ＰＥＧ４−ｍａｌ−ＤＭ１投与は９匹中１匹のＴＦＳであった。ｈｕＣＤ３７−３抗体又はＰＢＳベヒクル対照群ではＴＦＳは観察されなかった。更に又、ｈｕＣＤ３７−３−ＳＭＣＣ−ＤＭ１はこのモデルにおいて５ｍｇ／ｋｇの単回用量でも活性であり、細胞接種後第２４日の％Ｔ／Ｃ値は３４％であった。これはｈｕＣＤ３７−３抗体のマイタンシノイドコンジュゲート、例えばＳＭＣＣ−ＤＭ１又はＰＥＧ４−ｍａｌ−ＤＭ１コンジュゲートはＢＪＡＢモデルにおいて高度に活性であったことを示している。
ＳＵ−ＤＨＬ−４異種移植片モデルにおけるｈｕＣＤ３７−３抗体、ＰＥＧ４−ｍａｌ−ＤＭ４及びＳＭＣＣ−ＤＭ１コンジュゲートのインビボの薬効
ｈｕＣＤ３７−抗体及びそのＰＥＧ４−ｍａｌ−ＤＭ１及びＳＭＣＣ−ＤＭ１コンジュゲートを、ＳＣＩＤマウスに皮下移植されたＳＵ−ＤＨＬ−４びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫細胞を用いて樹立された異種移植片モデルにおいて試験した。動物を体重により投与群に無作為に割り付け、そして、ｈｕＣＤ３７−３Ａｂ、ｈｕＣＤ３７−３−ＳＭＣＣ−ＤＭ１、又はｈｕＣＤ３７−３−ＰＥＧ４−ｍａｌ−ＤＭ１の何れか１０ｍｇ／ｋｇを細胞移植後第１５日に１回投与した。種々異なる投与群の平均腫瘍体積を図２９において腫瘍細胞接種後の時間に対してプロットする。ｈｕＣＤ３７−３抗体の投与は平均腫瘍体積の低減をもたらし、何れのコンジュゲートの投与も平均腫瘍体積のより顕著な低減をもたらしたことがわかる。各投与群のメジアン腫瘍体積を用いながら各投与につき上記したとおり％Ｔ／Ｃ値を計算した。細胞接種後第３８日の％Ｔ／ＣはｈｕＣＤ３７−３、ｈｕＣＤ３７−３−ＳＭＣＣ−ＤＭ１又はｈｕＣＤ３７−３−ＰＥＧ４−ｍａｌ−ＤＭ１についてそれぞれ３４％、４％又は２％であった。細胞接種後第７４日において、ｈｕＣＤ３７−３−ＳＭＣＣ−ＤＭ１投与は１０匹中８匹の無腫瘍生存動物（ＴＦＳ）をもたらし、ｈｕＣＤ３７−３−ＰＥＧ４−ｍａｌ−ＤＭ１投与は１０匹中１０匹のＴＦＳであった。ｈｕＣＤ３７−３抗体又はＰＢＳベヒクル対照群ではＴＦＳは観察されなかった。これはｈｕＣＤ３７−３抗体そのものがＳＵ−ＤＨＬ−４モデルにおいて単回１０ｍｇ／ｋｇ用量で活性であったことを示している。更に又、マイタンシノイドコンジュゲート、例えばＳＭＣＣ−ＤＭ１、ＰＥＧ４−ｍａｌ−ＤＭ４又はＳＰＰ−ＤＭ１コンジュゲートは抗体への未コンジュゲート抗体薬効と比較して増強した薬効を示し、そしてこのモデルにおいて更に高値の力価をもたらしている。ｈｕＣＤ３７−３−ＳＭＣＣ−ＤＭ１コンジュゲートもまた、このモデルにおいて２．５又は５ｍｇ／ｋｇの単回用量において強力な薬効を示しており、細胞接種後第３７日の％Ｔ／Ｃ値はそれぞれ１８％及び６％であった。
ＤｏＨＨ２異種移植片モデルにおけるｈｕＣＤ３７−３抗体、ｈｕＣＤ３７−３−ＳＭＣＣ−ＤＭ１コンジュゲート、リツキシマブ抗体及びシクロホスファミド、ビンクリスチン及びプレドニソン（ＣＶＰ）の投薬法のインビボの薬効
ｈｕＣＤ３７−３抗体及びそのＳＭＣＣ−ＤＭ１コンジュゲートを、ＳＣＩＤマウスに皮下移植されたＤｏＨＨ２濾胞性リンパ腫を用いて樹立された異種移植片モデルにおいて試験した。動物は腫瘍体積により投与群に無作為に割り付け、そして１０ｍｇ／ｋｇのｈｕＣＤ３７−３抗体又はｈｕＣＤ３７−３−ＳＭＣＣ−ＤＭ１コンジュゲートの単回投与；３週間週当たり２回リツキシマブ２ｍｇ／ｋｇの６回投薬；又は単回４ｍｇ／ｋｇ用量のシクロホスファミド及び０．５ｍｇ／ｋｇのビンクリスチンと共に５回毎日０．２ｍｇ／ｋｇ用量のプレドニソン（ＣＶＰ）の投薬法の何れかを用いて接種後第１２日に投与を開始した。種々異なる投与群のメジアン腫瘍体積を、図３０において腫瘍細胞接種後の時間に対してプロットした。ｈｕＣＤ３７−３抗体の投与はメジアン腫瘍体積の低減をもたらし、ｈｕＣＤ３７−３−ＳＭＣＣ−ＤＭ１コンジュゲートの投与はリツキシマブ投与と同様のメジアン腫瘍低減及びＣＶＰ投与と比較した場合により持続性のあるメジアン腫瘍低減をもたらした。所定の大きさに到達するまでの投与群（Ｔ）及び対照群（Ｃ）の腫瘍にとって必要なメジアン時間（日数）として腫瘍生育遅延（Ｔ−Ｃ値）を定義し、そして、無腫瘍生存動物を除く各投与群について計算した。８００ｍｍ３に到達するためのメジアン投与腫瘍のＴ−Ｃ値は、ｈｕＣＤ３７−３、ｈｕＣＤ３７−３−ＳＭＣＣ−ＤＭ１、リツキシマブ及びＣＶＰについて、それぞれ８、２５、２４及び１３日に相当した。細胞接種後第１３０日の試験終了時、ｈｕＣＤ３７−３−ＳＭＣＣ−ＤＭ１投与は９匹中１匹の無腫瘍生存動物（ＴＦＳ）をもたらした。ｈｕＣＤ３７−抗体、リツキシマブ、ＣＶＰ又はＰＢＳベヒクル対照群ではＴＦＳは観察されなかった。ＳＭＣＣ−ＤＭ１コンジュゲートはＤｏＨＨ２モデルにおいて、リツキシマブに匹敵する腫瘍生育遅延及び未コンジュゲート抗体及びＣＶＰ投与と比較して増強された腫瘍生育遅延を示した。
ＪＶＭ−３異種移植片モデルにおけるｈｕＣＤ３７−３抗体、ｈｕＣＤ３７−３−ＳＭＣＣ−ＤＭ１コンジュゲート、オファツムマブ抗体及びベンダムスチンのインビボの薬効
ｈｕＣＤ３７−３抗体及びそのＳＭＣＣ−ＤＭ１コンジュゲートを、ＳＣＩＤマウスに皮下移植されたＪＶＭ−３慢性リンパ性白血病細胞を用いて樹立された異種移植片モデルにおいて試験した。動物は腫瘍体積により投与群に無作為に割り付け、そして単回投薬の１０ｍｇ／ｋｇのｈｕＣＤ３７−３抗体、５又は１０ｍｇ／ｋｇ用量のｈｕＣＤ３７−３-ＳＭＣＣ−ＤＭ１コンジュゲート、３週間週当たり２階のオファツムマブ５ｍｇ／ｋｇの６回投薬、又は、単回５０ｍｇ／ｋｇ投薬のベンダムスチンの何れかを用いて接種後第７日に投与を開始した。種々異なる投与群のメジアン腫瘍体積を、図３１において腫瘍細胞接種後の時間に対してプロットした。ｈｕＣＤ３７−３抗体の投与はメジアン腫瘍体積の低減をもたらし、ｈｕＣＤ３７−３−ＳＭＣＣ−ＤＭ１コンジュゲートの投与はメジアン腫瘍体積のより顕著な低減をもたらした。各投与群のメジアン腫瘍体積を用いながら各投与につき上記したとおり％Ｔ／Ｃ値を計算した。細胞接種後第２０日の％Ｔ／ＣはｈｕＣＤ３７−３、５ｍｇ／ｋｇのｈｕＣＤ３７−３−ＳＭＣＣ−ＤＭ１、１０ｍｇ／ｋｇのｈｕＣＤ３７−３−ＳＭＣＣ−ＤＭ１、オファツムマブ及びベンダムスチンについてそれぞれ３１％、１９％、１０％、３５％及び３８％に相当した。細胞接種後第７６日の試験終了時に、ｈｕＣＤ３７およびオファツムマブ抗体投与は共に１０匹中１匹の無腫瘍生存動物（ＴＦＳ）をもたらし、５及び１０ｍｇ／ｋｇにおけるｈｕＣＤ３７−３−ＳＭＣＣ−ＤＭ１はそれぞれ１０匹中１匹及び２匹のＴＦＳであった。ベンダムスチン又はＰＢＳベヒクル対照群ではＴＦＳは観察されなかった。これはｈｕＣＤ３７−３抗体そのものがＪＶＭ−３モデルにおいて単回１０ｍｇ／ｋｇ用量で活性であったことを示している。マイタンシノイドコンジュゲート、ｈｕＣＤ３７−３−ＳＭＣＣ−ＤＭ１は未コンジュゲート抗体と比較して増強された薬効を示した。更に又、ｈｕＣＤ３７−３−ＳＭＣＣ−ＤＭ１マイタンシノイドコンジュゲートの投与はこのモデルにおいてオファツムマブやベンダムスチン投与よりも寧ろ高値の力価をもたらした。
抗ＣＤ３７抗体コンジュゲートのインビボ薬効のまとめ
ＣＤ３７はマイタンシノイドイムノコンジュゲートの標的として評価されてこなかったが、ＣＤ２０は評価されてきた。ＣＤ３７とＣＤ２０は、両方の抗原とも４つの膜貫通ドメインと１つは小型、そして１つは大型の細胞外ループを含有する細胞表面蛋白であるため、構造的には東洋である。何れかの抗原に対する抗体は緩徐に内在化し、そして緩徐〜中程度の速度の細胞内代謝を有することがわかっている（Press等、1989,CancerRes. 49(17):4906-12, and Press等、1994, Blood.83(5):1390-7)）。ＣＤ抗体のイムノコンジュゲートが以前より評価されている。１つの例においては、抗ＣＤ２０抗体の切断不可能なＭＣＣ−ＤＭ１コンジュゲートが未コンジュゲートの抗体と同じ薬効を示し、そして同じ抗体の切断可能なＳＰＰ−ＤＭ１コンジュゲートがＳＣＩＤマウスにおけるＧｒａｎｔａ−５１９異種移植片モデルにおいて向上した薬効を示している（PolsonAG,CancerRes2009;69:2358-64）。同様に、酸安定性アミドリンカーを用いて作成されたリツキシマブのカリケアマイシンコンジュゲートはヌードマウスにおけるＲａｍｏｓ異種移植片モデルにおいては向上したインビボの薬効を示していない。酸不安定性のジメチルヒドラジドＡｃ−Ｂｕｔリンカーを用いて作成されたリツキシマブのカリケアマイシンコンジュゲートのみがこの試験において向上したインビボの薬効を示している（DiJosephJF,CancerImmunol Immunotherapy 2007;56:1107-1117）。
これとは対照的に、本発明の幾つかの単離された抗ＣＤ３７抗体の切断不可能なＳＭＣＣ−ＤＭ１コンジュゲートは未コンジュゲートの抗体と比較してＢＪＡＢ、ＳＵ−ＤＨＬ−４、ＤｏＨＨ２及びＪＶＭ−３異種移植片モデルにおいて劇的に向上したインビボの薬効を示す。このことは、単離された抗体が、それらをマイタンシノイドコンジュゲート、例えばＳＭＣＣ−ＤＭ１コンジュゲートのようにインビボでより有効とするユニークな特性を有することを示唆している。
当然ながら、概要や要約のセクションではなく詳細な説明のセクションが請求項の解釈のために使用されることを意図している。概要及び要約のセクションは本発明者等の意図する本発明の例示される実施形態の１つ以上であって全てではないものを記載しており、そして即ち、如何なる態様においても本発明及び添付請求項を限定する意図はない。
本発明は特定の機能及びその関連事項の実施を説明する機能的ビルディングブロックを用いながら上記説明してきた。これらの機能的ビルディングブロックの境界は説明の簡便化のために本明細書において任意に定義されている。代替の境界は、特定の機能及びその関連事項が適切に実施される限り、定義されることができる。
特定の実施形態の上記説明は、他者が、当該分野の知識の適用により、予定外の実験を行うことなく、本発明の一般的概念を逸脱することなくそのような特定の実施形態を容易に変更及び／又は種々の用途のために適合させることができるように、本発明の一般的性質を完全に顕示することになる。従って、そのような適合及び変更は、本明細書に示した教示及び指針に基づいて開示された実施形態の等価物の意味及び範囲に含まれることを意図している。本明細書の表現や用語は限定ではなく説明を目的としており、本明細書の用語又は表現は教示及び指針に鑑みて当業者により解釈されるべきである。
本発明の広範さは上記した例示される実施形態の何れによっても制限されるべきではなく、以下の請求項及びその等価物に従ってのみ定義されなければならない。
ポリペプチドは本明細書に記載する個々の可変軽鎖又は可変重鎖の１つを含むことができる。抗体及びポリペプチドは又、可変軽鎖及び可変重鎖の両方を含むこともできる。ネズミ、キメラ、及びヒト化ＣＤ３７−３、ＣＤ３７−１２、ＣＤ３７−５０、ＣＤ３７−５１、ＣＤ３７−５６又はＣＤ３７−５７抗体の可変軽鎖及び可変重鎖を以下の表３及び４に示す。



Claims (1)

  1. ＣＤ３７結合分子及びそのイムノコンジュゲートなど。
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