TWI593424B - 能與ｃｄ３７結合之分子類及彼等之免疫共軛物類 - Google Patents

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彼得 帕克
丹尼爾 泰佛斯
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Description

能與CD37結合之分子類及彼等之免疫共軛物類
本發明總體上涉及結合CD37的抗體、及其抗原結合片段、多肽以及免疫共軛物，而且涉及使用這些CD37結合分子來治療諸如B細胞惡性腫瘤的方法。
白細胞抗原CD37(“CD37”)，也稱為GP52-40、四跨膜蛋白-26或TSPAN26，是四跨膜蛋白超家族的跨膜蛋白(Maecker等人，1997 FASEB J. 11:428-442)。它是具有四個跨膜結構域的重糖基化蛋白，在前B細胞至外周成熟B細胞階段過程中在B細胞上表達，但在至漿細胞的終末分化中缺乏。(Link等人，1987,J Pathol. 152:12-21)。CD37抗原僅微弱表達於T細胞、髓樣細胞以及粒細胞(Schwartz-Albiez等人，1988,J. Immunol.,140(3)905-914)。然而，CD37還表達於惡性B細胞，例如那些建立的非何傑金氏淋巴瘤(NHL)和慢性淋巴系白血病(CLL)(Moore等人，1986,J Immunol. 137(9):3013-8)。該表達情況表明，CD37表現為B細胞惡性腫瘤的有前景的治療靶。
儘管CD37的確切生理學作用不清楚，但研究表明其在T細胞增殖中的潛在作用(van Spriel等人，2004,J Immunol.,172(5):2953-61)。CD37作為細胞表面糖蛋白的四跨膜家族的部分，還可與其他表面蛋白絡合(Angelisov 1994,Immunogenetics.,39(4):249-56)。CD37表達缺陷的小鼠被開發，顯示在淋巴樣器官的發育和細胞組成上沒有變化。僅觀察到IgG1水準下降和對於T細胞依賴性抗原的應答改變(Knobeloch等人，2000,Mol Cell Biol.,20(15):5363-9)。
抗體顯現為治療所述癌症的有前景的方法。特別地，能夠誘導靶細胞凋亡的抗體是合乎需要的。另外，具有補體依賴性細胞毒性活性(CDC)和抗體依賴性細胞毒性(ADCC)的抗體也是合乎需要的。
目前，被稱為利妥昔單抗(rituximab)的抗CD20抗體用於治療B細胞惡性腫瘤(Leget等人，1998,Curr. Opin. Oncol.,10:548-551)。然而，僅亞組患者響應利妥昔單抗治療，甚至服用妥昔單抗的響應患者最終復發，且常發生對利妥昔單抗治療的抗藥性。另外，還將CD37結合劑作為B細胞惡性腫瘤的潛在治療劑進行試驗。楚邦制藥公司(Trubion Pharmaceuticals)開發了CD37結合劑SMIP-016和TRU-016(Zhao等人，2007,Blood,110:2569-2577)。SMIP-016是一種單鏈多肽，包括來自雜交瘤的可變區和工程化人恒定區。TRU-016是抗CD37 SMIP抗原的人源化形式。見，例如，美國公開的第2007/0009519號申請。對於TRU-016進行臨床試驗，用於治療慢性淋巴細胞白血病(CLL)。勃林格殷格翰(Boehringer Ingelheim)也已經揭示了國際公佈的第WO 2009/019312號申請中的CD37結合劑。然而，尚無對於這些結合劑中的任何結合劑的CDC活性進行描述，且沒有描述中缺乏接頭的情況下的體外促細胞凋亡活性。
已經使用放射標記的抗CD37抗體MB-1在兩個分開的試驗中對於放射免疫治療(RIT)進行嘗試。將131I-MB-1的治療劑量施用于6個復發的NHL患者(Press等人，1989 J Clin Oncol. 7(8):1027-38,Press at el. 1993,N Engl J Med. 329(17):1219-24)。所有6個患者在持續4至31個月的時間獲得完全緩解(CR)。在另一個試驗中，將131I-MB-1施用于10個復發的NHL患者(Kaminski等人，1992 J Clin Oncol. 10(11):1696-711)。總共4個患者在持續2至6個月的時間範圍具有回應，但僅報導個過CR。然而，由於放射標記物不利的生物分佈所提出的對於重要的非靶器官的放射暴露的考慮，並非所有患者都能夠得以治療。確實，在這些試驗中觀察到RIT相關的毒性，包括嚴重的骨髓抑制和心肺毒性。儘管這些臨床資料表明抗CD37放射免疫共軛物有效，但這些治療劑施用麻煩，並且由於與高劑量放射相關的危險，復發的RIT後患者不能使用RIT來再治療。
為了克服RIT的局限性，已經開發了抗體-細胞毒性劑共軛物(ACC)，也稱為抗體-藥物共軛物(ADC)。這些是免疫共軛物，包括通過化學接頭與抗體共價連接的細胞毒性劑，所述化學接頭可允許細胞毒性藥物特異性遞送至表達被抗體識別的蛋白的細胞。然而，不良內化的蛋白被認為不是這些治療劑的有利的靶。CD37在結構上與CD20相似，因為這兩種抗原都含有四個跨膜結構域，但CD20不是四跨膜蛋白家族的部分(Tedder等人，1989,J. Immun. 142: 2560-2568)。已經對針對幾種B細胞抗原(包括CD37和CD20)的抗體研究了它們進行細胞內吞和降解的能力(Press等人，1989,Cancer Res. 49(17):4906-12，和Press等人，1994,Blood. 83(5):1390-7)。在體外，抗CD37抗體MB-1滯留於細胞表面並在Daudi淋巴瘤細胞中被緩慢內化。MB-1抗體還在體外在NHL患者細胞中具有低的細胞內吞和細胞內代謝速率。對於抗CD20抗體1F5獲得了相似的結果，抗CD20抗體1F5也主要滯留於淋巴瘤細胞表面且內化不良。先前還對於CD20抗體的ADC進行了研究，但沒有顯示顯著強效，特別是當使用非二硫化物或酸穩定接頭時(見，例如Polson等人，2009,Cancer Res.,69(6):2358-2364)。鑒於這些觀察結果，認為CD37並非抗體-藥物共軛物的有利的靶。
因此，存在對於作為治療B細胞惡性腫瘤的工具的CD37結合劑的需要，所述CD37結合劑包括抗體、其抗原結合片段以及抗體-藥物共軛物(免疫共軛物)。本發明提供了該需要。
本發明描述了結合人CD37的新型抗體、包含這些抗體的免疫共軛物及其使用方法。本發明還提供了新型多肽，例如結合人CD37的抗體、這些抗體的片段，和其他與這些抗體相關的多肽。本發明還提供了包含編碼所述多肽的核酸序列的多核苷酸，如包含所述多核苷酸對載體。本發明還提供了包含本發明多肽和/或多核苷酸對細胞。本發明還提供了保護所述新型CD37抗體或免疫共軛物的組合物(例如，藥物組合物)。另外，本發明還提供了製備和使用所述新型CD37抗體或免疫共軛物的方法，例如使用所述新型CD37抗體或免疫共軛物來抑制腫瘤生長和/或治療癌症的方法。
本發明提供了特異性結合CD37且能夠誘導補體依賴性細胞毒性(CDC)的抗體或其抗原結合片段。在一些實施方案中，所述抗體還能夠誘導細胞凋亡和/或抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(ADCC)。
所述抗體或其抗原結合片段可以是作為選自下列的抗體特異性結合相同CD37表位的：(a)包含SEQ ID NO:55的多肽和SEQ ID NO:72的多肽的抗體；(b)包含SEQ ID NO:59的多肽和SEQ ID NO:75的多肽的抗體；(c)包含SEQ ID NO:61的多肽和SEQ ID NO:77的多肽的抗體；(d)包含SEQ ID NO:64的多肽和SEQ ID NO:80的多肽的抗體；(e)包含SEQ ID NO:66的多肽和SEQ ID NO:82的多肽的抗體；(f)包含SEQ ID NO:68的多肽和SEQ ID NO:84的多肽的抗體；以及(g)包含SEQ ID NO:70的多肽和SEQ ID NO:86的多肽的抗體。
在一些實施方案中，所述抗體或其抗原結合片段特異性結合CD37且特異性結合SEQ ID NO: 180的多肽。在一些實施方案中，所述抗體或其抗原結合片段不結合SEQ ID NO: 184的多肽。
在一些實施方案中，所述抗體或其抗原結合片段特異性結合CD37，且所述抗體或其抗原結合片段競爭性抑制選自下列的抗體：(a)包含SEQ ID NO:55的多肽和SEQ ID NO:72的多肽的抗體；(b)包含SEQ ID NO:59的多肽和SEQ ID NO:75的多肽的抗體；(c)包含SEQ ID NO:61的多肽和SEQ ID NO:77的多肽的抗體；(d)包含SEQ ID NO:64的多肽和SEQ ID NO:80的多肽的抗體；(e)包含SEQ ID NO:66的多肽和SEQ ID NO:82的多肽的抗體；(f)包含SEQ ID NO:68的多肽和SEQ ID NO:84的多肽的抗體；以及(g)包含SEQ ID NO:70的多肽和SEQ ID NO:86的多肽的抗體。
在一些實施方案中，通過選自下列的雜交瘤來製備所述抗體或其抗原結合片段：於2010年2月18日保藏於ATCC(美國模式培養物保藏中心)的ATCC保藏名稱PTA-10664，於2010年2月18日保藏於ATCC的ATCC保藏名稱PTA-10665，於2010年2月18日保藏於ATCC的ATCC保藏名稱PTA-10666，於2010年2月18日保藏於ATCC的ATCC保藏名稱PTA-10667，於2010年2月18日保藏於ATCC的ATCC保藏名稱PTA-10668，於2010年2月18日保藏於ATCC的ATCC保藏名稱PTA-10669，於2010年2月18日保藏於ATCC的ATCC保藏名稱PTA-10670。
在一些實施方案中，所述抗體或其抗原結合片段特異性結合CD37，且所述抗體包含選自下列的多肽序列：(a)SEQ ID NO: 4、5以及6和SEQ ID NO: 28、29以及30；(b)SEQ ID NO: 7、8以及9和SEQ ID NO: 31、32以及33；(c)SEQ ID NO: 10、11以及12和SEQ ID NO: 34、35以及36；(d)SEQ ID NO: 13、14以及15和SEQ ID NO: 37、38以及39；(e)SEQ ID NO: 13、14以及15和SEQ ID NO: 37、40以及39；(f)SEQ ID NO: 16、17以及18和SEQ ID NO: 41、42以及43；(g)SEQ ID NO: 19、20以及21和SEQ ID NO: 44、45以及46；(h)SEQ ID NO: 19、20以及21和SEQ ID NO: 44、47以及46；(i)SEQ ID NO: 22、23以及24和SEQ ID NO: 48、49以及50；(j)SEQ ID NO: 22、23以及24和SEQ ID NO: 48、51以及50；(k)SEQ ID NO: 25、26以及27和SEQ ID NO: 52、53以及54；以及(l)包含1、2、3或4個保守胺基酸取代的(a)至(k)的變體。
在又一些實施方案中，所述抗體或其抗原結合片段包含與選自下列的多肽序列具有至少90%同一性、至少95%同一性、至少99%同一性或完全同一性的多肽序列:(a)SEQ ID NO:55和SEQ ID NO:72；(b)SEQ ID NO:56和SEQ ID NO:73；(c)SEQ ID NO:57和SEQ ID NO:74；(d)SEQ ID NO:58和SEQ ID NO:74；(e)SEQ ID NO:59和SEQ ID NO:75；(f)SEQ ID NO:60和SEQ ID NO:76；(g)SEQ ID NO:61和SEQ ID NO:77；(h)SEQ ID NO:62和SEQ ID NO:78；(i)SEQ ID NO:63和SEQ ID NO:79；(j)SEQ ID NO:64和SEQ ID NO:80；(k)SEQ ID NO:65和SEQ ID NO:81；(l)SEQ ID NO:66和SEQ ID NO:82；(m)SEQ ID NO:67和SEQ ID NO:83；(n)SEQ ID NO:68和SEQ ID NO:84；(O)SEQ ID NO:69和SEQ ID NO:85；(p)SEQ ID NO:70和SEQ ID NO:86；以及(q)SEQ ID NO:71和SEQ ID NO:87。
在一些實施方案中，所述抗體或其抗原結合片段是鼠的、非人的、人源化的、嵌合的、再表面化的或人的。
在一些實施方案中，所述抗體或其抗原結合片段能夠在缺乏接頭的情況下在體外誘導表達CD37的細胞的細胞凋亡。在一些實施方案中，所述抗體或其抗原結合片段能夠誘導補體依賴性細胞毒性(CDC)。在還一些實施方案中，所述抗體或其抗原結合片段能夠誘導抗體依賴性細胞毒性(ADCC)。
在其他實施方案中，所述抗體或其抗原結合片段是人的或人源化的，特異性結合CD37，且能夠在缺乏接頭的情況下在體外誘導表達CD37的細胞的細胞凋亡。在其他實施方案中，所述人的或人源化的抗體或其抗原結合片段還能夠誘導補體依賴性細胞毒性(CDC)和/或能夠誘導抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(ADCC)。
在還一些其他實施方案中，所述抗體或其抗原結合片段結合人的CD37和獼猴CD37。
在一些其他實施方案中，所述抗體或其抗原結合片段是全長的抗體或其抗原結合片段。所述抗體或其抗原結合片段可包含Fab、Fab'、F(ab')2、Fd、單鏈Fv或scFv、二硫鍵連接的Fv、V-NAR結構域、IgNar、細胞內抗體、IgGΔCH2、小抗體、F(ab')3、四鏈抗體、三鏈抗體、雙鏈抗體、單結構域抗體、DVD-Ig、Fcab、mAb2、(scFv)2或scFv-Fc。
在其他實施方案中，所述CD37結合劑為特異性結合CD37的多肽，所述多肽包含選自下列的序列：(a)SEQ ID NO: 4、5以及6和SEQ ID NO: 28、29以及30；(b)SEQ ID NO: 7、8以及9和SEQ ID NO: 31、32以及33；(c)SEQ ID NO: 10、11以及12和SEQ ID NO: 34、35以及36；(d)SEQ ID NO: 13、14以及15和SEQ ID NO: 37、38以及39；(e)SEQ ID NO: 13、14以及15和SEQ ID NO: 37、40以及39；(f)SEQ ID NO: 16、17以及18和SEQ ID NO: 41、42以及43；(g)SEQ ID NO: 19、20以及21和SEQ ID NO: 44、45以及46；(h)SEQ ID NO: 19、20以及21和SEQ ID NO: 44、47以及46；(i)SEQ ID NO: 22、23以及24和SEQ ID NO: 48、49以及50；(j)SEQ ID NO: 22、23以及24和SEQ ID NO: 48、51以及50；(k)SEQ ID NO: 25、26以及27和SEQ ID NO: 52、53以及54；以及(l)包含1、2、3或4個保守胺基酸取代的(a)至(k)的變體。
在其他實施方案中，所述CD37結合劑為特異性結合CD37的多肽，所述多肽包含與選自下列的多肽序列具有至少90%同一性、至少95%同一性、至少99%同一性或完全同一性的多肽序列：(a)SEQ ID NO:55和SEQ ID NO:72；(b)SEQ ID NO:56和SEQ ID NO:73；(c)SEQ ID NO:57和SEQ ID NO:74；(d)SEQ ID NO:58和SEQ ID NO:74；(e)SEQ ID NO:59和SEQ ID NO:75；(f)SEQ ID NO:60和SEQ ID NO:76；(g)SEQ ID NO:61和SEQ ID NO:77；(h)SEQ ID NO:62和SEQ ID NO:78；(i)SEQ ID NO:63和SEQ ID NO:79；(j)SEQ ID NO:64和SEQ ID NO:80；(k)SEQ ID NO:65和SEQ ID NO:81；(l)SEQ ID NO:66和SEQ ID NO:82；(m)SEQ ID NO:67和SEQ ID NO:83；(n)SEQ ID NO:68和SEQ ID NO:84；(O)SEQ ID NO:69和SEQ ID NO:85；(p)SEQ ID NO:70和SEQ ID NO:86；以及(q)SEQ ID NO:71和SEQ ID NO:87。
還可根據本發明所述的方法製備和使用產生所述抗體或其抗原結合片段或所述多肽的細胞。所述方法提供了包括下述步驟的製備所述抗體或其抗原結合片段或所述多肽的方法：(a)培養產生這樣的CD37結合劑的細胞：以及(b)從所述培養的細胞分離所述抗體、其抗原結合片段或多肽。
在一些實施方案中，所述CD37結合劑是具有式(A)-(L)-(C)的免疫共軛物，其中：(A)是CD37結合劑；(L)是接頭；以及(C)是細胞毒性劑；其中接頭(L)連接(A)與(C)。
在一些實施方案中，所述CD37結合劑是具有式(A)-(L)-(C)的免疫共軛物，其中：(A)是特異性結合CD37的抗體或其抗原結合片段；(L)是非可裂解接頭；以及(C)是細胞毒性劑；其中接頭(L)連接(A)與(C)。
在一些實施方案中，所述CD37結合劑是具有式(A)-(L)-(C)的免疫共軛物，其中：(A)是特異性結合CD37的抗體或其抗原結合片段；(L)是接頭；以及(C)是美登醇(美登醇)；其中接頭(L)連接(A)與(C)。
免疫共軛物接頭可為非可裂解接頭。所述接頭可選自可裂解接頭、非可裂解接頭、親水接頭以及基於二羧酸的接頭。所述接頭可選自：N-琥珀醯亞胺基4-(2-吡啶基二硫代)戊酸酯(SPP);N-琥珀醯亞胺基4-(2-吡啶基二硫代)丁酸酯(SPDB)或N-琥珀醯亞胺基4-(2-吡啶基二硫代)-2-磺基丁酸酯(磺基-SPDB);N-琥珀醯亞胺基4-(馬來醯亞胺基甲基)環己烷羧酸酯(SMCC);N-琥珀醯亞胺基4-(馬來醯亞胺基甲基)環己烷羧酸酯(磺基SMCC)；N-琥珀醯亞胺基-4-(碘代乙醯基)-氨基苯甲酸酯(SIAB)；以及N-琥珀醯亞胺基-[(N-馬來醯亞胺基丙醯胺基)-四乙二醇]酯(NHS-PEG4-馬來醯亞胺)。所述接頭可為N-琥珀醯亞胺基-[(N-馬來醯亞胺基丙醯胺基)-四乙二醇]酯(NHS-PEG4-馬來醯亞胺)。
細胞毒性劑可選自美登醇、美登醇類似物、多柔比星、改性的多柔比星、苯二氮卓類、紫杉烷、CC-1065、CC-1065類似物、倍癌黴素(duocarmycin)、倍癌黴素類似物、刺孢黴素、朵拉司他汀、朵拉司他汀類似物、aristatin、托馬黴素衍生物，以及來普黴素衍生物或所述製劑的前藥。細胞毒性劑可為美登醇。細胞毒性劑可為N(2')-脫乙醯基-N(2')-(3-巰基-1-氧丙基)-美登素(DM1)或N(2')-脫乙醯基-N2-(4-巰基-4-甲基-1-氧戊基)-美登素(DM4)。
本文中還提供包含CD37結合劑及藥學上可接受的載體的藥物組合物。所述藥物組合物可保護第二抗癌劑。
本文中還提供標記了的包含CD37結合劑的診斷試劑。標記物可選自放射標記物、螢光團、生色團以及顯像劑以及金屬離子。
本文中還提供一種包含CD37結合劑的試劑盒。
本文中描述的方法包括用於抑制表達CD37的細胞的生長的方法，所述方法包括使所述細胞與CD37結合劑或包含CD37結合劑的藥物組合物接觸。
所述方法還提供了用於治療患有癌症的患者的方法，所述方法包括對所述患者進行治療有效量的CD37結合劑的施用或對受治療者進行包含CD37結合劑的藥物組合物的施用。
所述方法可包括對所述受治療者進行第二抗癌劑的施用。所述第二抗癌劑可謂化學治療劑。
所述癌症可為選自下列的癌症，B細胞淋巴瘤，非何傑金氏淋巴瘤(NHL)，前B細胞成淋巴細胞白血病/淋巴瘤和成熟B細胞新生物，B細胞慢性淋巴細胞白血病(CLL)/小淋巴細胞白血病(SLL)，B細胞前淋巴細胞白血病，淋巴漿細胞淋巴瘤，外套細胞淋巴瘤(MCL)，濾泡性淋巴瘤(FL)，低度、中度以及高度(FL)，皮膚濾泡性淋巴瘤，緣區B細胞淋巴瘤，MALT型緣區B細胞淋巴瘤，結節緣區B細胞淋巴瘤，脾型緣區B細胞淋巴瘤，毛細胞性白血病，彌漫性大B細胞淋巴瘤，伯基特淋巴瘤，漿細胞瘤，漿細胞性骨髓瘤，移植後淋巴增生性障礙，沃爾登斯特倫氏氏巨球蛋白血症，以及間變大細胞淋巴瘤(ALCL)。
本文中還提供包含下列序列的分離的多核苷酸，即，編碼與選自SEQ ID NO: 55-87的序列具有至少90%同一性、至少95%同一性、至少99%同一性或完全同一性的多肽的序列。所述多核苷酸可包含與SEQ ID NO: 121-151具有至少90%同一性、至少95%同一性、至少99%同一性或完全同一性的序列。
本文中還提供載體和包含這些多核苷酸和載體的宿主細胞。
本發明提供了一種在下列三種針對表達CD37(例如，陽性)細胞的細胞毒性活性中具有高效的CD37結合分子：誘導細胞凋亡、ADCC以及CDC。另外，抗CD37抗體的免疫共軛物意外地殺傷表達CD37的細胞，如使用體內腫瘤模型所證實的。
I.　定義
為了促進對於本發明的理解，下文定義了一些術語和用語。
除非另有指明，本文使用的術語CD37是指任何天然CD37。CD37也被稱為GP52-40、白細胞抗原CD37以及四跨膜蛋白-26。術語“CD37”包括“全長”、未加工的CD37以及產生於細胞中的加工的任何形式的CD37.該術語還包括CD37的天然存在的變體，例如剪接變體，等位基因變體，以及亞型。本發明描述的CD37多肽可分離自多種來源，例如來自人組織型或來自其他來源，或者通過重組或合成方法製備。
術語“抗體”表示通過免疫球蛋白的可變區內的至少一個抗原識別位點識別並特異性結合靶的免疫球蛋白分子，所述靶例如蛋白、多肽、肽、碳水化合物、多核苷酸、脂質或前述的組合。本文使用的術語“抗體”包括完整的多克隆抗體、完整的單克隆抗體、抗體片段(例如，Fab、Fab'、F(ab')2以及Fv片段)、單鏈Fv(scFv)突變體、多特異性抗體(例如產生自至少兩個完整抗體的雙特異性抗體)、嵌合抗體、人源化抗體、人抗體、包含抗體的抗原確定部分的融合蛋白、以及包含抗原識別位點的任何其他修飾的免疫球蛋白分子，只要該抗體表現所需的生物活性。抗體可為五種主要免疫球蛋白的任何種類：基於其重鏈恒定區的鑒定(被稱為α、δ、ε、γ以及μ)，分別為IgA、IgD、IgE、IgG以及IgM，或者其亞類(同種型)(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1以及IgA2)。不同種類的免疫球蛋白具有不同的和公知的亞單位結構和三維構象。抗體可為裸露的或與其他分子綴合，例如毒素、放射性同位素等。
“阻斷”抗體或“拮抗劑”抗體是一種抑制或降低其結合抗原(例如CD37的生物活性的抗體。在一些實施方案中，阻斷抗體或拮抗劑抗體基本上或完全抑制抗原的生物活性。生物活性可被降低10%、20%、30%、50%、70%、80%、90%、95%或甚至100%。
術語“抗CD37抗體|”或“結合CD37的抗體”是指能夠以足夠親和力結合CD37的抗體，使得抗體可用作靶向CD37的診斷劑和/或治療劑。抗CD37抗體與無關的、非CD37蛋白結合的程度可小於抗體與CD37結合的約10%，這通過例如放射免疫測定(RIA)來檢測。在某些實施方案中，結合CD37的抗體具有1 μM、100 nM、10 nM、1 nM或0.1 nM的解離常數(Kd)。
術語“抗體片段”是指完整抗體的一部分，是指完整抗體的抗原決定可變區。抗體片段的實例包括但不限於Fab、Fab'、F(ab')2以及Fv片段，直鏈抗體、單鏈抗體以及形成於抗體片段的多特異性抗體。
“單克隆抗體”是指涉及對於單抗原決定簇或表位的高特異性識別和結合的同質性抗體群。這與通常包括針對不同抗原決定簇的不同抗體的多克隆抗體形成對照。術語“單克隆抗體”包括完整的和全長的單克隆抗體以及抗體片段(例如，Fab、Fab'、F(ab')2、Fv)，單鏈(scFv)突變體、包含抗體部分的融合蛋白，以及包含抗原識別位點的任何其他修飾的免疫球蛋白分子。另外“單克隆抗體”是指以任何形式製備的這些抗體，包括但不限於通過雜交瘤、噬菌體選擇、重組表達以及轉基因動物。
術語“人源化抗體”是指作為含有最少非人(例如，鼠)序列的特異性免疫球蛋白鏈、嵌合免疫球蛋白或其片段的非人(例如，鼠)抗體形式。通常，人源化抗體為其中來自互補決定區(CDR)的殘基被來自具有所需特異性、親和力和能力的非人物種(例如，小鼠、大鼠、家兔、倉鼠)的CDR的殘基取代的人免疫球蛋白(Jones等人，1986,Nature,321:522-525;Riechmann等人，1988,Nature,332:323-327;Verhoeyen等人，1988,Science,239:1534-1536)。在一些情況中，人免疫球蛋白的Fv框架區(FR)被來自非人物種的具有所需特異性、親和力以及能力的抗體中的相應殘基取代。人源化抗體可進一步通過Fv框架區和/或取代的非人殘基中的另外的殘基取代來修飾，以對於抗體特異性、親和力和/或能力進行精和優化。通常，人源化抗體包括基本上所有可變結構域，其中至少一種、通常兩種或三種可變結構域含有與非人免疫球蛋白相對應的所有或基本上所有CDR區，而所有或基本上所有FR區為人免疫球蛋白共有序列的那些。人源化抗體還可包括免疫球蛋白恒定區或結構域(Fc)的至少一部分(通常是人免疫球蛋白)。用於生成人源化抗體的方法的實例中美國專利5,225,539中描述。
抗體的“可變區”是指單獨的或組合的抗體輕鏈的可變區或抗體重鏈的可變區。重鏈和輕鏈可變區各自由通過三個互補決定區(CDR，也稱為高可變區)連接的四個框架區(FR)組成。各鏈中的CDR通過FR緊密結合，並且與來自其他鏈的CDR一起促進抗體的抗原結合位點形成。具有至少兩種確定CDR的技術：(1)一種基於交叉物種序列變異性的方法(即，Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest,(第5版，1991,National Institutes of Health,Bethesda Md.))；和(2)一種基於抗原-抗體複合物的結晶學研究的方法(Al-lazikani等人(1997)J. Molec. Biol. 273:927-948))。另外，本領域中有時將這兩種方法的組合用於確定CDR。
當提及可變結構域中的殘基時，通常使用Kabat編號系統(大約是輕鏈的殘基1-107和重鏈的殘基1-113)(例如，Kabat等人，Sequences of Immunological Interest.第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991))。
Kabat中的胺基酸位置編號是指用於抗體的編輯的重鏈可變結構域或輕鏈可變結構域的編號系統(Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991))。使用該編號系統，實際的直鏈胺基酸序列可含有與可變結構域的FR或CDR的縮短或插入相對應的較少的或另外的胺基酸。例如，重鏈可變結構域可包括在H2的殘基52之後的單個胺基酸插入(根據Kabat的殘基52a)和在重鏈FR殘基82之後插入的殘基(例如，根據Kabat的殘基82a、82b以及82c)。可通過對於抗體序列的同源區與“標準的”Kabat編號序列進行比對來對給定的抗體確定殘基的Kabat編號。Chothia則提及了結構環的位置(Chothia和Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917(1987))。當使用Kabat編號規定來編號時，Chothia CDR-H1環的末端根據環的長度在H32和H34之間不同(這是因為Kabat編號方案中H35A和H35B安置了插入；如果35A或35B均不存在，環狀32處結束；如果僅存在35A，環在33處結束；如果35A和35B均存在，環在34處結束)。AbM高可變區表現了在Kabat CDR和Chothia結構環之間的一致，被Oxford Molecular的AbM抗體造模軟體使用。
術語“人抗體”是指人產生的抗體，或者使用本領域已知的任何技術製備的具有與人產生的抗體對應的胺基酸序列的抗體。人抗體的該定義包括完整或全長抗體、其片段，和/或包含至少一個人重鏈和/或輕鏈多肽的抗體，例如包含鼠輕鏈和人重鏈多肽的抗體。
術語“嵌合抗體”是指其中免疫球蛋白分子的胺基酸序列衍生自兩個或多個物種的抗體。通常，輕鏈和重鏈的可變區與衍射自一個哺乳動物物種(例如，小鼠、大鼠、家兔等)的具有所需特異性、親和力以及能力的抗體可變區對應，而恒定區與衍生自另一個物種(通常是人)的抗體中的序列具有同源性，以避免引發該物種中的免疫反應。
術語“表位”或“抗原決定簇”在本發明中可互換使用，是指能夠被特定抗體識別和特異性結合的抗原的部分。當抗原是多肽時，可由連續胺基酸和通過蛋白質的三級折疊而並置的非連續胺基酸形成表位。由連續胺基酸形成的表位通常在蛋白質變性時保留，而由三級折疊形成的表位通常在蛋白質變性時喪失。在獨特的空間構象中，表位通常包括至少3給且通常更多，至少5給或8-10給胺基酸。
“結合親和力”通常是指一個分子(例如，抗體)的單結合位點及其結合配偶體(例如，抗原)之間的非共價相互作用的總數的強度。除非另有指明，本文使用的“結合親和力”是指反映了結合對(例如抗體和抗原)的成員之間的1:1相互作用的固有結合親和力。分子X與其配偶體Y的親和力通常通過解離常數(Kd)來表示。可通過本領域公知方法來測量親和力，包括本發明描述的那些方法。低親和力抗體通常緩慢結合抗原且傾向于容易解離，而高親和力抗體通常較快結合抗原且傾向於仍較長時間結合。本領域已知多種測量結合親和力的方法，其中任何方法可用于本發明的目的。下文描述了具體的說明性實施方案。
本發明提及結合親和力時使用的“或更好”是指分子及其結合配偶體之間的較強的結合。本文使用的“或更好”是指較強的結合，通過較小的Kd數位數值來表示。例如，對於抗原具有“0.6 nM或更好”的親和力的抗體，該抗體對於抗原的親和力為<0.6 nM，即，0.59 nM、0.58 nM、0.57 nM等，或小於0.6 nM的任何數值。
對於“特異性結合”，通常是指抗體通過其抗原結合結構域與表位元結合且該結合賦予抗原結構域和表位元之間一些互補性。根據該定義，當抗體與表位結合時，抗體被說成“特異性結合”該表位，通過其抗原結合結構域結合表位元比其結合隨機、無關的表位更容易。本文使用的術語“特異性”對某些抗體結合某些表位的相對親和力進行定性。例如，抗體“A”可被認為比抗體“B”對於給定的表位具有較高的親和力。或者抗體“A”被說成是以比其對相關表位“D”更高的親和力結合表位“C”。
對於“優先結合”，是指抗體比其結合相關的、相似的、同源性或類似表位更容易地特異性結合表位。因此，“優先結合”給定表位的抗體比相關的表位更可能結合該表位，即使這樣的抗體可與相關表位交叉反應。
如果抗體與給定表位的結合達到了在某種程度上其阻斷參考抗體與該表位的結合的程度，則該抗體被說成“競爭性抑制”參考抗體與該表位的結合。競爭性抑制可通過本領域已知的任何方法來確定，例如，競爭性ELISA測定。抗體可被說成競爭性抑制參考抗體與給定表位的結合達至少90%、至少80%、至少70%、至少60%或至少50%。
本文使用的用語“基本上相似”或“基本上相同”是指兩個數值之間(通常一個數值與本發明的抗體相關，另一個數值與參考/對照抗體相關)足夠高度的相似性，使得本領域技術人員認為在所述數值(例如，Kd值)測量的生物特性情況下兩個數值之間的差異很小或者無生物學和/或統計學意義。所述兩個數值之間的差異作為參考/對照抗體的數值的函數可小於約50%、小於約40%、小於約30%、小於約20%或小於約10%。
被“分離的”多肽、抗體、多核苷酸、載體、細胞或組合物為作為天然情況未發現的形式的多肽、抗體、多核苷酸、載體、細胞或組合物。分離的多肽、抗體、多核苷酸、載體、細胞或組合物包括已經被純化至不再是天然情況下發現的形式的程度的那些。在一些實施方案中，分離的多肽、抗體、多核苷酸、載體、細胞或組合物是基本上純的。
本文使用的“基本上純的”是指至少50%純(即，無污染物)、至少90%純、至少95%純、至少98%純或至少99%純。
本文使用的術語“免疫共軛物”或“共軛物”是指與細胞結合劑(即，抗CD37抗體或其片段)連接並由通式C-L-A(其中，C=細胞毒素，L=接頭，A=細胞結合劑或抗CD37抗體或抗體片段)定義的化合物或其衍生物。免疫共軛物還可由反序的通式定義：A-L-C。
接頭是能夠將化合物、通常藥物(例如美登素)與細胞結合劑(例如抗CD37抗體或其片段)以穩定、共價方式連接的任何化學部分(moiety)。在化合物或抗體仍具有活性的條件下，接頭可易感於或基本上抵抗酸誘導的裂解、光誘導的裂解、肽酶誘導的裂解、酯酶誘導的裂解以及二硫鍵裂解。合適的接頭為本領域公知，包括，例如二硫基、硫醚基、酸敏感性基團、光敏感性基、肽酶敏感性基團以及酯酶敏感性基團。接頭還可包括本發明描述和本領域已知的帶電荷的接頭及其親水形式。
術語“癌”和“癌的”是指或描述其中細胞群具有未調節的細胞生長的特性的哺乳動物中的生理狀況。癌的實例包括但不限於癌瘤、淋巴瘤、胚細胞瘤、肉瘤以及白血病。“腫瘤”和“新生物”是指產生於過度細胞生長或增殖的一種或多種細胞，例如良性(非癌的)或惡性(癌的)，包括癌前病變。可治療和/或預防的“癌”或“致瘤”疾病的實例包括B細胞淋巴瘤，包括NHL、前B細胞成淋巴細胞白血病/淋巴瘤以及成熟B細胞新生物，例如B細胞慢性淋巴細胞性白血病(CLL)/小淋巴細胞性白血病(SLL)，B細胞前淋巴細胞性白血病，淋巴漿細胞淋巴瘤、外套細胞淋巴瘤(MCL)、濾泡性淋巴瘤(FL)，包括低度、中度以及高度FL，皮膚濾泡中心淋巴瘤，緣區B細胞淋巴瘤(MALT型，結節型以及脾型)，毛細胞性白血病、彌漫性大B細胞淋巴瘤，伯基特氏淋巴瘤、漿細胞瘤、漿細胞性骨髓瘤、移植後淋巴增生性障礙、沃爾登斯特倫氏氏巨球蛋白血症，以及間變大細胞淋巴瘤(ALCL)。
術語“癌細胞”、“腫瘤細胞”以及語法等同術語是指衍生自腫瘤或癌前病變的細胞總群，包括非致瘤性細胞(包括腫瘤細胞群塊)和致瘤性幹細胞(癌幹細胞)。本文使用的術語“腫瘤細胞”當單獨指缺乏更新和分化能力的那些腫瘤細胞時將被術語“非致瘤性”修飾，以區別那些腫瘤細胞和癌幹細胞。
術語“受治療者”是指待為特定治療的接受者的任何動物(例如，哺乳動物)，包括但不限於人、非人靈長類、齧齒類等。通常，提及人受治療者時術語“受治療者”和“患者”在本文中可互換使用。
“聯合”一種或多種其他治療劑施用包括同時(同時發生的)和以任何順序的連續施用。
術語“藥物製劑”是指允許活性成分的生物活性有效的形式和不含有對於進行該製劑施用的受治療者有不能接受的毒性的其他組分的製劑。
本文揭示的抗體的“有效量”是足以實現特別說明的目的的量。根據所說明的目的，“有效量”可經驗性且以常規方式來確定。
術語“治療有效量”是指有效“治療”受治療者或哺乳動物的疾病或病症的抗體或其他藥物的量。在癌的情況中，藥物的治療有效量可減少癌細胞的數量，減小腫瘤體積，抑制(即，在某種程度上減緩或阻止)癌細胞浸潤至周圍器官，抑制(即，在某種程度上減緩或阻止)腫瘤轉移，在某種程度上抑制腫瘤生長，和/或者某種程度上緩解癌相關的症狀。見，本文“治療”的定義。在藥物可防止生長和/或殺傷存在的癌細胞的程度上，可為細胞生長抑制的和/或細胞毒性的。“預防有效量”是指在劑量和持續時間上有效實現所需預防效果需要的量。通常但非必須的，由於預防劑量組疾病前或在基本早期用於受治療者，預防有效量將小於治療有效量。
本文使用的詞語“標記物”是指直接或間接與抗體綴合以產生“標記的”抗體的可檢測化合物或組合物。標記物本身是可檢測的(例如，放射性同位素標記物或螢光標記物)，或在酶標記物的情況中，可催化可檢測的底物化合物或組合物的化學變化。
“化學治療劑”是一種可用於治療癌的化學化合物，不管其作用機制是什麼。化學治療劑包括，例如，CD20D的拮抗劑(例如利妥昔單抗和環磷醯胺)，多柔比星，長春新堿，潑尼松，氟達拉濱，鬼臼乙叉甙，甲氨喋呤，來那度胺，苯丁酸氮芥，苯達莫司汀和/或這些化學治療劑的修飾形式。
諸如“治療(treating或treatment或to treat)”、或“緩解(alleviating或to alleviate)”是指1)治癒、減緩、減輕所診斷的病理狀況或病症的症狀和/或阻止其進展的治療措施，和2)預防和/或減慢所靶向的病理狀況或病症的發展。因此，需要治療的那些患者包括已經患有病症的那些，易於患有病症的那些，以及其中有待預防病症的那些。在某些實施方案中，如果患者顯示了下列的一種或多種則受治療者被根據本發明的方法成功“治療”癌：癌細胞數量減少或完全缺乏，腫瘤大小減小；癌細胞浸潤至周圍器官受到抑制或缺乏，包括，例如癌播散至軟組織和骨骼；腫瘤轉移受到抑制或缺乏；腫瘤生長受到抑制或缺乏；與特定癌相關的一種或多種症狀減輕；發病率和死亡率減小；生命品質改善；腫瘤的致瘤性、致瘤頻率或致瘤能力減小；腫瘤中的癌幹細胞的數量或頻率減小；致瘤細胞分化為非致瘤狀態；或一些效果的組合。
本文中可互換使用的“多核苷酸”或“核酸”是指任何長度的核苷酸的聚合物，包括DNA和RNA。核苷酸可為去氧核糖核苷酸，核糖核苷酸，修飾的核苷酸或堿基，和/或它們的類似物，或可通過DNA或RNA聚合酶摻入聚合物的任何底物。多核苷酸可包括修飾的核苷酸，例如甲基化的核苷酸及其類似物。如果存在的話，對於核苷酸結構的修飾可以在聚合物組裝之前或之後賦予。核苷酸序列可通過非核苷酸組分間斷。多核苷酸可在聚合之後進一步修飾，例如通過使用標記組分綴合。其他類型的修飾包括，例如“帽”，使用類似物取代一種或多種天然存在的核苷酸，中間核苷酸修飾，例如具有不帶電荷的鍵(例如，甲基膦酸酯、磷酸三酯、磷醯胺酯、胺基甲酸酯等)的那些和具有帶電荷的鍵(例如，磷硫醯，二硫代磷酸酯等)的那些，含有懸垂部分(pendant moiety)的那些，例如，蛋白質(例如，核酸酶，毒素，抗體，信號肽，聚-L-賴氨酸等)，具有插入劑(例如，吖啶，補骨脂素等)的那些，含有螯合劑(例如，金屬，放射性金屬，硼，氧化金屬等)的那些，含有烷化劑的那些，具有修飾的鍵(例如，α異頭物核酸等)的那些，以及多核苷酸的未修飾形式。另外，通常存在於糖中的任何羥基可被例如膦酸酯基、磷酸基取代，被標準保護基團保護，或被活化以使另外的鍵製備成另外的核苷酸，或可被綴合成固體支持物。5'和3'末端OH可被磷醯基化或使用胺或具有1至20個碳原子的有機帽基團部分取代。其他羥基可也可被衍生為標準的保護基團。多核苷酸還可含有本領域公知的核糖或去氧核糖類似物，包括，例如2'-O-甲基，2'-O-烯丙基，2'-氟-核糖或2'-疊氮基-核糖，碳環碳類似物，α-異頭物糖，差向異構糖(例如，阿拉伯糖，木糖或來蘇糖，吡喃糖，呋喃糖，景天庚糖)，非環類似物以及鹼性核苷類似物(例如甲基肌苷)。一種或多種磷酸二酯鍵可被可選的連接基團取代。這些可選的連接基團包括但不限於其中磷酸被P(O)S(“硫酯”)、P(S)S(“二硫酯”)、(O)NR2(“醯胺酯”)、P(O)R、P(O)OR'、CO或CH2(“formacetal”)取代的實施方案，其中R或R'單獨為H或任選含有醚(--O--)鍵的取代或非取代的烷基(1-20 C)，芳基，鏈烯基，環烷基，環鏈烯基或芳烷基。多核苷酸中並非所有鍵都需要一致。前文描述用於本發明提及的所有多核苷酸，包括RNA和DNA。
術語“載體”是指能夠在宿主細胞中遞送並任選表達一種或多種基因或序列的構建體。載體的實例包括但不限於病毒載體、裸DNA或RNA表達載體、質粒、粘粒或噬菌體載體、與陽離子冷凝劑相關的DNA或RNA表達載體，包裹著脂質體中的DNA或RNA表達載體，以及某些真核細胞，例如生產細胞。
本文可互換使用的術語“多肽”、“肽”、以及“蛋白質”是指任何長度的胺基酸的聚合物。所述聚合物可為直鏈或支鏈，可包含修飾的胺基酸，可被非胺基酸間斷。該術語還包括被天然修飾或被干涉修飾的胺基酸聚合物，例如，二硫鍵形成，糖基化，脂質化，醯基化，磷酸化，或任何其他操作或修飾，例如使用標記組分綴合。在該定義中還包括，例如含有胺基酸的一種或多種類似物(包括，例如非天然胺基酸等)的多肽，以及本領域已知的其他修飾。應理解，因為本發明的多肽基於抗體，在某些實施方案中，所述多肽可作為單鏈或聯合鏈存在。
在兩個或多個核酸或多肽的上下文中的術語“同一性”或“同一性百分數”是指，當對於最大對應性來比較和比對(如果需要，引入間隙)時(不考慮作為序列同一性部分的任何保守性胺基酸取代)，兩個或多個序列或亞序列是相同的或者具有相同的核苷酸或胺基酸殘基的特定百分數。可使用序列比較軟體或演算法或通過目測觀察來測量同一性百分數。可用於獲得胺基酸或核苷酸序列比對的多種演算法和軟體為本領域已知。序列比對演算法的一個這樣的非限制性實例描述於Karlin等人，1990,Proc. Natl. Acad. Sci.,87:2264-2268,修改於Karlin等人，1993,Proc. Natl. Acad. Sci.,90:5873-5877,併合並至NBLAST和XBLAST程式中(Altschul等人，1991,Nucleic Acids Res.,25:3389-3402)。在某些實施方案中，可如Altschul等人，1997,Nucleic Acidss Res. 25:3389-3402中描述的使用Gapped BLAST。BLAST-2、WU-BLAST-2(Altschul等人，1996,Methods in Enzymology,266:460-480)、ALIGN、ALIGN-2(Genentech,South San Francisco,California)或Megalign(DNASTAR)是可用於進行序列比對的其他可公共獲得的軟體程式。在某些實施方案中，使用GCG軟體中的GAP程式來確定兩個核苷酸序列之間的同一性百分數(例如，使用NWSgapdna.CMP矩陣和40、50、60、70或90的間隙加權和1、2、3、4、5或6的長度加權)。在某些可選的實施方案中，併入了Needleman和Wunsch演算法(J. Mol. Biol.(48):444-453(1970))的GCG套裝軟體中的GAP程式可用於確定兩個胺基酸序列之間的同一性百分數(例如，使用Blossum 62矩陣或PAM250矩陣，和16、14、12、10、8、6或4的間隙加權和1、2、3、4、5的長度加權)。可選地，在某些實施方案中，使用Myers和Miller演算法(CABIOS,4:11-17(1989))確定核苷酸或胺基酸序列之間的同一性百分數。例如，可使用ALIGN程式(2.0版)和使用具有殘基表的PAM120、間隙長度罰分12和間隙罰分4來確定同一性百分數。本領域技術人員可通過特定比對軟體確定用於最大比對的合適參數。在某些實施方案中，使用比對軟體的缺省參數。在某些實施方案中，第一胺基酸序列與第二胺基酸序列的同一性百分數“X”被計算為100×(Y/Z)，其中，Y是指第一和第二序列的比對中計為完全匹配的胺基酸殘基的數目，Z是第二序列中殘基的總數。如果第一序列的長度比第二序列長，則第一序列與第二序列的同一性百分數會比第二序列與第一序列的同一性百分數要長。
作為非限制性實例，可在某些實施方案中使用Bestfit程式來確定任何特定的多核苷酸是否與參考序列具有某些序列同一性百分數(例如，至少80%同一性，至少85%同一性，至少90%同一性，以及在某些實施方案中，至少95%、96%、97%、98%或99%同一性)(Wisconsin序列分析包，Unix 8版，Genetics Computer Group，University Research Park,575 Science Drive,Madison,WI 53711)。Bestfit使用Smith和Waterman,Advances in Applied Mathematics 2: 482489(1981)的局部同源性演算法，來發現兩個序列之間具有同源性的最佳片段。當根據本發明使用Bestfit或任何其他序列比對程式來確定特定序列是否與參考序列具有例如95%的同一性時，設定參數，使得經參考核苷酸序列的全長來計算同一性百分數和允許同源性中的間隙達參考序列中核苷酸總數的5%。
在一些實施方案中，本發明的兩個核酸或多肽基本上完全同一，意思是，當如使用序列比較演算法或通過目測觀察測量的那樣比較和比對最大對應性時，它們具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%且在一些實施方案中具有至少95%、96%、97%、98%、99%的核苷酸或胺基酸殘基同一性。同一性可存在于長度為至少約10個、約20個、約40-60個殘基或任何整數值的序列區域，並可存在於長於60-80個殘基的區域，例如，至少約90-100個殘基，在一些實施方案中，序列中所比較的序列的全長是基本上完全同一的，例如核苷酸序列的編碼區。
“保守性胺基酸取代”是指其中一個胺基酸殘基被具有相似側鏈的另一個胺基酸殘基取代。具有相似側鏈的胺基酸殘基的家族在本領域中有定義，包括鹼性側鏈(例如，賴氨酸，精氨酸，組氨酸)，酸性胺基酸(例如，天門冬氨酸，谷氨酸)，不帶電荷的極性側鏈胺基酸(例如，甘氨酸，天門冬醯胺，穀醯胺，絲氨酸，蘇氨酸，酪氨酸，半胱氨酸)，非極性側鏈(例如，丙氨酸，纈氨酸，亮氨酸，異亮氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，甲硫氨酸，色氨酸)，β分支側鏈(例如，蘇氨酸，纈氨酸，異亮氨酸)和芳香族側鏈(例如，酪氨酸，苯丙氨酸，色氨酸，組氨酸)。例如，苯丙氨酸取代酪氨酸是保守性取代。在一些實施方案中，本發明的多肽和抗體序列中的保守性取代並不消除含有胺基酸序列的多肽或抗體與抗原結合，所述抗原即所述多肽或抗體結合的CD37。鑒定不消除抗原結合的核苷酸和胺基酸保守性取代的方法為本領域公知(見，例如，Brummell等人，Biochem. 32: 1180-1 187(1993);Kobayashi等人，Protein Eng. 12(10):879-884(1999);以及Burks等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:.412-417(1997))。
除非上下文另有明確指明，本文說明書和權利要求書所使用的單數形式(“a”、“an”以及“the”)包括複數形式。
應理解無論本文何處使用用語“包括”描述實施方案，都還提供以“由......組成”和/或“基本由......組成”描述的類似實施方案。
本文在諸如“A和/或B”的短語中使用的術語“和/或”意指包括“A和B”、“A或B”、“A”以及“B”。同樣的，在諸如“A、B和/或C”的短語中使用的術語“和/或”意指包括下列各實施方案：A、B以及C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A和C；A和B；B和C；A(單獨)；B(單獨)；以及C(單獨)。
II. CD37結合劑
本發明提供了特異性結合CD37D的製劑。這些製劑在本文中被稱為“CD37結合劑”。人、獼猴以及鼠CD37的全長胺基酸序列為本領域已知，在本文中分別由SEQ ID NO:1-3來表示。
人CD37：
獼猴CD37：
鼠CD37(NP_031671)：
在某些實施方案中，CD37結合劑是抗體、免疫共軛物或多肽。在一些實施方案中，CD37結合劑是人源化抗體。
在某些實施方案中，CD37結合劑具有一種或多種下列效果：抑制腫瘤細胞增殖，通過降低腫瘤中癌幹細胞的頻率而減小腫瘤的致瘤性，抑制腫瘤生長，增加存活率，引發腫瘤細胞的細胞死亡，使致瘤性細胞分化成非致瘤狀態，或預防腫瘤細胞的轉移。
在某些實施方案中，CD37結合劑能夠誘導補體依賴性細胞毒性。例如，使用CD37結合劑治療細胞可導致下述CDC活性，即，所述CDC活性降低細胞活力至小於未處理的細胞的約80%、約70%，約60%，約50%，約40%或約35%。使用CD37結合劑處理細胞還可導致下述CDC活性，即，所述CDC活性降低細胞活力至未處理的細胞的細胞活力的約70-80%、60-70%、50-60%、40-50%或30-40%。在一些特定實施方案中，CD37結合劑能夠誘導Ramos細胞中補體依賴的細胞毒性。
在某些實施方案中，CD37結合劑能夠誘導抗體依賴的細胞介導的細胞毒性(ADCC)。例如，使用CD37結合劑處理細胞可導致下述ADCC活性，即所述ADCC活性產生至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、或至少約60%的細胞裂解。使用CD37結合劑處理細胞可導致下述ADCC活性，即所述ADCC活性產生約10-50%、約20-50%、約30-50%或約40-50%的細胞裂解。在某些特定實施方案中，CD37結合劑能夠誘導Daudi、Ramos和/或Granata-519細胞中的ADCC。
在某些實施方案中，CD37結合劑能夠誘導細胞凋亡。例如，使用CD37結合劑處理細胞可誘導至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%或至少約55%的細胞凋亡。在一些特定實施方案中，CD3結合劑能夠誘導Ramos細胞和/Raji細胞中的細胞凋亡。
在一些實施方案中，CD37結合劑能夠減小腫瘤體積。CD37結合劑減小腫瘤體積的能力可通過測量%T/C值來評估，%T/C值是由對照受治療者的中位數腫瘤體積除被治療的受治療者的中位數腫瘤體積。在在一些實施方案中，使用CD37結合劑治療導致下列%T/C值：小於約55%、小於約50%、小於約45%、小於約40%、小於約35%、小於約30%、小於約25%、小於約20%、小於約15%、小於約10%或小於約5%。在一些特定的實施方案中，CD37結合劑可減小BJAB異種移植物模型和/或SU-DHL-4異種移植物模型中的腫瘤大小。
在某些實施方案中，特異性結合人CD37的免疫共軛物或其他製劑經細胞毒性劑來引發細胞死亡。例如，在某些實施方案中，將人CD37抗體的抗體與美登素綴合，美登素在表達CD37的細胞中通過蛋白質內化而活化。在某些可選的實施方案中，所述製劑或抗體不被綴合。
在某些實施方案中，CD37結合劑能夠抑制腫瘤生長。在某些實施方案中，CD37結合劑能夠在體外抑制腫瘤生長(例如，在異種移植物模型和/或者患有癌的人中)。
CD37結合劑包括CD37抗體CD37-3、CD37-12、CD37-38、CD37-50、CD37-51、CD37-56和CD37-57及其片段、變體以及衍生物。CD37結合劑還包括與選自下述抗體相同的CD37表位特異性結合的CD37結合劑：CD37-3、CD37-12、CD37-38、CD37-50、CD37-51、CD37-56以及CD37-57。CD37結合劑還包括競爭性抑制選自下述的抗體的CD37結合劑：CD37-3、CD37-12、CD37-38、CD37-50、CD37-51、CD37-56以及CD37-57。
在某些特定實施方案中，CD37結合劑與CD37的結合不需要人CD37胺基酸109-138。因此，一些CD37結合劑結合包含SEQ ID NO:180的胺基酸序列的多肽。在其他實施方案中，CD37結合劑與CD37的結合被人CD37胺基酸202-243的突變中斷。因此，一些CD37結合劑不結合包含SEQ ID NO:184的胺基酸序列的多肽。
在一些實施方案中，CD37結合劑結合SEQ ID NO:180的多肽和結合SEQ ID NO:183的多肽，但不結合SEQ ID NO:184的多肽。
在一些實施方案中，CD37結合劑結合SEQ ID NO:190的多肽。在一些實施方案中，CD37結合劑結合SEQ ID NO:190的多肽和SEQ ID NO:189的多肽。在一些實施方案中，CD37結合劑結合SEQ ID NO:190的多肽和SEQ ID NO:188的多肽。
在一些實施方案中，CD37結合劑結合SEQ ID NO:192的多肽，但不結合SEQ ID NO:194的多肽。在一些實施方案中，CD37結合劑結合SEQ ID NO:193的多肽，但不結合SEQ ID NO:194的多肽。
某些CD37結合劑結合的CD37肽片段包括但不限於包含、基本組成為或組成為SEQ ID NO: 1的胺基酸200-243、SEQ ID NO: 1的胺基酸202-220或SEQ ID NO: 1的胺基酸221-243的CD37片段。在一些實施方案中，CD37結合劑特異性結合包含SEQ ID NO:1的202-243的人CD37表位。在一些實施方案中，CD37結合劑與CD37的結合需要SEQ ID NO:1的胺基酸202-243。在一些實施方案中，CD37結合劑與CD37的結合需要SEQ ID NO:1的胺基酸200-220。在一些實施方案中，CD37結合劑與CD37的結合需要SEQ ID NO:1的胺基酸221-243。
CD37結合劑還包括包含CD37-3、CD37-12、CD37-38、CD37-50、CD37-51、CD37-56或CD37-57的重鏈和輕鏈CDR序列的CD37結合劑。CD37-38、CD37-50、CD37-51、CD37-56以及CD37-57的重鏈和輕鏈CDR含有相關的序列。因此，CD37結合劑還可包括保護通過CD37-38、CD37-50、CD37-51、CD37-56以及CD37-57比對獲得的共有序列的重鏈和輕鏈CDR序列。CD37-3、CD37-12、CD37-38、CD37-50、CD37-51、CD37-56以及CD37-57的CDR序列和CD37-38、CD37-50、CD37-51、CD37-56以及CD37-57的共有序列中在下文表1和2中描述。
CD37結合分子可為特異性結合下述CD37的抗體或抗原結合片段，即包含CD37-3、CD37-12、CD37-50、CD37-51、CD37-56或CD37-57的CDR(每個CDR最多達4(即，0、1、2、3或4)個保守性胺基酸取代)的CD37。
所述多肽可包含本文描述的單獨的輕鏈可變區或重鏈可變區之一。所述抗體和多肽還可同時包含輕鏈可變區和重鏈可變區。鼠、嵌合以及人源化CD37-3、CD37-12、CD37-50、CD37-51、CD37-56以及CD37-57抗體的輕鏈可變區和重鏈可變區在下文表3和4中提供。
本發明還提供了包括下述多肽的多肽：(a)與SEQ ID NO:55-71具有至少約90%序列同一性的多肽；和/或(b)與SEQ ID NO:72-87具有至少約90%序列同一性的多肽。在某些實施方案中，所述多肽包括與SEQ ID NO:55-87具有至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列同一性的多肽。因此，在某些實施方案中，所述多肽包括(a)與SEQ ID NO:55-71具有至少約95%序列同一性的多肽和/或(b)與SEQ ID NO:72-87具有至少約95%序列同一性的多肽。在某些實施方案中，所述多肽包括(a)具有SEQ ID NO:55-71的胺基酸序列的多肽；和/或(b)具有SEQ ID NO:72-87的胺基酸序列的多肽。在某些實施方案中，所述多肽是特異性結合CD37的鼠、嵌合或人源化抗體。在某些實施方案中，與SEQ ID NO:55-87具有一定序列同一性百分數的多肽與SEQ ID NO:55-87的不同僅在於保守性胺基酸取代。
所述多肽可包含本文描述的單獨的輕鏈可變區或重鏈可變區之一。所述抗體和多肽還可同時包含輕鏈可變區和重鏈可變區。鼠、嵌合以及人源化CD37-3、CD37-12、CD37-50、CD37-51、CD37-56以及CD37-57抗體的輕鏈和可變鏈序列在下文表5和6中提供。
本發明還提供了包括下述多肽的多肽：(a)與SEQ ID NO: 88-104具有至少約90%序列同一性的多肽；和/或(b)與SEQ ID NO: 105-120具有至少約90%序列同一性的多肽。在某些實施方案中，所述多肽包括與SEQ ID NO: 88-120具有至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列同一性的多肽。因此，在某些實施方案中，所述多肽包括(a)與SEQ ID NO: 88-104具有至少約95%序列同一性的多肽和/或(b)與SEQ ID NO: 105-120具有至少約95%序列同一性的多肽。在某些實施方案中，所述多肽包括(a)具有SEQ ID NO: 88-104的胺基酸序列的多肽；和/或(b)具有SEQ ID NO: 105-120的胺基酸序列的多肽。在某些實施方案中，所述多肽是特異性結合CD37的抗體和/或多肽。在某些實施方案中，所述多肽是特異性結合CD37的鼠、嵌合或人源化抗體。在某些實施方案中，與SEQ ID NO: 88-120具有一定序列同一性百分數的多肽與SEQ ID NO: 88-120的不同僅在於保守性胺基酸取代。
在某些實施方案中，CD37抗體可謂由選自下述的雜交瘤產生的抗體：於2010年2月18日保藏於ATCC的ATCC保藏名稱PTA-10664，於2010年2月18日保藏於ATCC的ATCC保藏名稱PTA-10665，於2010年2月18日保藏於ATCC的ATCC保藏名稱PTA-10666，於2010年2月18日保藏於ATCC的ATCC保藏名稱PTA-10667，於2010年2月18日保藏於ATCC的ATCC保藏名稱PTA-10668，於2010年2月18日保藏於ATCC的ATCC保藏名稱PTA-10669，於2010年2月18日保藏於ATCC的ATCC保藏名稱PTA-10670。在某些實施方案中，所述抗體包含由選自PTA-10665、PTA-10666、PTA-10667、PTA-10668、PTA-10669以及PTA-10670的雜交瘤產生的抗體的VH-CDR和VL-CDRS。
在某些實施方案中，CD37抗體可包含由重組質粒(於2010年3月18日保藏於ATCC的ATCC保藏名稱PTA-10722)編碼的輕鏈。在某些實施方案中，CD37抗體可包含由重組質粒DNA phuCD37-3HCv.1.0(於2010年3月18日保藏於ATCC的ATCC保藏名稱PTA-10723)編碼的重鏈。在某些實施方案中，CD37抗體可包含由重組質粒DNA phuCD37-3LC(PTA-10722)編碼的輕鏈和由重組質粒DNA phuCD37-3HCv.1.0(PTA-10723)編碼的重鏈。在某些實施方案中，CD37抗體可包含由重組質粒DNA phuCD37-3LC(PTA-10722)編碼的VL-CDR和由重組質粒DNA phuCD37-3HCv.1.0(PTA-10723)編碼的VH-CDR。
可使用雜交瘤方法來製備單克隆抗體，例如Kohler和Milstein(1975)Nature 256:495描述的那些。使用雜交瘤方法，如上所述對小鼠、倉鼠或其他合適的宿主動物進行免疫以引發淋巴細胞產生特異性結合免疫抗原的抗體。還可在體外對淋巴細胞進行免疫。在免疫之後，分離淋巴細胞並使用例如聚乙二醇與合適的骨髓瘤細胞系進行融合以形成雜交瘤細胞，然後可將所述雜交瘤細胞與未融合的淋巴細胞和骨髓瘤細胞選擇開。然後，可對於產生針對所選擇的抗原的單克隆抗體的雜交瘤[如通過免疫沉澱、免疫印跡或通過體外結合測定(例如，放射免疫測定(RIA)，酶聯免疫吸附測定(ELISA))所檢測]使用標準方法體外培養(Goding,Monoclonal Antibodies: Principles and Practice,Academic Press,1986)或在動物中體內作為腹水腫瘤來傳代。然後，可如上文對於多克隆抗體所述那樣從培養基或腹水瘤體純化單克隆抗體。
可選地，還可使用如美國專利4,816,567中描述的重組DNA方法來製備單克隆抗體。從成熟B細胞或雜交瘤細胞分離編碼單克隆抗體的多核苷酸，例如使用特異性擴增編碼抗體的重鏈和輕鏈的基因的寡核苷酸引物通過RT-PCR，並且使用常規程式來確定它們的序列。然後，將編碼重鏈和輕鏈的分離的多核苷酸克隆至合適的表達載體，然後將所述表達載體轉染至宿主細胞，例如大腸桿菌(E. coli)細胞、猿猴COS細胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞，或不產生免疫球蛋白的骨髓瘤細胞，由宿主細胞產生單克隆抗體。另外，可如先前所述從表達所需物種的CDR的噬菌體展示庫分離所需物種的重組單克隆抗體或其片段(McCafferty等人，1990,Nature,348:552-554;Clackson等人，1991,Nature,352:624-628;以及Marks等人，1991,J. Mol. Biol.,222:581-597)。
可使用重組DNA技術以許多不同方式進一步修飾編碼單克隆抗體的多核苷酸，以產生可選的抗體。在一些實施方案中，例如小鼠單克隆抗體的輕鏈和重鏈恒定區可被取代為1)例如人抗體的那些區以產生嵌合抗體或取代為2)非免疫球蛋白多肽以產生融合抗體。在一些實施方案中，將恒定區截短或去除以產生單克隆抗體的所需抗體片段。可變區的位元點定向或高密度誘變可用于優化單克隆抗體的特異性、親和力等。
在一些實施方案中，針對人CD37的單克隆抗體為人源化抗體。在某些實施方案中，當將這樣的抗體施用於人受治療者時，在治療上將其用於減小減小抗原性和HAMA(人抗小鼠抗體)反應。可使用本領域已知的多種技術來製備人源化抗體。在某些可選的實施方案中，針對CD37的抗體為人抗體。
可使用本領域已知的多種技術來直接製備人抗體。可生成體外免疫的或從產生針對靶抗原的免疫個體分離的永久性人B淋巴細胞(見，例如，Cole等人，單克隆Antibodies and Cancer Therapy,Alan R. Liss,第77頁(1985);Boemer等人，1991,J. Immunol.,147(1):86-95；以及美國專利5,750,373)。另外，人抗體可選自噬菌體庫，其中所述噬菌體庫表達人抗體，如例如Vaughan等人，1996,Nat. Biotech.,14:309-314,Sheets等人，1998,Proc. Nat’l. Acad. Sci.,95:6157-6162,Hoogenboom和Winter,1991,J. Mol. Biol.,227:381,以及Marks等人，1991,J. Mol. Biol.,222:581中所述。用於生成和使用抗體噬菌體庫的技術還描述於美國專利號5,969,108、6,172,197、5,885,793、6,521,404、6,544,731、6,555,313、6,582,915、6,593,081、6,300,064、6,653,068、6,706,484以及7,264,963；和Rothe等人，2007,J. Mol. Bio.,doi:10.1016/j.jmb.2007.12.018(這些文獻各自通過引用完整併入本文)。親和力成熟策略和鏈替換策略(Marks等人，1992,Bio/Technology 10:779-783,通過引用完整併入本文)為本領域已知，可被用於生成高親和力人抗體。
人源化抗體還可在含有人免疫球蛋白基因座的轉基因小鼠中製備，當免疫時所述小鼠能夠在不產生外源性免疫球蛋白的情況下產生人抗體的所有組分。該技術描述於美國專利5,545,807;5,545,806;5,569,825;5,625,126;5,633,425;以及5,661,016。
本發明還包括特異性識別CD37的雙特異性抗體。雙特異性抗體為能夠特異性識別並結合至少兩個不同表位的抗體。不同表位可位於相同分子中(例如，相同的CD37)或位於不同分子上，使得例如兩個抗體均能夠特異性識別和結合CD37，以及例如1)白細胞上的效應分子，例如T細胞受體(例如CD3)或Fc受體(例如，CD64、CD32或CD16)或2)如下文詳細描述的細胞毒性劑。
示例的雙特異性抗體可結合兩個不同的表位，其中至少之一源于本發明的多肽。可選地，免疫球蛋白分子的抗抗原臂可與結合白細胞上的觸發分子(例如T細胞受體分子(例如CD2、CD3、CD28或B7)或IgG的Fc受體的臂組合，以將細胞防禦機制集中於表達特定抗原的細胞。雙特異性抗體還可用於將細胞毒性劑針對表達特定抗原的細胞。這些抗體具有抗原結合臂和結合細胞毒性劑或放射性核素螯合劑(例如EOTUBE、DPTA、DOTA或TETA)的臂。製備雙特異性抗體的技術為本領域公知(Millstein等人，1983,Nature 305:537-539;Brennan等人，1985,Science 229:81;Suresh等人，1986,Methods in Enzymol. 121:120;Traunecker等人，1991,EMBO J. 10:3655-3659;Shalaby等人，1992,J. Exp. Med. 175:217-225;Kostelny等人，1992,J. Immunol. 148:1547-1553;Gruber等人，1994,J. Immunol. 152:5368；以及美國專利5,731,168)。還考慮了具有超過兩個原子價的抗體。例如，可製備三特異性抗體(Tutt等人，J. Immunol. 147:60(1991))。因此，在某些實施方案中，CD37的抗體為多特異性。
在某些實施方案中，提供了用於例如增加腫瘤滲透性的抗體片段。已知用於產生抗體片段的多種技術。傳統上，這些片段經對完整抗體進行蛋白水解消化而產生(例如，Morimoto等人，1993,Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117;Brennan等人，1985,Science,229:81)。在某些實施方案中，重組產生抗體片段。Fab、Fv以及scFv抗體片段均可表達或分泌於大腸桿菌或其他宿主細胞，從而允許產生大量這些片段。這樣的抗體片段還可從上文討論的抗體噬菌體庫分離。抗體片段還可為例如美國專利5,641,870中描述的直鏈抗體，且可為單特異性或雙特異性。用於產生抗體片段的其他技術對於醫學專業人員來說是顯而易見的。
根據本發明，多種技術可適於產生CD37的特異性單鏈抗體(見，美國專利號4,946,778)。另外，多種方法可適於構建Fab表達庫(Huse,等人，Science 246:1275-1281(1989))以使得快速和有效鑒定具有所需對於CD37的特異性的單克隆Fab片段或其衍生物、片段、類似物或同系物。可通過本領域的技術來治病抗體片段，包括但不限於(a)通過對於抗體分子進行胃蛋白酶消化產生的F(ab')2片段；(b)通過減少F(ab')2片段的二硫鍵而產生的Fab片段，(c)通過使用木瓜蛋白酶和還原劑來處理抗體而產生的Fab片段，以及(d)Fv片段。
修飾抗體以增加其血清半衰期也是合乎需要的，特別是在抗體片段的情況下。可通過下述方法實現這點，例如，通過對抗體片段中的合適區域進行突變而將結合補救受體的表位摻入抗體片段，或通過將表位摻入肽標籤，然後將所述標籤與抗體片段中末端或在中間融合(例如，通過DNA或肽合成)。
異綴合抗體也在本發明的範圍內。異綴合抗體由兩個共價連接的抗體組成。例如，這樣的抗體已經被提出使免疫細胞靶向非期望的細胞(美國專利第4,676,980號)。考慮到了可使用合成蛋白質化學中已知的方法來體外製備抗體，博客涉及接頭的那些。例如，可使用二硫鍵交換反應或通過形成硫醚鍵來構建免疫毒素。用於該目的的合適試劑的實例包括亞胺硫醇酯和甲基-4-巰基丁基醯亞胺酯。
對於本發明的目的，應理解修飾的抗體可包括提供了抗體與人CD37的多肽締合的任何類型的可變區。關於這點，可變區可包括或衍生自可被誘導產生體液反應並產生針對所需腫瘤相關抗原的免疫球蛋白的任何類型的哺乳動物。這樣，被修飾的抗體的可變區可為例如人、鼠、非人靈長類(例如，短尾猴、獼猴等)或狼來源。在一些實施方案中，被修飾的免疫球蛋白的可變區和恒定區均為人的。在其他實施方案中，相容的抗體的可變區(通常衍生自非人來源)可被工程化或特別修剪以改進結合特性或減輕分子的免疫原性。在該方面，用於本發明的可變區可為人源化或通過包含引入的胺基酸序列而改變。
在某些實施方案中，重鏈和輕鏈中的可變結構域可通過一種或多種CDR的至少部分取代和必要時通過部分框架區替換和序列改變而改變。儘管CDR可衍生自與框架區從中衍生的抗體相同的類或甚至亞類的抗體，但認為CDR可衍生自不同類別的抗體並可能衍生自不同物種的抗體。並非總是有必要使用供體可變區的完整CDR來替換所有CDR，以將一個可變結構域的抗原結合能力轉變為另一可變結構域的抗原結合能力。相反，在一些情況下，僅需要轉換對於維持抗原結合位點的活性必需的那些殘基。考慮到美國專利號5,585,089、5,693,761以及5,693,762中提出的解釋，通過實施常規實驗或通過試驗與誤差試驗來獲得具有減輕的免疫原性的功能抗體很好地在本領域技術人員的能力範圍內。
儘管對於可變區進行改變，但本領域技術人員應理解本發明的被修飾的抗體將包括下述抗體(例如，全長抗體或其免疫反應性片段)，即，其中一個或多個恒定結構域的至少一個級分缺失或被改變以提供所需的生物化學特性，例如當與包含天然或未改變的恒定區的具有近似相同免疫原性的抗體相比時增加的腫瘤定位或減少的血清半衰期。在一些實施方案中，修飾的抗體的恒定區包含入恒定區。適於本發明的恒定區的修飾包括一個或多個結構域中一個或多個胺基酸的添加、缺失或取代。也就是說，本發明揭示的修飾的抗體可包含對於三個重鏈恒定結構域(CH1、CH2或CH3)的一個或多個和/或對於輕鏈恒定區(CL)的改變或修飾。在一些實施方案中，考慮到其中一個或多個結構域被部分或完全缺失的修飾的恒定區。在一些實施方案中，修飾的抗體包含結構域缺失的構建體或變體，其中CH2結構域被去除(ΔCH2構建體)。在一些實施方案中，缺失的恒定結構域被短胺基酸間隔區(例如，10個殘基)取代，所述短胺基酸間隔區提供通常由所缺乏的恒定區賦予的一些分子柔性。
除了其構象，本領域中已知，恒定區介導幾種效應子功能。例如，補體的C1組分與抗體結合啟動補體系統。補體的啟動在細胞病原體的調理和裂解中是重要的。補體的啟動還刺激炎症反應，且還可涉及自身免疫超敏反應。另外，抗體經Fc區結合細胞，抗體Fc區上的Fc受體位點結合細胞上的Fc受體(FcR)。有多個對於不同類型抗體特異性的Fc受體，包括IgG(γ受體)、IgE(η受體)、IgA(α受體)以及IgM(μ受體)。抗體與細胞表面上的Fc受體結合觸發了重要的和不同生物反應，包括對於抗體覆蓋的顆粒的吞噬和破壞，免疫複合物的清除，殺傷細胞對於抗體覆蓋的靶細胞的裂解(被稱為抗體依賴性細胞介導的細胞毒性，或ADCC)，炎症介質的釋放，胎盤轉移和免疫球蛋白產生的控制。
在某些實施方案中，CD37結合抗體提供了改變的效應子功能，而改變的效應子功能又影響所施用的抗體的生物學模式。例如，恒定區結構域的缺失或滅活(通過點突變或其他方式)可減弱迴圈修飾的抗體的Fc受體結合，從而增加腫瘤定位。在其他情況中，可以是，與本發明相一致的，恒定區修飾減弱補體結合並從而減少血清半衰期和綴合的細胞毒素的非特異性締合。另外，恒定區的其他修飾可用於消除二硫鍵或寡糖部分，該二硫鍵或寡糖部分因增加的抗原特異性或抗體柔性而允許提高的定位。相似地，根據本發明對於恒定區的修飾可容易地使用很好地在本領域技術人員的技術範圍內的公知的生物化學或分子工程技術來製備。
在某些實施方案中，作為抗體的CD37結合劑不具有一種或多種效應子功能。例如，在一些實施方案中，抗體不具有抗體依賴性細胞毒性(ADCC)活性和/或不具有補體依賴性細胞毒性(CDC)活性。在某些實施方案中，抗體不結合Fc受體和/或補體因數。在某些實施方案中，抗體不具有效應子功能。
應注意，在某些實施方案中，可將修飾的抗體進行工程化來將CH3結構域直接與各修飾抗體的絞鏈區融合。在其他構建體中，提供位於絞鏈區和修飾的CH2和/或CH3結構域之間的肽間隔區可以是合乎需要的。例如，合適的構建體可被表達，其中，CH2結構域已缺失，剩下的CH3結構域(修飾的或未修飾的)與具有5-20個胺基酸間隔區的絞鏈區連接。這樣的間隔區可以被例如添加以保證恒定結構域的調節元件仍游離和易接近或保證鉸鏈區仍具有柔性。然而，應注意，在一些情況下，胺基酸間隔區顯示具有免疫原性且引發針對構建體的不想要的免疫反應。因此，在某些實施方案中，被添加至構建體的任何間隔區較不具有免疫原性，或甚至完全缺失，以維持修飾的抗體的所需的生物化學性質。
除了整個恒定區結構域缺失以外，應理解所提供的本發明的抗體可為少數或甚至單個胺基酸的部分缺失或取代。例如，在CH2結構域的缺失區域中單個胺基酸突變可足以基本上減弱Fc結合並由此增加腫瘤定位。相似地，僅使得調控待調節的效應子功能(例如，補體CLQ結合)的一個或多個恒定區結構域缺失可以是合乎需要的。這樣的恒定區的部分缺失可改善抗體的選擇的特性(血清半衰期)，同時使得與受治療者恒定區結構域相關的其他合乎需要的功能完整。另外，如上文提及的，所揭示的抗體的恒定區可通過對於一個或多個胺基酸進行突變或取代而修飾，這可提高所產生的構建體的特性。關於這方面，可能破壞保守結合位點(例如，Fc結合)提供的活性而同時基本上維持修飾的抗體的構象和免疫原性。某些實施方案可包括將一個或多個胺基酸添加至恒定區以提高合乎需要的特性，例如，減小或增加效應子功能或提供較多細胞毒素或碳水化合物附著。在這些實施方案中，插入或複製衍生自所選擇的恒定區結構域的特異性序列是合乎需要的。
本發明還包括基本上與本發明提到的嵌合抗體、人源化抗體以及人抗體具有同源性的變體和等同物。這些含有，例如，保守性取代突變，即一個或多個胺基酸被相似的胺基酸取代。例如，保守性取代是指以相同通用分類中的另一胺基酸取代一種胺基酸，例如，以另一種酸性胺基酸取代一種酸性胺基酸，以另一種鹼性胺基酸取代一種鹼性胺基酸或由另一種中性胺基酸取代一種中性胺基酸。預期的保守性胺基酸取代為本領域公知。
本發明的多肽可以是包含針對人CD37的抗體或其片段的重組多肽、天然多肽或合成多肽。本領域將認識到，本發明的一些胺基酸序列可改變而不會對蛋白的結構或功能產生顯著的影響。因此，本發明還包括顯示出實質上活性的多肽變體，或其包括針對CD37蛋白的抗體或其片段的區域。這些突變包括缺失、插入、翻轉、重複和類型置換。
多肽和類似物可進一步修飾以含有非蛋白通常部分的另外的化學部分。這些衍生的部分可改善蛋白的溶解度、生物半衰期或吸收。所述部分還可以降低或消除蛋白的任何期望的副作用等。這些部分的綜述可在REMINGTON'SPHARMACEUTICAL SCIENCES,20th ed.,Mack Publishing Co.,Easton,PA(2000)中找到。
本文中所述的分離的多肽可以通過本領域已知的任何合適的方法來製備。這些方法的範圍包括從直接蛋白合成方法到構建編碼分離的多肽序列的DNA序列，並且在合適的轉化的宿主中表達那些序列。在一些實施方案中，DNA序列使用重組技術通過分離或合成編碼目標野生型蛋白的DNA序列來構建。任選地，所述序列可通過定點突變來突變，以提供其功能類似物。例如參見Zoeller et al.,Proc. Nat’1. Acad. Sci. USA 81:5662-5066(1984)和美國專利No. 4,588,585。
在一些實施方案中，編碼目標多肽的DNA序列將通過化學合成使用寡核苷酸合成器來構建。這些寡核苷酸可基於期望的多肽的胺基酸序列並選擇那些密碼子來設計，所述密碼子在宿主細胞中是有利的，在所述宿主細胞中將製備目標重組多肽。標準方法可應用于合成編碼目標分離的多肽的分離的核苷酸序列。例如，完全胺基酸序列可用於構建反向翻譯的基因。另外，可以合成含有核苷酸序列的DNA低聚物，所述核苷酸序列編碼用於特定分離的多肽。例如，編碼用於部分期望的多肽的一些小寡核苷酸可被合成，並然後連接。各個寡核苷酸典型地含有5'或3'突出端以用於互補裝配。
在裝配後(通過合成、定點突變或另外方法)，編碼目標特定分離的多肽的多核苷酸序列將插入表達載體中，並且操作性地連接適於在期望的宿主中表達蛋白的表達控制序列。合適的裝配可通過下列方式來證實：核苷酸測序、限制性映射和生物活性多肽在合適宿主中的表達。如本領域已知的，為了在宿主中獲得高表達水準的轉染的基因，基因必須操作性的連接在選擇的表達宿主中具有功能的轉錄和翻譯的達控制序列。
在某些實施方案中，重組表達載體用於擴增和表達編碼針對人CD37的抗體或其片段的DNA。重組表達載體是可複製的DNA構建體，其具有編碼抗-CD37抗體或其片段的多肽鏈的合成或cDNA-衍生的片段，其操作性地連接合適的轉錄和翻譯的調節元件(衍生自哺乳動物、微生物、病毒或昆蟲基因)。轉錄單元通常包括下列裝配：(1)在基因表達中具有調節作用的一種或多種基因元件，例如轉錄啟動子或增強子；(2)轉錄到mRNA中並翻譯到蛋白中的結構或碼序列；以及(3)合適的轉錄和反應引發和終止序列，如下面詳細所述。這些調節元件可包括操縱基因序列以控制轉錄。可另外地引入的能力，其由複製源和選擇基因賦予以促進轉化體的識別。當它們功能上彼此關聯時，DNA區操作性地連接。例如，信號肽(分泌前導序列)的DNA操作性地連接多肽的DNA，如果其表達為參與多肽分泌的前體；啟動子操作性地連接編碼序列，如果其控制序列的轉錄；或核糖體結合位元點操作性地連接編碼序列，如果其被定位以允許翻譯。旨在用在酵母表達系統中的結構元件包括能夠通過宿主細胞進行翻譯的蛋白的細胞外分泌的前導序列。可選擇地，如果在沒有前導序列或運輸序列的情況下表達重組蛋白，其可包括N-末端蛋氨酸殘基。該殘基可任選地隨後從表達的重組蛋白切除以提供最終產物。
表達控制序列和表達載體的選擇取決於宿主的選擇。可以使用寬範圍的表達宿主/載體的組合。用於真核宿主的有用表達載體包括例如包含來自SV40的表達控制序列的載體、牛乳頭瘤病毒、腺病毒和細胞巨化病毒。細菌宿主的有用的表達載體包括已知的細菌質粒，例如來自Esherichia coli的質粒，包括pCR 1、pBR322、pMB9和它們的衍生物；更寬宿主範圍的質粒、例如M13和絲狀單鏈DNA噬菌體。
用於表達CD37-結合多肽或抗體(或CD37蛋白以用作抗原)的合適的宿主細胞包括原核細胞、酵母、昆蟲或在合適的啟動子控制下的高級真核細胞。原核細胞包括革蘭氏陰性或革蘭氏陽性有機體，例如E. coli或桿菌。高級真核細胞包括如下所示的哺乳動物源的建立的細胞系。也可以使用無細胞翻譯體系。用於細菌、真菌、酵母和哺乳動物細胞宿主的合適的克隆和表達載體由Pouwels et al.所述(Cloning Vectors: A Laboratory Manual,Elsevier,N.Y.,1985)，並且其相關公開通過引用的方式併入。關於蛋白製備包括抗體製備的方法的另外的資訊可以在例如美國專利公開No. 2008/0187954、美國專利No. 6,413,746和6,660,501、以及國際專利公開No. WO 04009823中找到，其均通過引用的方式全部併入本文中。
各種哺乳動物或昆蟲細胞培養物系統也有利地用於表達重組蛋白。重組蛋白在哺乳動物細胞中的表達可進行，因為這些蛋白通常正確地折疊、合適地修飾、並且是完全功能性的。合適的哺乳動物宿主細胞系的例子包括猴腎細胞的COS-7系，其由Gluzman所述(Cell 23:175,1981)，和能夠表達合適的載體的其他細胞系，包括例如L細胞,C127,3T3,中華倉鼠卵巢細胞(CHO),HeLa和BHK細胞系。哺乳動物表達載體可包含非轉錄的元件，例如複製源、連接待表達的基因的合適的啟動子和增強子、以及其他5'或3'側翼非轉錄的序列和5'或3'非翻譯的序列例如必需核糖體結合位點、多腺苷酸化位點、剪接供體和受體位點、以及轉錄終止序列。在昆蟲細胞中製備異源蛋白的杆狀病毒系統由Luckow和Summers綜述，Bio/Technology 6:47(1988)。
由轉化的宿主製備的蛋白可根據合適的方法來純化。這些標準方法包括色譜法(例如離子交換、親和和空間柱色譜法)、離心、差式溶解或通過用於蛋白純化的任何其他標準技術。親和標籤例如六聚組氨酸、麥芽糖結合域、流感覆膜序列和谷胱甘肽-S-轉移酶可附接蛋白以允許通過合適的親和柱來容易地進行純化。分離的蛋白還可以使用這些的技術來物理標準，所述技術例如蛋白質水解、核磁共振和x-射線結晶學。
例如，來自分泌重組蛋白到培養基中的系統的上清可使用市售蛋白濃縮篩檢程式例如Amicon或Millipore Pellicon超濾單元首先濃縮。在濃縮步驟後，所得濃縮物可應用於合適的純化基質。可選擇地，可以使用陰離子交換樹脂，例如具有側鏈二乙基氨基乙基(DEAE)基團的基質或基材。所述基質可以是丙烯醯胺、瓊脂糖、葡萄聚糖、纖維素或通常應用在蛋白純化中的其他類型。可選擇地，可以使用陽離子交換步驟。合適的陽離子交換包括各種不溶性基質，包含磺基丙基或羧甲基。最後，可以使用一種或多種反相高效液相色譜法(RP-HPLC)步驟(其利用疏水性RP-HPLC介質例如具有側鏈甲基或其他脂肪族基團的矽膠)來進一步純化CD37-結合劑。上述純化步驟的一些或全部以多種組合方式還可用于提供同源重組蛋白。
在細菌培養基中製備的重組蛋白可例如通過下列方式進行分離：初始從細胞沉澱物中提取，然後進行一次或多次濃縮，鹽析。水性離子交換或空間排阻色譜法步驟。高效液相色譜法(HPLC)可用於最終的純化步驟。在表達重組蛋白中使用的微生物細胞可通過任何常規方法來破壞，包括凍融迴圈、超聲、機械破壞或使用細胞胞溶劑。
還包括本領域已知的用於純化抗體和其他蛋白的方法，例如美國專利公開No. 2008/0312425、2008/0177048和2009/0187005中所述的那些，其均通過引用的方式全部併入本文中。
在某些實施方案中，CD37-結合劑是非抗體的多肽。鑒定和製備高親和性地結合蛋白靶的非抗體多肽的多種方法是本領域已知的。例如參見Skerra,Curr. Opin. Biotechnol.,18:295-304(2007),Hosse et al.,Protein Science,15:14-27(2006),Gill et al.,Curr. Opin. Biotechnol.,17:653-658(2006),Nygren,FEBS J.,275:2668-76(2008),和Skerra,FEBS J.,275:2677-83(2008)，其均通過引用的方式全部併入本文中。在某些實施方案中，噬菌體顯示技術用於鑒定/製備CD37-結合多肽。在某些實施方案中，多肽包含選自由下列構成的組的類型的蛋白支架：蛋白A、脂籠蛋白、纖維連接蛋白域、錨蛋白通用序列重複域和硫氧還蛋白。
在一些實施方案中，製劑是非蛋白分子。在某些實施方案中，製劑是小分子。用在鑒定非蛋白CD37-結合劑中的組合化學庫和技術是本領域技術人員已知的。參見例如Kennedy et al.,J. Comb. Chem,10:345-354(2008),Dolle et al,J. Comb. Chem.,9:855-902(2007)和Bhattacharyya,Curr. Med. Chem.,8:1383-404(2001)，其均通過引用的方式全部併入本文中。在某些進一步實施方案中，製劑是碳水化合物、粘多糖、醣蛋白或蛋白多糖。
在某些實施方案中，製劑是核酸適體。適體是多核苷酸分子，其基於它們結合另外分子的能力來選擇(例如來自隨機或突變庫)。在一些實施方案中，適體包含DNA多核苷酸。在某些可選擇的實施方案中，適體包含RNA多核苷酸。在某些實施方案中，適體包含一種或多種修飾的核酸殘基。產生和篩選用於結合蛋白的核酸適體的方法是是本領域熟知的。例如參見美國專利No. 5,270,163,美國專利No. 5,683,867,美國專利No. 5,763,595,美國專利No. 6,344,321,美國專利No. 7,368,236,美國專利No. 5,582,981,美國專利No. 5,756,291,美國專利No. 5,840,867,美國專利No. 7,312,325,美國專利No. 7,329,742,國際專利公開No. WO 02/077262,國際專利公開No. WO 03/070984,美國專利申請公開No. 2005/0239134,美國專利申請公開No. 2005/0124565和美國專利申請公開No. 2008/0227735，其均通過引用的方式全部併入本文中。
III.　免疫共軛物
本發明還涉及共軛物(本文中也稱為免疫共軛物)，包含連接或綴合的藥物或前藥的本文中公開的抗-CD37抗體、抗體片段和它們的功能等效物。合適的藥物或前藥是本領域已知的。藥物或前藥可以是細胞毒素劑。用在本發明的細胞毒素的共軛物中的細胞毒素劑可以是任何這樣的化合物，該化合物導致細胞死亡或誘導細胞死亡，或以一些方式降低細胞生存力，並且包括例如美登醇和美登醇類似物。其他合適的細胞毒素劑例如苯二氮卓類、紫杉烷、CC-1065、CC-1065類似物、倍癌黴素和倍癌黴素類似物、紫杉化合物例如剌孢黴素、朵拉司他汀和朵拉司他汀類似物包括auristatin、托馬黴素衍生物、來普黴素衍生物、甲氨蝶呤、順鉑、卡鉑、柔紅黴素、阿黴素、長春新堿、長春堿、美法倉、絲裂黴素C、苯丁酸氮芥和嗎啉代阿黴素。
這些共軛物可通過使用連接基團來製備，以使藥物或前藥連接至抗體或功能等效物。合適的連接基團是本領域熟知的，並且包括例如二硫化物基團、硫醚基、酸不穩定性基團、光不穩定性基團、肽酶不穩定性基團、和酯酶不穩定性基團。
藥物或前藥可以例如通過該二硫鍵連接抗-CD37抗體或其片段。接頭分子或交聯劑包含可和抗-CD37抗體或其片段反應的反應性化學基團。用於和細胞-結合劑反應的反應性化學基團可以是N-琥珀醯亞胺基酯和N-磺基琥珀醯亞胺基酯。另外，接頭分子包含反應性化學基團，其可以是可和藥物反應以形成二硫鍵的二硫吡啶基。接頭分子包括例如N-琥珀醯亞胺基3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)(例如參見Carlsson et al.,Biochem. J.,173: 723-737(1978)),N-琥珀醯亞胺基4-(2-吡啶基二硫代)丁酸酯(SPDB)(例如參見美國專利No. 4,563,304),N-琥珀醯亞胺基4-(2-吡啶基二硫代)2-磺基丁酸酯(磺基-SPDB)(參見美國公開No.20090274713),N-琥珀醯亞胺基4-(2-吡啶基二硫代)戊酸酯(SPP)(例如參見CAS註冊號341498-08-6),2-亞氨基硫烷，或乙醯琥珀酸酸酐。例如，抗體或細胞結合劑可以使用交聯試劑和含有游離或保護的巰基的抗體或細胞結合劑來修飾，並因此然後衍生，和二硫化物或含巰基的美登醇反應以製備共軛物。共軛物可以通過色譜法純化，包括但不限於HPLC、空間排阻、吸附、離子交換和親和捕獲、滲析或切向流過濾。
在本發明的另一方面，抗-CD37抗體通過二硫鍵和聚乙二醇間隔物連接細胞毒素的藥物以增強免疫共軛物的效價、溶解度或效力。這些可裂解親水性接頭在WO2009/0134976中有所描述。該接頭設計的附加優點是抗體-藥物共軛物的期望的高單體比例和最低聚集。該方面中具體涵蓋通過二硫化物基團(-S-S-)連接的細胞-結合劑和藥物的共軛物，其具有聚乙二醇間隔物((CH2CH2O)n=1-14)，藥物負載數在2-8的較窄範圍，這描述了其對於癌症細胞顯示出相對較高有效的生物活性，並且具有高綴合率和高單體比例的期望的生物化學性能，同時具有最小蛋白聚集。
該方面中具體涵蓋式(I)的抗-CD37抗體藥物共軛物或式(I')的共軛物：
CB-[X1-(-CH2-CH2O-)n-Y-D]m　(I)
[D-Y-(-CH2-CH2O-)n-X1]m-CB　(I')
其中：CB表示抗-CD37抗體或片段；D表示藥物；X表示通過硫醚鍵、醯胺鍵、氨基甲酸酯鍵或醚鍵附接細胞-結合劑的脂肪族、芳香族或雜環單元；Y表示通過二硫鍵附接藥物的脂肪族、芳香族或雜環單元；1是0或1；m是2至8的整數；以及n是1至24的整數。
在一些實施方案中，m是2至6的整數。
在一些實施方案中，m是3至5的整數。
在一些實施方案中，n是2至8的整數。可選擇地，如例如美國專利No. 6,441,163和7,368,565中所公開的，藥物可首選被修飾以引入適於和細胞-結合劑反應的反應性酯。這些含有活化的接頭部分的藥物和細胞-結合劑的反應提供了另一種製備細胞-結合劑藥物共軛物的方法。美登醇還可以使用PEG連接基團連接抗-CD37抗體或片段，如例如美國專利6,716,821中所闡述。這些PEG非可裂解連接基團在水和非水溶劑中都是可溶的，並且可用於使一種或多種細胞毒素劑接合細胞結合劑。示例性PEG連接基團包括雜雙官能PEG接頭，其和細胞毒素劑和細胞結合劑在接頭的相對端反應，其中在一端通過巰基或二硫化物基團，並且在另一端通過活性酯。作為使用PEG連接基團合成細胞毒素的共軛物的通常例子，再次參考美國專利6,716,821，其通過引用的方式併入本文中。合成開始於具有反應性PEG部分的一種或多種細胞毒素劑與細胞-結合劑的反應，從而導致各反應性PEG部分的末端活性酯被細胞結合劑的胺基酸殘基所取代，從而產生含有通過PEG連接基團共價鍵合細胞結合劑的一種或多種細胞毒素劑的細胞毒素的共軛物。可選擇地，細胞結合可使用雙官能PEG交聯劑修飾，以引入反應性二硫化物部分(例如吡啶基二硫化物),然後其可和含巰基的美登醇反應以提供共軛物。在另一方法中，細胞結合可使用雙官能PEG交聯劑修飾，以引入巰基部分，其可然後和含反應性二硫化物的美登醇(例如吡啶基二硫化物)反應以提供共軛物。
可製備具有非可裂解連接的抗體-美登醇共軛物。這些交聯劑在現有技術中有所描述(參見美國公開No. 20050169933)，並且包括但不限於N-琥珀醯亞胺基4-(馬來醯亞胺基甲基)環己烷羧酸酯(SMCC)。在一些實施方案中，抗體使用諸如琥珀醯亞胺基4-(N-馬來醯亞胺基甲基)-環己烷-1-羧酸酯(SMCC),磺基-SMCC,馬來醯亞胺苯甲醯-N-羥基琥珀醯亞胺酯(MBS),磺基-MBS或琥珀醯亞胺基-碘醋酸酯之類的交聯試劑修飾，例如文獻中所述，以引入1-10個反應性基團(Yoshitake et al,Eur. J. Biochem.,101:395-399(1979);Hashida et al,J. Applied Biochem.,56-63(1984);and Liu et al,Biochem.,18:690-697(1979))。修飾的抗體然後和含巰基的美登醇衍生物反應以製備共軛物。共軛物可通過凝膠過濾經過Sephadex G25柱或通過滲析或切向流過濾來純化。修飾的抗體使用含巰基的美登醇(1至2摩爾當量/馬來醯亞胺基)處理，並且抗體-美登醇共軛物通過下列方式進行純化：經過Sephadex G-25柱凝膠過濾、在陶瓷羥基磷灰石柱上的色譜法、滲析或切向流過濾、或這些方法的組合。典型地，平均1-10美登醇/抗體連接。一種方法是使用琥珀醯亞胺基4-(N-馬來醯亞胺基甲基)-環己烷-1-羧酸酯(SMCC)修飾抗體以引入馬來醯亞胺基，然後使修飾的抗體和含巰基的美登醇反應，從而得到硫醚-連接的共軛物。再次得到具有1至10個藥物分子/抗體分子的共軛物。按照相同的方式製備抗體、抗體片段和其他蛋白的美登醇共軛物。
在本發明的另一方面中，CD37抗體通過非可裂解鍵經過中間PEG間隔物連接藥物。合適的交聯試劑包括形成藥物和抗-CD37抗體或片段之間的接頭的親水性PEG鏈，這也是本領域熟知的，或者市售的(例如來自Quanta Biodesign,Powell,Ohio)。合適的含有PEG的交聯劑還可以從市售PEG本身使用本領域技術人員已知的標準合成化學技術來合成。通過美國專利公開20090274713和WO2009/0134976中詳細所述的方法，所述藥物可和含雙官能PEG交聯劑反應，以得到下式Z-X1-(-CH2-CH2-O-)n-Yp-D的化合物，其然後可和細胞結合劑反應以提供共軛物。可選擇地，細胞結合可使用雙官能PEG交聯劑修飾以引入巰基-反應性基團(例如馬來醯亞胺或鹵代乙醯胺)，其然後可和含巰基的美登醇反應以得到共軛物。在另外的方法中，細胞結合可使用雙官能PEG交聯劑修飾，以引入巰基部分，所述巰基部分然後可和巰基-反應性美登醇(例如具有馬來醯亞胺或鹵代乙醯胺的美登醇)反應以得到共軛物。
因此，本發明的另外方面是式(II)或式(II')的抗-CD37抗體藥物共軛物：
CB-[Xl-(-CH2-CH2-O-)n-Yp-D]m　(II)
[D-Yp-(-CH2-CH2-O-)n-Xl]m-CB　(II')
其中，CB表示抗-CD37抗體或片段；D表示藥物；X表示通過硫醚鍵、醯胺鍵、氨基甲酸酯鍵或醚鍵結合細胞-結合劑的脂肪族、芳香族或雜環單元；Y表示通過共價鍵結合藥物的的脂肪族、芳香族或雜環單元，所述共價鍵選自由下列構成的組：硫醚鍵、醯胺鍵、氨基甲酸酯鍵、醚鍵、胺鍵、碳-碳鍵和腙鍵；l是0或1；p是0或1；m是2至15的整數；以及n是1至2000的整數。
在一些實施方案中，m是2至8的整數；以及
在一些實施方案中，n是1至24的整數。
在一些實施方案中，m是2至6的整數。
在一些實施方案中，m是3至5的整數。
在一些實施方案中，n是2至8的整數。合適的含有PEG的接頭的例子包括具有N-琥珀醯亞胺基酯或N-磺基琥珀醯亞胺基酯部分以和抗-CD37抗體或其片段反應的接頭，以及具有基於馬來醯亞胺-或鹵代乙醯基的部分以和化合物反應的部分。PEG間隔物可通過本文中所述的方法引入本領域已知的任何交聯劑中。
本文中公開的多種接頭在美國專利公開No. 20050169933和20090274713與在WO2009/0134976中詳細描述，其內容全部通過引用的方式併入。
本發明包括下列方面，其中約2至約8個藥物分子("藥物負載數")例如美登醇連接抗-CD37抗體或其片段，和更少或更多數量的藥物連接至相同細胞結合劑的藥物負載數的情況相比，共軛物的抗-腫瘤效果更有效。本文中使用的“藥物負載數”是指可附接細胞結合劑(例如抗-CD37抗體或其片段)的藥物分子(例如美登醇)的數量。在一個方面，可附接細胞結合劑的藥物分子的數量可以為約2至約8(例如1.9,2.0,2.1,2.2,2.3,2.4,2.5,2.6,2.7,2.8,2.9,3.0,3.1,3.2,3.3,3.4,3.5,3.6,3.7,3.8,3.9,4.0,4.1,4.2,4.3,4.4,4.5,4.6,4.7,4.8,4.9,5.0,5.1,5.2,5.3,5.4,5.5,5.6,5.7,5.8,5.9,6.0,6.1,6.2,6.3,6.4,6.5,6.6,6.7,6.8,6.9,7.0,7.1,7.2,7.3,7.4,7.5,7.6,7.7,7.8,7.9,8.0,8.1)。可以使用N 2’-脫乙醯基-N 2’-(3-疏基-1-氧代丙基)-美登素(DM1)和N 2’-脫乙醯基-N2’-(4-疏基-4-甲基-1-氧代戊基)美登素(DM4)。
因此，在一個方面，免疫共軛物包含1個美登醇/抗體。在另一方面，免疫共軛物包含2個美登醇/抗體。在另一方面，免疫共軛物包含3個美登醇/抗體。在另一方面，免疫共軛物包含4個美登醇/抗體。在另一方面，免疫共軛物包含5個美登醇/抗體。在另一方面，免疫共軛物包含6個美登醇/抗體。在另一方面，免疫共軛物包含7個美登醇/抗體。在另一方面，免疫共軛物包含8個美登醇/抗體。
在一個方面，免疫共軛物包含約1至約8個美登醇/抗體。在另一方面，免疫共軛物包含約2至約7個美登醇/抗體。在另一方面，免疫共軛物包含約2至約6個美登醇/抗體。在另一方面，免疫共軛物包含約2至約5個美登醇/抗體。在另一方面，免疫共軛物包含約3至約5個美登醇/抗體。在另一方面，免疫共軛物包含約3至約4個美登醇/抗體。
在一個方面，包含免疫共軛物的組合物具有平均約2至約8(例如1.9,2.0,2.1,2.2,2.3,2.4,2.5,2.6,2.7,2.8,2.9,3.0,3.1,3.2,3.3,3.4,3.5,3.6,3.7,3.8,3.9,4.0,4.1,4.2,4.3,4.4,4.5,4.6,4.7,4.8,4.9,5.0,5.1,5.2,5.3,5.4,5.5,5.6,5.7,5.8,5.9,6.0,6.1,6.2,6.3,6.4,6.5,6.6,6.7,6.8,6.9,7.0,7.1,7.2,7.3,7.4,7.5,7.6,7.7,7.8,7.9,8.0,8.1)個附接的藥物分子(例如美登醇)/抗體。在一個方面，包含免疫共軛物的組合物具有平均約1至約8個藥物分子(例如美登醇)/抗體。在一個方面，包含免疫共軛物的組合物具有平均約2至約7個藥物分子(例如美登醇)/抗體。在一個方面，包含免疫共軛物的組合物具有平均約2至約6個藥物分子(例如美登醇)/抗體。在一個方面，包含免疫共軛物的組合物具有平均約2至約5個藥物分子(例如美登醇)/抗體。在一個方面，包含免疫共軛物的組合物具有平均約3至約5個藥物分子(例如美登醇)/抗體。在一個方面，包含免疫共軛物的組合物具有平均約3至約4個藥物分子(例如美登醇)/抗體。
在一個方面，包含免疫共軛物的組合物具有平均約2±0.5,約3±0.5,約4±0.5,約5±0.5,約6±0.5,約7±0.5或約8±0.5個附接的藥物分子(例如美登醇)/抗體。在一個方面，包含免疫共軛物的組合物具有平均約3.5±0.5個藥物分子(例如美登醇)/抗體。
抗-CD37抗體或其片段可通過下列方式來修飾：使雙官能交聯試劑和抗-CD37抗體或其片段反應，從而導致接頭分子共價附接抗-CD37抗體或其片段。如本文中所使用的，"雙官能交聯試劑"是使細胞-結合劑共價連接藥物例如本文中所述的藥物的任何化學部分。在另外的方法中，一部分連接部分由藥物提供。就此而言，藥物包含連接部分，該連接部分是較大接頭分子的一部分，所述接頭分子用於使細胞-結合劑接合藥物。例如，為了形成美登醇DM1，美登素的C-3羥基處的側臉被修飾以具有游離的氫硫基(SH)。該硫化形式的美登素可以和修飾的細胞-結合劑反應以形成共軛物。因此，最終接頭由兩個元件裝配而成，其中一個由交聯試劑提供，而另一個由DM1的側鏈提供。
藥物分子還可以通過中間載體分子例如血清白蛋白而連接抗體分子。
如本文中所使用的，表述"連接細胞-結合劑"或"連接抗-CD37抗體或片段"是指共軛物分子包含通過合適的連接基團或其前體結合細胞-結合劑抗-CD37抗體或片段的至少一種藥物衍生物。一種連接基團是SMCC。
在某些實施方案中，用在本發明中的細胞毒素劑是美登醇和美登醇類似物。合適的美登醇的例子包括美登醇和美登醇類似物的酯。包括抑制微管形成並對哺乳動物細胞具有高度毒性的任何藥物，如美登醇和美登醇類似物那樣。
合適的美登醇酯的例子包括具有修飾的芳香環的那些和在其他位置具有修飾的那些。這些合適的美登醇公開在美國專利No. 4,424,219;4,256,746;4,294,757;4,307,016;4,313,946;4,315,929;4,331,598;4,361,650;4,362,663;4,364,866;4,450,254;4,322,348;4,371,533;5,208,020;5,416,064;5,475,092;5,585,499;5,846,545;6,333,410;7,276,497和7,473,796中。
在某些實施方案中，本發明的免疫共軛物利用含巰基的美登醇(DM1)，正式命名為N 2’-脫乙醯基-N 2’-(3-疏基-1-氧代丙基)-美登素，作為細胞毒素劑。DM1由下列結構式(III)來表示：
在另一實施方案中，本發明的共軛物利用含巰基的美登醇N 2’-脫乙醯基-N 2’(4-甲基-4-疏基-1-氧代戊基)-美登素(例如DM4)作為細胞毒素劑。DM4由下列結構式(IV)來表示：
另一美登醇包含含有空間位阻的巰基鍵的側鏈，其是N 2’-脫乙醯基-N-2’(4-疏基-1-氧代戊基)-美登素(稱為DM3)，並且由下列結構式(V)來表示：
美國專利No. 5,208,020和7,276,497中教導的各美登醇也可用在本發明的共軛物中。就此而言，5,208,020和7,276,697的全部內容通過引用的方式併入。
美登醇上的多個位置可起到對連接部分進行化學連接的位置的作用。例如，具有羥基的C-3位、用羥基甲基修飾的C-14位、用羥基修飾的C-15位、和具有羥基的C-20位都預計是有用的。在一些實施方案中，C-3位元起到對連接部分進行化學連接的位置的作用，在一些特定實施方案中，美登醇的C-3位元起到對連接部分進行化學連接的位置的作用。
一些共軛物的結構示意圖如下所示：
製備這些抗體-美登醇共軛物的一些描述提供在美國專利No. 6,333,410,6,441,163,6,716,821和7,368,565中，其全部併入本文中。
通常，抗體在水性緩衝液中的溶液可和過量摩爾數的美登醇一起孵育，所述美登醇二硫化物部分(其具有反應性基團)。反應混合物可通過加入過量的胺(例如乙醇胺、牛磺酸等)淬火。美登醇-抗體共軛物然後可通過凝膠過濾純化。
結合的美登醇分子數/抗體分子可通過分光光度計測量在252 nm和280 nm處的吸光度的比來確定。美登醇分子的平均數/抗體可例如為約1-10,2-5,3-4或約3.5。在一個方面，美登醇分子的平均數/抗體為約3.5±0.5。
蒽環黴素化合物以及衍生物、中間體及其修飾的版本還可用於製備抗-CD37免疫共軛物。例如，阿黴素、阿黴素衍生物、阿黴素中間體、和修飾的阿黴素可用在抗-CD37共軛物中。WO 2010/009124中所述的示例性化合物通過引用的方式全部併入本文中。這些化合物包括例如下式的化合物或其藥學上可接受的鹽：
其中R1是氫原子、羥基或甲氧基，並且R2是C1-Cs烷氧基。
抗體和美登醇或其他藥物的共軛物可被體外評價它們抑制各種不需要的細胞系的增殖的能力。例如，細胞系例如人淋巴瘤細胞系Daudi和人淋巴瘤細胞系Ramos可容易地用於評估這些化合物的細胞毒性。待評價的細胞可暴露於化合物4至5天，並且通過已知的方法在直接測試中測量細胞的存活分數。然後IC50值可從測試結果來計算。
根據本文中所述的一些實施方案，免疫共軛物可內化到細胞中。因此，免疫共軛物當其被CD37-表達細胞攝取或內化時可發揮治療效果。在一些特定實施方案中，免疫共軛物包含通過可裂解接頭連接細胞毒素劑的抗體、抗體片段或多肽，並且細胞毒素劑從抗體、抗體片段或多肽切除，其中其被CD37-表達細胞內化。
在一些實施方案中，免疫共軛物能夠減小腫瘤體積。例如，在一些實施方案中，使用免疫共軛物治療導致%T/C值小於約50%、小於約45%、小於約40%、小於約35%、小於約30%、小於約25%、小於約20%、小於約15%、小於約10%或小於約5%。在一些特定實施方案中，免疫共軛物可減小BJAB異種移植物模型和/或SU-DHL-4異種移植物模型中腫瘤尺寸。
在本發明的另一方面，siRNA分子而不是藥物可連接本發明的抗體。siRNA可通過通常用於修飾寡核苷酸的方法(例如參見美國專利公開20050107325和20070213292)來連接本發明的抗體。因此，以其3’或5’-亞磷醯胺形式的siRNA可以和具有羥基官能度的交聯劑的一個末端反應，以在siRNA和交聯劑之間得到酯鍵。類似地，siRNA亞磷醯胺和具有末端氨基的交聯劑的反應導致通過胺使交聯劑連接至siRNA。可選擇地，siRNA可通過標準化學方法來衍生化以引入巰基。該含巰基的siRNA可以和抗體反應，所述抗體已經被修飾以引入活性二硫化物或馬來醯亞胺部分，從而製備可裂解或非可裂解共軛物。1-20個siRNA分子可通過該方法連接抗體。
III.　多核苷酸
在某些實施方案中，本發明包括多核苷酸，該多核苷酸包括編碼特異性結合CD37的多肽或這種多肽的片段的多核苷酸。例如，本發明提供包含核酸序列的多核苷酸，所述核酸序列編碼人CD37的抗體或編碼這種抗體的片段。本發明的多核苷酸可以為RNA形式或DNA形式。DNA包括cDNA、基因組DNA和合成DNA；並且可以是雙鏈或單鏈的，並且如果是單鏈的話，可以是編碼鏈或非編碼(反義)鏈。
在某些實施方案中，多核苷酸被分離。在某些實施方案中，多核苷酸是基本上純的。
本發明提供多核苷酸，所述多核苷酸包括編碼多肽的多核苷酸，所述多肽包含選自由下列構成的組的序列：SEQ ID NO:4-120。
本發明還包括多核苷酸，所述多核苷酸包含選自下表7-10中示出的那些序列。
還提供與SEQ ID NO:121-170具有至少約95%,至少約96%,至少約97%,至少約98%或至少約99%的序列同一性的多核苷酸。因此，在某些實施方案中，多肽包含(a)與SEQ ID NO:121-135或152-161具有至少約95%的序列同一性的多肽；和/或(b)與SEQ ID NO:136-151或162-170具有至少約95%的序列同一性的多肽。在某些實施方案中，多肽包含(a)具有SEQ ID NO: 121-135或152-161的胺基酸序列的多肽；和/或(b)具有SEQ ID NO: 136-151或162-170的胺基酸序列的多肽。
在一些實施方案中，多核苷酸編碼由重組質粒DNA phuCD37-3LC(ATCC保藏編號PTA-10722,在2010年3月18日保藏於ATCC)編碼的輕鏈，或與由phuCD37-3LC(PTA-10722)編碼的輕鏈具有至少約85%、至少約90%、至少約95%或至少約99%同一性的輕鏈。在一些實施方案中，多核苷酸編碼由重組質粒DNA phuCD37-3HCv.1.0(ATCC保藏編號PTA-10723,在2010年3月18日保藏於ATCC)編碼的重鏈，或與由phuCD37-3HCv.1.0(PTA-10723)編碼的重鏈具有至少約85%、至少約90%、至少約95%或至少約99%同一性的重鏈。在某些實施方案中，多核苷酸是重組質粒DNA phuCD37-3LC(PTA-10722)或重組質粒phuCD37-3HCv.1.0(PTA-10723)。
在某些實施方案中，多核苷酸包含用於融合在和多核苷酸相同的閱讀框中的成熟多肽的編碼序列，其例如輔助從宿主細胞表達和分泌多肽(例如前導序列，其起到分泌序列的作用以控制多肽從所述細胞的轉運)。具有前導序列的多肽是前蛋白，並且可具有由宿主細胞切除以從多肽形成成熟的前導序列。多核苷酸還可編碼用於前蛋白，所述前蛋白是成熟蛋白加另外的5'胺基酸殘基。具有前序列的成熟蛋白是前蛋白，並且是蛋白的失活形式。在前序列切除時，活性成熟蛋白保留。
在某些實施方案中，多核苷酸包含用於融合在和標誌物序列相同的閱讀框中的成熟多肽的編碼序列，其例如允許用於編碼的多肽的純化。例如，在細菌宿主的情況下，標誌物序列可以是由pQE-9載體供應的六聚組氨酸標籤，以提供融合標誌物的成熟多肽的純化，或者當使用哺乳動物宿主(例如COS-7細胞)時，標誌物序列可以是衍生自流感血凝素蛋白的紅血球凝集素(HA)標籤。
本發明還涉及編碼例如片段、類似物和衍生物的上述多核苷酸的變體。
多核苷酸變體可含有編碼區、非編碼區或兩者中的改變。在一些實施方案中，多核苷酸變體含有的改變會產生沉默置換、添加或缺失，但不會改變編碼的多肽的性能或活性。在一些實施方案中，因為遺傳密碼的簡並，核苷酸變體通過沉默置換而製備。多核苷酸變體可出於多種原因而製備，例如優化用於特定宿主(對於優選通過細菌宿主例如E. coli的那些，改變人mRNA中的密碼子)的密碼子表達。
還提供包含本文中所述的多核苷酸的載體和細胞。
IV.　使用方法和藥物組合物
本發明的CD37-結合劑(包括抗體、免疫共軛物和多肽)用於多種應用中，包括但不限於治療性治療方法，例如癌症例如B細胞惡性腫瘤的治療。在某些實施方案中，所述製劑可用於抑制腫瘤生長、誘導分化、減小腫瘤體積和/或降低腫瘤的致腫瘤性。使用方法可以是體外、離體或體內方法。在某些實施方案中，CD37-結合劑或抗體或免疫共軛物或多肽是其結合的人CD37的拮抗劑。
在一個方面，本發明的抗-CD37抗體和免疫共軛物可用於檢測CD37在生物樣品中的存在。如本文中所使用的，術語"檢測"包括定量或定性檢測。在某些實施方案中，生物樣品包括細胞或組織。在某些實施方案中，這些組織包括相對於其他組織例如B細胞和/或B細胞相關的組織，以更高水準表達CD37的正常和/或癌性組織。
在一個方面，本發明提供檢測CD37在生物樣品在存在的方法。在某些實施方案中，所述方法包括在允許抗-CD37抗體結合CD37的條件下使生物樣品接觸抗-CD37抗體，並且檢測是否在抗-CD37抗體和CD37之間形成絡合。
在一個方面，本發明提供診斷和CD37的表達增加有關的紊亂的方法。在某些實施方案中，方法包括使試驗細胞接觸抗-CD37抗體；通過檢測抗-CD37抗體與CD37的結合，經過試驗細胞測定CD37的表達水準(定性或定量)；以及比較經過試驗細胞的CD37的表達水準和對照細胞(例如作為試驗細胞的相同組織起源的正常細胞，或在可比得上這種正常細胞的水準下表達CD37的細胞)CD37的表達水準，其中和對照細胞相比經過試驗細胞的CD37的更高水準的表達指示存在和CD37的表達增加有關的紊亂。在某些實施方案中，試驗細胞得自懷疑具有和CD37的表達增加有關的紊亂的個體。在某些實施方案中，紊亂是細胞增殖紊亂，例如癌症或腫瘤。
在某些實施方案中，診斷或檢測的方法例如上述那些，包括檢測抗-CD37抗體與在細胞表面上表達的CD37的結合，或在得自在其比表面上表達CD37的細胞的膜製劑中的結合。在某些實施方案中，所述方法包括在允許抗-CD37抗體結合CD37的條件下使細胞接觸抗-CD37抗體，並且檢測是否在抗-CD37抗體和在細胞表面上的CD37之間形成絡合。用於檢測抗-CD37抗體和在細胞表面上表達的CD37之間的結合的示例性測試是"FACS"測試。
某些其他方法可用於檢測抗-CD37抗體和CD37的結合。這些方法包括但不限於本領域熟知的抗原-結合測試，例如蛋白質印跡、放射性免疫測定、ELISA(酶聯免疫吸附測定)、"夾心"免疫測定、免疫沉澱測定、螢光免疫測定、蛋白A免疫測定和免疫組織化學(IHC)。
在某些實施方案中，抗-CD37抗體被標記。標記包括但不限於直接檢測的標記或部分(例如螢光、發色團、電子緻密、化學發光和放射活性標記)以及例如通過酶反應或分子相互作用間接檢測的部分例如酶或配體。
在某些實施方案中，抗-CD37抗體固定在不溶性基質上。固定必須使抗-CD37抗體與在溶液中保持游離的任何CD37分離。這常規通過下列方式來完成：在測定工序之前通過吸附至水不溶性基質或表面而使抗-CD37抗體不溶(Bennich et al.,美國專利No. 3,720,760)，或通過共價偶聯(例如使用戊二醛交聯)，或通過在抗-CD37抗體和CD37之間形成絡合後使抗-CD37抗體不溶(例如通過免疫沉澱)。
代替抗-CD37抗體或除了抗-CD37抗體，上述診斷或檢測的實施方案中的任一種可使用本發明的免疫共軛物來進行。
在某些實施方案中，使用CD37-結合劑或拮抗劑(例如抗-CD37抗體)治療的疾病是癌症。在某些實施方案中，所述癌症由CD37-結合劑(例如抗體)結合的CD37表達細胞來表徵。
本發明提供治療癌症的方法，包括向受試者(例如需要治療的受試者)施用治療有效量的CD37-結合劑。在某些實施方案中，癌症是B細胞惡性腫瘤。在某些實施方案中，癌症選自由下列構成的組：B細胞淋巴瘤，NHL，前B細胞成淋巴細胞白血病/淋巴瘤和成熟B細胞新生物，B細胞慢性淋巴細胞白血病(CLL)/小淋巴細胞白血病(SLL)，B細胞前淋巴細胞白血病，淋巴漿細胞淋巴瘤，外套細胞淋巴瘤(MCL)，濾泡性淋巴瘤(FL)，低度、中度以及高度(FL)，皮膚濾泡性淋巴瘤，緣區B細胞淋巴瘤，MALT型緣區B細胞淋巴瘤，結節緣區B細胞淋巴瘤，脾型緣區B細胞淋巴瘤，毛細胞性白血病，彌漫性大B細胞淋巴瘤，伯基特淋巴瘤，漿細胞瘤，漿細胞性骨髓瘤，移植後淋巴增生性障礙，沃爾登斯特倫氏氏巨球蛋白血症，以及間變大細胞淋巴瘤(ALCL)。在某些實施方案中，受試者是人。
本發明還提供使用本文中所述的抗體或其他製劑來抑制腫瘤生長的方法。在某些實施方案中，抑制腫瘤生長的方法包括使細胞體外接觸CD37-結合劑(例如抗體)。例如表達CD37的無限細胞系或癌症細胞系在培養基中進行培養，所述培養基中加入抗體或其他製劑來抑制腫瘤生長。在一些實施方案中，腫瘤細胞分離自患者樣品例如組織生物切片、胸膜積液或血液樣品，並且在培養基中進行培養，所述培養基中加入CD37-結合劑來抑制腫瘤生長。
在一些實施方案中，抑制腫瘤生長的方法包括使腫瘤或腫瘤細胞體內接觸CD37-結合劑(例如抗體)。在某些實施方案中，使腫瘤或腫瘤細胞接觸CD37-結合劑在動物模型中進行。例如CD37-結合劑可施用至表達一種或多種CD37的異種移植物，所述CD37已經在無免疫應答的小鼠(例如NOD/SCID小鼠)中生長以抑制腫瘤生長。在一些實施方案中，癌症幹細胞分離自患者樣品例如組織生物切片、胸膜積液或血液樣品，並且注射到無免疫應答的小鼠中，所述小鼠然後被施用CD37-結合劑以抑制腫瘤細胞生長。在一些實施方案中，CD37-結合劑在將生瘤的細胞引入動物中以抑制腫瘤生長的同時或短暫之後被施用。在一些實施方案中，CD37-結合劑在生瘤的細胞已經生長至特定尺寸後被施用作為治療劑。
在某些實施方案中，抑制腫瘤生長的方法包括向受試者施用治療有效量的CD37-結合劑。在某些實施方案中，受試者是人。在某些實施方案中，受試者具有腫瘤或已經使腫瘤移除。
在某些實施方案中，腫瘤表達CD37-結合劑或抗體結合的CD37。在某些實施方案中，腫瘤過度表達人CD37。
另外，本發明提供在受試者中降低腫瘤生瘤性的方法，包括向受試者施用治療有效量的CD37-結合劑。在某些實施方案中，腫瘤包含癌症幹細胞。在某些實施方案中，癌症幹細胞在腫瘤中的頻率通過施加所述製劑而降低。
本發明還包括將生瘤的細胞分化到非生瘤的細胞中的方法，包括使生瘤的細胞和CD37-結合劑接觸，例如通過下列方法來進行：向受試者中施用CD37-結合劑，所述受試者具有腫瘤(包括生瘤的細胞)或已經使這種腫瘤移除。
還提供本文中所述的CD37-結合劑、多肽或抗體在誘導細胞包括但不限於腫瘤細胞的分化中的用途。例如誘導細胞分化的方法包括設想使細胞和有效量的本文中所述的CD37-結合劑(例如抗-CD37抗體)接觸。還提供在受試者的腫瘤中誘導細胞分化的方法，包括向受試者施加治療有效量的CD37-結合劑、多肽或抗體。在某些實施方案中，腫瘤是胰腺腫瘤。在某些其他實施方案中，腫瘤是結腸腫瘤。在一些實施方案中，治療方法包括向受試者施加治療有效量的CD37-結合劑、多肽或抗體。
本發明還提供藥物組合物，包含本文中所述的一種或多種CD37-結合劑。在某些實施方案中，藥物組合物還包含藥學上可接受的載體。這些藥物組合物發現在抑制腫瘤生長和治療人患者中的癌症的用途。
在某些實施方案中，通過聯合本發明的純化的抗體或試劑和藥學上可接受的載體(例如載體、賦形劑)(Remington,The Science and Practice of Pharmacy 20th Edition Mack Publishing,2000)製備製劑以用於儲存和使用。合適的藥學上可接受的載體包括但不限於非毒性緩衝鹽，例如磷酸鹽、檸檬酸鹽和其他有機酸；鹽例如氯化鈉；抗氧化劑，包括抗壞血酸和蛋氨酸；防腐劑(例如十八烷基二甲基苄基氯化銨；氯己雙銨；苯紮氯銨；苄索氯銨；苯酚，丁基或苄基醇；烷基苯甲酸酯例如甲基或丙基苯甲酸酯；兒茶酚；間苯二酚；環己醇；3-戊醇；和間甲酚)；低分子量多肽(例如少於約10個胺基酸殘基)；蛋白例如血清白蛋白，明膠，或免疫球蛋白；親水性聚合物例如聚乙烯吡咯烷酮；胺基酸例如甘氨酸，穀氨醯胺，天冬醯胺，組氨酸，精氨酸，或賴氨酸；碳水化合物例如單糖、二糖、葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑例如EDTA；糖例如蔗糖，甘露醇，海藻糖或山梨糖；成鹽配對離子例如鈉；金屬絡合物(例如Zn-蛋白絡合物)；和非離子表面活性劑例如TWEEN或聚乙二醇(PEG)。
本發明的藥物組合物可以以任意數量的方式來施用以用於局部或系統治療。施用可以是局部的(例如施用至粘膜包括陰道和直腸遞送)例如透皮貼片、油膏劑、塗劑、霜劑、凝膠、滴劑、栓劑、噴霧劑、液體和粉末；肺部施用(例如通過粉末或氣溶膠的吸入或噴射，包括通過噴霧器來進行；氣管內，鼻內，表皮和透皮)；口服；或胃腸外，包括靜脈內，動脈內，皮下，腹膜內或肌肉內注射或或輸注；或顱內(例如鞘內或心室內)施用。
本發明的抗體或免疫共軛物可以和具有抗癌性能的第二化合物聯合在藥物聯合制劑中或作為聯合療法進行給藥方案。藥物聯合制劑或給藥方案的第二化合物可對於聯合的ADC具有補充活性，使得它們不會彼此產生不利的影響。還提供包含CD37-結合劑和第二抗癌劑的藥物組合物。如CD37-結合劑可聯合CD20拮抗劑例如利妥昔單抗施用。
為了治療疾病，本發明的抗體或製劑的合適給藥取決於待治療的疾病的類型、疾病的嚴重性和期限、疾病的回應性，而不論抗體或製劑是為了治療還是預防目的施用、之前療法、患者的臨床史等，所有都任憑治療醫生決定。抗體或試劑可從數天至數月的持續內施用一次或一系列治療，或直到治療產生效果或實現疾病狀態的減輕(例如減小腫瘤尺寸)。最優給藥方案可從藥物在患者體內累積的測量值來計算，並且取決於單獨抗體或試劑的相對效力而改變。給藥醫師可容易地確定最佳劑量、給藥方法和重複速率。在某些實施方案中，劑量為0.01 μg至100 mg/kg體重，並且可給予每日、每週、每月或每年一次或多次。在某些實施方案中，抗體或其他CD37-結合劑給予每兩週一次或每三週一次。在某些實施方案中，抗體或其他CD37-結合劑的劑量為約0.1 mg至約20 mg/kg體重。治療醫生可基於測量的停留時間和藥物在機體流體或組織中的濃度來估計用於給藥的重複速率。
組合療法可提供"協同作用"並證實"協同作用的"，即當活性成分聯合使用時實現的效果大於源自單獨使用化合物的效果的總和。當活性成分是下列情況時可以達到協同效果：(1)在聯合的單元劑量製劑中共同配製和施用或同時遞送；(2)通過交替或作為單獨製劑平行的方式來遞送；或(3)通過一些其他方案。當以交替療法遞送時，當化合物例如在單獨注射器中通過不同注射而依次施用或遞送時可以達到協同效果。通常，在交替療法的過程中，各活性成分的有效劑量依次即連續地施用，而在聯合療法中，有效劑量的兩種或多種活性成分同時施用。
VI.　包含CD37結合劑的試劑盒
本發明提供包含本文中所述的抗體、免疫共軛物或其他製劑的試劑盒，並且其可用于進行本文中所述的方法。在某些實施方案中，試劑盒包含在一個或多個容器中針對CD37的至少一種純化的抗體。在一些實施方案中，試劑盒含有所有這樣的元件，所述元件必需和/或足以進行檢測測定，包括用於進行測定的所有對照、指導、和用於分析和展示結果的任何必需的軟體。本領域技術人員將容易地認識到，本發明公開的抗體、免疫共軛物或其他製劑可容易地引入本領域熟知的建立的試劑盒格式中的一種中。
還提供包含CD37-結合劑(例如CD37-結合抗體)和第二抗癌劑的試劑盒。在某些實施方案中，第二抗癌劑是化學治療劑(例如利妥昔單抗)。
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通過參照下列非限制性例子可進一步定義本公開的實施方案，其詳細描述了本公開的某些抗體的製備和使用本公開的抗體的方法。本領域技術人員將明白，在不偏離本公開的範圍的情況下可對材料和方法進行多種修改。
應理解，本文中所述的實施例和實施方案是僅用於示意性目的的，並且根據其的各種修改或改變將建議給本領域技術人員，並且包括在該申請的精神和範圍內。
所有細胞系在RPMI-1640培養基中、在37℃下在加濕5% CO2孵育器中生長，所述培養基補充10%胎牛血清、2 mM穀氨醯胺和1%青黴素-鏈黴素(所有試劑來自Invitrogen)。細胞通過每週二次稀釋到新鮮培養基中而傳代，並且保持為0.2至1 x 106細胞/ml。
實施例1 鼠CD37抗體的製備
構建表達質粒pSRa-CD37，其含有側翼為XbaI和BamHI限制性內切位元點的全部CD37編碼序列(CDS)，這允許人CD37的表達。300-19細胞，一種衍生自Balb/c小鼠的前B細胞系(M. G. Reth et al. 1985,Nature,317: 353-355)，使用該表達質粒轉染以穩定地在細胞表面上表達高水準的人CD37，並且用於免疫Balb/cVAF小鼠。每2-3周通過ImmunoGen,Inc.使用的標準免疫方案使用約5x106CD37-表達300-19細胞/小鼠來進行小鼠皮下免疫。免疫的小鼠在被犧牲以用於雜種瘤生殖之前三天用另一劑量的抗原來進行加強。根據標準動物方案來收集來自小鼠的脾臟，並且放置在兩塊無菌磨砂顯微鏡載玻片之間，以獲得在RPMI-1640培養基中的單一細胞混懸。將脾細胞粒狀沉澱，洗滌，並通過使用聚乙二醇-1500(Roche 783 641)和鼠骨髓瘤P3X63Ag8.653細胞融合(J. F. Kearney et al.1979,J Immunol,123: 1548-1550)。將融合細胞重懸浮在含有次黃嘌呤-氨基蝶呤-胸苷(HAT)(Sigma H-0262)的RPMI-1640選擇培養基中，並且選擇用於在37℃下和5% CO2在96-孔平底培養板(Corning-Costar 3596,200 μL的細胞混懸液/孔)中生長。在孵育5天后，將100 μL的培養上清從各孔中移除，並且用100 μL的RPMI-1640培養基來代替，所述培養基含有次黃嘌呤-胸苷(HT)補充物(Sigma H-0137)。繼續在37℃下和5% CO2的孵育，直到雜種瘤克隆準備用於抗體篩選。還可以使用免疫和雜種瘤製備的其他技術，包括J. Langone and H. Vunakis(Eds.,Methods in Enzymology,Vol. 121,"Immunochemical Techniques,Part I";Academic Press,Florida)和E. Harlow and D. Lane("Antibodies: A Laboratory Manual";1988;Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York)中所述的那些。
雜種瘤篩選和選擇
來自雜種瘤的培養上清通過流式細胞術篩選以用於分泌小鼠單克隆抗體，所述抗體結合CD37-表達300-19細胞，但不結合非轉染的300-19細胞。將100 μl的雜種瘤上清和CD37-表達300-19細胞或非轉染的300-19細胞(1 x105細胞/樣品)在100 μL FACS緩衝液(RPMI-1640培養基，補充2%正常山羊血清)中孵育3 h。然後，將細胞粒狀沉澱，洗滌，並且和100 μL的PE-綴合的山羊抗-小鼠IgG-抗體(Jackson Laboratory,在FACS緩衝液中6 μg/mL)孵育1 h。再次將細胞粒狀沉澱，使用FACS緩衝液洗滌，並且重懸浮在200 μL的含有1%的甲醛的PBS中。使用具有HTS多孔取樣器或FACS陣列流式細胞儀的FACSCalibur流式細胞儀來獲取樣品，並且使用CellQuest Pro(都來自BD Biosciences,San Diego,US)來進行分析。
測試陽性的雜種瘤克隆通過有限稀釋被亞克隆。一種來自各雜種瘤的亞克隆(通過流式細胞術這顯示出和親本細胞相同的針對CD37的反應性)被選擇用於隨後的分析。穩定的亞克隆被培養，並且各分泌的抗-CD37抗體的同種型使用市售同種型試劑(Roche 1493027)來鑒定。
在該研究器件內進行總共45個單獨的融合試驗。單一融合試驗慣例產生約200至1000個雜種瘤克隆。通過流式細胞術篩選所有所得雜種瘤克隆用於CD37結合，並且總共184個雜種瘤克隆顯示出對於CD37的特異性結合。
抗體純化
使用標準方法例如蛋白A或G色譜法(HiTrap蛋白A或G HP，1 mL,Amersham Biosciences)將抗體從雜種瘤亞克隆上清純化。簡言之，通過加入1/10體積的1 M Tris/HCl buffer,pH 8.0，上清被準備用於色譜法。將pH-調節的上清通過0.22 μm過濾膜過濾，並且上載到使用結合緩衝液(PBS,pH 7.3)平衡的柱上。將柱用結合緩衝液洗滌，直到獲得穩定的基線，並且在280 nm處無吸收。使用含有0.15 M NaCl的0.1 M乙酸緩衝液(pH 2.8)、利用0.5 mL/min的流速來洗脫抗體。收集約0.25 mL的部分，並且通過加入1/10體積的1M Tris/HCl,pH 8.0來中和。將峰值部分針對1x PBS整夜透析兩次，並且通過0.2 μm過濾膜過濾來滅菌。通過在A280的吸光度來定量純化的抗體。
蛋白A純化的部分使用離子交換色譜法(IEX)利用季銨(Q)色譜法進一步精製以用於鼠抗體。簡言之，來自蛋白A純化的樣品被緩衝液交換到結合緩衝液(10 mM Tris,10 mM氯化鈉，pH 8.0)中，並且通過0.22 μm篩檢程式過濾。然後，製備的樣品以120 cm/hr的流速上載到用結合緩衝液平衡的Q快速流動樹脂(GE Lifesciences)上。柱的尺寸被選擇為具有足夠的能力以結合樣品中所有的MAb。然後將柱用結合緩衝液洗滌，直到獲得穩定的基線，並且在280 nm處無吸收。通過初始化在20柱體積(CV)中10 mM至500 mM氯化鈉的梯度來洗脫抗體。基於在280 nm(A280)處測量的吸光度來收集峰值部分。使用空間排阻色譜法(SEC)在具有SWXL guard柱,6.0×40 mm(Tosoh Bioscience,Montgomeryville,PA)的TSK凝膠G3000SWXL,7.8×300 mm上、利用Agilent HPLC 1100 system(Agilent,Santa Clara,CA)來估計單體的百分率。將單體含量高於95%的部分集中，並且使用TFF體系緩衝液交換至PBS(pH 7.4)，然後通過0.2 μm過濾膜過濾來滅菌。純化的抗體的IgG濃度使用1.47的消光係數通過A280來確定。可替換的方法例如陶瓷羥基磷灰石(CHT)也用於精製抗體具有良好的選擇性。利用用於IEX色譜法所述的類似的方案來使用具有40 μm粒徑的II型CHT樹脂(Bio-Rad Laboratories)。用於CHT的結合緩衝液對應於20 mM磷酸鈉,pH 7.0，並且抗體在20 CV上使用20-160 mM磷酸鈉的梯度來洗脫。
實施例2 通過流式細胞術進行結合表徵
通過流式細胞術使用純化的抗體來測試結合特異性。FACS柱狀圖證實muCD37-3,muCD37-12,muCD37-38,muCD37-50,muCD37-51,muCD37-56和muCD37-57結合CD37-表達300-19細胞，並且在圖1和圖2中示出缺乏與親本300-19細胞的結合。所有鼠抗體和CD37-表達300-19細胞或非轉染的300-19細胞(1 x105細胞/樣品)在100 μL FACS緩衝液(RPMI-1640培養基，補充2%正常山羊血清)中孵育3 h。然後，將細胞粒狀沉澱，洗滌，並且和100 μL的FITC-綴合的山羊抗-小鼠IgG-抗體(Jackson Laboratory,在FACS緩衝液中6 μg/mL)孵育1 h。再次將細胞粒狀沉澱，使用FACS緩衝液洗滌，並且重懸浮在200 μL的含有1%的甲醛的PBS中。使用具有HTS多孔取樣器或FACS陣列流式細胞儀的FACSCalibur流式細胞儀來獲取樣品，並且使用CellQuest Pro(都來自BD Biosciences,San Diego,US)來進行分析。
和muCD37-3,muCD37-12,muCD37-38,muCD37-50,muCD37-51,muCD37-56或muCD37-57孵育的CD37-表達300-19細胞的FACS柱狀圖顯示出螢光偏移，而親本300-19細胞則不會。此外，當細胞系僅和FITC-綴合的山羊抗-小鼠IgG-抗體單獨孵育時，未檢測到明顯的螢光偏移(圖1的底部)。
為了證實抗體也可以結合內生地表達的CD37，使用CD37-陽性WSU-DLCL-2淋巴瘤細胞和muCD37-3,muCD37-12,muCD37-8,muCD37-10或muCD37-14抗體來進行結合試驗。將WSU-DLCL-2細胞和改變濃度的鼠抗體孵育，並如上所述處理用於流式細胞術分析。資料分析使用CellQuest Pro(BD Biosciences,San Diego,US)來進行，並且對於各樣品，FL1的平均螢光強度(MFI)輸出，並且在半-log圖中針對抗體濃度繪製(圖3)。通過非線性回歸來產生劑量-回應曲線，並且各曲線的EC50值，其對應於各抗體的表觀解離常數(Kd)，使用GraphPad Prism v4(GraphPad軟體,San Diego,CA)來計算。對於所有測試的抗體都觀察到螢光的強烈偏移，並且Kd值分別對應於0.52 nM,1.7 nM,2.7 nM,1.1 nM或0.91 nM的muCD37-3,muCD37-8,muCD37-10,muCD37-12或muCD37-14抗體。
同樣，當CD37-陽性BJAB淋巴瘤細胞用於上述相同的流式細胞術測定時，也觀察到強烈結合。如上所述計算Kd值，並且分別對應於0.2 nM,0.4 nM,0.6 nM,0.4 nM和1 nM的muCD37-3,muCD37-38,muCD37-50,muCD37-51,muCD37-56和muCD37-57。
實施例3 鼠抗體的促凋亡活性
鼠抗-CD37抗體誘導Ramos和Raji淋巴瘤細胞系的細胞凋亡。在使用膜聯蛋白-V(Invitrogen)的FITC共軛物和使用TO-PRO-3(Invitrogen)染色後，通過流式細胞術分析來測量細胞凋亡的程度。在健康正常的細胞中，磷脂醯絲氨酸表達在細胞膜雙層的內部，磷脂醯絲氨酸從質膜的內部小葉轉移至外部小葉是一種細胞凋亡的最早可檢測的信號。膜聯蛋白V結合外部上的磷脂醯絲氨酸，但在完整細胞的細胞膜雙層的內部上不是這樣。因此，膜聯蛋白V結合的程度是誘導細胞凋亡的指示。TO-PRO-3是單體菁核酸染色劑，其僅當膜的完整性破壞時(發生在細胞凋亡的後期)才可穿透質膜。在雙色流式細胞術中鑒別三種種群的細胞：非-細胞凋亡的細胞(膜聯蛋白-V陰性和TO-PRO-3陰性)、早期細胞凋亡的細胞(膜聯蛋白-V陽性和TO-PRO-3陰性)和壞死細胞或晚期細胞凋亡的細胞(膜聯蛋白-V陽性和TO-PRO-3陽性)。
以指數方式生長的細胞在24-孔板中的RMPI-1640培養基中以約2 x 105細胞/mL平板接種，所述培養基補充10%胎牛血清(FBS),2mM L穀氨醯胺和50 μg/mL慶大黴素(下文中稱為完全RMPI-1640培養基)。細胞通常生長在完全RMPI-1640培養基中，除非另有說明。細胞和10 nM的抗-CD37抗體在37℃下在加濕5% CO2孵育器中孵育20至24 h。然後將細胞粒狀沉澱，使用500 μl PBS洗滌兩次，重懸浮在100 μL結合緩衝液(10 mM Hepes-NaOH,pH 7.4,140 mM NaCl,2.5 mM CaCl2)中，使用5 μL的膜聯蛋白V-FITC在冰上染色15 min。然後，將具有1 μM的TO-PRO-3的400 μL的結合緩衝液加入混合物中，並且通過流式細胞術立即測量FITC和TO-PRO-3的細胞-相關的螢光度。對於各樣品收集五千個事件。使用BD CellQuest軟體來產生TO-PRO-3(FL4-H;y-軸)和膜聯蛋白V-FITC的螢光度(FL1-H;x-軸)的散點圖。
從這些圖測定各樣品的膜聯蛋白-V陽性細胞(包括TO-PRO-3陽性和陰性細胞)的百分率，並且對於Ramos細胞示於圖4中。分離自我們抗體篩選的數種抗體被測試和利妥昔單抗相比的促凋亡活性。未預料到的是，一些分離的鼠抗-CD37抗體例如muCD37-3和muCD37-12顯示出非常強的促凋亡活性。約39%的暴露於muCD37-3的Ramos細胞和46%的暴露於muCD37-12的Ramos細胞是膜聯蛋白-V陽性。相反，使用抗-CD20抗體利妥昔單抗處理導致只有13%的膜聯蛋白-V陽性細胞，而未處理的對照樣品含有5%膜聯蛋白-V陽性細胞。分離的鼠抗-CD37抗體中的一些不顯示出任何促凋亡活性。例如，相比於未處理的細胞，使用muCD37-8,muCD37-10或muCD37-14處理Ramos細胞導致膜聯蛋白-V陽性的百分率微小增加或不增加。這是儘管它們的與CD37的可比得上的結合親和性，如圖3中可見。
另外的抗體被分離和篩選它們在Ramos細胞中誘導細胞凋亡的能力。在多種分離的以高親和性結合CD37的抗體中，只有一些具有促凋亡活性。膜聯蛋白-V測定的結果示於圖4B。鼠抗體muCD37-38,muCD37-50,muCD37-51,muCD37-56和muCD37-57能夠誘導細胞凋亡，並導致38-45%的膜聯蛋白-V陽性Ramos細胞，相比的是在未處理的對照樣品中為5%。類似於之前的測試，使用抗-CD20抗體利妥昔單抗處理導致只有18%的膜聯蛋白-V陽性細胞。
另外，鼠抗體被測試它們在Raji淋巴瘤細胞中誘導細胞凋亡的能力。如對於Ramos細胞所觀察的，在多種分離的以高親和性結合CD37的抗體中，只有一些具有促凋亡活性。使用muCD37-3或muCD37-12處理分別導致36%或49%的膜聯蛋白-V陽性細胞。相反，使用抗-CD20抗體利妥昔單抗處理導致只有20%的膜聯蛋白-V陽性細胞，而未處理的對照樣品含有4%的膜聯蛋白-V陽性細胞。
同樣，相比較於15%的未處理的細胞，使用muCD37-3,muCD37-38,muCD37-50,muCD37-51,muCD37-56或muCD37-57處理的約60%的Raji細胞是膜聯蛋白-V陽性細胞。
實施例4 增殖測試
抗-CD37抗體抑制細胞生長的能力使用體外細胞毒性測試來測量。將靶細胞以5,000細胞/孔平板接種在100 μL的完全RPMI培養基中(RPMI-1640,10%胎牛血清,2 mM穀氨醯胺，1%青黴素-鏈黴素，所有試劑來自Invitrogen)。使用3-倍稀釋系列將抗體稀釋到完全RPMI培養基中，並且每孔加入100 μL。最終濃度典型地為3 x 10-8 M至4.6 x 10-12 M。將細胞在37℃下在加濕5% CO2孵育器中孵育4至5天。保留細胞的生存力通過比色WST-8測定(Dojindo Molecular Technologies,Inc.,Rockville,MD,US)來確定。WST-8通過活細胞中的脫氫酶還原成在組織培養基中可溶的橙色甲臢產物。甲臢產物的量直接成比例於活細胞的數量。將WST-8加入10%的最終體積中，並且將板在37℃下在加濕5% CO2孵育器中孵育另外2-4小時。通過在多孔板讀取器中測量450 nm(A450)處的吸光度來分析板。具有培養基和WST-8的孔的背景A450吸光度僅從所有值中減去。%生存力通過使各處理的樣品值除以具有未處理的細胞的孔的平均至來計算。%生存力=100*(A450處理的樣品-A450背景)/(A450未處理的樣品-A450背景)。對於各處理在半-log圖中，%生存力值針對抗體濃度繪製。
來自使用鼠CD37抗體和SU-DHL-4淋巴瘤細胞的典型增殖測試的結果展示於圖5。明顯的是數種鼠抗體能夠基本上和以劑量依賴性方式抑制SU-DHL-4細胞的增殖，而其他者沒有這種效果。例如，在測試的最高抗體濃度下，使用muCD37-3處理降低細胞生存力至34%，EC50為0.17 nM。類似地，在測試的最高抗體濃度下，使用muCD37-38降低細胞生存力至25%，EC50為0.19 nM。同樣，在測試的最高抗體濃度下，使用muCD37-50或muCD37-51處理降低細胞生存力至38%，EC50分別為0.25 nM或0.5 nM。相反，使用例如CD37-16處理不會以劑量依賴性方式降低細胞生存力。
實施例5 CD37-3抗體的VL和VH區的克隆和測序
根據製造商的方案，使用RNeasy試劑盒(QIAgen)從CD37-3雜種瘤的5 x 106細胞來製備總細胞RNA。cDNA隨後從總RNA使用SuperScript II cDNA合成試劑盒(Invitrogen)合成。
在衍生自雜種瘤細胞的cDNA上進行第一輪簡並PCR反應的步驟基於Wang et al.((2000)J Immunol Methοds. 233:167-77)和Co et al.((1992)J Immunol. 148:1149-54)中所述的方法。VH序列通過PCR使用下列簡並引物來擴展：EcoMH1 CTTCCGGAATTCSARGTNMAGCTGSAGSAGTC(SEQ IDNO:171),EcoMH2 CTTCCGGAATTCSARGTNMAGCTGSAGSAGTCWGG(SEQ ID NO:172)和BamIgG1 GGAGGATCCATAGACAGATGGGGGTGTCGTTTTGGC(SEQ ID NO:173)。VL序列通過PCR使用下列簡並引物來擴增：SacIMK GGAGCTCGAYATTGTGMTSACMCARWCTMCA(SEQ ID NO: 174)和HindKL TATAGAGCTCAAGCTTGGATGGTGGGAAGATGGATACAGTTGGTGC(SEQ ID NO:175)。(混合的堿基定義如下：N=G+A+T+C,S=G+C,Y=C+T,M=A+C,R=A+G,W=A+T)。PCR反應混合物然後運行在1%低熔點瓊脂糖凝膠上，300至400 bp帶被切除，使用Zymo DNA小柱純化，並且發送至Agencourt Biosciences以用於測序。各自5’和3’PCR引物用作測序引物以從兩個方向產生可變區cDNA。VH和VL區的胺基酸序列從DNA測序結果來預計。
由於用於克隆VL和VHcDNA序列的簡並引物改變5’端序列，因此需要另外的測序努力來證實完全序列。初步cDNA序列用於檢索NCBI IgBlast網站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)，以用於鼠種系序列，從該序列衍生抗體序列。PCR引物然後被設計為退火至鼠抗體的種系連接的前導序列，使得該新PCR反應將產生完全可變區cDNA序列，未被PCR引物改變。PCR反應、帶的純化和測序如上所述進行。
序列證實的質譜確定
可變區的cDNA序列資訊聯合種系恒定區序列以獲得全長抗體cDNA序列。然後，重鏈和輕鏈的分子量被計算，並且比較於通過鼠CD37-3抗體的LC/MS分析而獲得的分子量。對於CD37-3輕和重鏈，分子量測量情況一致於cDNA序列。
嵌合
輕鏈可變區的可變序列克隆到pchCD37-3LCZ質粒中的EcoRI和BsiWI位點中。重鏈可變區克隆到pchCD37-3HCN質粒中的HindIII和Apa1位點中。等同質粒被構建用於chCD37-12。這些質粒用於使用標準磷酸鈣方法(BD Biosciences,CalPhos Mammalian Transfection Kit,Cat # 631312)來表達HEK-293T細胞中的嵌合抗體。上清使用上述標準蛋白A色譜法純化，但是精製色譜步驟使用羧甲基(CM)快速流動離子交換(IEX)樹脂(GE Lifesciences)和10 mM磷酸鉀,10 mM氯化鈉結合緩衝液(pH 7.5)或者上述可替換的CHT法來進行。
實施例6 抗體人源化
CD37-3和huCD37-50抗體根據前述再表面化方法來人源化，例如Roguska et al.,Proc. Natl. Acad. Sci.,USA,91(3):969-973(1994)和Roguska et al.,Protein Eng. 9(10):895-904(1996)，其通過引用的方式全部併入本文中。再表面化法通常包括鑒定輕和重鏈中的可變區框表面殘基，並且使用人等同物置換它們。鼠CDR保存在再表面化的抗體中。CD37-3和CD37-50的示例性CDR限定為表11中所指示。除了用於再表面化的重鏈CDR2定義，所述表提供鼠和人CD37-3和CD37-50的示例性Kabat定義的重鏈CDR2。。帶下劃線的序列標記Kabat重鏈CDR2的不被認為用於再表面化的CDR的部分。
定義用於再表面化的CD37-3和CD7-50輕和重鏈CDR通過表11中的例子的方式給出。鼠CD37-50輕鏈CDR2中的賴氨酸53被人源化CD37-50中的天冬醯胺置換(斜體示出)，因此給出LC CDR2的兩種版本。重鏈CDR2的Kabat定義也給出用於鼠和人CD37-3。帶下劃線的序列標記Kabat重鏈CDR2的不被認為用於再表面化的CDR的部分。
表面殘基位被定義為其相對可接近性為30%或更高的任何位(Pedersen J.T. et. Al,J. Mol. Biol. 1994;235:959-973)。然後表面殘基和人種系表面序列進行比對，以鑒定最同源的人表面序列。對於CD37-3，用作置換表面的人種系序列是IGKV1/OR2-0*01和IGHV4-34*09(分別對於VL和VH)。對於CD37-50，用作置換表面的人種系序列是IGKV3/OR2-268*01和IGHV4-31*03(分別對於VL和VH)。如從圖6的列表可見，輕鏈中總共7個表面殘基和重鏈中7個殘基被CD37-3中的人負體置換。如圖7中對於CD37-50可見，被人負體置換的總表面殘基對於VL和VH分別是7個和5個。在CD37-3中，重鏈殘基61最鄰近CDR-H2，並且由於其置換人殘基脯氨酸可導致降低的結合親和性，第二再表面化的版本使用保留的鼠絲氨酸殘基來產生。由於這些抗體被測試為細胞毒素的共軛物，因此CD37-50輕鏈CDR2賴氨酸53被天冬醯胺置換以避免關注賴氨酸綴合可能影響結合親和性。圖8示出輕鏈和重鏈的CD37-3和CD37-50可變域的再表面化的序列和它們鼠負體的比對。
huCD37-3抗體的重組表達
huCD37-3和CD37-50的可變區序列被密碼子-優化，並且通過Blue Heron Biotechnology合成。序列側翼有限制性內切酶位點以使用單鏈哺乳動物表達質粒中各自恒定序列來進行框內克隆。輕鏈可變區克隆到pAbKZeo質粒中的EcoRI和BsiWI位點。重鏈可變區克隆到pAbG1Neo質粒中的HindIII和Apa1位點。這些質粒可用於以暫態或穩定哺乳動物細胞轉染表達重組抗體。暫態轉染以在HEK 293T細胞中表達重組抗體使用改善的PEI方法來進行(Durocher,Y. et al.,Nucleic Acids Res. 30:E9(2002))。上清通過蛋白A和精製色譜步驟使用上述用於嵌合抗體的標準方法來進行純化。
TRU-016的表達
為了比較分離的抗-CD37抗體的活性，將之前鑒定的抗-CD37抗體克隆和表達。用於抗-CD37 SMIP的DNA序列使用SEQ ID 51得自US2007/0059306。序列側翼有HindIII和Xho1限制性內切酶位點以克隆到pAbG1Neo哺乳動物表達質粒。如上面用於huCD37-3所述來進行表達和純化。
實施例7 嵌合抗體的結合親和性
嵌合抗體chCD37-3和chCD37-12被測定和它們鼠負體相比，它們和Ramos細胞的結合親和性。如實施例2中所述，利用二次FITC-綴合的山羊-抗-鼠和-抗-人抗體，使用Ramos細胞和muCD37-3,chCD37-3,muCD37-12與chCD37-12抗體的流式細胞術結合測試被進行和分析。圖9A示出對於各抗體通過非線性回歸產生的劑量-回應曲線。各抗體的表觀解離常數(Kd)的數值使用GraphPad Prism v4(GraphPad software,San Diego,CA)來計算。明顯的是，嵌合併未明顯影響抗體的結合親和性，因為muCD37-3,chCD37-3,muCD37-12和chCD37-12的Kd分別對應於0.4 nM,0.8 nM,0.8 nM和1.2 nM。
huCD37-3v1.0和huCD37-3v1.01的結合親和性
使用BJAB細胞和競爭結合樣式的流式細胞術結合測試用於評價CD37-3的嵌合和人源化版本的結合親和性。BJAB細胞和1 nM濃度的PE-標記的muCD37-3抗體孵育，並且通過添加變化量的muCD37-3,chCD37-3,huCD37-3v1.0或huCD37-3v1.01來測量競爭性。樣品在4℃下孵育3小時。然後，將細胞粒狀沉澱，使用FACS緩衝液洗滌，並且重懸浮在200 μL的含有1%的甲醛的PBS中。使用具有HTS多孔取樣器的FACSCalibur流式細胞儀來獲取樣品，並且使用CellQuest Pro(都來自BD Biosciences,San Diego,US)來進行分析。所得平均PE螢光值針對在半-log圖中使用的競爭抗體的量進行繪製。圖9B示出對於各抗體通過非線性回歸產生的劑量-回應曲線。各抗體的表觀解離常數(Kd)的數值使用GraphPad Prism v4(GraphPad software,San Diego,CA)來計算。明顯的是，嵌合或人源化並未影響CD37-3的結合親和性，因為所有版本平等地良好競爭和鼠親本抗體的結合。muCD37-3,chCD37-3,huCD37-3v1.0或huCD37-3v1.01的競爭結合的EC50分別對應於0.8 nM,0.7 nM,1 nM和0.6 nM。
人源化抗體的結合親和性
人源化抗體huCD37-38,huCD37-50,huCD37-51,huCD37-56和chCD37-57被測定和它們鼠負體相比，它們和BJAB細胞的結合親和性。利用二次FITC-綴合的山羊-抗-鼠和-抗-人抗體進行流式細胞術結合測試，並且如實施例2中所述進行分析，對於各抗體通過非線性回歸產生的劑量-回應曲線。各抗體的表觀解離常數(Kd)的數值使用GraphPad Prism v4(GraphPad software,San Diego,CA)來計算。明顯的是，人源化並不明顯影響任何抗體的結合親和性。muCD37-3和huCD37-3的Kd對應於0.2 nM，而muCD37-38和huCD37-38的Kd分別對應於0.4 nM和0.3 nM。類似地，muCD37-50和huCD37-50的Kd分別對應於0.6 nM和0.2 nM，而muCD37-51和huCD37-51的Kd分別對應於0.6 nM和0.8 nM。最後，muCD37-56和huCD37-56的Kd分別對應於0.4 nM和0.2 nM，而muCD37-57和huCD37-57的Kd分別對應於1.0 nM和0.3 nM。
實施例8 獼猴CD37的表達
獼猴CD37的CD37 AA序列得自Genbank(GI: 718718)。所述序列通過Blue Heron Biotechnology密碼子-優化和合成。表達質粒pSRa-CD37mac被構建，其含有來自獼猴的完整CD37編碼序列(CDS)，其側翼有XbaI和BamHI限制性內切位點，這允許獼猴CD37的表達。300-19細胞，一種衍生自Balb/c小鼠的前B細胞系(M. G. Reth et al. 1985,Nature,317: 353-355)，使用該表達質粒轉染以在細胞表面上穩定地表達獼猴CD37。
鼠抗體與獼猴CD37的結合親和性
鼠抗體muCD37-3,muCD37-12,muCD37-38,huCD37-50,muCD37-51,muCD37-56和muCD37-57被測定它們結合300-19/CD37mac細胞表達獼猴CD37的能力。使用二次FITC-綴合的山羊-抗-鼠或山羊-抗-人抗體來進行流式細胞術結合測試，並且如實施例2中所述進行分析。結合比較於之前描述的抗-CD37抗體WR17和抗-CD37 SMIP TRU-016。如圖10A中可見，數種分離的抗-CD37抗體，muCD37-38,huCD37-50,muCD37-51,muCD37-56和muCD37-57可結合獼猴衍生的CD37抗原。相反，muCD37-3,muCD37-12,之前描述的抗-CD37抗體WR17和抗-CD37 SMIP TRU-016不能結合獼猴衍生的CD37抗原。
人源化抗體與獼猴CD37的結合親和性
人源化抗體huCD37-38,huCD37-50,huCD37-51,huCD37-56和huCD37-57被測定它們與300-19/CD37mac細胞表達獼猴CD37的結合親和性。使用二次FITC-綴合的山羊-抗-人抗體來進行流式細胞術結合測試，並且如實施例2中所述進行分析，對於各抗體通過非線性回歸產生的劑量-回應曲線。各抗體的表觀解離常數(Kd)的數值使用GraphPad Prism v4(GraphPad software,San Diego,CA)來計算。從圖10B明顯的是，數種分離的人源化抗體結合獼猴CD37，而huCD37-3不是這樣。huCD37-38,huCD37-50,huCD37-51,huCD37-56和huCD37-57的Kd值分別對應於1.1 nM,1.8 nM,14 nM,5 nM和2 nM。因此，人源化不會影響分離的抗體的結合特異性。
實施例9 嵌合和人源化抗體的促凋亡活性
在Ramos細胞上評價嵌合和人源化抗體的促凋亡活性。將細胞和10nM濃度的抗體或huIgG同種型對照抗體孵育20小時，然後膜聯蛋白-V-FITC和TO-PRO-3染色，並且進行流式細胞術分析。ChCD37-12保留muCD37-12的強烈促凋亡活性。和4%的末處理的對照細胞相比，在使用muCD37-12或chCD37-12抗體處理後約40%的Ramos細胞是膜聯蛋白-V陽性。類似地，和4%的同種型對照處理的或未處理的細胞相比，在使用huCD37-3,huCD37-38,huCD37-50,huCD37-51,huCD37-56或huCD37-57抗體處理後約40%的Ramos細胞是膜聯蛋白-V陽性。相反，使用抗-CD20抗體利妥昔單抗處理導致只有13%的膜聯蛋白-V陽性細胞。所述結果證實此處分離的鼠抗-CD37抗體的強烈促凋亡活性通過衍生自它們的嵌合或人源化抗體而得以保持。因此，該組抗-CD37抗體的獨特的功能性能，在不存在交聯的情況下強烈的促凋亡活性，不會受到嵌合或人源化的不利影響。
huCD37-3和TRU-016的促凋亡活性
比較huCD37-3針對Ramos和Raji淋巴瘤細胞的促凋亡活性與抗-CD37 SMIP TRU-016的情況。TRU-016描述為不具有促凋亡活性的化合物，除非交聯有二次抗體。明顯的是，示例性抗-CD37抗體huCD37-3和chCD37-38針對兩種淋巴瘤細胞系具有更強的促凋亡活性。比較於3%的未處理的對照細胞，使用huCD37-3或chCD37-38處理導致40%或49%的膜聯蛋白-V陽性Ramos細胞。利妥昔單抗處理導致只有15%的膜聯蛋白-V陽性Ramos細胞。相反，TRU-016處理不會增加膜聯蛋白-V陽性Ramos細胞的百分率。同樣，比較於7%的未處理的對照細胞，使用huCD37-3或chCD37-38處理導致34%或30%的膜聯蛋白-V陽性Raji細胞。利妥昔單抗處理導致只有19%的膜聯蛋白-V陽性Raji細胞。相反，TRU-016處理不會增加膜聯蛋白-V陽性Ramos細胞的百分率。
人源化抗體的促凋亡活性的劑量應答
變化量的各抗體和Ramos細胞孵育20小時，然後膜聯蛋白-V-FITC和TO-PRO-3染色，並且進行流式細胞術分析。膜聯蛋白-V陽性細胞的百分率針對半-log圖中的抗體濃度繪製，使用非線性回歸分析從曲線擬合來計算EC50值。明顯的是，所有人源化抗體具有強烈促凋亡活性，膜聯蛋白-V陽性細胞的最大百分率為至少40%。圖11。用於該活性的EC50對應於0.08,0.08和0.11 nM(分別為huCD37-3,huCD37-38和huCD37-50)。另外，用於該活性的EC50對應於0.41,0.57和1.01 nM(分別為huCD37-51,huCD37-56和huCD37-57)。相反，比較於4%的使用同種型對照抗體處理的細胞，使用抗-CD20抗體利妥昔單抗處理導致膜聯蛋白-V陽性細胞的最大百分率僅為15%。
實施例10 嵌合和人源化抗-CD37抗體的增殖測試
嵌合和人源化抗-CD37抗體抑制細胞生長的能力使用體外細胞毒性測試來測量，如實施例4所述。使用SU-DHL-4和DOHH-2淋巴瘤細胞的典型增殖測試的結果展現於圖12。明顯的是，所有抗體能夠基本上和以劑量依賴性方式抑制SU-DHL-4細胞的增殖。例如，使用muCD37-3處理降低SU-DHL-4細胞的生存力為35%，EC50為0.07 nM。類似地，在測試的最高抗體濃度下，使用chCD37-3,huCD37-3v1.0或huCD37-3v1.01處理降低SU-DHL-4細胞的生存力為約30%，EC50分別為0.03 nM,0.06 nM或0.03 nM。同樣，所有抗體能夠基本上和以劑量依賴性方式抑制DOHH-2濾泡性淋巴瘤細胞的增殖。例如，使用muCD37-3處理降低DOHH-2細胞的生存力為45%，EC50為0.05 nM。類似地，使用chCD37-3,huCD37-3v1.0或huCD37-3v1.01處理降低DOHH-2細胞的生存力為約35%，EC50分別為0.06 nM,0.07 nM或0.05 nM。該結果證實各種版本的CD37-3抗體具有類似的抗-增殖活性，其不會受到嵌合或人源化的影響。
在類似的體外細胞毒性測定中測試另外的人源化抗-CD37抗體。所有測試的人源化抗體能夠基本上和以劑量依賴性方式抑制SU-DHL-4細胞的增殖。例如，使用huCD37-38處理降低SU-DHL-4細胞的生存力為24%，EC50為0.42 nM，，而使用huCD37-50處理降低SU-DHL-4細胞的生存力為31%，EC50為0.39 nM。相反，使用抗-CD20抗體利妥昔單抗處理降低SU-DHL-4細胞的生存力為35%，EC50為1.6 nM。另外，使用huCD37-51或huCD37-56處理降低SU-DHL-4細胞的生存力為24%，EC50分別為0.60 nM或0.68 nM。而且，使用huCD37-57處理降低SU-DHL-4細胞的生存力為31%，EC50為0.42 nM。使用同種型對照抗體處理對於SU-DHL-4細胞的生存力沒有影響。
比較於其他抗體的huCD37-3的抗-增殖活性
為了進一步表徵分離的抗-CD37抗體的抗-增殖活性，我們比較了示例性huCD37-3抗體與抗-CD37 SMIP TRU-16化合物的效果。使用腫瘤微陣列的免疫組織化學證實CD37和CD20在NHL的亞型中表現出類似的表達圖案和流行性。參見下表12。因此，還比較了抗-CD20抗體利妥昔單抗。細胞系組包括Granta-519,SU-DHL-4,Namalwa和Daudi淋巴瘤細胞。圖13。
在所有情況下，huCD37-3處理導致細胞生存力以劑量依賴性方式降低。例如，使用huCD37-3處理降低Granta-519細胞的生存力為約37%，EC50為0.062 nM。利妥昔單抗處理降低Granta-519細胞的生存力為約47%，EC50為0.36 nM。使用huCD37-3處理降低SU-DHL-4細胞的生存力為約17%，EC50為0.053 nM。利妥昔單抗處理降低SU-DHL-4細胞的生存力為約20%，EC50為0.2 nM。截然不同的是，使用TRU-016處理不會在明顯程度上或以劑量依賴性方式降低Granta-519或SU-DHL-4細胞的生存力。在進一步例子中，使用huCD37-3處理降低Namalwa細胞的生存力為約47%，EC50為0.1 nM，並且降低Daudi細胞的生存力為約68%，EC50為0.25 nM。利妥昔單抗處理對於Namalwa細胞沒有影響，但是降低Daudi細胞的生存力為約69%，EC50為2.6 nM。截然不同的是，使用TRU-016處理不會在明顯程度上或以劑量依賴性方式降低Namalwa或Daudi細胞的生存力。最後，使用huCD37-3處理降低Ramos細胞的生存力為約53%，EC50為0.08 nM，而TRU-016和利妥昔單抗處理都不會Ramos細胞生存力產生任何影響。該結果強調分離的抗-CD37抗體的抗-增殖活性的獨特性。
實施例11 CD37抗體的CDC活性
為了評價嵌合和人源化抗-CD37抗體的補體依賴性細胞毒性(CDC)活性，根據公開的方法(Gazzano-Santoro H,J Immunol Methοds. 1997 202(2):163-71)來進行細胞基測定。將抗體以50 μL/孔等分三份到平底96-孔組織培養板中，其在RHBP(RPMI-1640,20 mM HEPES,0.1% BSA,1%青黴素-鏈黴素)培養基中各種濃度下，典型地為5 μg/mL(=3.3 x 10-8 M)至2.3 ng/mL(=1.5 x 10-11 M)。將靶細胞以5 x 104細胞加入在100 μL的RHBP培養基/孔的抗體。凍幹人補體(Sigma-Aldrich,St. Louis,US)使用1 mL無菌純化的水/小瓶重組，並且在使用前立即稀釋5倍至具有RHBP培養基的20%儲液中。50 μL/孔的補體溶液加入各孔中至最終濃度5%。將板在37℃下在5% CO2加濕孵育器中孵育2 h，以允許補體介導的胞溶。在該孵育時間後，Alamar Blue試劑(Invitrogen)加入各孔至最終濃度為10%，以測量保留細胞的生存力。在EX540/EM590 nm處測量螢光度(相對螢光單位，RFU)之前，將板在37℃下孵育16至20小時。對照包括在具有培養基和補體但沒有細胞(僅有培養基,0%生存力)與具有細胞和補體但沒有抗體(僅有細胞,100%生存力)的三份孔中。各樣品的特定細胞生存力的百分率通過下列來測定：%生存力=(樣品-僅有培養基)/(僅有細胞-僅有培養基)。
使用Ramos細胞的示例性CDC測定的結果展現於圖14。吃驚地，chCD37-12針對Ramos細胞具有有效的CDC活性。在測試的最高抗體濃度下，其降低Ramos細胞的生存力為32%，EC50為0.037 μg/mL。另外，數種分離的抗體顯示出在變化程度上具有針對Ramos的CDC活性。使用huCD37-3,huCD37-38,huCD37-50處理導致分別降低細胞生存力為59%,50%和45%。在測試的最高抗體濃度下，使用huCD37-51,huCD37-56或huCD37-56處理適度地將Ramos細胞的細胞生存力為約70-80%。
實施例12 CD37抗體的ADCC活性
使用新鮮分離的人自然殺傷(NK)細胞作為效應子細胞，乳酸脫氫酶(LDH)釋放測試被用於測定腫瘤細胞系的抗體-依賴性細胞介導的細胞毒性(ADCC)(Shields RL,J Biol Chem. 2001 276(9):6591-604)。使用NKIsolation Kit II改進的方案(Miltenyi Biotech,130-091-152)，NK細胞首先分離自正常供體的人血液(Research Blood Components,Inc.,Brighton,MA)。將血液用1x PBS稀釋2倍。將25 mL的稀釋的血液仔細地在50 mL圓錐管中在25 mL的Ficoll Paque上分層，並且以400 g在RT下離心45 min。周圍血液單核細胞(PBMC)收集自介面，轉移到新的圓錐50 mL管中，並且使用1x PBS洗滌一次。將PBMC重懸浮在2 mL的NK-分離緩衝液中(1x PBS,0.5% BSA,2mM EDTA)，然後500 μL的Biotin-抗體Cocktail加入細胞混懸液中。Biotin-抗體Cocktail含有生物素化的抗體，其結合淋巴細胞(除了NK細胞)，從而導致NK細胞的陰性選擇。將混合物在4℃下孵育10 min，然後加入1.5 mL的NK-分離緩衝液和1 mL的抗-Biotin微珠。將細胞-抗體混合物在4℃下孵育另外15 min。然後，將細胞使用50 mL的NK-分離緩衝液洗滌一次，並重懸浮在3 mL的NK-分離緩衝液中。然後，MACS LS柱安裝在自動MACS分離器上(Miltenyi Biotech)，並且使用3 mL的NK-分離緩衝液預洗滌。將細胞混懸液自動地施加在柱上，洗滌，並且具有未標記的NK細胞的流出的部分收集到新的50-mL圓錐管中。將所得NK細胞平板接種到30 mL的完全RPMI培養基中(RPMI-1640，補充5%胎牛血清,1%青黴素-鏈黴素,1 mM HEPES,1 mM丙酮酸鈉,1% 100X MEM非必需胺基酸溶液)過夜。在RHBP培養基(RPMI-1640培養基，補充20 mM HEPES,pH 7.4,0.1% BSA和1%青黴素-鏈黴素)中進行隨後的測定和所有稀釋。
將在RHBP培養基中各種濃度的抗體以50 μL/孔一式兩份分到圓底96-孔板中。將靶細胞以106細胞/mL重懸浮在RHBP培養基中，並且以100 μL/孔加至含有抗體稀釋液的各孔中。含有靶細胞和抗體稀釋液的板在37℃下孵育30 min。然後將NK細胞以50 μL/孔加至含有靶細胞的孔中。典型比例為1個靶細胞比3-4個NK細胞。建立下列對照用於各試驗：單獨NK細胞，單獨靶細胞(自發LDH釋放),靶細胞和NK細胞(抗體獨立性LDH釋放),靶細胞和10%Triton X-100(最大LDH釋放)。將混合物在37℃下孵育4 h以允許細胞胞溶。將板以1200 rpm離心10 min，並將100 μL的上清仔細地轉移到新的平底96-孔板中。來自細胞毒性檢測試劑盒(Roche 1 644 793)的LDH反應混合物(100 μL/孔)加入各孔中，並在室溫下孵育5至30 min。在490 nm(OD490)下測量樣品的光學密度。各樣品的特定胞溶百分率使用下列來確定：特定胞溶百分率=(樣品值-自發釋放)/(最大釋放-自發釋放)*100。
和人源化抗體一起孵育導致在存在人NK效應子細胞的情況下針對Daudi,Ramos和Granta-519淋巴瘤細胞的良好的ADCC活性。它們針對Daudi淋巴瘤細胞的ADCC活性和TRU-016的ADCC活性進行比較(圖15)。
使用huCD37-3,huCD37-38或huCD37-50抗體處理導致約41%,39%或40% Daudi細胞胞溶，EC50值分別為0.42 ng/mL,1.31 ng/mL或2.42 ng/mL。該活性類似於得自觀察到的使用42% Daudi細胞胞溶的TRU-016處理，並且EC50值為0.93 ng/mL。另外，使用huCD37-51,huCD37-56和huCD37-57處理導致約39%,36%或36%的Daudi細胞胞溶，EC50值分別為5.7 ng/mL,4.3 ng/mL或7.9 ng/mL。
分離的抗體針對Ramos淋巴瘤細胞的ADCC活性和TRU-016的ADCC活性進行比較。使用huCD37-3,huCD37-38或huCD37-50抗體處理導致約43%,42%或46% Ramos細胞胞溶，EC50值分別為0.95 ng/mL,2.0 ng/mL或3.0 ng/mL。該活性類似於得自觀察到的使用59% Ramos細胞胞溶的TRU-016處理，並且EC50值為1.53 ng/mL。另外，使用huCD37-51,huCD37-56和huCD37-57處理導致約53%,43%或44%的Ramos細胞胞溶，EC50值分別為5.7 ng/mL,4.3 ng/mL或7.9 ng/mL。
在另外的試驗中，huCD37-3和chCD37-38針對Granta-519細胞的ADCC活性和TRU-016的ADCC活性進行比較。使用huCD37-3或chCD37-38抗體處理導致約19%或18% Granta-519細胞胞溶，EC50值分別為0.13 ng/mL或0.73 ng/mL。TRU-016處理導致觀察到的16% Granta-519細胞胞溶，EC50值為0.83 ng/mL。
實施例13 抗原表位映射
用於不同CD37抗體的抗原表位所要求的胺基酸的局域化可有助於建立通常或獨特的功能特性與特定分子相互作用之間的聯繫。CD37的胞外域含有兩個胞外環，小環為約18個殘基，大環由約135個胺基酸構成。對於之前公開的CD37抗體，抗原表位要求並未描述。為了進一步表徵本發明的分離的CD37抗體，我們構建了數種CD37抗原變體，其在較大胞外環中具有AA置換。
CD37變體克隆和表達
構建哺乳動物表達質粒，其含有全部人或獼猴CD37 cDNA序列，密碼子由Blue Heron Biotechnologies優化和合成，並且側翼有XbaI和BamHI限制性內切位點以促進克隆到pSRa載體多克隆位點。由於人和獼猴CD37序列高度同源(圖16)，因此這些構建體的表達能夠從下列那些情況來區別人和獼猴交叉反應性抗體：識別抗原表位，其要求在這兩個物種之間11個細胞外CD37胺基酸中至少一個不同，這如實施例8中所述。
為了進一步表徵CD37抗體抗原表位，構建一系列鼠和人嵌合CD37構建體。由於小CD37胞外環的尺寸和高度同源性，抗原表位的局域化努力對大胞外環進行了限制。大胞外環的EcoRV至Pst1盒編碼殘基I108至Q235被重新設計以通過引入4個獨特的限制性內切位點來進一步節段為5個部分，所述位元點可在人、鼠和獼猴CD37序列之間是保守的(圖17)。創建下列人和小鼠嵌合CD37構建體：
hCD37-M1
hCD37-M2
hCD37-M3
hCD37-M45
muCD37-R176
為了保存一個這樣的限制性內切位點Kpn1，人R176包括在所有鼠/人嵌合構建體中。鼠和人CD37盒訂購自Blue Heron，並且和由PCR產生的初始人CD37構建體的5'端片段一起克隆到pSRa載體中以引入EcoRV位點，並從初始獼猴CD37構建體中取出3’端Pst1至Xba1限制性片段。然後使用標準限制性內切酶消化和利用通常獨特的限制性內切位點的連接來構建鼠和人嵌合CD37盒。
hCD37-M1變體通過下列方式來創建：插入EcoRV-SacII限制性片段，其編碼類似鼠CD37序列的AA S109至A138。同樣，hCD37-M3變體通過下列方式來創建：插入KpnI-Blp1限制性片段，其編碼類似鼠CD37序列的AA V177至L201。hCD37-M45變體通過下列方式來創建：插入Blp1-PstI限制性片段，其編碼類似鼠CD37序列的AA S202至I243。所得克隆通過限制性內切酶消化、然後進行DNA測序來證實。
穩定的細胞系通過下列方式獲得：使用標準電穿孔方法，將鼠和人嵌合CD37變體表達質粒轉染到300-19細胞中。簡言之，使用在260V和960 μF設定的BioRad Gene Pulser，5 x 106 300-19細胞被電穿孔到冷RPMI-1640培養基中。隨後，將細胞稀釋，並且平板接種到96-孔板中的RPMI-1640培養基中，所述培養基補充10% FBS和50 μMβ-疏基乙醇。在24小時後，以最終濃度2 mg/mL加入G418(Invitrogen)，以選擇轉染的細胞。在2周後，分離單一集落，並且通過流式細胞術和擴大來分析用於CD37表面表達。
結合CD37變體的抗體
各種CD37抗體與細胞表達人CD37野生型和變體的結合通過流式細胞術使用1.5 μg/mL的各抗體來分析。本發明的分離的抗體和市售CD37抗體WR17以及TRU-016 SMIP相比較。在圖18A中可見，所有抗體結合野生型CD37表達細胞。同樣，所有測試的抗體結合hCD37-M3變體(圖18B)。相反，本發明的分離的抗體結合hCD37-M1變體，而TRU-016和WR17不能結合hCD37-M1變體(圖19A)。CD37-50和CD37-51抗體與TRU-016也能夠結合hCD37-M45變體。WR17顯示部分結合hCD37-M45變體，而其他抗體CD37-3,CD37-12,CD37-38,CD37-56和CD37-57不能結合(圖19B)。這暗示所有本發明的分離的抗體不需要在hCD37-M1變體中的12AA殘基，其改變至相應鼠AA殘基以結合CD37抗原。相反，CD37-3,CD37-12,CD37-38,CD37-56和CD37-57抗體要求hCD37-M45變體中10個AA殘基中的至少一個，其改變至相應鼠AA殘基以結合CD37抗原。
未預料的結果表明，本發明的分離的抗體表示新型種類的CD37抗體，其具有功能特性的獨特聯合。
另外，按照相同設計來構建類似的構建體。所述構建體含有編碼CD37的大胞外環的鼠、人和/或獼猴序列的各種組合(參見圖17)。具有插入到鼠大胞外環序列中的單一人部分的構建體的例子為：
hCD37mECD-H1:
hCD37mECD-H2:
hCD37mECD-H3:
hCD37mECD-H4:
hCD37mECD-H5
和hCD37mECD-H45
其他例子為具有插入到人大胞外環序列中的單一獼猴部分的構建體，例如：
hCD37-Mac12:
hCD37-Mac4:
hCD37-Mac5:
和hCD37-Mac45:
而且，單一點突變產生在人大胞外環序列中，以鑒定殘基對於抗體結合的重要性。
CD37結合劑與表達SEQ ID NO: 185-194的細胞的結合通過上述流式細胞術來分析。
實施例14 huCD37-3-SPP-DM1的製備
N-琥珀醯亞胺基4-(2-吡啶基二硫代)戊酸酯(SPP)接頭溶解於乙醇中。huCD37-3抗體以5 mg/mL和7倍摩爾數過量的SPP接頭在室溫下在50 mM磷酸鉀緩衝液(pH6.5)中孵育約100分鐘，所述緩衝液含有50 mM NaCl,2 mM EDTA和5%乙醇。反應混合物使用採用上述磷酸鉀緩衝液平衡的SEPHADEXTM G25F柱純化。含有所述部分的抗體集中並用於隨後的步驟。
美登醇DM1溶解於二甲基乙醯胺(DMA，最終濃度是3%)中，相對於接頭1.7倍摩爾數過量滴加至SPP修飾的抗體。在室溫下孵育過夜後，綴合的抗體通過色譜法在用磷酸鹽緩衝液(PBS),pH 6.5平衡的SEPHADEXTM G25F純化。然後，huCD37-3-SPP-DM1共軛物透析到含有10 mM組氨酸，250 mM甘氨酸，1%蔗糖，pH 5.5的緩衝液中。使用之前報導用於抗體和DM1的消光係數來測定連接的DM1分子數量/抗體分子(Liu et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA,93,8618-8623(1996))。在綴合反應後存在的游離美登醇的百分率通過下列方式來確定：將20-50 μg共軛物注射到以在100 mM乙酸銨緩衝液,pH 7.0中25%乙腈平衡的的HiSep柱上，並且以乙腈洗脫。全部游離美登醇類(梯度洗脫，並且通過和使用已知標準的洗脫時間進行比較來鑒定)的峰面積使用設定為波長252 nm的吸光度檢測器來測量，並且比較和結合的美登醇有關的峰面積(在柱流動-通過部分中在共軛物峰中洗脫的)，以計算全部游離美登醇類的百分率。獲得3.5-4個DM1分子/huCD37-3抗體的共軛物，存在<1%的未綴合的美登醇。
huCD37-3-SMCC-DM1的製備
(琥珀醯亞胺基4-(N-馬來醯亞胺基甲基)環己烷-1-羧酸酯(SMCC,Pierce Biotechnology,Inc)接頭溶解於DMA。通過將抗體以5 mg/mL和10摩爾數過量的SMCC在50 mM磷酸鉀,50 mM NaCl,2 mM EDTA,pH 6.5中孵育，huCD37-3抗體使用SMCC修飾，以將馬來醯亞胺引入抗體。在室溫下約100分鐘後，反應混合物使用採用相同磷酸鉀緩衝液平衡的SEPHADEXTM G25F柱純化。含有所述部分的抗體集中並用於隨後的步驟。
SMCC-修飾的抗體和DM1的10 mM溶液反應，所述DM1相對于馬來醯亞胺接頭1.7摩爾數過量。將反應在室溫下攪拌約18小時。綴合反應混合物通過使用1×PBS，pH 6.5平衡的SEPHADEXTM G25凝膠過濾柱過濾。huCD37-3-SMCC-DM1共軛物透析到含有10 mM組氨酸，250 mM甘氨酸，1%蔗糖，pH 5.5的緩衝液中。如上所述測定連接的DM1分子數量/抗體分子和全部游離美登醇類的百分率。獲得3.5-4個DM1分子/huCD37-3抗體的共軛物，存在<1%的未綴合的美登醇。
huCD37-3-磺基-mal-DM4的製備
DM4硫醇和雜雙官能接頭1-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-4-(2,5-二氧代吡咯烷-1-基氧基)-4-氧代丁烷-2-磺酸(3-磺基-mal)的溶液在N,N-二甲基乙醯胺(DMA)中製成濃度30-60 mM。接頭和DM4在DMA中混合在一起，所述DMA含有至多40 % v/v的200 mM琥珀酸鹽緩衝液,2 mM EDTA,pH 5.0，以使DM4與接頭的比例為1.6，並且DM4的最終濃度等於15 mM。在混合之後，將反應保持2 h，在4 mg/ml Ab,90%磷酸鹽緩衝液/10% DMA,pH 7.5的最終綴合條件下，加入huCD37-3抗體在磷酸鹽緩衝液(pH 7.5)的混合物中。綴合反應允許在室溫下繼續進行2 h。huCD37-3-磺基-mal-DM4共軛物純化自過量未反應的DM4和未綴合的接頭產物在PBS中的滲析，然後最終滲析到含有10 mM組氨酸,250 mM甘氨酸,1%蔗糖pH 5.5的緩衝液中。共軛物通過0.22 μm篩檢程式過濾以用於最終儲存。如上所述測定最終共軛物中連接的DM4分子數量/huCD37-3抗體分子(平均)和全部游離美登醇類的百分率。獲得3.5-4個DM4分子/huCD37-3抗體的共軛物，存在<1%的未綴合的美登醇。
huCD37-3-PEG4-mal-DM1的製備
N-羥基琥珀醯亞胺基-(聚乙二醇)4-(N-馬來醯亞胺基甲基)-DM1(NHS-PEG4-mal-DM1)試劑溶解於DMA。huCD37-3抗體以5 mg/mL在50 mM磷酸鉀,150 mM NaCl,2 mM EDTA,pH 7.5中和7倍摩爾數過量的NHS-PEG4-mal-DM1(總共10% DMA)孵育。在室溫下約2小時後，反應混合物使用以1x PBS,pH 7.4平衡的SEPHADEXTM G25柱純化。含有所述部分的抗體集中並透析到含有10 mM組氨酸,250 mM甘氨酸,1%蔗糖,pH 5.5的緩衝液中。如上所述測定連接的DM1分子數量/抗體和全部游離美登醇類的百分率。獲得3.5-4個DM4分子/huCD37-3抗體的共軛物，存在<1%的未綴合的美登醇。
實施例15 美登醇共軛物的結合親和性
在綴合SMCC-DM1,SPP-DM1或磺基-mal-DM4後，示例性huCD37-3的結合親和性通過上述實施例中所述的流式細胞術來測定。表觀解離常數(Kd)的值從圖20A中示出的結合曲線來計算，並且對應於：0.26 nM，huCD37-3；0.46，huCD37-3-SMCC-DM1；0.56 nM，huCD37-3-SPP-DM1；和0.89 nM，huCD37-3-磺基-mal-DM4共軛物。該結果證實，SMCC-DM1,SPP-DM1或磺基-mal-DM4綴合並未顯著改變示例性huCD37-3抗體的親和性。
在綴合SMCC-DM1後huCD37-38的結合親和性通過上述實施例中所述的流式細胞術來測定。表觀解離常數(Kd)的值從圖20B中示出的結合曲線來計算，並且對應於：1.04 nM，huCD37-38；和1.2 nM，huCD37-38-SMCC-DM1共軛物。該結果證實，SMCC-DM1綴合並未顯著改變huCD38抗體的親和性。同樣，在綴合SMCC-DM1後huCD37-50,huCD37-51,huCD37-56和huCD37-57的結合親和性通過流式細胞術來測定。表觀解離常數(Kd)的值從結合曲線來計算，並且對應於：0.43 nM，huCD37-50；0.70 nM，huCD37-50-SMCC-DM1；2.0 nM，huCD37-51；1.6 nM，huCD37-51-SMCC-DM1；0.3 nM，huCD37-56；0.34 nM，huCD37-56-SMCC-DM1；0.30，huCD37-57；和0.34，huCD37-57-SMCC-DM1。該結果證實，SMCC-DM1綴合也並未顯著改變huCD37-50,huCD37-51,huCD37-56或huCD37-57抗體的親和性。
PEG4-mal-DM1共軛物的結合親和性
在綴合PEG4-mal-DM1後示例性huCD37-3和huCD37-50抗體的結合親和性通過上述實施例中所述的流式細胞術來測定。表觀解離常數(Kd)的值從結合曲線來計算，並且對應於：0.28 nM，huCD37-3；0.35 nM，huCD37-3-PEG4-mal-DM1；0.68 nM，huCD37-50；和1.1 nM，huCD37-50-PEG4-mal-DM1共軛物。該結果證實，PEG4-mal-DM1綴合並未顯著改變示例性huCD37-3或huCD50抗體的親和性。
huCD37-3-SMCC-DM1共軛物的促凋亡活性
在綴合SMCC-DM1後huCD37-3的促凋亡活性通過上述在Ramos細胞上膜聯蛋白-V染色來評價。使用huCD37-3抗體或huCD37-3-SMCC-DM1共軛物處理導致約40%的膜聯蛋白-V陽性Ramos細胞，EC50值為約0.09 nM(圖21A)。使用非結合對照抗體或非結合SMCC-DM1對照共軛物處理的Ramos細胞僅含有至多4%的膜聯蛋白-V陽性細胞。作為比較，使用抗-CD20抗體利妥昔單抗處理導致只有16%的膜聯蛋白-V陽性細胞，EC50值為約2 nM。相反，TRU-016處理並未增加膜聯蛋白-V陽性Ramos細胞的百分率。這證實，在綴合SMCC-DM1後，人抗-CD37抗體huCD37-3的強烈促凋亡活性保持。
huCD37-3-SMCC-DM1共軛物的CDC活性
在綴合SMCC-DM1後huCD37-3的CDC活性在Ramos細胞上在存在5%的人補體的情況下進行評價。使用huCD37-3或huCD37-3-SMCC-DM1處理導致細胞生存力分別降低為53%和73%(圖21B)。因此，在美登醇綴合後，示例性huCD37-3抗體的CDC活性保持。
共軛物的ADCC活性
在綴合SMCC-DM1或PEG4-mal-DM1後huCD37-3的ADCC活性在Daudi和Ramos細胞上在存在人NK效應子細胞的情況下通過上述LDH釋放測定來評價。如圖22A中可見，huCD37-3-SMCC-DM1或huCD37-3-PEG4-mal-DM1共軛物和未綴合的huCD37-3抗體在Daudi細胞上具有類似的ADCC活性。使用huCD37-3,huCD37-3 SMCC-DM1或huCD37-3-PEG4-mal-DM1處理導致約41%,39%或36%Daudi細胞胞溶，EC50值分別為0.42 ng/mL,1.13 ng/mL或0.91 ng/mL。使用Ramos細胞作為靶細胞獲得類似的結果。如上，huCD37-3-SMCC-DM1或huCD37-3-PEG4-mal-DM1共軛物與未綴合的huCD37-3抗體在Ramos細胞上具有可比較的ADCC活性(圖22B)。使用huCD37-3,huCD37-3 SMCC-DM1或huCD37-3-PEG4-mal-DM1處理導致約43%,41%或42% Ramos細胞胞溶，EC50值分別為0.95 ng/mL,1.33 ng/mL或1.57 ng/mL。因此，在美登醇綴合後，示例性huCD37-3抗體的有效ADCC活性保持。
通過huCD37-3-SMCC-DM1誘導細胞週期停滯
抗-CD37抗體和共軛物在細胞系中誘導細胞週期停滯的潛力通過碘化丙啶(PI)染色、然後進行流式細胞術分析來評價。以指數方式生長的細胞通過以1,300 rpm在RT下離心5分鐘而收穫，並且以0.5 x 106細胞/mL重懸浮在完全RPMI培養基中。將細胞以1 mL/孔轉移至24-孔板(Falcon 3077)至相等的0.5 x 106細胞/測定。將試驗化合物加入各孔中至最終濃度10 nM。完全RPMI培養基加入未處理的對照孔。將細胞在37℃下在加濕5% CO2孵育器中孵育過夜16至20 hr。第二天，將細胞通過轉移至5 mL聚苯乙烯管中而收穫，並且使用3 mL PBS洗滌一次，然後在冰上固定在1 mL 70%乙醇中30分鐘。然後，將樣品再次用3 mL PBS洗滌一次，並且重懸浮在0.5 mL PBS中。將RNase以5 μL/mL加入樣品，並且在37℃下孵育30分鐘。然後，將樣品用碘化丙啶在最終濃度50 μg/mL下染色。在PI染色24小時內獲取樣品。樣品運行在FACS Calibur上(BD Biosciences,San Diego)。FL2-A參數設定為線性規格，並且FL2 PTM被調節至G1峰值為約200的位點。在低流速下獲取樣品，並且每樣品收集10,000個事件。細胞在細胞週期中的不同相的分佈使用ModFit software(Version5.11,Verity Software House Inc.,USA)來測定。該程式使用峰擬合技術來自動模型化PI資料，並且提供期望的定量資料。所述資料使用標準程式設定來分析。
在和10 nM濃度的化合物孵育16-20小時、然後進行碘化丙啶(PI)染色和流式細胞術分析後，huCD37-3和huCD37-3-SMCC-DM1對於BJAB和RL淋巴瘤細胞的細胞週期停滯進行評價。和huCD37-3-SMCC-DM1孵育導致G2/M相中的細胞百分率從未處理的BJAB淋巴瘤細胞時的13%增加至huCD37-3-SMCC-DM1處理的細胞時的95%(圖23A)。類似地，和huCD37-3-SMCC-DM1孵育導致G2/M相中的細胞百分率從未處理的RL淋巴瘤細胞時的12%增加至huCD37-3-SMCC-DM1處理的細胞時的33%(圖23B)。相反，huCD37-3抗體對於BJAB或RL細胞的細胞週期沒有影響。另外，在相同濃度測試的非結合SMCC-DM1共軛物也對兩種細胞類型的細胞週期沒有影響。這證實，由分離的抗-CD37抗體製備的美登醇共軛物引起CD37-陽性淋巴瘤細胞系的特異性細胞週期停滯。
實施例16 體外細胞毒性測試
使用實施例10中所述用於抗體的體外細胞毒性測試，測量抗CD37抗體-共軛物抑制細胞生長的能力。簡言之，將靶細胞以5,000細胞/孔平板接種在100 μL的完全RPMI培養基中(RPMI-1640,10%胎牛血清,2 mM穀氨醯胺,1% 青黴素-鏈黴素，所有試劑來自Invitrogen)。使用3-倍稀釋系列將共軛物稀釋到完全RPMI培養基中，並且每孔加入100 μL。最終濃度典型地為3 x 10-8 M至4.6 x 10-12 M。將細胞在37℃下在加濕5% CO2孵育器中孵育4至5天。保留細胞的生存力通過比色WST-8測定來確定，如用於抗體測定所述，在多孔板讀取器(Dojindo Molecular Technologies,Inc.,Rockville,MD,US)中測量450 nm(A450)處的吸光度。%生存力通過使各處理的樣品值除以具有未處理的細胞的孔的平均至來計算。對於各處理在半-log圖中，%生存力值針對抗體-共軛物濃度繪製。
各種抗體的SMCC-DM1共軛物的體外細胞毒性
由各種抗-CD37抗體製備的SMCC-DM1共軛物的體外細胞毒性和非特異性huIgG-SMCC-DM1共軛物的活性進行比較。來自典型細胞毒性測試的結果示於圖24A中，這對於Daudi細胞和huCD37-3-SMCC-DM1,huCD37-38-SMCC-DM1,huCD37-50-SMCC-DM1,huCD37-51-SMCC-DM1,huCD37-56-SMCC-DM1,huCD37-57-SMCC-DM1或非結合huIgG1-SMCC-DM1對照共軛物孵育。和對照共軛物相比，所有特異性共軛物導致特異性細胞殺傷，並且在測試的最高抗體濃度下完全降低細胞生存力。EC50值分別對應於0.067 nM,0.098 nM,0.13 nM,0.20 nM,0.31 nM和0.35 nM(分別為huCD37-3,huCD37-38,huCD37-50,huCD37-51,huCD37-56和huCD37-57的SMCC-DM1共軛物)。相反，非結合同種型對照抗體的SMCC-DM1共軛物導致EC50值只有20 nM的細胞殺傷性。
同樣，圖24B示出使用Granta-519細胞的典型細胞毒性測試的結果，所述Granta-519細胞和huCD37-3-SMCC-DM1,huCD37-38-SMCC-DM1,huCD37-50-SMCC-DM1,huCD37-51-SMCC-DM1,或非結合huIgG1-SMCC-DM1對照共軛物孵育5天。在測試的最高抗體濃度下，使用所有特異性SMCC-DM1處理完全降低生存力，EC50為0.047 nM,0.074 nM,0.12 nM和0.25 nM(分別為huCD37-3,huCD37-38,huCD37-50和huCD37-51的SMCC-DM1共軛物)。相反，非結合同種型對照抗體的SMCC-DM1共軛物導致EC50值只有20 nM的細胞殺傷性。
huCD37-3-SMCC-DM1,-SPP-DM1和磺基-mal-DM4共軛物體外細胞毒性
huCD37-3-SMCC-DM1,-SPP-DM1和磺基-mal-DM4共軛物針對Daudi,Granta-519和BJAB細胞的體外細胞毒性和非特異性huIgG-MCC-DM1共軛物的活性進行比較。在測試的最高抗體濃度下，所有測試的共軛物完全降低Daudi細胞的生存力，EC50值為0.065 nM,0.12 nM和0.14 nM(分別為huCD37-3-SMCC-DM1,huCD37-3-SPP-DM1和huCD37-3-磺基-mal-DM4)。相反，非特異性huIgG-SMCC-DM1共軛物的EC50為19 nM。同樣，在測試的最高抗體濃度下，所有測試的共軛物完全降低Granta-519細胞的生存力，EC50值為0.047 nM,0.13 nM和0.088 nM(分別為huCD37-3-SMCC-DM1,huCD37-3-SPP-DM1和huCD37-3-磺基-mal-DM4)。相反，非特異性huIgG-SMCC-DM1共軛物的EC50為19 nM。最後，在測試的最高抗體濃度下，所有測試的共軛物完全降低BJAB細胞的生存力，EC50值為0.041 nM,0.11 nM和0.11 nM(分別為huCD37-3-SMCC-DM1,huCD37-3-SPP-DM1和huCD37-3-磺基-mal-DM4)。相反，非特異性huIgG-SMCC-DM1共軛物的EC50為16 nM。
huCD37-3-SMCC-DM1和huCD37-3-PEG4-mal-DM1共軛物體外細胞毒性
huCD37-3-SMCC-DM1和huCD37-3-PEG4-mal-DM1共軛物針對一組淋巴瘤細胞系的體外細胞毒性和非特異性huIgG-SMCC-DM1共軛物的活性進行比較。在測試的最高抗體濃度下，使用huCD37-3共軛物處理完全降低Daudi細胞的生存力，EC50為0.036 nM或0.018 nM(分別為huCD37-3-SMCC-DM1或huCD37-3-PEG4-mal-DM1共軛物)。相反，非結合同種型對照共軛物降低生存力，EC50為16 nM或大於30 nM(分別為huIgG-SMCC-DM1或huIgG-PEG4-mal-DM1)。同樣，在測試的最高抗體濃度下，使用huCD37-3共軛物處理完全降低Granta-519細胞的生存力，EC50為0.014 nM或0.012 nM(其分別為huCD37-3-SMCC-DM1或huCD37-3-PEG4-mal-DM1共軛物)。相反，非結合同種型對照共軛物降低生存力，EC50為6.5 nM或大於12 nM(分別為huIgG-SMCC-DM1或huIgG-PEG4-mal-DM1)。
huCD37-3-SMCC-DM1和huCD37-3-PEG4-mal-DM1共軛物針對一組淋巴瘤細胞系的體外細胞毒性和非特異性huIgG-SMCC-DM1共軛物的活性進行比較。在測試的最高抗體濃度下，使用huCD37-3共軛物處理完全降低BJAB細胞生存力，EC50為0.019 nM或0.010 nM(分別為huCD37-3-SMCC-DM1或huCD37-3-PEG4-mal-DM1共軛物)。相反，非結合同種型對照共軛物降低生存力，EC50為13 nM或17 nM(分別為huIgG-SMCC-DM1或huIgG-PEG4-mal-DM1)。同樣，在測試的最高抗體濃度下，使用huCD37-3共軛物處理完全降低SU-DHL-4細胞生存力，EC50為0.031 nM或0.024 nM(分別為huCD37-3-SMCC-DM1或huCD37-3-PEG4-mal-DM1共軛物)。相反，非結合同種型對照共軛物降低生存力，EC50為大於30 nM(對於huIgG-SMCC-DM1和huIgG-PEG4-mal-DM1)。huCD37-3-SMCC-DM1共軛物還顯示出針對FL細胞系DOHH-2以及CLL細胞系的效力，例如JVM-2和JVM-3(圖32B)。
在測試的最高抗體濃度下，使用huCD37-3共軛物處理完全降低Raji細胞生存力，EC50為0.071 nM或0.045 nM(分別為huCD37-3-SMCC-DM1或huCD37-3-PEG4-mal-DM1共軛物)。相反，非結合同種型對照共軛物降低生存力，EC50為24 nM或47 nM(分別為huIgG-SMCC-DM1或huIgG-PEG4-mal-DM1)。然後，相同共軛物在稱為Raji-VCR的長春新堿-耐性Raji克隆中進行測試。如對於親本Raji細胞所見，共軛物都顯示出特異性細胞殺傷性。在測試的最高抗體濃度下，使用huCD37-3共軛物處理完全降低Raji-VCR細胞生存力，EC50為0.11 nM或0.037 nM(分別為huCD37-3-SMCC-DM1或huCD37-3-PEG4-mal-DM1共軛物)。相反，非結合同種型對照共軛物降低生存力，EC50為46 nM或100 nM(分別為huIgG-SMCC-DM1或huIgG-PEG4-mal-DM1)。
在測試的最高抗體濃度下，使用huCD37-3共軛物處理完全降低Namalwa細胞生存力，EC50為0.033 nM或0.024 nM(分別為huCD37-3-SMCC-DM1或huCD37-3-PEG4-mal-DM1共軛物)。相反，非結合同種型對照共軛物降低生存力，EC50為20 nM或大於30 nM(分別為huIgG-SMCC-DM1或huIgG-PEG4-mal-DM1)。同樣，在測試的最高抗體濃度下，使用huCD37-3共軛物處理完全降低Ramos細胞生存力，EC50為0.16 nM或0.069 nM(分別為huCD37-3-SMCC-DM1或huCD37-3-PEG4-mal-DM1共軛物)。相反，非結合同種型對照共軛物降低生存力，EC50為20 nM(huIgG-SMCC-DM1)和大於30 nM(huIgG-PEG4-mal-DM1)。
huCD37-3-SMCC-DM1在抗原陰性Molt-4細胞上的體外細胞毒性
為了進一步證實huCD37-3-SMCC-DM1細胞毒性的特異性，其活性比得上非特異性huIgG-MCC-DM1共軛物針對非-CD37表達Molt-4T細胞急性成淋巴細胞性白血病細胞系的活性。增加濃度的共軛物用在該試驗中以捕獲相對較差非特異性細胞毒性。HuCD37-3-SMCC-DM1和非特異性共軛物顯示出相同細胞毒性，EC50分別為38 nM和42 nM。
抗-CD37抗體美登醇共軛物的體外細胞毒性的概述
將這些細胞毒性結果結合在一起，明顯的是，由分離的抗-CD37抗體製備的共軛物顯示出針對一組CD37-陽性淋巴瘤細胞系的特異性細胞毒性(圖32B)。在各測試的情況下，對於各CD37-表達細胞系觀察到良好特異性視窗，這表明細胞毒性是由於抗-CD37抗體特異性結合靶細胞。另外，huCD37-3-SMCC-DM1和非特異性共軛物顯示出針對抗原-陰性Molt-4細胞的相同較差細胞毒性。這證實，對於該示例性共軛物觀察到的細胞毒性取決於CD37表達。huCD37-3抗體針對多種細胞系也是活性的，包括DOHH-2,Granata-519,SU-DHL-4,JVM-2和JVM-3。相反，抗-CD37 SMIP TRU-016化合物對於這些細胞系中任一種的存活沒有直接的影響。抗-CD20抗體在大部分這些細胞系中顯示出比huCD37-3更不直接的活性，儘管經常通過定量流式細胞術測量更高的CD20的表達水準(圖32A)。
實施例17 抗-CD37抗體和它們的SMCC-DM1共軛物在BJAB異種移植物模型中的體內效力
抗-CD37抗體和它們SMCC-DM1共軛物在建立的異種移植物模型中使用皮下移植到SCID小鼠中的BJAB淋巴瘤細胞來測試。通過腫瘤體積將動物隨機分到治療組，此時腫瘤達到的平均腫瘤體積為約120 mm3並且在細胞以10 mg/kg的(A)huCD37-3 Ab,huCD37-3-SMCC-DM1,huCD37-50 Ab,huCD37-50-SMCC-DM1或(B)huCD37-38 Ab,huCD37-38-SMCC-DM1,huCD37-56 Ab,huCD37-56-SMCC-DM1接種後12天治療一次。在圖25中，不同治療組的平均腫瘤體積針對腫瘤細胞接種後的時間進行繪製。明顯的是，使用任意抗體的治療導致平均腫瘤體積中等減小，而使用任意SMCC-DM1共軛物的治療導致平均腫瘤體積更明顯的減小。另外，對於各治療計算%T/C值，其對應於各治療組的平均腫瘤體積除以載體治療組的平均腫瘤體積。%T/C值低於42%的治療被認為是活性的，而%T/C值低於12%的治療被認為是高度活性的。使用所有測試的SMCC-DM1共軛物的治療導致平均腫瘤體積明顯的減小。在細胞接種後29天的%T/C值對應於20%,20%,9%或4%(分別為huCD37-3-SMCC-DM1,huCD37-50-SMCC-DM1,huCD37-38-SMCC-DM1或huCD37-56-SMCC-DM1)。
huCD37-3抗體，磺基-mal-DM4，-SPP-DM1和SMCC-DM1共軛物在BJAB異種移植物模型中的體內效力
為了評價另外的美登醇共軛物的體內效力，示例性huCD37-3抗體的磺基-mal-DM4和SPP-DM1共軛物和SMCC-DM1共軛物在異種移植物模型中使用靜脈內移植到SCID小鼠中的BJAB淋巴瘤細胞來進行比較。
通過腫瘤體積將動物隨機分到治療組，此時腫瘤達到的平均腫瘤體積為約120 mm3並且在細胞以10 mg/kg的huCD37-3 Ab,huCD37-3-SMCC-DM1,huCD37-3-磺基-mal-DM4或5 mg/kg的huCD37-3-SPP-DM1接種後9天治療一次。在圖26中，不同治療組的平均腫瘤體積針對腫瘤細胞接種後的時間進行繪製。明顯的是，使用任意共軛物的治療導致平均腫瘤體積明顯減小。如上所述使用各治療組的平均腫瘤體積來計算對於各治療的%T/C值。在細胞接種後21天的%T/C值對應於49%,5%,7%或4%(分別為huCD37-3,huCD37-3-SMCC-DM1,huCD37-3-磺基-ma1-DM4或huCD37-3-SPP-DM1)。在121天研究結束時，huCD37-3-磺基-mal-DM4治療導致8個中3個無腫瘤存活者(TFS),而huCD37-3-SPP-DM1治療導致8個中1個TFS。在huCD37-3抗體,huCD37-3-SMCC-DM1或PBS載體對照組中未觀察到TFS。這表明huCD37-3抗體的美登醇共軛物例如SMCC-DM1,磺基-mal-DM4或SPP-DM1共軛物在BJAB模型中是高度活性的。
huCD37-3抗體，磺基-mal-DM4,-SPP-DM1和SMCC-DM1共軛物在SU-DHL-4異種移植物模型中的體內效力
使用皮下移植到SCID小鼠中的SU-DHL-4彌漫性大B-細胞淋巴瘤細胞，第二異種移植物模型用於評價示例性huCD37-3抗體的磺基-mal-DM4和SPP-DM1共軛物的體內效力和SMCC-DM1共軛物的情況的比較。通過體重將動物隨機分到治療組，此時腫瘤建立並且在細胞以10 mg/kg的huCD37-3Ab,huCD37-3-SMCC-DM1,huCD37-3-磺基-mal-DM4或5 mg/kg的huCD37-3-SPP-DM1接種的17天治療一次。在圖27中，不同治療組的平均腫瘤體積針對腫瘤細胞接種後的時間進行繪製。明顯的是，使用huCD37-3抗體的治療導致平均腫瘤體積減小，而使用任意共軛物的治療導致平均腫瘤體積更明顯的減小。如上所述計算對於各治療的%T/C值。在細胞接種後37天的%T/C值對應於32%,1%,1%或3%(分別為huCD37-3,huCD37-3-SMCC-DM1,huCD37-3-磺基-mal-DM4或huCD37-3-SPP-DM1)。在125天研究結束時，huCD37-3-SMCC-DM1或huCD37-3-磺基-mal-DM4治療導致10個中8個無腫瘤存活者(TFS)，huCD37-3-SPP-DM1治療導致10個中9個TFS。在huCD37-3抗體或PBS載體對照組中未觀察到TFS。這表明，huCD37-3抗體本身使用10 mg/kg劑量在SU-DHL-4模型中是活性的。另外，美登醇共軛物例如SMCC-DM1,磺基-mal-DM4或SPP-DM1共軛物增加抗體的效力，並且甚至在該模型中導致更大的效力。
huCD37-3抗體,PEG4-mal-DM1和SMCC-DM1共軛物在BJAB異種移植物模型中的體內效力
huCD37-3抗體和其PEG4-mal-DM1與SMCC-DM1共軛物在建立的異種移植物模型中使用皮下移植到SCID小鼠中的BJAB淋巴瘤細胞來測試。通過腫瘤體積將動物隨機分到治療組，此時腫瘤達到的平均腫瘤體積為約120 mm3並且在細胞以10 mg/kg的huCD37-3 Ab,huCD37-3-SMCC-DM1或huCD37-3-PEG4-mal-DM1接種後9天治療一次。如圖28中可見，使用共軛物的治療導致平均腫瘤體積更明顯的減小。如上所述使用各治療組的平均腫瘤體積來計算對於各治療的%T/C值。在細胞接種後24天的%T/C值對應於48%,16%或5%(分別為huCD37-3,huCD37-3-SMCC-DM1或huCD37-3-PEG4-mal-DM1)。在細胞接種後74天，huCD37-3-SMCC-DM1處理導致9個中1個無腫瘤存活者(TFS)，而huCD37-PEG4-mal-DM1治療導致9個中1個TFS。在huCD37-3抗體或PBS載體對照組中未觀察到TFS。另外，huCD37-3-SMCC-DM1在以5 mg/kg的單劑量在該模型中在細胞接種後24天的%T/C值為34%，這也是活性的。這表明，huCD37-3抗體的美登醇共軛物，例如SMCC-DM1或PEG4-mal-DM1共軛物，在BJAB模型中具有較高活性。
huCD37-3抗體,PEG4-mal-DM1和SMCC-DM1共軛物在SU-DHL-4異種移植物模型中的體內效力
使用皮下移植到SCID小鼠中的SU-DHL-4彌漫性大B-細胞淋巴瘤細胞，建立的異種移植物模型用於測試huCD37-3抗體和其PEG4-mal-DM1與SMCC-DM1共軛物。通過體重將動物隨機分到治療組，並且在細胞以10 mg/kg的huCD37-3 Ab，huCD37-3-SMCC-DM1或huCD37-3-PEG4-mal-DM1接種的15天治療一次。在圖29中，不同治療組的平均腫瘤體積針對腫瘤細胞接種後的時間進行繪製。明顯的是，使用huCD37-3抗體的治療導致平均腫瘤體積減小，而使用共軛物的治療導致平均腫瘤體積更明顯的減小。如上所述使用各治療組的平均腫瘤體積來計算對於各治療的%T/C值。在細胞接種後38天的%T/C值對應於34%,4%或2%(分別為huCD37-3,huCD37-3-SMCC-DM1,或huCD37-3-PEG4-mal-DM1)。在細胞接種後74天，huCD37-3-SMCC-DM1處理導致10個中8個無腫瘤存活者(TFS)，而huCD37-3-PEG4-mal-DM1治療導致10個中10個TFS。在huCD37-3抗體或PBS載體對照組中未觀察到TFS。這表明，huCD37-3抗體本身使用10 mg/kg劑量在SU-DHL-4模型中是活性的。另外，美登醇共軛物例如SMCC-DM1或PEG4-mal-DM1共軛物和未綴合的抗體效力相比顯示出增強的效力，並且在該模型中導致甚至更強的效力。huCD37-3-SMCC-DM1共軛物在2.5或5 mg/kg的單劑量在該模型中也顯示出強烈效力，在細胞接種後37天的%T/C值分別為18%和6%。
huCD37-3抗體,huCD37-3-SMCC-DM1共軛物，利妥昔單抗抗體與環磷醯胺，長春新堿和潑尼松(CVP)的方案在DoHH2異種移植物模型中的體內效力
使用皮下移植到SCID小鼠中的DoHH2濾泡性淋巴瘤細胞，建立的異種移植物模型用於測試huCD37-3抗體和其SMCC-DM1共軛物。通過腫瘤體積將動物隨機分到治療組，在接種後12天以單劑量10 mg/kg的huCD37-3抗體或huCD37-3-SMCC-DM1共軛物；六劑量的2 mg/kg的利妥昔單抗每週兩次，三周；或使用單40 mg/kg劑量的環磷醯胺和0.5 mg/kg的長春新堿，以及5個每日0.2 mg/kg劑量的潑尼松(CVP)的方法開始治療。在圖30中，不同治療組的平均腫瘤體積針對腫瘤細胞接種後的時間進行繪製。使用huCD37-3抗體治療導致平均腫瘤體積減小，而使用huCD37-3-SMCC-DM1共軛物治療導致平均腫瘤體積更明顯減小。huCD37-3-SMCC-DM1共軛物導致平均腫瘤減小類似於使用利妥昔單抗處理的情況，並且和使用CVP治療相比，是更耐久性的平均腫瘤減小。腫瘤生長延遲(T-C值)定義為治療組(T)和對照組(C)腫瘤達到預定尺寸所要求的平均時間(天)，並且對於各治療組計算以排除無腫瘤存活者。平均治療腫瘤達到800 mm3的T-C值對應於8,25,24和13天(分別為huCD37-3,huCD37-3-SMCC-DM1,利妥昔單抗和CVP)。在研究結束時，在細胞接種後130天，huCD37-3-SMCC-DM1治療導致9個中1個無腫瘤存活者(TFS)。在huCD37-3抗體，利妥昔單抗,CVP或PBS載體對照組中未觀察到TFS。SMCC-DM1共軛物相比於利妥昔單抗顯示出可比較的腫瘤生長延遲，相比於未綴合的抗體和使用CVP在DoHH2模型中治療的情況顯示出增強的腫瘤生長延遲。
huCD37-3抗體，huCD37-3-SMCC-DM1共軛物，ofatumumab抗體和苯達莫司汀在JVM-3異種移植物模型中的體內效力
使用皮下移植到SCID小鼠中的JVM-3慢性淋巴細胞性白血病細胞，建立的異種移植物模型用於測試huCD37-3抗體和其huCD37-3-SMCC-DM1共軛物。通過腫瘤體積將動物隨機分到治療組，在接種後7天以單劑量10 mg/kg的huCD37-3抗體，5或10 mg/kg劑量的huCD37-3-SMCC-DM1共軛物，六劑量的5 mg/kg的ofatumumab每週兩次，三周；或使用單50 mg/kg劑量的苯達莫司汀開始治療。在圖31中，不同治療組的平均腫瘤體積針對腫瘤細胞接種後的時間進行繪製。使用huCD37-3抗體治療導致平均腫瘤體積減小，而使用huCD37-3-SMCC-DM1共軛物治療導致平均腫瘤體積更明顯減小。如上所述使用各治療組的平均腫瘤體積來計算對於各治療的%T/C值。在細胞接種後20天的%T/C值對應於31%,19%,10%,35%和38%(分別為huCD37-3,5 mg/kg huCD37-3-SMCC-DM1,10 mg/kg huCD37-3-SMCC-DM1,ofatumumab和苯達莫司汀)。在研究結束時，在細胞接種後76天，huCD37和ofatumumab抗體治療都導致10個中1個無腫瘤存活者(TFS)，而5和10 mg/kg的huCD37-3-SMCC-DM1分別導致10個中1個TFS和10個中2個TFS。在苯達莫司汀或PBS載體對照組中未觀察到TFS。這表明，huCD37-3抗體本身使用10 mg/kg劑量在JVM-3模型中是活性的。美登醇共軛物huCD37-3-SMCC-DM1和未綴合的抗體效力相比顯示出增強的效力。另外，使用huCD37-3-SMCC-DM1美登醇共軛物治療導致比ofatumumab或苯達莫司汀治療在該模型中甚至更大的效力。
抗-CD37抗體共軛物的體內效力的概述
CD37仍未被評價為美登醇免疫共軛物的靶，然而CD20是這樣的情況。CD37結構類似CD20，因為兩種抗原都是細胞表面蛋白，其含有4個跨膜域以及一個小和一個大的胞外環。針對任一種抗原的抗體顯示出緩慢內化，並且具有慢至中等速度的細胞內代謝(Press et al. 1989,Cancer Res. 49(17):4906-12,and Press et al. 1994,Blood. 83(5):1390-7)。CD20抗體的免疫共軛物之前被評價。在一個情況下，抗-CD20抗體的非可裂解MCC-DM1共軛物顯示出和未綴合的抗體的相同的效力，而相同抗體的可裂解SPP-DM1共軛物顯示出在SCID小鼠中的Granta-519異種移植物模型中改善的效力(Polson AG,Cancer Res 2009;69:2358-64)。類似地，由酸穩定醯胺接頭製備的利妥昔單抗的卡奇黴素共軛物在裸小鼠中的Ramos異種移植物模型中不顯示出改善的體內效力。只有由酸穩定二甲基醯肼Ac-But接頭製備的利妥昔單抗的卡奇黴素共軛物在該研究中顯示出改善的體內效力(DiJoseph JF,Cancer Immunol Immunotherapy 2007;56:1107-1117)。
截然不同的是，和未綴合的抗體相比，本發明的數種分離的抗-CD37抗體的非可裂解SMCC-DM1共軛物在BJAB,SU-DHL-4,DoHH2 and JVM-3異種移植物模型中顯示出顯著改善的體內效力。這暗示，分離的抗體具有獨特的性能，其允許它們體內更有效地作為美登醇共軛物例如SMCC-DM1共軛物。
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應意識到，發明詳述章節並非發明概述和摘要章節，旨在用於解釋權利要求書。如本發明人所思考的，發明概述和摘要章節闡述本發明的一個或多個、但非全部示例性實施方案，並因此不旨在以任何方式限制本發明和所附權利要求書。
上面借助示出實施特定功能及其關係的功能性構造塊來描述了本發明。為了方便描述，這些功能性構造塊的邊界在本文中任意地限定。可以限定替換的邊界，只要合適地進行特定的功能及其關係即可。
特定實施方案的前面描述將完全揭示本發明的通常本質，使得通過施用本領域內的知識，在不進行過度的試驗的情況下，其他人可容易地修飾和/或適於多種應用這些特定實施方案，而不偏離本發明的通常概念。因此，基於本文中展現的教導和指導，這些修飾和施用旨在公開的實施方案的等同形式的意思和範圍內。應該理解，本文中的措辭或屬於是為了描述的目的而非限制目的的，使得本說明書的術語或措辭由本領域技術人員依照所述教導和指導來解釋。
本發明的寬度和範圍不應該被上述示例性實施方案中的任一種所限制，而應該僅依照所附權利要求書和它們的等同形式來限定。
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<222> (3)..(3)
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<221> MISC_特徵
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<223> 其中Xaa是Gly或Ser
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<221> MISC_特徵
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<221> MISC_特徵
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<221> MISC_特徵
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<222> (4)..(4)
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<221> MISC_特徵
<222> (6)..(6)
<223> 其中Xaa是Ala或Pro
<220>
<221> MISC_特徵
<222> (7)..(7)
<223> 其中Xaa是Ser或Tyr
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<220>
<221> MISC_特徵
<222> (4)..(4)
<223> 其中Xaa是Ile或Ser
<220>
<221> MISC_特徵
<222> (5)..(5)
<223> 其中Xaa是Ser或Asp
<220>
<221> MISC_特徵
<222> (6)..(6)
<223> 其中Xaa是Asn或Asp
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<210> 55
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<212> PRT
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<220>
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<212> PRT
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<220>
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<212> PRT
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<212> PRT
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<212> PRT
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 可變重鏈多核？酸序列；muCD37-57抗體
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<211> 446
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 可變重鏈多核？酸序列；huCD37-57抗體
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<211> 324
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 可變輕鏈多核？酸序列；muCD37-3抗體
<400> 136
<210> 137
<211> 399
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 可變輕鏈多核？酸序列；chCD37-3抗體
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<210> 138
<211> 396
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 可變輕鏈多核？酸序列；huCD37-3v1.0和huCD37-3v1.1抗體
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 可變輕鏈多核？酸序列；muCD37-12抗體
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 可變輕鏈多核？酸序列；chCD37-12抗體
<400> 140
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<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 可變輕鏈多核？酸序列；muCD37-38抗體
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<211> 393
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 可變輕鏈多核？酸序列；chCD37-38抗體
<400> 142
<210> 143
<211> 393
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 可變輕鏈多核？酸序列；huCD37-38抗體
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<220>
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<220>
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<220>
<223> 可變輕鏈多核？酸序列；huCD37-57抗體
<400> 151
<210> 152
<211> 1410
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 全長重鏈多核？酸序列；chCD37-3抗體
<400> 152
<210> 153
<211> 1410
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 全長重鏈多核？酸序列；huCD37-3v1.0抗體
<400> 153
<210> 154
<211> 1410
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 全長重鏈多核？酸序列；huCD37-3v1.1抗體
<400> 154
<210> 155
<211> 1410
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 全長重鏈多核？酸序列；chCD37-12抗體
<400> 155
<210> 156
<211> 1425
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 全長重鏈多核？酸序列；chCD37-38抗體
<400> 156
<210> 157
<211> 1425
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 全長重鏈多核？酸序列；huCD37-38抗體
<400> 157
<210> 158
<211> 1425
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 全長重鏈多核？酸序列；huCD37-50抗體
<400> 158
<210> 159
<211> 1425
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 全長重鏈多核？酸序列；huCD37-51抗體
<400> 159
<210> 160
<211> 1425
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 全長重鏈多核？酸序列；huCD37-56抗體
<400> 160
<210> 161
<211> 1425
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 全長重鏈多核？酸序列；huCD37-57抗體
<400> 161
<210> 162
<211> 717
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 全長輕鏈多核？酸序列；chCD37-3抗體
<400> 162
<210> 163
<211> 714
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 全長輕鏈多核？酸序列；huCD37-3v1.0和huCD37-3v1.1抗體
<400> 163
<210> 164
<211> 726
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 全長輕鏈多核？酸序列；chCD37-12抗體
<400> 164
<210> 165
<211> 711
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 全長輕鏈多核？酸序列；chCD37-38抗體
<400> 165
<210> 166
<211> 711
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 全長輕鏈多核？酸序列；huCD37-38抗體
<400> 166
<210> 167
<211> 711
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 全長輕鏈多核？酸序列；huCD37-50抗體
<400> 167
<210> 168
<211> 711
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 全長輕鏈多核？酸序列；huCD37-51抗體
<400> 168
<210> 169
<211> 711
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 全長輕鏈多核？酸序列；huCD37-56抗體
<400> 169
<210> 170
<211> 711
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 全長輕鏈多核？酸序列；huCD37-57抗體
<400> 170
<210> 171
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 簡併引子EcoMH1
<220>
<221> misc_特徵
<222> (13)..(13)
<223> s是g或c
<220>
<221> misc_特徵
<222> (15)..(15)
<223> r是a或g
<220>
<221> misc_特徵
<222> (18)..(18)
<223> n是g,a,t或c
<220>
<221> misc_特徵
<222> (19)..(19)
<223> m是a或c
<220>
<221> misc_特徵
<222> (25)..(25)
<223> s是g或c
<220>
<221> misc_特徵
<222> (28)..(28)
<223> s是g或c
<400> 171
<210> 172
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 簡併引子EcoMH2
<220>
<221> misc_特徵
<222> (13)..(13)
<223> s是g或c
<220>
<221> misc_特徵
<222> (15)..(15)
<223> r是a或g
<220>
<221> misc_特徵
<222> (18)..(18)
<223> n是g,a,t或c
<220>
<221> misc_特徵
<222> (19)..(19)
<223> m是a或c
<220>
<221> misc_特徵
<222> (25)..(25)
<223> s是g或c
<220>
<221> misc_特徵
<222> (28)..(28)
<223> s是g或c
<220>
<221> misc_特徵
<222> (33)..(33)
<223> w是a或t
<400> 172
<210> 173
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 簡併引子BamIgG1
<400> 173
<210> 174
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 簡併引子SacIMK
<220>
<221> misc_特徵
<222> (10)..(10)
<223> y是c或t
<220>
<221> misc_特徵
<222> (17)..(17)
<223> m是a或c
<220>
<221> misc_特徵
<222> (19)..(19)
<223> s是g或c
<220>
<221> misc_特徵
<222> (22)..(22)
<223> m是a或c
<220>
<221> misc_特徵
<222> (25)..(25)
<223> r是a或g
<220>
<221> misc_特徵
<222> (26)..(26)
<223> w是a或t
<220>
<221> misc_特徵
<222> (28)..(28)
<223> m是a或c
<400> 174
<210> 175
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 簡併引子HindKL
<400> 175
<210> 176
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Kabat定義的CD37-3 HC CDR2用於鼠
<220>
<221> MISC_特徵
<222> (10)..(16)
<223> Kabat重鏈CDR2部分未被認為是CDR用於再表面化
<400> 176
<210> 177
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Kabat定義的CD37-3 HC CDR2用於人
<220>
<221> MISC_特徵
<222> (10)..(16)
<223> Kabat重鏈CDR2部分未被認為是CDR用於再表面化
<400> 177
<210> 178
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Kabat定義的CD37-50 HC CDR2用於鼠
<220>
<221> MISC_特徵
<222> (10)..(16)
<223> Kabat重鏈CDR2部分未被認為是CDR用於再表面化
<400> 178
<210> 179
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Kabat定義的CD37-50 HC CDR2用於人
<220>
<221> MISC_特徵
<222> (10)..(16)
<223> Kabat重鏈CDR2部分未被認為是CDR用於再表面化
<400> 179
<210> 180
<211> 281
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hCD37-M1
<400> 180
<210> 181
<211> 281
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hCD37-M2
<400> 181
<210> 182
<211> 281
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hCD37-M3
<400> 182
<210> 183
<211> 281
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hCD37-M45
<400> 183
<210> 184
<211> 128
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> muCD37-R176
<400> 184
<210> 185
<211> 280
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hCD37mECD-H1
<400> 185
<210> 186
<211> 281
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hCD37mECD-H2
<400> 186
<210> 187
<211> 281
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hCD37mECD-H3
<400> 187
<210> 188
<211> 281
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hCD37mECD-H4
<400> 188
<210> 189
<211> 281
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hCD37mECD-H5
<400> 189
<210> 190
<211> 281
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hCD37mECD-H45
<400> 190
<210> 191
<211> 281
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hCD37-Mac12
<400> 191
<210> 192
<211> 281
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hCD37-Mac4
<400> 192
<210> 193
<211> 281
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hCD37-Mac5
<400> 193
<210> 194
<211> 280
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hCD37-Mac45
<400> 194
<210> 195
<211> 446
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 可變重鏈多核？酸序列；huCD37-50抗體
<400> 195
<210> 196
<211> 446
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 可變重鏈多核？酸序列；huCD37-51抗體
<400> 196
<210> 197
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 可變重鏈胺基酸序列；muCD37-50抗體
<400> 197
<210> 198
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 可變輕鏈胺基酸序列；huCD37-3v1.0和huCD37-3v1.1抗體
<400> 198
圖1描述了結合非轉染300-19對照細胞(左小圖)和表達CD37的300-19細胞(右小圖)的抗體的柱狀圖。顯示了使用10 nM muCD37-3、muCD37-12、muCD37-38染色以及缺乏初級抗體的柱狀圖。
圖2描述了結合非轉染300-19對照細胞(左小圖)和表達CD37的300-19細胞(右小圖)的抗體的柱狀圖。顯示了使用10 nM muCD37-50、muCD37-51、muCD37-56以及muCD37-57染色的柱狀圖。
圖3描述了通過流式細胞術測定的(A)muCD37-3和muCD37-12以及(B)muCD37-8、muCD37-10以及muCD37-14與WSU-DLCL-2細胞的結合。對於各抗體濃度描繪了平均螢光強度(MFI)。結合曲線用於確定抗體結合的EC50，這與各抗體的表觀Kd對應。
圖4描述了來自膜聯蛋白-V測定的結果，對於使用10 nM濃度的(A)利妥昔單抗、muCD37-3、muCD37-8、muCD37-10、muCD37-12或muCD37-14和(B)利妥昔單抗、huCD37-3、muCD37-38、muCD37-50、muCD37-51、muCD37-56或muCD37-57孵育的Ramos淋巴瘤細胞測量細胞凋亡的誘導。缺乏抗體(無Ab)的情況下未處理的細胞的對照樣品用於對照。
圖5描述了來自WST-8增殖測定的結果，該測定是對於使用不同濃度的muCD37-3、muCD37-38、muCD37-50、muCD37-51以及muCD37-16抗體孵育的SU-DHL-4淋巴瘤細胞進行的。
圖6描述了(A)CD37-3 VL和(B)CD37-3 VH的一系列CD37-3表面殘基和再表面化形式的取代。
圖7描述了(A)CD37-50 VL和(B)CD37-50 VH的一系列CD37-3表面殘基和再表面化形式的取代。
圖8描述了CD37-3和CD37-50可變區的再表面化序列與其鼠相對物的比對：A)CD37-3輕鏈可變區結構域；B)CD37-3重鏈可變區結構域。C)CD37-50輕鏈可變區結構域；D)CD37-50重鏈可變區結構域。破折號“-”表示與鼠序列的同一性。
圖9描述了(A)通過細胞流式計量術測定的muCD37-3、chCD37-3、muCD37-12以及chCD37-12與Ramos細胞的直接結合測定，和(B)在2 nM濃度的muCD37-3-PE共軛物存在的情況下使用muCD37-3、chCD37-3、huCD37-3v1.0以及huCD37-3v1.01與BJAB細胞的競爭性結合測定。
圖10描述了通過流式細胞術測定的抗CD37抗體與表達獼猴CD37抗原的結合：(A)muCD37-3、muCD37-12、muCD37-38、muCD37-50、muCD37-51、muCD37-56、muCD37-57、WR17以及TRU-016的結合和(B)huCD37-3、huCD37-38、huCD37-50、huCD37-51、huCD37-56以及huCD37-57的結合。結合曲線用於確定抗體結合的EC50，這與各抗體的表觀Kd對應。
圖11描述了來自膜聯蛋白-V測定的結果，對使用不同濃度的(A)huCD37-3、huCD37-38、huCD37-50和(B)huCD37-51、huCD37-56、huCD36-57以及利妥昔單抗孵育的Ramos淋巴瘤細胞測量細胞凋亡的誘導。使用人的IgG1同種型對照抗體(huIgG對照)處理的細胞對照樣品用於對照。
圖12描述了來自WST-8增殖測定的結果，該測定是對於使用不同濃度的muCD37-3、chCD37-3、huCD37-3v1.0以及huCD37-3v1.01抗體經5天孵育(A)SU-DHL-4和(B)DOHH-2淋巴瘤細胞進行的。
圖13描述了來自WST-8增殖測定的結果，該測定是對於使用不同濃度的huCD37-3、TRU-016或利妥昔單抗抗體經5天孵育(A)Granta-519和(B)SU-DHL-4淋巴瘤細胞進行的。
圖14描述了來自對於Ramos淋巴瘤細胞進行的CDC測定的結果，所述Ramos淋巴瘤細胞使用(A)huCD37-3、huCD37-38、chCD37-12或huIgG1同種型對照抗體和(B)huCD37-38、huCD37-50、huCD37-51、huCD37-56、huCD37-57、chCD37-12或huIgG1同種型對照抗體孵育。
圖15描述來自對於Daudi淋巴瘤細胞進行的ADCC測定的結果，所述Daudi淋巴瘤細胞在作為效應細胞的純化的人NK細胞的存在的情況下使用(A)huCD37-3、huCD37-38、huCD37-50、TRU-016以及(B)huCD37-51、huCD37-56、huCD37-57、TRU-016或人IgG1同種型對照抗體孵育。
圖16描述了全長達鼠、人以及獼猴CD37胺基酸序列的比對。破折號“-”表示與鼠序列的同一性。使用下劃線標記小和大的細胞外結構域。
圖17描述了人、重組以及野生型鼠、獼猴以及嵌合CD37序列的大的細胞外結構域的比對。破折號“-”表示與人序列的同一性。給出了工程化限制性酶切位元點的位置並在受影響的殘基作下劃線。
圖18描述了一組CD37抗體與使用(A)人CD37野生型和(B)hCD37-M3變體轉染的細胞的結合，這通過使用1.5 μg/mL的各抗體的流式細胞術來測定。
圖19描述了一組CD37抗體與使用(A)hCD37-M1變體和(B)hCD37-M45變體轉染的細胞的結合，這通過使用1.5 μg/mL的各抗體的流式細胞術來測定。
圖20描述了通過流式細胞術測定的(A)huCD37-3與huCD37-3-SMCC-DM1 huCD37-3-SPP-DM1和huCD37-3-磺基-mal-DM4比較以及(B)huCD37-38與huCD37-38-SMCC-DM1比較的與BJAB細胞的結合。結合曲線用於確定抗體或共軛物結合的EC50，這與各抗體的表觀Kd對應。
圖21描述了(A)測定細胞凋亡的誘導的膜聯蛋白-V測定的結果和(B)來自CDC測定的結果。測定是對於使用不同濃度的huCD37-3、huCD37-3-SMCC-DM1、huIgG1對照抗體、huIgG1-SMCC-DM1對照共軛物或利妥昔單抗孵育的Ramos淋巴瘤細胞進行的。在作為補體來源的5%人血清存在的情況下進行CDC測定。
圖22描述了來自ADCC測定的結果，該測定是在作為效應細胞的純化的NK細胞存在的情況下對於(A)使用huCD37-3、huCD37-3-SMCC-DM1、huCD37-3-PEG4-mal-DM1、TRU-016或huIgG1同種型對照抗體孵育的Daudi淋巴瘤細胞和(B)使用huCD37-3、huCD37-3-SMCC-DM1、huCD37-3-PEG4-mal-DM1或huIgG1同種型對照抗體孵育的Ramos淋巴瘤細胞進行的。
圖23描述了細胞週期分析的結果，該分析使用對於使用10nM濃度的huCD37-3、huCD37-3-SMCC-DM1或非結合的huIgG1-SMCC-DM1對照共軛物孵育20小時的(A)BJAB細胞和(B)RL細胞來碘吡啶染色進行的。
圖24描述了來自WST-8細胞毒性測定的結果，該測定是對於(A)使用3×10-8M至1×10-11M濃度範圍的huCD37-3-SMCC-DM1、huCD37-38-SMCC-DM1、huCD37-50-SMCC-DM1、huCD37-51-SMCC-DM1、huCD37-56-SMCC-DM1、huCD37-57-SMCC-DM1經5天孵育的Daudi細胞和(B)使用3×10-8M至1×10-11M濃度範圍的huCD37-3-SMCC-DM1、huCD37-38-SMCC-DM1、huCD37-50-SMCC-DM1、huCD37-51-SMCC-DM1或非結合的huIgG1-SMCC-DM1對照共軛物經5天孵育的Granta-519細胞進行的。
圖25描述了使用BJAB淋巴瘤細胞皮下移植至SCID小 鼠建立的異種移植物模型的結果。在細胞接種後第12天使用10mg/kg(A)huCD37-3 Ab、huCD37-3-SMCC-DM1、huCD37-50 Ab、huCD37-50-SMCC-DM1或(B)huCD37-38 Ab、huCD37-38-SMCC-DM1、huCD37-56 Ab、huCD37-56-SMCC-DM1處理動物一次。針對腫瘤細胞接種後的時間來對不同處理組的平均腫瘤體積進行繪製。
圖26描述了來自使用BJAB淋巴瘤細胞皮下移植至SCID小鼠建立的異種移植物研究的結果。在細胞接種後第9天使用10mg/kg huCD37-3 Ab、huCD37-3-SMCC-DM1、huCD37-3-磺基-mal-DM4或5mg/kg huCD37-3-SPP-DM1處理動物一次。針對腫瘤細胞接種後的時間來對不同處理組的平均腫瘤體積進行繪製。
圖27描述了來自使用SU-DHL-4彌漫性大B細胞淋巴瘤皮下移植至SCID小鼠建立的異種移植物模型的結果。在細胞接種後第17天使用10mg/kg huCD37-3 Ab、huCD37-3-SMCC-DM1、huCD37-3-磺基-mal-DM4或5mg/kg huCD37-3-SPP-DM1處理動物一次。針對腫瘤細胞接種後的時間來對不同處理組的平均腫瘤體積進行繪製。
圖28描述了使用BJAB淋巴瘤細胞皮下移植至SCID小鼠建立的異種移植物模型的結果。在細胞接種後第9天使用10mg/kg of huCD37-3 Ab、huCD37-3-SMCC-DM1或huCD37-3-PEG4-mal-DM1處理動物一次。針對腫瘤細胞接種後的時間來對不同處理組的平均腫瘤體積進行繪製。
圖29描述了來自使用SU-DHL-4彌漫性大B細胞淋巴瘤皮下移植至SCID小鼠建立的異種移植物模型的結果。在細胞接種後第15天使用10 mg/kg huCD37-3 Ab、huCD37-3-SMCC-DM1或huCD37-3-PEG4-mal-DM1處理動物一次。針對腫瘤細胞接種後的時間來對不同處理組的平均腫瘤體積進行繪製。
圖30描述了使用DoHH2濾泡B細胞淋巴瘤細胞皮下移植至SCID小鼠建立的異種移植物模型的測定結果。在接種後第12天開始處理動物，(i)單劑量的10 mg/kg huCD37-3抗體，(ii)單劑量的10 mg/kg huCD37-3-SMCC-DM1共軛物，(iii)六個劑量的2 mg/kg利妥昔單抗，每週兩次，持續3周，(iv)單劑量的40 mg/kg環磷醯胺和0.5 mg/kg長春新堿的方案，連同每天一次五個劑量的0.2 mg/kg潑尼松(CVP)，或(v)載體對照。針對腫瘤細胞接種後的時間來對不同處理組的平均腫瘤體積進行繪製。
圖31描述了使用JVM3 CLL細胞皮下移植至SCID小鼠建立的異種移植物模型的測定結果。在接種後第7開始處理動物，(i)單劑量的10 mg/kg huCD37-3抗體，(ii)5 mg/kg劑量的huCD37-3-SMCC-DM1共軛物，(iii)10 mg/kg劑量的huCD37-3-SMCC-DM1共軛物，(iv)六個劑量的5 mg/kg的ofatumumab，一周兩次，持續三周，(v)單劑量50 mg/kg的苯達莫司汀或(vi)載體對照。針對腫瘤細胞接種後的時間來對不同處理組的平均腫瘤體積進行繪製。
圖32描述了在不同NHL和CLL腫瘤細胞系中測量的CD37和CD20表達水準(A)和在這些細胞系中測量的huCD37-3-SMCC-DM1的體外細胞毒性(B)。

Claims (31)

  1. 一種特異性結合CD37之經純化的人源化抗體或其抗原結合片段，其中所述抗體或其片段包含重鏈可變區和輕鏈可變區，且其中該抗體或其片段包含選自下述之多肽序列：(a)分別示於SEQ ID NO：4、5及6之重鏈可變區CDR1、CDR2及CDR3序列和分別示於SEQ ID NO：28、29及30之輕鏈可變區CDR1、CDR2及CDR3序列；(b)分別示於SEQ ID NO：10、11及12之重鏈可變區CDR1、CDR2及CDR3序列和分別示於SEQ ID NO：34、35及36之輕鏈可變區CDR1、CDR2及CDR3序列；(c)分別示於SEQ ID NO：13、14及15之重鏈可變區CDR1、CDR2及CDR3序列和分別示於SEQ ID NO：37、40及39之輕鏈可變區CDR1、CDR2及CDR3序列；(d)分別示於SEQ ID NO：16、17及18之重鏈可變區CDR1、CDR2及CDR3序列和分別示於SEQ ID NO：41、42及43之輕鏈可變區CDR1、CDR2及CDR3序列；(e)分別示於SEQ ID NO：19、20及21之重鏈可變區CDR1、CDR2及CDR3序列和分別示於SEQ ID NO：44、47及46之輕鏈可變區CDR1、CDR2及CDR3序列；及(f)分別示於SEQ ID NO：22、23及24之重鏈可變區CDR1、CDR2及CDR3序列和分別示於SEQ ID NO：48、51及50之輕鏈可變區CDR1、CDR2及CDR3序列。
  2. 如申請專利範圍第1項的抗體或其抗原結合片段，其中所述抗體或抗原結合片段能夠誘導抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(ADCC)。
  3. 如申請專利範圍第1項的抗體或其抗原結合片段，其中所述抗體或片段包含重鏈可變區序列和輕鏈可變區序列，該重鏈可變區序列和輕鏈可變區序列與選自下述的多肽序列具有至少90%、95%或99%同一性：(a)示於SEQ ID NO：57之重鏈可變區序列和示於SEQ ID NO：198之輕鏈可變區序列；(b)示於SEQ ID NO：58之重鏈可變區序列和示於SEQ ID NO：198之輕鏈可變區序列；(c)示於SEQ ID NO：63之重鏈可變區序列和示於SEQ ID NO：79之輕鏈可變區序列；(d)示於SEQ ID NO：65之重鏈可變區序列和示於SEQ ID NO：81之輕鏈可變區序列；(e)示於SEQ ID NO：67之重鏈可變區序列和示於SEQ ID NO：83之輕鏈可變區序列；(f)示於SEQ ID NO：69之重鏈可變區序列和示於SEQ ID NO：85之輕鏈可變區序列；及(g)示於SEQ ID NO：71之重鏈可變區序列和示於SEQ ID NO：87之輕鏈可變區序列。
  4. 如申請專利範圍第3項的抗體或其抗原結合片段，其中所述抗體或片段包含選自下述之多肽序列：(a)示於SEQ ID NO：57之重鏈可變區序列和示於 SEQ ID NO：198之輕鏈可變區序列；(b)示於SEQ ID NO：58之重鏈可變區序列和示於SEQ ID NO：198之輕鏈可變區序列；(c)示於SEQ ID NO：63之重鏈可變區序列和示於SEQ ID NO：79之輕鏈可變區序列；(d)示於SEQ ID NO：65之重鏈可變區序列和示於SEQ ID NO：81之輕鏈可變區序列；(e)示於SEQ ID NO：67之重鏈可變區序列和示於SEQ ID NO：83之輕鏈可變區序列；(f)示於SEQ ID NO：69之重鏈可變區序列和示於SEQ ID NO：85之輕鏈可變區序列；及(g)示於SEQ ID NO：71之重鏈可變區序列和示於SEQ ID NO：87之輕鏈可變區序列。
  5. 如申請專利範圍第1項的抗體或其抗原結合片段，其中所述抗體或其抗原結合片段係經再表面化。
  6. 如申請專利範圍第1項的抗體或其抗原結合片段，其中所述抗體結合人CD37和獼猴CD37。
  7. 如申請專利範圍第6項的抗體或其抗原結合片段，其中所述抗體或其抗原結合片段係經再表面化。
  8. 如申請專利範圍第1項的抗體或其抗原結合片段，其中所述抗體或其抗原結合片段包含全長抗體、Fab、Fab'、F(ab')2、單鏈Fv或scFv、二硫鍵連接的Fv、細胞內抗體、IgG△CH2、小抗體、F(ab')3、四鏈抗體、三鏈抗體、雙鏈抗體、DVD-Ig、mAb2、(scFv)2或 scFv-Fc。
  9. 如申請專利範圍第8項的抗體或其抗原結合片段，其中所述抗體或其抗原結合片段係經再表面化。
  10. 一種具有式(A)-(L)-(C)的免疫共軛物，其中：(A)是如申請專利範圍第1至9項中任一項的抗體或其抗原結合片段；(L)是連接子；且(C)是細胞毒性劑；且其中所述連接子(L)連接(A)與(C)。
  11. 如申請專利範圍第10項的免疫共軛物，其中該(A)係經再表面化。
  12. 如申請專利範圍第10項的免疫共軛物，其還包含2、3、4、2至6或3至4個(C)。
  13. 如申請專利範圍第10項的免疫共軛物，其中所述連接子選自：可切割之連接子、非可切割之連接子、親水性連接子、基於二羧酸的連接子、4-(2-吡啶基二硫基)戊酸N-琥珀醯亞胺酯(SPP)、4-(2-吡啶基二硫基)丁酸N-琥珀醯亞胺酯(SPDB)、4-(2-吡啶基二硫基)-2-磺酸基丁酸N-琥珀醯亞胺酯(磺酸基-SPDB)、4-(馬來醯亞胺基甲基)環己烷羧酸N-琥珀醯亞胺酯(SMCC)、4-(馬來醯亞胺基甲基)環己烷羧酸N-磺酸基琥珀醯亞胺酯(磺酸基SMCC)、4-(碘乙醯基)-胺基苯甲酸N-琥珀醯亞胺酯(SIAB)及N-琥珀醯亞胺基- 〔(N-馬來醯亞胺基丙醯胺基)-四乙二醇〕酯(NHS-PEG4-馬來醯亞胺)。
  14. 如申請專利範圍第13項的免疫共軛物，其中該連接子係4-(馬來醯亞胺基甲基)環己烷羧酸N-琥珀醯亞胺酯(SMCC)。
  15. 如申請專利範圍第10項的免疫共軛物，其中所述細胞毒性劑選自美登醇、美登醇類似物、多柔比星(doxorubicin)、改質的多柔比星、苯二氮卓、紫杉烷、CC-1065、CC-1065類似物、倍癌黴素(duocarmycin)、倍癌黴素類似物、刺孢黴素(calicheamicin)、朵拉司他汀(dolastatin)、朵拉司他汀類似物、阿利司他汀(auristatin)、托馬黴素(tomaymycin)衍生物、來普黴素(leptomycin)衍生物或所述毒性劑的前藥。
  16. 如申請專利範圍第14項的免疫共軛物，其中所述美登醇是N(2')-脫乙醯基-N(2')-(3-巰基-1-側氧基丙基)-美登素(DM1)或N(2')-脫乙醯基-N(2')、(4-巰基-4-甲基-1-側氧基戊基)-美登素(DM4)。
  17. 如申請專利範圍第10項的免疫共軛物，其中(A)是包含如示於SEQ ID NO：4、5及6和SEQ ID NO：28、29及30的重鏈可變區和輕鏈可變區之CDR1、CDR2及CDR3的抗體，其中(L)是SMCC且其中(C)是DM1。
  18. 如申請專利範圍第10項的免疫共軛物，其中(A)是包含如示於SEQ ID NO：57之重鏈可變區和如示於 SEQ ID NO：198之輕鏈可變區的抗體，其中(L)是SMCC且其中(C)是DM1。
  19. 一種醫藥組成物，其包含如申請專利範圍第1至9項中任一項的抗體或其抗原結合片段及藥學上可接受的載體。
  20. 一種醫藥組成物，其包含如申請專利範圍第10至18項中任一項的免疫共軛物及藥學上可接受的載體。
  21. 如申請專利範圍第20項的醫藥組成物，其包含每個(A)平均3至4個(C)或每個(A)平均3.5個(C)。
  22. 一種套組，其包含如申請專利範圍第1至9項中任一項的抗體或其抗原結合片段。
  23. 一種套組，其包含如申請專利範圍第10至18項中任一項的免疫共軛物。
  24. 一種活體外用於抑制表現CD37的細胞之生長的方法，所述方法包含使所述細胞與如申請專利範圍第1至9項中任一項的抗體或其抗原結合片段接觸。
  25. 一種活體外用於抑制表現CD37的細胞之生長的方法，所述方法包含使所述細胞與如申請專利範圍第10至18項中任一項的免疫共軛物接觸。
  26. 如申請專利範圍第1至9項中任一項的抗體或其抗原結合片段，所述抗體或其抗原結合片段是用於治療癌症。
  27. 如申請專利範圍第10至18項中任一項的免疫共 軛物，所述免疫共軛物是用於治療癌症。
  28. 如申請專利範圍第26項的抗體或其抗原結合片段，其中所述癌症選自下列：B細胞淋巴瘤、非何傑金氏淋巴瘤(NHL)、B細胞前體成淋巴細胞白血病/淋巴瘤和成熟B細胞贅瘤、B細胞慢性淋巴細胞白血病(CLL)/小淋巴細胞白血病(SLL)、B細胞前淋巴細胞白血病、淋巴漿細胞淋巴瘤、外套細胞淋巴瘤(MCL)、濾泡性淋巴瘤(FL)、低度、中度及高度FL、皮膚濾泡性中心淋巴瘤、邊緣區B細胞淋巴瘤、MALT型邊緣區B細胞淋巴瘤、結節邊緣區B細胞淋巴瘤、脾型邊緣區B細胞淋巴瘤、毛細胞性白血病、瀰漫性大B細胞淋巴瘤、伯基特(Burkitt)氏淋巴瘤、漿細胞瘤、漿細胞性骨髓瘤、移植後淋巴增生性病變、沃爾登斯特倫(Waldenstrom)氏巨球蛋白血症及異生性大細胞淋巴瘤(ALCL)。
  29. 如申請專利範圍第27項的免疫共軛物，其中所述癌症選自下列：B細胞淋巴瘤、非何傑金氏淋巴瘤(NHL)、B細胞前體成淋巴細胞白血病/淋巴瘤和成熟B細胞贅瘤、B細胞慢性淋巴細胞白血病(CLL)/小淋巴細胞白血病(SLL)、B細胞前淋巴細胞白血病、淋巴漿細胞淋巴瘤、外套細胞淋巴瘤(MCL)、濾泡性淋巴瘤(FL)、低度、中度及高度FL、皮膚濾泡性中心淋巴瘤、邊緣區B細胞淋巴瘤、MALT型邊緣區B細胞淋巴瘤、結節邊緣區B細胞淋巴瘤、脾型邊緣區B細胞淋巴瘤、毛細胞性白血病、瀰漫性大B細胞淋巴瘤、伯基特 (Burkitt)氏淋巴瘤、漿細胞瘤、漿細胞性骨髓瘤、移植後淋巴增生性病變、沃爾登斯特倫(Waldenstrom)氏巨球蛋白血症及異生性大細胞淋巴瘤(ALCL)。
  30. 如申請專利範圍第26項的抗體或其抗原結合片段，其中所述癌症是白血病或淋巴瘤。
  31. 如申請專利範圍第27項的免疫共軛物，其中所述癌症是白血病或淋巴瘤。
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