MX2012010514A - Moleculas de union cd37 y sus inmunoconjugados. - Google Patents

Moleculas de union cd37 y sus inmunoconjugados.

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MX2012010514A
MX2012010514A MX2012010514A MX2012010514A MX2012010514A MX 2012010514 A MX2012010514 A MX 2012010514A MX 2012010514 A MX2012010514 A MX 2012010514A MX 2012010514 A MX2012010514 A MX 2012010514A MX 2012010514 A MX2012010514 A MX 2012010514A
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nos
antigen
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MX2012010514A
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Jutta Deckert
Lingyun Rui
Peter Park
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Immunogen Inc
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Abstract

Se proporcionas nuevos agentes anticáncer, que incluyen, pero sin limitación, anticuerpos e inmunoconjugados, que se unen a CD37. Además se proporcionan métodos de usar los agentes, anticuerpos o inmunoconjugados, tales como métodos inhibir el crecimiento tumoral.

Description

MOLECULAS DE UNION CD37 Y SUS INMUNOCO JUGADOS Campo de la Invención El campo de la invención generalmente se refiere a anticuerpos, fragmentos de unión al antígeno, polipéptidos , e inmunoconjugados que se unen a CD37, así como a los métodos de uso de tales moléculas de unión a CD37 paral tratamiento de enfermedades, tales como las neoplasias de células B.
Antecedentes de la Invención El antígeno leucocitario CD37 ("CD37"), también conocido como GP52-40, tetraspanina-26 , o TSPAN26, es una proteína de transmembrana de la superfamilia de la tetraspanina (Maecker et al., 1997 FASEB J. 11:428-442). Es una proteína fuertemente glicosilada con cuatro dominios de transmembrana que se expresan en las células B durante las etapas de pre-B a células B maduras periféricas, pero está ausente en la diferenciación terminal a las células plasmáticas. (Link et al., 1987, J Pathol. 152:12-21). El antígeno CD37 está solo débilmente expresado en las células T, células mieloides y granulocitos (Schwartz-Albiez et al. 1988, J. Immunol . , 140(3)905-914). Sin embargo, CD37 también se expresa en las células B malignas tales como las que se hallan en linfoma no Hodgkin (NHL) y leucemia linfoide crónica (CLL) ( oore et al. 1986, J Immunol. 137 (9) : 3013-8) . Este perfil de expresión sugiere que CD37 representa un objetivo terapéutico Ref.:234794 promisorio para las neoplasias de células B.
Si bien el papel fisiológico exacto de CD37 es poco claro, los estudios sugieren un papel potencial en la proliferación de las células T (van Spriel et al. 2004, J Immunol . , 172 (5) : 2953-61) . Como parte de la familia tetraspanina de las glicoproteínas de la superficie celular, CD37 también puede complejarse con otras proteínas de superficie (Angelisová 1994, Immunogenetics . , 39 (4) : 249-56) . Se desarrollaron ratones deficientes en la expresión de CD37 y no revelaron cambios en el desarrollo y composición celular de los órganos linfoides . Solo se observaron niveles reducidos de IgGl y alteraciones de las respuestas a los antígenos dependientes de las células T (Knobeloch et al. 2000, Mol Cell Biol . , 20 (15) : 5363-9) .
Los anticuerpos surgen como un método promisorio para tratar tales cánceres. En particular, son convenientes los anticuerpos que pueden inducir apoptosis en las células blanco. Además, también son deseables los anticuerpos que tienen actividad de citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) y citotoxicidad dependiente del anticuerpo (ADCC) .
En la actualidad, un anticuerpo anti-CD20 llamado rituximab se está usando para tratar neoplasias de células B (Leget et al., 1998, Curr. Opin. Oncol . , 10:548-551). Sin embargo, solo un subconjunto de pacientes responden al tratamiento con rituximab, e incluso los pacientes receptivos que toman rituximab finalmente recaen y a menudo desarrollan resistencia al tratamiento con rituximab. Además, los agentes de unión a CD37 también se han analizado como potenciales terapéuticas para las neoplasias de células B. Trubion Pharmaceuticals desarrolló los agentes de unión a CD37 SMIP-016 y TRU-016 (Zhao et al., 2007, Blood, 110:2569-2577). SMIP-016 es un polipéptido de cadena simple que incluye regiones variables de un hibridoma y regiones constantes humanas manipuladas genéticamente. TRU-016 es una versión humanizada de la proteína SMIP de anti-CD37. Ver por ejemplo Solicitud publicada U.S. N. ° 2007/0009519. TRU-016 se está analizando clínicamente paral tratamiento de leucemia linfocítica crónica (CLL) . Boehringer Ingelheim también ha desarrollado un agente de unión a CD37 en Solicitud Internacional publicada N.° WO 2009/019312. Sin embargo, no se ha descripto actividad de CDC para ninguno de estos agentes de unión y no se ha descripto actividad in vitro pro-apoptótica en ausencia de agentes de entrecruzamiento .
La radioinmunoterapia (RIT) se ha intentado usando un anticuerpo anti-CD37 MB-1 radiomarcado en dos ensayos separados. Las dosis terapéuticas de 131I-MB-1 se administraron a seis pacientes de NHL con recaída (Press et al. 1989 J Clin Oncol . 7 (8) : 1027-38 , Press at el. 1993, N Engl J Med. 329 (17) : 1219-24) . Los seis pacientes lograron una remisión completa (CR) con una duración de cuatro a treinta y un meses. En otro ensayo, se administró 131I-MB-1 a diez pacientes con NHL con recaídas (Kaminski et al. 1992 J Clin Oncol. 10 (11) : 1696-711} . Un total de cuatro pacientes tenía una respuesta que varía en duración desde dos a seis meses, si bien solo se informó un CR. Si embargo, no todos los pacientes se pueden tratar debido a que la biodistribución desfavorable de la radiomarca originó preocupación por la exposición a la radiación de los órganos vitales no blanco. En efecto, se observaron toxicidades relacionadas con RIT en estos ensayos que incluyen severa mielosupresión y toxicidad cardiopulmonar . Si bien los datos clínicos sugieren que los radio-inmunoconjugados anti-CD37 pueden ser efectivos, estas terapias son incómodas para administrar, y en la recaída los pacientes pos-RIT no se pueden volver a tratar con RIT debido a los riesgos asociados con las altas dosis de radiación.
Para superar las limitaciones de la RIT, se han desarrollado los conjugados de anticuerpo-agente citotóxico (ACC) , también llamados conjugados de anticuerpo-fármaco (ADC) . Estos son inmunoconjugados que incluyen un agente citotóxico unido en forma covalente a un anticuerpo a través de un ligador químico que puede permitir la administración específica de los fármacos citotóxicos a las células que expresan una proteína reconocida por el anticuerpo. Sin embargo, las proteínas que son poco incorporadas no se consideran blancos favorables para tales terapéuticas. CD37 es estructuralmente similar a CD20 ya que ambos antígenos contienen cuatro dominios de transmembrana, aunque CD20 no es parte de la familia de tetraspanina (Tedder et al. 1989, J. Immun. 142: 2560-2568). Los anticuerpos contra varios antígenos de las células B que incluyen CD37 y CD20 se han estudiado en cuanto a su capacidad de experimentar endocitosis y degradación (Press et al. 1989, Cáncer Res. 49 (17) :4906-12, y Press et al. 1994, Blood. 83 (5) : 1390-7) . El anticuerpo anti-CD37 MB-1 fue retenido en la superficie celular y se incorporó lentamente en las células del linfoma Daudi in vitro. El anticuerpo MB-1 también tuvo una baja tasa de endocitosis y metabolismo intracelular en las células de pacientes con NHL in vitro. Se obtuvieron resultados similares con el anticuerpo anti-CD20 1F5, que también fue retenido principalmente en la superficie de las células del linfoma y se incorporó pobremente. Las ADC de los anticuerpos CD20 se han estudiado previamente pero no han demostrado una potencia significativamente fuerte, en especial cuando se usan ligadores no disulfuro o estables en ácido (ver por ejemplo, Polson et al., 2009, Cáncer Res., 69 (6) : 2358-2364) . A la luz de estas observaciones, CD37 no se ha considerado un blanco favorable para los conjugados de anticuerpo-fármaco.
En consecuencia, existe una necesidad de agentes de unión a CD37 que incluyen anticuerpos, fragmentos de unión al antígeno, y conjugados anticuerpo-f rmaco (inmunoconjugados) como medio para tratar las neoplasias de células B. La presente invención se dirige a esta necesidad.
Breve Descripción de la Invención En la presente se describen nuevos anticuerpos que se unen al CD37 humano, inmunoconjugados que comprenden estos anticuerpos, y sus métodos de uso. También se proporcionan nuevos polipéptidos , tales como anticuerpos que se unen a CD37 humano, fragmentos de tales anticuerpos, y otros polipéptidos relacionados con tales anticuerpos are. También se proporcionan polinucleótidos que comprenden las secuencias de ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos, así como vectores que comprenden los polinucleótidos. También se proporcionan células que comprenden los polipéptidos y/o polinucleótidos de la invención. También se proporcionan composiciones (por ejemplo, composiciones farmacéuticas) que comprenden los nuevos anticuerpos CD37 o inmunoconjugados . Además, se proporcionar métodos de preparar y usar los nuevos anticuerpos CD37 o inmunoconjugados, tales como métodos de usar los nuevos anticuerpos CD37 o inmunoconjugados para inhibir el crecimiento tumoral y/o tratar cáncer.
Se proporcionan anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno de este que se unen específicamente a CD37, y son capaces de inducir citotoxicidad dependiente de complemento (CDC) . En algunas formas de modalidad, el anticuerpo también es capaz de inducir apoptosis y/o citotoxicidad mediada por células dependiente del anticuerpo (ADCC) .
El anticuerpo o fragmento de unión al antígeno de este puede ser uno que se une específicamente al mismo epitope de CD37 como un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en: (a) un anticuerpo que comprende el polipéptido de la SEQ ID NO: 55 y el polipéptido de la SEQ ID NO: 72; (b) un anticuerpo que comprende el polipéptido de la SEQ ID NO: 59 y el polipéptido de la SEQ ID NO: 75; (c) un anticuerpo que comprende el polipéptido de la SEQ ID NO: 61 y el polipéptido de la SEQ ID NO: 77; (d) un anticuerpo que comprende el polipéptido de la SEQ ID NO: 64 y el polipéptido de la SEQ ID NO: 80; (e) un anticuerpo que comprende el polipéptido de la SEQ ID NO: 66 y el polipéptido de la SEQ ID NO: 82; (f) un anticuerpo que comprende el polipéptido de la SEQ ID NO: 68 y el polipéptido de la SEQ ID NO: 84; y (g) un anticuerpo que comprende el polipéptido de la SEQ ID NO: 70 y el polipéptido de la SEQ ID NO: 86.
En algunas formas de modalidad, el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno de este se une específicamente a CD37 y se une específicamente al polipéptido de la SEQ ID NO: 180. En una cierta modalidad, el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno de este no se une al polipéptido de la SEQ ID NO: 184.
En algunas formas de modalidad, el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno de este se une específicamente a CD37, y el anticuerpo o fragmento de este inhibe competitivamente un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en: (a) un anticuerpo que comprende el polipéptido de la SEQ ID NO: 55 y el polipéptido de la SEQ ID NO: 72; (b) un anticuerpo que comprende el polipéptido de la SEQ ID NO: 59 y el polipéptido de la SEQ ID NO: 75; (c) un anticuerpo que comprende el polipéptido de la SEQ ID NO: 61 y el polipéptido de la SEQ ID NO: 77; (d) un anticuerpo que comprende el polipéptido de la SEQ ID NO: 64 y el polipéptido de la SEQ ID NO: 80; (e) un anticuerpo que comprende el polipéptido de la SEQ ID NO: 66 y el polipéptido de la SEQ ID NO: 82; (f) un anticuerpo que comprende el polipéptido de la SEQ ID NO: 68 y el polipéptido de la SEQ ID NO: 84; y (g) un anticuerpo que comprende el polipéptido de la SEQ ID NO: 70 y el polipéptido de la SEQ ID NO: 86.
En ciertas formas de modalidad, el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno de este es producido por el hibridoma seleccionado del grupo que consiste en designación de depósito de ATCC PTA-10664, depositado con el ATCC el 18 de febrero de 2010, designación de depósito de ATCC PTA-10665, depositado con el ATCC el 18 de febrero de 2010, designación de depósito de ATCC PTA-10666, depositado con el ATCC el 18 de febrero de 2010, designación de depósito de ATCC PTA-10667 depositado con el ATCC el 18 de febrero de 2010, designación de depósito de ATCC PTA-10668, depositado con el ATCC el 18 de febrero de 2010, designación de depósito de ATCC PTA-10669, depositado con el ATCC el 18 de febrero de 2010, y designación de depósito de ATCC PTA-10670, depositado con el ATCC el 18 de febrero de 2010.
En algunas formas de modalidad, el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno de este se une específicamente a CD37, y el anticuerpo comprende secuencias de polipéptidos seleccionadas del grupo que consiste en: (a) SEQ ID NOs : 4, 5, y 6 y SEQ ID NOS : 28, 29, y 30; (b) SEQ ID NOs : 7, 8, y 9 y SEQ ID NOS: 31, 32, y 33; (c) SEQ ID NOs: 10, 11, y 12 y SEQ ID NOS : 34, 35, y 36; (d) SEQ ID NOS : 13, 14, y 15 y SEQ ID NOs : 37, 38, y 39; (e) SEQ ID NOs : 13, 14, y 15 y SEQ ID NOs: 37, 40, y 39; (f) SEQ ID NOS : 16, 17, y 18 y SEQ ID NOS : 41, 42, y 43; (g) SEQ ID NOs : 19, 20, y 21 y SEQ ID NOs : 44, 45, y 46; (h) SEQ ID NOs : 19, 20, y 21 y SEQ ID NOS : 44, 47, y 46; (i) SEQ ID NOs : 22, 23, y 24 y SEQ ID NOS : 48, 49, y 50; (j) SEQ ID NOS : 22, 23, y 24 y SEQ ID NOS : 48, 51, y 50; (k) SEQ ID NOs: 25, 26, y 27 y SEQ ID NOS : 52, 53, y 54; y (1) variantes de (a) a (k) que comprenden 1, 2, 3 ó 4 sustituciones conservadoras de aminoácidos.
En formas de modalidad adicionales, el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno de este comprende secuencias de polipéptidos que son al menos 90% idénticas, al menos 95% idénticas, al menos 99% idénticas, o idénticas a las secuencias de polipéptidos seleccionadas del grupo que consiste en: (a) SEQ ID NO: 55 y SEQ ID NO: 72; (b) SEQ ID NO: 56 y SEQ ID NO: 73; (c) SEQ ID NO: 57 y SEQ ID NO: 74; (d) SEQ ID NO: 58 y SEQ ID NO: 74; (e) SEQ ID NO: 59 y SEQ ID NO: 75; (f) SEQ ID NO:60 y SEQ ID NO:76; (g) SEQ ID NO:61 y SEQ ID NO: 77; (h) SEQ ID NO: 62 y SEQ ID NO: 78; (i) SEQ ID NO: 63 y SEQ ID NO: 79; (j) SEQ ID NO: 64 y SEQ ID NO: 80; (k) SEQ ID NO: 65 y SEQ ID NO: 81; (1) SEQ ID NO: 66 y SEQ ID NO: 82; (m) SEQ ID NO: 67 y SEQ ID NO: 83; (n) SEQ ID NO: 68 y SEQ ID NO: 84; (O) SEQ ID NO: 69 y SEQ ID NO: 85; (p) SEQ ID NO: 70 y SEQ ID NO: 86; y (q) SEQ ID NO: 71 y SEQ ID NO: 87.
En algunas formas de modalidad, el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno de este es murino, no humano, humanizado, quimérico, revestido o humano.
En algunas formas de modalidad, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo es capaz de inducir la apoptosis de una célula que expresa CD37 in vitro en ausencia de agentes de entrecruzamiento . En algunas formas de modalidad, el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno es capaz de inducir citotoxicidad dependiente de complemento (CDC) . En otras formas de modalidad más, el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno es capaz de inducir citotoxicidad mediada por células dependiente del anticuerpo (ADCC) .
En otras formas de modalidad, el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno de este es humano o humanizado, se une específicamente a CD37, y es capaz de inducir apoptosis de una célula que expresa CD37 in vitro en ausencia de agentes de entrecruzamiento . En formas de modalidad adicionales, el anticuerpo humano o humanizado o fragmento de unión al antígeno de este también es capaz de inducir citotoxicidad dependiente de complemento (CDC) y/o capaz de inducir citotoxicidad mediada por células dependiente del anticuerpo (ADCC) .
En aún otras formas de modalidad, el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno de este se une CD37 humano y CD37 de macaco.
En algunas formas de modalidad, el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno de este es un anticuerpo de longitud completa o un fragmento de unión al antígeno. El anticuerpo o fragmento de unión al antígeno de este puede comprender un Fab, Fab', F(ab')2, Fd, Fv de cadena simple o scFv, Fv unido por disulfuro, dominio V-NAR, IgNar, intracuerpo, IgGACH2, minicuerpo, F(ab')3, tetracuerpo, triacuerpo, diacuerpo, anticuerpo de dominio único, DVD-Ig, Fcab, mAb2, (scFv)2, o scFv-Fc.
En otras formas de modalidad, el agente de unión a CD37 es un polipéptido que se une específicamente CD37, y el polipéptido comprende secuencias seleccionadas del grupo que consiste en: (a) SEQ ID NOs : 4, 5, y 6 y SEQ ID NOs : 28, 29, y 30; (b) SEQ ID NOs : 7, 8, y 9 y SEQ ID NOs : 31, 32, y 33; (c) SEQ ID NOS: 10, 11, y 12 y SEQ ID NOs : 34, 35, y 36; (d) SEQ ID NOs: 13, 14, y 15 y SEQ ID NOs : 37, 38, y 39; (e) SEQ ID NOs : 13, 14, y 15 y SEQ ID NOS : 37, 40, y 39; (f) SEQ ID NOS : 16, 17, y 18 y SEQ ID NOs : 41, 42, y 43; (g) SEQ ID NOs : 19, 20, y 21 y SEQ ID NOs : 44, 45, y 46; (h) SEQ ID NOs : 19, 20, y 21 y SEQ ID NOs: 44, 47, y 46; (i) SEQ ID NOs : 22, 23, y 24 y SEQ ID NOs: 48, 49, y 50; (j) SEQ ID NOs : 22, 23, y 24 y SEQ ID NOs : 48, 51, y 50; (k) SEQ ID NOs : 25, 26, y 27 y SEQ ID NOs: 52, 53, y 54; y (1) variantes de (a) to (k) que comprende 1, 2, 3 ó 4 sustituciones conservadoras de aminoácidos.
En otras formas de modalidad, el agente de unión a CD37 es un polipéptido que se une específicamente CD37, y el polipéptido comprende secuencias que son al menos 90% idénticas, al menos 95% idénticas, al menos 99% idénticas, o idénticas a las secuencias seleccionadas del grupo que consiste en: (a) SEQ ID NO: 55 y SEQ ID NO: 72; (b) SEQ ID NO: 56 y SEQ ID NO: 73; (c) SEQ ID NO: 57 y SEQ ID NO: 74; (d) SEQ ID NO: 58 y SEQ ID NO: 74; (e) SEQ ID NO: 59 y SEQ ID NO: 75; (f) SEQ ID NO: 60 y SEQ ID NO: 76; (g) SEQ ID NO: 61 y SEQ ID NO:77; (h) SEQ ID NO:62 y SEQ ID NO:78; (i) SEQ ID NO:63 y SEQ ID NO:79; (j) SEQ ID NO:64 y SEQ ID NO:80; (k) SEQ ID NO: 65 y SEQ ID NO: 81; (1) SEQ ID NO: 66 y SEQ ID NO: 82; (m) SEQ ID NO:67 y SEQ ID NO:83; (n) SEQ ID NO:68 y SEQ ID NO:84; (o) SEQ ID NO: 69 y SEQ ID NO: 85; (p) SEQ ID NO: 70 y SEQ ID NO: 86; y (q) SEQ ID NO: 71 y SEQ ID NO: 87.
Las células productoras del anticuerpo o fragmento de unión al antígeno de este o el polipéptido también se pueden preparar y usar de acuerdo con los métodos descriptos en la presente. Los métodos proporcionan métodos de preparar un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno de este o a polipéptido que comprende (a) cultivar una célula productora de tal agente de unión a CD37; y (b) aislar el anticuerpo, fragmento de unión al antígeno de este, o polipéptido del cultivo celular.
En algunas formas de modalidad, el agente de unión a CD37 es un inmunoconjugado que tiene la fórmula (A) - (L) -(C) , donde: (A) es un agente de unión a CD37; (L) es un ligador; y (C) es un agente citotóxico; y donde el ligador (L) liga (A) a (C) .
En algunas formas de modalidad, el agente de unión a CD37 es un inmunoconjugado que tiene la fórmula (A) - (L) - (C) , donde: (A) es un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno que se une específicamente a CD37; (L) es un ligador no escindible; y (C) es un agente citotóxico; y donde el ligador (L) liga (A) a (C) .
En algunas formas de modalidad, el agente de unión a CD37 es un inmunoconjugado que tiene la fórmula (A) - (L) - (C) , donde: (A) es un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno que se une específicamente a CD37; (L) es un ligador; y (C) es un maytansinoide ; y donde el ligador (L) liga (A) a (C) .
El inmunoconjugado ligador can be a ligador no escindible. El ligador se puede seleccionar de un grupo que consiste en un ligador escindible, a ligador no escindible, a ligador hidrofílico, y a ligador basado en ácido dicarboxílico . El ligador se puede seleccionar del grupo que consiste en: 4- (2-piridilditio) pentanoato de N-succinimidilo (SPP) ; 4- (2-piridilditio) butanoato de N-succinimidilo (SPDB) o 4- (2-piridilditio) -2-sulfobutanoato de N-succinimidilo (sulfo-SPDB) ; 4- (maleimidometil) ciclohexanocarboxilato de N-succinimidilo (SMCC) ; 4- (maleimidometil) ciclohexanocarboxilato de N-sulfosuccinimidilo (sulfoSMCC) ; N-succinimidil-4- (iodoacetil) -aminobenzoato (SIAB) ; y N-succinimidil- [ (N-maleimidopropionamido) -tetraetilenglicol] éster (NHS-PEG4-maleimida) .
El agente citotóxico can be seleccionado del grupo que consiste en a maytansinoide , análogo de maytansinoide , doxorrubicina, una doxorrubicina modificada, benzodiazepina, taxoide, CC-1065, análogo de CC-1065, duocarmicina, análogo de duocarmicina, calic eamicina, dolastatina, análogo de dolastatina, aristatina, derivado de tomaymicina, y derivado de leptomicina o un profármaco del agente. El agente citotóxico puede ser un maytansinoide. El agente citotóxico puede ser (21 ) -deacetil-N (21 ) - (3-mercapto-l-oxopropil) -maytansina (DM1) o N (21 ) -deacetil-N2- (4-mercapto-4-metil-l-oxopentil) -maytansina (DM4).
También se proporciona en la presente una composición farmacéutica que comprende un agente de unión a CD37 y un portador farmacéuticamente aceptable. La composición farmacéutica puede comprender un segundo agente anticáncer.
También se proporciona un reactivo diagnóstico que comprende un agente de unión a CD37 que está marcado. La marca se puede seleccionar del grupo que consiste en una radiomarca, un fluoróforo, un cromóforo, un agente de imagen y un ion metálico.
También se proporciona en la presente un kit que comprende un agente de unión a CD37.
Los métodos descriptos en la presente incluyen los métodos para inhibir el crecimiento de una célula que expresa CD37 que comprende poner en contacto la célula con un agente de unión a CD37 o composición farmacéutica que comprende el mismo .
Los métodos también proporcionan métodos para tratar un paciente que tiene cáncer que comprende administrar la paciente una cantidad terapéuticamente efectiva de un agente de unión a CD37 o composición farmacéutica que comprende administrar el mismo al sujeto.
Los métodos pueden comprender administrar un segundo agente anticáncer al sujeto. El segundo agente anticáncer puede ser un agente quimioterapéutico .
El cáncer puede ser un cáncer seleccionado del grupo que consiste en linfomas de células B, NHL, leucemia/linforna linfoblástico de células B precursoras y neoplasia de células B maduras, leucemia linfocítica crónica de células B (CLL) /linforna linfocítico pequeño (SLL) , leucemia prolinfocítica de células B, linforna linfoplasmacítico, linfoma de células del manto (MCL) , linfoma folicular (FL) , grado bajo, grado intermedio y grado alto (FL) , linfoma cutáneo del centro folicular, linfoma de zona marginal de las células B, linfoma de zona marginal de las células B tipo ALT, linfoma nodal de zona marginal de las células B, linfoma de zona marginal de las células B tipo esplénico, leucemia de células pilosas, linfoma difuso de las células B grandes, linfoma de Burkitt, plasmacitoma, mieloma de células plasmáticas, trastorno linfoproliferativo pos-trasplante, macroglobulinemia de Waldenstrom, y linfoma de células grandes anaplásico (ALCL) .
También se proporcionan en la presente polinucleótidos aislados que comprenden una secuencia que codifica un polipéptido al menos 90% idéntica, al menos 95% idéntica, al menos 99% idéntica, o idéntica a una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOs : 55-87. El polinucleótido puede comprender una secuencia que es al menos 90%, al menos 95% idéntica, al menos 99% idéntica, o idéntica a las SEQ ID NOs : 121-151.
También se proporcionan en la presente vectores y células huésped que comprenden tales polinucleótidos y vectores .
Breve Descripción de las Figuras La Figura 1 ilustra los histogramas para la unión del anticuerpo a las células control 300-19 no transfectadas (paneles izquierdos) y las células que expresan CD37 300-19 (paneles derechos) . Los histogramas se muestran para la tinción con 10 nM de muCD37-3, muCD37-12, muCD37-38 y la ausencia de anticuerpo primario.
La Figura 2 ilustra los histogramas para para la unión del anticuerpo a las células control 300-19 no transfectadas (paneles izquierdos) y las células que expresan CD37 300-19 (paneles derechos) . Los histogramas se muestran para la tinción con 10 nM de muCD37-50, muCD37-51, muCD37-56 y muCD37-57.
Las Figuras 3A-3B ilustran la unión de muCD37-3 y muCD37-12 en la figura 3A y en la figura 3B muCD37-8, muCD37-10 y muCD37-14 a las células WSU-DLCL-2 ensayadas por citometría de flujo. La intensidad de fluorescencia media (MFIpor sus siglas en inglés) se gráfica para cada concentración de anticuerpo usada. Las curvas de unión se usaron para determinar la EC50 de la unión de anticuerpo, que corresponde a la Kd aparente de cada anticuerpo.
Las Figuras 4A-4B ilustran los resultados de un ensayo de Annexina-V para medir la inducción de la apoptosis usando células de linfoma Ramos incubadas con una concentración de 10 nM de rituximab, muCD37-3, muCD37-8, muCD37-10, muCD37-12 o muCD37-14 en la figura 4A y la figura 4B rituximab, huCD37-3, muCD37-38, rauCD37-50, muCD37-51, muCD37-56 o muCD37-57. Las muestras control de las células no tratadas en ausencia de anticuerpo (sin Ab) se usan en comparación.
La Figura 5 ilustra los resultados de ensayos de proliferación WST-8 sobre las células de linfoma SU-DHL-4 incubadas con variadas concentraciones de muCD37-3, muCD37-38, muCD37-50, muCD37-51 y muCD37-16 anticuerpos para 5 días.
Las Figuras 6A-6B ilustran una lista de residuos de superficie CD37-3 y sustituciones en versiones revestidas para CD37-3 VL en la figura 6A y en la figura 6B CD37-3 VH.
Las Figuras 7A-7B ilustran una lista de residuos y sustituciones de superficie CD37-50 en la versión revestida para CD37-50 VL en la figura 7A y en la figura 7B CD37-50 VH.
Las Figuras 8A-8D ilustran alineamientos de secuencias revestidas para la región variable de CD37-3 y CD37-50 con sus contrapartes murinas en la Figura 8A dominio variable de la cadena liviana CD37-3; en la figura 8B dominio variable de la cadena pesada CD37-3. En la figura 8C dominio variable de la cadena liviana CD37-50; en la figura 8D dominio variable de la cadena CD37-50. Las comillas "-" indican identidad con las secuencias murinas.
Las Figuras 9A-9B ilustran los ensayos de unión directos de muCD37-3, chCD37-3, muCD37-12 y chCD37-12 a las células Ramos ensayadas por citometría de flujo en la figura 9A y en la figura 9B los ensayos de unión competitiva con muCD37-3, chCD37-3, huCD37-3vl,0 y 11UCD37-3V1, 01 a las células BJAB en presencia de 2 nM de concentración de los conjugados de muCD37-3-PE.
Las Figuras 10A-10B ilustran la unión de los anticuerpos anti-CD37 a las células 300-19 que expresan el antígeno de CD37 de macaco analizado por citometría de flujo: unión de muCD37-3, muCD37-12, muCD37-38, muCD37-50, muCD37-51, muCD37-56, muCD37-57, WR17 y TRU-016 en la figura 10A y en la figura 10B la unión de huCD37-3, huCD37-38, huCD37-50( huCD37-51, huCD37-56 y huCD37-57. Las curvas de unión se usaron para determinar la EC50 de la unión del anticuerpo, que corresponde a la Kd aparente de cada anticuerpo .
Las Figuras 11A-11B ilustra los resultados de un ensayo de Annexina-V para medir la inducción de la apoptosis en las células de linfoma de Ramos incubadas con variadas concentraciones de huCD37-3, huCD37-38, huCD37-50 en la figura 11A y en la figura 11B de huCD37-51, huCD37-56, huCD36-57 y rituximab. Las muestras de control de las células tratadas con un control de isotipo IgGl humano (control huIgG) se usan en comparación.
Las Figuras 12A-12B ilustran los resultados de los ensayos de proliferación de WST-8 sobre SU-DHL-4 la figura 12A y la figura 12B las células de linfoma DOHH-2 incubadas con concentraciones variadas de los anticuerpos muCD37-3, chCD37-3, huCD37-3vl,0 y huCD37-3vl, 01 durante 5 días.
Las Figuras 13A-13B ilustran los resultados de los ensayos de proliferación de WST-8 sobre Granta-519 en la figura 13A y en la figura 13B las células de linfoma SU-DHL-4 incubadas con concentraciones variadas de huCD37-3, TRU-016 o anticuerpos rituximab durante 5 días.
Las Figuras 14A-14B ilustran los resultados de los ensayos CDC sobre las células de linfoma de Ramos incubadas con huCD37-3, huCD37-38, chCD37-12 o un anticuerpo control del isotipo huIgGl en la figura 14A y en la figura 14B sobre huCD37-38, huCD37-50, huCD37-51, huCD37-56, huCD37-57, chCD37-12 o un anticuerpo control del isotipo huIgGl en presencia de 5% de suero humano como una fuente de complemento.
Las Figuras 15A-15B ilustran los resultados de un ensayo de ADCC sobre las células de linfoma Daudi incubadas con huCD37-3, huCD37-38, huCD37-50, TRU-016 en la figura 15A y la figura 15B sobre huCD37-51, huCD37-56, huCD37-57, TRU-016 o un anticuerpo control del isotipo IgGlhumano en presencia de células N purificadas como células efectoras.
La Figura 16 ilustra el alineamiento de las secuencias de aminoácidos de CD37 de longitud completa .murina, humana, y macaco. Las comillas "-" indican identidad con la secuencia murina. Los dominios extracelulares pequeño y grande se marcan con subrayado.
La Figura 17 ilustra el alineamiento del dominio extracelular grande humano, recombinado y tipo salvaje murino y las secuencias de CD37 quiméricas. Las comillas "-" indican identidad con la secuencia humana. Se dan las posiciones de los sitios de restricción manipulados genéticamente y se subrayan los residuos afectados.
Las Figuras 18A-18B ilustran la unión de un panel de los anticuerpos CD37 a las células transfectadas con CD37 humano tipo salvaje en la figura 18A y en la figura 18B la variante de hCD37-M3 analizada por citometría de flujo usando 1,5 \iq/mL de cada anticuerpo . nLas Figuras 19A-19B ilustran la unión de un panel de anticuerpos CD37 a las células transfectadas con la variante de hCD37-Ml en la figura 19A y en la figura 19B la variante hCD37- 45 analizada por citometría de flujo usando 1,5 yg/mL de cada anticuerpo .
Las Figuras 20A-20B ilustran la unión de huCD37-3 en comparación con huCD37-3-SMCC-DMl huCD37-3-SPP-DMl y huCD37-3-sulfo-mal-DM4 en la figura 20A y en la Figura 20B huCD37-38 en comparación con huCD37-38-SMCC-DMl a las células BJAB analizada por citometría de flujo. Las curvas de unión se usaron para determinar la EC50 del anticuerpo o unión del conjugado, que corresponde a la Kd aparente de cada uno.
Las Figuras 21A-21B ilustra los resultados de Anexina-V para medir la inducción de apoptosis en la figura 20A y en la figura 20B los resultados de un ensayo de CDC. Los ensayos se realizaron en células de linfoma de Ramos incubadas con concentraciones variadas de huCD37-3, huCD37-3-SMCC-DMl, anticuerpo control huIgGl, conjugado control huIgGl-SMCC-DMl o rituximab. Se realizaron ensayos CDC en presencia de 5% de suero humanos como fuente de complemento.
Las Figuras 22A-22B ilustran los resultados de los ensayos de ADCC sobre células de linfoma Daudi incubadas con huCD37-3, huCD37-3-S CC-DMl, huCD37-3-PEG4-mal-DMl, TRU-016 o un anticuerpo control del isotipo huIgGl en la figura 22A y en la figura 22B las células de linfoma de Ramos incubadas con huCD37-3, huCD37-3-SMCC-DM1, huCD37-3-PEG4-mal-DMl o un anticuerpo control del isotipo huIgGl en presencia de células NK purficadas humanas como células efectoras .
Las Figuras 23A-23B ilustran los resultados de un análisis del ciclo celular que usa tinción de yoduro de propidio sobre células BJAB en la figura 23A y en la figura 23B las células RL incubadas con huCD37-3, huCD37-3-SMCC-DMl, o un conjugado control de no unión huIgGl-SMCC-DMl a una concentración de 10 nM durante 20 horas.
Las Figuras 24A-24B ilustran los resultados de un ensayo de citotoxicidad WST-8 sobre células Daudi incubadas con huCD37-3-SMCC-DM1, huCD37-38-SMCC-DMl, huCD37-50-SMCC-DMl , huCD37-51-SMCC-DM1, huCD37-56-SMCC-DMl, huCD37-57-SMCC-DMl, en la figura 24A y en la figura 24B células Granta-519 incubadas con huCD37-3-SMCC-DM1, huCD37-38-SMCC-DMl, huCD37-50-SMCC-DMl , huCD37-51-SMCC-DMl, o un conjugado control de no unión huIgGl-SMCC-DMl a a concentraciones que varían de 3 x 10 M a 1 x 10"11 M durante 5 días .
Las Figuras 25A-25B ilustran los resultados de un modelo de xenoinjerto establecido usando células de linfoma BJAB implantado en forma subcutánea en ratones SCID. Los animales se trataron una vez el día 12 pos-inoculación de células con 10 mg/kg de huCD37-3 Ab, huCD37-3-SMCC-DMl, huCD37-50 Ab, huCD37-50-SMCC-D l en la figura 25A o en la figura 25B huCD37-38 Ab, huCD37-38-SMCC-DMl, huCD37-56 Ab, huCD37-56-SMCC-DMl . El volumen de tumor promedio de los diferentes grupos de tratamiento se gráfica contra el tiempo pos-inoculación de células tumorales.
La Figura 26 ilustra los resultados de un estudio de xenoinjerto establecido usando células de linfoma BJAB implantadas en forma subcutánea en ratones SCID. Los animales se trataron una vez el día 9 pos-inoculación de células con 10 mg/kg of huCD37-3 Ab, huCD37-3-SMCC-DMl, huCD37-3-sulfo-mal-DM4 o 5 mg/kg of huCD37-3-SPP-DMl . El volumen de tumor promedio de los diferentes grupos de tratamiento se gráfica contra el tiempo posinoculación de células tumorales .
La Figura 27 ilustra los resultados de un estudio de xenoinjerto establecido usando células de linfoma de células B grande y difuso SU-DHL-4 implantadas en forma subcutánea en ratones SCID. Los animales se trataron una vez el día 17 posinoculación de células con 10 mg/kg de huCD37-3 Ab, huCD37-3-SMCC-D 1, huCD37-3-sulfo-mal-DM4 o 5 mg/kg de huCD37-3-SPP-DMl .
El volumen de tumor promedio de los diferentes grupos de tratamiento se gráfica contra el tiempo pos-inoculación de células tumorales.
La Figura 28 ilustra los resultados de un modelo de xenoinjerto establecido usando células de linfoma BJAB implantadas en forma subcutánea en ratones SCID. Los animales se trataron una vez el día 9 pos-inoculación de células con 10 mg/kg of huCD37-3 Ab, huCD37-3-SMCC-DMl o huCD37-3-PEG4-mal-DMl . El volumen de tumor promedio de los diferentes grupos de tratamiento se gráfica contra el tiempo pos-inoculación de células tumorales.
La Figura 29 ilustra los resultados de un modelo de xenoinjerto establecido usando células de linfoma de células B grande y difuso SU-DHL-4 implantadas en forma subcutánea en ratones SCID. Los animales se trataron una vez el día 15 pos-inoculación de células con 10 mg/kg de huCD37-3 Ab, huCD37-3-SMCC-DM1 o huCD37-3-PEG4-mal-DMl. El volumen de tumor promedio de los diferentes grupos de tratamiento se gráfica contra el tiempo pos-inoculación de células tumorales.
La Figura 30 ilustra los resultados de un ensayo usando un modelo de xenoinjerto establecido con Células de linfoma de células B foliculares DoHH2 implantadas en forma subcutánea en ratones SCID. Los animales se trataron a partir del día 12 posinoculación con (i) una dosis única de 10 mg/kg de anticuerpo huCD37-3, (ii) una dosis única de 10 mg/kg de conjugado de huCD37-3-SMCC-DMl, (iii) seis dosis de 2 mg/kg de Rituximab dos veces por semana durante tres semanas (iv) un régimen de una dosis única de 40 mg/kg de ciclofosfamida y 0,5 mg/kg de vincristina, junto con dosis cinco veces por día de 0,2 mg/kg de prednisona (CVP) , o (v) un control de vehículo. El volumen de tumor promedio de los diferentes grupos de tratamiento se gráfica contra el tiempo pos-inoculación de células tumorales.
La Figura 31 ilustra los resultados de un ensayo usando un modelo de xenoinjerto establecido con células JV 3 CLL implantadas en forma subcutánea en ratones SCID. Los animales se trataron a partir del día 7 pos-inoculación con (i) una dosis única de 10 mg/kg of anticuerpo huCD37-3, (ii) una dosis de 5 mg/kg del conjugado de huCD37-3-SMCC-DMl, (iii) una dosis de 10 mg/kg del conjugado de huCD37-3-SMCC-DMl, (iv) seis dosis de 5 mg/kg de Rituximab dos veces por semana durante tres semanas, (v) una dosis única de 50 mg/kg de bendamustina, o (vi) a control de vehículo. El volumen de tumor promedio de los diferentes grupos de tratamiento se gráfica contra el tiempo pos-inoculación de células tumorales .
Las Figuras 32A-32B ilustran los niveles de expresión de CD37 y CD20 medidos en varias líneas celulares tumorales NHL y CLL en la figura 32A y la citotoxicidad in vitro de huCD37-3-SMCC-DM1 medida en estas líneas celulares en la figura 32B.
Descripción Detallada de la Invención La presente invención proporciona una nueva clase de moléculas de unión a CD37 que tienen alta potencia en las siguientes tres actividades citotóxicas contra CD37 que expresa células (por ejemplo, positiva) : inducción de apoptosis, ADCC, y CDC. Además, los inmunoconjugados de los anticuerpos anti-CD37 destruyen las células que expresan CD37 inesperadamente bien, como se demostró usando modelos de tumor in vivo.
I .Definiciones Para facilitar la comprensión de la presente invención, a continuación se definen numerosos términos y frases.
El término CD37 como se usa en la presente, se refiere a cualquier CD37 nativo, a menos que se indique lo contrario. CD37 también se denomina como GP52-40, el antígeno leucocitario CD37, y Tetraspanina-26. El término "CD37" abarca CD37 no procesado de "longitud completa" así como cualquier forma de CD37 que resulte del procesamiento en la célula. El término también abarca variantes de CD37 naturales, por ejemplo, variantes de empalme, variantes alélicas e isoforma. Los polipéptidos de CD37 descriptos en la presente se pueden aislar de una variedad de fuentes, tales como de tipos de tejido humano o de otras fuentes, o prepararse por métodos recombinantes o sintéticos .
El término "anticuerpo" significa una molécula de inmunoglobulina que reconoce y se une específicamente a un blanco, tal como una proteína, polipéptido, péptido, carbohidrato, polinucleótido, lípido, o combinaciones de los precedentes a través de al menos un sitio de reconocimiento del antígeno dentro de la región variable de la molécula de inmunoglobulina. Como se usa en la presente, el término "anticuerpo" abarca anticuerpos policlonales intactos, anticuerpos monoclonales intactos, fragmentos de anticuerpos (tales como, los fragmentos Fab, Fab1, F(ab')2, y Fv) , mutantes de Fv de cadena simple (scFv) , anticuerpos multispecíficos tales como anticuerpos biespecíficos de al menos dos anticuerpos intactos, anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados, anticuerpos humanos, proteínas de fusión que comprende una porción de determinación antigénica de un anticuerpo, y cualquier otra molécula de inmunoglobulina modificada que comprende un sitio de reconocimiento del antígeno siempre que los anticuerpos exhiban la actividad biológica deseada. Un anticuerpo puede ser de cualquiera de las cinco principales clases de inmunoglobulinas : IgA, IgD, IgE, IgG, y IgM, o subclases (isotipos) de estas (por ejemplo IgGl, IgG2 , IgG3 , IgG4 , IgAl y IgA2), sobre la base de la identidad de sus dominios constantes de cadena pesada denominados como alfa, delta, epsilon, gamma, y mu, respectivamente. Las diferentes clases de inmunoglobulinas tienen diferentes y bien conocidas estructuras de subunidades y configuraciones tridimensionales. Los anticuerpos pueden estar desnudos o conjugados con otras moléculas tales como toxinas, radioisótopos, etc.
Un anticuerpo "bloqueante" o un anticuerpo "antagonista" es uno que inhibe o reduce la actividad biológica del antígeno al que se une, tal como CD37. En algunas formas de modalidad, los anticuerpos bloqueantes o anticuerpos antagonistas inhiben en forma sustancial o completa la actividad biológica del antígeno. La actividad biológica se puede reducir en 10%, 20%, 30%, 50%, 70%, 80%, 90%, 95%, o incluso 100%.
El término "anticuerpo anti-CD37" o "un anticuerpo que se une a CD37" se refiere a un anticuerpo que es capaz de unirse a CD37 con afinidad suficiente de modo que el anticuerpo sea útil como un agente de diagnóstico y/o terapéutico para dirigirse a CD37. El grado de la unión de un anticuerpo anti-CD37 a una proteína no CD37 no relacionada puede ser menos de aproximadamente 10% de la unión del anticuerpo a CD37 medida, por ejemplo, por un radoinmunoensayo (RIA) . En ciertas formas de modalidad, un anticuerpo que se une a CD37 tiene una constante de disociación (Kd) de =1 µ?, <100 nM, =10 nM, =1 nM, o =0,1 nM.
El término "fragmento de anticuerpo" se refiere a una porción de un anticuerpo intacto y se refiere a las regiones variables determinantes antigénicas de un anticuerpo intacto. Los ejemplos de los fragmentos de anticuerpos incluyen, pero sin limitación los fragmentos Fab, Fab1, F(ab')2, y Fv, anticuerpos lineales, anticuerpos de cadena simple, y anticuerpos multiespecíficos formados de fragmentos de anticuerpo .
Un "anticuerpo monoclonal" se refiere a una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, involucrada en el reconocimiento altamente específico y la unión de un single determinante antigénico, o epitope. Esto es en contraste con los anticuerpos policlonales que normalmente incluyen anticuerpos diferentes dirigidos contra determinantes antigénicos diferentes. El término "anticuerpo monoclonal" abarca anticuerpos monoclonales intactos y de longitud completa así como fragmentos de anticuerpo (tales como Fab, Fab1, F(ab')2, Fv) , mutantes de cadena simple (scFv) , proteínas de fusión que comprenden porción del anticuerpo, y cualquier otra molécula de inmunoglobulina modificada que comprende un sitio de reconocimiento del antígeno. Además, "anticuerpo monoclonal" se refiere a tales anticuerpos obtenidos de numerosas maneras que incluyen, pero sin limitación, por hibridoma, selección de fago, expresión recombinante y animales transgénicos .
El término "anticuerpo humanizado" se refiere a las formas de anticuerpo no humanos (por ejemplo, murino) que son cadenas inmunoglobulina específicas, inmunoglobulinas quiméricas, o fragmentos de estas que contienen inmunoglobulinas no humanas mínimas (por ejemplo, murinas) . Normalmente, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas en que los residuos de la región determinante de complementariedad (CDR) se reemplazan por residuos de la CDR de una especie no humana (por ejemplo ratón, rata, conejo, hámster) que tienen la especificidad, afinidad, y capacidad (Jones et al., 1986, Nature, 321:522-525; Riechmann et al., 1988, Nature, 332:323-327; Verhoeyen et al., 1988, Science, 239:1534-1536). En algunos casos, los residuos de la región estructural Fv (FR) de una inmunoglobulina humana se reemplazan con los residuos correspondientes en un anticuerpo de una especie no humana que tiene especificidad, afinidad y capacidad deseadas. El anticuerpo humanizado se puede modificar adicionalmente por la sustitución de residuos adicionales en la región estructural Fv y/o dentro de los residuos no humanos reemplazados para refinar y optimizar la especificidad, afinidad, y/o capacidad del anticuerpo. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente total 1 al menos uno, y normalmente dos o tres, los dominios variables que contienen todo o sustancialmente todas las regiones de la CDR que corresponden con la inmunoglobulina no humana donde mientras todo o sustancialmente todas las regiones FR son las una secuencia de consenso de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado también puede comprender al menos una porción de una región o dominio constante de la inmunoglobulina (Fe) , normalmente de una inmunoglobulina humana. Los ejemplos de los métodos usados para generar anticuerpos humanizados se describen en la patente U.S. 5.225.539.
Una "región variable" de un anticuerpo se refiere a la región variable de la cadena liviana del anticuerpo o la región variable de la cadena pesada del anticuerpo, solo o en combinación. Las regiones variables de la cadena pesada y liviana consisten en cuatro regiones estructurales (FR) conectadas por tres regiones determinantes de complementariedad (CDR) también conocidas como regiones hipervariables . Las CDR de cada cadena se mantienen juntos en proximidad cercana por la FR y, con las CDR de la otra cadena, contribuyen a la formación del sitio de unión al antígeno de los anticuerpos. Existen al menos dos técnicas para determinar las CDR: (1) un método basado en la variabilidad de secuencia de cruzadas especies (es decir, Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, (5th ed. , 1991, National Institutes of Health, Bethesda Md.)); y (2) un método basado en estudios cristalográficos de complejos antígeno-anticuerpo (Al-lazikani et al (1997) J. Molec. Biol. 273:927-948)). Además, las combinaciones de estos métodos algunas veces se usan en la técnica para determinar las CDR.
El sistema de numeración Kabat generalmente se usa cuando se denomina a un residuo del dominio variable (aproximadamente los residuos 1-107 de la cadena liviana y los residuos 1-113 de la cadena pesada) (por ejemplo, Kabat et al., Sequences of Inmunological Interest. 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991) ) .
La numeración de la posición de aminoácido tal como en Kabat se refiere al sistema de numeración usado para el dominio variable de cadena pesadas o dominio variable de cadena livianas de la compilación de anticuerpos en Kabat et al., supra. , Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, Nacional Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991) . Mediante este sistema de numeración, la secuencia de aminoácidos lineal real puede contener pocos o adicionales aminoácidos correspondientes a un acortamiento, o inserción de una FR o CDR del dominio variable. Por ejemplo, un dominio variable de la cadena pesada puede incluir un inserto de aminoácido único (residuo 52a de acuerdo con Kabat) después del residuo 52 de H2 y residuos insertados (por ejemplo residuos 82a, 82b, y 82c, etc. de acuerdo con Kabat) después del residuo 82 de la cadena pesada de FR. La numeración de Kabat de residuos se puede determinar para un anticuerpo dado por alineamiento en las regiones de homología de la secuencia del anticuerpo con una secuencia numerada Kabat "estándar" . Chothia se refiere en cambio a la ubicación los bucles estructurales (Chothia y Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)). El fin del bucle CDR-H1 de Chothia cuando se numera usando la convención de numeración de Kabat varía entre H32 y H34 de acuerdo con la longitud del bucle (esto es porque el esquema de numeración de Kabat coloca las inserciones en H35A y H35B; si ni 35A ni 35B está presente, los extremos del bucle en 32; si solo 35A está presente, los extremos del bucle a 33; si ambos 35A y 35B están presentes, los extremos del bucle en 34) . Las regiones hipervariables AbM representan un compromiso entre las CDR de Kabat y los bucles estructurales de Chothia y se usan en el programa de computación del modelo de anticuerpos Oxford Molecular' s AbM. Las regiones hipervariables "contacto" se basan en el análisis de las estructuras cristalinas complejas disponibles. Los residuos de cada una de estas HVR se indican a continuación.
Bucle Kabat AbM Chothia Ll L24-L34 L24-L34 L24-L34 L2 L50-L56 L50-L56 L50-L56 L3 L89-L97 L89-L97 L89-L97 Hl H31-H35B H26-H35B H26-H32..34 (Numeración de Kabat) Hl H31-H35 H26-H35 H26-H32 (Numeración de Clothia) H2 H50-HÓ5 H50-H58 H52-H56 H3 H95-HL02 H95-H102 H95-H102 El término "anticuerpo humano" significa un anticuerpo producido por un ser humano o un anticuerpo que tiene una secuencia de aminoácidos correspondiente a un anticuerpo producido por un ser humano obtenido usando cualquier técnica conocida en la materia. Esta definición de un anticuerpo humano incluye anticuerpos intactos o de longitud completo, fragmentos de estos, y/o anticuerpos que comprenden al menos un polipéptido de la cadena pesada y/o liviana humana tal como, por ejemplo, un anticuerpo que comprende cadena liviana murina y cadena pesada humana.
El término "anticuerpos quiméricos" se refiere a anticuerpos donde la secuencia de aminoácidos de la molécula de inmunoglobulina deriva de dos o más especies. Normalmente, la región variable de cadenas liviana y pesada corresponde a la región variable de los anticuerpos derivados de una especie de mamíferos (por ejemplo, ratón, rata, conejo, etc) con la especificidad, afinidad, y capacidad deseada mientra que las regiones constantes son homologas a las secuencias de los anticuerpos derivados de otra (usualmente humano) para evitar estimular una respuesta inmune en esta especie.
El término "epitope" o "determinante antigénico" se usan en forma indistinta en la presente y se refieren a la porción de un antígeno capaz de ser reconocido y unido específicamente por un anticuerpo particular. Cuando el antígeno es un polipéptido, los epitopes se pueden formar de aminoácidos contiguos y aminoácidos no contiguos yuxtapuestos por el plegamiento terciario de una proteína. Los epitopes formados de aminoácidos contiguos se retienen después de la desnaturalización, mientras que los epitopes formados por plegamiento terciario normalmente se pierden después de la desnaturalización de la proteína. Un epitope normalmente incluye al menos 3, y más usualmente, al menos 5 o 8-10 aminoácidos en una conformación espacial.
"Afinidad de unión" generalmente se refiere a la fuerza de la suma total de interacciones no covalentes entre un solo sitio de unión de una molécula (por ejemplo, un anticuerpo) y su compañero de unión (por ejemplo, un antígeno) . A menos que se indique de otro modo, como se usa en la presente, la "afinidad de unión" se refiere a afinidad de unión intrínseca que refleja una interacción 1:1 entre los miembros de un par de unión (por ejemplo, anticuerpo y antígeno). La afinidad de una molécula X por su pareja Y en general se puede representar con una constante de disociación (Kd) . La afinidad se puede medir por métodos comunes en la técnica, que incluyen los que se describen en la presente. Anticuerpos de baja afinidad generalmente se unen lentamente al antígeno y tienden a disociarse fácilmente, mientras que los anticuerpos de alta afinidad se unen rápidamente al antígeno y tienden a permanecer unidos más tiempo. Una variedad de métodos de medir la afinidad de unión son conocidos en la técnica, alguno de cuales se pueden usar para los fines de la presente invención. Las formas de modalidad ilustrativas y específicas se describen a continuación.
"O mejor" cuando se usa en la presente se refiere a la afinidad de unión se refiere a la unión más fuerte entre una molécula y su compañero de unión. "0 mejor" cuando se usa en la presente se refiere a la afinidad de unión se refiere a la unión más fuerte, representada por un valor de Kd numérico menor. Por ejemplo, un anticuerpo que tiene una afinidad por un antígeno de "0,6 nM o mejor", la afinidad del anticuerpo por el antígeno es <,6 nM, es decir ,59 nM, ,58 nM, ,57 nM etc. o cualquier valor menor de ,6 nM.
Por "se une específicamente" generalmente se entiende que un anticuerpo se une a un epitope por medio de un epitope por medio de su dominio de unión al antígeno, y que la unión supone alguna complementariedad entre el dominio de unión al antígeno y el epitope. De acuerdo con esta definición, se dice que un anticuerpo "se une específicamente" a un epitope cuando se une a este epitope, por medio de su dominio de unión al antígeno más fácilmente que se fuera un epitope no relacionado, aleatorio. El término "especificidad" se usa en la presente para calificar la afinidad relativa por la cual un anticuerpo determinado se une a un determinado epitope. Por ejemplo, el anticuerpo "A" se puede estimar que tiene una mayor especificidad para un epitope dado, el anticuerpo "B," o se puede decir que el anticuerpo "A" se une al epitope "C" con una mayor especificidad que la que tiene para un epitope relacionado "D." Por "se une con preferencia" se entiende que el anticuerpo se une específicamente a un epitope más fácilmente si se uniera a un epitope relacionado, homólogo, similar, homólogo, o análogo. En consecuencia, un anticuerpo que "se une con preferencia" a un epitope dado se uniría más probablemente a este epitope que a un epitope relacionado, incluso aunque tal anticuerpo puede reaccionar en forma cruzada con el epitope relacionado.
Se dice que un anticuerpo "inhibe competitivamente" la unión de un anticuerpo de referencia a un epitope dado si se une con preferencia a este epitope al punto que lo bloquea, en algún grado, la unión del anticuerpo de referencia al epitope. La inhibición competitiva se puede determinar por cualquier método conocido en la técnica, por ejemplo, ensayos ELISA de competición. Se puede decir un anticuerpo inhibe competitivamente la unión del anticuerpo de referencia a un epitope dado en al menos 90%, al menos 80%, al menos 70%, al menos 60%, o al menos 50%.
La frase " sustancialmente similar" o " sustancialmente igual" como se usa en la presente, indica un grado suficientemente alto de semejanza entre dos valores numéricos (generalmente, uno asociado con un anticuerpo de la invención y el otro asociado con un anticuerpo de referencia/comparador) , de modo que los expertos en la técnica consideren que la diferencia entre los dos valores es de poca o ninguna significación biológica y/o estadística dentro del contexto de la característica biológica medida por los valores (por ejemplo, valores de Kd) . La diferencia entre dos de estos valores es, por ejemplo, menor de aproximadamente 50%, menor de aproximadamente 40%, menor de aproximadamente 30%, menor de aproximadamente 20%, y con preferencia menos de aproximadamente 10% en función de un valor de referencia/comparador.
Un polipéptido, anticuerpo, polinucleótido, vector, célula, o composición que es "aislado" es un polipéptido, anticuerpo, polinucleótido, vector, célula, o composición que está en forma no hallada en la naturaleza. Los polipéptidos , anticuerpos, polinucleótidos , vectores, células o composiciones aisladas incluyen los que se han purificado en un grado en que ya no hallan en la naturaleza. En algunas formas de modalidad, un anticuerpo, polinucleótido, vector, célula, o composición que está aislado está sustancialmente puro .
Como se usa en la presente, "sustancialmente puro" se refiere a un material que es al menos 50% puro (es decir, libre de contaminantes) , al menos 90% puro, al menos 95% puro, al menos 98% puro, o al menos 99% puro.
El término " inmunoconjugado" o "conjugado" como se usa en la presente se refiere a un compuesto o un derivado de esta que se liga un agente de unión a célula (es decir, un anticuerpo anti-CD37 o fragmento de este) y se define por una fórmula genérica: C-L-A, donde C = citotoxina, L = ligador, y A = agente de unión celular o anticuerpo anti-CD37 o fragmento de anticuerpo. Los inmunoconjugados también se pueden definir por la fórmula genérica en orden inverso: A-L-C.
Un "ligador" es cualquier resto químico que es capaz de unirse a un compuesto, usualmente un fármaco, tal como un maytansinoide, a un agente de unión celular tal como un anticuerpo anti CD37 o un fragmento de este de una manera estable y covalente. Los ligadores pueden ser sensibles o sustancíalmente resistentes a la escisión inducida por ácido, escisión inducida por luz, escisión inducida por peptidasa, escisión inducida por esterasa y escisión inducida por enlace disulfuro, en condiciones bajo el cual el compuesto o el anticuerpo permanece activo. Los ligadores adecuados son bien conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, grupos disulfuro, grupos tioéter, grupos lábil al ácido, grupos fotolábiles, grupos lábiles a la peptidasa y grupos lábiles de la esterasa. Los ligadores también incluyen ligadores cargados, y sus formas hidrófilas como se describe en la presente y se conocen en la técnica.
Los términos "cáncer" y "canceroso" se refieren o describen la condición patológica de los mamíferos en que una población de células se caracteriza por el crecimiento celular no regulado. Los ejemplos de cáncer incluyen pero sin limitación, carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma, y leucemia. "Tumor" y "neoplasia" se refieren a una o más células que resultan del crecimiento o proliferación celular excesivos, sea benignos (no canceroso) o maligno (canceroso) que incluye las lesiones precancerosas . Los ejemplos de "cáncer" o enfermedades "tumorigénicas" que se pueden tratar y/o prevenir incluyen linfomas de células B que incluyen NHL, leucemia/linfoma linfoblástica de células B precursoras y neoplasias de células B maduras, tales como leucemia linfocítica crónica de células B (CLL) /linfoma linfocítico pequeño (SLL) , células B leucemia prolinfocítica, linfoma linfoplasmacítico, linfoma de células del manto (MCL) , linfoma folicular (FL) , que incluye FL de grado bajo, grado intermedio y grado alto, linfoma cutáneo del centro folicular, linfoma de zona marginal de las células B, linfoma de zona marginal de las células B (tipo MALT, nodal y tipo esplénico) , leucemia de células pilosas, linfoma difuso de las células B grandes, linfoma de Burkitt, plasmacitoma, mieloma de células plasmáticas, trastorno linfoproliferativo pos-trasplante, macroglobulinemia de Waldenstrom, y linfoma de células grandes anaplásico (ALCL) .
Los términos "célula cancerosa" "célula tumoral" y los equivalentes gramaticales se refieren a la población total de células derivadas de un tumor o una lesión precancerosa, que incluye las células no tumorigénicas , que comprenden la masa de la población celular del tumor, y las células madre tumorigénicas (células madre de cáncer) . Como se usa en la presente, el término "célula tumoral" será modificada por el término "no tumorigénico" cuando s e refiere únicamente a las células tumorales que carecen de la capacidad de renovarse y diferenciarse para distinguir las células tumorales de las células .
El término "sujeto" se refiere a cualquier animal (por ejemplo, un mamífero) , que incluye, pero sin limitación a seres humanos, primates no humanos, roedores, y similares, que es el receptor de un tratamiento particular. Normalmente, los términos "sujeto" y "paciente" se usan en forma indistinta en la presente con referencia al sujeto humano.
Administración "en combinación con" uno o más agentes terapéuticos adicionales incluye la administración simultánea (concurrente) y consecutiva en cualquier orden.
El término "formulación farmacéutica" se refiere a una preparación que está en forma tal que permite que la actividad biológica del ingrediente activo sea efectiva, y que no contiene componentes adicionales que sean inaceptablemente tóxicos para un sujeto al que se debe administrar la formulación. La formulación puede ser estéril.
Una "cantidad efectiva" de un anticuerpo como se describe en la presente es una cantidad suficiente para llevar a cabo un propósito específicamente establecido. Una "cantidad efectiva" se puede determinar en forma empírica y de manera rutinaria, en relación con el propósito establecido .
El término "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a una cantidad de un anticuerpo u otro fármaco efectivo para "tratar" una enfermedad o trastorno en un sujeto o mamífero. En el caso del cáncer, la cantidad terapéuticamente efectiva del fármaco puede reducir el número de células cancerosas; reducir el tamaño del tumor; inhibir (es decir, retardar en alguna medida o detener) la infiltración de células cancerosas en órganos periféricos; inhibir (es decir, retardar en alguna medida o detener) la metástasis tumoral; inhibir, en alguna medida, el crecimiento del tumor y/o aliviar en alguna medida uno o más síntomas asociados con el cáncer. Ver la definición en la presente de "tratamiento" . En la medida que el fármaco pueda evitar el crecimiento y/o destruir las células cancerosas existentes, puede ser citostático y/o citotóxico. Una "cantidad profilácticamente efectiva" se refiere a una cantidad efectiva, en las dosis y durante períodos de tiempo necesarios para obtener el resultado profiláctico deseado. Normalmente, pero no necesariamente, ya que se usa una dosis profiláctica en los sujetos antes o en una etapa temprana de la enfermedad, la cantidad profilácticamente efectiva debe ser menor que la cantidad terapéuticamente efectiva.
La palabra "marca" cuando se usa en la presente se refiere a un compuesto o composición detectable que se conjuga directa o indirectamente al anticuerpo, de modo de generar un anticuerpo "marcado". La marca puede ser detectable por sí misma (por ejemplo marcas de radioisótopos o marcas fluorescentes) o, en el caso de una marca enzimática, puede catalizar la alteración química de un compuesto o composición sustrato que es detectable.
Un "agente quimioterapéutico" es un compuesto químico útil para el tratamiento del cáncer, independientemente del mecanismo de acción. Las clases de agentes quimioterapéuticos incluyen, por ejemplo, los antagonistas de CD20 tales como Rituximab y ciclofosfamida, doxorrubicina, vincristina, predinisona, fludarabina, etopósido, metotrexato, lenalidomida, clotambucilo, bentamustina y/o versiones modificadas de tales quimioterapéuticos.
Los términos "tales como "que trata" o "tratamiento" o "tratar" o "alivio" o "aliviar" se refieren a 1) medidas terapéuticas que curan, lentifican, reducen síntomas, y/o detienen la progresión de la condición patológica o trastorno diagnosticado y 2) medidas profilácticas o preventivas que evitan y/o lentifican el desarrollo de una condición patológica o trastorno específico. En consecuencia, los que necesitan tratamiento incluyen los que ya padecen el trastorno; los propensos a tener el trastorno; y a aquellos en los que va a prevenir el trastorno. En ciertas formas de modalidad, un suceso se "trata" con éxito para cáncer de acuerdo con el los métodos de la presente invención si el paciente muestra una o más de los siguientes: una reducción de la cantidad o completa ausencia de las células cancerosas ; una reducción del tamaño del tumor; inhibición de o una ausencia de la infiltración de células cancerosas en los órganos periféricos que incluyen, por ejemplo, la propagación del cáncer en el tejido blando y hueso; inhibición de o una ausencia de la metástasis tumoral; inhibición o ausencia de crecimiento tumoral; alivio de uno o más síntomas asociados con el cáncer específico; reducción de morbilidad y mortalidad; mejora de la calidad de vida; reducción de tumorigenicidad, frecuencia tumorigénica, o capacidad tumorigenica de un tumor; reducción de la cantidad o frecuencia de las células madre de cáncer en un tumor; diferenciación de las células tumorigénicas a un estado no tumorigénico; o alguna combinación de efectos.
Polinucleótido, " o "ácido nucleico," usados en forma indistinta en la presente, se refieren a polímeros de nucleótidos de cualquier longitud e incluyen ADN y ARN. Los nucleótidos pueden ser desoxirribonucleótidos , ribonucleótidos, nucleótidos o bases modificados y/o sus análogos, o cualquier sustrato que se puede incorporar en un polímero por acción de ADN o ARN polimerasa o por una reacción de síntesis. Un polinucleótido puede comprender nucleótidos modificados, tales como nucleótidos metilados y sus análogos. Si está presente, la modificación en la estructura del nucleótido se puede impartir antes o después del ensamblaje del polímero. La secuencia de nucleótidos puede ser interrumpida por los componentes no nucleótido. Un polinucleótido puede comprender modificaciones realizadas después de la síntesis, tal como la conjugación a una marca. Otros tipos de modificaciones incluyen, por ejemplo, sustitución de "capuchones" de uno o más de los nucleótidos naturales con un análogo, modificaciones internucleótido tales como, por ejemplo, las que tienen uniones no cargadas (por ejemplo, metilfosfonatos , fosfotriésteres , fosfoamidatos , carbamatos, etc.) y con uniones cargadas (por ejemplo, fosforotioatos , fosforoditioatos , etc.), los que contienen residuos laterales, tales como, por ejemplo, proteínas (por ejemplo, nucleasas, toxinas, anticuerpos, péptidos señal, poli-L-lisina, etc.), los que tienen intercaladores (por ejemplo, acridina, psoraleno, etc.), los que contienen quelantes (por ejemplo, metales, metales radioactivos, boro, metales oxidativos, etc.), los que contienen alquilantes, los que tienen uniones modificadas (por ejemplo, ácidos nucleicos alfa anoméricos, etc.), así como formas no modificadas de los polinucleótidos . Además, cualquiera de los grupos hidroxilo normalmente presentes en los azúcares se puede reemplazar, por ejemplo, con grupos fosfonato, grupos fosfato, protegidos por grupos protectores estándares, o activados para preparar uniones adicionales a nucleótidos adicionales, o se pueden conjugar a soportes sólidos o semisólidos. El OH 5' y 3' terminal se puede fosforilar o sustituir con aminas o residuos de grupos capuchón orgánicos de 1 a 20 átomos de carbono. Otros hidroxilos también se pueden derivar de grupos protectores estándares. Los polinucleótidos también pueden contener formas análogas de ribosa o desoxirribosa que en general son conocidas en la técnica, que incluyen, por ejemplo, 2 ' -O-metil-, 2'-0-alil-, 2'-fluoro- o 2 ' -azido-ribosa, análogos de azúcar carbocíclico, azúcares a-anoméricos , azúcares epiméricos tales como arabinosa, xilosas o lixosas, azúcares de piranosa, azúcares de furanosa, sedoheptulosas , análogos acíclicos y análogos de nucleótidos básico tales como metil ribósido. Una o más uniones fosfodiéster se pueden reemplazar con grupos ligadores alternativos. Estos grupos ligadores alternativos incluyen pero sin limitación, formas de modalidad en donde el fosfato se reemplaza con P(0)S ("tioato"), P(S)S ( "ditioato" ) , (0)NR2 ( "amidato" ) , P(0)R, P(0)0', CO, o CH2 ( "formacetal" ) , en el que cada R o R' es de modo independiente H o alquilo sustituido o no sustituido (1-20 C) que opcionalmente contiene una unión éter (-0-) , arilo, alquenilo, cicloalquilo, cicloalquenilo o araldilo. No todas las uniones de un polinucleótido deben ser idénticas. La precedente descripción se aplica a todos los polinucleótidos mencionados en la presente, que incluyen ARN y ADN.
El término "vector" significa un constructo, que es capaz de administrar, y opcionalmente expresar, uno o más genes o secuencias de interés en una célula huésped. Los ejemplos de vectores incluyen, pero sin limitación, vectores virales, vectores de expresión de ADN o ARN desnudo, vectores de plásmido, cósmido o fago, vectores de expresión de ADN o ARN asociados con agentes de condensación catiónicos, vectores de expresión de ADN o ARN encapsulados en liposomas y ciertas células eucarióticas , tales como células productoras .
Los términos "polipéptido" , "péptido" y "proteína" se usan en forma indistinta en la presente para referirse a los polímeros de aminoácidos de cualquier longitud. El polímero puede ser lineal o ramificado, puede comprender aminoácidos modificados, y puede estar interrumpido por no aminoácidos. Los términos también abarcan un polímero de aminoácido que ha sido modificado en forma natural o por intervención; por ejemplo, formación de enlace disulfuro, glicosilación, lipidación, acetilación, fosforilación, o cualquier otra manipulación o modificación, tal como conjugación con un componente de marcación. También se incluyen dentro de la definición, por ejemplo, polipéptidos que contienen uno o más análogos de un aminoácido (que incluye, por ejemplo, aminoácidos no naturales, etc.), así como otras modificaciones conocidas en la técnica. Se entiende que, debido a que los polipéptidos de esta invención se basan en anticuerpos, en ciertas formas de modalidad, los polipéptidos pueden aparecen como cadenas simples o cadenas asociadas.
Los términos "idéntico" o por ciento de "identidad" en el contexto de dos o más ácidos nucleicos o polipéptidos, se refieren a dos o más secuencias o subsecuencias que son iguales o tienen un porcentaje especificado de residuos de nucleótidos o aminoácidos que son iguales, cuando se comparan y alinean (introduciendo brechas, si fuera necesario) para la correspondencia máxima, y sin considerar ninguna de las sustituciones conservadoras de aminoácidos como parte de la identidad de secuencia. El por ciento de identidad de secuencia se puede medir usando un programa de computación o algoritmos de comparación de secuencia o por inspección visual. Varios algoritmos y programas de computación son conocidos en la técnica que se pueden usar para obtener alineamientos de secuencias de aminoácidos o nucleótidos . Un ejemplo no limitante de un algoritmo de alineamiento de secuencia es el algoritmo descripto en Karlin et al, 1990, Proc. Nati. Acad. Sci., 87:2264-2268, modificado en Karlin et al., 1993, Proc. Nati. Acad. Sci., 90:5873-5877, y se incorpora en los programas de NBLAST y OBLAST (Altschul et al., 1991, Nucleic Acids Res., 25:3389-3402). En ciertas formas de modalidad, se puede usar Gapped BLAST como se describe en Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402. BLAST-2, WU-BLAST-2 (Altschul et al., 1996, Methods in Enzymology, 266:460-480), ALIGN, ALIGN-2 (Genentech, South San Francisco, California) o Megalign (DNASTAR) son programas de computación disponibles al público adicionales que se pueden usar para alinear secuencias. En ciertas formas de modalidad, el por ciento de identidad entre dos secuencias de nucleótidos se determina usando el programa GAP en el programa de computación GCG (por ejemplo, usando una matriz NWSgapdna . CMP y un peso de brecha de 40, 50, 60, 70, o 90 y un peso de longitud de 1, 2, 3, 4, 5, o 6). En ciertas formas de modalidad alternativas, el programa GAP en el paquete del programa de computación GCG, que incorpora el algoritmo de Needleman y Wunsch (J". Mol. Biol. (48):444-453 (1970) ) se puede usar para determinar el por ciento de identidad entre dos secuencias de aminoácidos (por ejemplo, usando una matriz Blossum 62 o una matriz PAM250 y un peso de brecha de 16, 14, 12, 10, 8, 6, o 4 y un peso de longitud de 1, 2, 3, 4, 5). Alternativamente, en ciertas formas de modalidad, el por ciento de identidad entre las secuencias de nucleótidos o aminoácidos se determina usando el algoritmo de Myers y Miller (CABIOS, 4:11-17 (1989)). Por ejemplo, el por ciento de identidad se puede determinar usado el programa ALIGN (versión 2,0) y usando una tabla de residuo PAM120, una penalización de longitud de brecha de 12 y una penalización de brecha de . Los parámetros apropiados para el alineamiento máximo por el programa de computación de alineamiento particular pueden ser determinados por los expertos en la técnica. En ciertas formas de modalidad, se usan los parámetros predeterminados del programa de computación del alineamiento. En ciertas formas de modalidad, el porcentaje de identidad "X" de una primera secuencia de aminoácidos a una segunda secuencia de aminoácidos se calcula como 100 x (Y/Z) , donde Y es el número de residuos de aminoácidos calificados como coincidencias exactas en el alineamiento de la primera y segunda secuencia (alineado por inspección visual o un programa de alineamiento de secuencia particular) y Z es el número total de residuos de la segunda secuencia. Si la longitud de una primera secuencia es más larga que la segunda secuencia, el por ciento de identidad de la primera secuencia a la segunda secuencia será mayor que el por ciento de identidad de la segunda secuencia a la primera.
Como ejemplo no limitante, si un polinucleótido particular tiene un determinado porcentaje de identidad de secuencia (por ejemplo, es al menos 80% idéntico, al menos 85% idéntico, al menos 90% idéntico, y en algunas formas de modalidad, al menos 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% idéntico) a una secuencia de referencia, en ciertas formas de modalidad, se puede determinar usando el programa Bestfit (Wisconsin Sequence Analysis Package, Versión 8 for Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, WI 53711) . Bestfit usa el algoritmo de homología local de Smith y Waterman, Advances in Applied Mathematics 2: 482 489 (1981) , para hallar el mejor segmento de homología entre dos secuencias. Cuando se usa Bestfit o cualquier otro programa de alineamiento de secuencia para determinar si una secuencia particular es, por ejemplo, 95% idéntica a una secuencia de referencia de acuerdo con la presente invención, los parámetros se establecen de modo que el porcentaje de identidad se calcula respecto de la longitud completa de la secuencia de de nucleótidos de referencia y se permiten brechas de homología hasta 5% del número total de nucleótidos de la secuencia de referencia.
En algunas formas de modalidad, dos ácidos nucleicos o polipéptidos de la invención son sustancialmente idénticos, lo que significa que tienen al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, y en algunas formas de modalidad al menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99% de identidad de residuos de nucleótidos o aminoácidos, cuando se comparan y alinean para la máxima correspondencia, medida mediante un algoritmo de comparación se secuencia o por visual inspección. La identidad puede existir respecto de una región de las secuencias que es tiene menos aproximadamente 10, aproximadamente 20, aproximadamente 40-60 residuos de longitud o cualquier valor entero entre ellos, y puede ser respecto de una región más larga que 60-80 residuos, por ejemplo, al menos aproximadamente 90-100 residuos, y en algunas formas de modalidad, las secuencias son sustancialmente idénticas respecto de la longitud completa de las secuencias que se comparan, tales como, por ejemplo la región codificadora de una secuencia de nucleótidos.
Una "sustitución conservadora de aminoácido" es en que el residuo de aminoácido se reemplaza con otro residuo de aminoácido tiene una cadena lateral similar. Las familias de residuos de aminoácidos tienen cadenas laterales similares se han definido en la técnica, que incluye cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina) , cadenas laterales ácidas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico) , cadenas laterales polares no cargadas (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína) , cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano) , cadenas laterales beta-ramificadas (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina) . Por ejemplo, La sustitución de una fenilalanina por una tirosina es una substitución conservadora. En algunas formas de modalidad, las sustituciones conservadoras de las secuencias de los polipéptidos y anticuerpos de la invención no anulan la unión del polipéptido o anticuerpo que contiene la secuencia de aminoácidos, al antígeno, es decir, el CD37 al que se une el polipéptido o el anticuerpo. Los métodos de identificar sustituciones conservadoras de nucleótidos y aminoácidos que no elimina la unión de antígeno son bien conocidas en la técnica (ver, por ejemplo, Brummell et al., Bioche . 32: 1180-1 187 (1993); Kobayashi et al. Protein Eng. 12(10) :879-884 (1999); y Burks et al. Proc . Nati. Acad. Sci. USA 94 : .412-417 (1997) ) .
Como se usa en la presente descripción y reivindicaciones, las formas singulares "un" "una" y "el/la" incluyen formas plural a menos que el contexto indique claramente lo contrario.
Se entiende que en cualquier forma de modalidad donde se describe en la presente con la frase "que comprende" también se proporcionan formas de modalidad análogas descriptas en términos de "que consiste en" y/o "que consiste esencialmente en" .
El término "y/o" usando en una frase tal como "A y/o B" en la presente se considera que incluye "A y B, " "A o B, " "A" y "B" . Asimismo, el término "y/o" usado en una frase tal como "A, B, y/o C" se considera que abarca cada una de las siguientes formas de modalidad: A, B, y C; A, B, o C; A o C; A o B; B o C; A y C; A y B; B y C; A (solo) ; B (solo) ; y C (solo) .
II. Agentes de unión a CD37 La presente invención proporciona agentes que unen específicamente CD37. Estos agentes se denominan en la presente como "agentes de unión a CD37". Las secuencias de aminoácidos de longitud completa para CD37 humano, macaco y murino son conocidas en la técnica y también se proporcionan en la presente representadas por las SEQ ID NOs : 1-3 , respectivamente.
CD37 humano: MSAQESCLSLIKYFLFVFNLFFFVLGSLIFCFGIWILIDKTSFVSFVGLAF VPLQIWSKVLAISGIFT GIALLGCVGALKELRCLLGLYFG LLLLFATQITLGILISTQR AQLERSLRDWEKTIQKYGTNPEETAAEESWDYVQFQLRCCGWHYPQDWFQVLILRGNGSE AHRVPCSCYNLSATNDSTILDKVILPQLSRLGHLARSRHSADICAVPAESHIYREGCAQGL QK LH LISIVGICLGVGLLELGFMTLSIFLCR LDHVYNRLAYR (SEQ ID NO:l) CD37 de Macaco:
[0120] MSAQESCLSLIKYFLFVFNLFFFVILGSLIFCFGIWILIDKTSFVSFVGL AFVPLQIWSKVLAISGVFTMGLALLGCVGALKELRCLLGLYFGMLLLLFATQITLGILIST QRAQLERSLQDIVEKTIQRYHTNPEETAAEESWDYVQFQLRCCG HSPQDWFQVLTLRGNG SEAHRVPCSCYNLSATNDSTILDKVILPQLSRLGQLARSRHSTDICAVPANSHIYREGCAR SLQKWLH NLISIVGICLGVGLLELGFMTLSIFLCR LDHVYNRLRYR (SEQ ID NO: 2) CD37 murino (NP_031671) : MSAQESCLSLIKYFLFVFNLFFFVLGGLIFCFGTWILIDKTSFVSFVGLSFVPLQT WSKVLAVSGVLTMALALLGCVGALKELRCLLGLYFGMLLLLFATQITLGILISTQRVRLER RVQELVLRTIQSYRTNPDETAAEESWDYAQFQLRCCGWQSPRDWN AQMLKANESEEPFVP CSCYNSTATNDSTVFDKLFFSQLSRLGPRAKLRQTADICALPAKAHIYREGCAQSLQ WLH N IISIVGICLGVGLLELGFMTLSIFLCRNLDHVYDRLARYR (SEQ ID NO: 3) En ciertas formas de modalidad, los agentes de unión a CD37 son anticuerpos, inmunoconjugados o polipéptidos . En algunas formas de modalidad, los agentes de unión a CD37 son anticuerpos humanizados.
En ciertas formas de modalidad, los agentes de unión a CD37 tienen uno o más de los siguientes efectos: inhibir la proliferación de células tumorales, reducir la tumorigenicidad de un tumor por la reducción de la frecuencia de las células madre de cáncer en el tumor, inhibir el crecimiento tumoral, aumentar la supervivencia, desencadenar la muerte celular de las células tumorales, diferenciar las células tumorigénicas a yb estado no -tumorigénico, o prevenir la metástasis de las células tumorales.
En ciertas formas de modalidad, los agentes de unión a CD37 son capaces de inducir la citotoxicidad dependiente de complemento. Por ejemplo, el tratamiento de las células con los agentes de unión a CD37 puede producir la actividad de CDC que reduce la viabilidad celular a menos de aproximadamente 80%, menos de aproximadamente 70%, menos de aproximadamente 60%, menos de aproximadamente 50%, menos de aproximadamente 40% o menos de aproximadamente 35% de la viabilidad celular de las células no tratadas. El tratamiento de las células con los agentes de unión a CD37 también pueden producir la actividad de CDC que reduce la viabilidad celular a aproximadamente 70-80%, aproximadamente 60-70%, aproximadamente 50-60%, aproximadamente 40-50%, o aproximadamente 30-40% de la viabilidad celular de las células no tratadas. En algunas formas de modalidad particulares, los agentes de unión a CD37 son capaces de inducir citotoxicidad dependiente de complemento en las células Ramos.
En ciertas formas de modalidad, los agentes de unión a CD37 son capaces de inducir citotoxicidad mediada por células dependiente del anticuerpo (ADCC) . Por ejemplo, el tratamiento de las células con los agentes de unión a CD37 puede producir actividad de ADCC que produce al menos aproximadamente 15%, al menos aproximadamente 20%, al menos aproximadamente 25%, al menos aproximadamente 30%, al menos aproximadamente 35%, al menos aproximadamente 40%, al menos aproximadamente 45%, al menos aproximadamente 50%, o al menos aproximadamente 60% de lisis celular. El tratamiento de células con los agentes de unión a CD37 puede producir actividad de ADCC que produce aproximadamente 10-20%, aproximadamente 20-30%, aproximadamente 30-40%, o aproximadamente 40-50% de lisis celular. El tratamiento de células con los agentes de unión a CD37 también puede producir actividad de ADCC que produce aproximadamente 10-50%, aproximadamente 20-50%, aproximadamente 30-50%, o aproximadamente 40-50% de lisis celular. En algunas formas de modalidad particulares, los agentes de unión a CD37 son capaces de inducir ADCC en las células Daudi, Ramos, y/o Granata-519.
En algunas formas de modalidad, los agentes de unión a CD37 son capaces de inducir apoptosis. Por ejemplo, el tratamiento de células con los agentes de unión a CD37 puede inducir apoptosis in al menos aproximadamente 15%, al menos aproximadamente 20%, al menos aproximadamente 25%, al menos aproximadamente 30%, al menos aproximadamente 35%, al menos aproximadamente 40%, al menos aproximadamente 45%, al menos aproximadamente 50%, o al menos aproximadamente 55% de células. En algunas formas de modalidad particulares, los agentes de unión a CD37 son capaces de inducir apoptosis en células Ramos y/o Células Raj i .
En algunas formas de modalidad, los agentes de unión a CD37 son capaces de reducir el volumen del tumor. La capacidad de un agente de unión a CD37 para reducir el volumen del tumor se puede evaluar, por ejemplo, por la medición de un valor de % de T/C, que es el volumen del tumor medio de los sujetos tratados dividido por el volumen de tumoral medio de los sujetos control. En algunas formas de modalidad, el tratamiento con un agente de unión a CD37 produce un valor de % de T/C que es menos de aproximadamente 55%, menos de aproximadamente 50%, menos de aproximadamente 45%, menos de aproximadamente 40%, menos de aproximadamente 35%, menos de aproximadamente 30%, menos de aproximadamente 25%, menos de aproximadamente 20%, menos de aproximadamente 15%, menos de aproximadamente 10%, o menos de aproximadamente 5%. En algunas formas de modalidad particulares, los agentes de unión a CD37 pueden reducir el tamaño del tumor en un modelo de xenoinjerto de BJAB y/o un modelo de xenoinjerto de SU-DHL-4.
En ciertas formas de modalidad, los inmunoconjugados u otros agentes que se unen específicamente a CD37 humano desencadena la muerte celular por medio de un agente citotóxico. Por ejemplo, en ciertas formas de modalidad, un anticuerpo para un anticuerpo de CD37 humano se conjuga a un maytansinoide que se activa en las células tumorales que expresan el CD37 por internalización de proteínas. En ciertas formas de modalidad alternativas, el agente o anticuerpo no está conjugado.
En ciertas formas de modalidad, los agentes de unión a CD37 son capaces de inhibir el crecimiento tumoral . En ciertas formas de modalidad, los agentes de unión a CD37 son capaces de inhibir el crecimiento tumoral in vivo (por ejemplo, en un modelo de xenoinjerto en ratón y/o en un ser humano que padece cáncer) .
Los agentes de unión a CD37 incluyen los anticuerpos CD37 CD37-3, CD37-12, CD37-38, CD37-50, CD37-51, CD37-56 y CD37-57 y sus fragmentos, variantes y derivados. Los agentes de unión a CD37 también incluyen los agentes de unión a CD37 que se unen específicamente al mismo epitope de CD37 como un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en CD37-3, CD37-12, CD37-38, CD37-50, CD37-51, CD37-56 y CD37-57. Los agentes de unión a CD37 también incluyen los agentes de unión a CD37 que inhiben competitivamente un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en CD37-3, CD37-12, CD37-38, CD37-50, CD37-51, CD37-56 y CD37-57.
En algunas formas de modalidad particulares, la unión de los agentes de unión a CD37 a CD37 no requiere los aminoácidos 109-138 del CD37 humano. En consecuencia, algunos agentes de unión a CD37 se unen a un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 180. En otras formas de modalidad, la unión de los agentes de unión a CD37 a CD37 se altera por la mutación de aminoácidos 202-243 del CD37 humano. En consecuencia, algunos agentes de unión a CD37 no se unen a un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 18 .
En algunas formas de modalidad, los agentes de unión a CD37 se unen a un polipéptido de la SEQ ID NO: 180 y a un polipéptido de la SEQ ID NO: 183, pero no se unen a un polipéptido de la SEQ ID NO: 184.
En algunas formas de modalidad, los agentes de unión a CD37 se unen a un polipéptido de la SEQ ID NO: 190. En algunas formas de modalidad, los agentes de unión a CD37 se unen a un polipéptido de la SEQ ID NO: 190 y un polipéptido de la SEQ ID NO: 189. En algunas formas de modalidad, los agentes de unión a CD37 se unen a un polipéptido de la SEQ ID NO: 190 y un polipéptido de la SEQ ID NO: 188.
En algunas formas de modalidad, el agente de unión a CD37 se une a un polipéptido de la SEQ ID NO: 192, pero no se unen a un polipéptido de la SEQ ID NO: 194. En algunas formas de modalidad, el agente de unión a CD37 se une a un polipéptido de la SEQ ID NO: 193, pero no se unen a un polipéptido de la SEQ ID NO: 194.
Los fragmentos peptídicos de CD37 a los que se unen ciertos agentes de unión a CD37, incluyen, pero sin limitación, fragmentos de CD37 que comprenden, consisten esencialmente en, o consisten en los aminoácidos 200-243 de la SEQ ID NO: 1, aminoácidos 202-220 o SEQ ID NO : 1 , o aminoácidos 221-243 de la SEQ ID NO : 1. En algunas formas de modalidad, el agente de unión a CD37 se une específicamente a un epitope de CD37 humano que comprende los aminoácidos 202-243 de la SEQ ID NO : 1. En algunas formas de modalidad, la unión del agente de unión a CD37 a CD37 requiere aminoácidos 202-243 de la SEQ ID NO:l. En algunas formas de modalidad, la unión del agente de unión a CD37 a CD37 requiere los aminoácidos 200-220 de la SEQ ID NO:l. En algunas formas de modalidad, la unión del agente de unión a CD37 a CD37 requiere los aminoácidos 221-243 de la SEQ ID NO : 1.
Los agentes de unión a CD37 también incluyen los agentes de unión a CD37 que comprenden las secuencias de CDR de las cadenas pesada y liviana de CD37-3, CD37-12, CD37-38, CD37-50, CD37-51, CD37-56 o CD37-57. Las CDR de las cadenas pesada y liviana de CD37-38, CD37-50, CD37-51, CD37-56 y CD37-57 contienen las secuencias relacionadas. En consecuencia, los agentes de unión a CD-37 también pueden comprender las secuencias de CDR de las cadenas pesada y liviana que comprenden una secuencia de consenso obtenida por el alineamiento de CD37-38, CD37-50, CD37-51, CD37-56 y CD37-57. Las secuencias de la CDR de CD37-3, CD37-12, CD37-38, CD37-50, CD37-51, CD37-56 y CD37-57, así como la secuencia de consenso de CD37-38, CD37-50, CD37-51, CD37-56 y CD37-57 se describen en las siguientes Tablas 1 y 2.
Tabla 1: Secuencias de aminoácidos de la CDR de la cadena pesada variable Tabla 2: Secuencias de aminoácidos de la CDR de la cadena liviana variable Anticuerpo VL-CDR1 VL--CDR2 VL-CDR3 CD37-3 RASENIRSNLA (SEQ VATNLAD (SEQ ID QHYWGTTWT (SEQ ID NO: 28) NO: 29) ID NO: 30) CD37-12 RASQSVSTSSYSILY YASNLAS (SEQ ID QHSWEIPYT (SEQ (SEQ ID NO: 31) NO: 32) ID NO: 33) CD37-38 SASSSVTYMH (SEQ ID DTSKLAS (SEQ ID QQWISNPPT (SEQ NO: 34) NO: 35) ID NO:36) CD37-50 SATSSVTY H (SEQ ID DTSKLPY (SEQ ID QQWSDNPPT (SEQ NO:37) NO: 38) ID NO: 39) Las moléculas de unión a CD37 pueden ser anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno que se unen específicamente a CD37 que comprende las CDR del CD37-3, CD37-12, CD37-50, CD37-51, CD37-56, o CD37-57 con hasta cuatro (es decir 0, 1, 2, 3 ó 4) sustituciones conservadoras de aminoácidos por CDR.
Los polipéptidos pueden comprender una de las cadenas livianas variables individuales o cadenas pesadas variables descriptas en la presente. Los anticuerpos y polipéptidos también pueden comprender cadena liviana variable y una cadena pesada variable. Las secuencias de la cadena liviana variable y cadena pesada variable de los anticuerpos CD37-3, CD37-12, CD37-50, CD37-51, CD37-56, y CD37-57 murinos, quiméricos y humanizados se proporcionan en las siguientes Tablas 3 y 4.
Tabla 3 : Secuencias de aminoácidos de la cadena pesada variable Tabla 4: Secuencias de aminoácidos de la cadena liviana variable También se proporcionan polipéptidos que comprenden: (a) un polipéptido que tiene al menos aproximadamente 90% de identidad de secuencia con las SEQ ID NOs: 55-71; y/o (b) un polipéptido que tiene al menos aproximadamente 90% de identidad de secuencia con las SEQ ID NOs : 72-87. En ciertas formas de modalidad, el polipéptido comprende un polipéptido que tiene al menos aproximadamente 95%, al menos aproximadamente 96%, al menos aproximadamente 97%, al menos aproximadamente 98%, o al menos aproximadamente 99% de identidad de secuencia con las SEQ ID NOs: 55-87. En consecuencia, en ciertas formas de modalidad, ele polipéptido comprende (a) un polipéptido que tiene al menos aproximadamente 95% de identidad de secuencia con las SEQ ID NOs: 55-71, y/o (b) un polipéptido que tiene al menos aproximadamente 95% de identidad de secuencia con las SEQ ID NOs : 72-87. En ciertas formas de modalidad, el polipéptido comprende (a) un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NOs: 55-71; y/o (b) un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NOs: 72-87. En ciertas formas de modalidad, el polipéptido es un anticuerpo y/o el polipéptido se une específicamente CD37. En ciertas formas de modalidad, el polipéptido es anticuerpo murino, quimérico o humanizado que se une específicamente CD37. En ciertas formas de modalidad, el polipéptido que tiene un determinado porcentaje de identidad de secuencia con las SEQ ID NOs : 55-87 difiere de las SEQ ID NOs: 55-87 solo en las sustituciones conservadoras de aminoácidos.
Los polipéptidos pueden comprender una de las individuales cadenas livianas o cadenas pesadas descriptas en la presente. Los anticuerpos y polipéptidos también pueden comprender una cadena liviana y una cadena pesada. Las secuencias de cadena liviana y cadena variable de los CD37-3, CD37-12, CD37-50, CD37-51, CD37-56, y CD37-57 murinos, quiméricos y humanizados se proporcionan en las siguientes Tablas 5 y 6.
Tabla 5 : Secuencias de aminoácidos de la cadena pesada longitud completa Tabla 6: Secuencias de aminoácidos de la cadena liviana longitud completa QWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEV THQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO:109) muCD37--38 QIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVTYMHWYQQKSGTSPKRWIYDT SKLASGVPA FSGGGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWISNPPTFGGG TKLEIKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASWCFLNNFYPKDINVKWKID GSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTS TSPIVKSFNRNEC (SEQ ID NO:110) chCD37 -38 QIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVTYMHWYQQKSGTSPKRWIYDT SKLASGVPARFSGGGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWISNPPTFGGG TKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLN FYPREAKVQWKVD NALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGL SSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO:lll) huCD37 -38 DIVLTQSPASMSASPGERVTMTCSASSSVTYMHWYQQKPGTSPKR IYDT SKLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWISNPPTFGGG TKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTAS CLL NFYPREAKVQWKVD NALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGL SSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 112) muCD37 -50 QIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSATSSVTYMHWYQQKSGTSPKR IYDT SKLPYGVPGRFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSDNPPTFGSG TKLEIKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASWCFLNNFYPKDINVKWKID GSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTS TSPIVKSFNRNEC (SEQ ID NO: 113) huCD37 -50 EIVLTQSPATMSASPGERVTMTCSATSS YMHWYQQKPGQSPKR IYDT SNLPYGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSDNPPTFGQG TKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVD NALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGL SSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 114) rauCD37 -51 QIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSATSSVTYMHWYQQKSGTSPKRWIYDT SKLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISNMEAEDAATYYCQQWSSNPPTFGSG TKLEIKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASWCFLNNFYPKDINVKWKID GSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTS TSPIVKSFNRNEC (SEQ ID NO: 115) huCD37 -51 EIVLTQSPATMSASPGERVTMTCSATSSVTYMHWYQQKPGQSPKRWIYDT SKLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSNPPTFGQG También se proporcionan polipéptidos que comprenden: (a) un polipéptido que tiene al menos aproximadamente 90% de identidad de secuencia con las SEQ ID NOs: 88-104; y/o (b) un polipéptido que tiene al menos aproximadamente 90% de identidad de secuencia con las SEQ ID NOs : 105-120. En ciertas formas de modalidad, el polipéptido comprende un polipéptido que tiene al menos aproximadamente 95%, al menos aproximadamente 96%, al menos aproximadamente 97%, al menos aproximadamente 98%, o al menos aproximadamente 99% de identidad de secuencia con las SEQ ID NOs : 88-120. En consecuencia, en ciertas formas de modalidad, el polipéptido comprende (a) un polipéptido que tiene al menos aproximadamente 95% de identidad de secuencia con las SEQ ID NOs : 88-104, y/o (b) un polipéptido que tiene al menos aproximadamente 95% de identidad de secuencia con las SEQ ID NOs : 105-120. En ciertas formas de modalidad, el polipéptido comprende (a) un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NOs: 88-104; y/o (b) un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NOs : 105-120. En ciertas formas de modalidad, el polipéptido es un anticuerpo y/o el polipéptido unen específicamentes CD37. En ciertas formas de modalidad, el polipéptido es un anticuerpo murino, quimérico o humanizado que se une específicamente CD37. En ciertas formas de modalidad, el polipéptido que tiene un por cierto de identidad de secuencia con las SEQ ID NOs: 88-120 difiere de las SEQ ID NOs : 88-120 solo por las sustituciones conservadoras de aminoácidos.
En ciertas formas de modalidad, el anticuerpo CD37 puede ser el anticuerpo producido de un hibridoma seleccionado del grupo que consiste en la designación de depósito de ATCC PTA-10664, depositado con el ATCC el 18 de febrero de 2010, designación de depósito de ATCC PTA-10665, depositado con el ATCC el 18 de febrero de 2010, designación de depósito de ATCC n PTA-10666, depositado con el ATCC el 18 de febrero de 2010, designación de depósito de ATCC PTA-10667 depositado con el ATCC el 18 de febrero de 2010, designación de depósito de ATCC PTA-10668, depositado con el ATCC el 18 de febrero de 2010, designación de depósito de ATCC PTA-10669, depositado con el ATCC el 18 de febrero de 2010, y designación de depósito de ATCC PTA-10670, depositado con el ATCC el 18 de febrero de 2010. En ciertas formas de modalidad, el anticuerpo comprende las VH-CDR y las VL-CDR del anticuerpo producidas de un hibridoma seleccionado del grupo que consiste en PTA-10665, PTA-10666, PTA-10667, PTA-10668, PTA-10669, y PTA-10670.
En ciertas formas de modalidad, el anticuerpo CD37 puede comprender una cadena liviana codificada por el ADN del plásmido recombinante phuCD37-3LC (designación de depósito de ATCC PTA-10722, depositado con el ATCC el 18 de marzo de 2010) . En ciertas formas de modalidad, el anticuerpo CD37 puede comprender una cadena pesada codificada por el ADN del plásmido recombinante phuCD37-3HCv .1 , 0 (designación de depósito de ATCC PTA-10723, depositado con el ATCC el 18 de marzo de 2010) . En ciertas formas de modalidad, el anticuerpo CD37 puede comprender una cadena liviana codificada por el ADN del plásmido recombinante phuCD37-3LC (PTA-10722) y una cadena pesada codificada por el ADN del plásmido recombinante phuCD37-3HCv .1,0 (PTA-10723). En ciertas formas de modalidad, el anticuerpo CD37 puede comprender las VL-CDR codificadas por el ADN del plásmido recombinante phuCD37-3LC (PTA-10722) y la VH-CDR codificada por el ADN del plásmido recombinante phuCD37-3HCv.1, 0 (PTA-10723).
Los anticuerpos monoclonales se pueden preparar usando los métodos de hibridoma, tales como los descriptos por Kohler y Milstein (1975) Nature 256:495. Usando el método del hibridoma, un ratón, hámster u otro animal huésped apropiado, se inmuniza como se describió anteriormente para estimular la producción de linfocitos de producir anticuerpos que se unirán específicamente al antígeno inmunizante. Los linfocitos también se pueden inmunizar in vitro. Después de la inmunización, los linfocitos se aislan y luego se fusionan con una línea de células de mieloma mediante un agente de fusión adecuada, usando, por ejemplo, polietilenglicol , para formar células del hibridoma que se pueden seleccionar partir de los linfocitos y las células de mieloma. Los hibridomas que producen anticuerpos monoclonales dirigidos contra un antígeno elegido determinado por inmunoprecipitación, inmunotransíerencia o por ensayo de unión in vitro (por ejemplo, radioinmunoensayo (RIA); ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima (ELISA) ) luego se pueden propagar en un cultivo in vitro usando métodos estándares (Goding, Monoclonal Antibodies: Principies and Practice, Academic Press, 1986) o in vivo como tumores ascíticos en un animal. Los anticuerpos monoclonales luego se pueden purificar del medio de cultivo o fluido ascitico descripto para los anticuerpos policlonales anteriores.
En forma alternativa, los anticuerpos monoclonales también se pueden obtener usando métodos de ADN recombinante descriptos en la patente U.S. 4.816.567. Los polinucleótidos que codifican un anticuerpo monoclonal se aislan de células B maduras o células de hibridoma, tales como por RT-PCR usando cebadores deoligonucleótidos que amplifican específicamente los genes que codifican las cadenas pesadas y livianas del anticuerpo, y su secuencia se determina usando procedimientos convencionales. Los polinucleótidos aislados que codifican las cadenas pesada y liviana luego se clonan en los vectores de expresión adecuada, que luego se transfectan en las células huésped tales como células de E. coli, células de simio COS, células de ovario de hámster chino (CHO) o células de mieloma que de otro modo no producen proteína de la inmunoglobulina, los anticuerpos monoclonales se generan por las células huésped. Asimismo, los anticuerpos monoclonales recombinantes o fragmentos de estos de las especies deseadas se pueden aislar de las bibliotecas de fagos que expresan las CDR de las especies deseadas como se describe (McCafferty et al., 1990, Nature, 348:552-554; Clackson et al., 1991, Nature, 352:624-628; y Marks et al., 1991, J. Mol. Biol., 222 : 581-597) .
El/los polinucleótido (s) que codifican un anticuerpo monoclonal también se pueden modificar de numerosas maneras diferentes usando tecnología de ADN recombinante para generar anticuerpos alternativos. En algunas formas de modalidad, los dominios constantes de las cadenas liviana y pesada de, por ejemplo, un anticuerpo monoclonal de ratón se pueden sustituir 1) para las regiones de, por ejemplo, un anticuerpo humano para generar un anticuerpo quimérico o 2) para un polipéptido no inmunoglobulina para generar un anticuerpo de fusión. En algunas formas de modalidad, las regiones constantes se truncan o eliminan para generar los fragmentos de anticuerpo deseados de un anticuerpo monoclonal. Se puede usar mutagénesis dirigida al sitio o de alta densidad de la región variable para optimizar la especificidad, afinidad, etc. de un anticuerpo monoclonal.
En algunas formas de modalidad, el anticuerpo monoclonal contra el CD37 humano es un anticuerpo humanizado. En ciertas formas de modalidad, tales anticuerpos se usan terapéuticamente para reducir la antigenicidad y las respuestas HAMA (anticuerpo anti-ratón humano) cuando se administran a un sujeto humano. Los anticuerpos humanizados se pueden producir usando varias técnicas conocidas en la materia. En ciertas formas de modalidad alternativas, el anticuerpo para CD37 es un anticuerpo humano.
Los anticuerpos humanos se pueden preparar directamente usando varias técnicas conocidas en la materia. Se pueden generar los linfocitos B humanos inmortalizados in vitro o aislados de un individuo inmunizado que produce un anticuerpo dirigido contra un antígeno blanco (Ver, por ejemplo, Colé et al., Monoclonal Antibodies and Cáncer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985); Boemer et al., 1991, J. Immunol . , 147 (1):86-95; y Patente U.S. 5.750.373). Asimismo, el anticuerpo humano se puede seleccionar de una biblioteca de fagos, donde esta biblioteca de fagos expresa anticuerpos humanos, com se describe, por ejemplo, en Vaughan et al., 1996, Nat . Biotech. , 14:309-314, Sheets et al., 1998, Proc . Nat'l. Acad. Sci., 95:6157-6162, Hoogenboom y Winter, 1991, J. Mol. Biol . , 227:381, y Marks et al., 1991, J. Mol. Biol., 222:581). Las técnicas para la generación y el uso de las bibliotecas de fago de anticuerpo también se describen en las Patentes U.S. Nros. 5.969.108, 6.172.197, 5.885.793, 6.521.404; 6.544.731; 6.555.313; 6.582.915; 6.593,081; 6.300,064; 6.653,068; 6.706.484; y 7.264.963; y Rothe et al., 2007, J. Mol. Bio . , doi : 10.1016/j . jmb.2007.12 , 018 (cada una de las cuales se incorpora por referencia en su totalidad) . Las estrategias de maduración de afinidad y las estrategias de transposición de cadenas (Marks et al., 1992, Bio/Technology 10:779-783, incorporado por referencia en su totalidad) son conocidas en la técnica y se pueden emplear para generar anticuerpos humanos de afinidad alta.
Los anticuerpos humanizados también se pueden obtener en ratones transgénicos que contienen locus de inmunoglobulina humana que tras la inmunización son capaces de producir el repertorio completo de anticuerpos humanos en ausencia de la producción de inmunoglobulina endógena. Este método se describe en las Patentes U.S. 5.545.807; 5.545.806; 5.569.825; 5.625.126; 5.633.425; y 5.661,016.
Esta invención también abarca anticuerpos biespecíficos que reconocen específicamente reconocen un CD37. Los anticuerpos biespecíficos son anticuerpos que son capaces de reconocer específicamente y unir al menos dos epitopes diferentes. Los epitopes diferentes pueden estar dentro de las misma molécula (por ejemplo, el mismo CD37) o en diferentes moléculas de modo que, por ejemplo, los anticuerpos pueden reconocer específicamente y unirse a CD37 así como, por ejemplo, 1) una molécula efectora sobre un leucocito tal como un receptor de células T (por ejemplo CD3) o receptor de Fe (por ejemplo CD64, CD32, o CD16) o 2) un agente citotóxico como se describe en detalle más adelante.
Los ejemplos de anticuerpos biespecíficos se pueden unir a dos epitopes diferentes, al menos uno de los cuales origina un polipéptido de la invención. De modo alternativo, un brazo anti-antigénico de una molécula de inmunoglobulina se puede combinar co un brazo que se une a una molécula desencadenante sobre un leucocito tal como una molécula receptora de células T (por ejemplo CD2 , CD3 , CD28, o B7) , o receptores de Fe para IgG de modo de centrar los mecanismos de defensa celular en la célula que expresa el antígeno particular. Los anticuerpos biespecíficos también se pueden usar para dirigir los agentes citotóxicos a las células que expresan un antígeno particular. Estos anticuerpos poseen un brazo de unión al antígeno y un brazo que se une a un agente citotóxico o un quelante de radionúclido, tal como EOTUBE, DPTA, DOTA, o TETA. Las técnicas para obtener anticuerpos biespecíficos son comunes en la técnica (Millstein et al., 1983, Nature 305:537-539; Brennan et al., 1985, Science 229:81; Suresh et al, 1986, Methods in Enzymol . 121:120; Traunecker et al., 1991, EMBO J. 10:3655-3659; Shalaby et al., 1992, J. Exp. Med. 175:217-225; Kostelny et al., 1992, J. Immunol . 148:1547-1553; Gruber et al., 1994, J. Immunol. 152:5368; y Patente U.S. 5.731.168). También se contemplan los anticuerpos con más de dos valencias. Por ejemplo, se pueden preparar anticuerpos triespecífieos (Tutt et al., J. Immunol. 147:60 (1991)). En consecuencia, en ciertas formas de modalidad los anticuerpos para CD37 son multiespecífieos .
En ciertas formas de modalidad se proporciona un fragmento de anticuerpo, por ejemplo, para aumentar la penetración en el tumor. Se conocen varias técnicas para la producción de los fragmentos de anticuerpo. En forma tradicional, estos fragmentos se derivaron por digestión proteolítica de anticuerpos intactos (ver, por ejemplo, Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biofisical Methods 24:107-117 (1992); En ciertas formas de modalidad, los fragmentos de anticuerpo se pueden producir en forma recombinante . Los fragmentos de anticuerpo Fab, Fv y ScFv se pueden expresar y secretar en E. coli, u otras células huésped, en consecuencia permite la producción de grandes cantidades de estos fragmentos. Tales fragmentos de anticuerpo también se pueden aislar de las bibliotecas de fagos de anticuerpo descriptas anteriormente. El fragmento de anticuerpo también puede ser lineal como se describió en la Patente U.S. 5.641.870, por ejemplo, y puede ser monoespecífico o biespecífico . Otras técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpo serán evidentes para el profesional experto.
De acuerdo con la presente invención, las técnicas se pueden adaptar para la producción de anticuerpos de cadena simple específicos para CD37 (ver U.S. Pat . N. ° 4.946.778). Además, los métodos se pueden adaptar para la construcción de bibliotecas de expresión de Fab (Huse, et al., Science 246:1275-1281 (1989)) para permitir la identificación rápida y efectiva de fragmentos Fab monoclonales con la especificidad deseada para CD37, o sus derivados, fragmentos, análogos u homólogos . Los fragmentos de anticuerpo se pueden producir por técnicas de la materia que incluyen, pero sin limitación: (a)un fragmento de F(ab')2 producido por digestión con pepsina de una molécula de anticuerpo; (b) un fragmento Fab generado por la reducción de puentes disulfuro de un fragmento F(ab')2, (c) un fragmento Fab generado por el tratamiento de la molécula de anticuerpo con papaína y un agente reductor, y (d) fragmentos Fv.
También puede ser deseable, en especial en el caso de los fragmentos de anticuerpo, modificar un anticuerpo a fin de aumentar su vida media sérica. Esto se puede obtener, por ejemplo, por la incorporación de un epitope de unión al receptor de reciclaje en el fragmento de anticuerpo por la mutación del región apropiada del fragmento de anticuerpo o por la incorporación del epitope en una marca de péptido que luego se fusiona al fragmento de anticuerpo en cualquier extremo o en la mitad (por ejemplo, por síntesis de ADN o péptidos) .
Los anticuerpos heteroconjugados también están dentro del alcance de la presente invención. Los anticuerpos heteroconjugados están compuestos de dos anticuerpos unidos en forma covalente. Tales anticuerpos, por ejemplo, se ha propuesta para dirigir las células inmunes blanco a las células no deseadas (Patente U.S. N . ° 4.676.980). Se contempla que los anticuerpos se puedan preparar in vitro usando métodos conocidos en química de síntesis de proteína, que incluyen los que involucran agentes de entrecruzamiento . Por ejemplo, las inmnunoto inas se pueden construir usando una reacción de intercambio de disulfuro o por la formación de un enlace tioéter. Los ejemplos de reactivos adecuados para este fin incluyen iminotiolato y metil-4-mercaptobutirimidato .
Para los fines de la presente invención, se debe apreciar que los anticuerpos modificados pueden comprender cualquier tipo de región variable que proporciona la asociación del anticuerpo con los polipéptidos de un CD37 humano. En este aspecto, la región variable puede comprender o derivar de cualquier tipo de mamífero que se puede inducir para montar una respuesta humoral y generar inmunoglobulinas contra el antígeno asociado al tumor deseado. Como tal, la región variable de los anticuerpos modificados puede ser, por ejemplo, de origen humano, murino, primate no humano (por ejemplo monos cynomolgus, macacos, etc.) o lupino. En algunas formas de modalidad las regiones variables y constantes de las inmunoglobulinas modificadas son humanas. En otras formas de modalidad las regiones variables de los anticuerpos compatibles (usualmente derivadas de una fuente no humana) se pueden manipular genéticamente o adaptar específicamente para mejorar las propiedades de unión o reducir la inmunogenicidad de la molécula. En este aspecto, las regiones variables útiles en la presente invención pueden ser humanizadas o alteradas de otro modo a través de la inclusión de secuencias de aminoácidos importadas.
En ciertas formas de modalidad, los dominios variables de las cadenas pesada y liviana se alteran por el reemplazo al menos parcial de una o más CDR y, si es necesario, por reemplazo parcial de la región estructural y el cambio de secuencia. Si bien las CDR pueden derivar de un anticuerpo de la misma clase o incluso subclase como el anticuerpo del cual derivan las regiones estructurales, se prevé que las CDR derivarán de un anticuerpo de diferente clase y posiblemente de un anticuerpo de una especie diferente. No siempre es necesario reemplazar todas la CDR con las CDR completa de la región variable dadora para transferir la capacidad de unión al antígeno de un dominio variable a otro. Más bien, en algunos casos solo es necesario transferir los residuos que son necesarios para mantener la actividad del sitio de unión al antígeno. Las explicaciones dadas se exponen en la Patentes U.S. Nros 5.585,089, 5.693.761 y 5.693.762, las que estarán dentro de la competencia de los expertos en la técnica, sea por la modalidad de experimentación de rutina o por el análisis de prueba y error para obtener un anticuerpo funcional con inmunogenicidad reducida.
No obstante las alteraciones en la región variable, los expertos en la técnica apreciarán que los anticuerpos modificados de esta invención comprenderán anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos de longitud completa o fragmentos inmunorreactivos de estos) en los que al menos una fracción de uno o más de los dominios de la región constante se ha suprimido o alterado de otro modo de modo de proporcionar las características bioquímicas deseadas tales como aumento de localización del tumor o reducción de la vida media cuando se compararon con un anticuerpo de aproximadamente la misma inmunogenicidad que comprende una región constante nativa o inalterada. En algunas formas de modalidad, la región constante de los anticuerpos modificados comprenderá una región constante humana. Las modificaciones en la región constante compatible con esta invención comprenden adiciones, supresiones y/o sustituciones de uno o más aminoácidos en uno o más dominios. Es decir, los anticuerpos modificados descriptos en la presente pueden comprender alteraciones o modificaciones en uno o más de los tres dominios constantes de la cadena pesada (CH1, CH2 o CH3 ) y/o en los dominios constantes de la cadena liviana (CL) . En algunas formas de modalidad, regiones constantes modificadas donde están contemplados uno o más dominios suprimidos en forma parcial o total. En algunas formas de modalidad, los anticuerpos modificados comprenderán constructos o variantes suprimidas del dominio donde el se ha eliminado el dominio CH2 completo (constructos ACH2 ) . En algunas formas de modalidad, el dominio de la región constante omitido se reemplazarán con un espaciador de aminoácidos corto (por ejemplo, 10 residuos) que proporcionan algo de flexibilidad molecular normalmente impartida por la región constante ausente.
Además de su configuración, se sabe en la técnica que la región constante media varias funciones efectoras . Por ejemplo, la unión del componente Cl del complemento a los anticuerpos activa el sistema del complemento. La activación del complemento es importante en la opsonización y lisis de los patógenos celulares. La activación del complemento también estimula la respuesta inflamatoria y también se pueden involucrar en la hipersensibilidad autoinmune. Además, los anticuerpos se unen a células por medio de la región Fe, con un sitio del receptor del Fe sobre la región Fe del anticuerpo que se une a un receptor del Fe (FcR) sobre una célula. Hay numerosos receptores del Fe que son específicos para las diferentes clases del anticuerpo, que incluyen IgG (receptores gamma) , IgE (receptores eta) , IgA (receptores alfa) e IgM (receptores mu) . La unión de anticuerpo a los receptores del Fe sobre las superficies celulares desencadena numerosas respuestas biológicas importantes y diversas que incluyen inmersión y destrucción de las partículas recubiertas de anticuerpo, depuración de complejos inmunes, lisis de células blanco recubiertas de anticuerpo por las células citolíticas (llamadas citotoxicidad mediada por células dependiente del anticuerpo o ADCC) , liberación de mediadores inflamatorias, transferencia placentaria y control de la producción de inmunoglobulin .
En ciertas formas de modalidad, los anticuerpos de unión a CD37 proporcionan funciones efectoras alteradas que, a su vez, afectan el perfil biológico del anticuerpo administrado. Por ejemplo, la supresión o inactivación (a través de mutaciones puntuales u otros medios) de un dominio de la región constante pueden reducir la unión del receptor del Fe del anticuerpo modificado circulante, de este modo aumenta la localización del tumor. En otros casos, puede ser que las modificaciones de la región constante, compatible con esta invención, unión del complemento moderado y en consecuencia reducir la vida media sérica y la asociación no específica de una citotoxina conjugada. Aún otras modificaciones de la región constante se pueden usar para eliminar uniones disulfuro o restos de oligosacáridos que permiten la mejora de la localización debido al aumento de la especificidad del antígeno o flexibilidad del anticuerpo. De modo similar, las modificaciones a la región constante de acuerdo con esta invención se pueden realizar fácilmente usando técnicas bioquímicas o ingeniería molecular bien conocidas bien dentro del ámbito del profesional experto.
En ciertas formas de modalidad, un agente de unión a CD37 que es un anticuerpo no tiene una o más funciones efectoras. Por ejemplo, en algunas formas de modalidad, el anticuerpo no tiene actividad de citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (ADCC) y/o sin actividad de citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) . En ciertas formas de modalidad, el anticuerpo no se une a un receptor del Fe y/o factores del complemento. En ciertas formas de modalidad, el anticuerpo no tiene función efectora.
Se indicará que en ciertas formas de modalidad, los anticuerpos modificados se pueden manipular genéticamente para fusionar el dominio CH3 directamente a la región bisagra de los anticuerpos modificados respectivos. En otros constructos puede ser conveniente proporcionar un péptido espaciador entre la región bisagra y los dominios de CH2 y/o CH3 modificados. Por ejemplo, los constructos compatible se pueden expresar donde se ha eliminado el dominio CH2 y el restante dominio CH3 (modificado o sin modificar) se une a la región bisagra con un espaciador de 5-20 aminoácidos. Tal espaciador se puede añadir, por ejemplo, para asegurar que los elementos reguladores del dominio constante permanezcan libres y accesibles o que la región bisagra permanezca flexible. Sin embargo, cabe mencionar que los espaciadores de aminoácidos, en algunos casos, pueden demostrar que son inmunogénicos e inducir una respuesta inmune no deseada contra el constructo. Por consiguiente, en ciertas formas de modalidad, cualquier espaciador añadido al constructo será relativamente no inmunogénico, o incluso omitido totalmente, de modo de mantener las cualidades bioquímicas deseadas de los anticuerpos modificados.
Además de la supresión de los dominios completos de la región constante, se apreciará que los anticuerpos de la presente invención pueden ser provistos por la supresión o sustitución parcial de unos pocos o incluso un aminoácido solo. Por ejemplo, la mutación de un solo aminoácido en áreas seleccionadas del dominio CH2 puede ser suficiente para reducir sustancialmente la unión al Fe y de este modo aumentar la localización del tumor. De modo similar, puede ser conveniente suprimir simplemente la parte de uno o más dominios de la región constante que controlan la función efectora (por ejemplo, unión de CLQ al complemento) por modular. Tales supresiones parciales de las regiones constantes pueden mejorar las características seleccionadas del anticuerpo (vida media sérica) mientras deja otras funciones deseables asociadas con el presente dominio de la región constante intacto. Además, como se aludió con anterioridad, las regiones constantes de los anticuerpos descriptos se pueden modificar a través de la mutación o sustitución de uno o más aminoácidos que mejora el perfil del constructo resultante. En este aspecto es posible alterar la actividad provista por un sitio de unión conservada (por ejemplo, unión de Fe) mientras que sustancialmente mantiene la configuración y el perfil inmunogénico del anticuerpo modificado. Ciertas formas de modalidad pueden comprender la adición de uno o más aminoácidos de la región constante para mejorar las características deseables tales como disminuir o aumentar la función efectora o proporciona más unión de citotoxina o carbohidratos. En tales formas de modalidad, puede ser conveniente insertar o replicar secuencias específicas derivadas de los dominios seleccionados de la región constante.
La presente invención además abarca variantes y equivalentes que son sustancialmente homólogos a los anticuerpos quiméricos, humanizados y humanos, o sus fragmentos de anticuerpos, expuestos en la presente. Estos pueden contener, por ejemplo, las mutaciones de la sustitución conservadora, es decir la sustitución de uno o más aminoácidos por aminoácidos similares. Por ejemplo, la sustitución conservadora se refiere a la sustitución de un aminoácido con otro dentro de la misma clase general tal como, por ejemplo, un aminoácido ácido con otro aminoácido ácido, un aminoácido básico con otro aminoácido básico o un aminoácido neutro con otro aminoácido neutro. Lo que se considera una sustitución conservadora de aminoácido es bien conocido en la técnica.
Los polipéptidos de la presente invención pueden ser polipéptidos recombinantes , polipéptidos naturales, o polipéptidos sintéticos que comprenden un anticuerpo, o fragmento de este, contra un CD37 humano. Será reconocido en la técnica que algunas secuencias de aminoácidos de la invención pueden variar sin efecto significativo sobre la estructura o función de la proteína. En consecuencia, la invención además incluye las variaciones de los polipéptidos que muestran actividad sustancial o que incluye las regiones de un anticuerpo, o fragmento de este, contra la proteína de CD37 . Tales mutantes incluyen supresiones, inserciones, inversiones, repeticiones y tupos de sustituciones.
Los polipéptidos y análogos se pueden modificar para contener restos químicos adicionales no normalmente parte de la proteína. Los restos derivatizados pueden mejorar la solubilidad, la vida media biológica o absorción de la proteína. Los restos también se pueden reducir o eliminar cualquiera de los efectos secundarios deseables de las proteínas y similares. Una panorama para estos restos se pueden hallar en REMINGTON ' S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 20th ed. , Mack Publishing Co . , Easton, PA (2000).
Los polipéptidos aislados descriptos en la presente se pueden producir por cualquier método adecuado conocido en la técnica. Tales métodos varían de métodos de síntesis de proteína directos para construir una secuencia de ADN que codifica las secuencias de polipéptidos codificadas y que expresa las secuencias en un huésped transformado adecuado. En algunas formas de modalidad, una secuencia de ADN se construye usando una tecnología recombinante por el aislamiento o síntesis de una secuencia de ADN que codifica una proteína tipo salvaje de interés. Opcionalmente, la secuencia se puede rautagenizar por mutagénesis específica del sitio para proporcionar sus análogos funcionales. Ver, por ejemplo Zoeller et al., Proc . Nat'l. Acad. Sci. USA 81:5662-5066 (1984) y Patente U.S. N. ° 4.588.585.
En algunas formas de modalidad una secuencia de ADN que codifica un polipéptido de interés se debe construir por síntesis química usando un sintetizador de oligonucleótido . Tales oligonucleótidos se pueden diseñar sobre la base de la secuencia de aminoácidos del polipéptido deseado y seleccionar los codones que están favorecidos en la célula huésped en los que se producirá el polipéptido recombinante de interés. Los métodos estándares se pueden aplicar para sintetizar una secuencia de polinucleótido aislada que codifica un polipéptido de interés aislado. Por ejemplo, una secuencia de aminoácidos completa se puede usar para construir un gen retraducido. Además, se puede sintetizar un oligómero de ADN que contiene una secuencia de nucleótidos que codifica para el polipéptido aislado particular. Por ejemplo, se pueden sintetizar varios oligonucleótidos pequeños que codificar las porciones del polipéptido y luego ligar. Los oligonucleótidos individuales normalmente contienen proyecciones 5' o 3' para el ensamblaje complementario .
Una vez ensamblado (por síntesis, mutagénesis dirigido al sitio u otro método) , las secuencias del polinucleótido que codifican un particular polipéptido aislado particular de interés se insertará en un vector de expresión y operativamente unido a una secuencia de control de expresión apropiado para la expresión de la proteína en un huésped deseado. El ensamblaje apropiado se puede confirmar por secuenciación de nucleótidos, mapeo por restricción, y expresión de un polipéptido biológicamente activo en un huésped adecuado. Como es bien conocido en la técnica, a fin de obtener altos niveles de expresión de un gen transfectado en un huésped, el gen se debe unir operativamente a las secuencias de control de expresión transcripcional y traduccional que son funcionales en el huésped de expresión elegido.
En ciertas formas de modalidad, los vectores de expresión recombinante se usan para amplificar y expresar anticuerpos que codifican ADN, o sus fragmentos, contra el CD37 humano. Vectores de expresión recombinante son constructos de ADN replicables que tienen fragmentos de ADN sintéticos o derivados de ADNc que codifican una cadena polipeptídica de un anticuerpo anti-CD37, o fragmento de este, operativamente unido a los elementos reguladores de transcripción o traducción derivado de genes mamífero, microbiana, viral o insecto. Una unidad de transcripción generalmente comprende un ensamblaje de (1) un elemento o elementos genéticos que tiene un papel regulador de la expresión génica, por ejemplo, promotores o potenciadores de transcripción, (2) una secuencia estructural o codificadora que se transcribe en ARNm y se traduce en la proteína, y (3) secuencias de iniciación y terminación de transcripción y traducción apropiadas, como se describe en detalle más adelante. Tales elementos reguladores pueden incluir una secuencia operadora de transcripción control. La capacidad de replicar en un huésped, usualmente conferida por un origen de replicación, y adicionalmente se puede incorporar un gen de selección para facilitar el reconocimiento de transformantes. Las regiones de ADN están unidas operativamente cuando ellos están funcionalmente relacionados entre sí. Por ejemplo, el ADN para un péptido señal (líder secretor) está operativamente unido al ADN para un polipéptido si se expresa como un precursor que participa en la secreción del polipéptido; un promotor está operativamente unido a una secuencia codificadora si este controla la transcripción de la secuencia; o un sitio de unión a ribosoma está operativamente unido a una secuencia codificadora si se ubica de modo para permitir la traducción. Los elementos estructurales deseados para el uso en sistemas de expresión de levaduras incluyen una secuencia líder que permite la secreción extracelular de la proteína traducida por una célula huésped. Alternativamente, donde la proteína recombinante se expresa sin un líder o secuencia de transporte, pueden incluir un residuo de metionina N-terminal. Este residuo opcionalmente posteriormente se puede escindir de la proteína recombinante expresada para proporcionar un producto final.
La elección de la secuencia de control de expresión y el vector de expresión dependerá de la elección del huésped. Se puede emplear una amplia variedad de las combinaciones del huésped/vector de expresión. Los vectores de expresión útiles para los huéspedes eucarióticos , incluyen, por ejemplo, vectores que comprende secuencias de control de expresión del SV40, virus del papiloma bovino, adenovirus y citomegalovirus . Los vectores de expresión útiles para los huéspedes bacterianos incluyen plásmidos bacterianos conocidos, tales como plásmidos de Escherichia coli, que incluye pCRl, pBR322, pMB9 y sus derivados, plásmidos de intervalo de huésped más amplios, tales como 13 y fagos de ADN de cadena simple filamentosos.
Las células huésped adecuadas para la expresión de un polipéptido de unión al CD37 o anticuerpo (o una proteína de CD37 para usar como un antígeno) incluyen los procariotas, levaduras, insectos o células eucarióticas superiores bajo el control de promotores apropiados . Los procariotas incluyen organismos gramnegativos o grampositivos , por ejemplo E. coli o bacilos. Las células eucarióticas superiores incluyen líneas celulares establecidas de origen mamífero como se describe a continuación. También se pueden emplear sistemas de traducción libres de células. Los vectores de clonación y expresión apropiados para usar con las huéspedes celulares bacterianos, fúngicos, levadura y mamífero se describen en Pouwels et al. (Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, N.Y., 1985), cuya descripción relevante se incorpora en la presente por referencia. La información adicional respecto de los métodos de producción de proteína, que incluye la producción de anticuerpos, se pueden hallar, por ejemplo, en la Publicación de la patente U.S. N.° 2008/0187954, Patentes U.S. Nros . 6.413.746 y 6.660.501, y la Publicación de patente internacional N.° WO 04009823, cada una de las cuales se incorpora en la presente por referencia en la presente en su totalidad.
Varios sistemas de cultivo celular de mamíferos o insectos también se emplean ventajosamente para expresar la proteína recombinante . La expresión de proteínas recombinantes en las células de mamífero se puede realizar porque tales proteínas generalmente se pliegan correctamente, se modifican en forma apropiada y completamente funcional. Los ejemplos de líneas de células huésped de mamífero adecuadas incluyen las líneas COS-7 de células de riñon de mono, descriptas por Gluzman (Cell 23:175, 1981), y otras líneas celulares capaces de expresar un vector apropiado que incluye, por ejemplo, células L, líneas celulares C127, 3T3, ovario de hámster chino (CHO) , HeLa y BHK. Los vectores de expresión de mamífero pueden comprender elementos no transcriptos tales como un origen de replicación, un promotor adecuado y potenciador ligado al gen por expresar, y otras secuencias no transcriptas flanqueantes 5' o 3', y secuencias no traducidas 5' o 3', tales como sitios de unión a ribosomas necesarios, un sitio de poliadenilación, sitios dadores y aceptores de empalme, y secuencias de terminación de transcripción. Los sistemas de baculovirus para la producción de proteínas heterólogas en las células de insecto son revisadas por Summers, Bio/Technology 6:47 (1988).
Las proteínas producidas por un huésped transformado se pueden purificar de acuerdo con cualquier método adecuado. Tales métodos estándares incluyen cromatografía (por ejemplo, cromatografía en columna de intercambio iónico, afinidad y tamaño), centrifugación, solubilidad diferencial, o por cualquier otra técnica estándar para la purificación de proteína. Las marcas de afinidad tales como hexahistidina, dominio de unión a maltosa, secuencia de cubierta de influenza y glutation-S-transferasa se pueden fijar a la proteína para permitir la purificación fácil por el pasaje sobre una columna de afinidad apropiada. Las proteínas aisladas también se caracterizan físicamente usando técnicas tales como proteólisis, resonancia magnética nuclear y cristalografía de rayos X.
Por ejemplo, los sobrenadantes de los sistemas que secretan la proteína recombinante en el medio de cultivo se pueden concentrar primero usando un filtro de concentración de proteína disponible en el comercio, por ejemplo, una unidad de ultrafiltración Amicon o Millipore Pellicon. Después de la etapa de concentración, el concentrado se puede aplicar a una matriz de purificación adecuada. En forma alternativa, se puede emplear una resina de intercambio de anión, por ejemplo, una matriz o sustrato que tiene grupos dietilaminoetilo (DEAE) laterales. Las matrices pueden ser acrilamida, agarosa, dextrano, celulosa u otros tipos comúnmente empleados en la purificación. En forma alternativa, se puede emplear una etapa de intercambio de catión. Los intercambiadores de cationes adecuados incluyen varias matrices insolubles que comprenden grupos sulfopropilo o carboximetilo . Finalmente, se pueden emplear una o más etapas de cromatografía líquida alto rendimiento de fase inversa (RP-HPLC) que emplea un medio RP-HPLC hidrofóbico, por ejemplo, gel de sílice que tiene grupos alifáticos metilo u otros alifáticos laterales para purificar adicionalmente un agente de unión a CD37. También se pueden emplear algunas o todas las etapas de purificación precedentes, en varias combinaciones, para proporcionar una proteína recombinante homogénea .
La proteína recombinante producida en el cultivo bacteriano se puede aislar, por ejemplo, por la extracción inicial de los pellet celulares, seguidos por una o más etapas de concentración, remoción de sales, cromatografía de intercambio iónico acuoso o exclusión de tamaño. Se puede emplear cromatografía líquida de rendimiento alto (HPLC) para las etapas de purificación final. Las células microbianas empleadas en la expresión de una proteína recombinante se pueden alterar por cualquier método conveniente, que incluyen ciclado congelado-descongelado, sonicación, disrupción mecánica, o uso de agentes de lisado celular.
Los métodos conocidos en la técnica para purificar anticuerpos y otras proteínas también incluyen, por ejemplo, los descriptos en Publicación de la patente U.S. N. ° 2008/0312425, 2008/0177048, y 2009/0187005, cada uno de los cuales se incorpora por la presente por referencia en la presente en su totalidad.
En ciertas formas de modalidad, el agente de unión a CD37 es un polipéptido que no es un anticuerpo. Se conoce una variedad de métodos para identificar y producir polipéptidos no anticuerpo que se unen con alta afinidad a una blanco de proteína en la técnica. Ver, por ejemplo, Skerra, Curr. Opin. Biotechnol., 18:295-304 (2007), Hosse et al., Protein Science, 15:14-27 (2006), Gilí et al., Curr . Opin. Biotechnol., 17:653-658 (2006), Nygren, FEBS J. , 275:2668-76 (2008), y Skerra, FEBS J., 275:2677-83 (2008), cada uno de los cuales se incorpora por la presente por referencia en la presente en su totalidad. En ciertas formas de modalidad, se ha usado la tecnología de despliegue de fagos para identificar/producir el polipéptido de unión al CD37. En ciertas formas de modalidad, el polipéptido comprende un armazón de proteínas de un tipo seleccionado del grupo que consiste en proteína A, una lipocalina, un dominio de fibronectina, un dominio de repetición de ankirina, y tiorredoxina .
En algunas formas de modalidad, el agente es una molécula no proteína. En ciertas formas de modalidad, el agente es una molécula pequeña. Las bibliotecas y técnicas de química combinatorias útiles en la identificación de agentes de unión a CD37 no proteína son conocidos por los expertos en la técnica. Ver, por ejemplo, Kennedy et al., J. Comb. Chem, 10:345-354 (2008), Dolle et al, J. Comb. Chem., 9:855-902 (2007), y Bhattacharyya, Curr. Med. Chem., 8:1383-404 (2001), cada uno de los cuales se incorpora por referencia en la presente en su totalidad. En ciertas formas de modalidad adicionales, el agente es un carbohidrato, un glicosaaminoglicano, una glicoproteína o un proteoglicano .
En ciertas formas de modalidad, el agente es un aptámero del ácido nucleico. Los aptámeros son moléculas de polinucleótidos que se han seleccionado (por ejemplo, de las mezclas aleatorias o mutagenizadas) sobre la base de su capacidad para unirse a otra molécula. En algunas formas de modalidad, el aptámero comprende un polinucleótido de ADN. En ciertas formas de modalidad alternativas, el aptámero comprende un polinucleótido de ARN. En ciertas formas de modalidad, el aptámero comprende uno o más residuos de ácido nucleico modificados. Los métodos de generar y detectar aptámeros de ácido nucleico para la unión a proteínas son bien conocidos en la técnica. Ver, por ejemplo, Patente U.S. N.° 5.270.163, Patente U.S. . ° 5.683.867, Patente U.S. N. ° 5.763.595, Patente U.S. N.° 6.344.321, Patente U.S. N.° 7.368.236, Patente U.S. N.° 5.582.981, Patente U.S. N.° 5.756.291, Patente U.S. N.° 5.840.867, Patente U.S. . ° 7.312.325, Patente U.S. N.° 7.329.742, Publicación de patente internacional N.° WO 02/077262, Publicación de patente internacional N.° WO 03/070984, Publicación de la solicitud de la Patente U.S. N.° 2005/0239134, Publicación de la solicitud de la Patente N.° 2005/0124565, y Patente U.S. Applicación Publicación N.° 2008/0227735, cada uno de los cuales se incorpora por referencia en la presente en su totalidad.
III. Inmunoconjugados La presente invención también se refiere a conjugados (también denominados en la presente como inmunoconjugados) , que comprende el anticuerpos anti-CD37, fragmentos de anticuerpo, y sus equivalentes funcionales como se describe en la presente, ligado o conjugado a un fármaco o profármaco. Los fármacos o profármacos adecuados son conocidos en la técnica. Los fármacos o profármacos pueden ser agentes citotóxicos. El agente citotóxico usado en el conjugado citotóxico de la presente invención pueden ser cualquier compuesto que produzca la muerte de una célula, o induce la muerte celular o de alguna manera disminuye la viabilidad celular, e incluye, por ejemplo, maytansinoides y análogos de maytansinoide . Otros agentes citotóxicos adecuados son por ejemplo benzodiacepinas , taxoides, análogos de CC-1065 y CC-1065, análogos de duocarmicinas y duocarmicina, enediínas, tales como análogos de calicheamicinas , dolastatina y dolastatina que incluyen auristatinas , derivados de tomaymicina, derivados de leptomicina, metotrexato, cisplatino, carboplatino, daunorrubicina, doxorrubicina, vincristina, vinblastina, melfalan, mitomicina C, clorambucilo y morfolino doxorrubicina.
Tales conjugados se pueden preparar usando un grupo de unión a fin de ligar un fármaco o profármaco al anticuerpo o equivalente funcional. Los grupos de unión adecuados son bien conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, grupos disulfuro, grupos tioéter, grupos lábiles al ácido, grupos fotolábiles, grupos lábiles a peptidasa y grupos lábiles a esterasa .
El fármaco o profármaco, por ejemplo, puede ligarse al anticuerpo anti-CD37 o fragmento de este a través de un puente disulfuro. La molécula ligadora o agente de entrecruzamiento comprende un grupo químico reactivo que puede reaccionar con el anticuerpo anti-CD37 o fragmento de este. Los grupos químicos reactivos para la reacción con el agente de unión celular pueden ser esteres N-succinimidílicos y esteres N-sulfosuccinimidílicos . Adicionalmente la molécula ligadora comprende un grupo químico reactivo, que puede ser un grupo ditiopiridilo que puede reaccionar con el fármaco para formar un enlace disulfuro. Las moléculas ligadoras incluyen, por ejemplo, 3- (2-piridilditio) propionato de iV-succinimidilo (SPDP) (ver, por ejemplo, Carlsson et al., Biochem. J. , 173: 723-737 (1978)) o 4- (2-piridiltio) pentanoato de N-succinimidilo (SPP) (ver, por ejemplo, Patente U.S. N.° 4,563,304), 4- ( 2-piridilditio) 2-sulfobutanoato de N-succinimidilo (sulfo-SPDB) (ver US Publicación N.° 20090274713), 4- (2-piridilditio) pentanoate (SPP) de iV-succinimidilo (ver, por ejemplo, número de registro CAS 341498-08-6) , 2-iminotiolano, o anhídrido acetilsuccínico . Por ejemplo, el anticuerpo o agente de unión celular se puede modificar con los reactivos de entrecruzamientos y el anticuerpo o agente de unión celular que contiene grupos tiol libres o protegidos así derivados luego se hace reaccionar con un maytansinoide que contiene disulfuro o tiol para producir conjugados. Los conjugados se pueden purificar por cromatografía, que incluye, pero sin limitación HPLC, exclusión por tamaño, adsorción, intercambio iónico y captura de afinidad, diálisis o filtración con flujo tangencial .
En otro aspecto de la presente invención, el anticuerpo anti-CD37 se une a fármacos citotóxicos por medio de enlaces disulfuro y un espaciador de polietilenglicol para aumentar la potencia, solubilidad o la eficacia del inmunoconjugado . Tales ligadores hidrofílicos escindibles se describen en WO2009/0134976. El beneficio adicional de este diseño del ligador es la relación de monómero alta deseada y la mínima agregación del conjugado de anticuerpo-fármaco. Se contempla específicamente en este aspecto los conjugados de los agentes de unión celular y se describen los fármacos ligados por medio los espaciadores de polietilenglicol que portan grupos disulfuro (-S-S-) ( (CH2CH20) n=1_14) con un estrecho intervalo de la carga del fármaco de 2-8 que muestran actividad biológica potente relativamente altas hacia las células cancerosas y tienen las propiedades bioquímicas deseadas de alto rendimiento de conjugación y relación de monómero alta con mínima agregación de proteína.
Se contempla específicamente en este aspecto es un conjugado de anticuerpo anti-CD37 fármaco de la fórmula (I) o un conjugado de fórmula (I1) : CB- [Xi- (-CH2-CH20-) n-Y-D] m ( I) [D-Y- (-CH2-CH20-)n-Xi]m-CB (?') donde : CB representa un anticuerpo anti-CD37 o fragmento; D representa un fármaco; X representa una unidad alif tica, una aromática o una heterocíclica para el agente de unión celular por medio de un enlace tioéter, un enlace amida, un enlace carbamato, o un enlace éter; Y representa una unidad alifática, una aromática o una heterocíclica para el fármaco por medio de un enlace disulfuro; 1 es 0 ó 1; m es un número entero de 2 a 8 ; y n es un número entero de 1 a 24.
En algunas formas de modalidad, m es un número entero de 2 a 6.
En algunas formas de modalidad, m es un número entero de 3 a 5.
En algunas formas de modalidad, n es un número entero de 2 a 8. En forma alternativa, como se describe en, por ejemplo, las Patentes U.S. N. ° 6.441.163 y 7.368.565, el fármaco se puede modificar primero para introducir un éster reactivo adecuado para reaccionar con un agente de unión celular. La reacción de estos fármacos que contienen un resto ligador activado con un agentes de unión celular proporciona otro método de producir un conjugado de agente de unión celular y fármaco. Los maytansinoides también se pueden ligar al anticuerpo anti-CD37 o fragmento usando los grupos de unión a PEG, que se expone por ejemplo en la Patente U.S. 6.716.821. Estos grupos de unión no escindibles de PEG son solubles tanto en agua como en solventes no acuosos, y se pueden usar para unir uno o más agentes citotóxicos a un agente de unión celular. Los ejemplos de grupos de unión a PEG incluyen ligadores de PEG heterobifuncionales que reaccionan con agentes citotóxicos y agentes de unión celular en los extremos opuestos de los ligadores a través de un grupo funcional sulfhidrilo o disulfuro en un extremo, y un éster activo en el otro extremo. A modo de ejemplo general de la síntesis de un conjugado citotóxico usando un grupo de unión a PEG, se hace referencia nuevamente a la Patente U.S. 6.716.821 que es incorporado enteramente por referencia en la presente. La síntesis comienza con la reacción de uno o más agentes citotóxicos que portan un resto de PEG reactivo con un agente de unión celular, lo que produce el desplazamiento del éster activo terminal de cada resto de PEG reactivo por un residuo de aminoácido del agente de unión celular, para producir un conjugado citotóxico que comprende uno o más agentes citotóxicos unidos en forma covalente a un agente de unión celular a través de un grupo de unión de PEG. En forma alternativa, la unión celular se puede modificar con el agente de entrecruzamiento PEG bifuncional para introducir un resto disulfuro reactivo (tal como un piridildisulfuro) , que luego se puede tratar con un maytansinoide que contiene tiol para proporcionar un conjugado. En otro método, la unión celular se puede modificar con el agente de entrecruzamiento PEG bifuncional para introducir un resto tiol que luego se puede tratar con un reactive maytansinoide que contiene disulfuro (tales como un piridildisulfuro) , para proporcionar un conjugado.
También se pueden preparar conjugados de anticuerpo-maytansinoide con uniones no escindibles. Tales agentes de entrecruzamiento se describen en la técnica (ver Publicación US N . ° 20050169933) e incluyen, pero sin limitación, 4-(maleimidometil) ciclohexanocarboxilato de .N-succinimidilo (SMCC) . En algunas formas de modalidad, el anticuerpo se modifica con reactivos de entrecruzamiento tales como 4-(N-maleimidometil) -ciclohexano-1-carboxilato de succinimidilo (SMCC) , sulfo-SMCC, éster de maleimidobenzoil-N-hidroxiccinimida (MBS) , sulfo-MBS o succinimidil-yodoacetato , como se describe en la bibliografía, para introducir 1-10 grupos reactivos (Yoshitake et al, Eur. J. Biochem. , 101:395-399 (1979); Hashida et al, J. Applied Biochem., 56-63 (1984); y Liu et al, Biochem. , 18:690-697 (1979)). El anticuerpo modificado luego se hace reaccionar con el maytansinoide que contiene el derivado de tiol para producir un conjugado. El conjugado se puede purificar por filtración con gel a través de una columna Sephadex G25 o por diálisis o filtración con flujo tangencial. Los anticuerpos modificados se tratan con el maytansinoide que contiene tiol (1 a 2 grupos equivalente molar/maleimido) y conjugados de anticuerpo-maytansinoide se purifican por la filtración con gel a través de una columna de Sephadex G-25, cromatografía en una columna de hidroxiapatita cerámica, diálisis o filtración con flujo tangencial o una combinación de métodos de estos. Normalmente, se unen un promedio de 1-10 maytansinoides por anticuerpo. Un método es para modificar los anticuerpos con 4- (N-maleimidometil) -ciclohexano-1-carboxilato de succinimidilo (SMCC) para introducir grupos maleimido seguido por la reacción del anticuerpo modificado con un maytansinoide que contiene tiol para dar un conjugado ligado a tioéter. Nuevamente los conjugados con 1 a 10 moléculas de fármaco por resultado de molécula de anticuerpo. Los conjugados de maytansinoide de anticuerpos, fragmentos de anticuerpo, y otras proteínas se preparan de la misma manera.
En otro aspecto de la invención, el anticuerpo CD37 está unido al fármaco por medio de un enlace no escindible a través de la intermediación de un espaciador de PEG. Los reactivos de entrecruzamiento adecuados que comprenden cadenas de PEG hidrofílicas que forman ligadores entre un fármaco y el anticuerpo anti-CD37 o fragmento también son bien conocidos en la técnica, o están disponibles en el comercio (por ejemplo, en Quanta Biodesign, Powell, Ohio) . Los agentes de entrecruzamiento que contienen PEG adecuados también se pueden sintetizar a partir de PEG disponibles en el comercio por sí mismos usando técnicas de química de síntesis estándares conocidos por los expertos en la técnica. Los fármacos pueden reaccionar con ligadores cruzados que contienen PEG bifuncionales para dar compuestos de la siguiente fórmula, Z -Xi- (-CH2-CH2-0-) n-Yp-D, por métodos descriptos en detalle en la Publicación de patente US 20090274713 y en O2009/0134976 , que luego pueden reaccionar con el agente de unión celular para proporcionar un conjugado. En forma alternativa, la unión celular se puede modificar con el agente de entrecruzamiento PEG bifuncional para introducir un grupo reactivo con tiol (tales como una maleimida o haloacetamida) que luego se puede tratar con un maytansinoide que contiene tiol para proporcionar un conjugado. En otro método, la unión celular se puede modificar con el agente de entrecruzamiento PEG bifuncional para introducir un resto tiol que luego se puede tratar con un maytansinoide reactivo con tiol (tal como un maytansinoide portador de una maleimida o haloacetamida) , para proporcionar un conjugado.
Por consiguiente, otro aspecto de la presente invención es un conjugado de anticuerpo anti-CD37 y fármaco de fórmula (II) o de fórmula (II1) : CB- [Xi- (-CH2-CH2-0-)n-Yp-D]m (II) [D-Yp- ( -CH2-CH2-0- ) n-Xi] m-CB ( II ' ) donde, CB representa un anticuerpo anti-CD37 o fragmento; D representa a fármaco; X representa una unidad alifática, una aromática o una heterocíclica unido al agente de unión celular por medio de un enlace tioéter, un enlace amida, un enlace carbamato, o un enlace éter; Y representa una unidad alifática, una aromática o una heterocíclica unido al fármaco por medio de un enlace covalente seleccionado del grupo que consiste en un enlace tioéter, un enlace amida, un enlace carbamato, un enlace éter, un enlace amida, un enlace carbono-carbono y un enlace hidrazona ; 1 es 0 ó 1; p es 0 ó 1; m es un número entero de 2 a 15; y n es un número entero de 1 a 2000.
En algunas formas de modalidad, m es un número entero de 2 a 8; y En algunas formas de modalidad, n es un número entero de 1 a 24.
En algunas formas de modalidad, m es un número entero de 2 a 6.
En algunas formas de modalidad, m es un número entero de 3 a 5.
En algunas formas de modalidad, n es un número entero de 2 a 8. Los ejemplos de ligadores que contienen PEG adecuados incluyen ligadores que tiene un resto éster N-succinimidílico o éster N-sulfosuccinimidílico para la reacción con el anticuerpo anti-CD37 o fragmento de este, asi como el resto basado en maleimido- o haloacetilo para la reacción con el compuesto. Un espaciador de PEG se puede incorporar en cualquier agente de entrecruzamiento conocido en la técnica por los métodos descriptos en la presente.
Muchos de los ligadores descriptos en la presente se describen en detalle en la Publicación de la patente U.S. Nos. 20050169933 y 20090274713, y en WO2009/0134976 ; cuyos contenidos se incorporan por completo en la presente por referencia.
La presente invención incluye aspectos donde aproximadamente 2 a aproximadamente 8 moléculas de fármaco ("carga de fármaco"), por ejemplo, maytansinoide , se ligan a un anticuerpo anti-CD37 o fragmento de este, el efecto anti-tumoral del conjugado es mucho más eficaz en comparación con una carga de fármaco de un número menor o mayor de fármacos ligados al mismo agente de unión celular. "Carga de fármaco", como se usa en la presente, se refiere al número de moléculas de fármaco (por ejemplo, un maytansinoide) que se puede ligar a un agente de unión celular (por ejemplo, un anticuerpo anti-CD37 o fragmento de este) . En un aspecto, la cantidad de moléculas de fármaco que se pueden unir a un agente de unión celular pueden promediar de aproximadamente 2 a aproximadamente 8 (por ejemplo, 1,9, 2,0, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3,0, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4,0, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,9, 8,0, 8,1). Se pueden usar iV^-deacetil-iV2'- (3-mercapto-l-oxopropil) -maytansina (DM1) y N2 ' -deacetil-N2' - ( 4-mercapto- -metil-l-oxopentil ) maytansina (DM4) .
En consecuencia, en un aspecto, un inmunoconj ugado comprende 1 maytansinoide por anticuerpo. En otro aspecto, un inmunoconjugado comprende 2 maytansinoides por anticuerpo. En otro aspecto, un inmunoconj ugado comprende 3 maytansinoides por anticuerpo. En otro aspecto, un inmunocon ugado comprende 4 maytansinoides por anticuerpo. En otro aspecto, un inmunoconj ugado comprende 5 maytansinoides por anticuerpo. En otro aspecto, un inmunoconj ugado comprende 6 maytansinoides por anticuerpo. En otro aspecto, un inmunoconjugado comprende 7 maytansinoides por anticuerpo. En otro aspecto, un inmunoconjugado comprende 8 maytansinoides por anticuerpo.
En un aspecto, un inmunoconjugado comprende aproximadamente 1 a aproximadamente 8 maytansinoides por anticuerpo. En otro aspecto, un inmunoconjugado comprende aproximadamente 2 a aproximadamente 7 maytansinoides por anticuerpo. En otro aspecto, un inmunoconjugado comprende aproximadamente 2 a aproximadamente 6 maytansinoides por anticuerpo. En otro aspecto, un inmunoconjugado comprende aproximadamente 2 a aproximadamente 5 maytansinoides por anticuerpo. En otro aspecto, un inmunoconjugado comprende aproximadamente 3 a aproximadamente 5 maytansinoides por anticuerpo. En otro aspecto, un inmunoconjugado comprende aproximadamente 3 a aproximadamente 4 maytansinoides por anticuerpo .
En un aspecto, una composición que comprende inmunoconjugados tiene un promedio de aproximadamente 2 a aproximadamente 8 (por ejemplo, 1,9, 2,0, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3,0, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4,0, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,9, 8,0, 8,1) moléculas de fármaco (por ejemplo, maytansinoides) unido por el anticuerpo. En un aspecto, una composición que comprende inmunocon ugados tiene un promedio de aproximadamente 1 a aproximadamente 8 moléculas de fármaco (por ejemplo, maytansinoides) por anticuerpo. En un aspecto, una composición que comprende inmunocon ugados tiene un promedio de aproximadamente 2 a aproximadamente 7 moléculas de fármaco (por ejemplo, maytansinoides) por anticuerpo. En un aspecto, una composición que comprende inmunoconjugados tiene un promedio de aproximadamente 2 a aproximadamente 6 moléculas de fármaco (por ejemplo, maytansinoides) por anticuerpo. En un aspecto, una composición que comprende inmunoconjugados tiene un promedio de aproximadamente 2 a aproximadamente 5 moléculas de fármaco (por ejemplo, maytansinoides) por anticuerpo. En un aspecto, una composición que comprende inmunoconjugados tiene un promedio de aproximadamente 3 a aproximadamente 5 moléculas de fármaco (por ejemplo, maytansinoides) por anticuerpo. En un aspecto, una composición que comprende inmunoconj ugados tiene un promedio de aproximadamente 3 a aproximadamente 4 moléculas de fármaco (por ejemplo, maytansinoides) por anticuerpo.
En un aspecto, una composición que comprende inmunoconjugados tiene un promedio de aproximadamente 2 ± 0,5, aproximadamente 3 ± 0,5, aproximadamente 4 ± 0,5, aproximadamente 5 ± 0,5, aproximadamente 6 + 0,5, aproximadamente 7 ± 0,5, o aproximadamente 8 ± 0,5 moléculas de fármaco (por ejemplo, maytansinoides) unido por el anticuerpo. En un aspecto, una composición que comprende inmunoconjugados tiene un promedio de aproximadamente 3,5 ± 0,5 moléculas de fármaco (por ejemplo, maytansinoides) por anticuerpo.
El anticuerpo anti-CD37 o fragmento de este se puede modificar por la reacción de un reactivo de entrecruzamiento bifuncional con el anticuerpo anti-CD37 o fragmento de este, de este modo produce la unión covalente de una molécula ligadora al anticuerpo anti-CD37 o fragmento de este. Como se usa en la presente, un "reactivo de entrecruzamiento bifuncional" es un resto químico que une en forma covalente un agente de unión celular a un fármaco, tal como los fármacos descriptos en la presente. En otro método, una porción del resto ligador es provista por el fármaco. En este aspecto, el fármaco comprende un resto ligador que es parte de una mayor molécula ligadora que se usa para unir el agente de unión celular al fármaco. Por ejemplo, para formar el maytansinoide DM1, la cadena lateral del grupo hidroxilo C-3 de maytansina se modifica para tener un grupo sulfhidrilo libre (SH) . Esta forma tiolada de maytansina puede reaccionar con un agente de unión celular modificado para formar un conjugado. En consecuencia, el ligador final se ensambla a partir de dos componentes, uno de los cuales es provisto por el reactivo de entrecruzamiento, mientras que el otro es provisto por la cadena lateral de DM1.
Las moléculas de fármaco también se pueden ligar a las moléculas de anticuerpo a través de una molécula portadora intermediaria tal como albúmina sérica.
Como se usa en la presente, la expresión "ligado a un agente de unión celular" o "ligado a un anticuerpo anti-CD37 o fragmento" se refiere a la molécula del conjugado que comprende al menos un derivado del fármaco unido a un agente de unión celular y anticuerpo anti-CD37 o fragmento por medio de un grupo ligador, o un precursor de este. Un grupo de unión es SMCC.
En ciertas formas de modalidad, los agentes citotóxicos útiles en la presente invención son maytansinoides y análogos de maytansinoides. Los ejemplos de maytansinoides adecuados incluyen ésteres de maytansinol y análogos de maytansinol. Se incluyen algunos fármacos que inhiben la formación de microtúbulos y que son altamente tóxicos para las células de mamífero, como son maytansinol y análogos de maytansinol.
Los ejemplos de ésteres de maytansinol adecuados incluyen los que tiene un anillo aromático modificado y los que tienen modificaciones en otras posiciones. Tales maytansinoides adecuados se describen en las Patentes U.S. Nros. 4.424.219; 4.256.746; 4.294.757; 4.307.016; 4.313.946; 4.315.929; 4.331.598; 4.361.650; 4.362.663; 4.364.866; 4.450.254; 4.322.348; 4.371.533; 5.208.020; 5.416.064; 5.475.092; 5.585.499; 5.846.545; 6.333.410; 7.276.497 y 7.473.796.
En una cierta modalidad, los inmunoconjugados de la invención utilizan el maytansinoide que contiene tiol (DM1) , formalmente llamado N2' -deacetil-iV2' - ( 3-mercapto-l-oxopropil) -maytansina, como el agente citotóxico. DM1 está representado por la siguiente fórmula estructural (III) : En otra forma de modalidad, los conjugados de la presente invención utilizan el maytansinoide que contiene tiol N2' -deacetil-N2' (4-metil-4-mercapto-l- oxopentil)-maytansina (por ejemplo, DM4) como agente citotóxico. DM4 está representado por la siguiente fórmula estructural (IV) : Otro raaytansinoide que comprende una cadena lateral que contiene un enlace tiol impedido estéricamente es N2'- deacetil-iV-2' (4-mercapto-l-oxopentil) -maytansina (denominado DM3) , representado por la siguiente fórmula estructural (V) : Cada uno de los maytansinoides descriptos en la Patente US N.° 5.208.020 y 7.276.497, también se pueden usar en el conjugado de la presente invención. En este aspecto, la descripción completa de 5.208.020 y 7.276.697 se incorpora en la presente por referencia.
Muchas posiciones de los maytansinoides pueden servir como la posición para unir químicamente el resto ligador. Por ejemplo, se espera que la posición C-3 que tiene un grupo hidroxilo, la posición C-14 modificada con el hidroximetilo, la posición C-15 modificada con hidroxi y la posición C-20 que tiene un grupo hidroxi sean útiles. En algunas formas de modalidad, la posición C-3 sirve como la posición para unir químicamente el resto ligador, y en algunas formas de modalidad particulares, la posición C-3 del maytansinol sirve como la posición para unir químicamente el resto ligador.
Las representaciones estructurales de algunos conjugados muestran a continuación: (VII) (VIII) (XI) (XIII) Varias descripciones para producir tales conjugados de anticuerpo-maytansinoide se proporcionan en las Patentes U.S. Nros. 6.333.410, 6.441.163, 6.716.821, y 7.368.565, cada uno de los cuales se incorpora en la presente en su totalidad.
En general, una solución de un anticuerpo en buffer acuoso se puede incubar con un exceso molar de maytansinoides que tiene un resto disulfuro que porta un grupo reactivo. La mezcla de reacción se puede inactivar por la adición de exceso de amina (tal como etanolamina, taurina, etc.) . El conjugado de maytansinoide-anticuerpo luego se puede purificar por filtración en gel .
El número de moléculas de maytansinoide unidas por la molécula de anticuerpo se puede determinar por la medición espectrofotométrica de la relación de la absorbancia a 252 nm y 280 nm. El número promedio de moléculas de maytansinoide/ant icuerpo pueden ser, por ejemplo, aproximadamente 1-10, 2-5, 3-4, o aproximadamente 3,5. En un aspecto, el número promedio de moléculas de maytans inoide/ant icuerpo es aproximadamente 3,5 ± 0,5.
Los compuestos de antraciclin , así como los derivados, intermediarios y versiones modificadas de estos, también se pueden usar para preparar inmunoconj ugados de anti-CD37. Por ejemplo, se pueden usar doxorrubicina, derivados de doxorrubicina , intermediarios de doxorrubicina y doxorrubic inas modificadas en los conjugados anti-CD37. Los ejemplos de compuestos incluidos se describen en WO 2010/009124, que se incorpora en la presente por referencia en su totalidad. Tales compuestos incluyen, por ejemplo, los compuestos de la siguiente fórmula: donde Ri es un átomo de hidrógeno, grupo hidroxi o metoxi y R2 es un grupo alcoxi Ci-C3, o una de sus sales farmacéuticamente aceptables.
Los conjugados de anticuerpos con maytansinoide u otros fármacos se pueden evaluar en cuanto a su capacidad de suprimir la proliferación de varias líneas celulares no deseadas in vi tro. Por ejemplo, las líneas celulares tales como la línea celular de linfoma humano Daudi y la línea celular de linfoma humano Ramos, se puede usar fácilmente para la evaluación de la citotoxicidad de estos compuestos. Las células por evaluar se pueden exponer a los compuestos durante 4 a 5 días y las fracciones sobrevivientes de las células medidas en los ensayos directos por métodos conocidos . Los valores de IC50 luego se pueden calcular a partir de los resultados de los ensayos.
Los inmunoconjugados , de acuerdo con algunas modalidades descriptas en la presente, se incorporan en las células. El inmunoconjugado, en consecuencia, puede ejercer un efecto terapéutico cuando es captado por, o incorporado por una célula que expresa CD37. En algunas formas de modalidad particulares, el inmunoconjugado comprende un anticuerpo, fragmento de anticuerpo, o polipéptido, ligado a un agente citotóxico por un ligador escindible, y el agente citotóxico se escinde del anticuerpo, fragmento de anticuerpo, o polipéptido, donde es incorporado por una célula que expresa CD37.
En algunas formas de modalidad, los inmunoconjugados son capaces de reducir el volumen del tumor. Por ejemplo, en algunas formas de modalidad, el tratamiento con un inmunoconjugado produce un valor de % de T/C que es al menos de aproximadamente 50%, menos de aproximadamente 45%, menos de aproximadamente 40%, menos de aproximadamente 35%, menos de aproximadamente 30%, menos de aproximadamente 25%, menos de aproximadamente 20%, menos de aproximadamente 15%, menos de aproximadamente 10%, o menos de aproximadamente 5%. En algunas formas de modalidad particulares, los inmunoconjugados pueden reducir el tamaño del tumor en un modelo de xenoinjerto de BJAB y/o un modelo de xenoinjerto de SU-DHL-4.
En otro aspecto de la invención las moléculas de ARNsi se pueden ligar a los anticuerpos de la presente invención en vez de un fármaco. Los AR si se pueden ligar a los anticuerpos de la presente invención por métodos usados comúnmente para la modificación de los oligonucleótidos (ver, por ejemplo, Publicaciones de patente US 20050107325 y 20070213292). En consecuencia el ARNsi en su forma de 3' o 5' fosforoamidita puede reaccionar con un extremo del agente de entrecruzamiento que porta un grupo funcional hidroxilo para dar un enlace éster entre el ARNsi y el agente de entrecruzamiento. De modo similar la reacción del ARNsi fosforoamidita con un agente de entrecruzamiento que porta un grupo amino terminal produce la unión del agente de entrecruzamiento al ARNsi a través de una amina. En forma alternativa, el ARNsi se puede derivatizar por métodos químicos estándares para introducir un grupo tiol. Este ARNsi que contiene tiol puede reaccionar con un anticuerpo, que ha sido modificado para introducir un resto disulfuro o maleimida activo, para producir un conjugado escindible o no escindible. Entre 1 - 20 moléculas de ARNsi se pueden ligar a un anticuerpo por este método.
III . Polinucleótidos En ciertas formas de modalidad, la invención abarca polinucleótidos que comprenden polinucleótidos que codifican un polipéptido que se une específicamente CD37 o un fragmento de tal polipéptido. Por ejemplo, la invención proporciona un polinucleótido que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un anticuerpo para un CD37 humano o codifica un fragmento de tal anticuerpo. Los polinucleótidos de la invención pueden estar en la forma de un ARN o en la forma de ADN. El ADN incluye ADNc, ADN genómico, y ADN sintético; y puede ser de cadena doble o cadena simple, y si la cadena simple puede ser la cadena codificadora o cadena no codificadora (antisentido) .
En ciertas formas de modalidad, los polinucleótidos son aislados. En ciertas formas de modalidad, los polinucleótidos son sustancialmente puros.
La invención proporciona un polinucleótido que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOS : 4-120.
La invención además proporciona un polinucleótido que comprende una secuencia seleccionada de las que se muestran en las siguientes Tablas 7-10.
Tabla 7: Secuencias de polinucleótidos de la cadena pesada variable Tabla 8 : Secuencias de polinucleótidos de la cadena liviana variable tcgttggatttatgatacctctaacctggcttcaggcgttcctgcccgct tttctggtagtggatctgggacttcctatagccttaccataagctctatg gaagccgaggacgccgctacatactactgccagcagtggagtgataaccc ccccaccttcgggcagggaaccaaattggagatcaaacgtacg (SEQ ID NO:151) Tabla 9: Secuencias de polinucleótidos de la cadena pesada de longitud completa huCD37-57 aagcttgccaccatgggctggagctgcatcattctgtttctggtggccac agcaactggcgttcacagtcaagtccaactgcaggagagcggccccggac tcctgaaaccatctcagtcactcagtctgacatgtactgtgagcggctac agcattacctcaggcttcgcttggcattggatcaggcagttccccggaaa aggtctggagtggatggggtacattctgtacagcggcagtacagtgtatt caccctccttgaaatctaggatatcaatcacacgtgatacaagcaaaaat cagttcttcctccagctgaactccgtcaccgccgcagacacagcaaccta ttattgtgctcgcggatactacggatatggcgcatggttcgcctattggg gccaggggacactcgtgaccgtttccgccgcctccacaaagggcccatca gttttccccttggctccaagttctaaatccacaagcggtggaacagctgc actgggatgcctcgttaaagattatttccctgagcctgtgacagtgagct ggaatagcggagcattgacttcaggtgtgcacacttttcccgctgtgttg cagtcctccggtctgtactcactgtccagtgtcgtaaccgtcccttctag cagcttgggaacccagacctacatctgtaacgtcaaccataaaccatcca acacaaaggtggataagaaggttgaaccaaagagctgtgataagacacat acatgccctccttgtcctgcaccagagctcctcggaggtccatctgtgtt cctgtttccccccaaacccaaggacactcttatgatctctcgtactccag aggtcacctgtgttgttgtcgacgtgagccatgaagatcccgaggttaaa ttcaactggtacgtggatggagtcgaggttcacaatgccaagaccaagcc cagggaggagcaatataattctacatatcgggtagtgagcgttctgaccg tgctccaccaagattggctcaatggaaaagagtacaagtgcaaggtgtcc aacaaggctcttcccgctcccattgagaaaactatctccaaagccaaggg gcagccacgggaaccccaggtgtatacattgcccccatctagagacgagc tgaccaagaaccaggtgagtctcacttgtctggtcaaggggttttaccct tctgacattgctgtagagtgggagtctaacggacagccagaaaacaacta caagacaactcccccagtgctggacagcgacgggagcttcttcctctact ccaagttgactgtagacaagtctagatggcagcaaggaaacgttttctcc tgctcagtaatgcatgaggctctgcacaatcactatacccagaaatcact gtcccttagcccagggtgactcgag (SEQ ID N0:161) Tabla 10: Secuencias de polinucleótidos de la cadena ana de longitud completa agtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggaga gtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcacc ctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcga agtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggg gagagtgttag (SEQ ID NO:170) También se proporciona un polinucleótido que tiene al menos aproximadamente 95%, al menos aproximadamente 96%, al menos aproximadamente 97%, al menos aproximadamente 98%, o al menos aproximadamente 99% de identidad de secuencia con las SEQ ID NOs : 121-170. En consecuencia, en ciertas formas de modalidad, el polipéptido comprende (a) un polipéptido que tiene al menos aproximadamente 95% de identidad de secuencia con las SEQ ID NOs : 121-135 o 152-161, y/o (b) un polipéptido que tiene al menos aproximadamente 95% de identidad de secuencia con las SEQ ID NOs : 136-151 o 162-170. En ciertas formas de modalidad, el polipéptido comprende (a) un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NOs: 121-135 o 152-161; y/o (b) un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NOs: 136-151 o 162-170.
En algunas formas de modalidad, el polinucleótido codifica la cadena liviana codificada por el ADN del plásmido recombinante phuCD37-3LC (designación de depósito de ATCC PTA-10722, depositado con el ATCC el 18 de marzo de 2010) o una cadena liviana que es al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95%, o al menos aproximadamente 99% idéntica a la cadena liviana codificada por phuCD37-3LC (PTA-10722) . En algunas formas de modalidad, el polinucleótido codifica la cadena pesada codificada por el ADN del plásmido recombinante phuCD37-3HCv,l,0 (designación de depósito de ATCC PTA-10723, depositado con el ATCC el 18 de marzo de 2010) o una cadena pesada que es al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95%, o al menos aproximadamente 99% idéntica a la cadena pesada codificada por phuCD37-3HCv, 1, 0 (PTA-10723). En ciertas formas de modalidad el polinucleótido es el ADN del plásmido recombinante phuCD37-3LC (PTA-10722) o el plásmido recombinante phuCD37-3HCv, 1, 0 (PTA-10723).
En ciertas formas de modalidad los polinucleótidos comprenden la secuencia codificadora para el polipéptido maduro fusionado en el mismo marco de lectura a un polinucleótido que ayuda, por ejemplo, en la expresión y secreción de un polipéptido de una célula huésped (por ejemplo una secuencia líder que funciona como una secuencia secretora para controlar el transporte de un polipéptido de la célula) . El polipéptido que tiene una secuencia líder es una preproteína y puede tener la secuencia líder escindida por la célula huésped para formar la forma madura del polipéptido. Los polinucleótidos también pueden codificar una proproteína que es la proteína madura más los residuos de aminoácidos 51 adicionales . Una proteína madura que tiene a prosecuencia es una proproteína y es una forma inactiva de la proteína. Una vez que la prosecuencia se escinde permanece una proteína madura activa.
En ciertas formas de modalidad los polinucleótidos comprenden la secuencia codificadora para el polipéptido maduro fusionado en el mismo marco de lectura para una secuencia marcadora que permite, por ejemplo, la purificación del polipéptido codificado. Por ejemplo, la secuencia marcadora puede ser una marca de hexa-histidina aportada por un vector pQE-9 para proporcionar la purificación del polipéptido maduro fusionado al marcador en el caso de un huésped bacteriano o la secuencia marcadora puede ser una marca de hemaglutinina (HA) derivada de la proteína de hemaglutinina de la influenza cuando se usa un huésped de mamífero (por ejemplo, células COS-7) .
La presente invención además se relaciona con las variantes de los polinucleótidos descriptos en la presente con anterioridad que codifican, por ejemplo, fragmentos, análogos y derivados .
Las variantes del polinucleótido pueden contener alteraciones en las regiones codificadoras, no codificadoras o ambas. En algunas formas de modalidad las variantes del polinucleótido contienen alteraciones que producen sustituciones, adiciones, o supresiones silentes, pero no alteran las propiedades o actividades del polipéptido codificado. En algunas formas de modalidad, las variantes de nucleótidos se producen por sustituciones silentes debido a la degeneración del código genético. Las variantes de polinucleótidos se pueden producir por una variedad de razones, por ejemplo, para optimizar la expresión de codón para un huésped particular (cambio de codones en el ARNm humano para los preferidos por un huésped bacteriano tal como E. coli) .
También se proporcionan los vectores y las células que comprenden los polinucleótidos descriptos en la presente.
IV.Métodos de uso y composiciones farmacéuticas Los agentes de unión a CD37 (que incluyen anticuerpos, inmunoconjugados, y polipéptidos) de la invención son útiles en una variedad de aplicaciones que incluyen, pero son limitación, métodos de tratamiento terapéutico, tales como el tratamiento del cáncer, tales como neoplasias de células B. En ciertas formas de modalidad, los agentes son útiles para inhibir el crecimiento tumoral, inducir diferenciación, reducir el volumen del tumor, y/o reducir la tumorigenicidad de un tumor. Los métodos de uso pueden ser métodos in vitro, ex vivo, o in vivo. En ciertas formas de modalidad, el agente de unión a CD37 o anticuerpo o inmunoconjugado, o polipéptido es un antagonista del CD37 humano al que se une.
En un aspecto, los anticuerpos anti-CD37 e inmunoconjugados de la invención son útiles para detectar la presencia de CD37 en una muestra biológica. El término "detectar" como se usa en la presente abarca la detección cuantitativa o cualitativa. En ciertas formas de modalidad, una muestra biológica comprende una célula o tejido. En ciertas formas de modalidad, los tejidos incluyen tejidos normales y/o cancerosos que expresan CD37 en niveles superiores respecto de otros tejidos, por ejemplo, las células B y/o tejidos asociados con las células B.
En un aspecto, la invención proporciona un método de detectar la presencia de CD37 en una muestra biológica. En ciertas formas de modalidad, el método comprende poner en contacto la muestra biológica con un anticuerpo anti- CD37 en condiciones permisivas para la unión del anticuerpo anti-CD37 a CD37, y detectar si un complejo se forma entre el anticuerpo anti-CD37 y CD37.
En un aspecto, la invención proporciona un método de diagnosticar un trastorno asociado con aumento de expresión de CD37. En ciertas formas de modalidad, el método comprende poner en contacto una célula de ensayo con un anticuerpo anti-CD37; determinar el nivel de expresión (sea en forma cuantitativa o cualitativa) de CD37 por la célula de ensayo por la detección de la unión del anticuerpo anti-CD37 a CD37; y comparar el nivel de expresión de CD37 por la célula de ensayo con el nivel de expresión de CD37 por una célula control (por ejemplo, una célula normal del mismo origen tisular que la célula de ensayo o una célula que expresa CD37 a niveles comparables con la célula normal) , en donde un mayor nivel de expresión de CD37 por la célula de ensayo en comparación con la célula control indica la presencia de un trastorno asociado con aumento de expresión de CD37. En ciertas formas de modalidad, la célula de ensayo se obtiene de un individuo que se sospecha que tiene un trastorno asociado con aumento de expresión de CD37. En ciertas formas de modalidad, el trastorno es un trastorno proliferativo celular, tal como un cáncer o un tumor.
En ciertas formas de modalidad, un método de diagnóstico o detección, tales como los descriptos anteriormente, comprende detectar la unión de un anticuerpo anti-CD37 al CD37 expresado en la superficie de una célula o en una preparación de membrana obtenida de una célula que expresa CD37 en su superficie. En ciertas formas de modalidad, el método comprende poner en contacto una célula con un anticuerpo anti-CD37 en condiciones permisivas para la unión del anticuerpo anti-CD37 al CD37, y detectar si se forma un complejo entre el anticuerpo anti-CD37 y CD37 en la superficie celular. Un ejemplo de ensayo para detectar la unión de un anticuerpo anti-CD37 al CD37 expresado en la superficie de una célula es un ensayo "FACS" .
Ciertos otros métodos se pueden usar para detectar la unión de anticuerpos anti-CD37 a CD37. Los métodos incluyen, pero sin limitación, ensayos de unión bien conocidos en la técnica, tales como transferencias western, radioinmunoensayos , ELISA (ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas), inmunoensayos "sandwich", ensayos de inmunoprecipitación, inmunoensayos fluorescentes, inmunoensayos de proteína A e inmunohistoquímica (IHC) ) .
En ciertas formas de modalidad, los anticuerpos anti-CD37 están marcados. Las marcas incluyen, pero sin limitación, marcas o residuos que se detectan directamente (tales como marcas fluorescentes, cromofóricos , electrodensa, quimioluminiscente y radiactiva) , así como residuos, tales como enzimas o ligandos, que se detectan indirectamente, por ejemplo, a través de una reacción enzimática o interacción molecular .
En ciertas formas de modalidad, los anticuerpos anti-CD37 se inmovilizan en una matriz insoluble . La inmovilización supone la separación de un anticuerpo anti-CD37 de cualquier CD37 que quedE libre en solución. Esto se obtiene en forma convencional por la insolubilización del anticuerpo anti-CD37 antes del procedimiento de ensayo, como por adsorción a una matriz o superficie insoluble en agua (Bennich et al., U.S. 3.720.760), o por acoplamiento covalente (por ejemplo, usando entrecruzamiento con glutaraldehído) , o por la insolubilización del anticuerpo anti-CD37 después de la formación de un complejo entre el anticuerpo anti-CD37 y CD37, por ejemplo, poR inmunoprecipitación.
Cualquiera de las formas de modalidad anteriores de diagnóstico o detección se puede realizar usando un inmunoconjugado de la invención en lugar o además de un anticuerpo anti-CD37.
En ciertas formas de modalidad, la enfermedad tratada con el agente de unión a CD37 o antagonista (por ejemplo, un anticuerpo anti-CD37) es un cáncer. En ciertas formas de modalidad, el cáncer se caracteriza por las células que expresan CD37 a las que se une el agente de unión a CD37 (por ejemplo, anticuerpo).
La presente invención proporciona métodos para tratar el cáncer que comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un agente de unión a CD37 a un sujeto (por ejemplo, un sujeto que necesita tratamiento) . En ciertas formas de modalidad, el cáncer es una neoplasia de células B. En ciertas formas de modalidad, el cáncer se selecciona del grupo que consiste en linfornas de células B, NHL, leucemia/linforna linfoblástico de células B precursoras y neoplasias de células B, leucemia linfocítica crónica de células B (CLL) /linforna linfocítico pequeño (SLL) , leucemia prolinfocítica de células B, linfoma linfoplasmacítico, linfoma de células del manto (MCL) , linfoma folicular (FL) , (FL) grado bajo, grado intermedio y grado alto, linfoma cutáneo del centro folicular, linfoma de zona marginal de las células B, linfoma de zona marginal de las células B tipo MALT, linfoma nodal de zona marginal de las células B, linfoma de zona marginal de las células B tipo esplénico, leucemia de células pilosas, linfoma difuso de las células B grandes, linfoma de Burkitt, plasmacitoma, mieloma de células plasmáticas, trastorno linfoproliferativo pos-trasplante, macroglobulinemia de Waldenstrom, y linfoma de células grandes anaplásico (ALCL) . En ciertas formas de modalidad, el sujeto es un ser humano.
La presente invención además proporciona métodos para inhibir el crecimiento tumoral usando los anticuerpos u otros agentes descriptos en la presente. En ciertas formas de modalidad, el método de inhibir el crecimiento tumoral comprende poner en contacto la célula con un agente de unión a CD37 (por ejemplo, anticuerpo,) in vitro. Por ejemplo, una línea celular inmortalizada o una línea celular cancerosa que expresa CD37 se cultiva en un medio al que se agrega el anticuerpo u otro para inhibir el crecimiento tumoral. En algunas formas de modalidad, las células tumorales se aislan de una muestra del paciente tal como, por ejemplo, una biopsia de tejido, efusión pleural, o muestra de sangre y se cultiva en el medio al que se agrega un agente de unión a CD37 para inhibir el crecimiento tumoral .
En algunas formas de modalidad, el método de inhibir el crecimiento tumoral comprende poner en contacto el tumor o las células tumorales con el agente de unión a CD37 (por ejemplo, anticuerpo) in vivo. En ciertas formas de modalidad, poner en contacto un tumor o célula tumoral con un agente de unión a CD37 se lleva a cabo en un modelo animal. Por ejemplo, los agentes de unión a CD37 se pueden administrar a los xenoinjertos que expresan uno o más CD37 que han crecido en ratones inmunocomprometidos (por ejemplo NOD/ratones SCID) para inhibir el crecimiento tumoral. En algunas formas de modalidad, las células madre del cáncer se aislan de una muestra del paciente tal como, por ejemplo, una biopsia de tejido, efusión pleural, o muestra de sangre y se inyecta en ratones inmunocomprometidos a los que luego se administra un agente de unión a CD37 para inhibir el crecimiento de las células tumorales. En algunas formas de modalidad, el agente de unión a CD37 se administra al mismo tiempo o inmediatamente después de la introducción de células tumorigénicas en el animal para evitar el crecimiento tumoral. En algunas formas de modalidad, el agente de unión a CD37 se administra como un agente terapéutico después de que las células tumorigénicas han crecido a un tamaño especificado.
En ciertas formas de modalidad, el método de inhibir el crecimiento tumoral comprende administrar a un sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de un agente de unión a CD37. En ciertas formas de modalidad, el sujeto es un ser humano. En ciertas formas de modalidad, el sujeto tiene un tumor o se le ha extirpado un tumor.
En ciertas formas de modalidad, el tumor expresa el CD37 al que se une el agente de unión a CD37 o anticuerpo. En ciertas formas de modalidad, el tumor sobreexpresa el CD37 humano .
Además, la invención proporciona un método de reducir la tumorigenicidad de un tumor en un sujeto, que comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un agente de unión a CD37 al sujeto. En ciertas formas de modalidad, el tumor comprende células madre de cáncer. En ciertas formas de modalidad, se reduce la frecuencia de las células madre de cáncer en el tumor por la administración del agente .
La invención además proporciona métodos de diferenciación de células tumorigénicas en células no tumorigénicas que comprende poner en contacto las células tumorigénicas con un agente de unión a CD37 (por ejemplo, por la administración del agente de unión a CD37 a un sujeto que tiene un tumor que comprende las células tumorigénicas o al que se ha extirpado tal tumor.
También se proporciona el uso de los agentes de unión a CD37, polipéptidos , o anticuerpos descriptos en la presente para inducir la diferenciación de las células, que incluyen pero sin limitación células tumorales. Por ejemplo, se prevén métodos de inducir células para diferenciar que comprende poner en contacto las células con una cantidad efectiva de un agente de unión a CD37 (por ejemplo, un anticuerpo anti-CD37) descripto en la presente. También se proporcionan métodos de inducir células en un tumor en un sujeto para diferenciar que comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un agente de unión a CD37, polipéptido, o anticuerpo al sujeto. En ciertas formas de modalidad, el tumor es un tumor pancreático. En ciertas otras formas de modalidad, el tumor es un tumor de colon. En algunas formas de modalidad, los métodos de tratamiento comprenden administrare una cantidad terapéuticamente efectiva del agente de unión a CD37, polipéptido, o anticuerpo al sujeto.
La presente invención además proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden uno o más de los agentes de unión a CD37 descriptos en la presente. En ciertas formas de modalidad, las composiciones farmacéuticas además comprenden un vehículo farmacéuticamente aceptable. Estas composiciones farmacéuticas se usan para inhibir el crecimiento tumoral y tratar cáncer en los pacientes humanos.
En ciertas formas de modalidad, las formulaciones se preparan para la conservación y el uso por la combinación de un anticuerpo o agente purificado de la presente invención con un vehículo farmacéuticamente aceptable (por ejemplo portador, excipiente) (Remington, The Science and Practice of Pharmacy 20th Edición Mack Publishing, 2000) . Los vehículos f rmacéuticamente aceptables incluyen, pero sin limitación, buffers no tóxicos tales como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos, sales tales como cloruro de sodio; antioxidantes que incluyen ácido ascórbico y metionina; conservantes (por ejemplo cloruro de octadecildimetilbencilamonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio; cloruro de bencetonio; fenol, alcohol butílico o bencílico; alquil parabenos, tales como metil o propil parabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol ; 3-pentanol; y m-cresol) ; polipéptidos de peso molecular bajo (por ejemplo menos de aproximadamente 10 residuos de aminoácidos) ; proteínas tales como albúmina sérica, gelatina o inmunoglobulinas ; polímeros hidrofílieos tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina, o lisina; carbohidratos tales como monosacáridos , disacáridos, glucosa, mañosa, o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; azúcares tales como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; contraiones formadores de sal tales como sodio; complejos metálicos (por ejemplo complejos Zn-proteína) ; y tensioactivos no iónicos tales como T EEN o polietilenglicol (PEG) .
Las composiciones farmacéuticas de la presente invención se pueden administrar de numerosas maneras para el tratamiento local o sistémico. La administración puede ser tópica (tal como en membranas mucosas que incluyen administración vaginal y rectal) tales como parches transdérmicos , ungüentos, lociones, cremas, geles, gotas oculares, supositorios, spray, líquidos y polvos; pulmonar (por ejemplo, por inhalación o insuflación de polvos o aerosoles, que incluyen por nebulizador; intratraqueal , intranasal, epidérmico y transdérmico) ; oral; o parenteral que incluye inyección o infusión intravenosa, intraarterial , subcutáneo, intraperitoneal o intramuscular; o administración intracraneana (por ejemplo, intratecal o intraventricular) .
Un anticuerpo o inmunoconjugado de la invención se puede combinar en una formulación farmacéutica combinada, o régimen de dosis como terapia de combinación, con un segundo compuesto que tiene propiedades anticáncer. El segundo compuesto de la formulación farmacéutica combinada, o régimen de dosis puede tener actividades complementarias a la ADC de la combinación de modo que ellas no se afecten adversamente entre sí. También se proporcionan composiciones farmacéuticas que comprenden el agente de unión a CD37 y el segundo agente anticáncer. Por ejemplo, los agentes de unión a CD37 se pueden administrar en combinación con los antagonistas de CD20, tales como Rituximab.
Para el tratamiento de la enfermedad, la dosis apropiada de un anticuerpo o agente de la presente invención depende del tipo de enfermedad tratada, la gravedad y curso de la enfermedad, la receptividad de la enfermedad, si el anticuerpo o agente se administra para fines terapéuticos o preventivos, terapia previa, historia clínica del paciente, y demás a criterio del médico tratante. El anticuerpo o agente se puede administrar una vez o durante una serie de tratamientos que duran de varios días a varios meses, o hasta que se efectúa la cura o se obtiene una disminución del estado de enfermedad (por ejemplo, reducción del tamaño del tumor) . Los esquemas de dosis óptima se pueden calcular a partir de las mediciones de la acumulación del fármaco en el cuerpo del paciente y variarán de acuerdo con la potencia relativa de un anticuerpo o agente individual. El médico administrante puede determinar fácilmente las dosis óptimas, metodologías de dosis y tasas de repetición. En ciertas formas de modalidad, la dosis es de 0,01 g a 100 mg por kg de peso corporal, y se puede dar una o más veces por día, semana, mes o años. En ciertas formas de modalidad, el anticuerpo u otro agente de unión a CD37 se una vez cada dos semanas o una vez cada tres semanas . En ciertas formas de modalidad, la dosis del anticuerpo u otro agente de unión a CD37 es de aproximadamente 0,1 mg a aproximadamente 20 mg por kg de peso corporal. El médico tratante puede estimar las tasas de repetición para la dosis sobre la base de los tiempos de permanencia medidos y las concentraciones del fármaco en los fluidos corporales o tejidos.
La terapia de combinación puede proporcionar "sinergia" y ser "sinérgica", es decir, el efecto obtenido cuando los ingredientes activos se usan juntos es mayor que la suma de los efectos que resultan de usar los compuestos en forma separada. Un efecto sinérgico se puede obtener cuando los ingredientes activos: (1) se coformulan y administran o aplican en forma simultánea en una formulación de unidad de dosis combinada; (2) se administra en forma alternada o en paralelo como formulaciones separadas; o (3) por algún otro régimen. Cuando se administra en terapia alternada, se puede obtener un efecto sinérgico cuando los compuestos se administran o aplican en forma secuencial, por ejemplo, por diferentes inyecciones en jeringas separadas. En general, durante la terapia alternada, se administra una dosis efectiva de cada ingrediente en forma secuencial, es decir, en forma seriada, mientras que en la terapia de combinación, las dosis efectivas de dos o más ingredientes se administran juntas .
VI. Kits que comprenden los agentes de unión a CD37 La presente invención proporciona kits que comprende los anticuerpos, inmunoconjugados u otros agentes descriptos en la presente y que se pueden usar para realizar los métodos descriptos en la presente. En ciertas formas de modalidad, un kit comprende al menos un anticuerpo purificado contra CD37 en uno o más recipientes. En algunas formas de modalidad, los kits contienen todos los componentes necesarios y/o suficientes para realizar un ensayo de detección, que incluye todos los controles, directivas para realizar los ensayos, y cualquier programa de computación para el análisis y la presentación de resultados. Los expertos en la técnica reconocerán que los anticuerpos, inmunoconjugados u otros agentes descriptos de la presente invención se pueden incorporan fácilmente en uno de los formatos del kit establecidos que son bien conocidos en la técnica.
También se proporcionan kits que comprenden un agente de unión a CD37 (por ejemplo, un anticuerpo de unión a CD37) , así como un segundo agente anticáncer. En ciertas formas de modalidad, el segundo agente anticáncer es un agente quimioterapéutico (por ejemplo, rituximab) .
Las formas de modalidad de la presente descripción también se pueden definir por referencia a los siguientes ejemplos no limitantes, que describen en detalle la preparación de ciertos anticuerpos de la presente descripción y los métodos para usar los anticuerpos de la presente descripción. Será evidente para los expertos en la técnica que se pueden practicar muchas modificaciones, tanto de materiales como métodos, sin apartarse del alcance de la presente descripción.
Ej emplos Se entiende que los ejemplos y formas de modalidad descriptas en la presente tienen propósitos ilustrativos solamente y que varias modificaciones o cambios a los mencionados serán sugeridos a los expertos en el arte y deberán ser incluidos dentro del espíritu y el alcance de esta solicitud Líneas celulares y cultivos Línea Origen Fuente celular Ramos Linfoma de Burkitt DSMZ (ACC 603) Raj i Linfoma de Burkitt DSMZ (ACC 319) Daudi Linfoma de Burkitt DSMZ (ACC 78) Namalwa Linfoma de Burkitt ATCC (CRL- 1432) BJAB B-NHL Un regalo de Elliot Kieff (Harvard) WSU-DLCL-2 B-NHL, linfoma difuso de las DSMZ (ACC células B grandes 575) RL B-NHL, linfoma difuso de las DSMZ (ACC células B grandes 613) SU-DHL-4 B-NHL, linfoma histiocítico DSMZ (ACC difuso 495) DOHH-2 linfoma de las células B DSMZ (ACC inmunoblástico refractario, 47) linfoma folicular Granta-519 B-NHL, linfoma de las células DSMZ (ACC del manto 342) Todas las líneas celulares fueron cultivadas en medio RPMI-1640 suplementado con suero bovino fetal al 10%, 2 mM de glutamina y 1% de penicilina-estreptomicina (todos los reactivos de Invitrogen) a 37 °C en una incubadora con 5% de C02 humidificada . Las células fueron pasadas diluyendo en medio fresco dos veces por semana y se mantuvieron entre 0,2 y 1 x 106 células/ml.
Ejemplo 1 Producción de anticuerpos CD37 de ratón Se construyó un plásmido de expresión pSRa-CD37 que contenía toda la secuencia codificadora CD37 (CDS) flanqueada por los sitios de restricción Xbal y BamHI que permitían la expresión de CD37 humana. Células 300-19, una línea celular pre-B derivada de un ratón Balb/c (M. G. Reth et al.. 1985, Nature, 317: 353-355), fueron transíectadas con este plásmido de expresión para expresar en forma estable altos niveles de CD37 humana en la superficie celular, y usadas para la inmunización de los ratones Balb/c VAF. Los ratones fueron inmunizados subcutáneamente con aproximadamente 5xl06 células 300-19 que expresan CD37 por ratón cada 2-3 semanas por protocolos de inmunización estándar usados en ImmunoGen, Inc.
Los ratones inmunizados recibieron un refuerzo con otra dosis de antígeno tres días antes de ser sacrificados por generación de hibridoma. El bazo del ratón fue recogido de acuerdo con los protocolos animales estándar y fue molido entre dos portaobjetos microscópicos, congelados para obtener una sola suspensión celular en un medio RPMI-1640. Las células del bazo fueron pelletizadas , lavadas y fusionadas con células P3X63Ag8.653 de mieloma de ratón (J. F. Kearney et al.. 1979, J. Immunol . , 123: 1548-1550) usando polietilenglicol-1500 (Roche 783 641) . Las células fusionadas fueron suspendidas nuevamente en medio de selección RPMI-1640 que contenía hipoxantina-aminopterina-timidina (HAT) (Sigma H-0262) y seleccionadas para cultivo en placas de cultivo de fondo plano de 96 cavidades (Corning-Costar 3596 , 200 µL de suspensión celular por cavidad) a 37 °C con 5% C02. Después de 5 días de incubación, 100 pL de sobrenadante de cultivo fueron removidos de cada cavidad y reemplazados con 100 µL de medio RPMI-1640 que contenía suplemento de hipoxantina-timidina (HT) (Sigma H-0137) . La incubación a 37 ° C con 5% C02 continuó hasta que los clones de hibridoma estaban listos para el rastreo de anticuerpos . También se pueden usar otras técnicas de inmunización y producción de hibridomas, incluyendo aquellos descriptos en J. Langone y H. Vunakis (Eds., Methods in Enzymology, Vol . 121, "Immunochemical Techniques, Part I"; Academic Press, Florida) y E. Harlow y D . Lañe ( "Antibodies : A Laboratory Manual"; 1988; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York) .
Rastreo y selección de ibridomas Los sobrenadantes de cultivos de hibridoma fueron rastreados por citometría de flujo para la secreción de anticuerpos raonoclonales de ratón que se ligan a las células 300-19 que expresan CD37, pero no a las células 300-19 no transíectadas . Se incubaron 100 µ? de sobrenadantes de hibridoma durante 3 hs ya sea con células 300-19 que expresan CD37 o las células 300-19 no transíectadas (1 xlO5 células por muestra) en 100 µ?, de tampón FACS (medio RPMI-1640 suplementado con suero de cabra normal al 2%) . Luego las células se pelletizaron, se lavaron, y se incubaron durante 1 h con 100 i de anticuerpo IgG anti-ratón de cabra PE-conjugado (Jackson Laboratory, 6 µ?/mL en tampón FACS) . Las células fueron pelletizadas nuevamente, se lavaron con tampón FACS y se volvieron a suspender en 200 L de PBS conteniendo 1% de formaldehído . Las muestras se adquirieron usando un citómetro de flujo FACSCalibur con el muestreador de múltiples cavidades HTS o un citómetro de flujo de conjunto FACS y analizadas usando CellQuest Pro (todo de BD Biosciences, San Diego, US) .
Los clones de hibridoma que dieron positivos en los tests fueron subclonados limitando la dilución. Un subclon de cada hibridoma, que mostró la misma reactividad contra CD37 que las células parentales por citometría de flujo, fue elegido para análisis subsiguiente. Los subclones estables fueron cultivados y el isotipo de cada anticuerpo anti-CD37 segregado fue identificado usando reactivos de isotipificación comerciales (Roche 1493027) .
Se realizaron un total de 45 experimentos de fusión separados durante el transcurso de esta investigación. Un solo experimento de fusión dio rutinariamente aproximadamente entre 200 y 1000 clones de hibridoma. Todos los clones de hibridoma resultantes fueron rastreados con respecto a ligadura de CD37 por citrometría de flujo y un total de 184 clones de hibridoma mostraron ligadura específica a CD37.
Purificación de anticuerpos Se purificaron anticuerpos de sobrenadantes de subclones de hibridoma usando métodos estándar, tales como, por ejemplo Proteína A o cromatografía G (HiTrap Protein A o G HP, 1 mL, Amersham Biosciences) . Brevemente, se preparó sobrenadante para cromatografía por la adición de 1/10 de volumen de 1 M de tampón Tris/HCl, pH 8,0. El sobrenadante ajustado al pH se filtró a través de una membrana de filtro de 0,22 m y se cargó en una columna equilibrada con tampón de ligadura (PBS, pH 7,3) . La columna se lavó con tampón de ligadura hasta que se obtuvo una línea de base estable sin absorbancia a 280 nm. El anticuerpo se eluyó con 0,1 M de tampón de ácido acético que contenía 0,15 M de NaCl, pH 2,8, usando un caudal de 0,5 mL/min. Se recogieron fracciones de aproximadamente 0,25 mL y se neutralizaron por la adición de 1/10 de volumen de 1M de Tris/HCl, pH 8 , 0. La o las fracciones pico fueron dializadas durante la noche dos veces contra lx PBS y se esterilizaron o filtraron a través de una membrana de filtro de 0,2 µ?t?. El anticuerpo purificado fue cuantificado por absorbancia a A280.
Las fracciones purificadas de proteína A fueron purificadas adicionalmente usando cromatografía de intercambio de iones (IEX) con cromatografía de amonio cuaternario (Q) para anticuerpos de ratón. Brevemente, las muestras de la purificación de la proteína A fueron sometidas a intercambio en tampón de ligadura (10 mM de Tris, 10 mM de cloruro de sodio, pH 8,0) y filtradas a través de un filtro de 0,22 µp?. La muestra preparada se cargó luego en una resina de flujo rápido Q (GE Lifesciences) que fue equilibrada con tampón de ligadura a un caudal de 120 cm/h. El tamaño de la columna fue elegido para tener suficiente capacidad para ligar todo el MAb en la muestra. La columna se lavó luego con tampón de ligadura hasta que se obtuvo una línea de base estable sin absorbancia a 280 nm. El anticuerpo se eluyó iniciando un gradiente de 10 mM a 500 mM de cloruro de sodio en volumen de columna 20 (CV) . Las fracciones pico se recogieron en base a la medición de la absorbancia a 280 nm (A280) . El porcenta e de monómeros fue evaluado con cromatografía de exclusión de tamaño (SEC) en un gel TSK G3000SWXL, 7,8 x 300 mm con un columna de guarda SWXL, 6,0 x 40 mm (Tosoh Bioscience, Montgomeryville, PA) usando un sistema Agilent HPLC 1100 (Agilent, Santa Clara, CA) . Las fracciones con contenido de monómeros mayor de 95% fueron reunidas, sometidas a intercambio en un tampón PBS (pH 7,4) usando un sistema TFF, y esterilizadas por filtrado a través de una membrana de filtro de 0,2 µp?. La concentración de IgG del anticuerpo purificado se determinó por A280 usando un coeficiente de extinción de 1,47. También se usaron métodos alternativos tales como hidroxiapatita cerámica (CHT) para purificar anticuerpos con buena selectividad. Se usó la resina CHT Tipo II con tamaño de partícula 40 µp? (Bio-Rad Laboratories) con un protocolo similar al descripto para la cromatografía IEX. El tampón de ligadura para CHT corresponde a 20 mM de fosfato de sodio, pH 7,0 y el anticuerpo se eluyó con un gradiente de 20-160 mM de fosfato de sodio sobre CV 20.
Ejemplo 2 Caracterización de ligadura por citometría de flujo La especificidad de ligadura fue testeada por citometría de flujo usando anticuerpos purificados. Los histogramas FACS demostraron la ligadura de muCD37-3, muCD37-12, muCD37-38, muCD37-50, muCD37-51, muCD37-56 y muCD37-57 a células 300-19 que expresan CD37 y la ausencia de ligadura a las células 300-19 parentales, se muestran en la Figura 1 y la Figura 2. Todos los anticuerpos de ratón fueron incubados durante 3 hs ya sea con células 300-19 que expresan CD37 o las células 300-19 no transfectadas (1 x 105 células por muestra) en 100 µ?. de tampón FACS (medio RPMI-1640 suplementado con suero de cabra normal al 2%) . Luego las células fueron pelletizadas , lavadas, e incubadas durante 1 h con 100 \iL de anticuerpo IgG anti-ratón de cabra FITC-conjugado (Jackson Laboratory, 6 g/mL en tampón FACS) . Las células fueron pelletizadas nuevamente, lavadas con tampón FACS y suspendidas nuevamente en 200 pL de PBS que contenía formaldehído al 1%. Las muestras fueron adquiridas usando un citómetro de flujo FACSCalibur con el muestreador HTS de múltiples cavidades o un citómetro de flujo de conjunto FACS y analizadas usando CellQuest Pro (todos de BD Biosciences, San Diego, US) .
Los histogramas FACS de células 300-19 que expresan CD37 incubadas con muCD37-3, muCD37-12, muCD37-38, muCD37-50, muCD37-51, muCD37-56 o muCD37-57 mostraron una desviación de fluorescencia, mientras que las células 300-19 parentales no. Además no se detectó una desviación de fluorescencia significativa cuando cualquiera de las líneas celulares se incubaba solamente con anticuerpo IgG anti-ratón de cabra FITC-conjugado (Figura 1 abajo) .
Para verificar que los anticuerpos también pueden ligarse a CD37 expresados endógenamente, se realizaron experimentos de ligadura con células de linfoma WSU-DLCL-2 CD37-positivas y los anticuerpos muCD37-3, muCD37-12, muCD37-8, muCD37-10 o muCD37-14. Las células WSU-DLCL-2 fueron incubadas con diversas concentraciones de anticuerpos de ratón y procesadas como se describió más arriba para el análisis de citometría de flujo. El análisis de los datos se realizó usando CellQuest Pro (BD Biosciences, San Diego, US) y para cada muestra se exportó la intensidad de fluorescencia media para FL1 (MFI) y se representó en un gráfico contra la concentración de anticuerpos en un gráfico semilogarítmico (Figura 3) . Se generó una curva dosis-respuesta por regresión no lineal y se calculó el valor EC50 de cada curva, que corresponde a la constante de disociación aparente (Kd) de cada anticuerpo, usando un GraphPad Prism v4 (GraphPad software, San Diego, CA) . Se observó una fuerte desviación de la fluorescencia para todos los anticuerpos testeados y los valores Kd correspondían a 0,52 nM, 1,7 nM, 2,7 nM, 1,1 nM o 0,91 nM para los anticuerpos muCD37-3, muCD37-8, muCD37-10, muCD37-12 o muCD37-14, respectivamente.
Igualmente, se observó una fuerte ligadura cuando se usaron células de linfoma BJAB CD37-positivas para el mismo ensayo de citometría de flujo descripto más arriba. Los valores Kd fueron calculados como se describió más arriba y corresponden a 0,2 nM, 0,4 nM, 0,6 nM, 0 , nM y 1 nM para muCD37-3, muCD37-38, muCD37-50, muCD37-51, muCD37-56 y muCD37-57, respectivamente.
Ejemplo 3 Actividad pro-apoptótica de los anticuerpos de ratón Los anticuerpos anti-CD37 de ratón indujeron apoptosis de las líneas celulares de linfoma de Ramos y Ra i. El grado de apoptosis se midió por análisis de citometría de flujo después de teñir con conjugados FITC de Anexina-V (Invitrogen) y con T0-PR0-3 (Invitrogen) . En células normales, sanas, se expresa fosfatidilserina en el interior de la bicapa de membrana, y la transición de fosfatidilserina desde la hoja interior a la exterior de la membrana plasmática es una de las señales de la apoptosis que se detectan más temprano. La Anexina V liga a la fosfatidilserina en la parte exterior pero no en el lado interior de la bicapa de la membrana celular de las células intactas. El grado de ligadura de Anexina V es por lo tanto un- indicador de la inducción de la apoptosis. TO-PRO-3 es una tinción de ácido nucleico de cianina monomérica que puede penetrar solamente en la membrana plasmática cuando se rompe la integridad de la membrana, como ocurre en las últimas etapas de la apoptosis. Tres poblaciones de células se pueden distinguir en la citometría de flujo de dos colores: las células no apoptóticas (Anexina-V negativas y TO-PRO-3 negativas) , las células tempranamente apoptóticas (Anexina-V positivas y TO-PRO-3 negatives) y las células necróticas o células tardíamente apoptóticas (Anexina-V positivas y T0-PRO-3 positivas) .
Las células que crecen exponencialmente fueron colocadas en placas a aprox. 2 x 105 células/mL en placas de 24 cavidades en medio RMPI-1640 suplementado con suero bovino fetal al 10 % ( FB S ) , 2mM de L glutamina y 50 pg/mL de gentamicina (denotada más abajo como medio RMPI-1640 completo) . Las células se cultivaron en general en medio RMPI-1640 completo, a menos que se indique de otra manera. Las células se incubaron con 10 nM de anticuerpos anti-CD37 durante 20 a 24 hs a 37°C en una incubadora con 5% de C02 humidif icada . Las células fueron pelletizadas luego, lavadas dos veces con 50 0 µ? PB S , suspendidas nuevamente en 10 0 \i de tampón de ligadura (10 mM de Hepes-NaOH, pH 7,4, 140 mM de NaCl , 2,5 mM de CaCl2) , y teñidas con 5 L de Anexina V-FITC durante 15 min en hielo. Luego se agregaron 4 0 0 L de tampón de ligadura con 1 µ? de TO-PRO-3 a la mezcla y la fluorescencia asociada con las células de FITC y TO-PRO-3 se midió inmediatamente por citometría de flujo. Se recogieron cinco mil eventos para cada muestra. Los gráficos de puntos para la fluorescencia de TO-PRO-3 (FL4-H; eje y) y la fluorescencia de Anexina V-FITC (FL1-H; eje x) se generaron usando el software BD CellQuest .
El porcentaje de células positivas a la Anexina-V (incluye ambas, las células positivas y negativas a TO-PRO-3) fue determinado para cada muestra de estos gráficos y se muestran en las Figuras 4A-4B para células Ramos. Varios anticuerpos aislados de nuestro rastreo de anticuerpos fueron testeados con respecto a la actividad pro-apoptótica en comparación con rituximab. Inesperadamente, algunos de los anticuerpos anti-CD37 de ratón aislados, tales como muCD37-3 y muCD37-12, mostraron una actividad pro-apoptótica muy fuerte. Aproximadamente 39% de las células Ramos expuestas a muCD37-3 y 46% de las células Ramos expuestas a muCD37-12 eran positivas a Anexina-V. Por contraste, el tratamiento con el anticuerpo anti-CD20 rituximab dio por resultado sólo 13% de células positivas a Anexina-V, mientras que las muestras control no tratadas contenían 5% de células positivas a Anexina-V. Varios de los anticuerpos anti-CD37 de ratón aislados no mostraron actividad pro-apoptótica. Por ejemplo, el tratamiento de las células Ramos con muCD37-8, muCD37-lO o muCD37-14 dio por resultado un pequeño aumento o ningún aumento en el porcentaje de células positivas a Anexina-V en comparación con células no tratadas. Esto a pesar de su afinidad de ligadura a CD37 comparable como se ve en las Figuras 3A-3B.
Se aislaron y rastrearon anticuerpos adicionales con respecto a su capacidad para inducir apoptosis en células Ramos. De muchos anticuerpos aislados que ligaron CD37 con alta afinidad, sólo algunos tenían actividad pro-apoptótica. Los resultados de un ensayo de Anexina-V se muestran en las Figuras 4A-4BB. Los anticuerpos de ratón muCD37-38, muCD37-50, muCD37-51, muCD37-56 y muCD37-57 fueron capaces de inducir apoptosis y dieron por resultado 38 - 45% de células Ramos positivas a Anexina-V en comparación con 5% en muestras de control no tratadas. Similarmente al ensayo previo, el tratamiento con el anticuerpo anti-CD20 rituximab dio por resultado sólo 18% de células positivas a Anexina-V.
Además, los anticuerpos de ratón fueron testeados con respecto a su capacidad para induce apoptosis en células de linfoma Raj i . Como se vio para las células Ramos, de los muchos anticuerpos aislados que se ligan a CD37 con alta afinidad, sólo algunos tenían actividad pro-apoptótica. El tratamiento con muCD37-3 o muCD37-12 dio por resultado 36% o 49% de células positivas a Anexina-V, respectivamente. Por contraste, el tratamiento con el anticuerpo anti-CD20 rituximab dio por resultado sólo 20% de células positivas a Anexina-V, mientras que las muestras de control no tratadas contenían 4% de células positivas a Anexina-V.
Igualmente, aproximadamente 60% de las células Raj i tratadas con muCD37-3, muCD37-38, muCD37-50, muCD37-51, muCD37-56 o muCD37-57 eran células positivas a Anexina-V en comparación con 15% de las células no tratadas.
Ejemplo 4 Ensayos de proliferación La capacidad de los anticuerpos anti-CD37 para inhibir el crecimiento celular se midió usando ensayos de citotoxicidad in vitro. Las células objetivo se colocaron en placas a 5.000 células por cavidad en 100 L en medio RPMI completo (RP I-1640, suero bovino fetal al 10%, 2 mM de glutamina, 1% de penicilina-estreptomicina, todos reactivos de Invitrogen) . Los anticuerpos se diluyeron en medio RPMI completo usando series de dilución de 3 veces y se agregaron 100 yL por cavidad. La concentración final osciló típicamente entre 3 x 10"8 M y 4,6 x 10"12 M. Las células se incubaron a 37°C en una incubadora con 5% C02 humidificada durante 4 a 5 días. La viabilidad de las células remanentes se determinó por un ensayo colorimétrico WST-8 (Dojindo Molecular Technologies, Inc., Rockville, MD, US). El WST-8 es reducido por deshidrogenasas en células vivientes a un producto de formazán anaranjado que es soluble en medio de cultivo de tejidos. La cantidad de formazán producida es directamente proporcional al número de células vivientes. El WST-8 fue agregado a 10% del volumen final y se incubaron placas a 37 °C en una incubadora con 5% C02 humidificada durante 2 a 4 horas adicionales. Las placas fueron analizadas midiendo la absorbancia a 450 nm (A450) en un lector de placa de múltiples cavidades. La absorbancia A450 de fondo de cavidades con medio y WST-8 solamente fue restada de todos los valores. La viabilidad por ciento se calculó dividiendo cada valor de muestra tratada por el valor promedio de cavidades con células no tratadas. La viabilidad por ciento = 100* (A450 muestra tratada - fondo A450)/ (A450 muestra no tratada - fondo A450) . El valor de viabilidad por ciento fue representado gráficamente contra la concentración de anticuerpos en un gráfico semilogarítmico para cada tratamiento.
Los resultados de un ensayo de proliferación típico usando anticuerpos CD37 de ratón y células de linfoma SU-DHL-4 se presentan en la Figura 5. Es evidente que varios anticuerpos de ratón eran capaces de inhibir la proliferación de las células SU-DHL-4 substancialmente y en una manera dependiente de la dosis, mientras que otros no tenían tal efecto. Por ejemplo, el tratamiento con muCD37-3 redujo la viabilidad celular a 34% a la concentración de anticuerpos más alta testeada con una EC50 de 0,17 nM. Similarmente , el tratamiento con muCD37-38 redujo la viabilidad celular a 25% a la concentración de anticuerpos más alta testeada con una EC50 de 0,19 nM. Igualmente, el tratamiento con muCD37-50 o muCD37-51 redujo la viabilidad celular a 38% a la concentración de anticuerpos más alta testeada con una EC50 de 0,25 nM o 0.5 nM, respectivamente. Por contraste, el tratamiento con por ejemplo CD37-16 no redujo la viabilidad celular en una manera dependiente de la dosis.
Ejemplo 5 Clonación y secuenciación de las regiones VL y VH del anticuerpo CD37-3 Se preparó ARN celular total a partir de 5 x 106 células del hibridoma CD37-3 usando un kit RNeasy (QIAgen) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Se sintetizó subsiguientemente cADN a partir de ARN total usando el kit de síntesis de cADN SuperScript II (Invitrogen) .
El procedimiento para la primera vuelta de la reacción de PCR degenerada en el cADN derivado de células de hibridoma se basó en métodos descriptos en Wang et al. ((2000) J. Immunol. Methods. 233:167-77) y Co et al. ((1992) .J I unol. 148:1149-54). Las secuencias de VH se amplificaron por PCR usando los siguientes cebadores degenerados: EcoMHl CTTCCGGAATTCSARGTNMAGCTGSAGSAGTC (SEQ ID NO: 171), ECO H2 CTTCCGGAATTCSARGTNMAGCTGSAGSAGTC GG (SEQ ID NO: 172) y BamlgGl GGAGGATCCATAGACAGATGGGGGTGTCGTTTTGGC (SEQ ID NO: 173). Las secuencias de VL se amplificaron por PCR usando los siguientes cebadores degenerados: SacIMK GGAGCTCGAYATTGTGMTSACMCARWCTMCA (SEQ ID NO: 174) y HindKL TATAGAGCTCAAGCTTGGATGGTGGGAAGATGGATACAGTTGGTGC (SEQ ID NO: 175) . (Las bases mixtas se definieron como sigue: N=G+A+T+C, S=G+C, Y-C+T, M=A+C, R=A+G, =A+T) . Las mezclas de reacción de PCR se corrieron luego en un gel de agarosa de baja fusión al 1%, se extrajeron las bandas de 300 a 400 bp, se purificaron usando mini-columnas de ADN Zymo, y se enviaron a Agencourt Biosciences para la secuenciación . Los cebadores de PCR 5' y 3' respectivos se usaron como cebadores de secuenciación para generar los cADNs de la región variable de ambas direcciones. Las secuencias de aminoácidos de las regiones VH y VL se predijeron de los resultados de la secuenciación de ADN.
Como los cebadores degenerados usados para clonar las secuencias de cADN VL y VH alteran las secuencias del extremo 5', se necesitaron esfuerzos de secuenciación adicionales para verificar las secuencias completas. Las secuencias de cADN preliminares se usaron para buscar el sitio NCBI IgBlast (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/) para las secuencias de línea germinal de ratón de las cuales se derivan las secuencias de anticuerpos . Los cebadores de PCR se diseñaron luego para asociarse a la secuencia líder ligada a la línea germinal del anticuerpo de ratón de modo que esta nueva reacción de PCR daría una secuencia de cADN de región variable completa, inalterada por los cebadores de PCR. Las reacciones de PCR, por purificaciones, y secuenciación se realizaron como se describió más arriba.
Determinación de masas para la confirmación de las secuencias La información de la secuencia de cADN para la región variable fue combinada con la secuencia de la región constante de la línea germinal para obtener secuencias de cADN de anticuerpos de longitud completa. Los pesos moleculares de la cadena pesada y la cadena liviana se calcularon luego y compararon con los pesos moleculares obtenidos por análisis LC/MS del anticuerpo CD37-3 de ratón. Las mediciones de los pesos moleculares son consistentes con las secuencias de cADN para ambas, la cadena liviana y la pesada de CD37-3.
Quimerización La secuencia variable para la región variable de cadena liviana se clonó en los sitios EcoRI y Bsi I en el plásmido pchCD37-3LCZ. La región variable de la cadena pesada se clonó en los sitios HindIII y Apal en el plásmido pchCD37-3HCN. Se construyeron plásmidos equivalentes para chCD37-12. Estos plásmidos se usaron para expresar anticuerpos quiméricos en células HEK-293T usando un procedimiento de fosfato de calcio estándar (BD Biosciences, CalPhos Mammalian Transfection Kit, Cat # 631312) . El sobrenadante se purificó usando procedimientos de cromatografía de Proteína A estándar como se describió más arriba, pero los pasos de cromatografía de purificación se realizaron usando o bien resina de intercambio iónico de flujo rápido (IEX) con carboximetilo (CM) (GE Lifesciences) y 10 mM de fosfato de potasio, 10 mM de tampón de ligadura de cloruro de sodio (pH 7,5) o los métodos CHT alternativos descriptos más arriba.
Ejemplo 6 Humanización de anticuerpos Los anticuerpos CD37-3 y huCD37-50 humanizados fueron humanizados siguiendo los métodos de "resurfacing" descriptos previamente, tales como, por ejemplo en Roguska et al., Proc. Nati. Acad. Sci., USA, 91 (3) : 969-973 (1994) y Roguska et al., Protein Eng. 9 (10) : 895-904 (1996), que se incorporan a la presente en su totalidad por referencia. El "resurfacing" involucra generalmente la identificación de los residuos de superficie del marco de la región variable en las cadenas livianas y las cadenas pesadas y el reemplazo de estos con equivalentes humanos. Las CDR' s murinas son preservadas en el anticuerpo "resurfaced" . Las CDRs ilustrativas de CD37-3 y CD37-50 se definen como se indicó en la Tabla 11. Además de la definición de la CDR2 de cadena pesada empleada para el "resurfacing", la tabla provee CDR2s de cadena pesada definidas por Kabat ilustrativas para CD37-3 y CD37-50 murino y humano. La secuencia subrayada marca la parte de la CDR2 de cadena pesada de Kabat no considerada una CDR para "resurfacing" .
Tabla 11 Las CDRs de cadena liviana y cadena pesada CD37-3 y CD7-50 como se definieron para el "resurfacing" se dan a modo de ejemplo en la Tabla 11. La lisina 53 en la CDR2 de cadena liviana CD37-50 murina fue reemplazada con asparagina en CD37-50 humanizada (mostrada en negrita) de modo que se dan ambas versiones de la LC CDR2. La definición de Kabat para la CDR2 de cadena pesada también se da para la CD37-3 murina y humana. La secuencia subrayada marca la parte de la CDR2 de cadena pesada de Kabat no considerada una CDR para "resurfacing" .
Las posiciones de los residuos de superficie son definidos como cualquier posición con su accesibilidad relativa de 30% o mayor (Pedersen J.T. et. Al, J. Mol. Biol . 1994; 235: 959-973). Los residuos de superficie son alineados luego con secuencias de superficie de la línea germinal humana para identificar la secuencia de superficie humana más homologa. Para CD37-3, las secuencias de la línea germinal humana usadas como las superficies de reemplazo eran IGKV1/OR2-0*01 y IGHV4-34*09 para VL y VH, respectivamente. Para CD37-50, las secuencias de la línea germinal humana usadas como las superficies de reemplazo eran IGKV3/OR2-268*01 y IGHV4-31*03 para VL y VH, respectivamente. Como se puede observar de las listas en la Figura 6, se reemplazaron un total de siete residuos de superficie en la cadena liviana y siete en la cadena pesada con las contrapartidas humanas en CD37-3. Como se puede ver en las Figuras 7A-7B para CD37-50, los residuos de superficie totales que fueron reemplazados con contrapartidas humanas son siete y cinco en VL y VH, respectivamente. En CD37-3, el residuo de cadena pesada 61 se encuentra muy cerca de CDR-H2 y como su substitución al residuo humano prolina podría dar por resultado una afinidad de ligadura reducida, se generó una segunda versión "resurfaced" con el residuo serina murino retenido. Como estos anticuerpos fueron testeados como conjugados citotóxicos, la lisina 53 de la CDR2 de cadena liviana CD37-50 fue reemplazada con una asparagina para evitar los problemas de que la conjugación de lisina podría impactar sobre la afinidad de ligadura. Las Figuras 8A-8D muestra la alineación de las secuencias "resurfaced" para el dominio variable de CD37-3 y CD37-50 de la cadena liviana y la cadena pesada con sus contrapartidas murinas.
Expresión recombinante del anticuerpo huCD37-3 Las secuencias de la región variable para huCD37-3 y CD37-50 fueron codón-optimizadas y sintetizadas por Blue Heron Biotechnology . Las secuencias son flanqueadas por sitios de enzimas de restricción para clonación en marco con las secuencias constantes respectivas en plásmidos de expresión en mamíferos de cadena simple. La región variable de cadena liviana es clonada en los sitios EcoRI y Bsi I en el plásmido pAbKZeo. La región variable de cadena pesada es clonada en los sitios HindIII y Apal en el plásmido pAbGINeo . Estos plásmidos se pueden usar para expresar los anticuerpos recombinantes o bien en transíecciones de células de mamíferos estables o transitorias. Las transíecciones transitorias que expresan anticuerpos recombinantes en células HEK 293T fueron realizadas usando un procedimiento PEI modificado (Durocher, Y. et al., Nucleic Acids Res. 30-.?.9 (2002)). El sobrenadante fue purificado por pasos de cromatografía de purificación y Proteína A usando procedimientos estándar como se describió más arriba para anticuerpos quimerizados.
Expresión de TRU-016 Para comparar la actividad de los anticuerpos anti-CD37 aislados, se clonaron y expresaron anticuerpos anti-CD37 identificados previamente. La secuencia de ADN para el SMIP anti-CD37 fue obtenida de US2007/0059306 usando SEQ ID 51. La secuencia fue flanqueada por los sitios de las enzimas de restricción HindIII y Xhol para clonación en los plásmidos de expresión en mamíferos pAbGINeo. La expresión y la purificación se llevaron a cabo como se describió para huCD37-3 más arriba.
Ejemplo 7 Afinidad de ligadura de anticuerpos quiméricos Los anticuerpos quiméricos chCD37-3 y chCD37-12 fueron ensayados con respecto a su afinidad de ligadura a las células Ramos en comparación con sus contrapartidas murinas . Se realizaron y analizaron ensayos de ligadura de citometría de flujo usando células Ramos y anticuerpos muCD37-3, chCD37-3, muCD37-12 y chCD37-12, como se describió en el Ejemplo 2 usando anticuerpos anti-humanos y anti-murinos de cabra FITC-conjugados secundarios. La Figura 9A ilustra las curvas de dosis-respuesta generadas por regresión no lineal para cada anticuerpo. El valor para la constante de disociación aparente (Kd) de cada anticuerpo se calculó usando GraphPad Prism v4 (GraphPad software, San Diego, CA) . Es evidente que la quimerización no afectó mucho la afinidad de ligadura de cualquiera de los anticuerpos ya que el Kd para muCD37-3, chCD37-3, muCD37-12 y chCD37-12 corresponde a 0,4 nM, 0,8 nM, 0,8 nM y 1,2 nM, respectivamente.
Afinidad de ligadura de huCD37-3yl .0 y huCD37-3yl .01 Los ensayos de ligadura de citometría de flujo usando células BJAB y un formato de ligadura competitivo fueron usados para evaluar la afinidad de ligadura de las versiones quiméticas y humanizadas de CD37-3. Las células BJAB fueron incubadas con una concentración 1 nM de anticuerpo muCD37-3 marcado con PE y se midió la competencia agregando diversas cantidades de muCD37-3, chCD37-3, huCD37-3vl.O o huCD37-3vl.01. Las muestras fueron incubadas durante 3 hs a 4°C. Luego se pelletizaron las células, se lavaron con tampón FACS y se volvieron a suspender en 200 L de PBS conteniendo 1% de formaldehído . Las muestras se adquirieron usando un citómetro de flujo FACSCalibur con el muestreador de múltiples cavidades HTS y fueron analizadas usando CellQuest Pro (todos de BD Biosciences, San Diego, US) . La fluorescencia de PE media resultante se representó gráficamente contra la cantidad de anticuerpo competitivo usada en un gráfico semilogarítmico . La Figura 9B ilustra las curvas dosis-respuesta generadas por regresión no lineal para cada anticuerpo. El valor para la constante de disociación aparente (Kd) de cada anticuerpo se calculó usando GraphPad Prism v4 (GraphPad software, San Diego, CA).. Es evidente que la quimerización o la humanización no afectaron la afinidad de ligadura de CD37-3 ya que toda la versión compite igualmente bien por la ligadura con el anticuerpo parental murino. La EC50 de la ligadura de competencia para muCD37-3, chCD37-3, huCD37-3vl.O o huCD37-3vl .01 corresponde a 0,8 nM, 0,7 nM, 1 nM y 0,6 nM, respectivamente.
Ligadura de afinidad de anticuerpos humanizados Los anticuerpos humanizados huCD37-38, huCD37-50, huCD37-51, huCD37-56 y chCD37-57 fueron ensayados con respecto a su afinidad de ligadura a las células BJAB en comparación con sus contrapartidas murinas . Los ensayos de ligadura de citometría de flujo se llevaron a cabo usando anticuerpos anti-humanos y anti-murinos de cabra FITC-conjugados secundarios, analizados como se' describió en el Ejemplo 2, y las curvas dosis-respuesta fueron generadas por regresión no lineal para cada anticuerpo. El valor para la constante de disociación aparente (Kd) de cada anticuerpo se calculó usando GraphPad Prism v4 (GraphPad software, San Diego, CA) . Es evidente que la humanización no afectó mucho la ligadura de afinidad de todos los anticuerpos. El Kd para muCD37-3 y huCD37-3 corresponde a 0,2 nM, mientras que el Kd para muCD37-38 y huCD37-38 corresponde a 0,4 nM y 0,3 nM, respectivamente. Similarmente , el Kd para muCD37-50 y huCD37-50 corresponde a 0,6 nM y 0,2 nM, respectivamente, mientras que el Kd para muCD37-51 y huCD37-51 corresponde a 0,6 nM y 0,8 nM, respectivamente. Finalmente, el Kd para muCD37-56 y huCD37-56 corresponde a 0,4 nM y 0,2 nM, respectivamente, mientras que el Kd para muCD37-57 y huCD37-57 corresponde a 1,0 nM y 0,3 nM, respectivamente.
Ejemplo 8 Expresión de CD37 de macaco La secuencia CD37 AA de CD37 de macaco se obtuvo de Genbank (GI: 718718). La secuencia fue codón-optimizada y sintetizada por Blue Heron Biotechnology . Se construyó un plásmido de expresión pSRa-CD37mac que contenía toda la secuencia de codificación CD37 (CDS) de macaco flanqueada por los sitios de restricción Xbal y BamHI que permitieron la expresión de CD37 de macaco. Las células 300-19s, una linea celular pre-B derivada de un ratón Balb/c (M. G. Reth et al. 1985, Nature, 317: 353-355) , fue transfectada con este plásmido de expresión para expresar en forma estable la CD37 de macaco en la superficie celular.
Afinidad de ligadura de anticuerpos murinos a la CD37 de macaco Los anticuerpos murinos muCD37-3, muCD37-12, muCD37-38, huCD37-50, muCD37-51, muCD37-56 y muCD37-57 fueron ensayados con respecto a su capacidad para ligarse a las células 300-19/CD37mac que expresan CD37 de macaco. Los ensayos de ligadura de citometría de flujo se llevaron a cabo usando anticuerpos anti-humanos de cabra o anti-murinos de cabra, FITC-conjugados, secundarios, analizados como se describió en el Ejemplo 2. La ligadura se comparó con el anticuerpo WR17 anti-CD37 descripto previamente y el SMIP TRU-016 anti-CD37. Como se puede observar de la Figura 10A, varios anticuerpos anti-CD37 aislados, muCD37-38, huCD37-50, muCD37-51, muCD37-56 y muCD37-57 se pueden ligar al antígeno CD37 derivado de macaco. Por contraste, muCD37-3, muCD37-12, el anticuerpo R17 anti-CD37 y el anticuerpo SMIP TRU-016 anti-CD37, descriptos previamente, fueron incapaces de ligarse al antígeno de CD37 derivado de macaco.
Ligadura de afinidad de anticuerpos humanizados a CD37 de macaco Los anticuerpos humanizados huCD37-38, huCD37-50, huCD37-51, huCD37-56 y huCD37-57 fueron ensayados con respecto a su ligadura de afinidad a las células 300-19/CD37mac que expresan CD37 de macaco. Se realizaron ensayos de ligadura de citometría de flujo usando anticuerpos anti-humanos de cabra, FITC-conjugados, secundarios, analizados como se describió en el Ejemplo 2 y se generaron las curvas dosis-respuesta por regresión no lineal para cada .anticuerpo. El valor para la constante de disociación aparente (Kd) de cada anticuerpo se calculó usando GraphPad Prism v4 (GraphPad software, San Diego, CA) . Es evidente de la Figura 10B, que varios anticuerpos humanizados aislados se ligan a la CD37 de macaco mientras que el huCD37-3 no. El valor Kd para huCD37-38, huCD37-50, huCD37-51, huCD37-56 y huCD37-57 corresponde a 1,1 nM, 1,8 nM, 14 nM, 5 nM, y 2 nM, respectivamente. Por lo tanto, la humanización no afecta la especificidad de ligadura de los anticuerpos aislados.
Ejemplo 9 Actividad pro-apoptótica de anticuerpos quiméricos y humanizados La actividad pro-apoptótica de los anticuerpos quiméricos y humanizados fue evaluada en células Ramos . Las células fueron incubadas con ???? de concentración de anticuerpos o un anticuerpo control de isotipo huIgG durante 20 hs seguido por tinción con Anexina-V-FITC y TO-PRO-3 y análisis de citometría de flujo. El ChCD37-12 retuvo una fuerte actividad pro-apoptótica de muCD37-12. Aproximadamente 40% de las células Ramos son positivas a Anexina-V después de tratamiento con o bien el anticuerpo muCD37-12 o el chCD37-12 en comparación con 4% de las células control no tratadas. Similarmente, aproximadamente 40% de las células Ramos son positivas a Anexina-V después de tratamiento con un anticuerpo huCD37-3, huCD37-38, huCD37-50, huCD37-51, huCD37-56 o huCD37-57 en comparación con 4% de células no tratadas o tratadas con el control de isotipo. Por contraste, el tratamiento con el anticuerpo anti-CD20 rituximab dio por resultado que sólo 13% de las células positivas a Anexina-V. Este resultado demuestra que la fuerte actividad pro-apoptótica de los anticuerpos anti-CD37 murinos aislados aquí es retenida por los anticuerpos quiméricos o humanizados derivados de estos. Por lo tanto, la única propiedad funcional de este grupo de anticuerpos anti-CD37, la fuerte actividad pro-apoptótica en ausencia de reticulación, no se ve afectada negativamente por quimerización o humanización.
Actividad pro-apoptótica de huCD37-3 y TRU-016 La actividad pro-apoptótica de huCD37-3 contra células de linfoma Ramos y Raj i se comparó con el SMIP TRU-016 anti-CD37. El TRU-016 se describió como un compuesto sin actividad pro-apoptótica a menos que fuera reticulado con un anticuerpo secundario. Es evidente que los anticuerpos huCD37-3 y chCD37-38 anti-CD37 ilustrativos tienen una actividad pro-apoptótica mucho más fuerte contra ambas líneas celulares de linfoma. El tratamiento con huCD37-3 o chCD37-38 dio por resultado 40% o 49% de células Ramos positivas a Anexina-V, en comparación con 3% de células control no tratadas. El tratamiento con Rituximab dio por resultado sólo 15% de células Ramos positivas a Anexina-V. Por contraste, el tratamiento con TRU-016 no aumentó el porcentaje de células Ramos positivas a Anexina-V. Igualmente, el tratamiento con huCD37-3 o chCD37-38 dio por resultado 34% o 30% de células Raj i positivas a Anexina-V, en comparación con 7% de células control no tratadas. El tratamiento con Rituximab dio por resultado sólo 19% de células Raj i positivas a Anexina-V. Por contraste, el tratamiento con TRU-016 no aumentó el porcentaje de células Ramos positivas a Anexina-V.
Respuesta a la dosis para la actividad pro-apoptótica de anticuerpos humanizados Diversas cantidades de cada anticuerpo fueron incubadas con células Ramos durante 20 hs seguido por tinción con Anexina-V-FITC y TO-PRO-3 y análisis por citometría de flujo. El porcentaje de células positivas a Anexina-V se representó gráficamente contra la concentración de anticuerpos en un gráfico semilogarítmico, y se calcularon los valores EC50 de las curvas realizadas usando análisis de regresión no lineal. Es evidente que todos los anticuerpos humanizados tienen una fuerte actividad pro-apoptótica con un porcentaje máximo de células positivas a Anexina-V de por lo menos 40%.' Figura 11. La EC50 para esta actividad corresponde a 0,08, 0,08 y 0,11 nM para huCD37-3, huCD37-38 y huCD37-50, respectivamente. Además, la EC50 para esta actividad corresponde a 0,41, 0,57 y 1,01 nM para huCD37-51, huCD37-56 y huCD37-57, respectivamente. Por contraste, el tratamiento con el anticuerpo anti-CD20 rituximab dio por resultado un porcentaje máximo de células positivas a Anexina-V de sólo 15% en comparación con 4% de células tratadas con un anticuerpo control de isotipo.
Ejemplo 10 Ensayos de proliferación para anticuerpos anti-CD37 quiméricos y humanizados La capacidad de los anticuerpos anti-CD37 quiméricos y humanizados para inhibir el crecimiento celular se midió usando ensayos de citotoxicidad in vitro como se describió en el Ejemplo 4. Los resultados de un ensayo de proliferación típico usando células de linfoma SU-DHL-4 y DOHH-2 se presentan en las Figuras 12A-12B. Es evidente que todos los anticuerpos fueron capaces de inhibir la proliferación de las células SU-DHL-4 substancialmente y en una manera dependiente de la dosis. Por ejemplo, el tratamiento con muCD37-3 redujo la viabilidad de las células SU-DHL-4 a 35% con una EC50 de 0,07 nM. Similarmente, el tratamiento con chCD37-3, huCD37-3vl.0 o huCD37-3vl .01 redujo la viabilidad de las células SU-DHL-4 a aproximadamente 30% a la mayor concentración de anticuerpos testeada con una EC50 de 0,03 nM, 0,06 nM o 0,03 nM, respectivamente. Igualmente, todos los anticuerpos fueron capaces de inhibir la proliferación de las células de linfoma folicular DOHH-2 substancialmente y en una manera dependiente de la dosis. Por ejemplo, el tratamiento con muCD37-3 redujo la viabilidad de las células DOHH-2 a 45% con una EC50 de 0,05 nM. Similarmente, el tratamiento con chCD37-3, huCD37-3vl.O o huCD37-3vl .01 redujo la viabilidad de las células DOHH-2 a aproximadamente 35% con una EC50 de .0,06 nM, 0,07 nM o 0,05 nM, respectivamente. Este resultado demuestra que las diversas versiones del anticuerpo CD37-3 tienen una actividad anti-proliferativa similar que no se ve afectada por quimerización o humanización.
Anticuerpos anti-CD37 humanizados adicionales fueron testeados en ensayos de citotoxicidad in vitro similares. Todos los anticuerpos humanizados testeados fueron capaces de inhibir la proliferación de las células SU-DHL-4 substancialmente y en una manera dependiente de la dosis. Por ejemplo, el tratamiento con huCD37-38 redujo la viabilidad de las células SU-DHL-4 a 24% con una EC50 de 0,42 nM, mientras que el tratamiento con huCD37-50 redujo la viabilidad de las células SU-DHL-4 a 31% con una EC50 de 0,39 nM. Por contraste, el tratamiento con el anticuerpo anti-CD20 rituximab redujo la viabilidad de las células SU-DHL-4 a 35% con una EC50 de 1,6 nM. Además, el tratamiento con huCD37-51 o huCD37-56 redujo la viabilidad de las células SU-DHL-4 a 24% con una EC50 de 0,60 nM o 0,68 nM, respectivamente. Además, el tratamiento con huCD37-57 redujo la viabilidad de las células SU-DHL-4 a 31% con una EC50 de 0,42 nM. El tratamiento con un anticuerpo de control de isotipo no tuvo un efecto sobre la viabilidad de las células SU-DHL-4.
Actividad anti-proliferativa de huCD37-3 en comparación con otros anticuerpos Para caracterizar adicionalmente la actividad anti-proliferativa de los anticuerpos anti-CD37 aislados, comparamos el efecto del anticuerpo huCD37-3 ilustrativo al del compuesto SMIP TRU-16 anti-CD37. La inmunohistoquímica usando microconjuntos tumorales confirmó que CD37 y CD20 exhibieron modelos de expresión similares y prevalencias en subtipos de NHL. Ver Tabla 12 más abajo. Así', las comparaciones se realizaron también con el anticuerpo anti-CD20 rituximab. El panel de líneas celulares incluían células de linfoma Granta-519, SU-DHL-4 , Namalwa y Daudi . Figura 13.
Tabla 12: Tinción de CD37 en microconjuntos de tumores linfoma en comparación con la tinción de CD20.
En todos los casos, el tratamiento con huCD37-3' dio por resultado una reducción de la viabilidad celular en una manera dependiente de la dosis. Por ejemplo, el tratamiento con huCD37-3 redujo la viabilidad de las células Granta-519 a aproximadamente 37% con una EC50 de 0,062 nM. El tratamiento con Rituximab redujo la viabilidad de las células Granta-519 a aproximadamente 47% con una EC50 de 0,36 nM. El tratamiento con huCD37-3 redujo la viabilidad de las células SU-DHL-4 a aproximadamente 17% con una EC50 de 0,053 nM. El tratamiento con Rituximab redujo la viabilidad de las células SU-DHL-4 a aproximadamente 20% con una EC50 de 0,2 nM. Con gran contraste, el tratamiento con TRU-016 no redujo la viabilidad de las células Granta-519 o SU-DHL-4 en un grado significativo o en una manera dependiente de la dosis. En otros ejemplos, el tratamiento con huCD37-3 redujo la viabilidad de las células Namalwa a aproximadamente 47% con una EC50 de 0,1 nM y redujo la viabilidad de las células Daudi a aproximadamente 68% con una EC50 de 0,25 nM. El tratamiento con Rituximab no tuvo un efecto sobre las células Namalwa pero redujo la viabilidad de las células Daudi a aproximadamente 69% con una EC50 de 2,6 nM. Con gran contraste, el tratamiento con TRU-016 no redujo la viabilidad de las células Namalwa o Daudi en un grado significativo o en una manera dependiente de la dosis. Finalmente, el tratamiento con huCD37-3 redujo la viabilidad de las células de Ramos a aproximadamente 53% con una EC50 de 0,08 nM, mientras que ni el tratamiento con TRU-016 o con rituximab tuvo ningún efecto sobre la viabilidad de las células de Ramos. Este resultado subraya la importancia de la actividad anti-proliferativa de los anticuerpos anti-CD37 aislados.
Ejemplo 11 Actividad CDC de los anticuerpos CD37 Para evaluar las actividades de citotoxicidad dependiente .del complemento (CDC) de los anticuerpos anti-CD37 quiméricos y humanizados, se realizaron ensayos basados en células de acuerdo con un método publicado (Gazzano-Santoro, H., J. Inmuno1. Methods . 1997 202 (2) : 163-71) . Los anticuerpos fueron divididos en alícuotas por duplicado a 50 pL/cavidad en una placa de cultivo de tejidos de 96 cavidades, de fondo plano a diversas concentraciones oscilando típicamente entre 5 g/mL (= 3,3 x 10"8 M) y 2,3 ng/mL (= 1,5 x 10"11 M) en medio RHBP (RPMI-1640, 20 mM de HEPES, 0,1 % BSA, 1% de penicilina-estreptomicina) . Se agregaron células objetivo a los anticuerpos a 5 x 104 células en 100 L de medio RHBP por cavidad. El complemento humano liofilizado (Sigma-Aldrich, St. Louis, US) fue reconstituido con 1 mL de agua purificada estéril por frasco-ampolla y diluido 5 veces a un stock de 20% con medio RHBP inmediatamente antes del uso. Se agregaron 50 L/cavidad de solución de complemento a cada cavidad para una concentración final de 5%. Las placas fueron incubadas durante 2 hs a 37 °C en una incubadora humidificada con 5% C02 para permitir la lisis mediada por el complemento. Después de este tiempo de incubación, se agregó reactivo Alamar Blue (Invitrogen) a cada cavidad a una concentración final de 10% para medir la viabilidad de las células restantes. La placa fue incubada durante 16 a 20 horas a 37°C antes de medir la fluorescencia (en unidades de fluorescencia relativas, RFU) a EX540/EM590 nm. Los controles incluían cavidades por triplicado con medio y complemento pero sin células (medio solamente, 0% de viabilidad) y cavidades con células y complemento pero sin anticuerpo (células solamente, 100% de viabilidad) . El porcentaje de viabilidad de células específico para cada muestra se determinó por la siguiente fórmula: Viabilidad por ciento = (muetra - medio solamente) / (células solamente -medio solamente) .
El resultado de un ensayo CDC ilustrativo usando células Ramos se presenta en las Figuras 14A-14B. Notablemente, chCD37-12 tiene una potente actividad CDC contra las células Ramos. Redujo la viabilidad de las células Ramos a 32% a la mayor concentración de anticuerpos testeada con una EC50 de 0 , 037 pg/mL . Además , varios anticuerpos aislados mostraron actividad CDC contra Ramos a diversos grados. El tratamiento con huCD37-3, huCD37-38, huCD37-50 dio por resultado una reducción de la viabilidad celular a 59%, 50% y 45%, respectivamente. El tratamiento con huCD37-51, huCD37-56 o huCD37-56 redujo moderadamente la viabilidad celular de las células de Ramos a aproximadamente 70 - 80% a la mayor concentración de anticuerpos testeada.
E emplo 12 Actividad ADCC de los anticuerpos CD37 Se usó un ensayo de liberación de lactato deshidrogenasa (LDH) para medir la citotoxicidad mediada por células dependientes de anticuerpos (ADCC) de líneas celulares tumorales usando células asesinas naturales (NK) humanas recién aisladas como células efectoras (Shields R.L., J. Biol. Chem. 2001 276 ( 9 ): 6591-604 ) . Las células NK fueron aisladas primero de sangre humana de un donante normal (Research Blood Components, Inc., Brighton, MA) usando un protocolo modificado para el kit NK Isolation Kit II (Miltenyi Biotech, 130-091-152) . La sangre se diluyó 2 veces con 1 x PBS . Una cantidad de 25 mL de sangre diluida fue aplicada cuidadosamente sobre 25 mL de Ficoll Paque en un tubo cónico de 50 mL y centrifugada a 400 g durante 45 min a TA. Las células mononucleares de la sangre periférica (PBMC) fueron recogidas de la interfase, transferidas a un nuevo tubo cónico de 50 mL, y lavadas una vez con lx PBS . Las PBMC fueron suspendidas nuevamente en 2 mL de tampón de aislamiento de NK (lx PBS, 0,5% de BSA, 2 mM de EDTA) , y luego se agregaron 500 L de Biotin-Anticuerpo Cocktail a la suspensión celular. El Biotin-Anticuerpo Cocktail contiene anticuerpos biotinilados que se ligan a los linfocitos, excepto por las células NK, dando por resultado una selección negativa de células NK. La mezcla se incubó a 4°C durante 10 min, y luego se agregaron 1,5 mL de tampón de aislamiento de NK y 1 mL de Anti-Biotin Micro Beads . La mezcla de anticuerpos celulares se incubó durante otros 15 min a 4°C. A continuación se lavaron las células una vez con 50 mL de tampón de aislamiento de NK y se volvieron a suspender en 3 mL de tampón de aislamiento de NK. Luego se montó una columna MACS LS en el separador autoMACS (Miltenyi Biotech) y se pre-lavó con 3 mL de tampón de aislamiento de NK. La suspensión celular se aplicó automáticamente sobre la column, se lavó y la fracción efluente con células NK no marcadas se recogió en un nuevo tubo cónico de 50. Las células NK resultantes se colocaron en placas en 30 mL de medio RPMI completo (RPMI-1640 suplementado con 5% de suero bovino fetal, 1% de penicilina-estreptomicina, 1 mM de HEPES, 1 mM de piruvato de sodio, 1% de 100X solución de aminoácidos no esencial MEM) durante la noche. El ensayo subsiguiente y todas las diluciones se llevaron a cabo en un medio RHBP (medio RPMI-1640 suplementado con 20 m de HEPES, pH 7,4, 0,1% de BSA y 1% de penicilina-estreptomicina) .
Diversas concentraciones de anticuerpos en medio RHBP fueron divididas en alícuotas por duplicado a 50 µL/cavidad en una placa de 96 cavidades de fondo plano. Las células objetivo fueron suspendidas nuevamente a 106 células/mL en medio RHBP y se agregaron a 100 L/cavidad a cada cavidad que contenía diluciones de anticuerpos . La placa que contenía células objetivo y diluciones de anticuerpos se incubó durante 30 min a 37°C. Las células NK se agregaron luego a las cavidades que contenía las células objetivo a 50 L/cavidad. La relación típica era de 1 célula objetivo a 3-4 células NK. Los siguientes controles de prepararon para cada experimento: células NK solamente, células objetivo solamente (liberación de LDH espontánea) , células objetivo con células NK (liberación de LDH independiente de anticuerpos) , células objetivo con 10% Tritón X-100 (liberación de LDH máxima) . Las mezclas se incubaron a 37°C durante 4 hs para permitir la lisis celular. Las placas fueron centrifugadas durante 10 min a 1200 rpm, y 100 L del sobrenadante se transfirieron cuidadosamente a una nueva placa de 96 cavidades de fondo plano. La mezcla de reacción de LDH (100 L/cavidad) del kit Cytotoxicity Detection Kit (Roche 1 644 793) se agregó a cada cavidad y se incubó a temperatura ambiente durante 5 a 30 min. La densidad óptica de las muestras se midió a 490 nm (OD490) . La lisis específica por ciento de cada muestra se determinó usando la siguiente fórmula: lisis específica por ciento = (valor de la muestra - liberación espontánea) / (liberación máxima - liberación espontánea) *100.
La incubación con anticuerpos humanizados llevó a una buena actividad ADCC contra células de linfoma Daudi, Ramos y Granta-519 en la presencia de células efectoas NK humanas. Su actividad ADCC contra las células de linfoma Daudi se comparó con la actividad ADCC de TRU-016 (Figura 15) .
El tratamiento con anticuerpos huCD37-3, huCD37-38 o huCD37-50 dio por resultado aproximadamente 41%, 39% o 40% de lisis de células Daudi con un valor EC50 de 0,42 ng/mL, 1,31 ng/mL o 2,42 ng/mL, respectivamente. Esta actividad era similar a la resultante del tratamiento con TRU-016 observándose 42% de lisis de células Daudi y un valor EC50 de 0,93 ng/mL. Además, el tratamiento con huCD37-51, huCD37-56 y huCD37-57 dio por resultado aproximadamente 39%, 36% o 36% de lisis de células Daudi con un valor EC50 de 5,7 ng/mL, 4,3 ng/mL o 7,9 ng/mL, respectivamente.
La actividad ADCC de los anticuerpos aislados contra las células de linfoma Ramos se comparó con la actividad ADCC de TRU-016. El tratamiento con los anticuerpos huCD37-3, huCD37-38 o huCD37-50 dio por resultado aproximadamente 43%, 42% o 46% de lisis de células Ramos con un valor EC50 de 0,95 ng/mL, 2,0 ng/mL o 3,0 ng/mL, respectivamente. Esta actividad era similar a la resultante del tratamiento con TRU-016 observándose 59% de lisis de células Ramos y un valor EC50 de 1,53 ng/mL. Además, el tratamiento con huCD37-51, huCD37-56 y huCD37-57 dio por resultado aproximadamente 53%, 43% or 44% de lisis de células Ramos con un valor EC50 de 5,7 ng/mL, 4,3 ng/mL o 7,9 ng/mL, respectivamente.
En experimentos adicionales la actividad ADCC de huCD37-3 y chCD37-38 contra las células Granta-519 se comparó con la actividad ADCC de TRU-016. El tratamiento con los anticuerpos huCD37-3 o chCD37-38 dio por resultado aproximadamente 19% o 18% de lisis de células Granta-519 con un valor EC50 de 0,13 ng/mL, o 0,73 ng/mL, respectivamente. El tratamiento con TRU-016 dio por resultado que se observó 16% de lisis de células Granta-519 y un valor EC50 valué de 0,83 ng/mL.
Ejemplo 13 Mapeado de epitopos La localización de los requerimientos de aminoácidos para los epitopos de diferentes anticuerpos CD37 puede ayudar a ligar características funcionales comunes o únicas a interacciones moleculares específicas. El dominio extracelular de CD37 contiene, dos "loops" extracelulares , un pequeño "loop" de aprox. 18 residuos, y uno más grande que consiste en aproximadamente 135 aminoácidos. Los requerimientos de los epitopos no han sido descriptos para los anticuerpos CD37 publicados previamente. Para caracterizar adicionalmente los anticuerpos CD37 aislados de esta invención, hemos construido varias variantes de antígenos CD37 con substitución AA en el "loop" extracelular más grande .
Clonación y expresión de variantes de CD37 Se construyeron plásmidos de expresión de mamíferos ya sea con secuencias de cADN de CD37 humano o de macaca, codón-optimizadas y sintetizadas por Blue Heron Biotechnologies , y flanqueadas por los sitios de restricción Xbal y BamHI para facilitar la clonación en el sitio de clonación múltiple del vector pSRa. Como las secuencias de CD37 humanas y de macaca son altamente homologas (Figura 16) , la expresión de estos constructos podría distinguir los anticuerpos reactivos cruzados humanos y de macaca de aquellos que reconocen epitopos que requieren por lo menos una de las 11 diferencias de aminoácidos de CD37 extracelulares entre estas dos especies como se describió en el Ejemplo 8.
Para caracterizar adicionalmente los epitopos de anticuerpos CD37, se construyeron una serie de constructos de CD37 quiméricos murinos y humanos. Como el tamaño y la homología del "loop" extracelular de CD37 pequeño era alta, los esfuerzos de localización del epitopo estaban limitados al "loop" extracelular grande. Un EcoRV a Pstl cassette que codificaba los residuos 1108 a Q235 del "loop2 extracelular grande fue rediseñado para ser segmentado adicionalmente en 5 secciones incorporando 4 sitios de restricción únicos que podrían ser conservados entre las secuencias de CD37 humanas, murinas y de macaca (Figura 17) . Se crearon los siguientes constructos de CD37 quiméricos humanos y de ratón: hCD37-Ml MSAQESCLSLIKYFLFVFNLFFFVLGSLIFCFGIWILIDKTSFVSFVGLAFVPLQI WSKVLAISGIFTMGIALLGCVGALKELRCLLGLYFGMLLLLFATQITLGILISTQRVRLER RVQELVLRTIQSYRTNPDETAAEESWDYVQFQLRCCGWHYPQDWFQVLILRGNGSEAHRVP CSCYNLSATNDSTILDKVILPQLSRLGHLARSRHSADICAVPAESHIYREGCAQGLQKWLH NLISIVGICLGVGLLELGFMTLSIFLCR LDHVYNRLARYR (SEQ ID NO: 180) hCD37-M2 MSAQESCLSLI YFLFVFNLFFFVLGSLIFCFGI ILIDKTSFVSFVGLAFVPLQI WSKVLAISGIFTMGIALLGCVGALKELRCLLGLYFGMLLLLFATQITLGILISTQRAQLER SLRDWEKTIQKYGTNPEETAAEESWDYAQFQLRCCGWQSPRD NKAQMLKA ESEEPRVP CSCYNLSATNDSTILDKVILPQLSRLGHLARSRHSADICAVPAESHIYREGCAQGLQKWLH NNLISIVGICLGVGLLELGFMTLSIFLCRNLDHVYNRLARYR (SEQ ID NO: 181) hCD37-M3 MSAQESCLSLIKYFLFVFNLFFFVLGSLIFCFGIWILIDKTSFVSFVGLAFVPLQI WSKVLAISGIFTMGIALLGCVGALKELRCLLGLYFGMLLLLFATQITLGILISTQRAQLER SLRDWEKTIQKYGTNPEETAAEESWDYVQFQLRCCGWHYPQDWFQVLILRGNGSEAHRVP CSCYNSTATNDSTVFDKLFFSQLSRLGHLARSRHSADICAVPAESHIYREGCAQGLQKWLH NNLISIVGICLGVGLLELGFMTLSIFLCRNLDHVYNRLARYR (SEQ ID NO: 182) hCD37-M45 MSAQESCLSLIKYFLFVFNLFFFVLGSLIFCFGIWILIDKTSFVSFVGLAFVPLQI SKVLAISGIFTMGIALLGCVGALKELRCLLGLYFGMLLLLFATQITLGILISTQRAQLER SLRDWEKTIQKYGTNPEETAAEESWDYVQFQLRCCG HYPQDWFQVLILRGNGSEAHRVP CSCYNLSATNDSTILDKVILPQLSRLGPRAKLRQTADICALPAKAHIYREGCAQSLQK LH N LISIVGICLGVGLLELGFMTLSIFLCR LDHVYNRLARYR (SEQ ID NO:183) rauCD37-R176 ISTQRVRLERRVQELVLRTIQSYRTNPDETAAEESWDYAQFQLRCCGWQSPRDW K AQMLKA ESEEPRVPCSCYNSTATNDSTVFDKLFFSQLSRLGPRAKLRQTADICALPAKAH IYREGCAQSLQ (SEQ ID NO:184).
Para preservar uno de estos sitios de restricción, Kpnl, se incluyó el R176 humano en todos los constructos quiméricos murinos/humanos . Los cassettes de CD37 murinos y humanos fueron ordenados de Blue Heron y clonados en el vector pSRa junto con un fragmento del extremo 5' del constructo de CD37 humano original generado por PCR para incorporar el sitio EcoRV y el fragmento de restricción Pstl a Xbal del extremo 3' tomado del constructo de CD37 de macaca original. Los cassettes de CD37 quiméricos murinos y humanos fueron construidos luego usando digestos de restrcción estándar y ligaduras aprovechando los sitios de restricción únicos comunes.
La variante hCD37-Ml se creó insertando un fragmento de restricción EcoRV-SacII que codificaba el AA S109 a A138 de la secuencia de CD37 urina análoga. Igualmente, la variante hCD37-M3 se creó insertando el fragmento de restricción Kpnl-Blpl que codificaba el AA V177 a L201 de la secuencia de CD37 murina análoga. La variante hCD37-M45 se creó insertando un fragmento de restricción Blpl-Pstl que codificaba el AA S202 a 1243 de la secuencia de CD37 murina análoga. Los clones resultantes fueron verificados por la digestión de la enzima de restricción seguido por secuenciación de ADN.
Se obtuvieron líneas celulares estables por transfección de los plásmidos de expresión de variantes de CD37 quiméricas murinas y humanas en células 300-19 usando procedimientos de electroporación estándar. Brevemente, 5 x 106 células 300-19 fueron electroporadas en medio RPMI-1640 frío usando un BioRad Gene Pulser austado a 260V y 960 i . Subsiguientemente, las células fueron diluidas y colocadas en placas de 96 cavidades en medio RPMI-1640 suplementado con 10% de FBS y 50 µ? de ß-mercaptoetanol . Después de 24 horas se agregó G418 (Invitrogen) a una concentración final de 2 mg/mL para seleccionar las células transíectadas . Después de 2 semanas, se aislaron colonias individuales, se analizaron con respecto a la expresión de superficie de CD37 por citometría de flujo y se expandieron.
Ligadura de anticuerpos a variantes de CD37 La ligadura de varios anticuerpos CD37 a células que expresan variantes y el tipo salvaje de CD37 humano fue analizada por citometría de flujo usando 1,5 µ?/p? de cada anticuerpo. Los anticuerpos aislados de esta invención fueron comparados al anticuerpo WR17 disponible comercialmente , como también el TRU-016 SMIP. Como se puede ver en la Figura 18A, todos los anticuerpos se ligaron a las células que expresaban el CD37 de tipo salvaje. Igualmente, todos los anticuerpos testeados se ligaron a la variante hCD37-M3 (Figura 18B) . Por contraste, los anticuerpos aislados de esta invención se ligaron a la variante hCD37-Ml, mientras que TRU-016 y WR17 no se pudieron ligar a la variante hCD37-Ml (Figura 19A) . Los anticuerpos CD37-50 y CD37-51, y TRU-016, también pudieron ligarse a la variante hCD37-M45. El R17 mostró una ligadura parcial a la variante hCD37-M45, mientras que los otros anticuerpos CD37-3, CD37-12, CD37-38, CD37-56 y CD37-57 no pudieron ligarse (Figura 19B) . Esto sugiere que todos los anticuerpos aislados de esta invención no requieren los 12 residuos AA en la variante hCD37-Ml que fueron cambiados a los residuos AA murinos correspondientes para ligarse al antígeno CD37. Por contraste, los anticuerpos CD37-3, CD37-12, CD37-38, CD37-56 y CD37-57 requieren por lo menos uno de los 10 residuos AA en la variante hCD37-M45 que fueron cambiados a los residuos AA murinos correspondientes para ligarse al antígeno.
Este resultado inesperado indica que los anticuerpos aislados de esta invención representan una clase nueva de anticuerpos CD37 con una combinación única de características funcionales .
Además, se construyen constructos similares siguiente el mismo diseño. Los constructos contienen varias combinaciones de secuencias murinas, humanas y/o de macaca que codifican el "loop" extracelular grande de CD37 (ver Figura 17) . Ejemplos de constructos con una sola sección humana insertada en la secuencia del "loop" extracelular grande murino son: hCD37mECD-Hl : MSAQESCLSLIKYFLFVFNLFFFVLGSLIFCFGIWILIDKTSFVSFVGLAFVPLQIWSKVL AISGIFTMGIALLGCVGALKELRCLLGLYFGMLLLLFATQITLGILISTQRAQLERSLRDV VEKTIQKYGTNPEETAAEESWDYAQFQLRCCGWQSPRD KAQMLKA ESEEPRVPCSCYN STATNDSTVFDKLFFSQLSRLGPRAKLRQTADICALPAKAHIYREGCAQSLQKWLH NLIS IVGICLGVGLLELGFMTLSIFLCRNLDHVYNRLARY (SEQ ID NO: 185) hCD37mECD-H2 : MSAQESCLSLIKYFLFVFNLFFFVLGSLIFCFGIWILIDKTSFVSFVGLAFVPLQIWSKVL AISGIFTMGIALLGCVGALKELRCLLGLYFGMLLLLFATQITLGILISTQRVRLERRVQEL VLRTIQSYRTNPDETAAEES DYVQFQLRCCGWHYPQD FQVLILRGNGSEAHRVPCSCYN STATNDSTVFDKLFFSQLSRLGPRAKLRQTADICALPAKAHIYREGCAQSLQKWLHNNLIS IVGICLGVGLLELGFMTLSIFLCRNLDHVYNRLARYR (SEQ ID NO: 186) hCD37mECD-H3 : MSAQESCLSLIKYFLFVFNLFFFVLGSLIFCFGI ILIDKTSFVSFVGLAFVPLQI WSKVLAISGIFTMGIALLGCVGALKELRCLLGLYFGMLLLLFATQITLGILISTQRVRLER RVQELVLRTIQSYRTNPDETAAEESWDYAQFQLRCCG QSPRDWNKAQMLKANESEEPRVP CSCYNLSATNDSTILDKVILPQLSRLGPRAKLRQTADICALPAKAHIYREGCAQSLQKWLH NNLISIVGICLGVGLLELGFMTLSIFLCRNLDHVYNRLARYR (SEQ ID NO: 187) hCD37mECD-H4 : MSAQESCLSLIKYFLFVFNLFFFVLGSLIFCFGIWILIDKTSFVSFVGLAFVPLQI WSKVLAISGIFTMGIALLGCVGALKELRCLLGLYFGMLLLLFATQITLGILISTQRVRLER RVQELVLRTIQSYRTNPDETAAEESWDYAQFQLRCCGWQSPRDWNKAQMLKA ESEEPRVP CSCYNSTATNDSTVFDKLFFSQLSRLGHLARSRHSADICALPAKAHIYREGCAQSLQKWLH N LISIVGICLGVGLLELGFMTLSIFLCR LDHVYNRLARYR (SEQ ID NO: 188) hCD37mECD-H5 MSAQESCLSLIKYFLFVFNLFFFVLGSLIFCFGIWILIDKTSFVSFVGLAFVPLQI SKVLAISGIFTMGIALLGCVGALKELRCLLGLYFGMLLLLFATQITLGILISTQRVRLER RVQELVLRTIQSYRTNPDETAAEESWDYAQFQLRCCGWQSPRDWNKAQMLKANESEEPRVP CSCYNSTATNDSTVFDKLFFSQLSRLGPRAKLRQTADICAVPAESHIYREGCAQGLQKWLH NNLISIVGICLGVGLLELGFMTLSIFLCRNLDHVYNRLARYR (SEQ ID NO : 189) y hCD37mECD-H45 MSAQESCLSLIKYFLFVFNLFFFVLGSLIFCFGI ILIDKTSFVSFVGLAFVPLQI WSKVLAISGIFTMGIALLGCVGALKELRCLLGLYFGMLLLLFATQITLGILISTQRVRLER RVQELVLRTIQSYRTNPDETAAEESWDYAQFQLRCCG QSPRDWNKAQMLKANESEEPRVP CSCYNSTATNDSTVFDKLFFSQLSRLGHLARSRHSADICAVPAESHIYREGCAQGLQKWLH NNLISIVGICLGVGLLELGFMTLSIFLCRNLDHVYNRLARYR (SEQ ID NO : 190) .
Ejemplos adicionales son constructos- con una sola sección de macaca insertada en el "loop" extracelular grande humano tales como: hCD37-Macl2 : MSAQESCLSLIKYFLFVFNLFFFVLGSLIFCFGIWILIDKTSFVSFVGLAFVPLQI WSKVLAISGIFTMGIALLGCVGALKELRCLLGLYFGMLLLLFATQITLGILISTQRAQLER SLQDIVEKTIQRYHTNPEETAAEESWDYVQFQLRCCGWHSPQDWFQVLTLRGNGSEAHRVP CSCYNLSATNDSTILDKVILPQLSRLGHLARSRHSADICAVPAESHIYREGCAQGLQKWLH NNLISIVGICLGVGLLELGFMTLSIFLCRNLDHVYNRLARYR (SEQ ID NO: 191) hCD37-Mac4: MSAQESCLSLIKYFLFVFNLFFFVLGSLIFCFGIWILIDKTSFVSFVGLAFVPLQI WSKVLAISGIFTMG-IALLGCVGALKELRCLLGLYFGMLLLLFATQITLGILISTQRAQLER SLRDWEKTIQKYGTNPEETAAEESWDYVQFQLRCCG HYPQDWFQVLILRGNGSEAHRVP CSCYNLSATNDSTILDKVILPQLSRLGQLARSRHSTDICAVPAESHIYREGCAQGLQK LH LISIVGICLGVGLLELGFMTLSIFLCR LDHVYNRLARYR (SEQ ID NO : 192) hCD37-Mac5 : MSAQESCLSLIKYFLFVFNLFFFVLGSLIFCFGIWILIDKTSFVSFVGLAFVPLQI WSKVLAISGIFTMGIALLGCVGALKELRCLLGLYFGMLLLLFATQITLGILISTQRAQLER SLRDWEKTIQKYGTNPEETAAEESWDYVQFQLRCCGWHYPQDWFQVLILRGNGSEAHRVP CSCYNLSATNDSTILDKVILPQLSRLGHLARSRHSADICAVPANSHIYREGCARSLQKWLH LISIVGICLGVGLLELGFMTLSIFLCRNLDHVYNRLARYR (SEQ ID NO: 193) y hCD37-Mac45 : MSAQESCLSLIKYFLFVFNLFFFVLGSLIFCFGIWILIDKTSFVSFVGLAFVPLQI SKVLAISGIFTMGIALLGCVGALKELRCLLGLYFGMLLLLFATQITLGILISTQRAQLER SLRDWEKTIQKYGTNPEETAAEESWDYVQFQLRCCGWHYPQDWFQVLILRGNGSEAHRVP CSCYNLSATNDSTILDKVILPQLSRLGQLARSRHSTDICAVPANSHIYREGCARSLQK LH NNLISIVGICLGVGLLELGFMTLSIFLCRNLDHVYNRLARY (SEQ ID NO: 194) .
Además se generaron mutaciones de puntos individuales en la secuencia del "loop" extracelular grande humano para identificar los residuos importantes para la ligadura de anticuerpos.
La ligadura de los agentes de ligadura de CD37 a células que expresan las SEQ ID NOs : 185-194 es analizada por citometría de flujo como se describió más arriba.
Ejemplo 14 Preparación de huCD37-3-SPP-DMl El ligador N-succinimidil 4- (2-piridyiditio) pentanoato (SPP) se disolvió en etanol. El anticuerpo huCD37-3 se incubó a 5 mg/mL con un exceso molar de 7 veces del ligador SPP durante aproximadamente 100 minutos a temperatura ambiente en 50 mM de tampón de fosfato de potasio (pH 6,5) que contenía 50 mM de NaCl, 2 mM de EDTA y 5% de etanol. La mezcla de reacción fue purificada usando una columna SEPHADEX™ G25F equilibrada con el tampón de fosfato de potasio antes mencionado. Las fracciones que contenían anticuerpos fueron reunidos y se usaron para pasos subsiguientes .
El maitansinoide DM1 se disolvió en dimetilacetamida (DMA, la concentración final es 3%) y se agregó de a gotas un exceso molar de 1,7 veces con relación al ligador, al anticuerpo modificado con SPP. Después de incubación durante la noche a temperatura ambiente, el anticuerpo conjugado fue purificado por cromatografía en SEPHADEX™ G25F equilibrada en solución salina con tampón fosfato (PBS) , pH 6,5. El conjugado huCD37-3-SPP-DMl fue dializado luego en un tampón que contenía 10 mM de histidina, 250 mM de glicina, 1% de sacarosa, pH 5,5. El número de moléculas de DM1 ligadas por molécula de anticuerpo se determinó usando los coeficientes de extinción informados previamente para el anticuerpo y el DM1 (Liu et al., Proc. Nati. Acad. Sci . USA, 93, 8618-8623 (1996)). El porcentaje de maitansinoide libre presente después de la reacción de conjugación se determinó inyectando 20-50 de conjugado sobre una columna HiSep equilibrada en 25% de acetonitrilo en 100 mM de tampón de acetato de amonio, pH 7,0, y eluyendo en acetonitrilo. El área pico de la especie de maitansinoide libre (eluido en el gradiente e identificado por comparación del tiempo de elución con estándares conocidos) se midió usando un detector de absorbancia ajustado a una longitud de onda de 252 nm y comparado con el área pico relacionada con el maitansinoide ligado (eluido en el pico conjugado en las fracciones de flujo a través de la columna) para calcular el porcentaje de la especie de maitansinoide libre total. Los conjugados con 3,5-4 moléculas de DM1 por anticuerpo huCD37-3 se obtuvieron con <1% presente como maitansinoide no conjugado.
Preparación de huCD37-3-SMCC-DMl El ligador (succinimidil 4-(N-maleimidometil) ciclohexano-1-carboxilato (SMCC, Pierce Biotechnology, Inc) se disolvió en DMA. El anticuerpo huCD37-3 fue modificado con SMCC para introducir maleimidas en el anticuerpo incubando el anticuerpo a 5 mg/mL en 50 mM de fosfato de potasio, 50 mM de NaCl, 2 mM de EDTA, pH 6,5 con un exceso molar de 10 de SMCC. Después de aproximadamente 100 minutos a temperatura ambiente, la mezcla de reacción se purificó usando una columna SEPHADEX™ G25 equilibrada con el mismo tampón de fosfato de potasio. Las fracciones que contenían el anticuerpo se reunieron y se usaron para los pasos subsiguientes.
El anticuerpo modificado con SMCC se hizo reaccionar con una solución 10 mM de DM1 a un exceso molar de 1,7 con relación al ligador de maleimida. La reacción se agitó a temperatura ambiente durante aproximadamente 18 horas. La mezcla de reacción de conjugación se filtró a través de una columna de filtración en gel SEPHADEX™ G25 equilibrada con lxPBS a pH 6,5. El conjugado huCD37-3-SMCC-DMl fue dializado luego en tampón que contenía 10 mM de histidina, 250 mM de glicina, 1% de sacarosa, pH 5,5. El número de moléculas de DM1 ligadas por molécula de anticuerpo y el porcentaje de especie de maitansinoide libre total fueron determinados como se describió más arriba. Los conjugados con 3,5-4 moléculas de DM1 por anticuerpo huCD37-3 se obtuvieron con <1% presente como maitansinoide no conjugado.
Preparación de huCD37-3-sulfo-mal-DM4 Soluciones de DM4 tiol y el ligador heterobifuncional ácido 1- (2 , 5-dioxo-2 , 5-dihidro-lH-pirrol-l-il) -4- (2 , 5-dioxopirrolidin-l-iloxi ) -4-oxobutano-2-sulfónico (3-sulfo-mal) fueron preparadas en N, N-dimetilacetamida (DMA) a concentraciones de 30-60 mM. El ligador y el DM4 se mezclaron juntos en DMA que contenía hasta 40 % v/v de 200 mM de tampón succinato, 2 mM de EDTA, pH 5,0 para dar una relación entre DM4 y ligador de 1,6 y una concentración final de DM4 igual a 15 mM. Después de mezclar, se dejó la reacción durante 2 hs agregada a una mezcla del anticuerpo huCD37-3 en tampón fosfato (pH 7,5) bajo condiciones de conjugación finales de 4 mg/ml Ab, 90% de tampón fosfato/10% de DMA, pH 7,5. La reacción de conjugación se dejó avanzar a temperatura ambiente durante 2 hs. El conjugado huCD37-3-sulfo-mal-DM4 fue purificado del DM4 en exceso que no reaccionó y se realizó una diálisis de los productos de ligador no conjugado en PBS, seguido por diálisis final en tampón que contenía 10 mM de histidina, 250 mM de glicina, 1% de sacarosa pH 5,5. El conjugado se filtró a través de un filtro de 0,22 µp? para almacenamiento final. El número de moléculas de DM4 por molécula de anticuerpo huCD37-3 (promedio) en el conjugado final y el porcentaje de la especie de maitansinoide libre total se determinaron como se describió más arriba. Los conjugados con 3,5-4 moléculas de DM4 por anticuerpo huCD37-3 se obtuvieron con <1% presente como maitansinoide no conjugado.
Preparación de huCD37-3-PEG4-mal-DMl El reactivo N-hidroxisuccinimidil- (polietilenglicol) 4- (N-maleimidometil) -DM1 (NHS-PEG4-mal-DMl) se disolvió en DMA. El anticuerpo huCD37-3 se incubó a 5 mg/mL en 50 mM de fosfato de potasio, 150 mM de NaCl, 2 mM de EDTA, pH 7,5 con un exceso molar de 7 veces de NHS-PEG4-mal-DMl (10% de DMA total) . Después de aproximadamente 2 horas a temperatura ambiente, la mezcla de reacción se purificó usando una columna SEPHADEX™ G25 equilibrada en lx PBS, pH 7,4. Las fracciones que contenían el anticuerpo se reunieron y dializaron en tampón que contenía 10 mM de histidina, 250 mM de glicina, 1% de sacarosa, pH 5 , 5. El número de moléculas de DM1 ligadas por anticuerpo y el porcentaje de la especie de maitansinoide libre total se determinaron como se describió más arriba. Los conjugados con 3,5-4 moléculas de DM4 por anticuerpo huCD37-3 se obtuvieron con <1 presente como maitansinoide no conjugado.
Ejemplo 15 Ligadura de afinidad de conjugados de maitansinoide Se ensayó la ligadura de afinidad del huCD37-3 ilustrativo después de conjugación a SMCC-DM1, SPP-DM1 o sulfo-mal-DM4 por citometría de flujo como se describió en el ejemplo más arriba. El valor para las constantes de disociación aparentes (Kd) se calculó de las curvas de ligadura mostradas en la Figura 20A y corresponden a 0,26 nM para huCD37-3, 0,46 para huCD37-3-SMCC-DMl , 0,56 nM para huCD37-3-SPP-DMl, y 0,89 nM para los conjugados huCD37-3-sulfo-mal-DM4. Este resultado demuestra que la conjugación de SMCC-DMl, SPP-DM1 o sulfo-mal-DM4 no altera notablemente la afinidad del anticuerpo huCD37-3 anticuerpo ilustrativo.
La ligadura de afinidad de huCD37-38 después de la conjugación a SMCC-DMl fue ensayada por citometría de flujo como se describió en el ejemplo más arriba. El valor para las constantes de disociación aparentes (Kd) se calculó de las curvas de ligadura mostradas en la Figura 20B y corresponden a 1,04 nM para huCD37-38 y 1,2 nM para los conjugados huCD37-38-SMCC-DMl. Este resultado demuestra que la conjugación de SMCC-DM1 no altera notablemente la afinidad del anticuerpo huCD38. Igualmente, la ligadura de afinidad de huCD37-50, huCD37-51, huCD37-56 y huCD37-57 después de la conjugación a SMCC-DM1 fue ensayada por citometría de flujo. El valor para las constantes de disociación aparentes (Kd) se calculó de las curvas de ligadura y corresponde a 0,43 nM para huCD37-50, 0,70 nM para huCD37-50-SMCC-DMl , 2,0 nM para huCD37-51, 1,6 nM para huCD37-51-SMCC-DMl , 0,3 nM para huCD37-56, 0,34 nM para huCD37-56-SMCC-DMl , 0,30 para huCD37-57 y 0,34 para huCD'37-57-SMCC-DMl . Este resultado demuestra que la conjugación con SMCC-DM1 tampoco altera notablemente la afinidad de los anticuerpos huCD37-50, huCD37-51, huCD37-56 o huCD37-57.
Ligadura de afinidad de los conjugados PEG4-mal-DMl La ligadura de afinidad de los anticuerpos huCD37-3 y huCD37-50 ilustrativos después de la conjugación a PEG4-mal-DM1 fue ensayada por citometría de flujo como se describió en el ejemplo más arriba. El valor para las constantes de disociación aparentes (Kd) se calculó de las curvas de ligadura y corresponde a 0,28 nM para los conjugados huCD37-3, 0,35 nM para huCD37-3-PEG4-mal-DMl , 0,68 nM para huCD37-50 y 1,1 nM para huCD37-50-PEG4-mal-DMl . Este resultado demuestra que la conjugadicón con PEG4-mal-DMl no altera notablemente la afinidad de los anticuerpos huCD37-3 o huCD50 ilustrativos.
Actividad pro-apoptótica de los conjugados huCD37-3-SMCC-DM1 La actividad pro-apoptótica de huCD37-3 después de la conjugación a SMCC-DMl fue evaluada por la tinción con Anexina-V en células Ramos como se describió más arriba. El tratamiento o bien con el anticuerpo huCD37-3 o el conjugado huCD37-3-SMCC-DMl dio por resultado aproximadamente 40% de células Ramos positivas a Anexina-V con un valor EC50 de aproximadamente 0,09 nM (Figura 21A) . Las células Ramos tratadas con un anticuerpo control no ligante o un conjugado control SMCC-DMl no ligante contenía sólo hasta 4% de células positivas a Anexina-V. En comparación, el tratamiento con el anticuerpo anti-CD20 rituximab dio por resultado sólo 16% de células positivas a Anexina-V con un valor EC50 de aproximadamente 2 nM. Por contraste, el tratamiento con TRU-016 no aumentó el porcentaje de células Ramos positivas a Anexina-V. Esto demuestra que la fuerte actividad pro-apoptótica del anticuerpo anti-CD37 humano huCD37-3 es retenida después de la conjugación a SMCC-DMl.
Actividad CDC de los conjugados huCD37-3-SMCC-DMl La actividad CDC de huCD37-3 después de la conjugación a SMCC-DMl fue evaluada en células Ramos en presencia de 5% de complemento humano. El tratamiento con huCD37-3 o huCD37-3-SMCC-DM1 dio por resultado una reducción en la viabilidad celular a 53% y 73%, respectivamente (Figura 21B) . Por lo tanto, la acrtividad CDC del anticuerpo huCD37-3 ilustrativo se mantiene después de la conjungación del maitansinoide .
Actividad ADCC de conjugados La actividad ADCC de huCD37-3 después de la conjugación a SMCC-DMl o PEG4-mal-DMl fue evaluada en células Daudi y Ramos en presencia de células efectoras NK humanas por el ensayo de liberación de LDH como se describió más arriba. Como se puede ver en la Figura 22A, los conjugados huCD37-3-SMCC-DM1 o huCD37-3-PEG4-mal-DMl tienen una actividad ADCC similar a la del anticuerpo huCD37-3 no conjugado en células Daudi. El tratamiento con huCD37-3, huCD37-3 SMCC-DMl o huCD37-3-PEG4-mal-DMl dio por resultado aproximadamente 41%, 39% o 36% de lisis de células Daudi con un valor EC50 de 0,42 ng/mL, 1,13 ng/mL, o 0,91 ng/mL, respectivamente. Se obtuvieron resultados similares usando células Ramos como células objetivo. Como antes, los conjugados huCD37-3-SMCC-DM1 o huCD37-3-PEG4-mal-DMl tienen una actividad ADCC comparable al anticuerpo huCD37-3 no conjugado en las células Ramos (Figura 22B) . El tratamiento con huCD37-3, huCD37-3 SMCC-DMl o huCD37-3-PEG4-mal-DMl dio por resultado aproximadamente 43%, 41% o 42% de lisis de células Ramos con un valor EC50 de 0,95 ng/mL, 1,33 ng/mL, o 1,57 ng/mL, respectivamente. Por lo tanto, la potente actividad ADCC del anticuerpo huCD37-3 ilustrativo se mantiene después de la conjugación con maitansinoide .
Inducción de arresto del ciclo celular por huCD37-3-SMCC-DMl El potencial de los anticuerpos y conjugados anti-CD37 para inducir un arresto del ciclo celular en líneas celulares fue evaluado por tinción con yoduro de propridio (PI) seguido por análisis de citometría de flujo. Las células que crecen exponencialmente fueron cosechadas por centrifugación a 1.300 rpm durante 5 minutos a TA y suspendidas nuevamente a 0 , 5 x 106 células/mL en medio RPMI completo. Las células fueron transferidas a 1 mL por cavidad a una placa con 24 cavidades (Falcon 3077) para igualar 0,5 x 106 células/ensayo. Los compuestos de prueba fueron agregados a cada cavidad en una concentración final de 10 nM. Se agregó medio RPMI completo a las cavidades control no tratadas . Las células fueron incubadas durante la noche durante 16 a 20 hs a 37°C en una incubadora humidificada con 5% de C02. El día siguiente, las células fueron cosechadas transfiriéndolas en tubos de poliestireno de 5 mL, se lavaron una vez con 3 mL de PBS, y se fijaron en 1 mL de etanol al 70% durante 30 minutos en hielo. Las muestras se lavaron nuevamente con 3 mL de PBS una vez y se volvieron a suspender en 0,5 mL de PBS . Se agregó R ase a la muestra a 5 L/mL y se incubó a 37 °C durante 30 minutos. Las muestras se tiñeron luego con yoduro de propidio a una concentración final de 50 yg/mL. Las muestras se adquirieron dentro de las 24 horas de la tinción con PI. Las muestras se corrieron en un FACS Calibur (BD Biosciences, San Diego) . El parámetro FL2-A se fijó en una escala lineal y el FL2 PTM se ajustó a la posición Gl pico alrededor de 200. Las muestras se adquirieron a un bajo caudal y se recogieron 10.000 eventos por muestra. La distribución de las células en las diferentes fases del ciclo celular se determinó usando el software ModFit software (Versión 5.11, Verity Software House Inc., USA). Este programa utiliza técnicas de ajuste de picos para modelar automáticamente los datos de PI y provee los datos cuantitativos deseados. Los datos fueron analizados con ajustes de programa estándar.
El efecto de huCD37-3 y huCD37-3-SMCC-DMl sobre el arresto del ciclo celular de células de linfoma BJAB y RL fue evaluado después de una incubación de 16-20 horas con el compuesto a una concentración de 10 nM seguido por tinción con yoduro de propridio (PI) y análisis de citometría de flujo. La incubación con huCD37-3-SMCC-DMl dio por resultado un aumento en el porcentaje de células en la fase G2/M de 13% para células de linfoma BJAB no tratadas a 95% para células tratadas con huCD37-3-SMCC-DMl (Figura 23A) . Similarmente , la incubación con huCD37-3-SMCC-DMl dio por resultado un aumento en el porcentaje de células en la fase G2/M de 12% para células de linfoma RL no tratadas a 33% para células tratadas con huCD37-3-SMCC-DMl (Figura 23B) . Por contraste, el anticuerpo huCD37-3 no tenía efecto sobre los ciclos celulares de las células BJAB o RL. Además, un conjugado SMCC-DMl no ligante testeado a la misma concentración tampoco tuvo efecto sobre el ciclo celular de cualquier tipo de célula. Esto demostró que los conjugados maitansinoides hechos con anticuerpos anti-CD37 aislados provocó un arresto del ciclo celular específico de las líneas celulares de linfoma CD37-positivas .
Ejemplo 16 Ensayos de citotoxicidad in vitro La capacidad de los conjuados de anticuerpos antiCD37 para inhibir el crecimiento celular se midió usando ensayos de citotoxicidad in vitro como se describió en el Ejemplo 10 para anticuerpos. Brevemente, las células objetivo fueron colocadas en placas a 5.000 células por cavidad en 100 µL en medio RPMI completo (RPMI-1640, 10% de suero bovino fetal, 2 mM de glutamina, 1% de penicilina-estreptomicina, todos los reactivos de Invitrogen) . Los conjugados se diluyeron en medio RPMI completo usando series de dilución de 3 veces y se agregaron 100 L por cavidad. La concentración final osciló típicamente entre 3 x 10"8 M y 4,6 x 10"12 M. Las células fueron incubadas a 37°C en una incubadora humidificada a 5% de C02 durante 4 a 5 días. La viabilidad de las células remanentes se determinó por el ensayo colorimétrico WST-8 como se describbió para los ensayos de anticuerpos y se midió la absorbancia a 450 nm (A450) en un lector de placas con cavidades múltiples (Dojindo Molecular Technologies, Inc., Rockville, MD, US) . Se calculó la viabilidad por ciento dividiendo cada valor de muestra tratada por el valor promedio de las cavidades con las células no tratadas . El valor de viabilidad por ciento se representó gráficamente contra la concentración de anticuerpo-conjugado en un gráfico semilogarítmico para cada tratamiento.
La citotoxicidad in vitro de conjugados SMCC-DM1 de varios anticuerpos La citotoxicidad in vitro de conjugados SMCC-DM1 hechos con varios anticuerpos anti-CD37 fue comparado con la actividad de un conjugado huIgG-SMCC-DMl no específico. Los resultados de un ensayo de citotoxicidad típico se muestran en la Figura 24A para células Daudi incubadas con huCD37-3-SMCC-DM1, huCD37-38-SMCC-DMl, huCD37-50-SMCC-DM1 , huCD37-51-SMCC-DM1, huCD37-56-SMCC-DMl, huCD37-57-SMCC-DMl , o un conjugado de control huIgGl-SMCC-DMl no ligante. Todos los conjugados específicos dieron por resultado una muerte celular específica en comparación con el conjugado control y redujeron la viabilidad celular completamente a la mayor concentración testeada. Los valores EC50 corresponden a 0,067 nM, 0,098 nM, 0,13 nM, 0,20 nM, 0,31 nM y 0,35 nM para los conjugados SMCC-DM1 de huCD37-3, huCD37-38, huCD37-50, huCD37-51, huCD37-56 y huCD37-57, respectivamente. Por contraste, los conjugados SMCC-DM1 de un anticuerpo de control de isotipo no ligante dieron por resultado la muerte celular con un valor EC50 de sólo 20 nM.
Igualmente, la Figura 24B muestra los resultados de un ensayo de citotoxicidad típico usando células Granta-519 incubadas con huCD37-3-SMCC-DMl , huCD37-38-SMCC-DMl , huCD37-50-SMCC-DM1, huCD37-51-SMCC-DMl, o un conjugado control huIgGl-SMCC-DMl no ligante durante 5 días. El tratamiento con SMCC-DM1 específico para todos redujo completamente la viabilidad a la mayor concentración testeada con un EC50 de 0,047 nM, 0,074 nM, 0,12 nM y 0,25 nM para conjugados SMCC-DM1 de huCD37-3, huCD37-38, huCD37-50 y huCD37-51, respectivamente. Por contraste, los conjugados de SMCC-DM1 de un anticuerpo control de isotipo no ligante dio por resultado la muerte celular con un valor EC50 de sólo 20 nM.
Citotoxicidad in vitro de los conjugados huCD37-3-SMCC-DM1, -SPP-DM1 y sulfo-mal-DM4 La toxicidad in vitro de los conjugados huCD37-3-SMCC-DM1, -SPP-DM1 y sulfo-mal-DM4 contra las células Daudi, Granta-519 y BJAB se comparó con la actividad de un conjugado huIgG-MCC-DMl no específico. Todos los conjugados testeados redujeron la viabilidad de las células Daudi completamente a la mayor concentración testeada con un valor EC50 de 0,065 nM, 0,12 nM y 0,14 nM para huCD37-3-SMCC-DMl , huCD37-3-SPP-DM1 y huCD37-3-sulfo-mal-DM4 , respectivamente. Por contraste, el conjugado huIgG-SMCC-DMl no específico tenía un valor EC50 de 19 nM. Igualmente, todos los conjugados testeados redujeron la viabilidad de las células Granta-519 completamente a la mayor concentración testeada con un valor EC50 de 0,047 nM, 0,13 nM y 0,088 nM para huCD37-3-SMCC-DMl , huCD37-3-SPP-DMl y huCD37-3-sulfo-mal-DM4 , respectivamente. Por contraste, el conjugado huIgG-SMCC-DMl no específico tenía un valor EC50 de 19 nM. Finalmente, todos los conjugados testeados redujeron la viabilidad de las células BJAB completamente a la mayor concentración testeada con un valor EC50 de 0,041 nM, 0 , 11 nM y 0 , 11 nM para huCD37-3-SMCC-DM1, huCD37-3-SPP-DMl y huCD37-3-sulfo-mal-DM4 , respectivamente. Por contraste, el conjugado huIgG-SMCC-DMl no específico tenía un EC50 de 16 nM.
Citotoxicidad in vitro de los conjugados huCD37-3-SMCC- DM1 y huCD37-3-PEG4-mal-DMl La citotoxicidad in vitro de los conjugados huCD37-3-SMCC-DM1 y huCD37-3-PEG4-mal-DMl contra un panel de líneas celulares de linfoma se comparó con la actividad de un conjugado huIgG-SMCC-DMl no específico. El tratamiento con los conjugados huCD37-3 redujo completamente a viabilidad de las células Daudi a la mayor concentración testeada con un valor EC50 de 0,036 nM o 0,018 nM para los conjugados huCD37-3-SMCC-DM1 o huCD37-3-PEG4-mal-DMl, respectivamente. Por contraste, los conjugados de control de isotipo no ligantes redujeron la viabilidad con un valor EC50 de 16 nM o mayor que 30 nM para huIgG-SMCC-DMl o huIgG-PEG4-mal-DMl , respectivamente. Igualmente, el tratamiento con los conjugados huCD37-3 redujo completamente la viabilidad de las células Granta-519 a la mayor concentración testeada con un valor EC50 de 0,014 nM o 0,012 nM para los conjugados huCD37-3-SMCC-DM1 o huCD37-3-PEG4-mal-DMl, respectivamente. Por contraste, los conjugados de control de isotipo no ligantes redujeron la viabilidad con un valor EC50 de 6,5 nM o mayor que 12 nM para huIgG-SMCC-DMl o huIgG-PEG4-mal-DMl , respectivamente .
La citotoxicidad in vifcro de los conjugados huCD37-3-SMCC-DM1 y huCD37-3-PEG4-mal-DMl contra un panel de líneas celulares de linfoma fue comparado con la actividad de un conjugado huIgG-SMCC-DMl no específico. El tratamiento con los conjugados huCD37-3 redujo completamente la viabilidad de las células BJAB a la mayor concentración testeada con un valor EC50 de 0,019 nM o 0,010 nM para los conjugados huCD37-3-SMCC-DM1 o huCD37-3-PEG4-mal-DMl, respectivamente. Por contraste, los conjugados de control de isotipo no ligantes redujeron la viabilidad con un valor EC50 de 13 nM o 17 nM para huIgG-SMCC-DMl o huIgG-PEG4-mal-DMl , respectivamente. Igualmente, el tratamiento con los conjugados huCD37-3 redujo completamente la viabilidad de las células SU-DHL-4 a la mayor concentración testeada con una EC50 de 0,031 nM o 0,024 nM para los conjugados huCD37-3-SMCC-DMl o huCD37-3-PEG4-mal-DM1, respectivamente. Por contraste, los conjugados de control de isotipo no ligantes redujeron la viabilidad con una EC50 de más de 30 nM para ambos, huIgG-SMCC-DMl o huIgG-PEG4-mal-DMl . El conjugado huCD37-3-SMCC-DMl también mostró potencia contra la línea celular FL DOHH-2 así como también las líneas celulares CLL tales como JVM-2 y JVM-3 (Figura 32B) .
El tratamiento con los conjugados huCD37-3 redujo completamente la viabilidad de las células Raji a la mayor concentración testeada con una EC50 de 0,071 nM o 0,045 nM para los conjugados huCD37-3-SMCC-DMl o huCD37-3-PEG4-mal-DM1, respectivamente. Por contraste, los conjugados de control de isotipo no ligantes redujeron la viabilidad con una EC50 de 24 nM o 47 nM para huIgG-SMCC-DMl o huIgG-PEG4-mal-DMl, respectivamente. A continuación, los mismos conjugados fueron testeados en un clon de Raji resistente a la vincristina denominadoRaj i-VCR . Como se puede ver para las células Raji parentales, ambos conjugados mostraron muerte celular específica. El tratamiento con los conjugados huCD37-3 redujo completamente la viabilidad de las células Raji-VCR a la mayor concentración testeada con una EC50 de 0,11 nM o 0,037 nM para los conjugados huCD37-3-SMCC-DMl o huCD37-3-PEG4-mal-DMl , respectivamente. Por contraste, los conjugados de control de isotipo no ligantes redujeron la viabilidad con una EC50 de 46 nM o 100 nM para huIgG-SMCC-DMl o huIgG-PEG4-mal-DMl, respectivamente.
• El tratamiento con los conjugados huCD37-3 redujo completamente la viabilidad de las células Namalwa a la mayor concentración testeada con una EC50 de 0,033 nM o 0,024 nM para los conjugados huCD37-3-SMCC-DMl o huCD37-3-PEG4-mal-DM1, respectivamente. Por contraste, los conjugados de control de isotipo no ligantes redujeron la viabilidad con una EC50 de 20 nM o mayor que 30 nM para huIgG-SMCC-DMl o huIgG-PEG4-mal-DMl , respectivamente. Igualmente, el tratamiento con los conjugados huCD37-3 redujo completamente la viabilidad de las células Ramos a la mayor concentración testeada con una EC50 de 0,16 nM o 0,069 nM para conjugados huCD37-3-SMCC-DMl o huCD37-3-PEG4-mal-DMl , respectivamente. Por contraste, los conjugados de control de isotipo no ligantes redujeron la viabilidad con una EC50 de 20 nM para huIgG-SMCC-DMl y más de 30 nM para huIgG-PEG4-mal-DMl .
Citotoxicidad in vitro de huCD37-3-SMCC-DMl en células Molt-4 antígeno-negativas Para verificar adicionalmente la especificidad de la citotoxicidad de huCD37-3-SMCC-DMl, se comparó su actividad con un conjugado huIgG-MCC-DMl no específico contra la línea celular de leucemia linfoblástica aguda de células Molt-4 que no expresa CD37. Se usó una concentración aumentada de ambos conjugados en este experimento para capturar la citotoxicidad no específica relativamente pobre. El conjugado HuCD37-3-SMCC-DMl y el conjugado no específico mostraron la misma citotoxicidad con una EC50 de 38 nM y 42 nM, respectivamente.
Resumen de citotoxicidad in vitro de los conjugados maitansinoides anticuerpos anti-CD37 Si se toman estos resultados de citotoxicidad juntos, es evidente que los conjugados hechos con los anticuerpos anti-CD37 aislados mostraron citotoxicidad específica contra un panel de líneas celulares de linfoma CD37-positivas (Figura 32B) . En cada caso testeado se observó una buena ventana de especificidad para cada línea celular que expresa CD37, sugiriendo que la citotoxicidad es un resultado de la ligadura del anticuerpo anti-CD37 específico a las células objetivo. Además, el conjugado huCD37-3-SMCC-DMl y el conjugado no específico mostraron la misma pobre citotoxicidad contra las células Molt-4 antígeno-negativas . Esto demuestra que la citotoxicidad observada para este conjugado ilustrativo depende de la expresión de CD37. El anticuerpo huCD37-3 también fue activo contra muchas líneas celulares incluyendo DOHH-2, Granata-519, SU-DHL-4 , JVM-2, y JVM-3. Por contraste, el compuesto SMIP TRU-016 anti-CD37 no tenía un efecto directo sobre la supervivencia de cualquiera de estas líneas celulares. El anticuerpo anti-CD20 mostró menos actividad directa que huCD37-3 en la mayoría de estas líneas celulares a pesar de los niveles de expresión de CD20 frecuentemente mayores medidos por citometría de flujo cuantitativa (Figura 32A) .
Ejemplo 17 Eficacia in vivo de anticuerpos anti-CD37 y sus conjugados SMCC-DMl en un modelo de xenoinjerto de BJAB Los anticuerpos anti-CD37 y sus conjugados SMCC-DMl fueron testeados en un modelo de xenoinjerto establecido usando células de linfoma BJAB implantadas en forma subcutánea en ratones SCID. Los animales fueron aleatorizados por volumen de tumor en grupos de tratamiento cuando los tumores alcanzaban un volumen de tumor medio de aproximadamente 120 mm3 y fueron tratados una vez el día 12 post- inoculación de células o bien con 10 mg/kg de (A) huCD37-3 Ab, huCD37-3-SMCC-DMl , huCD37-50 Ab, huCD37-50-SMCC-DM1 o (B) huCD37-38 Ab, huCD37-38-SMCC-DMl , huCD37-56 Ab, huCD37-56-SMCC-DMl . El volumen tumoral medio de los diferentes grupos de tratamiento se representó gráficamente contra el tiempo post-inoculación de células tumorales en las Figuras 25A-25B. Es evidente que el tratamiento con cualquiera de los anticuerpos dio por resultado una reducción moderada del volumen tumoral medio, mientras que el tratamiento con cualquiera de los conjugados SMCC-DMl dio por resultado una reducción más significativa del volumen tumoral medio. Adicionalmente, para cada tratamiento se calculó un valor %T/C que corresponde al volumen tumoral medio de cada grupo tratado dividido por el volumen tumoral medio del grupo tratado con vehículo. Un tratamiento con un valor % T/C de menos de 42% es considerado activo, mientras que un tratamiento con un valor % T/C de menos de 12% es considerado altamente activo. El tratamiento con todos los conjugados SMCC-DMl testeados dio por resultado una reducción significativa del volumen tumoral medio. El valor %T/C el día 29 post-inoculación de las células correspondió a 20%, 20%, 9% o 4% para huCD37-3-SMCC-DMl , huCD37-50-SMCC-DMl , huCD37-38-SMCC-DM1 o huCD37-56-SMCC-DM1 , respectivamente.
Eficacia in vivo del anticuerpo huCD37-3 y los conjugados sulfo-mal-DM4 , -SPP-DMl y SMCC-DMl en un modelo de xenoinjerto BJAB Para evaluar la eficacia in vivo de los conjugados maitansioides adicionales, se compararon los conjugados sulfo-mal-DM4 y SPP-DMl del anticuerpo huCD37-3 ilustrativo a los conjugados SMCC-DMl en un modelo de xenoinjerto usando células de linfoma BJAB implantadas endovenosamente en ratones SCID.
Los animales fueron aleatorizados por volumen de tumor en grupos de tratamiento cuando los tumores alcanzaron un volumen de tumor medio de aproximadamente 120 mm3 y fueron tratados una vez el día 9 post-inoculación de las células o bien con 10 mg/kg de huCD37-3 Ab, huCD37-3-SMCC-DMl, huCD37-3-sulfo-mal-DM4 o con 5 mg/kg of huCD37-3-SPP-DMl . El volumen tumoral medio de los diferentes grupos de tratamiento es representado gráficamente contra el tiempo post-inoculación de las células tumorales en la Figura 26. Es evidente que el tratamiento con cualquiera de los conjugados dio por resultado una reducción significativa en el volumen tumoral medio. El valor %T/C fue calculado como se describió más arriba para cada tratamiento usando el volumen tumoral medio para cada grupo de tratamiento. El valor %T/C el día 21 post-inoculación de las células correspondió a 49%, 5%, 7% o 4% para huCD37-3, huCD37-3-S CC-D l( huCD37-3-sulfo-mal-DM4 or huCD37-3-SPP-DMl, respectivamente. Al final del estudio el día 121, el tratamiento con huCD37-3-sulfo-mal-DM4 dio por resultado 3 de 8 supervivientes libres de tumores (TFS) , mientras que el tratamiento con huCD37-3-SPP-DMl dio por resultado 1 de 8 TFS . No se observaron TFS en los grupos de anticuerpo huCD37-3, huCD37-3-SMCC-DMl o PBS vehículo control. Esto indicó que los conjugados maitansinoides del anticuerpo huCD37-3, tal como, por ejemplo, los conjugados SMCC-DM1, sulfo-mal-DM4 o SPP-DM1, eran altamente activos en el modelo BJAB.
La eficacia in vivo del anticuerpo huCD37-3 y los conjugados sulfo-mal-DM4 , -SPP-DM1 y SMCC-DM1 en un modelo de xenoinjerto SU-DHL-4 Se utilizó un segundo modelo de xenoinjerto usando células de linforma difuso de las células B grandes SU-DHL-4 implantadas subcutáneamente en ratones SCID para evaluar la eficacia in vivo de los conjugados sulfo-mal-DM4 y SPP-DM1 del anticuerpo huCD37-3 ilustrativo en comparación con los conjugados SMCC-DM1. Los animales fueron aleatorizados por peso corporal en grupos de tratamiento cuando se establecían los tumores y se trataron una vez el día 17 post-inoculación de células o bien con 10 mg/kg de huCD37-3 Ab; huCD37-3-SMCC-DM1, huCD37-3-sulfo-mal-DM4 o con 5 mg/kg de huCD37-3-SPP-DM1. El volumen tumoral medio de los diferentes grupos de tratamiento se representó gráficamente contra el tiempo postinoculación de las células tumorales en la Figura 27. Es evidente que el tratamiento con el anticuerpo huCD37-3 dio por resultado una reducción en el volumen tumoral medio, mientras que el tratamiento con cualquiera de los conjugados dio por resultado una reducción más significativa en el volumen tumoral medio. El valor %T/C se calculó como se describió más arriba para cada tratamiento. El valor %T/C el día 37 post-inoculación de las células correspondió a 32%, 1%, 1% o 3% para huCD37-3, huCD37-3-SMCC-DMl , huCD37-3-sulfo-mal-DM4 o huCD37-3-SPP-DMl , respectivamente. Al final del estudio el día 125, el tratamiento con huCD37-3-SMCC-DMl o huCD37-3-sulfo-mal-DM4 dio por resultado 8 de 10 supervivientes libres de tumores (TFS) , mientras que el tratamiento con huCD37-3-SPP-D l dio por resultado 9 de 10 TFS. No se observaron TFS en los grupos de anticuerpo huCD37-3 o PBS vehículo control. Esto indicó que el anticuerpo huCD37-3 propiamente el era activo con una sola dosis de 10 mg/kg en el modelo SU-DHL-4. Además, los conjugados maitansinoides, tales como, por ejemplo, los conjugados SMCC-DM1, sulfo-mal-DM4 o SPP-DM1, agregaron eficacia al anticuerpo y dieron por resultado una potencia aún mayor en este modelo.
Eficacia in vivo del anticuerpo huCD37-3 y los conjugados PEG4-mal-DMl y SMCC-DM1 en un modelo de xenoinjerto de BJAB El anticuerpo huCD37-3 y sus conjugados PEG4-mal-DMl y S CC-DM1 fueron testeados en un modelo de xenoinjerto establecido usando células de linfoma de BJAB implantadas subcutáneamente en ratones SCID. Los animales fueron aleatorizados por volumen de tumor en grupos de tratamiento cuando los tumores alcanzaron un volumen tumoral medio de aproximadamente 120 mm3 y tratados una vez el día 9 post-inoculación celular o bien con 10 mg/kg de huCD37-3 Ab, huCD37-3-SMCC-DMl o huCD37-3-PEG4-mal-DMl . Como se puede ver en la Figura 28, el tratamiento o bien con cualquier conjugado dio por resultado una reducción significativa en el volumen tumoral medio. El valor %T/C se calculó como se describió más arriba para cada tratamiento usando el volumen tumoral medio para cada grupo de tratamiento. El valor %T/C el día 24 post-inoculación de las células correspondió a 48%, 16% o 5% para huCD37-3, huCD37-3-SMCC-DMl o huCD37-3-PEG4-mal-DMl, respectivamente. El día 74 post-inoculación de las células, el tratamiento con huCD37-3-SMCC-D l dio por resultado 1 de 9 supervivientes libres de tumores (TFS) , mientras que el tratamiento con huCD37- PEG4-mal-DMl dio por resultado en 1 de 9 TFS. No se observaron TFS en los grupos de anticuerpo huCD37-3 o PBS control de vehículo. Además, el huCD37-3-SMCC-DMl también era activo a una sola dosis de 5 mg/kg en este modelo con un valor %T/C en día 24 postinoculación de las células de 34%. Esto indicó que los conjugados maitansinoides del anticuerpo huCD37-3, tales como, por ejemplo, los conjugados SMCC-DM1 o PEG4-mal-DMl , eran altamente activos en el modelo BJAB .
Eficacia in yivo del anticuerpo huCD37-3 y los conjugados PEG4-mal-DMl y SMCC-DM1 en un modelo de xenoinjerto SU-DHL-4 Se testearon el anticuerpo huCD37-3 y sus conjugados PEG4-mal-DMl y SMCC-DM1 en un modelo de xenoinjerto establecido usando células de linfoma difuso de céluls B grandes SU-DHL-4 implantadas en forma subcutánea en ratones SCID. Los animáis fueron aleatorizados por peso corporal en grupos de tratamiento y tratados una vez el día 15 post-inoculación de células o bien con 10 mg/kg de huCD37-3 Ab, huCD37-3-SMCC-DMl o con huCD37-3-PEG4-mal-DMl . El volumen tumoral medio de los diferentes grupos de tratamiento se representa gráficamente contra el tiempo post-inoculación de las células tumorales. Figura 29. Es evidente que el tratamiento con el anticuerpo huCD37-3 dio por resultado una reducción del volumen tumoral medio, mientras que el tratamiento con el conjugado dio por resultado una reducción más significativa del volumen tumoral medio. El valor %T/C se calculó como se describió más arriba para cada tratamiento usando el volumen tumoral medio para cada grupo de tratamiento. El valor %T/C el día 38 post-inoculación celular correspondió a 34%, 4% o 2% para huCD37-3, huCD37-3-SMCC-DMl , o huCD37-3-PEG4-mal-DMl, respectivamente. El día 74 postinoculación celular, el tratamiento con huCD37-3-SMCC-DMl dio por resultado 8 de 10 supervivientes libres de tumores (TFS) , mientras que el tratamiento con huCD37-3- PEG4-mal-DMl dio por resultado 10 de 10 TFS. No se observaron TFS en los grupos de anticuerpo huCD37-3 o PBS control vehículo. Esto indicó que el anticuerpo huCD37-3 propiamente el era activo con una dosis invidividual de 10 mg/kg en el modelo SU-DHL-4. Además, los conjugados maitansinoides , tales como, por ejemplo, los conjugados SMCC-D 1 o PEG4-mal-DMl , mostraron una mayor eficacia en comparación con la eficacia del anticuerpo no conjugado al anticuerpo y dio por resultado una potencia aún mayor en este modelo. El conjugado huCD37-3-SMCC-DM1 también mostró una fuerte eficacia a dosis individuales de 2,5 o 5 mg/kg en este modelo con valores %T/C el día 37 post- inoculación celular de 18% y 6%, respectivamente .
Eficacia in vivo del anticuerpo huCD37-3, el conjugado huCD37-3-SMCC-DMl, el anticuerpo Rituximab y un régimem de ciclofosfamida, vincristina y prednisona (CVP) en un modelo de xenoinjerto DoHH2 El anticuerpo huCD37-3 y su conjugado SMCC-DM1 fueron testeados en un modelo de xenoinjerto establecido usando células de linfoma folicular DoHH2 implantadas en forma subcutánea en ratones SCID. Los animales fueron aleatorizados por volumen del tumor en grupos de tratamiento, y los tratamientos comenzaron el día 12 post-inoculación o bien con una sola dosis de 10 mg/kg de anticuerpo huCD37-3 o conjugado huCD37-3-SMCC-DMl; seis dosis de 2 mg/kg de Rituximab dos veces por semana durante tres semanas; o con un régimen de una sola dosis de 40 mg/kg de ciclofosfamida, y 0,5 mg/kg de vincristina, junto con cinco dosis diarias de 0,2 mg/kg de prednisona (CVP) . El volumen tumoral medio de los diferentes grupos de tratamiento fue representado gráficamente contra el tiempo post-inoculación de las células tumorales en la Figura 30. El tratamiento con el anticuerpo huCD37-3 dio por resultado una reducción en el volumen tumoral medio, mientras que el tratamiento con el conjugado huCD37-3-SMCC-DMl dio por resultado una reducción más significativa en el volumen tumoral medio. El conjugado huCD37-3-SMCC-DMl dio por resultado una reducción tumoral media similar al tratamiento con Rituximab y una reducción tumoral media más duradera en comparación con el tratamiento con CVP. El retardo del crecimiento tumoral (valor T-C) fue definido como el tiempo medio (en días) , requerido para que los tumores del grupo de tratamiento (T) y el grupo control (C) alcanzan un tamaño predeterminado y se calculó para cada grupo de tratamiento excluyendo los supervivientes libres de tumores. El valor T-C para que los tumores de tratamiento medios alcanzaran los 800 rara3 correspondió a 8, 25, 24, y 13 días para huCD37-3, huCD37-3-SMCC-DMl, rituximab y CVP, respectivamente. Al final del estudio, el día 130 post-inoculación celular, el tratamiento con huCD37-3-SMCC-D l dio por resultado 1 de 9 supervivientes libres de tumores (TFS) . No se observaron TFS en los grupos de anticuerpo huCD37-3, rituximab, CVP o PBS vehículo control. El conjugado SMCC-D 1 mostró un retardo del crecimiento tumoral comparable al de rituximab y un retardo del crecimiento tumoral en comparación con el anticuerpo no conjugado y el tratamiento con CVP en el modelo DoHH2.
Eficacia in vivo del anticuerpo huCD37-3, el conjugado huCD37-3-SMCC-DMl, los anticuerpos ofatumumab y bendamustina en un modelo de xenoinjerto de JVM-3 El anticuerpo huCD37-3 y su conjugado huCD37-3-SMCC-DMl fueron testeados en un modelo de xenoinjerto establecido usando células de leucemia linfocítica crónica JV -3 implantadas subcutáneamente en ratones SCID. Los animales fueron aleatorizados por volumen tumoral en grupos de tratamiento, y los tratamientos comenzaron el día 7 postinoculación o bien con una dosis individual de 10 mg/kg de anticuerpo huCD37-3, una dosis de 5 o 10 mg/kg de conjugado huCD37-3-SMCC-DMl, seis dosis de 5 mg/kg de ofatumumab dos veces por semana durante tres semanas, o una sola dosis de 50 mg/kg de bendamustina . El volumen tumoral medio de los diferentes grupos de tratamiento fue representado gráficamente contra el tiempo post<-inoculación de células tumorales en la Figura 31. El tratamiento con el anticuerpo huCD37-3 dio por resultado una reducción del volumen tumoral medio, mientras que el tratamiento con el conjugado huCD37-3-SMCC-DM1 dio por resultado una reducción más significativa del volumen tumoral medio. El valor %T/C se calculó como se describió más arriba para cada tratamiento usando el volumen tumoral medio para cada grupo de tratamiento. El valor %T/C el día 20 post-inoculación de células correspondió a 31%, 19%, 10%, 35% y 38% para huCD37-3, 5 mg/kg huCD37-3-SMCC-DM1 , 10 mg/kg huCD37-3-SMCC-DMl , ofatumumab, y bendamustina, respectivamente. Al final del estudio, el día 76 post-inoculación de células, los tratamientos con los anticuerpos huCD37 y ofatumumab dieron por resultado 1 de 10 sobrevivientes libres de tumores (TFS) , mientras que huCD37-3-SMCC-DM1 a 5 y 10 mg/kg dio por resultado 1 y 2 de 10 TFS, respectivamente. No se observaron TFS en los grupos de bendamustina o PBS vehículo control . Esto indicó que el anticuerpo huCD37-3 propiamente el era activo a una sola dosis de 10 mg/kg en el modelo JVM-3. El conjugado maitansinoide, huCD37-3-SMCC-DMl , mostró eficacia aumentada en comparación con el anticuerpo no conjugado. Además, el tratamiento con el conjugado maitansinoide huCD37-3-SMCC-DMl dio por resultado una potencia aún mayor que el tratamiento con ofatumumab o bendamustina en este modelo.
Resumen de la eficacia in vivo de los conjugados de anticuerpo anti-CD37 El CD37 no ha sido evaluado como un objetivo para los inmunoconjugados maitansinoides , sin embargo, el CD20 sí. CD37 es estructuralmente similar a CD20 ya que ambos antígenos son proteínas de la superficie celular que contienen 4 dominios transmembrana y un loop extracelular pequeño y uno grande. Se ha mostrado que los anticuerpos contra cualquiera de los antígenos son internalizados lentamente y tienen una velocidad lenta a moderada de metabolismo intracelular (Press et al. 1989, Cáncer Res. 49 (17) :4906-12 , y Press et al. 1994, Blood. 83 (5) : 1390-7) . Los inmunoconjugados de los anticuerpos de CD20 han sido evaluados previamente. En un caso, los conjugados MCC-DM1 no escindibles de un anticuerpo anti-CD20 mostraron la misma eficacia que el anticuerpo no conjugado, mientras que un conjugado SPP-DM1 escindible del mismo anticuerpo mostró una eficacia mejorada en un modelo de xenoinjerto de Granta-519 en ratones SCID (Polson, A.G., Cáncer Res. 2009;69:2358-64). Similarmente, los conjugados de caliqueamicina de rituximab hechos con un ligador amida estable a los ácidos, no mostraron una eficacia mejorada in vivo en un modelo de xenoinjerto de Ramos en ratones desnudos. Sólo los conjugados de caliqueamicina de rituximab hechos con un ligador Ac-But de dimetil hidrazida lábil a los ácidos mostró una eficacia mejorada in vivo en este estudio (DiJoseph, J.F., Cáncer Immunol. Immunotherapy 2007; 56:1107-1117).
En un fuerte contraste los conjugados SMCC-DM1 no escindibles de varios anticuerpos anti-CD37 aislados de esta invención muestran una eficacia in vivo notablemente mejorada en el modelo de xenoinjerto BJAB, SU-DHL-4, DoHH2 y JVM-3 en comparación con el anticuerpo no conjugado. Esto sugiere que los anticuerpos aislados tienen propiedades únicas que les permiten ser más eficaces que los conjugados maitansinoides , tales como, por ejemplo, los conjugados SMCC-DM1, in vivo.
Debe apreciarse que la sección Descripción Detallada, y no las secciones del Sumario y el Resumen, está prevista para ser usada para interpretar las reivindicaciones. Las secciones del Sumario y el Resumen presentan una o más, pero no todas, las formas de modalidad ilustrativas de la presente invención de acuerdo con la consideración del o de los inventores, y así, no está previsto que limiten la presente invención y las reivindicaciones adjuntas de ninguna manera.
La presente invención ha sido descripta más arriba con ayuda de los bloques de construcción funcionales que ilustran la implementación de las funciones especificadas y las relaciones de estas. Los límites de estos bloques de construcción funcionales han sido definidos arbitrariamente en la presente para una descripción más conveniente. Los límites alternativos pueden ser definidos en tanto las funciones y relaciones especificadas de estos se realicen apropiadamente .
La descripción precedente de las formas de modalidad específicas revelarán así completamente la naturaleza general de la invención que otros, aplicando el conocimiento compendido por el arte, pueden modificar y/o adaptar fácilmente para varias aplicaciones tales formas de modalidad específicas, sin experimentación excesiva, sin apartarse del concepto general de la presente invención. Por lo tanto, tales adaptaciones y modificaciones pretenden estar dentro del significado y el intervalo de equivalentes de las formas de modalidad divulgadas, en base a la enseñanza y guía presentadas en la presente. Debe entenderse que la fraseología o terminología en la presente es para el propósito de la descripción y no de limitación, de tal modo que la terminología o fraseología de la presente memoria debe ser interpretada por el experto en el arte a la luz de las enseñanzas y guías .
La amplitud y el alcance de la presente invención no debería ser limitada por cualquiera de las formas de modalidad ilustrativas arriba descriptas, sino que deberían ser definidos solamente de acuerdo con las siguientes reivindicaciones y sus equivalentes.
Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (66)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones :
1. Un anticuerpo o uno de sus fragmentos de unión a antígeno que se une específicamente a CD37, caracterizado porque el anticuerpo o su fragmento es capaz de inducir citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) .
2. El anticuerpo o uno de sus fragmentos de unión a antígeno de conformidad con la reivindicación l, caracterizado porque el anticuerpo también es capaz de inducir apoptosis.
3. El anticuerpo o uno de sus fragmentos de unión a antígeno de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque el anticuerpo también es capaz de inducir citotoxicidad mediada por células dependientes de anticuerpos (ADCC) .
4. Un anticuerpo o uno de sus fragmentos de unión a antígeno caracterizado porque específicamente se une con el mismo epítope CD37 como un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en: (a) un anticuerpo comprende el polipéptido de la SEQ ID NO: 55 y el polipéptido de la SEQ ID NO: 72; (b) un anticuerpo comprende el polipéptido de la SEQ ID NO: 59 y el polipéptido de la SEQ ID NO: 75; (c) un anticuerpo comprende el polipéptido de la SEQ ID NO: 61 y el polipéptido de la SEQ ID NO: 77; (d) un anticuerpo comprende el polipéptido de la SEQ ID NO: 64 y el polipéptido de la SEQ ID NO: 80; (e) un anticuerpo comprende el polipéptido de la SEQ ID NO: 66 y el polipéptido de la SEQ ID NO: 82; (f) un anticuerpo comprende el polipéptido de la SEQ ID NO: 68 y el polipéptido de la SEQ ID NO: 84; y (g) un anticuerpo comprende el polipéptido de la SEQ ID NO: 70 y el polipéptido de la SEQ ID NO: 86.
5 . Un anticuerpo o uno de sus fragmentos de unión a antígeno caracterizado porque específicamente se une con CD37 y específicamente se une con el polipéptido de la SEQ ID NO: 180.
6. El anticuerpo o uno de sus fragmentos de unión a antígeno de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque el anticuerpo o uno de sus fragmentos no se une con el polipéptido de la SEQ ID NO: 184.
7. Un anticuerpo o uno de sus fragmentos de unión a antígeno caracterizado porque específicamente se une con CD37 y no se une específicamente con el polipéptido de la SEQ ID NO: 184.
8. Un anticuerpo o uno de sus fragmentos de unión a antígeno que específicamente se une con CD37 , caracterizado porque el anticuerpo o uno de sus fragmentos inhibe competitivamente un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en: (a) un anticuerpo comprende el polipéptido de la SEQ ID NO: 55 y el polipéptido de la SEQ ID NO: 72; (b) un anticuerpo comprende el polipéptido de la SEQ ID NO: 59 y el polipéptido de la SEQ ID NO: 75; (c) un anticuerpo comprende el polipéptido de la SEQ ID NO: 61 y el polipéptido de la SEQ ID NO: 77; (d) un anticuerpo comprende el polipéptido de la SEQ ID NO: 64 y el polipéptido de la SEQ ID NO: 80; (e) un anticuerpo comprende el polipéptido de la SEQ ID NO: 66 y el polipéptido de la SEQ ID NO: 82; (f) un anticuerpo comprende el polipéptido de la SEQ ID NO: 68 y el polipéptido de la SEQ ID NO: 84; y (g) un anticuerpo comprende el polipéptido de la SEQ ID NO: 70 y el polipéptido de la SEQ ID NO: 86.
9. Un anticuerpo o uno de sus fragmentos de unión a antígeno producido por hibridoma caracterizado porque seleccionado del grupo que consiste en la designación del depósito de ATCC PTA-10664, depositado con ATCC el 18 de febrero de 2010, la designación del depósito de ATCC PTA-10665, depositado con ATCC el 18 de febrero de 2010, designación del depósito ATCC PTA-10666, depositado con ATCC el 18 de febrero de 2010, la designación del depósito de ATCC PTA-10667 depositado con ATCC el 18 de febrero de 2010, la designación del depósito de ATCC PTA-10668, depositado con ATCC el 18 de febrero de 2010, la designación del depósito de ATCC PTA-10669, depositado con ATCC el 18 de febrero de 2010 y la designación del depósito de ATCC PTA-10670, depositado con ATCC el 18 de febrero de 2010.
10. Un anticuerpo o uno de sus fragmentos de unión a antígeno que específicamente se une con CD37, caracterizado porque comprende secuencias de polipéptidos seleccionadas del grupo que consiste en: (a) SEQ ID NOS: 4, 5 y 6 y SEQ ID NOs: 28, 29 y 30; (b) SEQ ID NOS: 7, 8 y 9 y SEQ ID NOS: 31, 32 y 33; (c) SEQ ID NOS: 10, 11 y 12 y SEQ ID NOS: 34, 35 y 36 (d) SEQ ID NOS: 13, 14 y 15 y SEQ ID NOS: 37, 38 y 39 (e) SEQ ID NOs: 13, 14 y 15 y SEQ ID NOs : 37, 40 y 39 (f) SEQ ID NOS: 16, 17 y 18 y SEQ ID NOS : 41, 42 y 43 (g) SEQ ID NOS: 19, 20 y 21 y SEQ ID NOS: 44, 45 y 46 (h) SEQ ID NOS: 19, 20 y 21 y SEQ ID NOs: 44, 47 y 46 (i) SEQ ID NOS: 22, 23 y 24 y SEQ ID NOS: 48, 49 y 50 (j) SEQ ID NOS: 22, 23 y 24 y SEQ ID NOS: 48, 51 y 50 (k) SEQ ID NOS: 25, 26 y 27 y SEQ ID NOS: 52, 53 y 54 (1) variantes de (a) a (k) quei comprenden 1, 2, sustituciones de aminoácidos conservativas .
11. El anticuerpo o uno de sus fragmentos de unión a antígeno de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque comprende secuencias de polipéptidos que son al menos 90% idénticas a las secuencias de polipéptidos seleccionadas del grupo que consiste en: (a) SEQ ID NO: 55 y SEQ ID NO: 72; (b) SEQ ID NO: 56 y SEQ ID NO 73; (c) SEQ ID NO: 57 y SEQ ID NO 74; (d) SEQ ID NO 58 y SEQ ID NO 74; (e) SEQ ID NO 59 y SEQ ID NO 75; (f) SEQ ID NO 60 y SEQ ID NO 76; (g) SEQ ID NO 61 y SEQ ID NO 77; (h) SEQ ID NO 62 y SEQ ID NO 78; (i) SEQ ID NO 63 y SEQ ID NO 79; (j) SEQ ID NO 64 y SEQ ID NO 80; 00 SEQ ID NO 65 y SEQ ID NO 81; (1) SEQ ID NO 66 y SEQ ID NO 82; (m) SEQ ID NO 67 y SEQ ID NO 83; (n) SEQ ID NO 68 y SEQ ID NO 84; (o) SEQ ID NO 69 y SEQ ID NO :85; (P) SEQ ID NO 70 y SEQ ID NO :86; y (q) SEQ ID NO 71 y SEQ ID NO :87.
12. El anticuerpo o uno de sus antígeno de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque las secuencias de polipéptidos son al menos 95% idénticas a las secuencias de polipéptidos seleccionadas del grupo que consiste en: ((a) SEQ ID NO:55 y SEQ ID NO:72; (b) SEQ ID NO: 56 y SEQ ID NO: 73; (c) SEQ ID NO: 57 y SEQ ID NO: 74; (d) SEQ ID NO: 58 y SEQ ID NO: 74; (e) SEQ ID NO59 y SEQ ID NO 75; (f) SEQ ID NO- 60 y SEQ ID NO 76; (g) SEQ ID NO 61 y SEQ ID NO 77; (h) SEQ ID NO: 62 y SEQ ID NO 78; (i) SEQ ID NO: 63 y SEQ ID NO 79; (j) SEQ ID NO: 64 y SEQ ID NO 80; 00 SEQ ID NO. 65 y SEQ ID NO 81; (1) SEQ ID NO: 66 y SEQ ID NO 82; (m) SEQ ID NO: 67 y SEQ ID NO 83; (n) SEQ ID NO 68 y SEQ ID NO 84; (o) SEQ ID NO 69 y SEQ ID NO 85; (P) SEQ ID NO 70 y SEQ ID NO 86; y (q) SEQ ID NO 71 y SEQ ID NO 87.
13. El anticuerpo o uno de sus antígeno de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque las secuencias de polipéptidos son al menos 99% idénticas a las secuencias de polipéptidos seleccionadas del grupo que consiste en: (a) SEQ ID NO: 55 y SEQ ID NO: 72; (b) SEQ ID NO: 56 y SEQ ID NO: 73; (c) SEQ ID NO: 57 y SEQ ID NO: 74; (d) SEQ ID NO: 58 y SEQ ID NO: 74; (e) SEQ ID NO: 59 y SEQ ID NO: 75; (f) SEQ ID NO: 60 y SEQ ID NO: 76; (g) SEQ ID NO: 61 y SEQ ID NO: 77; (h) SEQ ID NO: 62 y SEQ ID NO: 78; (i) SEQ ID NO: 63 y SEQ ID NO: 79; (j) SEQ ID NO: 64 y SEQ ID NO: 80; (k) SEQ ID NO: 65 y SEQ ID NO: 81; (1) SEQ ID NO: 66 y SEQ ID NO: 82; (m) SEQ ID NO: 67 y SEQ ID NO: 83; (n) SEQ ID NO: 68 y SEQ ID NO: 84; (o) SEQ ID NO: 69 y SEQ ID NO: 85; (p) SEQ ID NO: 70 y SEQ ID NO: 86; y (q) SEQ ID NO: 71 y SEQ ID NO: 87.
14. El anticuerpo o uno de sus fragmentos de unión a antígeno de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1- 13, caracterizado porque el anticuerpo o uno de sus fragmentos de unión a antígeno es murino, no humano, humanizado, quimérico, resurgido o humano.
15. El anticuerpo o uno de sus fragmentos de unión a antígeno de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 4- 14, caracterizado porque el anticuerpo o fragmento de anticuerpo es capaz de inducir apoptosis de una célula que expresa CD37 in vitro en ausencia de agentes de reticulación.
16. El anticuerpo o uno de sus fragmentos de unión a antígeno de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 4-14, caracterizado porque el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno es capaz de inducir citotoxicidad dependiente de complemento (CDC) .
17. El anticuerpo o uno de sus fragmentos de unión a antígeno de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 4-14, caracterizado porque es capaz de inducir citotoxicidad mediada por células dependientes de anticuerpos (ADCC) .
18. Un anticuerpo humano o humanizado o uno de sus fragmentos de unión a antígeno que específicamente se une con CD37 , caracterizado porque el anticuerpo o uno de sus fragmentos es capaz de inducir apoptosis de una célula que expresa CD37 in vitro en ausencia de agentes de entrecruzamiento .
19. El anticuerpo humano o humanizado o uno de sus fragmentos de unión a antígeno de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque el anticuerpo humano o humanizado o uno de sus fragmentos de unión a antígeno también es capaz de inducir citotoxicidad dependiente de complemento (CDC) .
20. El anticuerpo humano o humanizado o uno de sus fragmentos de unión a antígeno de conformidad con la reivindicación 18 o 19, caracterizado porque el anticuerpo humano o humanizado o uno de sus fragmentos de unión a antígeno también es capaz de inducir citotoxicidad mediada por células dependientes de anticuerpos (ADCC) .
21. El anticuerpo o uno de sus fragmentos de unión a antígeno de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-20, caracterizado porque el anticuerpo se une con CD37 humano y CD37 de macaco.
22. El anticuerpo o uno de sus fragmentos de unión a antígeno de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-21, caracterizado porque es un anticuerpo de longitud total.
23. El anticuerpo o uno de sus fragmentos de unión a antígeno de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-21, caracterizado porque es un fragmento de unión a antígeno.
24. El anticuerpo o uno de sus fragmentos de unión a antígeno de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-21, caracterizado porque el anticuerpo o uno de sus fragmentos de unión a antígeno comprende Fab, Fab', F(ab')2, Fd, Fv o scFv de cadena simple, Fv ligado a disulfuro, dominio de V-NAR, IgNar, intracuerpo, IgGACH2, minicuerpo, F(ab')3, tetracuerpo, triacuerpo, diacuerpo, anticuerpo de dominio simple, DVD-Ig, Fcab, mAb2, (scFv)2 o scFv-Fc.
25. Un polipéptido que se une específicamente con CD37, caracterizado porque comprende secuencias seleccionadas del grupo que consiste en: (a) SEQ ID NOS: 4, 5 y 6 y SEQ ID NOs: 28, 29 y 30; (b) SEQ ID NOS: 7, 8 y 9 y SEQ ID NOS: 31, 32 y 33; (c) SEQ ID NOS: 10, 11 y 12 y SEQ ID NOs: 34, 35 y 36; (d) SEQ ID NOS: 13, 14 y 15 y SEQ ID NOS: 37, 38 y 39; (e) SEQ ID NOS: 13, 14 y 15 y SEQ ID NOs : 37, 40 y 39; (f) SEQ ID NOS: 16, 17 y 18 y SEQ ID NOS : 41, 42 y 43; (g) SEQ ID NOS: 19, 20 y 21 y SEQ ID NOS: 44, 45 y 46; (h) SEQ ID NOS: 19, 20 y 21 y SEQ ID NOs : 44, 47 y 46; (i) SEQ ID NOS: 22, 23 y 24 y SEQ ID NOS: 48, 49 y 50; (j) SEQ ID NOS: 22, 23 y 24 y SEQ ID NOS : 48, 51 y 50; (k) SEQ ID NOs: 25, 26 y 27 y SEQ ID NOS: 52, 53 y 54; y (1) variantes de (a) a (k) que comprenden 1, 2, 3 ó 4 sustituciones de aminoácidos conservativas.
26. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque comprende secuencias que son al menos 90% idénticas a las secuencias seleccionadas del grupo que consiste en: (a) SEQ ID NO: 55 y SEQ ID NO: 72; (b) SEQ ID NO: 56 y SEQ ID NO: 73; (c) SEQ ID NO: 57 y SEQ ID NO: 74; (d) SEQ ID NO: 58 y SEQ ID NO: 74; (e) SEQ ID NO: 59 y SEQ ID NO: 75; (f) SEQ ID NO: 60 y SEQ ID NO: 76; (g) SEQ ID NO: 61 y SEQ ID NO: 77; (h) SEQ ID NO: 62 y SEQ ID NO78; (i) SEQ ID NO: 63 y SEQ ID NO 79; (j) SEQ ID NO 64 y SEQ ID NO 80; (k) SEQ ID NO 65 y SEQ ID NO 81; (1) SEQ ID NO 66 y SEQ ID NO 82; (m) SEQ ID NO 67 y SEQ ID NO 83; (n) SEQ ID NO 68 y SEQ ID NO 84; (o) SEQ ID NO 69 y SEQ ID NO 85; (p) SEQ ID NO 70 y SEQ ID NO 86; y (q) SEQ ID NO 71 y SEQ ID NO 87.
27. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque las secuencias son al menos 95% idénticas a las secuencias seleccionadas del grupo que consiste en: (a) SEQ ID NO: 55 y SEQ ID NO: 72; (b) SEQ ID NO: 56 y SEQ ID NO: 73; (c) SEQ ID NO: 57 y SEQ ID NO 74; (d) SEQ ID NO: 58 y SEQ ID NO: 74; (e) SEQ ID NO: 59 y SEQ ID NO: 75; (f) SEQ ID NO 60 y SEQ ID NO 76; (g) SEQ ID NO: 61 y SEQ ID NO77; (h) SEQ ID NO 62 y SEQ ID NO 78; (i) SEQ ID NO 63 y SEQ ID NO 79; (j) SEQ ID NO 64 y SEQ ID NO 80; (k) SEQ ID NO 65 y SEQ ID NO 81; (1) SEQ ID NO 66 y SEQ ID NO 82; (m) SEQ ID NO 67 y SEQ ID NO 83; (n) SEQ ID NO 68 y SEQ ID NO 84; (o) SEQ ID NO 69 y SEQ ID NO 85; (p) SEQ ID NO 70 y SEQ ID NO 86; (q) SEQ ID NO 71 y SEQ ID NO 87.
28. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque las secuencias son al menos 99% idénticas a las secuencias seleccionadas del grupo que consiste en: (a) SEQ ID NO: 55 y SEQ ID NO: 72; (b) SEQ ID NO: 56 y SEQ ID NO: 73; (c) SEQ ID NO: 57 y SEQ ID NO: 74; (d) SEQ ID NO: 58 y SEQ ID NO: 74; (e) SEQ ID NO: 59 y SEQ ID NO: 75; (f) SEQ ID NO: 60 y SEQ ID NO: 76; (g) SEQ ID NO: 61 y SEQ ID NO77; (h) SEQ ID NO: 62 y SEQ ID NO 78; (i) SEQ ID NO 63 y SEQ ID NO 79; (j) SEQ ID NO 64 y SEQ ID NO 80; (k) SEQ ID NO 65 y SEQ ID NO 81; (1) SEQ ID NO 66 y SEQ ID NO 82; (m) SEQ ID NO 67 y SEQ ID NO 83; (n) SEQ ID NO 68 y SEQ ID NO 84; (o) SEQ ID NO 69 y SEQ ID NO 85; (P) SEQ ID NO 70 y SEQ ID NO 86; y (q) SEQ ID NO 71 y SEQ ID NO 87.
29. Una célula aislada caracte anticuerpo o uno de sus fragmentos de unión a antígeno de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-24 o el polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 25-28.
30. Un método de preparación del anticuerpo o uno de sus fragmentos de unión a antígeno de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-24 o el polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 25-28, caracterizado porque comprende (a) cultivar la célula de conformidad con la reivindicación 29; y (b) aislar el anticuerpo, uno de sus fragmentos de unión a antígeno o polipéptido de la célula cultivada.
31. Un inmunoconjugado que tiene la fórmula (A) - (L) -(C) , caracterizado porque: (A) es un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-24 o polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 25-28; (L) es un ligador; y (C) es un agente citotóxico; y en donde el ligador (L) liga (A) con (C) .
32. Un inmunoconjugado que tiene la fórmula (A) - (L) - (C) , caracterizado porque: (A) es un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno que específicamente se une con CD37; (L) es un ligador no clivable; y (C) es un agente citotóxico; y en donde el ligador (L) liga (A) con (C) .
33. Un inmunoconjugado que tiene la fórmula (A) - (L) - (C) , caracterizado porque: (A) es un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno que específicamente se une con CD37; (L) es un ligador; y (C) es un maitansinoide; y en donde el ligador (L) liga (A) con (C) .
34. El inmunoconjugado de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado porque el ligador es un ligador no clivable.
35. El inmunoconjugado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 31-34, caracterizado porque también comprende un segundo (C) .
36. El inmunoconjugado de conformidad con la reivindicación 35, caracterizado porque también comprende un tercer (C) .
37. El inmunoconjugado de conformidad con la reivindicación 36, caracterizado porque también comprende un cuarto (C) .
38. El inmunoconjugado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 31-34 caracterizado porque comprende 2-6 (C) .
39. El inmunoconjugado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 31-34 caracterizado porque comprende 3-4 (C) .
40. El inmunoconjugado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 31-39, caracterizado porque el ligador está seleccionado del grupo que consiste en un ligador clivable, un ligador no clivable, un ligador hidrofílico y un ligador a base de ácido dicarboxílico.
41. El inmunoconjugado de conformidad con la reivindicación 40, caracterizado porque el ligador está seleccionado del grupo que consiste en: 4- (2-piridilditio) pentanoato de N-succinimidilo (SPP) ; 4- (2-piridilditio) butanoato de N-succinimidilo (SPDB) o 4- (2-piridilditio) -2-sulfobutanoato de N-succinimidilo (sulfo-SPDB); 4- (maleimidometil) ciclohexancarboxilato de N- succinimidilo (SMCC) ; 4- (maleimidometil) ciclohexancarboxilato de N-sulfosuccinimidilo (sulfoSMCC) ; 4- (yodoacetil) -aminobenzoato de N-succinimidilo (SIAB) ; y [ (N-maleimidopropionamido) -tetraetilenglicol] éster de N-succinimidilo (NHS-PEG4-maleimida) .
42. El inmunoconjugado de conformidad con la reivindicación 41, caracterizado porque el ligador es N-succinimidil- [ (N-maleimidopropionamido) -tetraetilenglicol] éster (NHS-PEG4-maleimida) .
43. El inmunoconjugado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 31-32 y 35-42, caracterizado porque el agente citotóxico está seleccionado del grupo que consiste en un maitansinoide, análogo de maitansinoide, doxorrubicina, una doxorrubicina modificada, benzodiazepina, taxoide, CC-1065, análogo de CC-1065, duocarmicina, análogo de duocarmicina, caliqueamicina, dolastatina, análogo de dolastatina, aristatina, derivado de tomaimicina y derivado de leptomicina o un profármaco del agente .
44. El inmunoconjugado de conformidad con la reivindicación 43, caracterizado porque el agente citotóxico es un maitansinoide.
45. El inmunoconjugado de conformidad con la reivindicación 44, caracterizado porgue el agente citotóxico es (21 ) -deacetil- (21 ) - (3-mercapto-l-oxopropil) -maitansina (DM1) o (21 ) -deacetil-N2- (4-mercapto-4-metil-l-oxopentil) -maitansina (DM4) .
46. Una composición farmacéutica caracterizada porque comprende el anticuerpo o uno de sus fragmentos de unión a antígeno de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-24, el polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 25-28 o el inmunoconjugado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 31-45 y un portador farmacéuticamente aceptable .
47. Una composición farmacéutica caracterizada porque comprende los inmunoconjugados de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 31-45, en donde los inmunoconjugados tienen un promedio de aproximadamente 3 a aproximadamente 4 (C) por (A) .
48. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 41, caracterizada porque los inmunoconjugados tienen un promedio de aproximadamente 3,5 (C) por (A) .
49. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 41, caracterizada porque los inmunoconjugados tienen un promedio de aproximadamente 3,5 ± 0,5 (C) por (A) .
50. La composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 46-49, caracterizada porque también comprende un segundo agente anticáncer.
51. Un reactivo de diagnóstico caracterizado porque comprende el anticuerpo o uno de sus fragmentos de unión a antígeno de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-24, el polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 25-28 o el inmunoconjugado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 31-45 que está rotulado.
52. El reactivo de diagnóstico de conformidad con la reivindicación 51, caracterizado porque el rótulo está seleccionado del grupo que consiste en un radiorrótulo, un fluoróforo, un cromóforo, un agente de imagen y un ion metálico.
53. Un kit caracterizado porque comprende el anticuerpo o uno de sus fragmentos de unión a antígeno de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-24, el polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 25-28, el inmunoconjugado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 31-45 o la composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 46-50.
54. Un método para inhibir el crecimiento de una célula que expresa CD37 caracterizado porque comprende poner en contacto la célula con el anticuerpo o uno de sus fragmentos de unión a antígeno de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-24, el polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 25-28, el inmunoconj gado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 31-45 o la composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 46-50 al sujeto.
55. Un método para tratar un paciente que tiene cáncer caracterizado porque comprende la administración a el paciente de una cantidad terapéuticamente efectiva del anticuerpo o uno de sus fragmentos de unión a antígeno de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-24, el polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 25-28, te inmunoconjugado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 31-45 o la composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 46-50 al sujeto.
56. El método de conformidad con la reivindicación 55, caracterizado porque también comprende la administración de un segundo agente anticáncer al sujeto.
57. El método de conformidad con la reivindicación 56, caracterizado porque el segundo agente anticáncer es un agente quimioterapéutico .
58. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 55-57, caracterizado porque el cáncer está seleccionado del grupo que consiste en linfornas de células B, NHL, leucemia linfoblástica/linfoma de células B precursora y neoplasmas de células B maduras, leucemia linfocítica crónica de células B (CLL) /linfoma linfocítico pequeño (SLL) , leucemia prolinfocítica de células B, linfoma linfoplasmacitico, linfoma de células del manto (MCL) , linfoma folicular (FL) , linfoma de centro folicular cutáneo de grado bajo, de grado intermedio y de grado alto, linfoma de células B de zona marginal, linfoma de células B de zona marginal de tipo MALT, linfoma de células B de zona marginal nodal, linfoma de células B de zona marginal de tipo esplénico, leucemia de células pilosas, linfoma de células B grandes difusas, linfoma de Burkitt, plasmacitoma, mieloma de células plasmáticas, trastorno linfoproliferativo postrasplante, macroglobulinemia de Waldenstrom y linfoma de células grandes anaplásico (ALCL) .
59. Un polinucleótido aislado caracterizado porque comprende una secuencia que codifica un polipéptido al menos 90% idéntico a una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOS: 55-87.
60. El polinucleótido aislado de conformidad con la reivindicación 59, caracterizado porque la secuencia es al menos 95% idéntica a una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOS: 55-87.
61. El polinucleótido aislado de conformidad con la reivindicación 60, caracterizado porque la secuencia es al menos 99% idéntica a una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 55-87.
62. El polinucleótido aislado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 59-61, caracterizado porque el polinucleótido comprende una secuencia que es al menos 90% idéntica a la SEQ ID NOs: 121-151.
63. El polinucleótido aislado de conformidad con la reivindicación 62, caracterizado porque el polinucleótido comprende una secuencia que es al menos 95% idéntica a la SEQ ID NOS : 121-151.
64. El polinucleótido aislado de conformidad con la reivindicación 63, caracterizado porque el polinucleótido comprende una secuencia que es al menos 99% idéntica a la SEQ ID NOS: 121-151.
65. Un vector caracterizado porque comprende el polinucleótido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 59-64.
66. Una célula huésped caracterizada porque comprende el vector de conformidad con la reivindicación 65.
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