CN102971012A - Cd37结合分子及其免疫缀合物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了新型抗癌剂，包括但不限于结合CD37的抗体和免疫缀合物。本发明还提供了使用所述制剂、抗体或免疫缀合物的方法，例如抑制肿瘤生长的方法。

Description

CD37结合分子及其免疫缀合物
技术领域
本发明总体上涉及结合CD37的抗体、及其抗原结合片段、多肽以及免疫缀合物，而且涉及使用这些CD37结合分子来治疗诸如B细胞恶性肿瘤的方法。
背景技术
白细胞抗原CD37（“CD37”），也称为GP52-40、四跨膜蛋白-26或TSPAN26，是四跨膜蛋白超家族的跨膜蛋白(Maecker等人，1997FASEB J.11:428-442)。它是具有四个跨膜结构域的重糖基化蛋白，在前B细胞至外周成熟B细胞阶段过程中在B细胞上表达，但在至浆细胞的终末分化中缺乏。(Link等人，1987,J Pathol.152:12-21)。CD37抗原仅微弱表达于T细胞、髓样细胞以及粒细胞(Schwartz-Albiez等人，1988,J.Immunol.,140(3)905-914)。然而，CD37还表达于恶性B细胞，例如那些建立的非何杰金氏淋巴瘤(NHL)和慢性淋巴系白血病(CLL)(Moore等人，1986,JImmunol.137(9):3013-8)。该表达情况表明，CD37表现为B细胞恶性肿瘤的有前景的治疗靶。
尽管CD37的确切生理学作用不清楚，但研究表明其在T细胞增殖中的潜在作用(van Spriel等人，2004,J Immunol.,172(5):2953-61)。CD37作为细胞表面糖蛋白的四跨膜家族的部分，还可与其他表面蛋白络合(Angelisová1994,Immunogenetics.,39(4):249-56)。CD37表达缺陷的小鼠被开发，显示在淋巴样器官的发育和细胞组成上没有变化。仅观察到IgG1水平下降和对于T细胞依赖性抗原的应答改变(Knobeloch等人，2000,MolCell Biol.,20(15):5363-9)。
抗体显现为治疗所述癌症的有前景的方法。特别地，能够诱导靶细胞凋亡的抗体是合乎需要的。另外，具有补体依赖性细胞毒性活性(CDC)和抗体依赖性细胞毒性(ADCC)的抗体也是合乎需要的。
目前，被称为利妥昔单抗（rituximab）的抗CD20抗体用于治疗B细胞恶性肿瘤(Leget等人，1998,Curr.Opin.Oncol.,10:548-551)。然而，仅亚组患者响应利妥昔单抗治疗，甚至服用妥昔单抗的响应患者最终复发，且常发生对利妥昔单抗治疗的抗药性。另外，还将CD37结合剂作为B细胞恶性肿瘤的潜在治疗剂进行试验。楚邦制药公司（Trubion Pharmaceuticals）开发了CD37结合剂SMIP-016和TRU-016(Zhao等人，2007,Blood,110:2569-2577)。SMIP-016是一种单链多肽，包括来自杂交瘤的可变区和工程化人恒定区。TRU-016是抗CD37SMIP抗原的人源化形式。见，例如，美国公开的第2007/0009519号申请。对于TRU-016进行临床试验，用于治疗慢性淋巴细胞白血病(CLL)。勃林格殷格翰（Boehringer Ingelheim）也已经揭示了国际公布的第WO 2009/019312号申请中的CD37结合剂。然而，尚无对于这些结合剂中的任何结合剂的CDC活性进行描述，且没有描述中缺乏接头的情况下的体外促细胞凋亡活性。
已经使用放射标记的抗CD37抗体MB-1在两个分开的试验中对于放射免疫治疗(RIT)进行尝试。将131I-MB-1的治疗剂量施用于6个复发的NHL患者(Press等人，1989J Clin Oncol.7(8):1027-38,Press at el.1993,N Engl JMed.329(17):1219-24)。所有6个患者在持续4至31个月的时间获得完全缓解(CR)。在另一个试验中，将131I-MB-1施用于10个复发的NHL患者(Kaminski等人，1992J Clin Oncol.10(11):1696-711)。总共4个患者在持续2至6个月的时间范围具有响应，但仅报道个过CR。然而，由于放射标记物不利的生物分布所提出的对于重要的非靶器官的放射暴露的考虑，并非所有患者都能够得以治疗。确实，在这些试验中观察到RIT相关的毒性，包括严重的骨髓抑制和心肺毒性。尽管这些临床数据表明抗CD37放射免疫缀合物有效，但这些治疗剂施用麻烦，并且由于与高剂量放射相关的危险，复发的RIT后患者不能使用RIT来再治疗。
为了克服RIT的局限性，已经开发了抗体-细胞毒性剂缀合物(ACC)，也称为抗体-药物缀合物(ADC)。这些是免疫缀合物，包括通过化学接头与抗体共价连接的细胞毒性剂，所述化学接头可允许细胞毒性药物特异性递送至表达被抗体识别的蛋白的细胞。然而，不良内化的蛋白被认为不是这些治疗剂的有利的靶。CD37在结构上与CD20相似，因为这两种抗原都含有四个跨膜结构域，但CD20不是四跨膜蛋白家族的部分(Tedder等人，1989,J.Immun.142:2560-2568)。已经对针对几种B细胞抗原（包括CD37和CD20）的抗体研究了它们进行细胞内吞和降解的能力(Press等人，1989,Cancer Res.49(17):4906-12，和Press等人，1994,Blood.83(5):1390-7)。在体外，抗CD37抗体MB-1滞留于细胞表面并在Daudi淋巴瘤细胞中被缓慢内化。MB-1抗体还在体外在NHL患者细胞中具有低的细胞内吞和细胞内代谢速率。对于抗CD20抗体1F5获得了相似的结果，抗CD20抗体1F5也主要滞留于淋巴瘤细胞表面且内化不良。先前还对于CD20抗体的ADC进行了研究，但没有显示显著强效，特别是当使用非二硫化物或酸稳定接头时（见，例如Polson等人，2009,Cancer Res.,69(6):2358-2364）。鉴于这些观察结果，认为CD37并非抗体-药物缀合物的有利的靶。
因此，存在对于作为治疗B细胞恶性肿瘤的工具的CD37结合剂的需要，所述CD37结合剂包括抗体、其抗原结合片段以及抗体-药物缀合物（免疫缀合物）。本发明提供了该需要。
发明概述
本发明描述了结合人CD37的新型抗体、包含这些抗体的免疫缀合物及其使用方法。本发明还提供了新型多肽，例如结合人CD37的抗体、这些抗体的片段，和其他与这些抗体相关的多肽。本发明还提供了包含编码所述多肽的核酸序列的多核苷酸，如包含所述多核苷酸对载体。本发明还提供了包含本发明多肽和/或多核苷酸对细胞。本发明还提供了保护所述新型CD37抗体或免疫缀合物的组合物（例如，药物组合物）。另外，本发明还提供了制备和使用所述新型CD37抗体或免疫缀合物的方法，例如使用所述新型CD37抗体或免疫缀合物来抑制肿瘤生长和/或治疗癌症的方法。
本发明提供了特异性结合CD37且能够诱导补体依赖性细胞毒性(CDC)的抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，所述抗体还能够诱导细胞凋亡和/或抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。
所述抗体或其抗原结合片段可以是作为选自下列的抗体特异性结合相同CD37表位的：(a)包含SEQ ID NO:55的多肽和SEQ ID NO:72的多肽的抗体；(b)包含SEQ ID NO:59的多肽和SEQ ID NO:75的多肽的抗体；(c)包含SEQ ID NO:61的多肽和SEQ ID NO:77的多肽的抗体；(d)包含SEQ IDNO:64的多肽和SEQ ID NO:80的多肽的抗体；(e)包含SEQ ID NO:66的多肽和SEQ ID NO:82的多肽的抗体；(f)包含SEQ ID NO:68的多肽和SEQ IDNO:84的多肽的抗体；以及(g)包含SEQ ID NO:70的多肽和SEQ ID NO:86的多肽的抗体。
在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段特异性结合CD37且特异性结合SEQ ID NO:180的多肽。在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段不结合SEQ ID NO:184的多肽。
在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段特异性结合CD37，且所述抗体或其抗原结合片段竞争性抑制选自下列的抗体：(a)包含SEQ IDNO:55的多肽和SEQ ID NO:72的多肽的抗体；(b)包含SEQ ID NO:59的多肽和SEQ ID NO:75的多肽的抗体；(c)包含SEQ ID NO:61的多肽和SEQ IDNO:77的多肽的抗体；(d)包含SEQ ID NO:64的多肽和SEQ ID NO:80的多肽的抗体；(e)包含SEQ ID NO:66的多肽和SEQ ID NO:82的多肽的抗体；(f)包含SEQ ID NO:68的多肽和SEQ ID NO:84的多肽的抗体；以及(g)包含SEQ ID NO:70的多肽和SEQ ID NO:86的多肽的抗体。
在一些实施方案中，通过选自下列的杂交瘤来制备所述抗体或其抗原结合片段：于2010年2月18日保藏于ATCC（美国模式培养物保藏中心）的ATCC保藏名称PTA-10664，于2010年2月18日保藏于ATCC的ATCC保藏名称PTA-10665，于2010年2月18日保藏于ATCC的ATCC保藏名称PTA-10666，于2010年2月18日保藏于ATCC的ATCC保藏名称PTA-10667，于2010年2月18日保藏于ATCC的ATCC保藏名称PTA-10668，于2010年2月18日保藏于ATCC的ATCC保藏名称PTA-10669，于2010年2月18日保藏于ATCC的ATCC保藏名称PTA-10670。
在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段特异性结合CD37，且所述抗体包含选自下列的多肽序列：(a)SEQ ID NO:4、5以及6和SEQID NO:28、29以及30；(b)SEQ ID NO:7、8以及9和SEQ ID NO:31、32以及33；(c)SEQ ID NO:10、11以及12和SEQ ID NO:34、35以及36；(d)SEQ ID NO:13、14以及15和SEQ ID NO:37、38以及39；(e)SEQ IDNO:13、14以及15和SEQ ID NO:37、40以及39；(f)SEQ ID NO:16、17以及18和SEQ ID NO:41、42以及43；(g)SEQ ID NO:19、20以及21和SEQ ID NO:44、45以及46；(h)SEQ ID NO:19、20以及21和SEQID NO:44、47以及46；(i)SEQ ID NO:22、23以及24和SEQ ID NO:48、49以及50；(j)SEQ ID NO:22、23以及24和SEQ ID NO:48、51以及50；(k)SEQ ID NO:25、26以及27和SEQ ID NO:52、53以及54；以及(l)包含1、2、3或4个保守氨基酸取代的(a)至(k)的变体。
在又一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含与选自下列的多肽序列具有至少90%同一性、至少95%同一性、至少99%同一性或完全同一性的多肽序列：(a)SEQ ID NO:55和SEQ ID NO:72；(b)SEQ ID NO:56和SEQ ID NO:73；(c)SEQ ID NO:57和SEQ ID NO:74；(d)SEQ ID NO:58和SEQ ID NO:74；(e)SEQ ID NO:59和SEQ ID NO:75；(f)SEQ ID NO:60和SEQ ID NO:76；(g)SEQ ID NO:61和SEQ ID NO:77；(h)SEQ ID NO:62和SEQ ID NO:78；(i)SEQ ID NO:63和SEQ ID NO:79；(j)SEQ ID NO:64和SEQ ID NO:80；(k)SEQ ID NO:65和SEQ ID NO:81；(l)SEQ ID NO:66和SEQ ID NO:82；(m)SEQ ID NO:67和SEQ ID NO:83；(n)SEQ ID NO:68和SEQ ID NO:84；(o)SEQ ID NO:69和SEQ ID NO:85；(p)SEQ ID NO:70和SEQ ID NO:86;以及(q)SEQ ID NO:71和SEQ ID NO:87。
在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段是鼠的、非人的、人源化的、嵌合的、再表面化的或人的。
在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段能够在缺乏接头的情况下在体外诱导表达CD37的细胞的细胞凋亡。在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段能够诱导补体依赖性细胞毒性(CDC)。在还一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段能够诱导抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。
在其他实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段是人的或人源化的，特异性结合CD37，且能够在缺乏接头的情况下在体外诱导表达CD37的细胞的细胞凋亡。在其他实施方案中，所述人的或人源化的抗体或其抗原结合片段还能够诱导补体依赖性细胞毒性(CDC)和/或能够诱导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。
在还一些其他实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段结合人的CD37和猕猴CD37。
在一些其他实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段是全长的抗体或其抗原结合片段。所述抗体或其抗原结合片段可包含Fab、Fab'、F(ab')2、Fd、单链Fv或scFv、二硫键连接的Fv、V-NAR结构域、IgNar、细胞内抗体、IgGΔCH2、小抗体、F(ab')3、四链抗体、三链抗体、双链抗体、单结构域抗体、DVD-Ig、Fcab、mAb2、(scFv)2或scFv-Fc。
在其他实施方案中，所述CD37结合剂为特异性结合CD37的多肽，所述多肽包含选自下列的序列：(a)SEQ ID NO:4、5以及6和SEQ ID NO:28、29以及30；(b)SEQ ID NO:7、8以及9和SEQ ID NO:31、32以及33；(c)SEQ ID NO:10、11以及12和SEQ ID NO:34、35以及36；(d)SEQID NO:13、14以及15和SEQ ID NO:37、38以及39；(e)SEQ ID NO:13、14以及15和SEQ ID NO:37、40以及39；(f)SEQ ID NO:16、17以及18和SEQ ID NO:41、42以及43；(g)SEQ ID NO:19、20以及21和SEQ IDNO:44、45以及46；(h)SEQ ID NO:19、20以及21和SEQ ID NO:44、47以及46；(i)SEQ ID NO:22、23以及24和SEQ ID NO:48、49以及50；(j)SEQ ID NO:22、23以及24和SEQ ID NO:48、51以及50；(k)SEQ IDNO:25、26以及27和SEQ ID NO:52、53以及54；以及(l)包含1、2、3或4个保守氨基酸取代的(a)至(k)的变体。
在其他实施方案中，所述CD37结合剂为特异性结合CD37的多肽，所述多肽包含与选自下列的多肽序列具有至少90%同一性、至少95%同一性、至少99%同一性或完全同一性的多肽序列：(a)SEQ ID NO:55和SEQ IDNO:72；(b)SEQ ID NO:56和SEQ ID NO:73；(c)SEQ ID NO:57和SEQ IDNO:74；(d)SEQ ID NO:58和SEQ ID NO:74；(e)SEQ ID NO:59和SEQ IDNO:75；(f)SEQ ID NO:60和SEQ ID NO:76；(g)SEQ ID NO:61和SEQ IDNO:77；(h)SEQ ID NO:62和SEQ ID NO:78；(i)SEQ ID NO:63和SEQ IDNO:79；(j)SEQ ID NO:64和SEQ ID NO:80；(k)SEQ ID NO:65和SEQ IDNO:81；(l)SEQ ID NO:66和SEQ ID NO:82；(m)SEQ ID NO:67和SEQ IDNO:83；(n)SEQ ID NO:68和SEQ ID NO:84；(o)SEQ ID NO:69和SEQ IDNO:85；(p)SEQ ID NO:70和SEQ ID NO:86;以及(q)SEQ ID NO:71和SEQID NO:87。
还可根据本发明所述的方法制备和使用产生所述抗体或其抗原结合片段或所述多肽的细胞。所述方法提供了包括下述步骤的制备所述抗体或其抗原结合片段或所述多肽的方法：(a)培养产生这样的CD37结合剂的细胞：以及(b)从所述培养的细胞分离所述抗体、其抗原结合片段或多肽。
在一些实施方案中，所述CD37结合剂是具有式(A)-(L)-(C)的免疫缀合物，其中：(A)是CD37结合剂；(L)是接头；以及(C)是细胞毒性剂；其中接头(L)连接(A)与(C)。
在一些实施方案中，所述CD37结合剂是具有式(A)-(L)-(C)的免疫缀合物，其中：(A)是特异性结合CD37的抗体或其抗原结合片段；(L)是非可裂解接头；以及(C)是细胞毒性剂；其中接头(L)连接(A)与(C)。
在一些实施方案中，所述CD37结合剂是具有式(A)-(L)-(C)的免疫缀合物，其中：(A)是特异性结合CD37的抗体或其抗原结合片段；(L)是接头；以及(C)是美登醇（美登醇）；其中接头(L)连接(A)与(C)。
免疫缀合物接头可为非可裂解接头。所述接头可选自可裂解接头、非可裂解接头、亲水接头以及基于二羧酸的接头。所述接头可选自：N-琥珀酰亚胺基4-(2-吡啶基二硫代)戊酸酯(SPP);N-琥珀酰亚胺基4-(2-吡啶基二硫代)丁酸酯(SPDB)或N-琥珀酰亚胺基4-(2-吡啶基二硫代)-2-磺基丁酸酯(磺基-SPDB);N-琥珀酰亚胺基4-(马来酰亚胺基甲基)环己烷羧酸酯(SMCC);N-琥珀酰亚胺基4-(马来酰亚胺基甲基)环己烷羧酸酯(磺基SMCC);N-琥珀酰亚胺基-4-(碘代乙酰基)-氨基苯甲酸酯(SIAB);以及N-琥珀酰亚胺基-[(N-马来酰亚胺基丙酰胺基)-四乙二醇]酯(NHS-PEG4-马来酰亚胺)。所述接头可为N-琥珀酰亚胺基-[(N-马来酰亚胺基丙酰胺基)-四乙二醇]酯(NHS-PEG4-马来酰亚胺)。
细胞毒性剂可选自美登醇、美登醇类似物、多柔比星、改性的多柔比星、苯二氮卓类、紫杉烷、CC-1065、CC-1065类似物、倍癌霉素（duocarmycin）、倍癌霉素类似物、刺孢霉素、多拉司他汀、多拉司他汀类似物、aristatin、托马霉素衍生物，以及来普霉素衍生物或所述制剂的前药。细胞毒性剂可为美登醇。细胞毒性剂可为N(2')-脱乙酰基-N(2')-(3-巯基-1-氧丙基)-美登素(DM1)或N(2')-脱乙酰基-N2-(4-巯基-4-甲基-1-氧戊基)-美登素(DM4)。
本文中还提供包含CD37结合剂及药学上可接受的载体的药物组合物。所述药物组合物可保护第二抗癌剂。
本文中还提供标记了的包含CD37结合剂的诊断试剂。标记物可选自放射标记物、荧光团、生色团以及显像剂以及金属离子。
本文中还提供一种包含CD37结合剂的试剂盒。
本文中描述的方法包括用于抑制表达CD37的细胞的生长的方法，所述方法包括使所述细胞与CD37结合剂或包含CD37结合剂的药物组合物接触。
所述方法还提供了用于治疗患有癌症的患者的方法，所述方法包括对所述患者进行治疗有效量的CD37结合剂的施用或对受治疗者进行包含CD37结合剂的药物组合物的施用。
所述方法可包括对所述受治疗者进行第二抗癌剂的施用。所述第二抗癌剂可谓化学治疗剂。
所述癌症可为选自下列的癌症，B细胞淋巴瘤，非何杰金氏淋巴瘤（NHL），前B细胞成淋巴细胞白血病/淋巴瘤和成熟B细胞新生物，B细胞慢性淋巴细胞白血病(CLL)/小淋巴细胞白血病(SLL)，B细胞前淋巴细胞白血病，淋巴浆细胞淋巴瘤，外套细胞淋巴瘤(MCL)，滤泡性淋巴瘤(FL)，低度、中度以及高度(FL)，皮肤滤泡性淋巴瘤，缘区B细胞淋巴瘤，MALT型缘区B细胞淋巴瘤，结节缘区B细胞淋巴瘤，脾型缘区B细胞淋巴瘤，毛细胞性白血病，弥漫性大B细胞淋巴瘤，伯基特淋巴瘤，浆细胞瘤，浆细胞性骨髓瘤，移植后淋巴增生性障碍，沃尔登斯特伦氏氏巨球蛋白血症，以及间变大细胞淋巴瘤(ALCL)。
本文中还提供包含下列序列的分离的多核苷酸，即，编码与选自SEQID NO:55-87的序列具有至少90%同一性、至少95%同一性、至少99%同一性或完全同一性的多肽的序列。所述多核苷酸可包含与SEQ ID NO:121-151具有至少90%同一性、至少95%同一性、至少99%同一性或完全同一性的序列。
本文中还提供载体和包含这些多核苷酸和载体的宿主细胞。
附图简述
图1描述了结合非转染300-19对照细胞（左小图）和表达CD37的300-19细胞（右小图）的抗体的柱状图。显示了使用10nM muCD37-3、muCD37-12、muCD37-38染色以及缺乏初级抗体的柱状图。
图2描述了结合非转染300-19对照细胞（左小图）和表达CD37的300-19细胞（右小图）的抗体的柱状图。显示了使用10nM muCD37-50、muCD37-51、muCD37-56以及muCD37-57染色的柱状图。
图3描述了通过流式细胞术测定的(A)muCD37-3和muCD37-12以及(B)muCD37-8、muCD37-10以及muCD37-14与WSU-DLCL-2细胞的结合。对于各抗体浓度描绘了平均荧光强度(MFI)。结合曲线用于确定抗体结合的EC50，这与各抗体的表观Kd对应。
图4描述了来自膜联蛋白-V测定的结果，对于使用10nM浓度的(A)利妥昔单抗、muCD37-3、muCD37-8、muCD37-10、muCD37-12或muCD37-14和(B)利妥昔单抗、huCD37-3、muCD37-38、muCD37-50、muCD37-51、muCD37-56或muCD37-57孵育的Ramos淋巴瘤细胞测量细胞凋亡的诱导。缺乏抗体（无Ab）的情况下未处理的细胞的对照样品用于对照。
图5描述了来自WST-8增殖测定的结果，该测定是对于使用不同浓度的muCD37-3、muCD37-38、muCD37-50、muCD37-51以及muCD37-16抗体孵育的SU-DHL-4淋巴瘤细胞进行的。
图6描述了(A)CD37-3VL和(B)CD37-3VH的一系列CD37-3表面残基和再表面化形式的取代。
图7描述了(A)CD37-50VL和(B)CD37-50VH的一系列CD37-3表面残基和再表面化形式的取代。
图8描述了CD37-3和CD37-50可变区的再表面化序列与其鼠相对物的比对：A)CD37-3轻链可变区结构域；B)CD37-3重链可变区结构域。C)CD37-50轻链可变区结构域；D)CD37-50重链可变区结构域。破折号“-”表示与鼠序列的同一性。
图9描述了(A)通过细胞流式计量术测定的muCD37-3、chCD37-3、muCD37-12以及chCD37-12与Ramos细胞的直接结合测定，和(B)在2nM浓度的muCD37-3-PE缀合物存在的情况下使用muCD37-3、chCD37-3、huCD37-3v1.0以及huCD37-3v1.01与BJAB细胞的竞争性结合测定。
图10描述了通过流式细胞术测定的抗CD37抗体与表达猕猴CD37抗原的结合：(A)muCD37-3、muCD37-12、muCD37-38、muCD37-50、muCD37-51、muCD37-56、muCD37-57、WR17以及TRU-016的结合和(B)huCD37-3、huCD37-38、huCD37-50、huCD37-51、huCD37-56以及huCD37-57的结合。结合曲线用于确定抗体结合的EC50，这与各抗体的表观Kd对应。
图11描述了来自膜联蛋白-V测定的结果，对使用不同浓度的(A)huCD37-3、huCD37-38、huCD37-50和(B)huCD37-51、huCD37-56、huCD36-57以及利妥昔单抗孵育的Ramos淋巴瘤细胞测量细胞凋亡的诱导。使用人的IgG1同种型对照抗体（huIgG对照）处理的细胞对照样品用于对照。
图12描述了来自WST-8增殖测定的结果，该测定是对于使用不同浓度的muCD37-3、chCD37-3、huCD37-3v1.0以及huCD37-3v1.01抗体经5天孵育(A)SU-DHL-4和(B)DOHH-2淋巴瘤细胞进行的。
图13描述了来自WST-8增殖测定的结果，该测定是对于使用不同浓度的huCD37-3、TRU-016或利妥昔单抗抗体经5天孵育(A)Granta-519和(B)SU-DHL-4淋巴瘤细胞进行的。
图14描述了来自对于Ramos淋巴瘤细胞进行的CDC测定的结果，所述Ramos淋巴瘤细胞使用(A)huCD37-3、huCD37-38、chCD37-12或huIgG1同种型对照抗体和(B)huCD37-38、huCD37-50、huCD37-51、huCD37-56、huCD37-57、chCD37-12或huIgG1同种型对照抗体孵育。
图15描述来自对于Daudi淋巴瘤细胞进行的ADCC测定的结果，所述Daudi淋巴瘤细胞在作为效应细胞的纯化的人NK细胞的存在的情况下使用(A)huCD37-3、huCD37-38、huCD37-50、TRU-016以及(B)huCD37-51、huCD37-56、huCD37-57、TRU-016或人IgG1同种型对照抗体孵育。
图16描述了全长达鼠、人以及猕猴CD37氨基酸序列的比对。破折号“-”表示与鼠序列的同一性。使用下划线标记小和大的细胞外结构域。
图17描述了人、重组以及野生型鼠、猕猴以及嵌合CD37序列的大的细胞外结构域的比对。破折号“-”表示与人序列的同一性。给出了工程化限制性酶切位点的位置并在受影响的残基作下划线。
图18描述了一组CD37抗体与使用(A)人CD37野生型和(B)hCD37-M3变体转染的细胞的结合，这通过使用1.5μg/mL的各抗体的流式细胞术来测定。
图19描述了一组CD37抗体与使用(A)hCD37-M1变体和(B)hCD37-M45变体转染的细胞的结合，这通过使用1.5μg/mL的各抗体的流式细胞术来测定。
图20描述了通过流式细胞术测定的(A)huCD37-3与huCD37-3-SMCC-DM1huCD37-3-SPP-DM1和huCD37-3-磺基-mal-DM4比较以及(B)huCD37-38与huCD37-38-SMCC-DM1比较的与BJAB细胞的结合。结合曲线用于确定抗体或缀合物结合的EC50，这与各抗体的表观Kd对应。
图21描述了(A)测定细胞凋亡的诱导的膜联蛋白-V测定的结果和(B)来自CDC测定的结果。测定是对于使用不同浓度的huCD37-3、huCD37-3-SMCC-DM1、huIgG1对照抗体、huIgG1-SMCC-DM1对照缀合物或利妥昔单抗孵育的Ramos淋巴瘤细胞进行的。在作为补体来源的5%人血清存在的情况下进行CDC测定。
图22描述了来自ADCC测定的结果，该测定是在作为效应细胞的纯化的NK细胞存在的情况下对于(A)使用huCD37-3、huCD37-3-SMCC-DM1、huCD37-3-PEG4-mal-DM1、TRU-016或huIgG1同种型对照抗体孵育的Daudi淋巴瘤细胞和(B)使用huCD37-3、huCD37-3-SMCC-DM1、huCD37-3-PEG4-mal-DM1或huIgG1同种型对照抗体孵育的Ramos淋巴瘤细胞进行的。
图23描述了细胞周期分析的结果，该分析使用对于使用10nM浓度的huCD37-3、huCD37-3-SMCC-DM1或非结合的huIgG1-SMCC-DM1对照缀合物孵育20小时的(A)BJAB细胞和(B)RL细胞来碘吡啶染色进行的。
图24描述了来自WST-8细胞毒性测定的结果，该测定是对于使用3×10-8M至1×10-11M浓度范围的huCD37-3-SMCC-DM1、huCD37-38-SMCC-DM1、huCD37-50-SMCC-DM1、huCD37-51-SMCC-DM1、huCD37-56-SMCC-DM1、huCD37-57-SMCC-DM1经5天孵育的Daudi细胞和(B)使用3×10-8M至1×10-11M浓度范围的huCD37-3-SMCC-DM1、huCD37-38-SMCC-DM1、huCD37-50-SMCC-DM1、huCD37-51-SMCC-DM1或非结合的huIgG1-SMCC-DM1对照缀合物经5天孵育的Granta-519细胞进行的。
图25描述了使用BJAB淋巴瘤细胞皮下移植至SCID小鼠建立的异种移植物模型的结果。在细胞接种后第12天使用10mg/kg(A)huCD37-3Ab、huCD37-3-SMCC-DM1、huCD37-50Ab、huCD37-50-SMCC-DM1或(B)huCD37-38Ab、huCD37-38-SMCC-DM1、huCD37-56Ab、huCD37-56-SMCC-DM1处理动物一次。针对肿瘤细胞接种后的时间来对不同处理组的平均肿瘤体积进行绘制。
图26描述了来自使用BJAB淋巴瘤细胞皮下移植至SCID小鼠建立的异种移植物研究的结果。在细胞接种后第9天使用10mg/kg huCD37-3Ab、huCD37-3-SMCC-DM1、huCD37-3-磺基-mal-DM4或5mg/kg huCD37-3-SPP-DM1处理动物一次。针对肿瘤细胞接种后的时间来对不同处理组的平均肿瘤体积进行绘制。
图27描述了来自使用SU-DHL-4弥漫性大B细胞淋巴瘤皮下移植至SCID小鼠建立的异种移植物模型的结果。在细胞接种后第17天使用10mg/kg huCD37-3Ab、huCD37-3-SMCC-DM1、huCD37-3-磺基-mal-DM4或5mg/kg huCD37-3-SPP-DM1处理动物一次。针对肿瘤细胞接种后的时间来对不同处理组的平均肿瘤体积进行绘制。
图28描述了使用BJAB淋巴瘤细胞皮下移植至SCID小鼠建立的异种移植物模型的结果。在细胞接种后第9天使用10mg/kg of huCD37-3 Ab、huCD37-3-SMCC-DM1或huCD37-3-PEG4-mal-DM1处理动物一次。针对肿瘤细胞接种后的时间来对不同处理组的平均肿瘤体积进行绘制。
图29描述了来自使用SU-DHL-4弥漫性大B细胞淋巴瘤皮下移植至SCID小鼠建立的异种移植物模型的结果。在细胞接种后第15天使用10mg/kg huCD37-3Ab、huCD37-3-SMCC-DM1或huCD37-3-PEG4-mal-DM1处理动物一次。针对肿瘤细胞接种后的时间来对不同处理组的平均肿瘤体积进行绘制。
图30描述了使用DoHH2滤泡B细胞淋巴瘤细胞皮下移植至SCID小鼠建立的异种移植物模型的测定结果。在接种后第12天开始处理动物，(i)单剂量的10mg/kg huCD37-3抗体，(ii)单剂量的10mg/kghuCD37-3-SMCC-DM1缀合物，(iii)六个剂量的2mg/kg利妥昔单抗，每周两次，持续3周，(iv)单剂量的40mg/kg环磷酰胺和0.5mg/kg长春新碱的方案，连同每天一次五个剂量的0.2mg/kg泼尼松(CVP)，或(v)载体对照。针对肿瘤细胞接种后的时间来对不同处理组的平均肿瘤体积进行绘制。
图31描述了使用JVM3CLL细胞皮下移植至SCID小鼠建立的异种移植物模型的测定结果。在接种后第7开始处理动物，(i)单剂量的10mg/kghuCD37-3抗体，(ii)5mg/kg剂量的huCD37-3-SMCC-DM1缀合物，(iii)10mg/kg剂量的huCD37-3-SMCC-DM1缀合物，(iv)六个剂量的5mg/kg的ofatumumab，一周两次，持续三周，(v)单剂量50mg/kg的苯达莫司汀或(vi)载体对照。针对肿瘤细胞接种后的时间来对不同处理组的平均肿瘤体积进行绘制。
图32描述了在不同NHL和CLL肿瘤细胞系中测量的CD37和CD20表达水平(A)和在这些细胞系中测量的huCD37-3-SMCC-DM1的体外细胞毒性(B)。
发明详述
本发明提供了一种在下列三种针对表达CD37（例如，阳性）细胞的细胞毒性活性中具有高效的CD37结合分子：诱导细胞凋亡、ADCC以及CDC。另外，抗CD37抗体的免疫缀合物意外地杀伤表达CD37的细胞，如使用体内肿瘤模型所证实的。
I.定义
为了促进对于本发明的理解，下文定义了一些术语和用语。
除非另有指明，本文使用的术语CD37是指任何天然CD37。CD37也被称为GP52-40、白细胞抗原CD37以及四跨膜蛋白-26。术语“CD37”包括“全长”、未加工的CD37以及产生于细胞中的加工的任何形式的CD37.该术语还包括CD37的天然存在的变体，例如剪接变体，等位基因变体，以及亚型。本发明描述的CD37多肽可分离自多种来源，例如来自人组织型或来自其他来源，或者通过重组或合成方法制备。
术语“抗体”表示通过免疫球蛋白的可变区内的至少一个抗原识别位点识别并特异性结合靶的免疫球蛋白分子，所述靶例如蛋白、多肽、肽、碳水化合物、多核苷酸、脂质或前述的组合。本文使用的术语“抗体”包括完整的多克隆抗体、完整的单克隆抗体、抗体片段（例如，Fab、Fab'、F(ab')2以及Fv片段）、单链Fv(scFv)突变体、多特异性抗体（例如产生自至少两个完整抗体的双特异性抗体）、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、包含抗体的抗原确定部分的融合蛋白、以及包含抗原识别位点的任何其他修饰的免疫球蛋白分子，只要该抗体表现所需的生物活性。抗体可为五种主要免疫球蛋白的任何种类：基于其重链恒定区的鉴定（被称为α、δ、ε、γ以及μ），分别为IgA、IgD、IgE、IgG以及IgM，或者其亚类（同种型）（例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1以及IgA2）。不同种类的免疫球蛋白具有不同的和公知的亚单位结构和三维构象。抗体可为裸露的或与其他分子缀合，例如毒素、放射性同位素等。
“阻断”抗体或“拮抗剂”抗体是一种抑制或降低其结合抗原（例如CD37的生物活性的抗体。在一些实施方案中，阻断抗体或拮抗剂抗体基本上或完全抑制抗原的生物活性。生物活性可被降低10%、20%、30%、50%、70%、80%、90%、95%或甚至100%。
术语“抗CD37抗体|”或“结合CD37的抗体”是指能够以足够亲和力结合CD37的抗体，使得抗体可用作靶向CD37的诊断剂和/或治疗剂。抗CD37抗体与无关的、非CD37蛋白结合的程度可小于抗体与CD37结合的约10%，这通过例如放射免疫测定(RIA)来检测。在某些实施方案中，结合CD37的抗体具有≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM或≤0.1nM的解离常数(Kd)。
术语“抗体片段”是指完整抗体的一部分，是指完整抗体的抗原决定可变区。抗体片段的实例包括但不限于Fab、Fab'、F(ab')2以及Fv片段，直链抗体、单链抗体以及形成于抗体片段的多特异性抗体。
“单克隆抗体”是指涉及对于单抗原决定簇或表位的高特异性识别和结合的同质性抗体群。这与通常包括针对不同抗原决定簇的不同抗体的多克隆抗体形成对照。术语“单克隆抗体”包括完整的和全长的单克隆抗体以及抗体片段（例如，Fab、Fab'、F(ab')2、Fv），单链(scFv)突变体、包含抗体部分的融合蛋白，以及包含抗原识别位点的任何其他修饰的免疫球蛋白分子。另外“单克隆抗体”是指以任何形式制备的这些抗体，包括但不限于通过杂交瘤、噬菌体选择、重组表达以及转基因动物。
术语“人源化抗体”是指作为含有最少非人（例如，鼠）序列的特异性免疫球蛋白链、嵌合免疫球蛋白或其片段的非人（例如，鼠）抗体形式。通常，人源化抗体为其中来自互补决定区(CDR)的残基被来自具有所需特异性、亲和力和能力的非人物种（例如，小鼠、大鼠、家兔、仓鼠）的CDR的残基取代的人免疫球蛋白(Jones等人，1986,Nature,321:522-525;Riechmann等人，1988,Nature,332:323-327;Verhoeyen等人，1988,Science,239:1534-1536)。在一些情况中，人免疫球蛋白的Fv框架区(FR)被来自非人物种的具有所需特异性、亲和力以及能力的抗体中的相应残基取代。人源化抗体可进一步通过Fv框架区和/或取代的非人残基中的另外的残基取代来修饰，以对于抗体特异性、亲和力和/或能力进行精和优化。通常，人源化抗体包括基本上所有可变结构域，其中至少一种、通常两种或三种可变结构域含有与非人免疫球蛋白相对应的所有或基本上所有CDR区，而所有或基本上所有FR区为人免疫球蛋白共有序列的那些。人源化抗体还可包括免疫球蛋白恒定区或结构域(Fc)的至少一部分（通常是人免疫球蛋白）。用于生成人源化抗体的方法的实例中美国专利5,225,539中描述。
抗体的“可变区”是指单独的或组合的抗体轻链的可变区或抗体重链的可变区。重链和轻链可变区各自由通过三个互补决定区(CDR，也称为高可变区)连接的四个框架区(FR)组成。各链中的CDR通过FR紧密结合，并且与来自其他链的CDR一起促进抗体的抗原结合位点形成。具有至少两种确定CDR的技术：(1)一种基于交叉物种序列变异性的方法（即，Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest,(第5版，1991,NationalInstitutes of Health,Bethesda Md.))；和(2)一种基于抗原-抗体复合物的结晶学研究的方法(Al-lazikani等人(1997)J.Molec.Biol.273:927-948))。另外，本领域中有时将这两种方法的组合用于确定CDR。
当提及可变结构域中的残基时，通常使用Kabat编号系统（大约是轻链的残基1-107和重链的残基1-113）（例如，Kabat等人，Sequences ofImmunological Interest.第5版，Public Health Service,National Institutes ofHealth,Bethesda,Md.(1991))。
Kabat中的氨基酸位置编号是指用于抗体的编辑的重链可变结构域或轻链可变结构域的编号系统（Kabat等人，Sequences of Proteins ofImmunological Interest,第5版，Public Health Service,National Institutes ofHealth,Bethesda,Md.(1991)）。使用该编号系统，实际的直链氨基酸序列可含有与可变结构域的FR或CDR的缩短或插入相对应的较少的或另外的氨基酸。例如，重链可变结构域可包括在H2的残基52之后的单个氨基酸插入（根据Kabat的残基52a）和在重链FR残基82之后插入的残基（例如，根据Kabat的残基82a、82b以及82c）。可通过对于抗体序列的同源区与“标准的”Kabat编号序列进行比对来对给定的抗体确定残基的Kabat编号。Chothia则提及了结构环的位置(Chothia和Lesk J.Mol.Biol.196:901-917(1987))。当使用Kabat编号规定来编号时，Chothia CDR-H1环的末端根据环的长度在H32和H34之间不同（这是因为Kabat编号方案中H35A和H35B安置了插入；如果35A或35B均不存在，环状32处结束；如果仅存在35A，环在33处结束；如果35A和35B均存在，环在34处结束）。AbM高可变区表现了在Kabat CDR和Chothia结构环之间的一致，被Oxford Molecular的AbM抗体造模软件使用。
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术语“人抗体”是指人产生的抗体，或者使用本领域已知的任何技术制备的具有与人产生的抗体对应的氨基酸序列的抗体。人抗体的该定义包括完整或全长抗体、其片段，和/或包含至少一个人重链和/或轻链多肽的抗体，例如包含鼠轻链和人重链多肽的抗体。
术语“嵌合抗体”是指其中免疫球蛋白分子的氨基酸序列衍生自两个或多个物种的抗体。通常，轻链和重链的可变区与衍射自一个哺乳动物物种（例如，小鼠、大鼠、家兔等）的具有所需特异性、亲和力以及能力的抗体可变区对应，而恒定区与衍生自另一个物种（通常是人）的抗体中的序列具有同源性，以避免引发该物种中的免疫反应。
术语“表位”或“抗原决定簇”在本发明中可互换使用，是指能够被特定抗体识别和特异性结合的抗原的部分。当抗原是多肽时，可由连续氨基酸和通过蛋白质的三级折叠而并置的非连续氨基酸形成表位。由连续氨基酸形成的表位通常在蛋白质变性时保留，而由三级折叠形成的表位通常在蛋白质变性时丧失。在独特的空间构象中，表位通常包括至少3给且通常更多，至少5给或8-10给氨基酸。
“结合亲和力”通常是指一个分子（例如，抗体）的单结合位点及其结合配偶体（例如，抗原）之间的非共价相互作用的总数的强度。除非另有指明，本文使用的“结合亲和力”是指反映了结合对（例如抗体和抗原）的成员之间的1:1相互作用的固有结合亲和力。分子X与其配偶体Y的亲和力通常通过解离常数(Kd)来表示。可通过本领域公知方法来测量亲和力，包括本发明描述的那些方法。低亲和力抗体通常缓慢结合抗原且倾向于容易解离，而高亲和力抗体通常较快结合抗原且倾向于仍较长时间结合。本领域已知多种测量结合亲和力的方法，其中任何方法可用于本发明的目的。下文描述了具体的说明性实施方案。
本发明提及结合亲和力时使用的“或更好”是指分子及其结合配偶体之间的较强的结合。本文使用的“或更好”是指较强的结合，通过较小的Kd数字数值来表示。例如，对于抗原具有“0.6nM或更好”的亲和力的抗体，该抗体对于抗原的亲和力为<0.6nM，即，0.59nM、0.58nM、0.57nM等，或小于0.6nM的任何数值。
对于“特异性结合”，通常是指抗体通过其抗原结合结构域与表位结合且该结合赋予抗原结构域和表位之间一些互补性。根据该定义，当抗体与表位结合时，抗体被说成“特异性结合”该表位，通过其抗原结合结构域结合表位比其结合随机、无关的表位更容易。本文使用的术语“特异性”对某些抗体结合某些表位的相对亲和力进行定性。例如，抗体“A”可被认为比抗体“B”对于给定的表位具有较高的亲和力。或者抗体“A”被说成是以比其对相关表位“D”更高的亲和力结合表位“C”。
对于“优先结合”，是指抗体比其结合相关的、相似的、同源性或类似表位更容易地特异性结合表位。因此，“优先结合”给定表位的抗体比相关的表位更可能结合该表位，即使这样的抗体可与相关表位交叉反应。
如果抗体与给定表位的结合达到了在某种程度上其阻断参考抗体与该表位的结合的程度，则该抗体被说成“竞争性抑制”参考抗体与该表位的结合。竞争性抑制可通过本领域已知的任何方法来确定，例如，竞争性ELISA测定。抗体可被说成竞争性抑制参考抗体与给定表位的结合达至少90%、至少80%、至少70%、至少60%或至少50%。
本文使用的用语“基本上相似”或“基本上相同”是指两个数值之间（通常一个数值与本发明的抗体相关，另一个数值与参考/对照抗体相关）足够高度的相似性，使得本领域技术人员认为在所述数值（例如，Kd值）测量的生物特性情况下两个数值之间的差异很小或者无生物学和/或统计学意义。所述两个数值之间的差异作为参考/对照抗体的数值的函数可小于约50%、小于约40%、小于约30%、小于约20%或小于约10%。
被“分离的”多肽、抗体、多核苷酸、载体、细胞或组合物为作为天然情况未发现的形式的多肽、抗体、多核苷酸、载体、细胞或组合物。分离的多肽、抗体、多核苷酸、载体、细胞或组合物包括已经被纯化至不再是天然情况下发现的形式的程度的那些。在一些实施方案中，分离的多肽、抗体、多核苷酸、载体、细胞或组合物是基本上纯的。
本文使用的“基本上纯的”是指至少50%纯（即，无污染物）、至少90%纯、至少95%纯、至少98%纯或至少99%纯。
本文使用的术语“免疫缀合物”或“缀合物”是指与细胞结合剂（即，抗CD37抗体或其片段）连接并由通式C-L-A（其中，C=细胞毒素，L=接头，A=细胞结合剂或抗CD37抗体或抗体片段）定义的化合物或其衍生物。免疫缀合物还可由反序的通式定义：A-L-C。
接头是能够将化合物、通常药物（例如美登素）与细胞结合剂（例如抗CD37抗体或其片段）以稳定、共价方式连接的任何化学部分（moiety）。在化合物或抗体仍具有活性的条件下，接头可易感于或基本上抵抗酸诱导的裂解、光诱导的裂解、肽酶诱导的裂解、酯酶诱导的裂解以及二硫键裂解。合适的接头为本领域公知，包括，例如二硫基、硫醚基、酸敏感性基团、光敏感性基、肽酶敏感性基团以及酯酶敏感性基团。接头还可包括本发明描述和本领域已知的带电荷的接头及其亲水形式。
术语“癌”和“癌的”是指或描述其中细胞群具有未调节的细胞生长的特性的哺乳动物中的生理状况。癌的实例包括但不限于癌瘤、淋巴瘤、胚细胞瘤、肉瘤以及白血病。“肿瘤”和“新生物”是指产生于过度细胞生长或增殖的一种或多种细胞，例如良性（非癌的）或恶性（癌的），包括癌前病变。可治疗和/或预防的“癌”或“致瘤”疾病的实例包括B细胞淋巴瘤，包括NHL、前B细胞成淋巴细胞白血病/淋巴瘤以及成熟B细胞新生物，例如B细胞慢性淋巴细胞性白血病(CLL)/小淋巴细胞性白血病(SLL)，B细胞前淋巴细胞性白血病，淋巴浆细胞淋巴瘤、外套细胞淋巴瘤(MCL)、滤泡性淋巴瘤(FL)，包括低度、中度以及高度FL，皮肤滤泡中心淋巴瘤，缘区B细胞淋巴瘤（MALT型，结节型以及脾型），毛细胞性白血病、弥漫性大B细胞淋巴瘤，伯基特氏淋巴瘤、浆细胞瘤、浆细胞性骨髓瘤、移植后淋巴增生性障碍、沃尔登斯特伦氏氏巨球蛋白血症，以及间变大细胞淋巴瘤(ALCL)。
术语“癌细胞”、“肿瘤细胞”以及语法等同术语是指衍生自肿瘤或癌前病变的细胞总群，包括非致瘤性细胞（包括肿瘤细胞群块）和致瘤性干细胞（癌干细胞）。本文使用的术语“肿瘤细胞”当单独指缺乏更新和分化能力的那些肿瘤细胞时将被术语“非致瘤性”修饰，以区别那些肿瘤细胞和癌干细胞。
术语“受治疗者”是指待为特定治疗的接受者的任何动物（例如，哺乳动物），包括但不限于人、非人灵长类、啮齿类等。通常，提及人受治疗者时术语“受治疗者”和“患者”在本文中可互换使用。
“联合”一种或多种其他治疗剂施用包括同时（同时发生的）和以任何顺序的连续施用。
术语“药物制剂”是指允许活性成分的生物活性有效的形式和不含有对于进行该制剂施用的受治疗者有不能接受的毒性的其他组分的制剂。
本文揭示的抗体的“有效量”是足以实现特别说明的目的的量。根据所说明的目的，“有效量”可经验性且以常规方式来确定。
术语“治疗有效量”是指有效“治疗”受治疗者或哺乳动物的疾病或病症的抗体或其他药物的量。在癌的情况中，药物的治疗有效量可减少癌细胞的数量，减小肿瘤体积，抑制（即，在某种程度上减缓或阻止）癌细胞浸润至周围器官，抑制（即，在某种程度上减缓或阻止）肿瘤转移，在某种程度上抑制肿瘤生长，和/或者某种程度上缓解癌相关的症状。见，本文“治疗”的定义。在药物可防止生长和/或杀伤存在的癌细胞的程度上，可为细胞生长抑制的和/或细胞毒性的。“预防有效量”是指在剂量和持续时间上有效实现所需预防效果需要的量。通常但非必须的，由于预防剂量组疾病前或在基本早期用于受治疗者，预防有效量将小于治疗有效量。
本文使用的词语“标记物”是指直接或间接与抗体缀合以产生“标记的”抗体的可检测化合物或组合物。标记物本身是可检测的（例如，放射性同位素标记物或荧光标记物），或在酶标记物的情况中，可催化可检测的底物化合物或组合物的化学变化。
“化学治疗剂”是一种可用于治疗癌的化学化合物，不管其作用机制是什么。化学治疗剂包括，例如，CD20D的拮抗剂（例如利妥昔单抗和环磷酰胺），多柔比星，长春新碱，泼尼松，氟达拉滨，鬼臼乙叉甙，甲氨喋呤，来那度胺，苯丁酸氮芥，苯达莫司汀和/或这些化学治疗剂的修饰形式。
诸如“治疗（treating或treatment或to treat）”、或“缓解（alleviating或to alleviate）”是指1)治愈、减缓、减轻所诊断的病理状况或病症的症状和/或阻止其进展的治疗措施，和2)预防和/或减慢所靶向的病理状况或病症的发展。因此，需要治疗的那些患者包括已经患有病症的那些，易于患有病症的那些，以及其中有待预防病症的那些。在某些实施方案中，如果患者显示了下列的一种或多种则受治疗者被根据本发明的方法成功“治疗”癌：癌细胞数量减少或完全缺乏，肿瘤大小减小；癌细胞浸润至周围器官受到抑制或缺乏，包括，例如癌播散至软组织和骨骼；肿瘤转移受到抑制或缺乏；肿瘤生长受到抑制或缺乏；与特定癌相关的一种或多种症状减轻；发病率和死亡率减小；生命质量改善；肿瘤的致瘤性、致瘤频率或致瘤能力减小；肿瘤中的癌干细胞的数量或频率减小；致瘤细胞分化为非致瘤状态；或一些效果的组合。
本文中可互换使用的“多核苷酸”或“核酸”是指任何长度的核苷酸的聚合物，包括DNA和RNA。核苷酸可为脱氧核糖核苷酸，核糖核苷酸，修饰的核苷酸或碱基，和/或它们的类似物，或可通过DNA或RNA聚合酶掺入聚合物的任何底物。多核苷酸可包括修饰的核苷酸，例如甲基化的核苷酸及其类似物。如果存在的话，对于核苷酸结构的修饰可以在聚合物组装之前或之后赋予。核苷酸序列可通过非核苷酸组分间断。多核苷酸可在聚合之后进一步修饰，例如通过使用标记组分缀合。其他类型的修饰包括，例如“帽”，使用类似物取代一种或多种天然存在的核苷酸，中间核苷酸修饰，例如具有不带电荷的键（例如，甲基膦酸酯、磷酸三酯、磷酰胺酯、胺基甲酸酯等）的那些和具有带电荷的键（例如，磷硫酰，二硫代磷酸酯等）的那些，含有悬垂部分（pendant moiety）的那些，例如，蛋白质（例如，核酸酶，毒素，抗体，信号肽，聚-L-赖氨酸等），具有插入剂（例如，吖啶，补骨脂素等）的那些，含有螯合剂（例如，金属，放射性金属，硼，氧化金属等）的那些，含有烷化剂的那些，具有修饰的键（例如，α异头物核酸等）的那些，以及多核苷酸的未修饰形式。另外，通常存在于糖中的任何羟基可被例如膦酸酯基、磷酸基取代，被标准保护基团保护，或被活化以使另外的键制备成另外的核苷酸，或可被缀合成固体支持物。5'和3'末端OH可被磷酰基化或使用胺或具有1至20个碳原子的有机帽基团部分取代。其他羟基可也可被衍生为标准的保护基团。多核苷酸还可含有本领域公知的核糖或脱氧核糖类似物，包括，例如2'-O-甲基，2'-O-烯丙基，2'-氟-核糖或2'-叠氮基-核糖，碳环碳类似物，α-异头物糖，差向异构糖（例如，阿拉伯糖，木糖或来苏糖，吡喃糖，呋喃糖，景天庚糖），非环类似物以及碱性核苷类似物（例如甲基肌苷）。一种或多种磷酸二酯键可被可选的连接基团取代。这些可选的连接基团包括但不限于其中磷酸被P(O)S(“硫酯”)、P(S)S(“二硫酯”)、(O)NR2(“酰胺酯”)、P(O)R、P(O)OR'、CO或CH2(“formacetal”)取代的实施方案，其中R或R'单独为H或任选含有醚(--O--)键的取代或非取代的烷基(1-20C)，芳基，链烯基，环烷基，环链烯基或芳烷基。多核苷酸中并非所有键都需要一致。前文描述用于本发明提及的所有多核苷酸，包括RNA和DNA。
术语“载体”是指能够在宿主细胞中递送并任选表达一种或多种基因或序列的构建体。载体的实例包括但不限于病毒载体、裸DNA或RNA表达载体、质粒、粘粒或噬菌体载体、与阳离子冷凝剂相关的DNA或RNA表达载体，包裹着脂质体中的DNA或RNA表达载体，以及某些真核细胞，例如生产细胞。
本文可互换使用的术语“多肽”、“肽”、以及“蛋白质”是指任何长度的氨基酸的聚合物。所述聚合物可为直链或支链，可包含修饰的氨基酸，可被非氨基酸间断。该术语还包括被天然修饰或被干涉修饰的氨基酸聚合物，例如，二硫键形成，糖基化，脂质化，酰基化，磷酸化，或任何其他操作或修饰，例如使用标记组分缀合。在该定义中还包括，例如含有氨基酸的一种或多种类似物（包括，例如非天然氨基酸等）的多肽，以及本领域已知的其他修饰。应理解，因为本发明的多肽基于抗体，在某些实施方案中，所述多肽可作为单链或联合链存在。
在两个或多个核酸或多肽的上下文中的术语“同一性”或“同一性百分数”是指，当对于最大对应性来比较和比对（如果需要，引入间隙）时（不考虑作为序列同一性部分的任何保守性氨基酸取代），两个或多个序列或亚序列是相同的或者具有相同的核苷酸或氨基酸残基的特定百分数。可使用序列比较软件或算法或通过目测观察来测量同一性百分数。可用于获得氨基酸或核苷酸序列比对的多种算法和软件为本领域已知。序列比对算法的一个这样的非限制性实例描述于Karlin等人，1990,Proc.Natl.Acad．Sci.,87:2264-2268,修改于Karlin等人，1993,Proc.Natl.Acad．Sci.,90:5873-5877,并合并至NBLAST和XBLAST程序中(Altschul等人，1991,Nucleic AcidsRes.,25:3389-3402)。在某些实施方案中，可如Altschul等人，1997,NucleicAcidss Res.25:3389-3402中描述的使用Gapped BLAST。BLAST-2、WU-BLAST-2(Altschul等人，1996,Methods in Enzymology,266:460-480)、ALIGN、ALIGN-2(Genentech,South San Francisco,California)或Megalign(DNASTAR)是可用于进行序列比对的其他可公共获得的软件程序。在某些实施方案中，使用GCG软件中的GAP程序来确定两个核苷酸序列之间的同一性百分数（例如，使用NWSgapdna.CMP矩阵和40、50、60、70或90的间隙加权和1、2、3、4、5或6的长度加权）。在某些可选的实施方案中，并入了Needleman和Wunsch算法(J. Mol.Biol.(48):444-453(1970))的GCG软件包中的GAP程序可用于确定两个氨基酸序列之间的同一性百分数（例如，使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵，和16、14、12、10、8、6或4的间隙加权和1、2、3、4、5的长度加权)。可选地，在某些实施方案中，使用Myers和Miller算法(CABIOS,4:11-17(1989))确定核苷酸或氨基酸序列之间的同一性百分数。例如，可使用ALIGN程序(2.0版)和使用具有残基表的PAM120、间隙长度罚分12和间隙罚分4来确定同一性百分数。本领域技术人员可通过特定比对软件确定用于最大比对的合适参数。在某些实施方案中，使用比对软件的缺省参数。在某些实施方案中，第一氨基酸序列与第二氨基酸序列的同一性百分数“X”被计算为100×(Y/Z)，其中，Y是指第一和第二序列的比对中计为完全匹配的氨基酸残基的数目，Z是第二序列中残基的总数。如果第一序列的长度比第二序列长，则第一序列与第二序列的同一性百分数会比第二序列与第一序列的同一性百分数要长。
作为非限制性实例，可在某些实施方案中使用Bestfit程序来确定任何特定的多核苷酸是否与参考序列具有某些序列同一性百分数（例如，至少80%同一性，至少85%同一性，至少90%同一性，以及在某些实施方案中，至少95%、96%、97%、98%或99%同一性)(Wisconsin序列分析包，Unix 8版，Genetics Computer Group，University Research Park,575 Science Drive,Madison,WI 53711)。Bestfit使用Smith和Waterman,Advances in AppliedMathematics 2:482489(1981)的局部同源性算法，来发现两个序列之间具有同源性的最佳片段。当根据本发明使用Bestfit或任何其他序列比对程序来确定特定序列是否与参考序列具有例如95%的同一性时，设定参数，使得经参考核苷酸序列的全长来计算同一性百分数和允许同源性中的间隙达参考序列中核苷酸总数的5%。
在一些实施方案中，本发明的两个核酸或多肽基本上完全同一，意思是，当如使用序列比较算法或通过目测观察测量的那样比较和比对最大对应性时，它们具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%且在一些实施方案中具有至少95%、96%、97%、98%、99%的核苷酸或氨基酸残基同一性。同一性可存在于长度为至少约10个、约20个、约40-60个残基或任何整数值的序列区域，并可存在于长于60-80个残基的区域，例如，至少约90-100个残基，在一些实施方案中，序列中所比较的序列的全长是基本上完全同一的，例如核苷酸序列的编码区。
“保守性氨基酸取代”是指其中一个氨基酸残基被具有相似侧链的另一个氨基酸残基取代。具有相似侧链的氨基酸残基的家族在本领域中有定义，包括碱性侧链（例如，赖氨酸，精氨酸，组氨酸），酸性氨基酸（例如，天门冬氨酸，谷氨酸），不带电荷的极性侧链氨基酸（例如，甘氨酸，天门冬酰胺，谷酰胺，丝氨酸，苏氨酸，酪氨酸，半胱氨酸），非极性侧链（例如，丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，甲硫氨酸，色氨酸），β分支侧链（例如，苏氨酸，缬氨酸，异亮氨酸）和芳香族侧链（例如，酪氨酸，苯丙氨酸，色氨酸，组氨酸）。例如，苯丙氨酸取代酪氨酸是保守性取代。在一些实施方案中，本发明的多肽和抗体序列中的保守性取代并不消除含有氨基酸序列的多肽或抗体与抗原结合，所述抗原即所述多肽或抗体结合的CD37。鉴定不消除抗原结合的核苷酸和氨基酸保守性取代的方法为本领域公知（见，例如，Brummell等人，Biochem.32:1180-1187(1993);Kobayashi等人，Protein Eng.12(10):879-884(1999);以及Burks等人，Proc.Natl.Acad．Sci.USA 94:.412-417(1997))。
除非上下文另有明确指明，本文说明书和权利要求书所使用的单数形式（“a”、“an”以及“the”）包括复数形式。
应理解无论本文何处使用用语“包括”描述实施方案，都还提供以“由......组成”和/或“基本由......组成”描述的类似实施方案。
本文在诸如“A和/或B”的短语中使用的术语“和/或”意指包括“A和B”、“A或B”、“A”以及“B”。同样的，在诸如“A、B和/或C”的短语中使用的术语“和/或”意指包括下列各实施方案：A、B以及C；A、B或C；A或C;A或B;B或C;A和C;A和B;B和C;A(单独);B(单独);以及C(单独)。
II.CD37结合剂
本发明提供了特异性结合CD37D的制剂。这些制剂在本文中被称为“CD37结合剂”。人、猕猴以及鼠CD37的全长氨基酸序列为本领域已知，在本文中分别由SEQ ID NO:1-3来表示。
人CD37：
MSAQESCLSLIKYFLFVFNLFFFVLGSLIFCFGIWILIDKTSFVSFVGLAFVPLQIWSKVLAISGIFTMGIALLGCVGALKELRCLLGLYFGMLLLLFATQITLGILISTQRAQLERSLRDVVEKTIQKYGTNPEETAAEESWDYVQFQLRCCGWHYPQDWFQVLILRGNGSEAHRVPCSCYNLSATNDSTILDKVILPQLSRLGHLARSRHSADICAVPAESHIYREGCAQGLQKWLHNNLISIVGICLGVGLLELGFMTLSIFLCRNLDHVYNRLAYR(SEQ ID NO:1)
猕猴CD37：
MSAQESCLSLIKYFLFVFNLFFFVILGSLIFCFGIWILIDKTSFVSFVGLAFVPLQIWSKVLAISGVFTMGLALLGCVGALKELRCLLGLYFGMLLLLFATQITLGILISTQRAQLERSLQDIVEKTIQRYHTNPEETAAEESWDYVQFQLRCCGWHSPQDWFQVLTLRGNGSEAHRVPCSCYNLSATNDSTILDKVILPQLSRLGQLARSRHSTDICAVPANSHIYREGCARSLQKWLHNNLISIVGICLGVGLLELGFMTLSIFLCRNLDHVYNRLRYR(SEQ ID NO:2)
鼠CD37(NP_031671)：
MSAQESCLSLIKYFLFVFNLFFFVLGGLIFCFGTWILIDKTSFVSFVGLSFVPLQTWSKVLAVSGVLTMALALLGCVGALKELRCLLGLYFGMLLLLFATQITLGILISTQRVRLERRVQELVLRTIQSYRTNPDETAAEESWDYAQFQLRCCGWQSPRDWNKAQMLKANESEEPFVPCSCYNSTATNDSTVFDKLFFSQLSRLGPRAKLRQYADICALPAKAHIYREGCAQSLQKWLHNNIISIVGICLGVGLLELGFMTLSIFLCRNLDHVYDRLARYR(SEQ ID NO:3)
在某些实施方案中，CD37结合剂是抗体、免疫缀合物或多肽。在一些实施方案中，CD37结合剂是人源化抗体。
在某些实施方案中，CD37结合剂具有一种或多种下列效果：抑制肿瘤细胞增殖，通过降低肿瘤中癌干细胞的频率而减小肿瘤的致瘤性，抑制肿瘤生长，增加存活率，引发肿瘤细胞的细胞死亡，使致瘤性细胞分化成非致瘤状态，或预防肿瘤细胞的转移。
在某些实施方案中，CD37结合剂能够诱导补体依赖性细胞毒性。例如，使用CD37结合剂治疗细胞可导致下述CDC活性，即，所述CDC活性降低细胞活力至小于未处理的细胞的约80%、约70%，约60%，约50%，约40%或约35%。使用CD37结合剂处理细胞还可导致下述CDC活性，即，所述CDC活性降低细胞活力至未处理的细胞的细胞活力的约70-80%、60-70%、50-60%、40-50%或30-40%。在一些特定实施方案中，CD37结合剂能够诱导Ramos细胞中补体依赖的细胞毒性。
在某些实施方案中，CD37结合剂能够诱导抗体依赖的细胞介导的细胞毒性(ADCC)。例如，使用CD37结合剂处理细胞可导致下述ADCC活性，即所述ADCC活性产生至少约15%、至少约20%、至少约25%、至少约30%、至少约35%、至少约40%、至少约45%、至少约50%、或至少约60%的细胞裂解。使用CD37结合剂处理细胞可导致下述ADCC活性，即所述ADCC活性产生约10-50%、约20-50%、约30-50%或约40-50%的细胞裂解。在某些特定实施方案中，CD37结合剂能够诱导Daudi、Ramos和/或Granata-519细胞中的ADCC。
在某些实施方案中，CD37结合剂能够诱导细胞凋亡。例如，使用CD37结合剂处理细胞可诱导至少约15%、至少约20%、至少约25%、至少约30%、至少约35%、至少约40%、至少约45%、至少约50%或至少约55%的细胞凋亡。在一些特定实施方案中，CD3结合剂能够诱导Ramos细胞和/Raji细胞中的细胞凋亡。
在一些实施方案中，CD37结合剂能够减小肿瘤体积。CD37结合剂减小肿瘤体积的能力可通过测量%T/C值来评估，%T/C值是由对照受治疗者的中位数肿瘤体积除被治疗的受治疗者的中位数肿瘤体积。在在一些实施方案中，使用CD37结合剂治疗导致下列%T/C值：小于约55%、小于约50%、小于约45%、小于约40%、小于约35%、小于约30%、小于约25%、小于约20%、小于约15%、小于约10%或小于约5%。在一些特定的实施方案中，CD37结合剂可减小BJAB异种移植物模型和/或SU-DHL-4异种移植物模型中的肿瘤大小。
在某些实施方案中，特异性结合人CD37的免疫缀合物或其他制剂经细胞毒性剂来引发细胞死亡。例如，在某些实施方案中，将人CD37抗体的抗体与美登素缀合，美登素在表达CD37的细胞中通过蛋白质内化而活化。在某些可选的实施方案中，所述制剂或抗体不被缀合。
在某些实施方案中，CD37结合剂能够抑制肿瘤生长。在某些实施方案中，CD37结合剂能够在体外抑制肿瘤生长（例如，在异种移植物模型和/或者患有癌的人中）。
CD37结合剂包括CD37抗体CD37-3、CD37-12、CD37-38、CD37-50、CD37-51、CD37-56和CD37-57及其片段、变体以及衍生物。CD37结合剂还包括与选自下述抗体相同的CD37表位特异性结合的CD37结合剂：CD37-3、CD37-12、CD37-38、CD37-50、CD37-51、CD37-56以及CD37-57。CD37结合剂还包括竞争性抑制选自下述的抗体的CD37结合剂：CD37-3、CD37-12、CD37-38、CD37-50、CD37-51、CD37-56以及CD37-57。
在某些特定实施方案中，CD37结合剂与CD37的结合不需要人CD37氨基酸109-138。因此，一些CD37结合剂结合包含SEQ ID NO:180的氨基酸序列的多肽。在其他实施方案中，CD37结合剂与CD37的结合被人CD37氨基酸202-243的突变中断。因此，一些CD37结合剂不结合包含SEQ ID NO:184的氨基酸序列的多肽。
在一些实施方案中，CD37结合剂结合SEQ ID NO:180的多肽和结合SEQ ID NO:183的多肽，但不结合SEQ ID NO:184的多肽。
在一些实施方案中，CD37结合剂结合SEQ ID NO:190的多肽。在一些实施方案中，CD37结合剂结合SEQ ID NO:190的多肽和SEQ ID NO:189的多肽。在一些实施方案中，CD37结合剂结合SEQ ID NO:190的多肽和SEQ ID NO:188的多肽。
在一些实施方案中，CD37结合剂结合SEQ ID NO:192的多肽，但不结合SEQ ID NO:194的多肽。在一些实施方案中，CD37结合剂结合SEQ IDNO:193的多肽，但不结合SEQ ID NO:194的多肽。
某些CD37结合剂结合的CD37肽片段包括但不限于包含、基本组成为或组成为SEQ ID NO:1的氨基酸200-243、SEQ ID NO:1的氨基酸202-220或SEQ ID NO:1的氨基酸221-243的CD37片段。在一些实施方案中，CD37结合剂特异性结合包含SEQ ID NO:1的202-243的人CD37表位。在一些实施方案中，CD37结合剂与CD37的结合需要SEQ ID NO:1的氨基酸202-243。在一些实施方案中，CD37结合剂与CD37的结合需要SEQ ID NO:1的氨基酸200-220。在一些实施方案中，CD37结合剂与CD37的结合需要SEQ ID NO:1的氨基酸221-243。
CD37结合剂还包括包含CD37-3、CD37-12、CD37-38、CD37-50、CD37-51、CD37-56或CD37-57的重链和轻链CDR序列的CD37结合剂。CD37-38、CD37-50、CD37-51、CD37-56以及CD37-57的重链和轻链CDR含有相关的序列。因此，CD37结合剂还可包括保护通过CD37-38、CD37-50、CD37-51、CD37-56以及CD37-57比对获得的共有序列的重链和轻链CDR序列。CD37-3、CD37-12、CD37-38、CD37-50、CD37-51、CD37-56以及CD37-57的CDR序列和CD37-38、CD37-50、CD37-51、CD37-56以及CD37-57的共有序列中在下文表1和2中描述。
表1：重链可变区CDR氨基酸序列
Figure BDA00002129651500281
Figure BDA00002129651500291
表2：轻链可变区CDR氨基酸序列
Figure BDA00002129651500292
CD37结合分子可为特异性结合下述CD37的抗体或抗原结合片段，即包含CD37-3、CD37-12、CD37-50、CD37-51、CD37-56或CD37-57的CDR（每个CDR最多达4（即，0、1、2、3或4）个保守性氨基酸取代）的CD37。
所述多肽可包含本文描述的单独的轻链可变区或重链可变区之一。所述抗体和多肽还可同时包含轻链可变区和重链可变区。鼠、嵌合以及人源化CD37-3、CD37-12、CD37-50、CD37-51、CD37-56以及CD37-57抗体的轻链可变区和重链可变区在下文表3和4中提供。
表3：重链可变区氨基酸序列
Figure BDA00002129651500301
Figure BDA00002129651500311
Figure BDA00002129651500321
表4：轻链可变区氨基酸序列
Figure BDA00002129651500322
Figure BDA00002129651500331
本发明还提供了包括下述多肽的多肽：(a)与SEQ ID NO:55-71具有至少约90%序列同一性的多肽；和/或(b)与SEQ ID NO:72-87具有至少约90%序列同一性的多肽。在某些实施方案中，所述多肽包括与SEQ ID NO:55-87具有至少约95%、至少约96%、至少约97%、至少约98%或至少约99%序列同一性的多肽。因此，在某些实施方案中，所述多肽包括(a)与SEQ IDNO:55-71具有至少约95%序列同一性的多肽和/或(b)与SEQ ID NO:72-87具有至少约95%序列同一性的多肽。在某些实施方案中，所述多肽包括(a)具有SEQ ID NO:55-71的氨基酸序列的多肽；和/或(b)具有SEQ IDNO:72-87的氨基酸序列的多肽。在某些实施方案中，所述多肽是特异性结合CD37的鼠、嵌合或人源化抗体。在某些实施方案中，与SEQ ID NO:55-87具有一定序列同一性百分数的多肽与SEQ ID NO:55-87的不同仅在于保守性氨基酸取代。
所述多肽可包含本文描述的单独的轻链可变区或重链可变区之一。所述抗体和多肽还可同时包含轻链可变区和重链可变区。鼠、嵌合以及人源化CD37-3、CD37-12、CD37-50、CD37-51、CD37-56以及CD37-57抗体的轻链和可变链序列在下文表5和6中提供。
表5：全长重链氨基酸序列
Figure BDA00002129651500341
Figure BDA00002129651500351
Figure BDA00002129651500371
Figure BDA00002129651500381
Figure BDA00002129651500391
Figure BDA00002129651500401
表6：全长轻链氨基酸序列
Figure BDA00002129651500402
Figure BDA00002129651500411
本发明还提供了包括下述多肽的多肽：(a)与SEQ ID NO:88-104具有至少约90%序列同一性的多肽；和/或(b)与SEQ ID NO:105-120具有至少约90%序列同一性的多肽。在某些实施方案中，所述多肽包括与SEQ ID NO:88-120具有至少约95%、至少约96%、至少约97%、至少约98%或至少约99%序列同一性的多肽。因此，在某些实施方案中，所述多肽包括(a)与SEQID NO:88-104具有至少约95%序列同一性的多肽和/或(b)与SEQ ID NO:105-120具有至少约95%序列同一性的多肽。在某些实施方案中，所述多肽包括(a)具有SEQ ID NO:88-104的氨基酸序列的多肽；和/或(b)具有SEQID NO:105-120的氨基酸序列的多肽。在某些实施方案中，所述多肽是特异性结合CD37的抗体和/或多肽。在某些实施方案中，所述多肽是特异性结合CD37的鼠、嵌合或人源化抗体。在某些实施方案中，与SEQ ID NO:88-120具有一定序列同一性百分数的多肽与SEQ ID NO:88-120的不同仅在于保守性氨基酸取代。
在某些实施方案中，CD37抗体可谓由选自下述的杂交瘤产生的抗体：于2010年2月18日保藏于ATCC的ATCC保藏名称PTA-10664，于2010年2月18日保藏于ATCC的ATCC保藏名称PTA-10665，于2010年2月18日保藏于ATCC的ATCC保藏名称PTA-10666，于2010年2月18日保藏于ATCC的ATCC保藏名称PTA-10667，于2010年2月18日保藏于ATCC的ATCC保藏名称PTA-10668，于2010年2月18日保藏于ATCC的ATCC保藏名称PTA-10669，于2010年2月18日保藏于ATCC（10801 University Boulevard,Manassas,Virginia 20110)的ATCC保藏名称PTA-10670。在某些实施方案中，所述抗体包含由选自PTA-10665、PTA-10666、PTA-10667、PTA-10668、PTA-10669以及PTA-10670的杂交瘤产生的抗体的VH-CDR和VL-CDRS。
在某些实施方案中，CD37抗体可包含由重组质粒（于2010年3月18日保藏于ATCC的ATCC保藏名称PTA-10722）编码的轻链。在某些实施方案中，CD37抗体可包含由重组质粒DNA phuCD37-3HC v.1.0(于2010年3月18日保藏于ATCC的ATCC保藏名称PTA-10723)编码的重链。在某些实施方案中，CD37抗体可包含由重组质粒DNA phuCD37-3LC(PTA-10722)编码的轻链和由重组质粒DNA phuCD37-3HCv.1.0(PTA-10723)编码的重链。在某些实施方案中，CD37抗体可包含由重组质粒DNA phuCD37-3LC(PTA-10722)编码的VL-CDR和由重组质粒DNA phuCD37-3HCv.1.0(PTA-10723)编码的VH-CDR。
可使用杂交瘤方法来制备单克隆抗体，例如Kohler和Milstein(1975)Nature 256:495描述的那些。使用杂交瘤方法，如上所述对小鼠、仓鼠或其他合适的宿主动物进行免疫以引发淋巴细胞产生特异性结合免疫抗原的抗体。还可在体外对淋巴细胞进行免疫。在免疫之后，分离淋巴细胞并使用例如聚乙二醇与合适的骨髓瘤细胞系进行融合以形成杂交瘤细胞，然后可将所述杂交瘤细胞与未融合的淋巴细胞和骨髓瘤细胞选择开。然后，可对于产生针对所选择的抗原的单克隆抗体的杂交瘤[如通过免疫沉淀、免疫印迹或通过体外结合测定（例如，放射免疫测定（RIA），酶联免疫吸附测定(ELISA)）所检测]使用标准方法体外培养(Goding,Monoclonal Antibodies:Principles and Practice,Academic Press,1986)或在动物中体内作为腹水肿瘤来传代。然后，可如上文对于多克隆抗体所述那样从培养基或腹水瘤体纯化单克隆抗体。
可选地，还可使用如美国专利4,816,567中描述的重组DNA方法来制备单克隆抗体。从成熟B细胞或杂交瘤细胞分离编码单克隆抗体的多核苷酸，例如使用特异性扩增编码抗体的重链和轻链的基因的寡核苷酸引物通过RT-PCR，并且使用常规程序来确定它们的序列。然后，将编码重链和轻链的分离的多核苷酸克隆至合适的表达载体，然后将所述表达载体转染至宿主细胞，例如大肠杆菌（E.coli）细胞、猿猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，或不产生免疫球蛋白的骨髓瘤细胞，由宿主细胞产生单克隆抗体。另外，可如先前所述从表达所需物种的CDR的噬菌体展示库分离所需物种的重组单克隆抗体或其片段(McCafferty等人，1990,Nature,348:552-554;Clackson等人，1991,Nature,352:624-628;以及Marks等人，1991,J.Mol.Biol.,222:581-597)。
可使用重组DNA技术以许多不同方式进一步修饰编码单克隆抗体的多核苷酸，以产生可选的抗体。在一些实施方案中，例如小鼠单克隆抗体的轻链和重链恒定区可被取代为1)例如人抗体的那些区以产生嵌合抗体或取代为2)非免疫球蛋白多肽以产生融合抗体。在一些实施方案中，将恒定区截短或去除以产生单克隆抗体的所需抗体片段。可变区的位点定向或高密度诱变可用于优化单克隆抗体的特异性、亲和力等。
在一些实施方案中，针对人CD37的单克隆抗体为人源化抗体。在某些实施方案中，当将这样的抗体施用于人受治疗者时，在治疗上将其用于减小减小抗原性和HAMA（人抗小鼠抗体）反应。可使用本领域已知的多种技术来制备人源化抗体。在某些可选的实施方案中，针对CD37的抗体为人抗体。
可使用本领域已知的多种技术来直接制备人抗体。可生成体外免疫的或从产生针对靶抗原的免疫个体分离的永久性人B淋巴细胞（见，例如，Cole等人，单克隆Antibodies and Cancer Therapy,Alan R.Liss,第77页(1985);Boemer等人，1991,J.Immunol.,147(1):86-95;以及美国专利5,750,373)。另外，人抗体可选自噬菌体库，其中所述噬菌体库表达人抗体，如例如Vaughan等人，1996,Nat.Biotech.,14:309-314,Sheets等人，1998,Proc.Nat’l.Acad.Sci.,95:6157-6162,Hoogenboom和Winter,1991,J.Mol.Biol.,227:381,以及Marks等人，1991,J.Mol.Biol.,222:581中所述。用于生成和使用抗体噬菌体库的技术还描述于美国专利号5,969,108、6,172,197、5,885,793、6,521,404、6,544,731、6,555,313、6,582,915、6,593,081、6,300,064、6,653,068、6,706,484以及7,264,963；和Rothe等人，2007,J.Mol.Bio.,doi:10.1016/j.jmb.2007.12.018(这些文献各自通过引用完整并入本文)。亲和力成熟策略和链替换策略（Marks等人，1992,Bio/Technology10:779-783,通过引用完整并入本文）为本领域已知，可被用于生成高亲和力人抗体。
人源化抗体还可在含有人免疫球蛋白基因座的转基因小鼠中制备，当免疫时所述小鼠能够在不产生外源性免疫球蛋白的情况下产生人抗体的所有组分。该技术描述于美国专利5,545,807;5,545,806;5,569,825;5,625,126;5,633,425;以及5,661,016。
本发明还包括特异性识别CD37的双特异性抗体。双特异性抗体为能够特异性识别并结合至少两个不同表位的抗体。不同表位可位于相同分子中（例如，相同的CD37）或位于不同分子上，使得例如两个抗体均能够特异性识别和结合CD37，以及例如1)白细胞上的效应分子，例如T细胞受体（例如CD3）或Fc受体（例如，CD64、CD32或CD16）或2)如下文详细描述的细胞毒性剂。
示例的双特异性抗体可结合两个不同的表位，其中至少之一源于本发明的多肽。可选地，免疫球蛋白分子的抗抗原臂可与结合白细胞上的触发分子（例如T细胞受体分子（例如CD2、CD3、CD28或B7）或IgG的Fc受体的臂组合，以将细胞防御机制集中于表达特定抗原的细胞。双特异性抗体还可用于将细胞毒性剂针对表达特定抗原的细胞。这些抗体具有抗原结合臂和结合细胞毒性剂或放射性核素螯合剂（例如EOTUBE、DPTA、DOTA或TETA）的臂。制备双特异性抗体的技术为本领域公知(Millstein等人，1983,Nature 305:537-539;Brennan等人，1985,Science 229:81;Suresh等人，1986,Methods in Enzymol.121∶120;Traunecker等人，1991,EMBO J.10:3655-3659;Shalaby等人，1992,J.Exp.Med.175:217-225;Kostelny等人，1992,J.Immunol.148:1547-1553;Gruber等人，1994,J.Immunol.152:5368;以及美国专利5,731,168)。还考虑了具有超过两个原子价的抗体。例如，可制备三特异性抗体(Tutt等人，J.Immunol.147:60(1991))。因此，在某些实施方案中，CD37的抗体为多特异性。
在某些实施方案中，提供了用于例如增加肿瘤渗透性的抗体片段。已知用于产生抗体片段的多种技术。传统上，这些片段经对完整抗体进行蛋白水解消化而产生(例如，Morimoto等人，1993,Journal of Biochemical andBiophysical Methods 24:107-117;Brennan等人，1985,Science,229:81)。在某些实施方案中，重组产生抗体片段。Fab、Fv以及scFv抗体片段均可表达或分泌于大肠杆菌或其他宿主细胞，从而允许产生大量这些片段。这样的抗体片段还可从上文讨论的抗体噬菌体库分离。抗体片段还可为例如美国专利5,641,870中描述的直链抗体，且可为单特异性或双特异性。用于产生抗体片段的其他技术对于医学专业人员来说是显而易见的。
根据本发明，多种技术可适于产生CD37的特异性单链抗体（见，美国专利号4,946,778）。另外，多种方法可适于构建Fab表达库(Huse,等人，Science 246:1275-1281(1989))以使得快速和有效鉴定具有所需对于CD37的特异性的单克隆Fab片段或其衍生物、片段、类似物或同系物。可通过本领域的技术来治病抗体片段，包括但不限于(a)通过对于抗体分子进行胃蛋白酶消化产生的F(ab')2片段；(b)通过减少F(ab')2片段的二硫键而产生的Fab片段，(c)通过使用木瓜蛋白酶和还原剂来处理抗体而产生的Fab片段，以及(d)Fv片段。
修饰抗体以增加其血清半衰期也是合乎需要的，特别是在抗体片段的情况下。可通过下述方法实现这点，例如，通过对抗体片段中的合适区域进行突变而将结合补救受体的表位掺入抗体片段，或通过将表位掺入肽标签，然后将所述标签与抗体片段中末端或在中间融合（例如，通过DNA或肽合成）。
异缀合抗体也在本发明的范围内。异缀合抗体由两个共价连接的抗体组成。例如，这样的抗体已经被提出使免疫细胞靶向非期望的细胞（美国专利第4,676,980号）。考虑到了可使用合成蛋白质化学中已知的方法来体外制备抗体，博客涉及接头的那些。例如，可使用二硫键交换反应或通过形成硫醚键来构建免疫毒素。用于该目的的合适试剂的实例包括亚胺硫醇酯和甲基-4-巯基丁基酰亚胺酯。
对于本发明的目的，应理解修饰的抗体可包括提供了抗体与人CD37的多肽缔合的任何类型的可变区。关于这点，可变区可包括或衍生自可被诱导产生体液反应并产生针对所需肿瘤相关抗原的免疫球蛋白的任何类型的哺乳动物。这样，被修饰的抗体的可变区可为例如人、鼠、非人灵长类（例如，短尾猴、猕猴等）或狼来源。在一些实施方案中，被修饰的免疫球蛋白的可变区和恒定区均为人的。在其他实施方案中，相容的抗体的可变区（通常衍生自非人来源）可被工程化或特别修剪以改进结合特性或减轻分子的免疫原性。在该方面，用于本发明的可变区可为人源化或通过包含引入的氨基酸序列而改变。
在某些实施方案中，重链和轻链中的可变结构域可通过一种或多种CDR的至少部分取代和必要时通过部分框架区替换和序列改变而改变。尽管CDR可衍生自与框架区从中衍生的抗体相同的类或甚至亚类的抗体，但认为CDR可衍生自不同类别的抗体并可能衍生自不同物种的抗体。并非总是有必要使用供体可变区的完整CDR来替换所有CDR，以将一个可变结构域的抗原结合能力转变为另一可变结构域的抗原结合能力。相反，在一些情况下，仅需要转换对于维持抗原结合位点的活性必需的那些残基。考虑到美国专利号5,585,089、5,693,761以及5,693,762中提出的解释，通过实施常规实验或通过试验与误差试验来获得具有减轻的免疫原性的功能抗体很好地在本领域技术人员的能力范围内。
尽管对于可变区进行改变，但本领域技术人员应理解本发明的被修饰的抗体将包括下述抗体（例如，全长抗体或其免疫反应性片段），即，其中一个或多个恒定结构域的至少一个级分缺失或被改变以提供所需的生物化学特性，例如当与包含天然或未改变的恒定区的具有近似相同免疫原性的抗体相比时增加的肿瘤定位或减少的血清半衰期。在一些实施方案中，修饰的抗体的恒定区包含人恒定区。适于本发明的恒定区的修饰包括一个或多个结构域中一个或多个氨基酸的添加、缺失或取代。也就是说，本发明揭示的修饰的抗体可包含对于三个重链恒定结构域（CH1、CH2或CH3）的一个或多个和/或对于轻链恒定区(CL)的改变或修饰。在一些实施方案中，考虑到其中一个或多个结构域被部分或完全缺失的修饰的恒定区。在一些实施方案中，修饰的抗体包含结构域缺失的构建体或变体，其中CH2结构域被去除（ΔCH2构建体）。在一些实施方案中，缺失的恒定结构域被短氨基酸间隔区（例如，10个残基）取代，所述短氨基酸间隔区提供通常由所缺乏的恒定区赋予的一些分子柔性。
除了其构象，本领域中已知，恒定区介导几种效应子功能。例如，补体的C1组分与抗体结合激活补体系统。补体的激活在细胞病原体的调理和裂解中是重要的。补体的激活还刺激炎症反应，且还可涉及自身免疫超敏反应。另外，抗体经Fc区结合细胞，抗体Fc区上的Fc受体位点结合细胞上的Fc受体(FcR)。有多个对于不同类型抗体特异性的Fc受体，包括IgG(γ受体)、IgE(η受体)、IgA(α受体)以及IgM(μ受体)。抗体与细胞表面上的Fc受体结合触发了重要的和不同生物反应，包括对于抗体覆盖的颗粒的吞噬和破坏，免疫复合物的清除，杀伤细胞对于抗体覆盖的靶细胞的裂解（被称为抗体依赖性细胞介导的细胞毒性，或ADCC），炎症介质的释放，胎盘转移和免疫球蛋白产生的控制。
在某些实施方案中，CD37结合抗体提供了改变的效应子功能，而改变的效应子功能又影响所施用的抗体的生物学模式。例如，恒定区结构域的缺失或灭活（通过点突变或其他方式）可减弱循环修饰的抗体的Fc受体结合，从而增加肿瘤定位。在其他情况中，可以是，与本发明相一致的，恒定区修饰减弱补体结合并从而减少血清半衰期和缀合的细胞毒素的非特异性缔合。另外，恒定区的其他修饰可用于消除二硫键或寡糖部分，该二硫键或寡糖部分因增加的抗原特异性或抗体柔性而允许提高的定位。相似地，根据本发明对于恒定区的修饰可容易地使用很好地在本领域技术人员的技术范围内的公知的生物化学或分子工程技术来制备。
在某些实施方案中，作为抗体的CD37结合剂不具有一种或多种效应子功能。例如，在一些实施方案中，抗体不具有抗体依赖性细胞毒性(ADCC)活性和/或不具有补体依赖性细胞毒性(CDC)活性。在某些实施方案中，抗体不结合Fc受体和/或补体因子。在某些实施方案中，抗体不具有效应子功能。
应注意，在某些实施方案中，可将修饰的抗体进行工程化来将CH3结构域直接与各修饰抗体的绞链区融合。在其他构建体中，提供位于绞链区和修饰的CH2和/或CH3结构域之间的肽间隔区可以是合乎需要的。例如，合适的构建体可被表达，其中，CH2结构域已缺失，剩下的CH3结构域（修饰的或未修饰的）与具有5-20个氨基酸间隔区的绞链区连接。这样的间隔区可以被例如添加以保证恒定结构域的调节元件仍游离和易接近或保证铰链区仍具有柔性。然而，应注意，在一些情况下，氨基酸间隔区显示具有免疫原性且引发针对构建体的不想要的免疫反应。因此，在某些实施方案中，被添加至构建体的任何间隔区较不具有免疫原性，或甚至完全缺失，以维持修饰的抗体的所需的生物化学性质。
除了整个恒定区结构域缺失以外，应理解所提供的本发明的抗体可为少数或甚至单个氨基酸的部分缺失或取代。例如，在CH2结构域的缺失区域中单个氨基酸突变可足以基本上减弱Fc结合并由此增加肿瘤定位。相似地，仅使得调控待调节的效应子功能（例如，补体CLQ结合）的一个或多个恒定区结构域缺失可以是合乎需要的。这样的恒定区的部分缺失可改善抗体的选择的特性（血清半衰期），同时使得与受治疗者恒定区结构域相关的其他合乎需要的功能完整。另外，如上文提及的，所揭示的抗体的恒定区可通过对于一个或多个氨基酸进行突变或取代而修饰，这可提高所产生的构建体的特性。关于这方面，可能破坏保守结合位点（例如，Fc结合）提供的活性而同时基本上维持修饰的抗体的构象和免疫原性。某些实施方案可包括将一个或多个氨基酸添加至恒定区以提高合乎需要的特性，例如，减小或增加效应子功能或提供较多细胞毒素或碳水化合物附着。在这些实施方案中，插入或复制衍生自所选择的恒定区结构域的特异性序列是合乎需要的。
本发明还包括基本上与本发明提到的嵌合抗体、人源化抗体以及人抗体具有同源性的变体和等同物。这些含有，例如，保守性取代突变，即一个或多个氨基酸被相似的氨基酸取代。例如，保守性取代是指以相同通用分类中的另一氨基酸取代一种氨基酸，例如，以另一种酸性氨基酸取代一种酸性氨基酸，以另一种碱性氨基酸取代一种碱性氨基酸或由另一种中性氨基酸取代一种中性氨基酸。预期的保守性氨基酸取代为本领域公知。
本发明的多肽可以是包含针对人CD37的抗体或其片段的重组多肽、天然多肽或合成多肽。本领域将认识到，本发明的一些氨基酸序列可改变而不会对蛋白的结构或功能产生显著的影响。因此，本发明还包括显示出实质上活性的多肽变体，或其包括针对CD37蛋白的抗体或其片段的区域。这些突变包括缺失、插入、翻转、重复和类型置换。
多肽和类似物可进一步修饰以含有非蛋白通常部分的另外的化学部分。这些衍生的部分可改善蛋白的溶解度、生物半衰期或吸收。所述部分还可以降低或消除蛋白的任何期望的副作用等。这些部分的综述可在REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES,20th ed.,MackPublishing Co.,Easton,PA(2000)中找到。
本文中所述的分离的多肽可以通过本领域已知的任何合适的方法来制备。这些方法的范围包括从直接蛋白合成方法到构建编码分离的多肽序列的DNA序列，并且在合适的转化的宿主中表达那些序列。在一些实施方案中，DNA序列使用重组技术通过分离或合成编码目标野生型蛋白的DNA序列来构建。任选地，所述序列可通过定点突变来突变，以提供其功能类似物。例如参见Zoeller et al.,Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA81:5662-5066(1984)和美国专利No.4,588,585。
在一些实施方案中，编码目标多肽的DNA序列将通过化学合成使用寡核苷酸合成器来构建。这些寡核苷酸可基于期望的多肽的氨基酸序列并选择那些密码子来设计，所述密码子在宿主细胞中是有利的，在所述宿主细胞中将制备目标重组多肽。标准方法可应用于合成编码目标分离的多肽的分离的核苷酸序列。例如，完全氨基酸序列可用于构建反向翻译的基因。另外，可以合成含有核苷酸序列的DNA低聚物，所述核苷酸序列编码用于特定分离的多肽。例如，编码用于部分期望的多肽的一些小寡核苷酸可被合成，并然后连接。各个寡核苷酸典型地含有5'或3'突出端以用于互补装配。
在装配后(通过合成、定点突变或另外方法)，编码目标特定分离的多肽的多核苷酸序列将插入表达载体中，并且操作性地连接适于在期望的宿主中表达蛋白的表达控制序列。合适的装配可通过下列方式来证实：核苷酸测序、限制性映射和生物活性多肽在合适宿主中的表达。如本领域已知的，为了在宿主中获得高表达水平的转染的基因，基因必须操作性的连接在选择的表达宿主中具有功能的转录和翻译的达控制序列。
在某些实施方案中，重组表达载体用于扩增和表达编码针对人CD37的抗体或其片段的DNA。重组表达载体是可复制的DNA构建体，其具有编码抗-CD37抗体或其片段的多肽链的合成或cDNA-衍生的片段，其操作性地连接合适的转录和翻译的调节元件(衍生自哺乳动物、微生物、病毒或昆虫基因)。转录单元通常包括下列装配：(1)在基因表达中具有调节作用的一种或多种基因元件，例如转录启动子或增强子；(2)转录到mRNA中并翻译到蛋白中的结构或码序列；以及(3)合适的转录和反应引发和终止序列，如下面详细所述。这些调节元件可包括操纵基因序列以控制转录。可另外地引入的能力，其由复制源和选择基因赋予以促进转化体的识别。当它们功能上彼此关联时，DNA区操作性地连接。例如，信号肽(分泌前导序列)的DNA操作性地连接多肽的DNA，如果其表达为参与多肽分泌的前体；启动子操作性地连接编码序列，如果其控制序列的转录；或核糖体结合位点操作性地连接编码序列，如果其被定位以允许翻译。旨在用在酵母表达系统中的结构元件包括能够通过宿主细胞进行翻译的蛋白的细胞外分泌的前导序列。可选择地，如果在没有前导序列或运输序列的情况下表达重组蛋白，其可包括N-末端蛋氨酸残基。该残基可任选地随后从表达的重组蛋白切除以提供最终产物。
表达控制序列和表达载体的选择取决于宿主的选择。可以使用宽范围的表达宿主/载体的组合。用于真核宿主的有用表达载体包括例如包含来自SV40的表达控制序列的载体、牛乳头瘤病毒、腺病毒和细胞巨化病毒。细菌宿主的有用的表达载体包括已知的细菌质粒，例如来自Esherichia coli的质粒，包括pCR 1、pBR322、pMB9和它们的衍生物；更宽宿主范围的质粒、例如M13和丝状单链DNA噬菌体。
用于表达CD37-结合多肽或抗体(或CD37蛋白以用作抗原)的合适的宿主细胞包括原核细胞、酵母、昆虫或在合适的启动子控制下的高级真核细胞。原核细胞包括革兰氏阴性或革兰氏阳性有机体，例如E.coli或杆菌。高级真核细胞包括如下所示的哺乳动物源的建立的细胞系。也可以使用无细胞翻译体系。用于细菌、真菌、酵母和哺乳动物细胞宿主的合适的克隆和表达载体由Pouwels et al.所述(Cloning Vectors:A Laboratory Manual,Elsevier,N.Y．,1985)，并且其相关公开通过引用的方式并入。关于蛋白制备包括抗体制备的方法的另外的信息可以在例如美国专利公开No.2008/0187954、美国专利No.6,413,746和6,660,501、以及国际专利公开No.WO 04009823中找到，其均通过引用的方式全部并入本文中。
各种哺乳动物或昆虫细胞培养物系统也有利地用于表达重组蛋白。重组蛋白在哺乳动物细胞中的表达可进行，因为这些蛋白通常正确地折叠、合适地修饰、并且是完全功能性的。合适的哺乳动物宿主细胞系的例子包括猴肾细胞的COS-7系，其由Gluzman所述(Cell 23:175,1981)，和能够表达合适的载体的其他细胞系，包括例如L细胞,C127,3T3,中华仓鼠卵巢细胞(CHO),HeLa和BHK细胞系。哺乳动物表达载体可包含非转录的元件，例如复制源、连接待表达的基因的合适的启动子和增强子、以及其他5'或3'侧翼非转录的序列和5'或3'非翻译的序列例如必需核糖体结合位点、多腺苷酸化位点、剪接供体和受体位点、以及转录终止序列。在昆虫细胞中制备异源蛋白的杆状病毒系统由Luckow和Summers综述，Bio/Technology6:47(1988)。
由转化的宿主制备的蛋白可根据合适的方法来纯化。这些标准方法包括色谱法(例如离子交换、亲和和空间柱色谱法)、离心、差式溶解或通过用于蛋白纯化的任何其他标准技术。亲和标签例如六聚组氨酸、麦芽糖结合域、流感覆膜序列和谷胱甘肽-S-转移酶可附接蛋白以允许通过合适的亲和柱来容易地进行纯化。分离的蛋白还可以使用这些的技术来物理标准，所述技术例如蛋白质水解、核磁共振和x-射线结晶学。
例如，来自分泌重组蛋白到培养基中的系统的上清可使用市售蛋白浓缩过滤器例如Amicon或Millipore Pellicon超滤单元首先浓缩。在浓缩步骤后，所得浓缩物可应用于合适的纯化基质。可选择地，可以使用阴离子交换树脂，例如具有侧链二乙基氨基乙基(DEAE)基团的基质或基材。所述基质可以是丙烯酰胺、琼脂糖、葡萄聚糖、纤维素或通常应用在蛋白纯化中的其他类型。可选择地，可以使用阳离子交换步骤。合适的阳离子交换包括各种不溶性基质，包含磺基丙基或羧甲基。最后，可以使用一种或多种反相高效液相色谱法(RP-HPLC)步骤(其利用疏水性RP-HPLC介质例如具有侧链甲基或其他脂肪族基团的硅胶)来进一步纯化CD37-结合剂。上述纯化步骤的一些或全部以多种组合方式还可用于提供同源重组蛋白。
在细菌培养基中制备的重组蛋白可例如通过下列方式进行分离：初始从细胞沉淀物中提取，然后进行一次或多次浓缩，盐析。水性离子交换或空间排阻色谱法步骤。高效液相色谱法(HPLC)可用于最终的纯化步骤。在表达重组蛋白中使用的微生物细胞可通过任何常规方法来破坏，包括冻融循环、超声、机械破坏或使用细胞胞溶剂。
还包括本领域已知的用于纯化抗体和其他蛋白的方法，例如美国专利公开No.2008/0312425、2008/0177048和2009/0187005中所述的那些，其均通过引用的方式全部并入本文中。
在某些实施方案中，CD37-结合剂是非抗体的多肽。鉴定和制备高亲和性地结合蛋白靶的非抗体多肽的多种方法是本领域已知的。例如参见Skerra,Curr.Opin.Biotechnol.,18:295-304(2007),Hosse et al.,ProteinScience,15:14-27(2006),Gill et al.,Curr.Opin.Biotechnol.,17:653-658(2006),Nygren,FEBS J.,275:2668-76(2008),和Skerra,FEBS J.,275:2677-83(2008)，其均通过引用的方式全部并入本文中。在某些实施方案中，噬菌体显示技术用于鉴定/制备CD37-结合多肽。在某些实施方案中，多肽包含选自由下列构成的组的类型的蛋白支架：蛋白A、脂笼蛋白、纤维连接蛋白域、锚蛋白通用序列重复域和硫氧还蛋白。
在一些实施方案中，制剂是非蛋白分子。在某些实施方案中，制剂是小分子。用在鉴定非蛋白CD37-结合剂中的组合化学库和技术是本领域技术人员已知的。参见例如Kennedy et al.,J.Comb.Chem,10:345-354(2008),Dolle et al,J.Comb.Chem.,9:855-902(2007)和Bhattacharyya,Curr.Med.Chem.,8:1383-404(2001)，其均通过引用的方式全部并入本文中。在某些进一步实施方案中，制剂是碳水化合物、粘多糖、醣蛋白或蛋白多糖。
在某些实施方案中，制剂是核酸适体。适体是多核苷酸分子，其基于它们结合另外分子的能力来选择(例如来自随机或突变库)。在一些实施方案中，适体包含DNA多核苷酸。在某些可选择的实施方案中，适体包含RNA多核苷酸。在某些实施方案中，适体包含一种或多种修饰的核酸残基。产生和筛选用于结合蛋白的核酸适体的方法是是本领域熟知的。例如参见美国专利No.5,270,163,美国专利No.5,683,867,美国专利No.5,763,595,美国专利No.6,344,321,美国专利No.7,368,236,美国专利No.5,582,981,美国专利No.5,756,291,美国专利No.5,840,867,美国专利No.7,312,325,美国专利No.7,329,742,国际专利公开No.WO 02/077262,国际专利公开No.WO 03/070984,美国专利申请公开No.2005/0239134,美国专利申请公开No.2005/0124565和美国专利申请公开No.2008/0227735，其均通过引用的方式全部并入本文中。
III.免疫缀合物
本发明还涉及缀合物(本文中也称为免疫缀合物)，包含连接或缀合的药物或前药的本文中公开的抗-CD37抗体、抗体片段和它们的功能等效物。合适的药物或前药是本领域已知的。药物或前药可以是细胞毒素剂。用在本发明的细胞毒素的缀合物中的细胞毒素剂可以是任何这样的化合物，该化合物导致细胞死亡或诱导细胞死亡，或以一些方式降低细胞生存力，并且包括例如美登醇和美登醇类似物。其他合适的细胞毒素剂例如苯二氮卓类、紫杉烷、CC-1065、CC-1065类似物、倍癌霉素和倍癌霉素类似物、紫杉化合物例如刺孢霉素、多拉司他汀和多拉司他汀类似物包括auristatin、托马霉素衍生物、来普霉素衍生物、甲氨蝶呤、顺铂、卡铂、柔红霉素、阿霉素、长春新碱、长春碱、美法仓、丝裂霉素C、苯丁酸氮芥和吗啉代阿霉素。
这些缀合物可通过使用连接基团来制备，以使药物或前药连接至抗体或功能等效物。合适的连接基团是本领域熟知的，并且包括例如二硫化物基团、硫醚基、酸不稳定性基团、光不稳定性基团、肽酶不稳定性基团、和酯酶不稳定性基团。
药物或前药可以例如通过该二硫键连接抗-CD37抗体或其片段。接头分子或交联剂包含可和抗-CD37抗体或其片段反应的反应性化学基团。用于和细胞-结合剂反应的反应性化学基团可以是N-琥珀酰亚胺基酯和N-磺基琥珀酰亚胺基酯。另外，接头分子包含反应性化学基团，其可以是可和药物反应以形成二硫键的二硫吡啶基。接头分子包括例如N-琥珀酰亚胺基3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)(例如参见Carlsson et al.,Biochem.J,173:723-737(1978)),N-琥珀酰亚胺基4-(2-吡啶基二硫代)丁酸酯(SPDB)(例如参见美国专利No.4,563,304),N-琥珀酰亚胺基4-(2-吡啶基二硫代)2-磺基丁酸酯(磺基-SPDB)(参见美国公开No.20090274713),N-琥珀酰亚胺基4-(2-吡啶基二硫代)戊酸酯(SPP)(例如参见CAS注册号341498-08-6),2-亚氨基硫烷,或乙酰琥珀酸酸酐。例如，抗体或细胞结合剂可以使用交联试剂和含有游离或保护的巯基的抗体或细胞结合剂来修饰，并因此然后衍生，和二硫化物或含巯基的美登醇反应以制备缀合物。缀合物可以通过色谱法纯化，包括但不限于HPLC、空间排阻、吸附、离子交换和亲和捕获、渗析或切向流过滤。
在本发明的另一方面，抗-CD37抗体通过二硫键和聚乙二醇间隔物连接细胞毒素的药物以增强免疫缀合物的效价、溶解度或效力。这些可裂解亲水性接头在WO2009/0134976中有所描述。该接头设计的附加优点是抗体-药物缀合物的期望的高单体比例和最低聚集。该方面中具体涵盖通过二硫化物基团(-S-S-)连接的细胞-结合剂和药物的缀合物，其具有聚乙二醇间隔物((CH2CH2O)n=1-14)，药物负载数在2-8的较窄范围，这描述了其对于癌症细胞显示出相对较高有效的生物活性，并且具有高缀合率和高单体比例的期望的生物化学性能，同时具有最小蛋白聚集。
该方面中具体涵盖式(I)的抗-CD37抗体药物缀合物或式(I')的缀合物：
CB–[X1-(–CH2–CH2O–)n–Y–D]m    (I)
[D-Y-(–CH2–CH2O-)n–Xl]m-CB    (I')
其中:
CB表示抗-CD37抗体或片段;
D表示药物;
X表示通过硫醚键、酰胺键、氨基甲酸酯键或醚键附接细胞-结合剂的脂肪族、芳香族或杂环单元；
Y表示通过二硫键附接药物的脂肪族、芳香族或杂环单元；
l是0或1;
m是2至8的整数;以及
n是1至24的整数。
在一些实施方案中，m是2至6的整数。
在一些实施方案中，m是3至5的整数。
在一些实施方案中，n是2至8的整数。可选择地，如例如美国专利No.6,441,163和7,368,565中所公开的，药物可首选被修饰以引入适于和细胞-结合剂反应的反应性酯。这些含有活化的接头部分的药物和细胞-结合剂的反应提供了另一种制备细胞-结合剂药物缀合物的方法。美登醇还可以使用PEG连接基团连接抗-CD37抗体或片段，如例如美国专利6,716,821中所阐述。这些PEG非可裂解连接基团在水和非水溶剂中都是可溶的，并且可用于使一种或多种细胞毒素剂接合细胞结合剂。示例性PEG连接基团包括杂双官能PEG接头，其和细胞毒素剂和细胞结合剂在接头的相对端反应，其中在一端通过巯基或二硫化物基团，并且在另一端通过活性酯。作为使用PEG连接基团合成细胞毒素的缀合物的通常例子，再次参考美国专利6,716,821，其通过引用的方式并入本文中。合成开始于具有反应性PEG部分的一种或多种细胞毒素剂与细胞-结合剂的反应，从而导致各反应性PEG部分的末端活性酯被细胞结合剂的氨基酸残基所取代，从而产生含有通过PEG连接基团共价键合细胞结合剂的一种或多种细胞毒素剂的细胞毒素的缀合物。可选择地，细胞结合可使用双官能PEG交联剂修饰，以引入反应性二硫化物部分(例如吡啶基二硫化物),然后其可和含巯基的美登醇反应以提供缀合物。在另一方法中，细胞结合可使用双官能PEG交联剂修饰，以引入巯基部分，其可然后和含反应性二硫化物的美登醇(例如吡啶基二硫化物)反应以提供缀合物。
可制备具有非可裂解连接的抗体-美登醇缀合物。这些交联剂在现有技术中有所描述(参见美国公开No.20050169933)，并且包括但不限于N-琥珀酰亚胺基4-(马来酰亚胺基甲基)环己烷羧酸酯(SMCC)。在一些实施方案中，抗体使用诸如琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺基甲基)-环己烷-1-羧酸酯(SMCC),磺基-SMCC,马来酰亚胺苯甲酰-N-羟基琥珀酰亚胺酯(MBS),磺基-MBS或琥珀酰亚胺基-碘醋酸酯之类的交联试剂修饰，例如文献中所述，以引入1-10个反应性基团(Yoshitake et al,Eur.J.Biochem.,101:395-399(1979);Hashida et al,J.Applied Biochem.,56-63(1984);and Liuet al,Biochem.,18:690-697(1979))。修饰的抗体然后和含巯基的美登醇衍生物反应以制备缀合物。缀合物可通过凝胶过滤经过Sephadex G25柱或通过渗析或切向流过滤来纯化。修饰的抗体使用含巯基的美登醇(1至2摩尔当量/马来酰亚胺基)处理，并且抗体-美登醇缀合物通过下列方式进行纯化：经过Sephadex G-25柱凝胶过滤、在陶瓷羟基磷灰石柱上的色谱法、渗析或切向流过滤、或这些方法的组合。典型地，平均1-10美登醇/抗体连接。一种方法是使用琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺基甲基)-环己烷-1-羧酸酯(SMCC)修饰抗体以引入马来酰亚胺基，然后使修饰的抗体和含巯基的美登醇反应，从而得到硫醚-连接的缀合物。再次得到具有1至10个药物分子/抗体分子的缀合物。按照相同的方式制备抗体、抗体片段和其他蛋白的美登醇缀合物。
在本发明的另一方面中，CD37抗体通过非可裂解键经过中间PEG间隔物连接药物。合适的交联试剂包括形成药物和抗-CD37抗体或片段之间的接头的亲水性PEG链，这也是本领域熟知的，或者市售的(例如来自Quanta Biodesign,Powell,Ohio)。合适的含有PEG的交联剂还可以从市售PEG本身使用本领域技术人员已知的标准合成化学技术来合成。通过美国专利公开20090274713和WO2009/0134976中详细所述的方法，所述药物可和含双官能PEG交联剂反应，以得到下式Z–Xl–(-CH2-CH2-O-)n–Yp-D的化合物，其然后可和细胞结合剂反应以提供缀合物。可选择地，细胞结合可使用双官能PEG交联剂修饰以引入巯基-反应性基团(例如马来酰亚胺或卤代乙酰胺)，其然后可和含巯基的美登醇反应以得到缀合物。在另外的方法中，细胞结合可使用双官能PEG交联剂修饰，以引入巯基部分，所述巯基部分然后可和巯基-反应性美登醇(例如具有马来酰亚胺或卤代乙酰胺的美登醇)反应以得到缀合物。
因此，本发明的另外方面是式(II)或式(II')的抗-CD37抗体药物缀合物：
CB–[X1-(–CH2–CH2–O–)n–Yp–D]m    (II)
[D-Yp–(–CH2–CH2–O–)n–Xl]m-CB     (II')
其中，CB表示抗-CD37抗体或片段;
D表示药物;
X表示通过硫醚键、酰胺键、氨基甲酸酯键或醚键结合细胞-结合剂的脂肪族、芳香族或杂环单元；
Y表示通过共价键结合药物的的脂肪族、芳香族或杂环单元，所述共价键选自由下列构成的组：硫醚键、酰胺键、氨基甲酸酯键、醚键、胺键、碳-碳键和腙键；
l是0或1;
p是0或1;
m是2至15的整数;以及
n是1至2000的整数。
在一些实施方案中，m是2至8的整数;以及
在一些实施方案中，n是1至24的整数。
在一些实施方案中，m是2至6的整数。
在一些实施方案中，m是3至5的整数。
在一些实施方案中，n是2至8的整数。合适的含有PEG的接头的例子包括具有N-琥珀酰亚胺基酯或N-磺基琥珀酰亚胺基酯部分以和抗-CD37抗体或其片段反应的接头，以及具有基于马来酰亚胺-或卤代乙酰基的部分以和化合物反应的部分。PEG间隔物可通过本文中所述的方法引入本领域已知的任何交联剂中。
本文中公开的多种接头在美国专利公开No.20050169933和20090274713与在WO2009/0134976中详细描述，其内容全部通过引用的方式并入。
本发明包括下列方面，其中约2至约8个药物分子(″药物负载数")例如美登醇连接抗-CD37抗体或其片段，和更少或更多数量的药物连接至相同细胞结合剂的药物负载数的情况相比，缀合物的抗-肿瘤效果更有效。本文中使用的"药物负载数"是指可附接细胞结合剂(例如抗-CD37抗体或其片段)的药物分子(例如美登醇)的数量。在一个方面，可附接细胞结合剂的药物分子的数量可以为约2至约8(例如1.9,2.0,2.1,2.2,2.3,2.4,2.5,2.6,2.7,2.8,2.9,3.0,3.1,3.2,3.3,3.4,3.5,3.6,3.7,3.8,3.9,4.0,4.1,4.2,4.3,4.4,4.5,4.6,4.7,4.8,4.9,5.0,5.1,5.2,5.3,5.4,5.5,5.6,5.7,5.8,5.9,6.0,6.1,6.2,6.3,6.4,6.5,6.6,6.7,6.8,6.9,7.0,7.1,7.2,7.3,7.4,7.5,7.6,7.7,7.8,7.9,8.0,8.1)。可以使用N2’-脱乙酰基-N2’-(3-疏基-1-氧代丙基)-美登素(DM1)和N2’-脱乙酰基-N2’-(4-疏基-4-甲基-1-氧代戊基)美登素(DM4)。
因此，在一个方面，免疫缀合物包含1个美登醇/抗体。在另一方面，免疫缀合物包含2个美登醇/抗体。在另一方面，免疫缀合物包含3个美登醇/抗体。在另一方面，免疫缀合物包含4个美登醇/抗体。在另一方面，免疫缀合物包含5个美登醇/抗体。在另一方面，免疫缀合物包含6个美登醇/抗体。在另一方面，免疫缀合物包含7个美登醇/抗体。在另一方面，免疫缀合物包含8个美登醇/抗体。
在一个方面，免疫缀合物包含约1至约8个美登醇/抗体。在另一方面，免疫缀合物包含约2至约7个美登醇/抗体。在另一方面，免疫缀合物包含约2至约6个美登醇/抗体。在另一方面，免疫缀合物包含约2至约5个美登醇/抗体。在另一方面，免疫缀合物包含约3至约5个美登醇/抗体。在另一方面，免疫缀合物包含约3至约4个美登醇/抗体。
在一个方面，包含免疫缀合物的组合物具有平均约2至约8(例如1.9,2.0,2.1,2.2,2.3,2.4,2.5,2.6,2.7,2.8,2.9,3.0,3.1,3.2,3.3,3.4,3.5,3.6,3.7,3.8,3.9,4.0,4.1,4.2,4.3,4.4,4.5,4.6,4.7,4.8,4.9,5.0,5.1,5.2,5.3,5.4,5.5,5.6,5.7,5.8,5.9,6.0,6.1,6.2,6.3,6.4,6.5,6.6,6.7,6.8,6.9,7.0,7.1,7.2,7.3,7.4,7.5,7.6,7.7,7.8,7.9,8.0,8.1)个附接的药物分子(例如美登醇)/抗体。在一个方面，包含免疫缀合物的组合物具有平均约1至约8个药物分子(例如美登醇)/抗体。在一个方面，包含免疫缀合物的组合物具有平均约2至约7个药物分子(例如美登醇)/抗体。在一个方面，包含免疫缀合物的组合物具有平均约2至约6个药物分子(例如美登醇)/抗体。在一个方面，包含免疫缀合物的组合物具有平均约2至约5个药物分子(例如美登醇)/抗体。在一个方面，包含免疫缀合物的组合物具有平均约3至约5个药物分子(例如美登醇)/抗体。在一个方面，包含免疫缀合物的组合物具有平均约3至约4个药物分子(例如美登醇)/抗体。
在一个方面，包含免疫缀合物的组合物具有平均约2±0.5,约3±0.5,约4±0.5,约5±0.5,约6±0.5,约7±0.5或约8±0.5个附接的药物分子(例如美登醇)/抗体。在一个方面，包含免疫缀合物的组合物具有平均约3.5±0.5个药物分子(例如美登醇)/抗体。
抗-CD37抗体或其片段可通过下列方式来修饰：使双官能交联试剂和抗-CD37抗体或其片段反应，从而导致接头分子共价附接抗-CD37抗体或其片段。如本文中所使用的，"双官能交联试剂"是使细胞-结合剂共价连接药物例如本文中所述的药物的任何化学部分。在另外的方法中，一部分连接部分由药物提供。就此而言，药物包含连接部分，该连接部分是较大接头分子的一部分，所述接头分子用于使细胞-结合剂接合药物。例如，为了形成美登醇DM1，美登素的C-3羟基处的侧脸被修饰以具有游离的氢硫基(SH)。该硫化形式的美登素可以和修饰的细胞-结合剂反应以形成缀合物。因此，最终接头由两个组件装配而成，其中一个由交联试剂提供，而另一个由DM1的侧链提供。
药物分子还可以通过中间载体分子例如血清白蛋白而连接抗体分子。
如本文中所使用的，表述"连接细胞-结合剂"或"连接抗-CD37抗体或片段"是指缀合物分子包含通过合适的连接基团或其前体结合细胞-结合剂抗-CD37抗体或片段的至少一种药物衍生物。一种连接基团是SMCC。
在某些实施方案中，用在本发明中的细胞毒素剂是美登醇和美登醇类似物。合适的美登醇的例子包括美登醇和美登醇类似物的酯。包括抑制微管形成并对哺乳动物细胞具有高度毒性的任何药物，如美登醇和美登醇类似物那样。
合适的美登醇酯的例子包括具有修饰的芳香环的那些和在其他位置具有修饰的那些。这些合适的美登醇公开在美国专利No.4,424,219;4,256,746;4,294,757;4,307,016;4,313,946;4,315,929;4,331,598;4,361,650;4,362,663;4,364,866;4,450,254;4,322,348;4,371,533;5,208,020;5,416,064;5,475,092;5,585,499;5,846,545;6,333,410;7,276,497和7,473,796中。
在某些实施方案中，本发明的免疫缀合物利用含巯基的美登醇(DM1)，正式命名为N2’-脱乙酰基-N2’-(3-疏基-1-氧代丙基)-美登素，作为细胞毒素剂。DM1由下列结构式(III)来表示：
Figure BDA00002129651500611
在另一实施方案中，本发明的缀合物利用含巯基的美登醇N2’-脱乙酰基-N2’(4-甲基-4-疏基-1-氧代戊基)-美登素(例如DM4)作为细胞毒素剂。DM4由下列结构式(IV)来表示：
Figure BDA00002129651500612
另一美登醇包含含有空间位阻的巯基键的侧链，其是N2’-脱乙酰基-N-2’(4-疏基-1-氧代戊基)-美登素(称为DM3)，并且由下列结构式(V)来表示：
Figure BDA00002129651500621
美国专利No.5,208,020和7,276,497中教导的各美登醇也可用在本发明的缀合物中。就此而言，5,208,020和7,276,697的全部内容通过引用的方式并入。
美登醇上的多个位置可起到对连接部分进行化学连接的位置的作用。例如，具有羟基的C-3位、用羟基甲基修饰的C-14位、用羟基修饰的C-15位、和具有羟基的C-20位都预计是有用的。在一些实施方案中，C-3位起到对连接部分进行化学连接的位置的作用，在一些特定实施方案中，美登醇的C-3位起到对连接部分进行化学连接的位置的作用。
一些缀合物的结构示意图如下所示：
Figure BDA00002129651500622
Figure BDA00002129651500631
Figure BDA00002129651500641
Figure BDA00002129651500651
制备这些抗体-美登醇缀合物的一些描述提供在美国专利No.6,333,410,6,441,163,6,716,821和7,368,565中，其全部并入本文中。
通常，抗体在水性缓冲液中的溶液可和过量摩尔数的美登醇一起孵育，所述美登醇二硫化物部分(其具有反应性基团)。反应混合物可通过加入过量的胺(例如乙醇胺、牛磺酸等)淬火。美登醇-抗体缀合物然后可通过凝胶过滤纯化。
结合的美登醇分子数/抗体分子可通过分光光度计测量在252nm和280nm处的吸光度的比来确定。美登醇分子的平均数/抗体可例如为约1-10,2-5,3-4或约3.5。在一个方面，美登醇分子的平均数/抗体为约3.5±0.5。
蒽环霉素化合物以及衍生物、中间体及其修饰的版本还可用于制备抗-CD37免疫缀合物。例如，阿霉素、阿霉素衍生物、阿霉素中间体、和修饰的阿霉素可用在抗-CD37缀合物中。WO 2010/009124中所述的示例性化合物通过引用的方式全部并入本文中。这些化合物包括例如下式的化合物或其药学上可接受的盐：
Figure BDA00002129651500652
其中R1是氢原子、羟基或甲氧基，并且R2是C1-Cs烷氧基。
抗体和美登醇或其他药物的缀合物可被体外评价它们抑制各种不需要的细胞系的增殖的能力。例如，细胞系例如人淋巴瘤细胞系Daudi和人淋巴瘤细胞系Ramos可容易地用于评估这些化合物的细胞毒性。待评价的细胞可暴露于化合物4至5天，并且通过已知的方法在直接测试中测量细胞的存活分数。然后IC50值可从测试结果来计算。
根据本文中所述的一些实施方案，免疫缀合物可内化到细胞中。因此，免疫缀合物当其被CD37-表达细胞摄取或内化时可发挥治疗效果。在一些特定实施方案中，免疫缀合物包含通过可裂解接头连接细胞毒素剂的抗体、抗体片段或多肽，并且细胞毒素剂从抗体、抗体片段或多肽切除，其中其被CD37-表达细胞内化。
在一些实施方案中，免疫缀合物能够减小肿瘤体积。例如，在一些实施方案中，使用免疫缀合物治疗导致%T/C值小于约50%、小于约45%、小于约40%、小于约35%、小于约30%、小于约25%、小于约20%、小于约15%、小于约10%或小于约5%。在一些特定实施方案中，免疫缀合物可减小BJAB异种移植物模型和/或SU-DHL-4异种移植物模型中肿瘤尺寸。
在本发明的另一方面，siRNA分子而不是药物可连接本发明的抗体。siRNA可通过通常用于修饰寡核苷酸的方法(例如参见美国专利公开20050107325和20070213292)来连接本发明的抗体。因此，以其3’或5’-亚磷酰胺形式的siRNA可以和具有羟基官能度的交联剂的一个末端反应，以在siRNA和交联剂之间得到酯键。类似地，siRNA亚磷酰胺和具有末端氨基的交联剂的反应导致通过胺使交联剂连接至siRNA。可选择地，siRNA可通过标准化学方法来衍生化以引入巯基。该含巯基的siRNA可以和抗体反应，所述抗体已经被修饰以引入活性二硫化物或马来酰亚胺部分，从而制备可裂解或非可裂解缀合物。1-20个siRNA分子可通过该方法连接抗体。
III.多核苷酸
在某些实施方案中，本发明包括多核苷酸，该多核苷酸包括编码特异性结合CD37的多肽或这种多肽的片段的多核苷酸。例如，本发明提供包含核酸序列的多核苷酸，所述核酸序列编码人CD37的抗体或编码这种抗体的片段。本发明的多核苷酸可以为RNA形式或DNA形式。DNA包括cDNA、基因组DNA和合成DNA；并且可以是双链或单链的，并且如果是单链的话，可以是编码链或非编码(反义)链。
在某些实施方案中，多核苷酸被分离。在某些实施方案中，多核苷酸是基本上纯的。
本发明提供多核苷酸，所述多核苷酸包括编码多肽的多核苷酸，所述多肽包含选自由下列构成的组的序列：SEQ ID NO:4-120。
本发明还包括多核苷酸，所述多核苷酸包含选自下表7-10中示出的那些序列。
表7:可变重链多核苷酸序列
Figure BDA00002129651500671
Figure BDA00002129651500681
Figure BDA00002129651500691
表8:可变轻链多核苷酸序列
Figure BDA00002129651500692
Figure BDA00002129651500711
表9:全长重链多核苷酸序列
Figure BDA00002129651500721
Figure BDA00002129651500731
Figure BDA00002129651500741
Figure BDA00002129651500761
表10:全长轻链多核苷酸序列
Figure BDA00002129651500762
Figure BDA00002129651500771
还提供与SEQ ID NO:121-170具有至少约95%,至少约96%,至少约97%,至少约98%或至少约99%的序列同一性的多核苷酸。因此，在某些实施方案中，多肽包含(a)与SEQ ID NO:121-135或152-161具有至少约95%的序列同一性的多肽；和/或(b)与SEQ ID NO:136-151或162-170具有至少约95%的序列同一性的多肽。在某些实施方案中，多肽包含(a)具有SEQ IDNO:121-135或152-161的氨基酸序列的多肽；和/或(b)具有SEQ ID NO:136-151或162-170的氨基酸序列的多肽。
在一些实施方案中，多核苷酸编码由重组质粒DNAphuCD37-3LC(ATCC保藏编号PTA-10722,在2010年3月18日保藏于ATCC)编码的轻链，或与由phuCD37-3LC(PTA-10722)编码的轻链具有至少约85%、至少约90%、至少约95%或至少约99%同一性的轻链。在一些实施方案中，多核苷酸编码由重组质粒DNA phuCD37-3HCv.1.0(ATCC保藏编号PTA-10723,在2010年3月18日保藏于ATCC)编码的重链，或与由phuCD37-3HC v.1.0(PTA-10723)编码的重链具有至少约85%、至少约90%、至少约95%或至少约99%同一性的重链。在某些实施方案中，多核苷酸是重组质粒DNA phuCD37-3LC(PTA-10722)或重组质粒phuCD37-3HC v.1.0(PTA-10723)。
在某些实施方案中，多核苷酸包含用于融合在和多核苷酸相同的阅读框中的成熟多肽的编码序列，其例如辅助从宿主细胞表达和分泌多肽(例如前导序列，其起到分泌序列的作用以控制多肽从所述细胞的转运)。具有前导序列的多肽是前蛋白，并且可具有由宿主细胞切除以从多肽形成成熟的前导序列。多核苷酸还可编码用于前蛋白，所述前蛋白是成熟蛋白加另外的5'氨基酸残基。具有前序列的成熟蛋白是前蛋白，并且是蛋白的失活形式。在前序列切除时，活性成熟蛋白保留。
在某些实施方案中，多核苷酸包含用于融合在和标志物序列相同的阅读框中的成熟多肽的编码序列，其例如允许用于编码的多肽的纯化。例如，在细菌宿主的情况下，标志物序列可以是由pQE-9载体供应的六聚组氨酸标签，以提供融合标志物的成熟多肽的纯化，或者当使用哺乳动物宿主(例如COS-7细胞)时，标志物序列可以是衍生自流感血凝素蛋白的红血球凝集素(HA)标签。
本发明还涉及编码例如片段、类似物和衍生物的上述多核苷酸的变体。
多核苷酸变体可含有编码区、非编码区或两者中的改变。在一些实施方案中，多核苷酸变体含有的改变会产生沉默置换、添加或缺失，但不会改变编码的多肽的性能或活性。在一些实施方案中，因为遗传密码的简并，核苷酸变体通过沉默置换而制备。多核苷酸变体可出于多种原因而制备，例如优化用于特定宿主(对于优选通过细菌宿主例如E.coli的那些，改变人mRNA中的密码子)的密码子表达。
还提供包含本文中所述的多核苷酸的载体和细胞。
IV.使用方法和药物组合物
本发明的CD37-结合剂(包括抗体、免疫缀合物和多肽)用于多种应用中，包括但不限于治疗性治疗方法，例如癌症例如B细胞恶性肿瘤的治疗。在某些实施方案中，所述制剂可用于抑制肿瘤生长、诱导分化、减小肿瘤体积和/或降低肿瘤的致肿瘤性。使用方法可以是体外、离体或体内方法。在某些实施方案中，CD37-结合剂或抗体或免疫缀合物或多肽是其结合的人CD37的拮抗剂。
在一个方面，本发明的抗-CD37抗体和免疫缀合物可用于检测CD37在生物样品中的存在。如本文中所使用的，术语"检测"包括定量或定性检测。在某些实施方案中，生物样品包括细胞或组织。在某些实施方案中，这些组织包括相对于其他组织例如B细胞和/或B细胞相关的组织，以更高水平表达CD37的正常和/或癌性组织。
在一个方面，本发明提供检测CD37在生物样品在存在的方法。在某些实施方案中，所述方法包括在允许抗-CD37抗体结合CD37的条件下使生物样品接触抗-CD37抗体，并且检测是否在抗-CD37抗体和CD37之间形成络合。
在一个方面，本发明提供诊断和CD37的表达增加有关的紊乱的方法。在某些实施方案中，方法包括使试验细胞接触抗-CD37抗体;通过检测抗-CD37抗体与CD37的结合，经过试验细胞测定CD37的表达水平(定性或定量);以及比较经过试验细胞的CD37的表达水平和对照细胞(例如作为试验细胞的相同组织起源的正常细胞，或在可比得上这种正常细胞的水平下表达CD37的细胞)CD37的表达水平，其中和对照细胞相比经过试验细胞的CD37的更高水平的表达指示存在和CD37的表达增加有关的紊乱。在某些实施方案中，试验细胞得自怀疑具有和CD37的表达增加有关的紊乱的个体。在某些实施方案中，紊乱是细胞增殖紊乱，例如癌症或肿瘤。
在某些实施方案中，诊断或检测的方法例如上述那些，包括检测抗-CD37抗体与在细胞表面上表达的CD37的结合，或在得自在其比表面上表达CD37的细胞的膜制剂中的结合。在某些实施方案中，所述方法包括在允许抗-CD37抗体结合CD37的条件下使细胞接触抗-CD37抗体，并且检测是否在抗-CD37抗体和在细胞表面上的CD37之间形成络合。用于检测抗-CD37抗体和在细胞表面上表达的CD37之间的结合的示例性测试是"FACS"测试。
某些其他方法可用于检测抗-CD37抗体和CD37的结合。这些方法包括但不限于本领域熟知的抗原-结合测试，例如蛋白质印迹、放射性免疫测定、ELISA(酶联免疫吸附测定)、"夹心"免疫测定、免疫沉淀测定、荧光免疫测定、蛋白A免疫测定和免疫组织化学(IHC)。
在某些实施方案中，抗-CD37抗体被标记。标记包括但不限于直接检测的标记或部分(例如荧光、发色团、电子致密、化学发光和放射活性标记)以及例如通过酶反应或分子相互作用间接检测的部分例如酶或配体。
在某些实施方案中，抗-CD37抗体固定在不溶性基质上。固定必须使抗-CD37抗体与在溶液中保持游离的任何CD37分离。这常规通过下列方式来完成：在测定工序之前通过吸附至水不溶性基质或表面而使抗-CD37抗体不溶(Bennich et al.,美国专利No.3,720,760)，或通过共价偶联(例如使用戊二醛交联)，或通过在抗-CD37抗体和CD37之间形成络合后使抗-CD37抗体不溶(例如通过免疫沉淀)。
代替抗-CD37抗体或除了抗-CD37抗体，上述诊断或检测的实施方案中的任一种可使用本发明的免疫缀合物来进行。
在某些实施方案中，使用CD37-结合剂或拮抗剂(例如抗-CD37抗体)治疗的疾病是癌症。在某些实施方案中，所述癌症由CD37-结合剂(例如抗体)结合的CD37表达细胞来表征。
本发明提供治疗癌症的方法，包括向受试者(例如需要治疗的受试者)施用治疗有效量的CD37-结合剂。在某些实施方案中，癌症是B细胞恶性肿瘤。在某些实施方案中，癌症选自由下列构成的组：B细胞淋巴瘤，NHL，前B细胞成淋巴细胞白血病/淋巴瘤和成熟B细胞新生物，B细胞慢性淋巴细胞白血病(CLL)/小淋巴细胞白血病(SLL)，B细胞前淋巴细胞白血病，淋巴浆细胞淋巴瘤，外套细胞淋巴瘤(MCL)，滤泡性淋巴瘤(FL)，低度、中度以及高度(FL)，皮肤滤泡性淋巴瘤，缘区B细胞淋巴瘤，MALT型缘区B细胞淋巴瘤，结节缘区B细胞淋巴瘤，脾型缘区B细胞淋巴瘤，毛细胞性白血病，弥漫性大B细胞淋巴瘤，伯基特淋巴瘤，浆细胞瘤，浆细胞性骨髓瘤，移植后淋巴增生性障碍，沃尔登斯特伦氏氏巨球蛋白血症，以及间变大细胞淋巴瘤(ALCL)。在某些实施方案中，受试者是人。
本发明还提供使用本文中所述的抗体或其他制剂来抑制肿瘤生长的方法。在某些实施方案中，抑制肿瘤生长的方法包括使细胞体外接触CD37-结合剂(例如抗体)。例如表达CD37的无限细胞系或癌症细胞系在培养基中进行培养，所述培养基中加入抗体或其他制剂来抑制肿瘤生长。在一些实施方案中，肿瘤细胞分离自患者样品例如组织生物切片、胸膜积液或血液样品，并且在培养基中进行培养，所述培养基中加入CD37-结合剂来抑制肿瘤生长。
在一些实施方案中，抑制肿瘤生长的方法包括使肿瘤或肿瘤细胞体内接触CD37-结合剂(例如抗体)。在某些实施方案中，使肿瘤或肿瘤细胞接触CD37-结合剂在动物模型中进行。例如CD37-结合剂可施用至表达一种或多种CD37的异种移植物，所述CD37已经在无免疫应答的小鼠(例如NOD/SCID小鼠)中生长以抑制肿瘤生长。在一些实施方案中，癌症干细胞分离自患者样品例如组织生物切片、胸膜积液或血液样品，并且注射到无免疫应答的小鼠中，所述小鼠然后被施用CD37-结合剂以抑制肿瘤细胞生长。在一些实施方案中，CD37-结合剂在将生瘤的细胞引入动物中以抑制肿瘤生长的同时或短暂之后被施用。在一些实施方案中，CD37-结合剂在生瘤的细胞已经生长至特定尺寸后被施用作为治疗剂。
在某些实施方案中，抑制肿瘤生长的方法包括向受试者施用治疗有效量的CD37-结合剂。在某些实施方案中，受试者是人。在某些实施方案中，受试者具有肿瘤或已经使肿瘤移除。
在某些实施方案中，肿瘤表达CD37-结合剂或抗体结合的CD37。在某些实施方案中，肿瘤过度表达人CD37。
另外，本发明提供在受试者中降低肿瘤生瘤性的方法，包括向受试者施用治疗有效量的CD37-结合剂。在某些实施方案中，肿瘤包含癌症干细胞。在某些实施方案中，癌症干细胞在肿瘤中的频率通过施加所述制剂而降低。
本发明还包括将生瘤的细胞分化到非生瘤的细胞中的方法，包括使生瘤的细胞和CD37-结合剂接触，例如通过下列方法来进行：向受试者中施用CD37-结合剂，所述受试者具有肿瘤(包括生瘤的细胞)或已经使这种肿瘤移除。
还提供本文中所述的CD37-结合剂、多肽或抗体在诱导细胞包括但不限于肿瘤细胞的分化中的用途。例如诱导细胞分化的方法包括设想使细胞和有效量的本文中所述的CD37-结合剂(例如抗-CD37抗体)接触。还提供在受试者的肿瘤中诱导细胞分化的方法，包括向受试者施加治疗有效量的CD37-结合剂、多肽或抗体。在某些实施方案中，肿瘤是胰腺肿瘤。在某些其他实施方案中，肿瘤是结肠肿瘤。在一些实施方案中，治疗方法包括向受试者施加治疗有效量的CD37-结合剂、多肽或抗体。
本发明还提供药物组合物，包含本文中所述的一种或多种CD37-结合剂。在某些实施方案中，药物组合物还包含药学上可接受的载体。这些药物组合物发现在抑制肿瘤生长和治疗人患者中的癌症的用途。
在某些实施方案中，通过联合本发明的纯化的抗体或试剂和药学上可接受的载体(例如载体、赋形剂)(Remington,The Science and Practice ofPharmacy 20th Edition Mack Publishing,2000)制备制剂以用于储存和使用。合适的药学上可接受的载体包括但不限于非毒性缓冲盐，例如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；盐例如氯化钠；抗氧化剂，包括抗坏血酸和蛋氨酸；防腐剂(例如十八烷基二甲基苄基氯化铵;氯己双铵;苯扎氯铵;苄索氯铵;苯酚,丁基或苄基醇;烷基苯甲酸酯例如甲基或丙基苯甲酸酯;儿茶酚;间苯二酚;环己醇;3-戊醇;和间甲酚);低分子量多肽(例如少于约10个氨基酸残基);蛋白例如血清白蛋白,明胶,或免疫球蛋白;亲水性聚合物例如聚乙烯吡咯烷酮;氨基酸例如 甘氨酸,谷氨酰胺,天冬酰胺,组氨酸,精氨酸,或赖氨酸;碳水化合物例如单糖、二糖、葡萄糖、甘露糖或糊精;螯合剂例如EDTA;糖例如蔗糖,甘露醇,海藻糖或山梨糖;成盐配对离子例如钠;金属络合物(例如Zn-蛋白络合物);和非离子表面活性剂例如TWEEN或聚乙二醇(PEG)。
本发明的药物组合物可以以任意数量的方式来施用以用于局部或系统治疗。施用可以是局部的(例如施用至粘膜包括阴道和直肠递送)例如透皮贴片、油膏剂、涂剂、霜剂、凝胶、滴剂、栓剂、喷雾剂、液体和粉末;肺部施用(例如通过粉末或气溶胶的吸入或喷射,包括通过喷雾器来进行;气管内,鼻内,表皮和透皮);口服;或胃肠外，包括静脉内,动脉内,皮下,腹膜内或肌肉内注射或或输注;或颅内(例如鞘内或心室内)施用。
本发明的抗体或免疫缀合物可以和具有抗癌性能的第二化合物联合在药物联合制剂中或作为联合疗法进行给药方案。药物联合制剂或给药方案的第二化合物可对于联合的ADC具有补充活性，使得它们不会彼此产生不利的影响。还提供包含CD37-结合剂和第二抗癌剂的药物组合物。如CD37-结合剂可联合CD20拮抗剂例如利妥昔单抗施用。
为了治疗疾病，本发明的抗体或制剂的合适给药取决于待治疗的疾病的类型、疾病的严重性和期限、疾病的响应性，而不论抗体或制剂是为了治疗还是预防目的施用、之前疗法、患者的临床史等，所有都任凭治疗医生决定。抗体或试剂可从数天至数月的持续内施用一次或一系列治疗，或直到治疗产生效果或实现疾病状态的减轻(例如减小肿瘤尺寸)。最优给药方案可从药物在患者体内累积的测量值来计算，并且取决于单独抗体或试剂的相对效力而改变。给药医师可容易地确定最佳剂量、给药方法和重复速率。在某些实施方案中，剂量为0.01μg至100mg/kg体重，并且可给予每日、每周、每月或每年一次或多次。在某些实施方案中，抗体或其他CD37-结合剂给予每两周一次或每三周一次。在某些实施方案中，抗体或其他CD37-结合剂的剂量为约0.1mg至约20mg/kg体重。治疗医生可基于测量的停留时间和药物在机体流体或组织中的浓度来估计用于给药的重复速率。
组合疗法可提供"协同作用"并证实"协同作用的"，即当活性成分联合使用时实现的效果大于源自单独使用化合物的效果的总和。当活性成分是下列情况时可以达到协同效果：(1)在联合的单元剂量制剂中共同配制和施用或同时递送;(2)通过交替或作为单独制剂平行的方式来递送;或(3)通过一些其他方案。当以交替疗法递送时，当化合物例如在单独注射器中通过不同注射而依次施用或递送时可以达到协同效果。通常，在交替疗法的过程中，各活性成分的有效剂量依次即连续地施用，而在联合疗法中，有效剂量的两种或多种活性成分同时施用。
VI.包含CD37结合剂的试剂盒
本发明提供包含本文中所述的抗体、免疫缀合物或其他制剂的试剂盒，并且其可用于进行本文中所述的方法。在某些实施方案中，试剂盒包含在一个或多个容器中针对CD37的至少一种纯化的抗体。在一些实施方案中，试剂盒含有所有这样的组件，所述组件必需和/或足以进行检测测定，包括用于进行测定的所有对照、指导、和用于分析和展示结果的任何必需的软件。本领域技术人员将容易地认识到，本发明公开的抗体、免疫缀合物或其他制剂可容易地引入本领域熟知的建立的试剂盒格式中的一种中。
还提供包含CD37-结合剂(例如CD37-结合抗体)和第二抗癌剂的试剂盒。在某些实施方案中，第二抗癌剂是化学治疗剂(例如利妥昔单抗).
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通过参照下列非限制性例子可进一步定义本公开的实施方案，其详细描述了本公开的某些抗体的制备和使用本公开的抗体的方法。本领域技术人员将明白，在不偏离本公开的范围的情况下可对材料和方法进行多种修改。
实施例
应理解，本文中所述的实施例和实施方案是仅用于示意性目的的，并且根据其的各种修改或改变将建议给本领域技术人员，并且包括在该申请的精神和范围内。
细胞系和生长
Figure BDA00002129651500851
所有细胞系在RPMI-1640培养基中、在37°C下在加湿5%CO2孵育器中生长，所述培养基补充10%胎牛血清、2mM谷氨酰胺和1%青霉素-链霉素(所有试剂来自Invitrogen)。细胞通过每周二次稀释到新鲜培养基中而传代，并且保持为0.2至1x106细胞/ml。
实施例1
鼠CD37抗体的制备
构建表达质粒pSRa-CD37，其含有侧翼为XbaI和BamHI限制性内切位点的全部CD37编码序列(CDS)，这允许人CD37的表达。300-19细胞，一种衍生自Balb/c小鼠的前B细胞系(M.G.Reth et al.1985,Nature,317:353-355)，使用该表达质粒转染以稳定地在细胞表面上表达高水平的人CD37，并且用于免疫Balb/c VAF小鼠。每2-3周通过ImmunoGen,Inc.使用的标准免疫方案使用约5x106CD37-表达300-19细胞/小鼠来进行小鼠皮下免疫。免疫的小鼠在被牺牲以用于杂种瘤生殖之前三天用另一剂量的抗原来进行加强。根据标准动物方案来收集来自小鼠的脾脏，并且放置在两块无菌磨砂显微镜载玻片之间，以获得在RPMI-1640培养基中的单一细胞混悬。将脾细胞粒状沉淀，洗涤，并通过使用聚乙二醇-1500(Roche 783 641)和鼠骨髓瘤P3X63Ag8.653细胞融合(J.F.Kearney et al.1979,J Immunol,123:1548-1550)。将融合细胞重悬浮在含有次黄嘌呤-氨基蝶呤-胸苷(HAT)(Sigma H-0262)的RPMI-1640选择培养基中，并且选择用于在37°C下和5%CO2在96-孔平底培养板(Corning-Costar 3596,200μL的细胞混悬液/孔)中生长。在孵育5天后，将100μL的培养上清从各孔中移除，并且用100μL的RPMI-1640培养基来代替，所述培养基含有次黄嘌呤-胸苷(HT)补充物(Sigma H-0137)。继续在37°C下和5%CO2的孵育，直到杂种瘤克隆准备用于抗体筛选。还可以使用免疫和杂种瘤制备的其他技术，包括J.Langone and H.Vunakis(Eds.,Methods in Enzymology,Vol.121,"Immunochemical Techniques,Part I";Academic Press,Florida)和E.Harlowand D.Lane("Antibodies:A Laboratory Manual";1988;Cold Spring HarborLaboratory Press,New York)中所述的那些。
杂种瘤筛选和选择
来自杂种瘤的培养上清通过流式细胞术筛选以用于分泌小鼠单克隆抗体，所述抗体结合CD37-表达300-19细胞，但不结合非转染的300-19细胞。将100μl的杂种瘤上清和CD37-表达300-19细胞或非转染的300-19细胞(1x105细胞/样品)在100μLFACS缓冲液(RPMI-1640培养基，补充2%正常山羊血清)中孵育3h。然后，将细胞粒状沉淀，洗涤，并且和100μL的PE-缀合的山羊抗-小鼠IgG-抗体(Jackson Laboratory,在FACS缓冲液中6μg/mL)孵育1h。再次将细胞粒状沉淀，使用FACS缓冲液洗涤，并且重悬浮在200μL的含有1%的甲醛的PBS中。使用具有HTS多孔取样器或FACS阵列流式细胞仪的FACSCalibur流式细胞仪来获取样品，并且使用CellQuest Pro(都来自BD Biosciences,San Diego,US)来进行分析。
测试阳性的杂种瘤克隆通过有限稀释被亚克隆。一种来自各杂种瘤的亚克隆(通过流式细胞术这显示出和亲本细胞相同的针对CD37的反应性)被选择用于随后的分析。稳定的亚克隆被培养，并且各分泌的抗-CD37抗体的同种型使用市售同种型试剂(Roche 1493027)来鉴定。
在该研究器件内进行总共45个单独的融合试验。单一融合试验惯例产生约200至1000个杂种瘤克隆。通过流式细胞术筛选所有所得杂种瘤克隆用于CD37结合，并且总共184个杂种瘤克隆显示出对于CD37的特异性结合。
抗体纯化
使用标准方法例如蛋白A或G色谱法(HiTrap蛋白A或G HP，1mL,Amersham Biosciences)将抗体从杂种瘤亚克隆上清纯化。简言之，通过加入1/10体积的1M Tris/HCl buffer,pH 8.0，上清被准备用于色谱法。将pH-调节的上清通过0.22μm过滤膜过滤，并且上载到使用结合缓冲液(PBS,pH7.3)平衡的柱上。将柱用结合缓冲液洗涤，直到获得稳定的基线，并且在280nm处无吸收。使用含有0.15M NaCl的0.1M乙酸缓冲液(pH 2.8)、利用0.5mL/min的流速来洗脱抗体。收集约0.25mL的部分，并且通过加入1/10体积的1M Tris/HCl,pH 8.0来中和。将峰值部分针对1x PBS整夜透析两次，并且通过0.2μm过滤膜过滤来灭菌。通过在A280的吸光度来定量纯化的抗体。
蛋白A纯化的部分使用离子交换色谱法(IEX)利用季铵(Q)色谱法进一步精制以用于鼠抗体。简言之，来自蛋白A纯化的样品被缓冲液交换到结合缓冲液(10mM Tris,10mM氯化钠,pH 8.0)中，并且通过0.22μm过滤器过滤。然后，制备的样品以120cm/hr的流速上载到用结合缓冲液平衡的Q快速流动树脂(GE Lifesciences)上。柱的尺寸被选择为具有足够的能力以结合样品中所有的MAb。然后将柱用结合缓冲液洗涤，直到获得稳定的基线，并且在280nm处无吸收。通过初始化在20柱体积(CV)中10mM至500mM氯化钠的梯度来洗脱抗体。基于在280nm(A280)处测量的吸光度来收集峰值部分。使用空间排阻色谱法(SEC)在具有SWXL guard柱,6.0×40mm(Tosoh Bioscience,Montgomeryville,PA)的TSK凝胶G3000SWXL,7.8×300mm上、利用Agilent HPLC 1100system(Agilent,Santa Clara,CA)来估计单体的百分率。将单体含量高于95%的部分集中，并且使用TFF体系缓冲液交换至PBS(pH 7.4)，然后通过0.2μm过滤膜过滤来灭菌。纯化的抗体的IgG浓度使用1.47的消光系数通过A280来确定。可替换的方法例如陶瓷羟基磷灰石(CHT)也用于精制抗体具有良好的选择性。利用用于IEX色谱法所述的类似的方案来使用具有40μm粒径的II型CHT树脂(Bio-RadLaboratories)。用于CHT的结合缓冲液对应于20mM磷酸钠,pH 7.0，并且抗体在20CV上使用20-160mM磷酸钠的梯度来洗脱。
实施例2
通过流式细胞术进行结合表征
通过流式细胞术使用纯化的抗体来测试结合特异性。FACS柱状图证实muCD37-3,muCD37-12,muCD37-38,muCD37-50,muCD37-51,muCD37-56和muCD37-57结合CD37-表达300-19细胞，并且在图1和图2中示出缺乏与亲本300-19细胞的结合。所有鼠抗体和CD37-表达300-19细胞或非转染的300-19细胞(1x105细胞/样品)在100μLFACS缓冲液(RPMI-1640培养基，补充2%正常山羊血清)中孵育3h。然后，将细胞粒状沉淀，洗涤，并且和100μL的FITC-缀合的山羊抗-小鼠IgG-抗体(JacksonLaboratory,在FACS缓冲液中6μg/mL)孵育1h。再次将细胞粒状沉淀，使用FACS缓冲液洗涤，并且重悬浮在200μL的含有1%的甲醛的PBS中。使用具有HTS多孔取样器或FACS阵列流式细胞仪的FACSCalibur流式细胞仪来获取样品，并且使用CellQuest Pro(都来自BD Biosciences,San Diego,US)来进行分析。
和muCD37-3,muCD37-12,muCD37-38,muCD37-50,muCD37-51,muCD37-56或muCD37-57孵育的CD37-表达300-19细胞的FACS柱状图显示出荧光偏移，而亲本300-19细胞则不会。此外，当细胞系仅和FITC-缀合的山羊抗-小鼠IgG-抗体单独孵育时，未检测到明显的荧光偏移(图1的底部)。
为了证实抗体也可以结合内生地表达的CD37，使用CD37-阳性WSU-DLCL-2淋巴瘤细胞和muCD37-3,muCD37-12,muCD37-8,muCD37-10或muCD37-14抗体来进行结合试验。将WSU-DLCL-2细胞和改变浓度的鼠抗体孵育，并如上所述处理用于流式细胞术分析。数据分析使用CellQuest Pro(BD Biosciences,San Diego,US)来进行，并且对于各样品，FL1的平均荧光强度(MFI)输出，并且在半-log图中针对抗体浓度绘制(图3)。通过非线性回归来产生剂量-响应曲线，并且各曲线的EC50值，其对应于各抗体的表观解离常数(Kd)，使用GraphPad Prism v4(GraphPad软件,San Diego,CA)来计算。对于所有测试的抗体都观察到荧光的强烈偏移，并且Kd值分别对应于0.52nM,1.7nM,2.7nM,1.1nM或0.91nM的muCD37-3,muCD37-8,muCD37-10,muCD37-12或muCD37-14抗体。
同样，当CD37-阳性BJAB淋巴瘤细胞用于上述相同的流式细胞术测定时，也观察到强烈结合。如上所述计算Kd值，并且分别对应于0.2nM,0.4nM,0.6nM,0.4nM和1nM的muCD37-3,muCD37-38,muCD37-50,muCD37-51,muCD37-56和muCD37-57。
实施例3
鼠抗体的促凋亡活性
鼠抗-CD37抗体诱导Ramos和Raji淋巴瘤细胞系的细胞凋亡。在使用膜联蛋白-V(Invitrogen)的FITC缀合物和使用TO-PRO-3(Invitrogen)染色后，通过流式细胞术分析来测量细胞凋亡的程度。在健康正常的细胞中，磷脂酰丝氨酸表达在细胞膜双层的内部，磷脂酰丝氨酸从质膜的内部小叶转移至外部小叶是一种细胞凋亡的最早可检测的信号。膜联蛋白V结合外部上的磷脂酰丝氨酸，但在完整细胞的细胞膜双层的内部上不是这样。因此，膜联蛋白V结合的程度是诱导细胞凋亡的指示。TO-PRO-3是单体菁核酸染色剂，其仅当膜的完整性破坏时(发生在细胞凋亡的后期)才可穿透质膜。在双色流式细胞术中鉴别三种种群的细胞：非-细胞凋亡的细胞(膜联蛋白-V阴性和TO-PRO-3阴性)、早期细胞凋亡的细胞(膜联蛋白-V阳性和TO-PRO-3阴性)和坏死细胞或晚期细胞凋亡的细胞(膜联蛋白-V阳性和TO-PRO-3阳性)。
以指数方式生长的细胞在24-孔板中的RMPI-1640培养基中以约2x105细胞/mL平板接种，所述培养基补充10%胎牛血清(FBS),2mM L谷氨酰胺和50μg/mL庆大霉素(下文中称为完全RMPI-1640培养基)。细胞通常生长在完全RMPI-1640培养基中，除非另有说明。细胞和10nM的抗-CD37抗体在37°C下在加湿5%CO2孵育器中孵育20至24h。然后将细胞粒状沉淀，使用500μl PBS洗涤两次，重悬浮在100μL结合缓冲液(10mM Hepes-NaOH,pH 7.4,140mM NaCl,2.5mM CaCl2)中，使用5μL的膜联蛋白V-FITC在冰上染色15min。然后，将具有1μM的TO-PRO-3的400μL的结合缓冲液加入混合物中，并且通过流式细胞术立即测量FITC和TO-PRO-3的细胞-相关的荧光度。对于各样品收集五千个事件。使用BD CellQuest软件来产生TO-PRO-3(FL4-H;y-轴)和膜联蛋白V-FITC的荧光度(FL1-H;x-轴)的散点图。
从这些图测定各样品的膜联蛋白-V阳性细胞(包括TO-PRO-3阳性和阴性细胞)的百分率，并且对于Ramos细胞示于图4中。分离自我们抗体筛选的数种抗体被测试和利妥昔单抗相比的促凋亡活性。未预料到的是，一些分离的鼠抗-CD37抗体例如muCD37-3和muCD37-12显示出非常强的促凋亡活性。约39%的暴露于muCD37-3的Ramos细胞和46%的暴露于muCD37-12的Ramos细胞是膜联蛋白-V阳性。相反，使用抗-CD20抗体利妥昔单抗处理导致只有13%的膜联蛋白-V阳性细胞，而未处理的对照样品含有5%膜联蛋白-V阳性细胞。分离的鼠抗-CD37抗体中的一些不显示出任何促凋亡活性。例如，相比于未处理的细胞，使用muCD37-8,muCD37-10或muCD37-14处理Ramos细胞导致膜联蛋白-V阳性的百分率微小增加或不增加。这是尽管它们的与CD37的可比得上的结合亲和性，如图3中可见。
另外的抗体被分离和筛选它们在Ramos细胞中诱导细胞凋亡的能力。在多种分离的以高亲和性结合CD37的抗体中，只有一些具有促凋亡活性。膜联蛋白-V测定的结果示于图4B。鼠抗体muCD37-38,muCD37-50,muCD37-51,muCD37-56和muCD37-57能够诱导细胞凋亡，并导致38–45%的膜联蛋白-V阳性Ramos细胞，相比的是在未处理的对照样品中为5%。类似于之前的测试，使用抗-CD20抗体利妥昔单抗处理导致只有18%的膜联蛋白-V阳性细胞。
另外，鼠抗体被测试它们在Raji淋巴瘤细胞中诱导细胞凋亡的能力。如对于Ramos细胞所观察的，在多种分离的以高亲和性结合CD37的抗体中，只有一些具有促凋亡活性。使用muCD37-3或muCD37-12处理分别导致36%或49%的膜联蛋白-V阳性细胞。相反，使用抗-CD20抗体利妥昔单抗处理导致只有20%的膜联蛋白-V阳性细胞，而未处理的对照样品含有4%的膜联蛋白-V阳性细胞。
同样，相比较于15%的未处理的细胞，使用muCD37-3,muCD37-38,muCD37-50,muCD37-51,muCD37-56或muCD37-57处理的约60%的Raji细胞是膜联蛋白-V阳性细胞。
实施例4
增殖测试
抗-CD37抗体抑制细胞生长的能力使用体外细胞毒性测试来测量。将靶细胞以5,000细胞/孔平板接种在100μL的完全RPMI培养基中(RPMI-1640,10%胎牛血清,2mM谷氨酰胺,1%青霉素-链霉素,所有试剂来自Invitrogen)。使用3-倍稀释系列将抗体稀释到完全RPMI培养基中，并且每孔加入100μL。最终浓度典型地为3x 10-8M至4.6x 10-12M。将细胞在37°C下在加湿5%CO2孵育器中孵育4至5天。保留细胞的生存力通过比色WST-8测定(Dojindo Molecular Technologies,Inc.,Rockville,MD,US)来确定。WST-8通过活细胞中的脱氢酶还原成在组织培养基中可溶的橙色甲臜产物。甲臜产物的量直接成比例于活细胞的数量。将WST-8加入10%的最终体积中，并且将板在37°C下在加湿5%CO2孵育器中孵育另外2-4小时。通过在多孔板读取器中测量450nm(A450)处的吸光度来分析板。具有培养基和WST-8的孔的背景A450吸光度仅从所有值中减去。%生存力通过使各处理的样品值除以具有未处理的细胞的孔的平均至来计算。%生存力=100*(A450处理的样品–A450背景)/(A450未处理的样品–A450背景)。对于各处理在半-log图中，%生存力值针对抗体浓度绘制。
来自使用鼠CD37抗体和SU-DHL-4淋巴瘤细胞的典型增殖测试的结果展示于图5。明显的是数种鼠抗体能够基本上和以剂量依赖性方式抑制SU-DHL-4细胞的增殖，而其他者没有这种效果。例如，在测试的最高抗体浓度下，使用muCD37-3处理降低细胞生存力至34%，EC50为0.17nM。类似地，在测试的最高抗体浓度下，使用muCD37-38降低细胞生存力至25%，EC50为0.19nM。同样，在测试的最高抗体浓度下，使用muCD37-50或muCD37-51处理降低细胞生存力至38%，EC50分别为0.25nM或0.5nM。相反，使用例如CD37-16处理不会以剂量依赖性方式降低细胞生存力。
实施例5
CD37-3抗体的VL和VH区的克隆和测序
根据制造商的方案，使用RNeasy试剂盒(QIAgen)从CD37-3杂种瘤的5x 106细胞来制备总细胞RNA。cDNA随后从总RNA使用SuperScript IIcDNA合成试剂盒(Invitrogen)合成。
在衍生自杂种瘤细胞的cDNA上进行第一轮简并PCR反应的步骤基于Wang et al.((2000)J Immunol Methods.233:167-77)和Co et al.((1992)JImmunol.148:1149-54)中所述的方法。VH序列通过PCR使用下列简并引物来扩展：EcoMH1 CTTCCGGAATTCSARGTNMAGCTGSAGSAGTC(SEQ ID NO:171),EcoMH2 CTTCCGGAATTCSARGTNMAGCTGSAGSAGTCWGG(SEQ ID NO:172)和BamIgG 1GGAGGATCCATAGACAGATGGGGGTGTCGTTTTGGC(SEQ ID NO:173)。VL序列通过PCR使用下列简并引物来扩增：SacIMK GGAGCTCGAYATTGTGMTSACMCARWCTMCA(SEQ ID NO:174)和HindKL TATAGAGCTCAAGCTTGGATGGTGGGAAGATGGATACAGTTGGTGC(SEQ ID NO:175)。(混合的碱基定义如下:N=G+A+T+C,S=G+C,Y=C+T,M=A+C,R=A+G，W=A+T)。PCR反应混合物然后运行在1%低熔点琼脂糖凝胶上，300至400bp带被切除，使用Zymo DNA小柱纯化，并且发送至Agencourt Biosciences以用于测序。各自5’和3’PCR引物用作测序引物以从两个方向产生可变区cDNA。VH和VL区的氨基酸序列从DNA测序结果来预计。
由于用于克隆VL和VH cDNA序列的简并引物改变5’端序列，因此需要另外的测序努力来证实完全序列。初步cDNA序列用于检索NCBIIgBlast网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)，以用于鼠种系序列，从该序列衍生抗体序列。PCR引物然后被设计为退火至鼠抗体的种系连接的前导序列，使得该新PCR反应将产生完全可变区cDNA序列，未被PCR引物改变。PCR反应、带的纯化和测序如上所述进行。
序列证实的质谱确定
可变区的cDNA序列信息联合种系恒定区序列以获得全长抗体cDNA序列。然后，重链和轻链的分子量被计算，并且比较于通过鼠CD37-3抗体的LC/MS分析而获得的分子量。对于CD37-3轻和重链，分子量测量情况一致于cDNA序列。
嵌合
轻链可变区的可变序列克隆到pchCD37-3LCZ质粒中的EcoRI和BsiWI位点中。重链可变区克隆到pchCD37-3HCN质粒中的HindIII和Apa1位点中。等同质粒被构建用于chCD37-12。这些质粒用于使用标准磷酸钙方法(BD Biosciences,CalPhos Mammalian Transfection Kit,Cat#631312)来表达HEK-293T细胞中的嵌合抗体。上清使用上述标准蛋白A色谱法纯化，但是精制色谱步骤使用羧甲基(CM)快速流动离子交换(IEX)树脂(GELifesciences)和10mM磷酸钾,10mM氯化钠结合缓冲液(pH 7.5)或者上述可替换的CHT法来进行。
实施例6
抗体人源化
CD37-3和huCD37-50抗体根据前述再表面化方法来人源化，例如Roguska et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,91(3):969-973(1994)和Roguska etal.,Protein Eng.9(10):895-904(1996)，其通过引用的方式全部并入本文中。再表面化法通常包括鉴定轻和重链中的可变区框表面残基，并且使用人等同物置换它们。鼠CDR保存在再表面化的抗体中。CD37-3和CD37-50的示例性CDR限定为表11中所指示。除了用于再表面化的重链CDR2定义，所述表提供鼠和人CD37-3和CD37-50的示例性Kabat定义的重链CDR2。。带下划线的序列标记Kabat重链CDR2的不被认为用于再表面化的CDR的部分。
表11
Figure BDA00002129651500951
定义用于再表面化的CD37-3和CD7-50轻和重链CDR通过表11中的例子的方式给出。鼠CD37-50轻链CDR2中的赖氨酸53被人源化CD37-50中的天冬酰胺置换(斜体示出)，因此给出LC CDR2的两种版本。重链CDR2的Kabat定义也给出用于鼠和人CD37-3。带下划线的序列标记Kabat重链CDR2的不被认为用于再表面化的CDR的部分。
表面残基位被定义为其相对可接近性为30%或更高的任何位(PedersenJ.T.et.Al,J.Mol.Biol.1994;235:959-973)。然后表面残基和人种系表面序列进行比对，以鉴定最同源的人表面序列。对于CD37-3，用作置换表面的人种系序列是IGKV1/OR2-0*01和IGHV4-34*09(分别对于VL和VH)。对于CD37-50，用作置换表面的人种系序列是IGKV3/OR2-268*01和IGHV4-31*03(分别对于VL和VH)。如从图6的列表可见，轻链中总共7个表面残基和重链中7个残基被CD37-3中的人负体置换。如图7中对于CD37-50可见，被人负体置换的总表面残基对于VL和VH分别是7个和5个。在CD37-3中，重链残基61最邻近CDR-H2，并且由于其置换人残基脯氨酸可导致降低的结合亲和性，第二再表面化的版本使用保留的鼠丝氨酸残基来产生。由于这些抗体被测试为细胞毒素的缀合物，因此CD37-50轻链CDR2赖氨酸53被天冬酰胺置换以避免关注赖氨酸缀合可能影响结合亲和性。图8示出轻链和重链的CD37-3和CD37-50可变域的再表面化的序列和它们鼠负体的比对。
huCD37-3抗体的重组表达
huCD37-3和CD37-50的可变区序列被密码子-优化，并且通过BlueHeron Biotechnology合成。序列侧翼有限制性内切酶位点以使用单链哺乳动物表达质粒中各自恒定序列来进行框内克隆。轻链可变区克隆到pAbKZeo质粒中的EcoRI和BsiWI位点。重链可变区克隆到pAbG1Neo质粒中的HindIII和Apa1位点。这些质粒可用于以瞬时或稳定哺乳动物细胞转染表达重组抗体。瞬时转染以在HEK 293T细胞中表达重组抗体使用改善的PEI方法来进行(Durocher,Y.et al.,Nucleic Acids Res.30:E9(2002))。上清通过蛋白A和精制色谱步骤使用上述用于嵌合抗体的标准方法来进行纯化。
TRU-016的表达
为了比较分离的抗-CD37抗体的活性，将之前鉴定的抗-CD37抗体克隆和表达。用于抗-CD37SMIP的DNA序列使用SEQ ID 51得自US2007/0059306。序列侧翼有HindIII和Xho1限制性内切酶位点以克隆到pAbG1Neo哺乳动物表达质粒。如上面用于huCD37-3所述来进行表达和纯化。
实施例7
嵌合抗体的结合亲和性
嵌合抗体chCD37-3和chCD37-12被测定和它们鼠负体相比，它们和Ramos细胞的结合亲和性。如实施例2中所述，利用二次FITC-缀合的山羊-抗-鼠和-抗-人抗体，使用Ramos细胞和muCD37-3,chCD37-3,muCD37-12与chCD37-12抗体的流式细胞术结合测试被进行和分析。图9A示出对于各抗体通过非线性回归产生的剂量-响应曲线。各抗体的表观解离常数(Kd)的数值使用GraphPad Prism v4(GraphPad software,San Diego,CA)来计算。明显的是，嵌合并未明显影响抗体的结合亲和性，因为muCD37-3,chCD37-3,muCD37-12和chCD37-12的Kd分别对应于0.4nM,0.8nM,0.8nM和1.2nM。
huCD37-3v1.0和huCD37-3v1.01的结合亲和性
使用BJAB细胞和竞争结合样式的流式细胞术结合测试用于评价CD37-3的嵌合和人源化版本的结合亲和性。BJAB细胞和1nM浓度的PE-标记的muCD37-3抗体孵育，并且通过添加变化量的muCD37-3,chCD37-3,huCD37-3v1.0或huCD37-3v1.01来测量竞争性。样品在4°C下孵育3小时。然后，将细胞粒状沉淀，使用FACS缓冲液洗涤，并且重悬浮在200μL的含有1%的甲醛的PBS中。使用具有HTS多孔取样器的FACSCalibur流式细胞仪来获取样品，并且使用CellQuest Pro(都来自BD Biosciences,SanDiego,US)来进行分析。所得平均PE荧光值针对在半-log图中使用的竞争抗体的量进行绘制。图9B示出对于各抗体通过非线性回归产生的剂量-响应曲线。各抗体的表观解离常数(Kd)的数值使用GraphPad Prismv4(GraphPad software,San Diego,CA)来计算。明显的是，嵌合或人源化并未影响CD37-3的结合亲和性，因为所有版本平等地良好竞争和鼠亲本抗体的结合。muCD37-3,chCD37-3,huCD37-3v1.0或huCD37-3v1.01的竞争结合的EC50分别对应于0.8nM,0.7nM,1nM和0.6nM。
人源化抗体的结合亲和性
人源化抗体huCD37-38,huCD37-50,huCD37-51,huCD37-56和chCD37-57被测定和它们鼠负体相比，它们和BJAB细胞的结合亲和性。利用二次FITC-缀合的山羊-抗-鼠和-抗-人抗体进行流式细胞术结合测试，并且如实施例2中所述进行分析，对于各抗体通过非线性回归产生的剂量-响应曲线。各抗体的表观解离常数(Kd)的数值使用GraphPad Prismv4(GraphPad software,San Diego,CA)来计算。明显的是，人源化并不明显影响任何抗体的结合亲和性。muCD37-3和huCD37-3的Kd对应于0.2nM，而muCD37-38和huCD37-38的Kd分别对应于0.4nM和0.3nM。类似地，muCD37-50和huCD37-50的Kd分别对应于0.6nM和0.2nM，而muCD37-51和huCD37-51的Kd分别对应于0.6nM和0.8nM。最后，muCD37-56和huCD37-56的Kd分别对应于0.4nM和0.2nM，而muCD37-57和huCD37-57的Kd分别对应于1.0nM和0.3nM。
实施例8
猕猴CD37的表达
猕猴CD37的CD37AA序列得自Genbank(GI:718718)。所述序列通过Blue Heron Biotechnology密码子-优化和合成。表达质粒pSRa-CD37mac被构建，其含有来自猕猴的完整CD37编码序列(CDS)，其侧翼有XbaI和BamHI限制性内切位点，这允许猕猴CD37的表达。300-19细胞，一种衍生自Balb/c小鼠的前B细胞系(M.G.Reth et al.1985,Nature,317:353-355)，使用该表达质粒转染以在细胞表面上稳定地表达猕猴CD37。
鼠抗体与猕猴CD37的结合亲和性
鼠抗体muCD37-3,muCD37-12,muCD37-38,huCD37-50,muCD37-51,muCD37-56和muCD37-57被测定它们结合300-19/CD37mac细胞表达猕猴CD37的能力。使用二次FITC-缀合的山羊-抗-鼠或山羊-抗-人抗体来进行流式细胞术结合测试，并且如实施例2中所述进行分析。结合比较于之前描述的抗-CD37抗体WR17和抗-CD37SMIP TRU-016。如图10A中可见，数种分离的抗-CD37抗体,muCD37-38,huCD37-50,muCD37-51,muCD37-56和muCD37-57可结合猕猴衍生的CD37抗原。相反，muCD37-3,muCD37-12,之前描述的抗-CD37抗体WR17和抗-CD37SMIP TRU-016不能结合猕猴衍生的CD37抗原。
人源化抗体与猕猴CD37的结合亲和性
人源化抗体huCD37-38,huCD37-50,huCD37-51,huCD37-56和huCD37-57被测定它们与300-19/CD37mac细胞表达猕猴CD37的结合亲和性。使用二次FITC-缀合的山羊-抗-人抗体来进行流式细胞术结合测试，并且如实施例2中所述进行分析，对于各抗体通过非线性回归产生的剂量-响应曲线。各抗体的表观解离常数(Kd)的数值使用GraphPad Prismv4(GraphPad software,San Diego,CA)来计算。从图10B明显的是，数种分离的人源化抗体结合猕猴CD37，而huCD37-3不是这样。huCD37-38,huCD37-50,huCD37-51,huCD37-56和huCD37-57的Kd值分别对应于1.1nM,1.8nM,14nM,5nM和2nM。因此，人源化不会影响分离的抗体的结合特异性。
实施例9
嵌合和人源化抗体的促凋亡活性
在Ramos细胞上评价嵌合和人源化抗体的促凋亡活性。将细胞和10nM浓度的抗体或huIgG同种型对照抗体孵育20小时，然后膜联蛋白-V-FITC和TO-PRO-3染色，并且进行流式细胞术分析。ChCD37-12保留muCD37-12的强烈促凋亡活性。和4%的未处理的对照细胞相比，在使用muCD37-12或chCD37-12抗体处理后约40%的Ramos细胞是膜联蛋白-V阳性。类似地，和4%的同种型对照处理的或未处理的细胞相比，在使用huCD37-3,huCD37-38,huCD37-50,huCD37-51,huCD37-56或huCD37-57抗体处理后约40%的Ramos细胞是膜联蛋白-V阳性。相反，使用抗-CD20抗体利妥昔单抗处理导致只有13%的膜联蛋白-V阳性细胞。所述结果证实此处分离的鼠抗-CD37抗体的强烈促凋亡活性通过衍生自它们的嵌合或人源化抗体而得以保持。因此，该组抗-CD37抗体的独特的功能性能，在不存在交联的情况下强烈的促凋亡活性，不会受到嵌合或人源化的不利影响。
huCD37-3和TRU-016的促凋亡活性
比较huCD37-3针对Ramos和Raji淋巴瘤细胞的促凋亡活性与抗-CD37 SMIP TRU-016的情况。TRU-016描述为不具有促凋亡活性的化合物，除非交联有二次抗体。明显的是，示例性抗-CD37抗体huCD37-3和chCD37-38针对两种淋巴瘤细胞系具有更强的促凋亡活性。比较于3%的未处理的对照细胞，使用huCD37-3或chCD37-38处理导致40%或49%的膜联蛋白-V阳性Ramos细胞。利妥昔单抗处理导致只有15%的膜联蛋白-V阳性Ramos细胞。相反，TRU-016处理不会增加膜联蛋白-V阳性Ramos细胞的百分率。同样，比较于7%的未处理的对照细胞，使用huCD37-3或chCD37-38处理导致34%或30%的膜联蛋白-V阳性Raji细胞。利妥昔单抗处理导致只有19%的膜联蛋白-V阳性Raji细胞。相反，TRU-016处理不会增加膜联蛋白-V阳性Ramos细胞的百分率。
人源化抗体的促凋亡活性的剂量应答
变化量的各抗体和Ramos细胞孵育20小时，然后膜联蛋白-V-FITC和TO-PRO-3染色，并且进行流式细胞术分析。膜联蛋白-V阳性细胞的百分率针对半-log图中的抗体浓度绘制，使用非线性回归分析从曲线拟合来计算EC50值。明显的是，所有人源化抗体具有强烈促凋亡活性，膜联蛋白-V阳性细胞的最大百分率为至少40%。图11。用于该活性的EC50对应于0.08,0.08和0.11nM(分别为huCD37-3,huCD37-38和huCD37-50)。另外，用于该活性的EC50对应于0.41,0.57和1.01nM(分别为huCD37-51,huCD37-56和huCD37-57)。相反，比较于4%的使用同种型对照抗体处理的细胞，使用抗-CD20抗体利妥昔单抗处理导致膜联蛋白-V阳性细胞的最大百分率仅为15%。
实施例10
嵌合和人源化抗-CD37抗体的增殖测试
嵌合和人源化抗-CD37抗体抑制细胞生长的能力使用体外细胞毒性测试来测量，如实施例4所述。使用SU-DHL-4和DOHH-2淋巴瘤细胞的典型增殖测试的结果展现于图12。明显的是，所有抗体能够基本上和以剂量依赖性方式抑制SU-DHL-4细胞的增殖。例如，使用muCD37-3处理降低SU-DHL-4细胞的生存力为35%，EC50为0.07nM。类似地，在测试的最高抗体浓度下，使用chCD37-3,huCD37-3v1.0或huCD37-3v1.01处理降低SU-DHL-4细胞的生存力为约30%，EC50分别为0.03nM,0.06nM或0.03nM。同样，所有抗体能够基本上和以剂量依赖性方式抑制DOHH-2滤泡性淋巴瘤细胞的增殖。例如，使用muCD37-3处理降低DOHH-2细胞的生存力为45%，EC50为0.05nM。类似地，使用chCD37-3,huCD37-3v1.0或huCD37-3v1.01处理降低DOHH-2细胞的生存力为约35%，EC50分别为0.06nM,0.07nM或0.05nM。该结果证实各种版本的CD37-3抗体具有类似的抗-增殖活性，其不会受到嵌合或人源化的影响。
在类似的体外细胞毒性测定中测试另外的人源化抗-CD37抗体。所有测试的人源化抗体能够基本上和以剂量依赖性方式抑制SU-DHL-4细胞的增殖。例如，使用huCD37-38处理降低SU-DHL-4细胞的生存力为24%，EC50为0.42nM，，而使用huCD37-50处理降低SU-DHL-4细胞的生存力为31%，EC50为0.39nM。相反，使用抗-CD20抗体利妥昔单抗处理降低SU-DHL-4细胞的生存力为35％，EC50为1.6nM。另外，使用huCD37-51或huCD37-56处理降低SU-DHL-4细胞的生存力为24%，EC50分别为0.60nM或0.68nM。而且，使用huCD37-57处理降低SU-DHL-4细胞的生存力为31%，EC50为0.42nM。使用同种型对照抗体处理对于SU-DHL-4细胞的生存力没有影响。
比较于其他抗体的huCD37-3的抗-增殖活性
为了进一步表征分离的抗-CD37抗体的抗-增殖活性，我们比较了示例性huCD37-3抗体与抗-CD37SMIP TRU-16化合物的效果。使用肿瘤微阵列的免疫组织化学证实CD37和CD20在NHL的亚型中表现出类似的表达图案和流行性。参见下表12。因此，还比较了抗-CD20抗体利妥昔单抗。细胞系组包括Granta-519,SU-DHL-4,Namalwa和Daudi淋巴瘤细胞。图13。
表12:比较于CD20染色，在淋巴瘤肿瘤微阵列上CD37染色
Figure BDA00002129651501021
在所有情况下，huCD37-3处理导致细胞生存力以剂量依赖性方式降低。例如，使用huCD37-3处理降低Granta-519细胞的生存力为约37％，EC50为0.062nM。利妥昔单抗处理降低Granta-519细胞的生存力为约47％，EC50为0.36nM。使用huCD37-3处理降低SU-DHL-4细胞的生存力为约17%，EC50为0.053nM。利妥昔单抗处理降低SU-DHL-4细胞的生存力为约20%，EC50为0.2nM。截然不同的是，使用TRU-016处理不会在明显程度上或以剂量依赖性方式降低Granta-519或SU-DHL-4细胞的生存力。在进一步例子中，使用huCD37-3处理降低Namalwa细胞的生存力为约47%，EC50为0.1nM，并且降低Daudi细胞的生存力为约68%，EC50为0.25nM。利妥昔单抗处理对于Namalwa细胞没有影响，但是降低Daudi细胞的生存力为约69％，EC50为2.6nM。截然不同的是，使用TRU-016处理不会在明显程度上或以剂量依赖性方式降低Namalwa或Daudi细胞的生存力。最后，使用huCD37-3处理降低Ramos细胞的生存力为约53％，EC50为0.08nM，而TRU-016和利妥昔单抗处理都不会Ramos细胞生存力产生任何影响。该结果强调分离的抗-CD37抗体的抗-增殖活性的独特性。
实施例11
CD37抗体的CDC活性
为了评价嵌合和人源化抗-CD37抗体的补体依赖性细胞毒性(CDC)活性，根据公开的方法(Gazzano-Santoro H,J Immunol Methods.1997202(2):163-71)来进行细胞基测定。将抗体以50μL/孔等分三份到平底96-孔组织培养板中，其在RHBP(RPMI-1640,20mM HEPES,0.1%BSA,1%青霉素-链霉素)培养基中各种浓度下，典型地为5μg/mL(=3.3x 10-8M)至2.3ng/mL(=1.5x 10-11M)。将靶细胞以5x 104细胞加入在100μL的RHBP培养基/孔的抗体。冻干人补体(Sigma-Aldrich,St.Louis,US)使用1mL无菌纯化的水/小瓶重组，并且在使用前立即稀释5倍至具有RHBP培养基的20%储液中。50μL/孔的补体溶液加入各孔中至最终浓度5%。将板在37°C下在5%CO2加湿孵育器中孵育2h，以允许补体介导的胞溶。在该孵育时间后，Alamar Blue试剂(Invitrogen)加入各孔至最终浓度为10％，以测量保留细胞的生存力。在EX540/EM590nm处测量荧光度(相对荧光单位，RFU)之前，将板在37°C下孵育16至20小时。对照包括在具有培养基和补体但没有细胞(仅有培养基,0%生存力)与具有细胞和补体但没有抗体(仅有细胞,100%生存力)的三份孔中。各样品的特定细胞生存力的百分率通过下列来测定:%生存力=(样品–仅有培养基)/(仅有细胞–仅有培养基)。
使用Ramos细胞的示例性CDC测定的结果展现于图14。吃惊地，chCD37-12针对Ramos细胞具有有效的CDC活性。在测试的最高抗体浓度下，其降低Ramos细胞的生存力为32％，EC50为0.037μg/mL。另外，数种分离的抗体显示出在变化程度上具有针对Ramos的CDC活性。使用huCD37-3,huCD37-38,huCD37-50处理导致分别降低细胞生存力为59%,50%和45％。在测试的最高抗体浓度下，使用huCD37-51,huCD37-56或huCD37-56处理适度地将Ramos细胞的细胞生存力为约70-80%。
实施例12
CD37抗体的ADCC活性
使用新鲜分离的人自然杀伤(NK)细胞作为效应子细胞，乳酸脱氢酶(LDH)释放测试被用于测定肿瘤细胞系的抗体-依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)(Shields RL,J Biol Chem.2001 276(9):6591-604)。使用NKIsolation Kit II改进的方案(Miltenyi Biotech,130-091-152)，NK细胞首先分离自正常供体的人血液(Research Blood Components,Inc.,Brighton,MA)。将血液用1x PBS稀释2倍。将25mL的稀释的血液仔细地在50mL圆锥管中在25mL的Ficoll Paque上分层，并且以400g在RT下离心45min。周围血液单核细胞(PBMC)收集自界面，转移到新的圆锥50mL管中，并且使用1x PBS洗涤一次。将PBMC重悬浮在2mL的NK-分离缓冲液中(1xPBS,0.5%BSA,2mM EDTA)，然后500μL的Biotin-抗体Cocktail加入细胞混悬液中。Biotin-抗体Cocktail含有生物素化的抗体，其结合淋巴细胞(除了NK细胞)，从而导致NK细胞的阴性选择。将混合物在4°C下孵育10min，然后加入1.5mL的NK-分离缓冲液和1mL的抗-Biotin微珠。将细胞-抗体混合物在4°C下孵育另外15min。然后，将细胞使用50mL的NK-分离缓冲液洗涤一次，并重悬浮在3mL的NK-分离缓冲液中。然后，MACS LS柱安装在自动MACS分离器上(Miltenyi Biotech)，并且使用3mL的NK-分离缓冲液预洗涤。将细胞混悬液自动地施加在柱上，洗涤，并且具有未标记的NK细胞的流出的部分收集到新的50-mL圆锥管中。将所得NK细胞平板接种到30mL的完全RPMI培养基中(RPMI-1640，补充5%胎牛血清,1%青霉素-链霉素,1mM HEPES,1mM丙酮酸钠,1%100X MEM非必需氨基酸溶液)过夜。在RHBP培养基(RPMI-1640培养基，补充20mMHEPES,pH 7.4,0.1%BSA和1%青霉素-链霉素)中进行随后的测定和所有稀释。
将在RHBP培养基中各种浓度的抗体以50μL/孔一式两份分到圆底96-孔板中。将靶细胞以106细胞/mL重悬浮在RHBP培养基中，并且以100μL/孔加至含有抗体稀释液的各孔中。含有靶细胞和抗体稀释液的板在37°C下孵育30min。然后将NK细胞以50μL/孔加至含有靶细胞的孔中。典型比例为1个靶细胞比3-4个NK细胞。建立下列对照用于各试验：单独NK细胞,单独靶细胞(自发LDH释放),靶细胞和NK细胞(抗体独立性LDH释放),靶细胞和10% Triton X-100(最大LDH释放)。将混合物在37°C下孵育4h以允许细胞胞溶。将板以1200rpm离心10min，并将100μL的上清仔细地转移到新的平底96-孔板中。来自细胞毒性检测试剂盒(Roche1 644 793)的LDH反应混合物(100μL/孔)加入各孔中，并在室温下孵育5至30min。在490nm(OD490)下测量样品的光学密度。各样品的特定胞溶百分率使用下列来确定：特定胞溶百分率=(样品值-自发释放)/(最大释放-自发释放)*100。
和人源化抗体一起孵育导致在存在人NK效应子细胞的情况下针对Daudi,Ramos和Granta-519淋巴瘤细胞的良好的ADCC活性。它们针对Daudi淋巴瘤细胞的ADCC活性和TRU-016的ADCC活性进行比较(图15)。
使用huCD37-3,huCD37-38或huCD37-50抗体处理导致约41%,39%或40%Daudi细胞胞溶，EC50值分别为0.42ng/mL,1.31ng/mL或2.42ng/mL。该活性类似于得自观察到的使用42%Daudi细胞胞溶的TRU-016处理，并且EC50值为0.93ng/mL。另外，使用huCD37-51,huCD37-56和huCD37-57处理导致约39%,36%或36%的Daudi细胞胞溶，EC50值分别为5.7ng/mL,4.3ng/mL或7.9ng/mL。
分离的抗体针对Ramos淋巴瘤细胞的ADCC活性和TRU-016的ADCC活性进行比较。使用huCD37-3,huCD37-38或huCD37-50抗体处理导致约43%,42%或46%Ramos细胞胞溶，EC50值分别为0.95ng/mL,2.0ng/mL或3.0ng/mL。该活性类似于得自观察到的使用59%Ramos细胞胞溶的TRU-016处理，并且EC50值为1.53ng/mL。另外，使用huCD37-51,huCD37-56和huCD37-57处理导致约53%,43%或44%的Ramos细胞胞溶，EC50值分别为5.7ng/mL,4.3ng/mL或7.9ng/mL。
在另外的试验中，huCD37-3和chCD37-38针对Granta-519细胞的ADCC活性和TRU-016的ADCC活性进行比较。使用huCD37-3或chCD37-38抗体处理导致约19%或18%Granta-519细胞胞溶，EC50值分别为0.13ng/mL或0.73ng/mL。TRU-016处理导致观察到的16%Granta-519细胞胞溶，EC50值为0.83ng/mL。
实施例13
抗原表位映射
用于不同CD37抗体的抗原表位所要求的氨基酸的局域化可有助于建立通常或独特的功能特性与特定分子相互作用之间的联系。CD37的胞外域含有两个胞外环，小环为约18个残基，大环由约135个氨基酸构成。对于之前公开的CD37抗体，抗原表位要求并未描述。为了进一步表征本发明的分离的CD37抗体，我们构建了数种CD37抗原变体，其在较大胞外环中具有AA置换。
CD37变体克隆和表达
构建哺乳动物表达质粒，其含有全部人或猕猴CD37cDNA序列，密码子由Blue Heron Biotechnologies优化和合成，并且侧翼有XbaI和BamHI限制性内切位点以促进克隆到pSRa载体多克隆位点。由于人和猕猴CD37序列高度同源(图16)，因此这些构建体的表达能够从下列那些情况来区别人和猕猴交叉反应性抗体：识别抗原表位，其要求在这两个物种之间11个细胞外CD37氨基酸中至少一个不同，这如实施例8中所述。
为了进一步表征CD37抗体抗原表位，构建一系列鼠和人嵌合CD37构建体。由于小CD37胞外环的尺寸和高度同源性，抗原表位的局域化努力对大胞外环进行了限制。大胞外环的EcoRV至Pst1盒编码残基I108至Q235被重新设计以通过引入4个独特的限制性内切位点来进一步节段为5个部分，所述位点可在人、鼠和猕猴CD37序列之间是保守的(图17)。创建下列人和小鼠嵌合CD37构建体:
hCD37-M1
MSAQESCLSLIKYFLFVFNLFFFVLGSLIFCFGIWILIDKTSFVSFVGLAFVPLQIWSKVLAISGIFTMGIALLGCVGALKELRCLLGLYFGMLLLLFATQITLGILISTQRVRLERRVQELVLRTIQSYRTNPDETAAEESWDYVQFQLRCCGWHYPQDWFQVLILRGNGSEAHRVPCSCYNLSATNDSTILDKVILPQLSRLGHLARSRHSADICAVPAESHIYREGCAQGLQKWLHNNLISIVGICLGVGLLELGFMTLSIFLCRNLDHVYNRLARYR(SEQ ID NO:180)
hCD37-M2
MSAQESCLSLIKYFLFVFNLFFFVLGSLIFCFGIWILIDKTSFVSFVGLAFVPLQIWSKVLAISGIFTMGIALLGCVGALKELRCLLGLYFGMLLLLFATQITLGILISTQRAQLERSLRDVVEKTIQKYGTNPEETAAEESWDYAQFQLRCCGWQSPRDWNKAQMLKANESEEPRVPCSCYNLSATNDSTILDKVILPQLSRLGHLARSRHSADICAVPAESHIYREGCAQGLQKWLHNNLISIVGICLGVGLLELGFMTLSIFLCRNLDHVYNRLARYR(SEQ ID NO:181)
hCD37-M3
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hCD37-M45
MSAQESCLSLIKYFLFVFNLFFFVLGSLIFCFGIWILIDKTSFVSFVGLAFVPLQIWSKVLAISGIFTMGIALLGCVGALKELRCLLGLYFGMLLLLFATQITLGILISTQRAQLERSLRDVVEKTIQKYGTNPEETAAEESWDYVQFQLRCCGWHYPQDWFQVLILRGNGSEAHRVPCSCYNLSATNDSTILDKVILPQLSRLGPRAKLRQTADICALPAKAHIYREGCAQSLQKWLHNNLISIVGICLGVGLLELGFMTLSIFLCRNLDHVYNRLARYR(SEQ ID NO:183)
muCD37-R176
ISTQRVRLERRVQELVLRTIQSYRTNPDETAAEESWDYAQFQLRCCGWQSPRDWNKAQMLKANESEEPRVPCSCYNSTATNDSTVFDKLFFSQLSRLGPRAKLRQTADICALPAKAHIYREGCAQSLQ(SEQ ID NO:184).
为了保存一个这样的限制性内切位点Kpn1，人R176包括在所有鼠/人嵌合构建体中。鼠和人CD37盒订购自Blue Heron，并且和由PCR产生的初始人CD37构建体的5'端片段一起克隆到pSRa载体中以引入EcoRV位点，并从初始猕猴CD37构建体中取出3’端Pst1至Xba1限制性片段。然后使用标准限制性内切酶消化和利用通常独特的限制性内切位点的连接来构建鼠和人嵌合CD37盒。
hCD37-M1变体通过下列方式来创建：插入EcoRV-SacII限制性片段，其编码类似鼠CD37序列的AA S109至A138。同样，hCD37-M3变体通过下列方式来创建：插入KpnI-Blp1限制性片段，其编码类似鼠CD37序列的AA V177至L201。hCD37-M45变体通过下列方式来创建：插入Blp1-PstI限制性片段，其编码类似鼠CD37序列的AA S202至I243。所得克隆通过限制性内切酶消化、然后进行DNA测序来证实。
稳定的细胞系通过下列方式获得：使用标准电穿孔方法，将鼠和人嵌合CD37变体表达质粒转染到300-19细胞中。简言之，使用在260V和960μF设定的BioRad Gene Pulser，5x106 300-19细胞被电穿孔到冷RPMI-1640培养基中。随后，将细胞稀释，并且平板接种到96-孔板中的RPMI-1640培养基中，所述培养基补充10%FBS和50μM β-疏基乙醇。在24小时后，以最终浓度2mg/mL加入G418(Invitrogen)，以选择转染的细胞。在2周后，分离单一集落，并且通过流式细胞术和扩大来分析用于CD37表面表达。
结合CD37变体的抗体
各种CD37抗体与细胞表达人CD37野生型和变体的结合通过流式细胞术使用1.5μg/mL的各抗体来分析。本发明的分离的抗体和市售CD37抗体WR17以及TRU-016 SMIP相比较。在图18A中可见，所有抗体结合野生型CD37表达细胞。同样，所有测试的抗体结合hCD37-M3变体(图18B)。相反，本发明的分离的抗体结合hCD37-M1变体，而TRU-016和WR17不能结合hCD37-M1变体(图19A)。CD37-50和CD37-51抗体与TRU-016也能够结合hCD37-M45变体。WR17显示部分结合hCD37-M45变体，而其他抗体CD37-3,CD37-12,CD37-38,CD37-56和CD37-57不能结合(图19B)。这暗示所有本发明的分离的抗体不需要在hCD37-M1变体中的12AA残基，其改变至相应鼠AA残基以结合CD37抗原。相反，CD37-3,CD37-12,CD37-38,CD37-56和CD37-57抗体要求hCD37-M45变体中10个AA残基中的至少一个，其改变至相应鼠AA残基以结合CD37抗原。
未预料的结果表明，本发明的分离的抗体表示新型种类的CD37抗体，其具有功能特性的独特联合。
另外，按照相同设计来构建类似的构建体。所述构建体含有编码CD37的大胞外环的鼠、人和/或猕猴序列的各种组合(参见图17)。具有插入到鼠大胞外环序列中的单一人部分的构建体的例子为：
hCD37mECD-H1:
MSAQESCLSLIKYFLFVFNLFFFVLGSLIFCFGIWILIDKTSFVSFVGLAFVPLQIWSKVLAISGIFTMGIALLGCVGALKELRCLLGLYFGMLLLLFATQITLGILISTQRAQLERSLRDVVEKTIQKYGTNPEETAAEESWDYAQFQLRCCGWQSPRDWNKAQMLKANESEEPRVPCSCYNSTATNDSTVFDKLFFSQLSRLGPRAKLRQTADICALPAKAHIYREGCAQSLQKWLHNNLISIVGICLGVGLLELGFMTLSIFLCRNLDHVYNRLARY(SEQ ID NO:185)
hCD37mECD-H2:
MSAQESCLSLIKYFLFVFNLFFFVLGSLIFCFGIWILIDKTSFVSFVGLAFVPLQIWSKVLAISGIFTMGIALLGCVGALKELRCLLGLYFGMLLLLFATQITLGILISTQRVRLERRVQELVLRTIQSYRTNPDETAAEESWDYVQFQLRCCGWHYPQDWFQVLILRGNGSEAHRVPCSCYNSTATNDSTVFDKLFFSQLSRLGPRAKLRQTADICALPAKAHIYREGCAQSLQKWLHNNLISIVGICLGVGLLELGFMTL SIFLCRNLDHVYNRLARYR(SEQ ID NO:186)
hCD37mECD-H3:
MSAQESCLSLIKYFLFVFNLFFFVLGSLIFCFGIWILIDKTSFVSFVGLAFVPLQIWSKVLAISGIFTMGIALLGCVGALKELRCLLGLYFGMLLLLFATQITLGILISTQRVRLERRVQELVLRTIQSYRTNPDETAAEESWDYAQFQLRCCGWQSPRDWNKAQMLKANESEEPRVPCSCYNLSATNDSTILDKVILPQLSRLGPRAKLRQTADICALPAKAHIYREGCAQSLQKWLHNNLISIVGICLGVGLLELGFMTLSIFLCRNLDHVYNRLARYR(SEQ ID NO:187)
hCD37mECD-H4:
MSAQESCLSLIKYFLFVFNLFFFVLGSLIFCFGIWILIDKTSFVSFVGLAFVPLQIWSKVLAISGIFTMGIALLGCVGALKELRCLLGLYFGMLLLLFATQITLGILISTQRVRLERRVQELVLRTIQSYRTNPDETAAEESWDYAQFQLRCCGWQSPRDWNKAQMLKANESEEPRVPCSCYNSTATNDSTVFDKLFFSQLSRLGHLARSRHSADICALPAKAHIYREGCAQSLQKWLHNNLISIVGICLGVGLLELGFMTL SIFLCRNLDHVYNRLARYR(SEQ ID NO:188)
hCD37mECD-H5
MSAQESCLSLIKYFLFVFNLFFFVLGSLIFCFGIWILIDKTSFVSFVGLAFVPLQIWSKVLAISGIFTMGIALLGCVGALKELRCLLGLYFGMLLLLFATQITLGILISTQRVRLERRVQELVLRTIQSYRTNPDETAAEESWDYAQFQLRCCGWQSPRDWNKAQMLKANESEEPRVPCSCYNSTATNDSTVFDKLFFSQLSRLGPRAKLRQTADICAVPAESHIYREGCAQGLQKWLHNNLISIVGICLGVGLLELGFMTLSIFLCRNLDHVYNRLARYR(SEQ ID NO:189)
和hCD37mECD-H45
MSAQESCLSLIKYFLFVFNLFFFVLGSLIFCFGIWILIDKTSFVSFVGLAFVPLQIWSKVLAISGIFTMGIALLGCVGALKELRCLLGLYFGMLLLLFATQITLGILISTQRVRLERRVQELVLRTIQSYRTNPDETAAEESWDYAQFQLRCCGWQSPRDWNKAQMLKANESEEPRVPCSCYNSTATNDSTVFDKLFFSQLSRLGHLARSRHSADICAVPAESHIYREGCAQGLQKWLHNNLISIVGICLGVGLLELGFMTL SIFLCRNLDHVYNRLARYR(SEQ ID NO:190).
其他例子为具有插入到人大胞外环序列中的单一猕猴部分的构建体，例如：
hCD37-Mac12:
MSAQESCLSLIKYFLFVFNLFFFVLGSLIFCFGIWILIDKTSFVSFVGLAFVPLQIWSKVLAISGIFTMGIALLGCVGALKELRCLLGLYFGMLLLLFATQITLGILISTQRAQLERSLQDIVEKTIQRYHTNPEETAAEESWDYVQFQLRCCGWHSPQDWFQVLTLRGNGSEAHRVPCSCYNLSATNDSTILDKVILPQLSRLGHLARSRHSADICAVPAESHIYREGCAQGLQKWLHNNLISIVGICLGVGLLELGFMTLSIFLCRNLDHVYNRLARYR(SEQ ID NO:191)
hCD37-Mac4:
MSAQESCLSLIKYFLFVFNLFFFVLGSLIFCFGIWILIDKTSFVSFVGLAFVPLQIWSKVLAISGIFTMGIALLGCVGALKELRCLLGLYFGMLLLLFATQITLGILISTQRAQLERSLRDVVEKTIQKYGTNPEETAAEESWDYVQFQLRCCGWHYPQDWFQVLILRGNGSEAHRVPCSCYNLSATNDSTILDKVILPQLSRLGQLARSRHSTDICAVPAESHIYREGCAQGLQKWLHNNLISIVGICLGVGLLELGFMTLSIFLCRNLDHVYNRLARYR(SEQ ID NO:192)
hCD37-Mac5:
MSAQESCLSLIKYFLFVFNLFFFVLGSLIFCFGIWILIDKTSFVSFVGLAFVPLQIWSKVLAISGIFTMGIALLGCVGALKELRCLLGLYFGMLLLLFATQITLGILISTQRAQLERSLRDVVEKTIQKYGTNPEETAAEESWDYVQFQLRCCGWHYPQDWFQVLILRGNGSEAHRVPCSCYNLSATNDSTILDKVILPQLSRLGHLARSRHSADICAVPANSHIYREGCARSLQKWLHNNLISIVGICLGVGLLELGFMTLSIFLCRNLDHVYNRLARYR(SEQ ID NO:193)
和hCD37-Mac45:
MSAQESCLSLIKYFLFVFNLFFFVLGSLIFCFGIWILIDKTSFVSFVGLAFVPLQIWSKVLAISGIFTMGIALLGCVGALKELRCLLGLYFGMLLLLFATQITLGILISTQRAQLERSLRDVVEKTIQKYGTNPEETAAEESWDYVQFQLRCCGWHYPQDWFQVLILRGNGSEAHRVPCSCYNLSATNDSTILDKVILPQLSRLGQLARSRHSTDICAVPANSHIYREGCARSLQKWLHNNLISIVGICLGVGLLELGFMTLSIFLCRNLDHVYNRLARY(SEQ ID NO:194).
而且，单一点突变产生在人大胞外环序列中，以鉴定残基对于抗体结合的重要性。
CD37结合剂与表达SEQ ID NO:185-194的细胞的结合通过上述流式细胞术来分析。
实施例14
huCD37-3-SPP-DM1的制备
N-琥珀酰亚胺基4-(2-吡啶基二硫代)戊酸酯(SPP)接头溶解于乙醇中。huCD37-3抗体以5mg/mL和7倍摩尔数过量的SPP接头在室温下在50mM磷酸钾缓冲液(pH 6.5)中孵育约100分钟，所述缓冲液含有50mMNaCl,2mM EDTA和5%乙醇。反应混合物使用采用上述磷酸钾缓冲液平衡的SEPHADEXTMG25F柱纯化。含有所述部分的抗体集中并用于随后的步骤。
美登醇DM1溶解于二甲基乙酰胺(DMA,最终浓度是3%)中，相对于接头1.7倍摩尔数过量滴加至SPP修饰的抗体。在室温下孵育过夜后，缀合的抗体通过色谱法在用磷酸盐缓冲液(PBS),pH 6.5平衡的SEPHADEXTMG25F纯化。然后，huCD37-3-SPP-DM1缀合物透析到含有10mM组氨酸，250mM甘氨酸，1%蔗糖，pH 5.5的缓冲液中。使用之前报道用于抗体和DM1的消光系数来测定连接的DM1分子数量/抗体分子(Liu et al.,Proc.Natl.Acad．Sci.USA,93,8618-8623(1996))。在缀合反应后存在的游离美登醇的百分率通过下列方式来确定：将20-50μg缀合物注射到以在100mM乙酸铵缓冲液,pH 7.0中25%乙腈平衡的的HiSep柱上，并且以乙腈洗脱。全部游离美登醇类(梯度洗脱，并且通过和使用已知标准的洗脱时间进行比较来鉴定)的峰面积使用设定为波长252nm的吸光度检测器来测量，并且比较和结合的美登醇有关的峰面积(在柱流动-通过部分中在缀合物峰中洗脱的)，以计算全部游离美登醇类的百分率。获得3.5-4个DM1分子/huCD37-3抗体的缀合物，存在<1%的未缀合的美登醇。
huCD37-3-SMCC-DM1的制备
(琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸酯(SMCC,Pierce Biotechnology,Inc)接头溶解于DMA。通过将抗体以5mg/mL和10摩尔数过量的SMCC在50mM磷酸钾,50mM NaCl,2mM EDTA,pH 6.5中孵育，huCD37-3抗体使用SMCC修饰，以将马来酰亚胺引入抗体。在室温下约100分钟后，反应混合物使用采用相同磷酸钾缓冲液平衡的SEPHADEXTMG25F柱纯化。含有所述部分的抗体集中并用于随后的步骤。
SMCC-修饰的抗体和DM1的10mM溶液反应，所述DM1相对于马来酰亚胺接头1.7摩尔数过量。将反应在室温下搅拌约18小时。缀合反应混合物通过使用1×PBS，pH 6.5平衡的SEPHADEXTMG25凝胶过滤柱过滤。huCD37-3-SMCC-DM1缀合物透析到含有10mM组氨酸，250mM甘氨酸，1%蔗糖，pH 5.5的缓冲液中。如上所述测定连接的DM1分子数量/抗体分子和全部游离美登醇类的百分率。获得3.5-4个DM1分子/huCD37-3抗体的缀合物，存在<1%的未缀合的美登醇。
huCD37-3-磺基-mal-DM4的制备
DM4硫醇和杂双官能接头1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-4-(2,5-二氧代吡咯烷-1-基氧基)-4-氧代丁烷-2-磺酸(3-磺基-mal)的溶液在N,N-二甲基乙酰胺(DMA)中制成浓度30-60mM。接头和DM4在DMA中混合在一起，所述DMA含有至多40%v/v的200mM琥珀酸盐缓冲液,2mM EDTA,pH 5.0，以使DM4与接头的比例为1.6，并且DM4的最终浓度等于15mM。在混合之后，将反应保持2h，在4mg/ml Ab,90%磷酸盐缓冲液/10%DMA,pH 7.5的最终缀合条件下，加入huCD37-3抗体在磷酸盐缓冲液(pH 7.5)的混合物中。缀合反应允许在室温下继续进行2h。huCD37-3-磺基-mal-DM4缀合物纯化自过量未反应的DM4和未缀合的接头产物在PBS中的渗析，然后最终渗析到含有10mM组氨酸,250mM甘氨酸,1%蔗糖pH 5.5的缓冲液中。缀合物通过0.22μm过滤器过滤以用于最终储存。如上所述测定最终缀合物中连接的DM4分子数量/huCD37-3抗体分子(平均)和全部游离美登醇类的百分率。获得3.5-4个DM4分子/huCD37-3抗体的缀合物，存在<1%的未缀合的美登醇。
huCD37-3-PEG4-mal-DM1的制备
N-羟基琥珀酰亚胺基-(聚乙二醇)4-(N-马来酰亚胺基甲基)-DM1(NHS-PEG4-mal-DM1)试剂溶解于DMA。huCD37-3抗体以5mg/mL在50mM磷酸钾,150mM NaCl,2mM EDTA,pH 7.5中和7倍摩尔数过量的NHS-PEG4-mal-DM1(总共10%DMA)孵育。在室温下约2小时后，反应混合物使用以1xPBS,pH 7.4平衡的SEPHADEXTMG25柱纯化。含有所述部分的抗体集中并透析到含有10mM组氨酸,250mM甘氨酸,1%蔗糖,pH 5.5的缓冲液中。如上所述测定连接的DM1分子数量/抗体和全部游离美登醇类的百分率。获得3.5-4个DM4分子/huCD37-3抗体的缀合物，存在<1%的未缀合的美登醇。
实施例15
美登醇缀合物的结合亲和性
在缀合SMCC-DM1,SPP-DM1或磺基-mal-DM4后，示例性huCD37-3的结合亲和性通过上述实施例中所述的流式细胞术来测定。表观解离常数(Kd)的值从图20A中示出的结合曲线来计算，并且对应于：0.26nM，huCD37-3；0.46，huCD37-3-SMCC-DM1；0.56nM，huCD37-3-SPP-DM1；和0.89nM，huCD37-3-磺基-mal-DM4缀合物。该结果证实，SMCC-DM1,SPP-DM1或磺基-mal-DM4缀合并未显著改变示例性huCD37-3抗体的亲和性。
在缀合SMCC-DM1后huCD37-38的结合亲和性通过上述实施例中所述的流式细胞术来测定。表观解离常数(Kd)的值从图20B中示出的结合曲线来计算，并且对应于：1.04nM，huCD37-38；和1.2nM，huCD37-38-SMCC-DM1缀合物。该结果证实，SMCC-DM1缀合并未显著改变huCD38抗体的亲和性。同样，在缀合SMCC-DM1后huCD37-50,huCD37-51,huCD37-56和huCD37-57的结合亲和性通过流式细胞术来测定。表观解离常数(Kd)的值从结合曲线来计算，并且对应于：0.43nM，huCD37-50；0.70nM，huCD37-50-SMCC-DM1；2.0nM，huCD37-51；1.6nM，huCD37-51-SMCC-DM1；0.3nM，huCD37-56；0.34nM，huCD37-56-SMCC-DM1；0.30，huCD37-57；和0.34，huCD37-57-SMCC-DM1。该结果证实，SMCC-DM1缀合也并未显著改变huCD37-50,huCD37-51,huCD37-56或huCD37-57抗体的亲和性。
PEG4-mal-DM1缀合物的结合亲和性
在缀合PEG4-mal-DM1后示例性huCD37-3和huCD37-50抗体的结合亲和性通过上述实施例中所述的流式细胞术来测定。表观解离常数(Kd)的值从结合曲线来计算，并且对应于：0.28nM，huCD37-3；0.35nM，huCD37-3-PEG4-mal-DM1；0.68nM，huCD37-50；和1.1nM，huCD37-50-PEG4-mal-DM1缀合物。该结果证实，PEG4-mal-DM1缀合并未显著改变示例性huCD37-3或huCD50抗体的亲和性。
huCD37-3-SMCC-DM1缀合物的促凋亡活性
在缀合SMCC-DM1后huCD37-3的促凋亡活性通过上述在Ramos细胞上膜联蛋白-V染色来评价。使用huCD37-3抗体或huCD37-3-SMCC-DM1缀合物处理导致约40%的膜联蛋白-V阳性Ramos细胞，EC50值为约0.09nM(图21A)。使用非结合对照抗体或非结合SMCC-DM1对照缀合物处理的Ramos细胞仅含有至多4%的膜联蛋白-V阳性细胞。作为比较，使用抗-CD20抗体利妥昔单抗处理导致只有16%的膜联蛋白-V阳性细胞，EC50值为约2nM。相反，TRU-016处理并未增加膜联蛋白-V阳性Ramos细胞的百分率。这证实，在缀合SMCC-DM1后，人抗-CD37抗体huCD37-3的强烈促凋亡活性保持。
huCD37-3-SMCC-DM1缀合物的CDC活性
在缀合SMCC-DM1后huCD37-3的CDC活性在Ramos细胞上在存在5%的人补体的情况下进行评价。使用huCD37-3或huCD37-3-SMCC-DM1处理导致细胞生存力分别降低为53%和73%(图21B)。因此，在美登醇缀合后，示例性huCD37-3抗体的CDC活性保持。
缀合物的ADCC活性
在缀合SMCC-DM1或PEG4-mal-DM1后huCD37-3的ADCC活性在Daudi和Ramos细胞上在存在人NK效应子细胞的情况下通过上述LDH释放测定来评价。如图22A中可见，huCD37-3-SMCC-DM1或huCD37-3-PEG4-mal-DM1缀合物和未缀合的huCD37-3抗体在Daudi细胞上具有类似的ADCC活性。使用huCD37-3,huCD37-3SMCC-DM1或huCD37-3-PEG4-mal-DM1处理导致约41%,39%或36%Daudi细胞胞溶，EC50值分别为0.42ng/mL,1.13ng/mL或0.91ng/mL。使用Ramos细胞作为靶细胞获得类似的结果。如上，huCD37-3-SMCC-DM1或huCD37-3-PEG4-mal-DM1缀合物与未缀合的huCD37-3抗体在Ramos细胞上具有可比较的ADCC活性(图22B)。使用huCD37-3,huCD37-3SMCC-DM1或huCD37-3-PEG4-mal-DM1处理导致约43%,41%或42%Ramos细胞胞溶，EC50值分别为0.95ng/mL，1.33ng/mL或1.57ng/mL。因此，在美登醇缀合后，示例性huCD37-3抗体的有效ADCC活性保持。
通过huCD37-3-SMCC-DM1诱导细胞周期停滞
抗-CD37抗体和缀合物在细胞系中诱导细胞周期停滞的潜力通过碘化丙啶(PI)染色、然后进行流式细胞术分析来评价。以指数方式生长的细胞通过以1,300rpm在RT下离心5分钟而收获，并且以0.5x106细胞/mL重悬浮在完全RPMI培养基中。将细胞以1mL/孔转移至24-孔板(Falcon 3077)至相等的0.5x106细胞/测定。将试验化合物加入各孔中至最终浓度10nM。完全RPMI培养基加入未处理的对照孔。将细胞在37°C下在加湿5%CO2孵育器中孵育过夜16至20hr。第二天，将细胞通过转移至5mL聚苯乙烯管中而收获，并且使用3mL PBS洗涤一次，然后在冰上固定在1mL 70%乙醇中30分钟。然后，将样品再次用3mL PBS洗涤一次，并且重悬浮在0.5mL PBS中。将RNase以5μL/mL加入样品，并且在37°C下孵育30分钟。然后，将样品用碘化丙啶在最终浓度50μg/mL下染色。在PI染色24小时内获取样品。样品运行在FACS Calibur上(BD Biosciences,SanDiego)。FL2-A参数设定为线性规格，并且FL2PTM被调节至G1峰值为约200的位点。在低流速下获取样品，并且每样品收集10,000个事件。细胞在细胞周期中的不同相的分布使用ModFit software(Version 5.11,VeritySoftware House Inc.,USA)来测定。该程序使用峰拟合技术来自动模型化PI数据，并且提供期望的定量数据。所述数据使用标准程序设定来分析。
在和10nM浓度的化合物孵育16-20小时、然后进行碘化丙啶(PI)染色和流式细胞术分析后，huCD37-3和huCD37-3-SMCC-DM1对于BJAB和RL淋巴瘤细胞的细胞周期停滞进行评价。和huCD37-3-SMCC-DM1孵育导致G2/M相中的细胞百分率从未处理的BJAB淋巴瘤细胞时的13%增加至huCD37-3-SMCC-DM1处理的细胞时的95%(图23A)。类似地，和huCD37-3-SMCC-DM1孵育导致G2/M相中的细胞百分率从未处理的RL淋巴瘤细胞时的12%增加至huCD37-3-SMCC-DM1处理的细胞时的33%(图23B)。相反，huCD37-3抗体对于BJAB或RL细胞的细胞周期没有影响。另外，在相同浓度测试的非结合SMCC-DM1缀合物也对两种细胞类型的细胞周期没有影响。这证实，由分离的抗-CD37抗体制备的美登醇缀合物引起CD37-阳性淋巴瘤细胞系的特异性细胞周期停滞。
实施例16
体外细胞毒性测试
使用实施例10中所述用于抗体的体外细胞毒性测试，测量抗CD37抗体-缀合物抑制细胞生长的能力。简言之，将靶细胞以5,000细胞/孔平板接种在100μL的完全RPMI培养基中(RPMI-1640,10%胎牛血清,2mM谷氨酰胺,1%青霉素-链霉素,所有试剂来自Invitrogen)。使用3-倍稀释系列将缀合物稀释到完全RPMI培养基中，并且每孔加入100μL。最终浓度典型地为3x 10-8M至4.6x 10-12M。将细胞在37°C下在加湿5%CO2孵育器中孵育4至5天。保留细胞的生存力通过比色WST-8测定来确定，如用于抗体测定所述，在多孔板读取器(Dojindo Molecular Technologies,Inc.,Rockville,MD,US)中测量450nm(A450)处的吸光度。%生存力通过使各处理的样品值除以具有未处理的细胞的孔的平均至来计算。对于各处理在半-log图中，%生存力值针对抗体-缀合物浓度绘制。
各种抗体的SMCC-DM1缀合物的体外细胞毒性
由各种抗-CD37抗体制备的SMCC-DM1缀合物的体外细胞毒性和非特异性huIgG-SMCC-DM1缀合物的活性进行比较。来自典型细胞毒性测试的结果示于图24A中，这对于Daudi细胞和huCD37-3-SMCC-DM1,huCD37-38-SMCC-DM1,huCD37-50-SMCC-DM1,huCD37-51-SMCC-DM1,huCD37-56-SMCC-DM1,huCD37-57-SMCC-DM1或非结合huIgG1-SMCC-DM1对照缀合物孵育。和对照缀合物相比，所有特异性缀合物导致特异性细胞杀伤，并且在测试的最高抗体浓度下完全降低细胞生存力。EC50值分别对应于0.067nM,0.098nM,0.13nM,0.20nM,0.31nM和0.35nM(分别为huCD37-3,huCD37-38,huCD37-50,huCD37-51,huCD37-56和huCD37-57的SMCC-DM1缀合物)。相反，非结合同种型对照抗体的SMCC-DM1缀合物导致EC50值只有20nM的细胞杀伤性。
同样，图24B示出使用Granta-519细胞的典型细胞毒性测试的结果，所述Granta-519细胞和huCD37-3-SMCC-DM1,huCD37-38-SMCC-DM1,huCD37-50-SMCC-DM1,huCD37-51-SMCC-DM1,或非结合huIgG1-SMCC-DM1对照缀合物孵育5天。在测试的最高抗体浓度下，使用所有特异性SMCC-DM1处理完全降低生存力，EC50为0.047nM,0.074nM,0.12nM和0.25nM(分别为huCD37-3,huCD37-38,huCD37-50和huCD37-51的SMCC-DM1缀合物)。相反，非结合同种型对照抗体的SMCC-DM1缀合物导致EC50值只有20nM的细胞杀伤性。
huCD37-3-SMCC-DM1-SPP-DM1和磺基-mal-DM4缀合物体外细胞毒性
huCD37-3-SMCC-DM1,-SPP-DM1和磺基-mal-DM4缀合物针对Daudi，Granta-519和BJAB细胞的体外细胞毒性和非特异性huIgG-MCC-DM1缀合物的活性进行比较。在测试的最高抗体浓度下，所有测试的缀合物完全降低Daudi细胞的生存力，EC50值为0.065nM,0.12nM和0.14nM(分别为huCD37-3-SMCC-DM1,huCD37-3-SPP-DM1和huCD37-3-磺基-mal-DM4)。相反，非特异性huIgG-SMCC-DM1缀合物的EC50为19nM。同样，在测试的最高抗体浓度下，所有测试的缀合物完全降低Granta-519细胞的生存力，EC50值为0.047nM,0.13nM和0.088nM(分别为huCD37-3-SMCC-DM1,huCD37-3-SPP-DM1和huCD37-3-磺基-mal-DM4)。相反，非特异性huIgG-SMCC-DM1缀合物的EC50为19nM。最后，在测试的最高抗体浓度下，所有测试的缀合物完全降低BJAB细胞的生存力，EC50值为0.041nM,0.11nM和0.11nM(分别为huCD37-3-SMCC-DM1,huCD37-3-SPP-DM1和huCD37-3-磺基-mal-DM4)。相反，非特异性huIgG-SMCC-DM1缀合物的EC50为16nM。
huCD37-3-SMCC-DM1和huCD37-3-PEG4-mal-DM1缀合物体外细胞毒性
huCD37-3-SMCC-DM1和huCD37-3-PEG4-mal-DM1缀合物针对一组淋巴瘤细胞系的体外细胞毒性和非特异性huIgG-SMCC-DM1缀合物的活性进行比较。在测试的最高抗体浓度下，使用huCD37-3缀合物处理完全降低Daudi细胞的生存力，EC50为0.036nM或0.018nM(分别为huCD37-3-SMCC-DM1或huCD37-3-PEG4-mal-DM1缀合物)。相反，非结合同种型对照缀合物降低生存力，EC50为16nM或大于30nM(分别为huIgG-SMCC-DM1或huIgG-PEG4-mal-DM1)。同样，在测试的最高抗体浓度下，使用huCD37-3缀合物处理完全降低Granta-519细胞的生存力，EC50为0.014nM或0.012nM(其分别为huCD37-3-SMCC-DM1或huCD37-3-PEG4-mal-DM1缀合物)。相反，非结合同种型对照缀合物降低生存力，EC50为6.5nM或大于12nM(分别为huIgG-SMCC-DM1或huIgG-PEG4-mal-DM1)。
huCD37-3-SMCC-DM1和huCD37-3-PEG4-mal-DM1缀合物针对一组淋巴瘤细胞系的体外细胞毒性和非特异性huIgG-SMCC-DM1缀合物的活性进行比较。在测试的最高抗体浓度下，使用huCD37-3缀合物处理完全降低BJAB细胞生存力，EC50为0.019nM或0.010nM(分别为huCD37-3-SMCC-DM1或huCD37-3-PEG4-mal-DM1缀合物)。相反，非结合同种型对照缀合物降低生存力，EC50为13nM或17nM(分别为huIgG-SMCC-DM1或huIgG-PEG4-mal-DM1)。同样，在测试的最高抗体浓度下，使用huCD37-3缀合物处理完全降低SU-DHL-4细胞生存力，EC50为0.031nM或0.024nM（分别为huCD37-3-SMCC-DM1或huCD37-3-PEG4-mal-DM1缀合物）。相反，非结合同种型对照缀合物降低生存力，EC50为大于30nM(对于huIgG-SMCC-DM1和huIgG-PEG4-mal-DM1)。huCD37-3-SMCC-DM1缀合物还显示出针对FL细胞系DOHH-2以及CLL细胞系的效力，例如JVM-2和JVM-3(图32B)。
在测试的最高抗体浓度下，使用huCD37-3缀合物处理完全降低Raji细胞生存力，EC50为0.071nM或0.045nM(分别为huCD37-3-SMCC-DM1或huCD37-3-PEG4-mal-DM1缀合物)。相反，非结合同种型对照缀合物降低生存力，EC50为24nM或47nM(分别为huIgG-SMCC-DM1或huIgG-PEG4-mal-DM1)。然后，相同缀合物在称为Raji-VCR的长春新碱-耐性Raji克隆中进行测试。如对于亲本Raji细胞所见，缀合物都显示出特异性细胞杀伤性。在测试的最高抗体浓度下，使用huCD37-3缀合物处理完全降低Raji-VCR细胞生存力，EC50为0.11nM或0.037nM(分别为huCD37-3-SMCC-DM1或huCD37-3-PEG4-mal-DM1缀合物)。相反，非结合同种型对照缀合物降低生存力，EC50为46nM或100nM(分别为huIgG-SMCC-DM1或huIgG-PEG4-mal-DM1)。
在测试的最高抗体浓度下，使用huCD37-3缀合物处理完全降低Namalwa细胞生存力，EC50为0.033nM或0.024nM(分别为huCD37-3-SMCC-DM1或huCD37-3-PEG4-mal-DM1缀合物)。相反，非结合同种型对照缀合物降低生存力，EC50为20nM或大于30nM(分别为huIgG-SMCC-DM1或huIgG-PEG4-mal-DM1)。同样，在测试的最高抗体浓度下，使用huCD37-3缀合物处理完全降低Ramos细胞生存力，EC50为0.16nM或0.069nM(分别为huCD37-3-SMCC-DM1或huCD37-3-PEG4-mal-DM1缀合物)。相反，非结合同种型对照缀合物降低生存力，EC50为20nM(huIgG-SMCC-DM1)和大于30nM(huIgG-PEG4-mal-DM1)。
huCD37-3-SMCC-DM1在抗原阴性Molt-4细胞上的体外细胞毒性
为了进一步证实huCD37-3-SMCC-DM1细胞毒性的特异性，其活性比得上非特异性huIgG-MCC-DM1缀合物针对非-CD37表达Molt-4T细胞急性成淋巴细胞性白血病细胞系的活性。增加浓度的缀合物用在该试验中以捕获相对较差非特异性细胞毒性。HuCD37-3-SMCC-DM1和非特异性缀合物显示出相同细胞毒性，EC50分别为38nM和42nM。
抗-CD37抗体美登醇缀合物的体外细胞毒性的概述
将这些细胞毒性结果结合在一起，明显的是，由分离的抗-CD37抗体制备的缀合物显示出针对一组CD37-阳性淋巴瘤细胞系的特异性细胞毒性(图32B)。在各测试的情况下，对于各CD37-表达细胞系观察到良好特异性窗口，这表明细胞毒性是由于抗-CD37抗体特异性结合靶细胞。另外，huCD37-3-SMCC-DM1和非特异性缀合物显示出针对抗原-阴性Molt-4细胞的相同较差细胞毒性。这证实，对于该示例性缀合物观察到的细胞毒性取决于CD37表达。huCD37-3抗体针对多种细胞系也是活性的，包括DOHH-2,Granata-519,SU-DHL-4,JVM-2和JVM-3。相反，抗-CD37SMIPTRU-016化合物对于这些细胞系中任一种的存活没有直接的影响。抗-CD20抗体在大部分这些细胞系中显示出比huCD37-3更不直接的活性，尽管经常通过定量流式细胞术测量更高的CD20的表达水平(图32A)。
实施例17
抗-CD37抗体和它们的SMCC-DM1缀合物在BJAB异种移植物模型 中的体内效力
抗-CD37抗体和它们SMCC-DM1缀合物在建立的异种移植物模型中使用皮下移植到SCID小鼠中的BJAB淋巴瘤细胞来测试。通过肿瘤体积将动物随机分到治疗组，此时肿瘤达到的平均肿瘤体积为约120mm3并且在细胞以10mg/kg的(A)huCD37-3Ab,huCD37-3-SMCC-DM1,huCD37-50Ab,huCD37-50-SMCC-DM1或(B)huCD37-38Ab,huCD37-38-SMCC-DM1,huCD37-56Ab,huCD37-56-SMCC-DM1接种后12天治疗一次。在图25中，不同治疗组的平均肿瘤体积针对肿瘤细胞接种后的时间进行绘制。明显的是，使用任意抗体的治疗导致平均肿瘤体积中等减小，而使用任意SMCC-DM1缀合物的治疗导致平均肿瘤体积更明显的减小。另外，对于各治疗计算%T/C值，其对应于各治疗组的平均肿瘤体积除以载体治疗组的平均肿瘤体积。%T/C值低于42%的治疗被认为是活性的，而%T/C值低于12%的治疗被认为是高度活性的。使用所有测试的SMCC-DM1缀合物的治疗导致平均肿瘤体积明显的减小。在细胞接种后29天的%T/C值对应于20%,20%,9%或4%(分别为huCD37-3-SMCC-DM1,huCD37-50-SMCC-DM1,huCD37-38-SMCC-DM1或huCD37-56-SMCC-DM1)。
huCD37-3抗体，磺基-mal-DM4-SPP-DM1和SMCC-DM1缀合物在BJAB 异种移植物模型中的体内效力
为了评价另外的美登醇缀合物的体内效力，示例性huCD37-3抗体的磺基-mal-DM4和SPP-DM1缀合物和SMCC-DM1缀合物在异种移植物模型中使用静脉内移植到SCID小鼠中的BJAB淋巴瘤细胞来进行比较。
通过肿瘤体积将动物随机分到治疗组，此时肿瘤达到的平均肿瘤体积为约120mm3并且在细胞以10mg/kg的huCD37-3Ab,huCD37-3-SMCC-DM1,huCD37-3-磺基-mal-DM4或5mg/kg的huCD37-3-SPP-DM1接种后9天治疗一次。在图26中，不同治疗组的平均肿瘤体积针对肿瘤细胞接种后的时间进行绘制。明显的是，使用任意缀合物的治疗导致平均肿瘤体积明显减小。如上所述使用各治疗组的平均肿瘤体积来计算对于各治疗的%T/C值。在细胞接种后21天的%T/C值对应于49%,5%,7%或4%（分别为huCD37-3,huCD37-3-SMCC-DM1,huCD37-3-磺基-mal-DM4或huCD37-3-SPP-DM1）。在121天研究结束时，huCD37-3-磺基-mal-DM4治疗导致8个中3个无肿瘤存活者(TFS)，而huCD37-3-SPP-DM1治疗导致8个中1个TFS。在huCD37-3抗体,huCD37-3-SMCC-DM1或PBS载体对照组中未观察到TFS。这表明huCD37-3抗体的美登醇缀合物例如SMCC-DM1,磺基-mal-DM4或SPP-DM1缀合物在BJAB模型中是高度活性的。
huCD37-3抗体,磺基-mal-DM4,-SPP-DM1和SMCC-DM1缀合物在 SU-DHL-4异种移植物模型中的体内效力
使用皮下移植到SCID小鼠中的SU-DHL-4弥漫性大B-细胞淋巴瘤细胞，第二异种移植物模型用于评价示例性huCD37-3抗体的磺基-mal-DM4和SPP-DM1缀合物的体内效力和SMCC-DM1缀合物的情况的比较。通过体重将动物随机分到治疗组，此时肿瘤建立并且在细胞以10mg/kg的huCD37-3Ab,huCD37-3-SMCC-DM1,huCD37-3-磺基-mal-DM4或5mg/kg的huCD37-3-SPP-DM1接种的17天治疗一次。在图27中，不同治疗组的平均肿瘤体积针对肿瘤细胞接种后的时间进行绘制。明显的是，使用huCD37-3抗体的治疗导致平均肿瘤体积减小，而使用任意缀合物的治疗导致平均肿瘤体积更明显的减小。如上所述计算对于各治疗的%T/C值。在细胞接种后37天的%T/C值对应于32%,1%,1%或3%(分别为huCD37-3,huCD37-3-SMCC-DM1,huCD37-3-磺基-mal-DM4或huCD37-3-SPP-DM1)。在125天研究结束时，huCD37-3-SMCC-DM1或huCD37-3-磺基-mal-DM4治疗导致10个中8个无肿瘤存活者(TFS)，huCD37-3-SPP-DM1治疗导致10个中9个TFS。在huCD37-3抗体或PBS载体对照组中未观察到TFS。这表明，huCD37-3抗体本身使用10mg/kg剂量在SU-DHL-4模型中是活性的。另外，美登醇缀合物例如SMCC-DM1,磺基-mal-DM4或SPP-DM1缀合物增加抗体的效力，并且甚至在该模型中导致更大的效力。
huCD37-3抗体,PEG4-mal-DM1和SMCC-DM1缀合物在BJAB异种 移植物模型中的体内效力
huCD37-3抗体和其PEG4-mal-DM1与SMCC-DM1缀合物在建立的异种移植物模型中使用皮下移植到SCID小鼠中的BJAB淋巴瘤细胞来测试。通过肿瘤体积将动物随机分到治疗组，此时肿瘤达到的平均肿瘤体积为约120mm3并且在细胞以10mg/kg的huCD37-3Ab,huCD37-3-SMCC-DM1或huCD37-3-PEG4-mal-DM1接种后9天治疗一次。如图28中可见，使用缀合物的治疗导致平均肿瘤体积更明显的减小。如上所述使用各治疗组的平均肿瘤体积来计算对于各治疗的%T/C值。在细胞接种后24天的%T/C值对应于48%,16%或5%（分别为huCD37-3,huCD37-3-SMCC-DM1或huCD37-3-PEG4-mal-DM1）。在细胞接种后74天，huCD37-3-SMCC-DM1处理导致9个中1个无肿瘤存活者(TFS)，而huCD37-PEG4-mal-DM1治疗导致9个中1个TFS。在huCD37-3抗体或PBS载体对照组中未观察到TFS。另外，huCD37-3-SMCC-DM1在以5mg/kg的单剂量在该模型中在细胞接种后24天的%T/C值为34％，这也是活性的。这表明，huCD37-3抗体的美登醇缀合物，例如SMCC-DM1或PEG4-mal-DM1缀合物，在BJAB模型中具有较高活性。
huCD37-3抗体,PEG4-mal-DM1和SMCC-DM1缀合物在SU-DHL-4 异种移植物模型中的体内效力
使用皮下移植到SCID小鼠中的SU-DHL-4弥漫性大B-细胞淋巴瘤细胞，建立的异种移植物模型用于测试huCD37-3抗体和其PEG4-mal-DM1与SMCC-DM1缀合物。通过体重将动物随机分到治疗组，并且在细胞以10mg/kg的huCD37-3Ab,huCD37-3-SMCC-DM1或huCD37-3-PEG4-mal-DM1接种的15天治疗一次。在图29中，不同治疗组的平均肿瘤体积针对肿瘤细胞接种后的时间进行绘制。明显的是，使用huCD37-3抗体的治疗导致平均肿瘤体积减小，而使用缀合物的治疗导致平均肿瘤体积更明显的减小。如上所述使用各治疗组的平均肿瘤体积来计算对于各治疗的%T/C值。在细胞接种后38天的%T/C值对应于34%,4%或2%（分别为huCD37-3,huCD37-3-SMCC-DM1,或huCD37-3-PEG4-mal-DM1）。在细胞接种后74天，huCD37-3-SMCC-DM1处理导致10个中8个无肿瘤存活者(TFS)，而huCD37-3-PEG4-mal-DM1治疗导致10个中10个TFS。在huCD37-3抗体或PBS载体对照组中未观察到TFS。这表明，huCD37-3抗体本身使用10mg/kg剂量在SU-DHL-4模型中是活性的。另外，美登醇缀合物例如SMCC-DM1或PEG4-mal-DM1缀合物和未缀合的抗体效力相比显示出增强的效力，并且在该模型中导致甚至更强的效力。huCD37-3-SMCC-DM1缀合物在2.5或5mg/kg的单剂量在该模型中也显示出强烈效力，在细胞接种后37天的%T/C值分别为18%和6%。
huCD37-3抗体,huCD37-3-SMCC-DM1缀合物,利妥昔单抗抗体与 环磷酰胺,长春新碱和泼尼松(CVP)的方案在DoHH2异种移植物模 型中的体内效力
使用皮下移植到SCID小鼠中的DoHH2滤泡性淋巴瘤细胞，建立的异种移植物模型用于测试huCD37-3抗体和其SMCC-DM1缀合物。通过肿瘤体积将动物随机分到治疗组，在接种后12天以单剂量10mg/kg的huCD37-3抗体或huCD37-3-SMCC-DM1缀合物;六剂量的2mg/kg的利妥昔单抗每周两次，三周;或使用单40mg/kg剂量的环磷酰胺和0.5mg/kg的长春新碱,以及5个每日0.2mg/kg剂量的泼尼松(CVP)的方法开始治疗。在图30中，不同治疗组的平均肿瘤体积针对肿瘤细胞接种后的时间进行绘制。使用huCD37-3抗体治疗导致平均肿瘤体积减小，而使用huCD37-3-SMCC-DM1缀合物治疗导致平均肿瘤体积更明显减小。huCD37-3-SMCC-DM1缀合物导致平均肿瘤减小类似于使用利妥昔单抗处理的情况，并且和使用CVP治疗相比，是更耐久性的平均肿瘤减小。肿瘤生长延迟(T-C值)定义为治疗组(T)和对照组(C)肿瘤达到预定尺寸所要求的平均时间(天)，并且对于各治疗组计算以排除无肿瘤存活者。平均治疗肿瘤达到800mm3的T-C值对应于8,25,24和13天（分别为huCD37-3,huCD37-3-SMCC-DM1,利妥昔单抗和CVP）。在研究结束时，在细胞接种后130天，huCD37-3-SMCC-DM1治疗导致9个中1个无肿瘤存活者(TFS)。在huCD37-3抗体,利妥昔单抗,CVP或PBS载体对照组中未观察到TFS。SMCC-DM1缀合物相比于利妥昔单抗显示出可比较的肿瘤生长延迟，相比于未缀合的抗体和使用CVP在DoHH2模型中治疗的情况显示出增强的肿瘤生长延迟。
huCD37-3抗体huCD37-3-SMCC-DM1缀合物ofatumumab抗体和 苯达莫司汀在JVM-3异种移植物模型中的体内效力
使用皮下移植到SCID小鼠中的JVM-3慢性淋巴细胞性白血病细胞，建立的异种移植物模型用于测试huCD37-3抗体和其huCD37-3-SMCC-DM1缀合物。通过肿瘤体积将动物随机分到治疗组，在接种后7天以单剂量10mg/kg的huCD37-3抗体,5或10mg/kg剂量的huCD37-3-SMCC-DM1缀合物，六剂量的5mg/kg的ofatumumab每周两次，三周;或使用单50mg/kg剂量的苯达莫司汀开始治疗。在图31中，不同治疗组的平均肿瘤体积针对肿瘤细胞接种后的时间进行绘制。使用huCD37-3抗体治疗导致平均肿瘤体积减小，而使用huCD37-3-SMCC-DM1缀合物治疗导致平均肿瘤体积更明显减小。如上所述使用各治疗组的平均肿瘤体积来计算对于各治疗的%T/C值。在细胞接种后20天的%T/C值对应于31%,19%,10%,35%和38%（分别为huCD37-3,5mg/kghuCD37-3-SMCC-DM1,10mg/kg huCD37-3-SMCC-DM1,ofatumumab和苯达莫司汀）。在研究结束时，在细胞接种后76天，huCD37和ofatumumab抗体治疗都导致10个中1个无肿瘤存活者(TFS)，而5和10mg/kg的huCD37-3-SMCC-DM1分别导致10个中1个TFS和10个中2个TFS。在苯达莫司汀或PBS载体对照组中未观察到TFS。这表明，huCD37-3抗体本身使用10mg/kg剂量在JVM-3模型中是活性的。美登醇缀合物huCD37-3-SMCC-DM1和未缀合的抗体效力相比显示出增强的效力。另外，使用huCD37-3-SMCC-DM1美登醇缀合物治疗导致比ofatumumab或苯达莫司汀治疗在该模型中甚至更大的效力。
抗-CD37抗体缀合物的体内效力的概述
CD37仍未被评价为美登醇免疫缀合物的靶，然而CD20是这样的情况。CD37结构类似CD20，因为两种抗原都是细胞表面蛋白，其含有4个跨膜域以及一个小和一个大的胞外环。针对任一种抗原的抗体显示出缓慢内化，并且具有慢至中等速度的细胞内代谢(Press et al.1989,Cancer Res.49(17):4906-12,and Press et al.1994,Blood.83(5):1390-7)。CD20抗体的免疫缀合物之前被评价。在一个情况下，抗-CD20抗体的非可裂解MCC-DM1缀合物显示出和未缀合的抗体的相同的效力，而相同抗体的可裂解SPP-DM1缀合物显示出在SCID小鼠中的Granta-519异种移植物模型中改善的效力(Polson AG，Cancer Res 2009;69:2358-64)。类似地，由酸稳定酰胺接头制备的利妥昔单抗的卡奇霉素缀合物在裸小鼠中的Ramos异种移植物模型中不显示出改善的体内效力。只有由酸稳定二甲基酰肼Ac-But接头制备的利妥昔单抗的卡奇霉素缀合物在该研究中显示出改善的体内效力(DiJoseph JF,Cancer Immunol Immunotherapy 2007;56:1107-1117)。
截然不同的是，和未缀合的抗体相比，本发明的数种分离的抗-CD37抗体的非可裂解SMCC-DM1缀合物在BJAB,SU-DHL-4,DoHH2 andJVM-3异种移植物模型中显示出显著改善的体内效力。这暗示，分离的抗体具有独特的性能，其允许它们体内更有效地作为美登醇缀合物例如SMCC-DM1缀合物。
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应意识到，发明详述章节并非发明概述和摘要章节，旨在用于解释权利要求书。如本发明人所思考的，发明概述和摘要章节阐述本发明的一个或多个、但非全部示例性实施方案，并因此不旨在以任何方式限制本发明和所附权利要求书。
上面借助示出实施特定功能及其关系的功能性构造块来描述了本发明。为了方便描述，这些功能性构造块的边界在本文中任意地限定。可以限定替换的边界，只要合适地进行特定的功能及其关系即可。
特定实施方案的前面描述将完全揭示本发明的通常本质，使得通过施用本领域内的知识，在不进行过度的试验的情况下，其他人可容易地修饰和/或适于多种应用这些特定实施方案，而不偏离本发明的通常概念。因此，基于本文中展现的教导和指导，这些修饰和施用旨在公开的实施方案的等同形式的意思和范围内。应该理解，本文中的措辞或属于是为了描述的目的而非限制目的的，使得本说明书的术语或措辞由本领域技术人员依照所述教导和指导来解释。
本发明的宽度和范围不应该被上述示例性实施方案中的任一种所限制，而应该仅依照所附权利要求书和它们的等同形式来限定。
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Claims (66)

1.一种特异性结合CD37的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体或其片段能够诱导补体依赖性细胞毒性(CDC)。
2.如权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体还能够诱导细胞凋亡。
3.如权利要求1或2所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体还能够诱导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。
4.一种抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段特异性结合与选自下列的抗体相同的CD37表位：
(a)包含SEQ ID NO:55的多肽和SEQ ID NO:72的多肽的抗体；
(b)包含SEQ ID NO:59的多肽和SEQ ID NO:75的多肽的抗体；
(c)包含SEQ ID NO:61的多肽和SEQ ID NO:77的多肽的抗体；
(d)包含SEQ ID NO:64的多肽和SEQ ID NO:80的多肽的抗体；
(e)包含SEQ ID NO:66的多肽和SEQ ID NO:82的多肽的抗体；
(f)包含SEQ ID NO:68的多肽和SEQ ID NO:84的多肽的抗体；以及
(g)包含SEQ ID NO:70的多肽和SEQ ID NO:86的多肽的抗体。
5.一种抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段特异性结合CD37并特异性结合SEQ ID NO:180的多肽。
6.如权利要求5所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体或其片段不结合SEQ ID NO:184的多肽。
7.一种抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段特异性结合CD37并特异性结合SEQ ID NO:184的多肽。
8.一种特异性结合CD37的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体或其片段竞争性抑制选自下列的抗体：
(a)包含SEQ ID NO:55的多肽和SEQ ID NO:72的多肽的抗体；
(b)包含SEQ ID NO:59的多肽和SEQ ID NO:75的多肽的抗体；
(c)包含SEQ ID NO:61的多肽和SEQ ID NO:77的多肽的抗体；
(d)包含SEQ ID NO:64的多肽和SEQ ID NO:80的多肽的抗体；
(e)包含SEQ ID NO:66的多肽和SEQ ID NO:82的多肽的抗体；
(f)包含SEQ ID NO:68的多肽和SEQ ID NO:84的多肽的抗体；以及
(g)包含SEQ ID NO:70的多肽和SEQ ID NO:86的多肽的抗体。
9.一种抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段由选自下列的杂交瘤产生：于2010年2月18日保藏于ATCC的ATCC保藏名称PTA-10664，于2010年2月18日保藏于ATCC的ATCC保藏名称PTA-10665，于2010年2月18日保藏于ATCC的ATCC保藏名称PTA-10666，于2010年2月18日保藏于ATCC的ATCC保藏名称PTA-10667，于2010年2月18日保藏于ATCC的ATCC保藏名称PTA-10668，于2010年2月18日保藏于ATCC的ATCC保藏名称PTA-10669，于2010年2月18日保藏于ATCC的ATCC保藏名称PTA-10670。
10.一种特异性结合CD37的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体包含选自下列的多肽序列：
(a)SEQ ID NO:4、5以及6和SEQ ID NO:28、29以及30；
(b)SEQ ID NO:7、8以及9和SEQ ID NO:31、32以及33；
(c)SEQ ID NO:10、11以及12和SEQ ID NO:34、35以及36；
(d)SEQ ID NO:13、14以及15和SEQ ID NO:37、38以及39；
(e)SEQ ID NO:13、14以及15和SEQ ID NO:37、40以及39；
(f)SEQ ID NO:16、17以及18和SEQ ID NO:41、42以及43；
(g)SEQ ID NO:19、20以及21和SEQ ID NO:44、45以及46；
(h)SEQ ID NO:19、20以及21和SEQ ID NO:44、47以及46；
(i)SEQ ID NO:22、23以及24和SEQ ID NO:48、49以及50；
(j)SEQ ID NO:22、23以及24和SEQ ID NO:48、51以及50；
(k)SEQ ID NO:25、26以及27和SEQ ID NO:52、53以及54；以及
(l)包含1、2、3或4个保守氨基酸取代的(a)至(k)的变体。
11.如权利要求10所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体包含与选自下列的多肽序列具有至少90%同一性的多肽序列：
(a)SEQ ID NO:55和SEQ ID NO:72；
(b)SEQ ID NO:56和SEQ ID NO:73；
(c)SEQ ID NO:57和SEQ ID NO:74；
(d)SEQ ID NO:58和SEQ ID NO:74；
(e)SEQ ID NO:59和SEQ ID NO:75；
(f)SEQ ID NO:60和SEQ ID NO:76；
(g)SEQ ID NO:61和SEQ ID NO:77；
(h)SEQ ID NO:62和SEQ ID NO:78；
(i)SEQ ID NO:63和SEQ ID NO:79；
(j)SEQ ID NO:64和SEQ ID NO:80；
(k)SEQ ID NO:65和SEQ ID NO:81；
(l)SEQ ID NO:66和SEQ ID NO:82；
(m)SEQ ID NO:67和SEQ ID NO:83；
(n)SEQ ID NO:68和SEQ ID NO:84；
(o)SEQ ID NO:69和SEQ ID NO:85；
(p)SEQ ID NO:70和SEQ ID NO:86;以及
(q)SEQ ID NO:71和SEQ ID NO:87。
12.如权利要求11所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体包含与选自下列的多肽序列具有至少95%同一性的多肽序列：
(a)SEQ ID NO:55和SEQ ID NO:72；
(b)SEQ ID NO:56和SEQ ID NO:73；
(c)SEQ ID NO:57和SEQ ID NO:74；
(d)SEQ ID NO:58和SEQ ID NO:74；
(e)SEQ ID NO:59和SEQ ID NO:75；
(f)SEQ ID NO:60和SEQ ID NO:76；
(g)SEQ ID NO:61和SEQ ID NO:77；
(h)SEQ ID NO:62和SEQ ID NO:78；
(i)SEQ ID NO:63和SEQ ID NO:79；
(j)SEQ ID NO:64和SEQ ID NO:80；
(k)SEQ ID NO:65和SEQ ID NO:81；
(l)SEQ ID NO:66和SEQ ID NO:82；
(m)SEQ ID NO:67和SEQ ID NO:83；
(n)SEQ ID NO:68和SEQ ID NO:84；
(o)SEQ ID NO:69和SEQ ID NO:85；
(p)SEQ ID NO:70和SEQ ID NO:86;以及
(q)SEQ ID NO:71和SEQ ID NO:87。
13.如权利要求12所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体包含与选自下列的多肽序列具有至少99%同一性的多肽序列：
(a)SEQ ID NO:55和SEQ ID NO:72；
(b)SEQ ID NO:56和SEQ ID NO:73；
(c)SEQ ID NO:57和SEQ ID NO:74；
(d)SEQ ID NO:58和SEQ ID NO:74；
(e)SEQ ID NO:59和SEQ ID NO:75；
(f)SEQ ID NO:60和SEQ ID NO:76；
(g)SEQ ID NO:61和SEQ ID NO:77；
(h)SEQ ID NO:62和SEQ ID NO:78；
(i)SEQ ID NO:63和SEQ ID NO:79；
(j)SEQ ID NO:64和SEQ ID NO:80；
(k)SEQ ID NO:65和SEQ ID NO:81；
(l)SEQ ID NO:66和SEQ ID NO:82；
(m)SEQ ID NO:67和SEQ ID NO:83；
(n)SEQ ID NO:68和SEQ ID NO:84；
(o)SEQ ID NO:69和SEQ ID NO:85；
(p)SEQ ID NO:70和SEQ ID NO:86;以及
(q)SEQ ID NO:71和SEQ ID NO:87。
14.如权利要求1-13任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体或其抗原结合片段是鼠的、非人的、人源化的、嵌合的、再表面化的或人的。
15.如权利要求4-14任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体或抗体片段能够在缺乏接头的情况下在体外诱导表达CD37的细胞的细胞凋亡。
16.如权利要求4-14任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体或其抗原结合片段能够诱导补体依赖性细胞毒性(CDC)。
17.如权利要求4-14任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体能够诱导抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。
18.一种特异性结合CD37的人抗体或人源化抗体或其抗原结合片段，其中，所述人抗体或人源化抗体或其抗原结合片段能够在缺乏接头的情况下在体外诱导表达CD37的细胞的细胞凋亡。
19.如权利要求18所述的人抗体或人源化抗体或其抗原结合片段，其中，所述人抗体或人源化抗体或其抗原结合片段能够诱导补体依赖性细胞毒性(CDC)。
20.如权利要求18或19所述的人抗体或人源化抗体或其抗原结合片段，其中，所述人抗体或人源化抗体或其抗原结合片段能够诱导抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。
21.如权利要求1-20任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体结合人CD37和猕猴CD37。
22.如权利要求1-21任一项所述的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段抗体是全长抗体。
23.如权利要求1-21任一项所述的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段抗体是抗原结合片段。
24.如权利要求1-21任一项所述的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或抗其原结合片段抗体包含：Fab、Fab'、F(ab')2、Fd、单链Fv或scFv、二硫键连接的Fv、V-NAR结构域、IgNar、细胞内抗体、IgGΔCH2、小抗体、F(ab′)3、四链抗体、三链抗体、双链抗体、单结构域抗体、DVD-Ig、Fcab、mAb2、(scFv)2或scFv-Fc。
25.一种特异性结合CD37的多肽，其中，所述多肽包含选自下列的序列：
(a)SEQ ID NO:4、5以及6和SEQ ID NO:28、29以及30；
(b)SEQ ID NO:7、8以及9和SEQ ID NO:31、32以及33；
(c)SEQ ID NO:10、11以及12和SEQ ID NO:34、35以及36；
(d)SEQ ID NO:13、14以及15和SEQ ID NO:37、38以及39；
(e)SEQ ID NO:13、14以及15和SEQ ID NO:37、40以及39；
(f)SEQ ID NO:16、17以及18和SEQ ID NO:41、42以及43；
(g)SEQ ID NO:19、20以及21和SEQ ID NO:44、45以及46；
(h)SEQ ID NO:19、20以及21和SEQ ID NO:44、47以及46；
(i)SEQ ID NO:22、23以及24和SEQ ID NO:48、49以及50；
(j)SEQ ID NO:22、23以及24和SEQ ID NO:48、51以及50；
(k)SEQ ID NO:25、26以及27和SEQ ID NO:52、53以及54；以及
(l)包含1、2、3或4个保守氨基酸取代的(a)至(k)的变体。
26.如权利要求25的多肽，其中，所述多肽包含与选自下列的序列具有至少90%同一性的序列：
(a)SEQ ID NO:55和SEQ ID NO:72；
(b)SEQ ID NO:56和SEQ ID NO:73；
(c)SEQ ID NO:57和SEQ ID NO:74；
(d)SEQ ID NO:58和SEQ ID NO:74；
(e)SEQ ID NO:59和SEQ ID NO:75；
(f)SEQ ID NO:60和SEQ ID NO:76；
(g)SEQ ID NO:61和SEQ ID NO:77；
(h)SEQ ID NO:62和SEQ ID NO:78；
(i)SEQ ID NO:63和SEQ ID NO:79；
(j)SEQ ID NO:64和SEQ ID NO:80；
(k)SEQ ID NO:65和SEQ ID NO:81；
(l)SEQ ID NO:66和SEQ ID NO:82；
(m)SEQ ID NO:67和SEQ ID NO:83；
(n)SEQ ID NO:68和SEQ ID NO:84；
(o)SEQ ID NO:69和SEQ ID NO:85；
(p)SEQ ID NO:70和SEQ ID NO:86;以及
(q)SEQ ID NO:71和SEQ ID NO:87。
27.如权利要求26的多肽，其中，所述多肽包含与选自下列的序列具有至少95%同一性的序列：
(a)SEQ ID NO:55和SEQ ID NO:72；
(b)SEQ ID NO:56和SEQ ID NO:73；
(c)SEQ ID NO:57和SEQ ID NO:74；
(d)SEQ ID NO:58和SEQ ID NO:74；
(e)SEQ ID NO:59和SEQ ID NO:75；
(f)SEQ ID NO:60和SEQ ID NO:76；
(g)SEQ ID NO:61和SEQ ID NO:77；
(h)SEQ ID NO:62和SEQ ID NO:78；
(i)SEQ ID NO:63和SEQ ID NO:79；
(j)SEQ ID NO:64和SEQ ID NO:80；
(k)SEQ ID NO:65和SEQ ID NO:81；
(l)SEQ ID NO:66和SEQ ID NO:82；
(m)SEQ ID NO:67和SEQ ID NO:83；
(n)SEQ ID NO:68和SEQ ID NO:84；
(o)SEQ ID NO:69和SEQ ID NO:85；
(p)SEQ ID NO:70和SEQ ID NO:86;以及
(q)SEQ ID NO:71和SEQ ID NO:87。
28.如权利要求27的多肽，其中，所述多肽包含与选自下列的序列具有至少99%同一性的序列：
(a)SEQ ID NO:55和SEQ ID NO:72；
(b)SEQ ID NO:56和SEQ ID NO:73；
(c)SEQ ID NO:57和SEQ ID NO:74；
(d)SEQ ID NO:58和SEQ ID NO:74；
(e)SEQ ID NO:59和SEQ ID NO:75；
(f)SEQ ID NO:60和SEQ ID NO:76；
(g)SEQ ID NO:61和SEQ ID NO:77；
(h)SEQ ID NO:62和SEQ ID NO:78；
(i)SEQ ID NO:63和SEQ ID NO:79；
(j)SEQ ID NO:64和SEQ ID NO:80；
(k)SEQ ID NO:65和SEQ ID NO:81；
(l)SEQ ID NO:66和SEQ ID NO:82；
(m)SEQ ID NO:67和SEQ ID NO:83；
(n)SEQ ID NO:68和SEQ ID NO:84；
(o)SEQ ID NO:69和SEQ ID NO:85；
(p)SEQ ID NO:70和SEQ ID NO:86;以及
(q)SEQ ID NO:71和SEQ ID NO:87。
29.一种分离的细胞，其产生权利要求1-24任一项所述的抗体或其抗原结合片段或权利要求25-28任一项所述的多肽。
30.一种制备权利要求1-24任一项所述的抗体或其抗原结合片段或权利要求25-28任一项所述的多肽的方法，所述方法包括：(a)培养权利要求29所述的细胞；以及(b)从所述培养的细胞分离所述抗体、其抗原结合片段或多肽。
31.一种具有式(A)-(L)-(C)的免疫缀合物，其中：
(A)是权利要求1-24任一项所述的抗体或其抗原结合片段或权利要求25-28任一项所述的多肽；
(L)是接头；
(C)是细胞毒性剂；以及
其中所述接头(L)连接(A)与(C)。
32.一种具有式(A)-(L)-(C)的免疫缀合物，其中：
(A)是特异性结合CD37的抗体或其抗原结合片段；
(L)是非可裂解接头；
(C)是细胞毒性剂；以及
其中所述接头(L)连接(A)与(C)。
33.一种具有式(A)-(L)-(C)的免疫缀合物，其中：
(A)是特异性结合CD37的抗体或其抗原结合片段；
(L)是接头；
(C)是美登醇；以及
其中所述接头(L)连接(A)与(C)。
34.如权利要求33所述的免疫缀合物，其中，所述接头是非可裂解接头。
35.如权利要求31-34任一项所述的免疫缀合物，其还包含第二(C)。
36.如权利要求35所述的免疫缀合物，其还包含第三(C)。
37.如权利要求35所述的免疫缀合物，其还包含第四(C)。
38.如权利要求31-34任一项所述的免疫缀合物，其包含2-6(C)。
39.如权利要求31-34任一项所述的免疫缀合物，其包含3-4(C)。
40.如权利要求31-39任一项所述的免疫缀合物，其中，所述接头选自可裂解接头、非可裂解接头、亲水性接头以及基于二羧酸的接头。
41.如权利要求40所述的免疫缀合物，其中，所述接头选自：N-琥珀酰亚胺基4-(2-吡啶基二硫代)戊酸酯(SPP);N-琥珀酰亚胺基4-(2-吡啶基二硫代)丁酸酯(SPDB)或N-琥珀酰亚胺基4-(2-吡啶基二硫代)-2-磺基丁酸酯(磺基-SPDB);N-琥珀酰亚胺基4-(马来酰亚胺基甲基)环己烷羧酸酯(SMCC);N-琥珀酰亚胺基4-(马来酰亚胺基甲基)环己烷羧酸酯(磺基SMCC);N-琥珀酰亚胺基-4-(碘代乙酰基)-氨基苯甲酸酯(SIAB);以及N-琥珀酰亚胺基-[(N-马来酰亚胺基丙酰胺基)-四乙二醇]酯(NHS-PEG4-马来酰亚胺)。
42.如权利要求41所述的免疫缀合物，其中，所述接头是N-琥珀酰亚胺基-[(N-马来酰亚胺基丙酰胺基)-四乙二醇]酯(NHS-PEG4-马来酰亚胺)。
43.如权利要求31-32和35-42任一项所述的免疫缀合物，其中，所述细胞毒性剂选自：美登醇、美登醇类似物、多柔比星、改性的多柔比星、苯二氮卓类、紫杉烷、CC-1065、CC-1065类似物、倍癌霉素、倍癌霉素类似物、刺孢霉素、多拉司他汀、多拉司他汀类似物、aristatin、托马霉素衍生物，以及来普霉素衍生物或所述制剂的前药。
44.如权利要求43所述的免疫缀合物，其中，所述细胞毒性剂是美登醇。
45.如权利要求44所述的免疫缀合物，其中，所述细胞毒性剂是N(2')-脱乙酰基-N(2')-(3-巯基-1-氧丙基)-美登素(DM1)或N(2')-脱乙酰基-N2-(4-巯基-4-甲基-1-氧戊基)-美登素(DM4)。
46.一种药物组合物，其包含权利要求1-24任一项所述的抗体或其抗原结合片段、权利要求25-28任一项所述的多肽，或权利要求31-45任一项所述的免疫缀合物以及药学上可接受的载体。
47.一种药物组合物，其包含权利要求31-45任一项所述的免疫缀合物，其中所述缀合物具有每个(A)约3至约4的平均值。
48.如权利要求41所述的药物组合物，其中，所述免疫缀合物具有每个(A)约3.5(C)的平均值。
49.如权利要求41所述的药物组合物，其中，所述免疫缀合物具有每个(A)约3.5±0.5(C)的平均值。
50.如权利要求46-49任一项所述的药物组合物，其还包含第二抗癌剂。
51.一种诊断试剂，其包含被标记了的权利要求1-24任一项所述的抗体或其抗原结合片段、权利要求25-28任一项所述的多肽或权利要求31-45任一项所述的免疫缀合物。
52.如权利要求51所述的诊断试剂，其中，所述标记物选自放射标记物、荧光团、生色团、显像剂以及金属离子。
53.一种试剂盒，其包含权利要求1-24任一项所述的抗体或其抗原结合片段、权利要求25-28任一项所述的多肽、权利要求31-45任一项所述的免疫缀合物或权利要求46-50任一项所述的药物组合物。
54.一种用于抑制表达CD37的细胞的生长的方法，所述方法包括使所述细胞与权利要求1-24任一项所述的抗体或其抗原结合片段、权利要求25-28任一项所述的多肽、权利要求31-45任一项所述的免疫缀合物或权利要求46-50任一项所述的药物组合物接触。
55.一种用于治疗患有癌症的患者的方法，所述方法包括对作为受治疗者的所述患者进行治疗有效量的下述物质的施用：权利要求1-24任一项所述的抗体或其抗原结合片段、权利要求25-28任一项所述的多肽、权利要求31-45任一项所述的免疫缀合物或权利要求46-50任一项所述的药物组合物。
56.如权利要求55所述的方法，其还包括对所述受治疗者进行第二抗癌剂的施用。
57.如权利要求56所述的方法，其中，所述第二抗癌剂为化学治疗剂。
58.如权利要求55-57任一项所述的方法，其中，所述癌症选自下列：B细胞淋巴瘤，非何杰金氏淋巴瘤（NHL），前B细胞成淋巴细胞白血病/淋巴瘤和成熟B细胞新生物，B细胞慢性淋巴细胞白血病(CLL)/小淋巴细胞白血病(SLL)，B细胞前淋巴细胞白血病，淋巴浆细胞淋巴瘤，外套细胞淋巴瘤(MCL)，滤泡性淋巴瘤(FL)，低度、中度以及高度(FL)，皮肤滤泡性淋巴瘤，缘区B细胞淋巴瘤，MALT型缘区B细胞淋巴瘤，结节缘区B细胞淋巴瘤，脾型缘区B细胞淋巴瘤，毛细胞性白血病，弥漫性大B细胞淋巴瘤，伯基特淋巴瘤，浆细胞瘤，浆细胞性骨髓瘤，移植后淋巴增生性障碍，沃尔登斯特伦氏氏巨球蛋白血症，以及间变大细胞淋巴瘤(ALCL)。
59.一种分离的多核苷酸，其包含编码与选自SEQ ID NO:55-87的序列具有至少90%同一性的多肽的序列。
60.如权利要求59所述的分离的多核苷酸，其中，所述序列与选自SEQ ID NO:55-87的序列具有至少95%的同一性。
61.如权利要求60所述的分离的多核苷酸，其中，所述序列与选自SEQ ID NO:55-87的序列具有至少99%的同一性。
62.如权利要求59-61任一项所述的分离的多核苷酸，其中，所述多核苷酸包括与SEQ ID NO:121-151具有至少90%同一性的序列。
63.如权利要求62所述的分离的多核苷酸，其中，所述多核苷酸包括与SEQ ID NO:121-151具有至少95%同一性的序列。
64.如权利要求63所述的分离的多核苷酸，其中，所述多核苷酸包括与SEQ ID NO:121-151具有至少99%同一性的序列。
65.一种载体，其包含权利要求59-64任一项所述的多核苷酸。
66.一种宿主细胞，其包含权利要求65所述的载体。
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