ES2532635T3 - Conjugados de antraciclina, proceso para su preparación y su uso como compuestos antitumorales - Google Patents

Conjugados de antraciclina, proceso para su preparación y su uso como compuestos antitumorales Download PDF

Info

Publication number
ES2532635T3
ES2532635T3 ES09790394.2T ES09790394T ES2532635T3 ES 2532635 T3 ES2532635 T3 ES 2532635T3 ES 09790394 T ES09790394 T ES 09790394T ES 2532635 T3 ES2532635 T3 ES 2532635T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
antibody
ant
drug
receptor
thio
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES09790394.2T
Other languages
English (en)
Inventor
Italo Beria
Michele Caruso
John A. Flygare
Vittoria Lupi
Rita Perego
Paul Polakis
Andrew Polson
Matteo Salsa
Susan D. Spencer
Barbara Valsasina
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Nerviano Medical Sciences SRL
Genentech Inc
Original Assignee
Nerviano Medical Sciences SRL
Genentech Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Nerviano Medical Sciences SRL, Genentech Inc filed Critical Nerviano Medical Sciences SRL
Application granted granted Critical
Publication of ES2532635T3 publication Critical patent/ES2532635T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2863—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for growth factors, growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D498/00—Heterocyclic compounds containing in the condensed system at least one hetero ring having nitrogen and oxygen atoms as the only ring hetero atoms
    • C07D498/12—Heterocyclic compounds containing in the condensed system at least one hetero ring having nitrogen and oxygen atoms as the only ring hetero atoms in which the condensed system contains three hetero rings
    • C07D498/14—Ortho-condensed systems
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/535—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with at least one nitrogen and one oxygen as the ring hetero atoms, e.g. 1,2-oxazines
    • A61K31/5375—1,4-Oxazines, e.g. morpholine
    • A61K31/5383—1,4-Oxazines, e.g. morpholine ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6807—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug or compound being a sugar, nucleoside, nucleotide, nucleic acid, e.g. RNA antisense
    • A61K47/6809—Antibiotics, e.g. antitumor antibiotics anthracyclins, adriamycin, doxorubicin or daunomycin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding

Abstract

Un derivado de antraciclina de Fórmula (IIc) Ant-L-(Z)m-X (IIc) en la que Ant se selecciona entre la estructura:**Fórmula** en la que la línea ondulada indica la unión a L; L es un conector seleccionado entre -N(R)-, -N(R)m(alquileno C1-C12)-, -N(R)m(alquenileno C2-C8)-, - N(R)m(alquinileno C2-C8)-, -N(R)m(CH2CH2O)n-, y la estructura:**Fórmula** en la que las líneas onduladas indican las uniones a Ant y Z; y Z es un espaciador opcional seleccionado entre -CH2C(O)-, -CH2C(O)NR(alquileno C1-C12)-, y las estructuras:**Fórmula** X es un grupo funcional reactivo seleccionado entre maleimida, tiol, amino, bromuro, p-toluenosulfonato, yoduro, hidroxilo, carboxilo, disulfuro de piridilo, y N-hidroxisuccinimida; R es H, alquilo C1-C12 o arilo C6-C20; R1 y R2 se seleccionan independientemente entre una cadena lateral de aminoácido; Z1 se selecciona entre -(alquileno C1-C12)-, -(alquenileno C2-C8)-, -(alquinileno C2-C8)- y -(CH2CH2O)n-; m es 0 o 1; y n es de 1 a 6; o en el que el derivado de antraciclina se selecciona entre las estructuras:**Fórmula** en la que Z es alquileno C1-C12,**Fórmula**

Description

Conjugados de antraciclina, proceso para su preparación y su uso como compuestos antitumorales
Campo de la invención
La presente invención se refiere a conjugados de antraciclinas terapéuticamente útiles con vehículos tales como anticuerpos policlonales y monoclonales, proteínas o péptidos de origen natural o sintético; métodos para su preparación, composición farmacéutica que los contiene y tales compuestos para su uso en el tratamiento de determinados tumores en mamíferos.
Antecedentes de la invención
Las antraciclinas son compuestos antibióticos que presentan actividad citotóxica. Los estudios han indicado que las antraciclinas pueden intervenir para eliminar células mediante un número de mecanismos diferentes que incluyen: 1) intercalado de las moléculas de fármaco en el ADN de la célula inhibiendo de ese modo la síntesis de ácidos nucleicos dependientes de ADN; 2) producción por el fármaco de radicales libres que a continuación reaccionan con macromoléculas celulares para causar daño a las células o 3) interacciones de las moléculas de fármaco con la membrana celular [véase, por ejemplo, C. Peterson et al.," Transport And Storage Of Anthracicline In Experimental Systems And Human Leukemia" en Anthracicline Antibiotics In Cancer Therapy; N.R. Bachur, "Free Radical Damage" id. en las páginas 97-102]. Debido a su potencial citotóxico, se han usado antraciclinas en el tratamiento de numerosos cánceres tales como leucemia, carcinoma de mama, carcinoma de pulmón, adenocarcinoma de ovarios y sarcomas [véase por ejemplo, P.H-Wiernik, en Anthracicline: Current Status And New Developments p 11]. Las antraciclinas usadas normalmente incluyen doxorrubicina, epirrubicina, idarrubicina y daunomicina.
En los últimos años se han sintetizado muchas antraciclinas nuevas altamente citotóxicas. Por ejemplo la nemorrubicina, el derivado de antraciclina que porta un anillo de morfolino sustituido unido en la posición C-3’ del resto de azúcar, ha mostrado actividad antitumoral prometedora en tumores de murino experimentales [véase: J. W. Lown, Bioactive Molecules (1988) vol 6: 55-101] y en la actualidad está en ensayos en fase clínica para el tratamiento de carcinoma hepatocelular [véase: C. Sessa, O. Valota, C. Geroni, Cardiovascular Toxicology (2007) 7 (2): 75-79]. Aunque estos compuestos pueden ser útiles en el tratamiento de neoplasias y otras patologías en las que se busca eliminar una población seleccionada de células, a menudo su eficacia terapéutica está limitada por la toxicidad dependiente de la dosis asociada con su administración.
Se han hecho esfuerzos para intentar mejorar el efecto terapéutico de estos compuestos mediante la unión de la antraciclina a anticuerpos o a vehículos diferentes. Se informa de un ejemplo de una antraciclina conjugada con anticuerpos, por ejemplo, en el documento de patente EP 0328147 de Bristol Myers, en el documento de patente WO 9202255 de Farmitalia Carlo Erba o en la Patente de Estados Unidos Nº US 5776458 de Pharmacia & Upjohn.
Otros derivados tricíclicos de morfolino antraciclina interesantes, caracterizados por una actividad elevada, se describieron y se reivindicaron en la solicitud de patente Internacional nº WO 98/02446 (1997) de M. Caruso et al.. Entre estos derivados, un compuesto particularmente activo es PNU-159682, que se describe en Quintieri, L., Geroni, C. et al. en Clinical Cancer Research (2005) 11 (4): 160R-1617. El compuesto PNU-159682 tiene la fórmula (IIA) tal como se define a continuación en el presente documento, y los siguientes nombres químicos:
5,12-naftacenodiona, 7,8,9,10-tetrahidro-6,8,11-trihidroxi-8-(hidroxiacetil)-1-metoxi-10-[[(1S,3R,4aS,9S,9aR,10aS)octahidro-9-metoxi-1-metil-1H-pirano[4’,3’:4,5]oxazolo[2,3-c][1,4]oxazin-3-il]oxi]-, (8S,10S)-(9CI);
5,12-naftacenodiona, 7,8,9,10-tetrahidro-6,8,11-trihidroxi-8-(hidroxiacetil)-1-metoxi-10-[(octahidro-9-metoxi-1-metil1H-pirano[4’,3’:4,5]oxazolo[2,3-c][1,4]oxazin-3-il)oxi]-, [1S-[1α,3β(8R*,10R*),4aβ,9α,9aα,10aβ]] o (8S,10S)-6,8,11trihidroxi-8-(hidroxiacetil)-1-metoxi-10-{[(1S,3R,4aS,9S,9aR,10aS)-9-metoxi-1-metiloctahidro-1Hpirano[4’,3’:4,5][1,3]oxazolo[2,3-c][1,4]oxazin-3-il]oxi;-7,8,9,10-tetrahidrotetraceno-5,12-diona.
Se ha establecido terapia de anticuerpos para el tratamiento dirigido de pacientes con cáncer, trastornos inmunológicos y angiogénicos (Carter, P. (2006) Nature Reviews Immunology 6: 343-357). El uso de conjugados de anticuerpo-fármaco (ADC), es decir inmunoconjugados, para la administración local de agentes citotóxicos o citostáticos, es decir fármacos para eliminar o inhibir células tumorales en el tratamiento del cáncer, dirige la administración del resto de fármaco a tumores, y la acumulación intracelular en los mismos, mientras que la administración sistémica de estos agentes farmacológicos sin conjugar puede dar como resultado niveles inaceptables de toxicidad para las células normales así como para las células tumorales que se busca eliminar (Xie et al. (2006) Expert. Opin. Biol. Ther. 6 (3): 281-291; Kovtun et al. (2006) Cancer Res. 66 (6): 3214-31.21; Law et al. (2006) Cancer Res. 6 ((4): 2328-2337; Wu et al. (2005) Nature Biotech. 23 (9): 1137-1145; Lambert J. (2005) Current Opin. in Pharmacol. 5: 543-549; Hamann P. (2005) Expert Opin. Ther. Patents 15 (9): 1.087-1103; Payne, G. (2003) Cancer Cell 3: 207-212; Trail et al. (2003) Cancer Immunol. Immunother. 52: 328-337; Syrigos y Epenetos (1999) Anticancer Research 19: 605-614). De este modo se busca una eficacia máxima con la toxicidad mínima. Los esfuerzos para diseñar y refinar ADC se han centrado en la selectividad de anticuerpos monoclonales (mAb) así
como el mecanismo de acción del fármaco, unión al fármaco, relación de fármaco/anticuerpo (carga), y propiedades de liberación del fármaco (McDonagh (2006) Protein Eng. Design & Sel.; Doronina et al. (2006) Bioconj. Chem. 17: 114-124; Erickson et al. (2006) Cancer Res. 66 (8): 1-8; Sanderson et al. (2005) Clin. Cancer Res. 11: 843-852; Jeffrey et al. (2005) J. Med. Chem. 48: 1344-1358; Hamblett et al. (2004) Clin. Cancer Res. 10: 7063-7070). Los restos farmacológicos pueden transmitir sus efectos citotóxicos y citostáticos mediante mecanismos que incluyen la unión a tubulinas, unión a ADN, o inhibición de la topoisomerasa. Algunos fármacos citotóxicos tienden a ser inactivos o menos activos cuando se conjugan a anticuerpos grandes o ligandos receptores de proteínas.
Se cree que el análogo de antraciclina, doxorrubicina (ADRIAMYCIN®) interactúa con el ADN mediante el intercalado y la inhibición de la progresión de la enzima topoisomerasa II, que estira el ADN para la transcripción. La doxorrubicina estabiliza el complejo de la topoisomerasa II después de que haya roto la cadena de ADN para la replicación, evitando que la doble hélice del ADN se libere y de ese modo se detiene el proceso de replicación. La doxorrubicina y la daunorrubicina (DAUNOMYCIN) son prototipos de agentes quimioterapéuticos de productos naturales citotóxicos (Sessa et al. (2007) Cardiovasc. Toxicol. 7: 75-79). Se han preparado y estudiado inmunoconjugados y profármacos de la daunorrubicina y la doxorrubicina (Kratz et al. (2006) Current Med. Chem.
13: 477-523; Jeffrey et al. (2006) Bioorganic & Med. Chem. Letters 16: 358-362; Torgov et al. (2005) Bioconj. Chem.
16: 717-721; Nagy et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. 97: 829-834; Dubowchik et al. (2002) Bioorg. & Med. Chem. Letters 12: 1529-1532; King et al. (2002) J. Med. Chem. 45: 4336-4343; Patente de Estados Unidos Nº 6630579). El conjugado de anticuerpo-fármaco, BR96-doxorrubicina, reacciona específicamente con el antígeno asociado a tumor Lewis-Y y sea evaluado en estudios en fase I y II (Saleh et al. (2000) J. Clin. Oncology 18: 2282-2292; Ajani et al. (2000) Cancer Jour. 6: 78-81; Tolcher et al. (1999) J. Clin. Oncology 17: 478-484).
Los análogos de morfolino de doxorrubicina y daunorrubicina, formados por ciclación en el grupo aminoglucósido, tienen mayor potencia (Acton et al. (1984) J. Med. Chem. 638-645; Patentes de Estados Unidos Nº 4464529; Nº 4672057; Nº 5304687). La nemorrubicina es un análogo semisintético de la doxorrubicina con un grupo 2metoximorfolino en el aminoglucósido de la doxorrubicina y ha estado en evaluación clínica (Grandi et al. (1990) Cancer Treat. Rew. 17: 133; Ripamonti et al. (1992) Brit. J. Cancer 65: 703; ), incluyendo ensayos en fase II/III para carcinoma hepatocelular (Sun et al. (2003) Proceedings of the American Society for Clinical Oncology 22, Abs 1448; Quintieri (2003) Proceedings of the American Association of Cancer Research, 44: 1ª Ed, Abs 4649; Pacciarini et al. (2006) Jour. Clin. Oncology 24: 14116).
La nemorrubicina se denomina (8S,10S)-6,811-trihidroxi-10-((2R,4S,5S,6S)-5-hidroxi-4-((S)-2-metoximorfolino)-6metiltetrahidro-2H-piran-2-iloxi)-8-(2-hidroxiacetil)-1-metoxi-7,8,9,10-tetrahidrotetraceno-5,12-diona, con Nº de Reg. CAS 108852-90-0, y tiene la estructura:
Se han caracterizado varios metabolitos de la nemorrubicina (MMDX) a partir de microsomas hepáticos, que incluyen PNU-159682, (Quintieri et al. (2005) Clinical Cancer Research, 11 (4): 1608-1617; Beulz-Riche et al. (2001) Fundamental & Clinical Pharmacology, 15 (6): 373-378; documento de patente EP 0889898; documento de patente WO 2004/082689; documento de patente WO 2004/082579). PNU-159682 era notablemente más citotóxico que la nemorrubicina y la doxorrubicina in vitro, y era eficaz en modelos tumorales in vivo. PNU-159682 (fórmula (IIA) se denomina 3’-desamino-3",4’-anhidro-[2"(S)-metoxi-3"(R)-oxi-4"-morfolinil]doxorrubicina, y tienen la estructura:
Se han descrito determinados conjugados de anticuerpo-fármaco de PNU-159682 ("METABOLITO DE NEMORRUBICINA Y CONJUGADOS Y MÉTODOS ANÁLOGOS DE ANTICUERPOS-FÁRMACO", documento de 5 patente PCT/US2009/031199, presentado el 16 de enero de 2009).
Sumario de la invención
Un aspecto de la presente invención es proporcionar nuevos conjugados derivados de antraciclina con vehículos 10 tales como anticuerpos monoclonales o policlonales reactivos con una población seleccionada de células, proteínas, péptidos u otros vehículos de origen sintético reactivos con tejidos receptores.
Otro aspecto es un proceso para la preparación de tales conjugados así como compuestos intermedios útiles.
15 Los conjugados, proceso para su preparación y compuestos intermedios de la invención se definen en las reivindicaciones.
Los conjugados de este tipo por lo general se pueden caracterizar mediante la fórmula (I)
20 [Ant-L-Z-]m -T (I)
en la que
Ant es un resto de derivado de antraciclina,
25 L es un conector, Z es un espaciador, m es un número entero de 1 a 30 y T es un vehículo tal como proteína, péptido, anticuerpo monoclonal o policlonal o un derivado modificado químicamente del mismo adecuado para su unión al resto o restos de [Ant-L-Z-], o un vehículo polimérico;
30 caracterizados por que el resto de derivado de antraciclina que representa Ant se puede liberar para dar un derivado de antraciclina de fórmula (II):
en la que R1 es átomo de hidrógeno, grupo hidroxi o metoxi y R2 es un grupo alcoxi C1-C5, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
El resto de derivado de antraciclina se une al vehículo a través de un espaciador conector [L-Z-], y el enlace entre el derivado de antraciclina y la rama del conector se puede escindir en condiciones fisiológicas de modo que libera un derivado de antraciclina de fórmula (II) tal como se ha definido anteriormente, que es el agente bioactivo.
5 Por ejemplo, los conjugados en los que el enlace entre el derivado de antraciclina y el conector es sensible a condiciones ácidas o a condiciones reductoras pueden liberar el derivado de antraciclina en las condiciones que por lo general se encuentran dentro de la célula, por ejemplo, en vesículas de lisosomas.
Un conjugado de la presente invención es preferentemente útil para tratar tipos específicos de cáncer que incluyen,
10 pero no se limitan a: carcinoma tal como vejiga, mama, colon, riñón, hígado, pulmón, incluyendo cáncer de pulmón de células pequeñas, esófago, vesícula biliar, ovario, páncreas, estómago, cuello uterino, tiroides, próstata, y piel, incluyendo carcinoma de células escamosas; tumores hematopoyéticos de linaje linfoide que incluyen leucemia, leucemia linfocítica aguda, leucemia linfoblástica aguda, linfoma de linfocitos B, linfoma de linfocitos T, linfoma de Hodgkin, linfoma no Hodgkin, linfoma de células pilosas y linfoma de Burkett; tumores hematopoyéticos de linaje
15 mieloide, que incluyen leucemias mieloides aguda y crónica, síndrome mielodisplásico y leucemia promielocítica; tumores de origen mesenquimal, que incluyen fibrosarcoma y rabdomiosarcoma; tumores del sistema nervioso central y periférico, que incluyen astrocitoma neuroblastoma, glioma y schwannomas; otros tumores, que incluyen melanoma, seminoma, teratocarcinoma, osteosarcoma, xeroderma pigmentoso, queratoxantoma, cáncer folicular de tiroides y sarcoma de Kaposi.
20 Los Conjugados de la presente invención también son útiles preferentemente para tratar trastornos específicos de proliferación celular tales como, por ejemplo, hiperplasia de próstata benigna, poliposis adenomatosa familiar, neurofibromatosis, psoriasis, proliferación de células lisas vasculares asociada con aterosclerosis, fibrosis pulmonar, artritis, glomerulonefritis y estenosis y reestenosis post-quirúrgica.
25 Los conjugados de derivados de antraciclina de fórmula (I) se pueden preparar a través de un proceso que consiste en transformaciones sintéticas convencionales; tal proceso y los compuestos intermedios usados en tal proceso también se proporcionan en la presente invención.
30 La presente invención también proporciona una composición farmacéutica que comprende un conjugado de derivado de antraciclina de la invención o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo y un excipiente o diluyente farmacéuticamente aceptable.
Un aspecto de la invención es un derivado de antraciclina de fórmula (IIc) tal como se define en la reivindicación 1, 35 Ant-L-(Z)m-X (IIc)
en la que Ant es un derivado de antraciclina seleccionado entre la estructura
en la que la línea ondulada indica la unión al conector L; Z es un espaciador opcional; m es 0 o 1; X es un grupo funcional reactivo; y n es un número entero de 1 a 6.
45 Un aspecto de la invención es un compuesto de conjugado de anticuerpo-fármaco (ADC) tal como se define en la reivindicación 5 que comprende un anticuerpo unido de forma covalente mediante un conector L y un espaciador opcional Z a uno o más restos de fármaco derivados de antraciclina D, teniendo el compuesto la fórmula (Ic)
Ab-(L-Zm7-D)p (Ic) 50
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en la que p es un número entero de 1 a 8.
Breve descripción de las figuras
La Figura 1 muestra en una forma de gráfico la estabilidad del compuesto 2 que se muestra en la Tabla I a pH 5,2 en la que en el eje (Y) aparece el porcentaje de la cantidad del compuesto de fórmula (IIA) tal como se define a continuación, y en el eje (X) el tiempo en horas. Este gráfico demuestra la sensibilidad a ácido de la unión acetálica de la invención tal como se indica mediante el aumento de la liberación del compuesto libre de fórmula (IIA) a partir del conjugado a pH ácido. La Figura 2 muestra un proceso a modo de ejemplo para preparar compuestos de Fórmula Ia por reacción del derivado de antraciclina de Fórmula II con compuestos de éter de vinilo (X) o (IX) para dar el compuesto de acetal (XI), hidrólisis a un compuesto carboxi (XII), y activación para formar un éster (XIII) de N-hidroxi succinimida (NHS), listo para la conjugación con un compuesto vehículo. La Figura 3a muestra un proceso a modo de ejemplo para preparar compuestos de Fórmula Ia por reacción del éster (XIII) de N-hidroxi succinimida (NHS) activado con reactivo de amino-tiol (XXI) para dar XXII que se puede hacer reaccionar con el compuesto intermedio (VI) de vehículo de piridil-disulfuro (T) para dar el conjugado de derivado de antraciclina unido a disulfuro (Ia), o se puede hacer reaccionar el compuesto intermedio (XXII) de vehículo de maleimida (T) para dar el conjugado de derivado de antraciclina unido a maleimida (Ia). La Figura 3b muestra procesos a modo de ejemplo para preparar compuestos de Fórmula Ia por reacción del éster (XIII) de N-hidroxi succinimida (NHS) activado con reactivo de amino-éster (XVIII), seguido de hidrólisis de éster para dar el derivado de carboxi antraciclina (XIX), que se puede activar como un éster de NHS y acoplar con el compuesto intermedio de vehículo de amino T, por ejemplo un anticuerpo, para dar el conjugado de derivado de antraciclina unido a amida (Ia). La Figura 3c muestra procesos a modo de ejemplo para preparar compuestos de Fórmula Ia por reacción del éster (XIII) de N-hidroxi succinimida (NHS) activado con grupo amino o tiol del vehículo T (XIV), por ejemplo anticuerpo para dar el conjugado de derivado de antraciclina unido a amida o tioamida (Ia). La Figura 4 muestra un proceso a modo de ejemplo para hacer reaccionar un derivado de antraciclina (II) con un derivado de acil hidrazida (XXV) para formar hidrazona (XXVI) seguido de conjugación con un reactivo de vehículo T para dar el conjugado de derivado de antraciclina (Ib). La Figura 5a muestra procesos a modo de ejemplo: (2a) hacer reaccionar hidrazona derivada de antraciclina
(XXVI)
con un compuesto de vehículo de tiol o amino T (XIV) para dar un conjugado de derivado de antraciclina (Ib); (2b) hacer reaccionar una hidrazona derivada de antraciclina (XXVI) con el reactivo (XXVII), seguido de desprotección con (XXVIII) y acoplamiento con el compuesto (XVII) de vehículo de carboxilo T para dar un conjugado de derivado de antraciclina (Ib); y (2d) condensación del compuesto desprotegido (XXVIII) con el compuesto (XX) de vehículo de aldehído T para dar el conjugado de derivado de antraciclina (Ib). La Figura 5b muestra un proceso a modo de ejemplo: (2c) hacer reaccionar hidrazona derivada de antraciclina
(XXVI)
con el reactivo (XXIX), seguido de desprotección y acoplamiento con el compuesto de vehículo de amino T para dar el conjugado de derivado de antraciclina (Ib) La Figura 5c muestra procesos a modo de ejemplo: (2e) hacer reaccionar hidrazona derivada de antraciclina
(XXVI)
con el reactivo (XXXI) para dar (XXXII), seguido de (2e") acoplamiento con el compuesto de vehículo de disulfuro de piridilo (VI) para dar el derivado de conjugado de antraciclina (Ib), y (2e’) acoplamiento de (XXXII) con el compuesto de vehículo de maleimida (V) para dar el conjugado de derivado de antraciclina (Ib). La Figura 6 muestra un proceso a modo de ejemplo para hacer reaccionar un derivado de antraciclina (II) con una acil hidrazida, disulfuro de piridilo (XXXIII) para formar la hidrazona de disulfuro de piridilo (XXXIV) seguido de conjugación con un reactivo de vehículo T para dar el conjugado de derivado de antraciclina (Ib). La Figura 7a muestra procesos a modo de ejemplo: (3a) hacer reaccionar un derivado de antraciclina (XXXIV) con un vehículo de tiol (XIV) para dar el conjugado de derivado de antraciclina (Ib); (3b) hace reaccionar un derivado de antraciclina (XXXIV) con un compuesto de tiol (XXXV) para dar el compuesto de disulfuro de amina
(XXXVI) que se acopla con un reactivo de vehículo de carboxilo T para dar el conjugado de derivado de antraciclina (Ib); y (3d) condensación del compuesto desprotegido (XXXVI) con compuesto de vehículo de aldehído T (XX) para dar el conjugado de derivado de antraciclina (Ib). La Figura 7b muestra un proceso a modo de ejemplo (3c) hace reaccionar un derivado de antraciclina (XXXIV) con éster de tiol (XXXVII), seguido de desprotección del compuesto de disulfuro de carboxilo (XXXVIII), y acoplamiento con el vehículo de amino T (XIV) para dar el conjugado de derivado de antraciclina (Ib). La Figura 7c muestra procesos a modo de ejemplo: (3e) hace reaccionar un reactivo de tiol (XXXIX) derivado de antraciclina (XXXIV) para dar el disulfuro de tiol (XL), (3e’) acoplamiento del disulfuro de tiol (XL) con el compuesto de vehículo de disulfuro de piridilo (VI) para dar el conjugado de derivado de antraciclina (Ib); y acoplamiento del disulfuro de tiol (XL) con el compuesto de vehículo de maleimida (V) para dar el conjugado de derivado de antraciclina (Ib). La Figura 7d muestra una ruta de síntesis para el compuesto intermedio de fármaco-conector N-[6-(2,5-dioxo2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)hexanoil]-L-valil-N5-carbamoil-N-[4-({[(4-{[(2S,4S)-2,5,12-trihidroxi-7-metoxi-4{[(1S,3R,4aS,9S,9aR,10aS)-9-metoxi-1-metiloctahidro-1H-pirano[4’,3’:4,5][1,3]oxazolo[2,3-c][1,4]oxazin-3-il]oxi}6,11-dioxo-1,2,3,4,6,11-hexahidrotetracen-2-il]carbonil}piperazin-1-il)carbonil]oxi}metil)fenil]-L-ornitinamida 55. La Figura 8 muestra una representación de la viabilidad celular in vitro de SK-BR-3 a los 3 días frente a concentraciones en nM de: exposición continua de PNU-159682 libre de fármaco, incubación de 1 h de PNU159682, NHS-cetal-Ant 50, maleimida-cetal-Ant 51, maleimida-hidrazona-Ant 52, y tiopiridina-hidrazona-Ant 53. La Figura 9 muestra una representación de la viabilidad celular in vitro de BT-474 a los 3 días frente a concentraciones en nM de: exposición continua de PNU-159682 libre de fármaco, incubación de 1 h de PNU
159682, NHS-cetal-Ant 50, maleimida-cetal-Ant 51, maleimida-hidrazona-Ant 52, y tiopiridina-hidrazona-Ant 53. La Figura 10 muestra una representación de la viabilidad celular in vitro de BT-474 a los 3 días frente a concentraciones en nM de: exposición continua de PNU-159682 libre de fármaco, incubación de 1 h de PNU159682, NHS-cetal-Ant 50, maleimida-cetal-Ant 51, maleimida-hidrazona-Ant 52, y tiopiridina-hidrazona-Ant 53. La Figura 11 muestra una representación de la viabilidad celular in vitro de células Her2 resistentes a doxorrubicina (DoxRes) a los 3 días frente a concentraciones en nM de: exposición continua de PNU-159682 libre de fármaco, incubación de 1 h de PNU-159682, NHS-cetal-Ant 50, maleimida-cetal-Ant 51, maleimidahidrazona-Ant 52, y tiopiridina-hidrazona-Ant 53. La línea de células Her2 DoxRes también se conoce como "AdrRes Her2". La Figura 12 muestra una representación de la viabilidad celular in vitro de SK-BR-3 a los 3 días frente a concentraciones de: trastuzumab, trastuzumab-MCC-DM1 101, tio-trastuzumab (HC A114C)-maleimida cetal-Ant 102, tio-trastuzumab (HC A114C)-maleimida hidrazona-Ant 103. (Numeración del anticuerpo de cadena pesada mediante el esquema de numeración de Kabat). La Figura 13 muestra una representación de la viabilidad celular in vitro de BT-474 a los 3 días frente a concentraciones de: trastuzumab, trastuzumab-MCC-DM1 101, tio-trastuzumab (HC A114C)-maleimida cetal-Ant 102, tio-trastuzumab (HC A114C)-maleimida hidrazona-Ant 103. La Figura 14 muestra una representación de la viabilidad celular in vitro de MCF-7 a los 3 días frente a concentraciones de: trastuzumab, trastuzumab-MCC-DM1 101, tio-trastuzumab (HC A114C)-maleimida cetal-Ant 102, tio-trastuzumab (HC A114C)-maleimida hidrazona-Ant 103. La Figura 15 muestra una representación de la viabilidad celular in vitro de células Her2 resistentes a doxorrubicina (DoxRes) a los 3 días frente a concentraciones de: trastuzumab, trastuzumab-MCC-DM1 101, tiotrastuzumab (HC A114C)-maleimida cetal-Ant 102, tio-trastuzumab (HC A114C)-maleimida hidrazona-Ant 103. La Figura 16 muestra una representación la viabilidad celular in vitro de SK-BR-3 a los 3 días frente a concentraciones de: anti-CD22 NHS cetal-Ant 110, trastuzumab, trastuzumab-MCC-DM1 101, tio-trastuzumab (HC A114C)-NHS-cetal-Ant 105. La Figura 17 muestra una representación de la viabilidad celular in vitro de BT-474 a los 3 días frente a concentraciones de: anti-CD22 NHS cetal-Ant 110, trastuzumab, trastuzumab-M:CC-DM1 101, tio-trastuzumab (HC A114C)-NHS-cetal-Ant 105. La Figura 18 muestra una representación de la viabilidad celular in vitro de MCF-7 a los 3 días frente a concentraciones de: anti-CD22 NHS cetal-Ant 110, trastuzumab, trastuzumab-MCC-DM1 101, tio-trastuzumab (HC A114C)-NHS-cetal-Ant 105. La Figura 19 muestra una representación de la viabilidad celular in vitro de células Her2 resistentes a doxorrubicina (DoxRes) a los 3 días frente a concentraciones de: anti-CD22 NHS cetal-Ant 110, trastuzumab, trastuzumab-MCC-DM1 101, tio-trastuzumab (HC A114C)-NHS-cetal-Ant 105. La Figura 20 muestra una representación de la viabilidad celular in vitro de SK-BR-3 a los 3 días frente a concentraciones (µg/ml) de: tio-trastuzumab (HC A114C)-maleimida cetal-Ant 102, tio-trastuzumab (HC A114C)maleimida hidrazona-Ant 103, tio-trastuzumab (HC A114C)-tiopiridina hidrazona-Ant 104, tio-trastuzumab (HC A114C)-NHS-cetal-Ant 105, trastuzumab-MCC-DM1 101, tio-trastuzumab (HC A114C)-MC-vc-PAB-MMAE 106. La Figura 21 muestra una representación de la viabilidad celular in vitro de SK-BR-3 a los 3 días frente a concentraciones de: trastuzumab, tio-anti-CD22 (HC A114C)-maleimida cetal-Ant 107, tio-anti-CD22 (HC A114C)-maleimida hidrazona-Ant 108, tio-anti-CD22 (HC A114C)-tiopiridina hidrazona-Ant 109, anti-CD22-NHScetal-Ant 110, fármaco libre de PNU-159682. La Figura 22 muestra una representación de la viabilidad celular in vitro de BT-474 a los 3 días frente a concentraciones de: tio-trastuzumab (HC A114C)-maleimida cetal-Ant 102, tio-trastuzumab (HC A114C)maleimida hidrazona-Ant 103, tio-trastuzumab (HC A114C)-tiopiridina hidrazona-Ant 104, tio-trastuzumab (HC A114C)-NHS-cetal-Ant 105, trastuzumab-MCC-DM 101, tio-trastuzumab (HC A114C)-MC-vc-PAB-MMAE 106. La Figura 23 muestra una representación de la viabilidad celular in vitro de BT-474 a los 3 días frente a concentraciones de: trastuzumab, tio-anti-CD22 (HC A114C)-maleimida cetal-Ant 107, tio-anti-CD22 (HC A114C)-maleimida hidrazona-Ant 108, tio-anti-CD22 (HC A114C)-tiopiridina hidrazona-Ant 109, anti-CD22-NHScetal-Ant 110, fármaco libre de PNU-159682. La Figura 24 muestra una representación de la viabilidad celular in vitro de MCF-7 a los 3 días frente a concentraciones de: tio-trastuzumab (HC A114C)-maleimida cetal-Ant 102, tio-trastuzumab (HC A114C)maleimida hidrazona-Ant 103, tio-trastuzumab (HC A114C)-tiopiridina hidrazona-Ant 104, tio-trastuzumab (HC A114C)-NHS-cetal-Ant 105, trastuzumab-MCC-DM1 101, tio-trastuzumab (HC A114C)-MC-vc-PAB-MMAE 106. La Figura 25 muestra una representación de la viabilidad celular in vitro de MCF-7 a los 3 días frente a concentraciones de: trastuzumab, tio-anti-CD22 (HC A114C)-maleimida cetal-Ant 107, tio-anti-CD22 (HC A114C)-maleimida hidrazona-Ant 108, tio-anti-CD22 (HC A114C)-tiopiridina hidrazona-Ant 109, anti-CD22-NHScetal-Ant 110, fármaco libre de PNU-159682. La Figura 26 muestra una representación de la viabilidad celular in vitro de células Her2 resistentes a doxorrubicina (DoxRes) a los 3 días frente a concentraciones de: tio-trastuzumab (HC A114C)-maleimida cetal-Ant 102, tio-trastuzumab (HC A114C)-maleimida hidrazona-Ant 103, tio-trastuzumab (HC A114C)-tiopiridina hidrazona-Ant 104, tio-trastuzumab (HC A114C)-NHS-cetal-Ant 105, trastuzumab-MCC-DM1 101, tiotrastuzumab (HC A114C)-MC-vc-PAB-MMAE 106. La Figura 27 muestra una representación de la viabilidad celular in vitro de células Her2 resistentes a doxorrubicina (DoxRes) a los 3 días frente a concentraciones de: trastuzumab, tio-anti-CD22 (HC A114C)maleimida cetal-Ant 107, tio-anti-CD22 (HC A114C)-maleimida hidrazona-Ant 108, tio-anti-CD22 (HC A114C)
tiopiridina hidrazona-Ant 109, anti-CD22-NHS-cetal-Ant 110, fármaco libre de PNU-159682. La Figura 28 muestra una representación de la viabilidad celular in vitro de células Her2 resistentes a doxorrubicina (DoxRes) a los 3 días frente a concentraciones de: tio-trastuzumab (HC A114C)-maleimida cetal-Ant 102, tio-trastuzumab (HC A1I4C)-maleimida hidrazona-Ant 103, tio-trastuzumab (HC A114C)-tiopiridina hidrazona-Ant 104, tio-trastuzumab (HC A114C)-NHS-cetal-Ant 105, trastuzumab-MCC-DM1 101, tiotrastuzumab (HC A114C)-MC-vc-PAB-MMAE 106. La Figura 29 muestra una representación de la viabilidad celular in vitro de células Her2 resistentes a doxorrubicina (DoxRes) a los 3 días frente a concentraciones de: trastuzumab, tio-anti-CD22 (HC A114C)maleimida cetal-Ant 107, tio-anti-CD22 (HC A114C)-maleimidahidrazona-Ant 108, tio-anti-CD22 (HC A114C)tiopiridina hidrazona-Ant 109, anti-CD22-NHS-cetal-Ant 110, fármaco libre de PNU-159682, todo más verapamilo. La Figura 30 muestra una representación del cambio del volumen tumoral medio in vivo en el tiempo en tumores de xenoinjerto de Bjab-luc de linfoma de Burkitt inoculados en ratones CB17 SCID después de una sola dosificación intravenosa (iv) en el día 0 con: (1) Vehículo, (2) 1 mg/kg de tio-anti-CD22 (HC A114C)-MC-vc-PAB-MMAE 111, (3) 1 mg/kg de tio-trastuzumab (HC A114C)-maleimida cetal-Ant 102, (4) 5 mg/kg de tio-trastuzumab (HC A114C)-maleimida cetal-Ant 102, (5) 1 mg/kg de tio-anti-CD22 (HC A114C)-maleimida cetal-Ant 107, (6) 5 mg/kg de tio-anti-CD22 (HC A114C)-maleimida cetal-Ant 107, (7) 1 mg/kg de tio-trastuzumab (HC A114C)maleimida hidrazona-Ant 103, (8) 1 mg/kg de tio-anti-CD22 (HC A114C)-maleimida hidrazona-Ant 108, (9) 8,77 ug/kg de fármaco libre de PNU-159682 (exposición de 26 ug/m2), emparejado con la dosis del fármaco de 1 mg/kg de conjugados de anticuerpo-fármaco. La Figura 31 muestra una representación del cambio del volumen tumoral medio in vivo en el tiempo en tumores de aloinjerto de mama MMTV-HER2 Fo5 inoculados en ratones CRL nu/nu después de una sola dosificación iv en el día 0 con: (1) Vehículo, (2) 5 /mg/kg de trastuzumab-MCC-DM1 101, (3) 10 mg/kg de trastuzumab-MCC-DM1 101, (4) 5 mg/kg de tio-trastuzumab (HC A114C)-maleimida cetal-Ant 102, (5) 10 mg/kg de tio-trastuzumab (HC A114C)-maleimida cetal-Ant 102, (6) 5 mg/kg de tio-anti-CD22 (HC A114C)-maleimida cetal-Ant 107, (7) 10 mg/kg de tio-anti-CD22 (HC A114C)-maleimida cetal-Ant 107, (8) 5 /mg/kg de trastuzumab-MCC-DM1 101 +5 mg/kg de tio-trastuzumab (HC A114C)-maleimida cetal-Ant 102. La Figura 32 muestra una representación del cambio del volumen tumoral medio in vivo en el tiempo en tumores de xenoinjerto de LnCap-Ner inoculados en ratones n ale SCID-beige después de una sola dosificación iv en el día 0 con: (1) Vehículo, (2) 1 mg/kg de tio-anti-steapl (HC A114C)-MC-vc-PAB-MMAE 112, (3) 3 mg/kg de tioanti-steapl (HC A114C)-MC-vc-PAB-MMAE 112, (4) 1 mg/kg de tio-anti-steapl (HC A114C)-maleimida cetal-Ant 113, (5) 3 mg/kg de tio-anti-steapl (HC A114C)-maleimida cetal-Ant 113, (6) 6 mg/kg de tio-anti-steapl (HC A114C)-maleimida cetal-Ant 113, (7) 1 mg/kg de tio-anti-CD22 (HC A114C)-maleimida cetal-Ant 107, (8) 3 mg/kg de tio-anti-CD22 (HC A114C)-maleimida cetal-Ant 107, (9) 6 mg/kg de tio-anti-CD22 (HC A114C)-maleimida cetal-Ant 107.
Descripción detallada de realizaciones a modo de ejemplo
A continuación se hará referencia con detalle a determinadas realizaciones de la invención, cuyos ejemplos se ilustran en las estructuras y fórmulas adjuntas. Aunque la invención se describirá en conjunto con las realizaciones enumeradas, se entenderá que no pretenden limitar la invención a esas realizaciones. Por el contrario, la invención pretende cubrir todas las alternativas, modificaciones, y equivalentes, que se pueden incluir dentro del alcance de la presente invención tal como se define en las reivindicaciones. Un experto en la materia reconocerá muchos métodos y materiales similares o equivalentes a los que se describen en el presente documento, que se podrían usar en la práctica de la presente invención. La presente invención no se limita en modo alguno a los métodos y materiales que se describen. A menos que se defina de otro modo, las expresiones técnicas y científicas usadas en el presente documento tienen el mismo significado tal como normalmente lo entiende un experto habitual en la materia a la que pertenece la presente invención, y son coherentes con: Singleton et al., (1994) Dictionary of Microbiology and Molecular Biology, 2ª Ed., J. Wiley & Sons, Nueva York, NY; y Janeway, C., Travers, P., Walport, M., Shlomchik (2001) Immuno Biology, 5ª Ed., Garland Publishing, Nueva York.
Definiciones
A menos que se indique de otro modo, los siguientes términos y expresiones tal como se usan en el presente documento pretenden tener los siguientes significados.
Cuando en el presente documento se usan nombres comerciales, los solicitantes pretenden incluir de forma independiente la formulación del producto del nombre comercial, el fármaco genérico, y el principio o principios farmacéuticos activos del producto del nombre comercial.
"Derivado de antraciclina" es un metabolito de nemorrubicina, o compuesto análogo, que incluye pero no se limita a PNU-159682.
"Conjugado de derivado de antraciclina" es un compuesto formado por un derivado de antraciclina unido de forma covalente a través de un conector para un resto de vehículo, que incluyen anticuerpos, proteínas o péptidos. Los compuestos de conjugado de derivado de antraciclina incluyen compuestos de conjugado de anticuerpo-fármaco (ADC).
La expresión "cadena lateral de aminoácido" incluye los grupos que se encuentran en: (i) aminoácidos de origen natural tales como alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, glutamina, ácido glutámico, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina , treonina, triptófano, tirosina, y valina; (ii) aminoácidos secundarios tales como ornitina y eritrulina; (iii) aminoácidos no naturales, beta-aminoácidos, análogos sintéticos y derivados de aminoácidos de origen natural; y (iv) todos los enantiómeros, diastereómeros, isoméricamente enriquecidos, marcados isotópicamente (por ejemplo, 2H, 3H, 14C, 15N), formas protegidas, y mezclas racémicas de los mismos.
El término "anticuerpo" en el presente documento se usa en el sentido más amplio y cubre específicamente anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, dímeros, multímeros, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos), y fragmentos de anticuerpos, siempre y cuando presenten la actividad biológica deseada (Miller et al. (2003) Jour. of Immunology 170: 854-4861). Los anticuerpos pueden ser murinos, humanos, humanizados, quiméricos, o derivados de otras especies. Un anticuerpo es una proteína generada por el sistema inmune que es capaz de reconocer y unirse a un antígeno específico. (Janeway, C, Travers, P., Walport, M., Shlomchik (2001) Immuno Biology, 5ª Ed., Garland Publishing, Nueva York). Un antígeno diana por lo general tiene numerosos sitios de unión, también denominados epítopos, reconocidos por las CDR en múltiples anticuerpos. Cada anticuerpo que se une específicamente a un epítopo diferente tiene una estructura diferente. Por lo tanto, un antígeno puede tener más de un anticuerpo correspondiente. Un anticuerpo incluye una molécula de inmunoglobulina de longitud completa o una porción inmunológicamente activa de una molécula de inmunoglobulina de longitud completa, es decir, una molécula que contiene un sitio de unión a antígeno que se une de forma inmunoespecífica a un antígeno de una diana de interés o parte del mismo, incluyendo tales dianas, pero no se limitan a, célula o células cancerosas que producen anticuerpos autoinmunes asociados con una enfermedad autoinmune. La inmunoglobulina puede ser de cualquier tipo (por ejemplo, IgG, IgE, IgM, IgD, e IgA), clase (por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2) o subclase de molécula de inmunoglobulina. Las inmunoglobulinas pueden tener su origen en cualquier especie, que incluyen origen humano, murino, o de conejo.
"Fragmentos de anticuerpo" comprende una porción de un anticuerpo de longitud completa, por lo general la unión a antígeno o región variable del mismo. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen fragmentos de Fab, Fab’, F(ab’)2, y Fv; diacuerpos; anticuerpos lineales; fragmentos producidos mediante una biblioteca de expresión de Fab, anticuerpos anti-idiotípicos (anti-Id), CDR (región que determina la complementariedad), y fragmentos de unión a epítopo de cualquiera de los mencionados anteriormente que se unen de forma inmunoespecífica a antígenos de células cancerosas, antígenos virales o antígenos microbianos, moléculas de anticuerpo de una sola cadena; y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpo.
La expresión "anticuerpo monoclonal", tal como se usa en el presente documento, se refiere a un anticuerpo obtenido a partir de una población de anticuerpos básicamente homogéneos, es decir los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos excepto por posibles mutaciones de origen natural que pueden estar presentes en cantidades menores. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos, siendo dirigidos frente a un solo sitio antigénico. Además, en contraste con las preparaciones de anticuerpo policlonal que incluyen diferentes anticuerpos dirigidos frente a diferentes determinantes (epítopos), cada anticuerpo monoclonal se dirige frente a un solo determinante en el antígeno. Además de su especificidad, los anticuerpos monoclonales son ventajosos por que se pueden sintetizar sin contaminar por otros anticuerpos. El modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo tal como se obtiene a partir de una población básicamente homogénea de anticuerpos, y no se debe interpretar que requiere producción del anticuerpo mediante cualquier método en particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales a usar de acuerdo con la presente invención se pueden preparar mediante el método de hibridoma que se describió primero en Kohler et al. (1975) Nature 256: 495, o se pueden preparar mediante métodos de ADN recombinante (véase, la Patente de Estados Unidos Nº 4816567). Los anticuerpos monoclonales también se pueden aislar a partir de bibliotecas de anticuerpos de fagos usando las técnicas que se describen en Clackson et al. (1991) Nature, 352: 624-628; Marks et al. (1991) J. Mol. Biol., 222: 581-597.
Los anticuerpos monoclonales en el presente documento incluyen específicamente anticuerpos "quiméricos" en los que una porción de la cadena pesada y/o ligera es idéntica a u homóloga a las secuencias correspondientes en los anticuerpos derivados de una especie en particular o que pertenecen a una clase o subclase de anticuerpo en particular, mientras que el resto de la cadena o cadenas es idéntico a u homólogo a las secuencias correspondientes en los anticuerpos derivados de otra especie o que pertenecen a otra clase o subclase de anticuerpo, así como fragmentos de tales anticuerpos, siempre y cuando presenten la actividad biológica deseada (Patente de Estados Unidos Nº 4816567; y Morrison et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6851-6855). Los anticuerpos quiméricos incluyen anticuerpos "privatizados" que comprenden secuencias de unión a antígeno de dominio variable derivadas de un primate no humano (por ejemplo, Mono del Viejo Mundo o Simio) y secuencias de región constante humana.
Un "anticuerpo intacto" en el presente documento es uno que comprende un dominio de VL y de VH, así como un dominio constante de cadena ligera (CL) y dominios constantes de cadena pesada, CH1, CH2 y CH3. Los dominios constantes pueden ser dominios constantes de secuencias nativas (por ejemplo, dominios constantes de secuencias nativas humanas) o variante de secuencias de aminoácidos de los mismos. El anticuerpo intacto puede tener una o más "funciones efectoras" que se refieren a las actividades biológicas atribuibles a la región de Fc (una región de Fc de secuencia narrativa por región de Fc de variante de secuencia de aminoácidos) de un anticuerpo. Los ejemplos
de funciones efectoras de anticuerpos incluyen unión a C1q; citotoxicidad dependiente de complemento; unión al receptor de Fc; citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC); fagocitosis; y regulación negativa de receptores de la superficie celular tales como receptor de linfocitos B y PCR.
Dependiendo de la secuencia de aminoácidos del dominio constante de sus cadenas pesadas, los anticuerpos intactos se pueden asignar a diferentes "clases". Existen cinco clases principales de anticuerpos intactos: IgA, IgD, IgE, IgG, e IgM, y varios de éstos se pueden dividir adicionalmente en "subclases" (isotipos), por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, e IgA2. Los dominios constantes de cadena pesada que corresponden las diferentes clases de anticuerpos se denominan α, δ, ε, γ,y µ, respectivamente. Se conocen bien las estructuras de las subunidades y las configuraciones tridimensionales de diferentes clases de inmunoglobulinas.
Un "receptor ErbB" es una proteína tirosina quinasa receptora que pertenece a la familia de receptores de ErbB que son mediadores importantes del crecimiento, diferenciación y supervivencia celular. La familia de receptores de ErbB incluye cuatro miembros distintos que incluyen receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR, ErbB1, HER1), HER2 (ErbB2 o p185ncu), HER3 (ErbB3) y HER4 (ErbB4 o tyro2). El receptor ErbB comprenderá por lo general un dominio extracelular, que se pueden unir a un ligando de ErbB; un dominio transmembrana lipófilo; un dominio conservado de citosina quinasa intracelular; y un dominio de señalización carboxilo-terminal que alberga varios restos de tirosina que se pueden fosforilar. El receptor ErbB puede ser un receptor ErbB de "secuencia nativa" o una "variante de secuencia de aminoácidos" del mismo. El receptor ErbB puede ser un receptor ErbB humanos de secuencia nativa. En consecuencia, un "miembro de la familia de receptores de ErbB" es EGFR (ErbB1), ErbB2, ErbB3, ErbB4 o cualquier otro receptor ErbB conocido en la actualidad o a identificar en el futuro. La identificación sistemática de la identidad de secuencias ha dado como resultado la identificación de otros dos miembros de la familia de receptores de ErbB; ErbB3 (Patentes de Estados Unidos Nº 5183884; Nº 5480968; Kraus et al. (1989) PNAS (USA) 86: 9193-9197) y ErbB4 (documento de patente EP 599274; Plowman et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 174C-1750; y Plowman et al. (1993) Nature 366: 473-475). Ambos receptores presentan aumento de la expresión en al menos algunas líneas celulares de cáncer de mama. Se han caracterizado anticuerpos anti-ErbB2 (Patentes de Estados Unidos Nº 5677171; Nº 5821337; Nº 6054297; Nº 6165464; Nº 6407213; Nº 6719971; Nº 6800738; Fendly et al. (1990) Cancer Research 50: 1550-1558; Kotts et al. (1990) In Vitro 26 (3): 59A; Sarup et al. (1991) Growth Regulation 1: 72-82; Shepard et al. J. (1991) Clin. Immunol. 11 (3): 117-127; Kumar et al. (1991) Mol. Cell. Biol. 11 (2): 979-986; Lewis et al. (1993) Cancer Immunol. Immunother. 37: 255-263; Pietras et al. (1994) Oncogene 9: 1829-1838; Vitetta et al. (1994) Cancer Research 54: 5301-5309; Sliwkowski et al. (1994 J. Biol. Chem. 269 (20): 14661-14665; Scott et al. (1991) J. Biol. Chem. 266: 14300-5; D’souza et al. Proc. Natl. Acad. Sci. (1994)
91: 7202-7206; Lewis et al. (1996) Cancer Research 56: 1457-1465; y Schaefer et al. (1997) Oncogene 15: 13851394.
Las formas "humanizadas" de anticuerpos no humanos (por ejemplo, roedor) son anticuerpos quiméricos que contienen secuencias mínimas derivada de inmunoglobulina no humana. Para la mayor parte, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en los que restos de una región hipervariable del receptor se reemplazan con restos de una región hipervariable de una especie no humana (anticuerpo dador) tal como ratón, rata, conejo o primate no humano que tienen la especificidad, afinidad, y capacidad deseadlas. En algunos casos, restos de región de marco conservado (FR) de la inmunoglobulina humana se reemplazan con restos no humanos correspondientes. Además, los anticuerpos humanizados pueden comprender restos que no se encuentran en el anticuerpo receptor o en el anticuerpo dador. Estas modificaciones se hacen para refinar adicionalmente el rendimiento del anticuerpo. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá básicamente todos de al menos uno, y por lo general dos, dominios variables, en los que todos o básicamente todos los bucles hipervariables corresponden a los de una inmunoglobulina no humana y todos, o básicamente todos, los de las FR son los de una secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado también comprenderá opcionalmente al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina (Fc), por lo general la de una inmunoglobulina humana (Jones et al. (1986) Nature, 321: 522-525; Riechmann et al. (1988) Nature 332: 323-329; y Presta, (1992) Curr. Op. Struct. Biol., 2: 593-596). Los anticuerpos anti-ErbB2 humanizados incluyen huMAb4D5-1, huMAb4D5-2, huMAb4D5-3, huMAb4D5-4, huMAb4D5-5, huMAb4D5-6, huMAb4D5-7 y huMAb4D5-8 (HERCEPTIN®, trastuzumab) tal como se describe en la Tabla 3 de la Patente de Estados Unidos Nº 5821337; 520C9 humanizado (documento de patente WO 93/21319) y anticuerpos 2C4 humanizados.
Los términos "tratar" y "tratamiento" se refieren a tratamiento tanto terapéutico como profiláctico o medidas preventivas, en los que el objetivo es prevenir o ralentizar (disminuir) un cambio o trastorno fisiológico no deseado, tal como el desarrollo o la propagación del cáncer. Para fines de la presente invención, los resultados clínicos beneficiosos o deseados incluyen, pero no se limitan a, alivio de síntomas, disminución del alcance de la enfermedad, patología estabilizada (es decir, que no empeora), retraso hubo ralentización de la progresión de la enfermedad, mejora o alivio de la patología, y remisión (ya sea parcial o total), ya sea detectable o indetectable. "Tratamiento" también puede hacer referencia a prolongar la supervivencia en comparación con la supervivencia esperada si no se recibiera tratamiento. Aquéllos con necesidad de tratamiento incluyen LOS que ya padecen la afección o trastorno así como los propensos a padecer la afección o trastorno o aquéllos en los que se va a prevenir la afección o trastorno.
Un "trastorno" es cualquier afección que se beneficiaría del tratamiento de la presente invención. Éste incluye trastornos o enfermedades, crónicos y agudos, que incluyen las afecciones patológicas que predisponen al mamífero al trastorno en cuestión. Los ejemplos no limitantes de trastornos a tratar en el presente documento incluyen tumores benignos y malignos; leucemia y neoplasias linfoides, en particular cáncer de mama, ovario, estómago, endometrio, glándulas salival, pulmón, riñón, colon, tiroides, pancreático, de próstata o de vejiga; neuronal, glial, astrocital, hipotalámico y otros trastornos glandulares, macrófagos, epiteliales, del estroma y blastocoélicos; y trastornos inflamatorios, angiogénicos e inmunológicos. Un trastorno a modo de ejemplo a tratar de acuerdo con la presente invención es un tumor maligno, sólido.
La expresión "cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a una cantidad de un fármaco eficaz para tratar una enfermedad o trastorno en un mamífero. En el caso de cáncer, la cantidad terapéuticamente eficaz del fármaco puede: (i) reducir el número de células cancerosas; (ii) reducir el tamaño del tumor; (iii) inhibir, retardar, ralentizar hasta cierto punto y preferentemente detener la infiltración de células cancerosas en órganos periféricos; (iv) inhibir (es decir, ralentizar hasta cierto punto y preferentemente detener) la metástasis tumoral; (v) inhibir el crecimiento del tumor; y/o (vi) aliviar hasta cierto punto uno o más de los síntomas asociados con el cáncer. Hasta el punto en que el fármaco puede prevenir el crecimiento y/o destruir las células cancerosas existentes, puede ser citostático y/o citotóxico. En modelos animales, la eficacia se puede evaluar mediante medidas físicas durante el período que transcurre después de la administración del ADC, y mediante la determinación de la remisión parcial o completa del tumor. Para terapia frente al cáncer, la eficacia, por ejemplo, se puede medir mediante la evaluación del tiempo para la progresión de la enfermedad (TTP) y/o determinar la tasa de respuesta (RR).
El término "biodisponibilidad" se refiere a la disponibilidad sistémica (es decir, niveles en sangre/plasma) de una cantidad dada de fármaco administrada a un paciente. Biodisponibilidad es un término absoluto que indica la medida tanto del tiempo (tasa) como de la cantidad total (alcance) de fármaco que alcanza la circulación general a partir de una forma de dosificación administrada.
Los términos "cáncer" y "canceroso" se refieren a o describen la afección fisiológica en mamíferos que por lo general se caracteriza por un crecimiento celular desregulado. Un "tumor" comprende una o más células cancerosas. Los ejemplos de cáncer incluyen, pero no se limitan a, carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma, y leucemia o neoplasias linfoides. Los ejemplos más particulares de tales cánceres incluyen cáncer de células escamosas (por ejemplo, cáncer de células escamosas epiteliales), cáncer de pulmón que incluye cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer de pulmón de células no pequeñas ("NSCLC"), adenocarcinoma del pulmón y carcinoma escamoso del pulmón, cáncer del peritoneo, cáncer hepatocelular, cáncer gástrico o de estómago que incluye cáncer gastrointestinal, tumor del estroma gastrointestinal (GIST), cáncer pancreático, glioblastoma, cáncer de cuello uterino, cáncer de ovario, cáncer de hígado, cáncer de vejiga, hepatoma, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer rectal , cáncer colorrectal, carcinoma de endometrio o uterino, carcinoma de glándula salival, cáncer de riñón o renal, cáncer de próstata, cáncer de vulva, cáncer de tiroides, carcinoma hepático, carcinoma anal, carcinoma de pene, así como cáncer de cabeza y cuello.
Un "cáncer que expresa ErbB" es uno que comprende células que tienen proteína de ErbB presente en su superficie celular. Un "cáncer que expresa ErbB2" es uno que produce suficientes niveles de ErbB2 en la superficie de las células del mismo, de modo que un anticuerpo anti-ErbB2 se puede unir al mismo y tiene un efecto terapéutico con respecto al cáncer.
Un cáncer que "sobreexpresa" un receptor, por ejemplo un receptor ErbB, es uno que tiene niveles significativamente más elevados del receptor, tal como ErbB2, en la superficie celular del mismo, en comparación con una célula no cancerosa del mismo tipo de tejido. Tal sobre expresión se puede producir por una amplificación genética o por un aumento de la transcripción o traducción. La sobreexpresión del receptor se puede determinar en un ensayo de diagnóstico o de pronóstico mediante la evaluación del aumento de los niveles de la proteína receptora presente en la superficie de una célula (por ejemplo, a través del ensayo inmunohistoquímico; IHC). Como alternativa, o adicionalmente, se pueden medir los niveles de ácidos nucleicos que codifican receptores en la célula, por ejemplo, a través de técnicas de hibridación in situ con fluorescencia (FISH; véase el documento de patente WO 98/45479), transferencia de southern, o reacción en cadena de la polimerasa (PCR), tal como PCR cuantitativa en tiempo real (RT-PCR). La sobreexpresión del ligando receptor, se puede determinar de forma diagnóstica mediante la evaluación de los niveles del ligando (o ácidos nucleicos que lo codifican) en el paciente, por ejemplo, en una biopsia del tumor o mediante diversos ensayos de diagnóstico tales como los ensayos de IHC, FISH, transferencia de southern, PCR o in vivo que se han descrito anteriormente. También se puede estudiar la sobre expresión de receptores mediante la medida de un antígeno de separación (por ejemplo, dominio extracelular de ErbB) en un fluido biológico tal como suero (véase, por ejemplo, Patente de Estados Unidos Nº 4933294; documento de patente WO 91/05264; Patente de Estados Unidos Nº 5401638; y Sias et al. (1990) J. Immunol. Methods 132: 73-80). Además de los ensayos mencionados anteriormente, otros diversos ensayos in vivo están disponibles para el experto en la materia. Por ejemplo, las células dentro del organismo del paciente se pueden exponer a un anticuerpo que está opcionalmente marcado con una marca detectable, por ejemplo, un isótopo radiactivo, y se puede evaluar la unión del anticuerpo las células en el paciente, por ejemplo, mediante exploración externa de la radiactividad o mediante el análisis de una biopsia tomada de un paciente expuesto previamente al anticuerpo.
La expresión "agente citotóxico", tal como se usó el presente documento, se refiere a una sustancia que inhibe o previene la función de las células y/o causa la destrucción de las células. La expresión pretende incluir isótopos radiactivos (por ejemplo, 211At, 131I, 125I, 90Y, 186Re, 188Re, 153Sm, 212Bi, 32P, 60C, e isótopos radiactivos de Lu), agentes quimioterapéuticos, y toxinas tales como toxinas de molécula pequeña o toxinas enzimáticamente activas de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, que incluyen análogos sintéticos y derivados de los mismos.
Un "agente quimioterapéutico" es un compuesto químico útil en el tratamiento de cáncer, independientemente de su mecanismo de acción. Las clases de agentes quimioterapéuticos incluyen, pero no se limitan a: agentes de alquilación, antimetabolitos, alcaloides vegetales venenosos para el huso mitótico, antibióticos citotóxicos/antitumorales, inhibidores de la topoisomerasa, anticuerpos, fotosensibilizadores, e inhibidores de quinasas. Los agentes quimioterapéuticos incluyen compuestos usados en "terapia dirigida" y quimioterapia convencional. Los ejemplos de agentes quimioterapéuticos incluyen: erlotinib (TARCEVA®, Genentech/OSI Pharm.), docetaxel (TAXOTERE®, Sanofi-Aventis), 5-FU (fluorouracilo, 5-fluorouracilo, Nº de CAS 51-21-8), gemcitabina (GEMZAR®, Lilly), PD-0325901 (Nº de CAS 391210-10-9, Pfizer), cisplatino (cis-diamina, dicloroplatino (II), Nº de CAS 15663-27-1); carboplatino (Nº de CAS 41575-94-4), paclitaxel (TAXOL®, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.), trastuzumab (HERCEPTIN®, Genentech), temozolomida (4-metil-5-oxo-2,3,4,6,8pentazabiciclo[4.3.0]nona-2,7,9-trieno-9-carboxamida, Nº de CAS 85622-93-1, TEMODAR®, TEMODAL®, Schering Plough), tamoxifeno ((Z)-2-[4-(1,2-difenilbut-1-enil)fenoxi]-N,N-dimetil-etanamina, NOLVADEX®, ISTUBAL®, VALODEX®), y doxorrubicina (ADRIAMYCIN®), Akti-1/2, HPPD, y rapamicina.
Más ejemplos de agentes quimioterapéuticos incluyen: oxaliplatino (ELOXATIN®, Sanofi), bortezomib (VELCADE®, Millennium Pharm.), sutent (SUNITINIB®, SU11248, Pfizer), letrozol (FEMARA®, Novartis), mesilato de imatinib (GLEEVEC®, Novartis), XL-518 (inhibidor de Mek, Exelixis, WO 2007/044515), ARRY-886 (inhibidor de Mek, AZD6244, Array BioPharma, Astra Zeneca), SF-1126 (inhibidor de Mek PI3K, Semafore Pharmaceuticals), BEZ-235 (inhibidor de Mek PI3K, Novartis), XL-147 (inhibidor de Mek PI3K, Exelixis), PTK787/ZK 222584 (Novartis), fulvestrant (FASLODEX®, AstraZeneca), leucovorina (ácido folínico), rapamicina (sirolimus, RAPAMUNE®, Wyeth), lapatinib (TYKERB®, GSK572016, Glaxo Smith Kline), lonafarnib (SARASAR™, SCH 66336, Schering Plough), sorafenib (NEXAVAR®, BAY43-9006, Bayer Labs), gefitinib (IRESSA®, AstraZeneca), irinotecán (CAMPTOSAR®, CPT-11, Pfizer), tipifarnib (ZARNESTRA™, Johnson & Johnson), ABRAXANE™ (libre de Cremophor), formulaciones de nanopartículas modificadas por ingeniería de albúmina de paclitaxel (American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, II), vandetanib (rINN, ZD6474, ZACTIMA®, AstraZeneca), clorambucilo, AG1478, AG1571 (SU 5271; Sugen), temsirolimus (TORISEL®, Wyeth), pazopanib (GlaxoSmithKline), canfosfamida (TELCYTA®, Telik), tiotepa y ciclosfosfamida (CYTOXAN®, NEOSAR®); sulfonatos de alquilo tales como busulfán, improsulfán y piposulfán; aziridinas tales como benzodopa, carbocuona, meturedopa, y uredopa; etileniminas y metilamelaminas que incluyen altretamina, trietilenmelamina, trietilenfosforamida, trietilentiofosforamida y trimetilmelamina; acetogeninas (especialmente bullatacina y bullatacinona); una camptotecina (incluyendo el análogo sintético topotecán); briostatina; calistatina; CC-1065 (incluyendo sus análogos sintéticos de adozetesina, carzelesina y bizelesina); criptoficinas (particularmente criptoficina 1 y criptoficina 8); dolastatina; duocarmicina (incluyendo los análogos sintéticos, KW-2189 y CB1-TM1); eleuterobina; pancratistatina; una sarcodictiina; espongistatina; próstatas de nitrógeno tales como clorambucilo, clornafacina, clorofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, clorhidrato del óxido de mecloretamina, melfalano, novembiquina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostaza de uracilo; nitrosoureas tales como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina, y ranimnustina; antibióticos tales como antibióticos de enediina (por ejemplo, caliqueamicina, caliqueamicina gamma1I, caliqueamicina omegaI1 (Angew Chem. Intl. Ed. Engl. (1994) 33: 183-186); dinemicina, dinemicina A; bisfosfonatos, tales como clodronato; una esperamicina; así como cromóforo de neocarzinostatina y cromóforos antibióticos de cromoproteína enediina relacionados), aclacinomisinas, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, carabicina, carminomicina, carzinofilina, cromomicinas, dactinomicina, daunorrubicina, detorrubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, morfolino-doxorrubicina, cianomorfolino-doxorrubicina, 2-pirrolino-doxorrubicina y desoxidoxorrubicina), epirrubicina, esorrubicina, idarrubicina, marcelomicina, mitomicinas tales como mitomicina C, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, porfromicina, puromicina, quelamicina, rodorrubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorrubicina; antimetabolitos tales como metotrexato y 5-fluorouracilo (5-FU); análogos de ácido fólico tales como denopterina, metotrexato, pteropterina, trimetrexato; análogos de purina tales como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; análogos de pirimidina tales como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, didesoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina; andrógenos tales como calusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostano, testolactona; antiadrenales tales como aminoglutetimida, mitotano, trilostano; reforzador de ácido fólico tal como ácido frolínico; aceglatona; glucósido de aldofosfamida; ácido aminolevulínico; eniluracilo; amsacrina; bestrabucilo; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina; diazicuona; elfornitina; acetato de eliptinio; una epotilona; etoglúcido; nitrato de galio, hidroxiurea; lentinano; lonidainina; maitansinoides tales como maitansina y ansamitocinas; mitoguazona; mitoxantrona; mopidanmol; nitraerina; pentostatina; fenamet; pirarrubicina; losoxantrona; ácido podofilínico; 2-etilhidracida; procarbacina; complejo de polisacáridos PSK® (JHS Natural Products, Eugene, OR); tricotecenos (especialmente toxina T-2, verracurina A, roridina A y anguidina); uretano; vindesina; dacarbacina; manomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobromán; gacitosina; arabinósido ("Ara-C"); ciclofosfamida; tiotepa; 6-tioguanina; mercaptopurina; metotrexato; análogos de platino tales como cisplatino y carboplatino; vinblastina; etopósido (VP-16); ifosfamida; mitoxantrona; vincristina; vinorelbina (NAVELBINE®); novantrona; tenipósido; edatrexato; daunomicina; aminopterina; capecitabina (XELODA®, Roche); ibandronato; CPT-11; inhibidor de la topoisomerasa RFS 2000;
difluorometilornitina (DMFO); retinoides tales como ácido retinoico; y sales, ácidos y derivados farmacéuticamente aceptables de cualquiera de los mencionados anteriormente.
En la definición de "agente quimioterapéutico" también se incluyen: (i) agentes antihormonales que actúan para regular o inhibir la acción de las hormonas en tumores tales como antiestrógenos y moduladores de receptores de estrógenos selectivos (SERM), que incluyen, por ejemplo, tamoxifeno (incluyendo NOLVADEX®; citrato de tamoxifeno), raloxifeno, droloxifeno, 4-hidroxitamoxifeno, trioxifeno, queoxifeno, LY117018, onapristona, y FARESTON® (citrato de toremifino); (ii) inhibidores de aromatasa que inhiben la enzima aromatasa, que regula la producción de estrógeno en las glándulas adrenales, tales como, por ejemplo, 4(5)-imidazoles, aminoglutetimida, MEGASE® (acetato de megestrol), AROMASIN® (exemestano; Pfizer), formestanio, fadrozol, RIVISOR® (vorozol), FEMARA® (letrozol; Novartis), y ARIMIDEX® (anastrozol; AstraZeneca); (iii) antiandrógenos tales como flutamida, nilutamida, bicalutamida, leuprolida, y goserelina; así como troxacitabina (un análogo de 1,3-dioxolano nucleósido citosina); (iv) inhibidores de proteína quinasa tales como inhibidores de MEK (documento de patente WO 2007/044515); (v) inhibidores de quinasa lípida; (vi) oligonucleótidos antisentido, en particular los que inhiben la expresión de genes en rutas de señalización implicadas en la proliferación de células anómalas, por ejemplo, PKCalfa, Raf y H-Ras, tales como oblimersén (GENASENSE®, Genta Inc.); (vii) ribozimas tales como inhibidores de la expresión del VEGF (por ejemplo, ANGIOZYME®) e inhibidores de la expresión de HER2; (viii) vacunas tales como vacunas para terapia genética, por ejemplo, ALLOVECTIN®, LEUVECTIN®, y VAXID®; PROLEUKIN® rIL-2; inhibidores de la topoisomerasa 1 tales como LURTOTECAN®; ABARELEX® rmRH; (ix) agentes antiangiogénicos tales como bevacizumab (AVASTIN®, Genentech); y sales, ácidos y derivados farmacéuticamente aceptables de cualquiera de los mencionados anteriormente.
En la definición de "agente quimioterapéutico" también se incluyen anticuerpos terapéuticos tales como alemtuzumab (Campath), bevacizumab (AVASTIN®, Genentech); cetuximab (ERBITUX®, Imclone); panitumumab (VECTIBIX®, Amgen), rituximab (RITUXAN®, Genentech/Biogen Idec), pertuzumab (OMNITARG™, 2C4, Genentech), trastuzumab (HERCEPTIN®, Genentech), tositumomab (Bexxar, Corixia), y el conjugado de anticuerpo fármaco, gemtuzumab ozogamicina (MYLOTARG®, Wyeth).
Los anticuerpos monoclonales humanizados con potencial terapéutico como agentes quimioterapéuticos en combinación con los inhibidores de P13K de la invención incluyen: alemtuzumab, apolizumab, aselizumab, atlizumab, bapineuzumab, bevacizumab, bivatuzumab mertansina, cantuzumab mertansina, cedelizumab, certolizumab pegol, cidfusituzumab, cidtuzumab, daclizumab, eculizumab, efalizumab, epratuzumab, erlizumab, felvizumab, fontolizumab, gemtuzumab ozogamicin, inotuzumab ozogamicin, ipilimumab, labetuzumab, lintuzumab, matuzumab, mepolizumab, motavizumab, motovizumab, natalizumab, nimotuzumab, nolovizumab, numavizumab, ocrelizumab, omalizumab, palivizumab, pascolizumab, pecfusituzumab, pectuzumab, pertuzumab, pexelizumab, ralivizumab, ranibizumab, reslivizumab, reslizumab, resivizumab, rovelizumab, ruplizumab, sibrotuzumab, siplizumab, sontuzumab, tacatuzumab tetraxetano, tadocizumab, talizumab, tefibazumab, tocilizumab, toralizumab, trastuzumab, tucotuzumab celmoleuquina, tucusituzumab, umavizumab, urtoxazumab, y visilizumab.
La expresión "prospecto" se usa para hacer referencia a instrucciones incluidas habitualmente en envases comerciales de productos terapéuticos, que contienen información sobre las indicaciones, uso, dosificación, administración, contraindicaciones y/o advertencias con respecto al uso de tales productos terapéuticos.
"Alquilo" es hidrocarburo C1-C8 que contiene átomos de carbono normales, secundarios, terciarios o cíclicos. Los ejemplos de radicales alquilo incluyen, pero no se limitan a: metilo (Me, -CH3), etilo (Et, -CH2CH3), 1-propilo (n-Pr, npropilo, -CH2CH2CH3), 2-propilo (i-Pr, i-propilo, -CH(CH3)2), 1-butilo (n-Bu, n-butilo, -CH2CH2CH2CH3), 2-metil-1propil (i-Bu, i-butilo, -CH2CH(CH3)2), 2-butilo (s-Bu, s-butilo, -CH(CH3)CH2CH3), 2-metil-2-propilo (t-Bu, t-butilo, C(CH3)3), 1-pentilo (n-pentilo, -CH2CH2CH2CH2CH3), 2-pentilo (-CH(CH3)CH2CH2CH3), 3-pentilo (-CH(CH2CH3)2), 2metil-2-butilo (-C(C H3)2CH2CH3), 3-metil-2-butilo ( -CH(CH3)CH(CH3)2), 3-metil-1-butilo (-CH2CH2CH(CH3)2), 2-metil1-butilo (-CH2CH(CH3)CH2CH3), 1-hexilo (-CH2CH2CH2CH2CH2CH3), 2-hexilo (-CH(CH3)CH2CH2CH2CH3), 3-hexilo (-CH(CH2CH3)(CH2CH2CH3)), 2-metil-2-pentilo (-C(CH3)2CH2CH2CH3), 3-metil-2-pentilo (-CH(CH3)CH(CH3)CH2CH3), 4-metil-2-pentilo (-CH(CH3)CH2CH(CH3)2), 3-metil-3-pentilo (-C(CH3)(CH2CH3)2), 2-metil-3-pentilo (CH(CH2CH3)CH(CH3)2), 2,3-dimetil-2-butilo (-C(CH3)2CH(CH3)2), 3,3-dimetil-2-butilo (-CH(CH3)C(CH3)3.
El término "alquileno", tal como se usara el presente documento, se refiere a un radical de hidrocarburo divalente de cadena lineal o ramificada saturado de uno a doce átomos de carbono (C1-C12), en el que el radical alquileno puede estar opcionalmente sustituido de forma independiente con uno o más sustituyentes y se describen a continuación. En otra realización, un radical alquileno tiene de uno a ocho átomos de carbono (C1-C8), o de uno a seis átomos de carbono (C1-C6). Los ejemplos de grupos alquileno incluyen, pero no se limitan a, metileno (-CH2-), etileno (-CH2CH2), propileno (-CH2CH2CH2-), y similares.
El término "alquenilo" se refiere a un radical hidrocarburo monovalente de cadena lineal o ramificada de dos a ocho átomos de carbono (C2-C8) con al menos un sitio de insaturación, es decir, un doble enlace sp2, carbono-carbono, en el que el radical alquenilo puede estar opcionalmente sustituido de forma independiente con uno o más sustituyentes que se describen en el presente documento, e incluye radicales que tienen orientaciones "cis" y "trans", o como alternativa, orientaciones "E" y "Z". Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, etilenilo o vinilo (-CH=CH2), alilo (
CH2CH=CH2), y similares.
El término "alquenileno" se refiere a un radical hidrocarburo divalente de cadena lineal o ramificada de dos a ocho átomos de carbono (C2-C8) con al menos un sitio de insaturación, es decir, un doble enlace sp2, carbono-carbono, en el que el radical alquenilo puede estar opcionalmente sustituido, e incluye radicales que tienen orientaciones "cis" y "trans", o como alternativa, orientaciones "E" y "Z". Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, etilenileno o vinileno (-CH=CH-), alilo (-CH2CH=CH-), y similares.
El término "alquinilo" se refiere a un radical hidrocarburo monovalente lineal o ramificado de dos a ocho átomos de carbono (C2-C8) con al menos un sitio de insaturación, es decir, un triple enlace sp, carbono-carbono, en el que el radical alquinilo puede estar opcionalmente sustituido de forma independiente con uno o más sustituyentes que se describen en el presente documento. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, etinilo (-C≡CH), propinilo (propargilo, -CH2C≡CH), y similares.
El término "alquinileno" se refiere a un radical hidrocarburo divalente lineal o ramificado de dos a ocho átomos de carbono (C2-C8) con al menos un sitio de insaturación, es decir, un triple enlace sp, carbono-carbono, en el que el radical alquinilo puede estar opcionalmente sustituido. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, etinileno (-C≡C-), propinileno (propargileno, -CH2C≡C-), y similares.
Los términos "carbociclo", "carbociclilo", "anillo carbocíclico" y "cicloalquilo" se refieren a un anillo saturado o parcialmente insaturado, no aromático monovalente que tiene de 3 a 12 átomos de carbono (C1-C12) como un anillo monocíclico o de 7 a 12 átomos de carbono como un anillo bicíclico. Los carbociclos bicíclicos que tienen de 7 a 12 átomos se pueden colocar, por ejemplo, en forma de un sistema biciclo [4,5], [5,5], [5,6] o [6,6], y los carbociclos bicíclicos que tienen 9 o 10 átomos en el anillo se pueden colocar en forma de un sistema biciclo [5,6] o [6,6], o en forma de sistemas unidos por puente tales como biciclo[2.2.1]heptano, biciclo[2.2.2]octano y biciclo[3.2.2]nonano. Los ejemplos de carbociclos monocíclicos incluyen, pero no se limitan a, ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, 1ciclopent-1-enilo, 1-ciclopent-2-enilo, 1-ciclopent-3-enilo, ciclohexilo, 1-ciclohex-1-enilo; 1-ciclohex-2-enilo, 1ciclohex-3-enilo, ciclohexadienilo, cicloheptilo, ciclooctilo, ciclononilo, ciclodecilo, cicloundecilo, ciclododecilo, y similares.
"Arilo" se refiere a un radical hidrocarburo aromático monovalente de 6-20 átomos de carbono (C6-C20) derivados de la retirada de un átomo de hidrógeno a partir de un solo átomo de carbono de un sistema de anillo aromático recurso. Algunos grupos arilo se representan en las estructuras a modo de ejemplo como "Ar". Arilo incluye radicales bicíclicos que comprenden un anillo aromático condensado a un anillo saturado, parcialmente insaturado, o anillo carbocíclico aromático. Los grupos arilo habituales incluyen, pero no se limitan, radicales derivados que benceno (fenilo), bencenos sustituidos, naftaleno, antraceno, bifenilo, indenilo, indanilo, 1,2-dihidronaftaleno, 1,2,3,4tetrahidronaftilo, y similares. Los grupos arilo están opcionalmente sustituidos de forma independiente con uno o más sustituyentes que se describen en el presente documento.
"Arileno" se refiere a un radical hidrocarburo aromático divalente de 6-20 átomos de carbono (C6-C20) derivado de la retirada de dos átomos de hidrógeno de dos átomos de carbono de un sistema de anillo aromático precursor. Algunos grupos arileno se representan en las estructuras a modo de ejemplo como "Ar". Arileno incluye radicales bicíclicos que comprenden un anillo aromático condensado con un anillo saturado, parcialmente insaturado, o anillo carbocíclico aromático. Los grupos arileno habituales incluyen, pero no se limitan a, radicales derivados de benceno (fenileno), bencenos sustituidos, naftaleno, antraceno, bifenileno, indenileno, indanileno, 1,2-dihidronaftaleno, 1,2,3,4-tetrahidronaftilo, y similares. Los grupos arileno están opcionalmente sustituidos.
Los términos "heterociclo", "heterociclilo" y "anillo heterocíclico" se usan indistintamente en el presente documento y se refieren a un radical carbocíclico saturado o uno parcialmente y saturado (es decir, que tiene uno o más dobles y/o triples enlaces dentro del anillo) de 3 a 20 átomos en el anillo en el que al menos un átomo del anillo es un heteroátomo seleccionado entre nitrógeno, oxígeno, fósforo y azufre, siendo C los átomos restantes en el anillo, en el que uno o más átomos en el anillo están opcionalmente sustituidos de forma independiente con uno o más sustituyentes que se describen a continuación. Un heterociclo puede ser un monociclo que tiene de 3 a 7 miembros del anillo (de 2 a 6 átomos de carbono y de 1 a 4 heteroátomos seleccionados entre N, O, P, y S) o un biciclo que tiene de 7 a 10 miembros en el anillo (de 4 a 9 átomos de carbono y de 1 a 6 heteroátomos seleccionados entre N, O, P, y S), por ejemplo: un sistema biciclo [4,5], [5,5], [5,6], o [6,6]. Se describen heterociclos en Paquette, Leo A.; "Principles of Modern Heterociclic Chemistry" (W.A. Benjamin, Nueva York, 1968), particularmente en los Capítulos 1, 3, 4, 6, 7, y 9; "The Chemistry of Heterociclic Compounds, A series of Monographs" (John Wiley & Sons, Nueva York, 1950 hasta la fecha), en particular los Volúmenes 13, 14, 16, 19, y 28; y J. Am. Chem. Soc. (1960) 82: 5566. "Heterociclilo" también incluye radicales en los que los radicales heterociclo se condensan con un anillo saturado, parcialmente insaturado, o anillo carbocíclico o heterocíclico aromático. Los ejemplos de anillos heterocíclicos incluyen, pero no se limitan a, pirrolidinilo, tetrahidrofuranoílo, dihidrofuranilo, tetrahidrotienilo, tetrahidropiranilo, dihidropiranilo, tetrahidrotiopiranilo, piperidino, morfolino, tiomorfolino, tioxanilo, piperazinilo, homopiperazinilo, azetidinilo, oxetanilo, tietanilo, homopiperidinilo, oxepanilo, tiepanilo, oxazepinilo, diazepinilo, tiazepinilo, 2-pirrolinilo, 3-pirrolinilo, indolinilo, 2H-piranilo, 4H-piranilo, dioxanilo, 1,3-dioxolanilo, pirazolinilo, ditianilo, ditiolanilo, dihidropiranilo, dihidrotienilo, dihidrofuranilo, pirazolidinilimidazolinilo, imidazolidinilo, 3-azabiciclo[3.1.0]hexanilo, 3
azabiciclo[4.1.0]heptanilo, azabiciclo[2.2.2]hexanilo, 3H-indolil quinolizinilo y N-piridil ureas. Los restos espiro también se incluyen dentro del alcance de la presente definición. Los ejemplos de un grupo heterocíclico en el que 2 átomos de carbono en el anillo se sustituyen con restos oxo (=O) son pirimidinonilo y 1,1-dioxo-tiomorfolinilo. En el presente documento, los grupos heterociclo están opcionalmente sustituidos de forma independiente con uno o más sustituyentes que se describen en el presente documento.
El término "heteroarilo" se refiere a un radical aromático monovalente de anillos de 5, 6, o 7 miembros, e incluye sistemas de anillos condensados (al menos uno de ellos es aromático) de 5-20 átomos, que contienen uno o más heteroátomos seleccionados independientemente entre nitrógeno, oxígeno, y azufre. Los ejemplos de grupos heteroarilo son piridinilo (incluyendo, por ejemplo, 2-hidroxipiridinilo), imidazolilo, imidazopiridinilo, pirimidinilo (incluyendo, por ejemplo, 4-hidroxipirimidinilo), pirazolilo, triazolilo, pirazinilo, tetrazolilo, furilo, tienilo, isoxazolilo, tiazolilo, oxadiazolilo, oxazolilo, isotiazolilo, pirrolilo, quinolinilo, isoquinolinilo, tetrahidroisoquinolinilo, indolilo, benzoimidazolilo, benzofuranilo, cinnolinilo, indazolilo, indolizinilo, ftalazinilo, piridazinilo, triazinilo, isoindolilo, pteridinilo, purinilo, oxadiazolilo, triazolilo, tiadiazolilo, tiadiazolilo, furazanilo, benzofurazanilo, benzotiofenilo, benzotiazolilo, benzoxazolilo, quinazolinilo, quinoxalinilo, naftiridinilo, y furopiridinilo. Los grupos heteroarilo están opcionalmente sustituidos de forma independiente con uno o más sustituyentes que se describen en el presente documento.
Los grupos heterociclo o heteroarilo pueden ser carbono (unido al carbono), o nitrógeno (unido al nitrógeno) cuando ésto sea posible. A modo de ejemplo y no de limitación, los heterociclos o heteroarilos unidos a carbono se unen en la posición 2, 3, 4, 5 o 6 de una piridina, posición 3, 4, 5 o 6 de una piridazina, posición 2, 4, 5 o 6 de una pirimidina, posición 2, 3, 5 o 6 de una pirazina, posición 2, 3, 4 o de un furano, tetrahidrofurano, tiofurano, tiofeno, pirrol o tetrahidropirrol, posición 2, 4 o 5 de un oxazol, imidazol o tiazol, posición 3, 4 o 5 de un isoxazol, pirazol, o isotiazol, posición 2 o 3 de una aziridina, posición 2, 3 o 4 de una azetidina, posición 2, 3, 4, 5, 6, 7, o 8 de una quinolina o posición 1, 3, 4, 5, 6, 7, o 8 de una isoquinolina.
A modo de ejemplo y no de limitación, los heterociclos o heteroarilos unidos a nitrógeno se unen en la posición 1 de una aziridina, azetidina, pirrol, pirrolidina, 2-pirrolina, 3-pirrolina, imidazol, imidazolidina, 2-imidazolina, 3-imidazolina, pirazol, pirazolina, 2-pirazolina, 3-pirazolina, piperidina, piperazina, indol, indolina, 1H-indazol, posición 2 de un isoindol, o isoindolina, posición 4 de una morfolina, y posición 9 de un carbazol, o β-carbolina.
"Conector" o "conexión" se refiere a un resto químico divalente que comprende un enlace covalente o una cadena de átomos que se une de forma covalente un anticuerpo a un resto de fármaco. En diversas realizaciones de fórmula I, un conector se especifica como L.
El término "quiral" se refiere a moléculas que tienen la propiedad de no superposición sobre el compañero de imagen especular, mientras que el término "aquiral" se refiere a moléculas que son superponibles en el compañero de la imagen especular.
El término "estereoisómeros" se refiere a compuestos que tienen constitución química idéntica, pero que difieren con respecto a la disposición de los átomos o grupos en el espacio.
"Diastereómero" se refiere a un estereoisómero con dos o más centros de quiralidad y cuyas moléculas no son imágenes especulares entre sí. Los diastereómeros tienen propiedades físicas diferentes, por ejemplo puntos de fusión, puntos de ebullición, propiedades espectrales, y de actividades. Las mezclas de diastereómeros se pueden separar mediante procedimientos analíticos de alta resolución tales como electroforesis y cromatografía.
"Enantiómeros" se refiere a dos estereoisómeros de un compuesto que no son imágenes especulares superponibles entre sí.
Las definiciones y convenciones estereoquímicas usadas en el presente documento por lo general, siguen S. P. Parker, Ed., McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms (1984) McGraw-Hill Book Company, Nueva York; y Eliel, E. y Wilen, S., Stereochemistry of Organic Compounds (1994) John Wiley & Sons, Inc., Nueva York. Muchos compuestos orgánicos existen en formas ópticamente activas, es decir, tienen la capacidad de girar el plano de la luz polarizada en el plano. En la descripción de un compuesto ópticamente activo, los prefijos D y L, o R y S, se usan para indicar la configuración absoluta de la molécula sobre su centro o centros quirales. Los prefijos d e I o (+) y (-) se usan para designar el signo de rotación de la luz polarizada en el plano por el compuesto, con (-) o 1 significando que el compuesto es levógiro. Un compuesto con el prefijo (+) o d es dextrógiro. Para una estructura química dada, estos estereoisómeros son idénticos excepto en que son imágenes especulares entre sí. Un estereoisómero específico también se pueden denominar enantiómero, y una mezcla de tales isómeros a menudo se denomina mezcla enantiomérica. Una mezcla de enantiómeros a 50:50 se denomina una mezcla racémica o un racemato, que se puede producir cuando no se ha producido estereoselección o estereoespecificidad en una reacción o proceso químico. Las expresiones "mezcla racémica" y "racemato" se refieren a una mezcla equimolar de dos especies enantioméricas, libre de actividad óptica.
La expresión "sal farmacéuticamente aceptable", tal como se usa en el presente documento, se refiere a sales orgánicas o inorgánicas farmacéuticamente aceptables de un ADC. Las sales a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, sales de sulfato, citrato, acetato, oxalato, cloruro, bromuro, yoduro, nitrato, bisulfato, fosfato, fosfato ácido, isonicotinato, lactato, salicilato, citrato ácido, tartrato, oleato, tanato, pantotenato, bitartrato, ascorbato, 5 succinato, maleato, gentisinato, fumarato, gluconato, glucuronato, sacarato, formiato, benzoato, glutamato, metanosulfonato, etanosulfonato, bencenosulfonato, p-toluenosulfonato, y pamoato (es decir, 1,1’-metilen-bis-(2hidroxi-3-naftoato)). Una sal farmacéuticamente aceptable puede implicar la inclusión de otra molécula tal como un ión de acetato, un ión de succinato u otro contraión. El contraión puede ser cualquier resto orgánico o inorgánico que estabiliza la carga en el compuesto precursor. Además, una sal farmacéuticamente aceptable puede tener más de
10 un átomo cargado en su estructura. Los casos en los que múltiples átomos cargados forman parte de la sal farmacéuticamente aceptable pueden tener múltiples contraiones. Por lo tanto, una sal farmacéuticamente aceptable puede tener uno o más átomos cargados y/o uno o más contraiones.
"Solvato farmacéuticamente aceptable" se refiere a una asociación de una o más moléculas de disolvente y un ADC. 15 Los ejemplos de disolventes que forman solvatos farmacéuticamente aceptables incluyen, pero no se limitan a, agua, isopropanol, etanol, metanol, DMSO, acetato de etilo, ácido acético, y etanolamina.
DERIVADOS DE ANTRACICLINA Y CONJUGADOS DE DERIVADOS DE ANTRACICLINA
20 En un primer aspecto la presente invención se refiere a conjugados de un derivado de antraciclina de fórmula (Ic):
Ab-(Zm-L-D)p (Ic)
en la que D, L, Z, m y Ab son tal como se definen en el presente documento , o una sal farmacéuticamente 25 aceptable de los mismos.
Preferentemente, el resto de derivado de antraciclina que representa Ant se puede liberar para dar un derivado de antraciclina de fórmula (IIA):
CONECTORES Y ESPACIADORES
El conector L y las unidades espaciadoras Z unen el vehículo, por ejemplo anticuerpo, al resto de fármaco derivado
35 de antraciclina D a través de enlace o enlaces covalentes. El conector es un resto bifuncional o multifuncional que se puede usar para unir uno o más restos de fármaco (D) y una unidad de anticuerpo (Ab) para formar conjugados de anticuerpo-fármaco (ADC) de fórmula Ic. El conector (L) puede ser estable fuera de una célula, es decir extracelular,
o se puede escindir mediante actividad enzimática, hidrólisis, u otras condiciones metabólicas. Los conjugados de anticuerpo-fármaco (ADC) se pueden preparar de forma conveniente usando un conector que tenga un grupo
40 funcional reactivo para la unión al resto de fármaco y al anticuerpo. Un tiol grupo de la cisteína, o una amina, por ejemplo el extremo N o cadena lateral de aminoácido tal como lisina, del anticuerpo (Ab) puede formar un enlace con un grupo funcional de un conector o reactivo espaciador, resto de fármaco (D) o reactivo de fármaco-conector (D-L).
Muchas posiciones en los compuestos derivados de antraciclina pueden ser útiles como la posición de unión,
45 dependiendo del tipo de unión. Por ejemplo, se pueden formar uniones éster, amida, tioamida, tiocarbamato, o carbamato a partir del grupo hidroxilo de la hidroximetil cetona en la posición C14; se pueden formar uniones cetal e hidrazona a partir del grupo carbonilo en la posición C13 sobre el resto de fármaco; se pueden formar uniones amida, carbamato, y urea a partir de un grupo amino sobre el resto de fármaco D; y se pueden formar diversas uniones alquilo, éter, tioéter, disulfuro, y acilo a partir de los anillos de fenilo y arilo sobre el resto de fármaco
50 mediante reacciones de alquilación y acilación de tipo Friedel-Crafts.
Los conectores y espaciales son estables preferentemente de forma extracelular. Antes del transporte o administración en una célula, el conjugado de anticuerpo-fármaco (ADC) es estable preferentemente y permanece intacto, es decir el anticuerpo permanece unido al resto de fármaco. Los conectores son estables fuera de la célula diana y se pueden escindir a una tasa con cierta eficacia dentro de la célula. Un conector eficaz: (i) mantendrá las propiedades de unión específica del anticuerpo; (ii) permitirá la administración intracelular del conjugado o resto de fármaco; (iii) permanecerá estable e intacto, es decir no se escindirá, hasta que el conjugado se haya administrado o transportado a su sitio dirigido; y (iv) mantendrá un efecto citotóxico, de destrucción celular o un efecto citostático del resto de fármaco derivado de antraciclina. La estabilidad del ADC se puede medir mediante técnicas analíticas convencionales tales como espectroscopía de masas, HPLC, y la técnica de LC/MS de separación/análisis.
La unión covalente del anticuerpo y el resto de fármaco necesita que el conector, y el espaciador de forma opcional, tengan dos grupos funcionales reactivos, es decir bivalencia en un sentido reactivo. Se conocen reactivos conectores bivalentes que son útiles para unir dos o más restos funcional o biológicamente activos, tales como péptidos, ácidos nucleicos, fármacos, toxinas, anticuerpos, haptenos, y grupos indicadores, y se han descrito métodos que describen sus conjugados resultantes (Hermanson, G.T. (1996) Bioconjugate Techniques; Academic Press: Nueva York, p 234-242).
En otra realización, el conector o espaciador puede estar sustituido con grupos que modulan la solubilidad con la reactividad. Por ejemplo, un sustituyente de sulfonato puede aumentar la solubilidad en agua del reactivo y facilitar la reacción de acoplamiento del reactivo conector con el anticuerpo o el resto de fármaco, o facilitar la reacción de acoplamiento de Ab-L con D, o D-L con Ab, dependiendo de la ruta de síntesis usada para preparar el ADC.
Los grupos nucleófilos en los anticuerpos incluyen, pero no se limitan a: (i) grupos amino N-terminales, (ii) grupos amino de cadena lateral, por ejemplo lisina, (iii) grupos tiol de cadena lateral, por ejemplo cisteína, y (iv) grupos hidroxilo o amino de azúcar en los que el anticuerpo está glucosilado. Los grupos amino, tiol, e hidroxilo son nucleófilos y son capaces de reaccionar para formar enlaces covalentes con grupos electrófilos en los restos de conector y reactivos conectores que incluyen: (i) ésteres activos tales como ésteres de NHS, ésteres de HOBt, haloformiatos, y haluros de ácido; (ii) haluros de alquilo y bencilo tales como haloacetamidas; (iii) grupos aldehídos, cetonas, carboxilo, y maleimida. Determinados anticuerpos presentan enlaces disulfuros intercatenarios reducibles, es decir puentes de cisteína. Los anticuerpos se pueden volver reactivos para la conjugación con reactivos conectores mediante el tratamiento con un agente reductor tal como DTT (ditiotreitol). Cada puente de cisteína formará de este modo, teóricamente, dos nucleófilos de tiol reactivos. Los grupos nucleófilos adicionales se pueden introducir en anticuerpos a través de la reacción de restos de lisina con 2-iminotiolano (reactivo de Traut) dando como resultado la conversión de una amina en un tiol. Los grupos tiol reactivos se pueden introducir en el anticuerpo (o fragmento del mismo) mediante la introducción de uno, dos, tres, cuatro o más restos de cisteína (por ejemplo, mediante la preparación de anticuerpos mutantes que comprenden uno o más restos de aminoácidos de cisteína no nativos). La Patente de Estados Unidos Nº 2007/0092940 enseña como someter a ingeniería anticuerpos mediante la introducción de aminoácidos de cisteína reactivos.
En algunas realizaciones, un Conector tiene un grupo nucleófilo reactivo que es reactivo con un grupo electrófilo presente en un anticuerpo. Los grupos electrófilos útiles en un anticuerpo incluyen, pero no se limitan a, grupos carbónico de aldehído y cetona. El heteroátomo de un grupo nucleófilo de un Conector puede reaccionar con un grupo electrófilo en un anticuerpo y formar un enlace covalente con una unidad de anticuerpo. Los grupos nucleófilos útiles en un Conector incluyen, pero no se limitan a, hidrazida, oxima, amino, hidroxilo, hidrazina, tiosemicarbazona, hidrazina carboxilato, y arilhidrazida. El grupo electrófilo en un anticuerpo proporciona un sitio conveniente para la unión a un Conector.
Los grupos nucleófilos en un resto de fármaco incluyen, pero no se limitan a: grupos amino, tiol, hidroxilo, hidrazida, oxima, hidrazina, tiosemicarbazona, hidrazina carboxilato, y arilhidrazida capaces de reaccionar para formar enlaces covalentes con grupos electrófilos en restos de conector y reactivos conectores que incluyen: (i) ésteres activos tales como ésteres de NHS, ésteres de HOBt, haloformiatos, y haluros de ácido; (ii) haluros de alquilo y bencilo tales como haloacetamidas; (iii) grupos aldehídos, cetonas, carboxilo, y maleimida.
Los espaciadores (Z) pueden ser peptídicos, comprendiendo una o más unidades de aminoácido. Se pueden preparar reactivos de conector peptídico mediante de síntesis en fase sólida o en fase líquida (E. Schröder y K. Lübke, The Peptides, volumen 1, pp 76-136 (1965) Academic Press) que son bien conocidos en el campo de la química de péptidos, que incluyen química de t-BOC (Geiser et al. "Automation of solid-phase peptide synthesis" en Macromolecular Sequencing and Synthesis, Alan R. Liss, Inc., 1988, pp. 199-218) y química de Fmoc/HBTU (Fields,
G. y Noble, R. (1990) "Solid phase pdeptide synthesis utilizing 9-fluoroenylmethoxicarbonil amino acids", Int. J. Peptide Protein Res. 35: 161-214), en un sintetizador automatizado tal como el Sintetizador de Péptidos Rainin Symphony (Protein Technologies, Inc., Tucson, AZ), o el Modelo 433 (Applied Biosystems, Foster City, CA).
Los conectores de aminoácido a modo de ejemplo incluyen un dipéptido, un tripéptido, un tetrapéptido o un pentapéptido. Los dipéptidos a modo de ejemplo incluyen: valina-citrulina (vc o val-cit), alanina-fenilalanina (af o alaphe). Los tripéptidos a modo de ejemplo incluyen: glicina-valina-citrulina (glyval-cit) y glicina-glicina-glicina (gly-glygly). Los restos de aminoácido que comprenden un componente de conector de aminoácido incluyen los
aminoácidos de origen natural, así como aminoácidos secundarios y análogos de aminoácidos de origen no natural, tales como citrulina. Se pueden diseñar componentes de conector de aminoácido y su selectividad se puede optimizar para la escisión enzimática mediante una enzima en particular, por ejemplo, una proteasa asociada a tumor, catepsina B, C y D, o una proteasa de plasmina.
5 Las cadenas laterales de aminoácido incluyen los aminoácidos de origen natural, así como aminoácidos secundarios y análogos de aminoácidos de origen no natural, tales como citrulina. Las cadenas laterales de aminoácido incluyen hidrógeno, metilo, isopropilo, isobutilo, sec-butilo, bencilo, p-hidroxibencilo, -CH2OH, -CH(OH)CH3, -CH2CH2SCH3, -CH2CONH2, -CH2COOH, -CH2CH2CONH2, -CH2CH2COOH, -(CH2)3NHC(=NH)NH2, -(CH2)3NH2, -(CH2)3NHCOCH3,
10 (CH2)3NHCHO, -(CH2)4NHC(=NH)NH2, -(CH2)4NH2, -(CH2)4NHCOCH3, -(CH2)4NHCHO, -(CH2)3NHCONH2, (CH2)4NHCONH2, -CH2CH2CH(OH)CH2NH2, 2-piridilmetil-, 3-piridilmetil-, 4-piridilmetil-, fenilo, ciclohexilo, así como las siguientes estructuras:
15 Cuando las cadenas laterales de aminoácido incluyen otros átomos que no son hidrógeno (glicina), el átomo de carbono al que se une la cadena lateral de aminoácido es quiral. Cada átomo de carbono al que se une la cadena lateral de aminoácido se encuentra independientemente en la configuración (S) o (R), o una mezcla racémica. De este modo, los reactivos de fármaco-conector pueden ser enantioméricamente puros, racémicos, o
20 diastereoméricos.
En realizaciones a modo de ejemplo, las cadenas laterales de aminoácido se seleccionan entre las de aminoácidos naturales y no naturales, que incluyen alanina, ácido 2-amino-2-ciclohexilacético, ácido 2-amino-2-fenilacético, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, glutamina, ácido glutámico, glicina, histidina, isoleucina, leucina,
25 lisina, metionina, norleucina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptófano, tirosina, valina, ácido γ-aminobutírico, ácido α,α-dimetil γ-aminobutírico, ácido β,β-dimetil γ-aminobutírico, ornitina, y citrulina (Cit).
COMPUESTOS INTERMEDIOS DE FÁRMACO-CONECTOR
30 La invención incluye compuestos intermedios de fármaco-conector útiles para la conjugación con proteínas, péptidos, y anticuerpos. Tales compuestos intermedios de fármaco-conector incluyen un derivado de antraciclina de fórmula (IIc):
Ant-L-(Z)m-X (IIc) 35 en la que Ant se selecciona entre la estructura:
en la que la línea ondulada indica la unión a L;
L es un conector seleccionado entre -N(R)-, -N(R)m(alquileno C1-C12)-, -N(R)m(alquenileno C2-C8)-, N(R)m(alquinileno C2-C3)-, -N(R)m(CH2CH2O)n-, y la estructura:
10 en la que las líneas onduladas indican las uniones a Ant y Z; y Z es un espaciador opcional seleccionado entre -CH2C(O)-, -CH2C(O)NR(alquileno C1-C12)-, y las estructuras:
15 X es un grupo funcional reactivo seleccionado entre maleimida, tiol, amino, bromuro, p-toluenosulfonato, yoduro, hidroxilo, carboxilo, disulfuro de piridilo, y N-hidroxisuccinimida; R es H, alquilo C1-C12, o arilo C6-C20; R1 y R2 se seleccionan independientemente entre una cadena lateral de aminoácido;
20 Z1 se selecciona entre -(alquileno C1-C12)-, -(alquenileno C2-C8)-, -(alquinileno C2-C8)-y -(CH2CH2O)n-, m es 0 o1; y nes de 1a 6.
Las realizaciones de compuesto intermedio de fármaco-conector a modo de ejemplo de fórmula IIc que comprenden un resto de fármaco de antraciclina y una unidad de conector-espaciador incluyen los compuestos 50-53.
Los derivados de antraciclina de fórmula IIc incluyen la estructura:
en la que Z es alquileno C1-C12.
Las realizaciones de compuesto intermedio de fármaco-conector a modo de ejemplo de fórmula IIc que comprenden un resto de fármaco de antraciclina y una unidad de conector-espaciador incluyen el compuesto 54 (Ejemplo 3a):
Los derivados de antraciclina de fórmula IIc incluyen las estructuras:
y en la que X es maleimida:
Las realizaciones de compuesto intermedio de fármaco-conector a modo de ejemplo de fórmula IIc que comprenden un resto de fármaco de antraciclina y una unidad de conector-espaciador incluyen el compuesto 55 (Ejemplo 3b). Una ruta de síntesis para el compuesto intermedio de fármaco-conector 55 a partir del derivado de PNU-159682 carboxilo C-14 56 y compuesto intermedio de conector-espaciador 60 se muestra en la Figura 7d.
10 Los derivados de antraciclina de fórmula IIc incluyen las estructuras:
y en la que Z1 es -(alquileno C1-C12)-.
15 Las realizaciones de compuesto intermedio de fármaco-conector a modo de ejemplo de fórmula IIc que comprenden un resto de fármaco de antraciclina y una unidad de conector-espaciador incluyen el compuesto:
REACTIVOS CONECTORES Y ESPACIADORES
5 Los conectores de beta-glucurónido entre el anticuerpo y el resto de fármaco son sustratos para escisión mediante beta-glucuronidasa (Jeffrey et al. (2006) Bioconjugate Chem. 17: 831-840; documento de patente WO 2007/011968). La unión acetal de beta-glucurónido libera un hidroxil fenólico en el anillo de arilo, potenciando la "autoinmolación" y la eliminación en la posición 1,6 del grupo benciloxicarbonilo.
10 Un reactivo conector dipeptídico de valina-citrulina (val-cit o vc) a modo de ejemplo que tiene un bastidor de maleimida y un espaciador autoinmolativo de para-aminobencilcarbamoílo (PAB) tiene la estructura:
15 en la que Q es alquilo C1-C8, -O-(alquilo C1-C8), -halógeno, -NO2 o -CN; y m es un número entero que varía de 0-4.
Un reactivo de conector dipeptídico de phe-lys (Mtr) a modo de ejemplo que tiene una unidad de bastidor de maleimida y una unidad de Espaciador autoinmolativo de p-aminobencilo se puede preparar de acuerdo con Dubowchik, et al. (1997) Tetrahedron Letters, 38: 5257-60, y tiene la estructura:
en la que Mtr es mono-4-metoxitritilo, Q es alquilo C1-C8, -O-(alquilo C1-C8), -halógeno, -NO2 o -CN; y m es un número entero que varía de 0-4.
El "conector autoinmolativo", PABC o PAB (para-aminobenciloxicarbonilo), une el resto de fármaco al anticuerpo en el conjugado (Carl et al. (1981) J. Med. Chem. 24: 479-480; Chakravarty et al. (1983) J. Med. Chem. 26:638-644; Patente de Estados Unidos Nº 6214345; documento de patente US20030130189; documento de patente US20030096743; Patentes de Estados Unidos Nº 6759509; documento de patente US20040052793; Patentes de Estados Unidos Nº 6218519; Nº 6835807; Nº 6268488; documento de patente US20040018194; documento de patente WO98/13059; documento de patente US20040052793; Patentes de Estados Unidos Nº 6677435; Nº 5621002; documento de patente US20040121940; documento de patente WO2004/032828). Otros ejemplos de espaciadores autoinmolativos además de PAB incluyen, pero no se limitan a: (i) compuestos aromáticos que son electrónicamente similares al grupo PAB tales como derivados de 2-aminoimidazol-5-metanol (Hay et al. (1999) Bioorg. Med. Chem. Lett. 9: 2237), tiazoles documento de patente US 2005/0256030), unidades de PAB alargadas, múltiples (de Groot et al. (2001) J. Org. Chem. 66: 8815-8830; y orto o para-aminobencilacetales; y (ii) análogos de PAB de estirilo homologados (patente de Estados Unidos Nº 7223837). Se pueden usar espaciadores que experimenten ciclación después de la hidrólisis del enlace amida, tal como amidas del ácido 4-aminobutírico sustituido y sin sustituir (Rodrigues et al. (1995) Chemistry Biology 2: 223), sistemas apropiadamente sustituidos de anillos de biciclo[2.2.1] y biciclo[2.2.2] (Storm et al. (1972) J. Amer. Chem. Soc. 94: 5815) y amidas del ácido 2aminofenilpropiónico (Amsberry, et al. (1990) J. Org. Chem. 55: 5867). La eliminación de fármacos que contienen amina que están sustituidos en la glicina (Kingsbury et al. (1984) J. Med. Chem. 27: 1447) también son ejemplos de espaciadores autoinmolativos útiles en ADC.
Los reactivos conectores útiles para los conjugados de anticuerpo y fármaco de la invención incluyen, pero no se limitan a: BMPEO, BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, sulfo-EMCS, sulfoGMBS, sulfo-KMUS, sulfo-MBS, sulfo-SIAB, sulfo-SMCC, y sulfo-SMPB, y SVSB (succinimidil-(4vinilsulfona)benzoato), y que incluyen reactivos de bis-maleimida: DTME, BMB, BMDB, BMH, BMOE, 1,8-bismaleimidodietilenglicol (BM(PEO)2), y 1,11-bis-maleimidotrietilenglicol (BM(PEO)3), que están disponibles en el mercado en Pierce Biotechnology, Inc., ThermoScientific, Rockford, IL, y otros proveedores de reactivos. Los reactivos de bismaleimida permiten la unión de un grupo tiol libre de un resto de cisteína de un anticuerpo a un resto de fármaco que contiene tiol, marca, o compuesto intermedio conector, de una forma secuencial o simultánea. Otros grupos funcionales además de maleimida, que son reactivos con un grupo tiol de un anticuerpo, resto de fármaco derivado de antraciclina, o compuesto intermedio conector incluyen yodoacetamida, bromoacetamida, vinil piridina, disulfuro, disulfuro de piridilo, isocianato, e isotiocianato.
Otros reactivos conectores son: N-succinimidil-4-(2-piridiltio)pentanoato (SPP), N-succinimidil-3-(2-piridilditio) propionato (SPDP, Carlsson et al. (1978) Biochem. J. 173: 723-737), succinimidil-4-(N-maleimidometil) ciclohexano1-carboxilato (SMCC), iminotiolano (IT), derivados bifuncionales de imidoésteres (tales como dimetil adipimidato HCl), ésteres activos (tal como suberato de disuccinimidilo), aldehídos (tal como glutaraldehído), compuestos bisazido (tal como bis (p-azidobenzoil) hexanodiamina), derivados de bis-diazonio (tal como bis-(p-diazoniobenzoil)etilendiamina), di-isocianatos (tal como 2,6-diisocianato de tolueno), y compuestos de flúor bis-activos (tal como 1,5difluoro-2,4-dinitrobenceno). También se pueden obtener reactivos conectores útiles a través de otras fuentes comerciales, tales como Molecular Biosciences Inc. (Boulder, CO), o se pueden sintetizar de acuerdo con procedimientos que se prescriben en Toki et al. (2002) J. Org. Chem. 67: 1866-1,872; documento de patente US 621-4345; documento de patente WO 02/088172; documento de patente US 2003130189; documento de patente US2003096743; documento de patente WO 03/026577; documento de patente WO 03/043583; y documento de patente WO 04/032828.
El conector puede ser un conector de tipo dendrítico para la unión covalente de más de un resto de fármaco a través de una ramificación, restos de conector multifuncional a un anticuerpo (documento de patente US 2006/116422; documento de patente US 2005/271615; de Groot et al. (2003) Angew. Chem. Int. Ed. 42: 4490-4494; Amir et al. (2003) Angew. Chem. Int. Ed. 42: 4494-4499; Shamis et al. (2004) J. Am. Chem. Soc. 126: 1726-1731; Sun et al. (2002) Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 12: 2213-2215; Sun et al. (2003) Bioorganic & Medicinal Chemistry
11: 1761-1768; King et al. (2002) Tetrahedron Letters 43: 1987-1990). Los conectores dendríticos pueden aumentar la relación molar de fármaco a anticuerpo, es decir carga, que se relaciona con la potencia del ADC. Por lo tanto, cuando un anticuerpo porta solamente un grupo tiol de la cisteína, una multitud de restos de fármaco se puede unir a
través de un conector dendrítico o ramificado.
VEHÍCULO
El resto de vehículo de conjugados de derivados de antraciclina tiene su origen en anticuerpos policlonales y monoclonales, proteínas o péptidos de origen natural o sintético. Los compuestos vehículo T-NH2, T-COOH, T-CHO, T-SH, (V) o (VI) son adecuados para conjugación con compuestos derivados de antraciclina. Los restos de vehículo pueden tener su origen en anticuerpos policlonales generados contra antígenos asociados a tumores; o a partir de anticuerpos monoclonales que se unen a antígenos que se expresan preferente o selectivamente en poblaciones de células tumorales; o a partir de péptidos o proteínas o factores de crecimiento naturales o recombinantes que se unen preferente o selectivamente a células tumorales; o a partir de vehículos poliméricos naturales o sintéticos tales como polilisina, ácido poliglutámico, poliácido aspártico y sus análogos y derivados, o tales como dextrano u otros análogos de hidratos de carbono poliméricos y sus derivados; o a partir de copolímeros sintéticos tales como los obtenidos a partir de N-(2-hidroxipropil)metacrilamida (HPMA) véase: J. Kopecek, Macromolecules. H. Benoit & P. Rempp, Ed.: 505-520 (1982) Pergamon Press. Oxford, Inglaterra; o a partir de copolímeros de poli(aminoácido) tales como poli(GluNa, Ala, Tyr) que son útiles como vehículos de fármaco dirigibles hacia el tejido de pulmón R. Duncan et al., Journal of Bioactive and Compatible Polymers, Vol 4, julio de 1989. La porción de vehículo también puede tener su origen en porciones de los péptidos o proteínas mencionados anteriormente obtenidas a través de técnicas de ADN recombinante.
ANTICUERPOS
Los ejemplos representativos de los anticuerpos que se han mencionado anteriormente y posibles aplicaciones terapéuticas respectivas son: anticuerpo T101 anti-linfocitos T (Royston, I. et al., J. Immunol. 1980, 125:725); anticuerpo OKT1 anti-CD5 (Ortho) leucemias linfocíticas crónicas CRL 8000 de la ATCC); anticuerpo IgG1 anti-CD20 ibritumomab, (Theuer, C. P. et al. Biotechnology Annual Review 2004 linfoma no hodgkin); anticuerpo huCD33 anti-CD33, (Drug of the future 2000 25 (7): 686 leucemia mieloide aguda); anticuerpo OKT9 receptor de anti-transferrina (Ortho) tumores de ovarios y otros CRL 8021 de la ATCC; anticuerpo MAb 9.2.27 anti-melanoma (Bumol, T. F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1982, 79: 1245 melanomas); anticuerpo de marcadores anti-carcinoma tales comos: anti-CEA 1116 NS-3d CRL 8019 de la ATCC), OM 3-1.1 anti-alfa-fetoproteína HB 134 de la ATCC también hepatomas), 791T/36 (Embleton, M. J. et al., Br. J. Cancer 1981, 43, 582 también sarcoma osteogénico), B 72.3 (Patente de Estados Unidos Nº 4522918 carcinomas colorrectales y otros tumores), anticuerpo OVB 3 anti-carcinoma de ovario HB 9147 de la ATCC, antígeno del anticuerpo HMGF de anti-carcinoma de mama (Aboud-Pirak, E. et al., Cancer Res. 1988, 48: 3188), 1G3.10 anti-carcinoma de vejiga (Yu, D. S. et al., Eur. J. Urol. 1987, 13:198), anticuerpo del anticuerpo huC242 anti-CanAg (Olcher, Anthony W. et al., Journal of Clinical Oncology 2003, 21 (2): 211-222 colon, páncreas, gástrico), anticuerpo MLN591 anti-próstata (Henry, Michael D.et al., Cancer Research 2004 cáncer de próstata avanzado resistente a hormonas).
Los ejemplos representativos de los factores de crecimiento y proteínas de origen natural o recombinante que se han mencionado anteriormente son FGF, EGF, PDGF, TGF-ALPHA, ALPHA -MS, Interleuquinas, Interferones, TNF, melanotropina (MSH), Mcm2, etc. El vehículo T-CHO tiene su origen preferentemente en anticuerpos policlonales o monoclonales que tienen el resto de hidrato de carbono, localizado preferentemente en la región de Fc, oxidado de forma selectiva a grupos aldehído por medio de métodos químicos o enzimáticos, tal como se describe en la Patente de Estados Unidos Nº 4671958.
La unidad de anticuerpo (Ab) de Fórmula IIc incluye cualquier unidad, tipo, o clase de anticuerpo que se une o que se asocia de forma reactiva o forma complejos con un receptor, antígeno u otro resto receptivo asociado con una población dada de células diana. Un anticuerpo puede ser una proteína o molécula similar a una proteína que se une a, forma complejos con, o reacciona con un resto de una población de células que se busca modificar de forma terapéutica o de otro modo de forma biológica. En un aspecto, la unidad de anticuerpo actúa administrando el resto de fármaco de derivado de antraciclina a la población de células diana en particular con la que reacciona la unidad de anticuerpo. Tales anticuerpos incluyen, pero no se limitan a, proteínas de peso molecular elevado tales como, anticuerpos de longitud completa y fragmentos de anticuerpo. Los anticuerpos de Fórmula I permiten obtener concentraciones elevadas de moléculas de metabolito activo en células cancerosas. La dirección intracelular se puede conseguir mediante métodos y compuestos que permiten la acumulación o retención de agentes biológicamente activos dentro de las células. Tal dirección eficaz se puede aplicar a diversas formulaciones y procedimientos terapéuticos.
En una realización, el ADC se une específicamente a un receptor codificado por un gen de ErbB, tal como EGFR, HER2, HER3 y HER4. El ADC se puede unir específicamente al dominio extracelular del receptor HER2. El ADC puede inhibir el crecimiento de células tumorales que sobreexpresan el receptor HER2.
En otra realización, el anticuerpo (Ab) de Fórmula IIc es un anticuerpo humanizado tal como huMAb4D5-1, huMAb4D5-2, huMAb4D5-3, huMAb4D5-4, huMAb4D5-5, huMAb4D5-6, huMAb4D5-7 o huMAb4D5-8 (trastuzumab).
Los anticuerpos de la invención incluyen anticuerpos sometidos a ingeniería de cisteína en los que uno o más aminoácidos de cualquier forma de anticuerpo de tipo silvestre o precursor se reemplaza con un aminoácido cisteína. El aminoácido sometido a ingeniería de cisteína es un aminoácido cisteína libre y no forma parte de una unidad de disulfuro intracatenaria o intercatenaria. También se puede someter a ingeniería cualquier forma, tipo, o variante de anticuerpo, es decir mutar. Por ejemplo, un fragmento de anticuerpo Fab precursor se puede someter a ingeniería para formar un Fab sometido a ingeniería de cisteína, mencionado en el presente documento "TioFab". De forma análoga, un anticuerpo monoclonal precursor se puede someter a ingeniería para formar un "TioMab". Se debería indicar que una mutación de un solo sitio proporciona un solo resto de cisteína sometido ingeniería en un TioFab, mientras que una mutación de un solo sitio proporciona dos restos de cisteína sometidos a ingeniería en un TioMab, debido a la naturaleza dimérica del anticuerpo IgG. Los anticuerpos sometidos a ingeniería de cisteína de la invención incluyen anticuerpos monoclonales, anticuerpos monoclonales humanizados o quiméricos, fragmentos de anticuerpos de unión a antígeno, polipéptidos de fusión y análogos que se unen preferentemente a polipéptidos asociados a células.
Se han diseñado anticuerpos sometidos a ingeniería de cisteína como fragmentos de anticuerpo Fab (tioFab) y se expresan como anticuerpos monoclonales IgG (tioMab), de longitud completa (Patente de Estados Unidos Nº 7521541, cuyos contenidos se incorporan por referencia). Se han conjugado anticuerpos TioFab y TioMab a través de conectores en los grupos tiol de la cisteína recién introducidos con reactivos conectores reactivos a tiol y reactivos de fármaco-conector para preparar conjugados de anticuerpo-fármaco (Tio ADC), que incluyen anti-HER2 (Patente de Estados Unidos Nº 7521541), anti-CD22 (documento de patente US 2008/0050310), y anti-steapl (documento de patente WO 2008/052187), así como otros anticuerpos sometidos a ingeniería de cisteína y conjugados de anticuerpo-fármaco.
Los anticuerpos que comprenden los conjugados de anticuerpo-fármaco de Fórmula IIc mantienen preferentemente la capacidad de unión a antígeno de sus homólogos de tipo silvestre, nativos. Por lo tanto, los anticuerpos de la invención son capaces de unirse, preferentemente de forma específica, a antígenos. Tales antígenos incluyen, por ejemplo, antígenos asociados a tumores (TAA), proteínas receptoras de superficie celular y otras moléculas de superficie celular, factores reguladores de la supervivencia celular, factores reguladores de la proliferación celular, moléculas asociadas (por ejemplo, conocidas o que se sospecha que contribuyen de forma funcional a) con el desarrollo o diferenciación de tejido, linfoquinas, citoquinas, moléculas implicadas en la regulación del ciclo celular, moléculas implicadas en la vasculogénesis y moléculas asociadas (por ejemplo, conocidas o que se sospecha que contribuyen de forma funcional a) con la angiogénesis. El antígeno asociado a tumor puede ser un factor de diferenciación de grupos (es decir, una proteína CD). Un antígeno al que es capaz de unirse un anticuerpo de la invención puede ser un miembro de un subconjunto de una de las categorías mencionadas anteriormente, en la que el otro subconjunto de dicha categoría comprende otras moléculas/antígenos que tienen distintas características (con respecto al antígeno de interés).
En una realización, el anticuerpo de conjugados de anticuerpo-fármaco (ADC) de Fórmula IIc se une de forma específica a un receptor codificado por un gen de ErbB. El anticuerpo se puede unir de forma específica a un receptor de ErbB seleccionado entre EGFR, HER2, HER3 y HER4. El ADC se puede unir de forma específica al dominio extracelular (ECD) del receptor HER2 e inhibir el crecimiento de células tumorales que sobreexpresan el receptor HER2. El anticuerpo del ADC puede ser un anticuerpo monoclonal, por ejemplo un anticuerpo monoclonal murino, un anticuerpo quimérico, o un anticuerpo humanizado. Un anticuerpo humanizado puede ser huMAb4D5-1, huMAb4D5-2, huMAb4D5-3, huMAb4D5-4, huMAb4D5-5, huMAb4D5-6, huMAb4D5-7 o huMAb4D5-8 (trastuzumab). El anticuerpo puede ser un fragmento de anticuerpo, por ejemplo un fragmento de Fab.
Los anticuerpos en los conjugados de anticuerpo-fármaco (ADC) de Fórmula IIc y que pueden ser útiles en el tratamiento del cáncer incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos frente a receptores de superficie celular y antígenos asociados a tumores (TAA). Tales antígenos asociados a tumores se conocen en la técnica, y se pueden preparar para su uso en anticuerpos de generación usando métodos e información que son bien conocidos en la técnica. En intentos para descubrir dianas celulares eficaces para el diagnóstico y terapia frente al cáncer, los investigadores han buscado identificar polipéptidos transmembrana o de otro modo polipéptidos asociados a tumores que se expresan de forma específica en la superficie de uno o más tipos en particular de células cancerosas en comparación con una o mas células no cancerosas normales. A menudo, tales polipéptidos asociados a tumores se expresan de forma más abundante en la superficie de las células cancerosas en comparación con aquéllos en la superficie de las células no cancerosas. La identificación de tales polipéptidos de superficie celular asociados a tumores ha dado lugar a la capacidad de dirigir de forma específica células cancerosas la destrucción a través de terapias basadas en anticuerpos.
Los ejemplos de TAA incluyen, pero no se limitan a los Antígenos Asociados a Tumor (1)-(36) que se enumeran a continuación. Por conveniencia, la información con respecto a estos antígenos, todos los cuales se conocen en la técnica, se enumeran a continuación e incluye nombres, nombres alternativos, números de registro en Genbank y referencia por referencias primarias, seguido de convenciones para identificación de secuencia de ácidos nucleicos y proteínas del Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI). Las secuencias de ácidos nucleicos y proteínas que corresponden a TAA (1)-(36) están disponibles en bases de datos públicas tales como GenBank. Los antígenos asociados a tumor dirigidos por anticuerpos incluyen todas las variantes e isoformas de secuencias de aminoácidos
que poseen una identidad de secuencia de al menos aproximadamente un 70 %, un 80 %, un 85 %, un 90 %, o un 95 % con respecto a las secuencias identificadas en las referencias mencionadas, o que presentan básicamente las mismas propiedades o características biológicas que un TAA que tiene una secuencia encontrada en las referencias mencionadas. Por ejemplo, un TAA que tiene una variante de secuencia por lo general es capaz de unirse de forma específica a un anticuerpo que se une de forma específica con el TAA con la secuencia correspondiente enumerada.
ANTÍGENOS ASOCIADOS A TUMOR (1)-(36):
(1)
BMPRIB (receptor de tipo IB de proteína morfogenética ósea, Nº de registro en Genbank NM_001203); ten Dijke, P., et al. Science 264 (5155): 101-104 (1994), Oncogene 14 (11): 1377-1382 (1997)); documento de patente WO2004063362 (Reivindicación 2); documento de patente WO2003042661 (Reivindicación 12); documento de patente US2003134790-A1 (Páginas 38-39); documento de patente WO2002102235 (Reivindicación 13; Página 296); documento de patente WO2003055443 (Página 91-92); documento de patente WO200299122 (Ejemplo 2; Páginas 528-530); documento de patente WO2003029421 (Reivindicación 6); documento de patente WO2003024392 (Reivindicación 2; Fig 112); documento de patente WO200298358 (Reivindicación 1; Página 183); documento de patente WO200254940 (Páginas 100-101); documento de patente WO200259377 (Páginas 349-350); documento de patente WO200230268 (Reivindicación 27; Página 376); documento de patente WO200148204 (Ejemplo; Fig 4); receptor de proteína morfogenética ósea NP_001194, tipo IB /pid = NP_001194,1; Referencias cruzadas: MIM:603248; NP_001194.1; AY065994
(2)
E16 (LAT1, SLC7A5, Nº de registro en Genbank NM_003486); Biochem. Biophys. Res. Commun. 255 (2), 283-288 (1999), Nature 395 (6699): 288-291 (1998), Gaugitsch, H.W., et al. (1992) J. Biol. Chem. 267 (16): 11267-11273); documento de patente WO2004048938 (Ejemplo 2); documento de patente WO2004032842 (Ejemplo IV); documento de patente WO2003042661 (Reivindicación 12); documento de patente WO2003016475 (Reivindicación 1); documento de patente WO200278524 (Ejemplo 2); documento de patente WO200299074 (Reivindicación 19; Página 127-129); documento de patente WO200286443 (Reivindicación 27; Páginas 222, 393); documento de patente WO2003003906 (Reivindicación 10; Página 293); documento de patente WO200264798 (Reivindicación 33; Páginas 93-95); documento de patente WO200014228 (Reivindicación 5; Páginas 133-136); documento de patente US2003224454 (Fig 3); documento de patente WO2003025138 (Reivindicación 12; Página 150); documento de patente US 20050107595; documento de patente US 20050106644; familia 7 de vehículos soluto NP_003477 (transportador de aminoácidos catiónicos, sistema y+), miembro 5 /pid = NP_003477.3 -Referencias cruzadas de Homo sapiens: MIM:600182; NP_003477.3; NM_015923; NM_003486_1
(3)
STEAP1 (antígeno epitelial de seis dominios transmembrana de próstata, Nº de registro en Genbank NM_012449); Cancer Res. 61 (15), 5857-5860 (2001), Hubert, R.S., et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96 (25): 14523-14528); documento de patente WO2004065577 (Reivindicación 6); documento de patente WO2004027049 (Fig 1L); documento de patente EP1394274 (Ejemplo 11); documento de patente WO2004016225 (Reivindicación 2); documento de patente WO2003042661 (Reivindicación 12); documento de patente US2003157089 (Ejemplo 5); documento de patente US2003185830 (Ejemplo 5); documento de patente US2003064397 (Fig 2); documento de patente WO200289747 (Ejemplo 5; Páginas 618-619); documento de patente WO2003022995 (Ejemplo 9; Fig 13A, Ejemplo 53; Páginas 173, Ejemplo 2; Fig 2A); antígeno epitelial de seis dominios transmembrana de la próstata NP_036581; Referencias cruzadas: MIM:604415; NP_036581.1; NM_012449_1
(4)
0772P (CA125, MUC16, Nº de registro en Genbank AF361486); J. Biol. Chem. 276 (29): 27371-27375 (2001)); documento de patente WO2004045553 (Reivindicación 14); documento de patente WO200292836 (Reivindicación 6; Fig 12); documento de patente WO200283866 (Reivindicación 15; Páginas 116-121); documento de patente US2003124140 (Ejemplo 16); documento de patente US2003091580 (Reivindicación 6); documento de patente WO200206317 (Reivindicación 6; Páginas 400-408); Referencias cruzadas: GI:34501467; AAK74120.3; AF361486_1
(5)
MPF (MPF, MSLN, SMR, factor de potenciación de megacariocitos, mesotelina, Nº de registro en Genbank NM_005823); Yamaguchi, N., et al. Biol. Chem. 269 (2), 805-808 (1994), Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96 (20): 11531-11536 (1999), Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93 (1): 136-140 (1996), J. Biol. Chem. 270 (37): 21984-21990 (1995)); documento de patente WO2003101283 (Reivindicación 14); (documento de patente WO2002102235 (Reivindicación 13; Páginas 287-288); documento de patente WO2002101075 (Reivindicación 4; Páginas 308309); documento de patente WO200271928 (Páginas 320-321); documento de patente WO9410312 (Páginas 5257); Referencias cruzadas: MIM:601051; NP_005814.2; NM_005823_1
(6)
Napi3b (NAPI-3B, NPTIIb, SLC34A2, familia 34 de transportadores de soluto (fosfato sódico) , miembro 2, transportador 3b de fosfato dependiente de sodio de tipo II, Nº de registro en Genbank NM_006424); J. Biol. Chem. 277 (22): 19665-19672 (2002), Genomics 62 (2): 281-284 (1999), Feild, J.A., et al. (1999) Biochem. Biophys. Res. Commun. 258 (3): 578-582); documento de patente WO2004022778 (Reivindicación 2); documento de patente EP1394274 (Ejemplo 11); documento de patente WO2002102235 (Reivindicación 13; Página 326); documento de patente EP875569 (Reivindicación 1; Páginas 17-19); documento de patente WO200157188 (Reivindicación 20; Página 329); documento de patente WO2004032842 (Ejemplo IV); documento de patente WO200175177 (Reivindicación 24; Página 139-140); Referencias cruzadas: MIM:604217; NP_006415.1; NM_006424_1
(7)
Sema 5b (FLJ10372, KIAA1445, Mm.42015, SEMA5B, SEMAG, Semaforina 5b Hlog, dominio sema, siete repeticiones de trombospondina (de tipo 1 y similar al tipo 1), dominio transmembrana (TM) y dominio
citoplasmático corto, (semaforina) 5B, Nº de registro en Genbank AB040878); Nagase T., et al. (2000) DNA Res. 7 (2): 143-150); documento de patente WO2004000997 (Reivindicación 1); documento de patente WO2003003984 (Reivindicación 1); documento de patente WO200206339 (Reivindicación 1; Página 50); documento de patente WO200188133 (Reivindicación 1; Páginas 41-43, 48-58); documento de patente WO2003054152 (Reivindicación 20); documento de patente WO2003101400 (Reivindicación 11); Registro: Q9P283; EMBL; AB040878; BAA95969.1, Genew; HGNC:10737;
(8)
PSCA hlg (genes 2700050C12Rik, C530008016Rik, RIKEN cDNA 2700050C12, RIKEN cDNA 2700050C12, Nº de registro en Genbank AY358628); Ross et al. (2002) Cancer Res. 62: 2546-2553; documento de patente US2003129192 (Reivindicación 2); documento de patente US2004044180 (Reivindicación 12); documento de patente US2004044179 (Reivindicación 11); documento de patente US2003096961 (Reivindicación 11); documento de patente US2003232056 (Ejemplo 5); documento de patente WO2003105758 (Reivindicación 12); documento de patente US2003206918 (Ejemplo 5); documento de patente EP1347046 (Reivindicación 1); documento de patente WO2003025148 (Reivindicación 20); Referencias cruzadas: GI:37182378; AAQ88991.1; AY358628_1
(9)
ETBR (Receptor de endotelina de tipo B, Nº de registro en Genbank AY275463); Nakamuta M., et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 177, 34-39, 1991; Ogawa Y., et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 178, 248-255, 1991; Arai H., et al. Jpn. Circ. J. 56, 1303-1307, 1992; Arai H., et al. J. Biol. Chem. 268, 3463-3470, 1993; Sakamoto A., Yanagisawa M., et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 178, 656-663, 1991; Elshourbagy N.A., et al. J. Biol. Chem. 268, 3873-3879, 1993; Haendler B., et al. J. Cardiovasc. Pharmacol. 20, sl-S4, 1992; Tsutsumi M., et al. Gene 228, 43-49, 1999; Strausberg R.L., et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 16899-16903, 2002; Bourgeois C., et al. J. Clin. Endocrinol. Metab. 82, 3116-3123, 1997; Okamoto Y., et al. Biol. Chem. 272, 21589-21596, 1997; Verheij J.B., et al. Am. J. Med. Genet. 108, 223-225, 2002; Hofstra R.M.W., et al. Eur. J. Hum. Genet. 5, 180-185, 1997; Puffenberger E.G., et al. Cell 79, 1257-1266, 1994; Attie T., et al, Hum. Mol. Genet. 4, 2407-2409, 1995; Auricchio A., et al. Hum. Mol. Genet. 5:351-354, 1996; Amiel J., et al. Hum. Mol. Genet. 5, 355-357, 1996; Hofstra R.M.W., et al. Nat. Genet. 12, 445-447, 1996; Svensson P.J., et al. Hum. Genet. 103, 145-148, 1998; Fuchs S., et al. Mol. Med. 7, 115-124, 2001; Pingault V., et al. (2002) Hum. Genet. 111, 198206; documento de patente WO2004045516 (Reivindicación 1); documento de patente WO2004048938 (Ejemplo 2); documento de patente WO2004040000 (Reivindicación 151); documento de patente WO2003087768 (Reivindicación 1); documento de patente WO2003016475 (Reivindicación 1); documento de patente WO2003016475 (Reivindicación 1); documento de patente WO200261087 (Fig 1); documento de patente WO2003016494 (Fig 6); documento de patente WO2003025138 (Reivindicación 12; Página 144); documento de patente WO200198351 (Reivindicación 1; Páginas 124-125); documento de patente EP522868 (Reivindicación 8; Fig 2); documento de patente WO200177172 (Reivindicación 1; Páginas 297-299); documento de patente US2003109676; US6518404 (Fig 3); Patente de Estados Unidos Nº 5773223 (Reivindicación 1a; Col 31-34); documento de patente WO2004001004,
(10)
MSG783 (RNF124, proteína hipotética FLJ20315, Nº de registro en Genbank NM_017763); documento de patente WO2003104275 (Reivindicación 1); documento de patente WO2004046342 (Ejemplo 2); documento de patente WO2003042661 (Reivindicación 12); documento de patente WO2003083074 (Reivindicación 14; Página 61); documento de patente WO2003018621 (Reivindicación 1); documento de patente WO2003024392 (Reivindicación 2; Fig 93); documento de patente WO200166689 (Ejemplo 6); Referencias cruzadas: ID de Locus:54894; NP_060233.2; NM_017763_1
(11)
STEAP2 (HGNC_8639, IPCA-1, PCANAP1, STAMP1, STEAP2, STMP, gen 1 asociado al cáncer de próstata, proteína 1 asociada al cáncer de próstata, antígeno epitelial de seis dominios transmembrana de próstata 2, proteína de próstata de seis dominios transmembrana, Nº de registro en Genbank AF455138); Lab. Invest. 82 (11): 1573-1582 (2002)); documento de patente WO2003087306; documento de patente US2003064397 (Reivindicación 1; Fig 1); documento de patente WO200272596 (Reivindicación 13; Páginas 5455); documento de patente WO200172962 (Reivindicación 1; Fig 4B); documento de patente WO2003104270 (Reivindicación 11); documento de patente WO2003104270 (Reivindicación 16); documento de patente US2004005598 (Reivindicación 22); documento de patente WO2003042661 (Reivindicación 12); documento de patente US2003060612 (Reivindicación 12; Fig 10); documento de patente WO200226822 (Reivindicación 23; Fig 2); documento de patente WO200216429 (Reivindicación 12; Fig 10); Referencias cruzadas: GI:22655488; AAN04080.1; AF455138_1
(12)
TrpM4 (BR22450, FLJ20041, TRPM4, TRPM4B, canal catiónico potencial de receptores transitorios, subfamilia M, miembro 4, Nº de registro en Genbank NM_017636); Xu, X.Z., et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98 (19): 10692-10697 (2001), Cell 109 (3): 397-407 (2002), J. Biol. Chem. 278 (33): 30813-30820 (2003)); documento de patente US2003143557 (Reivindicación 4); documento de patente WO200040614 (Reivindicación 14; Páginas 100-103); documento de patente WO200210382 (Reivindicación 1; Fig 9A); documento de patente WO2003042661 (Reivindicación 12); documento de patente WO200230268 (Reivindicación 27; Página 391); documento de patente US2003219806 (Reivindicación 4); documento de patente WO200162794 (Reivindicación 14; Fig 1A-D); Referencias cruzadas: MIM:606936; NP_060106.2; NM_017636_1
(13)
CRIPTO (CR, CR1, CRGF, CRIPTO, TDGF1, factor de crecimiento derivado de teratocarcinoma, Nº de registro en Genbank NP_003203 o NM_003212); Ciccodicola, A., et al. EMBO J. 8 (7): 1987-1991 (1989), Am. J. Hum. Genet. 49 (3): 555-565 (1991)); documento de patente US2003224411 (Reivindicación 1); documento de patente WO2003083041 (Ejemplo 1); documento de patente WO2003034984 (Reivindicación 12); documento de patente WO200288170 (Reivindicación 2; Páginas 52-53); documento de patente WO2003024392 (Reivindicación 2; Fig 58); documento de patente WO200216413 (Reivindicación 1; Páginas 94-95, 105);
documento de patente WO200222808 (Reivindicación 2; Fig 1); Patente de Estados Unidos Nº 5854399 (Ejemplo 2; Col 17-18); Patente de Estados Unidos Nº 5792616 (Fig 2); Referencias cruzadas: MIM:187395; NP_003203.1; NM_003212_1
(14)
CD21 (CR2 (Receptor 2 de complemento) o C3DR (receptor de C3d/virus de Epstein Barr) o Hs.73792 Nº de registro en Genbank M26004); Fujisaku et al. (1989) J. Biol. Chem. 264 (4): 2118-2125); Weis J.J., et al. J. Exp. Med. 167, 1047-1066, 1988; Moore M., et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84, 9194-9198, 1987; Barel M., et al. Mol. Immunol. 35, 1025-1031, 1998; Weis J.J., et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83, 5639-5643, 1986; Sinha S.K., et al. (1993) J. Immunol. 150, 5311-5320; documento de patente WO2004045520 (Ejemplo 4); documento de patente US2004005538 (Ejemplo 1); documento de patente WO2003062401 (Reivindicación 9); documento de patente WO2004045520 (Ejemplo 4); documento de patente WO9102536 (Fig 9.1-9.9); documento de patente WO2004020595 (Reivindicación 1); Registro: P20023; Q13866; Q14212; EMBL; M26004; AAA35786.1.
(15)
CD79b (CD79B, CD79β, IGb (asociado a inmunoglobulina beta), B29, Nº de registro en Genbank NM_000626 o 11038674); Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (2003) 100 (7): 4126-4131, Blood (2002) 100 (9): 30683076, Muller et al. (1992) Eur. J. Immunol. 22 (6): 1621-1625); documento de patente WO2004016225 (reivindicación 2, Fig 140); documento de patente WO2003087768, documento de patente US2004101874 (reivindicación 1, página 102); documento de patente WO2003062401 (reivindicación 9); documento de patente WO200278524 (Ejemplo 2); documento de patente US2002150573 (reivindicación 5, página 15); Patente de Estados Unidos Nº 5644033; documento de patente WO2003048202 (reivindicación 1, páginas 306 ti 309); documento de patente WO 99/558658, US6534482 (reivindicación 13, Fig 17A/B); documento de patente WO200055351 (reivindicación 11, páginas 1145-1146); Referencias cruzadas: MIM:147245; NP_000617.1; NM_000626_1
(16)
FcRH2 (IFGP4, IRTA4, SPAP1A (proteína 1a de anclaje de fosfatasa que contiene el dominio SH2), SPAP1B, SPAP1C, Nº de registro en Genbank NM_030764, AY358130); Genome Res. 13 (10): 2265-2270 (2003), Immunogenetics 54 (2): 87-95 (2002), Blood 99 (8): 2662-2669 (2002), Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98 (17): 9772-9777 (2001), Xu, M.J., et al. (2001) Biochem. Biophys. Res. Commun. 280 (3): 768-775; documento de patente WO2004016225 (Reivindicación 2); documento de patente WO2003077836; documento de patente WO200138490 (Reivindicación 5; Fig 18D-1-18D-2); documento de patente WO2003097803 (Reivindicación 12); documento de patente WO2003089624 (Reivindicación 25); Referencias cruzadas: MIM:606509; NP_110391.2; NM_030764_1
(17)
HER2 (ErbB2, Nº de registro en Genbank M1730); Coussens L., et al. Science (1985) 230 (4730): 11321139); Yamamoto T., et al. Nature 319, 230-234, 1986; Semba K., et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82, 64976501, 1985; Swiercz J.M., et al. J. Cell Biol. 165, 869-880, 2004; Kuhns J.J., et al. J. Biol. Chem. 274, 3642236427, 1999; Cho H.-S., et al. Nature 421, 756-760, 2003; Ehsani A., et al. (1993) Genomics 15, 426-429; documento de patente WO2004048938 (Ejemplo 2); documento de patente WO2004027049 (Fig 1I); documento de patente WO2004009622; documento de patente WO2003081210; documento de patente WO2003089904 (Reivindicación 9); documento de patente WO2003016475 (Reivindicación 1); documento de patente US2003118592; documento de patente WO2003008537 (Reivindicación 1); documento de patente WO2003055439 (Reivindicación 29; Fig 1A-B); documento de patente WO2003025228 (Reivindicación 37; Fig 5C); documento de patente WO200222636 (Ejemplo 13; Páginas 95-107); documento de patente WO200212341 (Reivindicación 68; Fig 7); documento de patente WO200213847 (Páginas 71-74); documento de patente WO200214503 (Páginas 114-117); documento de patente WO200153463 (Reivindicación 2; Páginas 41-46); documento de patente WO200141787 (Página 15); documento de patente WO200044899 (Reivindicación 52; Fig 7); documento de patente WO200020579 (Reivindicación 3; Fig 2); Patente de Estados Unidos Nº 5869445 (Reivindicación 3; Col 31-38); documento de patente WO9630514 (Reivindicación 2; Páginas 56-61); documento de patente EP1439393 (Reivindicación 7); documento de patente WO2004043361 (Reivindicación 7); documento de patente WO2004022709; documento de patente WO200100244 (Ejemplo 3; Fig 4); Registro: P04626; EMBL; M11767; AAA35808.1, EMBL; M11761; AAA35808.1.
(18)
NCA (CEACAM6, Nº de registro en Genbank M18728); Bamett T., et al. Genomics 3, 59-66, 1988; Tawaragi Y., et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 150, 89-96, 1988; Strausberg R.L., et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.
99: 16899-16903, 2002; documento de patente WO2004063709; documento de patente EP1439393 (Reivindicación 7); documento de patente WO2004044178 (Ejemplo 4); documento de patente WO2004031238; documento de patente WO2003042661 (Reivindicación 12); documento de patente WO200278524 (Ejemplo 2); documento de patente WO200286443 (Reivindicación 27; Página 427); documento de patente WO200260317 (Reivindicación 2); Registro: P40199; Q14920; EMBL; M29541; AAA59915.1, EMBL; M18728
(19)
MDP (DPEP1, Nº de registro en Genbank BC017023); Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99 (26): 16899-16903 (2002)); documento de patente WO2003016475 (Reivindicación 1); documento de patente WO200264798 (Reivindicación 33; Páginas 85-87); documento de patente JP05003790 (Fig 6-8); documento de patente WO9946284 (Fig 9); Referencias cruzadas: MIM: 179780; AAH17023.1; BC017023_1
(20)
IL20Rα (IL20Ra, ZCYTOR7, Nº de registro en Genbank AF184971); Clark H.F., et al. Genome Res. 13, 2265-2270, 2003; Mungall A.J., et al. Nature 425, 805-811, 2003; Blumberg H., et al. Cell 104, 9-19, 2001; Dumoutier L., et al. J. Immunol. 167, 3545-3549, 2001; Parrish-Novak J., et al. J. Biol. Chem. 277, 47517-47523, 2002; Pletnev S., et al. (2003) Biochemistry 42:12617-12624; Sheikh F., et al. (2004) J. Immunol. 172, 20062010; documento de patente EP1394274 (Ejemplo 11); documento de patente US2004005320 (Ejemplo 5); documento de patente WO2003029262 (Página 74-75); documento de patente WO2003002717 (Reivindicación 2; Página 63); documento de patente WO200222153 (Página 45-47); documento de patente US2002042366 (Página 20-21); documento de patente WO200146261 (Página 57-59); documento de patente WO200146232
(Página 63-65); documento de patente WO9837193 (Reivindicación 1; Páginas 55-59); Registro: Q9UHF4; Q6UWA9; Q96SH8; EMBL; AF184971; AAF01320.1.
(21)
Brevicano (BCAN, BEHAB, Nº de registro en Genbank AF229053); Gary S.C., et al. Gene 256, 139-147, 2000; Clark H.F., et al. Genome Res. 13, 2265-2270, 2003; Strausberg R.L., et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 16899-16903, 2002; documento de patente US2003186372 (Reivindicación 11); USA2003186373 (Reivindicación 11); documento de patente US2003119131 (Reivindicación 1; Fig 52); documento de patente US2003119122 (Reivindicación 1; Fig 52); documento de patente US2003119126 (Reivindicación 1); documento de patente US2003119121 (Reivindicación 1; Fig 52); documento de patente US2003119129 (Reivindicación 1); documento de patente US2003119130 (Reivindicación 1); documento de patente US2003119128 (Reivindicación 1; Fig 52); documento de patente US2003119125 (Reivindicación 1); documento de patente WO2003016475 (Reivindicación 1); documento de patente WO200202634 (Reivindicación 1);
(22)
EphB2R (DRT, ERK, Hek5, EPHT3, Tyro5, Nº de registro en Genbank NM_004442); Chan, J. y Watt, V.M., Oncogene 6 (6), 1057-1061 (1991) Oncogene 10 (5):espacio897-905 (1995), Annu. Rev. Neurosci. 21:espacio309-345 (1998), Int. Rev. Cytol. 196: 177-244 (2000)); documento de patente WO2003042661 (Reivindicación 12); documento de patente WO200053216 (Reivindicación 1; Página 41); documento de patente WO2004065576 (Reivindicación 1); documento de patente WO2004020583 (Reivindicación 9); documento de patente WO2003004529 (Páginas 128-132); documento de patente WO200053216 (Reivindicación 1; Página 42); Referencias cruzadas: MIM:600997; NP_004433.2; NM_004442_1
(23)
ASLG659 (B7h, Nº de registro en Genbank AX092328); documento de patente US20040101899 (Reivindicación 2); documento de patente WO2003104399 (Reivindicación 11); documento de patente WO2004000221 (Fig 3); documento de patente US2003165504 (Reivindicación 1); documento de patente US2003124140 (Ejemplo 2); documento de patente US2003065143 (Fig 60); documento de patente WO2002102235 (Reivindicación 13; Página 299); documento de patente US2003091580 (Ejemplo 2); documento de patente WO200210187 (Reivindicación 6; Fig 10); documento de patente WO200194641 (Reivindicación 12; Fig 7b); documento de patente WO200202624 (Reivindicación 13; Fig 1A-1B); documento de patente US2002034749 (Reivindicación 54; Página 45-46); documento de patente WO200206317 (Ejemplo 2; Página 320-321, Reivindicación 34; Páginas 321-322); documento de patente WO200271928 (Páginas 468-469); documento de patente WO200202587 (Ejemplo 1; Fig 1); documento de patente WO200140269 (Ejemplo 3; Páginas 190-192); documento de patente WO200036107 (Ejemplo 2; Páginas 205-207); documento de patente WO2004053079 (Reivindicación 12); documento de patente WO2003004989 (Reivindicación 1); documento de patente WO200271928 (Páginas 233-234, 452-453); documento de patente WO 0116318;
(24)
PSCA (Percusor antigénico de células madre prostáticas, Nº de registro en Genbank AJ297436); Reiter R.E., et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 1735-1740, 1998; Gu Z., et al. Oncogene 19, 1288-1296, 2000; Biochem. Biophys. Res. Commun. (2000) 275 (3): 783-788; documento de patente WO2004022709; documento de patente EP1394274 (Ejemplo 11); documento de patente US2004018553 (Reivindicación 17); documento de patente WO2003008537 (Reivindicación 1); documento de patente WO200281646 (Reivindicación 1; Página 164); documento de patente WO2003003906 (Reivindicación 10; Página 288); documento de patente WO200140309 (Ejemplo 1; Fig 17); documento de patente US2001055751 (Ejemplo 1; Fig 1b); documento de patente WO200032752 (Reivindicación 18; Fig 1); documento de patente WO9851805 (Reivindicación 17; Página 97); documento de patente WO9851824 (Reivindicación 10; Página 94); documento de patente WO9840403 (Reivindicación 2; Fig 1B); Registro: 043653; EMBL; AF043498; AAC39607.1.
(25)
GEDA (Nº de registro en Genbank AY260763); proteína de tipo pareja de fusión HMGIC de lipoma AAP14954 /pid=AAP14954.1 Homo sapiens (humano); documento de patente WO2003054152 (Reivindicación 20); documento de patente WO2003000842 (Reivindicación 1); documento de patente WO2003023013 (Ejemplo 3, Reivindicación 20); documento de patente USA2003194704 (Reivindicación 45); Referencias cruzadas: GI:30102449; AAP14954.1; AY260763_1
(26)
BAFF-R (receptor del factor de activación de linfocitos B, receptor 3 de BLyS, BR3, Nº de registro en Genbank AF 116456); BAFF receptor/pid=NP_443177,1 -Homo sapiens; Thompson, J.S., et al. Science 293 (5537), 2108-2111 (2001); documento de patente WO2004058309; documento de patente WO2004011611; documento de patente WO2003045422 (Ejemplo; Páginas 32-33); documento de patente WO2003014294 (Reivindicación 35; Fig 6B); documento de patente WO2003035846 (Reivindicación 70; Páginas 615-616); documento de patente WO200294852 (Col 136-137); documento de patente WO200238766 (Reivindicación 3; Página 133); documento de patente WO200224909 (Ejemplo 3; Fig 3); Referencias cruzadas: MIM:606269; NP_443177.1; NM_052945_1; AF132600
(27)
CD22 (isoforma CD22-B de receptores de linfocitos B, BL-CAM, Lyb-8, Lyb8, SIGLEC-2, FLJ22814, Nº de registro en Genbank AK026467); Wilson et al. (1991) J. Exp. Med. 173: 137-146; documento de patente WO2003072036 (Reivindicación 1; Fig 1); Referencias cruzadas: MIM:107266; NP_001762.1; NM_001771_1
(28)
CD79a (CD79A, CD79α, asociado a inmunoglobulina alfa, una proteína específica de linfocitos B que interactúa covalentemente con Ig beta (CD79B) y forma un complejo sobre la superficie con moléculas de IgM, transduce una señal implicada en la diferenciación de linfocitos B); 226 aa), pI: 4,84, PM: 25028 TM: 2 [P] Cromosoma del Gen: 19q13.2, Nº de registro en Genbank NP_001774,10); documento de patente WO2003088808, documento de patente US20030228319; documento de patente WO2003062401 (reivindicación 9); documento de patente US2002150573 (reivindicación 4, páginas 13-14); documento de patente WO9958658 (reivindicación 13, Fig 16); documento de patente WO9207574 (Fig 1); Patente de Estados Unidos Nº 5644033; Ha et al. (1992) J. Immunol. 148 (5): 1526-1531; Mueller et al. (1992) Eur. J. Biochem. 22: 1621-1625; Hashimoto et al. (1994) Immunogenetics 40 (4): 287-295; Preud’homme et al. (1992) Clin. Exp. Immunol. 90 (1): 141-146; Yu
et al. (1992) J. Immunol. 148 (2) 633-637; Sakaguchi et al. (1988) EMBO J. 7 (11): 3457-3464
(29) CXCR5 (receptor 1 del linfoma de Burkitt, un receptor acoplado a la proteína G que se activa con la quimioquina CXCL13, funciona en la migración de linfocitos y en la defensa humoral, desempeña un papel en la infección por VIH-2 y quizá en el desarrollo de SIDA, linfoma, mieloma, y leucemia); 372 aa), pI: 8,54 PM: 41959 TM: 7 [P] Cromosoma del Gen: 11q23.3, Nº de registro en Genbank NP_001707,1); documento de patente WO2004040000; documento de patente WO2004015426; documento de patente US2003105292 (Ejemplo 2); Patente de Estados Unidos Nº 6555339 (Ejemplo 2); documento de patente WO200261087 (Fig 1); documento de patente WO200157188 (Reivindicación 20, página 269); documento de patente WO200172830 (páginas 1213); documento de patente WO200022129 (Ejemplo 1, páginas 152-153, Ejemplo 2, páginas 254-256); documento de patente WO9928468 (reivindicación 1, página 38); Patente de Estados Unidos Nº 5440021 (Ejemplo 2, col 49-52); documento de patente WO9428931 (páginas 56-58); documento de patente WO9217497 (reivindicación 7, Fig 5); Dobner et al. (1992) Eur. J. Immunol. 22: 2795-2799; Barella et al. (1995) Biochem. J.
309: 773-779
(30)
HLA-DOB (Subunidad beta de la molécula MHC de clase II (antígeno Ia) que se une a péptidos y los presenta a linfocitos T CD4+); 273 aa, pI: 6,56 PM: 30820 TM: 1 [P] Cromosoma del Gen: 6p21.3, Nº de registro en Genbank NP_002111,1); Tonnelle et al. (1985) EMBO J. 4 (11): 2839-2847; Jonsson et al. (1989) Immunogenetics 29 (6): 411-413; Beck et al. (1992) J. Mol. Biol. 228: 433-441; Strausberg et al. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci USA 99: 16899-16903; Servenius et al. (1987) J. Biol. Chem. 262: 8759-8766; Beck et al. (1996)
J.
Mol. Biol. 255: 1-13; Naruse et al. (2002) Tissue Antigens 59: 512-519; documento de patente WO9958658 (reivindicación 13, Fig 15); Patente de Estados Unidos Nº 6153408 (Col 35-38); Patente de Estados Unidos Nº 5976551 (col 168-170); Patente de Estados Unidos Nº 6011146 (col 145-146); Kasahara et al. (1989) Immunogenetics 30 (1): 66-68; Larhammar et al. (1985) J. Biol. Chem. 260 (26): 14111-14119
(31)
P2X5 (Canal iónico 5 abierto por el ligando receptor purinérgico P2X, n canal aniónico abierto por ATP extracelular, puede estar implicado en la transmisión y en la neurogénesis sináptica, la deficiencia puede contribuir a la patofisiología de inestabilidad detrusora idiopática); 422 aa), pI: 7.63, PM: 47206 TM: 1 [P] Cromosoma del Gen: 17p13.3, Nº de registro en Genbank NP_002552,2); Le et al. (1997) FEBS Lett. 418 (1-2): 195-199; documento de patente WO2004047749; documento de patente WO2003072035 (reivindicación 10); Touchman et al. (2000) Genome Res. 10: 165-173; documento de patente WO200222660 (reivindicación 20); documento de patente WO2003093444 (reivindicación 1); documento de patente WO2003087768 (reivindicación 1); documento de patente WO2003029277 (página 82)
(32)
CD72 (antígeno CD72 de diferenciación de linfocitos B, Lyb-2); 359 aa), pI: 8.66, PM: 40225 TM: 1 [P] Cromosoma del Gen: 9p13.3, Nº de registro en Genbank NP_001773,1); documento de patente WO2004042346 (reivindicación 65); documento de patente WO2003026493 (páginas 51-52, 57-58); documento de patente WO200075655 (páginas 105-106); Von Hoegen et al. (1990) J. Immunol. 144 (12): 4870-4877; Strausberg et al. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci USA 99: 16899-16903
(33)
LY64 (Antígeno 64 de linfocitos (RP105), proteína de membrana de tipo I de la familia de repetición rica en leucina (LRR), regula la activación y apoptosis de linfocitos B, la pérdida de función está asociada con mayor actividad de la enfermedad en pacientes con lupus sistémico eritematoso); 661 aa), pI: 6.20, PM: 74147 TM: 1 [P] Cromosoma del Gen: 5q12, Nº de registro en Genbank NP_005573,1); documento de patente US2002193567; documento de patente WO9707198 (reivindicación 11, páginas 39-42); Miura et al. (1996) Genomics 38 (3): 299304; Miura et al. (1998) Blood 92: 2815-2822; documento de patente WO2003083047; documento de patente WO9744452 (reivindicación 8, páginas 57-61); documento de patente WO200012130 (páginas 24-26)
(34)
FcRH1 (proteína 1 de tipo receptor de Fc, un supuesto receptor para el dominio Fc de la inmunoglobulina que contiene los dominios similar a Ig de tipo C2 e ITAM, puede tener un papel en la diferenciación de linfocitos B); 429 aa), pI: 5.28, PM: 46925 TM: 1 [P] Cromosoma del Gen: 1q21-1q22, Nº de registro en Genbank NP_443170,1); documento de patente WO2003077836; documento de patente WO200138490 (reivindicación 6, Fig 18E-1-18-E-2); Davis et al. (2001) Proc. Natl. Acad. Sci USA 98 (17): 9772-9777; documento de patente WO2003089624 (reivindicación 8); documento de patente EP1347046 (reivindicación 1); documento de patente WO2003089624 (reivindicación 7)
(35)
IRTA2 (FcRH5, Translocación asociada al receptor 2 de la superfamilia de inmunoglobulinas, un supuesto inmunoreceptor con posibles papeles en el desarrollo y la linfomagénesis de linfocitos B; la desregulación de los genes por translocación se produce en algunas neoplasias de linfocitos B); 977 aa), pI: 6.88 PM: 106468 TM: 1
[P] Cromosoma del Gen: 1q21, (Nº de registro en Genbank Human:AF343662, AF343663, AF343664, AF343665, AF369794, AF397453, AK090423, AK090475, AL834187, AY358085; Ratón: AK089756, AY158090, AY506558; NP_112571,1); documento de patente WO2003024392 (reivindicación 2, Fig 97); Nakayama et al. (2000) Biochem. Biophys. Res. Commun. 277 (1): 124-127; documento de patente WO2003077836; documento de patente WO200138490 (reivindicación 3, Fig 18B-1-18B-2)
(36) TENB2 (TMEFF2, tomorregulina, TPEF, HPP1, TR, supuesto proteoglicano transmembrana, relacionado con la familia de EGF/herregulina de factores de crecimiento y folistatina); 374 aa, Registro en NCBI: AAD55776, AAF91397, AAG49451, Sec de Ref en NCBI: NP_057276; Gen en NCBI: 23671; OMIM: 605734; SwissProt Q9UIK5; (Nº de registro en Genbank AF179274; AY358907, CAF85723, CQ782436); documento de patente WO2004074320; documento de patente JP2004113151; documento de patente WO2003042661; documento de patente WO2003009814; documento de patente EP1295944 (páginas 69-70); documento de patente WO200230268 (página 329); documento de patente WO200190304; documento de patente US2004249130; documento de patente US2004022727; documento de patente WO2004063355; documento de patente US2004197325; documento de patente US2003232350; documento de patente US2004005563; documento de
patente US2003124579; Patente de Estados Unidos Nº 6410506; Patente de Estados Unidos Nº 66420061; Horie et al. (2000) Genomics 67: 146-152; Uchida et al. (1999) Biochem. Biophys. Res. Commun. 266: 593-602; Liang et al. (2000) Cancer Res. 60: 4907-12; Glynne-Jones et al. (2001) Int J Cancer. 15 de octubre; 94 (2): 178
84.
Los compuestos de referencia de fórmula (Ia), (Ib), (I’a) y (I’b) se informan como Compuestos 1-14 en la Tabla 1 que sigue a continuación:
Tabla 1
[Ant-L-Z-]m -T (I) Ant-L-Z-Q (I’)
Comp
Fórmula Ant L Z M Q T
1
I’ IIa -NH - H -
2
I’ IIa -NH - CH3 -
3
I’ IIa -NH - -
4
I’ IIa - H -
5
I IIa -NH 6 - Mcm2
6
I’ IIa -NH - H -
7
I’ IIa -NH - CH3 -
8
I’ IIa -NH - -
9
I’ IIb - H -
10
I’ IIb - H -
11
I IIb NH 6 - Mcm2
12
I’ IIb - H -
13
I IIb S 1 - Mcm2
14
I IIa NH 6 - Mcm2
en la que el resto [Ant] se representa mediante un compuesto de fórmula (IIa) o (IIb) que sigue a continuación, es decir, [Ant] es un resto de una antraciclina de fórmula IIA tal como se ha definido anteriormente,
Si un centro quiral u otra forma de un centro isomérico está presente en un compuesto de la presente invención, todas las formas de tal isómero o isómeros, que incluyen enantiómeros y diastereómeros, pretenden quedar cubiertos en el presente documento. Los compuestos que contienen un centro quiral se pueden usar como una
10 mezcla racémica, una mezcla enantioméricamente enriquecida, o la mezcla racémica se puede separar usando técnicas bien conocidas y un enantiómero individual se puede usar solo. En casos en los que los compuestos tienen dobles enlaces carbono-carbono insaturados, los isómeros tanto cis (Z) como trans (E) están dentro del alcance de la presente invención.
15 En casos en los que los compuestos pueden existir en formas tautoméricas, tales como tautómeros ceto-enol, se contempla que cada forma tautomérica está incluida dentro de la presente intervención viene existiendo en equilibrio
o predominantemente en una forma.
Las sales farmacéuticamente aceptables de un derivado de antraciclina de fórmula (I’) o de un conjugado de
20 derivados de antraciclina de fórmula (I) incluyen las sales de adición ácida con ácidos inorgánicos u orgánicos, por ejemplo, ácido nítrico, clorhídrico, bromhídrico, sulfúrico, perclórico, fosfórico, acético, trifluoroacético, propiónico, glicólico, láctico, oxálico, malónico, málico, maleico, fumárico, tartárico, cítrico, benzoico, cinámico, mandélico, metanosulfónico, isetiónico y salicílico. Preferentemente, la sal de adición ácida de los compuestos de la invención es la sal de clorhidrato o mesilato.
25 Las sales farmacéuticamente aceptables de un derivado de antraciclina de fórmula (I’) o de un conjugado de derivados de antraciclina de fórmula (I) también incluyen las sales con bases inorgánicas u orgánicas, por ejemplo, metales alcalinos o alcalinotérreos, especialmente hidróxidos de sodio, potasio, calcio, amonio o magnesio, carbonatos o bicarbonatos, aminas acíclicas o cíclicas, preferentemente metilamina, etilamina, dietilamina,
30 trietilamina, piperidina y similares.
Tal como se usa en el presente documento, a menos que se indique de otro modo, con el término alquilo C1-C6 se hace referencia a un grupo tal como, por ejemplo, metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, isobutilo, sec-butilo, terc-butilo, n-pentilo, neopentilo, n-hexilo, isohexilo, y similares.
35 Con el término grupo cicloalquilo C3-C6 se hace referencia a, por ejemplo, ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo, ciclopentenilo, ciclohexenilo, y similares.
Con el término grupo alquileno C1-C6 se hace referencia a un resto divalente tal como, por ejemplo, metileno, etileno, 40 n-propileno, isopropileno, n-butileno, isobutileno, sec-butileno, terc-butileno, n-pentileno, neopentileno, n-hexileno,
isohexileno, y similares.
El término grupo cicloalquileno C3-C6 se refiere a un resto divalente tal como, por ejemplo, ciclopropileno, ciclobutileno, ciclopentileno, ciclohexileno, ciclopentenileno, ciclohexenileno, y similares.
5 Para un experto en la materia es evidente que cualquiera de los grupos o sustituyentes definidos en el presente documento se puede interpretar a partir de los nombres de los grupos a partir del que se originan.
Como an ejemplo, a menos que se indique específicamente de otro modo, en el grupo alcoxi C1-C5, el resto de
10 alquilo incluye, por ejemplo, metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, isobutilo, sec-butilo, terc-butilo, n-pentilo, neopentilo y similares. Los grupos alcoxi C1-C5 a modo de ejemplo son metoxi (-OCH3), etoxi (-OCH2CH3), propiloxi, isopropiloxi, n-butiloxi, isobutiloxi, sec-butiloxi, terc-butiloxi, n-pentiloxi, neopentiloxi y similares.
"Un resto de péptido constituido por 1 a 4 amino" se refiere a un péptido que comprende la secuencia de uno a 15 cuatro aminoácidos naturales o sintéticos.
La presente invención también proporciona procesos tal como se define en la reivindicación 16 para la preparación de un compuesto de conjugado de anticuerpo-fármaco.
20 Un compuesto de fórmula (Ia) tal como se ha definido anteriormente y las sales farmacéuticamente aceptables el mismo se puede preparar tal como se representa en la Figura 2.
Procesos para preparar conjugados de derivados de antraciclina
25 En consecuencia, un primer proceso de la presente invención para preparar un compuesto tal como se ha definido anteriormente y las sales farmacéuticamente aceptables del mismo, cuyo proceso comprende las siguientes etapas:
Etapa 1 hacer reaccionar un compuesto de fórmula (II) tal como se ha definido anteriormente con un compuesto de fórmula (IX) o (X): 30
en la que v, j, k, y, y B son tal como se han definido anteriormente y R3 es un grupo alquilo C1-C3; 35 Etapa 2 hidrolizar el compuesto intermedio de éster resultante (XI):
en la que R1, R2, R3 son tal como se han definido anteriormente y L1 es un grupo de fórmula (III) o (IV)
Etapa 3 activa del ácido resultante de fórmula (XII):
en la que R1, R2, y L1 son tal como se han definido anteriormente y Etapa 4 unir el compuesto activado resultante de fórmula (XIII):
10 en la que R1, R2, y L1 son tal como se han definido anteriormente y W es un grupo de activación del grupo ácido, tal como N-oxisuccinimido, N-oxisulfosuccinimido o 2,4-dinitrofenoxi o 2,3,4,5,6-pentafluorofenoxi o t-butoxi carboniloxi para el vehículo deseado con el fin de producir el compuesto de fórmula (Ia), y opcionalmente convertir el compuesto resultante en un ácido farmacéuticamente aceptable.
15 La reacción de la etapa I se realiza en un disolvente orgánico por ejemplo dimetoxietano o preferentemente N,Ndimetilformamida (DMF) y en presencia de ácido p-toluenosulfónico a una temperatura que varía de 0 ºC a 80 ºC y durante un período de tiempo que varía de 1 hora a 24 horas.
20 La reacción de la etapa 2 se realizó en condiciones hidrolíticas básicas, preferentemente con una base fuerte como NaOH, a una temperatura de 0 ºC a temperatura ambiente durante un período de tiempo que varía de 1 a 48 horas.
La reacción de la etapa 3 se realizó siguiendo métodos bien conocidos, por ejemplo el derivado de N-oxisuccinimido se puede preparar por reacción del ácido (XII) con N-hidroxisuccinimida sal de sulfonato sódico sustituido en la 25 posición 3 soluble en agua en presencia de N,N’-diciclohexil-carbodiimida en un disolvente tal como diclorometano o N,N-dimetilformamida a una temperatura de 0 ºC a 50 ºC durante un periodo de tiempo de 1 a 24 horas.
La reacción de la etapa 4 se puede realizar siguiendo uno de los métodos que se resumen en las Figuras 3a, 3b, 3c, dependiendo del compuesto deseado de fórmula (Ia) tal como se ha definido anteriormente que se va a obtener.
30 En particular, la condensación final para preparar un compuesto de fórmula (Ia) tal como se ha definido anteriormente comprende hacer reaccionar un compuesto de fórmula (XIII) tal como se ha definido anteriormente con:
35 1a) un compuesto de fórmula T-[X]m (XIV) en la que X es -NH2 o -SH y m es tal como se ha definido anteriormente, para obtener un compuesto de fórmula (Ia) tal como se ha definido anteriormente en el punto i) o ii) respectivamente.
La condensación se realiza en condiciones capaces de crear enlaces covalentes de tipo amídico o tioéster y 40 compatibles con la estructura del vehículo. Las condiciones preferentes incluyen el uso de soluciones acuosas
tamponadas a pH 7-9,5, temperaturas de 4 ºC a 37 ºC., durante períodos de tiempo de algunas horas a varios días.
Por ejemplo, las condiciones para la condensación entre los compuestos de fórmula (XIII) y anticuerpos T-NH2 son: fosfato sódico acuoso 0,1 M y cloruro sódico acuoso 0,1 M a pH 8 que contiene un anticuerpo monoclonal a 1 mg/ml,
5 se trató con un exceso molar de 30 veces de una solución al 10 % en p/v de 6 en N,N-dimetilformamida, durante 24 horas a 20 (grados) C. El conjugado se purifica mediante filtración en gel en una columna G-25 de SEPHADEX (Pharmacia Fine Chemical, Piscataway, N.J.), eluyendo con PBS (solución salina tamponada con fosfato).
Otra condensación para preparar un compuesto de fórmula (Ia) tal como se ha definido anteriormente comprende 10 hacer reaccionar un compuesto de fórmula (XIII) tal como se ha definido anteriormente con:
1b) un compuesto de fórmula (XV) NH2-D-NH-P en la que -D-o -D-NH-son tal como se han definido anteriormente y P es átomo de hidrógeno o preferentemente un grupo protector 1b’) desproteger la función NH, si fuera necesario, del compuesto de fórmula (XVI) resultante:
en la que R1, R2, L1 y D son todo tal como se han indicado anteriormente y P es un grupo protector, y a continuación 1"b) acoplamiento del compuesto resultante de fórmula (XVI):
en la que R1, R2, L1 y D son tal como se ha indicado anteriormente y P es átomo de hidrógeno, con un resto de
25 vehículo de fórmula T-[COOH]m (XVII) en la que T y m son tal como se han definido anteriormente, para obtener el compuesto de fórmula (Ia) tal como se define en el punto (iii) mencionado anteriormente en la que [T-Z]-es -NH-D-NHCO-T , R1, R2, L1 y T son tal como se han definido anteriormente.
La reacción de la etapa 1b se realiza en condiciones capaces de crear enlaces covalentes de tipo amídico y son bien
30 conocidas en la bibliografía y compatibles con la estructura del espaciador. Las condiciones preferentes incluyen el uso de soluciones acuosas tamponadas a pH 7-9,5, o disolventes orgánicos tales como, por ejemplo N,Ndimetilformamida, diclorometano, tetrahidrofurano o acetato de etilo, temperatura que varía de 4 ºC a 50 ºC y durante períodos de tiempo de algunas horas a varios días.
35 La desprotección opcional de la etapa 1’b se realiza usando métodos bien conocidos informados en la bibliografía [véase, por ejemplo Green T.W., Wuts P.G.M en Protective Groups in Organic Chemistry]. La reacción de acoplamiento de la etapa 1"b se realiza en un disolvente orgánico, preferentemente N,N-dimetilformamida en presencia de un agente de condensación tal como por ejemplo clorhidrato de 1-etil-3-(3dimetilaminopropil)carbodiimida 1,3-di-terc-butilcarbodiimida, N-(3-dimetilaminopropil)-n’-etilcarbodiimida, clorhidrato
de 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida, o preferentemente N,N’-diciclohexil-carbodiimida. La reacción se realiza a una temperatura que varía de 5 ºC a 50 ºC y durante un período de tiempo que varía de 1 hora a 24 horas.
De una forma alternativa, el compuesto de fórmula (XVII) se puede activar con un grupo ácido de activación 5 adecuado W tal como se ha descrito anteriormente en la etapa 3 mencionada anteriormente y a continuación se puede acoplar con la amina desprotegida usando las mismas condiciones que se ha informado anteriormente.
Otra condensación para preparar un compuesto de fórmula (Ia) tal como se ha definido anteriormente comprende hacer reaccionar un compuesto de fórmula (XIII) tal como se ha definido anteriormente con:
10 1c) un compuesto de fórmula (XVIII) NH2-D-COO-P1 en la que D o D-CO-son tal como se han definido anteriormente y P1 es un grupo ácido protector adecuado por ejemplo alquiléster que se retira después de la reacción de acoplamiento para producir el compuesto ácido de fórmula (XIX):
en la que R1, R2, L1 y D son tal como se han descrito anteriormente.
El compuesto de fórmula (XIX) resultante se puede usar como tal, o se puede activar preferentemente a través de un
20 grupo ácido de activación adecuado tal como se ha descrito anteriormente en la etapa 3, y a continuación acoplar con el resto de vehículo de fórmula (XIV) T-[X]m en la que X es NH2 y m y T son tal como se han definido anteriormente para preparar el compuesto de fórmula (Ia) definido en el punto (iv) en la que [T-Z]-es -NH-D-CONH-T, R1, R2, L1 y T son tal como se han definido anteriormente.
25 Las condiciones de reacción preferentes para acoplar un compuesto de fórmula (XIII) con un compuesto de fórmula
(XVIII) tal como se ha definido anteriormente son las mismas que las indicadas en la etapa 1b mencionada anteriormente. la retirada del grupo protector ácido se realiza usando métodos bien revisados [véase, por ejemplo Green T.W., Wuts P.G.M en Protective Groups in Organic Chemistry] por ejemplo cuando la función ácida se protege como derivado de éster de etilo la desprotección se puede realizar en condiciones hidrolíticas básicas usando
30 preferentemente NaOH y a una temperatura que varía de 0 ºC a temperatura ambiente y durante un período de tiempo que varía de 1 hora a 48 horas. La reacción de un compuesto de fórmula (XIX) con el compuesto de fórmula
(XIV) se realiza en disolvente orgánico preferentemente N,N-dimetilformamida en presencia de un agente de condensación tal como por ejemplo clorhidrato de 1-etil-3-(3-dimetil-aminopropil)carbodiimida 1,3-di-tercbutilcarbodiimida, N-(3-dimetilaminopropil)-n’-etilcarbodiimida, clorhidrato de 1-(3-dimetilaminopropil)-3
35 etilcarbodiimida, o preferentemente N,N’-diciclohexil-carbodiimida. La reacción se realiza a una temperatura que varía de 5 ºC a 50 ºC and durante un periodo de tiempo de 1 hora a 24 horas o en una ruta de síntesis alternativa activando el ácido (XIX) con un grupo de activación adecuado tal como se indica en la etapa 3 del proceso y a continuación acoplando el ácido activado con un compuesto de fórmula (XIV) en las condiciones de síntesis indicadas anteriormente en la etapa 1.
40 Otra condensación para preparar un compuesto de fórmula (Ia) tal como se ha definido anteriormente comprende hacer reaccionar un compuesto de fórmula (XIII) tal como se ha definido anteriormente con:
1d) un compuesto de fórmula (XV) tal como se ha descrito anteriormente, y a continuación acoplando el
45 compuesto intermedio resultante de fórmula (XVI) tal como se ha definido anteriormente en la que P es átomo de hidrógeno, con un resto de vehículo de fórmula T-[CHO]m (XX), en la que m y T son tal como se han definido anteriormente, para obtener un compuesto de fórmula (Ia) que se describe en el punto (v) mencionado anteriormente en la que el resto [T-Z]-representa -NH-D-N=CH-T.
50 La conjugación de derivado amino desprotegido de fórmula (XVI) con un vehículo de fórmula (XX) se puede realizar en condiciones capaces de crear enlaces covalentes de tipo hidrazona incompatibles con la estructura del vehículo. Las condiciones preferentes incluyen el uso de soluciones acuosas tamponadas a pH 4-7,5, alcoholes o una mezcla de los mismos, a una temperatura de 4 ºC la 37 ºC, durante periodos de tiempo de algunas horas a varios días. Las
condiciones para el acoplamiento entre los compuestos del derivado desprotegido de fórmula (XVI) y anticuerpos T-CHO son: acetato sódico acuoso 0,1 M y cloruro sódico acuoso 0,1 M a pH 6 que contiene un anticuerpo monoclonal a 1 mg/ml, tratado con un exceso molar de 30 veces de una solución al 5 % en p/v de 8 en el mismo tampón, durante 24 horas a 20 ºC. El conjugado se purifica por filtración en gel tal como se ha descrito anteriormente.
5 Otra condensación para preparar un compuesto de fórmula (Ia) tal como se ha definido anteriormente comprende hacer reaccionar un compuesto de fórmula (XIII) tal como se ha definido anteriormente con:
1e) un compuesto de fórmula (XXI) NH2-D-SH en la que D es tal como se ha definido anteriormente, en las 10 mismas condiciones de reacción indicadas en la etapa 1 del proceso y a continuación acoplar el compuesto de fórmula (XXII) resultante:
en la que R1, R2, L1 y D son tal como se ha indicado anteriormente, con: 1e’) un resto de vehículo de fórmula (V):
en la que T y m son tal como se han definido anteriormente, para obtener, después de adición de Michael, un compuesto de fórmula (Ia) que se describe en el punto (vi) en la que [T-Z]-es un resto de fórmula (XXIII):
en la que D y T son tal como se han definido anteriormente; o 1e") con un resto de vehículo de fórmula (VI):
en la que T y m son tal como se han definido anteriormente, para obtener, después del desplazamiento del grupo piridina-2-tiol, un compuesto de fórmula (Ia) definido en el punto (vii) mencionado anteriormente en la que [T-Z]es un resto de fórmula (XXIV)
en la que D y T son tal como se han definido anteriormente.
La reacción de un compuesto de fórmula (XXII) tal como se ha definido anteriormente con un compuesto de fórmula
(V) tal como se ha definido anteriormente se puede realizar en soluciones acuosas tamponadas a pH 7-9,5,
5 alcoholes o una mezcla de los mismos, a una temperatura de 4 ºC a temperatura ambiente y durante un periodo de 1 a 6 horas [véase por ejemplo Willner D. et al, Bioconjugate Chem. (1993) 4: 521-527]. El acoplamiento del compuesto (XXII) con el compuesto (VI) se realiza preferentemente en una mezcla de metanol y solución tamponada con fosfato, a pH 7,2 con 1 a 1,5 equivalentes de un compuesto de fórmula (XXII) tal como se ha definido anteriormente para cada grupo de reacción de un compuesto (VI) tal como se ha definido anteriormente. La reacción
10 se incuba preferentemente a una temperatura de 4 ºC a temperatura ambiente [véase, por ejemplo, documento de patente EP328147].
Un compuesto de fórmula (Ib) tal como se ha definido anteriormente y las sales farmacéuticamente aceptables del mismo se puede preparar tal como se representa en la Figura 4.
15 Los compuestos de la presente invención de fórmula (I’) tal como se ha definido anteriormente, en la que L es L1, y las sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, se pueden obtener mediante un proceso que se representa a continuación en los esquemas 7-10, en los que todos los símbolos tienen los mismos significados tal como se ha definido anteriormente.
Por reacción un compuesto de fórmula (XIII) con un compuesto de fórmula Q-NH2 o Q-SH, en la que Q es tal como se ha definido anteriormente, se obtienen compuestos de fórmula (I’) en la que L es L1 y R1, R2, Q y L1 son tal como 25 se han definido anteriormente. Las condiciones de reacción de acoplamiento son las mismas que se han descrito anteriormente en el punto 1a.
30 Por reacción un compuesto de fórmula (XIX) con un compuesto de fórmula Q-NH2 tal como se ha definido anteriormente se obtienen compuestos de fórmula (I’) en la que L es L1 y R1, R2, Q y D son tal como se han definido anteriormente. Las condiciones de reacción de acoplamiento son las mismas que se han descrito anteriormente en el punto 1c.
Por reacción un compuesto de fórmula (XVI) en la que P es átomo de hidrógeno con un compuesto de fórmula Q-CHO, en la que Q es tal como se ha definido anteriormente, se obtienen compuestos de fórmula (I’) en la que L es L1 y R1, R2, Q, L1 y D son tal como se han definido anteriormente. Las condiciones de reacción de acoplamiento son las
40 mismas que se han descrito anteriormente en el punto 1d.
Por reacción un compuesto de fórmula (XVI) en la que P es átomo de hidrógeno y L1 y D son tal como se han definido anteriormente, con un compuesto de fórmula Q-COOH en la que Q es tal como se ha definido 5 anteriormente, se obtienen compuestos de fórmula (I’) en la que L es L1 y L1, R1, R2, Q y D son tal como se han definido anteriormente.
Las condiciones de reacción de acoplamiento son las mismas que se han descrito anteriormente en el punto 1b. Los compuestos de la presente invención de fórmula (I’) tal como se ha definido anteriormente, en la que L es L2, y las
10 sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, se pueden obtener mediante un proceso que se representa a continuación en los Esquemas 11-15, en los que todos los símbolos tienen los mismos significados tal como se ha definido anteriormente.
15 Por reacción un compuesto de fórmula (XXVI) con un compuesto de fórmula Q-NH2 o Q-SH tal como se ha definido anteriormente, se obtienen compuestos de fórmula (I’) en la que L es L2, y L2 tiene la fórmula (VII) tal como se ha definido anteriormente y R1, R2, Q son tal como se han definido anteriormente.
Por reacción de un compuesto ácido de fórmula (XXX) con un compuesto de fórmula Q-NH2 tal como se ha definido anteriormente, se obtienen compuestos de fórmula (I’) en la que L es L2 y L2 es un conector de fórmula (VII) tal como se ha definido anteriormente y R1, R2, R4, D, Q son tal como se han definido anteriormente.
Por reacción de un compuesto ácido de fórmula (XXVIII) con un compuesto de fórmula Q-CHO tal como se ha definido anteriormente, se obtienen compuestos de fórmula (I’) en la que L2 es un conector de fórmula (VII) tal como se ha definido anteriormente y R1, R2, R4, D, Q son tal como se han definido anteriormente.
Por reacción de un compuesto ácido de fórmula (XXVIII) con un compuesto de fórmula Q-COOH tal como se ha definido anteriormente, se obtienen compuestos de fórmula (I’) en la que L es L2, L2 es un conector de fórmula (VII) tal como se ha definido anteriormente y R1, R2, R4, D, Q son tal como se han definido anteriormente. Las condiciones
10 de reacción de acoplamiento que se han descrito anteriormente son las mismas que se describen en el punto 1e’.
Por reacción un compuesto de fórmula (XXXIV) con un compuesto de fórmula Q-SH tal como se ha definido 15 anteriormente, se obtienen compuestos de fórmula (I’) en la que L es L2, L2 es un conector de fórmula (VIII) tal como se ha definido anteriormente y R1, R2, Q son tal como se han definido anteriormente.
20 Por reacción un compuesto de fórmula (XXXVIII) con un compuesto de fórmula Q-NH2 tal como se ha definido anteriormente, se obtienen compuestos de fórmula (I’) en la que L es L2, L2 es un conector de fórmula (VIII) y R1, R2, Qy D son tal como se han definido anteriormente.
Por reacción un compuesto de fórmula (XXXVI) con un compuesto de fórmula Q-CHO tal como se ha definido anteriormente, se obtienen compuestos de fórmula (I’) en la que L es L2, L2 es un conector de fórmula (VIII) y R1, R2, Q y D son tal como se han definido anteriormente.
Por reacción un compuesto de fórmula (XXXVI) con un compuesto de fórmula Q-COOH tal como se ha definido anteriormente, se obtienen compuestos de fórmula (I’) en la que L es L2, L2 es un conector de fórmula (VIII) y R1, R2, Q y D son tal como se han definido anteriormente. Las condiciones de reacción de acoplamiento que se han descrito anteriormente son las mismas que se describen en el punto 1e’’ mencionado anteriormente.
Los compuestos de partida y reactivos están disponibles en el mercado o se pueden preparar siguiendo métodos conocidos informados en la bibliografía. Por ejemplo, los compuestos de fórmula (II) se describen en el documento de patente WO 98/02446, los compuestos de fórmula (IX) y (X) se describen en el documento de patente WO 9202255.
CONJUGADOS DE ANTICUERPO-FÁRMACO
Los compuestos de conjugado derivado de antraciclina de la invención incluyen aquéllos con utilidad por su actividad anticáncer. En una realización, Los compuestos de conjugado derivado de antraciclina incluyen un anticuerpo conjugado, es decir unido covalentemente mediante un conector, a un resto de fármaco derivado de antraciclina en el que el fármaco cuando no se conjuga con un anticuerpo tiene un efecto citotóxico o citostático. La actividad biológica del resto de fármaco se modula de este modo por conjugación con un anticuerpo. Los conjugados de anticuerpo-fármaco (ADC) de la invención pretenda administrar de forma selectiva una dosis eficaz de un agente citotóxico al tejido tumoral mediante lo cual se puede conseguir una selectividad mayor, es decir una dosis eficaz menor.
En una realización, la biodisponibilidad del ADC, o un metabolito intracelular del ADC, mejora en un mamífero cuando se compara con el PNU-159682 correspondiente, compuesto derivado de antraciclina solo. Además, la biodisponibilidad del ADC, o un metabolito intracelular del ADC mejora en un mamífero cuando se compara con en anticuerpo correspondiente solo (anticuerpo del ADC, sin el resto de fármaco o conector).
En una realización, el resto de fármaco derivado de antraciclina del ADC no se escinde del anticuerpo hasta que el conjugado de anticuerpo-fármaco se une a un receptor de superficie celular o entra en una célula con un receptor de superficie celular específico para el anticuerpo del conjugado de anticuerpo-fármaco. El resto de fármaco se puede escindir el anticuerpo después de que el conjugado de anticuerpo-fármaco entre en la célula. El resto de fármaco derivado de antraciclina se puede escindir por vía intracelular en un mamífero desde el anticuerpo del compuesto, o un metabolito intracelular del compuesto, por acción enzimática, hidrólisis, oxidación, u otro mecanismo.
Los conjugados de anticuerpo-fármaco de la invención también se pueden producir por modificación del anticuerpo para introducir restos electrófilos, que pueden reaccionar con sustituyentes nucleófilos con en el reactivo o fármaco conector. Los azúcares de anticuerpos glicosilados se pueden oxidar, por ejemplo con reactivos oxidantes de peryodato, para formar grupos aldehído o cetona que pueden reaccionar con el grupo amino de reactivos conectores
o restos de fármaco. Los grupos imina de la base de Schiff resultantes pueden formar un enlace estable, o se pueden reducir, por ejemplo con reactivos de borohidruro para formar enlaces de amina estables. En una realización, la reacción de la porción de hidrato de carbono de un anticuerpo glicosilado con galactosa oxidasa o meta-peryodato sódico puede proporcionar grupos carbonilo (aldehído y cetona) en la proteína que pueden reaccionar con grupos apropiados en el fármaco (Hermanson, G.T. (1996) Bioconjugate Techniques; Academic Press: Nueva York, p 234-242). En otra realización, las proteínas que contienen restos de serina o treonina Nterminal pueden reaccionar con meta-peryodato sódico, dando como resultado la producción de un aldehído en lugar del primer aminoácido (Geoghegan & Stroh, (1992) Bioconjugate Chem. 3: 138-146; Patente de Estados Unidos Nº 5362852). Tal aldehído puede reaccionar con un resto de fármaco o conector nucleófilo.
En una realización, un compuesto de conjugado de anticuerpo-fármaco (ADC) comprende un anticuerpo unido covalentemente mediante un conector L y un espaciador opcional Z a uno o más restos de fármaco derivados de antraciclina D, teniendo el compuesto la fórmula (Ic) tal como se define en la reivindicación 5
Ab-(L-Zm-D)p Ic
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en la que:
Ab es un anticuerpo tal como se define en la reivindicación 5 D es un derivado de antraciclina seleccionado entre la estructura
en la que la línea ondulada indica la unión a L; L es un conector seleccionado entre -N(R)-, -N(R)m(alquileno C1-C12)-, -N(R)m(alquenileno C2-C8)-, N(R)m(alquinileno C2-C8)-, -N(R)m(CH2CH2O)n-, y la estructura:
en la que las líneas onduladas indican las uniones a D y Z; y Z es un espaciador opcional seleccionado entre -CH2C(O)-, -CH2C(O)NR(alquileno C1-C12)-, y las estructuras:
R es H, alquilo C1-C12, o arilo C6-C20; R1 y R2 se seleccionan independientemente entre una cadena lateral de aminoácido tal como se define en la reivindicación 5
20 Z1 se selecciona entre -(alquileno C1-C12)-, -(alquenileno C2-C8)-, -(alquinileno C2-C8)-y -(CH2CH2O)n-, m es 0 o1; n es de 1a 6;y p es un número entero de 1 a 8.
25 Los compuestos de Fórmula I incluyen todas las mezclas de conjugados de anticuerpo-fármaco cargados y unidos de diversas maneras en los que 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, y 8 restos de fármacos se unen covalentemente al anticuerpo.
Las realizaciones a modo de ejemplo de conjugados de anticuerpo-fármaco incluyen: 10
en la que Aa es una unidad divalente, tal como MC (maleimidocaproílo), MP (maleimidopropanoílo) o MPEG (2-(2-(2(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)etoxi)etoxi)acetilo), capaz de unir un anticuerpo (Ab) a una unidad de aminoácido, tal como valina-citrulina ; e Yy es una unidad divalente, tal como PAB (para-aminobenciloxicarbonilo) que une una unidad de aminoácido al resto de fármaco (D) cuando una unidad de aminoácido está presente. En otras realizaciones, Aa une Yy directamente al resto de fármaco cuando la unidad de aminoácido está ausente. En otras realizaciones, la unidad Yy une directamente el resto de fármaco a la unidad de anticuerpo cuando tanto la unidad de aminoácido como la unidad Aa están ausentes.
Los conjugados de anticuerpo-fármaco de fórmula (I) y los compuestos de fórmula (I’) incluyen todos los enantiómeros, diastereómeros, isoméricamente enriquecidos, mezclas racémicas, formas isotópicamente marcadas y formas isotópicamente enriquecidas (por ejemplo, 2H, 3H, 14C, 15N), y formas protegidas de los mismos.
Sin estar limitado por ningún mecanismo de acción en particular, los conjugados de anticuerpo-fármaco de fórmula
(I) y el compuesto de fórmula (I’) de la presente invención pueden ser agentes terapéuticos útiles ya que contienen un enlace acetálico o un enlace de hidrazona, que libera el fármaco precursor (II) después de la hidrólisis catalizada por ión hidronio o escisión enzimática "in vivo". Es bien conocido que en los tumores malignos existe una tasa elevada de glicólisis en comparación con el tejido normal, lo que causó un aumento de la producción de lactato y de este modo una disminución del pH en el tumor, véase: H. M. Rauen et al., Z. Naturforsch, Teil B, 23 (1968) 1461. La invención proporciona una especificidad de acción de dos niveles de los compuestos, el primero consistiendo en una localización preferente del conjugado en el tejido tumoral por medio de reconocimiento antigénico, y el segundo consistiendo en una liberación preferente del fármaco en su forma activa en el tejido tumoral por medio de escisión ácida preferente. Mientras que no limiten el alcance o la utilidad de las composiciones o métodos de la invención, los conectores de acetal sensibles a ácidos que se describen en el presente documento se pueden escindir in vivo en condiciones ácidas localizadas o sistémicas, separando de este modo el anticuerpo dirigido del resto de fármaco.
Los conjugados producidos de acuerdo con los métodos que se describen se caracterizan siguiendo diferentes métodos químico-físicos. La retención del peso molecular original y la carencia de formación de agregados se pueden evaluar mediante procedimientos que cromatográficos de filtración en gel (Yu, D. S. et al., J. Urol. 140, 415, 1988) con detección simultánea e independiente de antraciclina y anticuerpo a diferentes longitudes de onda, y mediante métodos de electroforesis en gel. La distribución de carga global de los compuestos obtenidos se puede evaluar mediante procedimientos cromatográficos de intercambio iónico. La concentración de antraciclina se puede evaluar mediante valoración espectrofotométrica frente a curva de calibración estándar obtenida a partir de la antraciclina precursora. La concentración de proteínas se puede evaluar mediante ensayos colorimétricos tales como ensayo con ácido bicincónico (Smith, P. K. et al., Anal. Biochem. 150, 76, 1985) o el ensayo de colorante de Bradford (Bradford, M. M., (1976) Anal. Biochem. 72: 248). La retención de actividad de unión a antígeno de los anticuerpos, después de los procedimientos de conjugación, se puede evaluar mediante un método de ELISA (Yu,
D. S. et al., J. Urol. 140, 415, 1988) y con métodos citofluorimétricos (Gallego, J. et al., Int. J. Cancer 33, 737, 1984). La sensibilidad del conjugado a ácidos se puede evaluar mediante métodos cromatográficos después de incubación de los compuestos en soluciones tamponadas adecuadas.
CARGA DE FÁRMACO
La carga de fármaco se representa con p, el número medio de moléculas de conjugado de anticuerpo-fármaco que se describen en el presente documento, de fármacos derivados de antraciclina por anticuerpo. La carga de fármaco puede variar de 1 a 8 fármacos (D) por anticuerpo (Ab), es decir cuando 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 y 8 restos de fármaco se unen covalentemente al anticuerpo. Las composiciones de ADC de Fórmula Ic incluyen colecciones de anticuerpos conjugados con un intervalo de fármacos, de 1 a 8. El número medio de fármacos por anticuerpo en las preparaciones de ADC a partir de reacciones de conjugación se puede caracterizar por medios convencionales tales como espectroscopía de masas, ensayo de ELISA, electroforesis, y HPLC. También se puede determinar la distribución cuantitativa de ADC en términos de p. Mediante ELISA se puede determinar el valor medio de p en una preparación de ADC en particular (Hamblett et al. (2004) Clin. Cancer Res. 10: 7063-7070; Sanderson et al. (2005) Clin. Cancer Res. 11: 843-852). Sin embargo, la distribución de los valores de p (drug) no se puede discernir mediante la unión de anticuerpo-antígeno limitación de la detección de ELISA. Además, el ensayo de ELISA para detección de conjugados de anticuerpo-fármaco no determina cuándo se unen los restos de fármaco al anticuerpo, tal como los fragmentos de cadena pesada o de cadena ligera, o los restos de aminoácidos en particular. En algunos casos, se puede conseguir separación, purificación, y caracterización de ADC homogéneos cuando p es un determinado valor de de ADC con otras cargas de fármaco por medios tales como HPLC en fase inversa o electroforesis.
Para algunos conjugados de anticuerpo-fármaco, p puede estar limitado por el número de sitios de unión en el anticuerpo. Por ejemplo, un anticuerpo puede tener solamente uno o varios grupos tiol de cisteína, o puede tener solamente uno o varios grupos tiol suficientemente reactivos a través de los que se puede unir un conector. La carga de fármaco más elevada, por ejemplo p > 5, puede causar agregación, insolubilidad, toxicidad, o pérdida de permeabilidad celular de determinados conjugados de anticuerpo-fármaco.
Por lo general, menos del máximo teórico de restos de fármaco se conjugan con un anticuerpo durante una reacción de conjugación. Un anticuerpo puede contener, por ejemplo, muchos restos de lisina que no reaccionan con el compuesto intermedio de fármaco-conector o reactivo conector. Solamente los grupos lisina más reactivos pueden reaccionar con un reactivo conector de reactivo para amina. Además, solamente los grupos tiol de la cisteína más reactivos pueden reaccionar con un reactivo conector reactivo para tiol. Generalmente, los anticuerpos no contienen muchos, si los hubiera, grupos tiol de la cisteína libres y reactivos que se pueden unir a un resto de fármaco. La mayoría de los restos tiol de la cisteína en los anticuerpos de los compuestos existen como puentes disulfuro y se deben reducir con un agente reductor tal como ditiotreitol (DTT) o TCEP, en condiciones de reducción parcial o total. Además, el anticuerpo se debe someter a condiciones de desnaturalización para dejar al descubierto grupos nucleófilos reactivos tales como lisina o cisteína. La carga (relación de fármaco/anticuerpo) de un ADC se puede controlar de diferentes maneras, que incluyen: (i) limitar el exceso molar de compuesto intermedio de fármacoconector (D-L) o reactivo conector con respecto al anticuerpo, (ii) limitar el tiempo o la temperatura de la reacción de conjugación, y (iii) hacer parciales o limitar las condiciones de reducción para la modificación del tiol de la cisteína.
Los aminoácidos cisteína se pueden someter a ingeniería en los sitios reactivos en un anticuerpo y que no forman enlaces disulfuro intracatenarios o intermoleculares (Patente de Estados Unidos Nº 7521541). Los tioles de la cisteína sometidos a ingeniería pueden reaccionar con reactivos conectores o los reactivos de fármaco-conector de la presente invención que tienen grupos electrófilos, reactivos para tiol tales como maleimida o alfa-halo amidas para formar ADC con anticuerpos sometidos a ingeniería de cisteína y los restos de fármaco derivado de antraciclina. La posición del resto de fármaco se puede diseñar, controlar, y conocer de este modo. La carga de fármaco se puede controlar dado que los grupos tiol de la cisteína sometidos en ingeniería por lo general reaccionan con reactivos conectores reactivos para tiol o reactivos de fármaco-conector con un rendimiento elevado. La ingeniería de un anticuerpo de IgG para introducir un aminoácido cisteína por sustitución en un solo sitio en la cadena pesada o ligera proporcionados nuevas cisteínas en el anticuerpo simétrico. Se puede conseguir una carga de fármaco próxima a 2 y casi la homogeneidad del ADC producto de conjugación.
Cuando más de un grupo nucleófilo o electrófilo del anticuerpo reacciona con un compuesto intermedio de fármacoconector, o reactivo conector seguido de reactivo de resto de fármaco, entonces el producto resultante es una mezcla de compuestos de ADC con una distribución de restos de fármaco unidos a un anticuerpo, por ejemplo 1, 2, 3, etc. Los métodos de cromatografía liquidar tales como fase inversa polimérica (PLRP) e interacción hidrófoba (HIC) pueden separar compuestos en la mezcla mediante el valor de carga de fármaco. Se pueden aislar preparaciones de ADC con un solo valor de carga de fármaco (p), sin embargo, estos ADC de un solo valor de carga aún pueden ser mezclas heterogéneas porque los restos de fármaco se pueden unir, a través del conector, a diferentes sitios en el anticuerpo.
Por lo tanto, las composiciones de conjugado de anticuerpo-fármaco de la invención incluyen mezclas de compuestos de conjugado de anticuerpo-fármaco en las que el anticuerpo tiene uno o más restos de fármaco derivado de antraciclina y en las que los restos de fármaco pueden unir al anticuerpo a diversos restos de aminoácido.
PREPARACIÓN DE CONJUGADOS DE ANTICUERPO-FÁRMACO
El ADC de Fórmula I se puede preparar mediante varias rutas, usando reacciones, condiciones, y reactivos de química orgánica conocidos por los expertos en la materia, que incluyen: (1) de acción de un grupo nucleófilo o un grupo electrófilo de un anticuerpo con un reactivo conector bivalente, para formar un compuesto intermedio de anticuerpo-conector Ab-L, mediante un enlace covalente, seguido de reacción con un reactivo de resto de fármaco activado; y (2) reacción de un grupo nucleófilo o un grupo electrófilo de un reactivo de resto de fármaco con un reactivo de conector, para formar un reactivo de de fármaco-conector D-L, mediante un enlace covalente, seguido de reacción con el grupo nucleófilo o un grupo electrófilo de un anticuerpo. Los métodos de conjugación (1) y (2) se pueden usar con diversos anticuerpos, restos de fármaco, y conectores para preparar los conjugados de anticuerpofármaco de Fórmula I.
Los grupos nucleófilos en los anticuerpos incluyen, pero no se limitan a: (i) grupos amino N-terminales, (ii) grupos amino de cadena terminal, por ejemplo lisina, (iii) grupos tiol de cadena lateral, por ejemplo cisteína, y (iv) grupos de azúcar hidroxilo o amino en los que el anticuerpo está glicosilado. Los grupos amino, tiol, e hidroxilo son nucleófilos y capaces de reaccionar para formar enlaces covalentes con grupos electrófilos entre restos de conector o reactivos conectores que incluyen: (i) ésteres activos tales como ésteres de NHS, ésteres de HOBt, haloformiatos, y haluros de ácido; (ii) haluros de alquilo y bencilo tales como haloacetamidas; (iii) aldehídos, cetonas, carboxilo, y grupos maleimida. Determinados anticuerpos tienen disulfuros intercatenarios reducibles, es decir puentes de cisteína. Los anticuerpos se pueden hacer reactivos para conjugación con reactivos conectores por tratamiento con un agente reductor tal como DTT (reactivo de Cleland, ditiotreitol) o TCEP (clorhidrato de tris(2-carboxietil)fosfina; Getz et al. (1999) Anal. Biochem. Vol 273: 73-80; Soltec Ventures, Beverly, MA). Cada puente disulfuro de cisteína formará de este modo, teóricamente, dos nucleófilos de tiol reactivos. Se pueden introducir grupos nucleófilos adicionales en anticuerpos a través de la reacción de lisinas con 2-iminotiolano (reactivo de Traut) dando como resultado la conversión de una amina en un tiol.
Los conjugados de anticuerpo-fármaco también se pueden producir por modificación del anticuerpo para introducir restos electrófilos, que pueden reaccionar con sustituyentes nucleófilos en el reactivo o fármaco conector. Los azúcares de anticuerpos glicosilados se pueden oxidar, por ejemplo con reactivos oxidantes de peryodato, para formar grupos aldehído o cetona que pueden reaccionar con el grupo amino de los reactivos conectores o restos de fármaco. Los grupos de imina de la base de Schiff pueden formar un enlace estable, o se pueden reducir, por ejemplo mediante reactivos de borohidruro para formar enlaces de amina estables. En una realización, la reacción de la porción de hidratos de carbono de un anticuerpo glicosilado con galactosa oxidasa o meta-peryodato sódico puede proporcionar grupos carbonilo (aldehído y cetona) en la proteína que puede reaccionar con grupos apropiados en el fármaco (Hermanson, G.T. (1996) Bioconjugate Techniques; Academic Press: Nueva York, p 234-242). En otra realización, las proteínas que contienen restos de serina o treonina N-terminales pueden reaccionar con metaperyodato sódico, dando como resultado la producción de un aldehído en lugar del primer aminoácido (Geoghegan y Stroh, (1992) Bioconjugate Chem. 3: 138-146; Patente de Estados Unidos Nº 5362852). Tal aldehído puede reaccionar con un resto de fármaco o nucleófilo conector.
De forma análoga, los grupos nucleófilos en un resto de fármaco incluyen, pero no se limitan a: grupos amino, tiol, hidroxilo, hidrazida, oxima, hidrazina, tiosemicarbazona, carboxilato de hidrazina, y arilhidrazida capaces de reaccionar para formar enlaces covalentes con grupos electrófilos o restos de conector y reactivos de conector que incluyen: (i) ésteres activos tales como ésteres de NHS, ésteres de HOBt, haloformiatos, y haluros de ácido; (ii) haluros de alquilo y bencilo tales como haloacetamidas; (iii) aldehídos, cetonas, carboxilo, y grupos maleimida. Los grupos nucleófilos reactivos se pueden introducir en los compuestos derivados de antraciclina mediante interconversiones convencionales de grupo funcional. Por ejemplo, los grupos hidroxilo se pueden convertir en grupos tiol mediante reacciones de tipo Mitsunobu, para formar compuestos de fármaco modificados con tiol.
Los conjugados de anticuerpo-fármaco en la Tabla 2 se prepararon de acuerdo con los métodos que se describen en los Ejemplos y se sometió a ensayo la eficacia mediante ensayo de proliferación celular in vitro e inhibición del crecimiento de xenoinjerto de tumor in vivo.
Tabla 2 Conjugados de anticuerpo-fármaco
Nº
Fórmula de ADC Figuras conector-fármaco DAR *
101
Tr-MCC-DM1 12-20, 22, 24, 26, 28, 31 SMCC-DM1 3,4
102
tio-HC-Tr-maleimida-cetal-Ant 12-15, 22, 24, 26, 28, 30, 31 51 2,18
103
tio-HG-Tr-maleimida-hidrazona-Ant 12-15, 20, 22, 24,26, 28,30 52 2,4
104
tio-HC-Tr-tiopiridina-hidrazona-Ant 16-20, 22, 24, 26, 28 53 1,25
105
tio-HC-Tr-NHS-cetal-Ant 16-20, 22, 24, 26, 28 50 1,6
106
tio-HC-Tr-MC-vc-PAB-MMAE 20,22, 24, 26, 28 MC-vc-PAB-MMAE 1,9
107
tio-HC-anti-CD22-maleimida-cetal-Ant 21,23, 25, 27, 29, 30, 31, 32 51 2,57
108
tio-HC-anti-CD22-maleimida hidrazona-Ant 21, 23, 25, 27, 39, 30 52 2,43
109
tio-HC-anti-CD22-tiopiridina-hidrazona-Ant 21, 23, 25, 27, 29, 53 1,43
110
anti-CD33-NHS-cetal-Ant 16-19, 21,23, 25, 27, 29, 50 2,13
111
tio-HC-anti-CD22-MC-vc-PAB-MMAE 30 MC-vc-PAB-MMAE 1,94
112
tio-HC-anti-steapl-MC-vc-PAB-MMAE 32 MC-vc-PAB-MMAE 2
113
tio-HC-anti-steapl-maleimida-cetal-Ant 32 51 1,65
* DAR = relación media de fármaco/anticuerpo
IDENTIFICACIÓN SISTEMÁTICA DE CONJUGADOS DE ANTICUERPO-FÁRMACO (ADC) DIRIGIDOS FRENTE A ANTÍGENOS Y RECEPTORES DE SUPERFICIE CELULAR ASOCIADOS A TUMOR
Los métodos de ensayo para detectar células cancerosas comprenden exponer las células a un compuesto de conjugado de anticuerpo-fármaco, y determinar el alcance de la unión del compuesto de conjugado de anticuerpofármaco a las células. Los compuestos de ADC de Fórmula I que se identifican en los modelos animales ensayos basados en células se pueden someter a ensayo adicionalmente en ensayos clínicos en primates superiores y seres humanos portadores de tumor.
Los animales transgénicos y las líneas celulares son particularmente útiles para identificar sistemáticamente conjugados de anticuerpo-fármaco (ADC) que tengan potencial como tratamientos profilácticos o terapéuticos de enfermedades o trastornos que implican la sobreexpresión de antígenos y receptores de superficie celular asociados a tumor, por ejemplo HER2 (Patente de Estados Unidos Nº 6632979). La identificación sistemática de un ADC útil puede implicar la administración del ADC candidato durante una serie de dosis al animal transgénico, y someter a ensayo el efecto por los efectos del ADC en diversos puntos temporales en la enfermedad o trastorno que se está evaluando. Como alternativa, o adicionalmente, el fármaco se puede administrar antes o simultáneamente con
exposición a un inductor de la enfermedad, si fuera aplicable. El ADC candidato se puede identificar sistemáticamente en serie e individualmente, o en paralelo en medio o en formato de identificación sistemática de alto rendimiento. La tasa a la que se puede identifica sistemáticamente la utilidad del ADC para tratamientos profilácticos o terapéuticos de enfermedades o trastornos solamente se limita por la tasa de metodología de síntesis
o identificación sistemática, que incluyen detección/medida/análisis de datos.
Una realización es un método de identificación sistemática que comprende (a) trasplantar células a partir de una línea celular de cáncer de mama estable en un animal no humano, (b) administrar un candidato a fármaco de ADC al animal no humano y (c) determinar la capacidad del candidato para inhibir la formación de tumores a partir de la línea celular trasplantada. La invención también se refiere un método para identificar sistemáticamente candidatos de ADC para el tratamiento de una enfermedad o trastorno caracterizado por la sobreexpresión de una proteína receptora que comprende (a) poner en contacto células a partir de una línea celular de cáncer de mama estable con un candidato a fármaco y (b) evaluar la capacidad del candidato de ADC para inhibir el crecimiento de la línea celular estable.
Una realización es un método de identificación sistemática que comprende (a) poner en contacto células a partir de una línea celular de cáncer de mama estable con un candidato a fármaco de ADC y (b) evaluar la capacidad del candidato de ADC para inducir la muerte celular, inducir la apoptosis, bloquear la unión de herregulina, bloquear la fosforilación de tirosina estimulada por ligando, o bloquear la activación de ligando de HER2. En otra realización se evalúa la capacidad del candidato de ADC. En otra realización se evalúa la capacidad del candidato de ADC.
Otra realización es un método de identificación sistemática que comprende (a) administrar un candidato a fármaco de ADC a un mamífero no humano transgénico que sobreexpresa, por ejemplo en sus células de glándula mamaria, una proteína humana nativa, por ejemplo HER2 o un fragmento de la misma, en la que al mamífero transgénico ha integrado de forma estable en su genoma una secuencia de ácidos nucleicos que codifica la proteína humana nativa
o fragmentos de la misma que tiene la actividad biológica de la proteína humana nativa, única de forma operativa las secuencias de regulación de la transcripción que dirigen su expresión, y desarrolla un tumor. El ADC candidato se identifica sistemáticamente al ser administrado al animal transgénico durante una serie de dosis, y se evalúa la respuesta fisiológica de la animada los compuestos en el tiempo. La administración puede ser oral, o mediante inyección adecuada, dependiendo de la naturaleza química del compuesto que se está evaluando. En algunos casos, puede ser apropiado administrar el compuesto en conjunto con cofactores que aumentarían la eficacia del compuesto. Si las líneas celulares derivadas de los animales transgénicos objetivo se usan para identificar sistemáticamente compuestos útiles en el tratamiento de diversos trastornos asociados con la sobreexpresión de determinadas proteínas de antígeno o receptores de la superficie celular asociados a tumor, por ejemplo sobreexpresión de HER2. Para identificar los compuestos de ADC que inhiben el crecimiento que se dirigen específicamente a HER2, se puede identificar sistemáticamente el ADC que inhibe el crecimiento de las células cancerosas que sobreexpresan HER2 derivadas de animales transgénicos (Patente de Estados Unidos Nº 5677171).
ENSAYO DE PROLIFERACIÓN CELULAR IN VITRO
Generalmente, la actividad citotóxica o citostática de un conjugado de anticuerpo-fármaco (ADC) se mide mediante: exposición al anticuerpo del ADC de células de mamífero que tienen antígenos o proteínas receptoras asociados a tumor en un medio de cultivo celular; cultivar las células durante un periodo de aproximadamente 6 horas a aproximadamente 5 días; y medir la viabilidad celular. Se pueden usar ensayos in vitro basados en células para medir la viabilidad, es decir proliferación (CI50), citotoxicidad (CE50), e inducción de apoptosis (activación de caspasas) del ADC. El Ensayo de Viabilidad Celular Luminiscente CellTiter-Glo® es un método de ensayo homogéneo disponible en el mercado (Promega Corp., Madison, WI), basado en la expresión recombinante de luciferasa de Coleópteros (Patente de Estados Unidos Nº 5583024; Patente de Estados Unidos Nº 5674713; Patente de Estados Unidos Nº 5700670). Este ensayo de proliferación celular determina el número de células viables en cultivo basándose en la cuantificación del ATP presente, un indicador de células metabólicamente activas (Crouch et al. (1993) J. Immunol. Meth. 160: 81-88; Patente de Estados Unidos Nº 6602677). El Ensayo CellTiter-Glo® se realiza en formato de 96 pocillos, lo que lo hace susceptible a la identificación sistemática de alto rendimiento automatizada (HTS) (Cree et al. (1995) AntiCancer Drugs 6: 398-404). El procedimiento de ensayo homogéneo implica la adición del reactivo individual (CellTiter-Glo®Reagent) directamente a las células cultivadas en medio complementado con suero. No son necesarios lavado celular, retirada del medio y etapas múltiples de pipeteo. El sistema detecta una cantidad tan pequeña como 15 células/pocillo en un formato de 384 pocillos a los 10 minutos después de la adición del reactivo y mezcla.
La evaluación de la retención de citotoxicidad de los conjugados en comparación con el fármaco precursor se puede evaluar mediante un ensayo basado en la cuantificación del ATP. Se sembraron células de cáncer de ovario humano A2780 y de mama humana MCF7 (1250 células/pocillo) en placas de 384 pocillos de fondo blanco en medio completo (RPMI1640 o EMEM más suero bovino Fetal al 10 %) y se trataron con compuestos disueltos en DMSO al 0,1 %, 24 h después de la siembra. Las células se incubaron a 37 ºC y CO2 al 5 % y después de 72 horas las placas se procesaron usando el ensayo CellTiter-Glo (Promega) siguiendo las instrucciones del fabricante.
CellTiter-Glo es un método homogéneo basado en la cuantificación del ATP presente, un indicador de células metabólicamente activas. El ATP se cuantifica usando un sistema basado en luciferasa y D-luciferina dando como resultado generación de luz. La señal luminiscente es proporcional al número de células presentes en cultivo. En resumen, se añadieron 25 µl/pocillo de soluciones de reactivo a cada pocillo y después de 5 minutos las microplacas en agitación se leyeron con un luminómetro. La señal luminiscente es proporcional al número de células presentes en cultivo.
Los efectos antiproliferativos de los conjugados de anticuerpo-fármaco de Fórmula Ic (Tabla 6) se midieron con el Ensayo CellTiter-Glo® (Ejemplo 9) frente a las líneas celulares de tumor que expresan HER2 en las Figuras 8-29 en estudios de exposición continua de 3 días.
La Figura 8 muestra una representación de la viabilidad celular in vitro de SK-BR-3 a los 3 días frente a concentraciones de: exposición continua de PNU-159682 libre de fármaco, incubación de 1 h de PNU-159682, fármaco conector: NHS-cetal-Ant 50, fármaco conector: maleimida-cetal-Ant 51, fármaco conector: maleimidahidrazona-Ant 52, y fármaco conector: tiopiridina-hidrazona-Ant 53. El nivel de expresión de HER2 de las células SKBR-3 es 3+. La proliferación de células SK-BR-3 estaba inhibida de forma más potente mediante la exposición continua a PNU-159682. En resumen, una exposición (1 h) también inhibía de forma eficaz el crecimiento de las células SK-BR-3. Ant 52 y 53 unidos a hidrazona eran menos potentes que Ant libre, mientras que los compuestos intermedios de fármaco conector Ant 50 y 51 unidos a cetal mostraban una actividad antiproliferativa mínima.
La Figura 9 muestra una representación de la viabilidad celular in vitro de BT-474 a los 3 días frente a concentraciones de: fármaco libre: exposición continua a PNU-159682, fármaco libre: incubación de 1 h de PNU159682, fármaco conector: NHS-cetal-Ant 50, fármaco conector: maleimida-cetal-Ant 51, fármaco conector: maleimida-hidrazona-Ant 52, y fármaco conector: tiopiridina-hidrazona-Ant 53. El nivel de expresión de HER2 de las células BT-474 es 3+. La proliferación de las células BT-474 estaba inhibida de forma más potente mediante la exposición continua a PNU-159682. En resumen, una exposición (1 h) también inhibía de forma eficaz el crecimiento de las células BT-474. Ant 52 y 53 unidos a hidrazona mostraban una actividad antiproliferativa mínima, mientras que Ant 50 y 51 unidos a cetal eran inactivos.
La Figura 10 muestra una representación de la viabilidad celular in vitro de MCF7 a los 3 días frente a concentraciones de: fármaco libre: exposición continua a PNU-159682; fármaco libre: incubación de 1 h de PNU159682, fármaco conector: NHS-cetal-Ant 50, fármaco conector: maleimida-cetal-Ant 51, fármaco conector: maleimida-hidrazona-Ant 52, y fármaco conector: tiopiridina-hidrazona-Ant 53. La proliferación de células MCF7 estaba inhibida de forma más potente mediante la exposición continua a PNU-159682. En resumen, una exposición (1 h) también inhibía de forma eficaz el crecimiento de las células MCF7. Ant 52 y 53 unidos a hidrazona mostraban una actividad antiproliferativa mínima, mientras que Ant 50 y 51 unidos a cetal eran inactivos.
La Figura 11 muestra una representación de la viabilidad celular in vitro de células Her2 resistentes a doxorrubicina (DoxRes) a los 3 días frente a concentraciones de: fármaco libre: exposición continua a PNU-159682, fármaco libre: incubación de 1 h de PNU-159682, fármaco conector: NHS-cetal-Ant 50, fármaco conector: maleimida-cetal-Ant 51, fármaco conector: maleimida-hidrazona-Ant 52, y fármaco conector: tiopiridina-hidrazona-Ant 53. El nivel de expresión de HER2 de las células HER2 DoxRes es 3+, con PgP/MDR1 elevado. La proliferación de células DoxRes/HER2 estaba inhibida de forma más potente mediante la exposición continua a PNU-159682. En resumen, una exposición (1 h) también inhibía de forma eficaz el crecimiento de las células AdrRes/HER2. Ant 52 y 53 unidos a hidrazona eran menos potentes que Ant libre, mientras que Ant 50 y 51 unidos a cetal mostraban una actividad antiproliferativa mínima. La línea de células Her2 DoxRes también se conoce como "AdrRes Her2".
La Figura 12 muestra una representación de la viabilidad celular in vitro de SK-BR-3 a los 3 días frente a concentraciones de: trastuzumab, trastuzumab-MCC-DM1 101, tio-trastuzumab (HC A114C)-maleimida cetal-Ant 102, y tio-trastuzumab (HC A114C)-maleimida hidrazona-Ant 103. Tio-Tr-HC-maleimida-hidrazona-Ant 103 mostraban la actividad antiproliferativa más potente en las células SK-BR-3. Tio-Tr-HC-maleimida-cetal-Ant 102 y Tr-MCC-DM1 101 eran igualmente potentes en términos de CI50, pero el tratamiento de las células SK-BR-3 con 102 dio como resultado una destrucción celular mayor que con 101. Todos los conjugados sometidos a ensayo eran más potentes que trastuzumab.
La Figura 13 muestra una representación de la viabilidad celular in vitro de BT-474 a los 3 días frente a concentraciones de: trastuzumab, trastuzumab-MCC-DM1 101, tio-trastuzumab (HC A114C)-maleimida cetal-Ant 102, and tio-trastuzumab (HC A114C)-maleimida hidrazona-Ant 103. Tio-Tr-HC-maleimida hidrazona-Ant 103 mostró una actividad antiproliferativa más potente en las células BT-474. Tio-Tr-HC-maleimida-cetal-Ant 102 y Tr-MCC-DM1 101 eran igualmente potentes en la inhibición del crecimiento de las células BT-474. Todos los conjugados sometidos a ensayo eran más potentes que trastuzumab.
La Figura 14 muestra una representación de la viabilidad celular in vitro de MCF-7a los 3 días frente a concentraciones de: trastuzumab, trastuzumab-MCC-DM1 101, tio-trastuzumab (HC A114C)-maleimida cetal-Ant 102, y tio-trastuzumab (HC A114C)-maleimida hidrazona-Ant 103. El nivel de expresión de HER2 de las células MCF7 es normal. Tio-Tr-HC-maleimida-hidrazona-Ant 103 mostró una actividad antiproliferativa potente en la línea
de células MCF7 normales que expresan Her2. Trastuzumab, Tr-MCC-DM1 101 y tio-Tr-HC-maleimida-cetal-Ant 102 no eran activos en las células MCF7.
La Figura 15 muestra una representación de la viabilidad celular in vitro de células Her2 resistentes a doxorrubicina (DoxRes) a los 3 días frente a concentraciones de: trastuzumab, trastuzumab-MCC-DM1 101, tio-trastuzumab (HC A114C)-maleimida cetal-Ant 102, y tio-trastuzumab (HC A114C)-maleimida hidrazona-Ant 103. Tio-Tr-HC-maleimidahidrazona-Ant 103 mostró una actividad antiproliferativa potente en las células DoxRes/HER2, que expresan niveles elevados tanto de HER2 como del transportador de resistencia a múltiples fármacos MDR1/PgP. Tio-Tr-HCmaleimida-cetal-Ant 103 era activo solamente en las dos concentraciones más elevadas sometidas a ensayo (3,3 y 10 ug/ml) mientras que Tr-MCC-DM1 101 y trastuzumab mostraban una actividad mínima en esta línea celular.
La Figura 16 muestra una representación de la viabilidad celular in vitro de SK-BR-3 a los 3 días frente a concentraciones de: anti-CD22 NHS cetal-Ant 110, trastuzumab, trastuzumab-MCC-DM1 101, y tio-trastuzumab (HC A114C)-NHS-cetal-Ant 105. Tio-Tr-HC-NHS-cetal-Ant 105 y Tr-MCC-DM1 101 mostraban una potencia equivalente en la proliferación de células SK-BR-3 en términos de CI50; con 105 el tratamiento dio como resultado mayor destrucción celular. El anti-CD22-NHS-cetal-Ant 110 de control no dirigido también mostró una actividad antiproliferativa potente en las células SK-BR-3 cells. Todos los conjugados sometidos a ensayo eran más potentes que trastuzumab.
La Figura 17 muestra una representación de la viabilidad celular in vitro de BT-474 a los 3 días frente a concentraciones de: anti-CD22 NHS cetal-Ant 110, trastuzumab, trastuzumab-MCC-DM1 101, y tio-trastuzumab (HC A114C)-NHS-cetal-Ant 105. Tio-Tr-HC-NHS cetal-Ant 105 mostraban la actividad antiproliferativa más potente en las células BT-474. El tratamiento con Tr-MCC-DM1 también dio como resultado una inhibición del crecimiento de las células BT-474. El anti-CD22-NHS-cetal-Ant 110 de control no dirigido mostró efectos antiproliferativos potentes en las células BT-474. Todos los conjugados sometidos a ensayo eran más potentes que trastuzumab.
La Figura 18 muestra una representación de la viabilidad celular in vitro de MCF-7a los 3 días frente a concentraciones de: anti-CD22 NHS cetal-Ant 110, trastuzumab, trastuzumab-MCC-DM1 101, y tio-trastuzumab (HC A114C)-NHS-cetal-Ant 105. Tio-Tr-HC-NHS-cetal-Ant 105 y anti-CD22-NHS-cetal-Ant 110 mostraban una actividad equivalente en las células MCF7 que expresan HER2. Trastuzumab y Tr-MCC-DM1 101 no eran activos en MCF7.
La Figura 19 muestra una representación de la viabilidad celular in vitro de células Her2 resistentes a doxorrubicina (DoxRes) a los 3 días frente a concentraciones de: anti-CD22 NHS cetal-Ant 110, trastuzumab, trastuzumab-MCC-DM1 101, y tio-trastuzumab (HC A114C)-NHS-cetal-Ant 105. Tio-Tr-HC-NHS-cetal-Ant 105 y anti-CD22-NHS-cetal-Ant 110 mostraban una actividad equivalente en las células DoxRes/HER2. Tr-MCC-DM1 101 mostró una actividad modesta, y trastuzumab no presentaba efecto en DoxRes/HER2.
La Figura 20 muestra una representación de la viabilidad celular in vitro de SK-BR-3 a los 3 días frente a concentraciones de: tio-trastuzumab (HC A114C)-maleimida cetal-Ant 102, tio-trastuzumab (HC A114C)-maleimida hidrazona-Ant 103, tio-trastuzumab (HC A114C)-tiopiridina hidrazona-Ant 104, tio-trastuzumab (HC A114C)-NHScetal-Ant 105, trastuzumab-MCC-DM1 101, y tio-trastuzumab (HC A114C)-MC-vc-PAB-MMAE 106.
La Figura 21 muestra una representación de la viabilidad celular in vitro de SK-BR-3 a los 3 días frente a concentraciones de: trastuzumab, tio-anti-CD22 (HC A114C)-maleimida cetal-Ant 107, tio-anti-CD22 (HC A114C)maleimida hidrazona-Ant 108, tio-anti-CD22 (HC A114C)-tiopiridina hidrazona-Ant 109, anti-CD22-NHS-cetal-Ant 110, y fármaco libre de PNU-159682. tal como se informado anteriormente, el trastuzumab inhibe modestamente el crecimiento de las células SK-BR-3 a través de un mecanismo citostático. Los ADC de control no dirigidos tio-antiCD22-HC-cetal-Ant 107 y anti-CD22-NHS-cetal-Ant 110 mostraban actividad antiproliferativa solamente a las dosis más elevadas sometidas a ensayo. Los ADC de control no dirigidos tio-anti-CD22-HC-maleimida hidrazona-Ant 108 y tio-anti-CD22-H-tiopiridina-hidrazona-Ant 109 mostraban una potencia equivalente para la inhibición del crecimiento de células SK-BR-3 como los ADC dirigidos por HER2 (Figura 20), lo que indica la debilidad de los ADC unidos a hidrazona. El fármaco libre PNU-159682, administrado en concentraciones de µM, provocaba citotoxicidad en todas las dosis sometidas a ensayo.
La Figura 22 muestra una representación de la viabilidad celular in vitro de BT-474 a los 3 días frente a concentraciones de: tio-trastuzumab (HC A114C)-maleimida cetal-Ant 102, tio-trastuzumab (HC A114C)-maleimida hidrazona-Ant 103, tio-trastuzumab (HC A114C)-tiopiridina hidrazona-Ant 104, tio-trastuzumab (HC A114C)-NHScetal-Ant 105, trastuzumab-MCC-DM1 101, y tio-trastuzumab (HC A114C)-MC-vc-PAB-MMAE 106. Todos los ADC sometidos a ensayos mostraban una actividad similar en la proliferación de las células BT-474. Tio-Tr-HC-vc-MMAE 106 presentaba la CI50 menor (0,01 µg/ml), aunque el tratamiento con tio-Tr-HC-maleimida-hidrazona-Ant 103 y tioTr-HC-tiopiridina-hidrazona-Ant 104 dio como resultado la cantidad más elevada de inhibición del crecimiento total.
La Figura 23 muestra una representación de la viabilidad celular in vitro de BT-474 a los 3 días frente a concentraciones de: trastuzumab, tio-anti-CD22 (HC A114C)-maleimida cetal-Ant 107, tio-anti-CD22 (HC A114C)maleimida hidrazona-Ant 108, tio-anti-CD22 (HC A114C)-tiopiridina hidrazona-Ant 109, anti-CD22-NHS-cetal-Ant 110, y fármaco libre de PNU-159682. tal como se hay indicado anteriormente, trastuzumab inhibe modestamente el
crecimiento de las células BT-474 a través de un mecanismo citostático. Los ADC de control no dirigidos tio-antiCD22-HC-cetal-Ant 107 y anti-CD22-NHS-cetal-Ant 110 no presentaban efecto antiproliferativo en las células BT
474. Los ADC de control no dirigidos tio-anti-CD22-HC-maleimida hidrazona-Ant 108 y tio-anti-CD22-H-tiopiridinahidrazona-Ant 109 mostraban una potencia equivalente para la inhibición del crecimiento de células BT-474 como los ADC dirigidos por HER2 (Figura 22), lo que indica la debilidad de los ADC unidos a hidrazona. El fármaco libre PNU159682, administrado en concentraciones de µM, provocaba citotoxicidad en todas las dosis sometidas a ensayo.
La Figura 24 muestra una representación de la viabilidad celular in vitro de MCF-7a los 3 días frente a concentraciones de: tio-trastuzumab (HC A114C)-maleimida cetal-Ant 102, tio-trastuzumab (HC A114C)-maleimida hidrazona-Ant 103, tio-trastuzumab (HC A114C)-tiopiridina hidrazona-Ant 104, tio-trastuzumab (HC A114C)-NHScetal-Ant 105, trastuzumab-MCC-DM1 101, y tio-trastuzumab (HC A114C)-MC-vc-PAB-MMAE 106. Solamente tioTr-HC-maleimida-hidrazona-Ant 103 y tio-Tr-HC-tiopiridina-Ant 104 presentaban efectos antiproliferativos en las células MCF7 con poca expresión de HER2, lo que indica la debilidad de los ADC unidos a hidrazona. Todos los demás ADC sometidos a ensayo (tio-Tr-HC-vc-MMAE 106, Tr-MCC-DM1 101, tio-Tr-HC-maleimida-cetal-Ant 102 y tio-Tr-NHS-cetal-Ant 105) no presentaban efecto en el crecimiento de las células MCF7.
La Figura 25 muestra una representación de la viabilidad celular in vitro de MCF-7a los 3 días frente a concentraciones de: trastuzumab, tio-anti-CD22 (HC A114C)-maleimida cetal-Ant 107, tio-anti-CD22 (HC A114C)maleimida hidrazona-Ant 108, tio-anti-CD22 (HC A114C)-tiopiridina hidrazona-Ant 109, anti-CD22-NHS-cetal-Ant 110, y fármaco libre de PNU-159682. De forma coherente con los informes anteriores, trastuzumab era totalmente inactivo en células MCF7 con poca expresión de HER2. Los ADC de control no dirigidos tio-anti-CD22-HCmaleimida-cetal-Ant 107 y tio-anti-CD22-NHS-cetal-Ant 110 tampoco presentaban inhibición del crecimiento de las células MCF7, lo que indica falta de liberación de fármaco a partir de conectores de cetal estables. Los ADC de control no dirigidos unidos a hidrazona 108 y 109 presentaban efectos antiproliferativos en las células MCF7, lo que indica la liberación de fármaco a partir de los ADC unidos a hidrazona débiles. El fármaco libre PNU-159682 administrada en dosis de µM, provocaba citotoxicidad a todas las concentraciones sometidas a ensayo.
La Figura 26 muestra una representación de la viabilidad celular in vitro de células (DoxRes)/HER2 resistentes a doxorrubicina a los 3 días frente a concentraciones de: tio-trastuzumab (HC A114C)-maleimida cetal-Ant 102, tiotrastuzumab (HC A114C)-maleimida hidrazona-Ant 103, tio-trastuzumab (HC A114C)-tiopiridina hidrazona-Ant 104, tio-trastuzumab (HC A114C)-NHS-cetal-Ant 105, trastuzumab-MCC-DM1 101, y tio-trastuzumab (HC A114C)-MC-vc-PAB-MMAE 106. Aunque 106 no presentaba efecto y Tr-MCC-DM1 101 presentaba un efecto mínimo en el crecimiento de las células DoxRes/HER2, los ADC 102 y 105 unidos a cetal eran activos solamente a las concentraciones más elevadas sometidas a ensayo, mientras que los ADC 103 y 104 unidos a hidrazona inhibían de forma más potente el crecimiento de las células DoxRes/HER2.
La Figura 27 muestra una representación de la viabilidad celular in vitro de células (DoxRes)/HER2 resistentes a doxorrubicina a los 3 días frente a concentraciones de: trastuzumab, tio-anti-CD22 (HC A114C)-maleimida cetal-Ant 107, tio-anti-CD22 (HC A114C)-maleimida hidrazona-Ant 108, tio-anti-CD22 (HC A114C)-tiopiridina hidrazona-Ant 109, anti-CD22-NHS-cetal-Ant 110, y fármaco libre de PNU-159682. Trastuzumab solo no presentaba efecto en el crecimiento de las células DoxRes/HER2. Los ADC 107 y 110 de control no dirigidos unidos a cetal inhibían el crecimiento de las células DoxRes/HER2 solamente a las concentraciones más elevadas sometidas a ensayo, mientras que los ADC 108 y 109 de control no dirigidos unidos a hidrazona presentaban una actividad antiproliferativa potente en las células DoxRes/HER2. Las actividades de los cuatro ADC de control anti-CD22-Ant no dirigidos eran similares a las de ADC tio-Ant dirigido por HER2 (Figura 26). El fármaco libre PNU-159682, administrado en dosis de µM inhibía el crecimiento en todas las concentraciones sometidas a ensayo.
La Figura 28 muestra una representación de la viabilidad celular in vitro de células (DoxRes)/HER2 resistentes a doxorrubicina a los 3 días frente a concentraciones de: tio-trastuzumab (HC A114C)-maleimida cetal-Ant 102, tiotrastuzumab (HC A114C)-maleimida hidrazona-Ant 103, tio-trastuzumab (HC A114C)-tiopiridina hidrazona-Ant 104, tio-trastuzumab (HC A114C)-NHS-cetal-Ant 105, trastuzumab-MCC-DM1 101, y tio-trastuzumab (HC A114C)-MC-vc-PAB-MMAE 106, todos administrados en presencia de verapamilo (10 µg/m). El verapamilo inhibe el eflujo de diversos fármacos conocidos por ser sustratos del transportador de resistencia a múltiples fármacos MDR1/Pglucoproteína (PgP), que se expresa altamente en las células DoxRes/HER2. La adición de verapamilo hace a las células DoxRes/HER2 sensibles a los efectos citotóxicos de Tr-MCC-DM1 101, lo que indica que DM1 es un sustrato para MDR1/PgP. El verapamilo no presentaba ningún efecto en la respuesta a los otros ADC sometidos a ensayo (102-106), lo que indica que los efectos del fármaco de estos ADC no se inhiben con NDR1/PgP.
La Figura 29 muestra una representación de la viabilidad celular in vitro de células (DoxRes)/HER2 resistentes a doxorrubicina a los 3 días frente a concentraciones de: trastuzumab, tio-anti-CD22 (HC A114C)-maleimida cetal-Ant 107, tio-anti-CD22 (HC A114C)-maleimida hidrazona-Ant 108, tio-anti-CD22 (HC A114C)-tiopiridina hidrazona-Ant 109, anti-CD22-NHS-cetal-Ant 110, y fármaco libre de PNU-159682, todos administrados en presencia de verapamilo. Todos los ADC sometidos a ensayo (107-110) eran igualmente activos en presencia de verapamilo (comparar con la Figura 27), lo que indica que el fármaco Ant no es un sustrato de MDR1/PgP.
La Tabla 3 resumen los valores de CI50 (ug/ ml) para la inhibición de SK-BR-3, BT-474, MCF7, resistente a doxorrubicina (DoxRes), y resistente a doxorrubicina (DoxRes) con proliferación de células con verapamilo de los compuestos de ensayo de las Figuras 20-29. Comparando SK-BR-3 y BT-474 con MCF7, el ADC de maleimidacetal-Ant y NHS-cetal-Ant muestran destrucción dependiente de la diana mientras que el ADC de Ant unido a hidrazona presenta una destrucción no selectiva, independiente de la diana.
Los efectos antiproliferativos de los conjugados de anticuerpo-fármaco de Fórmula Ic (Tabla 6) se midieron mediante el Ensayo de CellTiter-Glo® (Ejemplo 9) frente a líneas celulares linfoma B, positivas para CD22: BJAB, GRANTA, DoHH2 y SuDHL4 en estudios de exposición continua de 3 días. Las células Jurkat (negativas para CD22) se trataron con los conjugados de anticuerpo-fármaco como un control negativo.
La Tabla 4 resume los valores de CI50 (ug/ml) para la inhibición de líneas celulares de BJAB, GRANTA, DoHH2 SuDHL4 y Jurkat mediante el ensayo de los compuestos de conjugado de anticuerpo-fármaco en estudios de exposición continua de 3 días. Los conjugados de anticuerpo-fármaco 107-110 anti-CD22 mostraban efectos de destrucción celular altamente potentes. Se observó una destrucción celular significativa con los conjugados de anticuerpo y fármaco anti-HER2 de control negativo 102-105. Se observó una destrucción celular significativa con los conjugados de anticuerpo-fármaco anti-CD22 107-110 en las células de Jurkat negativas para CD22.
Tabla 4 inhibición in vitro de líneas celulares de BJAB, GRANTA, DoHH2 SuDHL4 y Jurkat
ADC de ensayo
CI50 (ug/ ml) BJAB CI50 (ug/ml) GRANTA CI50 (ug/ml) DoHH2 CI50 (ug/ml) SuDHL4 CI50 (ug/ml) JURKAT
tio-trastuzumab (HC A114C)-maleimida cetal-Ant 102
0,9863 0,3318 0,2053 0,7990 2,2985
tio-trastuzumab (HC A114C)-maleimida hidrazona-Ant 103
< 1,28 x 10-6 < 1,28 x 10-6 < 1,28 x 10-6 < 1,28 x 10-6 2,09 x 10-5
tio-trastuzumab (HC A114C)-tiopiridina hidrazona-Ant 104
> 10 > 10 > 10 > 10 > 10
tio-trastuzumab (HC A114C)-NHScetal-Ant 105
0,01197 0,00265 0,00189 0,00966 0,0281
tio-anti-CD22 (HC A114C)-maleimida cetal-Ant 107
0,000312 < 1,28 x 10-6 < 1,28 x 10-6 < 1,28 x 10-6 0,001446
tio-anti-CD22 (HC A114C)-maleimida hidrazona-Ant 108
< 1,28 x 10-6 < 1,28 x 10-6 < 1,28x x 10-6 < 1,28 x 10-6 4,60 x 10-5
tio-anti-CD22 (HC A114C)-tiopiridina hidrazona-Ant 109
9,83 x 10-5 < 1,28 x 10-6 < 1,28 x 10-6 0,000105 0,000412
anti-CD22-NHS-cetal-Ant 110
0,001217 0,000219 0,000125 0,001066 0,004702
ELIMINACIÓN DE SUERO IN VIVO Y ESTABILIDAD EN RATONES
La eliminación de suero y estabilidad de ADC se pedía investigar en ratones atímicos, sin tratamiento previo (sin tumores recibidos por injertos) de acuerdo con los procedimientos del Ejemplo 10. Una diferencia en la cantidad de anticuerpo total y ADC indica la escisión del conector y la separación del anticuerpo de su resto de fármaco.
La estabilidad de los conjugados se estudió usando análisis de HPLC. El conjugado se incubó en tampones de acetato amónico a pH 4 y 5,2 a 37 ºC. Cada solución se tomó a continuación periódicamente y se aplicó a una columna de HPLC usando un método indicado anteriormente. La cantidad de material liberado del conjugado se determinó y se expresó como porcentaje del material liberado.
EFICACIA IN VIVO
El efecto terapéutico de los compuestos de conjugado de anticuerpo-fármaco (ADC) y la mejora de su eficacia terapéutica en comparación con el fármaco precursor, se evaluaron en modelos animales de tumores trasplantados humanos. Los ratones que llevan xenoinjertos de tumores humanos se trataron con dosis adecuadas de conjugados de anticuerpo-fármaco, de fármaco libre de PNU-159682, y de anticuerpo desnudo, a determinadas dosis, y el crecimiento del tumor se registra y se comparó en los diferentes grupos de tratamiento. Las Figuras 30-32 muestran la eficacia de los conjugados de anticuerpo-fármaco de Fórmula Ic mediante la inhibición del tumor del xenoinjerto en ratones.
La eficacia de los conjugados de anticuerpo-fármaco de la invención se puede medir in vivo implantando aloinjertos
o xenoinjertos de células cancerosas o tumores primarios en roedores y tratando los tumores t con ADC de acuerdo con los procedimientos del Ejemplo 12. Se van a esperar resultados variables dependiendo de la línea celular, la especificidad de la unión a anticuerpo de los ADC a receptores presentes en las células cancerosas, régimen de dosificación, y otros factores. Por ejemplo, la eficacia in vivo de ADC anti-HER2 se puede medir mediante un modelo
de ratón de explante transgénico de HER2 de expresión elevada. Se puede propagar un aloinjerto a partir del ratón transgénico Fo5 mmtv que no responde a, o que responde escasamente a, la terapia con HERCEPTIN®. Los sujetos se tratan una vez con ADC y se controlan durante 3-6 semanas para medir el tiempo de duplicación del tumor, log de destrucción celular, y contracción del tumor. Se pueden realizar adicionalmente experimentos de seguimiento de dosis-respuesta y múltiples dosis.
La Figura 30 muestra una representación del cambio del volumen tumoral medio in vivo en el tiempo en tumores de xenoinjerto de Bjab-luc de linfoma de Burkitt inoculados en ratones CB17 SCID después de una sola dosificación el día 0 con: (1) Vehículo, (2) 1 mg/kg de tio-anti-CD22 (HC A114C)-MC-vc-PAB-MMAE 111, (3) 1 mg/kg de tiotrastuzumab (HC A114C)-maleimida cetal-Ant 102, (4) 5 mg/kg de tio-trastuzumab (HC A114C)-maleimida cetal-Ant 102, (5) 1 mg/kg de tio-anti-CD22 (HC A114C)-maleimida cetal-Ant 107, (6) 5 mg/kg de tio-anti-CD22 (HC A114C)maleimida cetal-Ant 107, (7) 1 mg/kg de tio-trastuzumab (HC A114C)-maleimida hidrazona-Ant 103, (8) 1 mg/kg de tio-anti-CD22 (HC A114C)-maleimida hidrazona-Ant 108, (9) 8,77 ug/kg de fármaco libre de PNU-159682. Todos los conjugados anti-CD22 (107, 108 y 111) presentaban una inhibición del crecimiento tumoral específica de diana y la actividad inhibidora del ADC anti-CD22 unido a cetal 107 era dependiente de la dosis. El fármaco libre PNU-159682 y los ADC de control no dirigidos (102 y 103) a la dosis equivalente no presentaban ningún efecto en el crecimiento del tumor.
La Tabla 5 muestra el nivel de exposición al fármaco, carga media de fármaco, incidencia del tumor, y respuestas para cada grupo tratado con compuesto de ensayo de la Figura 30 en el estudio de eficacia de tumor por xenoinjerto de Bjab-luc in vivo de 48 días. Los tumores Bjab-luc (linfoma de Burkitt negativo para EBV, luciferasa que expresa células Bjab) expresa la proteína del receptor CD22 (Polson et al. (2009) Cancer Res. 69 (6): 2358-2364; documento de patente US 2008/0050310; documento de patente US 2005/0276812). CD22 se expresa solamente en el compartimento de los linfocitos B y en la superficie de la mayoría de las células NHL (D’Arena et al. (2000) Am J Hematol. 64: 275-81; Olejniczak et al. (2006) Immunol Invest. 35: 93-114). La eficacia en la inhibición del tumor por xenoinjerto de Bjab-luc en ratones como un sistema modelo puede predecir la respuesta clínica en los pacientes en tratamiento con neoplasias hematopoyéticas tales como linfoma no Hodgkins. Todos los ADC anti-CD22 (107, 108, 111) eran eficaces en la inhibición del tumor en comparación con Vehículo y ADC de control (102 y 103) que no se unían a las células Bjab-luc. La ausencia de actividad con ADC de control indica que la actividad observada con el ADC dirigido es específica, por ejemplo, no se debe a la liberación sistémica de fármaco libre. En varios casos, los tumores no solamente se inhibieron, sino que también revertieron parcial y completamente con los conjugados anti-CD22 (107, 108, 111). Estos datos indican que el antígeno de superficie anti-CD22 es una diana potencialmente eficaz para el ADC derivado de antraciclina de la invención.
Tabla 5 estudio de eficacia de tumor por xenoinjerto de Bjab-luc in vivo (Figura 30) 10
Dosis del compuesto de ensayo
exposición al fármaco ug/m2 Carga Media de fármaco TI -incidencia del tumor PR -regresión parcial del tumor CR -regresión completa del tumor
(1) Vehículo
- - 9/9 0 0
(2) tio-anti-CD22 (HC A114C)-MC-vc-PAB-MMAE 111 1 mg/kg
28,66 1,94 8/8 1 1
(3) de tio-trastuzumab (HC A114C)-maleimida cetal-Ant 102 1 mg/kg
26,65 2 9/9 0 0
(4) tio-trastuztunab (HC A 114C)-maleimida cetal-Ant 102 5 mg/kg
133,25 2 9/9 0 0
(5) thio-anti-CD22 (HC A114C)-maleimida cetal-Ant 107 1 mg/kg
26,42 2 9/9 0 0
(6) tio-anti-CD22 (HC A114C)-maleimida cetal-Ant 107 5 mg/kg
132,08 2 9/9 3 0
(7) tio-trastuzumab (HC A114C)-maleimida hidrazona-Ant 103 1 mg/kg
22,65 1,7 9/9 0 0
(8) tio-anti-CD22 (HC A114C)-maleimida hidrazona-Ant 108 1 mg/kg
22,45 1,7 9/9 1 1
(9) 8,77 ug/kg de fármaco libre de PNU-159682
26,42 - 9/9 0 0
La Figura 31 muestra una representación del cambio del volumen tumoral medio in vivo en el tiempo en tumores por aloinjerto de mama MMTV-HER2 Fo5 inoculados en ratones CRL nu/nu después de una sola dosificación el día 0 con: (1) Vehículo, (2) 5 mg/kg de trastuzumab-MCC-DM1 101, (3) 10 mg/kg de trastuzumab-MCC-DM1 101, (4) 5 mg/kg de tio-trastuzumab (HC A114C)-maleimida cetal-Ant 102, (5) 10 mg/kg de tio-trastuzumab (HC A114C)maleimida cetal-Ant 102, (6) 5 mg/kg de tio-anti-CD22 (HC A114C)-maleimida cetal-Ant 107, (7) 10 mg/kg de tio-anti-CD22 (HC A114C)-maleimida cetal-Ant 107, (8) 5 mg/kg de trastuzumab-MCC-DM1 101 + 5 mg/kg de tiotrastuzumab (HC A114C)-maleimida cetal-Ant 102. Todos los conjugados anti-Her2 (101 y 102) presentaban una inhibición del crecimiento tumoral específica de diana y la actividad inhibidora era dependiente de la dosis. Ningún ADC de control dirigido 107 a dosis equivalentes presentaba efecto alguno en el crecimiento del tumor.
La Tabla 6 muestra la inhibición del crecimiento del tumor en el día 7, nivel de exposición al fármaco, carga media de fármaco, incidencia y respuestas del tumor para cada grupo tratado con compuesto de ensayo de la Figura 31 en el estudio de eficacia in vivo de 38 días de tumor por aloinjerto de mama con MMTV-HER2 Fo5 (Phillips et al. (2008) Cancer Res. 68 (22): 9280-9290; documento de patente US 2005/0276812). El tumor por aloinjerto de de mama con MMTV-HER2 Fo5 es una línea celular de cáncer de mama que sobreexpresa HER2, insensible al trastuzumab. Los ADC anti-HER2 dirigidos (101, 102, y la combinación de 101 y 102) eran eficaces en la inhibición del tumor en comparación con los de ADC Vehículo y control (107) que no se unían a las células MMTV-HER2 Fo5. La ausencia de actividad con el ADC de control indica que la actividad observada con el ADC dirigido es específica, por ejemplo, no se debe a la liberación sistémica de fármaco libre. Los tumores no solamente se inhibieron, sino que también revertieron parcial y completamente con los conjugados anti-HER2 (101, 102, y la combinación de 101 y 102). La combinación de trastuzumab-MCC-DM1 101 y tio-trastuzumab (HC A114C)-maleimida-cetal-Ant 102 no mostró una respuesta adicional más allá de la del agente 102 individual. Estos datos indican que el antígeno de superficie anti-HER2 es una diana potencialmente eficaz para el ADC derivado de antraciclina de la invención.
Tabla 6 estudio de eficacia de tumor por aloinjerto de MMTV-HER2 Fo5 de mama in vivo (Figura 31)
Dosis del compuesto de ensayo
% Inhibición el día 7 exposición del fármaco ug/m2 carga media de fármaco TI -incidencia del tumor PR regresión parcial del tumor CR regresión completa del tumor
(1) Vehículo
- - - 8/8 0 0
(2) trastuzumab-MCC-DM1 101 5 mg/kg
72 290 3,5 6/6 0 0
(3) trastuzumab-MCC-DM1 101 10 mg/kg
86 580 3,5 6/6 0 0
(4) tio-trastuzumab (HC A114C) maleimida cetal-Ant 102 5 mg/kg
87 110 1,5 6/7 3 2
(5) tio-trastuzumab (HC A114C)-maleimida cetal-Ant 102 10 mg/kg
91 215 1,5 5/7 3 4
(6) tio-anti-CD22 (HC A114C)-maleimida cetal-Ant 107 5 mg/kg
18 125 1,75 8/8 0 0
(7) tio-anti-CD22 (HC A114C)-maleimida cetal-Ant 107 10 mg/kg
5 250 1,75 8/8 0 0
(8) combinación: 5 /mg/kg de
88 290 + 110 3,5 + 6/7 2 2
trastuzumab-MCC-DM1, 101 y tiotrastuzumab (HC A114C)maleimida cetal-Ant 102, 5 mg/kg
1,5
La Figura 32 muestra una representación del cambio del volumen tumoral medio in vivo en el tiempo en tumores por xenoinjerto de LnCap-Ner inoculados en ratones SCID-beige macho después de una sola dosificación el día 0 con:
(1) Vehículo, (2) 1 mg/kg de tio-anti-steapl (HC A114C)-MC-vc-PAB-MMAE 112, (3) 3 mg/kg de tio-anti-steapl (HC A114C)-MC-vc-PAB-MMAE 112, (4) 1 mg/kg de tio-anti-steapl (HC A114C)-maleimida cetal-Ant 113, (5) 3 mg/kg de tio-anti-steapl (HC A114C)-maleimida cetal-Ant 113, (6) 6 mg/kg de tio-anti-steapl (HC A114C)-maleimida cetal-Ant 113, (7) 1 mg/kg de tio-anti-CD22 (HC A114C)-maleimida cetal-Ant 107, (8) 3 mg/kg de tio-anti-CD22 (HC A114C)maleimida cetal-Ant 107, (9) 6 mg/kg de tio-anti-CD22 (HC A114C)-maleimida cetal-Ant 107. Todos los conjugados
anti-steapl (112 y 113) presentaban una inhibición del crecimiento tumoral específica de diana y la actividad inhibidora del ADC anti-steapl unido a cetal 113 era dependiente de la dosis. El ADC de control no dirigido 107 a dosis equivalentes no presentará efecto alguno en el crecimiento del tumor.
5 La Tabla 7 muestra el nivel de exposición al fármaco, carga media del fármaco, incidencia y respuestas del tumor para cada grupo tratado con compuesto de ensayo de la Figura 32 en el estudio in vivo de 41 días de eficacia de tumor por xenoinjerto de LnCap-Ner. Steapl (antígeno epitelial de seis dominios transmembrana de la próstata) es un antígeno de superficie celular específico de la próstata altamente expresado en tumores de próstata humana (Hubert et al. (1999) PNAS 96 (25): 14523-14528). La línea celular LnCap expresa steapl altamente. El estudio de inhibición
10 de tumor por xenoinjerto de LnCap-Ner (Jin et al. (2004) Cancer Res. 64: 5489-5495) en ratones puede ser un indicador eficaz para el tratamiento de cáncer de próstata cancer en pacientes. El ADC anti-steapl dirigido (1.12 y 1.13) eran eficaces en la inhibición del tumor en comparación con el ADC de Vehículo y control (107) que no se unía a las células LnCap. La ausencia de actividad con el ADC de control indica que la actividad conservada con el ADC dirigido es específica, por ejemplo, no se debe a la liberación sistémica del fármaco libre. Los tumores no solamente
15 se inhibieron, sino que también revertieron parcialmente con los conjugados anti-HER2 (11.2 y 113): Estos datos indican que el antígeno de superficie anti-steapl es una diana potencialmente eficaz para el ADC derivado de antraciclina de la invención.
Tabla 7 estudio de eficacia de tumor de xenoinjerto de LnCap-Ner in vivo (Figura 32)
Dosis del compuesto de ensayo
exposición al fármaco ug/m2 carga media de fármaco TI incidencia del tumor PR -regresión parcial del tumor CR -regresión completa del tumor
(1) Vehículo
- - 8/8 0 0
(2) tio-anti-steapl (HC A114C)-MC-vc-PAB-MMAE 112 1 mg/kg
30,95 2 8/8 1 0
(3) tio-anti-steapl (HC A114C)-MC-vc-PAB-MMAE 112 3 mg/kg
92,85 2 8/8 1 0
(4) tio-anti-steapl (HC A114C)-maleimida cetal-Ant 113 1 /mg/kg
22,83 1,65 8/8 0 0
(5) tio-anti-steapl (HC A114C)-maleimida cetal-Ant 113 3 mg/kg
68,49 1,65 8/8 1 0
(6) tio-anti-steapl (HC A114C)-maleimida cetal-Ant 113 6 mg/kg
137 1,65 7/7 5 0
(7) tio-anti-CD22 (HC A114C)-maleimida cetal-Ant 107 1 mg/kg
24,21 1,75 6/6 0 0
(8) tio-anti-CD22 (HC A114C)-maleimida cetal-Ant 107 3 mg/kg
72,64 1,75 7/7 1 0
(9) tio-anti-CD22 (HC A114C)-maleimida cetal-Ant 107 6 mg/kg
145 1,75 7/7 0 0
20 TOXICIDAD EN ROEDORES
Los conjugados de anticuerpo-fármaco y un ADC-menos control, "Vehículo", se pueden evaluar en un modelo de rata de toxicidad aguda (Brown et al. (2002) Cancer Chemother. Pharmacol 50: 333-340) y de acuerdo con el Ejemplo 11. La toxicidad de ADC se investiga por tratamiento de ratas Sprague-Dawley hembra con el ADC y
25 posterior inspección y análisis de los efectos en diversos órganos. Basándose en observaciones totales (pesos corporales), parámetros patológicos clínicos (química de suero y hematología) e histopatología se puede observar caracterizar, y medir la citotoxicidad de ADC.
Se puede realizar un estudio de toxicidad aguda de múltiples días en ratas hembra adolescentes mediante una o
30 más dosis de un ADC candidato, un ADC de control, compuesto de derivado de antraciclina libre (PNU-159682) y un Vehículo de control (día 0). El peso corporal se mide periódicamente. La química clínica, enzimas en suero y análisis de hematología también se realizan periódicamente; concluyendo con necropsia completa con evaluación histopatológica. Las señales de toxicidad incluían la observación clínica de la pérdida de peso, considerando que
esa pérdida de peso, o cambio del peso con respecto a los animales dosificados solamente con Vehículo en animales después de la dosificación con ADC, es un indicador total y general indicador de toxicidad sistémica o localizada. La hepatoxicidad se puede medir mediante: (i) enzimas hepáticas elevadas tales como AST (aspartato aminotransferasa), ALT (alanina aminotransferasa), GGT (g-glutamil transferasa); (ii) aumento de índices de figuras mitóticas y apoptóticas; y (iii) necrosis de nepatocitos. Se observaron toxicidad hematolinfoide por supresión de leucocitos, granulocitos principalmente (neutrófilos), y/o plaquetas, e implicación de órganos linfoides, es decir atrofia
o actividad apoptótica. También se observa toxicidad en lesiones del tracto gastrointestinal tales como aumento de índices de figuras mitóticas y apoptóticas y enterocolitis degenerativa.
ADMINISTRACIÓN DE FORMULACIONES FARMACÉUTICAS DE CONJUGADO DE ANTICUERPO-FÁRMACO
Los conjugados de anticuerpo-fármaco (ADC) terapéuticos se pueden administrar mediante una vía apropiada para la afección a tratar. El ADC se administrará por lo general por vía parenteral, es decir infusión, subcutánea, intramuscular, intravenosa, intradérmicas, intratecal, bolo, inspección intratumoral o epidural (Shire et al. (2004) J. Pharm. Sciences 93 (6): 1390-1402). Las formulaciones farmacéuticas de conjugados de anticuerpo-fármaco (ADC) terapéuticos se preparan por lo general para la administración parenteral con un vehículo parenteral farmacéuticamente aceptable y en una forma inyectable de dosificación unitaria. Un conjugado de anticuerpofármaco (ADC) que tiene el grado de pureza deseado se mezcla opcionalmente con diluyentes, vehículos, excipientes o estabilizantes farmacéuticamente aceptables, en forma de una formulación liofilizada o una solución acuosa (Remington’s Pharmaceutical Sciences (1980) 16ª edición, Osol, A. Ed.).
El ADC se puede formular en forma de composiciones farmacéuticas con un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable. Se puede usar cualquier vehículo o diluyente apropiado. Los vehículos y diluyentes adecuados incluyen solución salina fisiológica y soluciones de dextrosa de Ringer.
Los vehículos parenterales, diluyentes, vehículos, excipientes, y estabilizantes aceptables son no tóxicos para los receptores en las dosificaciones y concentraciones usadas, e incluyen: (i) tampones tales como fosfato, citrato, fosfato cálcico dibásico, estearato de magnesio, y otros ácidos orgánicos; (ii) antioxidantes que incluyen ácido ascórbico y metionina; (iii) conservantes (tales como cloruro de octadecildimetilbencilamonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio; fenol, butilo o alcohol bencílico; (iv) alquil parabenos tales como metilo o propil parabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; y m-cresol); (v) polipéptidos de bajo peso molecular (inferior a aproximadamente 10 restos); proteínas, tales como albúmina de suero, gelatina, o inmunoglobulinas; (vi) polímeros hidrófilos tales como polivinilpirrolidona; (vii) aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina, o lisina; (viii) monosacáridos, disacáridos, y otros hidratos de carbono que incluyen glucosa, lactosa, sacarosa, manitol, trehalosa, glicolato sódico de almidón, sorbitol manosa, carboximetilcelulosa, o dextrinas; (ix) agentes quelantes tales como EDTA; (x) contraiones formadores de sales tales como sodio; complejos metálicos (por ejemplo, complejos de Zn-proteína); (xi) tensioactivos no iónicos tales como TWEEN™, PLURONICS™ o polietilenglicol (PEG); (xii) agentes de deslizamiento o de granulación tales como estearato de magnesio, carboximetilcelulosa, talco, sílice, y aceite vegetal hidrogenados; (xiii) disgregantes tales como crosprovidona, glicolato sódico de almidón o almidón de maíz; (xiv) agentes espesantes tales como gelatina y polietilenglicol; (xv) revestimientos entéricos tales como citrato de trietilo; y/o (xvi) modificadores del sabor o la textura, agentes antiespumantes, pigmentos, y de seca antes. Por ejemplo, en el documento de patente WO 97/04801 se describen formulaciones liofilizadas de anticuerpo anti-ErbB2. una formulación a modo de ejemplo de un ADC contiene aproximadamente 100 mg/ml de trehalosa (2-(hidroximetil)-6-[3,4,5-trihidroxi-6(hidroximetil)tetrahidropiran-2-il]oxi-tetrahidropiran-3,4,5-triol; C12H22O11; Número de CAS 99-20-7) y TWEEN™ 20 aproximadamente al 0,1 % (polisorbato 20; éster de 2-[2-[3,4-bis(2-hidroxietoxi)tetrahidrofurano-2-il]-2-(2hidroxietoxi)etoxi]etilo del ácido dodecanoico; C26H50O10; Número de CAS 9005-64-5) a aproximadamente pH 6.
Las formulaciones farmacéuticas de un conjugado de anticuerpo-fármaco (ADC) terapéutico pueden contener determinadas cantidades de resto de fármaco sin reaccionar (D), compuesto intermedio de anticuerpo-conector (Ab-L), y/o compuesto intermedio de fármaco-conector (D-L), como consecuencia de la purificación y separación incompleta de exceso de reactivos, impurezas, y productos secundarios, en el proceso para preparar el ADC; o tiempo/temperatura de hidrólisis o degradación después del almacenamiento del ADC en volumen o composición formulada de ADC. Por ejemplo, una formulación de ADC puede contener una cantidad detectable de fármaco libre. Como alternativa, o además, puede contener una cantidad detectable de compuesto intermedio de fármacoconector. Como alternativa, o además, puede contener una cantidad detectable del anticuerpo. Los principios activos farmacéuticos también pueden estar atrapados en microcápsulas preparadas, por ejemplo, mediante técnicas de coacervación o mediante polimerización interfacial, por ejemplo, microcápsulas de hidroximetilcelulosa o gelatina y microcápsulas de poli-(metilmetacrilato), respectivamente, en sistemas coloidales de administración del fármaco (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas) o en macroemulsiones. Tales técnicas se desvelan en Remington’s Pharmaceutical Sciences 16ª edición, Osol, A. Ed. (1980).
Se pueden preparar preparaciones de liberación sostenida. Los ejemplos adecuados de preparaciones de liberación sostenida matrices semipermeables de polímeros hidrófobos sólidos que contienen el ADC, cuyas matrices están en forma de artículos conformados, por ejemplo películas, o microcápsulas. Los ejemplos de matrices de liberación
sostenida incluyen poliésteres, hidrogeles (por ejemplo, poli(2-hidroxietil-metacrilato), o poli(alcohol vinílico)), polilactidas (Patente de Estados Unidos Nº 3773919), copolímeros de ácido L-glutámico y gamma-etil-L-glutamato, acetato de etileno-vinilo no degradable, copolímeros de ácido láctico-ácido glicólico degradables tales como el LUPRON DEPOT™ (microesferas inyectables formadas por copolímero de ácido láctico-ácido glicólico y acetato de leuprolida), y ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico.
Las formulaciones se pueden presentar de forma conveniente en forma de dosificación unitaria y se pueden preparar mediante cualquiera de los métodos bien conocidos en la técnica farmacéutica. Generalmente se encuentran técnicas y formulaciones en Remington’s Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Co., Easton, PA). Tales métodos incluyen la etapa de poner en asociación el principio activo con el vehículo que constituye uno o más ingredientes auxiliares. En general las formulaciones se preparan en condiciones estériles y poniendo la asociación uniforme e íntimamente el ADC con vehículos líquidos o vehículos sólidos finamente divididos o ambos, y a continuación, si fuera necesario, se da forma al producto.
Las suspensiones acuosas contienen los materiales activos (ADC) en mezcla con excipientes adecuados para la preparación de suspensiones acuosas. Tales excipientes incluyen un agente de suspensión, tal como carboximetilcelulosa sódica, croscarmelosa, povidona, metilcelulosa, hidroxipropil metilcelulosa, alginato sódico, polivinilpirrolidona, goma de tragacanto y goma arábiga, y agentes de dispersión o de unificación tales como un fosfátido de origen natural (por ejemplo, lecitina), un producto de condensación de un óxido de alquileno con un ácido graso (por ejemplo, estearato de polioxietileno), un producto de condensación de óxido de etileno con un alcohol alifático de cadena larga (por ejemplo, heptadecaetilenoxicetanol), un producto de condensación de óxido de etileno con un éster parcial derivados del ácido graso y un anhídrido de hexitol (por ejemplo, monooleato de polioxietilen sorbitán). La suspensión acuosa también puede contener uno o más conservantes tales como p-hidroxibenzoato de etilo o n-propilo, uno o más agentes colorantes, uno o más agentes saborizantes y uno o más agentes edulcorantes, tales como sacarosa o sacarina.
Las composiciones farmacéuticas de ADC pueden estar en forma de una preparación inyectable estéril, tal como una suspensión acuosa u oleaginosa inyectable estéril. Esta suspensión se puede formular de acuerdo con la técnica conocida usando los agentes de dispersión o humectación y agentes de suspensión adecuados que se han mencionado anteriormente. La preparación inyectable estéril también puede ser una solución o suspensión inyectable estéril en un diluyente o disolvente parenteralmente aceptable no tóxico, tal como una solución en 1,3butano-diol o se puede preparar como un polvo liofilizado. Entre los vehículos y disolventes aceptables que se pueden usar se encuentran el agua, solución de Ringer y solución isotónica de cloruro sódico. Además, de forma convencional se pueden usar aceites fijos estériles como un medio de disolvente o de suspensión. Para este fin se puede usar cualquier aceite fijo volátil que incluye mono-o diglicéridos sintéticos. Además, en la preparación de inyectables se pueden usar del mismo modo ácidos grasos tales como ácido oleico.
La cantidad de principio activo que se puede combinar con el material vehículo para producir una forma de dosificación individual variará dependiendo de huésped tratado y del modo de administración en particular. Por ejemplo, una solución acuosa destinada a infusión intravenosa puede contener de aproximadamente 3 a 500 µg del principio activo por mililitro de solución para que se pueda producir esa infusión de un volumen adecuado a una tasa de aproximadamente 30 ml/h. Se puede realizar administración subcutánea (bolo) con un volumen total de aproximadamente 1,5 ml o inferior y una concentración de aproximadamente 100 mg de ADC por ml. Para el ADC que requiere administración frecuente y crónica, se puede usar la vía subcutánea, tal como mediante aguja rellena previamente o tecnología de dispositivo autoinyector.
Como una propuesta general, la cantidad farmacéuticamente eficaz inicial de ADC administrado por dosis estará en el intervalo de aproximadamente 0,01-100 mg/kg, es decir de aproximadamente 0,1 a 20 mg/kg de peso corporal del paciente al día, con el intervalo inicial habitual del compuesto usado siendo de 0,3 a 15 mg/kg/día. Por ejemplo, los pacientes humanos se pueden dosificar inicialmente con aproximadamente 1,5 mg de ADC por kg de peso corporal del paciente. La dosis se puede incrementar hasta la dosis máxima tolerada (MTD). El programa de dosificación puede ser aproximadamente cada 3 semanas, pero de acuerdo con la afección o respuesta diagnosticada, el programa puede ser más o menos frecuente. La dosis se puede ajustar adicionalmente durante el curso del tratamiento para que sea igual o inferior a la MTD que se puede administrar de forma segura durante múltiples ciclos, tal como aproximadamente 4 o superior.
Las formulaciones adecuadas para administración parenteral incluyen soluciones para inyección estéril acuosas y no acuosas que pueden contener antioxidantes, tampones, agentes bacteriostáticos insolutos que convierten a la formulación en isotónica con la sangre del receptor pretendido; y suspensiones estériles acuosas y no acuosas que pueden incluir agentes de suspensión y agentes espesantes.
Aunque la administración oral de agentes terapéuticos proteícos por lo general se ve desfavorecida debido a la escasa biodisponibilidad debido a la absorción limitada, hidrólisis o desnaturalización en el intestino, se pueden preparar formulaciones de ADC adecuadas para administración oral en forma de unidades discretas tales como cápsulas, obleas o comprimidos que contiene cada uno una cantidad predeterminada del ADC.
Las formulaciones se pueden envasar en envases de dosis individual o de múltiples dosis, por ejemplo ampollas y viales cerrados herméticamente, y se pueden almacenar en una condición secada por congelación (liofilizada) que requiere solamente la adición del vehículo líquido estéril, por ejemplo agua, a la inyección inmediatamente antes de su uso. Se preparan soluciones y suspensiones de inyección extemporáneas a partir de polvos estériles, gránulos y comprimidos del tipo que sea descrito anteriormente. Las formulaciones de osificación individual a modo de ejemplo contienen una dosis diaria o sub dosis diaria individual, o una fracción apropiada de la misma, del principio activo.
MÉTODOS DE TRATAMIENTO DE CONJUGADOS DE ANTICUERPO-FÁRMACO
Los conjugados de anticuerpo-fármaco de la invención son útiles como agentes antitumorales. Un mamífero, por ejemplo un ser humano o animal, se puede tratar por lo tanto con un método que comprende administrar al mismo una cantidad farmacéuticamente eficaz de un conjugado de fórmula Ic tal como se ha definido anteriormente en el presente documento. La afección del ser humano o animal se puede recuperar o mejorar de esta manera.
El ADC de Fórmula Ic se puede usar para tratar diversas enfermedades o trastornos en un paciente, tal como cáncer y afecciones autoinmunes que incluyen las que se caracterizan por la sobre expresión de un antígeno asociado a tumor. Las afecciones o trastornos a modo de ejemplo incluyen tumores benignos o malignos; leucemia y neoplasias linfoides; otros trastornos tales como trastornos neuronales, gliales, astrocitales, hpotalámicos, glandulares, macrófagos, epiteliales, estromales, blastocoélicos, inflamatorios, angiogénicos e inmunológicos. Los tipos de cáncer susceptibles al tratamiento con ADC incluyen los que se caracterizan por la sobreexpresión de determinados antígenos o receptores de superficie celular asociados a tumor, por ejemplo HER2.
Un método es para el tratamiento del cáncer en un mamífero, en el que el cáncer se caracteriza por la sobreexpresión de un receptor ErbB. El mamífero opcionalmente no responde, o responde escasamente, al tratamiento con un anticuerpo anti-ErbB sin conjugar. El método comprende la administración al mamífero de una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto de conjugado de anticuerpo-fármaco. El crecimiento de células tumorales que sobreexpresan un receptor del factor del crecimiento tal como el receptor de HER2 por el receptor de EGF se puede inhibir mediante la administración a un paciente de un ADC de Fórmula Ic que se une específicamente a dicho receptor del factor de crecimiento y un agente quimioterapéutico en la que cada uno de dicho conjugado de anticuerpo-fármaco y dicho agente quimioterapéutico se administran en cantidades eficaces para inhibir el crecimiento de células tumorales en el paciente.
Un paciente humano susceptible a o diagnosticado con un trastorno caracterizado por la sobreexpresión de receptor de ErbB2, se puede tratar mediante la administración de una combinación de un ADC de Fórmula Ic y un agente quimioterapéutico. Tal activación excesiva se puede atribuir a la sobreexpresión o aumento de la producción del receptor ErbB o un ligando de ErbB. Se puede realizar un ensayo de diagnóstico de pronóstico para determinar si el cáncer del paciente se caracteriza por activación excesiva de un receptor ErbB. Por ejemplo, se puede determinar la amplificación y/o expresión del gen ErbB de un receptor ErbB en el cáncer. En la técnica están disponibles diversos ensayos para determinar tal amplificación/sobreexpresión e incluyen ensayos de IHC, FISH y separación de antígenos.
Los ejemplos de cáncer a tratar en el presente documento incluyen, pero no se limitan a, carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma, y leucemia o neoplasias linfoides. Los ejemplos más particulares de tales cánceres incluyen cáncer de células escamosas (por ejemplo, cáncer de células escamosas epiteliales), cáncer de pulmón que incluye cáncer de pulmón de células pequeñas; cáncer de pulmón de células no pequeñas, adenocarcinoma del pulmón y carcinoma escamoso del pulmón, cáncer del peritoneo, cáncer hepatocelular, cancer gástrico o de estómago que incluye cáncer gastrointestinal, tumor del estroma gastrointestinal (GIST), cáncer pancreático, glioblastoma, cáncer de cuello uterino, cáncer de ovario, cáncer de hígado, cáncer de vejiga, hepatoma, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer rectal, cáncer colorrectal , carcinoma de endometrio o uterino, carcinoma de glándula salival, cáncer de riñón o renal, cáncer de próstata, cáncer de vulva, cáncer de tiroides, carcinoma hepático, carcinoma anal, carcinoma de pene, así como cáncer de cabeza y cuello.
Para la prevención o tratamiento de enfermedades, la dosificación apropiada de un ADC dependerá del tipo de enfermedad a tratar, tal como se ha definido anteriormente, la gravedad y curso de la enfermedad, si la molécula se administra para fines preventivos o terapéuticos, terapia previa, la historia clínica del paciente y respuesta al anticuerpo, y el criterio del médico que prescribe. La formulación de ADC se administra adecuadamente al paciente de una vez o durante una serie de tratamientos. Dependiendo del tipo y la gravedad de la enfermedad, una dosificación candidata inicial de ADC es de aproximadamente 1 µg/kg a 15 mg/kg (por ejemplo, 0,1-20 mg/kg) para administración al paciente, bien, por ejemplo, mediante una o más administraciones separadas, o mediante infusión continua. Un régimen habitual de dosificación podría variar de aproximadamente 1 µg/kg a 100 mg/kg o superior, dependiendo de los factores mencionados anteriormente. Una dosificación de ADC a modo de ejemplo a administrar a un paciente está en el intervalo de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 10 mg/kg de peso del paciente. Para administraciones repetidas durante varios días o periodos superiores, dependiendo de la afección, el tratamiento se mantiene hasta que se produzca una supresión deseada de los síntomas de la enfermedad. Un régimen de dosificación a modo de ejemplo comprende la administración de una dosis de carga inicial de aproximadamente 4 mg/kg, seguido de una dosis de mantenimiento semanal de aproximadamente 2 mg/kg del ADC. Pueden ser útiles
otros regímenes de dosificación.
TERAPIA DE COMBINACIÓN
Un conjugado de anticuerpo-fármaco (ADC) se puede combinar en una formulación de combinación farmacéutica, o régimen de dosificación como terapia de combinación, con un segundo compuesto que tiene propiedades anticáncer. El segundo compuesto de la formulación de combinación farmacéutica o régimen de dosificación tiene preferentemente actividades complementarias a las del ADC de la combinación de modo que no se ven afectadas de forma adversa entre sí.
El segundo compuesto puede ser un agente quimioterapéutico, agente citotóxico, citoquina, agente inhibidor del crecimiento, agente antihormonal, inhibidor de aromatasa, inhibidor de proteína quinasa, inhibidor de quinasa lípida, antiandrógeno, oligonucleótido antisentido, ribozima, vacuna de terapia genética, agente antiangiogénico y/o cardioprotector. Tales moléculas están presentes de forma adecuada en combinación en cantidades que son eficaces para el fin pretendido. Una composición farmacéutica que contiene un ADC también puede tener una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente quimioterapéutico tal como un inhibidor de la formación de tubulina, un inhibidor de la topoisomerasa, o un aglutinante de ADN.
Como alternativa, o adicionalmente, el segundo compuesto puede ser un anticuerpo que une o bloquea la activación de ligandos de antígeno o receptor asociado a tumor. El segundo anticuerpo se puede conjugar con un agentes citotóxico o quimioterapéutico, por ejemplo, un depsipéptido macrocíclico, una auristatina, una calicheamicina, o un resto de 1,8 bis-naftalimida. Por ejemplo, puede ser deseable proporcionar adicionalmente anticuerpos que se unan a EGFR, ErbB2, ErbB3, ErbB4, o factor del endotelio vascular (VEGF) en la formulación o régimen de dosificación.
La terapia de combinación se puede administrar en forma de un régimen simultáneo o secuencial. Cuando se administran secuencialmente, la combinación se puede administrar en dos o más administraciones. La administración combinada incluye coadministración, usando formulaciones separadas o una sola formulación farmacéutica, y administración consecutiva en cualquier orden, en la que existe un periodo de tiempo mientras ambos (o todos) los principios activos ejercen de forma simultánea sus actividades biológicas.
En una realización, el tratamiento con un ADC de la presente invención implica un agente anticáncer identificado en el presente documento para la administración combinada con uno o más agentes quimioterapéuticos o agentes inhibidores de crecimiento. Se pueden usar preparación y programaciones de dosificación para tales agentes quimioterapéuticos de acuerdo con las instrucciones del fabricante o tal como las determina de forma empírica el experto en la materia. También se describen preparación y programaciones de dosificación para tal quimioterapia en Chemotherapy Service Ed., M.C. Perry, Williams & Wilkins, Baltimore, Md. (1992).
El ADC se puede combinar con un compuesto antihormonal; por ejemplo, un compuesto antiestrógeno tal como tamoxifeno; una antiprogesterona tal como onapristona (documento de patente EP 616812); o un antiandrógeno tal como flutamida, en dosificaciones conocidas para tales moléculas. Cuando el cáncer a tratar es un cáncer independiente de hormonas, el paciente se puede haber sometido previamente a una terapia antihormonal y, después de que el cáncer se convierte en independiente de hormonas, el anticuerpo anti-ErbB2 (y opcionalmente otros agentes tal como se describe en el presente documento) se puede administrar al paciente. También puede ser beneficioso coadministrar un cardioprotector (para prevenir o reducir la disfunción del miocardio asociada con la terapia) o una o más citoquinas al paciente. Además de los regímenes terapéuticos anteriores, el paciente se puede someter la retirada quirúrgica de células cancerosas y/o terapia de radiación.
Las dosificaciones adecuadas para cualquiera de los agentes coadministrados anteriormente se usan en la actualidad y se pueden reducir debido a la acción combinada (sinergia) del agente recién identificado y otros agentes
o tratamientos quimioterapéuticos.
La terapia de combinación puede proporcionar "sinergia" y demostrar que es "sinérgico", es decir el efecto conseguido cuando los principios activos usados en conjunto es mayor que la suma de los efectos que resultan del uso de los compuestos por separado. Un efecto sinérgico se puede conseguir cuando los principios activos se: (1) coformulan y administran o liberan de forma simultánea en una formulación de dosificación unitaria, combinada; (2) administran mediante alternancia o en paralelo como formulaciones separadas; o (3) mediante algún otro régimen. Cuando se administran en terapia alternativa, un efecto sinérgico se puede conseguir cuando los compuestos se administran o liberan secuencialmente, por ejemplo mediante diferentes inyecciones en jeringas separadas. En general, durante la terapia alternativa, se administra una dosificación eficaz de cada principio activo secuencialmente, es decir en serie, mientras que en la terapia de combinación, las dosificaciones eficaces de dos o más príncipes activos se administran en conjunto.
ARTÍCULOS DE FABRICACIÓN
También se concibe un artículo de fabricación, o "kit", que contiene ADC y materiales útiles para el tratamiento de los trastornos que se han descrito anteriormente. El artículo de fabricación comprende un envase y una etiqueta o
prospecto en o asociado con el envase. Los envases adecuados incluyen, por ejemplo, frascos, viales, jeringas, o envase tipo blíster. Los envases se pueden formar a partir de diversos materiales tales como vidrio o plástico. El envase contiene una composición de conjugado de anticuerpo-fármaco (ADC) que es eficaz para tratar la afección y puede tener un puerto de acceso estéril (por ejemplo el envase puede ser una bolsa de solución intravenosa o un vial o un tapón perforar de con una aguja de inyección hipodérmica). Al menos un agente activo en la composición es un ADC. La etiqueta o el prospecto indican que la composición se usa para tratar la afección de elección, tal como cáncer.
El artículo de fabricación puede comprender adicionalmente un segundo (o tercer) envase que comprende un tampón farmacéuticamente aceptable, tal como agua bacteriostática para inyección (BWFI), solución salina tamponada con fosfato, solución de Ringer y solución de dextrosa, y un prospecto que indica que el primer y segundo compuestos se pueden usar para tratar el cáncer. Pueden incluir adicionalmente otros materiales deseables desde un punto de vista comercial y del usuario, que incluyen otros tampones, diluyentes, filtros, agujas, y jeringas.
Ejemplos
Los compuestos, tal como se preparan de acuerdo con los siguientes ejemplos, se caracterizaron mediante datos analíticos de HPLC/MS; los datos de HPLC/MS se recogieron siguiendo uno cualquiera de los métodos 1, 2.
Método Analítico 1 de HPLC/MS
Sistema de HPLC Alliance HT 2795 de Waters equipado con un detector de PDA 2996 de Waters y espectrómetro de masas de cuadrupolo simple mod. ZQ de Micromass, equipado con una fuente iónica de electronebulización (ESI). El instrumento de control, adquisición de datos y procesamiento de datos los proporcionó Empower y software
4.0 de MassLynx. Se realizó HPLC a 30 ºC a un caudal de 1,0 ml/min usando una columna C18, de 3 micrómetros de Phenomenex (4,6 x 50 mm). La fase móvil A era tampón de acetato amónico 5 mM a pH 5,2 con acetonitrilo (95:5), y la fase móvil B era H2O/acetonitrilo (5:95); el gradiente era de un 10 a un 90 % de B en 8 minutos y a continuación se eleva a B al 100 % en 1,0 minutos. El volumen de inyección era de 10 ul. El espectrómetro de masas funcionaba en modo de ión positivo e ión negativo, el voltaje capilar se estableció a 3,5 KV (ES+) y 28 V (ES-); la temperatura de la fuente era de 120 °C; el cono era 14 V (ES+) y 2,8 KV (ES-), exploración total, intervalo de masas de 100 a 1000 m/z.
Método Analítico 2 de HPLC/MS
El sistema de HPLC 2795 de Waters estaba equipado con un detector de PDA 996 de Waters y espectrómetro de masas de cuadrupolo simple mod. ZQ de Micromass, equipado con una fuente iónica de electronebulización (ESI). El instrumento de control, adquisición de datos y procesamiento de datos los proporcionó Empower y software 4.0 de MassLynx. Se realizó HPLC a 30 ºC a un caudal de 1 ml/min usando una columna RP18 X Terra (4,6 µM x 50 mm) de Waters. La fase móvil A era tampón de hidróxido de amonio al 0,05 % a pH = 10 con acetonitrilo (95:5), y la Fase móvil B era H2O/acetonitrilo (5:95); el gradiente era de un 10 a un 90 % de B en 8 minutos y a continuación se mantuvo B al 100 % durante 2 minutos. El volumen de inyección era 10 µl. El espectrómetro de masas funcionaba en modo de ión positivo e ión negativo, el voltaje capilar se estableció a 2,5 KV; la fuente de temperatura era de 120 ºC; el cono era 10 V; exploración total, intervalo de masas de 100 a 1000 m/z.
Ejemplo Comparativo 1 N-metil-2-[(1-{2-oxo-2-[(2S,4S)-2,5,12-trihidroxi-7-metoxi-4-{[(1S,3R,4aS,9S,9aR,10aS)-9metoxi-1-metiloctahidro-1H-pirano[4’,3’:4,5][1,3]oxazolo[2,3-c][1,4]oxazin-3-il]oxi}-6,11-dioxo-1,2,3,4,6,11hexahidrotetracen-2-il]etoxi}ciclohexil)oxi]acetamida (Compuesto 2)
Etapa 1 Síntesis del compuesto intermedio [(1-{2-oxo-2-[(2S,4S)-2,5,12-trihidroxi-7-metoxi-4{[(1S,3R,4aS,9S,9aR,10aS)-9-metoxi-1-metiloctahidro-1H-pirano[4’,3’:4,5][1,3]oxazolo[2,3-c][1,4]oxazin-3-il]oxi}-6,11dioxo-1,2,3,4,6,11-hexahidrotetracen-2-il]etoxi}ciclohexil)oxi]acetato de etilo 45
A una solución de (8S,10S)-6,8,11-trihidroxi-8-(hidroxiacetil)-1-metoxi-10-{[(1S,3R,4aS,9S,9aR,10aS)-9-metoxi-)metiloctahidro-1H-pirano[4’,3’:4,5][1,3]oxazolo[2,3-c][1,4]oxazin-3-il]oxi}-7,8,9,10-tetrahidrotetraceno-5,12-diona (50 5 mg, 0,078 mmol) [PNU-159682, compuesto IIA, preparado tal como se informa en el documento de patente WO 9802446] en 2 ml de dimetilformamida seca mantenida en argón, se añadieron Éster de etilo del ácido (ciclohex-1eniloxi)-acético (0,5 ml, [preparado tal como se informa en J. Org. Chem. (1978) 43: 1244-1245] y monohidrato del ácido p-toluenosulfónico (5 mg, 0,026 mmol). La mezcla de reacción se agitó durante una noche a temperatura ambiente, se añadió solución saturada de bicarbonato sódico (20 ml) y el producto se extrajo con diclorometano (2 x
10 20 ml). Las fases orgánicas combinadas se secaron sobre sulfato sódico anhidro, se filtró, el disolvente se retiró al vacío y el residuo se purificó parcialmente mediante cromatografía ultrarrápida (DCM/Me-OH 97,5:2,5) para dar 30 mg (37 %) del éster intermedio que se usó como tal en la etapa 2. MS (ESI): 826 [M+H]+. Tiempo de retención = 7,48 min. Método 2
15 Etapa 2 Síntesis del compuesto intermedio ácido [(1-{2-oxo-2-[(2S,4S)-2,5,12-trihidroxi-7-metoxi-4{[(1S,3R,4aS,9S,9aR,10aS)-9-metoxi-1-metiloctahidro-1H-pirano[4’,3’:4,5][1,3]oxazolo[2,3-c][1,4]oxazin-3-il]oxi}-6,11dioxo-1,2,3,4,6,11-hexahidrotetracen-2-il]etoxi}ciclohexil)oxi]acético 46
20 A 30 mg de 45,5 ml de en se añadió NaOH 01 N. La suspensión se enfrió a 5 ºC y se agitó en atmósfera de argón durante 3 horas. La solución acuosa se llevó a pH ~ 8 con solución acuosa de ácido acético al 10 % y se extrajo con diclorometano (2 x 10 ml). Las fases orgánicas combinadas se secaron sobre sulfato sódico anhidro, se filtró, el disolvente se retiró al vacío y el residuo se purificó por cromatografía ultrarrápida (DCM/MeOH: 90:10) para dar 5 mg
25 (y = 8 % en 2 etapas) del ácido intermedio 46 en forma de un sólido de color rojo. MS (ESI): 798 [M+H]+. Tiempo de retención = 3,94 min. Método 2
Etapa 3 Síntesis del compuesto intermedio 1-({[(1-{2-oxo-2-[(2S,4S)-2,5,12-trihidroxi-7-metoxi-4{[(1S,3R,4aS,9S,9aR,10aS)-9-metoxi-1-metiloctahidro-1H pirano[4’,3’:4,5][1,3]oxazolo[2,3-c][1,4]oxazin-3-il]oxi}-6,1130 dioxo-1,2,3,4,6,11-hexahidrotetracen-2-il]etoxi} ciclohexil)oxi]acetil} oxi)pirrolidina-2,5-diona 47
A una solución del ácido intermedio 46 (4 mg, 0,005 mmol) en Diclorometano seco (2 ml) mantenido a +5 ºC, se añadieron N-hidroxisuccinimida (2 mg, 0,017 mmol) y N,N’-diciclohexilcarbodiimida (2 mg, 0,01 mmol). La solución
5 se agitó a temperatura ambiente durante 6 h, el disolvente se evaporó al vacío y el residuo se trató con éter etílico (5 ml). La suspensión se agitó durante 30 minutos, el sólido se retiró por filtración y la solución orgánica se concentró al vacío. La purificación del producto en bruto por cromatografía ultrarrápida (DCM/Acetona a 80:20) proporciona 1,5 mg (y = 33 %) de 47 en forma de un sólido de color rojo: MS (ESI): 895 [M+H]+. Tiempo de retención = 3,22 min. Método 1.
10 Etapa 4 Síntesis del compuesto del título 2
15 A una solución de 47 obtenido a partir de la etapa 3 (1 mg, 0,001 mmol) en tetrahidrofurano seco (2 ml), se añadió metilamina 1 M en THF (3 µl, 0,003 mmol). La solución se agitó a temperatura ambiente 30 minutos, el disolvente se evaporó al vacío y el residuo se purificó por cromatografía ultrarrápida (diclorometano/metanol a 90:10) y proporciona 0,9 mg (y = 99 %) de 2 en forma de un sólido de color rojo. MS (ESI): 811 [M+H]+. Tiempo de retención = 6,10 min. Método 2. Tiempo de retención = 5,99 min. Método 1.
20 Mediante un procedimiento análogo y usando los materiales de partida adecuados, se prepararon los siguientes compuestos:
2-[((1-{2-oxo-2-[(2S,4S)-2,5,12-trihidroxi-7-metoxi-4-([(1S,3R,4aS,9S,9aR,10aS)-9-metoxi-1-metiloctahidro-1H
25 pirano[4’,3’:4,5][1,3]oxazolo[2,3-c][1,4]oxazin-3-il]oxi}-6,11-dioxo-1,2,3,4,6,11-hexahidrotetracen-2il]etoxi}ciclohexil)oxi]acetamida (Compuesto 1) MS (ESI): 887 [M+H]-. Tiempo de retención = 5,86 min. Método 2 N-bencil-2-[(1-{2-oxo-2-[(2S,4S)-2,5,12-trihidroxi-7-metoxi-4-{[(1S,3R,4aS,9S,9aR,10aS)-9-metoxi-1metiloctahidro-1H-pirano[4’,3’:4,5][1,3]oxazolo[2,3-c][1,4]oxazin-3-il]oxi}-6,11-dioxo-1,2,3,4,6,11hexahidrotetracen-2-il]etoxi}ciclohexil)oxi]acetamida (Compuesto 3) MS (ESI): 797 [M+H]-. Tiempo de retención =
30 7,16 min. Método 2 N2-(terc-butoxicarbonil)-N6-{[(1-{2-oxo-2-[(2S,4S)-2,5,12-trihidroxi-7-metoxi-4-{[(1S,3R,4aS,9S,9aR,10aS)-9metoxi-1-metiloctahidro-1H-pirano[4’,3’:4,5][1,3]oxazolo[2,3-c][1,4]oxazin-3-il]oxi}-6,11-dioxo-1,2,3,4,6,11hexahidrotetracen-2-il]etoxi}ciclohexil)oxi]acetil}-L-lisina (Compuesto 4) MS (ESI): 1026 [M+H]+. Tiempo de retención = 5,26 min. Método 1; Tiempo de retención = 4,64 min. Método 2
35 Ejemplo Comparativo 2 N-metil-2-[(6-{2-oxo-2-[(2S,4S)-2,5,12-trihidroxi-7-metoxi-4-{[(1S,3R,4aS,9S,9aR,10aS)-9metoxi-1-metiloctahidro-1H-pirano[4’,3’:4,5][1,3]oxazolo[2,3-c][1,4]oxazin-3-il]oxi}-6,11-dioxo-1,2,3,4,6,11hexahidrotetracen-2-il]etoxi}tetrahidro-2-il-piran-2-il)metoxi]acetamida (Compuesto 7)
40 Etapa 1 Síntesis del compuesto intermedio: (3,4-dihidro-2H-piran-2-ilmetoxi)acetato de etilo
En un matraz de fondo redondo seco en atmósfera de argón, hidruro sódico al 60 % (240 mg, 6,0 mmol) se aclaró tres veces con n-pentano anhidro. Una solución de 2-hidroximetil-3,4-dihidro-2H-pirano (570,8 mg, 5 mmol) en tetrahidrofurano (10 ml) se enfrió a 0 ºC y a continuación se añadió al NaH. La mezcla de reacción se agitó a 0 ºC hasta que terminó la evolución del hidrógeno. Se añadió una solución de bromoacetato de etilo (1253 mg, 7,5 mmol) en tetrahidrofurano (6 ml) a la mezcla de reacción y la agitación continuó a temperatura ambiente hasta la desaparición del alcohol de partida (análisis de TLC). Después de un periodo de refrigeración, se añadió H2O, y el disolvente se evaporó a presión reducida. El residuo se purificó por cromatografía en columna ultrarrápida (AcOEt:hexano = 1:12) sobre gel de sílice (malla de 230-400), proporcionando 626 mg (rendimiento de un 57 %) de (3,4-dihidro-2H-piran-2-ilmetoxi)acetato de etilo en forma de un aceite incoloro; RMN 1H (401 MHz, DMSO-d6) δ ppm 1,18 -1,23 (m, 3 H) 3,55 -3,59 (m, 2 H) 3,93 (m, J = 10,08, 5,11, 5,11, 2,38 Hz, 1 H) 4,13 (c, J = 7,07, Hz, 2 H) 4,14 (s, 2 H) 4,67 (dddd, J = 6,14, 4,83, 2,56, 1,34 Hz, 1 H) 6,36 (dt, J = 6,13, 1,75 Hz, 1 H).
Etapa 2 Síntesis del compuesto intermedio: [(6-{2-oxo-2-[(2S,4S)-2,5,12-trihidroxi-7-metoxi-4{[(1S,3R,4aS,9S,9aR,10aS)-9-metoxi-1-metiloctahidro-1H-pirano[4’,3’:4,5][1,3]oxazolo[2,3-c][1,4]oxazin-3-il]oxi}-6,11dioxo-1,2,3,4,6,11-hexahidrotetracen-2-il]etoxi}tetrahidro-2H-piran-2-il)metoxi]acetato de etilo 48
A una solución de (8S,10S)-6,8,11-trihidroxi-8-(hidroxiacetil)-1-metoxi-10-{[(1S,3R,4aS,9S,9aR,10aS)-9-metoxi-1metiloctahidro-1H-pirano[4’,3’:4,5][1,3]oxazolo[2,3-c][1,4]oxazin-3-il]oxi}-7,8,9,10-tetrahidrotetraceno-5,12-diona (50 mg, 0,078 mmol) [PNU-159682, fórmula IIA, preparado tal como se informa en el documento de patente WO 9802446] en 4 ml de diclorometano seco en atmósfera de argón, se añadieron (3,4-dihidro-2H-piran-2ilmetoxi)acetato de etilo a partir de la etapa 1 (118,5 mg, 0,592 mmol) y ácido p-toluenosulfónico anhidro (22,3 mg, 0,12 mmol). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 4 horas, hasta que no se detectaba ningún material de partida (análisis de TLC, MeOH:CH2Cl2 = 0,3:9,7). A continuación se añadió a la mezcla de reacción solución acuosa de bicarbonato sódico al 10 % y la fase acuosa se extrajo con diclorometano (4 x 20 ml). Las fases orgánicas combinadas se secaron sobre sulfato sódico anhidro, se filtró y se evaporó al vacío. El residuo se purificó por cromatografía en columna ultrarrápida (MeOH:CH2Cl2 = 0,3:9,7) sobre gel de sílice (malla de 230400), proporcionando 41 mg (cera de color rojo, rendimiento de un 62 %) de 48, en forma de una mezcla de cuatro diaestereoisómeros. MS (ESI): 842 [M+H]+. Tiempo de retención = 7,47, 7,83 min (método 2).
Etapa 3 Síntesis del compuesto intermedio: ácido [(6-(2-oxo-2-[(2S,4S)-2,5,12-trihidroxi-7-metoxi-4[(11S,3R,4aS,9S,9aR,10aS)-9-metoxi-1-metiloctahidro-1H-pirano[4’,3’:4,5][1,3]oxazolo[2,3-c][1,4]oxazin-3-il]oxi}6,11-dioxo-1,2,3,4,6,11-hexahidrotetracen-2-il]etoxil tetrahidro-2H-piran-2-il)metoxi]acético 49
El éster de etilo intermedio 48 obtenido a partir de la etapa 2 (40 mg, 0,0475 mmol) enfriado a 0 ºC, se trató con solución acuosa de hidróxido sódico 0,1 N (1,5 ml) en atmósfera de argón. La mezcla de reacción se agitó a 0 ºC
durante 2 horas. El transcurso de la reacción fue seguido de HPLC-en fase inversa MS. Después de éso, la mezcla de reacción se llegó a pH ~ 8 con solución acuosa de ácido acético al 10 %, y se extrajo con n-butanol saturado con agua (8 x 10 ml). Las fases orgánicas combinadas se secaron sobre sulfato sódico anhidro, se filtró, y el disolvente se retiró al vacío. El residuo se purificó por cromatografía en columna ultrarrápida (MeOH:CH2Cl2 = 1:9) sobre gel de
5 sílice (malla de 230-400), proporcionando 4,5 mg (sólido de color rojo, rendimiento de un 12 %) de 49 en forma de una mezcla diastereoisomérica. MS (ESI): 814 [M+H]+. Tiempo de retención = 2,99, 3,50, 3,66 (método 2). Tiempo de retención = 4,24 (método 1).
Etapa 4 Síntesis del compuesto intermedio: 1-({[(6-{2-oxo-2-[(2S,4S)-2,5,12-trihidroxi-7-metoxi-4
10 {[(1S,3R,4aS,9S,9aR,10aS)-9-metoxi-1-metiloctahidro-1H-pirano[4’,3’:4,5][1,3]oxazolo[2,3-c][1,4]oxazin-3-il]oxi}-6,11dioxo-1,2,3,4,6,11-hexahidrotetracen-2-il]etoxi}tetrahidro-2H-piran-2-il)metoxi]acetil}oxi)pirrolidina-2,5-diona 50
15 A una solución del ácido intermedio 49 obtenido a partir de la etapa 3 del proceso (2 mg, 0,0024 mmol) en diclorometano seco (1 ml) enfriado a 0 ºC, se añadieron N-hidroxisuccinimida (1 mg, 0,00792 mmol) y N,N’diciclohexilcarbodiimida (1 mg, 0,004556 mmol). La mezcla de reacción se agitó a 0 ºC durante 2,5 h, hasta la desaparición del material de partida (análisis de análisis de HPLC-MS). El disolvente se evaporó al vacío y el residuo se trató con éter etílico (2 x 4 ml). La suspensión se agitó durante 10 minutos, el sólido se retiro por filtración y la
20 solución orgánica se concentró al vacío, proporcionando 2 mg de 50 (sólido de color rojo) en forma de una mezcla de diaestereoisómeros. MS (ESI): 911 [M+H]+. Tiempo de retención = 6,12, 6,30, 6,42 min (método 1).
Etapa 5 El compuesto del título 7
A una solución de 50 obtenido a partir de la etapa 4 del proceso (1 mg, 0,0011 mmol) en diclorometano seco (100 µl), se añadió metilamina 2,0 M en THF (65 µl, 0,0033 mmol). La solución se agitó a temperatura ambiente 4 horas hasta que no se detectaba ningún material de partida (análisis de HPLC-MS), y el disolvente se evaporó al vacío. El
30 residuo se purificó por cromatografía en columna ultrarrápida (MeOH: CH2Cl2 = 0,3:9,7) sobre gel de sílice (malla de 230-400), proporcionando 0,46 mg (sólido de color rojo, rendimiento de un 51 %) de 7 en forma de una mezcla de diaestereoisómeros. MS (ESI): 827 [M+H]-. Tiempo de retención = 5,34, 5,54, 5,66 min (método 1).
Mediante procedimientos análogos y usando los materiales de partida adecuados, se prepararon los siguientes 35 compuestos:
2-[((6-{2-oxo-2-[(2S,4S)-2,5,12-trihidroxi-7-metoxi-4-{[(1S,3R,4aS,9S,9aR,10aS)-9-metoxi-1-metiloctahidro-1Hpirano[4’,3’:4,5][1,3]oxazolo[2,3-c][1,4]oxazin-3-il]oxi}-6,11-dioxo-1,2,3,4,6,11-hexahidrotetracen-2il]etoxi}tetrahidro-2H-piran-2-il)metoxi]acetamida (Compuesto 6) MS (ESI): 813 [M+H]+. Tiempo de retención =
40 5,42 min (método 2). N-bencil-2-[(6-{2-oxo-2-[(2S,4S)-2,5,12-trihidroxi-7-metoxi-4-{[(1S,3R,4aS,9S,9aR,10aS)-9-metoxi-1metiloctahidro-1H-pirano[4’,3’:4,5][1,3]oxazolo[2,3-c][1,4]oxazin-3-il]oxi}-6,11-dioxo-1,2,3,4,6,11hexahidrotetracen-2-il]etoxi}tetrahidro-2H-piran-2il)metoxi]acetamida (Compuesto 8) MS (ESI): 903 [M+H]+. Tiempo de retención = 6,92 min (método 1). Tiempo de retención = 6,94 min (método 2).
45 Ejemplo Comparativo 3 N-acetil-3-({3-[(2E)-2-{2-hidroxi-1-[(2S,4S)-2,5,12-trihidroxi-7-metoxi-4{[(1S,3R,4aS,9S,9aR,10aS)-9-metoxi-1-metiloctahidro-1H-pirano[4’,3’:4,5][1,3]oxazolo[2,3-c][1,4]oxazin-3-il]oxi}-6;11dioxo-1,2,3,4,6,11-hexahidrotetracen-2-il]etiliden} hidrazinil]-3-oxopropil} disulfanil)-L-alanina (Compuesto 12)
5 Etapa 1 N’-{(1E)-2-hidroxi-1-[(2S,4S)-2,5,12-trihidroxi-7-metoxi-4-{[(1S,3R,4aS,9S,9aR,10aS)-9-metoxi-1-metiloctahidro-1H-pirano[4’,3’:4,5][1,3]oxazolo[2,3-c][1,4]oxazin-3-il]oxi}-6,11-dioxo-1,2,3,4,6,11-hexahidrotetracen-2il]etiliden}-3-(piridin-2-ildisulfanil)propanohidrazida 53
10 Una solución de HCl de hidrazida del ácido 3-(2-piridilditio)propiónico (41,5 mg, 0,156 mmol) en metanol anhidro (5 ml) se añadió a (8S,10S)-6,8,11-trihidroxi-8-(hidroxiacetil)-1-metoxi-10-{[(1S,3R,4aS,9S,9aR,10aS)-9-metoxi-1metiloctahidro-1H-pirano[4’,3’:4,5][1,3]oxazolo[2,3-c][1,4]oxazin-3-il]oxi}-7,8,9,10-tetrahidrotetraceno-5,12-diona [PNU-159682, compuesto IIA, preparado tal como se informa en el documento de patente WO 9802446] (50 mg,
15 0,078 mmol). La solución se agitó en la oscuridad a temperatura ambiente durante 20 horas. El transcurso de la reacción fue seguido de HPLC-MS en fase inversa. Después de este periodo el disolvente se evaporó y el residuo se purificó por cromatografía en columna ultrarrápida (M:eOH:CH2Cl2 = 0,2:9,8) sobre gel de sílice (malla de 230-400), proporcionando 18 mg (rendimiento de un 27 %) de 53, MS (ESI): 853 [M+H]+. Tiempo de retención = 5,52 min (método 2).
20 Mediante procedimientos análogos y usando los materiales de partida adecuados, se preparó el siguiente compuesto: 6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)-N’-(1E)-2-hidroxi-1-[(2S,4S)-2,5,12-trihidroxi-7-metoxi4-{[(1S,3R,4aS,9S,9aR,10aS)-9-metoxi-1-metiloctahidro-1H-pirano[4’,3’:4,5][1,3]oxazolo[2,3-c][1,4]oxazin-3
25 il]oxi}-6,11-dioxo-1,2,3,4,6,11-hexahidrotetracen-2-il]etilideno; hexanohidrazida 52. MS (ESI): 849 [M+H]+ Tiempo de retención = 5,15 min (método 2).
30 Etapa 2 A una solución de 53 obtenido a partir de la etapa 1 (8,5 mg, 0,01 mmol.) se añadió N-acetilcisteína (0,32 mg, 0,02 mmol). La solución se agitó a temperatura ambiente durante 24 horas, el disolvente se evaporó y el residuo se purificó por cromatografía en columna ultrarrápida (MeOH:CH2Cl2 = 2:8) sobre gel de sílice (malla de 230-400), proporcionando 7,2 mg (rendimiento de un 80 %) de 12 en forma de un sólido de color rojo. MS (ESI): 905 [M+H]+. Tiempo de retención = 3,62 min (método 2).
35 Mediante procedimientos análogos y usando los materiales de partida adecuados, se prepararon los siguientes compuestos:
N-acetil-S-(1-{6-[(2E)-2-{2-hidroxi-1-[(2S,4S)-2,5,12-trihidroxi-7-metoxi-4-{[(1S,3R,4aS,9S,9aR,10aS)-9-metoxi-1
40 metiloctahidro-1H-pirano[4’,3’:4,5][1,3]oxazolo[2,3-c][1,4]oxazin-3-il]oxi}-6,11-dioxo-1,2,3,4,6,11hexahidrotetracen-2-il]etiliden}hidrazinil]-6-oxohexil}-2,5-dioxopirrolidin-3-il)-L-cisteína (Compuesto 9). MS (ESI):
1012 [M+H]+. N2(terc-butoxicarbonil)-N2-(1-{6-[(2E)-2-{2-hidroxi-1-[(2S,4S)-2,5,12-trihidroxi-7-metoxi4-[(1S,3R,4aS,9S,9aR,10aS)-9-metoxi-1-metiloctahidro-1H-pirano[4’,3’:4,5][1,3]oxazolo[2,3-c][1,4]oxazin-3il]oxi}-6,11-dioxo-1,2,3,4,6,11-hexahidrotetracen-2-il]etiliden}hidrazinil]-6-oxohexil}-2,5-dioxopirrolidin-3-il)-L-lisina (Compuesto 10, Tabla 1) MS (ESI): 1095 [M+H]+.
Ejemplo 3a Preparación de (2S,4S)-N-[2-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)etil]-2,5,12-trihidroxi-7-metoxi-4{[(1S,3R,4aS,9S,9aR,10aS)-9-metoxi-1-metiloctahidro-1H-pirano[4’,3’:4,5][1,3]oxazolo[2,3-c][1,4]oxazin-3-il]oxi}-6,11dioxo-1,2,3,4,6,11-hexahidrotetraceno-2-carboxamida 54
A una solución de PNU-159682 (15,3 mg, 0,02038 mmol)) preparado tal como se informa en el documento de patente WO 98/02446, en 3 ml de metanol y 2 ml de H2O, se añadió una solución de NaIO4 (5,1 mg, 0,0238 mmol) en 1 ml de H2O. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 3 horas, hasta que no se detectaba ningún material de partida (análisis de TLC y HPLC). Los disolventes se retiraron a presión reducida y se usó el sólido de color rojo en bruto ácido (2S,4S)-2,5,12-trihidroxi-7-metoxi-4-{[(1S,3R,4aS,9S,9aR,10aS)-9-metoxi-1metiloctahidro-1H-pirano[4’,3’:4,5][1,3]oxazolo[2,3-c][1,4]oxazin-3-il]oxi}-6,11-dioxo-1,2,3,4,6,11-hexahidrotetraceno2-carboxílico 56 sin purificaciones adicionales en la siguiente etapa. MS (ESI): 628 [M+H]+. Tiempo de retención = 2,1-3,2 min (método 1, Ejemplo 3b).
A una solución del compuesto intermedio en bruto 56 (4,4 mg) en diclorometano anhidro (1,5 ml) en atmósfera de argón, se añadieron trietilamina anhidra (2,2 mg, 0,0204 mmol), TBTU (4,4 mg, 0,01388 mmol) y sal de trifluoroacetato de N-(2-aminoetil)maleimida disponible en el mercado (3,6 mg, 0,00694 mmol). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 30 min, hasta la desaparición del material de partida (análisis de HPLC-MS). El disolvente se evaporó al vacío y el residuo se purificó a continuación por cromatografía en columna ultrarrápida (EtOH:CH2Cl2 = 0,2:9,8) sobre gel de sílice (malla de 230-400), proporcionando 1,1 mg (sólido de color rojo, rendimiento calculado en PNU-159682 = 2 %) de 54. MS (ESI): 750 [M+H]+. Tiempo de retención = 5,18 min (método 1, Ejemplo 3b).
Ejemplo 3b Preparación de N-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)hexanoil]-L-valil-N5-carbamoil-N-[4-({[(4{[(2S,4S)-2,5,12-trihidroxi-7-metoxi-4-{[(1S,3R,4aS,9S,9aR,10aS)-9-metoxi-1-metiloctahidro-1Hpirano[4’,3’:4,5][1,3]oxazolo[2,3-c][1,4]oxazin-3-il]oxi}-6,11-dioxo-1,2m,3,4,6,11-hexahidrotetracen-2il]carbonil}piperazin-1-il)carbonil]oxi}metil)fenil]-L-ornitinamida 55 Etapa 1 Se hizo reaccionar 4-nitrofenil carbonato de 4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-Dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1il)hexanamido)-3-metilbutanamido)-5-ureido-pentanamido)bencilo 58 (30 mg, 0,041 mmol) con piperazina-1carboxilato de terc-butilo (5,3 mg, 0,0287 mmol) en DMSO anhidro en atmósfera de argón a temperatura ambiente (Figura 7d). La mezcla de reacción se agitó durante 1 h, hasta la desaparición del material de partida (análisis de HPLC-MS). A continuación se añadió éter dietílico (80 ml) a la mezcla de reacción y el precipitado obtenido de este modo se recogió por filtración para dar N-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)hexanoil]-L-valil-N-4-[({[4-(terc-butoxicarbonil)piperazin-1-il]carbonil}oxi)metil]fenil}-N5-carbamoil-L-ornitinamida 59 en forma de un sólido de color amarillo, 22,0 mg) que se aisló y se usó sin purificación adicional en la siguiente etapa. MS (ESI): 785 [M+H]+. Tiempo de retención = 4,87 min (método 1).
Etapa 2 El compuesto intermedio 59 (22,0 mg) se trató con ácido trifluoroacético (327 mg, 2,87 mmol) en diclorometano anhidro (0,12 ml). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 15 minutos, hasta la desaparición del material de partida (análisis de HPLC-MS). Después de éso, la mezcla de reacción se trató con éter dietílico (20 ml) y el residuo obtenido de este modo se aclaró con éter dietílico (2 x 10 ml): el producto N-[6-(2,5dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)hexanoil]-L-valil-N5-carbamoil-N-(4-{[(piperazin-1-ilcarbonil)oxi]metil}fenil)-Lornitinamida 60 (cera de color blanco, 20,0 mg) se aisló de este modo y se usó sin purificación adicional en la siguiente etapa. MS (ESI): 685 [M+H]+. Tiempo de retención = 2,977 min (método 1).
Etapa 3 Al compuesto intermedio 60 (13,2 mg) se añadió una solución de ácido (2S,4S)-2,5,12-trihidroxi-7-metoxi-4{[(1S,3R,4aS,9S,9aR,10aS)-9-metoxi-1-metiloctahidro-1H-pirano[4’,3’:4,5][1,3]oxazolo[2,3-c][1,4]oxazin-3-il]oxi}-6,11dioxo-1,2,3,4,6,11-hexahidrotetraceno-2-carboxílico 56 en bruto (9,3 mg) en diclorometano anhidro (2,6 ml), TBTU (5,3 mg, 0,0165 mmol) y trietilamina anhidra (2,8 mg, 0,0275 mg). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente en atmósfera de argón durante 15 minutos, hasta la desaparición del material de partida (análisis de HPLC-MS). El disolvente se evaporó a continuación al vacío y el producto en bruto se purificó por cromatografía en columna ultrarrápida (EtOH:AcOEt = 1,5:8,5) sobre gel de sílice (malla de 230-400), proporcionando 4,8 mg (sólido de color rojo, rendimiento calculado en PNU-159682 = 34 %) de 55. MS (ESI): 1295 [M+H]+. Tiempo de retención = 5,51 min (método 1).
Los compuestos se caracterizaron mediante datos analíticos de HPLC/MS; los datos de HPLC/MS se recogieron siguiendo uno cualquiera de los siguientes Métodos 1 o 2.
Método Analítico 1 de HPLC/MS: El equipo de HPLC consistía en un sistema Alliance HT 2795 de Waters equipado con un detector de PDA 2996 de Waters y espectrómetro de masas de cuadrupolo simple mod. ZQ de Micromass, equipado con una fuente iónica de electronebulización (ESI). El instrumento de control, adquisición de datos y procesamiento de datos los proporcionó Empower y software 4.0 de MassLynx. Se realizó HPLC a 30 ºC a un caudal de 1,0 ml/min usando una columna C18 X Terra MS de Waters -3,5 µM (4,6 x 50 mm). La fase móvil A era tampón de acetato amónico 5 mM a pH = 5,2 con acetonitrilo (95:5), y la fase móvil B era H2O/acetonitrilo (5:95); el gradiente era de un 10 a un 90 % de B en 8 minutos y a continuación se eleva a B al 100 % en 1,0 minutos. El espectrómetro de masas funcionaba en modo de ión positivo e ión negativo, el voltaje capilar se estableció a 3,5 kV (ES+) y 28 V (ES-); la fuente de temperatura era de 120 ºC; el cono era 14 V (ES+) y 2,8 kV (ES-); exploración total, el intervalo de masas se ajustó de 100 a 1000 m/z.
Método Analítico 2 de HPLC/MS: El equipo de HPLC consistía en un sistema 2795 HPLC de Waters equipado con un detector de PDA 996 de Waters y espectrómetro de masas de cuadrupolo simple mod. ZQ de Micromass, equipado con una fuente iónica de electronebulización (ESI). El instrumento de control, adquisición de datos y procesamiento de datos los proporcionó Empower y software 4.0 de MassLynx. Se realizó HPLC a 30 ºC a un caudal de 1 ml/min usando a RP18 Waters X Terra (4,6 µM x 50 mm). La fase móvil A era tampón de hidróxido de amonio al 0,05 % a pH = 10 con acetonitrilo (95:5), y la Fase móvil B era H2O/acetonitrilo (5:95); el gradiente era de un 10 a un 90 % de B en 8 minutos y a continuación se mantuvo B al 100 % durante 2 minutos. El espectrómetro de masas
5 funcionaba en modo de ión positivo e ión negativo, el voltaje capilar se estableció a 2,5 kV; la fuente de temperatura era de 120 ºC; el cono era 10 V; exploración total, el intervalo de masas se ajustó de 100 a 1000 m/z.
Ejemplo 3c Preparación de (8S,10S)-6,8,11-trihidroxi-1-metoxi-10-{[(1S,3R,4aS,9S,9aR,10aS)-9-metoxi-1metiloctahidro-1H-pirano[4’,3’:4,5][1,3]oxazolo[2,3-c][1,4]oxazin-3-il]oxi}-8-(piperazin-1-ilcarbonil)-7,8,9,10
10 tetrahidrotetraceno-5,12-diona 57
A una solución de 56 (9 mg) en diclorometano anhidro (5 ml) en atmósfera de argón, se añadieron trietilamina
15 anhidra (1,6 mg, 0,0158 mmol), piperazina (3,6 mg, 0,0424 mmol), HOBt (2,1 mg, 0,0158 mmol) y EDC (3,0 mg, 0,0158 mmol). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante una noche. El disolvente se evaporó al vacío y el residuo se purificó a continuación por cromatografía en columna ultrarrápida (DCM/MeOH/AcOH/H2O 45/4/1/0,5) sobre gel de sílice (malla de 230-400). El producto obtenido se disolvió en DCM y se lavó con NaHCO3 saturado (x 2) y agua (x 2). El disolvente orgánico se evaporó al vacío para proporcionar 5,0 mg de 57. MS (ESI):
20 696 [M+H]+. Tiempo de retención = 4,01 min (método 1, Ejemplo 3b).
Ejemplo Comparativo 3d Preparación de N-[2-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)etil]-2-[(6-{2-oxo-2-[(2S,4S)-2,5,12trihidroxi-7-metoxi-4-{[(1S,3R,4aS,9S,9aR,10aS-9-metoxi-1-metiloctahidro-1H-pirano[4’,3’:4,5][1,3]oxazolo[2,3c][1,4]oxazin-3-il]oxi}-6-metiliden-11-oxo-1,2,3,4,6,11-hexahidrotetracen-2-il]etoxi}tetrahidro-2H-piran-2
25 il)metoxi]acetamida 51
A una solución del compuesto intermedio en bruto 50 (103,8 mg) en diclorometano anhidro (29,7 ml) en atmósfera
30 de argón, se añadieron la sal de trifluoroacetato de N-(2-aminoetil)maleimida disponible en el mercado (57,9 mg, 0,228 mmol) y trietilamina anhidra (23,1 mg, 0,228 mmol). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 1 h, hasta la desaparición del material de partida (análisis de HPLC-MS). El disolvente se evaporó al vacío y el residuo se aclaró con una mezcla de Et2O/n-hexano (1 ml/20 ml). Del producto en bruto se purificó a continuación por cromatografía en columna ultrarrápida (EtOH:CH2Cl2 = 0,2:9,8) sobre gel de sílice (malla de 230-400),
35 proporcionando 12,2 mg (sólido de color rojo, rendimiento calculado en PNU-159682 = 20 %) de 51 en forma de una mezcla diastereoisomérica. MS (ESI): 936 [M+H]+. Tiempo de retención = 5,86, de acuerdo con el siguiente método:
Sistema de HPLC 2795 Alliance HT de Waters con un detector de PDA 2996 de Waters y espectrómetro de masas de cuadrupolo simple mod. ZQ de Micromass, con una fuente iónica de electronebulización (ESI). El instrumento de 40 control, adquisición de datos y procesamiento de datos los proporcionó Empower y software 4.0 de MassLynx. Se
realizó HPLC a 30 ºC a un caudal de 1,0 ml/min usando una columna X Terra MS C 18 de Waters-3,5 µM (4,6 x 50 mm). La fase móvil A era tampón de acetato amónico 5 mM a pH = 5,2 con acetonitrilo (95:5), y la fase móvil B era H2O/acetonitrilo (5:95); el gradiente era de un 10 a un 90 % de B en 8 minutos y a continuación se eleva a B al 100 % en 1,0 minutos. El espectrómetro de masas funcionaba en modo de ión positivo e ión negativo, el voltaje capilar se estableció a 3,5 kV (ES+) and 28 V (ES-); la temperatura de la fuente era de 120 °C; el cono era 14 V (ES+) and 2,8 kV (ES-); exploración total, intervalo de masas de 100 a 1000 m/z.
Ejemplo Comparativo 4 Preparación del Compuesto 5 de conjugado de MCM2, tal como se identifica en la Tabla 1.
Se disolvió proteína MCM2 (10-294) [Ishimi et al. (2001) Jour. Biol Chem. 276 (46): 42744-42752] (1,5 mg, 0,045 µmol) en 0,5 ml de solución salina tamponada con fosfato (pH 7,2), el valor de pH se ajustó a 8,5 mediante la adición de 55 µl de NaHCO3 1 M (pH 8,5) y se añadieron 0,5 mg de 1-({[(1-{2-oxo-2-[(2S,4S)-2,5,12-trihidroxi-7-metoxi-4{[(1S,3R,4aS,9S,9aR,10aS)-9-metoxi-1-metiloctahidro-1H-pirano[4’,3’:4,5][1,3]oxazolo[2,3-c][1,4]oxazin-3-il]oxi}-6,11dioxo-1,2,3,4,6,11-hexahidrotetracen-2-il]etoxi}ciclohexil)oxi]acetil}oxi)pirrolidina-2,5-diona (0,55 µmol) [preparado tal como se informa en la etapa 3 del ejemplo 1] a partir de una solución de 10 mg/ml de acetonitrilo. La reacción se incubó durante 1 h a temperatura ambiente y a continuación la mezcla de reacción se desaló en una columna NAP10 acondicionada en solución salina tamponada con fosfato y las fracciones que contenían la proteína se recogieron y se combinaron.
La proteína reaccionada se analizó por SDS PAGE en comparación con MCM2 sin reaccionar y diferentes cantidades de 1-({[(1-{2-oxo-2-[(2S,4S)-2,5,12-trihidroxi-7-metoxi-4-{[(1S,3R,4aS,9S,9aR,10aS)-9-metoxi-1metiloctahidro-1H-pirano[4’,3,4,5][1,3]oxazolo[2,3-c][1,4]oxazin-3-il]oxi}-6,11-dioxo-1,2,3,4,6,11-hexahidrotetracen-2il]etoxi}ciclohexil)oxi]acetil}oxi)pirrolidina-2,5-diona tal como se ha informado anteriormente.
Mediante procedimientos análogos y usando los materiales de partida adecuados se prepararon los siguientes compuestos (Tabla 1): Compuesto 11 de conjugado de MCM2; Compuesto 13 de conjugado de MCM2; Compuesto 14 de conjugado de MCM2.
Ejemplo 5 Estabilidad del conjugado: Procedimiento general
A 0,5 mg de conjugado, se añadió solución tampón de acetato amónico 5 mM a pH = 5,2 (200 ml). La solución se calentó a 37 ºC y la muestra se tomó periódicamente y se analizó mediante HPLC (método 2). Los resultados se expresan como % de material liberado (8S,10S)-6,8,11-trihidroxi-8-(hidroxiacetil)-1-metoxi-10{[(1S,3R,4aS,9S,9aR,10aS)-9-metoxi-1-metiloctahidro-1H-pirano[4’,3’:4,5][1,3]oxazolo[2,3-c][1,4]oxazin-3-il]oxi}7,8,9,10-tetrahidrotetraceno-5,12-diona (Compuesto IIA) a partir del conjugado.
Mediante procedimientos análogos, usando la solución tampón de acetato amónico 5 mM a pH = 4,5, también se determinó la estabilidad a pH 4,5.
Mediante procedimientos análogos, la estabilidad se realizó en el Compuesto 12 (Tabla 1), que muestra, después de cuatro horas de incubación, una liberación de un 90 % en solución tampón a pH 5,2 y un 100 % de liberación en solución tampón pH 4,2, de (8S,10S)-6,8,11-trihidroxi-8-(hidroxiacetil)-1-metoxi-10-{[(1S,3R,4aS,9S,9aR,10aS)-9metoxi-1-metiloctahidro-1H-pirano[4’,3’:4,5][1,3]oxazolo[2,3-c][1,4]oxazin-3-il]oxi}-7,8,9,10-tetrahidrotetraceno-5,12diona (Compuesto IIA) a partir del conjugado.
Ejemplo 6 Preparación de anticuerpos sometidos a ingeniería de cisteína para conjugación por reducción y reoxidación
Los aminoácidos de cadena pesada y de cadena ligera se enumeran de acuerdo con Kabat (Kabat et al., Sequences of proteins of immunological interest, (1991) 5ª Ed., Departamento de Salud y Servicios Humanos de Estados Unidos, National Institutes of Health, Bethesda, MD). Se usan abreviaturas de aminoácidos de una sola letra:
Anticuerpos monoclonales sometidos a ingeniería de cisteína, de longitud completa (TioMabs) expresados en células CHO portan aductos de cisteína (cistinas) o glutationilados en las cisteínas sometidas a ingeniería debido a las condiciones del cultivo celular. Para liberar los grupos tiol reactivos de las cisteínas sometidas a ingeniería, los TioMabs se disuelven en borato sódico 500 mM y cloruro sódico 500 mM a aproximadamente pH 8,0 y se reducen con un índice de dilución en exceso de aproximadamente 50-100 de TCEP clorhidrato de (tris(2-carboxietil)fosfina 1 mM; Getz et al. (1999) Anal. Biochem. 273: 73-80; Soltec Ventures, Beverly, MA) durante aproximadamente 1-2 horas a 37 ºC. Como alternativa, se puede usar DTT como agente reductor. La formación de enlaces disulfuro intercatenarios se controló mediante SDS-PAGE no reductor o mediante cromatografía en columna de PLRP para HPLC en fase inversa desnaturalizante. El anticuerpo son medio ingeniería de cisteína reducido se diluye y se carga en una columna HiTrap S en acetato sódico 10 mM, pH 5, y se eluye con PBS que contiene cloruro sódico 0,3 M. El anticuerpo sometido e ingeniería de cisteína reducido eluido (TioMab) se trata con ácido deshidroascórbico 2 mM (dhAA) a pH 7 durante 3 horas, o sulfato de cobre acuoso 2 mM (CuSO4) a temperatura ambiente durante una noche. También puede ser eficaz la oxidación con el aire ambiental. El tampón se intercambia por elución sobre resina Sephadex G25 y se fluye con PBS con DTPA 1 mM. El valor de tiol/Ab se comprueba mediante la determinación de la concentración de anticuerpo reducido a partir de la absorbancia a 280 nm de la solución y la concentración de tiol por reacción con DTNB (Aldrich, Milwaukee, WI) y la determinación de la absorbancia a 412 nm.
Se realizó Análisis de cromatografía/Espectrometría de Masas en un espectrómetro de masas de cuadrupolo triple TSQ Quantum con intervalo de masas extendido (Thermo Electron, San Jose California). Las muestras sé cromatografiaron en una columna de microbore PRLP-S, 1000 A, (50 mm x 2,1 mm, Polymer Laboratories, Shropshire, UK) calentada a 75 ºC. Se usó un gradiente lineal de un 30-40 % de B (disolvente A: TFA al 0,05 % en agua, disolvente B: TFA al 0,04 % en acetonitrilo) y eluyente se ionizó directamente usando la fuente de electronebulización. Los datos se recogieron con el sistema de datos Xcalibur y se realizó desconvolución usando ProMass (Novatia, LLC, New Jersey). Antes del análisis de LC/MS, los anticuerpos o conjugados de anticuerpofármaco (50 µg) se tratan con PNGasa F (2 unidades/ml; PROzyme, San Leandro, CA) durante 2 horas a 37 ºC para retirar hidratos de carbono unidos a N.
Se inyectaron muestras de Cromatografía de Interacción Hidrófoba (HIC) en una columna Butil HIC NPR (2,5 µm, 4,6 mm x 3,5 cm) (Tosoh Bioscience) y se huyeron con un gradiente lineal de un 0 a un 70 % de B a 0,8 ml/min (A: sulfato de amonio 1,5 M en fosfato potásico 50 mM, pH 7, B: fosfato potásico 50 mM a pH 7, isopropanol al 20 %). Se usó un sistema de HPLC 1100 series de Agilent equipado con un detector múltiple de longitudes de onda y el software Chemstation para resolver y cuantificar especies de anticuerpos con diferentes relaciones de fármacos por anticuerpo.
Ejemplo 7 Conjugación de anticuerpos y compuestos intermedios de fármaco-conector derivados de antraciclina
Generalmente, anticuerpos y compuestos intermedios de fármaco-conector derivados de antraciclina se conjugan de acuerdo con los métodos de la Patente de Estados Unidos Nº 7521541; Patente de Estados Unidos Nº 7498298; documento de patente US 2005/0276812; documento de patente US 2008/0311134; y "METABOLITO DE NEMORRUBICINA Y CONJUGADOS ANÁLOGOS DE ANTICUERPO-FÁRMACO Y MÉTODOS", documento de patente PCT/US2009/031199, presentado el 16 de enero de 2009.
Se realizó análisis de cuantificación de conjugados mediante detección de fluorescencia en gel usando el explorador basado en CCD ProXpress (PerkinElmer). La excitación del instrumento y los filtros de emisión se ajustaron a 480/30 nm y 590/35 nm respectivamente. El análisis de cuantificación se realizó usando el software Profinder proporcionado con el instrumento usando la cantidad diferente de materiales de partida cargados en el gel como referencia. A continuación se evaluó la proteína total cargada mediante tinción de proteína con Azul de Coomassie.
Ejemplo 8 Conjugación de anticuerpos sometidos a ingeniería de cisteína y compuestos intermedios de fármacoconector de maleimida
Después de los procedimientos de reducción y reoxidación del Ejemplo 6, el anticuerpo sometido a ingeniería de cisteína se disuelve en tampón de PBS (solución salina tamponada con fosfato) y se enfría en hielo. Más que inicial aproximadamente 1,5 equivalentes molares con respecto a cisteínas sometidas a ingeniería por anticuerpo de un derivado de antraciclina con un grupo funcional reactivo para tiol tal como: disulfuro de piridina, por ejemplo compuestos intermedios de fármaco-conector 53 o; bromo-acetamido y maleimida, por ejemplo compuestos intermedios de fármaco-conector 51 y 52, se disuelven en DMSO, se diluyen en acetonitrilo y agua, y se añaden al anticuerpo enfriado reducido, reoxidado en PBS. Después de aproximadamente una hora, se añade un exceso de maleimida para inactivar la reacción y proteger cualquier grupo tiol del anticuerpo sin reaccionar. La mezcla de reacción se concentra mediante ultrafiltración en centrífuga y el conjugado de anticuerpo-fármaco sometido a ingeniería de cisteína se purifica y se desala mediante elución a través de resina G25 en PBS, se filtra a través de filtros de 0,2 µm en condiciones estériles, y se congela para su almacenamiento.
Mediante los procedimientos anteriores, se prepararon conjugados de anticuerpo y fármacos sometidos a ingeniería de cisteína: 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 111, 112,y 113 (Tabla 2). Cada uno de los anticuerpos metidos a ingeniería de cisteína que comprenden los conjugados de anticuerpo-fármaco 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 111, 112, y 113 eran el mutante sometida ingeniería de cisteína A114C (Kabat) de cadena pesada (HC) (Patente de Estados Unidos Nº 7521541). Para el anticuerpo trastuzumab, el mutante A114C según el esquema de numeración de Kabat es el mismo que el mutante A118C según el esquema de numeración de EU y el mutante A 121 C según el esquema de numeración Secuencial.
Los conjugados de anticuerpo y fármacos sometidos a ingeniería de cisteína con los restos de fármaco-conector de maleimida caproílo (MC), valina-citrulina (vc), p-aminobenciloxicarbamoílo (PAB), y fármaco auristatina (MMAE) (106, 111, y 112) se prepararon mediante el método del Ejemplo 3 del documento de patente US 2008/0311134, y los Ejemplos 27 y 29 de la Patente de Estados Unidos Nº 7498298, con el compuesto intermedio de fármacoconector MC-vc-PAB-MMAE:
Ejemplo 9 Ensayo de proliferación celular in vitro
Las líneas celulares tumorales de carcinoma de mama BT-474, SKBR-3, y MCF7 se obtuvieron a partir de la Colección Americana de Cultivos Tipo.
La potencia in vitro de los conjugados de anticuerpo-fármaco se midió mediante un ensayo de proliferación celular (Figuras 8-29). El Ensayo de Viabilidad Celular Luminiscente CellTiter-Glo® es un método de ensayo homogéneo disponible en el mercado (Promega Corp., Madison, WI), basado en la expresión recombinante de luciferasa de Coleópteros (Patente de Estados Unidos Nº 5583024; Patente de Estados Unidos Nº 5674713; Patente de Estados Unidos Nº 5700670). Este ensayo determina el número de células viables en cultivo basándose en la cuantificación del ATP presente, un indicador de células metabólicamente activas (Crouch et al. (1993) J. Immunol. Meth. 160: 8188; Patente de Estados Unidos Nº 6602677). El Ensayo CellTiter-Glo® se realizó en formato de 96 pocillos, haciéndolo susceptible a identificación sistemática de alto rendimiento automatizada (HTS) (Cree et al. (1995) AntiCancer Drugs 6:398-404). El procedimiento de ensayo homogéneo implica la adición del reactivo individual (Reactivo de CellTiter-Glo®) directamente a las células cultivadas en medio complementado con suero.
El formato de "añadir-mezclar-medir" homogéneo da como resultado lisis y regeneración celular de una señal luminiscente proporcional a la cantidad de ATP presente. El sustrato, Luciferina de Escarabajo, se descarboxila de forma oxidada iba mediante luciferasa de luciérnaga recombinante con conversión simultánea de ATP en AMP y generación de fotones. Las células viables se reflejan en unidades relativas de luminiscencia (RLU). Los datos se pueden registrar mediante luminómetro o dispositivo de formación de imágenes con cámara CCD. La producción de luminiscencia se presenta como RLU, medidas en el tiempo. Como alternativa, se puede hacer recuento de fotones a partir de luminiscencia en un contador de centelleo en presencia de un centelleador. Las unidades de luz se pueden representar a continuación como CPS -recuentos por segundo.
La eficacia de ADC se midió mediante un ensayo de viabilidad celular usándole siguiente protocolo, adaptado a partir de Ensayo de Viabilidad Celular Luminiscente CellTiter Glo, Promega Corp. Boletín Técnico TB288 y Mendoza et al. (2002) Cancer Res. 62: 5485-5488:
1.
Una alícuota de 50 µl de cultivo celular que contiene aproximadamente 1000 o mas células, que incluye: células que expresan HER2 y células que expresan CD22, en medio se depositaron en cada pocillo de una placa de fondo transparente, de paredes opacas, de 96 pocillos.
2.
Se añadió ADC (50 µl) por triplicado a pocillos experimentales hasta una concentración finalmente 10 µg/ml, con pocillos de control "sin ADC" recibiendo medio solo, y se incubó durante 3 o más días.
3.
Las placas se equilibraron a temperatura ambiente durante aproximadamente 30 minutos.
4.
Se añadió Reactivo CellTiter-Glo (100 µl).
5.
Los contenidos se mezclaron durante 2 minutos en un agitador orbital para inducir la lisis celular.
6.
La placa se incubó a temperatura ambiente durante 10 minutos para estabilizar la señal de luminiscencia.
7.
La luminiscencia se registró y se informó en gráficos como RLU = unidades relativas de luminiscencia.
Ejemplo 10 Farmacocinética – Eliminación y estabilidad en suero
La disposición de conjugados de anticuerpo-fármaco in vivo se analiza midiendo las concentraciones en suero de anticuerpo y de conjugados de fármaco después de una sola dosis de bolo intravenosa en ratas Sprague-Dawley. Las concentraciones de conjugados de anticuerpo-fármaco que portan al menos un fármaco citotóxico se miden con un ELISA que usaba una proteína que dominio extracelular (ECD) para la captura y anticuerpo Fc anti-ratón conjugado con anti-antraciclina y peroxidasa de rábano picante (HRP) para detección. Las concentraciones totales de anticuerpo en suero se midieron con un ELISA que usa ECD para la captura y HRP anti-humano-Fc para detección, midiendo el anticuerpo, tanto con cómo sin derivado de antraciclina conjugado. Los datos de concentración en suero-tiempo de cada animal se analizan usando un modelo de los compartimentos con entrada de bolo IV, eliminación de primer orden, y constantes de macrotasa (Modelo 8, WinNonlin Pro v.5.0.1, Pharsight Corporation, Mountain View, CA).
Ejemplo 11 Toxicidad animal
Un estudio de toxicidad aguda de 12 días en ratas hembra adolescentes (100-125 gramos) se realiza mediante una sola inyección de conjugado de anticuerpo-fármaco a aproximadamente 1-10 mg/kg, y un Vehículo de control en el día 1. La inyección del artículo de ensayo por lo general se administra como un bolo intravenoso. El peso corporal se mide diariamente. Periódicamente se realiza química clínica, enzimas en suero y análisis de hematología. Las señales de toxicidad incluían la observación clínica de pérdida de peso.
Ejemplo 12 Modelo de ratón de eficacia in vivo de inhibición del crecimiento tumoral
Todos los estudios animales se realizaron en cumplimiento de las directrices de NIH para el cuidado y uso de animales de laboratorio y fueron aprobados por el Institutional Animal Care and Use Committee en Genentech.
Se realizaron estudios de eficacia usando ratones SCID (Charles River Laboratories). Se usaron los modelos de eficacia para los estudios a modo de ejemplo en las Figuras 30-32 tal como se describe en (Polson et al. (2009) Cancer Res. 69 (6): 2358-2364; Phillips et al. (2008) Cancer Res. 68 (22): 9280-9290; documento de patente US 2008/0050310; documento de patente US 2005/0276812), evaluando el volumen del tumor después de una sola dosis intravenosa. Se desarrollaron modelos de trasplante usando tumores extirpados de un ratón portador de un tumor intraperitoneal, a continuación se pasaron en serien ratones receptores. Por ejemplo, las células para implante se lavaron y se suspendieron en HBSS (Hyclone) y se inocularon por vía subcutánea en los costados de ratones CB17 ICR hembra con inmunodeficiencia combinada grave (7-16 semanas de edad de Charles Rivers Laboratories), en un volumen de 0,2 ml/ratón. Para someter a ensayo la eficacia de los conjugados de anticuerpo y fármaco in vivo, se inocularon aproximadamente varios millones de células por ratón SCID una vez y se permitió que crecieran durante aproximadamente 10 a 60 días después de la inyección. Cuando los volúmenes tumorales alcanzaron 150200 mm3 (por lo general del Día 14 al Día 21 después de la inoculación), los ratones se segregaron en grupos de muestra de 9-10 ratones por grupo y el volumen del tumor se determinó en cada ratón. Cuando el tamaño medio del tumor alcanzó el volumen deseado, los ratones se dividieron en grupos de 8 a 10 ratones con el mismo tamaño medio del tumor y se dosifican por vía intravenosa a través de la vena de la cola con muestras: los ADC, anticuerpos, o Vehículo. Las dosis de ADC se midieron como la masa del fármaco de molécula pequeña citotóxico conjugado por área de superficie del ratón, o como una masa constante de ADC por masa del ratón (por ejemplo, 5 mg de ADC/kg de ratón). En general, las cargas de fármaco en los anticuerpos en un experimento dado eran similares o normalizadas, de modo que estas dos medidas se podrían considerar equivalentes. El volumen del tumor se midió usando pinzas de acuerdo con la fórmula: V (mm3) = 0,5A X B2, en la que A y B son los diámetros largo y corto, respectivamente. Los ratones sacrificaron antes de que el volumen tumoral alcanzara 3000 mm3 o cuando los tumores mostraban signos de ulceración inminente. Los datos recogidos a partir de cada grupo experimental se expresaron como media ± SE.

Claims (14)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Un derivado de antraciclina de Fórmula (IIc)
    Ant-L-(Z)m-X (IIc) en la que Ant se selecciona entre la estructura:
    en la que la línea ondulada indica la unión a L;
    15 L es un conector seleccionado entre -N(R)-, -N(R)m(alquileno C1-C12)-, -N(R)m(alquenileno C2-C8)-, N(R)m(alquinileno C2-C8)-, -N(R)m(CH2CH2O)n-, y la estructura:
    20
    en la que las líneas onduladas indican las uniones a Ant y Z; y
    Z es un espaciador opcional seleccionado entre -CH2C(O)-, -CH2C(O)NR(alquileno C1-C12)-, y las estructuras:
    25
    5 X es un grupo funcional reactivo seleccionado entre maleimida, tiol, amino, bromuro, p-toluenosulfonato, yoduro, hidroxilo, carboxilo, disulfuro de piridilo, y N-hidroxisuccinimida; R es H, alquilo C1-C12 o arilo C6-C20; R1 y R2 se seleccionan independientemente entre una cadena lateral de aminoácido; Z1 se selecciona entre -(alquileno C1-C12)-, -(alquenileno C2-C8)-, -(alquinileno C2-C8)-y -(CH2CH2O)n-;
    10 mes0o1;y n es de 1a 6;
    o en el que el derivado de antraciclina se selecciona entre las estructuras:
    en la que Z es alquileno C1-C12,
    y
  2. 2.
    El derivado de antraciclina de la reivindicación 1, en el que R es H o alquilo C1-C12.
  3. 3.
    El derivado de antraciclina de la reivindicación 1, que tiene la estructura:
  4. 4.
    El derivado de antraciclina de acuerdo con la reivindicación 1,
    10 en el que R1 y R2 se seleccionan independientemente entre hidrógeno, metilo, isopropilo, isobutilo, sec-butilo, bencilo, p-hidroxibencilo, -CH2OH, -CH(OH)CH3, -CH2CH2SCH3, -CH2CONH2, -CH2COOH, -CH2CH2CONH2,
    CH2CH2COOH, -(CH2)3NHC(=NH)NH2, -(CH2)3NH2, -(CH2)3NHCOCH3, -(CH2)3NHCHO, -(CH2)4NHC(=NH)NH2, (CH2)4NH2, -(CH2)4NHCOCH3, -(CH2)4NHCHO, -(CH2)3NHCONH2, -(CH2)4NHCONH2, -CH2CH2CH(OH)CH2NH2, 2piridilmetil-, 3-piridilmetil-, 4-piridilmetil-, fenilo, ciclohexilo y las siguientes estructuras:
  5. 5. Un compuesto de conjugado de anticuerpo-fármaco que comprende un anticuerpo unido de forma covalente mediante un conector L y un espaciador opcional Z a uno o más restos de fármaco derivados de antraciclina D, teniendo el compuesto la Fórmula (Ic)
    Ab-(Zm-L-D)p Ic
    o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en la que:
    Ab es un anticuerpo que se une a uno o más antígenos asociados a tumor o receptores de superficie celular seleccionados entre (1)-(36):
    (1)
    BMPR1B (receptor de tipo IB de proteína morfogenética ósea);
    (2)
    E16 (LAT1, SLC7A5);
    (3)
    STEAP1 (antígeno epitelial de seis dominios transmembrana de próstata);
    (4)
    0772P (CA125, MUC16);
    (5)
    MPF (MPF, MSLN, SMR, factor de potenciación de megacariocitos, mesotelina);
    (6)
    Napi3b (NAPI-3B, NPTIIb, SLC34A2, familia 34 de transportadores de soluto (fosfato sódico) , miembro 2, transportador 3b de fosfato dependiente de sodio de tipo II);
    (7)
    Sema 5b (FLJ10372, KIAA1445, Mm.42015, SEMA5B, SEMAG, Semaforina 5b Hlog, dominio sema, siete repeticiones de trombospondina (de tipo 1 y similar al tipo 1), dominio transmembrana (TM) y dominio citoplasmático corto, (semaforina) 5B);
    (8)
    PSCA hlg (genes 2700050C12Rik, C530008016Rik, RIKEN cDNA 2700050C12, RIKEN cDNA 2700050C12);
    (9)
    ETBR (Receptor de endotelina de tipo B);
    (10)
    MSG783 (RNF124, proteína hipotética FLJ20315);
    (11)
    STEAP2 (HGNC_8639, IPCA-1, PCANAP1, STAMP1, STEAP2, STMP, gen 1 asociado al cáncer de próstata, proteína 1 asociada al cáncer de próstata, antígeno epitelial de seis dominios transmembrana de próstata 2, proteína de próstata de seis dominios transmembrana);
    (12)
    TrpM4 (BR22450, FLJ20041, TRPM4, TRPM4B, canal catiónico potencial de receptores transitorios, subfamilia M, miembro 4);
    (13)
    CRIPTO (CR, CR1, CRGF, CRIPTO, TDGF1, factor de crecimiento derivado de teratocarcinoma);
    (14)
    CD21 (CR2 (Receptor 2 de complemento) o C3DR (receptor de C3d/virus de Epstein Barr) o Hs 73792);
    (15)
    CD79b (CD79B, CD79β, IGb (asociado a inmunoglobulina beta), B29);
    (16)
    FcRH2 (IFGP4, IRTA4, SPAP1A (proteína 1a de anclaje de fosfatasa que contiene el dominio SH2), SPAP1B, SPAP1C);
    (17)
    HER2;
    (18)
    NCA;
    (19)
    MDP;
    (20)
    IL20Rα;
    (21)
    Brevicano; 5 (22) EphB2R;
    (23)
    ASLG659;
    (24)
    PSCA;
    (25)
    GEDA;
    (26)
    BAFF-R (receptor del factor de activación de linfocitos B, receptor 3 de BLyS, BR3); 10 (27) CD22 (isoforma CD22-B de receptores de linfocitos B);
    (28)
    CD79a (CD79A, CD79α, alfa asociado a inmunoglobulina);
    (29)
    CXCR5 (receptor 1 del linfoma de Burkitt);
    (30)
    HLA-DOB (subunidad Beta de molécula de clase II de MHC (antígeno Ia));
    (31)
    P2X5 (Canal iónico 5 abierto por el ligando receptor purinérgico P2X); 15 (32) CD72 (antígeno CD72 de diferenciación de linfocitos B, Lyb-2);
    (33)
    LY64 (Antígeno 64 de linfocitos (RP105), proteína de membrana de tipo I de la familia de repetición rica en leucina (LRR));
    (34)
    FcRH1 (proteína 1 de tipo receptor de Fc);
    (35)
    IRTA2 (Translocación asociada al receptor 2 de la superfamilia de inmunoglobulinas); y 20 (36) TENB2 (supuesto proteoglicano transmembrana);
    D es un derivado de antraciclina seleccionado entre la estructura:
    en la que la línea ondulada indica la unión a L; L es un conector seleccionado entre -N(R)-, -N(R)m(alquileno C1-C12)-, -N(R)m(alquenileno C2-C8)-, N(R)m(alquinileno C2-C8)-, -N(R)m(CH2CH2O)n-y la estructura:
    en la que las líneas onduladas indican las uniones a D y Z; y Z es un espaciador opcional seleccionado entre -CH2C(O)-, -CH2C(O)NR(alquileno C1-C12)-, y las estructuras:
    R es H, alquilo C1-C12 o arilo C6-C20; R1 y R2 se seleccionan independientemente entre hidrógeno, metilo, isopropilo, isobutilo, sec-butilo, bencilo, phidroxibencilo, -CH2OH, -CH(OH)CH3, -CH2CH2SCH3, -CH2CONH2, -CH2COOH, -CH2CH2CONH2, - CH2CH2COOH, -(CH2)3NHC(=NH)NH2, -(CH2)3NH2, -(CH2)3NHCOCH3, -(CH2)3NHCHO, -(CH2)4NHC(=NH)NH2, (CH2)4NH2, -(CH2)4NHCOCH3, -(CH2)4NHCHO, -(CH2)3NHCONH2, -(CH2)4NHCONH2, -CH2CH2CH(OH)CH2NH2, 2-piridilmetil-, 3-piridilmetil-, 4-piridilmetil-, fenilo, ciclohexilo y las siguientes estructuras:
    Z1 se selecciona entre -(alquileno C1-C12)-, -(alquenileno C2-C8)-, -(alquinileno C2-C8)-y -(CH2CH2O)n-, m es 0 o1; n es de 1a 6;y p es un número entero de 1 a 8.
  6. 6. El compuesto de conjugado de anticuerpo-fármaco de acuerdo con la reivindicación 5, en el que:
    el espaciador Z comprende un grupo para-aminobenciloxicarbonilo (PAB);
    o Z comprende un grupo de valina-citrulina (vc). 5
  7. 7. El compuesto de conjugado de anticuerpo-fármaco de acuerdo con la reivindicación 5, en el que Ab es un anticuerpo sometido a ingeniería de cisteína.
  8. 8. El compuesto de conjugado de anticuerpo-fármaco de acuerdo con la reivindicación 5, en el que Ab es un 10 anticuerpo que se une a un receptor ErbB.
  9. 9. El compuesto de conjugado de anticuerpo-fármaco de acuerdo con la reivindicación 8, en el que Ab es trastuzumab.
    15 10. El compuesto de conjugado de anticuerpo-fármaco de acuerdo con la reivindicación 5, en el que p es 1, 2, 3 o 4.
  10. 11. El compuesto de conjugado de anticuerpo-fármaco de acuerdo con la reivindicación 5, que comprende una mezcla de los compuestos de conjugado de anticuerpo-fármaco, en el que la carga media de fármaco por anticuerpo en la mezcla de compuestos de conjugado de anticuerpo-fármaco es de aproximadamente 2 a aproximadamente 5.
  11. 12. Una composición farmacéutica que comprende el compuesto de conjugado de anticuerpo-fármaco de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 11 y un diluyente, un vehículo o un excipiente farmacéuticamente aceptables.
    25 13. La composición farmacéutica de la reivindicación 12, que comprende adicionalmente una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente quimioterapéutico.
  12. 14. Uso de un compuesto de conjugado de anticuerpo-fármaco de acuerdo con una cualquiera de las
    reivindicaciones 5 a 11 en la preparación de un medicamento para el tratamiento del cáncer en un mamífero. 30
  13. 15.
    Un compuesto de conjugado de anticuerpo-fármaco de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 11 para uso en un método para el tratamiento del cáncer.
  14. 16.
    Un método para preparar un compuesto de conjugado de anticuerpo-fármaco que comprende hacer reaccionar
    35 un derivado de antraciclina y un anticuerpo Ab para formar el compuesto de conjugado de anticuerpo-fármaco, en el que el derivado de antraciclina tiene la Fórmula (IIc):
    Ant-L-(Z)m-X (IIc)
    40 en la que Ant se selecciona entre la estructura:
    en la que la línea ondulada indica la unión a L;
    L es un conector seleccionado entre -N(R)-, -N(R)m(alquileno C1-C12)-, -N(R)m(alquenileno C2-C8)-, N(R)m(alquinileno C2-C8)-, -N(R)m(CH2CH2O)n-, y la estructura:
    en la que las líneas onduladas indican las uniones a Ant y Z; y Z es un espaciador opcional seleccionado entre -CH2C(O)-, -CH2C(O)NR(alquileno C1-C12)-, y las estructuras:
    X es un grupo funcional reactivo seleccionado entre maleimida, tiol, amino, bromuro, p-toluenosulfonato, yoduro, hidroxilo, carboxilo, disulfuro de piridilo y N-hidroxisuccinimida;
    10 R es H, alquilo C1-C12 o arilo C6-C20; R1 y R2 se seleccionan independientemente entre una cadena lateral de aminoácido; Z1 se selecciona entre -(alquileno C1-C12)-, -(alquenileno C2-C8)-, -(alquinileno C2-C8)-y -(CH2CH2O)n-, m es 0 o1; y nes de 1a 6; el conjugado de anticuerpo-fármaco tiene la fórmula Ic:
    15 Ab-(Zm-L-D)p Ic
    en laqueD es Ant; en la que Ab es un anticuerpo que se une a uno o más antígenos asociados a tumor o receptores de superficie 20 celular seleccionados entre (1)-(36):
    (1)
    BMPR1B (receptor de tipo IB de proteína morfogenética ósea);
    (2)
    E16 (LAT1, SLC7A5);
    (3) STEAP1 (antígeno epitelial de seis dominios transmembrana de próstata); 25 (4) 0772P (CA125, MUC16);
    (5)
    MPF (MPF, MSLN, SMR, factor de potenciación de megacariocitos, mesotelina);
    (6)
    Napi3b (NAPI-3B, NPTIIb, SLC34A2, familia 34 de transportadores de soluto (fosfato sódico) , miembro 2, transportador 3b de fosfato dependiente de sodio de tipo II);
    (7)
    Sema 5b (FLJ10372, KIAA1445, Mm.42015, SEMA5B, SEMAG, Semaforina 5b Hlog, dominio sema, siete
    30 repeticiones de trombospondina (de tipo 1 y similar al tipo 1), dominio transmembrana (TM) y dominio citoplasmático corto, (semaforina) 5B);
    (8)
    PSCA hlg (genes 2700050C12Rik, C530008016Rik, RIKEN cDNA 2700050C12, RIKEN cDNA 2700050C12);
    (9)
    ETBR (Receptor de endotelina de tipo B);
    (10)MSG783 (RNF124, proteína hipotética FLJ20315);
    (11)STEAP2 (HGNC_8639, IPCA-1, PCANAP1, STAMP1, STEAP2, STMP, gen 1 asociado al cáncer de próstata, proteína 1 asociada al cáncer de próstata, antígeno epitelial de seis dominios transmembrana de próstata 2, proteína de próstata de seis dominios transmembrana);
    (12)TrpM4 (BR22450, FLJ20041, TRPM4, TRPM4B, canal catiónico potencial de receptores transitorios, subfamilia M, miembro 4);
    (13)CRIPTO (CR, CR1, CRGF, CRIPTO, TDGF1, factor de crecimiento derivado de teratocarcinoma);
    (14)CD21 (CR2 (Receptor 2 de complemento) o C3DR (receptor de C3d/virus de Epstein Barr) o Hs 73792);
    (15)CD79b (CD79B, CD79β, IGb (asociado a inmunoglobulina beta), B29);
    (16)FcRH2 (IFGP4, IRTA4, SPAP1A (proteína 1a de anclaje de fosfatasa que contiene el dominio SH2), SPAP1B, SPAP1C);
    (17)HER2;
    (18)NCA;
    (19)MDP;
    (20)IL20Rα;
    (21)Brevicano;
    (22)EphB2R;
    (23)ASLG659;
    (24)PSCA;
    (25)GEDA;
    (26)BAFF-R (receptor del factor de activación de linfocitos B, receptor 3 de BLyS, BR3);
    (27)CD22 (isoforma CD22-B de receptores de linfocitos B);
    (28)CD79a (CD79A, CD79α, alfa asociado a inmunoglobulina);
    (29)CXCR5 (receptor 1 del linfoma de Burkitt);
    (30)HLA-DOB (subunidad Beta de molécula de clase II de MHC (antígeno Ia));
    (31)P2X5 (Canal iónico 5 abierto por el ligando receptor purinérgico P2X);
    (32)CD72 (antígeno CD72 de diferenciación de linfocitos B, Lyb-2);
    (33)LY64 (Antígeno 64 de linfocitos (RP105), proteína de membrana de tipo I de la familia de repetición rica en leucina (LRR));
    (34)FcRH1 (proteína 1 de tipo receptor de Fc);
    (35)IRTA2 (Translocación asociada al receptor 2 de la superfamilia de inmunoglobulinas); y
    (36)TENB2 (supuesto proteoglicano transmembrana); y
    p es un número entero de 1 a 8.
ES09790394.2T 2008-07-15 2009-07-14 Conjugados de antraciclina, proceso para su preparación y su uso como compuestos antitumorales Active ES2532635T3 (es)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US8094408P 2008-07-15 2008-07-15
US80944P 2008-07-15
PCT/US2009/050537 WO2010009124A2 (en) 2008-07-15 2009-07-14 Anthracycline derivative conjugates, process for their preparation and their use as antitumor compounds

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2532635T3 true ES2532635T3 (es) 2015-03-30

Family

ID=41404334

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES09790394.2T Active ES2532635T3 (es) 2008-07-15 2009-07-14 Conjugados de antraciclina, proceso para su preparación y su uso como compuestos antitumorales

Country Status (19)

Country Link
US (3) US8900589B2 (es)
EP (1) EP2303332B1 (es)
JP (2) JP6067222B2 (es)
KR (1) KR101667062B1 (es)
CN (1) CN102159248B (es)
AR (1) AR072804A1 (es)
AU (1) AU2009270988A1 (es)
BR (1) BRPI0910810A2 (es)
CA (1) CA2727915C (es)
ES (1) ES2532635T3 (es)
HK (1) HK1157660A1 (es)
IL (1) IL210003A0 (es)
MX (1) MX2011000509A (es)
PE (1) PE20110571A1 (es)
RU (1) RU2523419C2 (es)
SG (1) SG192517A1 (es)
TW (1) TWI461428B (es)
WO (1) WO2010009124A2 (es)
ZA (1) ZA201009122B (es)

Families Citing this family (103)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6136311A (en) 1996-05-06 2000-10-24 Cornell Research Foundation, Inc. Treatment and diagnosis of cancer
EP1996716B1 (en) 2006-03-20 2011-05-11 The Regents of the University of California Engineered anti-prostate stem cell antigen (psca) antibodies for cancer targeting
JP6126773B2 (ja) 2007-09-04 2017-05-10 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア 癌のターゲッティングおよび検出のための高親和性抗前立腺幹細胞抗原（ｐｓｃａ）抗体
EP2209498A2 (en) * 2007-10-03 2010-07-28 Cornell University Treatment of proliferative disorders using antibodies to psma
ES2547552T3 (es) 2008-02-01 2015-10-07 Genentech, Inc. Metabolito de nemorrubicina y reactivos análogos, conjugados anticuerpo-fármaco y métodos
AU2009270988A1 (en) * 2008-07-15 2010-01-21 Genentech, Inc. Anthracycline derivative conjugates, process for their preparation and their use as antitumor compounds
US20100069616A1 (en) * 2008-08-06 2010-03-18 The Regents Of The University Of California Engineered antibody-nanoparticle conjugates
WO2010096486A1 (en) * 2009-02-17 2010-08-26 Cornell Research Foundation, Inc. Methods and kits for diagnosis of cancer and prediction of therapeutic value
CA2782333C (en) 2009-12-02 2019-06-04 Imaginab, Inc. J591 minibodies and cys-diabodies for targeting human prostate specific membrane antigen (psma) and methods for their use
MX2012009215A (es) 2010-02-23 2012-11-23 Genentech Inc Composiciones y metodos para el diagnostico y tratamiento de tumores.
US9725500B2 (en) * 2010-03-02 2017-08-08 Seattle Genetics, Inc. Methods for screening antibodies
CN102971012B (zh) 2010-03-12 2016-05-04 伊缪诺金公司 Cd37结合分子及其免疫缀合物
WO2012019024A2 (en) 2010-08-04 2012-02-09 Immunogen, Inc. Her3-binding molecules and immunoconjugates thereof
CN103298489A (zh) 2010-10-29 2013-09-11 伊缪诺金公司 新型egfr结合分子及其免疫偶联物
EP2632947A4 (en) 2010-10-29 2015-03-18 Immunogen Inc NON-ANTAGONIST MOLECULES BINDING TO THE EGF RECEPTOR AND IMMUNOCONJUGATES THEREOF
RU2563638C2 (ru) 2010-12-02 2015-09-20 НЕРВИАНО МЕДИКАЛ САЙЕНСИЗ С.р.л. Способ получения производных морфолинилантрациклина
MX345519B (es) 2010-12-20 2017-02-01 Genentech Inc Anticuerpos anti-mesotelina e inmunoconjugados.
CN103596590A (zh) 2011-04-01 2014-02-19 伊缪诺金公司 Cd37结合分子及其免疫缀合物
EP2592103A1 (en) 2011-11-08 2013-05-15 Adriacell S.p.A. Polymer aldehyde derivatives
KR20140105765A (ko) 2011-11-21 2014-09-02 이뮤노젠 아이엔씨 EGfr 항체 세포독성제 접합체에 의한 EGfr 치료에 내성을 나타내는 종양의 치료 방법
BR112014013526A8 (pt) * 2011-12-05 2017-06-13 Igenica Biotherapeutics Inc conjugados de anticorpo-fármaco e compostos, composições e métodos relacionados
WO2013109994A1 (en) 2012-01-20 2013-07-25 Sea Lane Biotechnologies, Llc Surrobody cojugates
WO2013132268A1 (en) * 2012-03-09 2013-09-12 Ucl Business Plc Chemical modification of antibodies
AR090549A1 (es) 2012-03-30 2014-11-19 Genentech Inc Anticuerpos anti-lgr5 e inmunoconjugados
EP2836493B1 (en) 2012-04-05 2018-06-20 Nerviano Medical Sciences S.r.l. Functionalized thieno-indole derivatives for the treatment of cancer
ES2929759T3 (es) 2012-04-05 2022-12-01 Nerviano Medical Sciences Srl Nuevos agentes alquilantes
RU2014148162A (ru) 2012-05-01 2016-06-20 Дженентек, Инк. Анти-pmel17 антитела и их иммуноконъюгаты
JP6262209B2 (ja) * 2012-05-07 2018-01-17 日東電工株式会社 リンカーを有するポリマー結合体
US9981046B2 (en) 2012-05-15 2018-05-29 Concortis Biosystems, Corp., a wholly owned Subsidiary of Sorrento Therapeutics, Inc. Drug-conjugates, conjugation methods, and uses thereof
CA2872327A1 (en) 2012-05-21 2013-11-28 Genentech, Inc. Anti-ly6e antibodies and immunoconjugates and methods of use
CA2874904A1 (en) * 2012-07-09 2014-01-16 Genentech, Inc. Immunoconjugates comprising anti-cd22 antibodies
SG11201500096YA (en) * 2012-07-09 2015-02-27 Genentech Inc Immunoconjugates comprising anti - cd79b antibodies
EP2879711A4 (en) 2012-08-02 2016-03-16 Genentech Inc ANTI-ETBR ANTIBODIES AND IMMUNOCONJUGATES
WO2014022679A2 (en) 2012-08-02 2014-02-06 Genentech, Inc. Anti-etbr antibodies and immunoconjugates
CN104755482B (zh) 2012-10-30 2017-04-26 内尔维阿诺医学科学有限公司 官能化的9‑溴‑喜树碱衍生物
CN105143271A (zh) * 2013-02-08 2015-12-09 Irm责任有限公司 用于修饰抗体以制备免疫缀合物的特定位点
US9562099B2 (en) 2013-03-14 2017-02-07 Genentech, Inc. Anti-B7-H4 antibodies and immunoconjugates
WO2014159835A1 (en) 2013-03-14 2014-10-02 Genentech, Inc. Anti-b7-h4 antibodies and immunoconjugates
EP2777714A1 (en) 2013-03-15 2014-09-17 NBE-Therapeutics LLC Method of producing an immunoligand/payload conjugate by means of a sequence-specific transpeptidase enzyme
ES2695162T3 (es) * 2013-04-29 2019-01-02 Nerviano Medical Sciences Srl Nuevos derivados de morfolinil antraciclina
GB201309807D0 (en) 2013-05-31 2013-07-17 Pharma Mar Sau Antibody drug conjugates
WO2014197866A1 (en) 2013-06-06 2014-12-11 Igenica Biotherapeutics, Inc. Modified antibodies and related compounds, compositions, and methods of use
AR096687A1 (es) * 2013-06-24 2016-01-27 Genentech Inc Anticuerpos anti-fcrh5
CN105764501A (zh) 2013-07-26 2016-07-13 现代化制药公司 改善比生群治疗效益的组合物
RU2699289C2 (ru) 2013-08-26 2019-09-04 Байонтек Рисерч Энд Дивелопмент, Инк. НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ, КОДИРУЮЩИЕ АНТИТЕЛА ПРОТИВ СИАЛИРОВАННОГО АНТИГЕНА ЛЬЮИСАа ЧЕЛОВЕКА
CN105518027A (zh) 2013-09-17 2016-04-20 豪夫迈·罗氏有限公司 使用抗lgr5抗体的方法
EP3049420B1 (en) 2013-09-25 2019-05-15 Nerviano Medical Sciences S.r.l. Thieno[2,3-e]indole derivatives as new antitumor agents
AU2014337317A1 (en) 2013-10-15 2016-09-15 Sorrento Therapeutics Inc. Drug-conjugates with a targeting molecule and two different drugs
WO2015061209A1 (en) 2013-10-21 2015-04-30 Genentech, Inc. ANTI-Ly6E ANTIBODIES AND METHODS OF USE
MA39095A1 (fr) 2013-12-13 2018-08-31 Genentech Inc Anticorps et immunoconjugués anti-cd33
RU2689388C1 (ru) * 2013-12-16 2019-05-28 Дженентек, Инк. Пептидомиметические соединения и их конъюгаты антител с лекарственными средствами
DK3083689T3 (da) 2013-12-17 2020-08-03 Genentech Inc Anti-CD3-antistoffer og fremgangsmåder til anvendelse
AU2015237200A1 (en) 2014-03-27 2016-10-06 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Metabolically-activated drug conjugates to overcome resistance in cancer therapy
MX2016015162A (es) 2014-05-22 2017-03-03 Genentech Inc Anticuerpos anti - gpc3 e inmunoconjugados.
PT3154583T (pt) 2014-06-04 2021-03-24 Biontech Res And Development Inc Anticorpos monoclonais humanos para o gangliósido gd2
EP3151830A4 (en) * 2014-06-06 2018-02-07 Redwood Bioscience, Inc. Anti-her2 antibody-maytansine conjugates and methods of use thereof
AU2015308818B2 (en) 2014-08-28 2021-02-25 Bioatla Llc Conditionally active chimeric antigen receptors for modified T-cells
EP3191518B1 (en) 2014-09-12 2020-01-15 Genentech, Inc. Anti-b7-h4 antibodies and immunoconjugates
EP3191134B1 (en) * 2014-09-12 2019-11-20 Genentech, Inc. Anthracycline disulfide intermediates, antibody-drug conjugates and methods
CA2957354A1 (en) 2014-09-12 2016-03-17 Genentech, Inc. Cysteine engineered antibodies and conjugates
EA201790545A1 (ru) 2014-09-12 2017-07-31 Дженентек, Инк. Антитела и иммуноконъюгаты против her2
US9751946B2 (en) 2014-09-12 2017-09-05 Genentech, Inc. Anti-CLL-1 antibodies and immunoconjugates
GB201419108D0 (en) 2014-10-27 2014-12-10 Glythera Ltd Materials and methods relating to linkers for use in antibody drug conjugates
JP6785780B2 (ja) * 2014-11-05 2020-11-18 ネルビアーノ・メデイカル・サイエンシーズ・エツセ・エルレ・エルレ 官能基化モルホリニルアントラサイクリン誘導体
EP3226909A1 (en) * 2014-12-03 2017-10-11 Genentech, Inc. Quaternary amine compounds and antibody-drug conjugates thereof
CN107750169B (zh) 2014-12-23 2022-02-08 恩比伊治疗股份公司 包含蒽环类衍生物的结合蛋白药物缀合物
JP6871858B2 (ja) 2015-01-28 2021-05-19 ソレント・セラピューティクス・インコーポレイテッドＳｏｒｒｅｎｔｏ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ， Ｉｎｃ． 抗体薬物コンジュゲート
US20170224835A1 (en) * 2015-02-06 2017-08-10 Sorrento Therapeutics, Inc. Antibody Drug Conjugates
SG10202108116SA (en) 2015-06-08 2021-08-30 Debiopharm International S A Anti-cd37 immunoconjugate and anti-cd20 antibody combinations
TWI731861B (zh) 2015-06-16 2021-07-01 美商建南德克公司 FcRH5之人源化及親和力成熟抗體及使用方法
NZ739721A (en) 2015-08-07 2019-09-27 Imaginab Inc Antigen binding constructs to target molecules
BR112018003147A2 (pt) 2015-08-28 2018-09-18 Debiopharm International S.A. anticorpos e testes para detecção de cd37
BR112018006820A2 (pt) * 2015-10-05 2018-10-23 Fredax Ab anticorpos anti-psa (5a10) humanizados
MA43354A (fr) 2015-10-16 2018-08-22 Genentech Inc Conjugués médicamenteux à pont disulfure encombré
US10618935B2 (en) 2015-11-03 2020-04-14 Industrial Technology Research Institute Antibody-drug conjugate (ADC) and method for forming the same
CN113599533A (zh) * 2015-11-25 2021-11-05 乐高化学生物科学股份有限公司 包含分支接头的抗体-药物缀合物及其相关方法
US11583593B2 (en) * 2016-01-14 2023-02-21 Synthis Therapeutics, Inc. Antibody-ALK5 inhibitor conjugates and their uses
US10947317B2 (en) 2016-03-15 2021-03-16 Mersana Therapeutics, Inc. NaPi2b-targeted antibody-drug conjugates and methods of use thereof
JP6943872B2 (ja) * 2016-03-25 2021-10-06 ジェネンテック， インコーポレイテッド 多重全抗体及び抗体複合体化薬物定量化アッセイ
CA3021086C (en) 2016-04-15 2023-10-17 Bioatla, Llc Anti-axl antibodies, antibody fragments and their immunoconjugates and uses thereof
SI3455261T1 (sl) 2016-05-13 2023-01-31 Bioatla, Inc. Protitelesa proti ROR2, fragmenti protitelesa, njihovi imunokonjugati in uporabe le-teh
WO2017201449A1 (en) 2016-05-20 2017-11-23 Genentech, Inc. Protac antibody conjugates and methods of use
JP7022080B2 (ja) 2016-05-27 2022-02-17 ジェネンテック， インコーポレイテッド 部位特異的抗体－薬物複合体の特徴付けのための生化学分析的方法
EP3464294B1 (en) 2016-05-30 2022-07-13 Toxinvent Oü Antibody-drug-conjugates comprising novel anthracycline-derivatives for cancer treatment
US11325901B2 (en) 2016-06-28 2022-05-10 University Of Kentucky Research Foundation Prostaglandin E synthase inhibitors and methods for utilizing the same
JP2020510608A (ja) 2016-11-02 2020-04-09 デビオファーム インターナショナル， エス． アー． 抗ｃｄ３７イムノコンジュゲート療法を改善するための方法
AU2017361887B2 (en) 2016-11-21 2019-08-15 Cureab Gmbh Anti-GP73 antibodies and immunoconjugates
CN108210935B (zh) * 2016-12-09 2023-08-18 凯惠科技发展(上海)有限公司 抗体药物偶联物、制备方法、中间体、药物组合物及应用
WO2018147960A1 (en) 2017-02-08 2018-08-16 Imaginab, Inc. Extension sequences for diabodies
JOP20190254A1 (ar) 2017-04-27 2019-10-27 Pharma Mar Sa مركبات مضادة للأورام
CN111587124B (zh) 2017-06-23 2024-01-12 维洛斯生物股份有限公司 Ror1抗体免疫缀合物
JP7279026B2 (ja) 2017-09-20 2023-05-22 メルサナ セラピューティクス インコーポレイテッド Ｎａｐｉ２ｂ標的化療法に対する応答を予測するための組成物および方法
US11707522B2 (en) 2017-10-13 2023-07-25 Boehringer Ingelheim International Gmbh Human antibodies to Tn antigen
BR112021002747A2 (pt) 2018-08-17 2021-08-10 Mersana Therapeutics, Inc. conjugados de anticorpo-fármaco e polímero direcionados a napi2b e métodos de uso dos mesmos
WO2020245229A1 (en) 2019-06-03 2020-12-10 Synaffix B.V. Acetal-based cleavable linkers
US11744876B2 (en) * 2019-06-10 2023-09-05 Sutro Biopharma, Inc. Immunomodulator antibody drug conjugates and uses thereof
BR112023001143A2 (pt) 2020-07-21 2023-02-14 Genentech Inc Conjugado, composto, composição farmacêutica, métodos para tratar uma doença e reduzir o nível de uma proteína brm alvo em um indivíduo
WO2022122709A1 (en) 2020-12-07 2022-06-16 Sotio Biotech A.S. Antibody-drug conjugates based on humanized cldn18.2 antibodies
AU2021405049A1 (en) 2020-12-23 2023-06-22 Sotio Biotech A.S. Tumor-specific claudin 18.2 antibody-drug conjugates
CN112924665B (zh) * 2021-02-19 2023-10-03 山东莱博生物科技有限公司 一种抗体辣根过氧化物酶标记物及其制备与应用
EP4180061A1 (en) 2021-11-10 2023-05-17 Nerviano Medical Sciences S.r.l. Anthracycline derivative linker reagents, antibody-drug conjugates and methods
WO2023147329A1 (en) 2022-01-26 2023-08-03 Genentech, Inc. Antibody-conjugated chemical inducers of degradation and methods thereof
WO2023147328A1 (en) 2022-01-26 2023-08-03 Genentech, Inc. Antibody-conjugated chemical inducers of degradation with hydolysable maleimide linkers and methods thereof

Family Cites Families (64)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3773919A (en) 1969-10-23 1973-11-20 Du Pont Polylactide-drug mixtures
US5162512A (en) * 1982-03-09 1992-11-10 Cytogen Corporation Amine derivatives of anthracycline antibodies
US4826964A (en) * 1982-07-20 1989-05-02 Sri International Bridged oxygen analogs of daunorubcin and doxorubicin
GB2172594B (en) * 1985-03-22 1988-06-08 Erba Farmitalia New morpholino derivatives of daunorubicin and doxorubicin
US5583024A (en) 1985-12-02 1996-12-10 The Regents Of The University Of California Recombinant expression of Coleoptera luciferase
IL106992A (en) 1988-02-11 1994-06-24 Bristol Myers Squibb Co Noble hydrazonic history of anthracycline and methods for their preparation
CA2016584C (en) 1989-05-17 1999-06-29 Robert S. Greenfield Anthracycline conjugates having a novel linker and methods for their production
US5304687A (en) * 1989-12-19 1994-04-19 Farmitalia Carlo Erba S.R.L. Morpholinyl derivatives of doxorubicin and process for their preparation
GB9017024D0 (en) * 1990-08-03 1990-09-19 Erba Carlo Spa New linker for bioactive agents
GB9019933D0 (en) 1990-09-12 1990-10-24 Erba Carlo Spa 13-dihydro-3'-(2-alkoxy-4-morphlinyl)anthracyclines
CA2048089A1 (en) * 1990-09-17 1992-03-18 Wolfgang A. Wrasidlo Chemical conjugation of morpholino anthracyclines to antibodies
US5776458A (en) * 1990-12-05 1998-07-07 Pharmacia & Upjohn S.P.A. Anthracycline-conjugates
GB9026491D0 (en) * 1990-12-05 1991-01-23 Erba Carlo Spa Anthracycline-conjugates
ES2206447T3 (es) 1991-06-14 2004-05-16 Genentech, Inc. Anticuerpo humanizado para heregulina.
US5362852A (en) 1991-09-27 1994-11-08 Pfizer Inc. Modified peptide derivatives conjugated at 2-hydroxyethylamine moieties
AU4025193A (en) 1992-04-08 1993-11-18 Cetus Oncology Corporation Humanized C-erbB-2 specific antibodies
ATE186219T1 (de) 1993-03-24 1999-11-15 Berlex Biosciences Kombination von antihormonale und bindende moleküle zur krebsbehandlung
GB2296495B (en) 1994-12-23 1998-04-15 Erba Carlo Spa Anthracycline derivatives
JPH08336393A (ja) 1995-04-13 1996-12-24 Mitsubishi Chem Corp 光学活性なγ−置換−β−ヒドロキシ酪酸エステルの製造法
JPH11510170A (ja) 1995-07-27 1999-09-07 ジェネンテック インコーポレーテッド タンパク質の処方
US5843903A (en) * 1995-11-27 1998-12-01 The Administrators Of The Tulane Educational Fund Targeted cytotoxic anthracycline analogs
GB2315067B (en) * 1996-07-11 2000-02-16 Pharmacia Spa Morpholinyl anthracycline derivatives
US6602677B1 (en) 1997-09-19 2003-08-05 Promega Corporation Thermostable luciferases and methods of production
JP4689781B2 (ja) 1998-09-03 2011-05-25 独立行政法人科学技術振興機構 アミノ酸輸送蛋白及びその遺伝子
NZ502058A (en) 1999-12-23 2003-11-28 Ovita Ltd Isolated mutated nucleic acid molecule for regulation of ovulation rate
AU767394C (en) * 1999-12-29 2005-04-21 Immunogen, Inc. Cytotoxic agents comprising modified doxorubicins and daunorubicins and their therapeutic use
MXPA03003151A (es) 2000-10-13 2003-08-19 Eos Biotechnology Inc Metodos de diagnostico de cancer de prostata, composiciones y metodos para seleccionar moduladores de cancer de prostata.
AU2002243495A1 (en) 2001-01-12 2002-07-24 University Of Medicine And Dentistry Of New Jersey Bone morphogenetic protein-2 in the treatment and diagnosis of cancer
MXPA03006617A (es) 2001-01-24 2004-12-02 Protein Design Labs Inc Metodos de diagnostico de cancer de pecho, composiciones y metodos de rastreo de moduladores de cancer de pecho.
WO2002064798A1 (en) 2001-02-12 2002-08-22 Bionomics Limited Dna sequences differentially expressed in tumour cell lines
EP1243276A1 (en) * 2001-03-23 2002-09-25 Franciscus Marinus Hendrikus De Groot Elongated and multiple spacers containing activatible prodrugs
AU2002311787A1 (en) 2001-03-28 2002-10-15 Zycos Inc. Translational profiling
AU2002309583A1 (en) 2001-04-18 2002-11-05 Protein Desing Labs, Inc. Methods of diagnosis of lung cancer, compositions and methods of screening for modulators of lung cancer
AU2002314901A1 (en) 2001-06-04 2002-12-16 Eos Biotechnology, Inc. Methods of diagnosis and treatment of androgen-dependent prostate cancer, prostate cancer undergoing androgen-withdrawal, and androgen-independent prostate cancer
ATE483976T1 (de) 2001-06-05 2010-10-15 Exelixis Inc Gfats als modifikatoren des p53-wegs und verwendungsverfahren
WO2002098356A2 (en) 2001-06-05 2002-12-12 Exelixis Inc. Ppp2cs as modifiers of the p53 pathway and methods of use
CA2451465A1 (en) 2001-06-18 2002-12-27 Eos Biotechnology Inc. Methods of diagnosis of ovarian cancer, compositions and methods of screening for modulators of ovarian cancer
US7803915B2 (en) 2001-06-20 2010-09-28 Genentech, Inc. Antibody compositions for the diagnosis and treatment of tumor
US20050107595A1 (en) 2001-06-20 2005-05-19 Genentech, Inc. Compositions and methods for the diagnosis and treatment of tumor
US20040076955A1 (en) 2001-07-03 2004-04-22 Eos Biotechnology, Inc. Methods of diagnosis of bladder cancer, compositions and methods of screening for modulators of bladder cancer
AU2002324700A1 (en) 2001-08-14 2003-03-03 Bayer Ag Nucleic acid and amino acid sequences involved in pain
AU2002330039A1 (en) 2001-09-17 2003-04-01 Eos Biotechnology, Inc. Methods of diagnosis of cancer compositions and methods of screening for modulators of cancer
WO2003024392A2 (en) 2001-09-18 2003-03-27 Genentech, Inc. Compositions and methods for the diagnosis and treatment of tumor
US20040249144A1 (en) 2001-10-03 2004-12-09 Zairen Sun Regulated breast cancer genes
KR20100013352A (ko) 2001-10-31 2010-02-09 알콘, 인코퍼레이티드 뼈 형태발생 단백질(ｂｍｐ), ｂｍｐ 수용체 및 ｂｍｐ 결합 단백질 및 녹내장 진단 및 치료에서 그의 용도
WO2003042661A2 (en) 2001-11-13 2003-05-22 Protein Design Labs, Inc. Methods of diagnosis of cancer, compositions and methods of screening for modulators of cancer
US20030134790A1 (en) 2002-01-11 2003-07-17 University Of Medicine And Dentistry Of New Jersey Bone Morphogenetic Protein-2 And Bone Morphogenetic Protein-4 In The Treatment And Diagnosis Of Cancer
WO2003101388A2 (en) 2002-05-30 2003-12-11 Bristol-Myers Squibb Company Human solute carrier family 7 member 11 (hslc7a11)
CA2501131A1 (en) 2002-10-04 2004-04-22 Van Andel Research Institute Molecular sub-classification of kidney tumors and the discovery of new diagnostic markers
AU2003298786A1 (en) 2002-11-26 2004-06-18 Protein Design Labs, Inc. Methods of detecting soft tissue sarcoma, compositions and methods of screening for soft tissue sarcoma modulators
US20050227301A1 (en) 2003-01-10 2005-10-13 Polgen Cell cycle progression proteins
US20040202666A1 (en) * 2003-01-24 2004-10-14 Immunomedics, Inc. Anti-cancer anthracycline drug-antibody conjugates
BRPI0408494A (pt) 2003-03-18 2006-04-04 Pharmacia Italia Spa terapia combinada contra tumores compreendendo nemorubicina com terapia de radiação
AU2004222527A1 (en) 2003-03-18 2004-09-30 Pharmacia Italia Spa Combined therapy comprising nemorubicin and a cyclooxygenase-2-inhibitor
CA2531283A1 (en) 2003-06-30 2005-01-20 Bio-Technology General (Israel) Ltd. Specific human antibodies
KR101520209B1 (ko) 2003-11-06 2015-05-13 시애틀 지네틱스, 인크. 리간드에 접합될 수 있는 모노메틸발린 화합물
NZ551180A (en) 2004-06-01 2009-10-30 Genentech Inc Antibody drug conjugates and methods
EP1791565B1 (en) * 2004-09-23 2016-04-20 Genentech, Inc. Cysteine engineered antibodies and conjugates
US20070060534A1 (en) * 2005-06-30 2007-03-15 Threshold Pharmaceuticals, Inc. Anthracycline analogs
AU2006269940C1 (en) * 2005-07-18 2013-11-07 Seagen Inc. Beta-glucuronide-linker drug conjugates
CA2683568A1 (en) 2007-05-08 2008-11-20 Genentech, Inc. Cysteine engineered anti-muc16 antibodies and antibody drug conjugates
ES2547552T3 (es) * 2008-02-01 2015-10-07 Genentech, Inc. Metabolito de nemorrubicina y reactivos análogos, conjugados anticuerpo-fármaco y métodos
AU2009270988A1 (en) * 2008-07-15 2010-01-21 Genentech, Inc. Anthracycline derivative conjugates, process for their preparation and their use as antitumor compounds
RU2563638C2 (ru) * 2010-12-02 2015-09-20 НЕРВИАНО МЕДИКАЛ САЙЕНСИЗ С.р.л. Способ получения производных морфолинилантрациклина

Also Published As

Publication number Publication date
EP2303332A2 (en) 2011-04-06
JP2011528360A (ja) 2011-11-17
TW201011041A (en) 2010-03-16
AR072804A1 (es) 2010-09-22
CA2727915A1 (en) 2010-01-21
CN102159248B (zh) 2013-09-11
US20150051380A1 (en) 2015-02-19
JP2016006045A (ja) 2016-01-14
SG192517A1 (en) 2013-08-30
US8900589B2 (en) 2014-12-02
TWI461428B (zh) 2014-11-21
IL210003A0 (en) 2011-02-28
EP2303332B1 (en) 2014-12-31
US9695240B2 (en) 2017-07-04
CN102159248A (zh) 2011-08-17
MX2011000509A (es) 2011-04-05
WO2010009124A2 (en) 2010-01-21
KR20110040922A (ko) 2011-04-20
US8389697B2 (en) 2013-03-05
RU2011105402A (ru) 2012-08-20
AU2009270988A1 (en) 2010-01-21
JP6067222B2 (ja) 2017-01-25
ZA201009122B (en) 2012-03-28
KR101667062B1 (ko) 2016-10-17
US20100034837A1 (en) 2010-02-11
WO2010009124A3 (en) 2010-12-23
RU2523419C2 (ru) 2014-07-20
HK1157660A1 (en) 2012-07-06
PE20110571A1 (es) 2011-08-29
BRPI0910810A2 (pt) 2019-09-24
CA2727915C (en) 2016-04-26
US20120130059A1 (en) 2012-05-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2532635T3 (es) Conjugados de antraciclina, proceso para su preparación y su uso como compuestos antitumorales
EP2240495B1 (en) Nemorubicin metabolite and analog reagents, antibody-drug conjugates and methods
JP7303298B2 (ja) 抗体薬物複合体及びその応用
KR101200133B1 (ko) 항체 약물 접합체 및 방법
JP5972864B2 (ja) ピロロベンゾジアゼピン及びそれらのコンジュゲート
JP5020636B2 (ja) リガンドに結合体化可能なモノメチルバリン化合物
US20090226465A1 (en) Macrocyclic depsipeptide antibody-drug conjugates and methods