JP2014064568A - 種間特異的二重特異性バインダー - Google Patents

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Abstract

【課題】増殖性疾患、腫瘍性疾患又は免疫疾患から選択された疾患の予防、治療又は回復のためのポリペプチドを含む医薬組成物及び前記ポリペプチドの医学的使用を提供する。
【解決手段】ヒト及び非チンパンジー霊長類ＣＤ３（イプシロン）鎖のエピトープに結合可能な第１結合ドメイン並びにヒト及び／又は非チンパンジー霊長類のＥＧＦＲ、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ又はＩｇＥに結合可能な第２結合ドメインを含むポリペプチド並びに上述のポリペプチドを産生する方法に関する。前記ポリペプチドをコードする核酸、前記を含むベクター及び前記ベクターを含むホスト細胞にさらに関する。
【選択図】なし

Description

本発明は、ヒト及び非チンパンジー霊長類ＣＤ３（イプシロン）のエピトープに結合可能な第１のヒト結合ドメイン並びにヒト及び／又は非チンパンジー霊長類のＥＧＦＲ、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ又はＩｇＥに結合可能な第２の結合ドメインを含むポリペプチド並びに上記のポリペプチドの製造方法に関する。本発明は、前記ポリペプチドをコードする核酸、前記ポリペプチドを含むベクター及び前記ベクターを含むホスト細胞にさらに関する。他の態様において、本発明は、前記ポリペプチドを含む医薬組成物及び前記ポリペプチドの医学的使用を提供する。
Ｔ細胞認識は、ペプチドＭＨＣ（ｐＭＨＣ）のペプチド負荷分子と相互作用する、クロノタイプ的に分布するアルファベータ及びガンマデルタＴ細胞レセプター（ＴｃＲ）により媒介される（Ｄａｖｉｓ ＆ Ｂｊｏｒｋｍａｎ， Ｎａｔｕｒｅ ３３４ （１９８８）， ３９５−４０２）。ＴｃＲの抗原特異的鎖は、シグナリングドメインを持たず、その代わりに保存されたマルチサブユニットシグナル伝達装置ＣＤ３に結合する（Ｃａｌｌ， Ｃｅｌｌ １１１ （２００２）， ９６７− ９７９， Ａｌａｒｃｏｎ， Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｒｅｖ． １９１ （２００３）， ３８−４６， Ｍａｌｉｓｓｅｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｒｅｖ． １９１ （２００３）， ７−２７）。ＴｃＲライゲーションがシグナル伝達装置に直接通じる機構は、Ｔ細胞生物学の根本的な疑問のままである（Ａｌａｒｃｏｎ，上記引用文献； Ｄａｖｉｓ， Ｃｅｌｌ １１０ （２００２）， ２８５−２８７））。持続したＴ細胞応答が、コレセプターの関与、ＴｃＲオリゴマー化及び免疫シナプス中のＴｃＲ−ｐＭＨＣ複合体の高次配列を含むことは明らかなようである（Ｄａｖｉｓ ＆ ｖａｎ ｄｅｒ Ｍｅｒｗｅ， Ｃｕｒｒ． Ｂｉｏｌ． １１ （２００１）， Ｒ２８９−Ｒ２９１， Ｄａｖｉｓ， Ｎａｔ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ４ （２００３）， ２１７− ２２４）。しかし、非常に早いＴｃＲシグナル伝達は、これらの事象の非存在下で起こり、ＣＤ３イプシロン中のリガンドが誘起するコンフォメーション変化を含むかもしれない（Ａｌａｒｃｏｎ，上記引用文献， Ｄａｖｉｓ （２００２），上記引用文献， Ｇｉｌ， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７６ （２００１）， １１１７４−１１１７９， Ｇｉｌ， Ｃｅｌｌ １０９ （２００２）， ９０１ −９１２）。シグナル伝達複合体のイプシロン、ガンマ、デルタ及びゼータサブユニットは互いに会合して、ＣＤ３イプシロン−ガンマヘテロダイマー、ＣＤ３イプシロン−デルタヘテロダイマー及びＣＤ３ゼータ−ゼータホモダイマーを形成する（Ｃａｌｌ， 上記引用文献）。様々な研究は、ＣＤ３分子がアルファベータＴｃＲの正常な細胞表面発現及び通常のＴ細胞発達にとって重要であることを明らかにした（Ｂｅｒｋｈｏｕｔ， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６３ （１９８８）， ８５２８−８５３６， Ｗａｎｇ， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １８８ （１９９８）， １３７５−１３８０， Ｋａｐｐｅｓ， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ７ （１９９５）， ４４１−４４７）。マウスＣＤ３イプシロンガンマヘテロダイマーのエクトドメイン断片の溶液構造は、イプシロンガンマサブユニットが、両方とも、互いに相互作用して異常な側々ダイマーコンフィグレーションを形成するＣ２セットＩｇドメインであることを示した（Ｓｕｎ， Ｃｅｌｌ １０５ （２００１）， ９１３− ９２３）。システインに富んだ軸は、ＣＤ３の二量体化を進めるのに重要な役割を果たすようであるが（Ｓｕ，上記引用文献， Ｂｏｒｒｏｔｏ， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７３ （１９９８）， １２８０７−１２８１６）、ＣＤ３イプシロン及びＣＤ３ガンマの細胞外ドメインによる相互作用は、これらのタンパク質とＴｃＲベータとの集合に十分である（Ｍａｎｏｌｉｏｓ， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２４ （１９９４）， ８４−９２， Ｍａｎｏｌｉｏｓ ＆ Ｌｉ， Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ７３ （１９９５）， ５３２−５３６）。未だ議論の的となっているが、ＴｃＲの優勢な化学量論は、１つのアルファベータＴｃＲ、１つのＣＤ３イプシロンガンマヘテロダイマー、１つのＣＤ３イプシロンデルタヘテロダイマー及び１つのＣＤ３ゼータゼータホモダイマーを含むことが最も可能性がある（Ｃａｌｌ，上記引用文献）。免疫応答におけるヒトＣＤ３イプシロンガンマヘテロダイマーの中心的な役割を仮定して、治療抗体ＯＫＴ３に結合したこの複合体の結晶構造が最近解明された（Ｋｊｅｒ−Ｎｉｅｌｓｅｎ， ＰＮＡＳ １０１， （２００４）， ７６７５−７６８０）。
多くの治療戦略は、ＴｃＲシグナル伝達を標的にしてＴ細胞免疫性を調整し、特に免疫抑制領域で臨床的に広く利用されている抗ヒトＣＤ３モノクローナル抗体（ｍＡｂ）がある。ＣＤ３特異性マウスｍＡｂ ＯＫＴ３は、ヒトへの使用に認可された最初のｍＡｂであり（Ｓｇｒｏ， Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ １０５ （１９９５）， ２３−２９）、移植（Ｃｈａｔｅｎｏｕｄ， Ｃｌｉｎ． Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ ７ （１９９３）， ４２２−４３０， Ｃｈａｔｅｎｏｕｄ， Ｎａｔ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ３ （２００３）， １２３−１３２， Ｋｕｍａｒ， Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ． Ｐｒｏｃ． ３０ （１９９８）， １３５１−１３５２）、１型糖尿病（Ｃｈａｔｅｎｏｕｄ （２００３），上記引用文献）及び乾癬（Ｕｔｓｅｔ， Ｊ． Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ． ２９ （２００２）， １９０７−１９１３）における免疫抑制剤として臨床的に広く使用されている。さらに、抗ＣＤ３ｍＡｂは、部分的なＴ細胞シグナル伝達及びクローンアネルギーを誘起することがある（Ｓｍｉｔｈ， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １８５ （１９９７）， １４１３−１４２２）。ＯＫＴ３は、潜在的なＴ細胞マイトジェン（Ｖａｎ Ｗａｕｖｅ， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １２４ （１９８０）， ２７０８−１８）並びに潜在的なＴ細胞キラー（Ｗｏｎｇ， Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ５０ （１９９０）， ６８３−９）として、文献に記載されてきた。ＯＫＴ３は、時間依存的にこれらの活性の両方を示す。サイトカイン放出につながるＴ細胞の早期活性化に続き、さらにＯＫＴ３を投与すると、公知のＴ細胞機能の全てを後に阻害する。同種移植組織拒絶の低減又はさらには全廃のために治療レジメンにおいて免疫抑制剤としてそのような広い用途をＯＫＴ３が見いだしたのは、この後期のＴ細胞機能の阻害による。
ＯＫＴ３は、急性拒絶反応に主要な役割を果たす全てのＴ細胞の機能を阻害することにより、同種移植組織拒絶を一変させていることが最も確からしい。ＯＫＴ３は、Ｔ細胞（ＴＣＲ）の抗原認識構造に関連しシグナル伝達に必須のヒトＴ細胞の細胞膜中でＣＤ３複合体と反応しその機能を阻害する。ＴＣＲ／ＣＤ３のどのサブユニットがＯＫＴ３と結合するかは、多くの研究のテーマであった。ＴＣＲ／ＣＤ３複合体のイプシロンサブユニットに対するＯＫＴ３の特異性を指摘したエビデンスもいくつかあった（Ｔｕｎｎａｃｌｉｆｆｅ， Ｉｎｔ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １ （１９８９）， ５４６−５０； Ｋｊｅｒ−Ｎｉｅｌｓｅｎ， ＰＮＡＳ １０１， （２００４）， ７６７５−７６８０）。さらなるエビデンスは、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体とのＯＫＴ３の結合には、この複合体の他のサブユニットの存在が必要であることを示している（Ｓａｌｍｅｒｏｎ， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４７ （１９９１）， ３０４７−５２）。
ＣＤ３分子に特異的である他の周知の抗体は、Ｔｕｎｎａｃｌｉｆｆｅ， Ｉｎｔ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １ （１９８９）， ５４６−５０に列記されている。上述のとおり、そのようなＣＤ３特異性抗体は、リンホカイン産生（Ｖｏｎ Ｗｕｓｓｏｗ， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １２７ （１９８１）， １１９７； Ｐａｌａｃｉｏｕｓ， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １２８ （１９８２）， ３３７）、増殖（Ｖａｎ Ｗａｕｖｅ， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １２４ （１９８０）， ２７０８−１８）及びサプレッサーＴ細胞誘起（Ｋｕｎｉｃｋａ， ｉｎ "Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ Ｔｙｐｉｎｇ ＩＩ" １ （１９８６）， ２２３）などの種々のＴ細胞応答を誘起することができる。すなわち、実験条件によって、ＣＤ３特異性モノクローナル抗体は、細胞障害性を阻害することも、誘起することもできる（Ｌｅｅｗｅｎｂｅｒｇ， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １３４ （１９８５）， ３７７０； Ｐｈｉｌｌｉｐｓ， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １３６ （１９８６） １５７９； Ｐｌａｔｓｏｕｃａｓ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７８ （１９８１）， ４５００； Ｉｔｏｈ， Ｃｅｌｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １０８ （１９８７）， ２８３−９６； Ｍｅｎｔｚｅｒ， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １３５ （１９８５）， ３４； Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １５５ （１９８２）， １５７９； Ｃｈｏｉ （２００１）， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ３１， ９４−１０６； Ｘｕ （２０００）， Ｃｅｌｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２００， １６−２６； Ｋｉｍｂａｌｌ （１９９５）， Ｔｒａｎｓｐｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ３， ２１２−２２１）。
当分野に記載されている多くのＣＤ３抗体がＣＤ３複合体のＣＤ３イプシロンサブユニットを認識すると報告されているが、それらのほとんどは、実際は、立体配座エピトープに結合しており、そのためＴＣＲのネイティブコンテクストにおけるＣＤ３イプシロンを認識しているのみである。立体配座エピトープは、一次配列中では分かれているがネイティブタンパク質／抗原中にポリペプチドが折り畳まれる時分子の表面で一緒になる、２つ以上の別々のアミノ酸残基の存在により特徴づけられる（Ｓｅｌａ， （１９６９） Ｓｃｉｅｎｃｅ １６６， １３６５及びＬａｖｅｒ， （１９９０） Ｃｅｌｌ ６１ ， ５５３−６）。当分野に記載されているＣＤ３イプシロン抗体に結合される立体配座エピトープは、２つの群に分けることができる。主要な群では、前記エピトープは、２つのＣＤ３サブユニット、例えばＣＤ３イプシロン鎖及びＣＤ３ガンマ鎖又はＣＤ３デルタ鎖により形成されている。例えば、最も広く使用されているＣＤ３イプシロンモノクローナル抗体ＯＫＴ３、ＷＴ３１、ＵＣＨＴ１、７Ｄ６及びＬｅｕ−４は、ＣＤ３イプシロン鎖により単独にトランスフェクトされた細胞には結合しなかったことが複数の研究で見出された。しかし、これらの抗体は、ＣＤ３イプシロンとＣＤ３ガンマ又はＣＤ３デルタの組み合わせにより二重にトランスフェクトされた細胞を染色した（Ｔｕｎｎａｃｌｉｆｆｅ，上記引用文献； Ｌａｗ， Ｉｎｔ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４ （２００２）， ３８９−４００； Ｓａｌｍｅｒｏｎ， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４７ （１９９１）， ３０４７−５２； Ｃｏｕｌｉｅ， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２１ （１９９１）， １７０３−９）。第２のより小さな群では、立体配座エピトープは、ＣＤ３イプシロンサブユニット自体の中に形成される。この群のメンバーは、例えば変性ＣＤ３イプシロンに対して産出されたｍＡｂ ＡＰＡ１／１である（Ｒｉｓｕｅｎｏ， Ｂｌｏｏｄ １０６ （２００５）， ６０１−８）。ひとまとめにすると、当分野に記載されているＣＤ３イプシロン抗体のほとんどは、ＣＤ３の２つ以上のサブユニット上に位置する立体配座エピトープを認識する。これらのエピトープの三次元構造を形成する別々のアミノ酸残基は、この結果、ＣＤ３イプシロンサブユニット自体の上に位置するか、ＣＤ３イプシロンサブユニットとＣＤ３ガンマ又はＣＤ３デルタなどの他のＣＤ３サブユニットの上に位置することがある。
ＣＤ３抗体に関する他の問題は、多くのＣＤ３抗体が種特異的であると見いだされたことである。他のモノクローナル抗体では一般的に正しいとされているとおり、抗ＣＤ３モノクローナル抗体は、それらの標的分子の高度に特異的な認識により機能する。それらは、標的ＣＤ３分子上の単一の部位又はエピトープのみを認識する。例えば、最も広く使用されキャラクタリゼーションが詳細に行われているＣＤ３複合体に特異的なモノクローナル抗体の１つはＯＫＴ３である。この抗体は、チンパンジーのＣＤ３と反応するが、マカクザルなど他の霊長類のＣＤ３ホモログ又はイヌＣＤ３とは反応しない（Ｓａｎｄｕｓｋｙ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｅｄ． Ｐｒｉｍａｔｏｌ． １５ （１９８６）， ４４１−４５１）。抗ＣＤ３モノクローナル抗体ＵＣＨＴ１もチンパンジーのＣＤ３とは反応性であるが、マカクザルのＣＤ３とは反応しない（発明者らのデータ）。その一方で、マカクザル抗原を認識するが、そのヒト対応物を認識しないモノクローナル抗体の例もある。この群の１例は、マカクザル由来のＣＤ３を対象とするモノクローナル抗体ＦＮ−１８である（Ｕｄａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｅｄ． Ｐｒｉｍａｔｏｌ． ３０ （２００１）， １４１−１４７）。興味深いことに、カニクイザルの約１２％の末梢リンパ球が、マカクザル中のＣＤ３抗原の多形性により、抗アカゲザルＣＤ３モノクローナル抗体（ＦＮ−１８）との反応性を欠くことが見いだされている。Ｕｄａらは、ＦＮ−１８と反応性である動物から誘導されたＣＤ３と比較し、ＦＮ−１８と反応性でないカニクイザルのＣＤ３配列中にある２つのアミノ酸の置換を記載した（Ｕｄａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｍｅｄ Ｐｒｉｍａｔｏｌ． ３２ （２００３）， １０５−１０； Ｕｄａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｍｅｄ Ｐｒｉｍａｔｏｌ． ３３ （２００４）， ３４−７）。
ＣＤ３モノクローナル抗体及びその断片に固有のこの識別能力、すなわち種特異性は、ヒトの疾患を治療するための治療薬としての開発には著しい妨げである。市場の認可を得るためには、どの新規薬剤候補も、厳しい試験を通過しなくてはならない。この試験は、前臨床相と臨床相に分けることができる。後者は、一般的に公知の臨床相Ｉ、ＩＩ及びＩＩＩとしてさらに分かれているが、ヒトの患者に実施され、前者は動物に実施される。前臨床試験の目的は、薬剤候補が望まれる活性を持ち、最も重要なことであるが安全であることを証明することである。動物での安全性及び薬剤候補の見込みのある効力が前臨床試験で確立された場合にのみ、その薬剤候補は、それぞれの規制当局によりヒトへの臨床試験を認可されるであろう。以下の３種の方法で、（ｉ）関連種、すなわち薬剤候補がオルソログ抗原を認識できる種において、（ｉｉ）ヒトの抗原を含むトランスジェニック動物において、及び（ｉｉｉ）動物に存在するオルソログ抗原に結合できる薬剤候補のサロゲートの使用により、薬剤候補の動物での安全性を試験することができる。トランスジェニック動物の限界は、この技術が典型的には齧歯動物に限られることである。齧歯動物と人間の間には生理機能に著しい違いがあり、安全性の結果は容易にヒトに外挿できない。薬剤候補のサロゲートの限界は、実際の薬剤候補に比べて異なる組成物であり、多くの場合使用される動物は先に議論した限界を持つ齧歯動物である。したがって、齧歯動物で作られた前臨床データは、薬剤候補に関して限られた予測力しかない。安全性試験の選択の手法は、関連種、好ましくは下等霊長類の利用である。当分野に記載される人間の治療介入に好適なＣＤ３結合分子の目下の限界は、関連種が高等霊長類、特にチンパンジーであることである。チンパンジーは絶滅危惧種と考えられており、ヒトに似た性質のためそのような動物を薬剤安全性試験に使用することは欧州では禁じられており、他の地域でも非常に制限されている。
本発明は、ヒト及び非チンパンジー霊長類ＣＤ３ε（イプシロン）鎖のエピトープに結合可能な、好ましくはヒトの、第１結合ドメイン並びにヒト及び／又は非チンパンジー霊長類のＥＧＦＲ、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ又はＩｇＥに結合可能な第２結合ドメインを含むポリペプチドに関するが、前記エピトープは配列番号２、４、６又は８からなる群に含まれるアミノ酸配列の一部である。配列番号２、４、６及び８に示される配列並びにその断片は、コンテクスト独立性ＣＤ３エピトープである。
本発明の利点は、ヒト及び非チンパンジー霊長類ＣＤ３ε（イプシロン）鎖に異種間特異性を示す、好ましくはヒトの結合ドメインを含むポリペプチドの提供であり、これは、霊長類におけるこれらの、好ましくはヒトの、結合ドメインの安全性、活性及び／又は薬物動態学的なプロファイルの前臨床評価のために、且つ理想的な形態ではヒトの薬剤として使用できる。同じ分子が、前臨床動物試験並びにヒトでの臨床試験にも使用できる。これにより、種に特異的なサロゲート分子に比べて、動物試験が高度に同等な結果を生みだし、予測力がはるかに増す。本発明において、当分野に記載されるＣＤ３イプシロンの他の公知のエピトープ全てとは対照的に、ＣＤ３複合体のネイティブ環境から取り出された（そして、ＥｐＣＡＭ又は免疫グロブリンＦｃ部などの異種アミノ酸配列に融合した）時にその三次元構造完全性を維持する、ＣＤ３イプシロンの細胞外ドメインのＮ末端１−２７アミノ酸残基ポリペプチド断片が、驚くべきことに確認された。
本発明に提供されるＣＤ３エピトープのコンテクスト独立性は、ＣＤ３イプシロンの最初の２７のＮ末端アミノ酸又はこの２７アミノ酸ストレッチの機能断片に相当する。ＣＤ３エピトープに関連して本願で使用される「コンテクスト独立性」という句は、本願記載の本発明の結合分子／抗体分子の結合が、抗原決定基又はエピトープを取り巻く立体配座、配列又は構造の変化又は修飾につながらないことを意味する。対照的に、従来のＣＤ３結合分子（例えば、国際公開第９９／５４４４０号又は国際公開第０４／１０６３８０号に開示される）により認識されるＣＤ３エピトープは、コンテクスト独立性エピトープのＣＤ３イプシロン鎖Ｃ末端からＮ末端１−２７アミノ酸に局在化するが、その場合、イプシロン鎖の残りの部分に埋め込まれ、イプシロン鎖とＣＤ３ガンマ又はデルタ鎖とのヘテロダイマー化により正しい位置に保持されないと正しいコンフォメーションがとれない。
本願に提供されコンテクスト独立性ＣＤ３エピトープに対して発生した（対象とした）二重特異性結合分子の一部として、抗ＣＤ３結合分子は、Ｔ細胞再分布に関して驚くべき臨床上の改善及びさらに好ましい安全性プロファイルを与える。理論に拘束されないが、ＣＤ３エピトープはコンテクスト独立性であり、ＣＤ３複合体の残りの部分にあまり影響を与えずに自律的で完全なサブドメインを形成するので、本願に提供されるＣＤ３結合分子は、コンテクスト依存性ＣＤ３エピトープを認識する従来のＣＤ３結合分子（国際公開第９９／５４４４０号に提供されている様な分子）よりも、ＣＤ３コンフォメーションに誘起するアロステリック変化が少ない。
二重特異性結合分子の一部として本発明のＣＤ３結合分子のＣＤ３エピトープのコンテクスト独立性は、本発明のＣＤ３結合分子による治療の開始段階におけるより低いＴ細胞再分布に関連し、コンテクスト依存性ＣＤ３エピトープを認識する、当分野に公知の従来のＣＤ３結合分子と比べて、本発明のＣＤ３結合分子の安全性プロファイルをより良好にする。特に、ＣＤ３結合分子による治療の開始段階におけるＴ細胞再分布は、ＣＮＳ有害事象の主な危険因子であるため、コンテクスト依存性ではくコンテクスト独立性のＣＤ３エピトープを認識することにより、本発明のＣＤ３結合分子は、当分野に公知のＣＤ３結合分子に勝り、著しい安全性の利点を有する。従来のＣＤ３結合分子による治療の開始段階におけるＴ細胞再分布に関連したそのようなＣＮＳ有害事象を経験する患者は、通常混乱と失見当職になり、場合によっては尿失禁も患う。混乱は、患者が自身の通常の明晰さのレベルで考えられない、精神状態の変化である。患者は、通常集中が困難となり、思考が不鮮明で不明確であるだけでなく、しばしば著しく遅くなる。従来のＣＤ３結合分子による治療の開始段階におけるＴ細胞再分布に関連したＣＮＳ有害事象を経験する患者は、記憶喪失も患うことがある。多くの場合、混乱により、人及び／又は場所を認識する能力又は時間及び日付が分かる能力が失われる。方角が分からない感覚は混乱には通常のものであり、意志決定能力が損なわれる。従来のＣＤ３結合分子による治療の開始段階におけるＴ細胞再分布に関連したＣＮＳ有害事象は、不明瞭な発語及び／又は言葉を探すことの困難を含むこともある。この障害は、言語の表現及び理解並びに読みとり及び書きとりの両方を損なうことがある。尿失禁の他に、患者によっては、空間識失調及び目眩も、従来のＣＤ３結合分子による治療の開始段階におけるＴ細胞の再分布に関連したＣＮＳ有害事象に加わることがある。
ＣＤ３イプシロンの言及された２７アミノ酸Ｎ末端ポリペプチド断片内の三次元構造の維持は、インビトロでＮ末端ＣＤ３イプシロンポリペプチド断片に、インビボでＴ細胞上のネイティブ（ＣＤ３イプシロンサブユニット）ＣＤ３複合体に同じ結合親和性で結合する、好ましくはヒトの、結合ドメインの生成に使用できる。これらのデータは、本願に記載のＮ末端断片が、インビボで通常存在する構造に類似した三次コンフォメーションを形成していることを強く示している。ＣＤ３イプシロンのＮ末端ポリペプチド断片のアミノ酸１−２７の構造完全性の重要性に関して非常に微妙な試験が実施された。ＣＤ３イプシロンのＮ末端ポリペプチド断片のアミノ酸１−２７の個々のアミノ酸をアラニンに変えて（アラニンスキャニング）、微小な混乱に対するＣＤ３イプシロンのＮ末端ポリペプチド断片のアミノ酸１−２７の感受性を試験した。本発明の二重特異性結合分子の一部としてのＣＤ３特異性抗体分子を使用して、ＣＤ３イプシロンのＮ末端ポリペプチド断片のアミノ酸１−２７のアラニン変異体への結合を試験した（添付される実施例５参照）。断片の正にＮ末端での最初の５つのアミノ酸残基及びＣＤ３イプシロンのＮ末端ポリペプチド断片のアミノ酸１−２７の位置２３及び２５の２つのアミノ酸の個々の変化が、抗体分子の結合に重要であった。残基Ｑ（位置１でのグルタミン）、Ｄ（位置２でのアスパラギン酸）、Ｇ（位置３でのグリシン）、Ｎ（位置４でのアスパラギン）及びＥ（位置５でのグルタミン酸）を含む、位置１〜５の領域のアミノ酸残基をアラニンに置換すると、前記断片に対する、本発明の、好ましくはヒトの、結合分子の結合が無くなった。その一方で、本発明の、好ましくはヒトの、結合分子の少なくともいくつかでは、言及された断片Ｔ（位置２３でのスレオニン）及びＩ（位置２５でのイソロイシン）のＣ末端での２つのアミノ酸残基、は、本発明の、好ましくはヒトの、結合分子への結合エネルギーを低下させた。
予期せぬことに、このように単離された、好ましくはヒトの、結合分子が、ＣＤ３イプシロンのヒトのＮ末端断片だけでなく、新世界猿（マーモセット、カリスリクス・ジャカス（Ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘ ｊａｃｃｈｕｓ）；サグイヌス・オイディプス（Ｓａｇｕｉｎｕｓ ｏｅｄｉｐｕｓ）；サイミリ・シウレウス（Ｓａｉｍｉｒｉ ｓｃｉｕｒｅｕｓ））及び旧世界猿（カニクイザルとしても知られるマカカ・ファシキュラリス（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）；又はアカゲザルとしても知られるマカカ・ムラッタ（Ｍａｃａｃａ ｍｕｌａｔｔａ））を含む種々の霊長類のＣＤ３イプシロンの対応する相同断片も認識することが見いだされた。したがって、本発明のＣＤ３結合分子の多霊長類特異性が検出された。以下の配列分析は、ＣＤ３イプシロンの細胞外ドメインのＮ末端で高度に相同性のある配列ストレッチを、ヒト及び霊長類が共有することを確認した。
ＣＤ３イプシロンに特異的な、好ましくはヒトの結合分子であって、同一分子を前臨床動物試験に、臨床試験にも、さらにヒトの治療にも使用できる結合分子を発生させることが可能であることが本発明において見いだされた。これは、ヒトＣＤ３イプシロンへの結合に加え（おそらくはチンパンジー対応物との遺伝的類似性により）新世界猿及び旧世界猿を含む、非チンパンジー霊長類の前記抗原のホモログにも結合する、好ましくはヒトの結合分子の予期せぬ確認による。以下の実施例に示されるとおり、前記ＣＤ３イプシロン特異的な、好ましくはヒトの、結合分子は、ガン又は免疫疾患を含むが、これらに限定されない種々の疾患に対する治療薬を生成するため、二重特異性単鎖抗体に一体化できる。したがって、サロゲートＣＤ３イプシロン結合ドメイン又は系統発生的に（ヒトから）遠い種での試験のためにそれを含む二重特異性単鎖抗体を構築する必要は消える。結果として、臨床試験でヒトに投与されるよう意図されるのと正に同じ分子を動物の前臨床試験に使用でき、それに続く市場の認可及び治療薬投与にも使用できる。後のヒトへの投与と同じ分子を前臨床動物試験に使用する能力があるので、前臨床動物試験で得られるデータのヒトの場合への適応性が限定される危険が、事実上消え、又は少なくとも大幅に低減する。手短に言うと、ヒトに実際に投与されるであろう分子と同じ分子を動物に使用して前臨床安全性データを得ることは、ヒトの関連するシナリオへのデータの適応性を確実にするために多くをなす。対照的に、サロゲート分子を使用する従来の手法では、前記サロゲート分子は前臨床安全性評価に使用される動物試験システムに分子的に適応させる必要がある。したがって、実際にヒトの治療に使用されるべき分子は、薬物動態パラメータ及び／又は生物的活性の前臨床試験に使用されるサロゲート分子とはその配列が異なり、おそらくは構造も異なり、前臨床動物試験で得られるデータのヒトの場合への適応性／転移性が限定される結果となる。サロゲート分子の使用は、完全に新しいコンストラクトの構築、製造、精製及びキャラクタリゼーションを必要とする。それにより、その分子を得るために追加の開発コスト及び時間がかかる。要するに、ヒトの治療に使用されるべき実際の薬剤に加えサロゲートは別に開発される必要があり、そのため２つの分子の２つの開発ラインが実施されなくてはならない。したがって、本願に記載される異種間特異性を示すヒト結合分子又は抗体系コンストラクトの主な利点は、同一の分子が、ヒトの治療薬のために、及び前臨床動物試験に使用できることである。
本発明のポリペプチドでは、ヒト及び非チンパンジー霊長類のＣＤ３イプシロン鎖のエピトープに結合可能な第１結合ドメインはヒト起源であることが好ましい。
さらに、本発明のヒト結合分子のヒト起源のため、前記結合分子に対する免疫反応の発生は、ヒトの患者への結合分子の投与時に、最大限可能な程度除外される。
本発明の二重特異性結合分子の一部として、好ましくはヒトの、ＣＤ３イプシロン特異性ヒト結合分子の他の主な利点は、種々の霊長類での前臨床試験のためのその適応性である。動物中の薬剤候補の挙動は、理想的には、ヒトへの投与時に予期されるこの薬剤候補の挙動を示さなければならない。その結果、したがって、そのような前臨床試験から得たデータは、一般的にヒトの場合への高度な予測力を当然持つ。しかし、最近のＴＧＮ１４１２（ＣＤ２８モノクローナル抗体）の第Ｉ相臨床試験の悲劇的な結果から分かるように、霊長類の種の中では、ヒトの中と薬剤候補の挙動が異なる。前記抗体の前臨床試験において、カニクイザルで実施された動物試験では有害事象が無いか、限定された有害事象のみが観察されたが、前記抗体の投与時に６人のヒトの患者が多臓器不全を起こした（Ｌａｎｃｅｔ ３６８ （２００６）， ２２０６−７）。これらの望ましくない有害な事象の結果は、前臨床試験を１つの（霊長類）種のみに限定することが十分でないことを示す。本発明のＣＤ３イプシロン特異性ヒト結合分子が、一連の新世界猿及び旧世界猿と結合するという事実は、上記の事例で直面する問題を克服する助けになることもある。したがって、本発明は、ヒトの治療用の薬剤が開発及び試験されている時に、事象における種の差異を最低限にする手段及び方法を提供する。
本発明の二重特異性結合分子の一部としての、好ましくはヒトの、異種間特異性ＣＤ３イプシロン結合ドメインにより、トランスジェニック動物の作製など、ヒトへの投与用の薬剤候補に試験動物を適応させることももはや必要でない。本発明の使用及び方法により異種間特異性を示す、ＣＤ３イプシロン特異的な、好ましくはヒトの、結合分子（又はそれを含む二重特異性単鎖抗体）は、動物の遺伝子操作を全くせずに、非チンパンジー霊長類での前臨床試験に直接使用できる。当業者に周知のように、試験動物が薬剤候補に適応させられる手法では、動物が修飾されているので、前臨床安全性試験で得られる結果の典型性が低く、ヒトのための予測性が低いという危険性を常に帯びている。例えば、トランスジェニック動物では、導入遺伝子によりコードされるタンパク質が高度に過剰発現されることが多い。したがって、このタンパク質抗原に対する抗体の生物的活性に関して得られたデータは、タンパク質の発現がはるかに低くより生理学的なレベルであるヒトに対する予測値において限定されることがある。
異種間特異性を示すＣＤ３イプシロン特異的な、好ましくはヒトの、結合分子（又はそれを含む二重特異性単鎖抗体）を使用するさらなる利点は、絶滅危惧種としてのチンパンジーが動物試験で回避される事実である。チンパンジーは、ヒトに最も近い近縁動物であり、ゲノムシーケンシングデータに基づき最近ヒト科に分類された（Ｗｉｌｄｍａｎ ｅｔ ａｌ．， ＰＮＡＳ １００ （２００３）， ７１８１）。したがって、チンパンジーで得られたデータは、一般的にヒトにとって高度に予測的であると考えられる。しかし、絶滅危惧種としての状況により、医学実験に使用できるチンパンジーの数は高度に制限されている。上述のとおり、したがって、動物試験のためのチンパンジーの維持は、コストがかかり、且つ倫理的にも問題である。本発明のＣＤ３イプシロン特異的な、好ましくはヒトの、結合分子（又はそれを含む二重特異性単鎖抗体）を使用すると、得られる動物試験データの質、すなわち適応性を損なわずに、前臨床試験の間の倫理的な支障及び資金面での負担を避けられる。これに照らして、ＣＤ３イプシロン特異的な、好ましくはヒトの、結合分子（又はそれを含む二重特異性単鎖抗体）の使用は、チンパンジーでの研究の妥当な代替物を与える。
本発明のＣＤ３イプシロン特異的な、好ましくはヒトの、結合分子（又はそれを含む二重特異性単鎖抗体）のさらなる利点は、動物前臨床試験の一部として使用している場合、例えば、薬物動態学動物試験の途中で、複数の血液サンプルを抽出する能力である。複数採血は、ネズミなどの下等動物よりも、非チンパンジー霊長類ではるかに容易に得られる。複数の血液サンプルを抽出すると、本発明の、好ましくはヒトの、結合分子（又は二重特異性単鎖抗体）により誘起される生物的効果を測定するための血液パラメータを連続試験できる。さらに、複数の血液サンプルの抽出により、本願に定義される、好ましくはヒトの、結合分子（又は二重特異性単鎖抗体）の薬物動態学的プロファイルを研究者が評価できるようになる。さらに、血液パラメータに反映されている、前記の、好ましくはヒトの、結合分子（又は二重特異性単鎖抗体）により誘起されるかもしれない潜在的な副作用が、前記抗体の投与の間に抽出された異なる血液サンプルで測定できる。これにより、本願に定義される、好ましくはヒトの、結合分子（又は二重特異性単鎖抗体）の潜在的な毒性プロファイルを測定できる。
本願に定義される、異種間特異性を示す、好ましくはヒトの、結合分子（又は二重特異性単鎖抗体）の利点は、以下のとおり簡単に要約できる。
第１に、前臨床試験に使用される、本願に定義される、好ましくはヒトの、結合分子（又は二重特異性単鎖抗体）は、ヒトの治療に使用される物と同じである。したがって、薬物動態学的な性質及び生物的活性が異なることがある、２つの独立した分子を開発する必要はもはやない。これは、例えば薬物動態学的結果が、例えば議論の的となるサロゲート手法よりも、より直接的にヒトの状況に転移可能で適用可能である点で、非常に有利である。
第２に、ヒトの治療薬を製造するために、本願に定義される、好ましくはヒトの、結合分子（又は二重特異性単鎖抗体）を使用すると、サロゲート手法よりもコスト集約性及び労働集約性が低い。
第３に、本願に定義される、好ましくはヒトの、結合分子（又は二重特異性単鎖抗体）は、１つの霊長類種だけでなく、一連の異なる霊長類種での前臨床試験に使用でき、そのため、霊長類とヒトの間の潜在的な種の差異の危険性を限定できる。
第４に、動物試験のための、絶滅危惧種としてのチンパンジーが避けられる。
第５に、複数の血液サンプルを、広範な薬物動態研究のために抽出できる。
第６に、本発明の好ましい実施形態による、好ましくはヒトの、結合分子のヒト起源のため、ヒトの患者に投与した場合、前記結合分子に対する免疫反応の発生が最低限になる。マウス起源の治療分子に対するヒト−抗ヒト抗体（ＨＡＭＡ）の発生につながる、ヒトでない種、例えばマウスから誘導された薬剤候補に特異的な抗体との免疫応答の誘起が排除される。
「タンパク質」という用語は当分野に周知であり、生物学的化合物を記述する。タンパク質は、１つ以上のアミノ酸鎖（ポリペプチド）を含み、それによりアミノ酸がペプチド結合により互いに結合する。本願での「ポリペプチド」という用語は、３０を超えるアミノ酸からなる、１群の分子を説明する。本発明によると、ポリペプチドの１群は、タンパク質が単一のポリペプチドからなる限り、「タンパク質」を構成する。定義と調和して、「ポリペプチド」という用語は、断片が３０を超えるアミノ酸からなる限り、タンパク質の断片を記述する。ポリペプチドは、ダイマー、トリマーなどのマルチマー及び高次のオリゴマー、すなわち２以上のポリペプチド分子からなるものをさらに形成することもある。そのようなダイマー、トリマーなどを形成するポリペプチド分子は、同一でも、異なっていてもよい。したがって、そのようなマルチマーの対応する高次の構造は、ホモ又はヘテロダイマー、ホモ又はヘテロトリマーなどと呼ばれる。ヘテロマルチマーの一例は抗体分子であり、その天然の形態で、２つの同一のポリペプチド軽鎖及び２つの同一のポリペプチド重鎖からなる。「ポリペプチド」及び「タンパク質」という用語は、例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化などの翻訳後修飾により修飾が実施される、天然修飾ポリペプチド／タンパク質も意味する。そのような修飾は当分野に周知である。
本願では、「ヒト」及び「人間」はホモ・サピエンス（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）を意味する。本願に記載されるコンストラクトの医学的使用に関する限り、ヒトの患者が同じ分子で治療される。
本発明の分子の文脈で使用される「ヒト起源」という用語は、ヒトライブラリーから誘導可能か、又はヒト等価物に相当する構造／配列を有する分子を記述する。したがって、アナログヒト配列に対応するアミノ酸配列を有するタンパク質、例えばヒト生殖細胞配列に対応するフレームワーク中にアミノ酸配列を有する抗体断片は、ヒト起源の分子と理解される。
本願では、「非チンパンジー霊長類」又は「非チンプ霊長類」又はその文法的変形は、チンパンジー以外の任意の霊長類、すなわちチンパンジー属（Ｐａｎ）に属し、アンスロポピテクス・トログロディテス（Ａｎｔｈｒｏｐｏｐｉｔｈｅｃｕｓ ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓ）又はシミア・サティルス（Ｓｉｍｉａ ｓａｔｙｒｕｓ）としてもまた知られる、ボノボ（Ｐａｎ ｐａｎｉｓｃｕｓ）種及びナミチンパンジー（Ｐａｎ ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓ）種を含む動物以外である。「霊長類（ｐｒｉｍａｔｅ）」、「霊長類種」、「霊長類（ｐｒｉｍａｔｅｓ）」又はその文法的変形は、原猿（ｐｒｏｓｉｍｉａｎｓ）及び類人猿（ａｎｔｈｒｏｐｏｉｄｓ）の２つの亜目に分けられ、人間、類人猿（ａｐｅｓ）、猿（ｍｏｎｋｅｙｓ）及びキツネザル（ｌｅｍｕｒｓ）を含む真獣類の目を意味する。具体的には、本願の「霊長類」は、曲鼻猿亜目（Ｓｔｒｅｐｓｉｒｒｈｉｎｉ）（非メガネザル（ｎｏｎ−ｔａｒｓｉｅｒ）原猿）を含み、前記亜目は、キツネザル下目（Ｌｅｍｕｒｉｆｏｒｍｅｓ）（それ自体、コビトキツネザル上科（Ｃｈｅｉｒｏｇａｌｅｏｉｄｅａ）及びキツネザル上科（Ｌｅｍｕｒｏｉｄｅａ）を含む）、アイアイ下目（Ｃｈｉｒｏｍｙｉｆｏｒｍｅｓ）（それ自体、アイアイ科（Ｄａｕｂｅｎｔｏｎｉｉｄａｅ）を含む）及びロリス下目（Ｌｏｒｉｓｉｆｏｒｍｅｓ）（それ自体、ロリス科（Ｌｏｒｉｓｉｄａｅ）及びガラゴ科（Ｇａｌａｇｉｄａｅ）を含む）を含む。本願の「霊長類」は、直鼻猿亜目（Ｈａｐｌｏｒｒｈｉｎｉ）もまた含み、前記亜目は、メガネザル下目（Ｔａｒｓｉｉｆｏｒｍｅｓ）（それ自体、メガネザル科（Ｔａｒｓｉｉｄａｅ）を含む）、真猿下目（Ｓｉｍｉｉｆｏｒｍｅｓ）（それ自体、広鼻小目（Ｐｌａｔｙｒｒｈｉｎｉ）又は新世界猿、及びオナガザル科（Ｃｅｒｃｏｐｉｔｈｅｃｉｄｅａ）を含む狭鼻小目（Ｃａｔａｒｒｈｉｎｉ）又は旧世界猿を含む）を含む。
非チンパンジー霊長類種は、本発明の意味の中で、キツネザル、メガネザル、テナガザル、マーモセット（マーモセット科（Ｃｅｂｉｄａｅ）の新世界猿に属する）又は旧世界猿（オナガザル上科（Ｃｅｒｃｏｐｉｔｈｅｃｏｉｄｅａ）に属する）であると理解されうる。
本願では「旧世界猿」は、オナガザル上科（Ｃｅｒｃｏｐｉｔｈｅｃｏｉｄｅａ）に分類されるあらゆる猿を含み、それ自体、主にアフリカ系であるがアジア及び北アフリカである種々のマカク属を含むオナガザル亜科（Ｃｅｒｃｏｐｉｔｈｅｃｉｎａｅ）；及びアジア属のほとんど及びアフリカコロブスザルも含むコロブス亜科（Ｃｏｌｏｂｉｎａｅ）に再分される。
具体的には、オナガザル亜科の中で、有利な非チンパンジー霊長類は、オナガザル族（Ｃｅｒｃｏｐｉｔｈｅｃｉｎｉ）由来でよく、アレンモンキー属（Ａｌｌｅｎｏｐｉｔｈｅｃｕｓ）内（アレン沼地ザル、アレノピテクス・ニグロビリディス（Ａｌｌｅｎｏｐｉｔｈｅｃｕｓ ｎｉｇｒｏｖｉｒｉｄｉｓ））；コビトグエノン属（Ｍｉｏｐｉｔｈｅｃｕｓ）内（コビトグエノン、ミオピテクス・タラポイン（Ｍｉｏｐｉｔｈｅｃｕｓ ｔａｌａｐｏｉｎ）；ガボン・タラポアン、ミオピテクス・オゴウエンシス（Ｍｉｏｐｉｔｈｅｃｕｓ ｏｇｏｕｅｎｓｉｓ））；パタスモンキー属（Ｅｒｙｔｈｒｏｃｅｂｕｓ）内（パタスモンキー、エリスロセブス・パタス（Ｅｒｙｔｈｒｏｃｅｂｕｓ ｐａｔａｓ））；クロロセブス属（Ｃｈｌｏｒｏｃｅｂｕｓ）内（ミドリザル、クロロセブス・サバセウス（Ｃｈｌｏｒｏｃｅｂｕｓ ｓａｂａｃｅｕｓ））；グリベットモンキー、クロロセブス・アエチオプス（Ｃｈｌｏｒｏｃｅｂｕｓ ａｅｔｈｉｏｐｓ）；ベールマウンテン・ベルベットモンキー、クロロセブス・ドジャムドジャメンシス（Ｃｈｌｏｒｏｃｅｂｕｓ ｄｊａｍｄｊａｍｅｎｓｉｓ）；タンタルスモンキー、クロロセブス・タンタルス（Ｃｈｌｏｒｏｃｅｂｕｓ ｔａｎｔａｌｕｓ）；ベルベットモンキー、クロロセブス・ピゲリスラス（Ｃｈｌｏｒｏｃｅｂｕｓ ｐｙｇｅｒｙｔｈｒｕｓ）；マルブルック、クロロセブス・シノスロス（Ｃｈｌｏｒｏｃｅｂｕｓ ｃｙｎｏｓｕｒｏｓ））；又はオナガザル属（Ｃｅｒｃｏｐｉｔｈｅｃｕｓ）内（ドリアスグエノン又はサロンゴモンキー、セルコピテクス・ドリアス（Ｃｅｒｃｏｐｉｔｈｅｃｕｓ ｄｒｙａｓ）；ダイアナモンキー、セルコピテクス・ダイアナ（Ｃｅｒｃｏｐｉｔｈｅｃｕｓ ｄｉａｎａ）；ロロウェイモンキー、セルコピテクス・ロロウェイ（Ｃｅｒｃｏｐｉｔｈｅｃｕｓ ｒｏｌｏｗａｙ）；オオハナジログエノン、セルコピテクス・ニクチタンス（Ｃｅｒｃｏｐｉｔｈｅｃｕｓ ｎｉｃｔｉｔａｎｓ）；ブルーモンキー、セルコピテクス・ミティス（Ｃｅｒｃｏｐｉｔｈｅｃｕｓ ｍｉｔｉｓ）；シルバーモンキー、セルコピテクス・ドゲッティ（Ｃｅｒｃｏｐｉｔｈｅｃｕｓ ｄｏｇｇｅｔｔｉ）；ゴールデンモンキー、セルコピテクス・カンジチ（Ｃｅｒｃｏｐｉｔｈｅｃｕｓ ｋａｎｄｔｉ）；サイクスモンキー、セルコピテクス・アルボグラリス（Ｃｅｒｃｏｐｉｔｈｅｃｕｓ ａｌｂｏｇｕｌａｒｉｓ）；モナモンキー、セルコピテクス・モナ（Ｃｅｒｃｏｐｉｔｈｅｃｕｓ ｍｏｎａ）；キャンベル・モナモンキー、セルコピテクス・キャンベリ（Ｃｅｒｃｏｐｉｔｈｅｃｕｓ ｃａｍｐｂｅｌｌｉ）；ロウ・モナモンキー、セルコピテクス・ロウイ（Ｃｅｒｃｏｐｉｔｈｅｃｕｓ ｌｏｗｅｉ）；クラウングエノン、セルコピテクス・ポゴニアス（Ｃｅｒｃｏｐｉｔｈｅｃｕｓ ｐｏｇｏｎｉａｓ）；ウォルフグエノン、セルコピテクス・ウォルフィ（Ｃｅｒｃｏｐｉｔｈｅｃｕｓ ｗｏｌｆｉ）；デント・モナモンキー、セルコピテクス・デンティ（Ｃｅｒｃｏｐｉｔｈｅｃｕｓ ｄｅｎｔｉ）；ショウハナジログエノン、セルコピテクス・ペタウリスタ（Ｃｅｒｃｏｐｉｔｈｅｃｕｓ ｐｅｔａｕｒｉｓｔａ）；アカハラグエノン、セルコペテクス・エリスロガスター（Ｃｅｒｃｏｐｉｔｈｅｃｕｓ ｅｒｙｔｈｒｏｇａｓｔｅｒ）；スクラターグエノン、セルコピテクス・スクラテリ（Ｃｅｒｃｏｐｉｔｈｅｃｕｓ ｓｃｌａｔｅｒｉ）；アカミミグエノン、セルコピテクス・エリスロティス（Ｃｅｒｃｏｐｉｔｈｅｃｕｓ ｅｒｙｔｈｒｏｔｉｓ）；クチヒゲグエノン、セルコピテクス・セファス（Ｃｅｒｃｏｐｉｔｈｅｃｕｓ ｃｅｐｈｕｓ）；アカオザル、セルコピテクス・アスカニウス（Ｃｅｒｃｏｐｉｔｈｅｃｕｓ ａｓｃａｎｉｕｓ）；ロエストグエノン、セルコピテクス・ロエスティ（Ｃｅｒｃｏｐｉｔｈｅｃｕｓ ｌｈｏｅｓｔｉ）；プロイッスモンキー、セルコピテクス・プロイッシ（Ｃｅｒｃｏｐｉｔｈｅｃｕｓ ｐｒｅｕｓｓｉ）；サンテイルド・モンキー、セルコピテクス・ソラタス（Ｃｅｒｃｏｐｉｔｈｅｃｕｓ ｓｏｌａｔｕｓ）；ハムリンズモンキー（Ｈａｍｌｙｎ'ｓ ｍｏｎｋｅｙ）又はフクロウグエノン、セルコピテクス・ハムリニ（Ｃｅｒｃｏｐｉｔｈｅｃｕｓ ｈａｍｌｙｎｉ）；ブラッザモンキー、セルコピテクス・ネグレクタス（Ｃｅｒｃｏｐｉｔｈｅｃｕｓ ｎｅｇｌｅｃｔｕｓ））である。
或いは、やはりオナガザル亜科内であるが、ヒヒ族（Ｐａｐｉｏｎｉｎｉ）内の有利な非チンパンジー霊長類は、マカク属（Ｍａｃａｃａ）内（バーバリマカク、マカカ・シルバヌス（Ｍａｃａｃａ ｓｙｌｖａｎｕｓ）；シシオザル、マカカ・シレヌス（Ｍａｃａｃａ ｓｉｌｅｎｕｓ）；ブタオザル又はベルク（Ｂｅｒｕｋ）、マカカ・ネメストリナ（Ｍａｃａｃａ ｎｅｍｅｓｔｒｉｎａ）；キタブタオザル、マカカ・レオニア（Ｍａｃａｃａ ｌｅｏｎｉｎａ）；パガイモンキー又はボッコイ（Ｂｏｋｋｏｉ）、マカカ・パゲンシス（Ｍａｃａｃａ ｐａｇｅｎｓｉｓ）；シブルー島マカク（Ｓｉｂｅｒｕｔ Ｍａｃａｑｕｅ）、マカカ・シベル（Ｍａｃａｃａ ｓｉｂｅｒｕ）；ムーアモンキー、マカカ・マウラ（Ｍａｃａｃａ ｍａｕｒａ）；ウスイロマカク、マカカ・オケレアタ（Ｍａｃａｃａ ｏｃｈｒｅａｔａ）；トンケアンマカク、マカカ・トンケアナ（Ｍａｃａｃａ ｔｏｎｋｅａｎａ）；ヘックモンキー、マカカ・ヘッキ（Ｍａｃａｃａ ｈｅｃｋｉ）；ゴロンタロモンキー、マカカ・ニグリシェンス（Ｍａｃａｃａ ｎｉｇｒｉｓｃｅｎｓ）；スラウェシトサカマカク又はクロザル、マカカ・ニグラ（Ｍａｃａｃａ ｎｉｇｒａ）；シノモルガスサル又はカニクイザル又はオナガザル又はクラ、マカカ・ファシキュラリス（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）；ベニガオザル又はクマザル、マカカ・アークトイデス（Ｍａｃａｃａ ａｒｃｔｏｉｄｅｓ）；アカゲザル、マカク・ムラッタ（Ｍａｃａｃａ ｍｕｌａｔｔａ）；タイワンザル、マカカ・キュクロピス（Ｍａｃａｃａ ｃｙｃｌｏｐｉｓ）；ニホンザル、マカカ・フスカタ（Ｍａｃａｃａ ｆｕｓｃａｔａ）；トクモンキー、マカカ・シニカ（Ｍａｃａｃａ ｓｉｎｉｃａ）；ボンネットモンキー、マカカ・ラディアタ（Ｍａｃａｃａ ｒａｄｉａｔａ）；バーバリーマカク、マカカ・シルバヌス（Ｍａｃａｃａ ｓｙｌｖａｎｍｕｓ）；アッサムモンキー、マカカ・アサメンシス（Ｍａｃａｃａ ａｓｓａｍｅｎｓｉｓ）；チベットマカク又はミルンエドワーズマカク（Ｍｉｌｎｅ−Ｅｄｗａｒｄｓ' Ｍａｃａｑｕｅ）、マカカ・チベタナ（Ｍａｃａｃａ ｔｈｉｂｅｔａｎａ）；アルナチャルモンキー又はムンザラ、マカカ・ムンザラ（Ｍａｃａｃａ ｍｕｎｚａｌａ））；ロフォセブス属（Ｌｏｐｈｏｃｅｂｕｓ）内（ホホジロマンガベイ、ロフォセブス・アルビゲナ（Ｌｏｐｈｏｃｅｂｕｓ ａｌｂｉｇｅｎａ）；ロフォセブス・アルビゲナ・アルビゲナ（Ｌｏｐｈｏｃｅｂｕｓ ａｌｂｉｇｅｎａ ａｌｂｉｇｅｎａ）；ロフォセブス・アルビゲナ・オスマニ（Ｌｏｐｈｏｃｅｂｕｓ ａｌｂｉｇｅｎａ ｏｓｍａｎｉ）；ロフォセブス・アルビゲナ・ジョンストニ（Ｌｏｐｈｏｃｅｂｕｓ ａｌｂｉｇｅｎａ ｊｏｈｎｓｔｏｎｉ）；ブラックマンガベイ、ロフォセブス・アテリムス（Ｌｏｐｈｏｃｅｂｕｓ ａｔｅｒｒｉｍｕｓ）；オプデンボッシュ・マンガベイ（Ｏｐｄｅｎｂｏｓｃｈ'ｓ Ｍａｎｇａｂｅｙ）、ロファセブス・オプデンボッシィ（Ｌｏｐｈｏｃｅｂｕｓ ｏｐｄｅｎｂｏｓｃｈｉ）；ハイランド・マンガベイ、ロファセブス・キプンジ（Ｌｏｐｈｏｃｅｂｕｓ ｋｉｐｕｎｊｉ））；ヒヒ属（Ｐａｐｉｏ）内（マントヒヒ、パピオ・ハマドリアス（Ｐａｐｉｏ ｈａｍａｄｒｙａｓ））；ギニアヒヒ、パピオ・パピオ（Ｐａｐｉｏ ｐａｐｉｏ）；アヌビスヒヒ、パピオ・アヌビス（Ｐａｐｉｏ ａｎｕｂｉｓ）；キイロヒヒ、パピオ・シノセファルス（Ｐａｐｉｏ ｃｙｎｏｃｅｐｈａｌｕｓ）；チャクマヒヒ、パピオ・ウルシヌス（Ｐａｐｉｏ ｕｒｓｉｎｕｓ））；ゲラダヒヒ属（Ｔｈｅｒｏｐｉｔｈｅｃｕｓ）内（ゲラダヒヒ、テロピテクス・ゲラダ（Ｔｈｅｒｏｐｉｔｈｅｃｕｓ ｇｅｌａｄａ））；マンガベイ属（Ｃｅｒｃｏｃｅｂｕｓ）内（スーティ・マンガベイ、セルコセブス・アティス（Ｃｅｒｃｏｃｅｂｕｓ ａｔｙｓ）；セルコセブス・アティス・アティス（Ｃｅｒｃｏｃｅｂｕｓ ａｔｙｓ ａｔｙｓ）；セルコセブス・アティス・ルヌラトゥス（Ｃｅｒｃｏｃｅｂｕｓ ａｔｙｓ ｌｕｎｕｌａｔｕｓ）；シロエリマンガベイ、セルコセブス・トルクアトゥス（Ｃｅｒｃｏｃｅｂｕｓ ｔｏｒｑｕａｔｕｓ）；アジルマンガベイ、セルコセブス・アギリス（Ｃｅｒｃｏｃｅｂｕｓ ａｇｉｌｉｓ）；ゴールデンマンガベイ、セルコセブス・クリソガスター（Ｃｅｒｃｏｃｅｂｕｓ ｃｈｒｙｓｏｇａｓｔｅｒ）；ボウシマンガベイ、セルコセブス・ガレリトゥス（Ｃｅｒｃｏｃｅｂｕｓ ｇａｌｅｒｉｔｕｓ）；サンジェマンガベイ、セルコセブス・サンジェイ（Ｃｅｒｃｏｃｅｂｕｓ ｓａｎｊｅｉ））；又はマンドリル属（Ｍａｎｄｒｉｌｌｕｓ）内（マンドリル、マンドリルス・スフィンクス（Ｍａｎｄｒｉｌｌｕｓ ｓｐｈｉｎｘ）；ドリル、マンドリルス・ロイコファエウス（Ｍａｎｄｒｉｌｌｕｓ ｌｅｕｃｏｐｈａｅｕｓ））由来でよい。
最も好ましいのは、マカカ・ファシキュラリス（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）（カニクイザルとしても知られ、したがって実施例では「カニクイザル」と称される）及びマカカ・ムラッタ（Ｍａｃａｃａ ｍｕｌａｔｔａ）（アカゲザル、「アカゲザル」と称される）である。
コロブス亜科内で、有利な非チンパンジー霊長類は、アフリカ系の群に由来してもよく、コロブス属（Ｃｏｌｏｂｕｓ）内（クロコロブス、コロブス・サタナス（Ｃｏｌｏｂｕｓ ｓａｔａｎａｓ）；アンゴラコロブス、コロブス・アンゴレンシス（Ｃｏｌｏｂｕｓ ａｎｇｏｌｅｎｓｉｓ）；キングコロブス、コロブス・ポリコモス（Ｃｏｌｏｂｕｓ ｐｏｌｙｋｏｍｏｓ）；クマコロブス、コロブス・ベレロサス（Ｃｏｌｏｂｕｓ ｖｅｌｌｅｒｏｓｕｓ）；アビシニアコロブス、コロブス・ゲレザ（Ｃｏｌｏｂｕｓ ｇｕｅｒｅｚａ））；ピリオコロブス属（Ｐｉｌｉｏｃｏｌｏｂｕｓ）内（ウェスタン・アカコロブス、ピリオコロブス・バディウス（Ｐｉｌｉｏｃｏｌｏｂｕｓ ｂａｄｉｕｓ）；ピリオコロブス・バディウス・バディウス（Ｐｉｌｉｏｃｏｌｏｂｕｓ ｂａｄｉｕｓ ｂａｄｉｕｓ）；ピリオコロブス・バディウス・テミンキー（Ｐｉｌｉｏｃｏｌｏｂｕｓ ｂａｄｉｕｓ ｔｅｍｍｉｎｃｋｉｉ）；ピリオコロブス・バディウス・ワルドロネ（Ｐｉｌｉｏｃｏｌｏｂｕｓ ｂａｄｉｕｓ ｗａｌｄｒｏｎａｅ）；ペナントアカコロブス、ピリオコロブス・ペナンティ（Ｐｉｌｉｏｃｏｌｏｂｕｓ ｐｅｎｎａｎｔｉｉ）；ピリオコロブス・ペナンティ・ペナンティ（Ｐｉｌｉｏｃｏｌｏｂｕｓ ｐｅｎｎａｎｔｉｉ ｐｅｎｎａｎｔｉｉ）；ピリオコロブス・ペナンティ・エピエニ（Ｐｉｌｉｏｃｏｌｏｂｕｓ ｐｅｎｎａｎｔｉｉ ｅｐｉｅｎｉ）；ピリオコロブス・ペナンティ・ボウビエリ（Ｐｉｌｉｏｃｏｌｏｂｕｓ ｐｅｎｎａｎｔｉｉ ｂｏｕｖｉｅｒｉ）；プレウス・アカコロブス（Ｐｒｅｕｓｓ'ｓ Ｒｅｄ Ｃｏｌｏｂｕｓ）、ピリオコロブス・プレウシ（Ｐｉｌｉｏｃｏｌｏｂｕｓ ｐｒｅｕｓｓｉ）；トロン・アカコロブス、ピリオコロブス・トロニ（Ｐｉｌｉｏｃｏｌｏｂｕｓ ｔｈｏｌｌｏｎｉ）；中央アフリカ・アカコロブス、ピリオコロブス・フォアイ（Ｐｉｌｉｏｃｏｌｏｂｕｓ ｆｏａｉ）；ピリオコロブス・フォアイ・フォアイ（Ｐｉｌｉｏｃｏｌｏｂｕｓ ｆｏａｉ ｆｏａｉ）；ピリオコロブス・フォアイ・エリオッティ（Ｐｉｌｉｏｃｏｌｏｂｕｓ ｆｏａｉ ｅｌｌｉｏｔｉ）；ピリオコロブス・フォアイ・オウスタレティ（Ｐｉｌｉｏｃｏｌｏｂｕｓ ｆｏａｉ ｏｕｓｔａｌｅｔｉ）；ピリオコロブス・フォアイ・セムリキエンシス（Ｐｉｌｉｏｃｏｌｏｂｕｓ ｆｏａｉ ｓｅｍｌｉｋｉｅｎｓｉｓ）；ピリオコロブス・フォアイ・パルメンティエロルム（Ｐｉｌｉｏｃｏｌｏｂｕｓ ｆｏａｉ ｐａｒｍｅｎｔｉｅｒｏｒｕｍ）；ウガンダ・アカコロブス、ピリオコロブス・テフロスケルス（Ｐｉｌｉｏｃｏｌｏｂｕｓ ｔｅｐｈｒｏｓｃｅｌｅｓ）；ウジングワ・アカコロブス、ピリオコロブス・ゴロドノルム（Ｐｉｌｉｏｃｏｌｏｂｕｓ ｇｏｒｄｏｎｏｒｕｍ）；ザンジバル・アカコロブス、ピリオコロブス・キルキ（Ｐｉｌｉｏｃｏｌｏｂｕｓ ｋｉｒｋｉｉ）；タナリバーアカコロブス、ピリオコロブス・ルフォミトラトゥス（Ｐｉｌｉｏｃｏｌｏｂｕｓ ｒｕｆｏｍｉｔｒａｔｕｓ））；又はプロコロブス属（Ｐｒｏｃｏｌｏｂｕｓ）内（オリーブコロブス、ポロコロブス・ベラス（Ｐｒｏｃｏｌｏｂｕｓ ｖｅｒｕｓ））でよい。
コロブス亜科内で、有利な非チンパンジー霊長類は、或いは、ラングール（Ｌａｎｇｕｒ（ｌｅａｆ ｍｏｎｋｅｙ））群由来でもよく、ラングール属（Ｓｅｍｎｏｐｉｔｈｅｃｕｓ）内（ネパール・グレイラングール、センノピテクス・スキスタケウス（Ｓｅｍｎｏｐｉｔｈｅｃｕｓ ｓｃｈｉｓｔａｃｅｕｓ）；カシミール・グレイラングール、センノピテクス・アジャクス（Ｓｅｍｎｏｐｉｔｈｅｃｕｓ ａｊａｘ）；タライ・グレイラングール、センノピテクス・ヘクター（Ｓｅｍｎｏｐｉｔｈｅｃｕｓ ｈｅｃｔｏｒ）；ハヌマンラングール、センノピテクス・エンテラス（Ｓｅｍｎｏｐｉｔｈｅｃｕｓ ｅｎｔｅｌｌｕｓ）；クロアシラングール（Ｂｌａｃｋ−Ｆｏｏｔｅｄ Ｇｒａｙ Ｌａｎｇｕｒ）、センノピテクス・ヒュポレウコス（Ｓｅｍｎｏｐｉｔｈｅｃｕｓ ｈｙｐｏｌｅｕｃｏｓ）；南部平野グレイラングール（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｐｌａｉｎｓ Ｇｒａｙ Ｌａｎｇｕｒ）、センノピテクス・デゥスミエリ（Ｓｅｍｎｏｐｉｔｈｅｃｕｓ ｄｕｓｓｕｍｉｅｒｉ）；タフテッド・グレイラングール（Ｔｕｆｔｅｄ Ｇｒａｙ Ｌａｎｇｕｒ）、センノピテクス・プリアム（Ｓｅｍｎｏｐｉｔｈｅｃｕｓ ｐｒｉａｍ））；Ｔ．ベツルス（Ｔ． ｖｅｔｕｌｕｓ）群又はトラキピテクス属（Ｔｒａｃｈｙｐｉｔｈｅｃｕｓ）内（カオムラサキラングール、トラキピテクス・ベツルス（Ｔｒａｃｈｙｐｉｔｈｅｃｕｓ ｖｅｔｕｌｕｓ）；ニルギリラングール、トラキピテクス・ジョーニ（Ｔｒａｃｈｙｐｉｔｈｅｃｕｓ ｊｏｈｎｉｉ））；トラキピテクス属のＴ．クリスタトゥス（Ｔ．ｃｒｉｓｔａｔｕｓ）群内（ジャワ・ルトン、トラキピテクス・アウラトゥス（Ｔｒａｃｈｙｐｉｔｈｅｃｕｓ ａｕｒａｔｕｓ）；シルバーリーフモンキー又はシルバー・ルトン、トラキピテクス・クリスタトゥス（Ｔｒａｃｈｙｐｉｔｈｅｃｕｓ ｃｒｉｓｔａｔｕｓ）；インドシナ・ルトン、トラキピテクス・ジャーマイニ（Ｔｒａｃｈｙｐｉｔｈｅｃｕｓ ｇｅｒｍａｉｎｉ）；テナセリム・ルトン、トラキピテクス・バーベイ（Ｔｒａｃｈｙｐｉｔｈｅｃｕｓ ｂａｒｂｅｉ））；トラキピテクス属のＴ．オブスキュルス（Ｔ．ｏｂｓｃｕｒｕｓ）群内（ダスキー・リーフモンキー又はスペクタクルリーフモンキー、トラキピテクス・オブスキュラス（Ｔｒａｃｈｙｐｉｔｈｅｃｕｓ ｏｂｓｃｕｒｕｓ）；ファイレ・リーフモンキー、トラキピテクス・ファイレイ（Ｔｒａｃｈｙｐｉｔｈｅｃｕｓ ｐｈａｙｒｅｉ））；トラキピテクス属のＴ．ピレアトゥス（Ｔ．ｐｉｌｅａｔｕｓ）群内（ボウシラングール、トラキピテクス・ピレアトゥス（Ｔｒａｃｈｙｐｉｔｈｅｃｕｓ ｐｉｌｅａｔｕｓ）；ショートリッジ・ラングール、トラキピテクス・ショートリジェイ（Ｔｒａｃｈｙｐｉｔｈｅｃｕｓ ｓｈｏｒｔｒｉｄｇｅｉ）；ゴールデンラングール、トラキピテクス・ギー（Ｔｒａｃｈｙｐｉｔｈｅｃｕｓ ｇｅｅｉ））；トラキピテクス属のＴ．フランコイシ（Ｔ．ｆｒａｎｃｏｉｓｉ）群内（フランソワ・ルトン、トラキピテクス・フランコイシ（Ｔｒａｃｈｙｐｉｔｈｅｃｕｓ ｆｒａｎｃｏｉｓｉ）；ハティン・ラングール、トラキピテクス・ハティンヘンシス（Ｔｒａｃｈｙｐｉｔｈｅｃｕｓ ｈａｔｉｎｈｅｎｓｉｓ）；ハクトウラングール、トラキピテクス・ポリオセファラス（Ｔｒａｃｈｙｐｉｔｈｅｃｕｓ ｐｏｌｉｏｃｅｐｈａｌｕｓ）；ラオス・ラングール、トラキピテクス・ラオタム（Ｔｒａｃｈｙｐｉｔｈｅｃｕｓ ｌａｏｔｕｍ）；コシジロラングール、トラキピテクス・デラコーリ（Ｔｒａｃｈｙｐｉｔｈｅｃｕｓ ｄｅｌａｃｏｕｒｉ）；インドシナ・クロラングール、トラキピテクス・エベヌゥス（Ｔｒａｃｈｙｐｉｔｈｅｃｕｓ ｅｂｅｎｕｓ））；又はリーフモンキー属（Ｐｒｅｓｂｙｔｉｓ）内（クロカンムリリーフモンキー、プレスビティス・メラロフォス（Ｐｒｅｓｂｙｔｉｓ ｍｅｌａｌｏｐｈｏｓ）；シマコノハザル、プレスビティス・フェモラリス（Ｐｒｅｓｂｙｔｉｓ ｆｅｍｏｒａｌｉｓ）；サラワク・スリリ（Ｓａｒａｗａｋ Ｓｕｒｉｌｉ）、プレスビティス・クリソメラス（Ｐｒｅｓｂｙｔｉｓ ｃｈｒｙｓｏｍｅｌａｓ）；シロモモ・スリリ（Ｗｈｉｔｅ−ｔｈｉｇｈｅｄ Ｓｕｒｉｌｉ）、プレスビティス・シアメンシス（Ｐｒｅｓｂｙｔｉｓ ｓｉａｍｅｎｓｉｓ）；シロビタイ・スリリ（Ｗｈｉｔｅ−ｆｒｏｎｔｅｄ Ｓｕｒｉｌｉ）、プレスビティス・フロンタタ（Ｐｒｅｓｂｙｔｉｓ ｆｒｏｎｔａｔａ）；ジャワ・スリリ（Ｊａｖａｎ Ｓｕｒｉｌｉ）、プレスビティス・コマタ（Ｐｒｅｓｂｙｔｉｓ ｃｏｍａｔａ）；トーマスラングール、プレスビティス・トマシ（Ｐｒｅｓｂｙｔｉｓ ｔｈｏｍａｓｉ）；ホースラングール、プレスビティス・ホセイ（Ｐｒｅｓｂｙｔｉｓ ｈｏｓｅｉ）；クリイロ・リーフモンキー、プレスビティス・ルビクンダ（Ｐｒｅｓｂｙｔｉｓ ｒｕｂｉｃｕｎｄａ）；オナガラングール又はジョジャ（Ｊｏｊａ）、プレスビティス・ポテンチアニ（Ｐｒｅｓｂｙｔｉｓ ｐｏｔｅｎｚｉａｎｉ）；ナツナ島スリリ（Ｎａｔｕｎａ Ｉｓｌａｎｄ Ｓｕｒｉｌｉ）、プレスビティス・ナツナエ（Ｐｒｅｓｂｙｔｉｓ ｎａｔｕｎａｅ））でよい。
コロブス亜科内で、有利な非チンパンジー霊長類は、或いは、シシバナ（Ｏｄｄ−Ｎｏｓｅｄ）群由来でもよく、ドゥクモンキー属（Ｐｙｇａｔｈｒｉｘ）内（アカアシドゥクモンキー、ピガスリクス・ネマエウス（Ｐｙｇａｔｈｒｉｘ ｎｅｍａｅｕｓ）；クロアシドゥクモンキー、ピガスリクス・ニグリペス（Ｐｙｇａｔｈｒｉｘ ｎｉｇｒｉｐｅｓ）；ハイイロアシドゥクモンキー、ピガスリクス・シネレア（Ｐｙｇａｔｈｒｉｘ ｃｉｎｅｒｅａ））；シシバナザル属（Ｒｈｉｎｏｐｉｔｈｅｃｕｓ）内（キンシコウ、リノピテクス・ロクセラーナ（Ｒｈｉｎｏｐｉｔｈｅｃｕｓ ｒｏｘｅｌｌａｎａ）；クロキンシコウ、リノピテクス・ビエティ（Ｒｈｉｎｏｐｉｔｈｅｃｕｓ ｂｉｅｔｉ）；ハイイロシシバナザル、リノピテクス・ブレリチ（Ｒｈｉｎｏｐｉｔｈｅｃｕｓ ｂｒｅｌｉｃｈｉ）；トンキンシシバナザル、リノピテクス・アバンキュラス（Ｒｈｉｎｏｐｉｔｈｅｃｕｓ ａｖｕｎｃｕｌｕｓ））；テングザル属（Ｎａｓａｌｉｓ）内（テングザル、ナサリス・ラバトゥス（Ｎａｓａｌｉｓ ｌａｒｖａｔｕｓ））；又はコバナテングザル属（Ｓｉｍｉａｓ）内（メンタウェーコバナテングザル、シミアス・コンコラー（Ｓｉｍｉａｓ ｃｏｎｃｏｌｏｒ））でよい。
本願での用語「マーモセット」はマーモセット属（Ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘ）内の任意の新世界ザルを意味し、例えば、マーモセット亜属（原文のまま）の大西洋マーモセットに属するもの（コモンマーモセット、カリスリクス（カリスリクス）ジャカス（Ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘ（Ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘ）ｊａｃｃｈｕｓ）；クロミミマーモセット、カリスリクス（カリスリクス）ペニシラータ（Ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘ（Ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘ）ｐｅｎｉｃｉｌｌａｔａ）；クールマーモセット、カリスリクス（カリスリクス）クーリ（Ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘ（Ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘ）ｋｕｈｌｉｉ）；ジョフロワマーモセット、カリスリクス（カリスリクス）ジョフロイ（Ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘ（Ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘ）ｇｅｏｆｆｒｏｙｉ）；キクガシラコモンマーモセット、カリスリクス（カリスリクス）フラビセプス（Ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘ（Ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘ）ｆｌａｖｉｃｅｐｓ）；ミミナガコモンマーモセット、カリスリクス（カリスリクス）アウリタ（Ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘ（Ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘ）ａｕｒｉｔａ））；ミコ亜属（Ｍｉｃｏ）のアマゾンマーモセットに属するもの（リオアカリマーモセット、カリスリクス（ミコ）アカリエンシス（Ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘ（Ｍｉｃｏ）ａｃａｒｉｅｎｓｉｓ）；マニコアマーモセット（Ｍａｎｉｃｏｒｅ Ｍａｒｍｏｓｅｔ）、カリスリクス（ミコ）マニコレンシス（Ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘ（Ｍｉｃｏ）ｍａｎｉｃｏｒｅｎｓｉｓ）；シルバーマーモセット、カリスリクス（ミコ）アルゲンタタ（Ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘ（Ｍｉｃｏ）ａｒｇｅｎｔａｔａ）；ホワイトマーモセット、カリスリクス（ミコ）ロイシペ（Ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘ（Ｍｉｃｏ）ｌｅｕｃｉｐｐｅ）；エミリアマーモセット（Ｅｍｉｌｉａ'ｓ Ｍａｒｍｏｓｅｔ）、カリスリクス（ミコ）エミリアエ（Ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘ（Ｍｉｃｏ）ｅｍｉｌｉａｅ）；クロテマーモセット、カリスリクス（ミコ）ニグリセプス（Ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘ（Ｍｉｃｏ）ｎｉｇｒｉｃｅｐｓ）；マルカマーモセット（Ｍａｒｃａ'ｓ Ｍａｒｍｏｓｅｔ）、カリスリクス（ミコ）マルカイ（Ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘ（Ｍｉｃｏ）ｍａｒｃａｉ）；オグロマーモセット、カリスリクス（ミコ）メラヌラ（Ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘ（Ｍｉｃｏ）ｍｅｌａｎｕｒａ）；サンタレムマーモセット、カリスリクス（ミコ）フメラリフェラ（Ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘ（Ｍｉｃｏ）ｈｕｍｅｒａｌｉｆｅｒａ）；マウエスマーモセット（Ｍａｕｅｓ Ｍａｒｍｏｓｅｔ）、カリスリクス（ミコ）マウエシ（Ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘ（Ｍｉｃｏ）ｍａｕｅｓｉ）；キンシロフサミミマーモセット、カリスリクス（ミコ）クリソロイカ（Ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘ（Ｍｉｃｏ）ｃｈｒｙｓｏｌｅｕｃａ）；フサミミマーモセット、カリスリクス（ミコ）インテルメディア（Ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘ（Ｍｉｃｏ）ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）；サテアマーモセット（Ｓａｔｅｒｅ Ｍａｒｍｏｓｅｔ）、カリスリクス（ミコ）サテレイ（Ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘ（Ｍｉｃｏ）ｓａｔｅｒｅｉ）；カリベラ亜属（Ｃａｌｌｉｂｅｌｌａ）に属するルースマレン・ドワーフマーモセット（Ｒｏｏｓｍａｌｅｎｓ' Ｄｗａｒｆ Ｍａｒｍｏｓｅｔ）、カリスリクス（カリベラ）ヒュミリス（Ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘ（Ｃａｌｌｉｂｅｌｌａ）ｈｕｍｉｌｉｓ）；又はセブエラ亜属（Ｃｅｂｕｅｌｌａ）に属するピグミーマーモセット、カリスリクス（セブエラ）ピグマエア（Ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘ（Ｃｅｂｕｅｌｌａ）ｐｙｇｍａｅａ）を意味する。
新世界ザルの他の属は、タマリン属（Ｓａｇｕｉｎｕｓ）のタマリン（サグイヌス・オイディプス（Ｓ．ｏｅｄｉｐｕｓ）群、サグイヌス・ミダス（Ｓ．ｍｉｄａｓ）群、サグイヌス・ニグロコリス（Ｓ．ｎｉｇｒｉｃｏｌｌｉｓ）群、サグイヌス・ミスタックス（Ｓ．ｍｙｓｔａｘ）群、サグイヌス・ビコラー（Ｓ．ｂｉｃｏｌｏｒ）群及びサグイヌス・イヌスタス（Ｓ．ｉｎｕｓｔｕｓ）群を含む）及びリスザル属（Ｓａｉｍｉｒｉ）のリスザル（例えば、サイミリ・シウレウス（Ｓａｉｍｉｒｉ ｓｃｉｕｒｅｕｓ）、サイミリ・オエルステディ（Ｓａｉｍｉｒｉ ｏｅｒｓｔｅｄｉｉ）、サイミリ・ウストゥス（Ｓａｉｍｉｒｉ ｕｓｔｕｓ）、サイミリ・ボルビエンシス（Ｓａｉｍｉｒｉ ｂｏｌｉｖｉｅｎｓｉｓ）、サイミリ・バンゾリニ（Ｓａｉｍｉｒｉ ｖａｎｚｏｌｉｎｉ）を含む。
「結合ドメイン」という用語は、本発明に関連して、ある標的構造／抗原／エピトープに特異的に結合／相互作用する、ポリペプチドのドメインを特徴づける。したがって、結合ドメインは、「抗原−相互作用部位」である。「抗原−相互作用部位」という用語は、本発明によると、特定の抗原又は抗原の特定の基、例えば異なる種における同一の抗原と特異的に相互作用できる、ポリペプチドのモチーフを定義する。前記結合／相互作用は、「特異的認識」を定義するとも理解される。「特異的に認識する」という用語は、本発明によると、抗体分子が、抗原、例えば本願に定義されるヒトＣＤ３抗原の、少なくとも２つの、好ましくは少なくとも３つの、より好ましくは少なくとも４つのアミノ酸と特異的に相互作用し、且つ／又はそれらと結合可能であることを意味する。そのような結合は、「鍵と鍵穴の原理」の特異性により例示することができる。したがって、結合ドメインのアミノ酸配列及び抗原における特異的なモチーフが、その一次、二次及び三次構造の結果として、並びに前記構造の二次修飾の結果として、互いを結合させる。抗原相互作用部位とその特異的な抗原との特異的な相互作用は、抗原に対する前記部位の単純な結合も起こすことがある。さらに、抗原相互作用部位とその特異的な抗原との特異的な相互作用は、或いは、抗原のコンフォメーションの変化の誘起、抗原のオリゴマー化などにより、シグナルの開始となることもある。本発明と調和する結合ドメインの好ましい例は抗体である。結合ドメインは、モノクローナル抗体でもポリクローナル抗体でもよく、或いはモノクローナル又はポリクローナル抗体から誘導されていることがある。
「抗体」という用語は、その誘導体又は機能性断片であって、結合特異性を未だ保持するものを含む。抗体の製造の技術は、当分野に周知であり、例えば、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ "Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ"， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， １９８８及びＨａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ "Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ" Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， １９９９に記載されている。「抗体」という用語は、異なるクラス（すなわち、ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＤ及びＩｇＥ）及びサブクラス（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２など）の免疫グロブリン（Ｉｇ）も含む。これらの抗体は、例えば、本発明のポリペプチド又は融合タンパク質の免疫沈降法、アフィニティ精製及び免疫局在化並びに、例えば、組換え原核生物或いは真核細胞又は真核生物の培養においてそのようなポリペプチドの存在及び量をモニタリングするために使用できる。
「抗体」という用語の定義は、キメラ、単鎖及びヒト化抗体並びに抗体断片、とりわけＦａｂ断片などの実施形態も含む。抗体断片又は誘導体は、Ｆ（ａｂ'）2、Ｆｖ、ｓｃＦｖ断片又は単一ドメイン抗体、単一可変ドメイン抗体又は他のＶ領域又はドメインとは独立に抗原又はエピトープと特異的に結合するＶＨ又はＶＬのことがある、１つの可変ドメインのみを含む免疫グロブリン単一可変ドメインをさらに含む。例えば、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ （１９８８） ａｎｄ （１９９９）の上記引用文献を参照されたい。そのような免疫グロブリン単一可変ドメインは、単離された抗体単一可変ドメインポリペプチドのみでなく、抗体単一可変ドメインポリペプチド配列の１つ以上のモノマーを含むより大きなポリペプチドも包含する。
そのような抗体及び／又は断片の製造には、種々の手順が当分野に公知であり使用することができる。例えば、（抗体）誘導体は、ペプチドミメティックスにより製造できる。さらに、単鎖抗体の製造のために記載された技術（中でも米国特許第４，９４６，７７８号を参照されたい）を適応して、選択されたポリペプチド（複数可）に特異的な単鎖抗体を製造できる。また、トランスジェニック動物を使用して、本発明のポリペプチド及び融合タンパク質に特異的なヒト化抗体を発現できる。モノクローナル抗体の調製には、連続継代性細胞株により産生される抗体を提供するどのような技術も利用できる。そのような技術の例には、ハイブリドーマ技術（Ｋoｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ Ｎａｔｕｒｅ ２５６ （１９７５）， ４９５−４９７）、トリオーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒ， Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ ４ （１９８３）， ７２）及びヒトモノクローナル抗体を製造する（Ｃｏｌｅ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ， Ａｌａｎ Ｒ． Ｌｉｓｓ， Ｉｎｃ． （１９８５）， ７７−９６）ＥＢＶハイブリドーマ技術がある。ＢＩＡＣｏｒｅシステムに使用されている表面プラズモン共鳴を利用して、ＣＤ３イプシロンなどの、標的ポリペプチドのエピトープに結合するファージ抗体の効率を高めることができる（Ｓｃｈｉｅｒ， Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ ７ （１９９６）， ９７−１０５； Ｍａｌｍｂｏｒｇ， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ １８３ （１９９５）， ７−１３）。本発明の文脈において、「抗体」という用語が、本願中で以下に記載する通りホスト中に発現される抗体コンストラクト、例えば、とりわけウイルス又はプラスミドベクターを介してトランスフェクト及び／又は形質導入される抗体コンストラクトを含むことも想定される。
本発明により使用される「特異的な相互作用」という用語は、結合分子により結合されるものと類似の構造を持ち、対象とするポリペプチドと同じ細胞により発現されるポリペプチドと、結合（ドメイン）分子が、公差反応しないか、又は著しく公差反応しないことを意味する。調査している結合分子パネルの公差反応性を、例えば、従来の条件下で結合分子の前記パネルの結合を評価することにより試験できる（例えば、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ， Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， １９８８及びＵｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， １９９９を参照されたい）。結合ドメインと特異的な抗原との特異的な相互作用の例は、リガンドとそのレセプターとの特異性を含む。そのような定義は、特にその特異的なレセプターとの結合時にシグナルを誘起するリガンドの相互作用を含む。前記定義により特に構成される、前記相互作用の例は、抗体の結合ドメイン（抗原結合部位）との抗原決定基（エピトープ）との相互作用である。
本願での「異種間特異性」又は「種間特異性」という用語は、本願に記載される結合ドメインの、ヒト及び非チンパンジー霊長類における同じ標的分子への結合を意味する。例えば、「異種間特異性」又は「種間特異性」は、異なる種に発現される同じ分子Ｘ以外の分子に対してではなく、同じ分子Ｘに対する種間反応性であると理解されたい。非チンパンジー霊長類ＣＤ３イプシロン、例えばマカクザルＣＤ３イプシロンに対する、例えばヒトＣＤ３イプシロンを認識するモノクローナル抗体の異種間特異性は、例えば、ＦＡＣＳ分析により測定できる。ＦＡＣＳ分析は、ヒト及び非チンパンジー霊長類ＣＤ３イプシロン抗原をそれぞれ発現するヒト及び非チンパンジー霊長類細胞、例えばマカクザル細胞に対する結合に関して、それぞれのモノクローナル抗体を試験する方法で実施される。適当なアッセイは、以下の実施例に示される。
本願では、ＣＤ３イプシロンは、Ｔ細胞レセプターの一部として発現された分子を意味し、従来技術で典型的にそれに属する意味を有する。ヒトでは、公知の全てのＣＤ３サブユニット、例えば、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３ゼータ、ＣＤ３アルファ及びＣＤ３ベータの個別又は独立に組み合わされた形態を包含する。本願で言及される非チンパンジー霊長類ＣＤ３抗原は、例えば、マカカ・ファシキュラリスＣＤ３及びマカカ・ムラッタＣＤ３である。マカカ・ファシキュラリスでは、それはＣＤ３イプシロンＦＮ−１８陰性及びＣＤ３イプシロンＦＮ−１８陽性、ＣＤ３ガンマ及びＣＤ３デルタを包含する。マカカ・ムラッタでは、それはＣＤ３イプシロン、ＣＤ３ガンマ及びＣＤ３デルタを包含する。好ましくは、本願で使用される前記ＣＤ３は、ＣＤ３イプシロンである。
ヒトＣＤ３イプシロンは、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０００７３３に示されており、配列番号１を含む。ヒトＣＤ３ガンマは、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００００７３に示されている。ヒトＣＤ３デルタは、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０００７３２に示されている。
マカカ・ファシキュラリスのＣＤ３イプシロン「ＦＮ−１８陰性」（すなわち、上述の多形性のためモノクローナル抗体ＦＮ−１８に認識されないＣＤ３イプシロン）は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢ０７３９９４に示されている。
マカカ・ファシキュラリスのＣＤ３イプシロン「ＦＮ−１８陽性」（すなわち、モノクローナル抗体ＦＮ−１８に認識されるＣＤ３イプシロン）は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢ０７３９９３に示されている。マカカ・ファシキュラリスのＣＤ３ガンマは、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢ０７３９９２に示されている。マカカ・ファシキュラリスのＣＤ３デルタは、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢ０７３９９１に示されている。
マカカ・ムラッタのそれぞれのＣＤ３イプシロン、ガンマ及びデルタホモログの核酸配列及びアミノ酸配列は、当分野に記載されている組換え技術により同定及び単離できる（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ； Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， ３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ ２００１）。これは、本願に定義される他の非チンパンジー霊長類のＣＤ３イプシロン、ガンマ及びデルタホモログにも、必要な変更を加えて当てはまる。カリスリクス・ジャカス、サイミリ・シウレウス及びサグイヌス・オイディプスのアミノ酸配列の同定は、添付する実施例に記載されている。カリスリクス・ジャカスのＣＤ３イプシロンの細胞外ドメインのアミノ酸配列は配列番号３に示されており、サグイヌス・オイディプスの配列は配列番号５に、サイミリ・シウレウスの配列は配列番号７に示されている。
上記のことと調和して、「エピトープ」という用語は、上記で定義された結合分子により特異的に結合／同定される抗原決定基を意味する。結合ドメイン又は分子は、標的構造に特有な、立体配座エピトープ又は連続エピトープ、例えばヒト及び非チンパンジー霊長類ＣＤ３イプシロン鎖と特異的に結合／相互作用することができる。立体配座エピトープ又は不連続エピトープは、一次配列中では分かれているがポリペプチドがネイティブタンパク質／抗原中に折り畳まれる時分子の表面上で一緒になる２つ以上の別々なアミノ酸残基の存在により、ポリペプチド抗原のために特徴づけられる（Ｓｅｌａ， （１９６９） Ｓｃｉｅｎｃｅ １６６， １３６５及びＬａｖｅｒ， （１９９０） Ｃｅｌｌ ６１ ， ５５３−６）。
エピトープに寄与する２つ以上の別々なアミノ酸残基は、１つ以上のポリペプチド鎖（複数可）の別々なセクションに存在する。これらの残基は、ポリペプチド鎖（複数可）が三次元構造中に折り畳まれる時分子の表面上で一緒になり、エピトープを構成する。対照的に、連続エピトープ又は直線エピトープは、ポリペプチド鎖の単一の直線セグメントに存在する２つ以上の別々のアミノ酸残基からなる。本発明の中では、「コンテクスト依存性」ＣＤ３エピトープは、前記エピトープのコンフォメーションを意味する。ＣＤ３のイプシロン鎖に局在化する、そのようなコンテクスト依存性エピトープは、イプシロン鎖の残りの部分に埋め込まれイプシロン鎖とＣＤ３ガンマ又はデルタ鎖とのヘテロダイマー化により正しい位置に保持されないと、その正しいコンフォメーションがとれない。対照的に、本願に提供されるコンテクスト独立性ＣＤ３エピトープは、ＣＤ３イプシロンのＮ末端１−２７アミノ酸残基ポリペプチド又はその機能性断片を意味する。このＮ末端１−２７アミノ酸残基ポリペプチド又はその機能性断片は、ＣＤ３複合体中でそのネイティブ環境から出される時、その三次元構造完全性及び正しいコンフォメーションを維持する。ＣＤ３イプシロンの細胞外ドメインの一部である、Ｎ末端１−２７アミノ酸残基ポリペプチド又はその機能性断片のコンテクスト独立性は、国際公開第２００４／１０６３８０号におけるヒト結合分子の調製方法に関して記載されているＣＤ３イプシロンのエピトープとは完全に異なるエピトープである。前記方法は、単独で発現したリコンビナントＣＤ３イプシロンを使用した。この単独で発現したリコンビナントＣＤ３イプシロンのコンフォメーションは、その天然形態で採り入れられたものとは異なり、すなわちＴＣＲ／ＣＤ３複合体のＣＤ３イプシロンサブユニットが、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体のＣＤ３デルタ又はＣＤ３ガンマサブユニットとの非共有結合複合体の一部として存在する形態である。そのような単独で発現したリコンビナントＣＤ３イプシロンタンパク質が、抗体ライブラリーから抗体を選択するための抗原として使用される場合、この抗原に特異的な抗体はライブラリーから同定されるが、そのようなライブラリーは自己抗原（ｓｅｌｆ−ａｎｔｉｇｅｎｓ）／自己抗原（ａｕｔｏａｎｔｉｇｅｎｓ）に対する特異性を持つ抗体を含まない。これは、単独に発現したリコンビナントＣＤ３イプシロンタンパク質がインビボで存在しない事実による。それは自己抗原ではない。その結果、このタンパク質に特異的な抗体を発現するＢ細胞の亜集団は、インビボで枯渇していない。そのようなＢ細胞から構成される抗体ライブラリーならば、単独で発現したリコンビナントＣＤ３イプシロンタンパク質に特異的な抗体の遺伝物質を含むであろう。
しかし、コンテクスト独立性Ｎ末端１−２７アミノ酸残基ポリペプチド又はその機能性断片は、そのネイティブ形態で折り畳まれたエピトープであるので、本発明に調和する結合ドメインは、国際公開第０４／１０６３８０号に記載されている手法に基づく方法では同定できない。したがって、国際公開第０４／１０６３８０号に開示されている結合分子が、ＣＤ３イプシロン鎖のＮ末端１−２７アミノ酸残基に結合できないことが試験で実証されうる。そのため、従来の抗ＣＤ３結合分子又は抗ＣＤ３抗体分子（例えば、国際公開第９９／５４４４０号に開示されたもの）は、本願に提供されるコンテクスト独立性Ｎ末端１−２７アミノ酸残基ポリペプチド又はその機能性断片よりも、よりＣ末端に位置する位置でＣＤ３イプシロン鎖と結合する。従来技術抗体分子ＯＫＴ３及びＵＣＨＴ−１は、アミノ酸残基３５から８５の間のＴＣＲ／ＣＤ３複合体のイプシロンサブユニットに特異性を有し、したがって、これらの抗体のエピトープもよりＣ末端側に位置する。更に、ＵＣＨＴ−１は、アミノ酸残基４３から７７の領域でＣＤ３イプシロン鎖と結合する（Ｔｕｎｎａｃｌｉｆｆｅ， Ｉｎｔ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １ （１９８９）， ５４６−５０； Ｋｊｅｒ−Ｎｉｅｌｓｅｎ， ＰＮＡＳ １０１， （２００４）， ７６７５− ７６８０； Ｓａｌｍｅｒｏｎ， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４７ （１９９１）， ３０４７−５２）。したがって、従来技術の抗ＣＤ３分子は、本願に定義されるコンテクスト独立性Ｎ末端１−２７アミノ酸残基エピトープ（又はその機能性断片）と結合せず、それに対して作られていない。
本発明のポリペプチド中に、例えば本願に定義された二重特異性単鎖抗体中に含まれる、好ましくはヒトの、結合ドメインを生成するために、例えば、ヒト及び非チンパンジー霊長類ＣＤ３イプシロン（例えば、マカクザルＣＤ３イプシロン）の両方に結合するモノクローナル抗体が使用できる。
本発明のポリペプチドの好ましい実施形態において、非チンパンジー霊長類は旧世界猿である。ポリペプチドのより好ましい実施形態において、旧世界猿は、ヒヒ属、マカク属のサルである。最も好ましくは、マカク属のサルは、アッサムモンキー（マカカ・アサメンシス、Ｍａｃａｃａ ａｓｓａｍｅｎｓｉｓ）、バーバリーマカク（マカカ・シルバヌス、Ｍａｃａｃａ ｓｙｌｖａｎｕｓ）、ボンネットモンキー（マカカ・ラディアタ、Ｍａｃａｃａ ｒａｄｉａｔａ）、ウスイロマカク又はスラウェシマカク（マカカ・オケレアタ、Ｍａｃａｃａ ｏｃｈｒｅａｔａ）、クロザル（マカカ・ニグラ、Ｍａｃａｃａ ｎｉｇｒａ）、タイワンザル（マカカ・キュクロピス、Ｍａｃａｃａ ｃｙｃｌｏｐｓｉｓ）、スノーモンキー又はニホンザル（マカカ・フスカタ、Ｍａｃａｃａ ｆｕｓｃａｔａ）、シノモルガスサル又はカニクイザル又はオナガザル又はクラ（マカカ・ファシキュラリス、Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）、シシオザル（マカカ・シレヌス、Ｍａｃａｃａ ｓｉｌｅｎｕｓ）、ブタオザル（マカカ・ネメストリナ、Ｍａｃａｃａ ｎｅｍｅｓｔｒｉｎａ）、アカゲザル（マカク・ムラッタ、Ｍａｃａｃａ ｍｕｌａｔｔａ）、チベットマカク（マカカ・チベタナ、Ｍａｃａｃａ ｔｈｉｂｅｔａｎａ）、トンケアンモンキー（マカカ・トンケアナ、Ｍａｃａｃａ ｔｏｎｋｅａｎａ）、トクモンキー（マカカ・シニカ、Ｍａｃａｃａ ｓｉｎｉｃａ）、ベニガオザル（Ｓｔｕｍｐ−ｔａｉｌｅｄ ｍａｃａｑｕｅ）、ベニガオザル（Ｒｅｄ−ｆａｃｅｄ ｍａｃａｑｕｅ）又はクマザル（マカカ・アークトイデス、Ｍａｃａｃａ ａｒｃｔｏｉｄｅｓ）又はムーアモンキー（マカカ・マウラ、Ｍａｃａｃａ ｍａｕｒｕｓ）である。最も好ましくは、ヒヒ属のサルは、マントヒヒ（パピオ・ハマドリアス、Ｐａｐｉｏ ｈａｍａｄｒｙａｓ）；ギニアヒヒ（パピオ・パピオ、Ｐａｐｉｏ ｐａｐｉｏ）；アヌビスヒヒ（パピオ・アヌビス、Ｐａｐｉｏ ａｎｕｂｉｓ）；キイロヒヒ（パピオ・シノセファルス、Ｐａｐｉｏ ｃｙｎｏｃｅｐｈａｌｕｓ）；チャクマヒヒ（パピオ・ウルシヌス、Ｐａｐｉｏ ｕｒｓｉｎｕｓ）である。
本発明のポリペプチドの別の好ましい実施形態において、非チンパンジー霊長類は新世界猿である。ポリペプチドのより好ましい実施形態において、新世界猿は、マーモセット属（マーモセット）、タマリン属又はリスザル属のサルである。最も好ましくは、マーモセット属のサルはカリスリクス・ジャカスであり、タマリン属のサルはサグイヌス・オイディプスであり、リスザル属のサルはサイミリ・シウレウスである。
本願で上述したように、本発明のポリペプチドは、ヒト及び非チンパンジー類人猿ＣＤ３ε（イプシロン）鎖のエピトープに、第１結合ドメインで結合するが、前記エピトープは、配列番号２、４、６又は８に記載される２７アミノ酸残基からなる群に含まれるアミノ酸配列の一部である。
本発明と調和して、本発明のポリペプチドにとって、前記エピトープが、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６又は５アミノ酸を含むアミノ酸配列の一部であることが好ましい。
より好ましくは、前記エピトープは、少なくともアミノ酸配列Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ（Ｑ−Ｄ−Ｇ−Ｎ−Ｅ−Ｄ）を含む。
本発明の中で、「Ｎ末端１−２７アミノ酸残基の機能性断片」は、ＣＤ３複合体のネイティブ環境から取り出された（そして、例えば実施例３．１に示すとおり、ＥｐＣＡＭ又は免疫グロブリンＦｃ部などの異種アミノ酸配列に融合された）時に、前記機能性断片が、まだ、その三次元構造完全性を維持するコンテクスト独立性エピトープであることを意味する。ＣＤ３イプシロンの２７アミノ酸Ｎ末端ポリペプチド又はその機能性断片内の三次元構造の維持は、インビトロでのＮ末端ＣＤ３イプシロンポリペプチド断片に、及びインビボでのＴ細胞上のネイティブ（ＣＤ３イプシロンサブユニット）ＣＤ３複合体に、同じ結合親和力で結合する結合ドメインの生成に利用できる。本発明の中で、Ｎ末端１−２７アミノ酸残基の機能性断片は、本願に提供されるＣＤ３結合分子が、コンテクスト独立的にそのような機能性断片に結合できることを意味する。当業者は、そのような抗ＣＤ３結合分子がエピトープのどのアミノ酸残基を認識するのかを測定するエピトープマッピングの方法（例えば、アラニンスキャニング又はペップスポット（ｐｅｐ ｓｐｏｔ）分析を承知している。
本発明の好ましい実施形態において、本発明のポリペプチドは、ヒト及び非チンパンジー類人猿ＣＤ３ε鎖のエピトープに結合可能な（第１）結合ドメイン及び細胞表面抗原に結合可能な第２結合ドメインを含む。
本願での「細胞表面抗原」という用語は、細胞の表面上に提示されている分子を意味する。ほとんどの場合で、この分子は、この分子の少なくとも一部分が、三次形態で細胞の外部から接近可能なままであるように、細胞の細胞膜の中又はその上に位置するであろう。細胞膜中に位置する細胞表面分子の非限定的な例は、その三次コンフォメーションで、親水性及び疎水性の領域を含む膜貫通型タンパク質である。ここで、少なくとも１つの疎水性領域は、細胞表面分子が細胞の疎水性細胞膜に埋め込まれるか、挿入されるようにし、その一方で親水性領域は、細胞膜の両面に延びてそれぞれ細胞質及び細胞外空間に延びる。細胞膜上に位置する細胞表面分子の非限定的な例は、パルミトイル基を持つようにシステイン残基で修飾されたタンパク質、ファルネシル基を持つようにＣ末端システイン残基で修飾されたタンパク質又はグリコシルホスファチジルイノシトール（「ＧＰＩ」）アンカーを持つようにＣ末端で修飾されたタンパク質である。これらの基により、細胞膜の外部表面にタンパク質が共有結合でき、それらは抗体などの細胞外分子による認識のために接近可能なままである。細胞表面抗原の例には、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＭＣＳＰ、炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡＩＸ）、ＣＤ３０、ＣＤ３３、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ＩｇＥ、ＣＤ４４ｖ６及びＭｕｃ−１がある。さらに、対応する細胞表面抗体の例は、特定の疾病又は病気、すなわち、ガン、自己免疫疾患又はウイルス感染を含む感染症に特徴的な抗原を含む。したがって、「細胞表面抗原」という用語は、感染細胞の表面に露出するネイティブの、未処理のウイルスタンパク質（とりわけ、Ｂ型、Ｃ型肝炎ウイルス及びＨＩＶ−１のエンベロープタンパク質に関して記載される）などのウイルスタンパク質を明確に含む。
細胞障害性Ｔ細胞の防御機能の１つはウイルス感染細胞の破壊であり、したがって、本発明の二重特異性結合分子が、その自己由来の特異性にかかわらず、細胞障害性Ｔ細胞を活性化させ向け直す独特な性質は、広い分野の慢性ウイルス感染に大きな影響を持つ。これらの感染症の大部分にとって、持続感染している細胞の除去は、治癒のための唯一の機会である。最近、慢性ＣＭＶ及びＥＢＶ感染症に対して、養子Ｔ細胞療法が開発されつつある（Ｒｏｏｎｅｙ， ＣＭ．， ｅｔ ａｌ．， Ｕｓｅ ｏｆ ｇｅｎｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｖｉｒｕｓ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ｔｏ ｃｏｎｔｒｏｌ Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ−ｖｉｒｕｓ−ｒｅｌａｔｅｄ ｌｙｍｐｈｏｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ． Ｌａｎｃｅｔ， １９９５． ３４５ （８９４１）： ｐ． ９−１３； Ｗａｌｔｅｒ， ＥＡ， ｅｔ ａｌ．， Ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ ｏｆ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ａｇａｉｎｓｔ ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ ｉｎ ｒｅｃｉｐｉｅｎｔｓ ｏｆ ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｂｙ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｏｆ Ｔ−ｃｅｌｌ ｃｌｏｎｅｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｄｏｎｏｒ． Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ， １９９５． ３３３ （１６）： ｐ． １０３８−４４）。
慢性Ｂ型肝炎感染は、明らかに、最も興味深くやりがいのある適応症の１つである。世界中で３億５千万人から４億人がＨＢＶに感染している。慢性ＨＢＶ肝炎の最近の治療は、インターフェロンγ及びヌクレオシド又はヌクレオチドアナログにあり、肝炎拡大、発熱、筋痛症、血小板減少及び鬱の誘起などの著しい副作用を伴う長期の治療である。現在４を超える認可された治療レジメンがあるが、ウイルスの除去が達成されることは希である。慢性Ｂ型肝炎の持続炎症は、２５％を超える患者に肝硬変及び肝細胞ガンを起こす。さらに、慢性Ｂ型肝炎の患者の４０％までが、重篤な合併症で死亡し、これは世界中で年間に６０万人から１００万人の死亡原因となっている。
ヘパドナウイルスの原型であるＨＢＶは、その緩和環状（ｒｃ）ゲノムがＲＮＡプレゲノムに逆転写される、エンベロープウイルスである。感染後、ｒｃＤＮＡは肝細胞の細胞核に取り込まれ、そこで４つの重複するリーディングフレームを含む共有結合閉環状ＤＮＡ（ｃｃｃＤＮＡ）になる。それは、プレゲノムＲＮＡ及び３つのサブゲノムＲＮＡのための転写鋳型として働く。ＲＮＡプレゲノムは、ウイルスコア及びポリメラーゼタンパク質の翻訳のためのｍＲＮＡとして機能する。感染細胞は、ＨＢＶ複製が停止した時でも、ｃｃｃＤＮＡからＨＢＶ表面タンパク質（ＨＢｓＡｇ）を連続的に産生する。ＨＢｓＡｇは、極低い割合の中程度及び大きい（Ｌ）表面タンパク質と共に小さい表面（Ｓ）タンパク質からなる。ＨＢＶ Ｓ及びＬのどちらも、小胞体（ＥＲ）膜を標的とし、そこでそれらは膜小胞中でトランスゴルジ小器官を介して細胞膜に輸送される（Ｇｏｒｅｌｉｃｋ， Ｆ． Ｓ． ａｎｄ Ｃ． Ｓｈｕｇｒｕｅ， Ｅｘｉｔｉｎｇ ｔｈｅ ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ． Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ， ２００１． １７７ （１−２）： ｐ． １３−８）。最近示されたとおり、Ｓ及びＬタンパク質は、ＨＢＶを複製する肝細胞の表面上で永久に発現される（Ｃｈｕ， ＣＭ． ａｎｄ Ｙ．Ｆ． Ｌｉａｗ， Ｍｅｍｂｒａｎｅ ｓｔａｉｎｉｎｇ ｆｏｒ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｓｕｒｆａｃｅ ａｎｔｉｇｅｎ ｏｎ ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ： ａ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ａｎｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍａｒｋｅｒ ｏｆ ａｃｔｉｖｅ ｖｉｒａｌ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ． Ｊ Ｃｌｉｎ Ｐａｔｈｏｌ， １９９５． ４８（５）： ｐ．４７０−３）。
細胞表面でエンベロープタンパク質を露出するプロトタイプウイルスは、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）及びＨＩＶ−１であり、そのどちらも世界的に莫大な疾病の苦しみを象徴する。ＨＩＶ−１ウイルス適応症では、ｇｐ１２０エンベロープタンパク質に対するＦｖ抗体コンストラクトを持つキメラＴＣＲにより修飾されたＴ細胞がＨＩＶ−１に感染した標的細胞を殺すことができることが最近示された（Ｍａｓｉｅｒｏ， Ｓ．， ｅｔ ａｌ．， Ｔ−ｃｅｌｌ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｂｙ ａ ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ｔ−ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｗｉｔｈ ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｔｙｐｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｆｏｒ ｔｈｅ ＨＩＶ−１ ｇｐ１２０． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ， ２００５． １２ （４）： ｐ． ２９９−３１０）。ヘパドナウイルスのうち、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）は、ＨＢＶ複製が低下した場合ですら、エピソーマルｃｃｃＤＮＡから連続的に産生されるエンベロープタンパク質複合体ＨＢｓＡｇを発現する。
細胞表面上での無傷のＳ及びＬ ＨＢＶタンパク質としての発現は、患者が感染の急性期から回復し、循環するＨＢｓＡｇから抗ＨＢｓに変わる時に、血清変換の特徴である抗体にとって接近可能になる。血清変換が起こらない場合、最大３０％の肝細胞が、長期間の非常に活性な抗ウイルス治療の後でも、ＨＢＶ Ｓタンパク質を発現し続ける。したがって、細胞内で処理されたＨＢＶペプチドを特異的に認識し細胞表面でＭＨＣ分子により提示されるＴリンパ球を超えて、外部細胞膜中で接近可能なＳ及びＬ抗原などの無傷の表面タンパク質に向けられた、他の形態のＴ細胞関与がありうる。Ｂ型肝炎ウイルス小（Ｓ）及び大（Ｌ）エンベロープタンパク質を認識する単鎖抗体断片を使用して、グラフトＴ細胞を感染した肝細胞に向け、これらのＴ細胞の抗原接触活性化時にサイトカインを分泌し、感染した肝細胞を殺すことを可能にする、人工Ｔ細胞レセプターが生成された。
この手法の限界は、（ｉ）Ｔ細胞をインビトロで操作する必要がある、（ｉｉ）Ｔ細胞レセプターの輸送に使用するレトロウイルスは、Ｔ細胞中に挿入突然変異を起こすことがある、（ｉｉｉ）Ｔ細胞が一旦輸送されると細胞障害性応答は制限できない。
これらの限界を克服するため、ヒト及び非チンパンジー霊長類ＣＤ３イプシロン抗原（本発明の文脈中で本願に提供される）に対する結合特異性を持つ第１ドメイン並びに感染肝細胞のＨＢＶ又はＨＢＣエンベロープタンパク質に対する結合特異性を持つ第２ドメインを含む、二重特異性単鎖抗体分子を生成することができ、これは本発明の範囲内である。
本発明の中で、第２結合ドメインが、ヒト細胞表面抗原及び／又はＥＧＦＲ、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ又はＩｇＥから選択されるヒト細胞表面抗原の非チンパンジー霊長類対応物と結合することがさらに好ましい。
本発明のポリペプチド、例えば本願に定義される二重特異性単鎖抗体の第２結合ドメインを生成するために、それぞれのヒト及び／又は非チンパンジー霊長類の細胞表面抗原の両方に結合するモノクローナル抗体が利用できる。本願に定義される二重特異性ポリペプチドのための適切な結合ドメインは、当分野に記載されている組換え法による異種間特異性モノクローナル抗体から誘導できる。ヒトの細胞表面抗原及び非チンパンジー霊長類の前記表面抗原のホモログに結合するモノクローナル抗体は、上述のとおりＦＡＣＳアッセイにより試験できる。異種間特異性抗体も文献に記載されているハイブリドーマ技術から生成できることは当業者には明らかである（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｋoｈｌｅｒ， Ｎａｔｕｒｅ ２５６ （１９７５）， ４９５−７）。例えば、マウスを、ヒト及び非チンパンジー霊長類のＣＤ３３に対して交互に免疫することができる。これらのマウスから、異種間特異性抗体を産生するハイブリドーマ細胞がハイブリドーマ技術により単離され、上述のとおりＦＡＣＳにより分析される。本願に記載された異種間特異性を示す二重特異性単鎖抗体などの二重特異性ポリペプチドの生成及び分析は、以下の実施例に示される。異種間特異性を示す二重特異性単鎖抗体の利点は、以下に列挙された点を含む。
本発明のポリペプチドにとって、ヒト及び非チンパンジー霊長類ＣＤ３ε鎖のエピトープと結合可能な第１結合ドメインが、以下から選択されるＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２及びＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬ領域を含むことが特に好ましい：
（ａ）配列番号２７に示されるＣＤＲ−Ｌ１、配列番号２８に示されるＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号２９に示されるＣＤＲ−Ｌ３；
（ｂ）配列番号１１７に示されるＣＤＲ−Ｌ１、配列番号１１８に示されるＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号１１９に示されるＣＤＲ−Ｌ３；
（ｃ）配列番号１５３に示されるＣＤＲ−Ｌ１、配列番号１５４に示されるＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号１５５に示されるＣＤＲ−Ｌ３。
可変領域、すなわち可変軽鎖（「ＶＬ」の「Ｌ」）及び可変重鎖（「Ｈ」又は「ＶＨ」）は、抗体の結合ドメインを与えると当分野で理解される。この可変領域は、相補性決定領域を含む。「相補性決定領域」（ＣＤＲ）という用語は、抗体の抗原特異性を示すことが当分野に周知である。「ＣＤＲ−Ｌ」又は「Ｌ ＣＤＲ」という用語は、ＶＬ中のＣＤＲを意味し、「ＣＤＲ−Ｈ」又は「Ｈ ＣＤＲ」という用語は、ＶＨ中のＣＤＲを意味する。
本発明のポリペプチドの別の好ましい実施形態において、ヒト及び非チンパンジー霊長類ＣＤ３ε鎖のエピトープに結合可能な第１結合ドメインは、以下から選択されるＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２及びＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨ領域を含む：
（ａ）配列番号１２に示されるＣＤＲ−Ｈ１、配列番号１３に示されるＣＤＲ−Ｈ２及び配列番号１４に示されるＣＤＲ−Ｈ３；
（ｂ）配列番号３０に示されるＣＤＲ−Ｈ１、配列番号３１に示されるＣＤＲ−Ｈ２及び配列番号３２に示されるＣＤＲ−Ｈ３；
（ｃ）配列番号４８に示されるＣＤＲ−Ｈ１、配列番号４９に示されるＣＤＲ−Ｈ２及び配列番号５０に示されるＣＤＲ−Ｈ３；
（ｄ）配列番号６６に示されるＣＤＲ−Ｈ１、配列番号６７に示されるＣＤＲ−Ｈ２及び配列番号６８に示されるＣＤＲ−Ｈ３；
（ｅ）配列番号８４に示されるＣＤＲ−Ｈ１、配列番号８５に示されるＣＤＲ−Ｈ２及び配列番号８６に示されるＣＤＲ−Ｈ３；
（ｆ）配列番号１０２に示されるＣＤＲ−Ｈ１、配列番号１０３に示されるＣＤＲ−Ｈ２及び配列番号１０４に示されるＣＤＲ−Ｈ３；
（ｇ）配列番号１２０に示されるＣＤＲ−Ｈ１、配列番号１２１に示されるＣＤＲ−Ｈ２及び配列番号１２２に示されるＣＤＲ−Ｈ３；
（ｈ）配列番号１３８に示されるＣＤＲ−Ｈ１、配列番号１３９に示されるＣＤＲ−Ｈ２及び配列番号１４０に示されるＣＤＲ−Ｈ３；
（ｉ）配列番号１５６に示されるＣＤＲ−Ｈ１、配列番号１５７に示されるＣＤＲ−Ｈ２及び配列番号１５８に示されるＣＤＲ−Ｈ３；及び
（ｊ）配列番号１７４に示されるＣＤＲ−Ｈ１、配列番号１７５に示されるＣＤＲ−Ｈ２及び配列番号１７６に示されるＣＤＲ−Ｈ３。
ヒト及び非チンパンジー霊長類ＣＤ３ε鎖のエピトープに結合可能な第１結合ドメインが、配列番号３５、３９、１２５、１２９、１６１又は１６５に示されるＶＬ領域からなる群から選択されるＶＬ領域を含むことがさらに好ましい。
或いは、ヒト及び非チンパンジー霊長類ＣＤ３ε鎖のエピトープに結合可能な第１結合ドメインが、配列番号１５、１９、３３、３７、５１、５５、６９、７３、８７、９１、１０５、１０９、１２３、１２７、１４１、１４５、１５９、１６３、１７７又は１８１に示されるＶＨ領域からなる群から選択されるＶＨ領域を含むことが好ましい。
より好ましくは、本発明のポリペプチドは、以下からなる群から選択されるＶＬ領域及びＶＨ領域を含む、ヒト及び非チンパンジー霊長類ＣＤ３ε鎖のエピトープに結合可能な第１結合ドメインにより特徴づけられる。
（ａ）配列番号１７又は２１に示されるＶＬ領域及び配列番号１５又は１９に示されるＶＨ領域；
（ｂ）配列番号３５又は３９に示されるＶＬ領域及び配列番号３３又は３７に示されるＶＨ領域；
（ｃ）配列番号５３又は５７に示されるＶＬ領域及び配列番号５１又は５５に示されるＶＨ領域；
（ｄ）配列番号７１又は７５に示されるＶＬ領域及び配列番号６９又は７３に示されるＶＨ領域；
（ｅ）配列番号８９又は９３に示されるＶＬ領域及び配列番号８７又は９１に示されるＶＨ領域；
（ｆ）配列番号１０７又は１１１に示されるＶＬ領域及び配列番号１０５又は１０９に示されるＶＨ領域；
（ｇ）配列番号１２５又は１２９に示されるＶＬ領域及び配列番号１２３又は１２７に示されるＶＨ領域；
（ｈ）配列番号１４３又は１４７に示されるＶＬ領域及び配列番号１４１又は１４５に示されるＶＨ領域；
（ｉ）配列番号１６１又は１６５に示されるＶＬ領域及び配列番号１５９又は１６３に示されるＶＨ領域；及び
（ｊ）配列番号１７９又は１８３に示されるＶＬ領域及び配列番号１７７又は１８１に示されるＶＨ領域。
本発明のポリペプチドの好ましい実施形態によると、ＶＨ領域とＶＬ領域の組は、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）のフォーマットにある。ＶＨ及びＶＬ領域は、ＶＨ−ＶＬ又はＶＬ−ＶＨの順番に配置されている。ＶＨ領域が、リンカー配列のＮ末端に位置することが好ましい。ＶＬ領域は、リンカー配列のＣ末端に位置する。
本発明の上述のポリペプチドの好ましい実施形態は、配列番号２３、２５、４１、４３、５９、６１、７７、７９、９５、９７、１１３、１１５、１３１、１３３、１４９、１５１、１６７、１６９、１８５又は１８７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、ヒト及び非チンパンジー霊長類ＣＤ３ε鎖のエピトープに結合可能な第１結合ドメインにより特徴づけられる。
本発明は、第２結合ドメインが、好ましくは腫瘍抗原である細胞表面抗原に結合する、上述のポリペプチドにさらに関する。
本願での「腫瘍抗原」という用語は、腫瘍細胞上に提示される抗原であると理解されうる。これらの抗原は、分子の膜貫通及び細胞質部分と結合していることが多い細胞外部分とともに細胞表面に提示されることがある。これらの抗原は、腫瘍細胞によりのみ提示され、通常細胞によっては決して提示され得ない。腫瘍抗原は、腫瘍細胞上にのみ発現されるか、通常細胞と比較して腫瘍特異的な突然変異を表すことがある。この場合、それらは腫瘍特異的抗原と呼ばれる。腫瘍細胞及び通常細胞により提示される抗原がより一般的であり、それらは腫瘍関連抗原と呼ばれる。これらの腫瘍関連抗原は、通常細胞に比べて過剰発現されることがあり、通常細胞に比べ腫瘍細胞の密集性の低い構造のため、腫瘍細胞中で抗体結合のために接近可能である。本願で使用される腫瘍抗原の非限定的な例はＥＧＦＲである（Ｌｉｕ， Ｂｒ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ ８２／１２ （２０００）， １９９１−１９９９； Ｂｏｎｎｅｒ， Ｓｅｍｉｎ． Ｒａｄｉａｔ． Ｏｎｃｏｌ． １２ （２００２）， １１−２０； Ｋｉｙｏｔａ， Ｏｎｃｏｌｏｇｙ ６３／１ （２００２）， ９２−９８； Ｋｕａｎ， Ｂｒａｉｎ Ｔｕｍｏｒ Ｐａｔｈｏｌ． １７／２ （２０００）， ７１−７８）。
ＥＧＦＲ（ｃ−ｅｒｂ１又はＨＥＲ１としても知られる）は、ｅｒｂＢレセプターチロシンキナーゼファミリーに属する。成長因子のＥＧＦファミリーのリガンドの結合により活性化すると、ＥＧＦＲは、第２のＥＧＦＲ又はｅｒｂＢレセプターファミリーの他のメンバーとそれぞれホモダイマー化又はヘテロダイマー化し、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ及び他の転写因子によりシグナル伝達カスケードを開始し、増殖、分化及び修復が起こる（Ｏｌａｙｉｏｙｅ， ＥＭＢＯ Ｊ． １９ （２０００）， ３１５９−６７）。ＥＧＦＲは、結直腸ガン、乳ガン、肺ガン及び頭頸部ガンを含む多くの上皮ガンで過剰発現される（Ｍｅｎｄｅｌｓｏｈｎ， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｏｎｃｏｌ． ２１ （２００３）， ２７８７−９９； Ｍｅｎｄｅｌｓｏｈｎ， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｏｎｃｏｌ． ２０ （１８， Ｓｕｐｐｌ．） （２００２）， １Ｓ−１３Ｓ； Ｐｒｅｗｅｔｔ， Ｃｌｉｎ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ８ （２００２）， ９９４−１００３）。悪性細胞中でのＥＧＦＲの過剰発現及び／又は突然変異は、キナーゼ活性の恒常的活性化につながり、増殖、血管形成、浸潤、転移及びアポトーシスの阻害を起こす（Ｍｅｎｄｅｌｓｏｈｎ （２００３，上記引用文献； Ｃｉａｒｄｉｅｌｌｏ， Ｃｌｉｎ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ７ （２００１）， ２９５８−７０； Ｐｅｒｅｚ−Ｓｏｌｅｒ， Ｏｎｃｏｌｏｇｉｓｔ ９ （２００４）， ５８−６７）。細胞外リガンド結合ドメイン又はＥＧＦＲの細胞内チロシンキナーゼシグナル伝達カスケードを標的にするモノクローナル抗体は、抗腫瘍標的としての効力が示されている（Ｌａｓｋｉｎ， Ｃａｎｃｅｒ Ｔｒｅａｔ． Ｒｅｖｉｅｗ ３０ （２００４）， １−１７）。例えば、セツキシマブ（Ｅｒｂｉｔｕｘ）、ＥＧＦＲに対するヒト化モノクローナル抗体は、ＥＧＦＲの細胞外ドメインを競合阻害し、レセプターのリガンド活性化を阻害するが、トポイソメラーゼ阻害剤イリノテカンと組み合わせた転移性大腸ガンの治療用に食品医薬品局（ＦＤＡ）により２００４年に認可された。
本発明の好ましい実施形態において、ポリペプチドは二重特異性単鎖抗体分子である。
前臨床試験のためのサロゲート分子の開発に関する本願で先に記載した問題は、薬剤候補が二重特異性抗体、例えば二重特異性単鎖抗体である場合、さらにひどくなる。そのような二重特異性抗体では、認識される抗原の両方が、ある動物種に異種間特異性であり、そのような動物での安全性試験を可能にすることが要される。
やはり本願で先に記したとおり、本発明は、ヒト及び非チンパンジー霊長類ＣＤ３ε鎖のエピトープに結合可能な第１結合ドメイン及びＥＧＦＲ、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ又はＩｇＥから選択される細胞表面抗原に結合可能な第２結合ドメインを含むポリペプチドを提供するが、前記第２結合ドメインは、ヒト及び／又は非チンパンジー霊長類の細胞表面抗原にも結合することが好ましい。本発明の好ましいポリペプチドの要件を満たす薬剤候補としての二重特異性単鎖抗体分子の利点は、その様な分子の前臨床動物試験での使用並びに臨床試験で、さらにはヒトの治療での使用である。本発明の種間特異的二重特異性単鎖抗体の好ましい実施形態において、細胞表面抗原に結合可能な第２の結合ドメインはヒト起源である。本発明の種間特異的二重特異性分子において、ヒト及び非チンパンジー霊長類ＣＤ３イプシロン鎖のエピトープに結合可能な結合ドメインは、二重特異性分子のＮ末端又はＣ末端でＶＨ−ＶＬ又はＶＬ−ＶＨの順で位置する。第１及び第２結合ドメインにおいてＶＨ及びＶＬ鎖の異なる配列にある本発明の種間特異的二重特異性分子の例は、添付する実施例に記載される。
本願では、「二重特異性単鎖抗体」は、２つの結合ドメインを含むポリペプチド単鎖を意味する。各結合ドメインは、抗体重鎖からの１つの可変領域（「ＶＨ領域」）を含むが、第１結合ドメインのＶＨ領域は、ＣＤ３ε分子に特異的に結合し、第２結合ドメインのＶＨ領域は、以下により詳細に定義される細胞表面抗原に特異的に結合する。２つの結合ドメインは、短いポリペプチドスペーサーにより任意に互いに結合する。ポリペプチドスペーサーの非限定的な例は、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｓ）及びそのリピートである。各結合ドメインは、抗体軽鎖からの１つの可変領域（「ＶＬ領域」）をさらに含み、第１及び第２結合ドメインのそれぞれにおいて、ＶＨ領域及びＶＬ領域は、例えばＥＰ６２３６７９Ｂ１に開示され特許請求されているタイプのポリペプチドリンカーにより互いに結合しているが、しかしいずれにせよ第１結合ドメインのＶＨ領域及びＶＬ領域と第２結合領域のＶＨ領域及びＶＬ領域が、それぞれの第１及び第２分子と特異的に結合できるように、互いに組むことが可能なほど長い。
本発明の好ましい実施形態によると、先に特徴を述べた二重特異性単鎖抗体分子は、第２結合ドメインにおけるＣＤＲ Ｈ１、ＣＤＲ Ｈ２、ＣＤＲ Ｈ３、ＣＤＲ Ｌ１、ＣＤＲ Ｌ２及びＣＤＲ Ｌ３として、配列番号４４１〜４４６、配列番号４５３〜４５８、配列番号４６３〜４６８、配列番号４８１〜４８６から選択される配列の群を含む。
本発明の特に好ましい実施形態は、二重特異性単鎖抗体分子が以下から選択される配列を含む、先に特徴を述べたポリペプチドに関する：
（ａ）配列番号３８９、３９１、３９３、３９５、３９７、３９９、４０９、４１１、４１３、４１５、４１７、４１９、４２９、４３１、４３３、４３５、４３７、４３９、４４７、４４９、４５１、４６９、４７１、４７３、４７５、４７７、４７９、４９５、４９７、４９９、５０１、５０３及び５０５のいずれかに示されるアミノ酸配列；並びに
（ｂ）配列番号３９０、３９２、３９４、３９６、３９８、４００、４１０、４１２、４１４、４１６、４１８、４２０、４３０、４３２、４３４、４３６、４３８、４４０、４４８、４５０、４５２、４７０、４７２、４７４、４７６、４７８、４８０、４９６、４９８、５００、５０２、５０４及び５０６のいずれかに示される核酸配列によりコードされるアミノ酸配列。
本発明の好ましい実施形態において、二重特異性単鎖抗体は、ＣＤ３イプシロンに対して、及びその第２結合ドメインにより認識される腫瘍抗原に対して異種間特異的である。
別の実施形態において、本発明は、本発明の上述のポリペプチドをコードする核酸配列を提供する。
本発明は、本発明の核酸分子を含むベクターにも関する。
多くの好適なベクターが分子生物学の当業者に公知であり、その選択は望まれる機能に依存するであろうが、プラスミド、コスミド、ウイルス、バクテリオファージ及び遺伝子工学で従来使用される他のベクターがある。当業者に周知の方法を利用して種々のプラスミド及びベクターを構築することができる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（上記引用文献）及びＡｕｓｕｂｅｌ， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ， Ｎ．Ｙ． （１９８９）， （１９９４）に記載されている技術を参照されたい。或いは、本発明のポリヌクレオチド及びベクターを、標的細胞への送達のため、リポソーム中に再構築することもできる。以下に詳細に議論されるように、クローニングベクターを使用してＤＮＡの個別の配列を単離することもできる。関連する配列を、特定のポリペプチドの発現が求められる発現ベクター中に移すこともできる。典型的なクローニングベクターは、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ、ｐＧＥＭ、ｐＵＣ９、ｐＢＲ３２２及びｐＧＢＴ９がある。典型的な発現ベクターにはｐＴＲＥ、ｐＣＡＬ−ｎ−ＥＫ、ｐＥＳＰ−１、ｐＯＰ１３ＣＡＴがある。
好ましくは、前記ベクターは、本願に定義される前記核酸配列に機能的に結合している調節配列である核酸配列を含む。
「調節配列」という用語は、それがライゲーションされるコード配列の発現をもたらすのに必要なＤＡＮ配列を意味する。そのような制御配列の性質は、ホスト生物により異なる。原核生物では、一般的に、制御配列はプロモーター、リボソーム結合部位及びターミネーターを含む。真核生物では、一般的に、制御配列は、プロモーター、ターミネーター及び、場合によって、エンハンサー、トランスアクティベーター又は転写因子を含む。「制御配列」という用語は、最低でも、その存在が発現に必要な全成分を含むものとし、追加の有利な成分も含むことがある。
「機能的に結合する」という用語は、そのように記載される成分が、その意図される方法で機能することを可能にする関係にある並列である。コード配列に「機能的に結合する」制御配列は、コード配列の発現が、制御配列と同等の条件下で達成するようにライゲーションされる。制御配列がプロモーターである場合、二本鎖核酸が使用されることが好ましいことは当業者には明らかである。
例えば、列挙されるベクターは好ましくは発現ベクターである。「発現ベクター」は、選択されたホストを形質転換するために使用でき、選択されたホスト中にコード配列の発現を可能にするコンストラクトである。発現ベクターは、例えば、クローニングベクター、バイナリーベクター又は組み込み型ベクターでよい。発現は、好ましくは翻訳可能なｍＲＮＡへの核酸分子の転写を含む。原核生物及び／又は真核生物において発現を確実にする調節因子は、当業者に周知である。真核細胞の場合には、それらは、転写の開始を確実にするプロモーター並びに、任意に、転写の停止及び転写の安定化を確実にするポリＡシグナルを通常含む。原核生物ホスト細胞での発現を可能にする可能性のある調節因子は、例えば、大腸菌でのＰL、ｌａｃ、ｔｒｐ又はｔａｃプロモーターがあり、真核生物ホスト細胞での発現を可能にする調節因子の例は、酵母菌中のＡＯＸ１又はＧＡＬ１プロモーター、又は哺乳類又は他の動物細胞中のＣＭＶ−、ＳＶ４０−、ＲＳＶ−プロモーター（ラウス肉腫ウイルス）、ＣＭＶ−エンハンサー、ＳＶ−４０エンハンサー又はグロビンイントロンがある。
転写の開始の原因となる因子の他に、そのような調節因子は、ポリヌクレオチドの下流に、ＳＶ−４０−ポリＡ部位又はｔｋ−ポリ−Ａ部位など転写停止シグナルを含むこともある。
さらに、使用される発現系によって、ポリペプチドを細胞区画に向けることが可能な、又はそれを媒体中に分泌することが可能なリーダー配列も、列記された核酸配列のコード配列に加えることができ、当分野に周知である。添付される実施例も参照されたい。リーダー配列（複数可）は、翻訳、開始及び停止配列並びに好ましくは、翻訳されたタンパク質又はその一部を細胞膜周辺腔又は細胞外媒体へ分泌するよう指示することのできるリーダー配列と適当な相で組み立てられる。任意に、異種配列は、所望の特性、例えば発現された組換え産物の安定化又は簡易化精製を付与するＮ末端同定ペプチドを含む融合タンパク質をコードすることができる。上記を参照されたい。この文脈において、Ｏｋａｙａｍａ−Ｂｅｒｇ ｃＤＮＡ発現ベクターｐｃＤＶ１（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ｐＣＤＭ８、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐｃＤＮＡ１、ｐｃＤＮＡ３（Ｉｎ−ｖｉｔｒｏｇｅｎｅ）、ｐＥＦ−ＤＨＦＲ、ｐＥＦ−ＡＤＡ又はｐＥＦ−ｎｅｏ（Ｍａｃｋ ｅｔ ａｌ．ＰＮＡＳ（１９９５）９２，７０２１−７０２５及びＲａｕｍ ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ （２００１） ５０（３）， １４１−１５０）又はｐＳＰＯＲＴ１（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）などの好適な発現ベクターが当分野に公知である。
好ましくは、発現制御配列は真核生物ホスト細胞を形質転換若しくはトランスフェクトすることが可能なベクター中の真核生物プロモーター系であろうが、原核生物ホスト用の制御配列も使用できる。ベクターが適当なホスト中に一旦取り入れられると、ホストは、ヌクレオチド配列の高レベルな発現に好適な条件下に維持され、望まれる場合、本発明のポリペプチドの回収及び精製を続けてよい。例えば、添付される実施例を参照されたい。
細胞周期相互作用タンパク質の発現に使用できる、別な発現系はインサート系である。そのような系において、オートグラファー・カリフォルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）核多角体ウイルス（ＡｃＮＰＶ）をベクターとして使用し、スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞又はイラクサギンウワバ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ）幼虫に外来遺伝子を発現する。言及された核酸分子のコード配列は、ポリヘドリン遺伝子など、ウイルスの非必須領域中にクローニングされ、ポリヘドリンプロモーターの制御下におくことができる。前記コード配列の挿入がうまくいくと、ポリヘドリン遺伝子が不活性化し、コートタンパク質コートを欠く組換えウイルスが産生されるであろう。次いで、組換えウイルスを使用して、エス・フルギペルダ細胞又はイラクサギンウワバ幼虫を感染させ、そこで本発明のタンパク質が発現される（Ｓｍｉｔｈ， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ４６ （１９８３）， ５８４； Ｅｎｇｅｌｈａｒｄ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１ （１９９４）， ３２２４−３２２７）。
追加の調節因子には、転写エンハンサー並びに翻訳エンハンサーが含まれる。上述の本発明のベクターが、選択マーカー及び／又はスコア可能なマーカーを含むことが有利である。
形質転換された細胞及び、例えば、植物組織及び植物の選択に有用な選択マーカー遺伝子は当業者に周知であり、例えば、メトトレキサートに対する耐性を与えるｄｈｆｒ（Ｒｅｉｓｓ， Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ． （Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ． Ａｄｖ．） １３ （１９９４）， １４３−１４９）；アミノグリコシドネオマイシン、カナマイシン及びパロマイシンに対する耐性を与えるｎｐｔ（Ｈｅｒｒｅｒａ−Ｅｓｔｒｅｌｌａ， ＥＭＢＯ Ｊ． ２ （１９８３）， ９８７−９９５）；及びハイグロマイシンに対する耐性を与えるｈｙｇｒｏ（Ｍａｒｓｈ， Ｇｅｎｅ ３２ （１９８４）， ４８１−４８５）に対する選択の基礎として代謝拮抗剤耐性を含む。追加の選択的遺伝子、すなわち、細胞がトリプトファンの代わりにインドールを利用するのを可能にするｔｒｐＢ；細胞がヒスチジンの代わりにヒスチノールを利用するのを可能にするｈｉｓＤ（Ｈａｒｔｍａｎ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５ （１９８８）， ８０４７）；細胞がマンノースを利用するのを可能にするマンノース−６−ホスフェートイソメラーゼ（国際公開第９４／２０６２７号）及びオルニチンデカルボキシラーゼ阻害剤である２−（ジフルオロメチル）−ＤＬオルニチン、ＤＦＭＯに対する耐性を与えるＯＤＣ（オルニチンデカルボキシラーゼ）（ＭｃＣｏｎｌｏｇｕｅ， １９８７， Ｉｎ： Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｅｄ．）又はブラストシジンＳに対する耐性を与えるアスペルギルス・テルレウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｅｒｒｅｕｓ）由来のデアミナーゼ（Ｔａｍｕｒａ， Ｂｉｏｓｃｉ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ５９ （１９９５）， ２３３６−２３３８）が記載されている。
有用なスコア可能なマーカーも当業者に公知であり、市販されている。前記マーカーが、ルシフェラーゼ（Ｇｉａｃｏｍｉｎ， Ｐｌ． Ｓｃｉ． １１６ （１９９６）， ５９−７２； Ｓｃｉｋａｎｔｈａ， Ｊ． Ｂａｃｔ． １７８ （１９９６）， １２１）、緑色蛍光タンパク質（Ｇｅｒｄｅｓ， ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． ３８９ （１９９６）， ４４−４７）又はβ−グルクロニダーゼ（Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ， ＥＭＢＯ Ｊ． ６ （１９８７）， ３９０１−３９０７）をコードする遺伝子であることが有利である。この実施形態は、記載されたベクターを含む細胞、組織及び生物の簡単で迅速なスクリーニングに特に有用である。
上述のとおり、記載された核酸分子は、例えば、精製のため、それのみならず遺伝子治療目的に、単独又は細胞に本発明のポリペプチドを発現するベクターの一部として使用できる。本発明の上述のポリペプチドのいずれかをコードするＤＮＡ配列（複数可）を含む核酸分子又はベクターは、細胞に導入され、次に目的とするポリペプチドを産生する。遺伝子治療は、エキソビボ又はインビボ技術による細胞への治療遺伝子の導入に基づくが、遺伝子導入の最も重要な用途の１つである。インビトロ又はインビボ遺伝子治療のための好適なベクター、方法又は遺伝子送達システムは文献に記載されており、当業者に公知である。例えば、Ｇｉｏｒｄａｎｏ， Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２ （１９９６）， ５３４−５３９； Ｓｃｈａｐｅｒ， Ｃｉｒｃ． Ｒｅｓ． ７９ （１９９６）， ９１１−９１９； Ａｎｄｅｒｓｏｎ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６ （１９９２）， ８０８−８１３； Ｖｅｒｍａ， Ｎａｔｕｒｅ ３８９ （１９９４）， ２３９； Ｉｓｎｅｒ， Ｌａｎｃｅｔ ３４８ （１９９６）， ３７０−３７４； Ｍｕｈｌｈａｕｓｅｒ， Ｃｉｒｃ． Ｒｅｓ． ７７ （１９９５）， １０７７−１０８６； Ｏｎｏｄｅｒａ， Ｂｌｏｏｄ ９１ （１９９８）， ３０−３６； Ｖｅｒｍａ， Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ５ （１９９８）， ６９２−６９９； Ｎａｂｅｌ， Ａｎｎ． Ｎ．Ｙ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ８１１ （１９９７）， ２８９−２９２； Ｖｅｒｚｅｌｅｔｔｉ， Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ９ （１９９８）， ２２４３−５１ ； Ｗａｎｇ， Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２ （１９９６）， ７１４−７１６；国際公開第９４／２９４６９号；国際公開第９７／００９５７号、米国特許第５，５８０，８５９号；米国特許第５，５８９，４６６号；又はＳｃｈａｐｅｒ， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７ （１９９６）， ６３５−６４０を参照されたい。記載された核酸分子及びベクターは、細胞への直接導入用にも、或いはリポソーム又はウイルスベクター（例えば、アデノウイルス、レトロウイルス）による導入用にも設計できる。好ましくは、前記細胞は、生殖細胞株細胞、胚細胞又は卵細胞であり、或いはそれらから誘導されており、最も好ましくは前記細胞は幹細胞である。胚性幹細胞の例は、とりわけ、Ｎａｇｙ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０ （１９９３）， ８４２４−８４２８に記載されている幹細胞でよい。
本発明は、本発明のベクターにより形質転換又はトランスフェクトされたホストも提供する。前記ホストは、本発明の上述のベクター又は本発明の上述の核酸分子をホストへ導入して製造できる。ホスト中の少なくとも１つのベクター又は少なくとも１つの核酸分子の存在が、上述の単鎖抗体コンストラクトをコードする遺伝子の発現を媒介することができる。
記載された本発明の核酸分子又はベクターは、ホストに導入され、ホストのゲノムに統合されることがあるが、染色体外に維持されることもある。
ホストは、どのような原核生物細胞でも真核生物細胞でもよい。
「原核生物」という用語は、細菌全てを含むように意味し、本発明のタンパク質の発現のためＤＮＡ又はＲＮＡ分子により形質転換又はトランスフェクトすることができる。原核細胞ホストは、大腸菌、ネズミチフス菌、霊菌及び枯草菌などのグラム陰性菌並びにグラム陽性菌を含む。「真核」という用語は、酵母、高等植物、昆虫、好ましくは哺乳類の細胞を含むように意味する。組換え産生手順に使用されるホストにより、本発明のポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質はグリコシル化されることがあるが、非グリコシル化されることもある。本発明のポリペプチドのコード配列を含みＮ末端ＦＬＡＧタグ及び／又はＣ末端Ｈｉｓタグが遺伝子的に融合されるプラスミド又はウイルスの使用が特に好ましい。好ましくは、前記ＦＬＡＧタグの長さは、約４〜８アミノ酸であり、最も好ましくは８アミノ酸である。上述のポリヌクレオチドを使用して、当業者に通常公知である技術のいずれかを利用して、ホストを形質転換又はトランスフェクトすることができる。さらに、融合し、機能的に結合した遺伝子の調製及び、例えば哺乳類細胞及び細菌中でのそれらの発現の方法は、当業者に周知である（Ｓａｍｂｒｏｏｋ、上記引用文献中）。
好ましくは、前記ホストは、細菌或いは昆虫、真菌、植物又は動物の細胞である。
記載されたホストが哺乳類細胞であることが特に想定される。特に好ましいホスト細胞は、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＳＰ２／０又はＮＳ／０などのミエローマ細胞株を含む。添付される実施例に示すとおり、ＣＨＯ細胞がホストとして特に好ましい。
より好ましくは、前記ホスト細胞は、ヒトの細胞又はヒトの細胞株、例えばｐｅｒ．ｃ６である（Ｋｒｏｏｓ， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｐｒｏｇ．， ２００３， １９：１６３−１６８）。
さらなる実施形態において、本発明は、本発明のポリペプチドの産生方法にも関するが、前記方法は、本発明のポリペプチドの発現を可能にする条件下で本発明のホストを培養する工程及び産生されたポリペプチドを培養物から回収する工程を含む。
形質転換されたホストは、当業者に公知の技術により発酵槽中で生育され、培養されて、最適な細胞成長を得る。次いで、本発明のポリペプチドは、増殖培養液、細胞溶解物又は細胞膜分画から単離できる。例えば、細菌により発現した本発明のポリペプチドの単離及び精製は、例えば、分取クロマトグラフ分離並びに、例えば本発明のポリペプチドのタグに対するモノクローナル又はポリクローナル抗体の使用を含むもの或いは添付される実施例に記載のものなどの免疫学的分離など、どのような従来の手段によってもよい。
発現を可能にするホストの培養条件は当業者に公知であり、ホスト系及びそのような方法に利用される発現系／ベクターに依存する。組換えポリペプチドの発現を可能にする条件を得るために修正すべきパラメータは当分野に公知である。例えば、好適な条件は、さらなる発明のインプットなしに当業者により決定できる。
一旦発現すると、本発明のポリペプチドは、硫酸アンモニウム沈殿、アフィニティーカラム、カラムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動などを含む、当分野の標準的な手順により精製することができる。Ｓｃｏｐｅｓ， "Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ"， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ， Ｎ．Ｙ． （１９８２）を参照されたい。少なくとも約９０から９５％の均質性の実質的に純粋なポリペプチドが好ましく、９８から９９％以上の均質性が医薬用途に最も好ましい。部分的に又は望まれるとおり均質に一旦精製されると、本発明のポリペプチドを（体外を含む）治療用に又はアッセイ手順の開発及び実施に使用できる。さらに、培養物からの本発明のポリペプチドの回収方法の例は、添付される実施例に詳細に記載される。
さらに、本発明は本発明のポリペプチド又は先に開示された方法により産生されたポリペプチドを含む組成物を与える。好ましくは、前記組成物は医薬組成物である。
本発明によると、「医薬組成物」という用語は、患者、好ましくはヒトの患者に投与するための組成物に関する。本発明の特に好ましい医薬組成物は、コンテクスト独立性ＣＤ３エピトープを対象としそれに対して生成された結合分子を含む。好ましくは、医薬組成物は、キャリア、安定剤及び／又は賦形剤の好適な製剤を含む。好ましい実施形態において、医薬組成物は、非経口、経皮、腔内、動脈内、髄腔内及び／又は鼻腔内投与のための、又は組織への直接注入による組成物を含む。前記組成物が、注入又は注射により患者に投与されることが特に想定される。好適な組成物の投与は、種々の方法により、例えば、静脈中への、腹膜内への、皮下への、筋肉内への、局所又は皮内への投与により実施することができる。特に、本発明は、好適な組成物の中断されない投与を与える。非限定的な例として、中断されない、すなわち連続的な投与が、患者の体内への治療薬の流入を測定する、患者が装着する小さなポンプシステムにより実現できる。本発明のコンテクスト独立性ＣＤ３エピトープを対象としそれに対して生成された結合分子を含む医薬組成物は、前記ポンプシステムの利用により投与できる。そのようなポンプシステムは一般的に当分野に公知であり、注入すべき治療薬を含むカートリッジの周期的な交換に通常頼る。そのようなポンプシステムでカートリッジを交換する際、患者の体内への治療薬のそうでなければ中断されない流入の一時的な中断が起こることがある。そのような場合、カートリッジ交換の前の投与の時期及びカートリッジ交換の後の投与の時期は、それでも医薬手段の意味の中にあると考えられ、本発明の方法は共に、そのような治療薬の１つの「中断されない投与」を作り上げる。本発明のコンテクスト独立性ＣＤ３エピトープを対象とし又はそれらに対して生成されたこれら結合分子の連続又は中断されない投与は、流体を貯蔵器から出すための流体駆動機構及び前記駆動機構を作動させるための作動機構を含む流体送達装置又は小さなポンプシステムにより、静脈又は皮下へ実施できる。皮下投与のためのポンプシステムは、患者の皮膚を貫通し、好適な組成物を患者の体内へ送達するための針又はカニューレを含む。前記ポンプシステムは、静脈、動脈又は血管に関係なく、患者の皮膚に直接固定又は付着してよく、それによりポンプシステムと患者の皮膚の直接接触を可能にする。ポンプシステムは、数日程度、２４時間、患者の皮膚に付着してよい。ポンプシステムは、小さい容積の貯蔵器を持つ小さなサイズでもよい。非限定的な例として、投与すべき好適な医薬組成物の貯蔵器の容積は、０．１から５０ｍｌでありうる。
連続投与は、皮膚に貼り付け時々交換するパッチによる経皮でもよい。当業者は、この目的に好適な薬物送達のためのパッチシステムを承知している。好都合には、第１の使用済みパッチの交換が、例えば、第１の使用済みパッチのすぐ隣の皮膚表面で第１の使用済みパッチの除去の直前に、新しい第２のパッチの配置と同時に実施できるので、経皮投与が中断されない投与を特に受け入れやすいことに留意されたい。流入の中断又は電池の消耗の問題が起こらない。
特に、コンテクスト独立性ＣＤ３エピトープを対象としそれに対して生成される結合分子を含む本発明の組成物は、薬剤的に許容できるキャリアをさらに含んでよい。好適な医薬キャリアの例は当分野に周知であり、溶液、例えばリン酸緩衝食塩水、水、水中油滴型エマルションなどのエマルション、種々の湿潤剤、無菌液、リポソームなどが挙げられる。そのようなキャリアを含む組成物は、周知の従来法により処方できる。製剤は、炭水化物、緩衝溶液、アミノ酸及び／又は界面活性剤を含むことがある。炭水化物は、非還元糖、好ましくはトレハロース、スクロース、八硫酸エステル、ソルビトール又はキシリトールでよい。そのような製剤は、ポンプシステムがある、及び／又はポンプシステムがない経皮でも皮下でもよい連続投与に使用できる。アミノ酸は、荷電アミノ酸、好ましくはリジン、リジン酢酸塩、アルギニン、グルタミン酸塩及び／又はヒスチジンでよい。界面活性剤は、好ましくは分子量が１．２ｋＤを超える洗剤及び／又は好ましくは分子量が３ｋＤを超えるポリエーテルでよい。好ましい洗剤の非限定的な例は、Ｔｗｅｅｎ２０、Ｔｗｅｅｎ４０、Ｔｗｅｅｎ６０、Ｔｗｅｅｎ８０又はＴｗｅｅｎ８５である。好ましいポリエーテルの非限定的な例は、ＰＥＧ３０００、ＰＥＧ３３５０、ＰＥＧ４０００又はＰＥＧ５０００である。本発明に使用される緩衝系は、ｐＨ５〜９を有することが好ましく、クエン酸塩、コハク酸塩、リン酸塩、ヒスチジン及び酢酸塩を含むことがある。本発明の組成物は、例えば、非チンパンジー霊長類、例えばマカクザルへの、本願に記載される異種間特異性を示す本発明のポリペプチドの投与量を増加させることによる用量増加試験により決定できる好適な用量で、被験者に投与することができる。上述のとおり、本願に記載される異種間特異性を示す本発明のポリペプチドは、好都合には、非チンパンジー霊長類における前臨床試験とヒトの薬剤として同一の形態で使用できる。これらの組成物は、他のタンパク質又は非タンパク質薬剤と組み合わせて投与することもできる。これらの薬剤は、本願に定義される本発明のポリペプチドを含む組成物と同時に投与してもよいが、前記ポリペプチドの投与の前又は後に、折良く決められた間隔及び用量で別々に投与することもできる。投与計画は、主治医及び臨床因子により決定されるであろう。医学分野に周知の通り、ある１人の患者への投与量は、患者の体格、体表面積、年齢、投与される特定の化合物、性別、投与の時間及び経路、全般的な健康状態及び同時に投与される他の薬剤など多くの因子による。非経口投与の調剤薬は、無菌の水溶液又は非水溶液、懸濁液及びエマルションを含む。非水溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油、オレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステルである。水性キャリアには、塩水及び緩衝媒体を含む、水、アルコール／水溶液、エマルション又は懸濁液がある。非経口賦形剤には、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロース及び塩化ナトリウム、乳酸リンゲル又は不揮発性油がある。静注用賦形剤には、流体及び栄養補液、電解質補液（リンゲルデキストロースに基づくものなど）等がある。抗菌剤、酸化防止剤、キレート剤、不活性ガスなどの防腐剤及び他の添加物も存在してよい。さらに、本発明の組成物は、好ましくはヒト起源の、血清アルブミン又は免疫グロブリンなどのタンパク質キャリアを含んでよい。本発明の組成物が、本願に定義された本発明のポリペプチドに加え、組成物の意図される用途によって、生物活性薬剤をさらに含むことが想定される。そのような薬剤は、胃腸系に作用する薬剤、細胞増殖抑止剤として作用する薬剤、高尿酸血症を防ぐ薬剤、免疫反応を阻害する薬剤（例えば、コルチコステロイド）、炎症反応を和らげる薬剤、循環系に作用する薬剤及び／又は当分野に工程のサイトカインなどの薬剤であることがある。
本願に定義される医薬組成物の生物活性は、例えば、以下の実施例、国際公開第９９／５４４４０号又はＳｃｈｌｅｒｅｔｈら（Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ． ２０ （２００５）， １ − １２）に記載される通り、細胞障害性アッセイにより測定することができる。本願での「効能」又は「インビボ効能」は、例えば標準化されたＮＣＩ応答基準を利用する、本発明の医薬組成物による治療への応答を意味する。本発明の医薬組成物を使用する治療の成功又はインビボ効能は、その意図された目的のための組成物の効力、すなわち組成物がその望まれる効果を起こす能力、すなわち、例えば腫瘍細胞など病的細胞の消耗を意味する。インビボ効能は、白血球数、ディファレンシャル、蛍光活性化細胞選別、骨髄穿刺法などがあるがこれらに限定されない、それぞれの疾病のための確立された標準方法により監視できる。それに加え、種々の疾病特異的な臨床化学パラメータ及び他の確立された標準法を使用してよい。さらに、コンピュータによる断層撮影、Ｘ線、核磁気共鳴断層撮影（例えば、米国国立ガン研究所の基準に基づく反応評価［Ｃｈｅｓｏｎ ＢＤ， Ｈｏｒｎｉｎｇ ＳＪ， Ｃｏｉｆｆｉｅｒ Ｂ， Ｓｈｉｐｐ ＭＡ， Ｆｉｓｈｅｒ Ｒｌ， Ｃｏｎｎｏｒｓ ＪＭ， Ｌｉｓｔｅｒ ＴＡ， Ｖｏｓｅ Ｊ， Ｇｒｉｌｌｏ−Ｌｏｐｅｚ Ａ， Ｈａｇｅｎｂｅｅｋ Ａ， Ｃａｂａｎｉｌｌａｓ Ｆ， Ｋｌｉｐｐｅｎｓｔｅｎ Ｄ， Ｈｉｄｄｅｍａｎｎ Ｗ， Ｃａｓｔｅｌｌｉｎｏ Ｒ， Ｈａｒｒｉｓ ＮＬ， Ａｒｍｉｔａｇｅ ＪＯ， Ｃａｒｔｅｒ Ｗ， Ｈｏｐｐｅ Ｒ， Ｃａｎｅｌｌｏｓ ＧＰ． Ｒｅｐｏｒｔ ｏｆ ａｎ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｗｏｒｋｓｈｏｐ ｔｏ ｓｔａｎｄａｒｄｉｚｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｃｒｉｔｅｒｉａ ｆｏｒ ｎｏｎ−Ｈｏｄｇｋｉｎ'ｓ ｌｙｍｐｈｏｍａｓ． ＮＣＩ Ｓｐｏｎｓｏｒｅｄ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｗｏｒｋｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ． Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ． １９９９ Ａｐｒ； １７（４）： １２４４］）、陽電子放出断層撮影スキャニング、白血球数、ディファレンシャル、蛍光活性化細胞選別、骨髄穿刺、リンパ節生検／組織構造及び種々のリンパ腫特異的な臨床化学的パラメータ（例えば、乳酸デヒドロゲナーゼ）及び他の確立された標準的な方法を利用できる。
本発明の医薬組成物などの薬剤の開発における他の主な課題は、薬物動態学的性質の予測可能な調整である。このために、薬剤候補の薬物動態学的プロファイル、すなわちある病気を治療するための特定の薬剤の能力を発揮する薬物動態学パラメータが確立される。ある疾病を治療するための薬剤の能力に影響を与える薬剤の薬物動態学的パラメータには、半減期、分布容積、肝初回通過代謝及び血清タンパク結合率があるが、これらに限定されない。ある薬剤の効能は、上述のパラメータのそれぞれにより影響を受けうる。
「半減期」は、投与された薬剤の５０％が、例えば代謝、排泄などの生物学的過程により除去される時間である。
「肝初回通過代謝」は、肝臓との初回接触時、すなわち肝臓を最初に通過する間に薬剤が代謝される傾向を意味する。「分布容積」は、体の種々の区画、例えば細胞内及び細胞外空間、組織及び器官等における薬剤の保持の程度及びこれらの区画中の薬剤の分布を意味する。「血清結合率」は、薬剤が、アルブミンなどの血清タンパク質と相互作用及び結合し、薬剤の生物活性の低下又は損失をもたらす傾向を意味する。
薬物動態学的パラメータには、投与されるある量の薬剤に対して、バイオアベイラビリティ、ラグタイム（Ｔｌａｇ）、Ｔｍａｘ、吸収速度、より多くの発症及び／又はＣｍａｘがある。
「バイオアベイラビリティ」は、血液区画中の薬剤の量を意味する。
「ラグタイム」は、薬剤の投与と血液又は血漿中のその検出及び可測性の間の遅延時間を意味する。
「Ｔｍａｘ」は、薬剤の最高血液濃度に達する時間であり、「Ｃｍａｘ」はある薬剤で最大に得られる血液濃度である。その生物学的効果のために要する薬剤の血液又は組織濃度に達する時間は、全てのパラメータに影響される。異種間特異性を示す本発明のポリペプチドの好ましい実施形態である、二重特異性単鎖抗体の薬物動態学的パラメータは、上記のとおり非チンパンジー霊長類における前臨床動物試験で測定可能だが、例えばＳｃｈｌｅｒｅｔｈら（Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ． ２０ （２００５）， １−１２）による刊行物にも述べられている。
本願での「毒性」という用語は、有害事象又は重篤な有害事象に明らかになる薬剤の毒作用を意味する。これらの副作用は、全般的な薬剤の耐容性の欠如及び／又は投与後の局所耐容性の欠如を意味することがある。毒性は、薬剤により起こる催寄性又は発ガン作用も含むことがある。
本願での「安全性」、「インビボ安全性」又は「耐容性」は、投与の直後（局所耐容性）及びより長い期間の薬剤の使用の間の重篤な有害事象を引き起こさない薬剤の投与を定義する。「安全性」、「インビボ安全性」又は「耐容性」は、例えば治療及び継続管理期間の間に定期的に評価できる。測定には、臨床評価、例えば器官の症状及び臨床検査値異常のスクリーニングが挙げられる。臨床評価は、ＮＣＩ−ＣＴＣ及び／又はＭｅｄＤＲＡ基準により記録／コード化された通常の所見により実施され基準から外れることもある。器官の症状には、Ｃｏｍｍｏｎ Ｔｅｒｍｉｎｏｌｏｇｙ Ｃｒｉｔｅｒｉａ ｆｏｒ ａｄｖｅｒｓｅ ｅｖｅｎｔｓ ｖ３．０ （ＣＴＣＡＥ）に述べられている通り、アレルギー／免疫、血液／骨髄、不整脈、凝固などの基準が含まれる。試験できる臨床検査パラメータには、例えば、血液、臨床化学検査、凝固プロファイル及び尿の分析があり、血清、血漿、リンパ球又は髄液、リカーなどの他の体液の検査がある。例えば、安全性は、身体検査、イメージング技術（すなわち、超音波、Ｘ線、ＣＴスキャン、磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ））、技術装置による他の手段（すなわち、心電図）、バイタルサインにより、臨床検査パラメータ測定及び有害事象の記録により評価できる。例えば、本発明の使用及び方法における非チンパンジー霊長類での有害事象は、組織病理学的及び／又は組織化学的方法により調査できる。
本願での「有効且つ非毒性の投与量」は、目立った毒作用を伴わず、又は基本的に伴わずに、病的細胞の枯渇、腫瘍の消去、腫瘍の縮小又は疾病の安定化をもたらすに十分なほど高い、本願に定義される二重特異性単鎖抗体の耐容量を意味する。そのような有効且つ非毒性の投与量は、例えば、当分野に記載される用量増加試験により決定することができ、重篤な有害事象を引き起こす用量未満でなくてはならない（用量規制毒性、ＤＬＴ）。
上記の用語は、例えば、バイオテクノロジー由来医薬品の前臨床における安全性評価Ｓ６；ＩＣＨ Ｈａｒｍｏｎｉｓｅｄ Ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅ Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅ； ＩＣＨ Ｓｔｅｅｒｉｎｇ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｍｅｅｔｉｎｇ ｏｎ Ｊｕｌｙ １６， １９９７にも言及されている。
さらに、本発明は、増殖性疾患、腫瘍性疾患又は免疫疾患から選択された疾患の予防、治療又は回復のための本発明のポリペプチド（すなわち、ヒト及び非チンパンジー霊長類ＣＤ３イプシロン鎖のエピトープに結合可能な少なくとも１つの結合ドメインを含むポリペプチドであって、前記エピトープが、本発明の、又は本発明の方法により産生された配列番号２、４、６又は８からなる群に含まれるアミノ酸配列の一部である）を含む医薬組成物に関する。好ましくは、前記医薬組成物は、キャリア、安定剤及び／又は賦形剤の好適な製剤をさらに含む。
本発明のさらなる態様は、先に本願に定義されたポリペプチド又は先に本願に定義された方法により産生されるポリペプチドの、疾患の予防、治療又は回復のための医薬組成物を調製するための使用に関する。好ましくは、前記疾患は、増殖性疾患、腫瘍性疾患又は免疫疾患である。前記腫瘍性疾患が悪性疾患、好ましくはガンであることがさらに好ましい。
本発明のポリペプチドの使用の他の好ましい実施形態において、前記医薬組成物は、追加の薬剤と組み合わせて、すなわち併用療法の一部として投与されることが好適である。前記併用療法において、活性薬剤が、本発明のポリペプチドとして同じ医薬組成物中に任意に含まれてもよく、或いは別な医薬組成物に含まれることもある。この後者の場合、前記の別な医薬組成物の投与は、本発明のポリペプチドを含む前記医薬組成物の投与の前でも、同時でも、その後でも好適である。追加の薬剤又は医薬組成物は、非タンパク質化合物でも、タンパク質化合物でもよい。追加の薬剤がタンパク質化合物である場合、タンパク質化合物が、免疫エフェクター細胞のための活性化シグナルを提供できるタンパク質化合物であることが有利である。
好ましくは、前記タンパク質化合物又は非タンパク質化合物は、本発明のポリペプチド、上記に定義された核酸分子、上記に定義されたベクター又は上記に定義されたホストと同時にでも、又は非同時にでも投与できる。
本発明の他の態様は、その必要のある被験者での疾患の予防、治療又は回復の方法に関するが、前記方法は本発明の有効量の医薬組成物を投与する工程を含む。好ましくは、前記疾患は、増殖性疾患、腫瘍性疾患又は免疫疾患である。さらにより好ましくは、前記腫瘍性疾患は、悪性疾患、好ましくはガンである。
本発明の方法の他の好ましい実施形態では、前記医薬組成物は、追加の薬剤と組み合わせて、すなわち併用療法の一部として投与されるのが好ましい。前記併用量において、活性薬剤が、本発明のポリペプチドとして同じ医薬組成物中に任意に含まれてもよく、或いは別な医薬組成物に含まれることもある。この後者の場合、前記の別な医薬組成物の投与は、本発明のポリペプチドを含む前記医薬組成物の投与の前でも、同時でも、その後でも好適である。追加の薬剤又は医薬組成物は、非タンパク質化合物でも、タンパク質化合物でもよい。追加の薬剤がタンパク質化合物である場合、タンパク質化合物が、免疫エフェクター細胞のための活性化シグナルを提供できるタンパク質化合物であることが有利である。
好ましくは、前記タンパク質化合物又は非タンパク質化合物は、本発明のポリペプチド、上記に定義された核酸分子、上記に定義されたベクター又は上記に定義されたホストと同時にでも、又は非同時にでも投与できる。
本発明の上記の方法では、前記被験者がヒトであることが好ましい。
さらなる態様において、本発明は、本発明のポリペプチド、本発明の核酸分子、本発明のベクター又は本発明のホストを含むキットに関する。
本発明は、以下のアイテムのリストによりさらに特徴づけられる。
アイテム１ ヒト及び非チンパンジー霊長類ＣＤ３イプシロン（ＣＤ３ε）のエピトープに結合可能な異種間特異性結合ドメインを含むポリペプチド（複数可）の同定方法であって、以下の工程を含む方法：
（ａ）該ポリペプチド（複数可）を、アミノ酸配列Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ（配列番号３８１）又はＧｌｎ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−ＧＩｙ（配列番号３８２）を含み、そのＣ末端で固定相に固定されている最大２７アミノ酸のＣＤ３εの細胞外ドメインのＮ末端断片に接触させる工程；
（ｂ）結合したポリペプチド（複数可）を前記断片から溶離する工程；及び
（ｃ）該ポリペプチド（複数可）を（ｂ）溶離液から単離する工程。
本発明の上記方法で同定されたポリペプチド（複数可）がヒト起源であることが好ましい。
本「ポリペプチド（複数可）の同定方法」は、複数のポリペプチド候補から、アミノ酸配列Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ（配列番号３８１）又はＧｌｎ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−ＧＩｙ（配列番号３８２）をそのＮ末端で含むＣＤ３εの細胞外ドメインの断片に対して同じ特異性を持つ１つ以上の異なるポリペプチドを単離する方法並びに溶液からのポリペプチドの精製方法であると理解される。ＣＤ３εの細胞外ドメインの断片に対して同じ特異性を持つ１つ以上の異なるポリペプチドを単離する方法の非限定的な実施形態には、抗原特異性結合体の選択方法、例えばハイブリドーマスクリーニングに通常利用されるパニング法、真核ホスト細胞の一過性導入／安定導入されたクローンのスクリーニング、ファージディスプレイ法がある。後者の溶液からのポリペプチドの精製方法の非限定的な例は、例えば、培養上清からのリコンビナント発現ポリペプチドの精製又はそのような培養液の調製である。
上述のとおり、本発明の方法に使用される断片は、霊長類ＣＤ３ε分子の細胞外ドメインのＮ末端断片である。異なる霊長類のＣＤ３ε分子の細胞外ドメインのアミノ酸配列は、配列番号１、３、５及び７に示されている。Ｎ末端オクタマーの２つの形態は、配列番号３８１及び３８２に示されている。本発明の方法により同定されるポリペプチドの結合用に、Ｎ末端が自由に利用可能であることが好ましい。本発明の文脈において、「自由に利用可能」という用語は、Ｈｉｓ−ｔａｇなどの追加モチーフがないと理解される。そのようなＨｉｓ−ｔａｇと本発明の方法により同定される結合分子との干渉は、添付する実施例６に記載されている。
本発明の方法によると、前記断片はＣ末端で固定相に固定されている。当業者は、本発明の方法の利用される実施形態に頼って、好適な固定相支持体を容易に発明の労作無く選択するであろう。固体支持体の例は、ビーズなどのマトリックス（例えば、アガロースビーズ、セファロースビーズ、ポリスチロールビーズ、デキストランビーズ）、プレート（培養プレート又は多穴プレート）並びに例えばＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）から知られるチップがあるが、これらに限定されない。断片の前記固体支持体への固定（ｆｉｘａｔｉｏｎ）／固定化（ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ）の手段及び方法の選択は、固体支持体の選択による。固定／固定化に通常利用される方法は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステルによるカップリングである。このカップリングの基となる化学作用並びに固定／固定化の他の方法は、例えばＨｅｒｍａｎｓｏｎ "Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ"， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ． （１９９６）から当業者に公知である。クロマトグラフィ支持体に固定／固定化するには、以下の手段が通常利用される：ＮＨＳ活性化セファロース（例えば、ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ−ＡｍｅｒｓｈａｍのＨｉＴｒａｐ−ＮＨＳ）、ＣｎＢｒ−活性化セファロース（例えば、ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ−Ａｍｅｒｓｈａｍ）、ＮＨＳ活性化デキストランビーズ（Ｓｉｇｍａ）又は活性化ポリメタクリレート。これらの試薬は、バッチ式手法にも使用できる。さらに、酸化鉄を含むデキストランビーズ（例えばＭｉｌｔｅｎｙｉから市販）もバッチ式手法に使用できる。これらのビーズは、溶液からビーズを分離するための磁石と組み合わせて使用できる。ポリペプチドは、ＮＨＳ活性化カルボキシメチルデキストランの使用によりＢｉａｃｏｒｅチップ（例えばＣＭ５チップ）に固定化できる。適当な固体支持体のさらなる例は、アミン反応性ＭｕｌｔｉＷｅｌｌプレート（例えば、ＮｕｎｃＩｍｍｏｂｉｌｉｚｅｒ（商標）プレート）である。
本発明の方法によると、ＣＤ３イプシロンの細胞外ドメインの前記断片は、直接に、或いは、リンカー又は他のタンパク質／ポリペプチド部分であることもあるアミノ酸のストレッチを介して固体支持体にカップリングできる。別法としては、ＣＤ３イプシロンの細胞外ドメインは、１つ以上のアダプター分子（複数可）により間接的にカップリングできる。
固定化されたエピトープに結合したペプチドを溶離する手段及び方法は当分野に周知である。同定されたポリペプチド（複数可）を溶離液から単離する方法にも同じことがいえる。
本発明と調和して、複数のポリペプチド候補から、そのＮ末端でアミノ酸配列Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−ＧＩｕ−Ｘ−ＧＩｙを含むＣＤ３εの細胞外ドメインの断片に同じ特異性を持つ１つ以上の異なるポリペプチドを単離する方法は、抗原特異体の選択に以下の方法の１つ以上の工程を含むことがある。
ＣＤ３ε特異的結合分子は、抗体から誘導されたレパートリーから選択できる。例えば、"Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ"； Ｅｄ． Ｂａｒｂａｓ， Ｂｕｒｔｏｎ， Ｓｃｏｔｔ ＆ Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ； Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， ２００１に開示されている標準的な手順に基づき、ファージディスプレイライブラリーを構築できる。抗体ライブラリー中の抗体断片のフォーマットはｓｃＦｖでよいが、一般的にはＦａｂ断片でも、さらには単一ドメイン抗体断片でもよい。抗体断片の単離には、ナイーブ抗体断片ライブラリーを利用できる。後に治療で利用するための潜在的に低い抗原性結合体の選択には、ヒト抗体断片ライブラリーが、ヒト抗体断片の直接選択に有利であることがある。場合によっては、それらは合成抗体ライブラリーの基礎を形成することがある（Ｋｎａｐｐｉｋ ｅｔ ａｌ． Ｊ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２０００， ２９６：５７ ｆｆ）。対応するフォーマットは、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ（以下に記載されるとおり）又はドメイン抗体（ｄＡｂｓ、Ｈｏｌｔ ｅｔ ａｌ．， Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２００３， ２１ ：４８４ ｆｆに総評されるとおり）でもよい。
多くの場合において、標的抗原に対し利用可能な免疫ヒト抗体源がないことも当分野で公知である。したがって、動物を標的抗原により免疫し、それぞれの抗体ライブラリーが動物組織、例えば脾臓又はＰＢＭＣから単離される。Ｎ末端断片をビオチン化し、或いはＫＬＨ又はウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）などのタンパク質に共有結合することができる。通常の手法によると、齧歯動物が免疫に使用される。非ヒト起源の免疫抗体レパートリーが、他の理由で、例えばラクダ種から誘導された単一ドメイン抗体（ＶＨＨ）の存在により（Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ， Ｊ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ７４：２７７； Ｄｅ Ｇｅｎｓｔ ｅｔ ａｌ． Ｄｅｖ Ｃｏｍｏ Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２００６， ３０：１８７ ｆｆに記載のとおり）特に有利である。したがって、抗体ライブラリーの対応するフォーマットは、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ（以下に記載の通り）又は単一ドメイン抗体（ＶＨＨ）でよい。
可能性のある一手法において、ｂａｌｂ／ｃ ｘ Ｃ５７黒交配の１０週齢のＦ１マウスを、成熟ＣＤ３ε鎖のＮ末端アミノ酸１から２７を翻訳融合としてＮ末端で示す膜貫通型ＥｐＣＡＭを発現する全細胞で免疫することができる。別法としては、マウスを、１−２７ＣＤ３イプシロンＦｃ融合タンパク質で免疫することもできる（対応する手法は添付する実施例２に記載される）。追加免疫（複数可）の後、血液サンプルをとり、ＣＤ３陽性Ｔ細胞に対する抗体血清力価を、例えばＦＡＣＳ分析で試験できる。通常、血清力価は、非免疫動物より免疫動物でははるかに高い。
免疫動物は、免疫抗体ライブラリーの構築の基礎を形成できる。そのようなライブラリーの例は、ファージディスプレイライブラリーがある。そのようなライブラリーは、一般的に、例えば"Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ"； Ｅｄ． Ｂａｒｂａｓ， Ｂｕｒｔｏｎ， Ｓｃｏｔｔ ＆ Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ； Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， ２００１に開示されている標準的な手順に基づき構築することができる。
非ヒト抗体は、より可変的な抗体ライブラリーの生成のためファージディスプレイによりヒト化でき、次いで選択の間バインダーのために高めることができる。
ファージディスプレイ手法では、抗体ライブラリーをディスプレイするファージのプールのいずれも、標的分子としてそれぞれの抗原を使用して結合体を選択する基礎を形成する。抗原特異的な抗原に結合したファージが単離される中心工程はパニングと呼ばれる。ファージの表面の抗体断片のディスプレイのため、この一般的な方法はファージディスプレイと呼ばれる。選択の好ましい一方法は、ファージによりディスプレイされたｓｃＦｖのＮ末端に翻訳融合した繊維状ファージＮ２ドメインなどの小さいタンパク質の使用である。結合体を単離するのに使用できる、当分野に公知の他のディスプレイ法は、リボソームディスプレイ法である（Ｇｒｏｖｅｓ ＆ Ｏｓｂｏｕｒｎ， Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｌ Ｔｈｅｒ． ２００５， ５：１２５ ｆｆ； Ｌｉｐｏｖｓｅｋ ＆ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ， Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２００４， ２９０：５２ ｆｆに総評されている）。
１−２７ＣＤ３ε−ＦＣ融合タンパク質へのｓｃＦｖファージ粒子の結合を示すために、クローニングされたｓｃＦｖレパートリーを持つファージライブラリーを、それぞれの培養上清からＰＥＧ（ポリエチレングリコール）により採取することができる。ｓｃＦｖファージ粒子は、固定化されたＣＤ３ε融合タンパク質とともにインキュベートすることができる。固定化されたＣＤ３εＦｃ融合タンパク質は固体相に被覆することができる。結合体は溶離することができ、溶離液を、新鮮な未感染細菌ホストの感染のために使用できる。ヒトｓｃＦｖ断片をコードする、ファージミドコピーにうまく形質導入された細菌ホストは、再びカルベニシリン耐性に関して選択され、次いで、例えばＶＣＭＳ１３ヘルパーファージに感染させられ、第２ラウンドの抗体ディスプレイ及びインビトロ選択を開始する。通常、合計で４から５ラウンドの選択が実施される。
単離された結合体の結合は、フローサイトメトリーアッセイを利用して、ＣＤ３イプシロン陽性Ｊｕｒｋａｔ細胞、ＨＰＢａｌｌ細胞、ＰＢＭＣ又は表面提示されたＥｐＣＡＭに融合したＮ末端ＣＤ３ε配列を有するトランスフェクトされた真核細胞で試験することができる（添付した実施例４参照）。
アイテム２ ポリペプチド（複数可）が、第１結合ドメインとして同定された結合ドメイン及び細胞表面抗原に結合可能な第２結合ドメインを含む、アイテム１の方法。
本発明の方法により同定されるポリペプチドの第２結合ドメインの生成のため、例えば、本願に定義される二重特異性単鎖抗体、それぞれのヒト及び非チンパンジー霊長類細胞表面抗原の両方に結合するモノクローナル抗体を使用できる。本願に記載される二重特異性ポリペプチドのための適当な結合ドメインを、当分野に記載の組換え法により異種間特異性モノクローナル抗体から誘導できる。ヒト細胞表面抗原及び非チンパンジー霊長類での前記細胞表面抗原のホモログに結合するモノクローナル抗体は、上述のとおりＦＡＣＳにより試験できる。文献に記載されるハイブリドーマ技術（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｋoｈｌｅｒ， Ｎａｔｕｒｅ ２５６ （１９７５）， ４９５−７）も異種間特異性抗体の生成に利用できる。例えば、マウスを、ヒト及び非チンパンジー霊長類ＣＤ３３で交互に免疫できる。これらのマウスから、異種間特異性抗体産生ハイブリドーマ細胞をハイブリドーマ技術により単離し、上述のＦＡＣＳにより分析できる。本願に記載される異種間特異性を示す二重特異性単鎖抗体などの二重特異性ポリペプチドの生成及び分析は以下の実施例に示される。異種間特異性を示す二重特異性単鎖抗体の利点には以下に列記される点がある。
アイテム３ 第２結合ドメインがヒト及び／又は非チンパンジー霊長類の細胞表面抗原と結合する、アイテム２の方法。
アイテム４ 第１結合ドメインが抗体である、アイテム１から３のいずれかの方法。
アイテム５ 抗体が単鎖抗体である、アイテム４の方法。
アイテム６ 第２結合ドメインが抗体である、アイテム２から５のいずれかの方法。
アイテム７ ＣＤ３εの細胞外ドメインの断片が、配列番号２、４、６又は８に示されるいずれかのアミノ酸配列を有するポリペプチドの１つ以上の断片からなる、アイテム１から６のいずれかの方法。
アイテム８ 前記断片の長さが、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７アミノ酸残基である、アイテム７の方法。
アイテム９ 同定の方法が、ヒト及び非チンパンジー霊長類ＣＤ３εとのエピトープに結合可能な異種間特異性結合ドメインを含む複数のポリペプチドをスクリーニングする方法である、アイテム１から８のいずれかの方法。
アイテム１０ 同定の方法が、ヒト及び非チンパンジー霊長類ＣＤ３εのエピトープに結合可能な異種間特異性結合ドメインを含むポリペプチドを精製／単離する方法である、アイテム１から８のいずれかの方法。
アイテム１１ 異種間特異性結合ドメインの生成のための、アミノ酸配列Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ（配列番号３８１）又はＧｌｎ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ（配列番号３８２）を含む最大２７アミノ酸のＣＤ３εの細胞外ドメインのＮ末端断片の使用。本発明の前記使用と調和して、生成した異種間特異性結合ドメインがヒト起源であることが好ましい。
アイテム１２ 異種間特異性結合ドメインが抗体である、アイテム１１による使用。
アイテム１３ 抗体が単鎖抗体である、アイテム１２による使用。
アイテム１４ 抗体が二重特異性抗体である、アイテム１２から１３による使用。
これらの実施形態及び他の実施形態は、本発明の説明及び実施例により開示されており、それらに包含される。免疫学における組換え技術及び方法は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ； Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， ３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ ２００１ ； Ｌｅｆｋｏｖｉｔｓ； Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍａｎｕａｌ； Ｔｈｅ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｓｏｕｒｃｅｂｏｏｋ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ； Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， １９９７； Ｇｏｌｅｍｉｓ； Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ： Ａ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｍａｎｕａｌ； Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， ２００２に記載されている。本発明により利用されるべき抗体、方法、使用及び化合物のいずれかに関するさらなる文献は、例えば電子デバイスを利用して公共の図書館及びデータベースから検索できる。例えば、インターネットで利用可能な公共データベース「Ｍｅｄｌｉｎｅ」は、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＰｕｂＭｅｄ／ｍｅｄｌｉｎｅ．ｈｔｍｌで利用できる。さらなるデータベース及びｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／などのアドレス又はｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｍｂｌ．ｄｅ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌでＥＭＢＬサービスホームページに列挙されたアドレスは当業者に公知であり、例えばｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ． ｇｏｏｇｌｅ．ｃｏｍを利用しても得られる。
［図１］異種可溶性タンパク質への霊長類ＣＤ３イプシロンのＮ末端アミノ酸１−２７の融合。
［図２］一過性導入された２９３細胞の上清中で、ヒトＩｇＧ１のヒンジ及びＦｃガンマ領域並びにＣ末端６ヒスチジンタグに融合した成熟ヒトＣＤ３イプシロンのＮ末端アミノ酸１−２７を含むコンストラクトの存在を検出するＥＬＩＳＡアッセイで測定された４連のサンプルの平均吸収値である。「２７アミノ酸ヒトＣＤ３Ｅ」と名称を付けられた第１カラムは、コンストラクトの平均吸収値を示し、「無関係な上清」と名称を付けられた第２のカラムは、ネガティブコントロールとして無関係なコンストラクトによりトランスフェクトされた２９３細胞の上清の平均値である。コンストラクトで得られた値をネガティブコントロールで得られた値と比較すると、組換えコンストラクトの存在を明らかに示している。
［図３］ヒトＩｇＧ１のヒンジ及びＦｃガンマ領域並びにＣ末端Ｈｉｓ６タグに融合した成熟ヒトＣＤ３イプシロン鎖のＮ末端アミノ酸１−２７を含むコンストラクトへの、ペリプラズム発現された単鎖抗体の粗調製物の形態である異種間特異性抗ＣＤ３結合分子の結合を検出するＥＬＩＳＡアッセイで測定された４連のサンプルの平均吸収値を示す。カラムは、左から右へ、Ａ２Ｊ ＨＬＰ、Ｉ２Ｃ ＨＬＰ、Ｅ２Ｍ ＨＬＰ、Ｆ７Ｏ ＨＬＰ、Ｇ４Ｈ ＨＬＰ、Ｈ２Ｃ ＨＬＰ、Ｅ１Ｌ ＨＬＰ、Ｆ１２Ｑ ＨＬＰ、Ｆ６Ａ ＨＬＰ及びＨ１Ｅ ＨＬＰと呼ばれる特異性の平均吸収値を示す。「ネガティブコントロール」と呼ばれる一番右のカラムは、ネガティブコントロールとしてネズミ抗ヒトＣＤ３抗体の単鎖調製物の平均吸収値を示す。抗ＣＤ３特異性で得られた値とネガティブコントロールで得られた値を比べると、成熟ヒトＣＤ３イプシロン鎖のＮ末端１−２７アミノ酸への抗ＣＤ３特異性の強い結合を明らかに示している。
［図４］異種膜結合タンパク質への霊長類ＣＤ３イプシロンのＮ末端アミノ酸１−２７の融合。
［図５］カニクイザルＥｐＣＡＭ並びにそれぞれ、ヒト、マーモセット、タマリン、リスザル及び家畜ブタのＣＤ３イプシロン鎖のＮ末端１−２７アミノ酸からなる組換え膜貫通型融合タンパク質の存在を検出するＦＡＣＳアッセイで試験された異なるトランスフェクタントのヒストグラムオーバーレイである。ヒストグラムオーバーレイは、左から右へ、上から下へ、それぞれヒト２７量体、マーモセット２７量体、タマリン２７量体、リスザル２７量体及びブタ２７量体を含むコンストラクトを発現するトランスフェクタントの結果を示す。個別のオーバーレイで、細線はネガティブコントロールとして抗ＦｌａｇＭ２の代わりに２％ＦＣＳを含むＰＢＳでインキュベートされたサンプルを表し、太線は抗ＦｌａｇＭ２抗体とともにインキュベートされたサンプルを表す。各コンストラクトで、ヒストグラムのオーバーレイは、トランスフェクタントへの抗ＦｌａｇＭ２抗体の結合を示し、トランスフェクタントでの組換えコンストラクトの発現を明らかに示している。
［図６Ａ］カニクイザルＥｐＣＡＭにそれぞれ融合したヒト、マーモセット、タマリン及びリスザルＣＤ３イプシロン鎖のＮ末端アミノ酸１−２７への、ペリプラズム発現された単鎖抗体の粗調製物の形態である異種間特異性抗ＣＤ３結合分子の結合を検出するＦＡＣＳアッセイで測定された種々のトランスフェクタントのヒストグラムオーバーレイである。
ヒストグラムオーバーレイは、左から右へ、上から下へ、Ｈ２Ｃ ＨＬＰ、Ｆ１２Ｑ ＨＬＰ、Ｅ２Ｍ ＨＬＰ及びＧ４Ｈ ＨＬＰとそれぞれ称されるＣＤ３特異的結合分子とともに試験されたヒト２７量体を含む１−２７ＣＤ３−ＥｐＣＡＭを発現するトランスフェクタントの結果を示す。
個別のオーバーレイにおいて、細線はネガティブコントロールとしてネズミ抗ヒトＣＤ３抗体の単鎖調製物とともにインキュベートされたサンプルを表し、太線は示されているそれぞれの抗ＣＤ３結合分子とともにインキュベートされたサンプルを表す。ブタ２７量体トランスフェクタントへの結合の欠如及び図５に示されるコンストラクトの発現レベルを考察すると、ヒストグラムのオーバーレイは、カニクイザルＥｐＣＡＭに融合したそれぞれヒト、マーモセット、タマリン及びリスザルＣＤ３イプシロン鎖のＮ末端アミノ酸１−２７を含む組換え膜貫通型融合タンパク質を発現する細胞への、完全に異種間特異的なヒト二重特異性単鎖抗体の試験された抗ＣＤ３特異性の特異的で強い結合を示し、したがって、抗ＣＤ３結合分子の多種霊長類異種間特異性を示す。
［図６Ｂ］カニクイザルＥｐＣＡＭにそれぞれ融合したヒト、マーモセット、タマリン及びリスザルＣＤ３イプシロン鎖のＮ末端アミノ酸１−２７への、ペリプラズム発現された単鎖抗体の粗調製物の形態である異種間特異性抗ＣＤ３結合分子の結合を検出するＦＡＣＳアッセイで測定された種々のトランスフェクタントのヒストグラムオーバーレイである。
ヒストグラムオーバーレイは、左から右へ、上から下へ、Ｈ２Ｃ ＨＬＰ、Ｆ１２Ｑ ＨＬＰ、Ｅ２Ｍ ＨＬＰ及びＧ４Ｈ ＨＬＰとそれぞれ称されるＣＤ３特異的結合分子とともに試験されたマーモセット２７量体を含む１−２７ＣＤ３−ＥｐＣＡＭを発現するトランスフェクタントの結果を示す。
個別のオーバーレイにおいて、細線はネガティブコントロールとしてネズミ抗ヒトＣＤ３抗体の単鎖調製物とともにインキュベートされたサンプルを表し、太線は示されているそれぞれの抗ＣＤ３結合分子とともにインキュベートされたサンプルを表す。ブタ２７量体トランスフェクタントへの結合の欠如及び図５に示されるコンストラクトの発現レベルを考察すると、ヒストグラムのオーバーレイは、カニクイザルＥｐＣＡＭに融合したそれぞれヒト、マーモセット、タマリン及びリスザルＣＤ３イプシロン鎖のＮ末端アミノ酸１−２７を含む組換え膜貫通型融合タンパク質を発現する細胞への、完全に異種間特異的なヒト二重特異性単鎖抗体の試験された抗ＣＤ３特異性の特異的で強い結合を示し、したがって、抗ＣＤ３結合分子の多種霊長類異種間特異性を示す。
［図６Ｃ］カニクイザルＥｐＣＡＭにそれぞれ融合したヒト、マーモセット、タマリン及びリスザルＣＤ３イプシロン鎖のＮ末端アミノ酸１−２７への、ペリプラズム発現された単鎖抗体の粗調製物の形態である異種間特異性抗ＣＤ３結合分子の結合を検出するＦＡＣＳアッセイで測定された種々のトランスフェクタントのヒストグラムオーバーレイである。
ヒストグラムオーバーレイは、左から右へ、上から下へ、Ｈ２Ｃ ＨＬＰ、Ｆ１２Ｑ ＨＬＰ、Ｅ２Ｍ ＨＬＰ及びＧ４Ｈ ＨＬＰとそれぞれ称されるＣＤ３特異的結合分子とともに試験されたタマリン２７量体を含む１−２７ＣＤ３−ＥｐＣＡＭを発現するトランスフェクタントの結果を示す。
個別のオーバーレイにおいて、細線はネガティブコントロールとしてネズミ抗ヒトＣＤ３抗体の単鎖調製物とともにインキュベートされたサンプルを表し、太線は示されているそれぞれの抗ＣＤ３結合分子とともにインキュベートされたサンプルを表す。ブタ２７量体トランスフェクタントへの結合の欠如及び図５に示されるコンストラクトの発現レベルを考察すると、ヒストグラムのオーバーレイは、カニクイザルＥｐＣＡＭに融合したそれぞれヒト、マーモセット、タマリン及びリスザルＣＤ３イプシロン鎖のＮ末端アミノ酸１−２７を含む組換え膜貫通型融合タンパク質を発現する細胞への、完全に異種間特異的なヒト二重特異性単鎖抗体の試験された抗ＣＤ３特異性の特異的で強い結合を示し、したがって、抗ＣＤ３結合分子の多種霊長類異種間特異性を示す。
［図６Ｄ］カニクイザルＥｐＣＡＭにそれぞれ融合したヒト、マーモセット、タマリン及びリスザルＣＤ３イプシロン鎖のＮ末端アミノ酸１−２７への、ペリプラズム発現された単鎖抗体の粗調製物の形態である異種間特異性抗ＣＤ３結合分子の結合を検出するＦＡＣＳアッセイで測定された種々のトランスフェクタントのヒストグラムオーバーレイである。
ヒストグラムオーバーレイは、左から右へ、上から下へ、Ｈ２Ｃ ＨＬＰ、Ｆ１２Ｑ ＨＬＰ、Ｅ２Ｍ ＨＬＰ及びＧ４Ｈ ＨＬＰとそれぞれ称されるＣＤ３特異的結合分子とともに試験されたリスザル２７量体を含む１−２７ＣＤ３−ＥｐＣＡＭを発現するトランスフェクタントの結果を示す。
個別のオーバーレイにおいて、細線はネガティブコントロールとしてネズミ抗ヒトＣＤ３抗体の単鎖調製物とともにインキュベートされたサンプルを表し、太線は示されているそれぞれの抗ＣＤ３結合分子とともにインキュベートされたサンプルを表す。ブタ２７量体トランスフェクタントへの結合の欠如及び図５に示されるコンストラクトの発現レベルを考察すると、ヒストグラムのオーバーレイは、カニクイザルＥｐＣＡＭに融合したそれぞれヒト、マーモセット、タマリン及びリスザルＣＤ３イプシロン鎖のＮ末端アミノ酸１−２７を含む組換え膜貫通型融合タンパク質を発現する細胞への、完全に異種間特異的なヒト二重特異性単鎖抗体の試験された抗ＣＤ３特異性の特異的で強い結合を示し、したがって、抗ＣＤ３結合分子の多種霊長類異種間特異性を示す。
［図６Ｅ］カニクイザルＥｐＣＡＭにそれぞれ融合したヒト、マーモセット、タマリン及びリスザルＣＤ３イプシロン鎖のＮ末端アミノ酸１−２７への、ペリプラズム発現された単鎖抗体の粗調製物の形態である異種間特異性抗ＣＤ３結合分子の結合を検出するＦＡＣＳアッセイで測定された種々のトランスフェクタントのヒストグラムオーバーレイである。
ヒストグラムオーバーレイは、左から右へ、上から下へ、Ｈ２Ｃ ＨＬＰ、Ｆ１２Ｑ ＨＬＰ、Ｅ２Ｍ ＨＬＰ及びＧ４Ｈ ＨＬＰとそれぞれ称されるＣＤ３特異的結合分子とともに試験されたブタ２７量体を含む１−２７ＣＤ３−ＥｐＣＡＭを発現するトランスフェクタントの結果を示す。
個別のオーバーレイにおいて、細線はネガティブコントロールとしてネズミ抗ヒトＣＤ３抗体の単鎖調製物とともにインキュベートされたサンプルを表し、太線は示されているそれぞれの抗ＣＤ３結合分子とともにインキュベートされたサンプルを表す。ブタ２７量体トランスフェクタントへの結合の欠如及び図５に示されるコンストラクトの発現レベルを考察すると、ヒストグラムのオーバーレイは、カニクイザルＥｐＣＡＭに融合したそれぞれヒト、マーモセット、タマリン及びリスザルＣＤ３イプシロン鎖のＮ末端アミノ酸１−２７を含む組換え膜貫通型融合タンパク質を発現する細胞への、完全に異種間特異的なヒト二重特異性単鎖抗体の試験された抗ＣＤ３特異性の特異的で強い結合を示し、したがって、抗ＣＤ３結合分子の多種霊長類異種間特異性を示す。
［図７］トランスフェクトされたネズミＥＬ４ Ｔ細胞上でのヒトＣＤ３イプシロンの検出のためのＦＡＣＳアッセイ。グラフ解析は、ヒストグラムのオーバーレイを示す。太線は、抗ヒトＣＤ３抗体ＵＣＨＴ−１とともにインキュベートされたトランスフェクトされた細胞を示す。細線は、マウスＩｇＧ１アイソタイプコントロールとともにインキュベートされた細胞を表す。抗ＣＤ３抗体ＵＣＨＴ−１の結合は、トランスフェクトされたネズミＥＬ４ Ｔ細胞の細胞表面でのヒトＣＤ３イプシロン鎖の発現を明らかに示す。
［図８Ａ］アラニンスキャニング実験でのアラニン変異体への異種間特異性抗ＣＤ３抗体の結合。個別の図で、カラムは、左から右へ、野生型トランスフェクタント（ＷＴ）及び位置１から２７からの全てのアラニン変異体の対数スケールでの任意単位の計算結合値を示す。結合値は以下の式を利用して計算される：
（式）
Figure 2014064568
この式において、「サンプル値」は、図に示される特定のアラニン変異体に対する特定の抗ＣＤ３抗体の結合の程度を示す任意単位の結合の値を意味し、「サンプル」は、特定のアラニンスキャニングトランスフェクタントにアッセイされた特定の抗ＣＤ３抗体で得られた幾何平均蛍光値を意味し、「ネガティブコントロール」は、特定のアラニン変異体にアッセイされたネガティブコントロールで得られた幾何平均蛍光値を意味し、ＵＣＨＴ−１は、特定のアラニン変異体にアッセイされたＵＣＨＴ−１抗体で得られた幾何平均蛍光値を意味し、「野生型」は、野生型トランスフェクタントでアッセイされた特定の抗ＣＤ３抗体で得られた幾何平均蛍光値を意味し、ｘはそれぞれのトランスフェクタントを明示し、ｙはそれぞれの抗ＣＤ３抗体を明示し、ｗｔはそれぞれのトランスフェクタントが野生型であることを明示する。個々のアラニン変異体の位置は、野生型アミノ酸の１文字のコード及び位置の数により標識づけられている。
キメラＩｇＧ分子として発現した異種間特異性抗ＣＤ３抗体Ａ２Ｊ ＨＬＰの結果を示す。位置４（アスパラギン）、位置２３（スレオニン）及び位置２５（イソロイシン）でのアラニンへの変異体では結合活性の低下が見られる。位置１（グルタミン）、位置２（アスパラギン酸）及び位置３（グリシン）及び位置５（グルタミン酸）でのアラニンへの変異体では結合が完全に失われている。
［図８Ｂ］アラニンスキャニング実験でのアラニン変異体への異種間特異性抗ＣＤ３抗体の結合。個別の図で、カラムは、左から右へ、野生型トランスフェクタント（ＷＴ）及び位置１から２７からの全てのアラニン変異体の対数スケールでの任意単位の計算結合値を示す。結合値は以下の式を利用して計算される：
（式）
Figure 2014064568
この式において、「サンプル値」は、図に示される特定のアラニン変異体に対する特定の抗ＣＤ３抗体の結合の程度を示す任意単位の結合の値を意味し、「サンプル」は、特定のアラニンスキャニングトランスフェクタントにアッセイされた特定の抗ＣＤ３抗体で得られた幾何平均蛍光値を意味し、「ネガティブコントロール」は、特定のアラニン変異体にアッセイされたネガティブコントロールで得られた幾何平均蛍光値を意味し、ＵＣＨＴ−１は、特定のアラニン変異体にアッセイされたＵＣＨＴ−１抗体で得られた幾何平均蛍光値を意味し、「野生型」は、野生型トランスフェクタントでアッセイされた特定の抗ＣＤ３抗体で得られた幾何平均蛍光値を意味し、ｘはそれぞれのトランスフェクタントを明示し、ｙはそれぞれの抗ＣＤ３抗体を明示し、ｗｔはそれぞれのトランスフェクタントが野生型であることを明示する。個々のアラニン変異体の位置は、野生型アミノ酸の１文字のコード及び位置の数により標識づけられている。
キメラＩｇＧ分子として発現した異種間特異性抗ＣＤ３抗体Ｅ２Ｍ ＨＬＰの結果を示す。位置４（アスパラギン）、位置２３（スレオニン）及び位置２５（イソロイシン）でのアラニンへの変異体では結合活性の低下が見られる。位置１（グルタミン）、位置２（アスパラギン酸）及び位置３（グリシン）及び位置５（グルタミン酸）でのアラニンへの変異体では結合が完全に失われている。
［図８Ｃ］アラニンスキャニング実験でのアラニン変異体への異種間特異性抗ＣＤ３抗体の結合。個別の図で、カラムは、左から右へ、野生型トランスフェクタント（ＷＴ）及び位置１から２７からの全てのアラニン変異体の対数スケールでの任意単位の計算結合値を示す。結合値は以下の式を利用して計算される：
（式）
Figure 2014064568
この式において、「サンプル値」は、図に示される特定のアラニン変異体に対する特定の抗ＣＤ３抗体の結合の程度を示す任意単位の結合の値を意味し、「サンプル」は、特定のアラニンスキャニングトランスフェクタントにアッセイされた特定の抗ＣＤ３抗体で得られた幾何平均蛍光値を意味し、「ネガティブコントロール」は、特定のアラニン変異体にアッセイされたネガティブコントロールで得られた幾何平均蛍光値を意味し、ＵＣＨＴ−１は、特定のアラニン変異体にアッセイされたＵＣＨＴ−１抗体で得られた幾何平均蛍光値を意味し、「野生型」は、野生型トランスフェクタントでアッセイされた特定の抗ＣＤ３抗体で得られた幾何平均蛍光値を意味し、ｘはそれぞれのトランスフェクタントを明示し、ｙはそれぞれの抗ＣＤ３抗体を明示し、ｗｔはそれぞれのトランスフェクタントが野生型であることを明示する。個々のアラニン変異体の位置は、野生型アミノ酸の１文字のコード及び位置の数により標識づけられている。
キメラＩｇＧ分子として発現した異種間特異性抗ＣＤ３抗体Ｈ２Ｃ ＨＬＰの結果を示す。位置４（アスパラギン）でのアラニンへの変異体では結合活性の低下が見られる。位置１（グルタミン）、位置２（アスパラギン酸）及び位置３（グリシン）及び位置５（グルタミン酸）でのアラニングルタミンへの変異体では結合が完全に失われている。
［図８Ｄ］アラニンスキャニング実験でのアラニン変異体への異種間特異性抗ＣＤ３抗体の結合。個別の図で、カラムは、左から右へ、野生型トランスフェクタント（ＷＴ）及び位置１から２７からの全てのアラニン変異体の対数スケールでの任意単位の計算結合値を示す。結合値は以下の式を利用して計算される：
（式）
Figure 2014064568
この式において、「サンプル値」は、図に示される特定のアラニン変異体に対する特定の抗ＣＤ３抗体の結合の程度を示す任意単位の結合の値を意味し、「サンプル」は、特定のアラニンスキャニングトランスフェクタントにアッセイされた特定の抗ＣＤ３抗体で得られた幾何平均蛍光値を意味し、「ネガティブコントロール」は、特定のアラニン変異体にアッセイされたネガティブコントロールで得られた幾何平均蛍光値を意味し、ＵＣＨＴ−１は、特定のアラニン変異体にアッセイされたＵＣＨＴ−１抗体で得られた幾何平均蛍光値を意味し、「野生型」は、野生型トランスフェクタントでアッセイされた特定の抗ＣＤ３抗体で得られた幾何平均蛍光値を意味し、ｘはそれぞれのトランスフェクタントを明示し、ｙはそれぞれの抗ＣＤ３抗体を明示し、ｗｔはそれぞれのトランスフェクタントが野生型であることを明示する。個々のアラニン変異体の位置は、野生型アミノ酸の１文字のコード及び位置の数により標識づけられている。
ペリプラズム発現した単鎖抗体として試験される、異種間特異性抗ＣＤ３抗体Ｆ１２Ｑ ＨＬＰの結果を示す。位置１（グルタミン）、位置２（アスパラギン酸）及び位置３（グリシン）及び位置５（グルタミン酸）でのアラニンへの変異体では結合が完全に失われている。
［図９］Ｎ末端Ｈｉｓ６タグがある場合と無い場合のヒトＣＤ３への、異種間特異性抗ＣＤ３結合分子Ｈ２Ｃ ＨＬＰの結合を検出するＦＡＣＳアッセイ。ヒストグラムオーバーレイは、異種間特異性結合分子Ｈ２Ｃ ＨＬＰの結合を検出するＦＡＣＳアッセイで試験された、野生型ヒトＣＤ３イプシロン鎖（左のヒストグラム）又はＮ末端Ｈｉｓ６タグがあるヒトＣＤ３イプシロン鎖（右のヒストグラム）によりトランスフェクトされたＥＬ４細胞株で実施される。サンプルは、ネガティブコントロールとして適当なアイソタイプコントロールと（細線）、ポジティブコントロールとして抗ヒトＣＤ３抗体ＵＣＨＴ−１と（点線）及びキメラＩｇＧ分子の形態の異種間特異性抗ＣＤ３抗体Ｈ２Ｃ ＨＬＰと（太線）ともにインキュベートされる。
ヒストグラムオーバーレイは、組換え構築体の両方の発現を示すアイソタイプコントロールに比べ、両トランスフェクタントへのＵＣＨＴ−１抗体の同等な結合を示す。ヒストグラムオーバーレイは、Ｈｉｓ６ヒトＣＤ３イプシロン鎖でなく、野生型ヒトＣＤ３イプシロン鎖のみへの抗ＣＤ３結合分子Ｈ２Ｃ ＨＬＰの結合も示す。これらの結果は、異種間特異性抗ＣＤ３結合分子Ｈ２Ｃ ＨＬＰの結合にはフリーのＮ末端が必須であることを表す。
［図１０］ＦＡＣＳ分析による、細胞上でのＣＤ３結合のＫＤ値を測定する、ヒトＣＤ３陽性ＰＢＭＣへのＥＧＦＲ−２１−６３ ＬＨ ｘ Ｈ２Ｃの飽和結合。このアッセイは、実施例７に記載されるとおり実施される。
［図１１ａ］ヒトＥＧＦＲによりトランスフェクトされたＣＨＯ細胞、ヒトＣＤ３＋Ｔ細胞株ＨＰＢ−ＡＬＬ、カニクイザルＥＧＦＲによりトランスフェクトされたＣＨＯ細胞及びマカクザルＴ細胞株４１１９ＬｎＰｘへの、明示された種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトのＦＡＣＳ結合分析。ＦＡＣＳ染色は実施例１２に記載のとおり実施される。太線は、２μｇ／ｍｌの精製タンパク質とともにインキュベートされ、その後抗ｈｉｓ抗体及びＰＥ標識検出抗体とともにインキュベートされた細胞を表す。細いヒストグラムの線はネガティブコントロールを表す：細胞は、抗ｈｉｓ抗体及び検出抗体とインキュベートされるのみである。
［図１１ｂ］ヒトＥＧＦＲによりトランスフェクトされたＣＨＯ細胞、ヒトＣＤ３＋Ｔ細胞株ＨＰＢ−ＡＬＬ、カニクイザルＥＧＦＲによりトランスフェクトされたＣＨＯ細胞及びマカクザルＴ細胞株４１１９ＬｎＰｘへの、明示された種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトのＦＡＣＳ結合分析。ＦＡＣＳ染色は実施例１２に記載のとおり実施される。太線は、２μｇ／ｍｌの精製タンパク質とともにインキュベートされ、その後抗ｈｉｓ抗体及びＰＥ標識検出抗体とともにインキュベートされた細胞を表す。細いヒストグラムの線はネガティブコントロールを表す：細胞は、抗ｈｉｓ抗体及び検出抗体とインキュベートされるのみである。
［図１１ｃ］ヒトＥＧＦＲによりトランスフェクトされたＣＨＯ細胞、ヒトＣＤ３＋Ｔ細胞株ＨＰＢ−ＡＬＬ、カニクイザルＥＧＦＲによりトランスフェクトされたＣＨＯ細胞及びマカクザルＴ細胞株４１１９ＬｎＰｘへの、明示された種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトのＦＡＣＳ結合分析。ＦＡＣＳ染色は実施例１２に記載のとおり実施される。太線は、２μｇ／ｍｌの精製タンパク質とともにインキュベートされ、その後抗ｈｉｓ抗体及びＰＥ標識検出抗体とともにインキュベートされた細胞を表す。細いヒストグラムの線はネガティブコントロールを表す：細胞は、抗ｈｉｓ抗体及び検出抗体とインキュベートされるのみである。
［図１１ｄ］ヒトＥＧＦＲによりトランスフェクトされたＣＨＯ細胞、ヒトＣＤ３＋Ｔ細胞株ＨＰＢ−ＡＬＬ、カニクイザルＥＧＦＲによりトランスフェクトされたＣＨＯ細胞及びマカクザルＴ細胞株４１１９ＬｎＰｘへの、明示された種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトのＦＡＣＳ結合分析。ＦＡＣＳ染色は実施例１２に記載のとおり実施される。太線は、２μｇ／ｍｌの精製タンパク質とともにインキュベートされ、その後抗ｈｉｓ抗体及びＰＥ標識検出抗体とともにインキュベートされた細胞を表す。細いヒストグラムの線はネガティブコントロールを表す：細胞は、抗ｈｉｓ抗体及び検出抗体とインキュベートされるのみである。
［図１２ａ］示される標的細胞株に向け直された、明示された異種間特異性ＥＧＦＲ特異性単鎖コンストラクトにより誘起される細胞障害活性。Ａ）及びＢ）刺激されたＣＤ４−／ＣＤ５６−ヒトＰＢＭＣがエフェクター細胞として使用され、ヒトＥＧＦＲによりトランスフェクトされたＣＨＯ細胞が標的細胞として使用される。アッセイは実施例１３に記載のとおり実施される。
［図１２ｂ］示される標的細胞株に向け直された、明示された異種間特異性ＥＧＦＲ特異性単鎖コンストラクトにより誘起される細胞障害活性。Ａ）及びＢ）刺激されたＣＤ４−／ＣＤ５６−ヒトＰＢＭＣがエフェクター細胞として使用され、ヒトＥＧＦＲによりトランスフェクトされたＣＨＯ細胞が標的細胞として使用される。アッセイは実施例１３に記載のとおり実施される。
［図１２ｃ］示される標的細胞株に向け直された、明示された異種間特異性ＥＧＦＲ特異性単鎖コンストラクトにより誘起される細胞障害活性。Ａ）及びＢ）刺激されたＣＤ４−／ＣＤ５６−ヒトＰＢＭＣがエフェクター細胞として使用され、ヒトＥＧＦＲによりトランスフェクトされたＣＨＯ細胞が標的細胞として使用される。アッセイは実施例１３に記載のとおり実施される。
［図１２ｄ］示される標的細胞株に向け直された、明示された異種間特異性ＥＧＦＲ特異性単鎖コンストラクトにより誘起される細胞障害活性。Ａ）及びＢ）刺激されたＣＤ４−／ＣＤ５６−ヒトＰＢＭＣがエフェクター細胞として使用され、ヒトＥＧＦＲによりトランスフェクトされたＣＨＯ細胞が標的細胞として使用される。アッセイは実施例１３に記載のとおり実施される。
［図１３］示される標的細胞株に向け直された、明示された異種間特異性ＥＧＦＲ特異性単鎖コンストラクトにより誘起される細胞障害活性。Ａ）及びＢ）マカクザルＴ細胞株４１１９ＬｎＰｘがエフェクター細胞として使用され、カニクイザルＥＧＦＲによりトランスフェクトされたＣＨＯ細胞が標的細胞として使用される。アッセイは実施例１３に記載のとおり実施される。
［図１４］ヒトＭＣＳＰ Ｄ３によりトランスフェクトされたＣＨＯ細胞、ヒトＣＤ３＋Ｔ細胞株ＨＰＢ−ＡＬＬ、カニクイザルＭＣＳＰ Ｄ３によりトランスフェクトされたＣＨＯ細胞及びマカクザルＴ細胞株４１１９ ＬｎＰｘへの、明示された種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトのＦＡＣＳ結合分析。ＦＡＣＳ染色は、実施例１７に記載されたとおり実施される。太線は、２μｇ／ｍｌの精製タンパク質とともにインキュベートされ、その後抗ｈｉｓ抗体及びＰＥ標識検出抗体とともにインキュベートされた細胞を表す。細いヒストグラム線はネガティブコントロールを表す。細胞は、抗ｈｉｓ抗体及び検出抗体とインキュベートされるのみである。
［図１５］ヒトＭＣＳＰ Ｄ３によりトランスフェクトされたＣＨＯ細胞、ヒトＣＤ３＋Ｔ細胞株ＨＰＢ−ＡＬＬ、カニクイザルＭＣＳＰ Ｄ３によりトランスフェクトされたＣＨＯ細胞及びマカクザルＴ細胞株４１１９ ＬｎＰＸへの、明示された種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトのＦＡＣＳ結合分析。ＦＡＣＳ染色は、実施例１７に記載されたとおり実施される。太線は、２μｇ／ｍｌの精製タンパク質とともにインキュベートされ、その後抗ｈｉｓ抗体及びＰＥ標識検出抗体とともにインキュベートされた細胞を表す。細いヒストグラム線はネガティブコントロールを表す。細胞は、抗ｈｉｓ抗体及び検出抗体とインキュベートされるのみである。
［図１６］ヒトＭＣＳＰ Ｄ３によりトランスフェクトされたＣＨＯ細胞、ヒトＣＤ３＋Ｔ細胞株ＨＰＢ−ＡＬＬ、カニクイザルＭＣＳＰ Ｄ３によりトランスフェクトされたＣＨＯ細胞及びマカクザルＴ細胞株４１１９ ＬｎＰＸへの、明示された種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトのＦＡＣＳ結合分析。ＦＡＣＳ染色は、実施例１７に記載されたとおり実施される。太線は、２μｇ／ｍｌのモノマータンパク質とともにインキュベートされ、その後抗ｈｉｓ抗体及びＰＥ標識検出抗体とともにインキュベートされた細胞を表す。細いヒストグラム線はネガティブコントロールを表す。細胞は、抗ｈｉｓ抗体及び検出抗体とインキュベートされるのみである。
［図１７］示される標的細胞株に向け直された、明示された異種間特異性ＭＣＳＰ特異性単鎖コンストラクトにより誘起される細胞障害活性。Ａ）刺激されたＣＤ４−／ＣＤ５６−ヒトＰＢＭＣがエフェクター細胞として使用され、ヒトＭＣＳＰ Ｄ３によりトランスフェクトされたＣＨＯ細胞が標的細胞として使用される。Ｂ）マカクザルＴ細胞株４１１９ＬｎＰｘがエフェクター細胞として使用され、カニクイザルＭＣＳＰ Ｄ３によりトランスフェクトされたＣＨＯ細胞が標的細胞として使用される。アッセイは実施例１８に記載のとおり実施される。
［図１８］示される標的細胞株に向け直された、明示された異種間特異性ＭＣＳＰ特異性単鎖コンストラクトにより誘起される細胞障害活性。Ａ）及びＢ）マカクザルＴ細胞株４１１９ ＬｎＰｘがエフェクター細胞として使用され、カニクイザルＭＣＳＰ Ｄ３によりトランスフェクトされたＣＨＯ細胞が標的細胞として使用される。アッセイは実施例１８に記載のとおり実施される。
［図１９］示される標的細胞株に向け直された、明示された異種間特異性ＭＣＳＰ特異性単鎖コンストラクトにより誘起される細胞障害活性。Ａ）及びＢ）刺激されたＣＤ４−／ＣＤ５６−ヒトＰＢＭＣがエフェクター細胞として使用され、ヒトＭＣＳＰ Ｄ３によりトランスフェクトされたＣＨＯ細胞が標的細胞として使用される。アッセイは実施例１８に記載のとおり実施される。
［図２０］示される標的細胞株に向け直された、明示された異種間特異性ＭＣＳＰ特異性単鎖コンストラクトにより誘起される細胞障害活性。Ａ）刺激されたＣＤ４−／ＣＤ５６−ヒトＰＢＭＣがエフェクター細胞として使用され、ヒトＭＣＳＰ Ｄ３によりトランスフェクトされたＣＨＯ細胞が標的細胞として使用される。Ｂ）マカクザルＴ細胞株４１１９ ＬｎＰｘがエフェクター細胞として使用され、カニクイザルＭＣＳＰ Ｄ３によりトランスフェクトされたＣＨＯ細胞が標的細胞として使用される。アッセイは実施例１８に記載のとおり実施される。
［図２１］示される標的細胞株に向け直された、明示された異種間特異性ＭＣＳＰ特異性単鎖コンストラクトにより誘起される細胞障害活性。Ａ）刺激されたＣＤ４−／ＣＤ５６−ヒトＰＢＭＣがエフェクター細胞として使用され、ヒトＭＣＳＰ Ｄ３によりトランスフェクトされたＣＨＯ細胞が標的細胞として使用される。Ｂ）マカクザルＴ細胞株４１１９ ＬｎＰｘがエフェクター細胞として使用され、カニクイザルＭＣＳＰ Ｄ３によりトランスフェクトされたＣＨＯ細胞が標的細胞として使用される。アッセイは実施例１８に記載のとおり実施される。
［図２２−１］５０％ヒト血漿とともにそれぞれ３７℃及び４℃で２４時間インキュベートされた、或いは細胞障害性試験の直前に５０％ヒト血漿が添加された、又は血漿が添加されない、明示された単鎖コンストラクトのサンプルにより誘起された、細胞障害活性の測定により試験されるＭＣＳＰ及びＣＤ３種間特異的二重特異性単鎖抗体の血漿安定性。ヒトＭＣＳＰによりトランスフェクトされたＣＨＯ細胞が標的細胞株として使用され、刺激されたＣＤ４−／ＣＤ５６−ヒトＰＢＭＣがエフェクター細胞として使用される。アッセイは実施例１９に記載されるとおり実施される。
［図２２−２］５０％ヒト血漿とともにそれぞれ３７℃及び４℃で２４時間インキュベートされた、或いは細胞障害性試験の直前に５０％ヒト血漿が添加された、又は血漿が添加されない、明示された単鎖コンストラクトのサンプルにより誘起された、細胞障害活性の測定により試験されるＭＣＳＰ及びＣＤ３種間特異的二重特異性単鎖抗体の血漿安定性。ヒトＭＣＳＰによりトランスフェクトされたＣＨＯ細胞が標的細胞株として使用され、刺激されたＣＤ４−／ＣＤ５６−ヒトＰＢＭＣがエフェクター細胞として使用される。アッセイは実施例１９に記載されるとおり実施される。
［図２２−３］５０％ヒト血漿とともにそれぞれ３７℃及び４℃で２４時間インキュベートされた、或いは細胞障害性試験の直前に５０％ヒト血漿が添加された、又は血漿が添加されない、明示された単鎖コンストラクトのサンプルにより誘起された、細胞障害活性の測定により試験されるＭＣＳＰ及びＣＤ３種間特異的二重特異性単鎖抗体の血漿安定性。ヒトＭＣＳＰによりトランスフェクトされたＣＨＯ細胞が標的細胞株として使用され、刺激されたＣＤ４−／ＣＤ５６−ヒトＰＢＭＣがエフェクター細胞として使用される。アッセイは実施例１９に記載されるとおり実施される。
［図２３ａ］それぞれ、ヒトＨＥＲ２によりトランスフェクトされたＣＨＯ細胞、ヒトＣＤ３＋Ｔ細胞株ＨＰＢ−ＡＬＬ、マカクザルＨＥＲ２によりトランスフェクトされたＣＨＯ細胞及びマカクザルＴ細胞株４１１９ ＬｎＰｘへの、明示された種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトのＦＡＣＳ結合分析。ＦＡＣＳ染色は、実施例２３．４に記載されるとおり実施される。太線は、２μｇ／ｍｌ精製二重特異的単鎖コンストラクトとともにインキュベートされた細胞を表す。細線はネガティブコントロールを表す。２％ＦＣＳを含むＰＢＳがネガティブコントロールとして使用された。各種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトで、ヒストグラムのオーバーレイは、ヒト及びマカクザルのＨＥＲ２並びにヒト及びマカクザルＣＤ３へのコンストラクトの特異的な結合を示す。
［図２３ｂ］それぞれ、ヒトＨＥＲ２によりトランスフェクトされたＣＨＯ細胞、ヒトＣＤ３＋Ｔ細胞株ＨＰＢ−ＡＬＬ、マカクザルＨＥＲ２によりトランスフェクトされたＣＨＯ細胞及びマカクザルＴ細胞株４１１９ ＬｎＰｘへの、明示された種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトのＦＡＣＳ結合分析。ＦＡＣＳ染色は、実施例２３．４に記載されるとおり実施される。太線は、２μｇ／ｍｌ精製二重特異的単鎖コンストラクトとともにインキュベートされた細胞を表す。細線はネガティブコントロールを表す。２％ＦＣＳを含むＰＢＳがネガティブコントロールとして使用された。各種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトで、ヒストグラムのオーバーレイは、ヒト及びマカクザルのＨＥＲ２並びにヒト及びマカクザルＣＤ３へのコンストラクトの特異的な結合を示す。
［図２４ａ］ダイヤグラムは、示される標的細胞株へ向け直される、明示される異種間特異性ＨＥＲ２特異性単鎖コンストラクトにより誘起される細胞障害活性を測定する、クロム放出アッセイの結果を示す。示されるとおり、エフェクター細胞も使用された。アッセイは、実施例２３．５に記載されるとおり実施される。ダイヤグラムは、示される各コンストラクトで、それぞれヒト及びマカクザルＨＥＲ２でトランスフェクトされたＣＨＯ細胞に対してヒト及びマカクザルエフェクター細胞の細胞障害活性の潜在的な漸増を明らかに示す。
［図２４ｂ］ダイヤグラムは、示される標的細胞株へ向け直される、明示される異種間特異性ＨＥＲ２特異性単鎖コンストラクトにより誘起される細胞障害活性を測定する、クロム放出アッセイの結果を示す。示されるとおり、エフェクター細胞も使用された。アッセイは、実施例２３．５に記載されるとおり実施される。ダイヤグラムは、示される各コンストラクトで、それぞれヒト及びマカクザルＨＥＲ２でトランスフェクトされたＣＨＯ細胞に対してヒト及びマカクザルエフェクター細胞の細胞障害活性の潜在的な漸増を明らかに示す。
［図２５］選択されたクローンからのＦｌａｇタグ付きｓｃＦｖタンパク質断片を含むペリプラズム調製物のＣＤ３特異的ＥＬＩＳＡ分析。可溶性ヒトＣＤ３イプシロン（ａａ１−２７）Ｆｃ融合タンパク質でコートされ、さらに３％ＢＳＡを含むＰＢＳでブロックされたＥＬＩＳＡプレートのウェルに、可溶性ｓｃＦｖタンパク質断片のペリプラズム調製物が加えられた。検出は、モノクローナル抗Ｆｌａｇ−ビオチン−標識抗体、次いでペルオキシダーゼ結合ストレプトアビジンにより実施された。ＥＬＩＳＡは、ＡＢＴＳ基質溶液により展開された。ＯＤ値（ｙ軸）は、ＥＬＩＳＡリーダーにより４０５ｎｍで測定された。クローン名がｘ軸上に示されている。
［図２６］選択されたクローンからのＦｌａｇタグ付きｓｃＦｖタンパク質断片を含むペリプラズム調製物のＥＬＩＳＡ分析。ｈｕｌｇＧ１（Ｓｉｇｍａ）とともにヒトＣＤ３イプシロン（ａａ１−２７）Ｆｃ融合タンパク質でコートされ、さらに３％ＢＳＡを含むＰＢＳでブロックされたＥＬＩＳＡプレートのウェルに、図２５と同じ可溶性ｓｃＦｖタンパク質断片のペリプラズム調製物が加えられた。
検出は、モノクローナル抗Ｆｌａｇ−ビオチン−標識抗体、次いでペルオキシダーゼ結合ストレプトアビジンにより実施された。ＥＬＩＳＡは、ＡＢＴＳ基質溶液により展開された。ＯＤ値（ｙ軸）は、ＥＬＩＳＡリーダーにより４０５ｎｍで測定された。クローン名がｘ軸上に示されている。
本発明のより良い理解及び多くの利点を提供する、実例となる非限定的な以下の実施例により、本発明はさらに説明される。
１．非ヒト霊長類の血液サンプルからのＣＤ３イプシロン配列の同定
以下の非ヒト霊長類、カリスリクス・ジャカス、サグイヌス・オイディプス及びサイミリ・シウレウスの血液サンプルを、ＣＤ３イプシロン同定に使用した。新鮮なヘパリン処理全血サンプルを、製造業者のプロトコルに従い（ＱＩＡａｍｐ ＲＮＡ Ｂｌｏｏｄ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ、Ｑｉａｇｅｎ）トータル細胞ＲＮＡの単離のために調製した。抽出したｍＲＮＡは、発表されているプロトコルに従いｃＤＮＡに転写した。簡単に言うと、１０μｌの沈殿したＲＮＡを、１．２μｌの１０×ヘキサヌクレオチドミックス（Ｒｏｃｈｅ）と７０℃で１０分間インキュベートし、氷上で保存した。４μｌの５×ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩバッファ、０．２μｌの０．１Ｍジチオスレイトール、０．８μｌのｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１．２μｌのデオキシリボヌクレオシド三リン酸（２５μＭ）、０．８μｌのＲＮａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ｒｏｃｈｅ）及び１．８μｌのＤＮａｓｅ・ＲＮａｓｅフリーウォーター（Ｒｏｃｈｅ）からなる反応ミックスを加えた。反応ミックスを、室温で１０分間インキュベートし、次いで４２℃で５０分間、９０℃で５分間インキュベートした。反応を氷上で冷却してから、０．８μｌのＲＮａｓｅＨ（１Ｕ／μｌ、Ｒｏｃｈｅ）を加え、３７℃で２０分間インキュベートした。
各種からの第１鎖ｃＤＮＡに、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｉｇｍａ）及びデータベース研究で設計された以下のプライマー組み合わせを利用して、別々な３５サイクルポリメラーゼ連鎖反応を施した：フォワードプライマー５'−ＡＧＡＧＴＴＣＴＧＧＧＣＣＴＣＴＧＣ−３'（配列番号３７７）；リバースプライマー５'−ＣＧＧＡＴＧＧＧＣＴＣＡＴＡＧＴＣＴＧ−３'（配列番号３７８）。増幅された５５０ｂｐバンドをゲル精製し（Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ、Ｑｉａｇｅｎ）、配列決定した（Ｓｅｑｕｉｓｅｒｖｅ、Ｖａｔｅｒｓｔｅｔｔｅｎ／ドイツ、配列表参照）。
ＣＤ３イプシロン、カリスリクス・ジャカス
ヌクレオチド
ＣＡＧＧＡＣＧＧＴＡＡＴＧＡＡＧＡＡＡＴＧＧＧＴＧＡＴＡＣＴＡＣＡＣＡＧＡＡＣＣＣＡＴＡＴＡＡＡＧＴＴＴＣＣＡＴＣＴＣＡＧＧＡＡＣＣＡＣＡＧＴＡＡＣＡＣＴＧＡＣＡＴＧＣＣＣＴＣＧＧＴＡＴＧＡＴＧＧＡＣＡＴＧＡＡＡＴＡＡＡＡＴＧＧＣＴＣＧＴＡＡＡＴＡＧＴＣＡＡＡＡＣＡＡＡＧＡＡＧＧＴＣＡＴＧＡＧＧＡＣＣＡＣＣＴＧＴＴＡＣＴＧＧＡＧＧＡＣＴＴＴＴＣＧＧＡＡＡＴＧＧＡＧＣＡＡＡＧＴＧＧＴＴＡＴＴＡＴＧＣＣＴＧＣＣＴＣＴＣＣＡＡＡＧＡＧＡＣＴＣＣＣＧＣＡＧＡＡＧＡＧＧＣＧＡＧＣＣＡＴＴＡＴＣＴＣＴＡＣＣＴＧＡＡＧＧＣＡＡＧＡＧＴＧＴＧＴＧＡＧＡＡＣＴＧＣＧＴＧＧＡＧＧＴＧＧＡＴ
アミノ酸
ＱＤＧＮＥＥＭＧＤＴＴＱＮＰＹＫＶＳＩＳＧＴＴＶＴＬＴＣＰＲＹＤＧＨＥＩＫＷＬＶＮＳＱＮＫＥＧＨＥＤＨＬＬＬＥＤＦＳＥＭＥＱＳＧＹＹＡＣＬＳＫＥＴＰＡＥＥＡＳＨＹＬＹＬＫＡＲＶＣＥＮＣＶＥＶＤ
ＣＤ３イプシロン、サグイヌス・オイディプス
ヌクレオチド
ＣＡＧＧＡＣＧＧＴＡＡＴＧＡＡＧＡＡＡＴＧＧＧＴＧＡＴＡＣＴＡＣＡＣＡＧＡＡＣＣＣＡＴＡＴＡＡＡＧＴＴＴＣＣＡＴＣＴＣＡＧＧＡＡＣＣＡＣＡＧＴＡＡＣＡＣＴＧＡＣＡＴＧＣＣＣＴＣＧＧＴＡＴＧＡＴＧＧＡＣＡＴＧＡＡＡＴＡＡＡＡＴＧＧＣＴＴＧＴＡＡＡＴＡＧＴＣＡＡＡＡＣＡＡＡＧＡＡＧＧＴＣＡＴＧＡＧＧＡＣＣＡＣＣＴＧＴＴＡＣＴＧＧＡＧＧＡＴＴＴＴＴＣＧＧＡＡＡＴＧＧＡＧＣＡＡＡＧＴＧＧＴＴＡＴＴＡＴＧＣＣＴＧＣＣＴＣＴＣＣＡＡＡＧＡＧＡＣＴＣＣＣＧＣＡＧＡＡＧＡＧＧＣＧＡＧＣＣＡＴＴＡＴＣＴＣＴＡＣＣＴＧＡＡＧＧＣＡＡＧＡＧＴＧＴＧＴＧＡＧＡＡＣＴＧＣＧＴＧＧＡＧＧＴＧＧＡＴ
アミノ酸
ＱＤＧＮＥＥＭＧＤＴＴＱＮＰＹＫＶＳＩＳＧＴＴＶＴＬＴＣＰＲＹＤＧＨＥＩＫＷＬＶＮＳＱＮＫＥＧＨＥＤＨＬＬＬＥＤＦＳＥＭＥＱＳＧＹＹＡＣＬＳＫＥＴＰＡＥＥＡＳＨＹＬＹＬＫＡＲＶＣＥＮＣＶＥＶＤ
ＣＤ３イプシロン、サイミリ・シウレウス
ヌクレオチド
ＣＡＧＧＡＣＧＧＴＡＡＴＧＡＡＧＡＧＡＴＴＧＧＴＧＡＴＡＣＴＡＣＣＣＡＧＡＡＣＣＣＡＴＡＴＡＡＡＧＴＴＴＣＣＡＴＣＴＣＡＧＧＡＡＣＣＡＣＡＧＴＡＡＣＡＣＴＧＡＣＡＴＧＣＣＣＴＣＧＧＴＡＴＧＡＴＧＧＡＣＡＧＧＡＡＡＴＡＡＡＡＴＧＧＣＴＣＧＴＡＡＡＴＧＡＴＣＡＡＡＡＣＡＡＡＧＡＡＧＧＴＣＡＴＧＡＧＧＡＣＣＡＣＣＴＧＴＴＡＣＴＧＧＡＡＧＡＴＴＴＴＴＣＡＧＡＡＡＴＧＧＡＡＣＡＡＡＧＴＧＧＴＴＡＴＴＡＴＧＣＣＴＧＣＣＴＣＴＣＣＡＡＡＧＡＧＡＣＣＣＣＣＡＣＡＧＡＡＧＡＧＧＣＧＡＧＣＣＡＴＴＡＴＣＴＣＴＡＣＣＴＧＡＡＧＧＣＡＡＧＡＧＴＧＴＧＴＧＡＧＡＡＣＴＧＣＧＴＧＧＡＧＧＴＧＧＡＴ
アミノ酸
ＱＤＧＮＥＥＩＧＤＴＴＱＮＰＹＫＶＳＩＳＧＴＴＶＴＬＴＣＰＲＹＤＧＱＥＩＫＷＬＶＮＤＱＮＫＥＧＨＥＤＨＬＬＬＥＤＦＳＥＭＥＱＳＧＹＹＡＣＬＳＫＥＴＰＴＥＥＡＳＨＹＬＹＬＫＡＲＶＣＥＮＣＶＥＶＤ
２．ヒト及び異なる非チンパンジー霊長類のＣＤ３イプシロンのＮ末端アミノ酸１−２７に結合する異種間特異性単鎖抗体断片（ｓｃＦｖ）の生成
２．１ 異種可溶性タンパク質への融合による、そのナイーブＣＤ３コンテクストから分離されるＣＤ３イプシロンのＮ末端を利用するマウスの免疫
ｂａｌｂ／ｃ ｘ ｃ５７黒交配の１０週齢のＦ１マウスを、ヒト及び／又はサイミリ・シウレウスの成熟ＣＤ３イプシロン鎖の最もＮ末端アミノ酸１−２７を持つＣＤ３イプシロンＦｃ融合タンパク質（１−２７ＣＤ３−Ｆｃ）で免疫した。このために、マウスあたり３００μｌのＰＢＳ中の４０μｇの１−２７ＣＤ３Ｆｃ融合タンパク質を、１０ｎｍｏｌのチオアート修飾ＣｐＧ−オリゴヌクレオチド（５'−ｔｃｃａｔｇａｃｇｔｔｃｃｔｇａｔｇｃｔ−３'）とともに腹腔内に注射した。マウスには、２１日後、４２日後、任意に６３日後に追加免疫を同様に与えた。最初の追加免疫の１０日後に、血液サンプルをとり、１−２７ＣＤ３Ｆｃ融合タンパク質に対する抗体血清力価をＥＬＩＳＡにより試験した。追加的に、ＣＤ３陽性ヒトＴ細胞株ＨＰＢａｌｌに対する力価も、標準プロトコルによりフローサイトメトリーで試験した。血清力価は、非免疫動物よりも免疫動物で著しく高かった。
２．２ 免疫マウス抗体ｓｃＦｖライブラリーの生成：コンビナトリアル抗体ライブラリー及びファージディスプレイの構築
最後の注射の３日後、マウスの脾臓細胞を、標準プロトコルによりトータルＲＮＡの調製のために摘出した。
マウス免疫グロブリン（Ｉｇ）軽鎖（カッパ）可変領域（ＶＫ）及びＩｇ重鎖可変領域（ＶＨ）ＤＮＡ断片のライブラリーを、ＶＫ及びＶＨ特異的なプライマーを利用してマウス脾臓ＲＮＡに対するＲＴ−ＰＣＲにより構築した。ｃＤＮＡは、標準プロトコルにより合成した。
増幅した重鎖Ｖ断片のための５'−Ｘｈｏｌ及び３'−ＢｓｔＥｌｌ認識部位及び増幅したＶＫ ＤＮＡ断片のための５'−Ｓａｃｌ及び３'−Ｓｐｅｌ認識部位を生じるように、プライマーを設計した。
ＶＨ ＤＮＡ断片のＰＣＲ増幅のために、８つの異なる５'−ＶＨファミリー特異性プライマー（ＭＶＨＩ（ＧＣ）ＡＧ ＧＴＧ ＣＡＧ ＣＴＣ ＧＡＧ ＧＡＧ ＴＣＡ ＧＧＡ ＣＣＴ；ＭＶＨ２ ＧＡＧ ＧＴＣ ＣＡＧ ＣＴＣ ＧＡＧ ＣＡＧ ＴＣＴ ＧＧＡ ＣＣＴ；ＭＶＨ３ ＣＡＧ ＧＴＣ ＣＡＡ ＣＴＣ ＧＡＧ ＣＡＧ ＣＣＴ ＧＧＧ ＧＣＴ；ＭＶＨ４ ＧＡＧ ＧＴＴ ＣＡＧ ＣＴＣ ＧＡＧ ＣＡＧ ＴＣＴ ＧＧＧ ＧＣＡ；ＭＶＨ５ ＧＡ（ＡＧ） ＧＴＧ ＡＡＧ ＣＴＣ ＧＡＧ ＧＡＧ ＴＣＴ ＧＧＡ ＧＧＡ；ＭＶＨ６ ＧＡＧ ＧＴＧ ＡＡＧ ＣＴＴ ＣＴＣ ＧＡＧ ＴＣＴ ＧＧＡ ＧＧＴ；ＭＶＨ７ ＧＡＡ ＧＴＧ ＡＡＧ ＣＴＣ ＧＡＧ ＧＡＧ ＴＣＴ ＧＧＧ ＧＧＡ；ＭＶＨ８ ＧＡＧ ＧＴＴ ＣＡＧ ＣＴＣ ＧＡＧ ＣＡＧ ＴＣＴ ＧＧＡ ＧＣＴ）をそれぞれ、１つの３'−ＶＨプライマー（３'ＭｕＶＨＢｓｔＥｌｌ ｔｇａ ｇｇａ ｇａｃ ｇｇｔ ｇａｃ ｃｇｔ ｇｇｔ ｃｃｃ ｔｔｇ ｇｃｃ ｃｃａ ｇ）と組み合わせた：ＶＫ鎖断片のＰＣＲ増幅のために、７つの異なる５'−ＶＫファミリー特異性プライマー（ＭＵＶＫ１ ＣＣＡ ＧＴＴ ＣＣＧ ＡＧＣ ＴＣＧ ＴＴＧ ＴＧＡ ＣＴＣ ＡＧＧ ＡＡＴ ＣＴ；ＭＵＶＫ２ ＣＣＡ ＧＴＴ ＣＣＧ ＡＧＣ ＴＣＧ ＴＧＴ ＴＧＡ ＣＧＣ ＡＧＣ ＣＧＣ ＣＣ；ＭＵＶＫ３ ＣＣＡ ＧＴＴ ＣＣＧ ＡＧＣ ＴＣＧ ＴＧＣ ＴＣＡ ＣＣＣ ＡＧＴ ＣＴＣ ＣＡ；ＭＵＶＫ４ ＣＣＡ ＧＴＴ ＣＣＧ ＡＧＣ ＴＣＣ ＡＧＡ ＴＧＡ ＣＣＣ ＡＧＴ ＣＴＣ ＣＡ；ＭＵＶＫ５ ＣＣＡ ＧＡＴ ＧＴＧ ＡＧＣ ＴＣＧ ＴＧＡ ＴＧＡ ＣＣＣ ＡＧＡ ＣＴＣ ＣＡ；ＭＵＶＫ６ ＣＣＡ ＧＡＴ ＧＴＧ ＡＧＣ ＴＣＧ ＴＣＡ ＴＧＡ ＣＣＣ ＡＧＴ ＣＴＣ ＣＡ；ＭＵＶＫ７ ＣＣＡ ＧＴＴ ＣＣＧ ＡＧＣ ＴＣＧ ＴＧＡ ＴＧＡ ＣＡＣ ＡＧＴ ＣＴＣ ＣＡ）を、それぞれ、１つの３'−ＶＫプライマー（３'ＭｕＶｋＨｉｎｄＩＩＩ／ＢｓｉＷ１ ｔｇｇ ｔｇｃ ａｃｔ ａｇｔ ｃｇｔ ａｃｇ ｔｔｔ ｇａｔ ｃｔｃ ａａｇ ｃｔｔ ｇｇｔ ｃｃｃ）と組み合わせた。
以下のＰＣＲプログラムを増幅に利用した：９４℃で２０秒間変性；５２℃で５０秒間プライマーアニーリング及び７２℃で６０秒間プライマー伸長及び４０サイクル、次いで７２℃で１０分間の最終伸長。
４５０ｎｇのカッパ軽鎖断片（Ｓａｃｌ−Ｓｐｅｌ消化）を、１４００ｎｇのファージミドｐＣｏｍｂ３Ｈ５Ｂｈｉｓ（Ｓａｃｌ−Ｓｐｅｌ消化；大きい断片）とライゲーションした。次いで、得られたコンビナトリアル抗体ライブラリーを、エレクトロポレーション（２．５ｋＶ、０．２ｃｍギャップキュベット、２５ｕＦＤ、２００オーム、Ｂｉｏｒａｄ ジーンパルサー）により３００μｌのエレクトロコンピテント大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＸＬ１ Ｂｌｕｅ細胞中に形質転換し、１０7を超える独立クローンのライブラリーサイズを得た。表現型発現の１時間後、陽性形質転換体を、１００ｍｌの液体スーパーブロス（ＳＢ）培地中で一晩、ｐＣｏｍｂ３Ｈ５ＢＨｉｓベクターによりコードされるカルベニシリン耐性に関して選択した。次いで、細胞を遠心分離により採取し、市販のプラスミド調製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を利用してプラスミド調製を実施した。
ＶＫライブラリーを含む２８００ｎｇのこのプラスミドＤＮＡ（Ｘｈｏｌ−ＢｓｔＥＩＩ消化；大きい断片）を、９００ｎｇの重鎖Ｖ断片（Ｘｈｏｌ−ＢｓｔＥＩＩ消化）にライゲーションし、エレクトロポリマーレーション（２．５ｋＶ、０．２ｃｍギャップキュベット、２５ｕＦＤ、２００オーム）により再びエレクトロコンピテント大腸菌ＸＬ１ Ｂｌｕｅ細胞の２つの３００μｌアリコート中に形質転換し、１０7を超える独立クローンの総ＶＨ−ＶＫ ｓｃＦｖ（単鎖可変断片）ライブラリーサイズを得た。
表現型発現及びカルベニシリンへのゆっくりとした適応の後、抗体ライブラリーを含む大腸菌細胞を、ＳＢ−カルベニシリン（５０μｇ／ｍｌ）の選択培地に移した。次いで、抗体ライブラリーを含む大腸菌細胞を、ヘルパーファージＶＣＳＭ１３の１０12粒子の感染量に感染させ、繊維状Ｍ１３ファージの産生及び分泌を得たが、ファージ粒子は、マウスｓｃＦｖ断片をコードする単鎖ｐＣｏｍｂ３Ｈ５ＢＨｉｓ−ＤＮＡを含み、ファージコートタンパク質ＩＩＩへの翻訳融合として対応するｓｃＦｖタンパク質を提示した。抗体ライブラリーを提示するファージのプールは、後に抗体結合体の選択に使用した。
２．３ファージディスプレイに基づくＣＤ３特異性バインダーの選択
クローニングされたｓｃＦｖレパートリーを持つファージライブラリーを、ＰＥＧ８０００／ＮａＣｌ沈殿及び遠心分離によりそれぞれの培養上清から採取した。およそ１０11から１０12のｓｃＦｖファージ粒子を、０．４ｍｌのＰＢＳ／０．１％ＢＳＡに再懸濁し、１０5から１０7のＪｕｒｋａｔ細胞（ＣＤ３陽性ヒトＴ細胞株）と共に氷上で１時間ゆっくりと攪拌しながらインキュベートした。これらのＪｕｒｋａｔ細胞は、事前に、ウシ胎児血清（１０％）、グルタミン及びペニシリン／ストレプトマイシンを富化したＲＰＭＩ培地中で生育し、遠心分離により採取し、ＰＢＳで洗浄して、ＰＢＳ／１％ＦＣＳ（アジ化ナトリウム含有）に再懸濁した。Ｊｕｒｋａｔ細胞に特異的に結合しないｓｃＦｖファージは、最大５回のＰＢＳ／１％ＦＣＳ（アジ化ナトリウム含有）による洗浄工程により除去した。洗浄の後、細胞をＨＣｌ−グリシン ｐＨ２．２（１０分間インキュベート、その後ボルテックス処理）に再懸濁して結合体を細胞から溶出し、２ＭのＴｒｉｓ ｐＨ１２で中和の後、溶出液を、新鮮な未感染大腸菌ＸＬ１ Ｂｌｕｅ培養液（ＯＤ６００＞０．５）の感染に使用した。ヒトｓｃＦｖ断片をコードする、ファージミドコピーによりうまくトランスフェクトされた大腸菌細胞を含む大腸菌培養液を、再びカルベニシリン耐性で選択し、次いでＶＣＭＳ １３ヘルパーファージに感染させて、抗体ディスプレイ及びインビトロ選択の第２ラウンドを開始した。通常、４から５ラウンドの選択を実施した。
２．４ ＣＤ３特異性バインダーのスクリーニング
４から５ラウンドのパニングに相当するプラスミドＤＮＡを、選択の後大腸菌培養液から単離した。可溶性ｓｃＦｖタンパク質の産生のため、ＶＨ−ＶＬ−ＤＮＡ断片をプラスミドから切除した（Ｘｈｏｌ−Ｓｐｅｌ）。これらの断片を、元々のｐＣｏｍｂ３Ｈ５ＢＨｉｓとは、発現コンストラクト（例えばｓｃＦｖ）がｓｃＦｖとＨｉｓ６−タグの間にＦｌａｇタグ（ＴＧＤ ＹＫＤＤＤＤＫ）を含む点で異なるプラスミドｐＣｏｍｂ３Ｈ５ＢＦｌａｇ／Ｈｉｓ中で、同じ制限部位によりクローニングし、追加のファージタンパク質を排除した。ライゲーションの後、プラスミドＤＮＡの各プール（異なるパニングのラウンド）を、１００μｌヒートショックコンピテント大腸菌ＴＧ１又はＸＬ１−Ｂｌｕｅ中に形質転換し、カルベニシリンＬＢアガーに播種した。単一のコロニーを１００μｌのＬＢ ｃａｒｂ（５０ｕｇ／ｍｌ）に選び入れた。
ＶＬ及びＶＨセグメントを含むｐＣｏｍｂ３Ｈ５ＢＨｉｓにより形質転換された大腸菌は、遺伝子ＩＩＩ断片の切除及び１ｍＭ ＩＰＴＧによる誘導の後、可溶性ｓｃＦｖを十分な量産生する。好適なシグナル配列により、ｓｃＦｖ鎖はペリプラズムにエクスポートされ、機能的コンフォメーションに折り畳まれる。
形質転換プレートから単一の大腸菌ＴＧ１細菌コロニーを、小スケールペリプラズム調製物のために選び取り、採取の後、２０ｍＭ ＭｇＣｌ2及びカルベニシリン５０μｇ／ｍｌを補い（及びＰＢＳ（例えば１ｍｌ）に再溶解された）ＳＢ培地（例えば１０ｍｌ）中で増殖させた。−７０℃での冷凍及び３７℃での解凍の４ラウンドにより、細菌の外膜を温度ショックにより破壊し、ｓｃＦｖを含む可溶性ペリプラズムタンパク質を上清中に放出させた。無傷の細胞及び細胞片を遠心分離で除去した後、ヒト抗ヒトＣＤ３−ｓｃＦｖを含む上清を回収し、さらなる実験に使用した。
２．５ ＣＤ３特異性バインダーの同定
単離したｓｃＦｖの結合を、真核細胞上でフローサイトメトリーにより試験したが、真核細胞は、その表面で、そのＮ末端でＣＤ３イプシロンの最初の２７Ｎ末端アミノ酸を提示する異種タンパク質を発現する。
実施例４に記載されるとおり、ヒトＴ細胞レセプター複合体の成熟ＣＤ３イプシロン鎖のＮ末端配列の最初のアミノ酸１−２７（アミノ酸配列： ＱＤＧＮＥＥＭＧＧＩＴＱＴＰＹＫＶＳＩＳＧＴＴＶＩＬＴ）を、Ｎ末端が外部細胞表面に位置するように、膜貫通型タンパク質ＥｐＣＡＭのＮ末端に融合した。さらに、ＦＬＡＧエピトープを、Ｎ末端１−２７ＣＤ３イプシロン配列とＥｐＣＡＭ配列の間に挿入した。この融合産物は、ヒト胎児由来腎臓細胞（ＨＥＫ）及びチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）中に発現した。
他の霊長類種の成熟ＣＤ３イプシロンの２７の最もＮ末端アミノ酸を提示する真核細胞は、サイミリ・シウレウス（リスザル）（ＣＤ３イプシロンＮ末端アミノ酸配列：ＱＤＧＮＥＥＩＧＤＴＴＱＮＰＹＫＶＳＩＳＧＴＴＶＴＬＴ）、カリスリクス・ジャカス（ＣＤ３イプシロンＮ末端アミノ酸配列： ＱＤＧＮＥＥＭＧＤＴＴＱＮＰＹＫＶＳＩＳＧＴＴＶＴＬＴ）及びサグイヌス・オイディプス（ＣＤ３イプシロンＮ末端アミノ酸配列：ＱＤＧＮＥＥＭＧＤＴＴＱＮＰＹＫＶＳＩＳＧＴＴＶＴＬＴ）に対して同様に調製した。
フローサイトメトリーには、２．５×１０5細胞を、５０μｌの上清又は２％ＦＣＳを含む５０μｌのＰＢＳ中で５μｇ／ｍｌの精製コンストラクトと共にインキュベートする。コンストラクトの結合は、２％ＦＣＳを含む５０μｌのＰＢＳ中で２μｇ／ｍｌで抗Ｈｉｓ抗体（Ｐｅｎｔａ−Ｈｉｓ Ａｎｔｉｂｏｄｙ、ＢＳＡ不含、Ｑｉａｇｅｎ ＧｍｂＨ、ヒルデン、ドイツ）により検出された。第２工程試薬として、２％ＦＣＳを含む５０μｌ ＰＢＳ中に１：１００で希釈されたＲ−フィコエリスリン結合アフィニティ精製Ｆ（ａｂ'）２断片、ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｆｃ−ガンマ断片特異性）（Ｄｉａｎｏｖａ、ハンブルグ、ドイツ）を使用した。サンプルを、ＦＡＣＳｓｃａｎ（ＢＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ハイデルブルグ、ドイツ）で測定した。
結合は、ヒト及び異なる霊長類（サイミリ・シウレウス、カリスリクス・ジャカス、サグイヌス・オイディプス）の一次Ｔ細胞上で前記段落に記載されたとおりフローサイトメトリーにより常に確認した。
２．６ 非ヒトＣＤ３イプシロン特異性ｓｃＦｖのヒト／ヒト化等価物の生成
マウス抗ＣＤ３ｓｃＦｖのＶＨ領域を、ヒト抗体生殖細胞株アミノ酸配列に対して整列させた。非ヒトＶＨに最も近い相同性を有する、ヒト抗体生殖細胞株ＶＨ配列を選び、２つのアミノ酸配列の直接整列を実施した。ヒトＶＨフレームワーク領域とは異なる、非ヒトＶＨのフレームワーク残基が多くあった（「異なるフレームワーク位置」）。これらの残基のいくつかは、標的への抗体の結合及び活性に寄与しているかも知れない。
マウスＣＤＲと、選択されたヒトＶＨ配列とは異なる全てのフレームワーク位置に両方の可能性（ヒト及び母系マウスアミノ酸残基）を含むライブラリーを構築するために、変性したオリゴヌクレオチドを合成した。これらのオリゴヌクレオチドは、異なる部位で、７５％の確率でヒトの残基を、２５％の確率でマウスの残基を取り込む。１つのヒトＶＨでは、例えば、およそ２０ヌクレオチドの末端ストレッチに重複する、これらのオリゴヌクレオチドの６つが合成されなくてはならなかった。このために、１つおきのプライマーはアンチセンスプライマーであった。オリゴヌクレオチド内の後のクローニングに必要な制限部位を削除した。
これらのプライマーは、Ｖ配列全体に拡がるのに必要とされるプライマーの数により、６０から９０ヌクレオチドの長さを有することがある。
これらの、例えば６つのプライマーを同量（例えば、１μｌの各プライマー（プライマーストック、２０から１００μＭ）を２０μｌのＰＣＲ反応に）で混合し、ＰＣＲバッファ、ヌクレオチド及びＴａｑポリメラーゼからなるＰＣＲミックスに加えた。このミックスを９４℃で３分間、６５℃で１分間、６２℃で１分間、５９℃で１分間、５６℃で１分間、５２℃で１分間、５０℃で１分間、７２℃で１０分間、ＰＣＲサイクラー中でインキュベートした。その後、産物を、アガロースゲル電気泳動にかけ、２００から４００のサイズの産物を標準法によりゲルから単離した。
次いで、このＰＣＲ産物を鋳型として、Ｎ末端及びＣ末端好適クローニング制限部位を取り込むプライマーを利用して、標準ＰＣＲ反応に使用した。適当なサイズのＤＮＡ断片（ＶＨではおよそ３５０ヌクレオチド）を、標準法によりアガロースゲル電気泳動により単離した。このようにして、十分なＶＨ ＤＮＡ断片を増幅した。このＶＨ断片は、それぞれの異なるフレームワーク位置で、それぞれに異なる量のヒト及びマウス残基を有するＶＨ断片のプールであった（ヒト化ＶＨのプール）。同じ手順を、マウス抗ＣＤ３ｓｃＦｖのＶＬ領域にも実施した（ヒト化ＶＬのプール）。
次いで、ヒト化ＶＨのプールを、ファージディスプレイベクターｐＣｏｍｂ３Ｈ５Ｂｈｉｓ中でヒト化ＶＬのプールと組み合わせ、機能性ｓｃＦｖのライブラリーを形成し、繊維状ファージ上での提示の後、ここから母系非ヒト（マウス）抗ＣＤ３ｓｃＦｖに関して上述のとおり抗ＣＤ３バインダーを選択し、スクリーニングし、同定し、確認した。次いで、単一のクローンを、望ましい性質及びアミノ酸配列に関して分析した。ヒト生殖細胞株Ｖセグメントに、アミノ酸配列相同性で最も近いこれらのｓｃＦｖは好ましく、ＶＨのＣＤＲＩ及びＩＩ並びにＶＬカッパのＣＤＲＩ及びＩＩ並びにＶＬラムダのＣＤＲＩ及びＩＩの中の少なくとも１つのＣＤＲが、全てのヒト生殖細胞株Ｖセグメントの最も近いそれぞれのＣＤＲに、８０％を超えるアミノ酸配列同一性を示す物が特に好ましい。抗ＣＤ３ｓｃＦｖを、以下の実施例１０及び１６に記載されるとおり組換え二重特異性単鎖抗体に変換し、さらにキャラクタリゼーションした。
３．ＩｇＧ１のＦｃ部に融合したヒトＣＤ３イプシロン鎖のＮ末端アミノ酸１−２７の組換え融合タンパク質の生成（１−２７ＣＤ３−Ｆｃ）
３．１ １−２７ＣＤ−３Ｆｃのクローニング及び発現
ヒト免疫グロブリンＩｇＧ１のヒンジ及びＦｃガンマ領域並びに６ヒスチジンタグに融合したヒトＣＤ３イプシロン鎖の１−２７Ｎ末端アミノ酸のコード配列は、標準プロトコルによる遺伝子合成により得た（組換え融合タンパク質のｃＤＮＡ配列及びアミノ酸配列は、配列番号３５０及び３４９に記されている）。遺伝子合成断片は、コンストラクトの真核細胞発現のためのコザック部位をまず含み、次いで１９アミノ酸免疫グロブリンリーダーペプチド、次いでフレームを合わせて成熟ヒトＣＤ３イプシロン鎖の細胞外部分の最初の２７アミノ酸のコード配列、次いでフレームを合わせてヒトＩｇＧ１のヒンジ領域及びＦｃガンマ部分のコード配列、次いでフレームを合わせて６ヒスチジンタグのコード配列及び終止コドンを含むように設計した（図１）。遺伝子合成断片は、融合タンパク質をコードするｃＤＮＡの最初及び最後に制限部位を導入するようにも設計した。導入された制限部位、５'末端でのＥｃｏＲＩ及び３'末端でのＳａｌｌは、以下のクローニング手順で利用する。遺伝子合成断片を、標準プロトコルに従い、ＥｃｏＲＩ及びＳａｌｌによりｐＥＦ−ＤＨＦＲと呼ばれるプラスミド中にクローニングした（ｐＥＦ−ＤＨＦＲは、Ｍａｃｋ ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９２ （１９９５） ７０２１−７０２５に記載されている）。配列実証済みプラスミドを、製造業者のプロトコルに従い、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＧｍｂＨ、カールスルーエ、ドイツ）でのトランスフェクションに使用した。３日後、トランスフェクタントの細胞培養上清を採取し、ＥＬＩＳＡアッセイで組換えコンストラクトの存在を試験した。ヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｆｃガンマ断片特異性抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｅｕｒｏｐｅ Ｌｔｄ．ニューマーケット、サフォーク、英国から入手）をＰＢＳ中に希釈し５μｇ／ｍｌとし、ＭａｘｉＳｏｒｐ ９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ ＧｍｂＨ ＆ Ｃｏ．ＫＧ、ヴィースバーデン、ドイツ）にウェルあたり１００μｌで、４℃で一晩コーティングした。ウェルを、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ）で洗浄し、室温（ＲＴ）で６０分間ＰＢＳ中３％ＢＳＡ（ウシアルブミン、Ｖ分画、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｅ ＧｍｂＨ、タウフキルヒェン、ドイツ）でブロックした。その後、ウェルをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎで再び洗浄し、次いで６０分間ＲＴで細胞培養上清とともにインキュベートした。洗浄の後、ウェルを、１％ＢＳＡを含むＰＢＳに１：５００で希釈したペルオキシダーゼ結合抗Ｈｉｓ６抗体（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ，Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ、マンハイム、ドイツ）とともに６０分間ＲＴでインキュベートした。その後、ウェルを２００μｌのＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎで洗浄し、１００μｌのＳＩＧＭＡＦＡＳＴ ＯＰＤ（ＳＩＧＭＡＦＡＳＴ ＯＰＤ（ｏ−フェニレンジアミンジヒドロクロライド）基質溶液（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｅ ＧｍｂＨ、タウフキルヒェン、ドイツ）を、製造業者のプロトコルに従い加えた。１００μｌの１Ｍ Ｈ2ＳＯ4を加えて反応を停止した。呈色反応を、ＰｏｗｅｒＷａｖｅＸマイクロプレート分光光度計（ＢｉｏＴｅｋ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ、ウィヌースキ、バーモント州、米国）で、４９０ｎｍで測定し、６２０ｎｍでのバックグラウンド吸収を差し引いた。図２に示されるとおり、ネガティブコントロールとして使用した模擬トランスフェクションＨＥＫ２９３細胞の無関係な上清に比べ、コンストラクトの存在がはっきりと検出できた。
３．２ １−２７ＣＤ３−Ｆｃへの異種間特異性単鎖抗体の結合アッセイ
１−２７ＣＤ３−Ｆｃへの、ＣＤ３イプシロンに特異的なペリプラズム発現した異種間特異性単鎖抗体の粗調製物の結合を、ＥＬＩＳＡアッセイで試験した。ヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｆｃ−ガンマ断片特異性抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｅｕｒｏｐｅ Ｌｔｄ．ニューマーケット、サフォーク、英国）をＰＢＳ中に希釈し５μｇ／ｍｌとし、ＭａｘｉＳｏｒｐ ９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ ＧｍｂＨ ＆ Ｃｏ．ＫＧ、ヴィースバーデン、ドイツ）にウェルあたり１００μｌで、４℃で一晩コーティングした。ウェルを、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ）で洗浄し、ＲＴで６０分間ＰＢＳ中３％ＢＳＡ（ウシアルブミン、Ｖ分画、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｅ ＧｍｂＨ、タウフキルヒェン、ドイツ）でブロックした。その後、ウェルをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎで洗浄し、次いで６０分間ＲＴで１−２７ＣＤ３−Ｆｃコンストラクトを発現する細胞の上清とともにインキュベートした。ウェルを、ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎで洗浄し、ペリプラズム発現した異種間特異性単鎖抗体の粗調製物とともに室温で６０分間インキュベートした。ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎで洗浄した後、ウェルを１％ＢＳＡを含むＰＢＳに１：１００００で希釈したペルオキシダーゼ結合抗Ｆｌａｇ Ｍ２抗体（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｅ ＧｍｂＨ、タウフキルヒェン、ドイツ）とともに６０分間ＲＴでインキュベートした。その後、ウェルをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎで洗浄し、１００μｌのＳＩＧＭＡＦＡＳＴ ＯＰＤ（ＯＰＤ（ｏ−フェニレンジアミンジヒドロクロライド））基質溶液（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｅ ＧｍｂＨ、タウフキルヒェン、ドイツ）とともに、製造業者のプロトコルに従いインキュベートした。１００μｌの１Ｍ Ｈ2ＳＯ4を加えて呈色反応を停止し、ＰｏｗｅｒＷａｖｅＸマイクロプレート分光光度計（ＢｉｏＴｅｋ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ、ウィヌースキ、バーモント州、米国）で、４９０ｎｍで測定し、６２０ｎｍでのバックグラウンド吸収を差し引いた。マウス抗ＣＤ３単鎖抗体に比べ、１−２７ＣＤ３−Ｆｃコンストラクトへの、ＣＤ３イプシロンに特異的な異種間特異性ヒト単鎖抗体の強い結合を観察した（図３）。
４． カニクイザル由来のＥｐＣＡＭに融合した異なる非チンパンジー霊長類由来のＣＤ３イプシロンのＮ末端アミノ酸１−２７の組換え膜貫通型融合タンパク質の生成（１−２７ＣＤ３−ＥｐＣＡＭ）
４．１ １−２７ＣＤ３−ＥｐＣＡＭのクローニング及び発現
異なる非チンパンジー霊長類（マーモセット、タマリン、リスザル）及びブタから、ＣＤ３イプシロンを単離した。Ｆｌａｇタグ付きカニクイザルＥｐＣＡＭのＮ末端に融合した、成熟ヒト、コモンマーモセット（カリスリックス・ジャカス）、ワタボウシタマリン（サグイヌス・オイディプス）、コモンリスザル（サイミリ・シウレウス）及び家畜ブタ（サス・スクローファ、Ｓｕｓ Ｓｃｒｏｆａ；ネガティブコントロールとして使用）のＣＤ３イプシロン鎖の１−２７Ｎ末端アミノ酸のコード配列を、標準プロトコルに従い、遺伝子合成により得た。組換え融合タンパク質のｃＤＮＡ配列及びアミノ酸配列は、配列番号３５１から３６０に示されている。遺伝子合成断片は、第１に、標的発現ベクターにすでに存在する１９アミノ酸免疫グロブリンリーダーペプチドのコード配列と正しいリーディングフレームでの融合を可能にするＢｓｒＧＩ部位を含むように、次いで、フレームを合わせて成熟ＣＤ３イプシロン鎖の細胞外部分のＮ末端１−２７アミノ酸のコード配列を、次いで、フレームを合わせてＦｌａｇタグのコード配列を、次いで、フレームを合わせて、成熟カニクイザルＥｐＣＡＭ膜貫通型融合タンパク質のコード配列を含むように設計した（図４）。遺伝子合成断片を、融合タンパク質をコードするｃＤＮＡの末端に制限部位を導入するように設計した。導入された制限部位、５'末端でのＢｓｒＧＩ及び３'末端でのＳａｌｌを、以下のクローニング手順に利用した。遺伝子合成断片を、ＢｓｒＧＩ及びＳａｌｌにより、標準プロトコルに従い、１９アミノ酸免疫グロブリンリーダーペプチドのコード配列をすでに含む、ｐＥＦ−ＤＨＦＲと呼ばれるプラスミドの誘導体中にクローニングした（ｐＥＦ−ＤＨＦＲは、Ｍａｃｋ ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９２ （１９９５） ７０２１−７０２５に記載されている）。配列実証済みプラスミドを使用して、製造業者のプロトコルに従い、１７５ｍｌの細胞培養フラスコ中の接着性２９３−ＨＥＫ細胞のために、ＭＡＴｒａ−Ａ試薬（ＩＢＡ ＧｍｂＨ、ゲッティンゲン、ドイツ）及び１２μｇのプラスミドＤＮＡを使用し、２９３−ＨＥＫ細胞を一過性導入した。細胞培養の３日後、トランスフェクタントを、標準プロトコルに従い、ＦＡＣＳアッセイにより、組換え膜貫通型タンパク質の細胞表面発現に関して試験した。その目的のため、２．５×１０5の細胞を、２％ＦＣＳを含むＰＢＳ中で５μｇ／ｍｌで抗Ｆｌａｇ Ｍ２抗体（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｅ ＧｍｂＨ、タウフキルヒェン、ドイツ）と共にインキュベートした。結合した抗体を、Ｒ−フィコエリスリン結合アフィニティ精製Ｆ（ａｂ'）２断片、２％ＦＣＳを含むＰＢＳ中で１：１００のヤギ抗マウスＩｇＧ、Ｆｃ−ガンマ断片特異的（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｅｕｒｏｐｅ Ｌｔｄ．ニューマーケット、サフォーク、英国）により検出した。サンプルを、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ＢＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ハイデルベルグ、ドイツ）で測定した。カニクイザルＥｐＣＡＭ及び、それぞれ、ヒト、マーモセット、タマリン、リスザル及びブタのＣＤ３イプシロン鎖の１−２７Ｎ末端アミノ酸からなるＦｌａｇタグ付き組換え膜貫通型融合タンパク質の、トランスフェクトされた細胞上での発現は、はっきりと検出可能であった（図５）。
４．２ １−２７ＣＤ３−ＥｐＣＡＭへの異種間特異性抗ＣＤ３単鎖抗体の結合
カニクイザルＥｐＣＡＭに融合した、それぞれヒト、マーモセット、タマリン及びリスザルＣＤ３イプシロン鎖の１−２７Ｎ末端アミノ酸への、ペリプラズム発現した異種間特異性抗ＣＤ３単鎖抗体の粗調製物の結合を、標準プロトコルに従いＦＡＣＳアッセイで試験した。その目的のため、２．５×１０5の細胞を、ペリプラズム発現した異種間特異性抗ＣＤ３単鎖抗体（上述のとおり、標準プロトコルに従い調製した）の粗調製物及びネガティブコントロールとしての単鎖マウス抗ヒトＣＤ３抗体とともにインキュベートした。二次抗体として、Ｐｅｎｔａ−Ｈｉｓ抗体（Ｑｉａｇｅｎ ＧｍｂＨ、ヒルデン、ドイツ）を、２％ＦＣＳを含む５０μｌＰＢＳ中で５μｇ／ｍｌで使用した。抗体の結合は、２％ＦＣＳを含むＰＢＳ中に１：１００で希釈されたＲ−フィコエリスリン結合アフィニティ精製Ｆ（ａｂ'）２断片、ヤギ抗マウスＩｇＧ、Ｆｃ−ガンマ断片特異的（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｅｕｒｏｐｅ Ｌｔｄ．、ニューマーケット、サフォーク、英国）により検出した。サンプルを、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ＢＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ハイデルベルグ、ドイツ）で測定した。図６（ＡからＥ）に示されるとおり、カニクイザルＥｐＣＡＭに融合した、それぞれヒト、マーモセット、タマリン及びリスザルのＣＤ３イプシロンの１−２７Ｎ末端アミノ酸からなる組換え膜貫通型タンパク質を発現するトランスフェクタントへの、単鎖抗体の結合が観察された。異種間特異性単鎖抗体の、ネガティブコントロールとして使用したカニクイザルＥｐＣＡＭに融合したブタの１−２７Ｎ末端ＣＤ３イプシロンからなる融合タンパク質への結合は全く見られなかった。抗ＣＤ３単鎖抗体の多霊長類異種間特異性が示された。抗Ｆｌａｇ Ｍ２抗体と異種間特異性単鎖抗体で得られたシグナルは同等であり、異種間特異性単鎖抗体のＣＤ３イプシロンのＮ末端アミノ酸１−２７への強い結合活性を示している。
５．ヒトＣＤ３イプシロン鎖及びそのアラニン変異体でトランスフェクトされたマウス細胞のアラニンスキャニングによる異種間特異性抗ＣＤ３単鎖抗体の結合分析
５．１ ヒト野生型ＣＤ３イプシロンのクローニング及び発現
ヒトＣＤ３イプシロン鎖のコード配列は、標準プロトコルに従い遺伝子合成により得た（ヒトＣＤ３イプシロン鎖のｃＤＮＡ配列及びアミノ酸配列は、配列番号３６２及び３６１に記す）。遺伝子合成断片は、コンストラクトの真核細胞発現のためのコザック部位及びヒトＣＤ３イプシロンをコードするｃＤＮＡの最初と最後に制限部位を含むように設計した。導入された制限部位、５'末端でのＥｃｏＲＩ及び３'末端でのＳａｌｌを以下のクローニング手順で利用した。次いで、以下の標準プロトコルに従い、ｐＥＦ ＮＥＯと呼ばれるプラスミド中で、ＥｃｏＲＩ及びＳａｌｌにより、遺伝子合成断片をクローニングした。ｐＥＦ ＮＥＯは、ｐＥＦ−ＤＨＦＲ（Ｍａｃｋ ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９２ （１９９５） ７０２１−７０２５）から、従来の分子クローニングにより、ＤＨＦＲのｃＤＮＡをネオマイシン耐性のｃＤＮＡに置換することにより誘導した。配列実証済みプラスミドを使用して、１０％ＦＣＳ、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、１％ＨＥＰＥＳ、１％ピルビン酸、１％非必須アミノ酸（全て、Ｂｉｏｃｈｒｏｍ ＡＧ、ベルリン、ドイツ）を補った安定化Ｌグルタミンを含むＲＰＭＩ中で、３７℃、湿度９５％、ＣＯ2７％で培養したマウスＴ細胞株ＥＬ４（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＴＩＢ−３９）にトランスフェクトした。トランスフェクションは、ＳｕｐｅｒＦｅｃｔ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｑｉａｇｅｎ ＧｍｂＨ、ヒルデン、ドイツ）及び２μｇのプラスミドＤＮＡにより、製造業者のプロトコルに従って実施した。２４時間後、細胞をＰＢＳで洗浄し、再び上述の細胞培養培地で、選択のために６００μｇ／ｍｌのＧ４１８（ＰＡＡ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ ＧｍｂＨ、パッシング、オーストリア）とともに培養した。トランスフェクションの１６から２０日後に、耐性細胞の増殖が観察された。さらに７から１４日後、標準プロトコルに従い、ヒトＣＤ３イプシロンの発現に関して、ＦＡＣＳ分析により細胞を試験した。２．５×１０5の細胞を、２％ＦＣＳを含むＰＢＳ中で５μｇ／ｍｌで、抗ヒトＣＤ３抗体ＵＣＨＴ−１（ＢＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ハイデルベルグ、ドイツ）と共にインキュベートした。抗体の結合は、２％ＦＣＳを含むＰＢＳ中に１：１００で希釈されたＲ−フィコエリスリン結合アフィニティ精製Ｆ（ａｂ'）２断片、ヤギ抗マウスＩｇＧ、Ｆｃ−ガンマ断片特異的（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｅｕｒｏｐｅ Ｌｔｄ．、ニューマーケット、サフォーク、英国）により検出した。サンプルを、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ＢＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ハイデルベルグ、ドイツ）で測定した。トランスフェクトされたＥＬ４細胞上での、ヒト野生型ＣＤ３イプシロンの発現が図７に示されている。
５．２ ＩｇＧ１抗体としての異種間特異性抗ＣＤ３単鎖抗体のクローニング及び発現
異種間特異性抗ＣＤ３単鎖抗体の結合を検出する改善された手段を提供するために、Ｈ２Ｃ ＨＬＰ、Ａ２Ｊ ＨＬＰ及びＥ２Ｍ ＨＬＰを、マウスＩｇＧ１及びヒトラムダ定常部とともにＩｇＧ１抗体中に変換した。それぞれのＩｇＧ抗体の重鎖及び軽鎖をコードするｃＤＮＡ配列は、標準プロトコルに従い、遺伝子合成により得た。各特異性の遺伝子合成断片は、まず、コンストラクトの真核細胞発現を可能にするコザック部位を含むように、次いで、１９アミノ酸免疫グロブリンリーダーペプチド（配列番号３６４及び３６３）を、次いで、フレームを合わせて、それぞれの重鎖可変領域又はそれぞれの軽鎖可変領域のコード配列を、次いで、フレームを合わせて、それぞれ、マウスＩｇＧ１の重鎖定常領域のコード配列（配列番号３６６及び３６５）又はヒトラムダ軽鎖定常領域のコード配列（配列番号３６８及び３６７）を含むように設計した。制限部位は、融合タンパク質をコードするｃＤＮＡの最初と最後に導入した。制限部位、５'末端でのＥｃｏＲＩ及び３'末端でのＳａｌｌを以下のクローニング手順に利用した。遺伝子合成断片は、標準プロトコルに従い、ＥｃｏＲＩ及びＳａｌｌにより、重鎖コンストラクト用にｐＥＦ ＤＨＦＲ（Ｍａｃｋ ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９２ （１９９５） ７０２１−７０２５）と呼ばれるプラスミド中に、軽鎖コンストラクト用にはｐＥＦ ＡＤＡ（ｐＥＦ ＡＤＡは、Ｒａｕｍ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．， ５０（３）， （２００１）， １４１−１５０に記載されている）と呼ばれるプラスミド中にクローニングした。配列実証済みプラスミドを、製造業者のプロトコルに従い、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＧｍｂＨ、カールスルーエ、ドイツ）中で、それぞれの軽鎖及び重鎖コンストラクトの同時導入に使用した。３日後、トランスフェクタントの細胞培養上清を採取し、アラニンスキャニング実験に使用した。
５．３ アラニンスキャニングのためのヒトＣＤ３イプシロンのアラニン変異体のクローニング及び発現
ヒトＣＤ３イプシロン鎖をコードする２７ｃＤＮＡ断片であって、ヒトＣＤ３イプシロンの野生型配列の１つのコドンを、成熟ヒトＣＤ３イプシロン鎖の細胞外領域のアミノ酸１−２７の各アミノ酸のアラニン（ＧＣＣ）をコードするコドンに置換した断片を、遺伝子合成により得た。置換したコドンの他は、ｃＤＮＡ断片は、上述のヒト野生型ＣＤ３ｃＤＮＡ断片と同一であった。各コンストラクト中で、上述のヒト野生型ＣＤ３ｃＤＮＡ断片に比べ、１つのコドンのみを置換した。制限部位、ＥｃｏＲＩ及びＳａｌｌを、野生型コンストラクトに比べて同一の部位でｃＤＮＡ断片中に導入した。全てのアラニンスキャニングコンストラクトを、ｐＥＦ ＮＥＯ中にクローニングし、配列実証済みプラスミドを、ＥＬ４細胞中にトランスフェクトした。トランスフェクション及びトランスフェクタントの選択は、上述のとおり実施した。その結果、発現したコンストラクトのパネルが得られ、ヒトＣＤ３イプシロン鎖の第１アミノ酸、位置１でのグルタミン（Ｑ、Ｇｌｎ）をアラニンに置換した。アラニンに置換された最後のアミノ酸は、成熟ヒト野生型ＣＤ３イプシロンの位置２７でのスレオニン（Ｔ、Ｔｈｒ）である。グルタミン１からスレオニン２７の間の各アミノ酸で、野生型アミノ酸をアラニンに置換した、それぞれのトランスフェクタントを生成した。
５．４ アラニンスキャニング実験
２）に記載されたキメラＩｇＧ抗体及びＣＤ３イプシロンに特異的な異種間特異性単鎖抗体を、アラニンスキャニング実験で試験した。３）に記載されたヒトＣＤ３イプシロンのアラニン変異体コンストラクトでトランスフェクトされたＥＬ４細胞株への抗体の結合は、標準プロトコルに従い、ＦＡＣＳアッセイにより試験した。２．５×１０5のそれぞれのトランスフェクタントの細胞を、キメラＩｇＧ抗体を含む細胞培養上清５０μｌ又はペリプラズム発現した単鎖抗体の粗調製物５０μｌとともにインキュベートした。ペリプラズム発現した単鎖抗体の粗調製物と共にインキュベートしたサンプルでは、抗Ｆｌａｇ Ｍ２抗体（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｅ ＧｍｂＨ、タウフキルヒェン、ドイツ）を、二次抗体として、２％ＦＣＳを含む５０μｌＰＢＳ中で５μｇ／ｍｌで使用した。キメラＩｇＧ抗体と共にインキュベートしたサンプルでは、二次抗体は必要なかった。全てのサンプルで、抗体分子の結合は、２％ＦＣＳを含むＰＢＳ中に１：１００で希釈されたＲ−フィコエリスリン結合アフィニティ精製Ｆ（ａｂ'）２断片、ヤギ抗マウスＩｇＧ、Ｆｃ−ガンマ断片特異的（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｅｕｒｏｐｅ Ｌｔｄ．、ニューマーケット、サフォーク、英国）により検出した。サンプルを、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ＢＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ハイデルベルグ、ドイツ）で測定した。ヒトＣＤ３イプシロンのアラニン変異体によりトランスフェクトされたＥＬ４細胞株への、キメラＩｇＧ分子又は異種間特異性単鎖抗体の異なる結合が検出された。ネガティブコントロールとして、アイソタイプコントロール又は関係ない特異性のペリプラズム発現した単鎖抗体の粗調製物をそれぞれ使用した。ＵＣＨＴ−１抗体を、ヒトＣＤ３イプシロンのアラニン変異体の発現レベルのポジティブコントロールとして使用した。成熟ＣＤ３イプシロン鎖のアミノ酸、位置１５でのチロシン、位置１７でのバリン、位置１９でのイソロイシン、位置２４でのバリン又は位置２６でのロイシンのアラニン変異体によりトランスフェクトされたＥＬ４細胞株は、非常に低い発現レベルのため（データ示さず）評価しなかった。異種間特異性単鎖抗体及びキメラＩｇＧフォーマットの単鎖抗体の、ヒトＣＤ３イプシロンのアラニン変異体によりトランスフェクトされたＥＬ４細胞株への結合を、任意単位での相対結合と、全てのそれぞれの幾何平均蛍光サンプル値からそれぞれのネガティブコントロールの幾何平均蛍光値を引いた値とともに、図８Ａ−８Ｄに示す。発現レベルの違いを補償するため、あるトランスフェクタントの全サンプル値を、それぞれのトランスフェクタントのＵＣＨＴ−１抗体の幾何平均蛍光値で割った。ある特異性の野生型サンプル値の比較のため、それぞれの特異性の全サンプル値を、野生型サンプル値で最終的に割り、野生型サンプル値を結合の任意単位１に設定した。
利用した計算は、以下の式に詳細に示される。
Figure 2014064568
 この式において、「サンプル値」は、図８Ａから８Ｄに示される特定のアラニン変異体に対する特定の抗ＣＤ３抗体の結合の程度を示す任意単位の結合の値を意味し、「サンプル」は、特定のアラニンスキャニングトランスフェクタントにアッセイされた特定の抗ＣＤ３抗体で得られた幾何平均蛍光値を意味し、「ネガティブコントロール」は、特定のアラニン変異体にアッセイされたネガティブコントロールで得られた幾何平均蛍光値を意味し、ＵＣＨＴ−１は、特定のアラニン変異体にアッセイされたＵＣＨＴ−１抗体で得られた幾何平均蛍光値を意味し、「野生型」は、野生型トランスフェクタントでアッセイされた特定の抗ＣＤ３抗体で得られた幾何平均蛍光値を意味し、ｘはそれぞれのトランスフェクタントを明示し、ｙはそれぞれの抗ＣＤ３抗体を明示し、ｗｔはそれぞれのトランスフェクタントが野生型であることを明示する。
図８Ａから８Ｄで分かるとおり、ＩｇＧ抗体Ａ２Ｊ ＨＬＰは、成熟ＣＤ３イプシロン鎖のアミノ酸、位置４でのアスパラギン、位置２３でのスレオニン、位置２５でのイソロイシンに対して、著しい結合の低下を示した。ＩｇＧ抗体Ａ２Ｊ ＨＬＰの結合の完全な喪失が、成熟ＣＤ３イプシロン鎖のアミノ酸、位置１でのグルタミン、位置２でのアスパラギン酸、位置３でのグリシン及び位置５でのグルタミン酸に対して見られた。ＩｇＧ抗体Ｅ２Ｍ ＨＬＰは、成熟ＣＤ３イプシロン鎖のアミノ酸、位置４でのアスパラギン、位置２３でのスレオニン及び位置２５でのイソロイシンに対して、著しい結合の低下を示した。ＩｇＧ抗体Ｅ２Ｍ ＨＬＰは、成熟ＣＤ３イプシロン鎖のアミノ酸、位置１でのグルタミン、位置２でのアスパラギン酸、位置３でのグリシン及び位置５でのグルタミン酸に対して、結合の完全な喪失を示した。ＩｇＧ抗体Ｈ２Ｃ ＨＬＰは、成熟ＣＤ３イプシロン鎖のアミノ酸、位置４でのアスパラギンに対して中程度の結合の低下を示し、成熟ＣＤ３イプシロン鎖のアミノ酸、位置１でのグルタミン、位置２でのアスパラギン酸、位置３でのグリシン及び位置５でのグルタミン酸に対して、結合の完全な喪失を示した。単鎖抗体Ｆ１２Ｑ ＨＬＰは、成熟ＣＤ３イプシロン鎖のアミノ酸、位置１でのグルタミン、位置２でのアスパラギン酸、位置３でのグリシン及び成熟ＣＤ３イプシロン鎖の位置５でのグルタミン酸に対して、基本的に完全な結合の喪失を示した。
６．マウスＴ細胞株ＥＬ４にトランスフェクトされた、Ｎ末端Ｈｉｓ６タグの付いた、又は付いていないヒトＣＤ３イプシロン鎖への、異種間特異性抗ＣＤ３結合分子Ｈ２Ｃ ＨＬＰの結合分析
６．１ Ｎ末端６ヒスチジンタグ（Ｈｉｓ６タグ）の付いたヒトＣＤ３イプシロン鎖のクローニング及び発現
Ｎ末端Ｈｉｓ６タグの付いたヒトＣＤ３イプシロン鎖をコードするｃＤＮＡ断片を遺伝子合成により得た。遺伝子合成断片は、まず、コンストラクトの真核細胞発現のためのコザック部位、次いで、フレームを合わせて、１９アミノ酸免疫グロブリンリーダーペプチドのコード配列、次いで、フレームを合わせて、Ｈｉｓ６タグのコード配列、次いで、フレームを合わせて、成熟ヒトＣＤ３イプシロン鎖のコード配列を含むように設計した（コンストラクトのｃＤＮＡ配列及びアミノ酸配列は、配列番号３８０及び３７９に記す）。遺伝子合成断片は、ｃＤＮＡの最初及び最後に制限部位を含むようにも設計した。導入された制限部位、５'末端でのＥｃｏＲＩ及び３'末端でのＳａｌｌを、以下のクローニング手順で利用した。次いで、遺伝子合成断片を、ＥｃｏＲＩ及びＳａｌｌにより、標準プロトコルに従い、ｐＥＦ−ＮＥＯ（上述）と呼ばれるプラスミド内にクローニングした。配列実証済みプラスミドを使用して、ネズミＴ細胞株ＥＬ４にトランスフェクトした。トランスフェクション及びトランスフェクタントの選択は、上述のとおり実施した。細胞培養の３４日後、トランスフェクタントを、以下に記載されるアッセイに使用した。
６．２ Ｎ末端Ｈｉｓ６タグの付いた、又は付いていないヒトＣＤ３イプシロン鎖への、異種間特異性抗ＣＤ３結合分子Ｈ２Ｃ ＨＬＰの結合
ＣＤ３イプシロンに特異的な結合特異性Ｈ２Ｃ ＨＬＰを持つ、キメラＩｇＧ抗体を、Ｎ末端Ｈｉｓ６タグの付いた、又は付いていないヒトＣＤ３イプシロンへの結合に関して試験した。それぞれ、Ｈｉｓ６ヒトＣＤ３イプシロン及び野生型ヒトＣＤ３イプシロンによりトランスフェクトされたＥＬ４細胞株への抗体の結合を、標準プロトコルに従いＦＡＣＳアッセイにより試験した。２．５×１０5のトランスフェクタントの細胞を、キメラＩｇＧ抗体を含む細胞培養上清５０μｌ又は２％ＦＣＳを含むＰＢＳ中の５μｇ／ｍｌのそれぞれの対照抗体５０μｌとともにインキュベートした。ネガティブコントロールとして適当なアイソタイプコントロールを、又はコンストラクトの発現のポジティブコントロールとしてＣＤ３特異性抗体ＵＣＨＴ−１をそれぞれ使用した。抗体の結合は、２％ＦＣＳを含むＰＢＳ中に１：１００で希釈されたＲ−フィコエリスリン結合アフィニティ精製Ｆ（ａｂ'）２断片、ヤギ抗マウスＩｇＧ、Ｆｃ−ガンマ断片特異的（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｅｕｒｏｐｅ Ｌｔｄ．、ニューマーケット、サフォーク、英国）により検出した。サンプルを、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ＢＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ハイデルベルグ、ドイツ）で測定した。野生型ヒトＣＤ３イプシロンにトランスフェクトされたＥＬ４細胞株に比べ、Ｎ末端Ｈｉｓ６タグの付いたヒトＣＤ３イプシロンへの、結合特異性Ｈ２Ｃ ＨＬＰを持つキメラＩｇＧの結合の明らかな低下が検出された。これらの結果は、ＣＤ３イプシロンのフリーのＮ末端が、ヒトＣＤ３イプシロン鎖への、異種間特異性抗ＣＤ３結合特異性Ｈ２Ｃ ＨＬＰの結合に必須であることを示した（図９）。
７．蛍光活性化細胞選別機（ＦＡＣＳ）により測定するＣＤ３発現ＰＢＭＣへの結合に比較した、表面プラズモン共鳴測定による融合タンパク質１−２７ＣＤ３−Ｆｃへの、霊長類ＥＧＦＲ及び霊長類ＣＤ３に異種間特異的な二重特異性単鎖抗体（ＥＧＦＲ ＬＨ ｘ Ｈ２Ｃ ＨＬＰ）の結合定数ＫＤの決定
７．１ 表面プラズモン共鳴測定
ヒトＣＤ３イプシロン鎖のＮ末端のアミノ酸１−２７への、完全に異種間特異的な二重特異性単鎖抗体ＥＧＦＲ−２１−６３ ＬＨ ｘ Ｈ２Ｃ ＨＬＰの結合親和性を測定するため、ヒトＩｇＧ１のＦｃ部に融合した成熟ヒトＣＤ３イプシロン鎖のＮ末端アミノ酸１−２７からなる組換え融合タンパク質（１−２７ＣＤ３−Ｆｃ）で、表面プラズモン共鳴測定を実施した。このために、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌ−Ｄｅｘｔｒａｎ ＣＭ５チップ（Ｂｉａｃｏｒｅ、ウプサラ、スウェーデン）を、Ｂｉａｃｏｒｅ ２０００（登録商標）システム（Ｂｉａｃｏｒｅ、ウプサラ、スウェーデン）に取り付けた。１フローセルを、Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ'−エチルカルボジイミド塩酸塩／Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド溶液で、標準プロトコルに従い活性化した。融合タンパク質１−２７ＣＤ３−Ｆｃの溶液をその後加えると、Ｂｉａｃｏｒｅチップのデキストラン層へのタンパク質の安定な共有結合が生じた。結合していないタンパク質を徹底的な洗浄により除去し、次いで、エタノールアミン溶液の添加により、未反応の残存ＮＨＳ活性化カルボキシ基をブロックした。カップリングの前のシグナルに比べ、応答単位として測定されるより高いシグナルにより、タンパク質カップリングの成功を確認した。対照セルを、タンパク質溶液を加えずに上述のとおり調製した。
精製した二重特異的抗体ＥＧＦＲ−２１−６３ ＬＨ ｘ Ｈ２Ｃ ＨＬＰを、Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ（登録商標）Ｍｉｎｉ Ｄｉａｌｙｓｉｓ Ｕｎｉｔ（Ｐｉｅｒｃｅ、ロックフォード、イリノイ州、米国）中で、ＨＢＳ−ＥＰバッファ（Ｂｉａｃｏｒｅ、ウプサラ、スウェーデン）に対して徹底的に透析した。透析後のタンパク質濃度は、ＵＶ２８０ｎｍ吸収により測定し、４３μｇ／ｍｌの濃度となった。
タンパク質溶液を、９６ウェルプレートに移し、さらに１０のウェルに１：１の比でＨＢＳ−ＥＰバッファで連続的に希釈した。
表面プラズモン共鳴測定は、全１１ウェルを別々にサンプリングして行った。測定の間で、フローセルをアセテートバッファにより再生し、結合したタンパク質を放出した。
二重特異性抗体分子の結合シグナルは、１−２７ＣＤ３−Ｆｃタンパク質と結合した測定セルのシグナルから対照セルのシグナルを引いて得た。会合及び解離曲線を応答単位として測定し記録した。結合定数は、ラングミュアモデルに基づくＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）カーブフィッティングソフトウェアを利用して計算した。
計算した結合定数ＫＤは、最初の５種の濃度で、１．５２×１０-7Ｍであった。
７．２ ＦＡＣＳ測定によるＣＤ３結合定数の決定
ナイーブヒトＣＤ３への結合強度に関して種間特異的二重特異性抗体分子の親和性を試験するため、追加の飽和ＦＡＣＳ結合分析を実施した。選択した二重特異性抗体分子ＥＧＦＲ−２１−６３ ＬＨ ｘ Ｈ２Ｃ ＨＬＰを使用し、１：１．５の係数及び出発濃度６３．３μｇ／ｍｌで希釈列を設定した。二重特異性抗体分子を、これらの異なる濃度で、それぞれ１．２５×１０5のヒトＰＢＭＣとともに４℃で１時間インキュベートし、次いで、４℃でＰＢＳ中で２回洗浄した。結合した二重特異性抗体分子の検出は、Ｐｅｎｔａ−Ｈｉｓ抗体（Ｑｉａｇｅｎ ＧｍｂＨ、ヒルデン、ドイツ）を、２％ＦＣＳを含む５０μｌＰＢＳ中で５μｇ／ｍｌで使用して実施した。４℃で４５分間インキュベーション及び２回の洗浄工程の後、Ｐｅｎｔａ−Ｈｉｓ抗体の結合を、２％ＦＣＳを含むＰＢＳ中に１：１００で希釈されたＲ−フィコエリスリン結合アフィニティ精製Ｆ（ａｂ'）２断片、ヤギ抗マウスＩｇＧ、Ｆｃ−ガンマ断片特異性（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｅｕｒｏｐｅ Ｌｔｄ．、ニューマーケット、サフォーク、英国）により検出した。フローサイトメトリーは、ＦＡＣＳ−Ｃａｎｔｏ ＩＩ装置で実施し、ＦＡＣＳ Ｄｉｖａソフトウェアを利用して、データを取得し分析した（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ハイデルベルグ）。ＦＡＣＳ染色及び蛍光強度の測定は、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｃｏｌｉｇａｎ， Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ， Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ， Ｓｈｅｖａｃｈ ａｎｄ Ｓｔｒｏｂｅｒ，Ｗｉｌｅｙ−ｌｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，２００２）に記載のとおり実施した。取得した蛍光強度平均値を、使用した二重特異性抗体分子濃度の関数としてプロットし、生物数学ソフトウェアＰｒｉｓｍにより、片側結合分析（双曲線）で分析した。ソフトウェアは、質量作用の法則に従う、リガンド（二重特異性抗体分子）のレセプター（ＣＤ３陽性ＰＢＭＣサブフラクション）への結合を記載する、対応するＫＤ値を計算した。基礎となる式は以下のとおりである：Ｙ＝Ｂｍａｘ ｘ Ｘ／（Ｋｄ＋Ｘ）、ここでＢｍａｘは最大結合である。ＫＤは、半最大結合に達するのに要するリガンドの濃度である。ＦＡＣＳ染色は２連で実施し、Ｒ2値は０．９５より高かった。
二重特異性抗体分子ＥＧＦＲ−２１−６３ ＬＨ ｘ Ｈ２Ｃ ＨＬＰの決定した半最大結合は、８４７２ｎｇ／ｍｌの濃度に達し、５５０００ダルトンの分子量で１５４ｎＭ（１．５４×１０-7Ｍ）に相当する（図１０）。したがって、ネイティブＣＤ３コンテクストから分離されたヒトＣＤ３イプシロン鎖のＮ末端アミノ酸１−２７への、ＥＧＦＲ−２１−６３ ＬＨ ｘ Ｈ２Ｃ ＨＬＰの親和性は、無傷のＴ細胞上のネイティブＣＤ３へのＥＧＦＲ−２１−６３ ＬＨ ｘ Ｈ２Ｃ ＨＬＰの親和性と同等であることが証明された。
８．ヒトＥＧＦＲによりトランスフェクトされたＣＨＯ細胞の生成
ヒトＥＧＦＲに陽性の細胞株、Ａ４３１（表皮ガン細胞株、ＣＲＬ−１５５５、アメリカンタイプカルチャーコレクション、ロックビル、メリーランド州）を使用し、キットマニュアル（Ｑｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ、ヒルデン、ドイツ）の説明書に従い単離されたトータルＲＮＡを得た。得られたＲＮＡを、ランダムプライムド逆転写によりｃＤＮＡ合成に使用した。ヒトＥＧＦＲ抗原の全長配列のクローニングには、以下のオリゴヌクレオチドを使用した：
５'ＥＧＦＲ ＡＧ Ｘｂａｌ ５'−ＧＧＴＣＴＡＧＡＧＣＡＴＧＣＧＡＣＣＣＴＣＣＧＧＧＡＣＧＧＣＣＧＧＧ−３'
３'ＥＧＦＲ ＡＧ Ｓａｌｌ ５'−ＴＴＴＴＡＡＧＴＣＧＡＣＴＣＡＴＧＣＴＣＣＡＡＴＡＡＡＴＴＣＡＣＴＧＣＴ−３'
コード配列をＰＣＲ（最初のサイクルに、９４℃で５分間変性、５８℃で１分間アニーリング、７２℃で２分間伸長；３０サイクルに、９４℃で１分間変性、５８℃で１分間アニーリング、７２℃で２分間伸長；７２℃で５分間末端伸長）により増幅した。次いで、ＰＣＲ産物をＸｂａｌ及びＳａｌｌで消化し、適切に消化された発現ベクターｐＥＦ−ＤＨＦＲ（Ｒａｕｍ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ． ２００１；５０： １４１−１５０）中にライゲーションし、大腸菌中に形質転換した。上述の手順を標準的なプロトコルに従い実施した（Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ； Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （２００１））。配列実証済みヌクレオチド配列を持つクローン（配列番号３７０、アミノ酸配列番号３６９）を、コンストラクトの真核細胞発現のためにＤＨＦＲ欠損ＣＨＯ細胞中にトランスフェクトした。ＤＨＦＲ欠損ＣＨＯ細胞中の真核細胞タンパク質発現は、Ｋａｕｆｍａｎｎ Ｒ．Ｊ． （１９９０） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １８５， ５３７−５６６により記載されるとおり実施した。コンストラクトの遺伝子増幅は、メトトレキサート（ＭＴＸ）の濃度を２０ｎＭ ＭＴＸまでの最終濃度に上昇させることにより誘導した。
９． カニクイザルＥＧＦＲの細胞外ドメインを発現するＣＨＯ細胞の生成
カニクイザルＥＧＦＲの細胞外ドメインのｃＤＮＡ配列を、以下の反応条件を利用し、カニクイザル結腸ｃＤＮＡ（カタログ番号Ｃ１５３４０９０−Ｃｙ−ＢＣ；ＢｉｏＣａｔ ＧｍｂＨ、ハイデルベルグ、ドイツから入手）への１組の２つのＰＣＲにより得た：９４℃で３分間で１サイクル、次いで９４℃で１分間で３５サイクル、５３℃で１分間及び７２℃で２分間、次いで７２℃で３分間で停止サイクル。以下のプライマーを使用した：
１．フォワードプライマー；５'− ＣＧＣＴＣＴＧＣＣＣＧＧＣＧＡＧＴＣＧＧＧＣ−３'
リバースプライマー；５'− ＣＣＧＴＣＴＴＣＣＴＣＣＡＴＣＴＣＡＴＡＧＣ−３'
２．フォワードプライマー；５'− ＡＣＡＴＣＣＧＧＡＧＧＴＧＡＣＡＧＡＴＣＡＣＧＧＣＴＣＧＴＧＣ−３'
リバースプライマー；５'−ＣＡＧＧＡＴＡＴＣＣＧＡＡＣＧＡＴＧＴＧＧＣＧＣＣＴＴＣＧＣ−３'
これらのＰＣＲは、２つの重複する断片を生成し（Ａ：１−８６９、Ｂ：８４８−１９２３）、ＰＣＲプライマーを使用して標準プロトコルにより単離及び配列決定し、成熟タンパク質のコドン＋１の第３ヌクレオチドから膜貫通ドメインの２１番コドンまでのカニクイザルＥＧＦＲのｃＤＮＡ配列の１９２３ ｂｐ部分を与えた。カニクイザルＥＧＦＲの発現のためのコンストラクトを生成するため、ｃＤＮＡ断片を標準プロトコルに従い遺伝子合成により得た（コンストラクトのｃＤＮＡ及びアミノ酸配列は、配列番号３７２及び３７１に記す）。このコンストラクトにおいて、成熟ＥＧＦＲタンパク質のアミノ酸＋２から＋６４１のカニクイザルＥＧＦＲのコード配列を、ヒトＥＧＦＲのコード配列中に融合し、アミノ酸＋２から＋６４１のコード配列を置換した。遺伝子合成断片は、コンストラクトの真核細胞発現のためのコザック部位を含むように、ヒトＥＧＦＲの膜貫通ドメイン及び細胞間ドメインに融合したカニクイザルＥＧＦＲの細胞外ドメインを基本的にコードするｃＤＮＡの最初と最後に制限部位を含むように設計した。さらに、保存的突然変異をアミノ酸６２７（膜貫通ドメインの第４のアミノ酸）に導入し、バリンをロイシンに変異し、クローニング目的の制限部位（Ｓｐｈｌ）を生成した。導入された制限部位、５'末端でのＸｂａｌ及び３'末端でのＳａｌｌを以下のクローニング手順に利用した。次いで、遺伝子合成断片を、Ｘｂａｌ及びＳａｌｌにより、ｐＥＦ−ＤＨＦＲ（ｐＥＦ−ＤＨＦＲはＭａｃｋ ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９２ （１９９５） ７０２１−７０２５に記載されている）と呼ばれるプラスミド中にクローニングした。このプラスミドの配列実証済みクローンを使用して、上述のとおりＣＨＯ／ｄｈｆｒ−細胞にトランスフェクトした。
１０． ＥＧＦＲ及びＣＤ３種間特異的二重特異性単鎖分子の生成
１０．１ 異種間特異性結合分子のクローニング
一般的に、ヒト及び非チンパンジー霊長類ＣＤ３イプシロンに対して異種間特異的な結合特異性を有するドメイン並びにヒト及び非チンパンジー霊長類ＥＧＦＲに対して異種間特異的な結合特異性を有するドメインをそれぞれ含む、二重特異性単鎖抗体分子を、以下の表１に記載のとおり設計した。
Figure 2014064568
ヒト及びカニクイザルＥＧＦＲに対して異種間特異的な可変軽鎖（Ｌ）及び可変重鎖（Ｈ）ドメインを含む上述のコンストラクトは、遺伝子合成により得た。遺伝子合成断片は、まず、コンストラクトの真核細胞発現のためのコザック部位を含むように、次いで１９アミノ酸免疫グロブリンリーダーペプチド、次いで、フレームを合わせて、それぞれの二重特異性単鎖抗体分子のコード配列を、次いで、フレームを合わせて、６ヒスチジンタグのコード配列及び終止コドンを含むように設計した。遺伝子合成断片は、好適なＮ及びＣ末端制限部位を導入するようにも設計した。遺伝子合成断片を、これらの制限部位により、標準プロトコルに従い（Ｓａｍｂｒｏｏｋ、 Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ； Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、 ３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ、 Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ、 Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （２００１））、ｐＥＦ−ＤＨＦＲ（ｐＥＦ−ＤＨＦＲはＲａｕｍ ｅｔ ａｌ．、 Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ． ５０（２００１） １４１−１５０に記載されている）と呼ばれるプラスミドにクローニングした。配列実証済みヌクレオチド配列を有するクローンを、コンストラクトの真核細胞発現のために、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）欠損チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞中にトランスフェクトした。
コンストラクトを、ＤＨＦＲ欠損ＣＨＯ細胞（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＲＬ９０９６）にエレクトロポレーションにより安定導入又は一過性導入し、或いは、標準プロトコルに従い一過性にＨＥＫ２９３（ヒト胎児由来腎臓細胞、ＡＴＣＣ番号 ＣＲＬ１５７３）にトランスフェクトした。
１０．２ 二重特異性単鎖抗体分子の発現及び精製
二重特異性単鎖抗体分子は、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）中で発現した。ＤＨＦＲ欠損ＣＨＯ細胞での真核生物タンパク質発現は、Ｋａｕｆｍａｎｎ Ｒ．Ｊ． （１９９０） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １８５， ５３７−５６６に記載されているとおり実施した。コンストラクトの遺伝子増幅は、ＭＴＸの最終濃度を２０ｎＭまで上昇させて誘導した。静置培養の２回の継代後、細胞を、ヌクレオシドを含まないＨｙＱ ＰＨ ＣＨＯ液体大豆培地により（４．０ｍＭのＬ−グルタミン及び０．１％のプルロニックＦ−６８、ＨｙＣｌｏｎｅを含む）回転瓶中で７日間生育してから、採取した。細胞を遠心分離により除去し、発現したタンパク質を含む上清を−２０℃で保存した。或いは、コンストラクトを、ＨＥＫ２９３細胞中で一過性発現させた。トランスフェクションは製造業者のプロトコルに従い、２９３ｆｅｃｔｉｎ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１２３４７−０１９番）により実施した。
Ａｋｔａ（登録商標） Ｅｘｐｌｏｒｅｒ Ｓｙｓｔｅｍ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｙｓｔｅｍｓ）及びＵｎｉｃｏｒｎ（登録商標）Ｓｏｆｔｗａｒｅをクロマトグラフィに使用した。製造業者が提供するプロトコルに従い、ＺｎＣｌ2を充填したＦｒａｃｔｏｇｅｌ ＥＭＤキレート（登録商標）（Ｍｅｒｃｋ）を使用して、固定化金属イオンアフィニティクロマトグラフィ（「ＩＭＡＣ」）を実施した。バッファＡ（２０ｍＭリン酸ナトリウムバッファ、ｐＨ ７．２、０．１Ｍ ＮａＣｌ）によりカラムを平衡化し、細胞培養上清（５００ｍｌ）を、３ｍｌ／分の流速で、カラム（１０ｍｌ）に注いだ。カラムをバッファＡで洗浄して結合してないサンプルを除いた。結合したタンパク質を、バッファＢ（２０ｍＭリン酸ナトリウムバッファ、ｐＨ ７．２、０．１Ｍ ＮａＣｌ、０．５Ｍ イミダゾール）の２段階勾配を利用して、以下のとおり溶離した：
工程１：６カラム容積の２０％バッファＢ
工程２：６カラム容積の１００％バッファＢ
工程２から溶離したタンパク質分画を、さらなる精製のために貯蔵した。全ての試薬は、研究用グレードであり、Ｓｉｇｍａ（ダイゼンホーフェン）又はＭｅｒｃｋ（ダルムシュタット）から購入した。
Ｅｑｕｉ−ｂｕｆｆｅｒ（２５ｍＭ シトレート、２００ｍＭ リジン、５％グリセロール、ｐＨ ７．２）により平衡化したＨｉＬｏａｄ１６／６０Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００分取用カラム（ＧＥ／Ａｍｅｒｓｈａｍ）で、ゲル濾過クロマトグラフィを実施した。溶離したタンパク質サンプル（流速１ｍｌ／分）を、検出のため、標準的なＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタンブロットにかけた。精製の前に、分子量測定のために（分子量マーカーキット、Ｓｉｇｍａ、ＭＷ ＧＦ−２００）カラムを平衡化した。タンパク質濃度は、ＯＤ２８０ｎｍを利用して測定した。
精製した二重特異性単鎖抗体タンパク質を、プレキャスト４−１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により実施した還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。サンプル調製及び適用は、製造業者が提供するプロトコルに従って実施した。分子量は、ＭｕｌｔｉＭａｒｋタンパク質標準物質（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により測定した。ゲルを、コロイド状クーマシー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎプロトコル）により染色した。単離したタンパク質の純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定して９５％を超えていた。
天然条件下でＰＢＳ中のゲル濾過により測定して、二重特異性単鎖抗体の分子量は約５２ｋＤａである。コンストラクトは全てこの方法により精製した。
ウェスタンブロットは、Ｏｐｔｉｔｒａｎ（登録商標）ＢＡ−Ｓ８３メンブレン及びＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｂｌｏｔ Ｍｏｄｕｌｅを利用して、製造業者が提供するプロトコルにより実施した。使用した抗体に、Ｈｉｓ Ｔａｇ（Ｐｅｎｔ Ｈｉｓ、Ｑｉａｇｅｎ）及びアルカリホスファターゼ（ＡＰ）標識ヤギ抗マウスＩｇ（Ｓｉｇｍａ）及び基質としてのＢＣＩＰ／ＮＢＴ（Ｓｉｇｍａ）を作用させた。精製した二重特異性単鎖抗体に相当する５２ｋＤでシングルバンドを検出した。
１１． 表面プラズモン共鳴測定による、融合タンパク質１−２７ＣＤ３−Ｆｃへの、完全に種間特異的二重特異性単鎖抗体の結合定数ＫＤの決定
成熟ヒトＣＤ３イプシロン鎖のＮ末端のアミノ酸１−２７への、霊長類ＥＧＦＲ及び霊長類ＣＤ３に異種間特異的な二重特異性単鎖抗体分子の結合親和性を測定するため、表面プラズモン共鳴測定を、ヒトＩｇＧ１のＦｃ部に融合したヒトＣＤ３イプシロン鎖のＮ末端アミノ酸１−２７からなる組換え融合タンパク質で実施した（１−２７ＣＤ３−Ｆｃ）。このために、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌ−Ｄｅｘｔｒａｎ ＣＭ５チップ（Ｂｉａｃｏｒｅ、ウプサラ、スウェーデン）を、Ｂｉａｃｏｒｅ ２０００（登録商標）システム（Ｂｉａｃｏｒｅ、ウプサラ、スウェーデン）に取り付けた。フローセルを、Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ'−エチルカルボジイミド塩酸塩／Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド溶液で、標準プロトコルに従い活性化した。融合タンパク質１−２７ＣＤ３−Ｆｃの溶液をその後加えると、Ｂｏａｃｏｒｅチップのデキストラン層へのタンパク質の安定な共有結合が生じた。結合していないタンパク質を徹底的な洗浄により除去し、次いで、エタノールアミン溶液の添加により、未反応の残存ＮＨＳ活性化カルボキシ基をブロックした。カップリングの前のシグナルに比べ、応答単位として測定されるより高いシグナルの検出により、タンパク質カップリングの成功を確認した。対照セルを、タンパク質溶液を加えずに上述のとおり調製した。
以下に列記する精製した二重特異性単鎖抗体は、ＨＢＳ−ＥＰバッファ（Ｂｉａｃｏｒｅ、ウプサラ、スウェーデン）で５μｇ／ｍｌに調整し、それぞれ１５０μｌの体積で９６ウェルプレートに移した。
全サンプルに表面プラズモン共鳴測定を実施し、測定の間にフローセルをアセテートバッファで再生し、結合したタンパク質を放出した（全て標準プロトコルによる）。
二重特異性単鎖抗体の結合シグナルは、１−２７ＣＤ３−Ｆｃタンパク質に結合した測定セルのシグナルから、対照セルのシグナルを引いて得た。
会合及び解離曲線を応答単位として測定し記録した。結合定数は、ラングミュアモデルに基づくＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）カーブフィッティングソフトウェアを利用して計算した。ヒトＣＤ３イプシロンのＮ末端アミノ酸１−２７への、試験した完全に種間特異的二重特異性の単鎖分子の親和性計算値は、以下のＫＤ値として与えられ、２．５４×１０-6Ｍから２．４９×１０-7Ｍの範囲である。「ＬＨ」は、ＶＬ−ＶＨの順の可変ドメインの配置を意味する。「ＨＬ」は、ＶＨ−ＶＬの順の可変ドメインの配置を意味する。Ｇ４Ｈ、Ｆ７０、Ａ２Ｊ、Ｅ１Ｌ、Ｅ２Ｍ、Ｈ１Ｅ及びＦ６Ａは、異なる異種間特異性ＣＤ３結合分子を意味する。
Figure 2014064568
１２． ＥＧＦＲ及びＣＤ３種間特異的二重特異性抗体のフローサイトメトリー結合分析
それぞれ、ヒト及びカニクイザルのＥＧＦＲ及びＣＤ３へ結合能に関して、種間特異的二重特異性抗体コンストラクトの機能性を試験するために、ＦＡＣＳ分析を実施した。この目的のため、実施例８に記載したヒトＥＧＦＲによりトランスフェクトされたＣＨＯ細胞及びヒトＣＤ３陽性Ｔ細胞白血病細胞株ＨＰＢ−ＡＬＬ（ＤＳＭＺ、ブラウンシュヴァイク、ＡＣＣ４８３）を使用し、ヒト抗原への結合を試験した。カニクイザル抗原の結合反応性は、実施例９に記載された生成したカニクイザルＥＧＦＲトランスフェクタント及びマカクザルＴ細胞株４１１９ＬｎＰｘ（Ｆｉｃｋｅｎｓｃｈｅｒ教授による提供に感謝、Ｈｙｇｉｅｎｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ， Ｖｉｒｏｌｏｇｙ， Ｅｒｌａｎｇｅｎ−Ｎｕｅｒｎｂｅｒｇ；Ｋｎａｐｐｅ Ａ， ｅｔ ａｌ．， ａｎｄ Ｆｉｃｋｅｎｓｃｈｅｒ Ｈ．，Ｂｌｏｏｄ ２０００，９５，３２５６−６１に発表）を使用して試験した。それぞれの細胞集団の２０万の細胞を、種間特異的二重特異性抗体コンストラクト（２μｇ／ｍｌ）の精製タンパク質５０μｌとともに氷上で３０分間インキュベートした。或いは、一過的に産生したタンパク質の細胞培養上清を使用した。細胞をＰＢＳで２回洗浄し、コンストラクトの結合を、マウスＰｅｎｔａ Ｈｉｓ抗体（Ｑｉａｇｅｎ；２％ＦＣＳを含む５０μｌＰＢＳで１：２０に希釈）により検出した。洗浄の後、結合した抗Ｈｉｓ抗体を、２％ＦＣＳを含むＰＢＳに１：１００で希釈された、フィコエリスリンに結合したＦｃガンマ特異性抗体（Ｄｉａｎｏｖａ）により検出した。新鮮な培地をネガティブコントロールとして使用した。
フローサイトメトリーをＦＡＣＳ−Ｃａｌｉｂｕｒ装置で実施し、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェア（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ハイデルベルグ）を利用してデータを取得し分析した。ＦＡＣＳ染色及び蛍光強度の測定は、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ （Ｃｏｌｉｇａｎ， Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ， Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ， Ｓｈｅｖａｃｈ ａｎｄ Ｓｔｒｏｂｅｒ， Ｗｉｌｅｙ−ｌｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ， ２００２）に記載のとおり実施した。
ＥＧＦＲに特異的でヒト及び非チンパンジー霊長類ＣＤ３に異種間特異的であるいくつかの二重特異性単鎖分子の結合能は、図１１に示されるとおり、明らかに検出可能であった。ＦＡＣＳ分析において、全コンストラクトが、ネガティブコントロールとしての培地及び１次・２次抗体に比べ、ＣＤ３及びＥＧＦＲへの結合を示した。ヒト及びカニクイザルＣＤ３及びＥＧＦＲ抗原に対する二重特異性抗体の異種間特異性が示された。
１３．ＥＧＦＲ及びＣＤ３種間特異的二重特異性単鎖抗体の生理活性
生成した二重特異性単鎖抗体の生理活性を、実施例８及び９に記載されたＥＧＦＲ陽性細胞株を利用して、インビトロ細胞障害アッセイにおいてクロム５１（51Ｃｒ）の放出により分析した。エフェクター細胞として、刺激を受けたヒトＣＤ８陽性Ｔ細胞又はマカクＴ細胞株４１１９ＬｎＰｘをそれぞれ使用した。
刺激を受けたＣＤ８＋Ｔ細胞の生成は以下のとおり実施した：
ペトリ皿（直径１４５ｍｍ、Ｇｒｅｉｎｅｒ）を、市販の抗ＣＤ３特異性抗体により、最終濃度１μｇ／ｍｌで１時間３７℃でプレコートした。未結合のタンパク質を、ＰＢＳでの１洗浄工程で除去した。新鮮なＰＢＭＣを、標準プロトコルに従い、Ｆｉｃｏｌｌ勾配遠心分離により末梢血（３０〜５０ｍｌ、ヒトの血液）から単離した。３〜５×１０7ＰＢＭＣを、プレコートされたペトリ皿に、１２０ｍｌのＲＰＭＩ １６４０／１０％ ＦＣＳ／ＩＬ−２ ２０Ｕ／ｍｌ（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ、Ｃｈｉｒｏｎ）に加え、２日間刺激した。３日目に、細胞を回収し、ＲＰＭＩ １６４０で１回洗浄した。ＩＬ−２を２０ Ｕ／ｍｌの最終濃度で加え、１日間再び培養した。ＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ５６＋ＮＫ細胞の除去により、ＣＤ８＋細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を単離した。
標的細胞をＰＢＳで２回洗浄し、５０％ＦＣＳを含む１００μｌのＲＰＭＩの最終体積で、３７℃で４５分間、１１．１ＭＢｑ51Ｃｒで標識した。次いで、標識した標的細胞を、５ｍｌのＲＰＭＩで３回洗浄し、次いで、細胞障害性アッセイに使用した。アッセイは、１０：１のＥ：Ｔ比で、ＲＰＭＩ（上述）を補った総体積２５０μｌで９６ウェルプレート中で実施した。１μｇ／ｍｌの種間特異的二重特異性単鎖抗体分子及びその２０回の３倍希釈体を利用した。或いは、一過性産生されたタンパク質の細胞培養上清を、１：２ステップで連続的に希釈した。アッセイ時間は１８時間であり、細胞障害性は、最大溶解（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘの添加）と自然溶解（エフェクター細胞なし）の差に関連する上清中の放出クロムの相対値として測定した。測定は全て４連で実施した。上清中のクロム活性の測定を、Ｗｉｚａｒｄ ３"ガンマカウンター（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ＧｍｂＨ、ケルン、ドイツ）で実施した。実験データの分析は、Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）用Ｐｒｉｓｍ ４（バージョン４．０２、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ．、サンディエゴ、カリフォルニア州、米国）で実施した。Ｓ字状の用量応答曲線のＲ2値は、該ソフトウェアにより測定して、通常０．９０を超えた。分析プログラムにより計算されたＥＣ50値を、生理活性の比較に使用した。
図１２及び１３に示されるように、生成した全ての種間特異的二重特異性単鎖抗体コンストラクトは、ヒトＣＤ８＋細胞により誘発されたヒトＥＧＦＲ陽性標的細胞及びマカクザルＴ細胞株４１１９ＬｎＰｘにより誘発されたカニクイザルＥＧＦＲ陽性標的細胞に対して、細胞障害活性を現した。異なる標的特異性を持つ二重特異性単鎖抗体をネガティブコントロールとして使用した。
１４． ヒトＭＣＳＰのＣ末端の膜貫通及び先端切断型細胞外ドメインのクローニング及び発現
ヒトＭＣＳＰのＣ末端の膜貫通及び先端切断型細胞外ドメイン（アミノ酸１５３８〜２３２２）のコード配列を、標準プロトコルに従い遺伝子合成により得た（ヒトＭＣＳＰ（ヒトＤ３と呼ばれる）のＣ末端の、膜貫通及び先端切断型細胞外ドメインの発現のための組換えコンストラクトのｃＤＮＡ配列及びアミノ酸配列は配列番号３７４及び３７３に記す）。遺伝子合成断片は、まず、コンストラクトの真核細胞発現を可能にするコザック部位、次いで、１９アミノ酸免疫グロブリンリーダーペプチドのコード配列、次いで、フレームを合わせて、ＦＬＡＧタグ、次いで、フレームを合わせて、クローニング目的のいくつかの制限部位を含み９アミノ酸人工リンカー（ＳＲＴＲＳＧＳＱＬ）をコードする配列、次いで、フレームを合わせて、ヒトＭＣＳＰのＣ末端膜貫通及び先端切断型細胞外ドメインのコード配列及び終止コドンを含むように設計した。ＤＮＡ断片の最初と最後に制限部位を導入した。制限部位、５'末端でのＥｃｏＲＩ及び３'末端でのＳａｌｌを以下のクローニング手順で使用した。断片をＥｃｏＲＩ及びＳａｌｌにより消化し、ｐＥＦ−ＤＨＦＲ（ｐＥＦ−ＤＨＦＲはＭａｃｋ ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９２ （１９９５） ７０２１−７０２５に記載されている）に以下の標準プロトコルでクローニングした。配列実証済みプラスミドを使用し、ＣＨＯ／ｄｈｆｒ−細胞（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＲＬ９０９６）にトランスフェクトした。細胞を、１０％ＦＣＳ、１％ペニシリン／ストレプトマイシン（全て、Ｂｉｏｃｈｒｏｍ ＡＧ、ベルリン、ドイツから入手）及び細胞培養グレード試薬（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｅ ＧｍｂＨ、タウフキルヒェン、ドイツ）のストック溶液から１０μｇ／ｍｌのアデノシン、１０μｇ／ｍｌのデオキシアデノシン及び１０μｇ／ｍｌのチミジンの最終濃度にヌクレオシドを補い安定化グルタミンを含むＲＰＭＩ １６４０中で、３７℃、湿度９５％、ＣＯ2７％でインキュベーター中で培養した。トランスフェクションは、ＰｏｌｙＦｅｃｔ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｑｉａｇｅｎ ＧｍｂＨ、ヒルデン、ドイツ）及び５μｇのプラスミドＤＮＡを製造業者のプロトコルに従い使用して実施した。２４時間培養の後、細胞をＰＢＳで１回洗浄し、安定化グルタミン及び１％ペニシリン／ストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ １６４０中で再び培養した。このように、細胞培地はヌクレオシドを含んでおらず、選択はトランスフェクトされた細胞に行われた。トランスフェクションのおよそ１４日後、耐性細胞の増殖が観察された。さらに７から１４日後、トランスフェクタントを、ＦＡＣＳによりコンストラクトの発現に関して試験した。２．５×１０5の細胞を、２％ＦＣＳを含むＰＢＳ中で５μｇ／ｍｌに希釈された抗Ｆｌａｇ Ｍ２抗体（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｅ ＧｍｂＨ、タウフキルヒェン、ドイツ）５０μｌとともにインキュベートした。抗体の結合を、２％ＦＣＳを含むＰＢＳ中に１：１００で希釈されたＲ−フィコエリスリン結合アフィニティ精製Ｆ（ａｂ'）２断片、ヤギ抗マウスＩｇＧ、Ｆｃ−ガンマ断片特異的（ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｅｕｒｏｐｅ Ｌｔｄ．、ニューマーケット、サフォーク、英国）により検出した。サンプルを、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ＢＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ハイデルベルグ、ドイツ）で測定した。
１５． マカクＭＳＣＰのＣ末端の膜貫通及び先端切断型細胞外ドメインのクローニング及び発現
マカクザルＭＣＳＰ（マカクＤ３と呼ばれる）Ｃ末端の膜貫通及び先端切断型細胞外ドメインのｃＤＮＡ配列を、以下の反応条件により、マカクザル皮膚ｃＤＮＡ（カタログ番号Ｃ１５３４２１８−Ｃｙ−ＢＣ；ＢｉｏＣａｔ ＧｍｂＨ、ハイデルベルグ、ドイツ）への１組の３つのＰＣＲにより得た：９４℃で３分間で１サイクル、４０サイクルを９４℃で０．５分間、５２℃で０．５分間、そして７２℃で１．７５分間、７２℃で３分間の停止サイクル。以下のプライマーを使用した：
フォワードプライマー：５''−ＧＡＴＣＴＧＧＴＣＴＡＣＡＣＣＡＴＣＧＡＧＣ−３''
リバースプライマー：５''−ＧＧＡＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＧＣＴＣＡＧＴＧＡＧＧ−３''
フォワードプライマー：５''−ＴＴＣＣＡＧＣＴＧＡＧＣＡＴＧＴＣＴＧＡＴＧＧ−３''
リバースプライマー：５''−ＣＧＡＴＣＡＧＣＡＴＣＴＧＧＧＣＣＣＡＧＧ−３''
フォワードプライマー：５''−ＧＴＧＧＡＧＣＡＧＴＴＣＡＣＴＣＡＧＣＡＧＧＡＣＣ−３''
リバースプライマー：５''−ＧＣＣＴＴＣＡＣＡＣＣＣＡＧＴＡＣＴＧＧＣＣ−３''
これらのＰＣＲは、３つの重複断片を生成したが（Ａ：１−１３２９、Ｂ：１２２９−２４２８、Ｃ：１７８２−２５４７）、ＰＣＲプライマーを使用して標準プロトコルにより単離及び配列決定し、Ｃ末端ドメインのコード配列の７４ ｂｐ上流から終止コドンの１２１ ｂｐ下流まで、マカクザルＭＣＳＰのｃＤＮＡ配列の２５４７ ｂｐ部分を与えた（マカクザルＭＣＳＰのこの部分のｃＤＮＡ配列及びアミノ酸配列は、配列番号３７６及び３７５に記す）。以下の反応条件を利用するもう１つのＰＣＲを使用して、上述の反応Ａ及びＢのＰＣＲ産物を融合した：９４℃で３分間で１サイクル、１０サイクルを９４℃で１分間で１０サイクル、５２℃で１分間及び７２℃で２．５分間、７２℃で３分間の停止サイクル。以下のプライマーを使用する：
フォワードプライマー：５''−ｔｃｃｃｇｔａｃｇａｇａｔｃｔｇｇａｔｃｃｃａａｔｔｇｇａｔｇｇｃｇｇａｃｔｃｇｔｇｃｔｇｔｔｃｔｃａｃａｃａｇａｇｇ−３''
リバースプライマー：５''−ａｇｔｇｇｇｔｃｇａｃｔｃａｃａｃｃｃａｇｔａｃｔｇｇｃｃａｔｔｃｔｔａａｇｇｇｃａｇｇｇ−３''
このＰＣＲのプライマーは、マカクザルＭＣＳＰのＣ末端膜貫通及び先端切断型細胞ドメインをコードするｃＤＮＡ配列の最初と最後に制限部位を導入するように設計した。導入された制限部位、５'末端でのＭｆｅｌ及び３'末端でのＳａｌｌを以下のクローニング手順で使用した。次いで、ＰＣＲ断片を、Ｍｆｅｌ及びＳａｌｌにより、ヒトＭＣＳＰのＣ末端膜貫通及び先端切断型細胞外ドメインを置換することにより、上述のプラスミドｐＥＦ−ＤＨＦＲ（ｐＥＦ−ＤＨＦＲは、Ｒａｕｍ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ． ５０（２００１） １４１−１５０に記載されている）のＥｃｏＲＩ／Ｍｆｅｌ断片を含むＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔプラスミド中にクローニングした。遺伝子合成断片は、免疫グロブリンリーダーペプチド及びＦｌａｇタグのコード配列並びにマカクザルＭＣＳＰのＣ末端膜貫通及び先端切断型細胞外ドメインをコードするｃＤＮＡ断片の５'末端にフレームを合わせて人工リンカー（ＳＲＴＲＳＧＳＱＬ）を含んでいた。このベクターを使用して、ＣＨＯ／ｄｈｆｒ−細胞（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＲＬ ９０９６）にトランスフェクトした。細胞を、１０％ＦＣＳ、１％ペニシリン／ストレプトマイシン（全て、Ｂｉｏｃｈｒｏｍ ＡＧ、ベルリン、ドイツから入手）及び細胞培養グレード試薬（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｅ ＧｍｂＨ、タウフキルヒェン、ドイツ）のストック溶液から１０μｇ／ｍｌのアデノシン、１０μｇ／ｍｌのデオキシアデノシン及び１０μｇ／ｍｌのチミジンの最終濃度にヌクレオシドを補い安定化グルタミンを含むＲＰＭＩ １６４０中で、３７℃、湿度９５％ＣＯ2７％でインキュベーター中で培養した。トランスフェクションは、ＰｏｌｙＦｅｃｔ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｑｉａｇｅｎ ＧｍｂＨ、ヒルデン、ドイツ）及び５μｇのプラスミドＤＮＡを製造業者のプロトコルに従い使用して実施した。２４時間培養の後、細胞をＰＢＳで１回洗浄し、安定化グルタミン及び１％ペニシリン／ストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ １６４０中で再び培養した。このように、細胞培地はヌクレオシドを含んでおらず、選択はトランスフェクトされた細胞に行われた。トランスフェクションのおよそ１４日後、耐性細胞の増殖が観察された。さらに７から１４日後、トランスフェクタントを、ＦＡＣＳにより組換えコンストラクトの発現に関して試験した。２．５×１０5の細胞を、２％ＦＣＳを含むＰＢＳ中で５μｇ／ｍｌに希釈された抗Ｆｌａｇ−Ｍ２抗体（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｅ ＧｍｂＨ、タウフキルヒェン、ドイツ）５０μｌとともにインキュベートした。結合した抗体を、２％ＦＣＳを含むＰＢＳ中に１：１００で希釈されたＲ−フィコエリスリン結合アフィニティ精製Ｆ（ａｂ'）２断片、ヤギ抗マウスＩｇＧ、Ｆｃ−ガンマ断片特異的（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｅｕｒｏｐｅ Ｌｔｄ．、ニューマーケット、サフォーク、英国）により検出した。サンプルを、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ＢＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ハイデルベルグ、ドイツ）で測定した。
１６．ＭＣＳＰ及びＣＤ３種間特異的二重特異性単鎖分子の生成及びキャラクタリゼーション
ヒト及び非チンパンジー霊長類ＣＤ３イプシロンに異種間特異的な結合ドメイン並びにヒト及び非チンパンジー霊長類ＭＣＳＰに異種間特異的な結合ドメインをそれぞれ含む二重特異性単鎖抗体分子を、以下の表２に記載のとおり設計する。
Figure 2014064568
ヒト及びマカクザルＭＣＳＰ Ｄ３に異種間特異的な可変重鎖（ＶＨ）及び可変軽鎖（ＶＬ）ドメイン及びヒト及びマカクザルＣＤ３に異種間特異的なＶＨ及びＶＬドメインを含む上述のコンストラクトを、遺伝子合成により得た。遺伝子合成断片を、まずコンストラクトの真核細胞発現のためのコザック部位を含むように、次いで、１９アミノ酸免疫グロブリンリーダーペプチドを、次いで、フレームを合わせて、それぞれの二重特異性単鎖抗体分子のコード配列を、次いで、フレームを合わせて、ヒスチジン6タグのコード配列及び終止コドンを含むように、設計した。遺伝子合成断片を、好適なＮ末端及びＣ末端制限部位を導入するようにも設計した。遺伝子合成断片を、これらの制限部位により、ｐＥＦ−ＤＨＦＲと呼ばれるプラスミド（ｐＥＦ−ＤＨＦＲは、Ｒａｕｍ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．， ５０（２００１） １４１−１５０に記載されている）中に、標準プロトコルに従い（Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ； Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （２００１））クローニングした。コンストラクトを、エレクトロポレーションによりＤＨＦＲ欠損ＣＨＯ細胞（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＲＬ ９０９６）に安定導入又は一過性導入し、或いはＨＥＫ２９３（ヒト胎児由来腎臓細胞、ＡＴＣＣ番号 ＣＲＬ−１５７３）に標準プロトコルに従い一過性導入させた。
ＤＨＦＲ欠損ＣＨＯ細胞での真核細胞タンパク質発現は、Ｋａｕｆｍａｎｎ Ｒ．Ｊ． （１９９０） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １８５， ５３７−５６６により記載されるとおりに実施した。コンストラクトの遺伝子増幅は、メトトレキサート（ＭＴＸ）の濃度を、２０ｎｍのＭＴＸ最終濃度まで上昇することにより誘導した。静置培養の２回の継代後、細胞を、ヌクレオシドを含まないＨｙＱ ＰＨ ＣＨＯ液体大豆培地により（４．０ｍＭのＬ−グルタミン及び０．１％のプルロニックＦ−６８、ＨｙＣｌｏｎｅを含む）回転瓶中で７日間生育してから、採取した。細胞を遠心分離により除去し、発現したタンパク質を含む上清を−２０℃で保存した。
Ａｋｔａ（登録商標） Ｅｘｐｌｏｒｅｒ Ｓｙｓｔｅｍ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｙｓｔｅｍｓ）及びＵｎｉｃｏｒｎ（登録商標）Ｓｏｆｔｗａｒｅをクロマトグラフィに使用した。製造業者が提供するプロトコルに従い、ＺｎＣｌ2を充填したＦｒａｃｔｏｇｅｌ ＥＭＤキレート（登録商標）（Ｍｅｒｃｋ）を使用して、固定化金属イオンアフィニティクロマトグラフィ（「ＩＭＡＣ」）を実施した。バッファＡ（２０ｍＭリン酸ナトリウムバッファ、ｐＨ ７．２、０．１Ｍ ＮａＣｌ）によりカラムを平衡化し、細胞培養上清（５００ｍｌ）を、３ｍｌ／分の流速で、カラム（１０ｍｌ）に注いだ。カラムをバッファＡで洗浄して結合してないサンプルを除いた。結合したタンパク質を、バッファＢ（２０ｍＭリン酸ナトリウムバッファ、ｐＨ ７．２、０．１Ｍ ＮａＣｌ、０．５Ｍ イミダゾール）の２段階勾配を利用して、以下のとおり溶離した：
工程１：６カラム容積の２０％バッファＢ
工程２：６カラム容積の１００％バッファＢ
工程２から溶離したタンパク質分画を、さらなる精製のために貯蔵した。全ての試薬は、研究用グレードであり、Ｓｉｇｍａ（ダイゼンホーフェン）又はＭｅｒｃｋ（ダルムシュタット）から購入した。
Ｅｑｕｉ−ｂｕｆｆｅｒ（２５ｍＭ シトレート、２００ｍＭ リジン、５％グリセロール、ｐＨ ７．２）により平衡化したＨｉＬｏａｄ１６／６０Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００分取用カラム（ＧＥ／Ａｍｅｒｓｈａｍ）で、ゲル濾過クロマトグラフィを実施した。溶離したタンパク質サンプル（流速１ｍｌ／分）を、検出のため、標準的なＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタンブロットにかけた。精製の前に、分子量測定のために（分子量マーカーキット、Ｓｉｇｍａ、ＭＷ ＧＦ−２００）カラムを平衡化した。タンパク質濃度は、ＯＤ２８０ｎｍを利用して測定した。
精製した二重特異性単鎖抗体タンパク質を、プレキャスト４−１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により実施した還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。サンプル調製及び適用は、製造業者が提供するプロトコルに従って実施した。分子量は、ＭｕｌｔｉＭａｒｋタンパク質標準物質（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により測定した。ゲルを、コロイド状クーマシー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎプロトコル）により染色した。単離したタンパク質の純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定して９５％を超える。
天然条件下でリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中のゲル濾過により測定して、二重特異性単鎖抗体の分子量は約５２ｋＤａである。コンストラクトは全てこの方法により精製した。
ウェスタンブロットは、Ｏｐｔｉｔｒａｎ（登録商標）ＢＡ−Ｓ８３メンブレン及びＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｂｌｏｔ Ｍｏｄｕｌｅを利用して、製造業者が提供するプロトコルにより実施した。二重特異性単鎖抗体タンパク質抗体の検出には、抗Ｈｉｓ Ｔａｇ抗体（Ｐｅｎｔａ Ｈｉｓ，Ｑｉａｇｅｎ）を使用した。アルカリホスファターゼ（ＡＰ）標識ヤギ抗マウスＩｇ抗体（Ｓｉｇｍａ）を二次抗体として使用し、基質としてＢＣＩＰ／ＮＢＴ（Ｓｉｇｍａ）を使用した。精製した二重特異性単鎖抗体に相当する５２ｋＤでシングルバンドを検出した。
或いは、コンストラクトは、ＤＨＦＲ欠損ＣＨＯ細胞中に一過性発現した。簡単に言うと、コンストラクト当たり４×１０5の細胞を、１０％胎児ウシ血清、１％ペニシリン／ストレプトマイシン及び細胞培養グレード試薬（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｅ ＧｍｂＨ、タウフキルヒェン、ドイツ）のストック溶液から１０μｇ／ｍｌのアデノシン、１０μｇ／ｍｌのデオキシアデノシン及び１０μｇ／ｍｌのチミジンの最終濃度にヌクレオシドを補い安定化グルタミンを含む３ｍｌのＲＰＭＩ １６４０ ａｌｌ ｍｅｄｉｕｍ中で、３７℃、湿度９５％、ＣＯ2７％でインキュベーター中で、トランスフェクションの１日前に培養した。トランスフェクションは、製造業者のプロトコルに従い、Ｆｕｇｅｎｅ ６ Ｔｒａｎｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｒｏｃｈｅ、番号１１８１５０９１００１）により実施した。９４μｌのＯｐｔｉＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及び６μｌのＦｕｇｅｎｅ６を混合し、室温で５分間インキュベートする。その後、コンストラクト当たり１．５μｇのＤＮＡを加え、混合し、室温で１５分間インキュベートした。その間、ＤＨＦＲ欠損ＣＨＯ細胞を、１×ＰＢＳで洗浄し、１．５ｍｌのＲＰＭＩ １６４０ ａｌｌ ｍｅｄｉｕｍに再懸濁した。トランスフェクションミックスを、６００μｌのＲＰＭＩ １６４０ ａｌｌ ｍｅｄｉｕｍで希釈し、細胞に加え、３７℃で、湿度９５％、ＣＯ2７％で一晩インキュベートした。トランスフェクションの翌日、各アプローチのインキュベーション容積を５ｍｌのＲＰＭＩ ａｌｌ ｍｅｄｉｕｍに増量した。インキュベーションの３日後に上清を採取した。
１７．ＭＣＳＰ及びＣＤ３種間特異的二重特異性抗体のフローサイトメトリー結合分析
それぞれヒト及びマカクザルＭＣＳＰ Ｄ３及びＣＤ３に結合する能力に関して種間特異的二重特異性抗体コンストラクトの機能性を試験するため、ＦＡＣＳ分析を実施した。この目的のため、ヒトＭＣＳＰ Ｄ３でトランスフェクトされたＣＨＯ細胞（実施例１４に記載のとおり）及びヒトＣＤ３陽性Ｔ細胞白血病細胞株ＨＰＢ−ＡＬＬ（ＤＳＭＺ、ブラウンシュヴァイク、ＡＣＣ４８３）を使用して、ヒト抗原への結合を試験した。マカクザル抗原への結合反応性は、生成したマカクザルＭＣＳＰ Ｄ３トランスフェクタント（実施例１５に記載のとおり）及びマカクザルＴ細胞株４１１９ＬｎＰｘ（Ｆｉｃｋｅｎｓｃｈｅｒ教授による提供に感謝、Ｈｙｇｉｅｎｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ， Ｖｉｒｏｌｏｇｙ， Ｅｒｌａｎｇｅｎ−Ｎｕｅｒｎｂｅｒｇ；Ｋｎａｐｐｅ Ａ， ｅｔ ａｌ．， ａｎｄ Ｆｉｃｋｅｎｓｃｈｅｒ Ｈ．，Ｂｌｏｏｄ ２０００，９５，３２５６−６１に発表）を使用して試験した。それぞれの細胞株の２０万の細胞を、種間特異的二重特異性抗体コンストラクト（２μｇ／ｍｌ）の精製タンパク質５０μｌ又は種間特異的二重特異性抗体コンストラクトを発現するトランスフェクトされた細胞の細胞培養上清とともに氷上で３０分間インキュベートした。細胞を、２％ＦＣＳを含むＰＢＳで２回洗浄し、コンストラクトの結合を、マウス抗Ｈｉｓ抗体（Ｐｅｎｔａ Ｈｉｓ抗体；Ｑｉａｇｅｎ，２％ＦＣＳを含む５０μｌＰＢＳで１：２０に希釈）により検出した。洗浄の後、結合した抗Ｈｉｓ抗体を、２％ＦＣＳを含むＰＢＳに１：１００で希釈された、フィコエリスリンに結合したＦｃガンマ特異性抗体（Ｄｉａｎｏｖａ）により検出した。トランスフェクトされていないＣＨＯ細胞の上清を、Ｔ細胞株への結合のネガティブコントロールとして使用した。無関係な標的特異性を持つ単鎖コンストラクトを、ＭＣＳＰ−Ｄ３にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞への結合のネガティブコントロールとして使用した。
フローサイトメトリーをＦＡＣＳ−Ｃａｌｉｂｕｒ装置で実施し、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェア（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ハイデルベルグ）を利用してデータを取得し分析した。ＦＡＣＳ染色及び蛍光強度の測定は、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ （Ｃｏｌｉｇａｎ， Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ， Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ， Ｓｈｅｖａｃｈ ａｎｄ Ｓｔｒｏｂｅｒ， Ｗｉｌｅｙ−ｌｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ， ２００２）に記載のとおり実施した。
ＭＣＳＰ Ｄ３に異種間特異的でヒト及びマカクザルＣＤ３に異種間特異的である、先に列記した単鎖分子の二重特異性結合は、図１４、１５及び１６に示されるとおり、明らかに検出可能であった。ＦＡＣＳ分析において、全コンストラクトが、それぞれのネガティブコントロールに比べ、ＣＤ３及びＭＣＳＰ−Ｄ３への結合を示した。ヒト及びマカクザルＣＤ３及びＭＣＳＰ Ｄ３抗原に対する二重特異性抗体の異種間特異性が示された。
１８．ＭＣＳＰ及びＣＤ３種間特異的二重特異性単鎖抗体の生理活性
図１７から２１に示されるとおり、生成した種間特異的二重特異性単鎖抗体コンストラクトの全ては、ヒトＣＤ８＋細胞により誘発されたヒトＭＳＣＰ陽性標的細胞及びマカクザルＴ細胞株４１１９ＬｎＰｘにより誘発されたカニクイザルＭＣＳＰ陽性標的細胞に対して、細胞障害活性を現した。異なる標的特異性を持つ二重特異性単鎖抗体をネガティブコントロールとして使用した。
１９．ＭＣＳＰ及びＣＤ３種間特異的二重特異性単鎖抗体の血漿安定性
二重特異性単鎖抗体を５０％ヒト血漿中で、３７℃及び４℃で２４時間インキュベートし、その後生理活性を試験して、生成された二重特異性単鎖抗体のヒト血漿中での安定性を分析した。生理活性は、ＭＣＳＰ陽性ＣＨＯ細胞株（実施例１４及び１５によりクローニング時にＭＣＳＰを発現）を標的として、刺激を受けたヒトＣＤ８陽性Ｔ細胞をエフェクター細胞として利用して、インビトロ細胞障害アッセイにおいてクロム５１（51Ｃｒ）の放出により分析した。
上述の分析プログラムにより計算されたＥＣ50値を、５０％ヒト血漿とともに２４時間それぞれ３７℃及び４℃でインキュベートされた二重特異性単鎖抗体と、血漿を添加していない二重特異性単鎖抗体又はアッセイの直前に同量の血漿と混合された二重特異性単鎖抗体との生理活性の比較に使用した。
図２２及び表３に示されるとおり、Ｇ４ Ｈ−Ｌ ｘ Ｉ２Ｃ Ｈ−Ｌ、Ｇ４ Ｈ−Ｌ ｘ Ｈ２Ｃ Ｈ−Ｌ及びＧ４ Ｈ−Ｌ ｘ Ｆ１２Ｑ Ｈ−Ｌ二重特異性抗体の生理活性は、血漿の添加されていないコントロール又は生理活性試験の直前に血漿を添加されたコントロールと比較して、著しく低下しなかった。
Figure 2014064568
２０．ヒトＥＧＦＲ及びＣＤ３種間特異的二重特異性単鎖分子の生成
ヒト及びカニクイザルＣＤ３に異種間特異的な結合ドメイン並びにヒトＥＧＦＲに異種間特異的な結合ドメインを持つ二重特異性単鎖抗体分子を、以下の表４に記載のとおり設計する。
Figure 2014064568
ヒト及びカニクイザルＥＧＦＲに異種間特異的な可変軽鎖（Ｌ）及び可変重鎖（Ｈ）ドメインを含む上述のコンストラクトを、遺伝子合成により得た。遺伝子合成断片は、まず、コンストラクトの真核細胞発現のためのコザック部位を含むように、次いで、１９アミノ酸免疫グロブリンリーダーペプチド、次いで、フレームを合わせて、それぞれの二重特異性単鎖抗体分子のコード配列、次いで、フレームを合わせて、６ヒスチジンタグのコード配列及び終止コドンを含むように、設計した。
遺伝子合成断片は、好適なＮ末端及びＣ末端制限部位を導入するようにも設計した。遺伝子合成断片は、これらの制限部位により、ｐＥＦ−ＤＨＦＲと呼ばれるプラスミド（ｐＥＦ−ＤＨＦＲは、Ｒａｕｍ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．， ５０（２００１） １４１−１５０に記載されている）中に、標準プロトコルに従い（Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ； Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （２００１））クローニングした。コンストラクトを、ＤＨＦＲ欠損ＣＨＯ細胞（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＲＬ ９０９６）に安定導入し、実施例１０に記載されるとおり、産生及び精製した。
２１．ヒトＥＧＦＲ及びＣＤ３種間特異的二重特異性単鎖分子の生成
ヒト及びカニクイザルＣＤ３に異種間特異的な結合ドメイン並びにヒトＥＧＦＲに異種間特異的な結合ドメインを持つ二重特異性単鎖抗体分子を、以下の表５に記載のとおり設計する。
Figure 2014064568
ヒト及びカニクイザルＥＧＦＲに異種間特異的な可変軽鎖（Ｌ）及び可変重鎖（Ｈ）ドメインを含む上述のコンストラクトを、遺伝子合成により得た。遺伝子合成断片は、まず、コンストラクトの真核細胞発現のためのコザック部位を含むように、次いで、１９アミノ酸免疫グロブリンリーダーペプチド、ついで、フレームを合わせて、それぞれの二重特異性単鎖抗体分子のコード配列、次いで、フレームを合わせて、６ヒスチジンタグのコード配列及び終止コドンを含むように設計した。
遺伝子合成断片を、好適なＮ末端及びＣ末端制限部位を導入するようにも設計した。遺伝子合成断片は、これらの制限部位により、ｐＥＦ−ＤＨＦＲと呼ばれるプラスミド（ｐＥＦ−ＤＨＦＲは、Ｒａｕｍ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．， ５０（２００１） １４１−１５０に記載されている）中に、標準プロトコルに従い（Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ； Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （２００１））クローニングした。コンストラクトを、ＤＨＦＲ欠損ＣＨＯ細胞（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＲＬ ９０９６）に安定導入し、実施例１０に記載されるとおり、産生及び精製した。
２２．ヒトＨｅｒ２／ｎｅｕ及びＣＤ３種間特異的二重特異性単鎖分子の生成
ヒト及びカニクイザルＣＤ３に異種間特異的な結合ドメイン並びにヒトＨｅｒ２／ｎｅｕに異種間特異的な結合ドメインを持つ二重特異性単鎖抗体分子を、以下の表６に記載のとおり設計する。
Figure 2014064568
ヒト及びカニクイザルＨＥＲ２／ｎｅｕに異種間特異的な可変軽鎖（Ｌ）及び可変重鎖（Ｈ）ドメインを含む上述のコンストラクトを、遺伝子合成により得た。遺伝子合成断片を、まず、コンストラクトの真核細胞発現のためのコザック部位を含むように、次いで、１９アミノ酸免疫グロブリンリーダーペプチドを、次いで、フレームを合わせて、それぞれの二重特異性単鎖抗体分子のコード配列、次いで、フレームを合わせて、６ヒスチジンタグのコード配列及び終止コドンを含むように設計した。
遺伝子合成断片を、好適なＮ末端及びＣ末端制限部位を導入するようにも設計した。遺伝子合成断片は、これらの制限部位により、ｐＥＦ−ＤＨＦＲと呼ばれるプラスミド（ｐＥＦ−ＤＨＦＲは、Ｒａｕｍ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．， ５０（２００１） １４１−１５０に記載されている）中に、標準プロトコルに従い（Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ； Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （２００１））クローニングした。コンストラクトを、ＤＨＦＲ欠損ＣＨＯ細胞（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＲＬ ９０９６）に安定導入し、実施例１０に記載されるとおり、産生及び精製した。
２３．１ ヒトＨＥＲ２を発現するＣＨＯ細胞の生成
ＧｅｎＢａｎｋ（アクセッション番号Ｘ０３３６３）に発表されているヒトＨＥＲ２のコード配列を、標準プロトコルに従い遺伝子合成により得る。遺伝子合成断片は、そのリーダーペプチドを含むヒトＨＥＲ２タンパク質のコード配列を含むように設計する（コンストラクトのｃＤＮＡ及びアミノ酸配列を、配列番号４５９及び４６０に記す）。遺伝子合成断片は、断片の最初と最後に制限部位を導入するようにも設計される。導入される制限部位、５'末端でのＸｂａｌ及び３'末端でのＳａｌｌを以下のクローニング手段に利用する。遺伝子合成断片は、Ｘｂａｌ及びＳａｌｌにより、ｐＥＦ−ＤＨＦＲと呼ばれるプラスミド（ｐＥＦ−ＤＨＦＲは、Ｒａｕｍ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．， ５０（２００１） １４１−１５０に記載されている）中に、標準プロトコルに従いクローニングする。上述の手順は、標準プロトコルに従い実施する（Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ； Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （２００１））。配列実証済みヌクレオチド配列を有するクローンを、コンストラクトの真核細胞発現のためにＤＨＦＲ欠損ＣＨＯ細胞中にトランスフェクトする。ＤＨＦＲ欠損ＣＨＯ細胞での真核細胞タンパク質発現は、Ｋａｕｆｍａｎｎ Ｒ．Ｊ． （１９９０） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １８５， ５３７−５６６に記載されるとおり実施する。コンストラクトの遺伝子増幅は、メトトレキサート（ＭＴＸ）の濃度を２０ｎＭ ＭＴＸまでの最終濃度に上昇させることにより誘導する。
２３．２ マカクザルＨｅｒ２の細胞外ドメインを発現するＣＨＯ細胞の生成
上述のヒトＨｅｒ２のコード配列を、ＧｅｎＢａｎｋ（アクセション番号ＸＰ＿００１０９０４３０）に発表されるマカクザルＨｅｒ２タンパク質のアミノ酸１２３から１０３８をコードするように修飾する。このキメラタンパク質のコード配列を、標準プロトコルに従い、遺伝子合成により得る（コンストラクトのｃＤＮＡ及びアミノ酸配列を、配列番号４６１及び４６２に記す）。遺伝子合成断片は、コンストラクトの真核細胞発現のためのコザック部位及び断片の最初と最後に制限部位を含むように設計する。導入される制限部位、５'末端でのＸｂａｌ及び３'末端でのＳａｌｌを以下のクローニング手順で利用する。次いで、遺伝子合成断片を、Ｘｂａｌ及びＳａｌｌにより、ｐＥＦ−ＤＨＦＲと呼ばれるプラスミド（ｐＥＦ−ＤＨＦＲは、Ｒａｕｍ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．， ５０（２００１） １４１−１５０に記載されている）中にクローニングする。このプラスミドの配列実証済みクローンを使用して、上述のとおりＣＨＯ／ｄｈｆｒ−細胞にトランスフェクトする。
２３．３ ＨＥＲ２及びＣＤ３種間特異的二重特異性単鎖分子の生成
３．１ 異種間特異性結合分子のクローニング
一般的に、ヒト及びマカクザルのＣＤ３イプシロンに異種間特異的な結合特異性を持つドメイン並びにヒト及びマカクザルＨＥＲ２に異種間特異的な結合特異性を持つドメインをそれぞれ含む、二重特異性単鎖抗体分子を、以下の表７に記載の通り設計する。
Figure 2014064568
ヒト及びマカクザルＨＥＲ２に異種間特異的な可変軽鎖（Ｌ）及び可変重鎖（Ｈ）ドメイン並びにヒト及びマカクザルＣＤ３に異種間特異的なＣＤ３特異的ＶＨ及びＶＬ組み合わせを含む上述のコンストラクトを、遺伝子合成により得る。遺伝子合成断片を、まず、コンストラクトの真核細胞発現のためのコザック部位を含むように、次いで、１９アミノ酸免疫グロブリンリーダーペプチド、次いで、フレームを合わせて、それぞれの二重特異性単鎖抗体分子のコード配列、次いで、フレームを合わせて、６ヒスチジンタグのコード配列及び終止コドンを含むように設計する。遺伝子合成断片を、断片の最初と最後に好適な制限部位を導入するようにも設計する。導入される制限部位を以下のクローニング手順に使用する。遺伝子合成断片は、ｐＥＦＤＨＦＲと呼ばれるプラスミド（ｐＥＦＤＨＦＲは、Ｒａｕｍ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．， ５０（２００１） １４１−１５０に記載されている）中に、標準プロトコルに従いクローニングする。上述の手順は、標準プロトコルに従い実施する（Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ； Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （２００１））。配列実証済みヌクレオチド配列を有するクローンを、コンストラクトの真核細胞発現のためにＤＨＦＲ欠損ＣＨＯ細胞中にトランスフェクトする。ＤＨＦＲ欠損ＣＨＯ細胞中の真核細胞タンパク質発現は、Ｋａｕｆｍａｎｎ Ｒ．Ｊ． （１９９０） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １８５， ５３７−５６６に記載されるとおり実施する。コンストラクトの遺伝子増幅は、メトトレキサート（ＭＴＸ）の濃度を２０ｎＭ ＭＴＸまでの最終濃度に上昇させることにより誘導する。
３．２ 二重特異性単鎖抗体分子の発現及び精製
二重特異性単鎖抗体分子は、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）中に発現する。ＤＨＦＲ欠損ＣＨＯ細胞中の真核細胞タンパク質発現は、Ｋａｕｆｍａｎｎ Ｒ．Ｊ． （１９９０） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １８５， ５３７−５６６に記載されるとおり実施する。コンストラクトの遺伝子増幅は、ＭＴＸの濃度を２０ｎＭ ＭＴＸまでの最終濃度に上昇させることにより誘導する。静置培養の２回の継代後、細胞を、ヌクレオシドを含まないＨｙＱ ＰＨ ＣＨＯ液体大豆培地により（４．０ｍＭのＬ−グルタミン及び０．１％のプルロニックＦ−６８、ＨｙＣｌｏｎｅを含む）回転瓶中で７日間生育してから、採取する。細胞を遠心分離により除去し、発現したタンパク質を含む上清を−８０℃で保存する。トランスフェクションは、製造業者のプロトコルに従い、２９３ｆｅｃｔｉｎ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１２３４７−０１９番）により実施する。
Ａｋｔａ（登録商標） Ｅｘｐｌｏｒｅｒ Ｓｙｓｔｅｍ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｙｓｔｅｍｓ）及びＵｎｉｃｏｒｎ（登録商標）Ｓｏｆｔｗａｒｅをクロマトグラフィに使用する。製造業者が提供するプロトコルに従い、ＺｎＣｌ2を充填したＦｒａｃｔｏｇｅｌ ＥＭＤキレート（登録商標）（Ｍｅｒｃｋ）を使用して、固定化金属イオンアフィニティクロマトグラフィ（「ＩＭＡＣ」）を実施する。バッファＡ（２０ｍＭリン酸ナトリウムバッファ、ｐＨ ７．２、０．１Ｍ ＮａＣｌ）によりカラムを平衡化し、細胞培養上清（５００ｍｌ）を、３ｍｌ／分の流速で、カラム（１０ｍｌ）に注ぐ。カラムをバッファＡで洗浄して結合してないサンプルを除く。結合したタンパク質を、バッファＢ（２０ｍＭリン酸ナトリウムバッファ、ｐＨ ７．２、０．１Ｍ ＮａＣｌ、０．５Ｍ イミダゾール）の２段階勾配を利用して、以下のとおり溶離する：
工程１：６カラム容積の２０％バッファＢ
工程２：６カラム容積の１００％バッファＢ
工程２から溶離したタンパク質分画を、さらなる精製のために貯蔵した。全ての試薬は、研究用グレードであり、Ｓｉｇｍａ（ダイゼンホーフェン）又はＭｅｒｃｋ（ダルムシュタット）から購入する。
Ｅｑｕｉ−ｂｕｆｆｅｒ（２５ｍＭ シトレート、２００ｍＭ リジン、５％グリセロール、ｐＨ ７．２）により平衡化したＨｉＬｏａｄ１６／６０Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００分取用カラム（ＧＥ／Ａｍｅｒｓｈａｍ）で、ゲル濾過クロマトグラフィを実施する。溶離したタンパク質サンプル（流速１ｍｌ／分）を、検出のため、標準的なＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタンブロットにかける。精製の前に、分子量測定のために（分子量マーカーキット、Ｓｉｇｍａ、ＭＷ ＧＦ−２００）カラムを平衡化する。タンパク質濃度は、ＯＤ２８０ｎｍを利用して測定する。
精製した二重特異性単鎖抗体タンパク質を、プレキャスト４−１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により実施した還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析する。サンプル調製及び適用は、製造業者が提供するプロトコルに従って実施する。分子量は、ＭｕｌｔｉＭａｒｋタンパク質標準物質（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により測定する。ゲルを、コロイド状クーマシー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎプロトコル）により染色する。単離したタンパク質の純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定して９５％を超える。
天然条件下でＰＢＳ中のゲル濾過により測定して、二重特異性単鎖抗体分子の分子量は約５２ｋＤａである。コンストラクトは全てこの方法により精製する。
ウェスタンブロットは、Ｏｐｔｉｔｒａｎ（登録商標）ＢＡ−Ｓ８３メンブレン及びＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｂｌｏｔ Ｍｏｄｕｌｅを利用して、製造業者が提供するプロトコルにより実施する。二重特異性単鎖抗体タンパク質抗体の検出のため、抗Ｈｉｓ Ｔａｇ抗体を使用する（Ｐｅｎｔ Ｈｉｓ、Ｑｉａｇｅｎ）。アルカリホスファターゼ（ＡＰ）標識ヤギ抗マウスＩｇ抗体（Ｓｉｇｍａ）を二次抗体として、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ（Ｓｉｇｍａ）を基質として作用する。精製した二重特異性単鎖抗体に相当する５２ｋＤでシングルバンドを検出する。
２３．４ ＨＥＲ２及びＣＤ３種間特異的二重特異性抗体のフローサイトメトリー結合分析
それぞれヒト及びマカクザルＨＥＲ２及びＣＤ３に結合する能力に関して種間特異的二重特異性抗体コンストラクトの機能性を試験するため、ＦＡＣＳ分析を実施する。この目的のため、実施例２３．１に記載されるヒトＨＥＲ２にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞及びヒトＣＤ３陽性Ｔ細胞白血病細胞株ＨＰＢ−ＡＬＬ（ＤＳＭＺ、ブラウンシュヴァイク、ＡＣＣ４８３）を使用して、ヒト抗原への結合を試験する。マカクザル抗原への結合反応性は、実施例２３．２に記載される生成したマカクザルＨＥＲ２トランスフェクタント及びマカクザルＴ細胞株４１１９ＬｎＰｘ（Ｆｉｃｋｅｎｓｃｈｅｒ教授による提供に感謝、Ｈｙｇｉｅｎｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ， Ｖｉｒｏｌｏｇｙ， Ｅｒｌａｎｇｅｎ−Ｎｕｅｒｎｂｅｒｇ；Ｋｎａｐｐｅ Ａ， ｅｔ ａｌ．， ａｎｄ Ｆｉｃｋｅｎｓｃｈｅｒ Ｈ．，Ｂｌｏｏｄ ２０００，９５，３２５６−６１に発表）を使用して試験する。それぞれの細胞株の２０万の細胞を、種間特異的二重特異性抗体コンストラクト（２μｇ／ｍｌ）の精製タンパク質５０μｌとともに氷上で３０分間インキュベートする。細胞を、２％ＦＣＳを含むＰＢＳで２回洗浄し、コンストラクトの結合を、マウス抗Ｈｉｓ抗体（Ｐｅｎｔａ Ｈｉｓ抗体；Ｑｉａｇｅｎ，２％ＦＣＳを含む５０μｌＰＢＳで１：２０に希釈）により検出する。洗浄の後、結合した抗Ｈｉｓ抗体を、２％ＦＣＳを含むＰＢＳに１：１００で希釈された、フィコエリスリンに結合したＦｃガンマ特異性抗体（Ｄｉａｎｏｖａ）により検出する。２％ＦＣＳを含むＰＢＳを、Ｔ細胞株への、並びにＨＥＲ２にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞への結合のネガティブコントロールとして使用する。
フローサイトメトリーをＦＡＣＳ−Ｃａｌｉｂｕｒ装置で実施し、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェア（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ハイデルベルグ）を利用してデータを取得し分析する。ＦＡＣＳ染色及び蛍光強度の測定は、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ （Ｃｏｌｉｇａｎ， Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ， Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ， Ｓｈｅｖａｃｈ ａｎｄ Ｓｔｒｏｂｅｒ， Ｗｉｌｅｙ−ｌｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ， ２００２）に記載のとおり実施する。
ＨＥＲ２に異種間特異的でヒト及び非チンパンジー霊長類ＣＤ３に異種間特異的である、先に列記した単鎖分子の二重特異性結合は、図２３に示されるとおり、明らかに検出可能である。ＦＡＣＳ分析において、全コンストラクトが、それぞれのネガティブコントロールに比べ、ＣＤ３及びＨＥＲ２への結合を示す。ヒト及びマカクザルＣＤ３及びＨＥＲ２抗原に対する二重特異性抗体の異種間特異性が示される。
２３．５ ＨＥＲ２及びＣＤ３種間特異的二重特異性単鎖抗体の生理活性
生成した二重特異性単鎖抗体の生理活性を、実施例２３．１及び２３．２に記載されたＨＥＲ２陽性細胞株を利用して、インビトロ細胞障害アッセイにおいてクロム５１（51Ｃｒ）の放出により分析する。エフェクター細胞として、刺激を受けたヒトＣＤ４／ＣＤ５６除去ＰＢＭＣ又はマカクザルＴ細胞株４１１９ＬｎＰｘを、それぞれの図に示されるとおり使用する。
刺激を受けたＣＤ４／ＣＤ５６除去ＰＢＭＣの生成は以下のとおり実施する：
ペトリ皿（直径８５ｍｍ、Ｎｕｎｃ）を、市販の抗ＣＤ３特異性抗体（例えばＯＫＴ３、Ｏｔｈｏｃｌｏｎｅ）により、最終濃度１μｇ／ｍｌで１時間３７℃でプレコートする。未結合のタンパク質を、ＰＢＳでの１洗浄工程で除去する。新鮮なＰＢＭＣを、標準プロトコルに従い、Ｆｉｃｏｌｌ勾配遠心分離により末梢血（３０〜５０ｍｌ、ヒトの血液）から単離する。３〜５×１０7ＰＢＭＣを、プレコートされたペトリ皿に、安定化グルタミン／１０％ ＦＣＳ／ＩＬ−２ ２０Ｕ／ｍｌ（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ、Ｃｈｉｒｏｎ）を含む５０ｍｌのＲＰＭＩ １６４０に加え、２日間刺激する。３日目に、細胞を回収し、ＲＰＭＩ １６４０で１回洗浄する。ＩＬ−２を２０ Ｕ／ｍｌの最終濃度で加え、細胞を、上述のものと同じ細胞培地で１日間再び培養した。標準プロトコルによるＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ５６＋ＮＫ細胞の除去により、ＣＤ８＋細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を富化する。
標的細胞をＰＢＳで２回洗浄し、５０％ＦＣＳを含む１００μｌのＲＰＭＩの最終体積で、３７℃で４５分間、１１．１ＭＢｑ51Ｃｒで標識する。次いで、標識した標的細胞を、５ｍｌのＲＰＭＩで３回洗浄し、次いで、細胞障害アッセイに使用する。アッセイは、それぞれの図中に示す１：１又は１０：１のＥ：Ｔ比で、補われたＲＰＭＩ（上述）最終体積２５０μｌで９６ウェルプレート中で実施する。１μｇ／ｍｌの種間特異的二重特異性単鎖抗体分子及びその１５〜２１倍希釈体を利用する。アッセイ時間は１８時間であり、細胞障害性は、最大溶解（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘの添加）と自然溶解（エフェクター細胞なし）の差に関連する上清中の放出クロムの相対値として測定する。測定は全て４連で実施する。上清中のクロム活性の測定を、Ｗｉｚａｒｄ ３"ガンマカウンター（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ＧｍｂＨ、ケルン、ドイツ）で実施する。実験データの分析は、Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）用Ｐｒｉｓｍ ４（バージョン４．０２、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ．、サンディエゴ、カリフォルニア州、米国）で実施する。Ｓ字状の用量応答曲線のＲ2値は、前記ソフトウェアにより測定して、通常０．９０を超える。分析プログラムにより計算されたＥＣ50値を、生理活性の比較に使用する。
図２４に示されるように、種間特異的二重特異性単鎖抗体コンストラクトは、刺激されたヒトＣＤ４／ＣＤ５６除去ＰＢＭＣにより誘発されたヒトＨＥＲ２陽性標的細胞及びマカクザルＴ細胞株４１１９ＬｎＰｘにより誘発されたマカクザルＨＥＲ２陽性標的細胞に対して、細胞障害活性を現す。
実施例２４ ヒト及びマカクザルの膜結合形態のＩｇＥのクローニング及び発現
マウス細胞株Ｊ５８８Ｌ（Ｉｎｔｅｒｌａｂ Ｐｒｏｊｅｃｔ、ｌｓｔｉｔｕｔｏ Ｎａｚｉｏｎａｌｅ ｐｅｒ Ｉａ Ｒｉｃｅｒｃａ ｓｕｌ Ｃａｎｃｒｏ、ジェノバ、イタリア、ＥＣＡＣＣ ８８０３２９０２）、ラムダ軽鎖を産生し分泌する、自然重鎖欠損バリアントミエローマ細胞株を使用して、それぞれヒト及びマカクザルＩｇＥの膜結合型重鎖バリアントにより補わせた。そのようなコンストラクトを生成するために、標準プロトコルに従い、合成分子を遺伝子合成により得た（コンストラクトのヌクレオチド配列を、配列番号５０７及び５０８に記す）。これらのコンストラクトにおいて、ヒト及びマカクザルｃイプシロン鎖のコード配列を、それぞれ、ＩｇＥのヒト膜貫通領域に融合した。ＶＨ鎖の組み込まれた特異性は、ハプテン（４−ヒドロキシ−３−ニトロ−フェニル）アセチル）（ＮＰ）に向けられる。遺伝子合成断片は、コンストラクトの真核細胞発現のためのコザック部位並びに免疫グロブリンリーダー及びＤＮＡの最初と最後に制限部位を含むようにも設計した。導入された制限部位、５'末端でのＥｃｏＲＩ及び３'末端でのＳａｌｌを、ｐＥＦＤＨＦＲと呼ばれる発現プラスミド中へのクローニング工程の間に利用した。配列実証（マカクザル：ＸＭ＿００１１１６７３４ マカカ・マラッタ（ｍａｃａｃａ ｍｕｌａｔｔａ）、ＩｇイプシロンＣ領域、ｍＲＮＡ；ヒト：ＮＣ＿００００１４ ホモサピエンス、染色体１４、完全配列、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ， ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｅｎｔｒｅｚ）の後、プラスミドを使用して、上述のとおりＣＨＯ／ｄｈｆｒ−細胞にトランスフェクトした。ＤＨＦＲ欠損ＣＨＯ細胞中での真核細胞タンパク質発現は、Ｋａｕｆｍａｎｎ ＲＪ． （１９９０） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １８５， ５３７− ５６６に記載されるとおり実施される。コンストラクトの遺伝子増幅は、メトトレキサート（ＭＴＸ）の濃度を２０ｎＭ ＭＴＸまでの最終濃度に上昇させることにより誘導する。
実施例２５ ＩｇＥ及びＣＤ３種間特異的二重特異性単鎖分子の生成
一般的に、ヒト及びカニクイザルＣＤ３抗原への結合特異性を持つドメイン並びにヒト及びマカクザルＩｇＥ抗原への結合特異性を持つドメインをそれぞれ含む二重特異性単鎖抗体分子は、以下の表８に記載されるとおり設計した。
Figure 2014064568
ヒト及びマカクザルＩｇＥに異種間特異的である可変軽鎖（Ｌ）及び可変重鎖（Ｈ）ドメイン並びにヒト及びマカクザルＣＤ３に異種間特異的であるＣＤ３特異性ＶＨ及びＶＬ組み合わせを含む上述のコンストラクトを、遺伝子合成により得る。遺伝子合成断片を、まず、コンストラクトの真核細胞発現のためのコザック部位を含むように、次いで、１９アミノ酸免疫グロブリンリーダーペプチド、次いで、フレームを合わせて、それぞれの二重特異性単鎖抗体分子のコード配列、次いで、フレームを合わせて、６ヒスチジンタグのコード配列及び終止コドンを含むように設計する。遺伝子合成断片は、断片の最初と最後に好適な制限部位を導入するようにも設計される。導入される制限部位を以下のクローニング手順で利用する。遺伝子合成断片を、これらの制限部位により、ｐＥＦＤＨＦＲと呼ばれるプラスミド中に、標準プロトコルに従いクローニングする。配列実証済みヌクレオチド配列を持つクローンを、ＤＨＦＲ欠損ＣＨＯ細胞中に、コンストラクトの真核細胞発現のためにトランスフェクトする。ＤＨＥＦ欠損ＣＨＯ細胞中の真核細胞タンパク質発現は、Ｋａｕｆｍａｎｎ Ｒ．Ｊ． （１９９０） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １８５， ５３７−５６６に記載されるとおり実施する。コンストラクトの遺伝子増幅は．メトトレキサート（ＭＴＸ）の濃度を２０ｎＭ ＭＴＸまでの最終濃度に上昇させることにより誘導する。或いは、コンストラクトを、標準プロトコルに従い、一過的にＤＨＦＲ欠損ＣＨＯ細胞中にトランスフェクトする。
ＦＡＣＳ結合実験を、ヒトＩｇＥにトランスフェクトされたＪ５５８Ｌ細胞株に実施し、ヒトＩｇＥへの結合能を評価した。マカクザルＩｇＥ陽性細胞への異種間特異性は、マカクザルＩｇＥにトランスフェクトされたＪ５５８Ｌ細胞を展開して試験した。細胞株での同じ変化が、ＩｇＥ及びＣＤ３種間特異的二重特異性単鎖抗体で実施した細胞障害アッセイに当てはまる。これとは別に、実施例４及び５に記載されたとおり、アッセイを実施した。
図２３に示されるとおり、生成したＩｇＥ及びＣＤ３種間特異的二重特異性単鎖抗体は、ヒト及びカニクイザルの抗原両方への結合を示し、完全に異種間特異性であることが証明された。
図２４に示されるとおり、生成した種間特異的二重特異性単鎖抗体コンストラクトの全てが、ヒトＣＤ８＋細胞に誘発されるヒトＩｇＥ陽性標的細胞及びマカクザルＴ細胞株４１１９ＬｎＰｘにより誘発されるマカクザルＩｇＥ陽性標的細胞に対して細胞障害活性を現した。ネガティブコントロールとして、無関係な二重特異性単鎖抗体を使用した。
実施例２６ ヒトＣＤ３イプシロンのＮ末端へのｓｃＦｖクローンの特性結合
２６．１ 大腸菌ＸＬ１ Ｂｌｕｅ中でのｓｃＦｖコンストラクトの細菌発現
先に述べたとおり、ＶＬ及びＶＨセグメントを含むｐＣｏｍｂ３Ｈ５Ｂｈｉｓ／Ｆｌａｇでトランスフェクトされた大腸菌ＸＬ１ Ｂｌｕｅは、遺伝子ＩＩＩ断片の切除及び１ｍＭ ＩＰＴＧによる誘起の後、可溶性ｓｃＦｖを十分な量で産生する。ｓｃＦｖ鎖は、ペリプラズムにエクスポートされ、機能的コンフォメーションに折り畳まれる。
以下のｓｃＦｖクローンをこの実験のために選択した：
ｉ）国際公開第２００４／１０６３８０号に記載のＳｃＦｖ４−１０、３−１０６、３−１１４、３−１４８、４−４８、３−１９０及び３−２７１
ｉｉ）本願に記載されたヒト抗ＣＤ３イプシロン結合クローンＨ２Ｃ、Ｆ１２Ｑ及びＩ２Ｃ由来のｓｃＦｖ。
ペリプラズム調製物のため、ペリプラズム発現を可能にするプラスミドを含むそれぞれのｓｃＦｖで形質転換された細菌細胞を、２０ｍＭ ＭｇＣｌ2及びカルベニシリン５０μｇ／ｍｌを補ったＳＢ培地中で生育し、採取の後ＰＢＳに再溶解した。−７０℃での冷凍及び３７℃での解凍を４回行い、浸透圧衝撃により細菌の外膜を破壊し、ｓｃＦｖを含む可溶性ペリプラズムタンパク質を上清中に放出させた。無傷の細胞及び細胞片を遠心分離で除去した後、ヒト抗ヒトＣＤ３−ｓｃＦｖを含む上清を回収し、さらなる実験に使用した。ｓｃＦｖを含むこれらの粗上清を、さらにペリプラズム調製物（ＰＰＰ）と呼ぶ。
２６．２ ヒトＣＤ３イプシロン（ａａ１−２７）Ｆｃ融合タンパク質へのｓｃＦｖの結合
ヒトＣＤ３イプシロン（ａａ１−２７）Ｆｃ融合タンパク質を、典型的には４℃で一晩、９６ウェルプラスティックプレート（Ｎｕｎｃ、ｍａｘｉｓｏｒｂ）のウェルにコーティングすることにより、ＥＬＩＳＡ実験を実施した。次いで、抗原コーティング溶液を除去し、ウェルをＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０により１回洗浄し、次いで少なくとも１時間ＰＢＳ／３％ＢＳＡによりブロックした。ブロッキング溶液の除去後、ＰＰＰ及びコントロール溶液をウェルに加え、典型的には１時間室温でインキュベートした。次いで、ウェルを、ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で３回洗浄した。固定化抗原に結合したｓｃＦｖの検出は、ビオチン標識抗Ｆｌａｇタグ抗体（Ｍ２抗Ｆｌａｇ−Ｂｉｏ、Ｓｉｇｍａ、典型的には１μｇ／ｍｌＰＢＳの最終濃度で）を利用して実施し、ペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジン（Ｄｉａｎｏｖａ、１μｇ／ｍｌＰＢＳ）により検出した。ＡＢＴＳ基質溶液を加えてシグナルを発生させ、波長４０５ｎｍで検出した。試験サンプルのブロッキング剤及び／又はヒトＣＤ３イプシロン（ａａ１−２７）Ｆｃ融合タンパク質のヒトＩｇＧ１部分への非特異的な結合を、ヒトＩｇＧ１（Ｓｉｇｍａ）によりコーティングされたＥＬＩＳＡプレート上の同一試薬及び同一タイミングを利用する同一なアッセイの実施により検討した。ネガティブコントロールとしてＰＢＳを使用した。
図２５に示されるとおり、ｓｃＦｖ Ｈ２Ｃ、Ｆ１２Ｑ及びＩ２Ｃは、ヒトＣＤ３イプシロン（ａａ１−２７）Ｆｃ融合タンパク質に強い結合シグナルを示す。ヒトｓｃＦｖ ３−１０６、３−１１４、３−１４８、３−１９０、３−２７１、４−１０及び４−４８（国際公開第２００４／１０６３８０号に記載）は、ネガティブコントロールレベルを超える有意な結合を示さない。
ｓｃＦＶ Ｈ２Ｃ、Ｆ１２Ｑ及びＩ２Ｃの、ヒトＣＤ３イプシロン（ａａ１−２７）Ｆｃ融合タンパク質をコーティングされたウェルの陽性の結合が、ＢＳＡ（ブロッキング剤として使用）及び／又はヒトＣＤ３イプシロン（ａａ１−２７）Ｆｃ融合タンパク質のヒトＩｇＧ１ Ｆｃガンマ部分への結合によるものかもしれないという可能性を排除するため、第２のＥＬＩＳＡ実験を同時に行った。この第２のＥＬＩＳＡ実験では、ヒトＣＤ３イプシロン（ａａ１−２７）Ｆｃ融合タンパク質の代わりにヒトＩｇＧ１（Ｓｉｇｍａ）をコーティングした以外、全パラメータを第１のＥＬＩＳＡ実験と同じにした。図２６に示されるとおり、試験したｓｃＦｖで、バックグラウンドレベルを超えてＢＳＡ及び／又はヒトＩｇＧ１と有意な結合を示したものはない。
まとめると、これらの結果により、ｓｃＦｖ ４−１０、３−２７１、３−１４８、３−１９０、４−４８、３−１０６及び３−１１４はヒトＣＤ３イプシロン（ａａ１−２７）領域に特異的に結合せず、ｓｃＦｖ Ｈ２Ｃ、Ｆ１２Ｑ及びＩ２Ｃは、ヒトＣＤ３イプシロンのＮ末端２７アミン酸への特異的な結合をはっきりと示すという結論が認められる。
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Claims (35)

  1. ヒト及び非チンパンジー霊長類ＣＤ３ε（イプシロン）鎖のエピトープに結合可能な第１結合ドメイン並びにヒト及び／又は非チンパンジー霊長類のＥＧＦＲ、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ又はＩｇＥに結合可能な第２結合ドメインを含むポリペプチドであって、前記エピトープが、配列番号２、４、６又は８からなる群に含まれるアミノ酸配列の一部であるポリペプチド。
  2. ヒト及び非チンパンジー霊長類ＣＤ３ε（イプシロン）鎖のエピトープに結合可能な前記第１結合ドメインが、ヒト起源である、請求項１に記載のポリペプチド。
  3. ヒト及び非チンパンジー霊長類ＣＤ３ε鎖のエピトープに結合可能な前記第１結合ドメインが、
    （ａ）配列番号２７に記載のＣＤＲ−Ｌ１、配列番号２８に記載のＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号２９に記載のＣＤＲ−Ｌ３；
    （ｂ）配列番号１１７に記載のＣＤＲ−Ｌ１、配列番号１１８に記載のＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号１１９に記載のＣＤＲ−Ｌ３；及び
    （ｃ）配列番号１５３に記載のＣＤＲ−Ｌ１、配列番号１５４に記載のＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号１５５に記載のＣＤＲ−Ｌ３；
    から選択される、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２及びＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬ領域を含む、請求項１又は２のいずれかに記載のポリペプチド。
  4. ヒト及び非チンパンジー霊長類ＣＤ３ε鎖のエピトープに結合可能な前記第１結合ドメインが、
    （ａ）配列番号１２に記載のＣＤＲ−Ｈ１、配列番号１３に記載のＣＤＲ−Ｈ２及び配列番号１４に記載のＣＤＲ−Ｈ３；
    （ｂ）配列番号３０に記載のＣＤＲ−Ｈ１、配列番号３１に記載のＣＤＲ−Ｈ２及び配列番号３２に記載のＣＤＲ−Ｈ３；
    （ｃ）配列番号４８に記載のＣＤＲ−Ｈ１、配列番号４９に記載のＣＤＲ−Ｈ２及び配列番号５０に記載のＣＤＲ−Ｈ３；
    （ｄ）配列番号６６に記載のＣＤＲ−Ｈ１、配列番号６７に記載のＣＤＲ−Ｈ２及び配列番号６８に記載のＣＤＲ−Ｈ３；
    （ｅ）配列番号８４に記載のＣＤＲ−Ｈ１、配列番号８５に記載のＣＤＲ−Ｈ２及び配列番号８６に記載のＣＤＲ−Ｈ３；
    （ｆ）配列番号１０２に記載のＣＤＲ−Ｈ１、配列番号１０３に記載のＣＤＲ−Ｈ２及び配列番号１０４に記載のＣＤＲ−Ｈ３；
    （ｇ）配列番号１２０に記載のＣＤＲ−Ｈ１、配列番号１２１に記載のＣＤＲ−Ｈ２及び配列番号１２２に記載のＣＤＲ−Ｈ３；
    （ｈ）配列番号１３８に記載のＣＤＲ−Ｈ１、配列番号１３９に記載のＣＤＲ−Ｈ２及び配列番号１４０に記載のＣＤＲ−Ｈ３；
    （ｉ）配列番号１５６に記載のＣＤＲ−Ｈ１、配列番号１５７に記載のＣＤＲ−Ｈ２及び配列番号１５８に記載のＣＤＲ−Ｈ３；及び
    （ｊ）配列番号１７４に記載のＣＤＲ−Ｈ１、配列番号１７５に記載のＣＤＲ−Ｈ２及び配列番号１７６に記載のＣＤＲ−Ｈ３；
    から選択される、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２及びＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨ領域を含む、請求項１又は２のいずれかに記載のポリペプチド。
  5. ヒト及び非チンパンジー霊長類ＣＤ３ε鎖のエピトープに結合可能な前記第１結合ドメインが、配列番号３５、３９、１２５、１２９、１６１又は１６５に記載のＶＬ領域からなる群から選択されるＶＬ領域を含む、請求項１から３のいずれかに記載のポリペプチド。
  6. ヒト及び非チンパンジー霊長類ＣＤ３ε鎖のエピトープに結合可能な前記第１結合ドメインが、配列番号１５、１９、３３、３７、５１、５５、６９、７３、８７、９１、１０５、１０９、１２３、１２７、１４１、１４５、１５９、１６３、１７７又は１８１に記載のＶＨ領域からなる群から選択されるＶＨ領域を含む、請求項１又は２及び４のいずれかに記載のポリペプチド。
  7. ヒト及び非チンパンジー霊長類ＣＤ３ε鎖のエピトープに結合可能な前記第１結合ドメインが、
    （ａ）配列番号１７又は２１に記載のＶＬ領域及び配列番号１５又は１９に記載のＶＨ領域；
    （ｂ）配列番号３５又は３９に記載のＶＬ領域及び配列番号３３又は３７に記載のＶＨ領域；
    （ｃ）配列番号５３又は５７に記載のＶＬ領域及び配列番号５１又は５５に記載のＶＨ領域；
    （ｄ）配列番号７１又は７５に記載のＶＬ領域及び配列番号６９又は７３に記載のＶＨ領域；
    （ｅ）配列番号８９又は９３に記載のＶＬ領域及び配列番号８７又は９１に記載のＶＨ領域；
    （ｆ）配列番号１０７又は１１１に記載のＶＬ領域及び配列番号１０５又は１０９に記載のＶＨ領域；
    （ｇ）配列番号１２５又は１２９に記載のＶＬ領域及び配列番号１２３又は１２７に記載のＶＨ領域；
    （ｈ）配列番号１４３又は１４７に記載のＶＬ領域及び配列番号１４１又は１４５に記載のＶＨ領域；
    （ｉ）配列番号１６１又は１６５に記載のＶＬ領域及び配列番号１５９又は１６３に記載のＶＨ領域；及び
    （ｊ）配列番号１７９又は１８３に記載のＶＬ領域及び配列番号１７７又は１８１に記載のＶＨ領域；
    からなる群から選択されるＶＬ領域及びＶＨ領域を含む、請求項１から６のいずれかに記載のポリペプチド。
  8. ヒト及び非チンパンジー霊長類ＣＤ３ε鎖のエピトープに結合可能な前記第１結合ドメインが、配列番号２３、２５、４１、４３、５９、６１、７７、７９、９５、９７、１１３、１１５、１３１、１３３、１４９、１５１、１６７、１６９、１８５又は１８７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項７に記載のポリペプチド。
  9. 前記ポリペプチドが二重特異性単鎖抗体分子である、請求項１から８のいずれかに記載のポリペプチド。
  10. 前記二重特異性単鎖抗体分子が、第２結合ドメインにおけるＣＤＲ Ｈ１、ＣＤＲ Ｈ２、ＣＤＲ Ｈ３、ＣＤＲ Ｌ１、ＣＤＲ Ｌ２及びＣＤＲ Ｌ３として、配列番号４４１〜４４６、配列番号４５３〜４５８、配列番号４６３〜４６８、配列番号４８１〜４８６から選択される配列の群を含む、請求項９に記載のポリペプチド。
  11. 前記二重特異性単鎖抗体分子が、
    （ａ）配列番号３８９、３９１、３９３、３９５、３９７、３９９、４０９、４１１、４１３、４１５、４１７、４１９、４２９、４３１、４３３、４３５、４３７、４３９、４４７、４４９、４５１、４６９、４７１、４７３、４７５、４７７、４７９、４９５、４９７、４９９、５０１、５０３及び５０５のいずれかに記載のアミノ酸配列；並びに
    （ｂ）配列番号３９０、３９２、３９４、３９６、３９８、４００、４１０、４１２、４１４、４１６、４１８、４２０、４３０、４３２、４３４、４３６、４３８、４４０、４４８、４５０、４５２、４７０、４７２、４７４、４７６、４７８、４８０、４９６、４９８、５００、５０２、５０４及び５０６のいずれかに記載の核酸配列によりコードされるアミノ酸配列
    から選択される配列を含む、請求項９に記載のポリペプチド。
  12. 請求項１から１１のいずれかに定義されるポリペプチドをコードする核酸配列。
  13. 請求項１２に定義される核酸配列を含むベクター。
  14. 前記ベクターが、請求項１２に定義される前記核酸配列に機能的に結合している調節配列をさらに含む、請求項１３に記載のベクター。
  15. 前記ベクターが発現ベクターである、請求項１４に記載のベクター。
  16. 請求項１３から１５のいずれかに定義されるベクターにより形質転換又はトランスフェクトされたホスト。
  17. 請求項１から１１のいずれかに記載のポリペプチドの産生方法であって、請求項１から１１のいずれかに定義されるポリペプチドの発現を可能にする条件下で請求項１６に定義されるホストを培養する工程及び産生されたポリペプチドを培養物から回収する工程を含む方法。
  18. 請求項１から１１のいずれかに記載のポリペプチド又は請求項１７に記載の方法により産生されたポリペプチドを含む医薬組成物。
  19. キャリア、安定剤及び／又は賦形剤の好適な製剤をさらに含む、請求項１８に記載の医薬組成物。
  20. 増殖性疾患、腫瘍性疾患又は免疫疾患から選択される疾患の予防、治療又は回復のための、請求項１から１１のいずれかに記載のポリペプチド又は請求項１７に記載の方法により産生されたポリペプチドを含む医薬組成物。
  21. キャリア、安定剤及び／又は賦形剤の好適な製剤をさらに含む、請求項２０に記載の医薬組成物。
  22. 疾患の予防、治療又は回復のための医薬組成物の調製のための、請求項１から１１のいずれかに定義されたポリペプチド又は請求項１７により産生されるポリペプチドの使用。
  23. 前記疾患が、増殖性疾患、腫瘍性疾患又は免疫疾患である、請求項２２に記載の使用。
  24. 前記腫瘍性疾患が悪性疾患である、請求項２３に記載の使用。
  25. 前記医薬組成物が、追加の薬剤と組み合わせて投与するのに好適である、請求項２２から２４のいずれかに記載の使用。
  26. 前記薬剤が、非タンパク質化合物又はタンパク質化合物である、請求項２５に記載の使用。
  27. 前記タンパク質化合物又は非タンパク質化合物が、請求項１８又は１９に記載の医薬組成物と同時に、又は非同時に投与される、請求項２６に記載の使用。
  28. 疾患の予防、治療又は回復を必要とする被験者における疾患の予防、治療又は回復のための方法であって、請求項１８又は１９に記載の有効量の医薬組成物を投与する工程を含む方法。
  29. 前記疾患が、増殖性疾患、腫瘍性疾患又は免疫疾患である、請求項２８に記載の方法。
  30. 前記腫瘍性疾患が悪性疾患である、請求項２９に記載の方法。
  31. 前記医薬組成物が、追加の薬剤と組み合わせて投与される、請求項２８から３０のいずれかに記載の方法。
  32. 前記薬剤が、非タンパク質化合物又はタンパク質化合物である、請求項３１に記載の方法。
  33. 前記タンパク質化合物又は非タンパク質化合物が、請求項１８又は１９に記載の医薬組成物と同時に、又は非同時に投与される、請求項３２に記載の方法。
  34. 前記被験者がヒトである、請求項２８から３３のいずれか一項に記載の方法。
  35. 請求項１から１１のいずれかに定義されたポリペプチド、請求項１２に定義された核酸分子、請求項１３から１５のいずれかに定義されたベクター又は請求項１６に定義されたホストを含むキット。
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