CN104829729B - 一种携带抗Her2/CD3双特异性功能蛋白的人T细胞制备 - Google Patents
一种携带抗Her2/CD3双特异性功能蛋白的人T细胞制备 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种双特异性抗体。本发明提供一种双特异性抗体，所述双特异性抗体包括第一抗体段和第二抗体段，所述第一抗体段为抗肿瘤抗原抗体段，第二抗体段为抗人CD3分子抗体段。本发明发明人利用双特异性抗体原理，构建Her2肿瘤抗原和T细胞特异性的双特异性抗体，利用过继转输的T细胞携带并体内持续表达该抗体蛋白，从而使该双特异性抗体在体内发挥杀伤作用的同时，伴随足量的T效应细胞，更优化了效应发挥的效率。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种双特异性抗体。
背景技术
双特异性抗体：由两种抗体直接连接而成，目前常见的制备方法如下：参考文献PNAS,2013,110(1):270-275.
首先利用PCR制备双特异性抗体基因，再将此基因克隆到表达载体pRB199转化到大肠杆菌菌株BL21(λDE3)。细菌接种到含80μg/ml氯霉素的肉汤培养基中，在37℃培养，至A600处吸光度达2.0。在培养基中加入0.1mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropylβ-D-1-thiogalactopyranoside)诱导重组双特异性抗体的表达，继续在37℃培养4h。菌液在2000g离心15分钟，收集细菌，并用TE50/20缓冲液[50mM Tris(pH 7.5)and 20mM EDTA]重悬细菌，储存于-70℃。使用大量TE50/20缓冲液洗涤细菌，制备包涵体(Inclusion bodies)。随后，在包涵体中加入6M guanidine-HCl和DET(dithioerythritol)进行变性，然后使用到复性缓冲液(0.1M Tris,0.5M arginine-HCl,0.9mM oxidized glutathione,and 2mM EDTA；pH 10.3)进行100稀释，在4℃快速混合，随后在4℃孵育72h，使蛋白重新折叠。复性后，以1:10的比例加入0.1M Tris和0.5M NaCl进行透析，重复三次后进行过滤(0.2μm)，随后进行金属离子亲和层析。随后，采用快速蛋白液相色谱仪(BioLogic DuoFlow 10System；Bio-Rad)进行纯化，采用组氨酸标签融合蛋白质纯化柱分离bscEGFRvIIIxCD3。上样速度恒流控制在2毫升/分钟,然后用0.1M Tris和0.5M NaCl进行清洗，直到280nm液吸光度的洗出液为0。蛋白质是由咪唑逐步梯度洗脱，流速1毫升/分钟。将该产物进行过柱(Sartorius StedimBiotech)处理，去掉分子量大于10000的蛋白，用PBS透析，过滤除菌。测定浓度后使用SDS/PAGE进行银染鉴定。
其中有一类叫双特异性T细胞连接子(Bispecific T-cell Engager,BiTE)，因其一端特异性抗T细胞表达的CD3分子而得名。
Her2单抗治疗：如Trastuzumab(Herceptin)已在部分Her阳性的肿瘤治疗中取得了一定的疗效，但由于效应性免疫细胞的缺失，单纯的抗体治疗肿瘤难以完全清楚残余肿瘤细胞进而防止肿瘤复发。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种双特异性抗体，用于解决现有技术中的问题。本发明所提供的一种双特异性抗体由三部分组成：抗肿瘤抗原的抗体段、连接段和抗人CD3分子的抗体段，通过肿瘤抗原抗体段连接肿瘤细胞，同时抗CD3抗体段连接T淋巴细胞，从而有效将效应性免疫细胞趋化到肿瘤局部，使机体更有效地发挥抗肿瘤效应。
为实现上述目的及其他相关目的，本发明第一方面提供一种双特异性抗体，所述双特异性抗体包括第一抗体段和第二抗体段，所述第一抗体段为抗肿瘤抗原抗体段，第二抗体段为抗人CD3分子抗体段。
优选的，所述双特异性抗体为单链双特异性抗体。
优选的，所述抗肿瘤抗原抗体段为抗Her2抗体。
更优选的，所述抗Her2抗体的VL氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，所述抗Her2抗体的VH氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。
更优选的，所述抗Her2抗体的VL核苷酸编码序列如SEQ ID No.1所示，所述抗Her2抗体的VH核苷酸编码序列如SEQ ID No.3所示。
更优选的，所述抗Her2抗体的VL和VH之间通过连接段2连接，所述连接段2的氨基酸序列选自SEQ ID No.5-7中的一种。
在本发明一实施例中，所述抗肿瘤抗原抗体段从N端到C端依次包括抗Her2抗体的VL、连接段2、抗Her2抗体的VH，其氨基酸序列如SEQ ID No.21、23、25所示，核苷酸编码序列如SEQ ID No.20、22、24所示。
在本发明一实施例中，所述抗肿瘤抗原抗体段从N端到C端依次包括抗Her2抗体的VH、连接段2、抗Her2抗体的VL，其氨基酸序列如SEQ ID No.27所示，核苷酸编码序列如SEQID No.26所示。
优选的，所述抗人CD3分子抗体段的VL氨基酸序列如SEQ ID No.9所示，所述抗人CD3分子抗体段的VH氨基酸序列如SEQ ID No.11所示。
优选的，所述抗人CD3分子抗体段的VL核苷酸编码序列如SEQ ID No.8所示，所述抗人CD3分子抗体段的VH核苷酸编码序列如SEQ ID No.10所示。
更优选的，所述抗人CD3分子抗体段的VL和VH之间通过连接段3连接，所述连接段3的氨基酸序列如SEQ ID No.12所示。
在本发明一实施例中，所述抗人CD3分子抗体段从N端到C端依次包括抗人CD3分子抗体段的VH、连接段3、抗人CD3分子抗体段的VL，其氨基酸序列如SEQ ID No.29所示，核苷酸编码序列如SEQ ID No.28中第1-744位所示。
更优选的，所述第一抗体段和第二抗体段之间通过连接段1连接。
进一步优选的，所述连接段1的氨基酸序列如SEQ ID No.13或SEQ ID No.14所示。
在本发明一实施例中，所述双特异性抗体从N端到C端依次包括第一抗体段、连接段1、第二抗体段，其氨基酸序列如SEQ ID No.31、33、35、37、39、41、43、45所示，核苷酸编码序列分别如SEQ ID No.30第1-1560位、SEQ ID No.32第1-1560位、SEQ ID No.34第1-1560位、SEQ ID No.36第1-1545位、SEQ ID No.38第1-1533位、SEQ ID No.40第1-1566位、SEQID No.42第1-1551位、SEQ ID No.44第1-1539位所示。
本发明第二方面提供一种多核苷酸，所述多核苷酸编码所述的双特异性抗体。
本发明第三方面提供一种含有所述多核苷酸的构建体。
优选的，所述构建体由所述多核苷酸插入到表达载体的多克隆位点构建而成。
更优选的，所述表达载体选自pGEM、pELNS、pMSGV中的一种或多种的组合。
本发明第四方面提供一种重组的宿主细胞，所述重组的宿主细胞含有所述的构建体、或者染色体中整合有所述的多核苷酸。
优选的，所述重组的宿主细胞由所述构建体转染到宿主细胞构建而成。
优选的，所述宿主细胞为T细胞。
本发明第五方面提供所述双特异性抗体的制备方法，包括如下步骤：在适合表达所述双特异性抗体的条件下，培养所述重组的宿主细胞，从而表达出所述的双特异性抗体，纯化分离出所述的双特异性抗体。
本发明第六方面提供所述双特异性抗体、多核苷酸、构建体、重组的宿主细胞在制备或筛选治疗Her2阳性肿瘤药物上的用途。
例如，人胃癌细胞株N87、人卵巢癌细胞株SKOV3、人乳腺癌细胞株SKBR3、BT474这些是Her2阳性的，人白血病细胞株K562、人乳腺癌细胞株MDA231、MDA468、MCF3为Her阴性的
优选的，所述Her2阳性肿瘤选自人胃癌细胞株N87、人卵巢癌细胞株SKOV3、人乳腺癌细胞株SKBR3、BT474中的一种或多种的组合。
具体的，所述重组的宿主细胞在制备或筛选治疗Her2阳性肿瘤药物上的用途具体为携带所述双特异性抗体基因的T细胞在制备或筛选过继转输治疗Her2阳性肿瘤药物上的用途。
本发明第七方面一种药物组合物，包括治疗有效量的所述双特异性抗体或重组的宿主细胞。
这种组合物以所述双特异性抗体为活性成分，加上本领域一种或多种药物可接受的载体、稀释剂、填充剂、结合剂及其它赋形剂。
本发明发明人利用双特异性抗体原理，构建Her2肿瘤抗原和T细胞特异性的双特异性抗体，利用过继转输的T细胞携带并体内持续表达该抗体蛋白，从而使该双特异性抗体在体内发挥杀伤作用的同时，伴随足量的T效应细胞，更优化了效应发挥的效率。
如上所述，本发明构建Her2肿瘤抗原和T细胞特异性的双特异性抗体，利用过继转输的T细胞携带并体内持续表达该抗体蛋白，具有以下有益效果：
a)靶向性：制备携带针对Her2阳性肿瘤双特异性抗体的效应性T细胞，过继转输体内治疗肿瘤靶向性更好。
b)有效性：双特异性抗体RNA基因电转入T细胞后，会以分泌的形式表达，在体内更有利于结合肿瘤细胞表面抗原，将肿瘤细胞与T细胞拉近，从T细胞更有效发挥杀伤效应。
c)安全性：双特异性抗体RNA基因电转入T细胞体内，过继转输这群基因修饰的T细胞进入体内后，待效应发挥后基因会被及时清除，而不会像慢病毒转染那样在体内长期存在，这样安全性更佳。
附图说明
图1显示为轻链段huMAb4D5-5VL和重链段huMAb4D5-5VH示意图。
图2(a)显示为本发明中所使用的抗CD3的抗体序列与Pubmed上的OKT的VL链对比示意图。
图2(b)显示为本发明中所使用的抗CD3的抗体序列与Pubmed上的OKT的VH链对比示意图。
图3显示为Journal of Biochemistry,1996,120:657-662.文献中的OKT的VH和VL链示意图。
图4显示为pGEM4Z/GFP/A64示意图。
图5(a)显示为T细胞活力示意图。
图5(b)显示为各细胞亚群比例以及细胞表面活性分子表达水平示意图。
图6(a)显示为T细胞的CD107a膜转位情况示意图。
图6(b)显示为T细胞的CD107a膜转位情况示意图。
图7(a)显示为细胞分泌IFN-γ能力示意图。
图7(b)显示为细胞杀伤能力示意图。
图8显示为实施例2中的细胞活性示意图。
图9显示为实施例2中的CD107a膜转位示意图。
图10显示为实施例2中的分泌IFN-γ能力示意图。
图11显示为实施例2中的细胞杀伤能力示意图。
具体实施方式
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring HarborLaboratory Press，1989and Third edition，2001；Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，New York，1987and periodic updates；theseries METHODS IN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego；Wolffe，CHROMATINSTRUCTURE AND FUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego，1998；METHODS INENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，AcademicPress，San Diego，1999；和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Vol.119，ChromatinProtocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。
实施例1
①目的基因制备：
a.抗Her2抗体序列来源于文献(Humanization of an anti-p185HER2antibodyfor human cancer therapy.Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1992，89:4285-4289.)中的人化抗体：轻链段huMAb4D5-5VL和重链段huMAb4D5-5VH(如图1所示)。
本发明实施例中使用的抗Her2抗体VL序列如下：
核酸序列如SEQ ID No.1所示：
ATGGATTTTCAGGTGCAGATTTTCAGCTTCCTGCTAATCAGTGCCTCAGTCATAATGTCCAGAGGAGATATCCAGATGACCCAGTCCCCGAGCTCCCTGTCCGCCTCTGTGGGCGATAGGGTCACCATCACCTGCCGTGCCAGTCAGGATGTGAATACTGCTGTAGCCTGGTATCAACAGAAACCAGGAAAAGCTCCGAAACTACTGATTTACTCGGCATCCTTCCTTGAGTCTGGAGTCCCTTCTCGCTTCTCTGGATCTAGATCTGGGACGGATTTCACTCTGACCATCAGCAGTCTGCAGCCGGAAGACTTCGCAACTTATTACTGTCAGCAACATTATACTACTCCTCCCACGTTCGGACAGGGTACCAAGGTGGAGATCAAA(SEQ ID No.1)
蛋白序列如SEQ ID No.2所示：
MDFQVQIFSFLLISASVIMSRGDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLESGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIK(SEQ ID No.2)
本发明实施例中使用的抗Her2抗体VH序列如下：
核酸序列如SEQ ID No.3所示：
GAGGTTCAGCTGGTGGAGTCTGGCGGTGGCCTGGTGCAGCCAGGGGGCTCACTCCGTTTGTCCTGTGCAGCTTCTGGCTTCAACATTAAAGACACCTATATACACTGGGTGCGTCAGGCCCCGGGTAAGGGCCTGGAATGGGTTGCAAGGATTTATCCTACGAATGGTTATACTAGATATGCCGATAGCGTCAAGGGCCGTTTCACTATAAGCGCAGACACATCCAAAAACACAGCCTACCTGCAGATGAACAGCCTGCGTGCTGAGGACACTGCCGTCTATTATTGTTCTAGATGGGGAGGGGACGGCTTCGTTGCTATGGACGTGTGGGGTCAAGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCG(SEQ ID No.3)
蛋白序列如SEQ ID No.4所示：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFVAMDVWGQGTLVTVSS(SEQ ID No.4)
b.设计了如下三种linker：
i.(G4S)3(SEQ ID No.5):
ggt ggt ggt ggt tct ggc ggc ggc ggc tcc ggt ggt ggt ggt tct(SEQ IDNo.15)
ggc gga ggg gga agt ggc ggg ggt ggg tcc ggc ggc ggc ggc tcg(SEQ IDNo.46)ii.(G4S)2(SEQ ID No.6):ggt ggt ggt ggt tct ggc ggc ggc ggc tcc(SEQ IDNo.16)
iii.SGGGGS(SEQ ID No.7)：tcg ggg ggc ggg gga agt(SEQ ID No.17)
用我们设计的不同linker将抗Her2抗体4D5的VH和VL段按照不同顺序连接成：
VL-(G4S)3-VH、VL-(G4S)2-VH、VL-SGGGGS-VH和VH-(G4S)3-VL。
VL-(G4S)3-VH：(粗体为linker，下同)
核酸序列如SEQ ID No.20所示：
ATGGATTTTCAGGTGCAGATTTTCAGCTTCCTGCTAATCAGTGCCTCAGTCATAATGTCCAGAGGAGATATCCAGATGACCCAGTCCCCGAGCTCCCTGTCCGCCTCTGTGGGCGATAGGGTCACCATCACCTGCCGTGCCAGTCAGGATGTGAATACTGCTGTAGCCTGGTATCAACAGAAACCAGGAAAAGCTCCGAAACTACTGATTTACTCGGCATCCTTCCTTGAGTCTGGAGTCCCTTCTCGCTTCTCTGGATCTAGATCTGGGACGGATTTCACTCTGACCATCAGCAGTCTGCAGCCGGAAGACTTCGCAACTTATTACTGTCAGCAACATTATACTACTCCTCCCACGTTCGGACAGGGTACCAAGGTGGAGATCAAA GAGGTTCAGCTGGTGGAGTCTGGCGGTGGCCTGGTGCAGCCAGGGGGCTCACTCCGTTTGTCCTGTGCAGCTTCTGGCTTCAACATTAAAGACACCTATATACACTGGGTGCGTCAGGCCCCGGGTAAGGGCCTGGAATGGGTTGCAAGGATTTATCCTACGAATGGTTATACTAGATATGCCGATAGCGTCAAGGGCCGTTTCACTATAAGCGCAGACACATCCAAAAACACAGCCTACCTGCAGATGAACAGCCTGCGTGCTGAGGACACTGCCGTCTATTATTGTTCTAGATGGGGAGGGGACGGCTTCGTTGCTATGGACGTGTGGGGTCAAGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCG(SEQ ID No.20)
蛋白序列如SEQ ID No.21所示：
MDFQVQIFSFLLISASVIMSRGDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLESGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFVAMDVWGQGTLVTVSS(SEQ ID No.21)
VL-(G4S)2-VH：
核酸序列如SEQ ID No.22所示：
ATGGATTTTCAGGTGCAGATTTTCAGCTTCCTGCTAATCAGTGCCTCAGTCATAATGTCCAGAGGAGATATCCAGATGACCCAGTCCCCGAGCTCCCTGTCCGCCTCTGTGGGCGATAGGGTCACCATCACCTGCCGTGCCAGTCAGGATGTGAATACTGCTGTAGCCTGGTATCAACAGAAACCAGGAAAAGCTCCGAAACTACTGATTTACTCGGCATCCTTCCTTGAGTCTGGAGTCCCTTCTCGCTTCTCTGGATCTAGATCTGGGACGGATTTCACTCTGACCATCAGCAGTCTGCAGCCGGAAGACTTCGCAACTTATTACTGTCAGCAACATTATACTACTCCTCCCACGTTCGGACAGGGTACCAAGGTGGAGATCAAA GAGGTTCAGCTGGTGGAGTCTGGCGGTGGCCTGGTGCAGCCAGGGGGCTCACTCCGTTTGTCCTGTGCAGCTTCTGGCTTCAACATTAAAGACACCTATATACACTGGGTGCGTCAGGCCCCGGGTAAGGGCCTGGAATGGGTTGCAAGGATTTATCCTACGAATGGTTATACTAGATATGCCGATAGCGTCAAGGGCCGTTTCACTATAAGCGCAGACACATCCAAAAACACAGCCTACCTGCAGATGAACAGCCTGCGTGCTGAGGACACTGCCGTCTATTATTGTTCTAGATGGGGAGGGGACGGCTTCGTTGCTATGGACGTGTGGGGTCAAGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCG(SEQ ID No.22)
蛋白序列如SEQ ID No.23所示：
MDFQVQIFSFLLISASVIMSRGDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLESGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFVAMDVWGQGTLVTVSS(SEQ ID No.23)
VL-SGGGGS-VH：
核酸序列如SEQ ID No.24所示：
ATGGATTTTCAGGTGCAGATTTTCAGCTTCCTGCTAATCAGTGCCTCAGTCATAATGTCCAGAGGAGATATCCAGATGACCCAGTCCCCGAGCTCCCTGTCCGCCTCTGTGGGCGATAGGGTCACCATCACCTGCCGTGCCAGTCAGGATGTGAATACTGCTGTAGCCTGGTATCAACAGAAACCAGGAAAAGCTCCGAAACTACTGATTTACTCGGCATCCTTCCTTGAGTCTGGAGTCCCTTCTCGCTTCTCTGGATCTAGATCTGGGACGGATTTCACTCTGACCATCAGCAGTCTGCAGCCGGAAGACTTCGCAACTTATTACTGTCAGCAACATTATACTACTCCTCCCACGTTCGGACAGGGTACCAAGGTGGAGATCAAA GAGGTTCAGCTGGTGGAGTCTGGCGGTGGCCTGGTGCAGCCAGGGGGCTCACTCCGTTTGTCCTGTGCAGCTTCTGGCTTCAACATTAAAGACACCTATATACACTGGGTGCGTCAGGCCCCGGGTAAGGGCCTGGAATGGGTTGCAAGGATTTATCCTACGAATGGTTATACTAGATATGCCGATAGCGTCAAGGGCCGTTTCACTATAAGCGCAGACACATCCAAAAACACAGCCTACCTGCAGATGAACAGCCTGCGTGCTGAGGACACTGCCGTCTATTATTGTTCTAGATGGGGAGGGGACGGCTTCGTTGCTATGGACGTGTGGGGTCAAGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCG(SEQ ID No.24)
蛋白序列如SEQ ID No.25所示：
MDFQVQIFSFLLISASVIMSRGDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLESGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFVAMDVWGQGTLVTVSS(SEQ ID No.25)
VH-(G4S)3-VL
核酸序列如SEQ ID No.26所示：
ATGGATTTTCAGGTGCAGATTTTCAGCTTCCTGCTAATCAGTGCCTCAGTCATAATGTCCAGAGGAGAGGTTCAGCTGGTGGAGTCTGGCGGTGGCCTGGTGCAGCCAGGGGGCTCACTCCGTTTGTCCTGTGCAGCTTCTGGCTTCAACATTAAAGACACCTATATACACTGGGTGCGTCAGGCCCCGGGTAAGGGCCTGGAATGGGTTGCAAGGATTTATCCTACGAATGGTTATACTAGATATGCCGATAGCGTCAAGGGCCGTTTCACTATAAGCGCAGACACATCCAAAAACACAGCCTACCTGCAGATGAACAGCCTGCGTGCTGAGGACACTGCCGTCTATTATTGTTCTAGATGGGGAGGGGACGGCTTCTATGCTATGGACGTGTGGGGTCAAGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCGGATATCCAGATGACCCAGTCCCCGAGCTCCCTGTCCGCCTCTGTGGGCGATAGGGTCACCATCACCTGCCGTGCCAGTCAGGATGTGAATACTGCTGTAGCCTGGTATCAACAGAAACCAGGAAAAGCTCCGAAACTACTGATTTACTCGGCATCCTTCCTTTATTCTGGAGTCCCTTCTCGCTTCTCTGGATCTAGATCTGGGACGGATTTCACTCTGACCATCAGCAGTCTGCAGCCGGAAGACTTCGCAACTTATTACTGTCAGCAACATTATACTACTCCTCCCACGTTCGGACAGGGTACCAAGGTGGAGATCAAA(SEQ ID No.26)
蛋白序列如SEQ ID No.27所示：
MDFQVQIFSFLLISASVIMSRGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDVWGQGTLVTVSSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIK(SEQ ID No.27)
c.抗CD3的抗体利用的是OKT这一抗体克隆的序列，Journal of Biochemistry,1996,120:657-662.文献中的OKT的VH和VL链如图3所示，Pubmed上的OKT的VH和VL链，以及本发明中所使用的抗CD3的抗体序列与Pubmed上的OKT的VL链对比如图2(a)所示，Pubmed上的OKT的VH链对比如图2(b)所示。
本发明实施例中使用的抗CD3的抗体VL序列如下：
核酸序列如SEQ ID No.8所示：
CTGACCCAGTCTCCAGCAATCATGTCTGCATCTCCAGGGGAGAAGGTCACCATGACCTGCAGAGCCAGTTCAAGTGTAAGTTACATGAACTGGTACCAGCAGAAGTCAGGCACCTCCCCCAAAAGATGGATTTATGACACATCCAAAGTGGCTTCTGGAGTCCCTTATCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACCTCATACTCTCTCACAATCAGCAGCATGGAGGCTGAAGATGCTGCCACTTATTACTGCCAACAGTGGAGTAGTAACCCGCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAA(SEQ ID No.8)
蛋白序列如SEQ ID No.9所示：
LTQSPAIMSASPGEKVTMTCRASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKVASGVPYRFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSNPLTFGAGTKLELK(SEQ ID No.9)
本发明实施例中使用的抗CD3的抗体VH序列如下：
核酸序列如SEQ ID No.10所示：
CTGCAGCAGTCAGGGGCTGAACTGGCAAGACCTGGGGCCTCAGTGAAGATGTCCTGCAAGACTTCTGGCTACACCTTTACTAGGTACACGATGCACTGGGTAAAACAGAGGCCTGGACAGGGTCTGGAATGGATTGGATACATTAATCCTAGCCGTGGTTATACTAATTACAATCAGAAGTTCAAGGACAAGGCCACATTGACTACAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTACATGCAACTGAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCAGTCTATTACTGTGCAAGATATTATGATGATCATTACTGCCTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCA(SEQ ID No.10)
蛋白序列如SEQ ID No.11所示：
LQQSGAELARPGASVKMSCKTSGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSS(SEQ ID No.11)
VH和VL之间使用了一个固定的linker为VEGGSGGSGGSGGSGGVDDAAIQ(SEQ IDNo.12)，连接成OKT的VH-VL单链结构，因为OKT连接方式和linker都为固定模式，故后文中OKT的VH-VL单链结构统称为OKT。
本发明实施例中使用的抗CD3的抗体的氨基酸序列和核苷酸编码序列如下：
核酸序列如SEQ ID No.28所示：
CTGCAGCAGTCAGGGGCTGAACTGGCAAGACCTGGGGCCTCAGTGAAGATGTCCTGCAAGACTTCTGGCTACACCTTTACTAGGTACACGATGCACTGGGTAAAACAGAGGCCTGGACAGGGTCTGGAATGGATTGGATACATTAATCCTAGCCGTGGTTATACTAATTACAATCAGAAGTTCAAGGACAAGGCCACATTGACTACAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTACATGCAACTGAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCAGTCTATTACTGTGCAAGATATTATGATGATCATTACTGCCTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCAGTCGAAGGTGGAAGTGGAGGTTCTGGTGGAAGTGGAGGTTCAGGTGGAGTCGACGACGCCGCCATTCAGCTGACCCAGTCTCCAGCAATCATGTCTGCATCTCCAGGGGAGAAGGTCACCATGACCTGCAGAGCCAGTTCAAGTGTAAGTTACATGAACTGGTACCAGCAGAAGTCAGGCACCTCCCCCAAAAGATGGATTTATGACACATCCAAAGTGGCTTCTGGAGTCCCTTATCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACCTCATACTCTCTCACAATCAGCAGCATGGAGGCTGAAGATGCTGCCACTTATTACTGCCAACAGTGGAGTAGTAACCCGCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAACATCATCACCATCATCATTAATAA(SEQ ID No.28)其中，第1-744位为核苷酸编码序列，最后六个碱基TAATAA为终止密码子
蛋白序列如SEQ ID No.29所示：
LQQSGAELARPGASVKMSCKTSGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSSVEGGSGGSGGSGGSGGVDDAAIQLTQSPAIMSASPGEKVTMTCRASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKVASGVPYRFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSNPLTFGAGTKLELKHHHHHH(SEQ ID No.29)
d.在我们设计的两种不同的linker(见下)将4D5和OKT连接起来成为我们的目的基因。
i.GGGGSDIK(SEQ ID No.13):gga ggt ggt gga tcc gat atc aaa(SEQ IDNo.18)
ii.VTVSSGGGGS(SEQ ID No.14):gtg acg gtg tcg tcg ggg ggc ggg ggg agt(SEQ ID No.19)
目的基因1(VL-VH-OKT(4D5的VL—Linker:(G4S)3—4D5的VH—Linker:GGGGSDIK—OKT))全长序列如下:
核酸序列如SEQ ID No.30所示：
ATGGATTTTCAGGTGCAGATTTTCAGCTTCCTGCTAATCAGTGCCTCAGTCATAATGTCCAGAGGAGATATCCAGATGACCCAGTCCCCGAGCTCCCTGTCCGCCTCTGTGGGCGATAGGGTCACCATCACCTGCCGTGCCAGTCAGGATGTGAATACTGCTGTAGCCTGGTATCAACAGAAACCAGGAAAAGCTCCGAAACTACTGATTTACTCGGCATCCTTCCTTTATTCTGGAGTCCCTTCTCGCTTCTCTGGATCTAGATCTGGGACGGATTTCACTCTGACCATCAGCAGTCTGCAGCCGGAAGACTTCGCAACTTATTACTGTCAGCAACATTATACTACTCCTCCCACGTTCGGACAGGGTACCAAGGTGGAGATCAAA GAGGTTCAGCTGGTGGAGTCTGGCGGTGGCCTGGTGCAGCCAGGGGGCTCACTCCGTTTGTCCTGTGCAGCTTCTGGCTTCAACATTAAAGACACCTATATACACTGGGTGCGTCAGGCCCCGGGTAAGGGCCTGGAATGGGTTGCAAGGATTTATCCTACGAATGGTTATACTAGATATGCCGATAGCGTCAAGGGCCGTTTCACTATAAGCGCAGACACATCCAAAAACACAGCCTACCTGCAGATGAACAGCCTGCGTGCTGAGGACACTGCCGTCTATTATTGTTCTAGATGGGGAGGGGACGGCTTCTATGCTATGGACGTGTGGGGTCAAGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCG CTGCAGCAGTCAGGGGCTGAACTGGCAAGACCTGGGGCCTCAGTGAAGATGTCCTGCAAGACTTCTGGCTACACCTTTACTAGGTACACGATGCACTGGGTAAAACAGAGGCCTGGACAGGGTCTGGAATGGATTGGATACATTAATCCTAGCCGTGGTTATACTAATTACAATCAGAAGTTCAAGGACAAGGCCACATTGACTACAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTACATGCAACTGAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCAGTCTATTACTGTGCAAGATATTATGATGATCATTACTGCCTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCA CTGACCCAGTCTCCAGCAATCATGTCTGCATCTCCAGGGGAGAAGGTCACCATGACCTGCAGAGCCAGTTCAAGTGTAAGTTACATGAACTGGTACCAGCAGAAGTCAGGCACCTCCCCCAAAAGATGGATTTATGACACATCCAAAGTGGCTTCTGGAGTCCCTTATCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACCTCATACTCTCTCACAATCAGCAGCATGGAGGCTGAAGATGCTGCCACTTATTACTGCCAACAGTGGAGTAGTAACCCGCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAACATCATCACCATCATCATTAATAA(SEQ ID No.30)其中，第1-1560位为核苷酸编码序列，最后六个碱基TAATAA为终止密码子
蛋白全长序列如SEQ ID No.31所示：
MDFQVQIFSFLLISASVIMSRGDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDVWGQGTLVTVSSGGGGSDIKLQQSGAELARPGASVKMSCKTSGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSSVEGGSGGSGGSGGSGGVDDAAIQLTQSPAIMSASPGEKVTMTCRASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKVASGVPYRFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSNPLTFGAGTKLELKHHHHHH(SEQ ID No.31)
目的基因2(VH-VL-OKT(4D5的VH—Linker:(G4S)3—4D5的VL—Linker:GGGGSDIK—OKT))全长序列如下:
核酸序列如SEQ ID No.32所示：
ATGGATTTTCAGGTGCAGATTTTCAGCTTCCTGCTAATCAGTGCCTCAGTCATAATGTCCAGAGGAGAGGTTCAGCTGGTGGAGTCTGGCGGTGGCCTGGTGCAGCCAGGGGGCTCACTCCGTTTGTCCTGTGCAGCTTCTGGCTTCAACATTAAAGACACCTATATACACTGGGTGCGTCAGGCCCCGGGTAAGGGCCTGGAATGGGTTGCAAGGATTTATCCTACGAATGGTTATACTAGATATGCCGATAGCGTCAAGGGCCGTTTCACTATAAGCGCAGACACATCCAAAAACACAGCCTACCTGCAGATGAACAGCCTGCGTGCTGAGGACACTGCCGTCTATTATTGTTCTAGATGGGGAGGGGACGGCTTCTATGCTATGGACGTGTGGGGTCAAGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCGGATATCCAGATGACCCAGTCCCCGAGCTCCCTGTCCGCCTCTGTGGGCGATAGGGTCACCATCACCTGCCGTGCCAGTCAGGATGTGAATACTGCTGTAGCCTGGTATCAACAGAAACCAGGAAAAGCTCCGAAACTACTGATTTACTCGGCATCCTTCCTTTATTCTGGAGTCCCTTCTCGCTTCTCTGGATCTAGATCTGGGACGGATTTCACTCTGACCATCAGCAGTCTGCAGCCGGAAGACTTCGCAACTTATTACTGTCAGCAACATTATACTACTCCTCCCACGTTCGGACAGGGTACCAAGGTGGAGATCAAA CTGCAGCAGTCAGGGGCTGAACTGGCAAGACCTGGGGCCTCAGTGAAGATGTCCTGCAAGACTTCTGGCTACACCTTTACTAGGTACACGATGCACTGGGTAAAACAGAGGCCTGGACAGGGTCTGGAATGGATTGGATACATTAATCCTAGCCGTGGTTATACTAATTACAATCAGAAGTTCAAGGACAAGGCCACATTGACTACAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTACATGCAACTGAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCAGTCTATTACTGTGCAAGATATTATGATGATCATTACTGCCTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCA CTGACCCAGTCTCCAGCAATCATGTCTGCATCTCCAGGGGAGAAGGTCACCATGACCTGCAGAGCCAGTTCAAGTGTAAGTTACATGAACTGGTACCAGCAGAAGTCAGGCACCTCCCCCAAAAGATGGATTTATGACACATCCAAAGTGGCTTCTGGAGTCCCTTATCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACCTCATACTCTCTCACAATCAGCAGCATGGAGGCTGAAGATGCTGCCACTTATTACTGCCAACAGTGGAGTAGTAACCCGCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAACATCATCACCATCATCATTAATAA(SEQ ID No.32)其中，第1-1560位为核苷酸编码序列，最后六个碱基TAATAA为终止密码子
蛋白全长序列如SEQ ID No.33所示：
MDFQVQIFSFLLISASVIMSRGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDVWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKGGGGSDIKLQQSGAELARPGASVKMSCKTSGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSSVEGGSGGSGGSGGSGGVDDAAIQLTQSPAIMSASPGEKVTMTCRASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKVASGVPYRFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSNPLTFGAGTKLELKHHHHHH(SEQ ID No.33)
②质粒构建：载体是pGEM4Z/GFP/A64(图谱如图4所示)(Nature medicine,2000,6(9):1011-1017.)，我们利用neb的Not I和Hind III两个酶切掉GFP基因，然后将上述目的基因1和目的基因2插入。两种目的基因(SEQ ID No.30和SEQ ID No.32)均采用直接合成的方法，然后两头加上3’端和5’端分别加上Not I和Hind III酶切位点和保护碱基，用NEB公司Not I和Hind III酶切后与同样经Not I和Hind III酶切的载体连接(采用Roche公司rapid DNA Ligation Kit进行连接)，酶切产物使用QIAGEN公司试剂盒回收纯化。
③制备mRNA：将质粒利用neb的SpeI酶切过夜，利用QIAGEN的QIAquick PCRPurification Kit试剂盒纯化酶切产物，使用CELLSCRIPTTM的T7mScriptTMStandard mRNAProduction System试剂盒制备RNA。
④T细胞制备：健康人外周血分离的单个核细胞，调整浓度为1×106/mL(T细胞培养液：1640培养基(Gibco)+10％胎牛血清(Gibco)+1％丙酮酸钠(Gibco)+1％HEPES(Gibco)+1％谷氨酰胺(Gibco)+1％非必需氨基酸(Gibco)+1％青霉素、链霉素(Gibco))，铺于24孔板中，1mL/孔。培养条件5ug/mL anti-hCD3(pre-coated)，2ug/mL anti-hCD28。五天后去除anti-hCD3/28刺激，给予40ng/mL(100U/mL)rmIL-2维持量，每2天根据细胞浓度补充培养基，待9-11天后T细胞体积缩小为8um以下时，细胞冻存备用。
⑤RNA电转T细胞：首先用冷Opti-MEM洗细胞三次，重悬细胞于合适浓度(20～300×106/mL)；然后取100μL细胞悬液与5～10ug RNA混匀，加入0.2μM电转杯；电转条件：500uv700us(刺激后T细胞)，500uv 800us(静息T细胞)，500uv 500us(肿瘤细胞)；电转后迅速转入预热的1640完全培养基中。
⑥相关目的基因VL-VH-OKT(4D5的VL—Linker:(G4S)3—4D5的VH—Linker:GGGGSDIK—OKT)和VH-VL-OKT(4D5的VH—Linker:(G4S)3—4D5的VL—Linker:GGGGSDIK—OKT)的实验结果如下：
(1)电转RNA的24小时后，与对照组相比，T细胞活力(如图5a所示)、各细胞亚群比例以及细胞表面活性分子表达(如图5b所示)均未见明显改变。电转仪(BTX的ECM 830)、细胞计数仪(Invitrogen的C10310)、流式检测仪(BD的FACSCanto II)
(2)电转RNA的24小时后，各组T细胞分别与K562(Her2阴性)肿瘤细胞和N87(Her2阳性)肿瘤细胞按不同比例(效靶比：1:4、1:2、1:1，T细胞为效应细胞，浓度为1*106/mL，每孔50uL；肿瘤细胞(K562或N87)为靶细胞，浓度分别为2*106/mL、1*106/mL、0.5*106/mL，每孔100uL；故每孔总体积为150uL)共孵育4小时(细胞培养液：1640培养基(Gibco)+10％胎牛血清(Gibco)+1％青霉素、链霉素(Gibco))，检测T细胞表面CD107a膜转位情况,每组T细胞样品包括3个样品。结果发现，与K562(Her2阴性)肿瘤细胞共孵育时，各组T细胞表面均只检测到较低水平的CD107a膜转位；但是当与N87(Her2阳性)肿瘤细胞共孵育时，与未转RNA组T细胞相比，两种电转RNA组的T细胞表面均可检测到高水平的CD107a膜转位，具体如图6(a)和图6(b)所示。电转仪(BTX的ECM 830)、流式检测仪(BD的FACSCanto II)
(3)电转RNA的24小时后，各组T细胞分别与K562(Her2阴性)肿瘤细胞和N87(Her2阳性)肿瘤细胞按不同比例(效靶比：1:1、1:1/2、1:1/4，T细胞为效应细胞，浓度为1*106/mL，每孔100uL；肿瘤细胞(K562或N87)为靶细胞，浓度分别为1*106/mL、0.5*106/mL、0.25*106/mL，每孔100uL；故每孔总体积为200uL)共孵育16小时(细胞培养液：1640培养基(Gibco)+10％胎牛血清(Gibco)+1％青霉素、链霉素(Gibco))，检测细胞培养上清中IFN-γ分泌情况,每组T细胞样品包括3个样品。结果发现，与K562(Her2阴性)肿瘤细胞共孵育时，各组细胞培养上清均只检测到较低水平的IFN-γ分泌；但是当与N87(Her2阳性)肿瘤细胞共孵育时，与未转RNA组T细胞相比，两种电转RNA组的细胞培养上清均可检测到高水平的IFN-γ分泌，具体如图7(a)和图7(b)所示。电转仪(BTX的ECM 830)、微孔板分光光度计(BioTek的Epoch)、洗板机(BioTek的Elx50/8)
(4)杀伤实验：K562(Her2阴性，作为阴性对照细胞)肿瘤细胞用CMRA标记，N87(Her2阳性，作为靶细胞)肿瘤细胞用CFSE标记，两种肿瘤细胞按1:1混合，再与各组电转或不电转RNA24小时后的T细胞按照不同比例(效靶比：1:1、10:1、20:1，T细胞为效应细胞，浓度分别为0.25*106/mL、2.5*106/mL、25*106/mL，每孔100uL；肿瘤细胞N87为靶细胞，肿瘤细胞K562为无关对照，两种肿瘤细胞浓度均为0.5*106/mL，再按1:1混合后，每孔100uL；故每孔总体积为200uL)共孵育16小时(细胞培养液：1640培养基(Gibco)+10％胎牛血清(Gibco)+1％青霉素、链霉素(Gibco))，细胞表染CD3分子荧光抗体去除T细胞，表染7AAD染料去除死细胞，流式细胞仪检测CMRA+K562肿瘤细胞和CFSE+N87肿瘤细胞比例，计算各组T细胞对N87特异性杀伤能力，公式为:[1-(CD3-CFSE+7AAD-的活N87细胞比例)/(CD3-CMRA+7AAD-的活K562细胞比例)]*100％,每组T细胞样品包括3个样品。结果发现，与未电转RNA组T细胞相比，两种电转RNA的T细胞组随着孵育比例下降，特异性杀伤N87细胞的能力显著上调。
仪器：电转仪(BTX的ECM 830)、流式检测仪(BD的FACSCanto II)
实施例2
根据上述结果，我们4D5单链结构选择了VL-VH的方式，接着我们进一步更换了4D5VL和4D5VH之间的linker，以及4D5和OKT之间的linker。制备了以下六种结构
(1)OA:VL-(G4S)3-VH-GGGGSDIK-OKT
核酸序列如SEQ ID No.34所示：
ATGGATTTTCAGGTGCAGATTTTCAGCTTCCTGCTAATCAGTGCCTCAGTCATAATGTCCAGAGGAGATATCCAGATGACCCAGTCCCCGAGCTCCCTGTCCGCCTCTGTGGGCGATAGGGTCACCATCACCTGCCGTGCCAGTCAGGATGTGAATACTGCTGTAGCCTGGTATCAACAGAAACCAGGAAAAGCTCCGAAACTACTGATTTACTCGGCATCCTTCCTTTATTCTGGAGTCCCTTCTCGCTTCTCTGGATCTAGATCTGGGACGGATTTCACTCTGACCATCAGCAGTCTGCAGCCGGAAGACTTCGCAACTTATTACTGTCAGCAACATTATACTACTCCTCCCACGTTCGGACAGGGTACCAAGGTGGAGATCAAAggcggagggggaagtggcgggggtgggtccggcggcggcggctcgGAGGTTCAGCTGGTGGAGTCTGGCGGTGGCCTGGTGCAGCCAGGGGGCTCACTCCGTTTGTCCTGTGCAGCTTCTGGCTTCAACATTAAAGACACCTATATACACTGGGTGCGTCAGGCCCCGGGTAAGGGCCTGGAATGGGTTGCAAGGATTTATCCTACGAATGGTTATACTAGATATGCCGATAGCGTCAAGGGCCGTTTCACTATAAGCGCAGACACATCCAAAAACACAGCCTACCTGCAGATGAACAGCCTGCGTGCTGAGGACACTGCCGTCTATTATTGTTCTAGATGGGGAGGGGACGGCTTCTATGCTATGGACGTGTGGGGTCAAGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCGggaggtggtggatccgatatcaaaCTGCAGCAGTCAGGGGCTGAACTGGCAAGACCTGGGGCCTCAGTGAAGATGTCCTGCAAGACTTCTGGCTACACCTTTACTAGGTACACGATGCACTGGGTAAAACAGAGGCCTGGACAGGGTCTGGAATGGATTGGATACATTAATCCTAGCCGTGGTTATACTAATTACAATCAGAAGTTCAAGGACAAGGCCACATTGACTACAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTACATGCAACTGAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCAGTCTATTACTGTGCAAGATATTATGATGATCATTACTGCCTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCAgtcgaaggtggaagtggaggttctggtggaagtggaggttcaggtggagtcgacgacgccgccattcagCTGACCCAGTCTCCAGCAATCATGTCTGCATCTCCAGGGGAGAAGGTCACCATGACCTGCAGAGCCAGTTCAAGTGTAAGTTACATGAACTGGTACCAGCAGAAGTCAGGCACCTCCCCCAAAAGATGGATTTATGACACATCCAAAGTGGCTTCTGGAGTCCCTTATCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACCTCATACTCTCTCACAATCAGCAGCATGGAGGCTGAAGATGCTGCCACTTATTACTGCCAACAGTGGAGTAGTAACCCGCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAACATCATCACCATCATCATTAATAA(SEQ ID No.34)其中，第1-1560位为核苷酸编码序列，最后六个碱基TAATAA为终止密码子
蛋白全长序列如SEQ ID No.35所示：
MDFQVQIFSFLLISASVIMSRGDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDVWGQGTLVTVSSGGGGSDIKLQQSGAELARPGASVKMSCKTSGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSSVEGGSGGSGGSGGSGGVDDAAIQLTQSPAIMSASPGEKVTMTCRASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKVASGVPYRFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSNPLTFGAGTKLELKHHHHHH(SEQ ID No.35)
(2)OB:VL-(G4S)2-VH-GGGGSDIK-OKT
核酸序列如SEQ ID No.36所示：
ATGGATTTTCAGGTGCAGATTTTCAGCTTCCTGCTAATCAGTGCCTCAGTCATAATGTCCAGAGGAGATATCCAGATGACCCAGTCCCCGAGCTCCCTGTCCGCCTCTGTGGGCGATAGGGTCACCATCACCTGCCGTGCCAGTCAGGATGTGAATACTGCTGTAGCCTGGTATCAACAGAAACCAGGAAAAGCTCCGAAACTACTGATTTACTCGGCATCCTTCCTTTATTCTGGAGTCCCTTCTCGCTTCTCTGGATCTAGATCTGGGACGGATTTCACTCTGACCATCAGCAGTCTGCAGCCGGAAGACTTCGCAACTTATTACTGTCAGCAACATTATACTACTCCTCCCACGTTCGGACAGGGTACCAAGGTGGAGATCAAAggtggtggtggttctggcggcggcggctccGAGGTTCAGCTGGTGGAGTCTGGCGGTGGCCTGGTGCAGCCAGGGGGCTCACTCCGTTTGTCCTGTGCAGCTTCTGGCTTCAACATTAAAGACACCTATATACACTGGGTGCGTCAGGCCCCGGGTAAGGGCCTGGAATGGGTTGCAAGGATTTATCCTACGAATGGTTATACTAGATATGCCGATAGCGTCAAGGGCCGTTTCACTATAAGCGCAGACACATCCAAAAACACAGCCTACCTGCAGATGAACAGCCTGCGTGCTGAGGACACTGCCGTCTATTATTGTTCTAGATGGGGAGGGGACGGCTTCTATGCTATGGACGTGTGGGGTCAAGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCGggaggtggtggatccgatatcaaaCTGCAGCAGTCAGGGGCTGAACTGGCAAGACCTGGGGCCTCAGTGAAGATGTCCTGCAAGACTTCTGGCTACACCTTTACTAGGTACACGATGCACTGGGTAAAACAGAGGCCTGGACAGGGTCTGGAATGGATTGGATACATTAATCCTAGCCGTGGTTATACTAATTACAATCAGAAGTTCAAGGACAAGGCCACATTGACTACAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTACATGCAACTGAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCAGTCTATTACTGTGCAAGATATTATGATGATCATTACTGCCTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCAgtcgaaggtggaagtggaggttctggtggaagtggaggttcaggtggagtcgacgacgccgccattcagCTGACCCAGTCTCCAGCAATCATGTCTGCATCTCCAGGGGAGAAGGTCACCATGACCTGCAGAGCCAGTTCAAGTGTAAGTTACATGAACTGGTACCAGCAGAAGTCAGGCACCTCCCCCAAAAGATGGATTTATGACACATCCAAAGTGGCTTCTGGAGTCCCTTATCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACCTCATACTCTCTCACAATCAGCAGCATGGAGGCTGAAGATGCTGCCACTTATTACTGCCAACAGTGGAGTAGTAACCCGCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAACATCATCACCATCATCATTAATAA(SEQ ID No.36)其中，第1-1545位为核苷酸编码序列，最后六个碱基TAATAA为终止密码子
蛋白全长序列如SEQ ID No.37所示：
MDFQVQIFSFLLISASVIMSRGDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDVWGQGTLVTVSSGGGGSDIKLQQSGAELARPGASVKMSCKTSGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSSVEGGSGGSGGSGGSGGVDDAAIQLTQSPAIMSASPGEKVTMTCRASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKVASGVPYRFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSNPLTFGAGTKLELKHHHHHH(SEQ ID No.37)
(3)OC:VL-SGGGGS-VH-GGGGSDIK-OKT
核酸序列如SEQ ID No.38所示：
ATGGATTTTCAGGTGCAGATTTTCAGCTTCCTGCTAATCAGTGCCTCAGTCATAATGTCCAGAGGAGATATCCAGATGACCCAGTCCCCGAGCTCCCTGTCCGCCTCTGTGGGCGATAGGGTCACCATCACCTGCCGTGCCAGTCAGGATGTGAATACTGCTGTAGCCTGGTATCAACAGAAACCAGGAAAAGCTCCGAAACTACTGATTTACTCGGCATCCTTCCTTTATTCTGGAGTCCCTTCTCGCTTCTCTGGATCTAGATCTGGGACGGATTTCACTCTGACCATCAGCAGTCTGCAGCCGGAAGACTTCGCAACTTATTACTGTCAGCAACATTATACTACTCCTCCCACGTTCGGACAGGGTACCAAGGTGGAGATCAAAtcggggggcgggggaagtGAGGTTCAGCTGGTGGAGTCTGGCGGTGGCCTGGTGCAGCCAGGGGGCTCACTCCGTTTGTCCTGTGCAGCTTCTGGCTTCAACATTAAAGACACCTATATACACTGGGTGCGTCAGGCCCCGGGTAAGGGCCTGGAATGGGTTGCAAGGATTTATCCTACGAATGGTTATACTAGATATGCCGATAGCGTCAAGGGCCGTTTCACTATAAGCGCAGACACATCCAAAAACACAGCCTACCTGCAGATGAACAGCCTGCGTGCTGAGGACACTGCCGTCTATTATTGTTCTAGATGGGGAGGGGACGGCTTCTATGCTATGGACGTGTGGGGTCAAGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCGggaggtggtggatccgatatcaaaCTGCAGCAGTCAGGGGCTGAACTGGCAAGACCTGGGGCCTCAGTGAAGATGTCCTGCAAGACTTCTGGCTACACCTTTACTAGGTACACGATGCACTGGGTAAAACAGAGGCCTGGACAGGGTCTGGAATGGATTGGATACATTAATCCTAGCCGTGGTTATACTAATTACAATCAGAAGTTCAAGGACAAGGCCACATTGACTACAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTACATGCAACTGAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCAGTCTATTACTGTGCAAGATATTATGATGATCATTACTGCCTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCAgtcgaaggtggaagtggaggttctggtggaagtggaggttcaggtggagtcgacgacgccgccattcagCTGACCCAGTCTCCAGCAATCATGTCTGCATCTCCAGGGGAGAAGGTCACCATGACCTGCAGAGCCAGTTCAAGTGTAAGTTACATGAACTGGTACCAGCAGAAGTCAGGCACCTCCCCCAAAAGATGGATTTATGACACATCCAAAGTGGCTTCTGGAGTCCCTTATCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACCTCATACTCTCTCACAATCAGCAGCATGGAGGCTGAAGATGCTGCCACTTATTACTGCCAACAGTGGAGTAGTAACCCGCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAACATCATCACCATCATCATTAATAA(SEQ ID No.38)其中，第1-1533位为核苷酸编码序列，最后六个碱基TAATAA为终止密码子
蛋白全长序列如SEQ ID No.39所示：
MDFQVQIFSFLLISASVIMSRGDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDVWGQGTLVTVSSGGGGSDIKLQQSGAELARPGASVKMSCKTSGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSSVEGGSGGSGGSGGSGGVDDAAIQLTQSPAIMSASPGEKVTMTCRASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKVASGVPYRFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSNPLTFGAGTKLELKHHHHHH(SEQ ID No.39)
(4)NA:VL-(G4S)3-VH-VTVSSGGGGS-OKT
核酸序列如SEQ ID No.40所示：
ATGGATTTTCAGGTGCAGATTTTCAGCTTCCTGCTAATCAGTGCCTCAGTCATAATGTCCAGAGGAGATATCCAGATGACCCAGTCCCCGAGCTCCCTGTCCGCCTCTGTGGGCGATAGGGTCACCATCACCTGCCGTGCCAGTCAGGATGTGAATACTGCTGTAGCCTGGTATCAACAGAAACCAGGAAAAGCTCCGAAACTACTGATTTACTCGGCATCCTTCCTTTATTCTGGAGTCCCTTCTCGCTTCTCTGGATCTAGATCTGGGACGGATTTCACTCTGACCATCAGCAGTCTGCAGCCGGAAGACTTCGCAACTTATTACTGTCAGCAACATTATACTACTCCTCCCACGTTCGGACAGGGTACCAAGGTGGAGATCAAAggcggagggggaagtggcgggggtgggtccggcggcggcggctcgGAGGTTCAGCTGGTGGAGTCTGGCGGTGGCCTGGTGCAGCCAGGGGGCTCACTCCGTTTGTCCTGTGCAGCTTCTGGCTTCAACATTAAAGACACCTATATACACTGGGTGCGTCAGGCCCCGGGTAAGGGCCTGGAATGGGTTGCAAGGATTTATCCTACGAATGGTTATACTAGATATGCCGATAGCGTCAAGGGCCGTTTCACTATAAGCGCAGACACATCCAAAAACACAGCCTACCTGCAGATGAACAGCCTGCGTGCTGAGGACACTGCCGTCTATTATTGTTCTAGATGGGGAGGGGACGGCTTCTATGCTATGGACGTGTGGGGTCAAGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCGgtgacggtgtcgtcggggggcggggggagtCTGCAGCAGTCAGGGGCTGAACTGGCAAGACCTGGGGCCTCAGTGAAGATGTCCTGCAAGACTTCTGGCTACACCTTTACTAGGTACACGATGCACTGGGTAAAACAGAGGCCTGGACAGGGTCTGGAATGGATTGGATACATTAATCCTAGCCGTGGTTATACTAATTACAATCAGAAGTTCAAGGACAAGGCCACATTGACTACAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTACATGCAACTGAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCAGTCTATTACTGTGCAAGATATTATGATGATCATTACTGCCTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCAgtcgaaggtggaagtggaggttctggtggaagtggaggttcaggtggagtcgacgacgccgccattcagCTGACCCAGTCTCCAGCAATCATGTCTGCATCTCCAGGGGAGAAGGTCACCATGACCTGCAGAGCCAGTTCAAGTGTAAGTTACATGAACTGGTACCAGCAGAAGTCAGGCACCTCCCCCAAAAGATGGATTTATGACACATCCAAAGTGGCTTCTGGAGTCCCTTATCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACCTCATACTCTCTCACAATCAGCAGCATGGAGGCTGAAGATGCTGCCACTTATTACTGCCAACAGTGGAGTAGTAACCCGCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAACATCATCACCATCATCATTAATAA(SEQ ID No.40)其中，第1-1566位为核苷酸编码序列，最后六个碱基TAATAA为终止密码子
蛋白全长序列如SEQ ID No.41所示：
MDFQVQIFSFLLISASVIMSRGDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDVWGQGTLVTVSSVTVSSGGGGSLQQSGAELARPGASVKMSCKTSGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSSVEGGSGGSGGSGGSGGVDDAAIQLTQSPAIMSASPGEKVTMTCRASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKVASGVPYRFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSNPLTFGAGTKLELKHHHHHH(SEQ ID No.41)
(5)NB:VL-(G4S)2-VH-VTVSSGGGGS—OKT
核酸序列如SEQ ID No.42所示：
ATGGATTTTCAGGTGCAGATTTTCAGCTTCCTGCTAATCAGTGCCTCAGTCATAATGTCCAGAGGAGATATCCAGATGACCCAGTCCCCGAGCTCCCTGTCCGCCTCTGTGGGCGATAGGGTCACCATCACCTGCCGTGCCAGTCAGGATGTGAATACTGCTGTAGCCTGGTATCAACAGAAACCAGGAAAAGCTCCGAAACTACTGATTTACTCGGCATCCTTCCTTTATTCTGGAGTCCCTTCTCGCTTCTCTGGATCTAGATCTGGGACGGATTTCACTCTGACCATCAGCAGTCTGCAGCCGGAAGACTTCGCAACTTATTACTGTCAGCAACATTATACTACTCCTCCCACGTTCGGACAGGGTACCAAGGTGGAGATCAAAggtggtggtggttctggcggcggcggctccGAGGTTCAGCTGGTGGAGTCTGGCGGTGGCCTGGTGCAGCCAGGGGGCTCACTCCGTTTGTCCTGTGCAGCTTCTGGCTTCAACATTAAAGACACCTATATACACTGGGTGCGTCAGGCCCCGGGTAAGGGCCTGGAATGGGTTGCAAGGATTTATCCTACGAATGGTTATACTAGATATGCCGATAGCGTCAAGGGCCGTTTCACTATAAGCGCAGACACATCCAAAAACACAGCCTACCTGCAGATGAACAGCCTGCGTGCTGAGGACACTGCCGTCTATTATTGTTCTAGATGGGGAGGGGACGGCTTCTATGCTATGGACGTGTGGGGTCAAGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCGgtgacggtgtcgtcggggggcggggggagtCTGCAGCAGTCAGGGGCTGAACTGGCAAGACCTGGGGCCTCAGTGAAGATGTCCTGCAAGACTTCTGGCTACACCTTTACTAGGTACACGATGCACTGGGTAAAACAGAGGCCTGGACAGGGTCTGGAATGGATTGGATACATTAATCCTAGCCGTGGTTATACTAATTACAATCAGAAGTTCAAGGACAAGGCCACATTGACTACAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTACATGCAACTGAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCAGTCTATTACTGTGCAAGATATTATGATGATCATTACTGCCTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCAgtcgaaggtggaagtggaggttctggtggaagtggaggttcaggtggagtcgacgacgccgccattcagCTGACCCAGTCTCCAGCAATCATGTCTGCATCTCCAGGGGAGAAGGTCACCATGACCTGCAGAGCCAGTTCAAGTGTAAGTTACATGAACTGGTACCAGCAGAAGTCAGGCACCTCCCCCAAAAGATGGATTTATGACACATCCAAAGTGGCTTCTGGAGTCCCTTATCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACCTCATACTCTCTCACAATCAGCAGCATGGAGGCTGAAGATGCTGCCACTTATTACTGCCAACAGTGGAGTAGTAACCCGCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAACATCATCACCATCATCATTAATAA(SEQ ID No.42)其中，第1-1551位为核苷酸编码序列，最后六个碱基TAATAA为终止密码子
蛋白全长序列如SEQ ID No.43所示：
MDFQVQIFSFLLISASVIMSRGDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDVWGQGTLVTVSSVTVSSGGGGSLQQSGAELARPGASVKMSCKTSGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSSVEGGSGGSGGSGGSGGVDDAAIQLTQSPAIMSASPGEKVTMTCRASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKVASGVPYRFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSNPLTFGAGTKLELKHHHHHH(SEQ ID No.43)
(6)NC:VL-SGGGGS-VH-VTVSSGGGGS-OKT
核酸序列如SEQ ID No.44所示：
ATGGATTTTCAGGTGCAGATTTTCAGCTTCCTGCTAATCAGTGCCTCAGTCATAATGTCCAGAGGAGATATCCAGATGACCCAGTCCCCGAGCTCCCTGTCCGCCTCTGTGGGCGATAGGGTCACCATCACCTGCCGTGCCAGTCAGGATGTGAATACTGCTGTAGCCTGGTATCAACAGAAACCAGGAAAAGCTCCGAAACTACTGATTTACTCGGCATCCTTCCTTTATTCTGGAGTCCCTTCTCGCTTCTCTGGATCTAGATCTGGGACGGATTTCACTCTGACCATCAGCAGTCTGCAGCCGGAAGACTTCGCAACTTATTACTGTCAGCAACATTATACTACTCCTCCCACGTTCGGACAGGGTACCAAGGTGGAGATCAAAtcggggggcgggggaagtGAGGTTCAGCTGGTGGAGTCTGGCGGTGGCCTGGTGCAGCCAGGGGGCTCACTCCGTTTGTCCTGTGCAGCTTCTGGCTTCAACATTAAAGACACCTATATACACTGGGTGCGTCAGGCCCCGGGTAAGGGCCTGGAATGGGTTGCAAGGATTTATCCTACGAATGGTTATACTAGATATGCCGATAGCGTCAAGGGCCGTTTCACTATAAGCGCAGACACATCCAAAAACACAGCCTACCTGCAGATGAACAGCCTGCGTGCTGAGGACACTGCCGTCTATTATTGTTCTAGATGGGGAGGGGACGGCTTCTATGCTATGGACGTGTGGGGTCAAGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCGgtgacggtgtcgtcggggggcggggggagtCTGCAGCAGTCAGGGGCTGAACTGGCAAGACCTGGGGCCTCAGTGAAGATGTCCTGCAAGACTTCTGGCTACACCTTTACTAGGTACACGATGCACTGGGTAAAACAGAGGCCTGGACAGGGTCTGGAATGGATTGGATACATTAATCCTAGCCGTGGTTATACTAATTACAATCAGAAGTTCAAGGACAAGGCCACATTGACTACAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTACATGCAACTGAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCAGTCTATTACTGTGCAAGATATTATGATGATCATTACTGCCTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCAgtcgaaggtggaagtggaggttctggtggaagtggaggttcaggtggagtcgacgacgccgccattcagCTGACCCAGTCTCCAGCAATCATGTCTGCATCTCCAGGGGAGAAGGTCACCATGACCTGCAGAGCCAGTTCAAGTGTAAGTTACATGAACTGGTACCAGCAGAAGTCAGGCACCTCCCCCAAAAGATGGATTTATGACACATCCAAAGTGGCTTCTGGAGTCCCTTATCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACCTCATACTCTCTCACAATCAGCAGCATGGAGGCTGAAGATGCTGCCACTTATTACTGCCAACAGTGGAGTAGTAACCCGCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAACATCATCACCATCATCATTAATAA(SEQ ID No.44)其中，第1-1539位为核苷酸编码序列，最后六个碱基TAATAA为终止密码子
蛋白全长序列如SEQ ID No.45所示：
MDFQVQIFSFLLISASVIMSRGDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDVWGQGTLVTVSSVTVSSGGGGSLQQSGAELARPGASVKMSCKTSGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSSVEGGSGGSGGSGGSGGVDDAAIQLTQSPAIMSASPGEKVTMTCRASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKVASGVPYRFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSNPLTFGAGTKLELKHHHHHH(SEQ ID No.45)
质粒构建、制备mRNA、T细胞制备、RNA电转T细胞的方法均与实施例1中相同。
对上述六种结构的单链双特异性抗体以及VH-VL-OKT和VL-VH-OKT进行分析后发现，更改linker后在不影响细胞活力的情况下，使其特异性杀伤能力进一步上升，实验结果如图8-11所示。图11中各数据点数值如表1所示。
表1
注：表中数字为平均数±标准误
实施例2中细胞活性、CD107a膜转位、分泌IFN-γ能力、杀伤实验的相关实验方法亦与实施例1中相同。
综上所述，本发明有效克服了现有技术中的种种缺点而具高度产业利用价值。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。
Claims (6)
1.一种重组的宿主细胞，所述宿主细胞为T细胞，所述重组的宿主细胞含有构建体，所述构建体由编码如下所述的双特异性抗体的多核苷酸插入到表达载体的多克隆位点构建而成；
或者，所述重组的宿主细胞被如下所述的双特异性抗体RNA基因电转入；
所述双特异性抗体氨基酸序列如SEQ ID No. 31、33、35、37、39、41、43、45所示。
2.如权利要求1所述的一种重组的宿主细胞，其特征在于，所述重组的宿主细胞由所述构建体转染到宿主细胞构建而成。
3.如权利要求1-2任一权利要求所述的重组的宿主细胞在制备或筛选治疗Her2阳性肿瘤药物上的用途。
4.如权利要求3所述的用途，其特征在于，所述Her2阳性肿瘤的细胞选自人胃癌细胞株N87、人卵巢癌细胞株SKOV3、人乳腺癌细胞株SKBR3、BT474中的一种或多种的组合。
5.如权利要求3所述的用途，其特征在于，所述重组的宿主细胞在制备或筛选治疗Her2阳性肿瘤药物上的用途具体为携带所述双特异性抗体基因的T细胞在制备或筛选过继转输治疗Her2阳性肿瘤药物上的用途。
6.一种药物组合物，包括治疗有效量的权利要求1-2任一权利要求所述的重组的宿主细胞。
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