KR20100016199A - 종간 특이적 이중특이적인 결합제들 - Google Patents

Abstract

본 발명은 인간과 침팬지가 아닌 영장류 CD3 입실론 사슬의 에피토프에 결합할 수 있는 제1 인간 결합 도메인과, 인간 그리고/또는 침팬지가 아닌 영장류의 EGFR, Her2/neu 또는 IgE에 결합할 수 있는 제2 결합 도메인을 포함하는 폴리펩티드에 관한 것이며, 또한 상기한 폴리펩티드의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명은 더욱이 폴리펩티드를 암호화하는 핵산들과, 그와 동일한 것을 포함하는 벡터들(vectors) 그리고 벡터를 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 상기 폴리펩티드를 포함하는 약학적 조성물과 상기 폴리펩티드의 의학적 사용법을 제공한다.

폴리펩티드, 결합 도메인, 핵산, 벡터, 숙주세포

Description

종간 특이적 이중특이적인 결합제들{CROSS-SPECIES-SPECIFIC BISPECIFIC BINDERS}

본 발명은 인간과 침팬지가 아닌 영장류 CD3ε(입실론)의 에피토프(epitope)에 결합할 수 있는 제1 인간 결합 도메인(human binding domain)과 인간 그리고/또는 침팬지가 아닌 영장류의 EGFR, Her2/neu 또는 IgE에 결합할 수 있는 제2 결합 도메인을 포함하는 폴리펩티드에 관한 것이며, 또한 상기한 폴리펩티드의 제조방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 폴리펩티드를 암호화하는 핵산들과, 그와 동일한 것을 포함하는 벡터들 그리고 벡터를 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 상기 폴리펩티드를 포함하는 약학적 조성물과 그 폴리펩티드의 의학적 사용법을 제공한다.

T 세포 인식은 펩티드 MHC(pMHC)의 펩티드 장착 분자들과 상호작용을 하는 클론의 전형대로 분포되어 있는 알파 베타 그리고 감마 T 세포 수용체들(T cell receptors)(TcR)에 의해 매개된다(Davis & Bjorkman, Nature 334 (1988), 395-402). TcR의 항원 특이적 사슬들은 신호전달 도메인들을 가지고 있진 않지만, 그 대신에 보존된 멀티서브유니트 신호전달 장치 CD3에 결합된다(Call, Cell 111 (2002), 967- 979, Alarcon, Immunol. Rev. 191 (2003), 38-46, Malissen Immunol. Rev. 191 (2003), 7-27). TcR 라이게이션(결찰, ligation)이 신호전달 장치로 직접 소통되는 기전은 T 세포 생물학에서 근본적인 문제점으로 남아있다(Alarcon, loc. cit.; Davis, Cell 1 10 (2002), 285-287). 지속되는 T 세포 반응들이 면역학적 시냅스(immunological synapse)에서의 공수용체(coreceptor)의 교합(engagement), TcR 올리고머화(oligomerization), 그리고 TcR-pMHC 복합체들의 고차 배열과 관련이 있다는 사실은 명백해 보인다(Davis & van der Merwe, Curr. Biol. 11 (2001), R289-R291, Davis, Nat. Immunol. 4 (2003), 217- 224). 그러나 너무 조기에 일어난 TcR 신호전달은 이러한 반응들이 없는 경우에도 발생하고 CD3 입실론에서 리간드에 의해 유도된 구조적인 변화가 수반될 수도 있다(Alarcon, loc. cit., Davis (2002), loc. cit., Gil, J. Biol. Chem. 276 (2001), 11174-11179, Gil, Cell 109 (2002), 901 -912). 신호 복합체의 입실론, 감마, 델타 그리고 제타 서브유니트들은 서로 결합하여 CD3 입실론-감마 이성질중합체(heterodimer), CD3 입실론-델타 이성질중합체, 그리고 CD3 제타-제타 이성질중합체를 형성한다(Call, loc. cit.). CD3 분자들이 알파 베타 TcR과 정상적인 T 세포 발달의 적절한 세포 표면 발현을 위해 중요하다는 것이 다양한 연구에서 밝혀져 왔다(Berkhout, J. Biol. Chem. 263 (1988), 8528-8536, Wang, J. Exp. Med. 188 (1998), 1375-1380, Kappes, Curr. Opin. Immunol. 7 (1995), 441-447). 생쥐의 CD3 입실론 감마 이성질중합체의 외부유래 도메인(ectodomain)의 단편들의 용액 구조는 입실론 감마 서브유니트들이 양쪽 모두 서로 결합하여 정상적이지 않은 좌우로의 중합체 배열을 형성하는 C2-set Ig 도메인들이라는것을 보여 주었다(Sun, Cell 105 (2001), 913- 923). 시스테 인(cysteine)이 풍부한 줄기가 CD3 중합체화를 촉진하는 중요한 역할을 하는 것으로 보여짐에도 불구하고(Su, loc. cit, Borroto, J. Biol. Chem. 273 (1998), 12807-12816), CD3 입실론과 CD3 감마의 세포외 도메인들의 의한 상호작용은 TcR 베타와 이 단백질들을 집합시키기 위해서는 충분하다(Manolios, Eur. J. Immunol. 24 (1994), 84-92, Manolios & Li, Immunol. Cell Biol. 73 (1995), 532-536). 비록 여전히 논쟁이 되고 있다 하더라도, 지배적인 TcR의 화학양론은 필시 하나의 알파 베타 TcR, 하나의 CD3 입실론 감마 이성질중합체, 하나의 CD3 입실론 델타 이성질중합체와 하나의 CD3 제타 제타 동질중합체(homodimer)로 구성될 것이다(Call, loc. cit.). 면역반응에서 인간의 CD3 입실론 감마 이성질중합체의 중심적인 역할이 밝혀진 후, 치료용 항체 OKT3에 결합된 상기 복합체의 결정 구조는 최근에 밝혀지게 되었다(Kjer-Nielsen, PNAS 101, (2004), 7675-7680).

수많은 치료용 전략들이 TcR 신호전달을 표적화함에 의해서 T 세포 면역을 조절하는데, 특히 특별히 면역억제요법에서 임상적으로 널리 사용되는 항-인간 CD3 단일 클론 항체(mAbs)를 조절한다. CD3-특이적 생쥐 mAb OKT3는 인간에게 사용하기 위해 라이센스를 받은 최초의 mAb였고 (Sgro, Toxicology 105 (1995), 23-29), 이식술(transplantation)(Chatenoud, Clin. Transplant 7 (1993), 422-430, Chatenoud, Nat. Rev. Immunol. 3 (2003), 123-132, Kumar, Transplant. Proc. 30 (1998), 1351-1352), 제1 형 당뇨병(Chatenoud (2003), loc. cit.) 그리고 건선(psoriasis)(Utset, J. Rheumatol. 29 (2002), 1907-1913)에서 면역억제제로서 임상적으로 널리 사용되고 있다 . 더욱이, 항-CD3 mAb들은 부분적인 T 세포 신호전 달과 클론 무반응 상태(clonal anergy)를 유도할 수 있다(Smith, J. Exp. Med. 185 (1997), 1413-1422). OKT3는 강력한 T 세포 살해자(T cell killer)(Wong, Transplantation 50 (1990), 683-9)로서 뿐만 아니라 강력한 T 세포 미토젠(mitogen)(Van Wauve, J. Immunol. 124 (1980), 2708-18)으로서 문헌에 기술되어 왔다. OKT3는 시간 의존적 방식으로 이런 작용들 모두를 나타낸다; 시토카인(cytokine) 방출을 일으키게 되는 T 세포의 조기 활성화 다음에, 또 다른 OKT3의 투여 시점에서 모든 알려진 T 세포 기능들을 차후에 차단한다. OKT3가 동종이식의 조직 거부 반응의 감소 또는 심지어 반응 차단을 위한 치료법들에서 면역억제제와 같은 광범위한 적용을 알아내게 된 것은 상기한 차후의 T 세포 기능의 차단에 기인한다. OKT3는 대체로 급성 거부반응에서 주요한 역할을 수행하는 모든 T 세포들의 기능을 차단함에 의해서 동종이식 조직 거부반응을 역전시킨다. OKT3는, T 세포들의 항원 인식 구조(TCR)와 결합되어 있고 신호의 전달을 위해 필수적인, 인간 T 세포의 세포막에서 CD3 복합체와 반응하여 그 기능을 차단한다. OKT3에 의해 결합되어 있는 TCR/CD3의 서브유니트는 여러 연구들의 주제가 되어왔다. 그렇지만 어떤 증거들은 TCR/CD3 복합체의 입실론-서브유니트에 대한 OKT3의 특이성을 지적하여 왔다(Tunnacliffe, Int. Immunol. 1 (1989), 546-50; Kjer-Nielsen, PNAS 101, (2004), 7675-7680). 또 다른 증거는 TCR/CD3 복합체의 OKT3 결합이 이 복합체의 다른 서브유니트들이 존재하는 것을 필요로 함을 보여주었다(Salmeron, J. Immunol. 147 (1991), 3047-52).

CD3 분자에 대해 특이적인 또 다른 잘 알려진 항체들이 Tunnacliffe, Int. Immunol. 1 (1989), 546-50에 나열되어 있다. 위에서 지시된 바와 같이, 그러한 CD3 특이 항체들은 림포카인(lymphokine) 생산(Von Wussow, J. Immunol. 127 (1981), 1197; Palacious, J. Immunol. 128 (1982), 337), 증식 (Van Wauve, J. Immunol. 124 (1980), 2708-18) 그리고 억제자-T 세포 유도(Kunicka, in "Lymphocyte Typing Ⅱ" 1 (1986), 223)와 같은 다양한 T 세포 반응들을 유도할 수 있다. 즉, 실험적 조건들에 의존적으로서, CD3 특이적 단일클론 항체(monoclonal antibody)는 세포독성을 저해할 수도 아니면 유도할 수도 있다(Leewenberg, J. Immunol. 134 (1985), 3770; Phillips, J. Immunol. 136 (1986) 1579; Platsoucas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78 (1981), 4500; Itoh, Cell. Immunol. 108 (1987), 283-96; Mentzer, J. Immunol. 135 (1985), 34; Landegren, J. Exp. Med. 155 (1982), 1579; Choi (2001), Eur. J. Immunol. 31, 94-106; Xu (2000), Cell Immunol. 200, 16-26; Kimball (1995), Transpl. Immunol. 3, 212-221).

비록 이 기술 영역에서 기술된 많은 CD3 항체들이 CD3 복합체의 CD3 입실론 서브유니트를 인식하는 것이 보고되어 왔으나, 그들 대부분이 입체적 구조의 에피토프들에 실제로 결합하고, 그에 의해, TCR의 선천적 컨텍스트(native context)에서 CD3 입실론을 인식하기만 한다. 입체적 구조의 에피토프들은 제1의 서열에서 분리된 두 개 또는 그 이상의 별개의 아미노산 잔기들의 존재에 의해 그 특징이 결정되지만, 폴리펩티드가 선천적 단백질/항체로 접혀 들어가 있을 때 분자의 표면상에 함께 나타나게 된다(SeIa, (1969) Science 166, 1365 그리고 Laver, (1990) Cell 61, 553-6). 이 기술에서 기술된 CD3 입실론 항체들에 의해 결합된 입체적 구조의 에피토프들은 두 개의 그룹으로 분리될 수 있다. 대그룹에서는 상기 에피토프들이, 예를 들면, CD3 입실론 사슬 그리고 CD3 감마 또는 CD3 델타 사슬 중에서 두 개의 CD3 서브유니트에 의해 형성되고 있다. 예를 들어, 가장 널리 사용되는 CD3 입실론 단일클론 항체들 OKT3, WT31, UCHT1, 7D6 그리고 Leu-4가 CD3-입실론 사슬을 이용하여 단일로 트랜스펙션된(transfected) 세포들에 결합하기 않았다는 사실이 몇몇의 연구들에서 밝혀졌다. 그러나 이 항체들은 CD3 입실론 사슬 그리고 CD3 감마 또는 CD3 델타 사슬 중에서 하나의 조합과 이중으로 트랜스펙션된 세포들을 착색시켰다(Tunnacliffe, loc. cit.; Law, Int. Immunol. 14 (2002), 389-400; Salmeron, J. Immunol. 147 (1991), 3047-52; Coulie, Eur. J. Immunol. 21 (1991), 1703-9). 두 번째 소그룹에서는, 입체적 구조의 에피토프들이 CD3 입실론 서브유니트 자체 내에서 형성되고 있다. 이 그룹의 한 구성원은, 예를 들어, 변성된 CD3 입실론에 대항해 성장되었던 mAb APA 1/1에 대한 것이다(Risueno, Blood 106 (2005), 601-8). 모두 종합해 보면, 이 기술에서 기술된 대부분의 CD3 입실론 항체들은 CD3의 두 개 또는 그 이상의 서브유니트들 상에 자리하는 입체적 구조의 에피토프들을 인식한다. 그 결과, 이 에피토프들의 3차원적 구조를 형성하고 있는 별개의 아미노산 잔기들은 CD3 입실론 서브유니트 자체에, 또는 CD3 입실론 서브유니트 그리고 CD3 감마 또는 CD3 델타와 같은 그외 다른 CD3 서브유니트들 위에 자리할 수 있다.

CD3 항체들에 관련된 또 다른 문제점은 많은 CD3 항체들이 종간 특이적인 것으로 밝혀져 왔다는 것이다. 항-CD3 단일클론 항체들은 - 그외 다른 단일클론 항체들에게는 일반적으로 딱 들어맞는 - 그 항체들의 표적 분자들의 높은 특이성을 보 이는 인식에 의해서 기능한다. 그 항체들은 그 항체들의 표적 CD3 분자 상에서 단일 자리, 또는 에피토프만을 인식한다. 예를 들면, 가장 광범위하게 사용되고 있고 CD3 복합체에 대해 특이성을 잘 나타내는 가장 특징적인 단일클론 항체들 중 하나가 OKT-3이다. 이 항체는 침팬지의 CD3와 반응하지만 짧은꼬리원숭이(macaques)처럼 그외 다른 영장류의 CD3 동족류(homolog), 또는 개의 CD3와는 반응하지 않는다(Sandusky et al., J. Med. Primatol. 15 (1986), 441-451). 항-CD3 단일클론 항체 UCHT-1도 또한 침팬지로부터의 CD3와는 반응하지만 짧은꼬리원숭이로부터의 CD3와는 반응하지 않는다(자체의 자료). 이에 반해서, 짧은꼬리원숭이의 항체를 인식하지만, 인간의 그에 상응되는 부분들에서는 반응하지 않는 단일클론 항체들의 예들도 또한 있다, 이 그룹의 한 예가 짧은꼬리원숭이로부터의 CD3에 직접 지시되는 단일클론 항체 FN-18이다(Uda et al., J. Med. Primatol. 30 (2001), 141-147). 흥미롭게도, 약 12%의 사이노몰거스(cynomolgus) 원숭이들의 말초 임파구들이 짧은꼬리원숭이에 있는 CD3 항체의 다형성(polymorphism)에 기인하여 항-rhesus 원숭이의 CD3 단일클론 항체(FN-18)와의 반응성이 결핍된다는 사실이 밝혀졌다. 우다 등(Uda et al.)은 FN-18 항체들과 반응성이 있으면서 동물에서 유래한 CD3와 비교하여 FN-18 항체들과 반응성이 없는 사이노몰거스(cynomolgus) 원숭이들의 CD3 서열에서 두 개의 아미노산들의 치환을 기술하였다(Uda et al., J Med Primatol. 32 (2003), 105-10; Uda et al., J Med Primatol. 33 (2004), 34-7).

그러나 이러한 식별 가능한 능력, 예를 들어, CD3 단일클론 항체들과 그들의 단편들에 대하여 고유한 종의 특이성은 인간의 질병 치료를 위한 치료용 제제들로 서 그것들을 발전시키는데 주요한 장애요소이다. 시판 허가를 얻기 위해서 새 후보가 될 만한 약제는 엄격한 실험을 통과해야만 한다. 이 실험은 전임상 단계와 임상 단계들로 나누어질 수 있다: 후자가 - 또 다시 일반적으로 알려진 임상 단계 I, Il 그리고 III로 나누어진다 - 인간 환자들에서 수행되는 반면에, 전자는 동물들에서 수행된다. 전임상 실험의 목적은 후보가 되는 약제가 요구되는 작용을 가지는 것과 가장 중요하게는 안전하다는 것을 증명하는 것이다. 동물들에서의 안전성과 약제 후보의 가능한 유효성(effectiveness)이 전임상 단계의 실험에서 정립되었을 때에만 이 약제 후보가 인간을 피검자로 한 임상 실험이 가능하도록 각각의 규제 당국에 의해 승인될 것이다. 후보약제들은 다음의 3가지 방법들로 동물에서의 안전성에 대하여 실험될 수 있다, (i) 관련성이 있는 종들, 예를 들어, 약제 후보들이 그 종들에서 종간 상동유전자 항원들(ortholog antigens)을 인식할 수 있는 종들에서, (ii) 인간의 항원들을 함유하는 트랜스펙션된 동물들(transgenic animals)에서 그리고 (iii) 동물에 존재하는 종간 상동유전자 항원들을 결합시킬 수 있는 약제 후보에 대한 대리물(surrogate)의 사용하는 방법. 트랜스펙션된 동물들의 한계점들은 이 기술이 설치류에 전형적으로 제한된다는 것이다. 설치류와 인간 사이에는 생리학적으로 현저한 차이점이 있고 안전성의 결과가 인간에게는 쉽게 추정되지 않는다. 약제 후보에 대한 대리물의 한계점은 실질적인 약제 후보에 비교하여 내용물의 조성이 다르다는 것이고 종종 사용되는 동물들도 위에서 논의된 바와 같은 한계점을 지닌 설치류이다. 그러므로, 설치류에서 발생된 전임상 단계의 자료는 약제 후보에 관하여는 제한적인 예측력을 가진다. 안전성 실험에 대한 선택에의 접근은 관 련성 있는 종들, 바람직하게는 보다 하등한 영장류를 사용하는 것이다. 이제 이 기술 영역에서 기술된 것으로 인간에서 치료적 개입를 위해 적합한 CD3 결합 분자들의 한계점은 관련성 있는 종들이 보다 고등한 영장류, 특정하게는 침팬지이라는 것이다. 침팬지들은 위험에 처한 종들로 여겨지고 있고 그들의 인간과 유사한 속성 때문에 약제 안전성 실험을 위한 그러한 동물들의 사용이 유럽에서는 금지되었고 그외 다른 곳에서도 매우 제한되어 있다.

본 발명은 인간과 침팬지가 아닌 영장류 CD3 입실론 사슬의 에피토프에 결합할 수 있는, 바람직하게는 인간의, 제1 결합 도메인과, 인간 그리고/또는 침팬지가 아닌 영장류의 EGFR, Her2/neu 또는 IgE에 결합할 수 있는 제2 결합 도메인을 포함하는 폴리펩티드에 관한 것이고, 여기에서 상기 에피토프는 서열번호: 2, 4, 6, 또는 8로 이루어진 그룹에 포함되는 아미노산 서열의 일부분이다. 서열번호: 2, 4, 6 그리고 8에서 보여지는 서열들과 그것들의 단편들이 컨텍스트에서 독립적인(context-independent) CD3 에피토프들이다.

본 발명의 이점은 인간과 침팬지가 아닌 영장류 CD3 입실론사슬에 종간 교차 특이성을 나타내는, 바람직하게는 인간의 결합 도메인을 포함하는 폴리펩티드의 제공이고, 상기 폴리펩티드는 영장류들에서의, 바람직하게는 인간의, 이들 결합 도메인들의 안전성, 활동도 그리고/또는 약제동력학적 프로파일의 전임상 단계의 평가를 위해서 그리고- 동일한 형태로서 - 인간에게서 약제로서 모두 사용될 수 있다. 상기한 것과 동일한 분자들은 인간을 피검자로 한 임상학적 연구들에서 뿐만 아니라 전임상 단계의 동물 연구들에서도 사용될 수 있다. 이 사실들로 종 특이성을 가진 대리 분자들과 비교해서 동물 연구들에서 거의 필적할 만한 결과들과 매우 증진된 예측력이 나오게 되었다. 본 발명에서는, CD3 입실론의 세포외 도메인의 N-말단 1-27 아미노산 잔기 폴리펩티드 단편이 놀랍게도 확인되었는데 - 이 기술에서 설명된 CD3 입실론의 모든 그외 다른 알려져 있는 에피토프들에는 대조적으로 - 그 단편은 CD3 복합체에서 선천적 환경에서 가져온 그 3차원적 구조의 완전성을 유지한다(그리고 EpCAM 또는 면역글로불린 Fc 부분과 같은 이종의(heterogeneous) 아미노산 서열에 융합되었다).

본 발명에서 제공된 CD3 에피토프의 컨텍스트-독립성(context-independence)은 CD3 입실론의 첫번째 27 N-말단 아미노산들 또는 27 아미노산 뻗침의 기능적 단편들에 상응한다. CD3 에피토프와 관련하여 여기서 사용되는 구문 "컨텍스트에서 독립성을 띠는(context-independent)"은 여기서 기술된 독창적인 결합 분자/항체 분자들의 결합이 항원 결정자 또는 에피토프를 에워 싸고 있는 공간 구조, 서열, 또는 구조를 변화시키거나 변형하는 결과에 이르지 않게 한다는 것을 의미한다. 이와는 대조적으로, 기존의 CD3 결합 분자에 의해 인식되는 CD3 에피토프는 (예를 들면, WO 99/54440 또는 WO 04/106380에 설명된 것처럼) 컨텍스트에서 독립적인 에피토프의 N-말단 1-27 아미노산들에까지 CD3 입실론 사슬 C-말단 상에 위치하며, CD3 에피토프는 나머지 입실론 사슬 내에 심어져서 CD3 감마 사슬이나 아니면 델타 사슬과 입실론 사슬의 이성이합체화에 의해 제위치에 자리하게 될 때에만 올바른 입체구조가 된다.

컨텍스트에서 독립적인 CD3 에피토프에 대항하여 여기서 제공되고 생성된(그리고 지시된), 이중특이 결합 분자의 일부분으로서의 항-CD3 결합 분자들은 T 세포 재분포에 관련해서는 놀라운 임상학적 향상을 제공하고, 그로 인하여 보다 유리한 안전성 프로파일을 제공한다. 이론에 속박됨이 없이, CD3 에피토프는 컨텍스트에서 독립성을 띠고 있으므로, 나머지 CD3 복합체 상에 큰 영향을 미치지 않고서 자율적인 자급자족의 서브도메인을 형성하면서, 여기서 제공되는 CD3 결합 분자들은, 컨텍스트에 의존적인 CD3 에피토프들을 인식하는 기존의 CD3 결합 분자들보다 CD3 입체 구조에서 다른 자리(allosteric) 입체성 변화를 더 적게 유도한다(WO 99/54440에서 제공된 분자들과 같이).

이중특이성의 결합 분자의 일부분으로서 본 발명의 CD3 결합 분자들에서 CD3 에피토프의 컨텍스트에서의 독립성은, 컨텍스트에서 의존적인 CD3 에피토프들을 인식하는 이 기술에서 잘 알려진 기존의 CD3 결합 분자들과 비교해서, 본 발명의 CD3 결합 분자들의 보다 나은 안전성 프로파일이라는 결과를 가져오는 본 발명의 CD3 결합 분자들을 사용한 치료의 초기 단계 기간 중의 보다 적은 T 세포 재분포와 관련되어 있다. 특이하게는, CD3 결합 분자들을 사용한 치료의 초기 단계 기간 중 T 세포 재분포가 중추신경계 부작용 사례들에 주요한 위험 인자이기 때문에, 컨텍스트에 의존적인 CD3 에피토프보다는 컨텍스트에서 독립적인 것을 더 인식함에 의해서 본 발명의 CD3 결합 분자들이 이 기술에서 알려진 CD3 결합 분자들보다 안전성에 대하여 상당한 이점을 가진다. 기존의 CD3 결합 분자들을 사용한 치료의 초기 단계 기간 중의 T 세포 재분포와 관련되어 있는 중추신경계 부작용 사례를 가지는 환자들은 보통 정신착란증과 방향감각 상실증으로, 또 어떤 경우에는 요실금 증상으로 고통스러워 하고 있다. 정신착란증은 환자가 그 또는 그녀의 보통의 명석함의 정도로 사고할 수 없는 정신적 상태에서의 변화이다. 환자는 보통 집중하는 것에 어려움을 느끼고 사고하는 것이 흐릿하고 불명확할 뿐만 아니라 종종 현저히 사고가 느려지기도 한다. 기존의 CD3 결합 분자들을 사용한 치료의 초기 단계 기간 중의 T 세포 재분포와 관련되어 있는 중추신경계 부작용 사례를 가지는 환자들은 또한 기억 상실로도 고통받을 수 있다. 빈번하게는, 정신착란증은 인간 그리고/또는 장소를 인식하는 능력을 상실하거나, 또는 시간과 날짜를 말하는 능력을 상실하는 결과에 이르게 한다. 방향감각 상실증의 감정들은 정신착란증에서와 공통되고, 결정을 내리는 능력도 손상된다. 기존의 CD3 결합 분자들을 사용한 치료의 초기 단계 기간 중의 T 세포 재분포와 관련되어 있는 중추신경계 부작용 사례들은 또한 흐릿해진 말 그리고/또는 어휘를 찾는 것에서의 어려움들을 포함할 수 있다. 이러한 장애들은 읽기와 쓰기뿐만 아니라 언어의 표현과 이해도를 모두 다 손상시킬 수 있다. 요실금 증상 외에도, 현훈증과 현기증이 어떤 환자들에게서 기존의 CD3 결합 분자들을 사용한 치료의 초기 단계 기간 중의 T 세포 재분포와 관련되어 있는 중추신경계 부작용 사례들을 동반할 수 있다.

상기한 CD3 입실론의 27 아미노산 N-말단 폴리펩티드 단편 내의 3차원적 구조를 유지하는 것은 시험관내(in vitro)에서는 N-말단 CD3 입실론 폴리펩티드 단편에, 그리고 생체내(in vivo)에서는 동일한 결합 친화력을 가지고 T 세포들 위에 선천적인 (CD3 입실론 서브유니트) CD3 복합체에 결합된, 바람직하게는 인간의, 결합 도메인들의 생성을 위해 사용될 수 있다. 이 자료들은 여기서 기술된 N-말단 단편이 생체내에서 정상적으로 존재하는 그 구조에 유사한 3가의 입체 구조를 형성한다는 사실을 강력히 보여준다. CD3 입실론의 N-말단 폴리펩티드 단편의 1-27 아미노산 잔기의 구조적 완전성의 중요성을 위한 매우 예민한 실험이 수행되었다. CD3 입실론의 N-말단 폴리펩티드 단편의 1-27 아미노산 잔기들의 개개의 아미노산들이 소규모의 파쇄들을 위해 CD3 입실론의 N-말단 폴리펩티드 단편의 1-27 아미노산 잔기들의 예민성을 실험하기 위해 알라닌(alanine)으로 변화되었다(알라닌 스캐닝). 본 발명의 이중특이 결합 분자의 일부분으로서 CD3 특이적 항체 분자들이 CD3 입실론의 N-말단 폴리펩티드 단편의 1-27 아미노산 잔기들의 알라닌-돌연변이들(mutants)에 결합하기 위한 실험을 하기 위해 사용되었다(첨부된 예 5를 참고하시오). 단편의 N-말단의 가장 끝에 첫번째 5개의 아미노산 잔기들과 CD3 입실론의 N-말단 폴리펩티드 단편의 1-27 아미노산 잔기들의 위치 23과 25에 있는 아미노산 두 개와의 개개의 상호교환이 항체 분자들의 결합에 결정적이다. 알라닌에 Q(위치 1에 있는 글루타민(Glutamine) 1), D(위치 2에 있는 아스파트산(Aspartic acid)), G(위치 3에 있는 글리신(glycine), N(위치 4에 있는 아스파라긴(Asparagine)), 그리고 E(위치 5에 있는 글루타민산(Glutamic acid))잔기들을 포함하는 1-5 위치 지역에서 아미노산 잔기들의 치환은, 바람직하게는 인간의, 상기한 단편에 본 발명의 결합 분자들의 결합을 파괴시켰다. 반면에 적어도 어느 정도의, 바람직하게는 인간의, 본 발명의 결합 분자들에 대하여, 상기한 단편 T(위치 23에 있는 트레오닌(Threonine)) 그리고 I(위치 25에 있는 이소로이신(Isoleucine ))의 C-말단들에 있는 두 개의 아미노산 잔기들은, 바람직하게는 인간의, 본 발명의 결합 분자들에 대한 결합에너지는 감소시켰다.

예상 밖으로, 그에 의하여 격리되고, 바람직하게는 인간, 결합 분자들은 인간의 CD3 입실론의 N-말단 단편을 인식하지 않을 뿐만 아니라, 광비원류(신세계 원숭이)(Marmoset, Callithrix jacchus; Saguinus oedipus; Saimiri sciureus) 그리고 구세계 원숭이(Cynomolgus Monkey)로도 알려져 있는 Macaca fascicularis; 또는 레서스 원숭이(Rhesus Monkey)로도 알려져 있는 Macaca mulatta)를 포함하는 다양한 영장류들의 CD3 입실론의 상응하는 동종의 단편들도 인식하지 않는다는 사실이 밝혀졌다. 그리하여, 본 발명의 CD3-결합 분자들의 다중-포유류 특이성이 발견되었다. 다음에 오는 서열의 분석결과들이 인간과 영장류가 CD3 입실론의 세포외 도메인의 N-말단에서 고도로 동종성을 보이는 서열을 공통으로 가진다는 사실을 확인시켜주었다.

바람직하게는 인간의, 그와 동일한 분자들이 임상학적 연구들에서와 심지어 인간에서의 치료법에서 뿐만 아니라, 전임상 단계의 동물실험에서도 사용될 수 있는 CD3 입실론에 대해 특이적인 결합 분자들을 생성시키는 것이 가능하다는 것이 본 발명에서 밝혀졌다. 이것은 인간 CD3 입실론에 결합하는데에 추가적으로(그리고 침팬지의 상응 부분에 유전적인 유사성에 기인하여), 또한 신세계 원숭이들과 구세계 원숭이들을 포함하는 침팬지가 아닌 영장류들의 상기한 항원들의 동종류들에도 결합하는, 바람직하게는 인간의, 결합 분자들의 뜻밖의 검증에 기인한다. 다음에 오는 예들에서 나타나는 것과 같이, 상기한 특이적 CD3 입실론, 바람직하게는 인간의, 결합 분자들은 암이나 면역학적 질환들에 국한됨이 없이, 다양한 질환들에 대한 치료법들을 만들어내기 위하여 이중특이 단일 사슬 항체들 속으로 통합되어 들어갈 수 있다. 그리하여, 대리 CD3 입실론 결합 도메인이나 또는 이중특이성의 단일 사슬 항체들을 - 계통발생적으로 거리가 있는 종들(인간으로부터)에서의 실험을 위한 그와 동일한 것들을 포함하여 - 구축할 필요성이 사라져버렸다. 결과적으로, 다음에 올 시판 허가단계와 치료목적의 약제 투여뿐만 아니라 임상 실험에서 인간에게 투여되도록 의도되는 것과 같이, 바로 그 동일한 분자가 동물의 전임상 단계 실험에서 사용될 수 있다. 인간에게 차후에 투여한 경우에서와 같이, 동물의 전임상 단계 실험에 동일한 분자를 사용할 수 있는 것이, 동물의 전임상 단계 실험에서 얻어진 자료가 인간의 경우에는 제한된 적용력을 가지고 있다는 위험성을 사실상 제거하거나, 또는 적어도 크게 감소시킨다. 간단히 말해서, 인간에게 실제로 투여될 것 같이 상기한 동일 분자를 사용하여 동물들에서 전임상 단계의 안전성 자료를 얻어내는 것은 인간과 연관성 있는 시나리오에 자료의 적용력을 보장하기 위해 많은 기여를 한다. 그와는 대조적으로, 대리 분자들을 사용하는 기존의 시도들에서, 상기한 대리 분자들은 전임상 단계의 안전성 평가를 위해 사용되는 동물 실험 체계에 분자 차원에서 적응시켜야 된다. 그리하여, 실제로 인간의 치료에서 사용되는 분자는, 인간의 경우에서 제한된 적용력/전이가능성을 가지는 결과로서, 전임상 단계의 동물 실험에서 얻어진 자료들이 약제동력학적 파라미터들과 그리고/또는 생물학적 활성에서 전임상 단계 실험에서 사용된 대리 분자와 서열에서 차이점을 보이고 또한 구조에서도 차이점을 보일 수 있다. 대리 분자들의 사용은 완전히 새로운 구축물(construct)의 구축, 생산, 정화 그리고 특성화를 요구한다. 이것이 그런 분자들을 얻어내기 위해 필요한 발전 비용들과 시간을 이끌어 낸다. 요약해 보면, 인간 치료에 사용되기 위한 실제적 약제에 추가하여 대리분자들이 별개로 발전되어야 하며, 그리하여 두 분자들을 위한 두 개 선상의 발전이 수행될 수 있어야 한다. 그러므로, 여기서 기술되는 종간 교차 특이적인 인간 결합 분자나 또는 항체-기반의 구축물들의 주요한 이점은 동일성이 검증되는(identical) 분자가 인간의 치료법들과 전임상 단계의 동물 실험에서 사용될 수 있다는 점이다.

인간의 그리고 침팬지가 아닌 영장류의 CD3 입실론 사슬의 에피토프에 결합할 수 있는 제1 인간 결합 도메인은 인간에서 기원 되는 것이 본 발명의 폴리펩티드를 위해 바람직하다.

또한, 본 발명의 인간 결합 분자들의 인간에서 기원한다는 이유로 상기 결합 분자들에 대항한 면역 반응의 발생이 인간 환자들에 대한 결합 분자들의 투여에서 최대 가능한 정도까지 배제된다.

본 발명의 이중특이성의 결합 분자의 일부분으로서, 바람직하게는 인간, CD3 입실론 특이적 인간 결합 분자들의 또 다른 주요한 이점은 다양한 영장류들에서 전임상 단계 실험을 위한 그들의 적용력이다. 동물들에서 약제 후보의 양태는 이상적으로는 인간에 투여될 때 이 약제 후보의 예상되는 양태를 나타내어야만 한다. 결과적으로, 그와 같은 전임상 단계 실험으로부터 얻어진 자료들은 이에 일반적으로 인간인 경우에 대해서는 높은 예측력을 가져야만 한다. 그러나, TGN 1412(CD28 단일 클론 항체)에 대한 최근의 제1상 임상 실험의 비극적 결과로부터 알게 된 것과 같이, 약제 후보는 인간에게서 보다 더 영장류의 다른 종들에서 다르게 작용할 수 있다: 반면에 상기한 항체의 전임상단계 실험에서 없거나 또는 유일한 제한된 부작용들이 사이노몰거스(cynomolgus. 필리핀원숭이) 원숭이들로 수행되었던 동물 연구들에서 관찰되어 왔는데, 6명의 인간 환자들은 상기한 항체가 투여될 때 다발성 장기 장애로 발전되었다(Lancet 368 (2006), 2206-7). 이런 원하지 않는 부정적 사례들의 결과들은 유일하게 한가지(영장류) 종에만 전임상단계 실험을 국한시키는 것으로 충분하지 않을 수 있음을 보여준다. 본 발명의 CD3 입실론 특이적 인간 결합 분자들이 신세계 원숭이와 구세계 원숭이 계통에 결합한다는 사실이 위에서 언급된 경우에서 직면한 문제들을 극복하는데 도움을 줄 수도 있다. 따라서, 본 발명은 인간의 치료를 위한 약제들이 개발되어 실험되고 있을 때 효과 면에서 종간의 차이점들을 최소화하기 위한 수단과 방법들을 제공해준다.

본 발명의 이중특이성의 결합 분자의 일부분으로서, 바람직하게는 인간의, 종간 교차 특이성 CD3 입실론 결합 도메인을 가지고, 예를 들어 트랜스펙션된 동물들의 생산과 같이, 인간들에게 투여하기 위해 의도된 약제 후보에 실험 동물을 적응시키는 것도 더 이상은 필요하지 않다. 본 발명의 사용과 방법들에 따라서 종간 교차 특이적인 CD3 입실론 특이적, 바람직하게는 인간의, 결합 분자들(또는 그와 동일한 것을 함유하는 이중특이성의 단일 사슬 항체들)은, 동물에게 어떤 유전자조작을 하지 않고, 침팬지가 아닌 영장류들에서 전임상단계 실험을 위해 직접 사용될 수 있다. 이 기술에 숙련된 인간들에게 잘 알려진 것과 같이, 실험 동물이 약제 후보에 적응하는 시도들이 전임상단계 안전성 실험에서 얻어진 결과들이 동물의 유전자 변형((modification)) 때문에 인간에 대해서는 특징적인 것과 예측가능성이 보다 적다는 위험성을 언제나 내포하고 있다. 예를 들면, 트랜스펙션된 동물들에서, 트랜스 유전자들에 의해 암호화된 단백질들은 종종 매우 과발현된다. 그리하여, 이 단백질 항원에 대항하는 항체의 생물학적 작용에 대해 얻어진 자료들은 단백질이 매우 낮게, 보다 더 생리학적인 수준들로 발현되는 인간에 대한 자료들의 예측되는 수치에 국한될 수 있다.

종간 교차 특이적인 CD3 입실론 특이적, 바람직하게는 인간의, 결합 분자들(또는 그와 동일한 것을 함유하는 이중특이성의 단일 사슬 항체들)을 사용하는 또 다른 이점은 위험에 처한 종들로서 침팬지는 동물 실험에서 기피 된다는 사실이다. 침팬지는 인간에게 가장 가까운 연관성을 가지고 게놈 서열 자료들에 근거하여 최근에 인간과의 모든 동물들과 같은 그룹에 속하게 되었다(Wildman et al., PNAS 100 (2003), 7181). 그러므로, 침팬지로 얻은 자료들은 일반적으로 인간에 대해 매우 예측력이 높은 것으로 간주 된다. 그러나, 위험에 처한 종들로서의 그들의 지위 때문에 의학적 실험들을 위해 사용될 수 있는 침팬지의 숫자는 매우 제한되었다. 위에서 진술한 것과 같이, 동물 실험을 위해서 침팬지를 고집하는 것은 비용면에서나 윤리적인 면에서 문제점이 있다. 본 발명의 CD3 입실론 특이적, 바람직하게는 인간의, 결합 분자들(또는 그와 동일한 것을 함유하는 이중특이성의 단일 사슬 항체들)의 사용들은 예를 들어, 얻어진 동물 실험 자료들의 적용력과 같은 품질을 손상시킴이 없이, 전임상단계 실험 기간 중에 윤리적인 반대의견과 재정적 부담을 모두 피해 간다. 이런 사실에 비추어 볼 때, CD3 입실론 특이적, 바람직하게는 인간의, 결합 분자들(또는 그와 동일한 것을 함유하는 이중특이성의 단일 사슬 항체들)의 사용들은 침팬지 대상의 연구들에 대한 타당한 대체물을 제공한다.

본 발명의 CD3 입실론 특이적, 바람직하게는 인간의, 결합 분자들(또는 그와 동일한 것을 함유하는 이중특이성의 단일 사슬 항체들)의 또 다른 이점은 다수의 혈액 샘플들을 추출할 수 있는 능력이며, 동물 전임상 단계 실험의 일부분으로 그 능력을 사용하며, 예를 들면, 약제동력학적 동물 연구들의 과정 중에 있을 때이다. 다수의 혈액 추출은, 예를 들어, 생쥐같은 보다 하등한 동물들에서보다는 침팬지가 아닌 영장류에서 아주 더 쉽게 얻어질 수 있다. 다수의 혈액 샘플들의 추출은 본 발명의, 바람직하게는 인간의, 결합 분자(또는 이중특이성의 단일 사슬 항체들)에 의해 유도되는 생물학적 효과들을 결정하기 위한 혈액 파라미터들의 연속적인 실험을 가능하게 한다. 더욱이, 다수의 혈액 샘플들의 추출이 연구자가, 여기서 정의된 것과 같이, 바람직하게는 인간의, 결합 분자(또는 이중특이성의 단일 사슬 항체들)의 약제동력학적 프로파일을 평가할 수 있도록 해준다. 추가적으로, 혈액 파라미터들에서 반영된 상기한, 바람직하게는 인간의, 결합 분자(또는 이중특이성의 단일 사슬 항체들)에 의해 유도될 수 있는 일어날 가능성이 있는 부작용들이 상기한 항체의 투여 기간 중에 추출된 다른 혈액 샘플들에서 측정될 수 있다. 이 사실들이, 여기서 정의된 것처럼, 바람직하게는 인간의, 결합 분자(또는 이중특이성의 단일 사슬 항체들)의 잠재적 독성 프로파일을 결정할 수 있게 해준다.

여기에서 정의된, 종간 교차 특이적인, 바람직하게는 인간의, 결합 분자들(또는 이중특이성의 단일 사슬 항체들)의 이점들은 다음과 같이 간략하게 요약될 수 있다:

첫째로, 여기서 정의된 것과 같이, 전임상 단계 실험에서 사용된, 바람직하게는 인간의, 결합 분자들(또는 이중특이성의 단일 사슬 항체들)은 인간의 치료에서 사용되는 분자들과 동일하다. 그리하여, 그들의 약제동력학적 속성들과 생물학적 작용에서 다를 수 있는 두 개의 독립적인 분자들을 더 이상 개발시킬 필요가 없다. 예를 들어, 약제동력학적 결과들이, 예를 들어, 기존의 대리물 연구들에서 보다 인간 세팅 환경에 더 직접적으로 전이가능하고 적용가능한 경우에서 이것은 매우 유익하다.

둘째로, 여기에서 정의된, 인간에게서 치료의 준비를 위한, 바람직하게는 인간의, 결합 분자들(또는 이중특이성의 단일 사슬 항체들)의 사용들은 대리물 연구법들보다 비용이 적고 노동 강도가 덜하다.

셋째로, 여기서 정의된, 바람직하게는 인간의, 결합 분자들(또는 이중특이성의 단일 사슬 항체들)은 한가지의 영장류 종에서 뿐만 아니라 일련의 다른 영장류 종들에서의 전임상 단계 실험을 위해서도 사용될 수 있고, 그것에 의하여 영장류와 인간 사이의 잠재적 종간 차이점의 위험을 제한시킨다.

넷째로, 동물 실험을 위해서 침팬지는 위험에 처한 종으로서 피한다.

다섯째로, 다수의 혈액 샘플들은 확장된 약제동력학적 연구들을 위해 추출될 수 있다.

여섯째, 본 발명의 바람직한 실시에 상응하여, 바람직하게는 인간의, 결합 분자들이 인간에서 기원하기 때문에 상기한 결합 단백질들에 대항한 면역 반응의 발생은 인간 환자들에 투여되었을 때 최소화된다.

쥐과 동물 기원의 치료용 분자들에 대항하여 인간-항-인간 항체들(HAMAs)의 개발에 이르게 되는, 예를 들어, 생쥐와 같은 인간이 아닌 종들로부터 유래한 약제 후보에 대한 특이적인 항체들과 면역 반응을 유도하는 것은 배제된다.

"단백질"이란 용어는 이 기술에서 잘 알려져 있고 생물학적 화합물들을 설명한다. 단백질들은 하나 또는 다수의 아미노산 사슬들(풀리펩티드들)을 포함하고, 그것에 의해 아미노산들이 펩티드 결합을 통해서 또 다른 아미노산 사이에 결합된다. 본 명세서에서 사용된 "폴리펩티드"란 용어는 30개 이상의 아미노산들로 구성되는 분자들의 한 그룹을 칭하는 것이다. 본 발명에 따라서, 단백질들이 단일 폴리펩티드로 구성되는 한, 폴리펩티드들의 그룹은 "단백질"을 포함한다. 또한 그 정의에 따라서 이 단편들이 30개 이상의 아미노산들로 구성되는 한, 용어 "폴리펩티드"는 단백질들의 단편들을 칭하는 것이다. 폴리펩티드들은 더욱이 이합체들, 삼중합체들 그리고 보다 고도의 올리고머들, 예를 들어, 하나 이상의 폴리펩티드 분자로 구성되는 다중합체들을 형성할 수 있다. 이합체들, 삼중합체들 등등과 같은 것을 형성하는 폴리펩티드 분자들은 동일하거나 또는 동일하지 않을 수 있다. 그와 같은 다중합체들의 상응하는 보다 고위의 구조들은 그 결과로서, 동종(homo-) 또는 이종이중합체들(heterodimers), 동종(homo-) 또는 이종삼중합체들(heterotrimers) 등등으로 일컬어 진다. 이종다중합체의 일례는 항체 분자인데, 그것은 자연발생적 형태에서 두 개의 동일한 가벼운 폴리펩티드 사슬과 두 개의 동일한 무거운 폴리펩티드 사슬들로 구성된다. 용어 "폴리펩티드"와 "단백질"은 또한 자연적으로 변형된 폴리펩티드들/단백질들에 관한 것인데, 그곳에서 그 변형은 예를 들어 글리코실화, 아세틸화, 인산화, 그리고 그 유사반응과 같은 후전사 변형들에 의해 이루어졌다. 그러한 변형들은 이 기술에서 잘 알려져 있다.

본 명세서에서 사용된 "인간(human)"과 "인간(man)"은 호모사피엔스(Homo sapiens)라는 종(species)에 관한 것이다. 여기서 설명된 구축물들의 의학적 사용들에 관한 한, 인간 환자들은 동일한 분자로 치료받게 된다.

본 발명의 분자들과 함께 본문에서 사용된 "인간 기원(human origin)"이라는 용어는 인간의 유전자 라이브러리로부터 유래하였거나 또는 인간에 대한 동등성에 상응하는 구조/서열을 가지고 있는 분자들을 일컫는 것이다. 따라서, 예를 들어, 인간 생식 계열의 서열에 상응하는 구조체제(framework)에서 아미노산 서열들을 가지는 항체와 같이, 상사(analog) 인간 서열에 상응하는 아미노산 서열들을 가지는 단백질들이 인간 기원의 분자들로 이해된다.

본 명세서에서 사용된 "침팬지" 또는 "침팬지가 아닌 영장류" 또는 그것들의 문법적 여러 형태들은 침팬지가 아닌 다른 영장류를 말하는 것으로서, 예를 들어, 침팬지 속(genus Pan)에 속하는 동물과 다른 것들, 그리고 보노보(Pan paniscus) 종과 침팬지(Pan troglodytes) 종을 포함하고, 또한 침팬지(Anthropopithecus troglodytes) 또는 오랑우탄(Simia satyrus)으로 알려져 있는 것들을 말한다. "영장류(primate)", "영장류 종(primate species)", "영장류(primates)" 또는 그것들의 문법적 여러 형태들은 인간, 유인원(apes), 원숭이(monkeys) 그리고 여우원숭이(lemurs)를 포함하면서, 원원류(prosimians) 및 유인원(anthropoids)의 두 아목들(suborders)로 나누어지는 태반류(eutherian mammals)의 순위를 표시하는 것이다. 명확하게는, 본 명세서에서 사용된 "영장류(primates)"는 여우원숭이(Lemuriformes) 하목(infraorder)(상과들(superfamilies)인 난쟁이여우원숭이(Cheirogaleoidea)와 여우원숭이(Lemuroidea)를 포함하는 그 자체), 아이아이하목(Chiromyiformes) 아이아이과(Daubentoniidae family)를 포함하는 그 자체) 그리고 로리스하목(Lohsiformes) (로리스과(Lorisidae)와 갈라고과(Galagidae)를 포함하는 그 자체)를 포함하는 원원 아목(Strepsirrhini)(비-안경원숭이(non-tarsier) 원원류)을 포함한다. 본 명세서에서 사용된, "영장류(primates)"는 또한 안경원숭이하목(Tarsiiformes) (안경원숭이과(Tarsiidae)를 포함하는 그 자체), 원숭이하목(Simiiformes)(광비원류(Platyrrhini)를 포함하는 그 자체, 또는 신세계 원숭이(New-World monkeys) 그리고 긴꼬리원숭이과(Cercopithecidea)를 포함하는 협비원류(Catarrhini), 또는 구세계 원숭이(Old-World Monkeys))를 포함하는 진원아목(Haplorrhini)을 포함한다.

침팬지가 아닌 영장류 종은 본 발명에서의 취지 내에서 여우원숭이, 안경원숭이, 긴팔원숭이(gibbon), 마모셋(marmoset)(꼬리감는원숭이과(Cebidae)의 신세계 원숭이에 속하는) 또는 구세계 원숭이(긴꼬리원숭이상과(Cercopithecoidea)에 속하는)인 것으로 이해될 수 있을 것이다. 여기서 사용된 "구세계 원숭이"는 긴꼬리원숭이상과에 해당하는 원숭이를 포함하며, 그 자체가 다음의 과들, 즉: 주로 아프리카에 있지만 아시아와 북아프리카에 있는 짧은꼬리원숭이(macaques, 머카크)의 다양한 속을 포함하는 긴꼬리원숭이아과(Cercopithecinae); 그리고 대부분의 아시아의 속들을 포함하지만 또한 아프리카의 콜로부스(colobus) 원숭이들을 포함하는 콜로부스아과(Colobinae)로 구분된다.

구체적으로, 긴꼬리원숭이과 내에서 유리한 침팬지가 아닌 영장류는 알렌 원숭이속(Allenopithecus)(알렌원숭이(Allen's Swamp Monkey, Allenopithecus nigroviridis) 내; 탈라포인속(Miopithecus)(앙골라탈라포인원숭이(angolan Talapoin, Miopithecus talapoin); 가봉탈라포인원숭이(Gabon Talapoin, Miopithecus ogouensis)) 내; 파타스원숭이속(Erythroebus)(파타스원숭이(Patas Monkey, Erythrocebus patas) 내; 버빗원숭이속(Chlorocebus)(사바나원숭이(Green Monkey, Chlorocebus sabaceus); 그리벳원숭이(Grivet, Chlorocebus aethiops); 베일산맥버빗원숭이(Bale Mountains Vervet, Chlorocebus djamdjamensis); 탄탈루스원숭이(Tantal Monkey, Chlorocebus tantalus); 버빗원숭이(Vervet Monkey, Chlorocebus pygerythrus); 말브록원숭이(Malbrouck, Chlorocebus cynosuros)) 내; 또는 긴꼬리원숭이속(Cercopithecus)(드리아스원숭이(Drays Monkey or Salongo Monkey, Cercopithecus dryas); 다이애나원숭이(Diana Monkey, Cercopithecus diana); 롤로웨이원숭이(Roloway Monkey, Cercopithecus nictitans); 푸른원숭이(Blue Monkey, Cercopithecus mitis); 은색원숭이(Silver Monkey, Cercopithecus doggetti); 황금원숭이(Golden Monkey, Cercopithecus kandti); 사이크스원숭이(Sykes's Monkey, Cercopithecus albogularis); 모나원숭이(Mona Monkey, Cercopithecus mona); 캠벨모나원숭이(Campbell;s Mona Monkey, Cercopithecus campbelli); 로우모나원숭이(Lowe's Mona Monkey, Cercopithecus lowei); 관머리게논(Crested Mona Monkey, Cercopithecus pogonias); 여우게논(Wolf's Mona Monkey, Cercopithecus wolfi); 덴트모나원숭이(Dent's Mona Monkey, Cercopithecus denti); 작은흰코게논(Lesser Spot-nosed Monkey, Cercopithecus petaurista); 붉은배게논(White-throated Guenon, Cercopithecus erthrogaster); 스클레이터게논(Sclater's Guenon, Cercopithecus sclateri); 붉은귀게논(Red-eared Guenon, Cercopithecus erythrotis); 콧수염게논(Moustachedd Guenon, Cercopithecus cephus); 붉은꼬리원숭이(Red-tailed Monkey, Cercopithecus ascanius); 로에스트게논(L'Hoest's Monkey, Cercopithecus lhoesti); 프레우스게논(Preuss's Monkey, Cercopithecus preussi); 꼬리스크라터게논(Sun-tailed Monkey, Cercopithecus sloatus); 올빼미게논(Hamlyn's Monkey, or Owl-faced Monkey, Cercopithecus hamlyni); 네글렉투스원숭이(De Brazza's Monkey, Cercopithecus neglectus)) 내의 긴꼬리원숭이족(Cercopithecinae)으로부터 유래할 수 있다.

또한, 긴꼬리원숭이아과에 속하지만 개코원숭이족(Papionini)에 속하는 유리한 침팬지가 아닌 영장류는 머카크속(Macaca)(바바리원숭이(Barbary Macaque, Macaca sylvanus); 사자꼬리원숭이(Lion-tailed Macaque, Macaca silenus); 남부돼지꼬리원숭이(Southern Pig-tailed Macaque or Beruk, Macaca nemestrina); 북부돼지꼬리원숭이(Northern Pig-tailed Macaque, Macaca leonina); 파가이섬원숭이(Pagai Island Macaque or Bokkoi, Macaca pagensis); 시베루트원숭이(Siberut Macaque, Macaca siberu); 무어원숭이(Moor Macaque, Macaca maura); 엷은색머카크(Booted Macaque, Macaca ochreata); 토기안원숭이(Tonkean Macaque, Macaca tonkeana); 헥원숭이(Heck's Macaque, Macaca hecki); 고론탈로원숭이(Gorontalo Macaque, Macaca nigriscens); 검은짧은꼬리원숭이(Celebes Crested Macaque or Black "Ape", Macaca nigra); 필리핀 원숭이(Cynomolgus monkey or Crab-eating Macaque or Long-tailed Macaque or Kera, Macaca fascisularis); 붉은얼굴원숭이(Stump-tailed Macaque or Bear Macaque, Macaca arctoides); 히말라야원숭이(Rhesus Macaque, Macaca mulatta); 타이완원숭이(Formosan Rock Macaque, Macaca cyclopis); 일본원숭이(Japanese Macaque, Macaca fuscata); 토크원숭이(Toque Macaque, Macaca sinica); 보넷원숭이(Bonnet Macaque, Macaca radiata); 바바리 원숭이; 아삼원숭이(Assam Macaque, Macaca assamensis); 티베트원숭이(Tibetan Macaque or Milne-Edwards' Macaque, Macaca thibetana); 아루나찰원숭이(Arunachal Macaque or Munzala, Macaca munzala) 내; 볏망가베이속(Lophocebus)(회색뺨망가베이(Gray-cheeked Mangabey, Lophocebus albigena)); 회색뺨망가베이(Lophocebus albigena albigena); 오스만힐망가베이(Lophocebus albigena osmani); 존스턴망가베이(Lophocebus albigena johnstoni); 검은볏망가베이(Black Crested Mangabey, Lophocebus albigena aterrimus); 옵덴부쉬망가베이(Opdenbosch's Mangabey, Lophocebus albigena opdenboschi); 고원망가베이(Highland Mangabey, Lophocebus kipunji)) 내; 개코원숭이속(Papio)(망토개코원숭이(Hamadryas Baboon, Papio hamadryas); 기니개코원숭이(Guinea Baboon, Papio papio); 올리브개코원숭이(Olive Baboon, Papio anubis); 노랑개코원숭이(Yellow Baboon, Papio cynocephalus); 차크마개코원숭이(Chacma Baboon, Papio ursinus) 내; 겔라다개코원숭이속(Theropithecus)(겔라다개코원숭이(Gelada, Theropithecus gelada)) 내; 흰눈꺼풀망가베이속(Cercocebus)(검댕망가베이(Sooty Mangabey, Cercocebus atys); 검댕망가베이(Cercocebus atys atys); 검댕망가베이(Sooty Mangabey, Cercocebus atys); 흰목도리망가베이(Collared Mangabey, Cercocebus torquatus); 날쌘망가베이(Agile Mangabey, Cercocebus agilis); 황금배망가베이(Golden-bellied Mangabey, Cercocebus chrysogaster); 타나강망가베이(Tana River Mangabey, Cercocebus galeritus); 산제이망가베이(Sanje Mangabey, Cercocebus sanjei)) 내; 또는 만드릴루스원숭이속(Mandrillus)(만드릴원숭이(Mandrill, Mandrillus sphinx); 드릴원숭이(Drill, Mandrillus leucophaeus)) 내로부터 유래할 수 있다.

가장 바람직하게는 필리핀원숭이(사이노몰거스(Cynomolgus) 원숭이라고도 알려져 있으며, 따라서 "사이노몰거스"라 칭한 실시예에서) 및 히말라야원숭이("레서스"라는 이름의 레서스 원숭이)이다.

콜로부스아과(Colobinae)의 범위 내에서, 유익한 침팬지가 아닌 영장류는 아프리카 그룹에서 유래한 것이고, 콜로부스속(Colobus) 범위 내에서(검은콜로부스(Black Colobus, Colobus satanas); 앙골라콜로부스(Angola Colobus, Colobus angolensis); 서부콜로부스(King Colobus, Colobus polykomos); 센털콜로부스(Ursine Colobus, Colobus vellerosus); 동부콜로부스(Mantled Guereza, Colobus guereza); 붉은콜로부스속(Piliocolobus)(서부붉은콜로부스(Western Red Colobus, Piliocolobus badius; Piliocolobus badius badius ; Piliocolobus badius temminckii; Piliocolobus badius waldronae); 페넌트콜로부스(Pennant's Colobus, Piliocolobus pennantii); 비오코붉은콜로부스(Piliocolobus pennantii pennantii); 니제르삼각주붉은콜로부스(Piliocolobus pennantii epieni); 부비어붉은콜로부스(Piliocolobus pennantii bouvieh); 프로이스붉은콜로부스(Preuss's Red Colobus, Piliocolobus preussi); 톨롱붉은콜로부스(Thollon's Red Colobus, Piliocolobus tholloni); 중부아프리카붉은콜로부스(Central African Red Colobus, Piliocolobus foai; Piliocolobus foai foai ; Piliocolobus foai ellioti ; Piliocolobus foai oustaleti ; Piliocolobus foai semlikiensis ; Piliocolobus foai parmentierorum); 우간다붉은콜로부스(Ugandan Red Colobus, Piliocolobus tephrosceles); 우중와붉은콜로부스(Uzyngwa Red Colobus, Piliocolobus gordonorum); 잔지바르붉은콜로부스(Zanzibar Red Colobus, Piliocolobus kirkii); 타나강붉은콜로부스(Tana River Red Colobus, Piliocolobus rufomitratus); 또는 올리브콜로부스속( Procolobus)(올리브콜로부스(Olive Colobus, Procolobus verus)내의 아프리카 군으로부터 유래할 수 있다.

또한, 콜로부스아과(Colobinae)의 범위 내에서, 유익한 침팬지가 아닌 영장류는 회색랑구르속(Semnopithecus)(네팔회색랑구르(Nepal Gray Langur, Semnopithecus schistaceus); 카슈미르회색랑구르(Kashmir Gray Langur, Semnopithecus ajax); 타라이회색랑구르(Tarai Gray Langur, Semnopithecus hector); 북부평원회색랑구르(Northern Plains Gray Langur, Semnopithecus entellus); 검은발회색랑구르(Black-footed Gray Langur, Semnopithecus hypoleucos); 남부평원회색랑구르(Southern Plains Gray Langur, Semnopithecus dussumieh); 회색술랑구르(Tufted Gray Langur, Semnopithecus pnam) 내; 자주빛얼굴랑구르(T. vetulus) 그룹 또는 루뚱원숭이속(Trachypithecus)(자주빛얼굴랑구르(Purple-faced Langur, Trachypithecus vetulus); 검은두건랑구르(Nilgiri Langur, Trachypithecus johnii)) 내; 루뚱원숭이속의 은색루뚱(T. cristatus) 그룹(자바루뚱(Javan Lutung, Trachypithecus auratus); 은색잎원숭이 또는 은색루뚱(Silvery Leaf Monkey 또는 Silvery Lutung, Trachypithecus c[ eta ] status); 인도차이나루뚱(lndochinese Lutung, Trachypithecus germaini); 테나세림루뚱(Tenasserim Lutung, Trachypithecus barbei)) 내; 루뚱원숭이속의 검은잎원숭이(T. obscurus) 그룹(검은잎원숭이(Dusky Leaf Monkey 또는 Spectacled Leaf Monkey, Trachypithecus obscurus); 파이레잎원숭이(Phayre's Leaf Monkey, Trachypithecus phayrei)) 내; 루뚱원숭이속의 볏랑구르(T. pileatus) 그룹(볏랑구르(Capped Langur, Trachypithecus pileatus); 쇼트리지랑구르(Shortridge's Langur, Trachypithecus shortridgei); 황금랑구르(Gee's Golden Langur, Trachypithecus geei)) 내; 루뚱원숭이속의 프랑스와랑구르(T. francoisi) 그룹(프랑스와랑구르(Francois' Langur, Trachypithecus francoisi); 하띤랑구르(Hatinh Langur, Trachypithecus hatinhensis); 흰머리랑구르(White-headed Langur, Trachypithecus poliocephalus); 라오스랑구르(Laotian Langur, Trachypithecus laotum); 델라쿠르랑구르(Delacour's Langur, Trachypithecus delacouh); 인도차이나검은랑구르(lndochinese Black Langur, Trachypithecus ebenus) 내; 또는 잎원숭이속(Presbytis)(수마트라잎원숭이(Sumatran Surili, Presbytis melalophos); 띠잎원숭이(Banded Surili, Presbytis femoralis); 사라와크잎원숭이(Sarawak Surili, Presbytis chrysomelas); 흰넓적다리잎원숭이(White-thighed Surili, Presbytis siamensis); 흰이마잎원숭이(White-fronted Surili, Presbytis frontata); 자바잎원숭이(Javan Surili, Presbytis comata); 토마스랑구르(Thomas's Langur, Presbytis thomasi); 호세랑구르(Hose's Langur, Presbytis hosei); 마룬잎원숭이(Maroon Leaf Monkey, Presbytis rubicunda); 멘타와이랑구르 또는 주자(Mentawai Langur 또는 Joja, Presbytis potenziani); 나투나섬잎원숭이(Natuna Island Surili, Presbytis natunae)) 내의 랑구르(잎 원숭이)(Langur(leaf monkey)) 그룹으로부터 유래할 수 있다.

또한, 콜로부스아과 내에서 유리한 침팬지가 아닌 영장류는 두크원숭이속( Pygathrix)(붉은정강이두크원숭이(Red-shanked Douc, Pygathrix nemaeus; 검은정강이두크원숭이(Black-shanked Douc, Pygathrix nigripes); 회색정강이두크원숭이(Gray-shanked Douc, Pygathrix cinerea)) 내; 들창코원숭이속(Rhinopithecus)(황금들창코원숭이(Golden Snub-nosed Monkey, Rhinopithecus roxellana); 검은들창코원숭이(Black Snub-nosed Monkey, Rhinopithecus bieti); 회색들창코원숭이(Gray Snub-nosed Monkey, Rhinopithecus brelichi); 통킹들창고랑구르(Tonkin Snub-nosed Langur, Rhinopithecus avunculus)) 내; 코주부원숭이속(Nasalis)(코주부원숭이(Proboscis Monkey, Nasalis larvatus)) 내; 또는 돼지꼬리랑구르속(Simias)(돼지꼬리랑구르(Pig-tailed Langur, Simias concolor)) 내의 들창코원숭이(Odd-Nosed) 그룹으로부터 유래할 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어 "마모셋(marmoset)"은 비단마모셋속(Callithhx)의 임의의 신세계 원숭이들을 표시하는 것이고, 예를 들어, 비단마모셋아속(비단마모셋(Common Marmoset, Callithrix (Callithrix) jacchus); 검은솔마모셋(Black-tufted Marmoset, Callithrix ( Callithrix ) penicillata); 비트마모셋(Wied's Marmoset, Callithrix ( Callithrix ) kuhlii); 흰머리마모셋(White-headed Marmoset, Callithrix ( Callithrix ) geoffroyi); 황갈색머리마모셋(Buffy-headed Marmoset, Callithrix ( Callithrix ) flaviceps); 황갈색술마모셋(Buffy-tufted Marmoset, Callithrix ( Callithrix ) aurita))의 대서양 마모셋에 속하며; 미코아속(Mico)(리오아카리마모셋(Rio Acari Marmoset, Callithrix ( Mico ) acariensis); 매니코어마모셋(Manicore Marmoset, Callithrix ( Mico ) manicorensis); 은색마모셋(Silvery Marmoset, Callithrix ( Mico ) argentata); 흰마모셋(White Marmoset, Callithrix ( Mico ) leucippe); 에밀리아마모셋(Emilia's Marmoset, Callithrix (Mico) emiliae); 검은머리마모셋(Black-headed Marmoset, Callithrix ( Mico ) nigriceps); 마르카마모셋(Marca's Marmoset, Callithrix ( Mico ) marcai); 검은꼬리마모셋(Black-tailed Marmoset, Callithrix ( Mico ) melanura); 산타렘마모셋(Santarem Marmoset, Callithrix ( Mico ) humeralifera); 마우에마모셋(Maues Marmoset, Callithrix ( Mico ) mauesi); 흰노랑마모셋(Gold-and-white Marmoset, Callithrix ( Mico ) chrysoleuca); 허쉬코비즈마모셋(Hershkovitz's Marmoset, Callithrix ( Mico ) intermedia); 사테라마모셋(Satere Marmoset, Callithrix (Mico) saterei))의 아마존 마모셋에 속하며; 루스말렌잔쟁이마모셋아속( Callibella)(검은관잔쟁이마모셋(Callithrix ( Callibella ) humilis))에 속하는 루스말렌난쟁이마모셋아(Roosmalens' Dwarf Marmoset); 또는 피그미마모셋아속(Cebuella (Callithrix ( Cebuella ) pygmaea )에 속하는 피그미마모셋(Pygmy Marmoset)이 해당한다.

신세계 원숭이들의 또 다른 속들은 타마린속(Saguinus)(솜털머리타마린(S. oedipus) 그룹, 붉은손타마린(S. midas) 그룹, 검은망토타마린(S. nigricollis) 그룹, 콧수염타마린(S. mystax) 그룹, 얼룩무늬타마린(S. bicolor) 그룹 그리고 반점무늬얼굴타마린(S. inustus) 그룹을 포함함)의 비단원숭이(tamarin, 타마린) 및 다람쥐원숭이속(Samiri)(예를 들면, 커먼다람쥐원숭이(Saimiri sciureus), 중앙아메리카다람쥐원숭이(Saimiri oerstedii), 맨귀다람쥐원숭이(Saimiri ustus), 검은머리다람쥐원숭이(Saimiri boliviensis), 검은다람쥐원숭이(Saimiri vanzolini)을 포함한다.

"결합 도메인"이란 용어는 본 발명과 관련하여 주어진 표적의 구조/항원/에피토프와 특이성을 가지고 결합하는/상호작용하는 폴리펩티드의 도메인을 특징 으로 한다. 그러므로, 결합 도메인은 "항원-상호작용-자리"이다. 본 발명에 따르면, 용어 "항원-상호작용-자리"는, 예를 들면, 다른 종들에서 그것들과 일치하는 항원처럼, 특이성 있는 항원 또는 특이성 있는 항원의 그룹과 특이적으로 상호작용할 수 있는 폴리펩티드의 모티프(motif)를 정의한다. 상기 결합/상호작용은 또한 "특이적으로 인식함"을 정의하는 것으로도 이해된다. 본 발명에 따르면, "특이적으로 인식함"이란 용어는, 항체 분자가 특이적으로 상호작용할 수 있는 것과 그리고/또는 항체 분자가 예를 들면, 여기서 정의된 인간 CD3 항원과 같은 항원의 적어도 두 개, 바람직하게는 적어도 세 개, 보다 바람직하게는 적어도 네 개의 아미노산들에 결합될 수 있는 것을 의미한다. 그와 같은 결합은 "자물쇠-열쇠-원칙"의 특이성에 의해 예시화될 수 있다. 그리하여, 결합 도메인과 항원의 아미노산 서열에서의 특이적인 모티프들은 그들의 1차, 2차 또는 3차 구조의 결과로서는 물론이고, 상기한 구조의 제2 변형의 결과로서도 서로에 결합한다. 항원-상호작용-자리의 그 특이적 항원과의 특이적 상호작용은 항원에 상기한 자리의 단순한 결합이라는 결과로 끝날 수도 있다. 더욱이, 항원-상호작용-자리의 그 특이적 항원과의 특이적 상호작용은 대안적으로, 예를 들면, 항원의 입체 구조의 변화, 항원의 올리고머화, 등등의 유도에 기인하여 신호의 시발이라는 결과를 낳을 수도 있다. 본 발명과 관련하여 결합 도메인의 바람직한 일례는 항체이다. 결합 도메인은 단일 클론 항체 또는 복수 클론 항체이거나 또는 단일 클론 항체 또는 복수 클론 항체(polyclonal antibody)로부터 유래된 것일 것이다.

"항체"라는 용어는 결합 특이성을 여전히 유지하는 그들의 유도체들이나 또는 기능적 단편들을 포함한다. 항체들의 생산을 위한 기술들은 이 기술에서 잘 알려져 있고 예를 들면, Harlow and Lane "Antibodies, A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988 그리고 Harlow and Lane "Using Antibodies: A Laboratory Manual" Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999에 기술되어 있다. 용어 "항체"는 또한 다른 클래스들인 면역글로불린들(i.e. IgA, IgG, IgM, IgD 그리고 IgE)과 서브클래스들(such as IgGI, lgG2 etc.)을 포함한다. 이 항체들은, 예를 들면, 본 발명의 폴리펩티드나 또는 융합 단백질들의 면역침전법(immunoprecipitation), 친화성 분리정제법(affinity purification) 그리고 면역국재화법(immunolocalization)을 위해 사용될 수 있고, 또한, 예를 들면, 재조합 원핵세포들 또는 진핵세포들이나 또는 그의 유기체들의 배양에서 사용되는 것과 같이 폴리펩티드들의 존재와 그 양의 모니터링을 위해 사용될 수 있다.

용어 "항체"의 정의는 또한 키메릭(chimeric) 항체, 단일 사슬 항체 그리고 인간화된 항체들과 같은 실시예들을 포함하고, 또한 그 중에서도 특별히, Fab 단편들과 같은 항체 단편들도 포함한다. 항체 단편들이나 유도체들은 더욱이 F(ab')2, Fv, scFv 단편들이나 또는 단일 사슬 항체들, 단일 가변성의 도메인 항체들이나 또는 VH 또는 VL일 것이고, 그외 다른 V 구역들이나 도메인들에는 독립적으로 항원이나 에피토프에 특이적으로 결합하는 겨우 하나의 가변성 도메인을 포함하는 면역글로불린 단일 가변성 도메인을 포함한다; 예를 들어, Harlow and Lane (1988)와 (1999), loc. cit.를 참조하시오. 그러한 면역글로불린 단일 가변성 도메인은 격리된 항체 단일 가변성 도메인 폴리펩티드 뿐만 아니라, 항체 단일 가변성 도메인 폴리펩티드 서열을 가지는 하나 또는 다수의 단량체들을 포함하는 보다 큰 폴리펩티드들을 에워 싼다.

다양한 실험방법들이 이 기술에서 알려져 있고 상기한 항체들 그리고/또는 단편들의 생산을 위해 사용될 수 있다. 그리하여 그 (항체) 유도체들이 펩티드 모방체들에 의해 생산될 수 있다. 더욱이, 단일 사슬 항체들(그 중에서도 특히, US Patent 4,946,778을 참조하시오)의 생산을 위해 기술된 기술들이 선출된 폴리펩티드(들)에 특이적인 단일 사슬 항체들을 생산하기 위해 적용될 수 있다. 또한, 트랜스펙션된 동물들이 본 발명의 폴리펩티드들과 융합단백질들에 특이적인 인간화 항체들을 발현하기 위해 사용될 수 있다. 단일클론 항체들의 실험방법을 위해서, 연속적인 세포주(cell line) 배양에 의해 생산되는 항체들을 공급하는 기술이 사용될 수 있다. 그런 기술들의 예들은 하이브리도마 기술(hybridoma technique)(K[omicron]hler and Milstein Nature 256 (1975), 495-497), 트리오마 기술(trioma technique), 인간 B-세포 하이브리도마 기술(Kozbor, Immunology Today 4 (1983), 72) 그리고 인간의 인간 단일클론 항체들을 생산하기 위한 EBV-하이브리도마 기술(Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc. (1985), 77-96)을 포함한다. BIAcore 시스템에서 채택되었던 표면 플라즈몬 공명이 CD3 입실론과 같은 표적 폴리펩티드의 에피토프에 결합하는 파지 항체들(phage antibodies)의 효능성을 증가시키기 위해 사용될 수 있다(Schier, Human Antibodies Hybridomas 7 (1996), 97-105; Malmborg, J. Immunol. Methods 183 (1995), 7-13). 용어 "항체"가 그 중에서도 특별히, 바이러스들 또는 플라스미드 벡터들을 경유해서 유전자가 도입될 수 있고 그리고/또는 유전자가 전달될 수 있는(transducted) 항체 구축물들과 같이 아래에서 기술될 것과 같은 숙주에서 발현될 수 있는 항체 구축물들을 포함한다는 사실이 또한 파악되었다.

본 발명에 따라서 사용된 "특이적 상호작용"이란 용어는 결합(도메인) 분자가 결합 분자에 의해 결합되는 폴리펩티드들과 같은 유사한 구조를 가지는 폴리펩티드들과 교차 반응을 하지 않거나 또는 현저하게 교차 반응을 하지 않는다는 것을 의미하는 것이고, 그 분자는 목적하는 폴리펩티드와 같은 동일한 세포들에 의해 발현될 것이다. 조사 중에 있는 한 그룹의 결합 분자들의 교차 반응성이 예를 들면, 기존의 조건들 아래에서 상기한 그룹의 결합 분자들의 결합을 평가함에 의해서 실험될 수 있다(예를 들면 Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988 그리고 Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999를 참조하시오). 특이적 항원을 가지는 결합 도메인의 특이적 상호작용에 대한 예들은 그것의 수용체에 대한 리간드의 특이성을 포함한다. 상기 정의는 특별히 그 특이적 수용체들에 결합할 때 신호를 유도하는 리간드들의 상호작용을 포함한다. 상기 정의에 의해 또한 특별히 포함되는 상기한 상호작용의 예들은 항체의 결합 도메인(항체의 결합 자리)과 에피토프의 상호작용이다.

본 명세서에서 사용된 "종간 교차 특이성(cross-species specificity)" 또는 "동일 종들 사이의 특이성(interspecies specificity)"이란 용어는 인간들과 침팬지가 아닌 영장류에서 동일한 표적 분자에의 여기서 기술된 결합 도메인의 결합을 의미한다. 그리하여, "종간 교차 특이성" 또는 "동일 종들 사이의 특이성"은 다른 종에서 발현된 동일한 분자 X에 대한 동일종 사이의 반응성으로 이해되어야 하지만, X외에 다른 분자들에 대한 반응성은 아니다. 예를 들면, macaque CD3 입실론과 같은 침팬지가 아닌 영장류 CD3 입실론에 대한 인간 CD3 입실론같은 것을 인식하는 단일클론 항체의 종간 교차 특이성이, 예를 들어, 형광세포분석기(FACS)의 분석과 같은 방법에 의해 결정될 수 있다. 형광세포분석기의 분석은 각각의 단일클론 항체가, 예로서, 상기한 인간과 침팬지가 아닌 영장류 CD3 입실론 항체들을 각각 발현하는 머카크(macaque) 세포들과 같은 인간과 침팬지가 아닌 영장류 세포들에 결합에 대해 실험되는 방법으로 수행된다. 적절한 실험이 다음에 오는 예들에서 제시된다.

본 명세서에서 사용된, CD3 입실론은 T 세포 수용체의 일부분으로 표현되는 분자를 표시하는 것이고 보다 이전의 기술에서 전형적으로 T 세포 수용체의 일부분으로 표현되는 것에 기인한다고 여겨지는 것과 같은 의미를 갖는다. 인간에게서, 그것은 개개의 또는 독립적으로 결합된 형태로 예를 들면 CD3 입실론, CD3 델타, CD3 감마, CD3 제타, CD3 알파 그리고 CD3 베타와 같은 것들과 같은 모든 알려져 있는 CD3 서브유니트들을 에워 싼다. 여기에서 언급되는 침팬지가 아닌 영장류 CD3 항체들은, 예를 들면, 필리핀원숭이(Macaca fascicularis) CD3 그리고 히말라야 원숭이(Macaca mulatta) CD3이다. 필리핀원숭이(Macaca fascicularis)에서, 그 항체는 CD3 입실론 FN-18 음성(FN-18 negative)과 CD3 입실론 FN-18 양성(FN-18 positive), CD3 감마와 CD3 델타를 에워 싼다. 히말라야 원숭이(Macaca mulatta)에서, 그 항체는 CD3 입실론, CD3 감마 그리고 CD3 델타를 에워 싼다. 바람직하게는 여기서 사용된 상기 CD3는 CD3 입실론이다. 인간 CD3 입실론은 유전자은행 등록 번호(GenBank Accession No.) NM_000733에 지시되어 있고 서열번호: 1을 포함하고 있다. 인간 CD3 감마는 유전자은행 등록 번호 NM_000073에 지시되어 있다. 인간 CD3 델타는 유전자은행 등록 번호 NM_000732에 지시되어 있다.

필리핀원숭이(Macaca fasciculahs)의 CD3 입실론 "FN-18 음성"(즉, 위에서 설명된 것과 같이 다형성 때문에 단일클론 항체 FN-18에 의해 인식되지 않는 CD3 입실론)은 유전자은행 등록 번호 AB073994에 지시되어 있다.

필리핀원숭이(Macaca fasciculahs)의 CD3 입실론 "FN-18 양성"(즉, 단일클론 항체 FN-18에 의해 인식되는 CD3 입실론)은 유전자은행 등록 번호 AB073993에 지시되어 있다. 필리핀원숭이(Macaca fasciculahs)의 CD3 감마는 유전자은행 등록 번호 AB073992에 지시되어 있다. 필리핀원숭이(Macaca fasciculahs)의 CD3 델타는 유전자은행 등록 번호 AB073991에 지시되어 있다.

히말라야 원숭이(Macaca mulatta)의 각각의 CD3 입실론, 감마 그리고 델타 동족체들의 핵산의 서열들과 아미노산의 서열들은 이 기술에서 설명된 재조합 기술들에 의해 동일성이 검증되고 분리될 수 있다(Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, 3^rd edition 2001). 이는 여기에서 정의된, 침팬지가 아닌 다른 영장류의 CD3 입실론, 감마 그리고 델타 동족체들에게 준용하여 적용된다. 검은솔마모셋(Callithrix jacchus), 커먼다람쥐원숭이(Saimiri sciureus) 그리고 솜털머리타마린(Saguinus oedipus)의 아미노산의 서열의 확인은 첨부된 예들에 기술되어 있다. 검은솔마모셋(Callithrix jacchus)의 CD3 입실론의 세포외 도메인의 아미노산 서열이 서열번호: 3에 표현되어 있고, 솜털머리타마린(Saguinus oedipus) 중의 하나의 상응하는 서열도 서열번호: 5에 표현되어 있으며 커먼다람쥐원숭이(Saimiri sciureus) 중의 하나의 상응하는 서열도 서열번호: 7에 표현되어 있다.

상기한 내용들과 관련하여, 용어 "에피토프(epitope)"는 위에서 정의된 것과 같이 결합 분자에 의해 특이적으로 결합된/확인된 에피토프를 정의한다. 결합 도메인이나 또는 분자들은 예를 들어 인간과 침팬지가 아닌 영장류 CD3 입실론 사슬과 같은 표적 구조에 대해 독특한, 입체구조의 또는 연속적인 에피토프들과 특이적으로 결합할 수 있다/상호작용할 수 있다. 입체구조의 또는 불연속적인 에피토프는 제1 서열에서 분리되지만, 폴리펩티드가 천연의 단백질/항원 속으로 접혀 들어갈 때 분자의 표면 상에 같이 있는, 개개의 두 개 또는 그 이상의 아미노산 잔기들의 존재에 의해 폴리펩티드 항원들에 대해 특징화된다(SeIa, (1969) Science 166, 1365 그리고 Laver, (1990) Cell 61, 553-6). 에피토프에 기여하는 두 개 또는 그 이상의 아미노산 잔기들은 하나 또는 다수의 폴리펩티드 사슬(들)의 분리된 부분들에 존재한다. 이 잔기들은 폴리펩티드 사슬(들)이 에피토프를 구축하기 위해 3차원 구조 속으로 접혀 들어갈 때 분자의 표면 상에 같이 있다. 이와는 대조적으로, 연속적인 또는 선형의 에피토프는 폴리펩티드 사슬의 단일의 선형 조각에서 존재하는, 두 개 또는 그 이상의 개개의 아미노산 잔기들로 구성된다. 본 발명의 범위 내에서, "컨텍스트에 의존적인" CD3 에피토프는 상기한 에피토프의 입체 구조를 말한다. CD3의 입실론 사슬에 국지화되어 있는 그러한 컨텍스트에서 독립적인 에피토프는 나머지 입실론 사슬의 범위 내에 심어지고 입실론 사슬의 CD3 감마 사슬과 델타 사슬 중 하나와의 이종중합체화에 의해 제자리를 잡게 될 때에만 올바른 입체 구조를 발전시킬 수 있다. 이와는 대조적으로, 여기서 제공된 것과 같이 컨텍스트에서 독립적인 CD3 에피토프는 CD3 입실론의 N-말단 1-27 아미노산 잔기 폴리펩티드나 또는 그것의 기능적 단편에 관한 것이다. 이러한 N-말단 1-27 아미노산 잔기 폴리펩티드나 또는 그것의 기능적 단편은 그것들의 3차원 구조의 완전성과 CD3 복합체에서 그 천연의 환경에서 꺼내었을 때 올바른 입체 구조를 유지시킨다. CD3 입실론의 세포외 도메인의 일부분인, N-말단 1-27 아미노산 잔기 폴리펩티드나 또는 그것의 기능적 단편의 컨텍스트에서의 독립성은 WO 2004/106380에서 인간 결합 분자의 처리법을 위한 방법과 관련되어 기술된 CD3 입실론의 에피토프들에 완전히 다른 에피토프를 나타낸다. 상기한 방법은 단독으로 발현된 재조합 CD3 입실론을 사용한다. 단독으로 발현된 재조합 CD3 입실론의 입체 구조는, TCR/CD3 복합체의 CD3-입실론 서브유니트가 TCR/CD3 복합체의 D3-델타나 CD3-감마 서브유니트 중 하나와 비공유적 복합체의 일부분으로 존재하는 형태, 즉, 그것의 천연적 형태로 채택된 것과는 다르다. 그러한 단독으로 발현된 재조합 CD3 입실론 단백질이 항체 라이브러리로부터의 항체들의 선택을 위한 항원으로 사용될 때, 그와 같은 라이브러리가 자기-항원(self-antigens/autoantigens)들에 대한 특이성으로 항체들을 함유하지 못한다 할지라도, 이 항원에 대해 특이적인 항체들은 그 라이브러리로부터 동일성이 검증된다. 상기한 것은 단독으로 발현된 재조합 CD3 입실론 단백질이 in vivo에서 존재하지 않는다는 사실에 기인한다; 그것은 자기항원이 아니다. 결과적으로, 상기 단백질에 대해 특이적인 항체들을 발현시키는 B세포들의 부차적 집단은 생체내에서 결손되지 않았었다; 그러한 B세포들로부터 구축된 항체 라이브러리는 단독으로 발현된 재조합 CD3 입실론 단백질에 대해 특이적인 항체들을 위한 유전물질을 함유하고 있을 것이다.

그러나, 컨텍스트에서 독립적인 N-말단 1-27 아미노산 잔기 폴리펩티드나 또는 그것의 기능적 단편이, 천연의 형태로 접혀있는 에피토프이므로, 본 발명과 관련된 결합 도메인들은 WO 04/106380에서 기술된 접근법에 기초하는 방법들에 의해서 동일성이 검증될 수 없다. 그러므로, WO 04/106380에 제시된 결합 분자들은 CD3 입실론 사슬의 N-말단 1-27 아미노산 잔기들에 결합할 수 없다는 것이 실험에서 검증될 수 있다. 그러므로, 기존의 항-CD3 결합 분자들이나 또는 항-CD3 항체 분자들 (예를 들어 WO 99/54440에서 개시된 것과 같이)은 여기에서 제공된 컨텍스트에서 독립적인 CD3 에피토프는 CD3 입실론의 N-말단 1-27 아미노산 잔기 폴리펩티드나 또는 그것의 기능적 단편보다 더 C-말단 쪽으로 자리하는 위치에 있는 CD3 입실론 사슬에 결합한다. 보다 이전의 기술에서 항체 분자들 OKT3와 UCHT-1도 또한 아미노산 잔기들 35에서 85 사이에 있는 TCR/CD3 복합체의 입실론-서브유니트에 대한 특이성을 갖고, 따라서, 이 항체들의 에피토프 역시 보다 C-말단 쪽으로 자리한다. 추가적으로, UCHT-1은 아미노산 잔기들 43에서 77 사이에 구역에 있는 CD3 입실론 사슬에 결합한다(Tunnacliffe, Int. Immunol. 1 (1989), 546-50; Kjer-Nielsen, PNAS 101, (2004), 7675- 7680; Salmeron, J. Immunol. 147 (1991), 3047-52). 그러므로, 보다 이전의 기술에서 항-CD3 분자들은 여기서 정의된 컨텍스트에서 독립적인 N-말단 1-27 아미노산 잔기 에피토프(또는 그것의 기능적 단편)에 결합하지 않고 그 에피토프에 대항하여 지시되지 않는다.

본 발명의 폴리펩티드에 포함된, 바람직하게는 인간의, 결합 도메인의 생성을 위하여, 예를 들어, 인간과 침팬지가 아닌 영장류 CD3 입실론 (예를 들어 머카크(macaque) CD3 입실론) 양쪽 모두에 결합되는 단일클론 항체들과 같이, 여기서 정의된 이중특이성의 단일 사슬 항체가 사용될 수 있다.

본 발명의 폴리펩티드의 바람직한 일 실시예에서, 침팬지가 아닌 영장류는 구세계 원숭이이다, 폴리펩티드의 보다 바람직한 일 실시예에서, 구세계 원숭이는 개코원숭이속(Papio) 및 머카크속(macaque)의 원숭이이다. 가장 바람직하게는, 머카크속의 원숭이는 아삼원숭이(Macaca assamensis), 바바리원숭이(Macaca sylvanus), 보넷원숭이(Macaca radiata), 엷은색머카크, 검은짧은꼬리원숭이(Sulawesi-crested macaque), 타이완원숭이, 일본원숭이, 필리핀원숭이 또는 게잡이머카크 도는 긴꼬리머카크 또는 자바머카크(필리핀원숭이), 사자꼬리원숭이, 돼지꼬리원숭이, 히말라야원숭이, 티베트원숭이, 토기안원숭이, 토크원숭이, 붉은얼굴원숭이 또는 무어원숭이(Moor macaque (Macaca maurus))이다. 가장 바람직하게는, 상기 개코원숭이속의 원숭이는 망토개코원숭이; 기니개코원숭이; 올리브개코원숭이; 노랑개코원숭이; 차크마개코원숭이이다.

본 발명의 폴리펩티드의 대안적으로 바람직한 일 실시예에서, 침팬지가 아닌 영장류는 신세계 원숭이이다. 그 폴리펩티드의 보다 바람직한 일 실시예에서, 신세계 원숭이는 비단마모셋속(마모셋), 타마린속 또는 다람쥐원숭이속의 원숭이이다. 가장 바람직하게는, 상기 비단마모셋속의 원숭이는 비단마모셋이며, 상기 타마린속의 원숭이는 솜털머리타마린이며, 상기 다람쥐원숭이속의 원숭이는 커먼다람쥐원숭이이다.

여기서 상기한 것과 같이 본 발명의 폴리펩티드는 제1 결합 도메인으로 인간과 침팬지가 아닌 영장류 CD3ε (입실론) 사슬의 에피토프에 결합하고, 여기서 상기 에피토프는 서열번호: 2, 4, 6, 또는 8에 표현되어 있는 27 아미노산 잔기들로 이루어진 그룹에서 포함되는 아미노산 서열의 일부분이다.

본 발명과 관련하여, 상기 에피토프는 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6 또는 5 아미노산들을 포함하는 아미노산 서열의 일부분인 것이 본 발명의 폴리펩티드를 위해 보다 바람직하다.

보다 바람직하게는, 상기 에피토프는 적어도 아미노산 서열Gln-Asp-Gly-Asn-Glu (Q-D-G-N-E-D)을 포함한다 .

본 발명의 범위 내에서, "N-말단 1-27 아미노산 잔기들의 기능적 단편"은 여전히 CD3 복합체에서 선천적 환경으로부터 꺼내어 졌을 때 그 3차원적 구조의 완전성을 유지하는 컨텍스트에서 독립적인 에피토프이다. (그리고 예 3.1에서 제시된 것과 같이, EpCAM 또는 면역글로불린 Fc 부분과 같은 이종의 아미노산 서열에 융합되었다). CD3 입실론의 27 아미노산 N-말단 폴리펩티드나 또는 그것의 기능적 단편의 범위 내에서 3차원적 구조를 유지하는 것은 시험관내에서는 N-말단 CD3 입실론 폴리펩티드 단편에, 그리고 in vivo에서는 동일한 결합 친화력을 가지고 T 세포들 위에 천연의 (CD3 입실론 서브유니트) CD3 복합체에 결합된 결합 도메인들의 생성을 위해 사용될 수 있다. 본 발명의 범위 내에서, N-말단 1-27 아미노산 잔기들의 기능적 단편은 여기서 제공되는 CD3 결합 분자들은 여전히 컨텍스트에서 독립적인 방법으로 그러한 기능적 단편들에 결합할 수 있다. 이 기술에서 숙련된 인간은 에피토프의 아미노산 잔기들이 항-CD3 결합 분자들에 의해 인식되는 것을 결정하기 위한 에피토프 맵핑을 위한 방법들을 숙지하고 있다(예를 들어 알라닌 스캐닝 또는 펩 스팟 분석법(pep spot analysis)).

본 발명의 바람직한 실시예에서, 본 발명의 폴리펩티드는 제1 결합 도메인으로 인간과 침팬지가 아닌 영장류 CD3ε 사슬의 에피토프에 결합할 수 있는 (제1) 결합 도메인과 세포 표면 항원에 결합할 수 있는 제2 결합 도메인을 포함한다.

본 명세서에서 사용된 "세포 표면 항원"이란 용어는 세포의 표면에 나타나는 분자들을 가리킨다. 대부분의 경우들에서, 이 분자는 세포의 원형질막의 내부 또는 그 위에 위치할 것이고, 그것은 적어도 이 분자의 일부분이 3차의 형태로 세포 바깥으로부터 접근가능한 채로 남아있도록 하기 위해서이다. 원형질막의 내부에 위치하는 세포 표면 항원의 국한됨이 없는 일례가 3차의 입체 구조로서, 친수성 부분과 소수성 부분을 포함하고 있는 막 통과 단백질(transmembrane protein)이다. 여기서, 적어도 하나의 소수성 부분이 세포 표면 항원이 소수성인 세포의 원형질막 내부로 심어지거나 또는 삽입될 수 있게 해주고, 한편 친수성 부분이 세포질과 세포외 공간 속으로, 각각, 원형질막의 서로 다른 면 상에서 확장된다. 원형질막 상에 위치하는 세포 표면 항원의 국한됨이 없는 예들이 팔미토일기(palmitoyl group)를 보유하기 위해 시스테인 잔기에서 변형된 단백질들, 파네실(farnesyl)기를 보유하기 위해 C-말단 시스테인 잔기에서 변형된 단백질들 또는 glycosyl phosphatidyl inositol ("GPI") 앵커(anchor)를 보유하기 위해 C-말단들에서 변형된 단백질들이다. 이런 그룹들이 원형질막의 외부 표면에 단백질을 공유 결합이 가능할 수 있도록 하여, 거기서 단백질들은 항체들과 같은 세포 외부의 분자들에 의한 인식에 대해 영향받을 수 있는 상태로 남아있게 된다. 세포 표면 항원들의 예들은 EGFR, EGFRvIII, MCSP, Carbonic anhydrase IX (CAIX), CD30, CD33, Her2/neu, IgE, CD44v6 그리고 Muc-1을 포함한다. 추가적으로 상응하는 세포 표면 항원들의 예들은, 예를 들면, 암, 자가면역질환들 또는 바이러스 감염을 포함하는 감염 질환들과 같은, 특정한 질환이나 병적상태에서 특징적인 항원들을 포함한다. 따라서, 용어 "세포 표면 항원들"은 감염된 세포들의 표면에 노출되어 있는 천연의, 가공되지 않은 바이러스의 단백질들과 같은 바이러스의 단백질들을 명백히 포함한다( 그 중에서도 특별히 B, C 그리고 HIV-1 간염 바이러스의 피막 단백질들에 대하여 기술되어 있는).

세포독성 T 세포들의 한 가지 방어 기능은 바이러스에 감염된 세포들의 파괴이며, 그리하여, 그 감염된 세포들의 토착적 특이성에 관계없이 세포독성 T 세포들을 활성화시키고 재지시하는, 본 발명의 이중특이성의 결합 분자들의 독특한 속성은 만성 바이러스 감염증의 광범위한 영역에 큰 영향을 미친다. 지속적으로 감염되는 세포들의 감염들의 제거가 치료를 위한 유일한 기회이다. 현재는, 양자 T 세포 치료법이 만성적 CMV와 EBV 감염들에 대해 일반적으로 개발되고 있다(Rooney, CM., et al., Use of gene-modified virus-specific T lymphocytes to control Epstein-Barr-virus-related lymphoproliferation. Lancet, 1995. 345 (8941): p. 9-13; Walter, EA, et al., Reconstitution of cellular immunity against cytomegalovirus in recipients of allogeneic bone marrow by transfer of T-cell clones from the donor. N Engl J Med, 1995. 333 (16): p. 1038-44).

B형 만성 간염의 감염은 분명히 가장 흥미롭고 성과를 얻을 수 있는 적응증들 중의 하나이다. 전 세계적으로 3.5억 내지 4억의 인구가 HBV에 감염되어 있다. 만성 HBV 간염에 대한 현재의 치료는 인터페론 감마외 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체들의, 간염의 일시적 악화, 열, 근육통, 혈소판감소증 그리고 우울증의 유도와 같은 상당한 부작용들을 동반하는 장기간의 치료에 만족하고 있는 상태이다. 지금은 네 개 이상의 승인된 치료 계획들이 있지만, 바이러스의 제거는 그의 되지않고 있다. B형 만성 간염에서 지속되는 염증은 25% 이상의 환자들에서 간경변증과 간세포 악성종양에 이르게 된다. 더욱이, B형 만성 간염이 있는 환자들의 40% 정도까지 심각한 합병으로 사망하고 있고, B형 만성 간염으로 인해 전 세계적으로 매년 6십만 내지 백만의 사망자를 낳는다.

헤파드나바이러스(Hepadnaviruses)의 프로토타입인 HBV는 느슨한 환상의 (rc)게놈)이 RNA pregenome 속으로 역전사되는 피막에 둘러싸인 바이러스이다. 감염된 후에 re DNA는 네 개의 중첩된 reading frames을 포함하는, 공유적으로 인접한 환상의 DNA (cccDNA)으로 완료되는 곳에 있는 간세포 핵 속으로 운반된다. pregenomic RNA와 세 개의 subgenomic RNAs에 대한 전사 주형으로서의 역할을 한다. RNA pregenome은 바이러스의 코어(core)와 폴리머라제(polymerase) 단백질의 번역을 위해 mRNA로서 기능을 한다. 감염된 세포들을 심지어 HBV 복제증식이 멈추었을 때도 cccDNA로부터 HBV 표면 단백질(HBsAg)을 연속적으로 생산한다. HBsAg는 얼마 되지 않는 부분의 중간의 또는 큰 표면(L) 단백질들과 함께 작은 표면(S) 단백질로 구성된다. HBV S와 L 양쪽 모두가, 그것들이 세포막의 소낭들에서 이동 골지 소기관을 경유하여 원형질막으로 운반되는 곳으로부터, 형질내세망(ER)의 막으로 표적화된다(Gorelick, F. S. and C. Shugrue, Exiting the endoplasmic reticulum. MoI Cell Endocrinol, 2001. 177 (1-2): p. 13-8). S와 L 단백질들은 최근에 제시되는 것과 같이 HBV 복제 간세포들의 표면 상에 영구히 발현된다(Chu, CM. and Y.F. Liaw, Membrane staining for hepatitis B surface antigen on hepatocytes: a sensitive and specific marker of active viral replication in hepatitis B. J Clin Pathol, 1995. 48(5): p. 470-3).

세포 표면에서 피막 단백질들을 노출시키는 프로토타입 바이러스들이 B형 간염 바이러스(HBV), C형 간염 바이러스 (HCV) 그리고 HIV-1이며 모두 다 전세계적으로 질병의 엄청난 부담을 대표한다. HIV-1 바이러스의 징후에 대해서, gp120 피막 단백질에서 지시된 Fv 항체 구축물을 사용한 키메릭 TCR에 의해 변형된 T 세포들이 HIV-1 감염된 표적 세포들을 살해할 수 있다는 사실이 최근에 제시되었다(Masiero, S., et al., T-cell engineering by a chimeric T-cell receptor with antibody-type specificity for the HIV-1 gp120. Gene Ther, 2005. 12 (4): p. 299-310).

헤파드나 바이러스들 중에서, B형 간염 바이러스(HBV)는, 심지어 HBV 복제가 소강상태일 때에도, 에피솜 cccDNA로부터 연속적으로 생산되는 피막 단백질 복합체 HBsAg를 발현시킨다. 세포 표면에 손상되지 않은 S와 L HBV 단백질들로서의 발현이, 급성 상태의 감염증들과 HBsAg를 순환시키는 것에서 antiHBs를 순환시키는 것으로의 변화에서 환자들이 회복할 때, 혈청전환의 보증서가 되는 항체들을 위해 그 단백질들이 이용되기 쉽도록 만들어 준다. 만약 혈청전환이 일어나지 않는 다면, 간세포의 30 %까지 HBV S 단백질을 발현하기를 계속하고, 매우 활성이 높은 장기간의 항바이러스 치료법 후에도 그러하다. 그리하여, 세포내에서 처리된 HBV 펩티드들을 특이성 있게 인식하고 세포 표면에서 MHC 분자들에 의해 제시된 T 임파구들의 범위를 넘어서서, T 세포 교합의 또 다른 형태들에게 외부의 세포막에서 영향을 받기 쉬운 S와 L 항체들과 같은 손상되지 않은 표면 단백질이 실제 가능한 정도로 표적이 된다. B형 간염 바이러스 작은 피막(S) 단백질과 큰 피막(L) 단백질들을 인식하는 단일 사슬 항체 단편들을 사용하여, 인공적인 T-세포 수용체들이 생성되어서 이식된 T-세포들을 감염된 간세포들에 향하게 해줄 수 있게 되고 T-세포들의 항원 접촉 활성화가 일어날 때 시토카인들을 분비하여 감염된 간세포들를 살해한다.

이 접근법의 한계는, (i) T-세포들이 시험관내에서 조작될 필요가 있는 것, (ii) T-세포 수용체들을 이동시키는데 사용되는 레트로바이러스들(retroviruses)이 T-세포들에서 삽입 돌연변이발생을 야기할 수 있음과, 그리고 (iii) 일단 T-세포들이 전달되기만 하면, 세포독성 반응이 제한될 수 없다는 것이다.

이러한 한계를 극복하기 위해서, 인간과 침팬지가 아닌 영장류 CD3 입실론 항체에 대한 결합 특이성을 가진 제1 도메인과 또한 감염된 간세포들의 HBV 또는 HCV 피막 단백질들에 대한 결합 특이성을 가진 제2 도메인도 포함하는 이중특이성의 단일 사슬 항체 분자들(본 발명의 맥락에서 여기서 제공된 것으로서)이 생성될 수 있고 본 발명의 범주 내에 있다.

본 발명의 범위 내에서, 또한 상기한 제2 결합 도메인이 인간 세포 표면 항원 그리고/또는 EGFR, Her2/neu 또는 IgE로부터 선택된 인간 세포 표면 항원들의 침팬지가 아닌 영장류의 상응되는 부분들에 결합하는 것이 보다 바람직하다.

본 발명의 폴리펩티드, 예를 들어 여기서 정의된 것과 같이, 이중특이 단일 사슬 항체들의 상기한 제2 결합 도메인의 생성을 위해서, 각각의 인간 그리고/또는 침팬지가 아닌 영장류 세포의 표면 항원들 양쪽 모두에 결합하는 단일클론 항체들이 사용될 수 있다. 여기서 정의된 것과 같이, 이중특이 폴리펩티드에 대해 적절한 결합 도메인들은 예를 들면 이 기술에서 설명된 재조합 방법들에 의한 종간 교차 특이적 단일클론 항체들로부터 유래할 수 있다. 인간 세포의 표면 항원과 침팬지가 아닌 영장류에서의 상기한 세포의 표면 항원의 동족체에 결합하는 단일클론 항체는 위에서 제시되었던 FACS 분석법에 의해 실험될 수 있다. 종간 교차 특이적 항체들이 또한 문헌에서 기술된 히브리도마(융합세포) 기술들에 의해서도 생성될 수 있다는 사실이 이 기술에서 숙련된 인간들에게 명백하다(Milstein and Kohler, Nature 256 (1975), 495-7). 예를 들면, 생쥐는 대안적으로 인간과 침팬지가 아닌 영장류 CD33로 면역성을 가질 수 있다. 이 생쥐들로부터, 종간 교차 특이적 항체-생산 융합세포들은 히브리도마 기술을 통해 분리되고 위에서 제시되었던 FACS 분석법에 의해 분석된다. 여기서 설명된 것처럼종간 교차 특이적인 이중특이 단일 사슬 항체들과 같은 이중특이 폴리펩티드들의 생성과 분석은 다음에 오는 예들에서 보여진다. 종간 교차 특이적인 이중특이 단일 사슬 항체들의 이점들은 아래에 열거된 요지들을 포함한다.

인간과 침팬지가 아닌 영장류 CD3 입실론 사슬에 결합할 수 있는 제1 결합 도메인은 하기의 (a)-(c)로부터 선택된 CDR-L1, CDR-L2 그리고 CDR-L3를 포함하는 VL 부위을 포함한다는 것이 본 발명의 폴리펩티드에 대해 특별히 바람직하다:

(a) 서열번호: 27에서 표현된 CDR-L1, 서열번호: 28에서 표현된 CDR-L2 그리고 서열번호: 29에서 표현된 CDR-L3;

(b) 서열번호: 117에서 표현된 CDR-L1, 서열번호: 118에서 표현된 CDR-L2 그리고 서열번호: 119에서 표현된 CDR-L3; 그리고

(c) 서열번호: 153에서 표현된 CDR-L1, 서열번호: 154에서 표현된 CDR-L2 그리고 서열번호: 155에서 표현된 CDR-L3.

가변적 부위들(variable regions), 예를 들면, 가변적 가벼운 사슬("L" of "VL")과 가변적 무거운 사슬("H" 또는 "VH")들이 항체의 결합 도메인을 제공하기 위한 것이라는 것으로 이 기술에서는 이해된다. 이 가변적 부위들은 상보적 결정 부위들을 수용한다.

"상보적 결정 부위(CDR)"라는 용어는 항체의 항원 특이성을 지시해주는 곳이라는 것이 이 기술에서는 잘 알려져 있다. 용어 "CDR-L" 또는 "L CDR"은 VL에서 CDRs를 말하고, 반면에 용어 "CDR-H" 또는 "H CDR"은 VH에서 CDRs을 말한다.

본 발명의 폴리펩티드의 대안적으로 바람직한 일 실시예에서, 인간과 침팬지가 아닌 영장류 CD3ε 사슬의 에피토프에 결합할 수 있는 상기 제1 결합 도메인은 하기의 (a)-(j)로부터 선택된 CDR-H1, CDR-H2 그리고 CDR- H3를 포함하는 VH 부위을 포함한다:

(a) 서열번호: 12에서 표현된 CDR-H1, 서열번호: 13에서 표현된 CDR-H2 그리고 서열번호: 14에서 표현된 CDR-H3;

(b) 서열번호: 30에서 표현된 CDR-H1, 서열번호: 31에서 표현된 CDR-H2 그리고 서열번호: 32에서 표현된 CDR-H3;

(C) 서열번호: 48에서 표현된 CDR-H1, 서열번호: 49에서 표현된 CDR-H2 그리고 서열번호: 50에서 표현된 CDR-H3;

(d) 서열번호: 66에서 표현된 CDR-H1, 서열번호: 67에서 표현된 CDR-H2 그리고 서열번호: 68에서 표현된 CDR-H3;

(e) 서열번호: 84에서 표현된 CDR-H1, 서열번호: 85에서 표현된 CDR-H2 그리고 서열번호: 86에서 표현된 CDR-H3;

(f) 서열번호: 102에서 표현된 CDR-H1, 서열번호: 103에서 표현된 CDR-H2 그리고 서열번호: 104에서 표현된 CDR-H3;

(g) 서열번호: 120에서 표현된 CDR-H1, 서열번호: 121에서 표현된 CDR-H2 그리고 서열번호: 122에서 표현된 CDR-H3;

(h) 서열번호: 138에서 표현된 CDR-H1, 서열번호: 139에서 표현된 CDR-H2 그리고 서열번호: 140에서 표현된 CDR-H3;

(i) 서열번호: 156에서 표현된 CDR-H1, 서열번호: 157에서 표현된 CDR-H2 그리고 서열번호: 158에서 표현된 CDR-H3; 그리고

(j) 서열번호: 174에서 표현된 CDR-H1, 서열번호: 175에서 표현된 CDR-H2 그리고 서열번호: 176에서 표현된 CDR-H3;

본 발명의 폴리펩티드의 보다 바람직한 일 실시예에서, 인간과 침팬지가 아닌 영장류 CD3 입실론사슬의 에피토프에 결합할 수 있는 제1 결합 도메인은 서열번호: 35, 39, 125, 129, 161 또는 165에서 표현된 VL 부위로 이루어진 그룹으로부터 선택된 VL 부위를 포함한다.

인간과 침팬지가 아닌 영장류 CD3 입실론사슬의 에피토프에 결합할 수 있는 제1 결합 도메인은 서열번호: 15, 19, 33, 37, 51, 55, 69, 73, 87, 91, 105, 109, 123, 127, 141, 145, 159, 163, 177 또는 181에서 표현된 VH 부위로 이루어진 그룹으로부터 선택된 VH 부위를 포함한다는 것이 본 발명의 폴리펩티드에 대해 대안적으로 바람직하다.

보다 바람직하게는, 본 발명의 폴리펩티드는 인간과 침팬지가 아닌 영장류 CD3 입실론사슬의 에피토프에 결합할 수 있는 제1 결합 도메인에 의해 특징화되고, 그 결합 도메인은 하기의 (a)-(j)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 VL 부위와 VH 부위를 포함한다:

(a) 서열번호: 17 또는 21에서 표현된 VL 부위와 서열번호: 15 또는 19에서 표현된 VH 부위;

(b) 서열번호: 35 또는 39에서 표현된 VL 부위와 서열번호: 33 또는 37에서 표현된 VH 부위;

(c) 서열번호: 53 또는 57에서 표현된 VL 부위와 서열번호: 51 또는 55에서 표현된 VH 부위;

(d) 서열번호: 71 또는 75에서 표현된 VL 부위와 서열번호: 69 또는 73에서 표현된 VH 부위;

(e) 서열번호: 89 또는 93에서 표현된 VL 부위와 서열번호: 87 또는 91에서 표현된 VH 부위;

(f) 서열번호: 107 또는 111에서 표현된 VL 부위와 서열번호: 105 또는 109에서 표현된 VH 부위;

(g) 서열번호: 125 또는 129에서 표현된 VL 부위와 서열번호: 123 또는 127에서 표현된 VH 부위;

(h) 서열번호: 143 또는 147에서 표현된 VL 부위와 서열번호: 141 또는 145에서 표현된 VH 부위;

(i) 서열번호: 161 또는 165에서 표현된 VL 부위와 서열번호: 159 또는 163에서 표현된 VH 부위; 그리고

G) 서열번호: 179 또는 183에서 표현된 VL 부위와 서열번호: 177 또는 181에서 표현된 VH 부위;

본 발명의 폴리펩티드의 바람직한 일 실시예에 따라서, VH 부위들과 VL 부위들의 쌍들은 단일 사슬 항체(scFv)의 체재에 있다. VH 부위들과 VL 부위들은 VH-VL 또는 VL-VH의 순서로 정열된다. VH 부위는 연결자 서열의 C-말단 쪽에 위치하는 것이 보다 바람직하다. VL 부위는 연결자 서열의 C-말단 쪽에 위치하는 것이 보다 바람직하다.

위에서 기술된 본 발명의 폴리펩티드의 바람직한 일 실시예는 인간과 침팬지가 아닌 영장류 CD3 입실론사슬의 에피토프에 결합할 수 있는 제1 결합 도메인에 의해 특징화되고, 그 결합 도메인은 서열번호들: 23, 25, 41, 43, 59, 61, 77, 79, 95, 97, 113, 115, 131, 133, 149, 151, 167, 169, 185 또는 187로 이루어진 그룹으로부터 아미노산 서열을 포함한다:

또한, 본 발명은 위에서 기술된 폴리펩티드에 관한 것으로서, 여기서 상기 제2 결합 도메인은, 바람직하게는 종양 항원인, 세포 표면 항원에 결합한다.

본 명세서에서 사용된 용어 "종양 항원"은 종양 세포들 상에 제시된 종양 항원들로서 이해될 수 있다. 이 항원들은 종종 분자의 막을 통과성의 세포질의 일부분과 결합되는 세포 외부의 일부분이 있는 세포 표면에 제시될 수 있다. 이 항원들은 어떤 경우에 종양 세포들에 의해서만 제시될 수 있고 정상세포들에 의해서는 결코 제시될 수 없다. 종양 항원들은 종양 세포들 상에 배타적으로 발현될 수 있고, 그렇지 않으면 정상 세포들에 비교하면 종양에 특이적인 돌연변이를 제시할 수도 있다. 이러한 경우에는, 그 항원들은 종양-특이적 항원들로 불리운다. 보다 평범한 것은 종양 세포들과 정상 세포들에 의해 제시되는 항원들이고, 그 항원들은 종양-연관성 항원들로 불리운다. 이 종양-연관성 항원들은 정상 세포들에 비교하면 과발현될 수 있고, 그렇지 않으면 정상 조직에 비교해서 종양 조직이 보다 적게 압축되어 있기 때문에 종양 세포들에서 항체 결합에 위해 이용되기가 쉽다. 여기서 사용되는 것과 같이 종양 항원들의 국한됨이 없는 예들이 EGFR이다(Liu, Br. J. Cancer 82/12 (2000), 1991-1999; Bonner, Semin. Radiat. Oncol. 12 (2002), 11-20; Kiyota, Oncology 63/1 (2002), 92-98; Kuan, Brain Tumor Pathol. 17/2 (2000), 71-78),.

EGFR (c-erb1 또는 HER1로도 알려져 있는)은 erbB 수용체 타이로신족에 속한다. 성장인자들인 EGF족으로부터의 리간드의 결합에 의해 활성화될 때, EGFR은 두 번째 EGFR 또는 erbB 수용체 족의 또 다른 구성원을 가지고 동종이중합체화하거나 또는 이종이중합체화는데, 각각, 미토젠-활성화 단백질 키나아제들(protein kinases)과 증식(proliferation), 분화(differentiation) 그리고 수복(repair)에 이르게 하는 다른 전사 인자들을 통한 신호전달의 단계적 반응을 시발점으로 한다(Olayioye, EMBO J. 19 (2000), 3159-67). EGFR은 결장 직장암, 유방암, 폐암, 그리고 머리와 목 암들을 포함하는 많은 상피암들에서 과발현된다(Mendelsohn, J. Clin. Oncol. 21 (2003), 2787-99; Mendelsohn, J. Clin. Oncol. 20 (18, Suppl.) (2002), 1S-13S; Prewett, Clin. Cancer Res. 8 (2002), 994-1003). 악성 세포들에서 EGFR의 과발현(Overexpression) 그리고/또는 돌연변이는 키나아제 활성의 구조적 활성화에 이르게 되어 증식, 혈관신생성(angiogenesis), 침입(invasion), 전이(metastasis), 그리고 아폽토시스(apoptosis)의 결과를 가져온다(Mendelsohn (2003, loc. cit.; Ciardiello, Clin. Cancer Res. 7 (2001), 2958-70; Perez-Soler, Oncologist 9 (2004), 58-67). 세포 외부의 리간드 결합 도메인이나 또는 EGFR의 세포내의 타이로신 키나아제의 신호전달의 단계적 반응을 표적으로 하는 단일클론 항체들은 항종양 표적으로서 효능성을 보여주게 되었다(Laskin, Cancer Treat. Review 30 (2004), 1-17). 예를 들면, 수용체의 리간드 활성화를 저해하기 위한 세포 외부의 도메인을 경쟁적으로 저해하는 EGFR에 대한 인간화된 단일클론 항체, cetuximab (Erbitux)이 토포이소머라아제(topoisomerase) 저해제 irinotecan과 병용되어 전이성 결장암의 치료를 위해 2004년도에 미국식약청에 의해 승인되었다.

본 발명의 바람직한 일 실시예에서, 상기 폴리펩티드는 이중특이성의 단일 사슬 항체 분자이다.

만약 약제 후보가 이중 특이 항체, 예를 들어 이중특이성의 단일 사슬 항체라면, 전임상 연구들을 위한 대리 분자들의 개발과 관련된 여기서 상기한 문제들이 한층 더 악화된다. 그와 같은 이중 특이 항체는 인식되는 양쪽 모두의 항원들이 동물들에서 안전성 실험을 위해 허락되는 주어진 동물의 종과 종간 특이성을 띤다.

또한 위에서 명시되었던 것과 같이, 본 발명은 인간과 침팬지가 아닌 영장류 CD3 입실론 사슬의 에피토프에 결합할 수 있는 제1 결합 도메인과 인간 그리고/또는 침팬지가 아닌 영장류의 EGFR, Her2/neu 또는 IgE로부터 선택된 세포 표면 항원에 결합할 수 있는 제2 결합 도메인을 포함하는 폴리펩티드들을 제공하며, 상기 폴리펩티드들에서 상기 제2 결합 도메인은 바람직하게는 또한 인간 그리고/또는 침팬지가 아닌 영장류의 세포 표면 항원에 결합한다. 본 발명의 바람직한 폴리펩티드의 요구들을 채워주는 약제 후보들로서 이중특이성의 단일 사슬 항체 분자들의 이점은 전임상 단계의 동물 연구들에서 그리고 심지어 인간을 피검자로 한 임상학적 연구들에서의 그 분자들의 사용이다. 본 발명의 종간 교차 특이적 이중특이 단일 사슬 항체들의 바람직한 일 실시예에서, 세포 표면 항원에 결합할 수 있는 제2 결합 도메인은 인간을 기원으로 한 것이다. 본 발명에 상응하는 종간 교차 특이적 이중특이 분자에서 인간과 침팬지가 아닌 영장류 CD3 입실론 사슬의 에피토프에 결합할 수 있는 결합 도메인은 이중특이 분자의 N-말단이나 C-말단에 있는 VH-VL 또는 VL-VH의 순서로 위치하게 된다. 일차와 제2 결합 도메인에서 VH-사슬과 VL-사슬의 다른 배치에 있는 본 발명에 상응하는 종간 교차 특이적 이중특이 분자들에 대한 예들이 첨부된 예들에 기술되어 있다.

본 명세서에서 사용된 "이중특이 단일 사슬 항체"는 두 개의 결합 도메인을 포함하는 단일 폴리펩티드 사슬을 명시한다. 아래에 보다 상세하게 설명된 것처럼, 각각의 결합 도메인은 항체의 무거운 사슬("VH 부위")로부터의 하나의 가변적 부위를 포함하고, 그 도메인에서 제1 결합 도메인의 VH 부위는 CD3[epsilon] 분자에 특이적으로 결합하고, 제2 결합 도메인의 VH 부위는 세포 표면 항원에 특이적으로 결합한다. 두 개의 결합 도메인들은 짧은 폴리펩티드 간극기(spacer)에 의해 서로에게 선택적으로 연결된다. 폴리펩티드 간극기의 국한됨이 없는 예는 GIy-GIy-GIy- Gly-Ser (G-G-G-S)이고 그런 이유로 반복한다. 각각의 결합 도메인은, 항체의 가벼운 사슬("VL 부위")로부터의 하나의 가변적 부위와, 폴리펩티드 연결자(linker)를 통해 서로에게 연결되어 있는 제1 결합 도메인과 제2 결합 도메인 각각의 범위 내에서 VH 부위와 VL 부위를 포함하고, EP 623679 B1에서 개시되고 청구된 타입의 예로서, 하지만 제1 결합 도메인의 VH-부위와 VL-부위 그리고 제2 결합 도메인의 VH-부위와 VL-부위가 서로와 쌍을 이룰 수 있기에 충분히 긴 경우에, 모두 다 각각의 제1 분자들과 제2 분자들에 특이적으로 결합할 수 있다.

본 발명의 바람직한 일 실시예에 따르면, 위에서 특징화된 이중특이 단일 사슬 항체 분자는 서열번호: 441 - 446, 서열번호: 453 - 458, 서열번호: 463 - 468, 서열번호: 481 - 486에서 선택된 제2 결합 도메인의 CDR H1, CDR H2, CDR H3, CDR L1, CDR L2 그리고 CDR L3와 같은 다음에 오는 한 그룹의 서열들을 포함한다.

본 발명의 특별히 바람직한 일 실시예는 상기 특징화된 폴리펩티드에 관한 것이고, 그 폴리펩티드에서 이중특이 단일 사슬 항체 분자은 하기의 (a)와 (b로부터 선택된 서열을 포함한다:

(a) 서열번호들: 389, 391, 393, 395, 397, 399, 409, 411, 413, 415, 417, 419, 429, 431, 433, 435, 437, 439, 447, 449, 451, 469, 471, 473, 475, 477, 479, 495, 497, 499, 501, 503 그리고 505 중 어떤 것에서 표현되는 것과 같은 아미노산 서열; 그리고

(b) 서열번호들: 390, 392, 394, 396, 398, 400, 410, 412, 414, 416, 418, 420, 430, 432, 434, 436, 438, 440, 448, 450, 452, 470, 472, 474, 476, 478, 480, 496, 498, 500, 502, 504 그리고 506 중 어떤 것에서 표현되는 것과 같은 핵산 서열에 의해 암호화된 아미노산 서열.

본 발명의 바람직한 일 실시예에서, 이중특이 단일 사슬 항체들은 CD3 입실론에 대하여 그리고 그 항체들의 제2 결합 도메인에 의해 인식되는 종양 항원에 대하여 종간 교차 특이적이다.

다른 실시예에서, 본 발명은 본 발명의 상기 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열을 제공한다.

본 발명은 또한 본 발명의 핵산 분자를 포함하는 벡터에 관한 것이다.

많은 적절한 벡터들이 분자생물학에서 숙련된 인간들에게 알려져 있는데, 상기 벡터의 선택은 원하는 기능에 의존하며, 유전공학에서 기존에 사용된 플라스미드(plasmids), 코즈미드들(cosmids), 바이러스들, 박테이로파지들(bacteriophages) 그리고 그외 다른 벡터들을 포함한다. 이 기술에서 숙련된 인간들에 잘 알려져 있는 방법들이 다양한 플라스미드들과 벡터들을 구축하기 위해 사용될 수 있다; 예를 들면, Sambrook et al. (loc cit.) and Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. (1989), (1994)에 기술된 기술들을 참조하시오. 대안적으로, 본 발명의 폴리뉴클레오티드들과 벡터들이 표적 세포들에 송달을 위하여 리포좀들 속으로 재구축될 수 있다. 아래에서 보다 상세하게 논의된 것과 같이, 클로닝 벡터가 DNA의 개개의 서열들을 격리시키는데 사용되었다. 연관된 서열들이 특정한 폴리펩티드의 발현이 요구되는 발현 벡터들 속으로 옮겨 질 수 있다. 전형적인 클로닝 벡터들은 pBluescript SK, pGEM, pUC9, pBR322 그리고 pGBT9를 포함한다. 전형적인 발현 벡터들은 pTRE, pCAL-n-EK, pESP-1, pOP13CAT을 포함한다.

바람직하게는 상기 벡터는 여기서 정의된 상기 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 조절 서열인 핵산 서열을 포함한다.

"조절 서열(regulatory sequence)"이란 용어는 DNA 서열들이 결찰되어 있는 암호화 서열들의 발현을 달성하기 위해 필요한 DNA 서열들을 말한다. 그러한 조절 서열들의 본성은 숙주 생물체에 따라 달라진다. 원형세포들에서, 조절 서열들은 일반적으로 프로모터, 리보솜 결합 자리, 그리고 종결자들을 포함한다. 진핵세포들에서는 일반적으로 조절 서열들이 프로모터들(promoters), 종결자들(terminators) 그리고, 어떤 경우에는, 증강인자들(enhancer), 트랜스활성자들(tranactivators) 또는 전사 인자들(transcription factors)을 포함한다. 용어 "제어 서열(control sequence)"은 발현을 위하여 필요한 모든 구성 요소들의 존재를 최소한으로 포함하는 것을 의도하고, 그 서열의 존재는 발현을 위해 필수적이며, 또한 추가적인 유익한 구성 요소들을 포함할 수도 있다.

"작동가능하게 연결된(operably linked)"이란 용어는 병렬배치를 말하는데, 여기서 그렇게 기술된 구성 요소들은 그들을 의도된 방법으로 기능하도록 하는 관계에 있다. 암호화 서열에 "작동가능하게 연결된" 제어 서열은 암호화 서열의 발현이 제어 서열들과 양립할 수 있는 조건들 하에서 달성되는 그러한 방법으로 결찰된다. 상기 제어 서열이 프로모터인 경우, 바람직하게는 이중 가닥의 핵산이 사용된다는 것은 이 기술에 통상의 지식을 가진 자들에게는 명백하다.

그러므로, 상기 언급된 벡터는 바람직하게는 발현 벡터이다. "발현 벡터"는 선택된 숙주를 형질전환시키기 위해 사용될 수 있는 구축물이고 선택된 숙주에서 암호화 서열의 발현을 제공한다. 발현 벡터들은 예를 들면 클로닝 벡터들, 이원 벡터들 또는 통합 벡터들일 수 있다. 발현은 바람직하게는 번역가능한 mRNA 속으로 핵산 분자를 전사하는 것을 포함한다. 원핵세포들 그리고/또는 진핵세포들에서 발현을 보증하는 조절 요소들은 이 기술에서 숙련된 인간들에게 잘 알려져 있다. 진핵세포들의 경우에 조절 요소들은 정상적으로는 전사의 개시를 보증하는 프로모터들을 포함하고 선택사항으로 전사의 종결과 유전정보의 사본의 안정화를 보증하는poly-A 신호들을 포함한다. 원핵생물의 숙주 세포들에서의 발현을 허용해주는 실행 가능한 조절 요소들은 예를 들어 E. coli에서 PL, lac, trp 또는 tac 프로모터를 포함하고, 진핵생물의 숙주 세포들에서의 발현을 허용해주는 예들은 효모에서 A0X1 또는 GAL1 프로모터, 또는 CMV-, SV40-, RSV-프로모터 (Rous sarcoma virus), 포유류와 그외 다른 동물 세포들에서 CMV-증강인자, SV40-증강인자 또는 글로빈 인트론(globin intron)이다.

전사의 개시에 책임이 있는 요소들에 추가해서, 그런 조절 요소들도 또한 SV40-poly-A 자리 또는 tk-poly-A 자리. 폴리뉴클레오티드의 하위부분과 같은 전사 신호들을 포함할 수 있다.

더욱이, 사용되는 발현 시스템에 의존하여 폴리펩티드를 세포의 분획에 인도할 수 있거나 또는 배지 속으로 폴리펩티드를 분비할 수 있는 대장 서열들이 자세히 열거된 핵산 서열의 암호화 서열에 추가될 수 있고 이 기술에서는 잘 알려져 있다; 또한 첨부되는 예들을 참조하시오. 대장 서열(들)은 번역, 개시 그리고 종결 서열들, 그리고 바람직하게는, 주변세포질의 공간 또는 세포 외부의 배지 속으로 번역된 단백질, 또는 그것의 한 부분의 분비를 지시할 수 있는 대장 서열로 적절한 시기에 조립된다. 선택사항으로서, 이종기원의 서열은 원하는 특징들, 예를 들면, 발현된 재조합 생성물의 안정화 또는 단순화된 정제와 같은 것을 전해주는 N-말단의 동일성 검증 펩티드를 포함하는 융합 단백질을 암호화할 수 있다; 위의 내용을 참조하시오. 이러한 맥락에서, Okayama-Berg cDNA 발현 벡터 pcDV1 (Pharmacia), pCDM8, pRc/CMV, pcDNAI, pcDNA3 (In-vitrogene), pEF-DHFR, pEF-ADA 또는 pEF-neo (Mack et al. PNAS (1995) 92, 7021- 7025 그리고 Raum et al. Cancer Immunol lmmunother (2001) 50(3), 141-150) 또는 pSPORTI (GIBCO BRL)와 같은 적절한 발현 벡터들이 이 기술에서 알려져 있다.

바람직하게는, 상기 발현 조절 서열들은 진핵생물의 숙주 세포들을 감염시키는 것의 형질전환을 가능하게 하는 벡터들에서의 진핵생물의 프로모터 시스템들일 것이지만, 그러나 원핵생물 숙주들을 위한 조절 서열들도 또한 사용될 수 있다. 일단 벡터가 적당한 숙주 속으로 협동해 들어가면, 그 숙주는 뉴클레오티드 서열들의 높은 수준의 발현에 적절한 조건들 아래에서 지탱되고, 뜻하던 대로, 본 발명의 폴리펩티드의 수집과 정제는 다음에 따라올 것이다; 예로서, 첨부되는 예들을 참조함.

세포 주기 상호작용 단백질을 발현하기 위해 사용될 수 있는 또 다른 발현 시스템이 곤충 시스템이다. 그러한 한 시스템에서, Autographs californica nuclear polyhedrosis virus (AcNPV)는 Spodoptera frugiperda 세포들 또는 Trichoplusia larvae에서 외래 속을 발현시키기 위해 벡터로서 사용된다. 자세히 열거된 핵산 분자의 암호화 서열은 폴리헤드린(polyhedrin) 유전자와 같이, 바이러스의 필수적인 아닌 부위 속으로 클로닝되어, 폴리헤드린 프로모터의 통제하에 놓이게 될 수 있다. 상기한 암호화 서열의 성공적인 삽입은 폴리헤드린 유전자에 불활성을 부여하고 피막 단백질 피막이 결손된 재조합 바이러스를 생산할 것이다. 재조합 바이러스들은 그런 다음 S. frugiperda cells 또는 Trichoplusia larvae를 감염시키기 위해 사용되고, 그 사용에서 본 발명의 단백질이 발현된다(Smith, J. Virol. 46 (1983), 584; Engelhard, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 91 (1994), 3224-3227).

추가적인 조절 요소들은 전사의 증강인자들 그리고 번역 증강인자들도 역시 포함한다. 유익하게도, 본 발명의 상기한 벡터들은 선택 가능한 그리고/또는 객관적으로 점수화할 수 있는 표지(marker)를 포함한다.

형질전환된 세포들과, 예를 들어, 식물 조직과 식물들의 선택에 유용한 선택가능한 표지 유전자들이 이 기술에서 숙련된 인간들에게 잘 알려져 있고, 예를 들면, 메토트렉세이트(methotrexate)에 내성을 부여하는 dhfr에 대한 선택의 기준으로서 항대사 내성을 포함한다(Reiss, Plant Physiol. (Life Sci. Adv.) 13 (1994), 143-149); 아미노글리코시드들인 네오마이신(neomycin), 가나마이신(kanamycin) 그리고 파로마이신(paromycin)에 내성을 부여하는 npt (Herrera-Estrella, EMBO J. 2 (1983), 987-995) 그리고 히그로마이신(hygromycin)에 내성을 부여하는 hygro(Marsh, Gene 32 (1984), 481-485). 추가적인 선택가능한 유전자들이 이름하여 trpB으로 기술되었고, 그것은 세포들이 트립토판(tryptophan)의 자리에 인돌기(indole)를 이용할 수 있게 해준다; 히스티딘(histidine)의 자리에 히스티놀기(histinol)를 이용할 수 있게 해주는 hisD(Hartman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988), 8047); 만노즈(mannose)(WO 94/20627)를 이용할 수 있게 해주는 만노즈-6-포스페이트 이소머라아제(mannose-6-phosphate isomerase), 그리고 오르니틴 디카르복실라아제(ODC, ornithine decarboxylase) 저해제, 2-(디플루오로메틸)- DL-오르니틴(2-(difluoromethyl)- DL-ornithine), DFMO(McConlogue, 1987, In: Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory ed.)에 내성을 부여하는 오르니틴 디카르복실라아제 또는 블라스티시딘 에스(Blasticidin S)에 내성을 부여하는 Aspergillus terreus로부터의 디아미나아제(deaminase)(Tamura, Biosci. Biotechnol. Biochem. 59 (1995), 2336-2338).

유용한 객관적으로 점수화할 수 있는 표지들은 또한 이 기술에서 숙련된 인간들에게 잘 알려져 있고 상업적으로 이용가능하다. 유익하게도, 상기한 표지는 루시퍼라아제(luciferase)(Giacomin, Pl. Sci. 116 (1996), 59-72; Scikantha, J. Bact. 178 (1996), 121), 녹색 형광 단백질 (Gerdes, FEBS Lett. 389 (1996), 44-47) 또는 베타-글루코유로니아아제(β-glucouronidase) (Jefferson, EMBO J. 6 (1987), 3901-3907)를 암호화하는 유전자이다. 이러한 실시예는 열거된 벡터를 함유하는 세포들, 조직들 그리고 유기체들의 간단하고 빠른 스크리닝을 위해 특별히 유용하다.

위에서 설명된 것처럼, 열거된 핵산 분자는 단독으로 또는 벡터의 일부분으로서, 세포들에서 본 발명의 폴리펩티드를 발현하기 위해서 사용될 수 있는데, 예를 들면, 정제를 위해서 그러나 또한 유전자 치료법의 목적을 위해서이다. 위에서 기술된 본 발명의 폴리펩티드의 어느 하나를 암호화하는 DNA 서열(들)을 함유하고 있는 핵산 분자들이나 벡터들이 그에 대응하여 목적하는 폴리펩티드를 생산하는 세포들 속으로 도입된다. ex-vivo 또는 in-vivo 기술들에 의해 세포들 속으로 치료용 유전자들을 도입시키는 것에 기초하는 유전자 치료법은 유전자 전달의 가장 중요한 적용들 중 하나이다. ex-vivo 또는 in-vivo 유전자 치료법을 위한 적절한 벡터들, 방법들 또는 유전자-송달 시스템들이 문헌에 기술되어 있고 이 기술에서 숙련된 인간에게 알려져 있다; 예를 들어, Giordano, Nature Medicine 2 (1996), 534-539; Schaper, Circ. Res. 79 (1996), 911-919; Anderson, Science 256 (1992), 808-813; Verma, Nature 389 (1994), 239; Isner, Lancet 348 (1996), 370-374; Muhlhauser, Circ. Res. 77 (1995), 1077-1086; Onodera, Blood 91 (1998), 30-36; Verma, Gene Ther. 5 (1998), 692-699; Nabel, Ann. N.Y. Acad. Sci. 811 (1997), 289-292; Verzeletti, Hum. Gene Ther. 9 (1998), 2243-51; Wang, Nature Medicine 2 (1996), 714-716; WO 94/29469; WO 97/00957, US 5,580,859; US 5,589,466; 또는 Schaper, Current Opinion in Biotechnology 7 (1996), 635-640을 참조함. 열거된 핵산 분자들 또는 벡터들은 세포 속으로 직접적인 도입을 위해 또는 리포좀들을 통한 도입 또는 바이러스의 벡터들(예를 들어, 아데노바이러스의, 레트로바이러스의)의 도입을 위해 고안될 수 있다. 바람직하게는, 상기한 세포는 생식선 세포, 배아 세포, 또는 난세포나 그것에서 유래한 세포이고, 가장 바람직하게는 상기한 세포는 줄기세포이다. 배아줄기세포에 대한 예는 그 중에서도 특별히, Nagy, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993), 8424-8428에 기술되어 있는 것과 같은 줄기세포가 될 수 있다.

본 발명은 또한 본 발명의 벡터로 형질전환되었거나 감염된 숙주를 제공한다. 상기한 숙주는 위에서 기술된 본 발명의 벡터 또는 위에서 기술된 본 발명의 핵산 분자를 숙주 속으로 도입함에 의해서 생산될 수 있다. 숙주에서 적어도 하나의 벡터 또는 적어도 하나의 핵산 분자의 존재는 위에서 기술된 단일 사슬 항체 구축물들을 암호화하는 유전자의 발현을 매개할 수 있다.

숙주에 도입이 되는 본 발명의 상기한 핵산 분자 또는 벡터는, 숙주의 게놈 속으로 통합될 수 있고 그렇지 않으면 그것은 염색체 외부에서 유지될 것이다.

상기 숙주는 원핵세포이거나 진핵세포일 수 있다.

용어 "원핵생물"는 모든 세균들를 포함하는 의미이고, 그것들은 본 발명의 단백질의 발현을 위해서 DNA 또는 RNA 분자들로 형질전환될 수도 있고 감염될 수도 있다. 원핵생물 숙주들은, 예를 들면, E. coli, S. typhimuhum, Serratia marcescens 그리고 Bacillus subtilis와 같은 그람 음성 세균들 그리고 그람 양성 세균들도 역시 포함한다. 용어 "진핵생물"는 효모, 고등 식물, 곤충 그리고 바람직하게는 포유류 세포들을 포함하는 의미이다. 재조합 생산 과정에서 채택되는 숙주에 의존적이면서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되는 단백질은 글리코실화가 되었을 수도 있고 또는 글리코실화가 되지 않은 것일 수도 있다. 본 발명의 폴리펩티드의 암호화 서열을 함유하고 있고, N-말단 플래그-태그(N-terminal FLAG-tag) 그리고/또는 C-말단 His-태그로 유전적으로 융합된 플라스미드나 바이러스의 사용이 특별히 바람직하다. 바람직하게는, 상기 플래그-태그의 길이는 약 4개 내지 8개 아미노산들이고, 가장 바람직하게는 8개 아미노산들이다. 위에서 기술된 폴리뉴클레오티드는 이 기술에서 보통의 기술을 가진 인간에게 보통 알려져 있는 기술 중 하나를 사용하여 숙주를 형질전환시키거나 감염시키기 위해 사용될 수 있다. 더욱이, 융합되고, 작동가능하게 연결된 유전자들을 준비하고, 예를 들어, 포유류 세포들과 세균들에서 그것들을 발현시키기 위한 방법들이 이 기술에서 잘 알려져 있다(Sambrook, loc cit.).

바람직하게는, 상기 숙주는 세균 또는 곤충, 곰팡이, 식물 또는 동물 세포이다.

열거된 숙주가 포유류라는 사실이 특별히 표현된다. 특별히 바람직하게는 숙주 세포들이 CHO 세포들, COS 세포들, SP2/0 또는 NS/0와 같은 골수 세포주를 포함한다. 첨부된 예들에서 표현되는 것과 같이, 숙주들이 CHO 세포들인 것이 특별히 바람직하다.

보다 바람직하게는 상기 숙주 세포가 인간 세포이거나 인간 세포주, 예를 들어 per.c[theta] (Kroos, Biotechnol. Prog., 2003, 19:163-168)이다.

또 다른 실시예에서, 본 발명은 상기한 대로 본 발명의 폴리펩티드의 생산을 위한 과정에 관한 것이고, 상기 과정은 본 발명의 폴리펩티드를 발현할 수 있고 제조된 폴리펩티드를 배양물로부터 회수할 수 있는 조건하에서, 본 발명의 숙주를 배양하는 단계를 포함한다.

형질전환된 숙주들이 적정한 세포 성장을 달성하기 위하여 이 기술에서 알려진 기술들에 따라서 발효기들에서 성장하고 배양될 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드는 그 다음 성장 배지, 세포 융해물들, 또는 세포막 조각들로부터 격리될 수 있다. 예를 들어, 미생물로 발현된 본 발명의 폴리펩티드들의 격리와 정제는 기존의 방법들에 의해 이루어질 수 있고, 그 방법들은 예를 들어, 본 발명의 폴리펩티드의 태그에 대항하여 또는 첨부된 예들에서 설명된 것처럼 지시된, 단일클론 또는 폴리클론 항체들의 사용을 포함하는 방법들과 같은, 예를 들면, 조제용 크로마토그래피 분리법들과 면역학적 분리법과 같은 방법들이다.

발현을 가능하게 하는 숙주의 배양을 위한 조건들이 이 기술에서 알려져 있고 그 조건은 그와 같은 과정에서 사용되는 숙주 시스템과 발현 시스템/벡터에 의존적이다. 재조합 폴리펩티드의 발현을 가능하게 하는 조건들을 성취하기 위해서 변형된 파라미터들이 이 기술에서 알려져 있다. 그 결과, 적절한 조건들은 또 다른 독창적인 정보가 없는 곳에서는 이 기술에서 숙련된 인간에 의해 결정될 수 있다.

일단 발현되면, 본 발명의 폴리펩티드가 황산 암모늄 침강법(ammonium sulfate precipitation), 친화성 컬럼들(affinity columns), 컬럼 크로마토그래피(column chromatography), 겔 전기영동법(gel electrophoresis) 그리고 그와 유사한 공정을 포함하여 이 기술의 표준 공정들에 따라서 정제될 수 있다; Scopes, "Protein Purification", Springer- Verlag, N.Y. (1982)를 참조하시오. 약학적 사용을 위해서, 적어도 약 90 내지 95% 균질성을 가지는 실질적으로 순수한 폴리펩티드들이 바람직하고, 98 내지 99% 또는 그 이상의 균질성을 가지는 것이 가장 바람직하다. 일단 정제가 되면, 부분적으로 또는 원하는 수준의 균질성을 가지기까지, 본 발명의 폴리펩티드는 치료적으로나(체외 사용을 포함하여) 또는 실험 공정들을 발전시키고 수행하는 중에 사용될 수 있다. 더욱이, 배양으로부터의 본 발명의 폴리펩티드의 회복을 위한 방법들의 예들이 첨부된 예들에서 상세히 기술되어 있다.

더욱이, 본 발명의 폴리펩티드 또는 위에서 개시된 과정에 의해 생산된 폴리펩티드를 포함하는 조성물을 제공한다. 바람직하게는, 상기 조성물은 약학적 조성물이다.

본 발명에 따르면, 용어 "약학적 조성물"은 환자, 바람직하게는 인간 환자에 대한 투여를 위한 조성물을 말한다. 본 발명의 특별히 바람직한 약학적 조성물은 컨텍스트에서 독립적인 CD3 에피토프들에 대항하여 지시되여 그들에 대항하여 생성되는 결합 분자들을 포함한다.

바람직하게는, 약학적 조성물은 담체들, 안정화제들 그리고/또는 부형제들의 적절한 제형들(formulations)을 포함한다. 바람직한 일 실시예에서, 약학적 조성물은 비경구적, 경피로, 강내의, 동맥내, 격막내 그리고/또는 비강내 투여 또는 조직 속으로의 직접 주사법을 위한 조성물을 포함한다. 상기한 조성물이 주입 또는 주사를 통해서 환자에게 투여되는 것이 특별히 관찰된다. 적절한 조성물들의 투여는, 예를 들어, 정맥내, 복강내, 피하로, 근육내, 국소적 또는 피부내 투여와 같은 여러 방법들에 의해 영향을 받을 것이다. 특별히, 본 발명은 적절한 조성물의 중단되지 않은 투여를 제공한다. 국한됨이 없는 예로서, 중단되지 않은, 다시 말해서, 연속적인 투여는 환자의 몸속으로 치료용 약제의 유입을 계량화하기 위해 환자에게 착용된 작은 펌프 시스템에 의해 달성될 수 있다. 본 발명의 컨텍스트에서 독립적인 CD3 에피토프들에 대항하여 지시되여 그들에 대항하여 생성되는 결합 분자들을 포함하는 약학적 조성물이 상기한 펌프 시스템들을 사용하여 투여될 수 있다. 그러한 펌프 시스템들은 이 기술에서 일반적으로 알려져 있고, 보통은 유입되기 위한 치료용 약제를 함유하는 카트리지의 주기적인 교체에 의지한다. 그러한 펌프 시스템에서 카트리지를 교체할 때, 환자의 몸속으로 치료용 약제의 다른 방법으로 중단되지 않은 유출입의 일시적 중단이 뒤이어 일어날 수 있다. 그와 같은 경우에, 카트리지 교체에 앞선 투여의 상태와 카트리지 교체 후의 투여의 상태는 약학적 수단들의 의미의 범주 내에서 여전히 고려될 것이고 본 발명의 방법들은 그와 같은 치료용 약제의 하나의 "중단되지 않은 투여"를 함께 보상한다.

본 발명의 컨텍스트에서 독립적인 CD3 에피토프들에 대항하여 지시되어서 그들에 대항하여 생성되는 이들 결합 분자들의, 유액을 저장소 밖으로 배출시키기 위한 유액 배출 기전과 배출 기전을 가동하기 위한 가동 시스템을 포함하는, 연속된 또는 중단되지 않은 투여가 유액 송달 장치 또는 작은 펌프 시스템을 통해 정맥내로 또는 피하로 행해질 수 있다. 피하 투여를 위한 펌프 시스템들은 환자의 피부를 관통하여 환자의 몸속으로 적절한 조성물을 송달하기 위한 바늘이나 카눌라를 포함할 수 있다. 상기한 펌프 시스템들은 정맥, 동맥 또는 혈관에 독립적으로 환자의 피부에 직접 고정되거나 또는 부착되고, 그에 의하여 펌프 시스템과 환자의 피부 사이에 직접적인 접촉을 가능하게 할 수 있다. 펌프 시스템은 환자의 피부에 24시간에서 수일 동안 부착될 수 있다. 펌프 시스템은 작은 부피를 위한 저장소를 가진 작은 크기일 수 있다. 국한됨이 없는 예로서, 투여되기 위한 적절한 약학적 조성물을 위한 부피는 0.1ml에서 50 ml 사이일 수 있다.

연속적인 투여는 피부에 착용되는 패치를 통해 경피로 될 수 있고 일정 시간 간격을 두고 교체될 것이다. 이 기술에서의 숙련된 인간은 이 목적에 적절한 약제 송달을 위한 패치 시스템들을 숙지하고 있다. 경피적 투여는 특별히 중단되지 않는 투여를 특별히 지켜야하므로, 이에 첫 번째 소모된 패치의 교환이 유익하게도 새로운 두 번째 패치의 장착과 동시에 수행될 수 있는데, 예를 들면, 첫 번째 소모된 패치에 바로 근접한 피부의 표면에, 그리고 첫 번째 소모된 패치의 제거의 바로 이전에 될 수 있다. 유출입 중단 또는 동력 세포 기능 부전의 문제점들은 야기되지 않는다.

컨텍스트에서 독립적인 CD3 에피토프들에 대항하여 지시되어서 그들에 대항하여 생성되는 결합 분자들을 특별히 포함하는 본 발명의 조성물은 또한 약학적으로 허용가능한 담체를 포함한다. 적절한 약학적 담체들의 예들이 이 기술에서 잘 알려져 있고, 예를 들어 인산염 완충 생리식염(phosphate buffered saline) 용액들, 물, 유액들(emulsions), 유상/수상 유액들(oil/water emulsions)과 같은 것들, 다양한 유형들의 습윤제들(wetting agents), 멸균 용액들(sterile solutions), 리포좀들(liposomes) 등과 같은 용액을 포함한다. 그와 같은 담체들을 포함하는 조성물들은 잘 알려져 있는 기존의 방법들에 의해 제조될 수 있다. 제형들은 탄수화물들, 완충액들, 아미노산들 그리고/또는 계면활성제들(surfactants)를 포함할 수 있다. 탄수화물들은 비환원당들(non-reducing sugars), 바람직하게는 트레할로스(trehalose), 슈크로오스(sucrose), 옥타설페이트(octasulfate), 소르비톨(sorbitol) 또는 자일리톨(xylitol). 그러한 제형들은 펌프 시스템들로 그리고/또는 펌프 시스템들이 없이 정맥내로 또는 피하로 될 수 있는 연속적인 투여를 위해서 사용될 수 있다. 아미노산들은 하전된 아미노산들, 바람직하게는 라이신(lysine), 라이신 아세테이트(lysine acetate), 아르기닌(arginine), 글루타메이트(glutamate) 그리고/또는 히스티딘(histidine)일 수 있다. 계면활성제들은 세정제들, 바람직하게는 분자량이 >1.2 KD인 것들 그리고/또는 폴리에테르(polyether), 바람직하게는 분자량이 >3 KD인 것들일 수 있다. 바람직한 세정제들에 대한 국한됨이 없는 예들은 Tween 20, Tween 40, Tween 60, Tween 80 또는 Tween 85이다. 바람직한 폴리에테르들에 대한 국한됨이 없는 예들은 PEG 3000, PEG 3350, PEG 4000 또는 PEG 5000이다. 본 발명에서 사용된 완충 시스템들은 바람직한 pH 5-9일 수 있고 시트르산염(citrate), 숙신산염(succinate), 인산염(phosphate), 히스티딘 그리고 아세트산염(acetate)을 포함할 수 있다. 본 발명의 조성물들은, 예를 들어, 예로서 macaques와 같은 침팬지가 아닌 영장류들에 대해 여기서 기술된 종간 교차 특이적인, 본 발명의 폴리펩티드를 투여량을 증가시키면서 투여함에 의한 투여량의 단계적 증가 연구들에 의해 결정될 수 있는 적정한 투여량에서 객체에 투여될 수 있다. 위에서 제시된 바와 같이, 여기서 기술된 종간 교차 특이적인 본 발명의 폴리펩티드는 침팬지가 아닌 영장류들의 전임상단계 실험에서의 동일한 형태에서 그리고 인간에서 약제로서 유익하게 사용될 수 있다. 이 조성물들은 또한 다른 단백질성 약제들 및 비단백질성 약제들과 병용하여 투여될 수 있다. 이 약제들은 여기서 정의된 것과 같이 본 발명의 폴리펩티드 포함하는 조성물과 동시에 투여될 수 있고, 또는 정해진 시간대로의 간격과 투여량으로 상기한 폴리펩티드의 투여 전과 후에 개개의으로 투여될 수 있다. 투여 계획은 참석하는 의사와 임상 인자들에 의해 결정될 것이다. 의학적 기술에서는 잘 알려져 있는 것처럼, 환자의 신체사이즈, 신체의 표면적, 연령, 투여되는 특정한 화합물, 성별, 투여되는 시간과 경로, 전반적인 건강상태, 그리고 병용해서 투여되는 다른 약제들을 포함하여, 한 환자를 위한 투여들은 많은 인자들에 의존적이다. 비경구적 투여를 위한 제법들은 멸균 수성 또는 비멸균 수성 용액들, 현탁액들(suspensions), 그리고 유제들을 포함한다. 비수성 용매들의 예들은 프로필렌 글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol), 올리브유와 같은 식물성 기름들, 그리고 에틸 올레이트(ethyl oleate)와 같은 주사 가능한 유기 에테르들이다. 수성 담체들은, 생리식염액과 완충 기초액을 포함하여, 물, 알콜성/수성 용액들(alcoholic/aqueous solutions), 유액들 또는 현탁액들을 포함한다. 비경구적 수송체들은 염화나트륨 용액, 덱스트로오수 링거씨액(Ringer's dextrose), 덱스트로오스 그리고 염화나트륨, 젖산염 링거씨액(lactated Ringer's), 또는 불휘발성 기름들을 포함한다. 정맥내 수송체들은 액체와 영양분 보충액들, 전해질 보충액들(링거씨 포도당액에 기초한 보충액과 같은), 그리고 그와 유사한 것을 포함한다. 보존제들과 그외 다른 첨가제들도 존재할 수 있는데, 예를 들면, 항생제들, 항산화제들, 킬레이트 시약들(chelating agents), 불활성 기체들 그리고 그와 유사한 것이다. 추가적으로, 본 발명의 조성물은 예를 들어, 바람직하게는 인간 기원의, 혈청 알부민(serum albumin) 또는 면역글로불린(immunoglobulin)과 같은 단백질성 담체들을 포함할 수 있다. 본 발명의 조성물은 여기서 정의된 본 발명의 폴리펩티드에 추가적으로, 조성물의 의도하는 사용에 의존적으로 더욱 생물학적으로 활성이 있는 약제들을 포함할 수 있는 사실이 관찰된다. 그러한 약제들은 위장관 계통에 작용하는 약제들, 세포증식억제제(cytostatica)로 작용하는 약제들, 고요산혈증(hyperurikemia)을 예방하는 약제들, 면역반응들을 저해하는 약제들 (예를 들어 크로티코스케로이드들(corticosteroids)), 염증반응을 조절해주는 약제들, 순환 계통에 작용하는 약제들 그리고/또는 이 기술에서 잘 알려져 있는 시토카인들과 같은 약제들일 수 있다.

여기서 정의된 약학적 조성물의 생물학적 활성은 예를 들어 세포독성 실험들에 의해 결정될 수 있고, 이는 WO 99/54440 또는 Schlereth 등 (Cancer Immunol. Immunother. 20 (2005), 1 - 12)에 기술되어 있다. 본 명세서에서 사용된 "효능(efficacy)" 또는 "생체내 효능"은, 예를 들어 standardized NCI response criteria를 사용하는, 본 발명의 약학적 조성물에 의한 치료법에 대한 반응을 말한다. 본 발명의 약학적 조성물을 사용하는 치료법의 성공 또는 생체내 효능은 그 조성물의 요구되는 목적을 위한 조성물의 유효성(effectiveness)을 말하는데, 다시말해, 그 유효성은 그 조성물의 요구되는 효과, 다시 말해서, 예를 들어 종양 세포들과 같은 병적상태의 세포들의 고갈이다. 생체내 효능은, 다음에 열거된 것들에 국한됨이 없이, 백혈구 숫자, 미분법, 형광활성세포분류법(FACS), 골수 천차을 포함하는, 각각의 질병명(질병단위)를 위해 설립된 표준 방법들에 의해 모니터링될 수 있다. 추가적으로, 여러 질환 특이적 임상화학 파라미터들과 그외 다른 설립된 표준 방법들이 사용될 수 있다. 더욱이, 컴퓨터단층촬영(CT), 엑스레이, 핵자기공명(NMR)단층촬영(예를 들어 for National Cancer Institute-criteria에 기초한 반응 평가를 위한 [Cheson BD, Horning SJ, Coiffier B, Shipp MA, Fisher Rl, Connors JM, Lister TA, Vose J, Grillo-Lopez A, Hagenbeek A, Cabanillas F, Klippensten D, Hiddemann W, Castellino R, Harris NL, Armitage JO, Carter W, Hoppe R, Canellos GP. Report of an international workshop to standardize response criteria for non-Hodgkin's lymphomas. NCI Sponsored International Working Group. J Clin Oncol. 1999 Apr; 17(4): 1244]), 양전자 방출 촬영(PET) 스캐닝, 백혈구수, 미분, 형광활성세포분류법, 골수 천차, 림프절 생검들/조직구조들, 그리고 다양한 림프종양 특이적 임상화학 파라미터들(예를 들어 락테이트 디히드로게네이즈(lactate dehydrogenase)) 그리고 그외 다른 설립된 표준 방법들이 사용될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물과 같은 약제들의 개발에서 또 다른 주요한 도전은 약학적 속성들의 예측가능한 조절이다. 그것 때문에, 약제 후보의 약제동력학적 프로파일, 다시 말해, 주어진 상태를 치료하기 위한 특정한 약제의 능력을 유효하게 하기 위한 약제동력학적 파라미터들의 프로파일이 설립되었다. 약제동력학적 파라미터들은 다음에 열거된 것들에 국한됨이 없이 포함한다: 반감기, 분포 용적, 간의 초회 통과 대사 그리고 혈청 결합의 정도. 주어진 약품의 효능은 위에서 언급한 각각의 파라미터들에 의해 영향받을 수 있다.

"반감기"는 투여된 약제의 50%가, 예를 들어 대사, 분비 등의 생물학적 과정들을 통해서 제거되는 곳에서의 시간을 의미한다.

"간의 초회 통과 대사"에 의해 의미되는 것은 간과 첫 번째 접촉할 때 대사되는 약제의 성향, 다시 말해, 간을 통한 그 약제의 초회 통과이다. "분포의 용적"은 예를 들어 세포 내부와 세포 외부의 공간들, 조직들과 장기들 등과 이 구획들 범위 내에서 약제의 분포와 같이, 신체의 여러 구획들을 통한 약제의 체류 정도를 의미한다. "혈청 결합의 정도"는 알부민과 같은 혈청 단백질들과 상호작용하고 그것에 결합하여, 약제의 생물학적 활성의 감소나 또는 소실에 이르게 될 때, 그 약제의 성향을 의미한다.

약제동력학적 파라미터들은 또한 투여된 약제의 주어진 양에 대한 생물학적 이용률, 지연 시간(Tlag), 최대농도 도달시간(Tmax), 흡수 속도들, 약제효과 최초발현에 걸리는 시간(more onset) 그리고/또는 최대농도(Cmax)를 포함한다. "생물학적 이용률"은 혈액 구획에서 약제의 양을 의미한다.

"지연 시간(Lag time)"은 혈액이나 또는 혈장에서 약제의 투여와 그것의 검출과 측정가능성 사이에 시간 지연을 의미한다.

"Tmax"는 약제의 최대 혈액 농도가 도달된 후의 시간이고, "Cmax"는 주어진 약제로 최대로 획득되는 혈액 농도이다. 약제의 생물학적 효과를 위해 요구되는 혈액이나 또는 조직의 약제의 농도에 도달하기 위한 시간은 모든 파라미터들에 의해 영향을 받는다. 위에서 윤곽이 그려진 것과 같이 침팬지가 아닌 영장류들에서 전임상단계 동물 실험에서 결정될 수 있는 종간 교차 특이적인 본 발명의 폴리펩티드의 바람직한 실시예인, 이중특이 단일 사슬 항체들의 약제동력학적 파라미터들도 또한 Schlereth et al. (Cancer Immunol. Immunother. 20 (2005), 1 - 12)의 공표에 의해 예로서 제시되고 있다.

본 명세서에서 사용된 "독성"이라는 용어는 부작용 사례들 또는 심각한 역으로의 부작용 사례들에서 명백하게 나타난 약제의 독성 효과들을 말한다. 이 부작용 사례들은 투여 후에 전반적인 그리고/또는 국소적 내성의 결핍에서 약제의 내약성의 결핍을 말한다 독성도 또한 약제에 의해 야기된 최기형성 또는 종양유발 효과들을 포함할 수 있을 것이다.

본 명세서에서 사용된 "안전성", "생체내 안전성" 또는 "내약성"이란 용어들은 투여 후에 바로(국소적 내성) 그리고 약제을 적용하는 보다 긴 기간 중에 심각한 역작용 사례들을 유도하지 않는 약제의 투여를 정의한다.

용어 "안전성(Safety)", "생체내 안전성" 또는 "내약성(tolerability)"은 예를 들어 치료 중간에 그리고 추적치료 기간 중에 규칙적인 간격들에서 평가될 수 있다. 측정들은 임상적 평가, 예를 들어 장기의 증후 발현들, 그리고 검사결과 이상들의 스크리닝을 포함한다. 임상적 평가는 NCI-CTC 그리고/또는 MedDRA 표준들에 따라서 기록되고/코드화된 정상적인 연구결과에 대해 수행될 수 있고 그것으로 빗나가게 될 수도 있다. 장기의 증후 발현들은, Common Terminology Criteria for adverse events v3.0 (CTCAE)에서 예로서 제시되고 있는 것과 같이, 알러지/면역학, 혈액/골수, 심장 부정맥, 혈전 그리고 그와 유사한 것들을 포함할 수 있다. 실험될 수 있는 검사의 파라미터들은 예로서 혈액학, 임상 화학, 혈전 프로파일 그리고 소변 분석과 혈청, 혈장, 림프액이나 또는 척수액, 물 그리고 그와 유사한 것들과 같은 그외 다른 체액의 검사들과 같은 기준을 포함할 수 있다. 안전성은 이와 같이 예를 들어 신체검사, 영상화 기술들(다시 말해, 초음파, 엑스레이, CT 스캔, 자기 공명 영상(MRI)), 기술 장치들(다시 말해, 심전도기계)을 사용한 그외 다른 측정들, 생체 증상들, 검사 파라미터들을 측정하고 역작용 사례들을 기록함에 의해서 평가될 수 있다. 예를 들면, 본 발명에 따라서 사용들과 방법들에서 침팬지가 아닌 영장류들에서의 역작용 사례들이 조직병리학적 그리고/또는 조직화학적 방법들에 의해 실험될 수 있다.

본 명세서에서 사용된 "유효하고 독성이 없는 투여량"이란 용어는 주요한 독성 효과들이 없이 또는 본질적으로 없이 병적 상태의 세포들의 고갈, 종양 제거, 종양 축소 또는 질병의 안정화를 일으키기에 아주 충분한 여기서 정의된 것과 같은 이중특이 단일 사슬 항체의 허용될 수 있는 투여량을 말한다. 그러한 효과적이고 독성이 없는 투여량들은 예를 들어 이 기술에서 설명되어 있는 투여량 단계적 증가 연구들에 의해서 결정될 수 있고 심각한 역으로의 부작용들을 유도하는 투여량보다 적어야 할 것이다(투여 제한 독성(dose limiting toxicity, DLT)).

상기한 용어들은 또한 문헌[Preclinical safety evaluation of biotechnology-derived pharmaceuticals S6; ICH Harmonised Tripartite Guideline; ICH Steering Committee meeting on July 16, 1997]에도 언급되어 있다.

더욱이, 본 발명은 증식성 질환, 종양 질환, 또는 면역학적 기능이상으로부터 선택된 질환의 예방, 치료 또는 상태 향상를 위한, 본 발명의 폴리펩티드(다시 말해, 인간과 침팬지가 아닌 영장류 CD3 입실론 사슬의 에피토프에 결합할 수 있는 적어도 하나의 제1 결합 도메인을 포함하고, 거기서 본 발명에 따라서 또는 본 발명에 상응하는 과정에 따라 생산된, 에피토프는 서열번호: 2, 4, 6, 또는 8로 이루어진 그룹에서 포함되는 아미노산 서열의 일부분이다)를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다. 바람직하게는, 상기 약학적 조성물이 담체담체정화제들 그리고/또는 부형제들의 적절한 제형들을 더 포함한다.

본 발명의 또 다른 측면은 질환의 예방, 치료 또는 상태 향상를 위한 약학적 조성물의 제법을 위한, 여기서 위에서 정의된 것과 같은 또는 여기서 위에서 정의된 과정에 따라서 생산되는 폴리펩티드의 사용에 관한 것이다. 바람직하게는, 상기한 질환이 증식성 질환, 종양 질환, 또는 면역학적 기능이상이다. 상기한 종양성 질환은 악성 질환, 바람직하게는 암인 것이 보다 바람직하다.

본 발명의 폴리펩티드의 사용의 또 다른 바람직한 실시예에서 상기한 약학적 조성물은 추가적인 약제와 병용하여, 다시 말해서, 공동-치료법의 일환으로, 투여되기에 적절하다. 상기한 공동-치료법에서, 활성 약제는 본 발명의 폴리펩티드와 동일한 약학적 조성물에 선택사항으로 포함될 수 있거나, 또는 개개의 약학적 조성물에서 포함될 수 있다. 이 후자의 경우에서, 상기한 개개의 약학적 조성물이 본 발명의 폴리펩티드를 포함하는 상기한 약학적 조성물의 투여에 앞서서, 동시에 또는 그 후에 투여하기 위해 적절하다. 추가적인 약제 또는 약학적 조성물은 단백질이 아닌 화합물이나 또는 단백질성 화합물일 수 있다. 추가적 약제가 단백질성 화합물일 경우에, 그 단백질성 화합물은 면역 작동체 세포들을 위한 활성 신호들을 제공할 수 있다는 점이 유리하다.

바람직하게는 상기한 단백질성 화합물 또는 비단백질성 화합물이 본 발명의 폴리펩티드, 여기서 정의된 핵산 분자, 여기서 정의된 벡터, 또는 여기서 정의된 숙주와 동시에 투여되거나, 비-동시적으로(non-simultaneously) 투여될 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면은 본 주제에서 그것에 대한 요구로 질환의 예방, 치료 또는 상태 향상를 위한 방법에 관한 것이고, 상기한 방법은 본 발명의 약학적 조성물의 유효한 용량의 투여의 단계를 포함한다. 바람직하게는, 상기한 질환이 증식성 질환, 종양 질환, 또는 면역학적 기능이상이다. 보다 바람직하게는, 상기한 종양성 질환은 악성 질환, 암이다.

본 발명의 방법의 또 다른 바람직한 실시예에서 상기한 약학적 조성물은 추가적인 약제와 병용하여, 다시 말해서, 공동-치료법의 일환으로, 투여되기에 적절하다. 상기한 공동-치료법에서, 활성 약제는 본 발명의 폴리펩티드와 동일한 약학적 조성물에 선택사항으로 포함될 수 있거나, 또는 개개의 약학적 조성물에서 포함될 수 있다. 이 후자의 경우에서, 상기한 개개의 약학적 조성물이 본 발명의 폴리펩티드를 포함하는 상기한 약학적 조성물의 투여에 앞서서, 동시에 또는 그 후에 투여하기 위해 적절하다. 추가적인 약제 또는 약학적 조성물은 단백질이 아닌 화합물이나 또는 단백질성 화합물일 수 있다. 추가적 약제가 단백질성 화합물일 경우에, 그 단백질성 화합물은 면역 작동체 세포들을 위한 활성 신호들을 제공할 수 있음이 이점이 된다.

바람직하게는 상기한 단백질성 화합물 또는 단백질이 아닌 화합물이 본 발명의 폴리펩티드, 여기서 정의된 것과 같은 핵산 분자, 여기서 정의된 것과 같은 벡터, 또는 여기서 정의된 것과 같은 숙주와 동시에 일어나거나 또는 동시에 일어나지 않도록 투여될 수 있다.

상기한 방법을 위하여, 상기 피검자는 인간인 것이 바람직하다.

또 다른 일 측면에서, 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드, 본 발명의 핵산 분자, 본 발명의 벡터, 또는 본 발명의 숙주를 포함하는 키트에 관한 것이다.

본 발명은 다음에 오는 항목들의 목록을 추가적인 특징으로 한다:

항목 1. 인간과 침팬지가 아닌 영장류 CD3 입실론의 에피토프에 결합할 수 있는, 종간 교차 특이적 결합 도메인을 포함하는 (a) 폴리펩티드(들)의 동일성 검증을 위한 방법으로서,

(a) 고체 상태로 단편의 C-말단을 통해 고정되어서, 아미노산 서열 Gln-Asp-Gly-Asn-Glu-Glu-Met-Gly (서열번호: 381) 또는 Gln-Asp-Gly-Asn-Glu-Glu- He-GIy (서열번호: 382)을 포함하는 최대한 27개 아미노산들의 CD3 입실론의 세포 외부의 도메인의 N-말단 단편과 폴리펩티드(들)을 접촉시키는 단계;

(b) 상기한 단편으로부터의 결합된 폴리펩티드(들)을 용출시켜서 분리시키ㄴ는 단계; 그리고

(c) (b)의 용출액으로부터 폴리펩티드(들)을 격리시키는 단계를 포함하는 방법.

본 발명의 상기 방법에 의해 동일성 검증이 이루어진 폴리펩티드(들)은 인간 기원인 것이 바람직하다.

본 발명의 "(a) 폴리펩티드(들)의 동일성 검증을 위한 방법"은 폴리펩티드 후보들의 대다수로부터의 N-말단에서 아미노산 서열 Gln-Asp-Gly-Asn-Glu-Glu-Met-Gly (서열번호: 381) 또는 Gln-Asp-Gly-Asn-Glu-Glu-lle-Gly (서열번호: 382)을 포함하는 CD3 입실론의 세포 외부의 도메인의 단편에 대해 동일한 특이성으로 하나 또는 다수의 다른 폴리펩티드들의 격리를 위한 방법으로 이해되고, 또한 용액으로부터의 폴리펩티드의 정제를 위한 방법으로도 이해된다. 예를 들어 히브리도마 스크리닝을 위해 보통 사용되는 것과 같은 팬닝(panning) 방법들, 진핵동물 숙주 세포들의 일시적으로/안정적으로 감염된 클론들의 스크리닝 또는 파지 발현 방법들에서와 같은, CD3 입실론의 세포 외부의 도메인의 단편에 대해 동일한 특이성으로 하나 또는 다수의 다른 폴리펩티드들의 격리를 위한 방법의 국한됨이 없는 실시예들은 항원-특이적 결합 존재물들의 선택을 위한 방법들을 포함한다. 용액으로부터의 폴리펩티드의 정제를 위한 후자의 방법을 위한 국한됨이 없는 예는, 예를 들어 배양 상층액 또는 그러한 배양으로부터의 조제된 것으로부터의 재조합으로 발현된 폴리펩티드의 정제이다.

위에서 언급된 것과 같이 본 발명의 방법에서 사용된 단편은 영장류들 CD3 입실론 분자의 세포 외부의 도메인의 N-단편이다. 다른 영장류들 CD3 입실론 분자의 세포 외부의 도메인의 아미노산 서열은 서열번호들: 1, 3, 5 그리고 7에 표현되어 있다. N-말단 8량체(옥타머)의 두 형태들이 서열번호들: 381 그리고 382에 표현되어 있다. 이 N-말단은 본 발명의 방법에 의해 동일성이 검증되는 폴리펩티드들의 결합에 대해서 자유롭게 이용가능한 것이 바람직하다. 용어 "자유롭게 이용가능한"은 His-태그와 같은 추가적인 모티브들이 없는 것으로 본 발명의 맥락에서 이해된다. 본 발명의 방법에 의해 동일성이 검증된 결합 분자를 가진 그와 같은 His-태그의 방해가 첨부된 예 6에서 기술되어 있다.

본 발명의 방법에 따라서 상기한 단편은 고체 상태로 그 단편의 C-말단을 통해 고정된다. 이 기술에서 숙련된 인간은 쉽게 그리고 어떤 독창적인 수고 없이 본 발명의 방법의 사용된 실시예에 의지하여 적절한 고체상태의 유지장치를 선택한다. 고체 유지장치를 위한 예들은, 그것에 국한됨이 없이, 비드들(구슬들)과 같은 매트릭스들(예를 들어 한천 비드(agarose beads), 세파로즈 비드(sepharose beads), 폴리스티롤 비드(polystyrol beads), 덱스트란 비드(dextran beads)), 평판들(배양 배지들 또는 멀티웰 플레이트들(MultiWell plates))과, 또한 예를 들어 Biacore^ⓡ로 알려져 있는 칩들도 포함한다. 상기한 고체 유지장치에 단편을 고정화/부동화하기 위한 수단과 방법들의 선택은 고체 유지장치의 선출에 의존적이다. 고정화/부동화를 위해 보통 사용되는 방법은 N-히드록시숙시니미드 에스테르(N-hydroxysuccinimide (NHS) ester)를 통한 커플링(coupling)이다. 이러한 커플링 그리고 또한 고정화/부동화하기 위한 대체적 방법들의, 예를 들어 Hermanson "Bioconjugate Techniques", Academic Press, Inc. (1996)로부터의 근본적인 화학은 이 기술에서 숙련된 인간에게는 알려져 있다. 크로마토그래피 유지장치들 상에 고정화/부동화하기 위해서, 다음과 같은 수단들이 보통 사용된다: NHS-활성화 세파로스(예를 들어 HiTrap-GE Life Science - Amersham의 NHS), CnBr-활성화 세파로스(예를 들어 GE Life Science - Amersham), NHS-활성화 덱스트란 비드(Sigma) 또는 활성화된 폴리에트아크릴레이트(polymethacrylate). 이 시약들은 또한 배치 접근법에서도 사용될 수 있다. 더욱이, 산화철을 포함하는(예를 들어 Miltenyi로부터 이용가능한) 덱스트린 비드들이 배치 접근법에서 사용될 수 있다. 이 비드들은 용액으로부터 구슬들의 분리를 위한 자석과 결합 되어서 사용될 수 있다. 폴리펩티드들은 NHS 활성화 카르복시메틸덱스트란(carboxymethyldextran)의 사용에 의해 Biacore chip(예를 들어 CM5 chips) 상에서 부동화될 수 있다. 적당한 고체 유지장치의 또 다른 예들은 아민(amine) 반응성 MultiWell plates이다(예를 들어 Nunc Immobilizer^TM plates).

본 발명의 방법에 따라서 사용된 단편은 영장류들 CD3 입실론의 세포 외부의 도메인의 상기한 단편은 고체 유지장치에 직접적으로 커플링되거나 또는 연결자 또는 또 다른 단백질/폴리펩티드 부분(moiety)이 될 수도 있는 아미노산들을 경유해서 커플링될 수 있다. 대안적으로, CD3 입실론의 세포 외부의 도메인은 하나 또는 다수의 어댑터 분자(들)를 통해서 간접적으로 커플링 될 수 있다.

부동화된 에피토프에 결합되는 펩티드의 용출을 위한 수단과 방법들은 이 기술에서 잘 알려져 있다. 용출액으로부터 동일성 검증된 폴리펩티드(들)의 격리를 위한 방법들도 상기와 마찬가지이다.

본 발명과 관련하여 폴리펩티드 후보들의 복수로부터의 N-말단에서 아미노산 서열 Gln-Asp-Gly-Asn-Glu- GIu-X-GIy을 포함하는 CD3 입실론의 세포 외부의 도메인의 단편에 대해 동일한 특이성으로 하나 또는 다수의 다른 폴리펩티드들의 격리를 위한 방법은 항원-특이적 결합 존재물들의 선택을 위한 다음의 방법들의 하나 또는 다수의 단계들을 포함한다 :

CD3 입실론 특이적 결합 분자들은 항체 유래의 레퍼토리들로부터 선택될 수 있다. 파지 발현 라이브러리는 예로서 "Phage Display: A Laboratory Manual"; Ed. Barbas, Burton, Scott & Silverman; Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001에서 개시된 것과 같이, 표준 공정에 기초하여 구축될 수 있다. 항체 라이브러리에서 항체 단편들의 체재는 scFv일 수 있지만, 보통 Fab 단편 또는 심지어 단일 도메인 항체 단편일 수도 있다. 항체 단편들의 격리를 위해서 천연 그대로의 항체 단편 라이브러리들이 사용될 수 있다. 이후의 치료적 사용에서 매우 낮은 면역성 결합 존재물들의 선택을 위해서, 인간의 항체 단편 라이브러리들은 인간의 항체 단편들의 직접적 선택을 위해 유리할 수 있다. 어떤 경우들에서, 그 라이브러리들은 합성 항체 라이브러리들을 위한 근간을 형성할 수 있다(Knappik et al. J MoI. Biol. 2000, 296:57 ff). 그에 상응하는 체재는 Fab, scFv (아래에 설명된 것처럼) 또는 도메인 항체들(Holt et al., Trends Biotechnol. 2003, 21 :484 ff에서 재고된 것과 같은 dAbs)일 수 있다.

많은 경우들에서 표적 항원에 대항하여 이용가능한 면역 인간 항체 재료가 없는 것도 또한 이 기술에서 알려져 있다. 그러므로 동물들은 표적 항원과, 예를 들어 비장 또는 PBMCs와 같이 동물 조직으로부터 격리된 각각의 항체 라이브러리들로 면역성을 얻게 되다. N-말단 단편은 KLH 또는 소 혈청 알부민(BSA)과 같은 단백질들에 비오티닐레이트(biotinylated) 되거나 또는 공유적으로 결합될 수 있다. 보통의 접근법들에 따라서 설치류들은 면역화를 위해서 사용된다. 인간이 아닌 기원의 어떤 면역 항체 레퍼토리들은 다른 이유들을 위해서, 예를 들어 cameloid 종으로부터 유래한 단일 도메인 항체(VHH)의 존재을 위해서 특별히 유익할 수 있다(Muyldermans, J Biotechnol. 74:277; De Genst et al. Dev Como Immunol. 2006, 30:187 ff에 설명된 것처럼). 그러므로 항체 라이브러리의 상응하는 체재는 Fab, scFv (아래에 설명된 것처럼) 또는 단일 도메인 항체(VHH)이다.

하나의 가능한 접근법에서 balb/c x C57black crossings 10주 된 F1 생쥐는, 예를 들어 병진 융합(translational fusion) 으로서 성숙한 CD3 입실론 사슬의 N-말단 아미노산들 1 내지 27을 N-말단 쪽으로 개시하는 막간 EpCAM를 발현하는 전체 세포들로 면역성을 가질 수 있다. 대안적으로, 생쥐는 1-27 CD3 입실론-Fc 융합 단백질로 면역성을 가질 수 있다(상응하는 한 접근법이 첨부된 예 2에 기술되어 있다).

추가 예방접종(들) 후에, 혈액 샘플이 채취될 수 있고 CD3-양성 T 세포들에 대항하는 항체 혈청 적정농도가 예를 들어 FACS 분석법에서 실험될 수 있다. 보통, 혈청 적정농도들은 면역성이 없는 동물들에서보다 면역성이 있는 동물들에서 현저히 높다.

면역성이 있는 동물들은 면역 항체 라이브러리들의 구축을 위한 근간을 형성할 수 있다. 그와 같은 라이브러리의 예들은 파지 발현 라이브러리들을 포함하며, 예를 들면, 문헌["Phage Display: A Laboratory Manual"; Ed. Barbas, Burton, Scott & Silverman; Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001]에 개시되어 있다.

인간이 아닌 항체들은 또한 선택 과정 중에 결합제들(binders)을 위해 그 후에 풍부해질 수 있는 보다 가변적인 항체 라이브러리들의 생성 때문에 파지 발현술을 통해 인간화될 수도 있다.

파지 발현 접근법에서 항체를 개시하는 파지의 풀들(pools)은 표적 분자로서 각각의 항원을 사용하여 결합 존재물들을 선택하는 근간을 형성한다. 항원 특이적, 항원 결합 파지들이 격리되는 곳에서 중심이 되는 단계는 팬닝법으로서 지정된다. 파지의 표면에 있는 항체 단편들의 개시에 기인하여, 이러한 일반적 방법이 파지 발현술로 불리운다. 선택의 바람직한 한 방법은 파지에 의해 발현된 scFv의 N-말단에 병진으로 융합된 섬사상 파지 N2 도메인과 같은 작은 단백질들의 사용이다. 결합 존재물들을 격리시키기 위해 사용될 수 있는 이 기술에서 알려져 있는 또 다른 발현 방법은 리보좀 발현 방법이다(reviewed in Groves & Osbourn, Expert Opin Biol Ther. 2005, 5:125 ff; Lipovsek & Pluckthun, J Immunol Methods 2004, 290:52 ff).

1-27 CD3ε-Fc 융합 단백질 scFv 파지 입자들의 결합을 제시하기 위해서 클로닝된 scFv-레퍼토리를 운반하는 파지 라이브러리는 PEG (polyethyleneglycole)에 의한 각각의 배양 상층액으로부터 획득될 수 있다. ScFv 파지 입자들은 부동화된 CD3εFc 융합 단백질과 함께 인큐베이션될 수 있다. CD3εFc 융합 단백질은 고체 상태에 코팅될 수 있다. 결합 존재물들이 용출될 수 있고 그 용출액은 새로운 감염되지 않은 세균성 숙주의 감염을 위해 사용될 수 있다. 인간 scFv-단편을 암호화하는 파지미드(phagemid) 사본으로 성공적으로 유전자가 전달된 세균성 숙주들은 카르베니실린(carbenicillin) 내성을 위해 다시 선택되고, 예를 들어 항체 발현과 시험관내 선택에서의 두 번째 라운드를 개시하는 VCMS 13 도움 파지로 그 후에 감염될 수 있다. 선택들의 총 4 내지 5 라운드가 정상적으로 수행된다.

격리된 결합 존재물들의 결합은 유세포 분석 실험(flow cytometric assay)을 사용하여, CD3 입실론 양성 Jurkat 세포들, HPBaII 세포들, PBMCs 또는 표면 발현 EpCAM에 융합된 N-말단 CD3[epsilon] 서열을 운반하는 트랜스펙션된 진핵세포들에 대해 실험될 수 있다(첨부된 예 4를 참조함).

항목 2. 폴리펩티드(들)이 세포 표면 항원에 결합할 수 있는 제1 결합 도메인과 제2 결합 도메인과 같은 동일성이 검증된 결합 도메인을 포함하는 곳에서의 항목 1의 방법.

본 발명의 방법에 의해 동일성이 검증된 폴리펩티드의 제2 결합 도메인의 생성을 위해서, 예를 들어 여기서 정의된 것과 같이, 이중특이 단일 사슬 항체들, 각각의 인간 그리고/또는 침팬지가 아닌 영장류 세포의 표면 항원들 양쪽 모두에 결합하는 단일클론 항체들이 사용될 수 있다. 여기서 정의된 것과 같이, 이중특이 폴리펩티드에 대해 적절한 결합 도메인들은 예를 들면 이 기술에서 설명된 재조합 방법들에 의한 종간 교차 특이적 단일클론 항체들로부터 유래할 수 있다. 인간 세포의 표면 항원과 침팬지가 아닌 영장류에서의 상기한 세포의 표면 항원의 동족체에 결합하는 단일클론 항체는 위에서 제시되었던 FACS 분석법에 의해 실험될 수 있다. 종간 교차 특이적 항체들이 또한 문헌에서 기술된 히브리도마 기술들도(Milstein and Kohler, Nature 256 (1975), 495-7) 또한 종간 교차 특이적 항체들의 생성에 사용될 수 있다. 예를 들면, 생쥐는 대안적으로 인간과 침팬지가 아닌 영장류 CD33로 면역성을 가질 수 있다. 이 생쥐들로부터, 종간 교차 특이적 항체-생산 융합세포들은 히브리도마 기술을 통해 분리되고 위에서 제시되었던 FACS 분석법에 의해 분석된다. 여기서 설명된 것처럼 종간 교차 특이적인 이중특이 단일 사슬 항체들과 같은 이중특이 폴리펩티드들의 생성과 분석은 다음에 오는 예들에서 보여진다. 종간 교차 특이적인 이중특이 단일 사슬 항체들의 이점들은 아래에 열거된 요지들을 포함한다.

항목 3. 제2 결합 도메인이 인간 그리고/또는 침팬지가 아닌 영장류의 세포의 표면 항원에 결합하는 곳에서, 항목 2의 방법.

항목 4. 제1 결합 도메인이 항체인 곳에서, 항목들 1 내지 3.

항목 5. 항체가 단일 사슬 항체인 곳에서, 항목 4의 방법.

항목 6. 제2 결합 도메인이 항체인 곳에서, 항목들 2 내지 5 중의 어느 하나의 방법.

항목 7. CD3ε의 세포 외부의 도메인의 단편이 서열번호: 2, 4, 6 또는 8에서 표현된 어느 하나의 아미노산 서열을 가지고 있는 폴리펩티드의 하나 또는 다수의 단편들로 구성되는 곳에서, 항목들 1 내지 6 중의 어느 하나의 방법.

항목 8. 상기한 단편이 길이가 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 아미노산 잔기들인 곳에서, 항목 7의 방법.

항목 9. 동일성 검증의 방법이 인간과 침팬지가 아닌 영장류 CD3 입실론의 에피토프에 결합할 수 있는 종간 교차 특이적인 결합 도메인을 포함하는 다수의 폴리펩티드를 스크리닝하는 방법인 곳에서, 항목들 1 내지 8 중의 어느 하나의 방법.

항목 10. 동일성 검증의 방법이 인간과 침팬지가 아닌 영장류 CD3 입실론의 에피토프에 결합할 수 있는 종간 교차 특이적인 결합 도메인을 포함하는 폴리펩티드의 정제/격리의 방법인 곳에서, 항목들 1 내지 8 중의 어느 하나의 방법.

항목 11. 종간 교차 특이적인 결합 도메인의 생성을 위한, 아미노산 서열 Gln-Asp-Gly-Asn-Glu-Glu-Met-Gly (서열번호: 381) 또는 Gln-Asp-Gly-Asn-Glu-Glu- He-GIy (서열번호: 382)을 포함하는 최대한 27개 아미노산들의 CD3 입실론의 세포 외부의 도메인의 N-말단 단편의 사용. 본 발명의 상기한 사용과 관련하여, 생성된 종간 교차 특이적인 결합 도메인이 인간 기원인 것이 바람직하다.

항목 12. 종간 교차 특이적인 결합 도메인이 항체인 곳에서, 항목 11에 상응하는 사용.

항목 13. 항체가 단일 사슬 항체인 곳에서, 항목 12에 상응하는 사용.

항목 14. 항체가 이중 특이 항체인 곳에서, 항목 12 내지 13에 상응하는 사용.

이들 실시예들과 그외 다른 실시예들은 본 발명의 설명과 예들에 의해 개시되고 완수된다. 면역학에서 재조합 기술들과 방법들은 예를 들어 문헌[Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, 3<rd> edition 2001; Lefkovits; Immunology Methods Manual; The Comprehensive Sourcebook of Techniques; Academic Press, 1997; Golemis; Protein-Protein Interactions: A Molecular Cloning Manual; Cold Spring Laboratory Press, 2002]에 기술되어 있다. 예를 들면 전자 장치들을 사용하여, 항체들, 방법들, 사용들 그리고 본 발명에 따라서 채택된 화합물들의 어느 하나에 관한 또 다른 문헌은 공개된 라이브러리들과 데이터베이스들에서 구해 질 수 있다. 예를 들면, 인터넷 상에서 이용가능한 공개 데이터베이스 "Medline"이 이용될 수 있는데, 예를 들어 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/PubMed/medline.html 와 같은 주소이다. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ 또는 http://www.embl.de/services/index.html 주소 아래의 EMBL-services 홈페이지에 열거되어 있는 또 다른 데이터베이스들과 주소들이 이 기술에서 숙련된 인간에게 알려져 있고 또한 예를 들어 http://www. google.com을 사용하여 얻어질 수 있다.

도 1은 영장류의 CD3 입실론의 N-말단 아미노산들 1-27의 이종기원의 가용성 단백질에 대한 융합을 보여준다.

도 2는 일시적으로 트랜스펙션된 293 세포들의 상층액에서 인간 IgGI의 경첩부위와 Fc 감마 부분과 C-말단 6 히스티딘 태그에 융합된 성숙한 인간의 CD3 입실론 사슬의 N-말단 아미노산들 1-27로 구성되는 구축물의 존재를 검출하는 ELISA 실험에서 측정된 4배수 샘플들의 평균 흡착값들을 제시해준다. "27 aa huCD3E"으로 라벨링된 첫 번째 컬럼은 구축물을 위한 평균 흡착값들을 제시해주고, "irrel. SN"으로 라벨링된 두 번째 컬럼은 음성 대조군으로서 관계성이 없는 구축물로 트랜스펙션된 293 세포들의 상층액을 위한 평균 흡착값을 제시해준다. 음성 대조군을 위해 얻어진 값들과 구축물을 위해 얻어진 값들의 비교는 재조합 구축물의 존재를 명확히 나타내준다.

도 3은 인간 IgGI의 경첨부위와 Fc 감마 부분과 C-말단 6 히스티딘 태그에 융합된 성숙한 인간의 CD3 입실론 사슬의 N-말단 아미노산들 1-27을 포함하는 구축물에 주변 세포질(periplasm)에서 발현된 단일-사슬 항체들의 천연 그대로의 조제물의 형태로 종간 교차 특이적인 항-CD3 결합 분자들의 결합을 검출하는 ELISA 실험에서 측정된 4배수 샘플들의 평균 흡착값들을 제시해준다. 컬럼들은 A2J HLP, I2C HLP E2M HLP, F7O HLP, G4H HLP, H2C HLP, E1 L HLP, F12Q HLP, F6A HLP 그리고 H1 E HLP로 지정되는 특이성에 대한 평균 흡착값들을 왼쪽에서 우측으로 제시해 준다. 가장 오른쪽에 있는 "neg. contr."으로 라벨링된 컬럼은 음성 대조군으로서의 쥐과 동물의 항-인간 CD3 항체의 단일-사슬 조제물을 위한 평균 흡착값을 제시해준다. 음성 대조군을 위해 얻어진 값들과 항-CD3 특이성들을 위해 얻어진 값들의 비교는 성숙한 인간의 CD3 입실론 사슬의 N-말단 1-27 아미노산들에 대한 항-CD3 특이성들의 강한 결합을 명확히 나타내준다.

도 4는 영장류의 CD3 입실론의 N-말단 아미노산들 1-27의 이종기원의 막에 결합되는 단백질에 대한 융합을 보여준다.

도 5는 사이노몰거스(cynomolgus) EpCAM와 인간, 중남미산 비단털원숭이(marmoset), 남미산 비단원숭이(tamarin), 남미산 다람쥐원숭이(squirrel monkey) 그리고 가축돼지(domestic swine)의 CD3 입실론 사슬 각각의 N-말단 1-27 아미노산들로 구성되는 재조합 세포막성 융합 단백질들의 존재를 검출하는 FACS 실험(FACS assay)에서 실험되는 다른 트랜스펙션된 세포들의 히스토그램 오버레이들을 각각 보여준다. 히스토그램 오버레이들은 왼쪽에서 오른쪽으로 그리고 위쪽에서 바닥으로 인간 27 mer, marmoset 27 mer, tamarin 27 mer, squirrel monkey 27 mer 그리고 swine 27 mer 각각을 포함하는 구축물들을 발현하는 다른 트랜스펙션된 세포들(transfectants)에 대한 결과들을 제시해준다. 개개의 오버레이들에서 얇은 선은 음성 대조군으로서 항-Flag M2 항체 대신에 2% FCS를 포함한 PBS와 함께 인큐베이션된 샘플을 제시해준다. 각 구축물에 대하여 히스토그램들의 오버레이는 트랜스펙션된 세포들 상에 재조합 구축물들의 발현을 명확히 나타내주는 트랜스펙션된 세포들에 대한 항-Flag M2 항체의 결합을 제시해준다.

도 6은 사이노몰거스(cynomolgus) EpCAM에 융합된 인간, 중남미산 비단털원숭이(marmoset), 남미산 비단원숭이(tamarin), 그리고 남미산 다람쥐원숭이(squirrel monkey)의 CD3 입실론 사슬의 N-말단 아미노산들 1-27의 각각에, 주변 세포질에서 발현된 단일-사슬 항체들의 천연 그대로의 조제물의 형태로 종간 교차 특이적인 항-CD3 결합 분자들의 결합을 검출하는 FACS 실험에서 실험된 다른 트랜스펙션된 세포들의 히스토그램 오버레이들을 보여준다.

도 6a에서 히스토그램 오버레이들은 왼쪽에서 오른쪽으로 그리고 위쪽에서 바닥으로, CD3 특이성 결합 분자들인 지정된 H2C HLP, F12Q HLP, E2M HLP 그리고 G4H HLP로 각각 실험된 인간 27 mer를 포함하는 1-27 CD3-EpCAM을 발현하는 트랜스펙션된 세포들을 위한 결과를 제시해준다.

도 6b에서 히스토그램 오버레이들은 왼쪽에서 오른쪽으로 그리고 위쪽에서 바닥으로, CD3 특이성 결합 분자들인 지정된 H2C HLP, F12Q HLP, E2M HLP 그리고 G4H HLP로 각각 실험된 marmoset 27 mer를 포함하는 1-27 CD3-EpCAM을 발현하는 트랜스펙션된 세포들을 위한 결과를 제시해준다.

도 6c에서 히스토그램 오버레이들은 왼쪽에서 오른쪽으로 그리고 위쪽에서 바닥으로, CD3 특이성 결합 분자들인 지정된 H2C HLP, F12Q HLP, E2M HLP 그리고 G4H HLP로 각각 실험된 tamarin 27 mer를 포함하는 1-27 CD3-EpCAM을 발현하는 트랜스펙션된 세포들을 위한 결과를 제시해준다.

도 6d에서 히스토그램 오버레이들은 왼쪽에서 오른쪽으로 그리고 위쪽에서 바닥으로, CD3 특이성 결합 분자들인 지정된 H2C HLP, F12Q HLP, E2M HLP 그리고 G4H HLP로 각각 실험된 squirrel monkey 27 mer를 포함하는 1-27 CD3-EpCAM을 발현하는 트랜스펙션된 세포들을 위한 결과를 제시해준다.

도 6e에서 히스토그램 오버레이들은 왼쪽에서 오른쪽으로 그리고 위쪽에서 바닥으로, CD3 특이성 결합 분자들인 지정된 H2C HLP, F12Q HLP, E2M HLP 그리고 G4H HLP로 각각 실험된 swine 27 mer를 포함하는 1-27 CD3-EpCAM을 발현하는 트랜스펙션된 세포들을 위한 결과를 제시해준다.

개개의 오버레이들에서 얇은 선은 음성 대조군으로서의 쥐과 동물의 항-인간 CD3 항체의 단일-사슬 조제물과 인큐베이션된 샘플을 제시해주고 두드러지는 선은 지시된 각각의 항-CD3 결합 분자들과 인큐베이션된 샘플을 제시해 준다. swine 27 mer에 대한 트랜스펙션된 세포들의 결합이 부족한 것과 도 5의 히스토그램들의 오버레이들에서 제시되는 구축물들의 발현 수준들을 고려하는 것이, 사이노몰거스(cynomolgus) EpCAM에 융합된 인간, marmoset, tamarin, 그리고 squirrel monkey의 CD3 입실론 사슬의 N-말단 아미노산들 1-27을 각각 포함하는 재조합 세포막성 융합 단백질들을 발현하는 세포들에 대한 완전히 종간 교차 특이성을 가지는 인간 이중특이 단일 사슬 항체들의 실험된 항-CD3 특이성들의 특이적이고 강한 결합을 제시해주고 그에 의한 항-CD3 결합 분자들의 다수의 영장류 종간 교차 특이성을 보여준다.

도 7은 트랜스펙션된 쥐과 동물의 EL4 T 세포들 상에서 인간 CD3 입실론의 검출을 위한 FACS 실험. 그래프식의 분석법은 히스토그램들의 오버레이를 보여준다. 두드러진 선은 항-인간 CD3 항체 UCHT-1과 인큐베이션된 트랜스펙션된 세포들 을 보여준다. 얇은 선은 생쥐의 IgGI 동형 대조군과 함께 인큐베이션된 트랜스펙션된 세포들을 보여준다. 항 CD3 항체 UCHT-1의 결합은 트랜스펙션된 쥐과 동물의 EL4 T 세포들의 세포 표면 상에서 인간 CD3 입실론의 발현을 보여준다.

도 8은 알라닌 스캐닝 실험에서 알라닌-돌연변이들에 대한 종간 교차 특이성을 가지는 항 CD3 항체들의 결합. 개개의 도면들에서 컬럼들은 왼쪽에서 오른쪽으로 야생형의 트랜스펙션된 세포(WT)와 위치 1 내지 27까지의 모든 알라닌-돌연변이들을 위한 대수 계산자에서 임의의 단위들로 계산된 결합력 수치들을 제시해준다. 결합력 수치들은 다음에 오는 식을 사용하여 계산된다:

이러한 방정식에서 value_Sample은 도면에서 도시된 것처럼 특이성 있는 알라닌-돌연변이에 특이성 있는 항-CD3 항체의 결합의 정도를 표현하는 결합의 임의적 단위들에서의 값을 의미한다. Sample은 특이성을 가지는 알라닌-스캐닝 트랜스펙션된 세포에 대하여 실험된 항 CD3 항체들에 대해 얻어진 기하학적 평균 형광 값(geometric mean fluorescence value)을 의미하고, neg_Contr은 특이성을 가지는 알라닌-돌연변이에 대하여 실험된 음성 대조군에 대해 얻어진 기하학적 평균 형광 값을 의미하며, UCHT-1는 특이성을 가지는 알라닌-돌연변이에 대하여 실험된 UCHT-1 항체에 대해 얻어진 기하학적 평균 형광 값을 의미하고, WT는 야생형의 트랜스펙션된 세포에 대하여 실험된 특이성을 가지는 항 CD3 항체에 대해 얻어진 기하학적 평균 형광 값(geometric mean fluorescence value)을 의미하며, x는 각각의 트랜스펙션된 세포를 지정하는 것이고, y는 각각의 항-CD3 항체를 지정하는 것이며 그리고 wt는 각각의 트랜스펙션된 세포가 야생형인 것을 지정한다. 개개의 알라닌-돌연변이 위치들은 야생형 아미노산의 단일 글자 코드와 위치의 숫자로 라벨링된다.

도 8a는 키메릭 IgG 분자로서 발현되는 종간 교차 특이성을 가지는 항 CD3 항체 A2J HLP에 대한 결과들을 보여준다. 감소된 결합 활성이, 위치 4 아스파라긴(asparagine)에서, 위치 23 트레오닌(threonine)에서 그리고 위치 25 이소로이신(isoleucine)에서 알라닌에 대한 돌연변이들에 대해서 관찰된다. 결합의 완전한 손실이, 위치 1 글루타민(glutamine)에서, 위치 2 아스파르테이트(aspartate)에서 위치 3 글리신(glycine)에서 그리고 위치 5 글루타메이트(glutamate)에서 알라닌에 대한 돌연변이들에 대해서 관찰된다.

도 8b는 키메릭 IgG 분자로서 발현되는 종간 교차 특이성을 가지는 항 CD3 항체 E2M HLP에 대한 결과들을 보여준다. 감소된 결합 활성이, 위치 4 (아스파라긴)에서, 위치 23 (트레오닌)에서 그리고 위치 25 (이소로이신)에서 알라닌에 대한 돌연변이들에 대해서 관찰된다. 결합의 완전한 손실이, 위치 1 (글루타민)에서, 위치 2 (아스파르테이트)에서 위치 3 (글리신)에서 그리고 위치 5(글루타메이트)에서 알라닌에 대한 돌연변이들에 대해서 관찰된다.

도 8c는 키메릭 IgG 분자로서 발현되는 종간 교차 특이성을 가지는 항 CD3 항체 H2C HLP에 대한 결과들을 보여준다. 감소된 결합 활성이, 위치 4 (아스파라긴)에서, 위치 23 (트레오닌)에서 그리고 위치 25 (이소로이신)에서 알라닌에 대한 돌연변이들에 대해서 관찰된다. 결합의 완전한 손실이, 위치 1 (글루타민)에서, 위치 2 (아스파르테이트)에서 위치 3 (글리신)에서 그리고 위치 5(글루타메이트)에서 알라닌에 대한 돌연변이들에 대해서 관찰된다.

도 8d는 주변 세포질에서 발현되는 단일-사슬 항체로서 실험되는 것과 같이, 종간 교차 특이성을 가지는 항 CD3 항체 F12Q HLP 대한 결과들을 보여준다. 결합의 완전한 손실이, 위치 1 (글루타민)에서, 위치 2 (아스파르테이트)에서 위치 3 (글리신)에서 그리고 위치 5(글루타메이트)에서 알라닌에 대한 돌연변이들에 대해서 관찰된다.

도 9는 종간 교차 특이적인 항-CD3 결합 분자 H2C HLP의 N-말단 His6 태그를 가지는 그리고 가지지 않는 인간에 대한 결합을 검출하는 FACS 실험 결과들을 보여준다.

히스토그램 오버레이들은 야생형의 인간 CD3 입실론 사슬(왼쪽 히스토그램) 또는 종간 교차 특이적인 항-CD3 결합 분자 H2C HLP의 결합을 검출하는 FACS 실험에서 실험되는 N-말단 His6 태그를 가지는 인간 CD3 입실론 사슬(오른쪽 히스토그램)로 트랜스펙션된 EL4 세포주에 대해 수행된 것이다. 샘플들은 음성 대조군으로(얇은 선) 적당한 동형 대조군, 양성 대조군으로(점선) 항-인간 CD3 항체 UCHT-1 그리고 키메릭 IgG 분자의 형태로서(두드러지는 선) 종간 교차 특이적인 항-CD3 결합 분자 H2C HLP 와 함께 인큐베이션된다.

히스토그램 오버레이들은 양쪽 모두의 재조합 구축물들의 발현을 제시해주는 동형 대조군에 비교해서 양쪽 모두의 트랜스펙션된 세포들에 대한 UCHT-1 항체의 필적할 만한 결합을 보여준다. 히스토그램 오버레이들은 또한 야생형의 인간 CD3 입실론 사슬에 대한 항-CD3 결합 분자 H2C HLP의 결합뿐만 아니라 His6-인간 CD3 입실론 사슬에 대한 결합도 보여준다. 이러한 결과들은 자유 N-말단들이 종간 교차 특이적인 항-CD3 결합 분자 H2C HLP의 결합을 위해서 필수적인 것을 제시해준다.

도 10은 FACS 분석법에 의한 세포들 상의 CD3 결합의 KD 값을 결정하기 위한 인간 CD3 양성 PBMC에 EGFR-21-63 LH x H2C 의 포화 결합을 보여준다. 그 실험은 예 7에서 설명된 것처럼 수행된다.

도 11은 인간 EGFR로 트랜스펙션된 CHO 세포들, 인간 CD3+ T 세포주 HPB-ALL, 사이노몰거스(cynomolgus) EGFR 그리고 머카크(macaque) T 세포주 4119 LnPx로 트랜스펙션된 CHO 세포들에 지정된 종간 교차 특이성이 있는 이중특이 단일 사슬 구축물들의 FACS 결합 분석법을 보여준다. FACS 염색법이 예 12에서 설명된 것처럼 수행된다. 두꺼운 선은, 그 후에 항-his 항체(anti-His antibody)와 PE 라벨링이 된 검출 항체와 함께 인큐베이션된 2 ㎍/ml의 정제된 단백질과 함께 인큐베이션된 세포들을 제시해준다. 얇은 히스토그램 선은 음성 대조군을 반영한다: 항-his 항체와 검출 항체만으로 배양된 세포들.

도 12는 지시된 표적 세포주들에 재지시되는 지정된 종간 교차 특이성을 지닌 EGFR 특이적 단일 사슬 구축물들에 의해서 유도되는 세포독성 활성을 보여준다. A) 그리고 B)에서 활성화된 CD4-/CD56- 인간 PBMCs은 작동체 세포들(effector cells)로 사용된다. CHO 세포들은 표적 세포들로서 인간 EGFR로 감염된다. 실험은 예 13에서 설명된 것처럼 수행된다.

도 13은 지시된 표적 세포주들에 재지시되는 지정된 종간 교차 특이성을 지닌 EGFR 특이적 단일 사슬 구축물들에 의해서 유도되는 세포독성 활성을 보여준다. A) 그리고 B)에서 머카크(macaque) T 세포주 4119 LnPx는 작동체 세포들로 사용된다. CHO 세포들은 표적 세포들로서 사이노몰거스(cynomolgus) EGFR로 트랜스펙션된다. 실험은 예 13에서 설명된 것처럼 수행된다.

도 14는 인간 MCSP D3로 트랜스펙션된 CHO 세포들, 인간 CD3+ T 세포주 HPB-ALL, 사이노몰거스(cynomolgus) MCSP D3 그리고 머카크(macaque) T 세포주 4119 LnPx로 트랜스펙션된 CHO 세포들에 지정된 종간 교차 특이성이 있는 이중특이 단일 사슬 구축물들의 FACS 결합 분석법을 보여준다. FACS 염색법이 예 17에서 설명된 것처럼 수행된다. 두꺼운 선은, 그 후에 항-his 항체와 PE 라벨링이 된 겸출 항체와 함께 인큐베이션된 2 ㎍/ml의 정제된 단백질과 함께 인큐베이션된 세포들을 제시해준다. 얇은 히스토그램 선은 음성 대조군을 반영한다: 항-his 항체와 겸출 항체와 함께 단지 인큐베이션만 된 세포들.

도 15는 인간 MCSP D3로 트랜스펙션된 CHO 세포들, 인간 CD3+ T 세포주 HPB-ALL, 사이노몰거스(cynomolgus) MCSP D3 그리고 머카크(macaque) T 세포주 4119 LnPx로 트랜스펙션된 CHO 세포들에 지정된 종간 교차 특이성이 있는 이중특이 단일 사슬 구축물들의 FACS 결합 분석법. FACS 염색법이 예 17에서 설명된 것처럼 수행된다. 두꺼운 선은, 그 후에 항-his 항체와 PE 라벨링이 된 겸출 항체와 함께 인큐베이션된 2 ㎍/ml의 정제된 단백질과 함께 인큐베이션된 세포들을 제시해준다. 얇은 히스토그램 선은 음성 대조군을 반영한다: 항-his 항체와 겸출 항체와 함께 단 지 인큐베이션만 된 세포들.

도 16은 인간 MCSP D3로 트랜스펙션된 CHO 세포들, 인간 CD3+ T 세포주 HPB-ALL, 사이노몰거스(cynomolgus) MCSP D3 그리고 머카크(macaque) T 세포주 4119 LnPx로 트랜스펙션된 CHO 세포들에 지정된 종간 교차 특이성이 있는 이중특이 단일 사슬 구축물들의 FACS 결합 분석결과를 보여준다. FACS 염색법이 예 17에서 설명된 것처럼 수행된다. 두꺼운 선은, 그 후에 항-his 항체와 PE 라벨링이 된 겸출 항체와 함께 인큐베이션된 2 ㎍/ml의 모노머의 단백질과 함께 인큐베이션된 세포들을 제시해준다. 얇은 히스토그램 선은 음성 대조군을 반영한다: 항-his 항체와 겸출 항체와 함께 단지 인큐베이션만 된 세포들.

도 17은 지시된 표적 세포주들에 재지시되는 지정된 종간 교차 특이성을 지닌 MCSP 특이적 단일 사슬 구축물들에 의해서 유도되는 세포독성 활성을 보여준다. A) 그리고 B)에서 활성화된 CD4-/CD56-인간 PBMCs은 작동체 세포들로 사용되고, CHO 세포들은 표적 세포들로서 인간 MCSP D3로 트랜스펙션된다. B)에서 머카크(macaque) T 세포주 4119 LnPx는 작동체 세포들로 사용되고, CHO 세포들은 표적 세포들로서 사이노몰거스(cynomolgus) MCSP D3로 트랜스펙션된다. 실험은 예 18에서 설명된 것처럼 수행된다.

도 18은 지시된 표적 세포주들에 재지시되는 지정된 종간 교차 특이성을 지닌 MCSP 특이적 단일 사슬 구축물들에 의해서 유도되는 세포독성 활성을 보여준다. A) 그리고 B)에서 머카크(macaque) T 세포주 4119 LnPx는 작동체 세포들로 사용되고, CHO 세포들은 표적 세포들로서 사이노몰거스(cynomolgus) MCSP D3로 트랜스펙 션된다. 실험은 예 18에서 설명된 것처럼 수행된다.

도 19는 지시된 표적 세포주들에 재지시되는 지정된 종간 교차 특이성을 지닌 MCSP 특이적 단일 사슬 구축물들에 의해서 유도되는 세포독성 활성을 보여준다. A) 그리고 B)에서 활성화된 CD4-/CD56-인간 PBMCs은 작동체 세포들로 사용되고, CHO 세포들은 표적 세포들로서, 인간 MCSP D3로 트랜스펙션된다. 실험은 예 18에서 설명된 것처럼 수행된다.

도 20은 지시된 표적 세포주들에 재지시되는 지정된 종간 교차 특이성을 지닌 MCSP 특이적 단일 사슬 구축물들에 의해서 유도되는 세포독성 활성을 보여준다. A)에서 활성화된 CD4-/CD56-인간 PBMCs은 작동체 세포들로 사용되고, CHO 세포들은 표적 세포들로서, 인간 MCSP D3로 트랜스펙션된다. B)에서 머카크(macaque) T 세포주 4119 LnPx는 작동체 세포들로 사용되고, CHO 세포들은 표적 세포들로서, 사이노몰거스(cynomolgus) MCSP D3로 트랜스펙션된다. 실험은 예 18에서 설명된 것처럼 수행된다.

도 21은 지시된 표적 세포주들에 재지시되는 지정된 종간 교차 특이성을 지닌 MCSP 특이적 단일 사슬 구축물들에 의해서 유도되는 세포독성 활성을 보여준다. A)에서 활성화된 CD4-/CD56-인간 PBMCs은 작동체 세포들로 사용되고, CHO 세포들은 표적 세포들로서, 인간 MCSP D3로 트랜스펙션된다. B)에서 머카크(macaque) T 세포주 4119 LnPx는 작동체 세포들로 사용되고, CHO 세포들은 표적 세포들로서의 사이노몰거스(cynomolgus) MCSP D3로 트랜스펙션된다. 실험은 예 18에서 설명된 것처럼 수행된다.

도 22는 24시간 동안 37℃ 그리고 4℃에서 50% 인간 혈장과 함께 각각 인큐베이션 된, 또는 세포독성 실험 바로 직전에 50% 인간 혈장을 추가하거나 또는 혈장의 추가 없이 인큐베이션 된, 지정된 단일 사슬 구축물들의 샘플들에 의해서 유도된 세포독성 활성의 측정에 의해서 실험된, MCSP 그리고 CD3 종간 교차 특이적 이중특이 단일 사슬 항체들의 혈장 안정성을 보여준다. 인간 MCSP D3로 트랜스펙션된 CHO 세포들이 표적 세포주로 사용되고 활성화된 CD4-/CD56-인간 PBMCs이 작동체 세포들로 사용된다. 실험은 예 19에서 설명된 것처럼 수행된다.

도 23은 인간 HER2로 트랜스펙션된 CHO 세포들, 인간 CD3+ T 세포주 HPB-ALL, 머카크(macaque) HER2 그리고 머카크(macaque) T 세포주 4119 LnPx로 각각 트랜스펙션된 CHO 세포들에 지정된 종간 교차 특이성이 있는 이중특이 단일 사슬 구축물들의 FACS 결합 분석결과를 보여준다. FACS 염색법이 예 23.4에서 설명된 것처럼 수행된다. 두드러진 선들은, 그 후에 항-his 항체와 PE 라벨링이 된 겸출 항체와 함께 인큐베이션된 2 ㎍/ml의 정제된 이중특이 단일 사슬 구축물과 인큐베이션된 세포들을 제시해준다. 얇은 선들은 음성 대조군을 반영한다. 2% FCS를 포함한 PBS는 음성 대조군으로 사용되었다. 각각의 종간 교차 특이성이 있는 이중특이 단일 사슬 구축물에 대하여 히스토그램들의 오버레이들은 인간과 머카크(macaque) HER2 그리고 인간과 머카크(macaque) CD3에 대한 구축물의 특이적 결합을 제시해준다.

도 24의 다이어그램들은 지시된 표적 세포주들에 재지시된 지정된 종간 교차 특이성을 지닌 HER2 특이적 단일 사슬 구축물들에 의해서 유도되는 세포독성 활성 을 측정하는 크로뮴 방출 실험들의 결과들을 보여준다. 작동체 세포들도 또한 지시된 것과 같이 사용되었다. 실험들은 예 23.5에서 설명된 것처럼 수행된다. 다이어그램들은 인간과 머카크(macaque) HER2 트랜스펙션된 CHO 세포들 각각에 대항하는 인간과 머카크(macaque) 작동체 세포들의 세포독성 활성의 강력한 보충을 보여주는 각각의 구축물에 대해 명확히 보여준다.

도 25는 선택된 클론들로부터의 플래그 태그가 달린 scFv 단백질 단편들을 함유하고 있는 주변 세포질의 조제물들의 CD3 특이적 ELISA 분석결과를 보여준다. 가용성인 scFv 단백질 단편들의 주변 세포질의 조제물들이, 가용성인 인간 CD3 입실론 (aa 1-27)-Fc 융합 단백질로 코팅되어 왔었고 3% BSA를 포함하는 PBS로 추가적으로 차단되어 왔던 ELISA 평판의 웰들(wells)에 첨가되었다. 검출이 단일클론 anti Flag-Biotin-라벨링된 항체에 의해서 수행되었고 뒤이어 퍼옥시다아제-컨쥬게이션이 된 스트렙타비딘(Streptavidin)에 의해서 수행되었다. ELISA는 ABTS 기질 용액에 의해서 전개되었다. OD 값들(y 축)은 ELISA reader에 의해 405 nm에서 측정되었다. 클론의 이름들은 x 축에 제시되어 있다.

도 26은 선택된 클론들로부터의 플래그 태그가 달린 scFv 단백질 단편들을 함유하고 있는 주변 세포질의 조제물들의 ELISA 분석결과를 보여준다. 가용성인 scFv 단백질 단편들의 도 25에 있는 것과 동일한 주변 세포질의 조제물들이 가용성인 인간 CD3 입실론 (aa 1-27)-Fc 융합 단백질로 코팅되지 않았었지만 hulgGI (Sigma)으로는 코팅되어 왔었고 3% BSA를 포함하는 PBS에서 차단되어 왔던 ELISA 평판의 웰들(wells)에 첨가되었다.

검출이 단일클론 anti Flag-Biotin-라벨링된 항체에 의해서 수행되었고 뒤이어 퍼옥시다아제-컨쥬게이션 된 스트렙타비딘에 의해서 수행되었다. ELISA는 ABTS 기질 용액에 의해서 전개되었다. OD 값들(y 축)은 ELISA reader에 의해 405 nm에서 측정되었다. 클론의 이름들은 x 축에 제시되어 있다.

본 발명은 본 발명에 대한 보다 나은 이해와 그것의 많은 장점들을 제공해 주는, 다음의 예시적이고 비제한적인 예들을 통하여 추가로 설명된다.

예들

1. 인간이 아닌 영장류들의 혈액 샘플들로부터의 CD3 입실론 서열들의 동일성 검증

다음에 오는 인간이 아닌 영장류들의 혈액 샘플들은 CD3 입실론 서열들의 동일성 검증을 위해 사용되었다: 비단마모셋(Callithrix jacchus), 솜털머리타마린(Saguinus oedipus) 및 다람쥐원숭이(Saimihs ciureus). 새로운 헤파린-처리된 온전한 혈액 샘플들이 생산자의 프로토콜에 따라서 총 세포 RNA를 격리시키기 위해 조제될 수 있다 (QIAamp RNA Blood Mini Kit, Qiagen). 추출된 mRNA는 공개된 프로토콜들에 따라서 cDNA 속으로 전사되었다. 간략하게 말하자면, 10㎕의 침강된 RNA가 70 ℃에서 10분 동안 1.2㎕의 1O× 헥사뉴클레오티드 혼합액(hexanucleotide mix)(Roche)와 함께 인큐베이션 되어서 얼음에서 저장되었다. 4㎕의 5× superscript Il buffer, 0.2㎕의 0.1 M 디티오트레이톨(dithiothreitole), 0.8㎕의 superscript Il (Invitrogen), 1.2㎕의 디옥시리보뉴클레오시드 트리포스페이트 들(desoxyribonucleoside triphosphates)(25μM), 0.8㎕의 RNase 저해제(Roche) 그리고 1.8㎕의 DNA분해효소와 RNA분해효소가 없는 순수한 물(DNase RNase free wate, Roth)로 구성되는 반응 혼합물이 첨가되었다. 그 반응 혼합물은 실온에서 10분 동안 인큐베이션 되었고, 뒤이어서 42 ℃에서 50분 동안 그리고 90 ℃에서 5분동안 인큐베이션 되었다. 그 반응은 0.8㎕의 RNaseH (1 U/㎕, Roche)를 첨가하기 전에 얼음에서 냉각되었고 37 ℃에서 20분동안 인큐베이션 되었다.

각각의 종으로부터의 첫 번째-가닥 cDNAs은 Taq DNA 폴리머라아제(Taq DNA polymerase)(Sigma)와 다음에 오는 데이터베이스 연구에 대하여 고안된 프라이머(primer) 조합를 사용하여 분리된 35-주기의 폴리머라제(polymerase) 연쇄 반응들의 대상이 되었다: 정방향 프라이머(forward primer) 5'- AGAGTTCTGGGCCTCTGC-3' (서열번호: 377); 역방향 프라이머(reverse primer) 5'- CGGATGGGCTCATAGTCTG-S' (서열번호: 378);. 증폭된 550 bp-bands이 겔을 이용하여 정제되었고(Gel Extraction Kit, Qiagen) 서열로 배열되었다(Sequiserve, Vaterstetten/Germany, see sequence listing).

CD3 입실론 마모셋 ( Callithrix iacchus )

뉴클레오티드들

CAGGACGGTAATGAAGAAATGGGTGATACTACACAGAACCCATATAAAGTTTCCATCTCAGG AACCACAGTAACACTGACATGCCCTCGGTATGATGGACATGAAATAAAATGGCTCGTAAATA GTCAAAACAAAGAAGGTCATGAGGACCACCTGTTACTGGAGGACTTTTCGGAAATGGAGCAA AGTGGTTATTATGCCTGCCTCTCCAAAGAGACTCCCGCAGAAGAGGCGAGCCATTATCTCTA CCTGAAGGCAAGAGTGTGTGAGAACTGCGTGGAGGTGGAT

아미노산들

QDGNEEMGDTTQNPYKVSISGTTVTLTCPRYDGHEIKWLVNSQNKEGHEDHLLLEDFSEMEQ SGYYACLSKETPAEEASHYLYLKARVCENCVEVD

CD3 입실론 솜털머리타마린 ( Saquinus oedipus )

뉴클레오티드들

CAGGACGGTAATGAAGAAATGGGTGATACTACACAGAACCCATATAAAGTTTCCATCTCAGG AACCACAGTAACACTGACATGCCCTCGGTATGATGGACATGAAATAAAATGGCTTGTAAATA GTCAAAACAAAGAAGGTCATGAGGACCACCTGTTACTGGAGGATTTTTCGGAAATGGAGCAA AGTGGTTATTATGCCTGCCTCTCCAAAGAGACTCCCGCAGAAGAGGCGAGCCATTATCTCTA CCTGAAGGCAAGAGTGTGTGAGAACTGCGTGGAGGTGGAT

아미노산들

QDGNEEMGDTTQNPYKVSISGTTVTLTCPRYDGHEIKWLVNSQNKEGHEDHLLLEDFSEMEQ SGYYACLSKETPAEEASHYLYLKARVCENCVEVD

CD3 입실론 다람쥐원숭이( Saimiris ciureus )

뉴클레오티드들

CAGGACGGTAATGAAGAGATTGGTGATACTACCCAGAACCCATATAAAGTTTCCATCTCAGG AACCACAGTAACACTGACATGCCCTCGGTATGATGGACAGGAAATAAAATGGCTCGTAAATG ATCAAAACAAAGAAGGTCATGAGGACCACCTGTTACTGGAAGATTTTTCAGAAATGGAACAA AGTGGTTATTATGCCTGCCTCTCCAAAGAGACCCCCACAGAAGAGGCGAGCCATTATCTCTA CCTGAAGGCAAGAGTGTGTGAGAACTGCGTGGAGGTGGAT

아미노산들

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2. 인간과 다른 침팬지가 아닌 영장류들의 CD3 입실론의 N-말단 아미노산들 1-27에 결합하는 종간 교차 특이적 단일 사슬 항체 단편( scFv )들의 생성

2.1. 이종의 가용성 단백질에 대한 융합에 의해 선천적 CD3 -컨텍스트(선천적 CD3-context)로부터 분리된 CD3 입실론의 N-말단을 사용하는 생쥐에의 면역성 부여

balb/c × C57black crossings로부터의 생후 10주의 F1 생쥐들은 인간 그리고/또는 saimiris ciureus 성숙한 CD3 입실론 사슬(1-27 CD3-Fc)의 가장 N-말단에 있는 아미노산들 1-27를 지니고 있는 CD3 입실론-Fc 융합 단백질로 면역성이 부여되었다. 이 목적을 위하여 300 μl PBS에서 10 nmol의 티오에이트-변형된 CpG-올리고뉴클레오티드(thioate-modified CpG-Oligonucleotide)(5'-tccatgacgttcctgatgct-3')와 함께 40 ㎍의 1-27 CD3 입실론-Fc 융합 단백질이 생쥐의 복강내로 주사되었다. 그와 동일한 방법으로 21일, 42일 그리고 옵션으로 63일 후에 생쥐들은 추가 접종의 면역성들을 받는다. 첫 번째 추가 접종 면역조치 10일 후에, 혈액 샘플들이 채취되어 1-27 CD3 입실론-Fc 융합 단백질에 대항하는 항체 혈청 적정 농도는 ELISA에 의해서 실헙되었다. 추가적으로, CD3-양성 인간 T 세포주 HPBaII에 대항하는 적정농도는 표준적 프로토콜들에 따라서 유세포 분석기에 의해서 시험되었다. 혈청의 적정 농도들은 면역성을 부여받지 못한 동물들에서 보다 면역성을 부여받은 동물들에서 현저히 높았다.

2.2. 면역의 쥐과 동물 항체 scFv 라이브러리의 생성: 조합적 항체 라이브러리와 파지 발현의 구축

마지막 주사 3일 후에 쥐과 동물의 비장 세포들은 표준적 프로토콜들에 따라서 총 RNA의 조제를 위해 거두어 들여졌다.

쥐과 동물의 면역글로불린(Ig)의 가벼운 사슬(kappa) 가변적 부위(VK)의 라이브러리와 면역글로불린(Ig)의 무거운 사슬(kappa) 가변적 부위(VH) DNA-단편들은 VK-그리고 VH 특이적 프라이머를 사용하여, 쥐과 동물의 비장 상의 RT-PCR에 의해 구축된다. cDNA는 표준적 프로토콜들에 따라서 합성되었다.

프라이머들은 증폭된 무거운 사슬의 V-단편들을 위한 5'-Xhol 그리고 a 3'-BstEII 인식 자리와 증폭된 VK DNA 단편들을 위한 5'-Sacl 그리고 a 3<1>- Spel 인식 자리를 생성시킬 수 있는 방법으로 고안되었다.

VH DNA 단편들의 PCR-증폭(amplification)을 위해서 8개의 다른 5'-VH-family 특이적 프라이머들(MVHI(GC)AG GTG CAG CTC GAG GAG TCA GGA CCT; MVH2 GAG GTC CAG CTC GAG CAG TCT GGA CCT; MVH3 CAG GTC CAA CTC GAG CAG CCT GGG GCT; MVH4 GAG GTT CAG CTC GAG CAG TCT GGG GCA; MVH5 GA(AG) GTG AAG CTC GAG GAG TCT GGA GGA; MVH6 GAG GTG AAG CTT CTC GAG TCT GGA GGT; MVH7 GAA GTG AAG CTC GAG GAG TCT GGG GGA; MVH8 GAG GTT CAG CTC GAG CAG TCT GGA GCT)은 하나의 3'-VH 프라이머와 각각 결합되었고(3'MuVHBstEII tga gga gac ggt gac cgt ggt ccc ttg gcc cca g); VK-사슬 단편들의 PCR-증폭을 위해서 7개의 다른 5'-VK-family 특이적 프 라이머들(MUVK1 CCA GTT CCG AGC TCG TTG TGA CTC AGG AAT CT; MUVK2 CCA GTT CCG AGC TCG TGT TGA CGC AGC CGC CC; MUVK3 CCA GTT CCG AGC TCG TGC TCA CCC AGT CTC CA; MUVK4 CCA GTT CCG AGC TCC AGA TGA CCC AGT CTC CA; MUVK5 CCA GAT GTG AGC TCG TGA TGA CCC AGA CTC CA; MUVK6 CCA GAT GTG AGC TCG TCA TGA CCC AGT CTC CA; MUVK7 CCA GTT CCG AGC TCG TGA TGA CAC AGT CTC CA)은 하나의 3'-VK 프라이머와 각각 결합되었다(3'MuVkHindlll/BsiW1 tgg tgc act agt cgt acg ttt gat etc aag ctt ggt ccc).

다음에 오는 PCR 프로그램이 증폭을 위해 사용되었다: 94℃에서 20초 동안 변성(denaturation); 52℃에서 50초 동안 프라이머 어닐링(열처리, annealing) 그리고 72℃에서 60초 동안 그리고 40 사이클로 프라이머 확장(extension), 그 뒤에 이어서 72℃에서 10분 동안의 마지막 연장으로 이어짐.

450 ng의 카파(kappa) 가벼운 사슬 단편들(Sacl-Spel digested)은 의 1400 ng의 파이지미드 pComb3H5Bhis (Sacl-Spel digested; 큰 단편)과 결찰되었다. 결과로서 생긴 조합적 항체 라이브러리는 그 다음 300 ul의 전기처리된 형질전환용(electrocompetent) Escherichia coli XL1 Blue cells로 전기천공법(electroporation)에 의해서 형질전환되었고(2.5 kV, 0.2 cm gap cuvette, 25 uFD, 200 Ohm, Biorad gene-pulser) 10⁷ 이상의 라이브러리 크기인 독립적 클론들이 생기게 되었다. 표현형 발현 한 시간 후에, 양성 형질전환체들은 100 ml의 액상 super broth (SB) 배지-배양에서 하룻밤 동안 pComb3H5BHis 벡터에 의해 암호화된 카르베니실린 내성을 위해 선택되었다. 세포들은 그 다음 원심분리되어 거두어 들여 지고 플라스미드 제형은 상업적으로 이용가능한 플라스미드 조제 키트(plasmid preparation kit)(Qiagen)를 사용하여 수행되었다.

VK-라이브러리(Xhol-BstEII digested; 큰 단편)를 함유하고 있는 2800 ng의 상기 플라스미드-DNA는 900 ng의 무거운 사슬 V-단편들(Xhol-BstEII digested)에 결찰되었고 다시 두 개의 300 ul 분취량들의 전기처리된 형질전환용 E. coli XL1 Blue cells로 전기천공법에 의해서 형질전환되었고(2.5 kV, 0.2 cm gap cuvette, 25 uFD, 200 Ohm) 총 VH-VK scFv (단일 사슬 가변적 단편) 10⁷ 이상의 라이브러리 크기인 독립적 클론들이 생기게 되었다.

표현형 발현과 카르베니실린에 속도가 늦은 적응 후에, 항체 라이브러리를 함유하는 E. coli 세포들이 SB-Carbenicillin (50 ug/ml_) 선택 배지 속으로 옮겨졌다. E. coli 세포들은 그 다음 헬퍼 파지(helper phage) VCSM 13의 10¹² 개 입자들의 감염성 있는 투여량으로 감염되어서 섬사상의 M13 파지의 생산과 분비의 결과에 이르렀고, 그곳에서 파지 입자들은 쥐과 동물의 scFv-단편을 암호화하는 단일 가닥의 pComb3H5BHis-DNA를 함유하고 있고. 파지 피막 단백질 III(phage coat protein III)에 대하여 병진 융합으로서 상응하는 scFv-단백질을 발현하였다. 항체 라이브러리를 발현하는 파지들의 이 풀들은 차후에 항체 결합 존재물들의 선택을 위해 사용되었다.

2.3. CD3 -특이적 결합제들의 선택에 근거한 파지 발현

클로닝된 scFv-레퍼토리를 지니고 있는 파지 라이브러리가 PEG8000/염화나트륨 침강과 원심분리에 의해 각각의 배양 상층액으로부터 거두어 들여 졌다. 대략 10¹¹ 내지 10¹² scFv 파지 입자들은 0.4 ml의 PBS/0.1% BSA에서 재분산되어 10⁵ 내지 10⁷ Jurkat 세포들(CD3-양성 인간 T- 세포주)과 함께 한 시간 동안 얼음에서 천천히 교반하면서 인큐베이션 되었다. 이러한 Jurkat 세포들은 사전에 태아 단계의 송아지 혈청(10%), 글루타민 그리고 페니실린/스트렙토마이신(penicillin/streptomycin)으로 내용이 풍부하게 된 RPMI 배지에서 성장하였고, 원심분리에 의해 거두어 들여졌고, PBS에서 세척되었으며 PBS/1% FCS (소듐 아자이드(Na Azide)를 함유하고 있는)에서 재분산되었다. Jurkat 세포들에 특이적으로 결합하지 않는 scFv 파지는 PBS/1% FCS (Na Azide를 함유하고 있는)에서 5개에 이르는 세척 단계에 의해 제거되었다. 세척 후에, 결합 존재물들은 그 세포들을 염산-글리신(HCI-glycine) pH 2.2 (후속적인 볼텍스 처리와 함께 10분 동안 인큐베이션)에 재분산시킴에 의해서 세포들로부터 용출되었고 2 M Tris pH 12로 중화시킨 후에, 그 용출액은 새롭고 감염되지 않은 E. coli XL1 Blue culture (OD600 > 0.5)의 감염을 위해서 사용되었다. 파지미드 사본으로 성공적으로 유전자가 전달된 E. coli 세포들을 함유하고 있는 E. coli 배양은 다시 카르베니실린 내성을 위해 선택되었고, 인간 scFv-단편을 암호화하고, 후속적으로 VCMS 13 헬퍼 파지(helper phage)로 감염되어서 항체 발현의 두 번째 라운드를 시험관내 선택에서 시작하였다. 선택 들 중 4 내지 5 라운드들 전체가 정상적으로 수행되었다.

2.4. CD3 -특이적 결합제들을 위한 차단

팬닝의 4 내지 5 라운드들에 상응하는 플라스미드 DNA는 선택 후에 E. coli 배양들로부터 격리되었다. 가용성의 scFv-단백질의 생산을 위하여, VH-VL-DNA 단편들은 플라스미드들(Xhol-Spel)로부터 삭제되었다. 발현 구축물(예를 들어 scFv)이 scFv와 His6-태그 사이에 있는 플래그-태그(TGD YKDDDDK)을 포함하고 있는 곳에 있는 원래의 pComb3H5BHis와는 다르면서 플라스미드 pComb3H5BFIag/His에서 동일한 제한 자리들(Restriction sites)을 경유하여 클로닝되었고 추가적인 파지 단백질들이 삭제되었다. 결찰 후에, 플라스미드 DNA의 각각의 풀(팬닝의 다른 라운드들)은 100㎕의 열처리 형질전환용(heat shock competent) E. coli TG1 또는 XLI blue로 형질전환되었고 carbenicillin LB-agar 상에 평판 배양되었다. 단일 군락들(Single colonies)은 LB carb (50 ug/ml)의 100 μl 속에 채집되었다.

VL-조각과 VH-조각을 함유하고 있는 pComb3H5BHis로 형질전환된 E. coli는 유전자 III(gene III) 단편의 삭제와 1 mM IPTG의 유입 후에 충분한 양으로 가용성 scFv를 생산한다. 적절한 신호전달 서열 때문에, scFv-사슬은 그 사슬이 기능적 입체 구조들 속으로 접혀 들어가는 곳에서 주변 세포질로 수송되었다.

변환 평판으로부터 단일의 E. coli TG1 세균성 군락들은 주변 세포질의 작은 규모의 조제물들을 위해 채집되었고 20 mM MgCI2와 카르베니실린 50㎍/ml로 보충된 SB-배지(예를 들어 10ml)에서 성장되었고 그리고 거두어 들인 후에 PBS (예를 들어 1 ml)에서 재용해되었다. -70℃에서 동결시키고 37℃에서 해동시키는 4 라운드들에 의해서, 세균들의 외막은 온도로 인한 충격으로 파괴되었고 scFv들을 포함하는 가 용성 주변 세포질 단백질들은 상층액 속으로 방출되었다. 원심분리에 의한 손상되지 않은 세포들과 세포 잔여물의 제거 후에, 인간의 항-인간 CD3-scFv들을 함유하고 있는 상층액이 수집되었고 또 다른 실험을 위해 사용되었다.

2.5. CD3 -특이적 결합제들의 동일성 검증

격리된 scFv들의 결합은 진핵 세포들 상에 유세포 분석기에 의해 실험되었고, 그 진핵 세포들은 CD3 입실론의 첫 번째 27 N-말단 아미노산들에서 발현하는 이종기원의 단백질을 그 표면 상에 발현한다.

예 4에서 설명된 것처럼, 인간 T 세포 수용체 복합체(아미노산 서열: QDGNEEMGGITQTPYKVSISGTTVILT)의 성숙한 CD3 입실론 사슬의 첫 번째 N-말단 아미노산들 1-27은 막 통과 단백질 EpCAM의 N-말단에 융합되어서, N-말단이 외부의 세포 표면에 위치하였다. 추가적으로, FLAG 에피토프는 N-말단 1-27 CD3 입실론 서열과 EpCAM 서열 사이에 삽입되었다. 이 융합 생성물은 인간의 배아기의 신장(HEK)와 중국 햄스터 난소(CHO) 세포들에서 발현되었다.

다른 영장류 종의 성숙한 CD3 입실론 사슬의 27 가장 N-말단인 아미노산들을 발현하는 진핵 세포들은 Saimiri ciureus (Squirrel monkey)(CD3 입실론 N-말단 아미노산 서열:QDGNEEIGDTTQNPYKVSISGTTVTLT)에 대하여, Callithrix jacchus (CD3 입실론 N-말단 아미노산 서열: QDGNEEMGDTTQNPYKVSISGTTVTLT)에 대하여, 그리고 Saguinus oedipus (CD3 입실론 N-말단 아미노산 서열: QDGNEEMGDTTQNPYKVSISGTTVTLT)에 대하여 상기와 동일한 방법으로 조제되었다.

유세포 분석을 위하여 2,5×10⁵ 세포들이 50 μl 상층액과 함께 또는 5 ㎍/ml의 정제된 구축물들과 함께 2% FCS를 포함하는 50㎕ PBS에서 인큐베이션된다. 구축물들의 결합은 2% FCS를 포함하는 50㎕ PBS에서 2 ㎍/ml에서 항-His 항체(Penta-His Antibody, BSA free, Qiagen GmbH, Hilden, FRG)로 검출되었다. 두 번째 단계 시약으로서, 2% FCS를 포함하는 50㎕ PBS에서 1 :100로 희석된(Dianova, Hamburg, FRG), R-Phycoerythrin-콘주게이션이 된 친화성 정제된 F(ab')2 단편, 염소의 항-생쥐 IgG (Fc-감마 단편 특이적)가 사용되었다. 그 샘플들은 FACS 스캔 상에서 측정되었다(BD biosciences, Heidelberg, FRG).

결합은 언제나 인간과 다른 영장류(예를 들어 saimiris ciureus, callithrix jacchus, saguinus oedipus)의 제1 T 세포들 상의 상기한 단락에서 설명된 것처럼 유세포 분석기에 의해 확인되었다.

2.6. 인간이 아닌 CD3 입실론 특이적 scFv 들의 인간/인간화된 동등물들의 생성

쥐과 동물의 항-CD3 scFv의 VH 부위는 인간의 항체 생식 계열 아미노산 서열들에 대항하여 한 줄로 정렬되었다. 인간의 항체 생식 계열 VH 서열은 인간이 아닌 VH에 가장 근접하는 상동성을 가지도록 선택되었고 두 개의 아미노산 서열들의 직접적 일직선 정렬이 수행되었다. 인간 VH 구조 형성 부위들("다른 구조체제 위치들")와 다른 인간이 아닌 VH의 구조 형성 잔기들이 다수 존재하였다. 이런 잔기들 중 어떤 것들은 그 표적에 대한 항체의 결합과 활성에 기여할 수 있다.

쥐과 동물 CDRs을 함유하고 있는 그리고 선택된 인간 VH 서열, 양쪽 모두의 가능성들(인간의 아미노산 잔기들과 모계의 쥐과 동물의 아미노산 잔기들)과는 다른 모든 구조 형성 위치에서 라이브러리를 구축하기 위해, 퇴화된 올리고뉴클레오티드들이 합성되었다. 이 올리고뉴클레오티드들은 다른 위치들에서 75 %의 개연율을 가진 인간 잔기와 25 %의 개연율을 가진 쥐과동물 잔기가 편입된다.

하나의 인간 VH에 대하여, 예를 들어 대략 20 뉴클레오티드들의 말단 뻗침(stretch)에서 중첩하는 이들 올리고뉴클레오티드들 중의 6개가 합성되어야만 했다. 이 때문에 모든 제2 프라이머는 안티센스 프라이머(antisense primer)였다. 올리고뉴클레오티드들의 범위 내에서 차후의 클로닝을 위해 필요한 제한 자리들은 삭제되었다.

이 프라이머들은 온전한 V 서열 전반에 걸쳐 있도록 요구되었던 다수의 프라이머들에 의존하여, 60개 내지 90게 뉴클레오티드들의 길이를 가질 수 있다.

이 프라이머들 예를 들어 6개 프라이머들이 동등한 용량들에서 혼합되었고(예를 들어 20㎕ PCR 반응에 대하여 1㎕의 각 프라이머들(프라이머는 20 내지 100μM)를 두고 있다 )) PCR 완충액, 뉴클레오티드들 그리고 Taq 폴리머라아제(Taq polymerase)로 구성되는 PCR 혼합물에 첨가되었다. 이 혼합물은 PCR cycler에서 94 ℃에서 3분 동안, 65 ℃에서 1분 동안, 62℃에서 1분 동안, 59℃에서 1분 동안, 56 ℃에서 1분 동안, 52 ℃에서 1분 동안, 50 ℃에서 1분 동안, 그리고 72℃에서 10분 동안 인큐베이션 되었다. 후속적으로 생성물은 한천 겔 전기영동(agarose gel electrophoresis)에서 조작되었고 200 내지 400 크기의 생성물이 표준적 방법들에 따라서 겔로부터 격리되었다.

이 PCR 생성물은 그 다음 N-말단과 C-말단의 적절한 클로닝 제한 자리들을 편입시키는 프라이머들을 사용하는 표준 PCR 반응을 위하여 주형으로서 사용되었다. 올바른 크기의 DNA 단편(VH에 대해서는 대략 350 뉴클레오티드들)은 한천 겔 전기영동에 의해서 표준적 방법들에 따라서 격리되었다. 이런 방법에서 충분한 VH DNA 단편이 증폭되었다. 이 VH 단편은 각각의 다른 구조 형성 위치들(인간화된 VH의 풀)에서 인간과 쥐과 동물의 잔기들의 다른 용량 중 각각의 한 용량을 가지는 한 풀의 VH 단편들이다. 그와 동일한 공정이 쥐과 동물의 항-CD3 scFv (인간화된 VL의 풀)의 VL 부위에 대해서도 수행되었다.

부계의 인간이 아닌(쥐과 동물)의 항-CD3 scFv를 위해서 위에서 설명된 것처럼 항-CD3 결합제들이 선택되고, 스크리닝되며, 동일성이 검증되고 그리고 확인되는-섬사상 파지 상에 발현된 후에- 기능적 scFvs의 라이브러리를 형성하기 위해서 파지 발현 벡터 pComb3H5Bhis에서 인간화된 VH의 풀은 그 다음 인간화된 VL의 풀과 결합되었다. 단일 클론들은 그 다음 유익한 속성들과 아미노산 서열에 대해 분석되었다. 인간 생식 계통의 V-조각들에 아미노산 서열 상동성에서 가장 근접하였던 scFvs는 바랍직하며 VH의 CDR I과 Il, 그리고 VL 카파의 CDR I과 Il, 또는 VL 람다의 CDR I과 Il 중 적어도 하나의 CDR이 모든 인간 생식 계통의 V-조각들의 가장 근접한 각각의 CDR에 80% 이상의 아미노산 서열 동일성을 보이는 곳에서 특히 바람직하다. 항-CD3 scFvs은 다음에 오는 예 10과 16에서 설명된 것처럼 재조합 이중특이 단일 사슬 항체들로 전환되고 더욱이 특징화된다.

3. IgGI 의 Fc -부분에 융합된 인간 CD3 입실론 사슬의 N-말단 아미노산들 1- 27의 재조합 융합 단백질의 생성(1-27 CD3 - Fc ).

3.1. 1-27 CD3 - Fc 의 클로닝과 발현

6 히스티딘 태그(Histidine Tag)뿐만 아니라 인간의 면역글로불린 IgGI의 경첩 부위(hinge)과 Fc 감마 부위에 융합된 인간 CD3 입실론 사슬의 1-27 N-말단 아미노산들의 암호 서열은 표준적 프로토콜들에 따라서 유전자 합성에 의해 획득되었다(재조합 융합 단백질의 cDNA 서열과 아미노산 서열은 서열번호: 350 그리고 349 아래에 열거되어 있다). 유전자 합성 단편은 구축물의 진핵성 발현을 위한 Kozak 자리를 첫째로 함유하기 위한 것으로서 고안되었고, 후속적으로 19 아미노산 면역글로불린 리더 펩티드(immunoglobulin leader peptide), 그 다음은 성숙한 인간 CD3 입실론 사슬의 세포외 부분의 첫 번째 27 아미노산들의 암호화 서열(coding sequence)에 의한 프레임(frame)에서, 그 다음은 인간 IgGI의 경첩 부위와 Fc 감마 부분의 암호화 서열에 의한 프레임에서, 그 다음은 6 히스티딘 태그(6 Histidine tag)과 종결코돈(stop codon) 의 암호화 서열에 의한 프레임(도 1)에서 이어진다. 유전자 합성 단편은 또한 융합 단백질을 위한 cDNA 코드의 시작점에서와 종결점에서 제한 자리들을 도입하기 위한 것으로서 고안되었다. 도입된 제한 자리들, 5' end에서 EcoRI와 3' end에서 Sail은 다음에 오는 클로닝 공정들에서 사용된다. 유전자 합성 단편은 EcoRI와 Sail을 통해서 플라스미드 지정의 pEF-DHFR(plasmid designated pEF-DHFR)(pEF-DHFR는 Mack et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 (1995) 7021-7025에 기술되어 있다)로 다음에 오는 표준 프로토콜들에 따라서 클로 닝되었다. 서열이 검증된 플라스미드가 생산자들의 프로토콜에 따라서 FreeStyle 293 Expression System (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, Germany)에서 트랜스펙션을 위해 사용되었다.

3일 후에 트랜스펙션된 세포들의 세포 배양 상층액들이 거두어 들여졌고 ELISA 실험에서 재조합 구축물의 존재에 대해 실험되었다. 염소의 항-인간 IgG, Fc-감마 단편 특이적 항체(Jackson ImmunoResearch Europe Ltd., Newmarket, Suffolk, UK로부터 얻어진)가 PBS에서 5 ㎍/ml까지 희석되었고 웰 당 100㎕로 MaxiSorp 96-well ELISA plate (Nunc GmbH & Co. KG, Wiesbaden, Germany) 상에 하룻밤 동안 4 ℃에서 코팅되었다. 웰들은 실온(RT)에서 60분 동안 0,05 % Tween 20을 포함한 PBS로 세척되어서(PBS/Tween) PBS에서 3% BSA로 차단되었다(bovine Albumin, fraction V, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Germany). 후속적으로, 웰들은 PBS/Tween로 다시 세척되었고 그 다음 실온(RT)에서 60분 동안 세포 배양 상층액들과 함께 인큐베이션 되었다. 세척 후에 웰들은 1:500으로 1% BSA를 포함한 PBS로 희석된 퍼옥시다아제(peroxidase) 컨쥬게이션 된 항-His6 항체(Roche Diagnostics GmbH, Roche Applied Science, Mannheim, Germany)와 함께 실온(RT)에서 60분 동안 인큐베이션 되었다. 후속적으로, 웰들은 200㎕ PBS/Tween으로 세척되었고 100㎕의 SIGMAFAST OPD(SIGMAFAST OPD [o-페닐렌디아민 디히드로클로라이드(o-Phenylenediamine dihydrochloride)] 기질 용액(Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Germany)이 생산자들의 프로토콜들에 따라서 첨가되었다. 그 반응은 100㎕ 1 M H2SO4를 첨가함에 의해서 중단되었다. 색깔 반응은 PowerWaveX 효소면역 반응 분광광도계(PowerWaveX microplate spectrophotometer)(BioTek Instruments, Inc., Winooski, Vermont, USA) 상에서 490 nm에서 측정되었고 바탕선 흡수의 삭감은 620 nm에서 측정되었다. 도 2에서 도시된 것처럼, 음성 대조군으로 사용되는 공벡터로 트랜스펙션된(mock-transfected) HEK 293 세포들의 관련성 없는 상층액과 비교해서 구축물의 존재가 명백히 검출가능한 것이었다.

3.2. 1-27 CD3 - FC 에 대한 종간 교차 특이적 단일 사슬 항체들의 결합 실험.

1-27 CD3-FC에 주변 세포질로 발현된 CD3 입실론에 특이적인 종간 교차 특이적 단일 사슬 항체들의 원상태의 조제물의 결합이 ELISA 실험에서 실험되었다. 염소의 항-인간 IgG, Fc-감마 단편 특이적 항체 (Jackson ImmunoResearch Europe Ltd., Newmarket, Suffolk, UK)가 PBS에서 5 ㎍/ml까지 희석되었고 웰 당 100㎕로 MaxiSorp 96-well ELISA plate(Nunc GmbH & Co. KG, Wiesbaden, Germany) 상에 하룻밤 동안 4 ℃에서 코팅되었다. 웰들은 실온(RT)에서 60분 동안 0,05 % Tween 20을 포함한 PBS로 세척되어서(PBS/Tween) 3% BSA를 포함한 PBS로 차단되었다(소 알부민(bovine Albumin), fraction V, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Germany). 후속적으로, 웰들은 PBS/Tween로 세척되었고 실온(RT)에서 60분 동안 1-27 CD3-FC 구축물을 발현하는 세포들의 상층액들과 함께 인큐베이션 되었다. 웰들은 PBS/Tween으로 세척되었고 위에서 기술한 것과 같이 주변 세포질로 발현된 종간 교차 특이적 단일 사슬 항체들의 원상태의 조제물들과 함께 실온(RT)에서 60분 동안 인큐베이션 되었다. PBS/Tween으로 세척 한 후에 웰들은 1:10000으로 1% BSA를 포함한 PBS로 희석된 퍼옥시다아제 컨쥬게이션 된 항-His6 항체 (Roche Diagnostics GmbH, Roche Applied Science, Mannheim, Germany)와 함께 실온(RT)에서 60분 동안 인큐베이션 되었다. 웰들은 PBS/Tween으로 세척되었고 100㎕의 SIGMAFAST OPD(SIGMAFAST OPD[o-페닐렌디아민 디히드로클로라이드] 기질 용액(Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Germany)과 함께 생산자들의 프로토콜들에 따라서 인큐베이션 되었다. 색깔 반응은 100㎕ 1 M H2SO4에 의해서 중단되었고 PowerWaveX 효소면역반응 분광광도계(BioTek Instruments, Inc., Winooski, Vermont, USA) 상에서 490 nm에서 측정되었고 바탕선 흡수의 삭감은 620 nm에서 측정되었다. 쥐과 동물의 항 CD3 단일-사슬 항체1-27 CD3-FC 구축물에 대한 CD3 입실론에 특이적인 종간 교차 특이적 인간 단일 사슬 항체들의 강한 결합이 관찰되었다(도 3)

4. 사이노몰거스(cynomolgus) monkey 로부터의 EpCAM 에 융합된 다른 침팬지가 아닌 영장류들로부터의 CD3 입실론의 N-말단 아미노산들 1-27의 재조합 막 통과 융합 단백질의 생성(1-27 CD3 - EpCAM ).

4.1. 1-27 CD3 - EpCAM 의 클로닝과 발현

CD3 입실론은 다른 침팬지가 아닌 영장류들(마모셋, 타마린, 다람쥐원숭이)과 돼지로부터 격리되었다. 플래그 태그된 사이노몰거스(cynomolgus) EpCAM의 N-말단에 융합된, 성숙한 인간, 보통의 마모셋(Callithrix jacchus), 목화머리 타마린(Saguinus oedipus), 보통의 다람쥐원수이(Saimiri sciureus) 그리고 가축용 ㄷ돼지(Sus scrota; 음성 대조군으로 사용되는)의 CD3 입실론의 1-27 N-말단 아미노산들의 암호화 서열들이 표준적 프로토콜들에 따라서 유전자 합성에 의해 획득되었 다. cDNA 서열과 재조합 융합 단백질들의 아미노산 서열이 서열번호: 351 내지 360 아래에 열거되어 있다. 유전자 합성 단편들은 표적 발현 벡터에서 이미 존재하는 19 아미노산 면역글로불린 리더 펩티드의 암호화 서열과 함께 올바른 리딩 프레임(reading frame)에서 융합을 가능하게 하기 위한 첫째 BsrGI 자리를 함유하기 위한 것으로서 고안되었고, 후속적으로 성숙한 CD3 입실론 사슬들의 세포외 부분의 N-말단 1-27 아미노산들의 암호화 서열에 의한 프레임에서, 그 다음은 플래그 태그의 암호화 서열에 의한 프레임에서 그리고 성숙한 사이노몰거스(cynomolgus) EpCAM 막 통과 단백질의 암호화 서열에 의한 프레임에서 이어진다(도 4). 유전자 합성 단편은 또한 융합 단백질을 위한 cDNA 코드의 종결점에서 제한 자리들을 도입하기 위한 것으로서 고안되었다. 도입된 제한 자리들, 5' end에서 BsrGI와 3' end에서 Sall은 다음에 오는 클로닝 공정들에서 사용되었다. 유전자 합성 단편은 그 다음 BsrGI와 Sall을 통해서 다음에 오는 표준 프로토콜들에 따라서 19 아미노산 면역글로불린 리더 펩티드의 암호화 서열을 이미 함유하고 있는 플라스미드 지정의 pEF-DHFR의 유도체 속으로(pEF-DHFR는 Mack et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 (1995) 7021-7025에 기술되어 있다) 클로닝되었다. 서열이 검증된 플라스미드들이 생산자들의 프로토콜에 따라서 MATra-A Reagent(IBA GmbH, G[omicron]ttingen, Germany)과 175 ml 세포 배양 플라스크들에서 부착(adherent) 293-HEK 세포들에 대한 12 ㎍의 플라스미드 DNA를 사용하여 일시적으로 트랜스펙션된 293-HEK 세포들에 대해 사용되었다. 세포 배양 3일 후에 트랜스펙션된 세포들은 생산자들의 프로토콜에 따라서 FACS 실험를 통하여 재조합 막 통과 단백질의 세포 표면 발현에 대하여 실험되었다. 그런 목적을 위하여 2,5×10⁵ 세포들이 2% FCS를 포함하는 50㎕ PBS에서 5 ㎍/ml의 항-Flag M2 항체(anti-Flag M2 antibody)(Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Germany)와 함께 인큐베이션 되었다. 결합된 항체는 Fc-감마 단편 특이적이고 2% FCS를 포함하는 50㎕ PBS에서 1 :100로 희석된, R-Phycoerythrin-콘주게이션이 된 친화성 정제된 F(ab')2 단편, 염소의 항-생쥐 IgG로 검출되었다(Jackson ImmunoResearch Europe Ltd., Newmarket, Suffolk, UK). 가 사용되었다. 그 샘플들은 FACScalibur (BD biosciences, Heidelberg, Germany) 상에서 측정되었다. 사이노몰거스(cynomolgus) EpCAM와 트랜스펙션된 세포들 상의 인간, 마모셋, 타마린, 다람쥐원숭이 그리고 돼지 각각의 CD3 입실론 사슬의 1-27 N-말단 아미노산들로 구성되는 플래그가 태그된 재조합 막 통과 융합 단백질들의 발현은 명백히 검출가능하였다(도 5).

4.2. 1- 27 CD3 - EpCAM 에 대한 종간 교차 특이적 항- CD3 단일 사슬 항체들의 결합.

사이노몰거스(cynomolgus) Ep-CAM에 각각 융합된 인간, 마모셋, 타마린, 그리고 다람쥐원숭이 CD3 입실론 사슬들의 1-27 N-말단 아미노산들에 대한 주변 세포질로 발현된 종간 교차 특이적 항 CD3 단일-사슬 항체들의 원상태의 조제물의 결합이 표준적 프로토콜들에 따라서 FACS 실험에서 실험되었다. 그런 목적을 위하여 2,5×10⁵ 세포들이 주변 세포질로 발현된 종간 교차 특이적 항 CD3 단일-사슬 항체들의 원상태의 조제물과(위에서 설명된 것처럼 그리고 표준적 프로토콜들에 따라서 수행되었던 조제물) 음성 대조군으로서 단일-사슬 쥐과동물 항-인간 CD3 항체와 함께 인큐베이션 되었다. 제2 항체로서 Penta-His 항체(Qiagen GmbH, Hildesheim, Germany)가 2% FCS를 포함하는 50㎕ PBS에서 5 ㎍/ml로 사용되었다. 그 항체의 결합은 Fc-감마 단편 특이적이고 2% FCS를 포함하는 50㎕ PBS에서 1:100로 희석된 R-Phycoerythrin-콘주게이션이 된 친화성 정제된 F(ab')2 단편, 염소의 항-생쥐 IgG로 검출되었다(Jackson ImmunoResearch Europe Ltd., Newmarket, Suffolk, UK)다. 그 샘플들은 FACScalibur(BD biosciences, Heidelberg, Germany) 상에서 측정되었다(BD biosciences, Heidelberg, FRG). 도 6 (A 내지 E)에서 도시된 것처럼, 사이노몰거스(cynomolgus) EpCAM에 융합된, 인간, 마모셋, 타마린 또는 다람쥐원숭이의 CD3 입실론의 1-27 N-말단 아미노산들로 구성되는 재조합 막 통과 융합 단백질들을 발현하는 트랜스펙션된 세포들의 단일 사슬 항체들에 대한 결합이 관찰되었다. (Sus scrota; 음성 대조군으로 사용되는)의 CD3 입실론의 1-27 N-말단 아미노산들의 암호화 서열들이 표준적 프로토콜들에 따라서 유전자 합성에 의해 획득되었다. 종간 교차 특이적 단일 사슬 항체들에 대한 어떤 결합도 음성 대조군으로 사용되는 사이노몰거스(cynomolgus) EpCAM에 융합된 swine의 1-27 N-말단 CD3 입실론으로 구성되는 융합 단백질들에 대해서 관찰되지 않았다. 항-CD3 단일 사슬 항체들의 다중-영장류 종간 교차 특이성이 제시되었다. CD3 입실론의 N-말단 아미노산들 1-27에 대한 종간 교차 특이적 단일 사슬 항체들의 강력한 결합 활성을 나타내면서, 항-Flag M2 항체와 종간 교차 특이적 단일 사슬 항체들로 얻어지는 신호들은 서로 동등했다.

5. 인간의 CD3 입실론 사슬과 그것의 알라닌 돌연변이들로 트랜스펙션된 생쥐 세포들의 알라닌-스캐닝에 의한 종간 교차 특이적 항- CD3 단일 사슬 항체들의 결합 분석

5.1. 인간의 야생형 CD3 입실론의 클로닝과 발현

인간의 CD3 입실론 사슬의 암호화 서열이 표준적 프로토콜들에 따라서 유전자 합성에 의해 획득되었다(인간의 CD3 입실론 사슬의 cDNA 서열과 아미노산 서열은 서열번호: 362와 361 아래에 열거되어 있다). 유전자 합성 단편은 구축물의 진핵성 발현을 위한 Kozak 자리와 인간 CD3 입실론을 위한 cDNA 코드의 시작점에서와 종결점에서 제한 자리들를 함유하기 위한 것으로서 고안되었다. 도입된 제한 자리들, 5' end에서 EcoRI와 3' end에서 Sall은, 그 다음에 이어지는 클로닝 공정들에서 사용되었다. 유전자 합성 단편은 그 다음 플라스미드 지정의 pEF DHFR(Mack et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 (1995) 7021-7025) 속으로 EcoRI와 Sall을 경유해서 다음에 오는 표준적 프로토콜들에 따라서 클로닝되었다. pEF NEO는 DHFR의 cDNA를 기존의 분자의 클로닝에 의한 네오마이신 내성의 cDNA로 교체함에 의하여 pEF DHFR (Mack et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 (1995) 7021-7025)으로부터 유래되었다. 서열이 검증된 플라스미드는, 37 ℃, 95 % 습도 그리고 7 % CO₂에서, 10 % FCS, 1% 페니실린/스트렙토마이신, 1 % HEPES, 1 % 피루브산염(pyruvate), 1 % 필수적이지 않은 아미노산들(모두 Biochrom AG Berlin, Germany)로 보충된 안정화된 L- 글루타민를 포함하는 RPMI에서 배양된 쥐과 동물 T 세포주 EL4 (ATCC No. TIB-39)를 트랜스펙션시키기 위해 사용되었다. 트랜스펙션은 SuperFect Transfection Reagent (Qiagen GmbH, Hilden, Germany)과 2 ㎍의 플라스미드 DNA를 가지고 생산자들의 프로토콜에 따라서 수행되었다. 24시간 후에 세포들은 PBS로 세척되어서 600 ㎍/ml의 G418와 함께 위에서 언급한 세포 배양 배지에서 선택을 위하여 다시 배양되었다(PAA Laboratories GmbH, Pasching, Austria). 16일 내지 20일 후에 트랜스펙션은 내성이 있는 세포들의 과성장이 관찰되었다. 추가적인 7일 내지 14일 후에 세포들은 FACS 분석에 의해 인간 CD3 입실론의 발현을 위해서 표준적 프로토콜들에 따라서 실험되었다. 2,5×10⁵ 세포들은 2% FCS를 포함하는 PBS에서 5 ㎍/ml의 항-인간 CD3 항체 UCHT-1 (BD biosciences, Heidelberg, Germany)와 함께 인큐베이션 되었다. 결합된 항체는 Fc-감마 단편 특이적이고 2% FCS를 포함하는 PBS에서 1 :100로 희석된, R-Phycoerythrin-콘주게이션이 된 친화성 정제된 F(ab')2 단편, 염소의 항-생쥐 IgG로 검출되었다(Jackson ImmunoResearch Europe Ltd., Newmarket, Suffolk, UK). 그 샘플들은 FACScalibur (BD biosciences, Heidelberg, Germany) 상에서 측정되었다. 트랜스펙션된 EL4 세포들 상의 인간의 야생형 CD3의 발현은 도 7에서 제시되었다.

5.2. IgGI 항체들로서 종간 교차 특이적 항- CD3 단일 사슬 항체들의 클로닝 과 발현

종간 교차 특이적 단일 사슬 항-CD3 항체들 H2C HLP, A2J HLP 그리고 E2M HLP의 결합의 검출의 개선된 방법을 제공하기 위하여 쥐과동물 IgGI 그리고 인간 람다 불변적 부위들(human lambda constant regions)을 가지는 IgGI 항체들로 전환되었다. 각각의 IgG 항체의 무거운 사슬들과 가벼운 사슬들에 대한 cDNA 서열들의 코드가 표준적 프로토콜들에 따라서 유전자 합성에 의해 획득되었다. 유전자 합성 단편은 구축물의 진핵성 발현을 위한 Kozak 자리를 첫째로 함유하기 위한 것으로서 고안되었고, 후속적으로 19 아미노산 면역글로불린 리더 펩티드가 이어지고(서열번호: 364 그리고 363), 그 다음은 각각의 무거운 사슬 가변적 부위 또는 각각의 가벼운 사슬들 가변적 부위의 암호화 서열에 의한 프레임에서, 그 다음은 쥐과동물 IgG1(서열번호: 366 그리고 365)의 무거운 사슬 불변 부위의 암호화 서열 또는 인간의 람다 가벼운 사슬 불변적 부위(서열번호: 368 및 367)의 암호화 서열에 각각에 의한 프레임에서 이어진다. 제한 자리들은 융합 단백질을 위한 cDNA 코드의 시작점에서와 종결점에서 도입되었다. 제한 자리들, 5' end에서 EcoRI와 3' end에서 Sall은 다음에 오는 클로닝 공정들에서 사용되었다. 유전자 합성 단편은 EcoRI와 Sall을 통해서 무거운 사슬 구축물들을 위한 플라스미드 지정의 pEF-DHFR (pEF-DHFR는 Mack et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 (1995) 7021-7025에 기술되어 있다)과 가벼운 사슬 구축물들을 위한 pEF ADA (pEF ADA Raum et al., Cancer Immunol Immunother., 50(3), (2001), 141-50에 기술되어 있다) 속으로 다음에 오는 표준적 프로토콜들에 따라서 클로닝되었다. 서열이 검증된 플라스미드가 생산자들의 프로토콜에 따라서 FreeStyle 293 Expression System (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, Germany)에서 가벼운 사슬과 무거운 사슬 구축물들 각각의 공동-트랜스펙션을 위해 사용되었다. 3일 후에 트랜스펙션된 세포들의 세포 배양 상층액들이 거두어 들여졌고 알라닌-스캐닝 실험을 위해 사용되었다.

5.3. 알라닌-스캐닝을 위한 인간 CD3 입실론의 알라닌 돌연변이들의 클로닝 과 발현

인간 CD3 입실론의 야생형 서열의 하나의 코돈을 성숙한 인간 CD3 입실론 사슬의 세포외 도메인의 아미노산들 1-27의 각 아미노산을 위한 알라닌에 대한 암호화하는 코돈(GCC)의 각각의 교환이 있는, 인간 CD3 입실론 사슬에 대하여 암호화하는 27 cDNA 단편들이 유전자 합성에 의해 획득되었다. 교환된 코돈을 제외하고 cDNA 단편들은 위에서 언급한 인간의 야생형 CD3 cDNA 단편에 동일성을 보였다. 상기한 인간의 야생형 CD3 cDNA 단편과 비교해서 오직 하나의 코돈만이 각 구축물에서 교체되었다. 제한 자리들, EcoRI와 Sall은 야생형 구축물과 비교해서 동일한 위치들에서 cDNA 단편들 속으로 도입되었다. 모든 알라닌-스캐닝 구축물들은 pEF NEO 속으로 클로닝되었고 서열이 검증된 플라스미드들이 EL4 세포들 속으로 트랜스펙션이 되었다. 트랜스펙션 세포들의 트랜스펙션과 선택은 위에서 설명된 것처럼 수행되었다. 결과적으로 한 그룹의 발현된 구축물들은 인간 CD3 입실론 사슬의 첫 번째 아미노산과, 위치 1에서 글루타민 (Q, GIn)이 알라닌에 의해서 교체된 곳에서 획득되었다. 알라닌에 의해서 교체된 마지막 아미노산이 성숙한 인간의 야생형 CD3 입실론의 위치 27에서의 트레오닌(T, Thr)이었다. 글루타민 1 그리고 트레오닌 27 사이의 각 아미노산에 대하여 야생형 아미노산의 알라닌으로의 교환이 일어난 각각의 트랜스펙션 세포들이 생성되었다.

5.4. 알라닌-스캐닝 실험

2)에서 기술된 것과 같은 키메릭 IgG 항체들과 CD3 입실론에 특이적인 종간 교차 특이적 단일 사슬 항체들들이 알라닌-스캐닝 실험에서 실험되었다. 3)에서 기술된 것과 같은 인간 CD3 입실론의 알라닌-돌연변이 구축물들로 트랜스펙션이 된 EL4 세포주들에 대한 항체들의 결합이 FACS 실험에서 표준적 프로토콜들에 따라서 실험되었다. 각각의 트랜스펙션 세포들의 2,5×10⁵ 세포들이 키메릭 IgG antibodies을 함유하고 있는 50㎕의 세포 배양 상층액과 함께 또는 50㎕의 주변 세포질로 발현된 단일 사슬 항체들의 원상태의 조제물들과 함께 인큐베이션 되었다. 주변 세포질로 발현된 단일 사슬 항체들의 원상태의 조제물들과 함께 인큐베이션된 샘플들에 대하여 항-Flag M2 항체(Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Germany)가 at 5 ㎍/ml in 50㎕ PBS with 2% FCS 제2 항체로서 사용되었다.

키메릭 IgG antibodies과 함께 인큐베이션된 샘플들에 대하여 제2 항체가 필요하지는 않았다. 모든 샘플들에 대하여 항체 분자들의 결합은 Fc-감마 단편 특이적이고 2% FCS를 포함하는 PBS에서 1 :100로 희석된, R-Phycoerythrin-콘주게이션이 된 친화성 정제된 F(ab')2 단편, 염소의 항-생쥐 IgG로 검출되었다(Jackson ImmunoResearch Europe Ltd., Newmarket, Suffolk, UK). 그 샘플들은 FACScalibur (BD biosciences, Heidelberg, Germany) 상에서 측정되었다. 인간 CD3 입실론의 알라닌-돌연변이들로 트랜스펙션된 EL4 세포주들에 대한 키메릭 IgG 분자들 또는 종간 교차 특이적 단일 사슬 항체들의 구별된 결합이 검출되었다. 음성 대조군으로 동형 대조군이나 그것이 아니면 관련성이 없는 특이성의 주변 세포질로 발현된 단 일 사슬 항체들의 원상태의 조제물들이 각각 사용되었다. UCHT-1 항체는 인간 CD3 입실론의 알라닌-돌연변이s의 발현율을 위해서 양성 대조군으로서 사용되었다. 성숙한 CD3 입실론 사슬의 위치 15서 타이로신(tyrosine), 위치 17에서 발린(valine), 위치 19에서 이소로이신, 위치 24에서 발린, 또는 위치 26에서 로이신(leucine) 아미노산들에 대한 알라닌-돌연변이로 트랜스펙션이 된 EL4 세포주들이 매우 낮은 발현율들(제시되지 않은 자료) 때문에 평가가 이루어지질 않았다. 모든 각각의 기하학적 평균 형광 샘플 값들로부터 뺀 각각의 음성 대조군들의 기하학적 평균 형광 값들을 가진 임의의 단위들에서 연관된 결합으로서, 인간 CD3 입실론의 알라닌-돌연변이s로 트랜스펙션이 된 EL4 세포주들에 대한 키메릭 IgG 체제에서의 결합이 도 8 (A- D)에서 제시되었다. 다른 발현율들을 보정하기 위해 트랜스펙션이 세포들에 대한 모든 샘플 값들은 그 다음 각각의 트랜스펙션이 세포들에 대한 UCHT-1 항체의 기하학적 평균 형광 값을 통해 분할되었다. 특이성의 야생형 샘플 값과 비교해서 각각의 특이성의 모든 샘플 값들은 야생형 샘플 값을 통해 최종적으로 분할되었고, 그것에 의하여 결합의 임의적 단위 1에 대한 야생형 샘플 값을 정한다.

사용된 계산들이 다음에 오는 식에서 자세히 제시되었다:

위의 식에서 value_Sample은 도 8 (a-d)에서 도시된 것처럼 특이성 있는 알 라닌-돌연변이에 특이성 있는 항-CD3 항체의 결합의 정도를 표현하는 결합의 임의적 단위들에서의 값을 의미한다. Sample은 특이성을 가지는 알라닌-스캐닝 트랜스펙션된 세포에 대하여 실험된 항 CD3 항체들에 대해 얻어진 기하학적 평균 형광 값을 의미하고, neg_contr은 특이성을 가지는 알라닌-돌연변이에 대하여 실험된 음성 대조군에 대해 얻어진 기하학적 평균 형광 값을 의미하며, UCHT-1는 특이성을 가지는 알라닌-돌연변이에 대하여 실험된 UCHT-1 항체에 대해 얻어진 기하학적 평균 형광 값을 의미하고, WT는 야생형의 트랜스펙션된 세포에 대하여 실험된 특이성을 가지는 항 CD3 항체에 대해 얻어진 기하학적 평균 형광 값을 의미하며, x는 각각의 트랜스펙션된 세포를 지정하는 것이고, y는 각각의 항-CD3 항체를 지정하는 것이며 그리고 wt는 각각의 트랜스펙션된 세포가 야생형인 것을 지정한다. 개개의 알라닌-돌연변이 위치들은 야생형 아미노산의 단일 글자 코드와 위치의 숫자로 라벨링된다.

도 8 (a-d)에서 보여질 수 있는 것처럼 IgG 항체 A2J HLP는 성숙한 CD3 입실론 사슬의 위치 4에서 아스파라긴, 위치 23에서 트레오닌, 그리고 위치 25에서 이소로이신 아미노산들에 대한 결합의 두드러진 손실을 보여 주었다. IgG 항체 A2J HLP의 결합의 완전한 손실은 성숙한 CD3 입실론 사슬의 위치 1에서 글루타민, 위치 2에서 아스파르테이트, 위치 3에서 글리신, 그리고 위치 5에서 글루타메이트에서의 아미노산들에 대해서 관찰되었다. E2M HLP는 성숙한 CD3 입실론 사슬의 위치 4에서 아스파라긴, 위치 23에서 트레오닌, 그리고 위치 25에서 이소로이신 아미노산들에 대한 결합의 두드러진 손실을 보여 주었다. IgG 항체 E2M HLP는 성숙한 CD3 입실론 사슬의 위치 1에서 글루타민, 위치 2에서 아스파르테이트, 위치 3에서 글리신, 그리고 위치 5에서 글루타메이트에서의 아미노산들에 대한 결합의 완전한 손실을 보여 주었다. IgG 항체 H2C HLP는 성숙한 CD3 입실론 사슬의 위치 4에서 아미노산 아스파라긴에 대한 결합의 중등도의 손실을 보여 주었고 그것은 성숙한 CD3 입실론 사슬의 위치 1에서 글루타민, 위치 2에서 아스파르테이트, 위치 3에서 글리신, 그리고 위치 5에서 글루타메이트에서의 아미노산들에 대한 결합의 완전한 손실을 보여 주었다. 단일 사슬 항체 F12Q HLP는 성숙한 CD3 입실론 사슬의 위치 1에서 글루타민, 위치 2에서 아스파르테이트, 위치 3에서 글리신, 그리고 위치 5에서 글루타메이트에서의 아미노산들에 대한 결합의 본질적으로 완전한 손실을 보여 주었다.

6. 쥐과 동물 T 세포주 EL4 속으로 트랜스펙션된 N-말단 His6 태그이 있는 그리고 N-말단 His6 태그이 없는 인간 CD3 입실론 사슬에 대한 종간 교차 특이적 항-CD3 결합 분자 H2C HLP 의 결합 분석

6.1. N-말단 6 히스티딘 태그(His6 tag)을 가진 인간 CD3 입실론 사슬의 클 로닝과 발현

N-말단 His6 태그을 가진 인간 CD3 입실론 사슬에 대하여 암호화하는 cDNA 단편들이 유전자 합성에 의해 획득되었다. 유전자 합성 단편은 구축물의 진핵성 발현을 위한 Kozak 자리를 첫째로 함유하기 위한 것으로서 고안되었고, 그것은 19 아미노산 면역글로불린 리더 펩티드의 암호화 서열에 의한 프레임에서 이어지고, 그 다음에 성숙한 인간 CD3 입실론 사슬의 암호화 서열에 의한 프레임에서 뒤이어지는 His6 태그의 암호화 서열에 의한 프레임에서 이어진다(서열번호: 380과 379에 열거 된 구축물의 cDNA와 아미노산 서열들). 유전자 합성 단편은 또한 cDNA 코드의 시작점에서와 종결점에서 제한 자리들을 포함하기 위한 것으로서 고안되었다. 도입된 제한 자리들, 5' end에서 EcoRI와 3' end에서 Sall은 다음에 오는 클로닝 공정들에서 사용된다. 유전자 합성 단편은 그 다음 EcoRI와 Sall을 통해서 플라스미드 지정의 pEF-NEO (위에서 설명된 것처럼)로 다음에 오는 표준 프로토콜들에 따라서 클로닝되었다. 서열이 검증된 플라스미드가 쥐과 동물 T 세포주 EL4를 트랜스펙션시키기 위해 사용되었다. 트랜스펙션된 세포들의 트랜스펙션과 선택이 위에서 설명된 것처럼 수행되었다. 세포 배양 34일 후에 트랜스펙션된 세포들은 아래에 기술된 실험을 위해서 사용되었다.

6.2. N-말단 His6 태그가 있는 그리고 N-말단 His6 태그가 없는 인간 CD3 입 실론 사슬에 대한 종간 교차 특이적 항- CD3 결합 분자 H2C HLP 의 결합

CD3 입실론에 특이적인 결합 특이성 H2C HLP를 가진 키메릭 IgG 항체가 N-말단 His6 태그가 있는 그리고 없는 인간 CD3 입실론 사슬에 대한 결합을 위해서 실험되었다. 트랜스펙션이 된 EL4 세포주들 His6-인간 CD3 입실론과 야생형 인간 CD3 입실론 각각에 대한 항체의 결합이 FACS 실험에서 표준적 프로토콜들에 따라서 실험되었다. 트랜스펙션 세포들의 2,5×10⁵ 세포들이 키메릭 IgG 항체들 또는 2% FCS를 포함하는 50㎕ PBS에서 5 ㎍/ml로 각각의 대조군 항체들을 함유하고 있는 50㎕의 세포 배양 상층액과 함께 인큐베이션 되었다. 음성 대조군으로서 적당한 동형 대조군 그리고 구축물들의 발현을 위해서 양성 대조군으로서 CD3 특이적 항체 UCHT-1가 각각 사용되었다. 항체들의 결합은 Fc-감마 단편 특이적이고 2% FCS를 포함하는 PBS에서 1 :100로 희석된, R-Phycoerythrin-콘주게이션이 된 친화성 정제된 F(ab')2 단편, 염소의 항-생쥐 IgG로 검출되었다(Jackson ImmunoResearch Europe Ltd., Newmarket, Suffolk, UK). 샘플들은 FACScalibur (BD biosciences, Heidelberg, Germany) 상에서 측정되었다. 야생형 인간 CD3 입실론으로 트랜스펙션된 EL4 세포주에 비교해서 N-말단 His6 태그를 가진 인간-CD3 입실론에 대한 결합 특이성 H2C HLP를 가진 키메릭 IgG의 결합의 명백한 손실이 검출되었다. 이 결과들은 CD3 입실론의 자유 N-말단이 인간 CD3 입실론 사슬에 대한 종간 교차 특이적 항-CD3 결합 분자 H2C HLP의 결합에 필수적이라는 것을 제시하였다(도 9).

7. 형광 활성화 세포 분류기( Fluorescence Activated Cell Sorter ) ( FACS )에 의해 측정된 PBMC 를 발현하는 CD3 에 대한 결합과 비교한 영장류 EGFR 과 영장류 CD3 ( EGFR LH × H2C HLP )에 대하여 종간 교차 특이적인 이중특이 단일 사슬 항체의 융합 단백질 1-27 CD3 - Fc 에 대한 결합 상수 KD 의 표면 플라즈몬 공명 측정( Plasmon Surface Resonance measurement )에 의한 결정

7.1. 표면 플라즈몬 공명 측정( Plasmon Surface Resonance measurement )

인간 CD3 입실론 사슬의 N-말단의 아미노산들 1-27에 대한 완전히 종간 교차 특이적 이중특이 단일 사슬 항체 EGFR-21-63 LH × H2C HLP의 결합 친화성을 결정하기 위하여 표면 플라즈몬 공명 측정이 인간 IgGI의 Fc-부분(1-27 CD3-Fc)에 융합된 성숙한 인간 CD3 입실론 사슬의 N-말단의 아미노산들 1-27로 구성되는 재조합 융합 단백질로 수행되었다. 이 때문에 비아코어(Biacore) Carboxymethyl-Dextran CM5 칩(Biacore, Uppsala, Sweden)이 비아코어 2000® 시스템 (Biacore, Uppsala, Sweden) 상에 설치되었다. 하나의 유세포가 표준 공정들에 따라서 N-(3-디메틸아미노프로필)-N'-에틸카르보디미드 히드로클로라이드/N-히드록시숙시니미드 용액(N-(3-Dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimide hydrochloride / N-Hydroxysuccinimide solution)에 의해 활성화되었다. 융합 단백질 1-27 CD3-Fc의 용액이 나중에 첨가되었고 비아코어 칩의 덱스트란 층에 단백질의 안정한 공유 결합의 결과를 가져왔다. 결합되지 않은 단백질은 넓은 범위의 세척에 의해서 제거되었고 후속적으로 에타놀라민 용액(ethanolamine solution)을 첨가함에 의해서 반응하지 않고 남아 있는 NHS-활성화 카르복시(carboxy) 그룹들의 차단하게 되었다. 단백질 커플링의 성공은 커플링 이전의 신호에 비교하여 응답단위(Response Units)로 측정된 보다 고차의 신호에 의해 확인되었다. 대조 세포(reference cell)는 설명된 것처럼 그러나 단백질 용액을 첨가함이 없이 조제되었다.

정제된 이중특이 항체 EGFR-21-63 LH × H2C HLP가 Slide-A-Lyzer® Mini Dialysis Unit (Pierce, Rockford-ll, USA)에서 HBS-EP 완충액(Biacore, Uppsala, Sweden)에 대항하여 광범위하게 투석되었다. 투석 후에 단백질 농도는 43 ㎍/ml의 농도가 될 수 있도록 UV280 nm 흡광에 의하여 결정되었다. 그 단백질 용액은 96 well plate 속에 옮겨졌고 10개의 또 다른 웰들로 1 : 1 비율에서 HBS-EP 완충액으로 순차적으로 희석되었다.

표면 플라즈몬 공명 측정들은 모든 11 웰들을 별개로 샘플링함에 의해서 수행되었다. 유세포들은 결합된 단백질을 방출시키기 위하여 측정들 사이에서 아세테 이트 완충액으로 재생성되었다.

이중 특이 항체 분자들의 결합 신호들은 1-27 CD3-Fc 단백질과 콘쥬게이션된 측정 세포의 신호로부터 대조 세포의 신호를 빼는 것에 의해서 얻어졌다. 결합 곡선들과 해리 곡선들은 응답단위로서 측정되어 기록되었다. 결합 상수들은 랭뮤어 모델(Langmuir model)에 근거하여 비아코어® 곡선 피팅 소프트웨어를 사용하여 계산되었다. 첫 번째 5개 농도들에 대하여 계산된 결합 상수 KD는 1.52×10^-7 M이 되도록 결정되었다.

7.2. FACS 측정에 의한 CD3 결합 상수의 결정

선천적 인간 CD3에 대한 결합 강도에 관하여, 종간 교차 특이적 이중특이 항체 분자들의 친화성을 실험하기 위하여 추가적인 포화 FACS 결합 분석이 수행되었다. 선택된 이중특이 항체 분자 EGFR-21-63 LH × H2C HLP가 1:1.5의 인자를 가진 희석 열(row)과 63.3 ㎍/ml의 시작 농도를 정하기 위하여 사용되었다. 이중특이 항체 분자는 1.25 × 10⁵ 인간 PBMCs과 함께 다른 농도들에서 각각 한 시간 동안 4℃에서 인큐베이션되었고 그 다음에 4℃에서 PBS에서의 두 번의 세척 단계가 이어졌다. 결합된 이중특이 항체 분자들의 검출은 2% FCS를 포함하는 50㎕ PBS에서 5 ㎍/ml로 Penta-His 항체(Qiagen GmbH, Hildesheim, Germany)를 사용하는 것에 의해서 수행되었다. 45분 동안 4℃에서의 인큐베이션과 두 번의 세척 단계 후에 Penta-His 항체의 결합이 Fc-감마 단편 특이적이고 2% FCS를 포함하는 PBS에서 1 :100로 희석된, R-Phycoerythrin-콘주게이션이 된 친화성 정제된 F(ab')2 단편, 염소의 항-생 쥐 IgG로 검출되었다(Jackson ImmunoResearch Europe Ltd., Newmarket, Suffolk, UK). 유세포 분석은 FACS-Canto Il 장치 상에서 측정되었고, FACS Diva software가 자료를 입수하여 분석하기 위해서 사용되었다(Becton Dickinson biosciences, Heidelberg). FACS 염색(FACS staining)과 형광 세기의 측정이 Current Protocols in Immunology (Coligan, Kruisbeek, Margulies, Shevach and Strober, Wiley-lnterscience, 2002)에서 설명된 것처럼 수행된다. 입수된 형광 세기 평균값들은 사용된 이중특이 항체 분자 농도의 방정식으로서 플롯되었고 단면 결합 분석에서 바이오매스매티컬 소프트웨어 프리즘(biomathematical software Prism)에 의해 분석되었다(hyperbola). 상기 소프트웨어는 질량 작용의 법칙을 따르는 수용체(CD3 양성 PBMC 소분획)에 대한 리간드(이중특이 항체 분자)의 결합을 기술하는 상응하는 KD 값을 계산하였다. 기초 공식은 다음과 같다: Y = Bmax × X / (Kd+X) (여기서 Bmax는 최대 결합). KD는 최대결합 중간값(half-maximal binding)에 도달하기 위해 요구되는 리간드의 농도이다. FACS 염색이 이중으로 수행되었고, R² 값들은 0.95보다 좋았다.

이중특이 항체 분자 EGFR-21- 63 LH × H2C HLP에 대해 결정된 최대결합 중간값이 55000 Dalton의 주어진 분자량에서 154 nM (1.54 × 10^-7> M)에 상응하는 8472 ng/ml의 농도에 도달되었다(도 10).

따라서, EGFR-21-63 LH × H2C HLP의 선천적 CD3-context로부터 분리된 인간 CD3 입실론 사슬의 N-말단 아미노산들 1-27에 대한 친화성이 손상되지 않은 T 세포 들 상에 선천적 CD3에 대한 EGFR-21-63 LH × H2C HLP의 친화성에 동등하다고 증명해주었다.

8. 인간 EGFR 로 트랜스펙션된 CHO 세포들의 생성

인간 EGFR에 대해 양성인 세포주, A431 (epidermoid carcinoma cell line, CRL- 1555, American Type Culture Collection, Rockville, MD)이 키트 매뉴얼의 지시사항들에 따라 격리되었던 총 RNA를 획득하기 위해 사용되었다(Qiagen, RNeasy Mini Kit, Hilden, Germany). 획득된 RNA가 랜덤-프라이밍(random-priming)법에 따르는 역전사에 의한 cDNA 합성을 위해 사용되었다. 인간 EGFR 항원의 전체 길이의 서열의 클로닝을 위해서 다음에 오는 올리고뉴클레오티드들이 사용되었다:

5' EGFR AG Xbal 5'-GGTCTAGAGCATGCGACCCTCCGGGACGGCCGGG-S'

3' EGFR AG Sall 5'-TTTTAAGTCGACTCATGCTCCAATAAATTCACTGCT-S'

암호화 서열은 PCR(94 ℃에서 5분 동안 변성, 58℃에서 1분동안 어닐링, 72℃에서 2분 동안 30 사이클로 연장(elongation); 72℃에서 5분 동안의 마지막 연장(extension))에 의해서 증폭되었다. PCR 생성물은 그 다음에 Xbal 그리고 Sall로서 간추려 졌고(digested), 적절히 간추려 진 발현 벡터 pEF-DHFR(Raum et al., Cancer Immunol. Immunother. 2001; 50: 141[tau]150) 속으로 결찰되고, E.coli로 유전자 형질전환되었다. 상기한 과정들은 표준 프로토콜들에 따라서 수행되었다(Sambrook, Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 3rd edition, Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, New York (2001)). 서열이 검증된 뉴클레오티드 서열(서열번호: 370, 아미노산 서열의 서열번호: 369)로의 클론은 구축물의 진핵성 발현을 위해서 DHFR이 결핍된 CHO 세포들 속으로 트랜스펙션되었다. DHFR이 결핍된 CHO 세포들에서 진핵성 단백질 발현이 Kaufmann R.J. (1990) Methods Enzymol. 185, 537-566에서 설명된 것처럼 수행되었다. 구축물의 유전자 증폭이 최종 농도가 20 nM MTX에 이르도록 메토트렉세이트의 농도들을 증가시킴에 의해서 유도되었다.

9. 사이노몰거스(cynomolgus) EGFR 의 세포외 도메인을 발현시키는 CHO 세포들의 생성

사이노몰거스(cynomolgus) EGFR의 세포외 도메인의 cDNA 서열은 사이노몰거스 원숭이 콜론(cynomolgus monkey colon) cDNA (Cat#: C1534090-Cy-BC; BioCat GmbH, Heidelberg, Germany에서 얻어짐) 상에 두개의 PCRs의 한 세트에 의해서 다음에 오는 반응 조건들을 사용하여 획득되었다: 94℃에서 3분 동안 1 사이클, 그 다음에 94℃에서 1분 동안, 53℃에서 1분 동안, 그리고 72℃에서 2분 동안 35 사이클, 그 다음에 72℃에서 3분 동안 최종 사이클. 다음에 오는 프라이머들이 사용되었다:

1. 정방향 프라이머(forward primer):

5'-CGCTCTGCCCGGCGAGTCGGGC-3'

역방향 프라이머(reverse primer):

5'-CCGTCTTCCTCCATCTCATAGC-3"

2. 정방향 프라이머: 5'- ACATCCGGAGGTGACAGATCACGGCTCGTGC -3'

역방향 프라이머: 5'- CAGGATATCCGAACGATGTGGCGCCTTCGC -3'

표준 프로토콜들에 따라서 PCR 프라이머들을 사용하여 격리되고 서열화되었던 그러한 PCRs은 두 개의 중첩된 단편들을 생성하였고(A: 1-869, B: 848-1923), 그것에 의하여 막 통과 도메인의 21번째 코돈에 대한 성숙한 단백질의 codon +1의 세 번째 뉴클레오티드로부터 사이노몰거스(cynomolgus) EGFR의 cDNA 서열의 1923 bp 부분을 제공하였다. 사이노몰거스(cynomolgus) EGFR의 발현을 위한 구축물을 생성하기 위하여 cDNA 단편이 표준 프로토콜들에 따라서 유전자 합성에 의해 획득되었다(구축물의 cDNA와 아미노산 서열이 서열번호: 372 그리고 371 아래에 열거되어 있다). 이 구축물에서 성숙한 EGFR protein의 아미노산 +2 내지 +641로부터 사이노몰거스(cynomolgus) EGFR를 위한 암호화 서열은 아미노산 +2 내지 +641의 암호화 서열을 교체하여 인간 EGFR의 암호화 서열 속으로 융합되었다. 유전자 합성 단편은 또한 구축물의 진핵성 발현을 위한 Kozak 자리와 인간 EGFR의 막 통과 도메인들과 세포내 도메인들에 융합된 필수적으로 사이노몰거스(cynomolgus) EGFR의 세포외 도메인을 위한 cDNA 암호화의 시작점에서와 종결점에서 제한 자리들을 함유하기 위한 것으로서 고안되었다. 더욱이 기존의 돌연변이는 클로닝 목적들을 위하여 제한 자리(Sphl)를 생성시키기 위하여 발린을 로이신으로 변이시켜서 아미노산 627(막 통과 도메인의 4 번째 아미노산)에서 도입되었다. 도입된 제한 자리들, 5' end에서 Xbal와 3' end에서 Sall은 다음에 오는 클로닝 공정들에서 사용되었다. 유전자 합성 단편은 그 다음 Xbal과 Sall을 통해서 플라스미드 지정의 pEF-DHFR (pEF-DHFR는 Mack et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 (1995) 7021-7025에 기술되어 있다)로 클로닝되었다. 플라스미드의 서열이 검증된 클론은 위에서 설명된 것처럼 CHO/dhfr-세포들을 트랜스펙션시키기 위해 사용되었다.

10. EGFR 과 CD3 종간 교차 특이적 이중특이 단일 사슬 분자들의 생성

10.1. 종간 교차 특이적 결합 분자들의 클로닝

일반적으로, 인간과 침팬지가 아닌 영장류 EGFR에 종간 교차 특이적인 결합 특이성을 가진 도메인뿐만 아니라 인간과 침팬지가 아닌 영장류 CD3 입실론에 종간 교차 특이적인 결합 특이성을 가진 도메인을 각각 포함하는 이중특이성의 단일 사슬 항체 분자들이 다음에 오는 도 1에서 제시되는 것과 같이 고안되었다:

항-CD3 그리고 항-EGFR 종간 교차 특이적 이중특이성의 단일 사슬 항체 분자들의 체제들

서열번호(nucl/prot)	단백질 구축물들의 체제들(N→C)
294/293	EGFR-21-63 LH ×H2C HL
296/295	EGFR-21-63 LH ×H2C HLP
302/301	EGFR-21-63 LH ×A2J HLP
298/297	EGFR-21-63 LH ×H1E HLP
306/305	EGFR-21-63 LH ×E2M HLP
308/307	EGFR-21-63 LH ×F70 HLP
390/389	EGFR1 HL ×12C HL
392/391	EGFR1 LH ×12C HL
394/393	EGFR1 HL ×F12Q HL
396/395	EGFR1 LH ×F12Q HL
398/397	EGFR1 HL ×H2C HL
400/399	EGFR1 LH ×H2C HL
448/447	EGFR1 HL ×H2C HL
450/449	EGFR1 HL ×F12Q LH
452/451	EGFR1 HL ×12C HL
410/409	EGFR1 HL ×12C HL
412/411	EGFR1 LH ×12C HL
414/413	EGFR1 HL ×F12Q HL
416/415	EGFR1 LH ×F12Q HL
418/417	EGFR2 HL ×H2C HL
420/419	EGFR2 LH ×H2C HL

인간과 사이노몰거스(cynomolgus) EGFR에 종간 교차 특이적인 가변적 가벼운-사슬(L) 도메인들과 가변적 무거운-사슬(H) 도메인들을 함유하고 있는 상기한 구축믈들이 유전자 합성에 의해서 획득되었다. 유전자 합성 단편은 구축물의 진핵성 발현을 위한 Kozak 자리를 첫째로 함유하기 위한 것으로서 고안되었고, 후속적으로 19 아미노산 면역글로불린 리더 펩티드, 그 다음은 각각의 이중특이 단일 사슬 항체 분자의 암호화 서열에 의한 프레임에서, 그 다음은 6 히스티딘 태그와 종결코돈의 암호화 서열에 의한 프레임(도 1)에서 이어진다. 유전자 합성 단편은 또한 적합한 N-말단과 C-말단의 제한 자리들을 도입하기 위한 것으로서 고안되었다. 유전자 합성 단편은 이 도입된 제한 자리들을 통해서 플라스미드 지정의 pEF-DHFR(pEF-DHFR은 Raum et al. Cancer Immunol lmmunother 50 (2001) 141-150에 기술되어 있다)로 표준 프로토콜들에 따라서 클로닝되었다(Sambrook, Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 3rd edition, Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, New York (2001)). 서열이 검증된 뉴클레오티드 서열을 가진 클론은 구축물의 진핵성 발현을 위하여 디히드로 리덕타아제(dihydrofolate reductase)(DHFR)가 결핍된 중국 햄스터 난소(CHO)세포들 속으로 트랜스펙션되었다.

구축물들은 표준적 프로토콜들에 따라서 DHFR-결핍 CHO-세포들(ATCC No. CRL 9096) 속으로 전기천공법에 의해서 안정적으로 또는 일시적으로 트랜스펙션되었고 또는 다른 선택으로서 HEK 293(인간 배아기 신장 세포들, ATCC Number: CRL-1573) 속으로 일시적인 방법으로 트랜스펙션되었다.

10.2. 이중특이성의 단일 사슬 항체 분자들의 발현과 정제

이중특이성의 단일 사슬 항체 분자들이 중국 햄스터 난소 세포들(CHO)에서 발현되었다. DHFR-결핍 CHO 세포들에서 진핵성 단백질 발현이 Kaufmann R.J. (1990) Methods Enzymol. 185, 537-566에 의해 설명된 것처럼 수행되었다. 구축물들의 유전자 증폭이 최종 농도가 20 nM MTX에 이르도록 메토트렉세이트의 농도들을 증가시킴에 의해서 유도되었다. 정지되어 있는 배양의 두 경로들 후에 세포들은 거두어 들이기 전에 7일 동안 뉴클레오시드가 없는 HyQ PF CHO 액상 대두 배지(nucleoside-free HyQ PF CHO liquid soy medium) (0.1% Pluronic F - 68; HyClone을 포함하는 4.0 mM L- 글루타민)으로 회전병들(roller bottles)에서 성장하였다. 세포들은 원심분리에 의해 제거되었고 그 발현된 단백질을 함유하는 상층액은 -20℃에서 저장되었다. 대안적으로, 구축물들은 HEK 293 세포들에서 일시적으로 발현되었다. 트랜스펙션이 생산자들의 프로토콜들에 따라서 293fectin reagent(Invitrogen, #12347-019)으로 수행되었다.

Akta® 익스플로러 시스템(GE Health Systems)과 Unicorn® 소프트웨어가 크로마토그래피를 위해 사용되었다. 고정 금속이온 친화성 크로마토그래피(Immobilized metal affinity chromatography ("IMAC"))가 생산자들에 의해 제공된 ZnCl₂가 채워진 프락토겔 EMD 킬레이트(Fractogel EMD chelate® (Merck)를 사용하여 수행되었다. 컬럼(column)은 완충액 A(20 mM 인산나트륨 완충용액 pH 7.2, 0.1 M NaCl)로 평형화되었고 세포 배양 상층액(500 ml)이 3 ml/min의 유속에서 컬럼(10 ml)에 적용되었다. 컬럼은 완충액 A로 결합되지 않은 샘플을 제거하기 위해서 세척되었다. 결합된 단백질은 두 단계의 농도 구배로 완충액 B (20 mM 인산나트륨 완충용액 pH 7.2, 0.1 M NaCI, 0.5 M 이미다졸)를 사용하여 다음에 오는 단계들로 용출되었다:

단계 1 : 6개 컬럼 부피들에서 20% 완충액 B

단계 2: 6개 컬럼 부피들에서 100% 완충액 B

단계 2로부터의 용출된 단백질 분획들은 또 다른 정제를 위해서 풀로 형성되었다. 모든 화학물질들은 연구 등급이었고 Sigma (Deisenhofen) 또는 Merck (Darmstadt)로부터 구매된 것이었다.

겔 여과 크로마토그래피는 Equi-buffer (25 mM Citrat, 200 mM Lysin, 5% Glycerol, pH 7.2)로 평형화된 HiLoad 16/60 Superdex 200 prep grade column (GE/Amersham) 상에서 수행되었다. 용출된 단백질 샘플들(유속 1 ml/min)은 검출을 위해 표준 SDS-PAGE와 웨스턴 블롯(Western Blot)을 하였다. 정제 이전에, 컬럼은 분자량 결정을 위해서 검량되었다(molecular weight marker kit, Sigma MW GF-200). 단백질 농도들은 OD280 nm을 사용하여 결정되었다.

정제된 이중특이 단일 사슬 항체 단백질이 pre-cast 4-12% Bis Tris gels (Invitrogen)로 수행된 조건들을 감소시키는 중에 SDS PAGE에서 분석되었다. 샘플의 조제과 적용은 생산자들에 의해 제공된 프로토콜에 따라서 수행되었다. 분자량은 멀티마크 단백질 표준(MultiMark protein standard)(Invitrogen)으로 결정되었다. 겔은 콜로이드상의 Coomassie (Invitrogen protocol)로 염색되었다. 고립된 단백질의 순도는 SDS-PAGE에 의해서 결정되는 것과 같이 >95%이었다. 이중특이 단일 사슬 항체는 PBS에서 겔 여과법에 의해 결정된 것과 같이 천연적 조건들 하에서 약 52 kDa의 분자량을 갖는다. 모든 구축물들은 상기 방법에 따라서 정제되었다.

웨스턴 블롯이 생산자들에 의해 제공된 프로토콜에 따라서 Optitran® BA-S83 막과 인비트로겐(Invitrogen) 블롯 모듈을 사용하여 수행되었다. 사용된 항체들은 알칼리성 포스파타아제(AP)(Sigma)로 라벨링된 His 태그 (Penta His, Qiagen) 및 염소-항-쥐 lg, 그리고 기질로서 BCIP/NBT(Sigma)에 대항하는 방향으로 향하였다. 단일 밴드는 정제된 이중특이 단일 사슬 항체에 상응하여 52 kD에서 검출되었다.

11. 표면 플라즈몬 공명 측정에 의한 융합 단백질 1-27 CD3 - Fc 에 대하여 완전히 종간 교차 특이적인 이중특이 단일 사슬 항체들의 결합 상수 KD 의 결정

영장류 EGFR 그리고 영장류 CD3에 종간 교차 특이적인 이중특이성의 단일 사슬 항체 분자들의 성숙한 인간 CD3 입실론 사슬의 N-말단의 아미노산들 1-27에 대한 결합 친화성들을 결정하기 위하여, 표면 플라즈몬 공명 측정이 인간 IgGI의 Fc-부분 (1-27 CD3-Fc)에 융합되는 인간 CD3 입실론 사슬의 N-말단 아미노산들 1-27로 구성되는 재조합 융합 단백질로 수행되었다. 이 때문에 비아코어 카복시메틸-덱스트란 CM5 칩 (Biacore, Uppsala, Sweden)이 비아코어 2000® 시스템(Biacore, Uppsala, Sweden) 상에 설치되었다. 하나의 유세포가 표준 공정들에 따라서 N-(3-디메틸아미노프로필)-N'-에틸카르보디미드 히드로클로라이드/N-히드록시숙시니미드 용액에 의해 활성화되었다. 융합 단백질 1-27 CD3-Fc의 용액이 나중에 첨가되었고 비아코어 칩의 덱스트란 층에 단백질이 안정한 공유결합을 이루는 결과를 가져왔다. 결합되지 않은 단백질은 넓은 범위의 세척에 의해서 제거되었고 후속적으로 에타놀라민 용액을 첨가하는 것에 의해서 반응하지 않고 남아 있는 NHS-활성화 카르복시 그룹들의 차단하게 되었다. 단백질 커플링의 성공이 커플링 이전의 신호에 비교하여 응답단위로 측정된 보다 고차의 신호에 의해 확인되었다. 대조 세포가 설명된 것처럼 그러나 단백질 용액을 첨가함이 없이 조제되었다.

아래에서 열거된 정제된 이중특이성의 단일 사슬 항체들은 HBS-EP 완충액(Biacore, Uppsala, Sweden)을 포함한 5 ㎍/ml에 조정되었고 96 웰 플레이트 속에 각각 150㎕의 부피로 옮겨졌다.

표면 플라즈몬 공명측정은 모든 샘플들에 대하여 수행되었고 유세포들은 결합된 단백질을 방출시키기 위하여 측정들 사이에서 아세테이트 완충액으로 재생성되었다(모두가 표준 프로토콜들에 따라서).

이중특이성의 단일 사슬 항체들의 결합 신호들은 1-27 CD3-Fc 단백질과 콘쥬게이션된 측정 세포의 신호로부터 대조 세포의 신호를 빼는 것에 의해서 얻어지게 되었다.

결합 곡선들과 해리 곡선들은 응답단위로서 측정되어 기록되었다. 결합 상수들은 랭뮤어 모델(Langmuir model)에 근거하여 비아코어® 곡선 피팅 소프트웨어를 사용하여 계산되었다. 인간 CD3 입실론 사슬의 N-말단의 아미노산들 1-27에 대하여 실험된 완전히 종간 교차 특이적 이중특이 단일 사슬 분자들에 대하여 계산된 친화성들이 아래의 KD값들로서 주어지고 범위는 2,54×10⁶ M 내지 2,49×10⁷ M이다. "LH"는 VL-VH의 순서로 가변적 도메인들이 정열하는 것을 나타낸다. "HL"은 VH-VL의 순서로 가변적 도메인들이 정열하는 것을 나타낸다. G4H, F70, A2J, E1 L, E2M, H1 E 그리고 F6A는 다른 종간 교차 특이적 CD3 결합 분자들을 가리킨다.

이중특이 항체분자 KD (M)

EGFR LH ×F70 HLP 1.01×10 ^-6

EGFR LH ×A2J HLP 2.49×10 ^-7

EGFR LH × E2M HLP 2.46×10 ^-6

EGFR LH × H1E HLP 2.54×10 ^-6

12. EGFR 와 CD3 종간 교차 특이적 이중특이 항체들의 유세포 결합 분석

인간 그리고 사이노몰거스(cynomolgus) EGFR 그리고 CD3, 각각에 결합 능력에 관하여 종간 교차 특이적 이중특이 항체 구축물들의 기능성을 실험하기 위하여, FACS 분석이 수행되었다. 이 목적을 위해 예 8에서 설명된 것처럼 인간 EGFR로 그리고 인간 CD3 양성 T 세포 백혈병 세포주 HPB-ALL (DSMZ, Braunschweig, ACC483)으로 트랜스펙션된 CHO 세포들이 인간 항원들에 대한 결합을 실험하기 위해서 사용되었다. 사이노몰거스(cynomolgus) 항원들에 대한 결합 반응성은, 예 9에서 설명된, 생성된 사이노몰거스(cynomolgus) EGFR 감염세포와 머카크(macaque) T 세포주 4119LnPx (kindly provided by Prof Fickenscher, Hygiene Institute, Virology, Erlangen-Nuernberg; published in Knappe A, et al., and Fickenscher H., Blood 2000, 95, 3256-61)를 이용하여 실험되었다. 각각의 세포 집단 중에 200.000 세포들이 종간 교차 특이적 이중특이 항체 구축물들 (2 ㎍/ml)의 정제된 단백질 50㎕와 함께 얼음 상에서 30분 동안 인큐베이션 되었다. 대안적으로, 일시적으로 생산된 단백질들의 세포 배양 상층액이 사용되었다. 세포들은 PBS에서 두 번 세척되었고 구축물들의 결합은 쥐과 동물 Penta His 항체(Qiagen; 2% FCS를 포함하는 50㎕ PBS에서 2 ㎍/ml에서 1:20으로 희석됨)로 검출되었다. 세척 후에, 결합된 항 His 항체들이 2% FCS를 포함하는 50㎕ PBS에서 1:100로 희석된, Phycoerythrin-콘주게이션이 된 Fc-감마 단편 특이적 항체(Dianova)로 검출되었다. 새로운 배양 배지가 음성 대조군으로 사용되었다.

유세포 분석은 FACS-Calibur 장치 상에서 측정되었고, 셀퀘스트(CellQuest) 소프트웨어가 자료를 입수하고 분석하기 위해서 사용되었다(Becton Dickinson biosciences, Heidelberg). FACS 염색과 형광 세기의 측정이 Current Protocols in Immunology (Coligan, Kruisbeek, Margulies, Shevach and Strober, Wiley-lnterscience, 2002)에서 설명된 것처럼 수행된다.

EGFR에 대하여 특이적이고 인간과 침팬지가 아닌 영장류 CD3에 대해 종간 교차 특이적인 몇몇 이중특이 단일 사슬 분자들의 결합능이 도 11에서 도시된 것처럼 명백히 검출될 수 있다. FACS 분석에서, 음성 대조군으로서의 배양 배지 그리고 첫 번째와 두 번째 검출 항체와 비교해서, 모든 구축물들은 CD3와 EGFR에 대한 결합을 보여주었다. 인간과 사이노몰거스(cynomolgus) CD3와 EGFR 항원들에 대한 이중특이 항체의 종간 교차 특이성이 설명되었다.

13. EGFR 과 CD3 종간 교차 특이적 이중특이 단일 사슬 항체들의 생물활성

생성된 이중특이 단일 사슬 항체들의 생물활성이 예 8과 9에서 설명된 것처럼 EGFR 양성 세포주들을 사용하는 세포 독성 실험들에서 크로뮴 51 (⁵¹Cr) 방출에 의해서 분석되었다. 작동체 세포들로써 활성화된 인간 CD8 양성 T 세포들 또는 머카크(macaque) T 세포주 4119LnPx가 각각 사용되었다.

활성화된 CD8+ T 세포들의 생성이 다음과 같이 수행된다:

페트리 접시(Petri dish)(145 mm 직경, Greiner)가 37℃에서 한 시간 동안 1 ㎍/ml의 최종 농도로 상업적으로 이용 가능한 항-CD3 특이적 항체로 전-코팅되었다. 결합되지 않은 단백질은 PBS로 일회의 세척 단계에 의해서 제거되었다. 새로운 PBMCs이 표준적 프로토콜들에 따라서 Ficoll 밀도구배 원심분리(Ficoll gradient centrifugation)에 의해서 말초 혈액(30-50 ml의 인간 혈액)으로부터 격리되었다. 3-5 × 10⁷ PBMCs이 120 ml의 RPMI 1640 / 10% FCS / IL-2 20 U/ml (Proleukin, Chiron)로 전코팅된 페트리 접시에 첨가되었고 2일 동안 자극을 받았다. 3 일째 되는 날 세포들이 수집되고, RPMI 1640로 1회 세척되었다. IL-2가 20 U/ml의 최종 농도에 첨가되었고 하루 동안 다시 배양되었다. CD8+ 세포독성 T 임파구들(CTLs)은 CD4+ T 세포들과 CD56+ NK 세포들의 고갈에 의해서 격리되었다.

표적 세포들은 PBS로 2회 세척되었고 37℃에서 45분 동안 50% FCS를 함유한 100㎕ RPMI의 최종 부피에서 11,1 MBq ⁵¹Cr로 라벨링되었다. 후속적으로 라벨링된 표적 세포들은 5 ml RPMI로 3회 세척되었고 그 다음 세포 독성 실험에서 사용되었다. 실험은 10:1 E:T 비율로 보충된 RPMI(상기한 바와 같이) 총 부피 250㎕로 96 웰 플레이트에서 수행되었다. 1 ㎍/ml의 종간 교차 특이적 이중특이성의 단일 사슬 항체 분자들과 그 분자들의 20개의 3배의 희석액들이 적용되었다. 대안적으로, 일시적으로 생산된 단백질들의 세포 배양 상층액이 순차적으로 1:2 단계들로 희석되었다. 실험 시간은 18 시간이었고 세포 독성은 최대의 세포 용해(maximum lysis) (Triton-X의 첨가)와 자발적 세포 용해(spontaneous lysis)(작동체 세포들이 없이)의 차이에 관련된 상층액에서 방출된 크로뮴의 상대적 값들로서 측정되었다. 모든 측정들이 4중으로 시행되었다. 상층액들에서의 크로뮴 활성의 측정은 위즈드 3" 감마카운터(Wizard 3" gammacounter)(Perkin Elmer Life Sciences GmbH, KoIn, Germany)로 수행되었다. 실험적 자료의 분석은 Prism 4 for Windows (version 4.02, GraphPad Software Inc., San Diego, California, USA)에 의해 수행되었다. 에스자(Sigmoidal) 용량 반응 곡선들은 전형적으로 그 소프트웨어에 의해서 결정된 것과 같이 R² 값들 >0.90을 가지고 있었다. 분석 프로그램에 의해서 계산된 EC50 값들은 생물활성의 비교를 위해서 사용되었다.

도 12와 13에서 도시된 것처럼, 생성된 모든 종간 교차 특이적 이중특이 단일 사슬 항체 구축물들은 인간 CD8+ 세포들에 의해서 도출되는 인간 EGFR 양성 표적 세포들과 머카크(macaque) T 세포주 4119LnPx에 의해서 도출되는 cynomolgus EGFR 양성 표적 세포들에 대항하는 세포 독성 활성을 밝혀 주었다. 다른 표적 특이성을 가지는 이중특이 단일 사슬 항체는 음성 대조군으로 사용되었다.

14. 인간 MCSP 의 C-말단, 막 통과 그리고 절단된 세포외 도메인들의 클로닝 과 발현

인간 MCSP(아미노산들 1538 - 2322)의 C-말단, 막 통과 그리고 절단된 세포외 도메인들의 암호화 도메인이 표준적 프로토콜들에 따라서 유전자 합성에 의해 획득되었다(인간 MCSP(인간 D3로 지정된)의 C-말단, 막 통과 그리고 절단된 세포외 도메인들의 발현을 위한 재조합 구축물의 cDNA 서열과 아미노산 서열은 서열번호: 374 그리고 373 아래에 열거되어 있다). 유전자 합성 단편은 구축물의 진핵성 발현을 위한 Kozak 자리를 첫째로 함유하기 위한 것으로서 고안되었고, 그 다음에 19 아미노산 면역글로불린 리더 펩티드가 이어지고, 그 다음은 플래그 태그에 의한 프레임에서, 그 다음은 클로닝의 목적들을 위한 몇몇의 제한 자리들과 9 아미노산 인공의 연결자(linker)암호화(SRTRSGSQL)에 의한 프레임에서 이어지고, 그 다음은 인간 MCSP의 C-말단, 막 통과 그리고 절단된 세포외 도메인의 암호화와 종결코돈에 의한 프레임에서 이어졌다. 제한 자리들은 DNA 단편의 시작점에서와 종결점에서 도입되었다. 제한 자리들은 5' end에서 EcoRI와 3' end에서 Sall은 다음에 오는 클로닝 공정들에서 사용되었다. 그 단편은 EcoRI와 Sall를 가지고 간추려 졌고 pEF-DHFR (pEF-DHFR는 Mack et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 (1995) 7021-7025에 기술되어 있다) 속으로 다음에 오는 표준적 프로토콜들로 클로닝 되었다. 플라스미드의 서열이 검증된 클론은 위에서 설명된 것처럼 CHO/dhfr-세포들을 트랜스펙션시키기 위해 사용되었다. 세포들은 10 % FCS, 1% 페니실린/스트렙토마이신(모두 Biochrom AG Berlin, Germany로부터 획득됨), 그리고 인큐베이터에서 37 ℃에서, 95 % 습도 그리고 7 % CO2에서 최종농도가 10 ㎍/ml Adenosine, 10 ㎍/ml Deoxyadenosine 그리고 10 ㎍/ml Thymidine에 이르는 세포 배양 등급 시약들(cell culture grade reagents)(Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Germany)의 저장 용액(stock solution)으로부터의 뉴클레오시드들로 보충된 안정화된 글루타민을 포함하는 RPMI 1640에서 배양되었다. 트랜스펙션은 폴리펙트 트랜스펙션 리젼트(PolyFect Transfection Reagent) (Qiagen GmbH, Hilden, Germany)와 5 ㎍의 플라스미드 DNA를 가지고 생산자들의 프로토콜에 따라서 수행되었다. 24시간 동안의 배양 후에 세포들은 PBS로 1회 세척되었고 다시 안정화된 글루타민과 1% 페니실린/스트렙토마이신을 포함하는 RPMI 1640에서 배양되었다. 그리하여 세포 배양 배지는 뉴클레오시드들을 함유하지 않았고 그에 의해 선택이 트랜스펙션된 세포들 상에 적용되었다. 트랜스펙션의 약 14일 후에 내성이 있는 세포들의 과성장이 관찰되었다. 트랜스펙션의 추가적인 7일 내지 14일 후에 트랜스펙션된 세포들은 FACS 분석에 의해 구축물의 발현을 위해서 실험되었다. 2,5×10⁵ 세포들이 2% FCS를 포함하는 50㎕ PBS에서 50 ul로 희석된 50㎕의 항-플래그-M2 항체(Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Germany)와 함께 인큐베이션 되었다. 항체의 결합은 Fc-감마 단편 특이적이고 2% FCS를 포함하는 PBS에서 1 :100로 희석된, R-Phycoerythrin-콘주게이션이 된 친화성 정제된 F(ab')2 단편, 염소의 항-생쥐 IgG로 검출되었다(ImmunoResearch Europe Ltd., Newmarket, Suffolk, UK). 그 샘플들은 FACScalibur (BD biosciences, Heidelberg, Germany) 상에서 측정되었다.

15. 머카크(macaque) MCSP 의 C-말단, 막 통과 그리고 절단된 세포외 도메인들의 클로닝과 발현

머카크(macaque) MCSP(머카크(macaque) D3로 지정된)의 C-말단, 막 통과 그리고 절단된 세포외 도메인들의 cDNA 서열은 머카크(macaque) skin cDNA (Cat No. C1534218-Cy-BC; BioCat GmbH, Heidelberg, Germany) 상에 세개의 PCRs의 한 세트에 의해서 다음에 오는 반응 조건들을 사용하여 획득되었다: 94℃에서 3분 동안 1 사이클, 그 다음에 94℃에서 0.5분 동안, 52℃에서 0.5분 동안, 그리고 72℃에서 1.75분 동안 40 사이클, 그 다음에 72℃에서 3분 동안 최종 사이클. 다음에 오는 프라이머들이 사용되었다:

정방향 프라이머: 5'-GATCTGGTCTACACCATCGAGC-3'

역방향 프라이머: 5'-GGAGCTGCTGCTGGCTCAGTGAGG-3'

정방향 프라이머: 5'- TTCCAGCTGAGCATGTCTGATGG-3'

역방향 프라이머: 5'- CGATCAGCATCTGGGCCCAGG-3'

정방향 프라이머: 5'- GTGGAGCAGTTCACTCAGCAGGACC-3'

역방향 프라이머: 5'- GCCTTCACACCCAGTACTGGCC-3'

표준적 프로토콜들에 따라서 PCR 프라이머들을 사용하여 격리되고 서열화되었던 그 PCRs은 세 개의 중첩된 단편들을 생성하였고(A: 1-1329, B: 1229-2428, C: 1782-2547), 그것에 의하여 C-말단 도메인의 암호화 서열의 74 bp upstream으로부터 종결코돈의 121 bp downstream까지의 머카크(macaque) MCSP의 cDNA 서열의 2547 bp 부분을 제공하였다(머카크(macaque) MCSP의 이 부분의 cDNA와 아미노산 서열이 서열번호: 376 그리고 375 아래에 열거되어 있다). 또 다른 PCR이, 다음과 같은 반응 조건들 하에서: 94℃에서 3분 동안 1 사이클, 94℃에서 1분 동안 10 사이클, 52℃에서 1분 동안, 그리고 72℃에서 2.5분 동안 10 사이클, 그 다음에 72℃에서 3분 동안 최종 사이클, 상기한 반응들 A와 B의 PCR 생성물들을 융합시키기 위해서 사용되었다. 다음에 오는 프라이머들이 사용된다:

정방향 프라이머:

5'-tcccgtacgagatctggatcccaattggatggcggactcgtgctgttctcacacagagg-3'

역방향 프라이머:

5'-agtgggtcgactcacacccagtactggccattcttaagggcaggg-3'

이 PCR에 대한 프라이머들은 머카크(macaque) MCSP(designated as 머카크(macaque) D3)의 C-말단, 막 통과 그리고 절단된 세포외 도메인들에 대하여 암호화하는 cDNA 단편의 시작점에서와 종결점에서 제한 자리들을 도입하기 위하여 고안되었다. 그 도입된 제한 자리들, 5' end에서 Mfel와 3' end에서 Sall은 다음에 오는 클로닝 공정들에서 사용된다. PCR 단편은 그 다음 Mfel 그리고 Sall을 통하여 상기한 플라스미드 지정의 pEF-DHFR (pEF-DHFR는 Mack et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 (1995) 7021-7025에 기술되어 있다) EcoRI/Mfel를 함유하고 있는 블루스크립트 플라스미드(Bluescript plasmid) 속으로 인간 MCSP의 C-말단, 막 통과 그리고 절단된 세포외 도메인들을 교체함에 의해서 클로닝되었다. 유전자 합성 단편은 머카크(macaque) MCSP의 C-말단, 막 통과 그리고 절단된 세포외 도메인들에 대하여 암호화하는 cDNA 단편의 5' end에 대한 프레임에서 인공의 연결자(SRTRSGSQL)뿐만 아니라 면역글로불린 리더 펩티드와 플래그 태그의 암화화 서열들을 함유하고 있었다. 이 벡터는 CHO/dhfr-세포들(ATCC No. CRL 9096)을 트랜스펙션시키기 위해 사용되었다.

세포들은 10 % FCS, 1% 페니실린/스트렙토마이신(모두가 Biochrom AG Berlin, Germany로부터 유래함), 그리고 인큐베이터에서 37 ℃에서, 95 % 습도 그리고 7 % CO2에서 최종농도가 10 ㎍/ml Adenosine, 10 ㎍/ml Deoxyadenosine 그리고 10 ㎍/ml Thymidine에 이르는 세포 배양 등급 시약들(Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Germany)의 저장 용액으로부터의 뉴클레오시드들로 보충된 안정화된 글루타민을 포함하는 RPMI 1640에서 배양되었다. 트랜스펙션은 폴리펙트 트랜스펙션 리젼트(PolyFect Transfection Reagent) (Qiagen GmbH, Hilden, Germany)과 5 ㎍의 플라스미드 DNA를 가지고 생산자들의 프로토콜에 따라서 수행되었다. 24시간 동안의 배양 후에 세포들은 PBS로 1회 세척되었고 다시 안정화된 글루타민과 1% 페니실린/스트렙토마이신을 포함하는 RPMI 1640에서 배양되었다. 그리하여 세포 배양 배지는 뉴클레오시드들을 함유하지 않았고 그에 의해 선택이 트랜스펙션된 세포들 상에 적용되었다. 트랜스펙션의 약 14일 후에 내성이 있는 세포들의 과성장이 관찰되었다. 트랜스펙션의 추가적인 7일 내지 14일 후에 트랜스펙션된 세포들은 FACS 분석에 의해 재조합 구축물의 발현을 위해서 실험되었다. 2,5×10⁵ 세포들이 2% FCS를 포함하는 50㎕ PBS에서 50 ul로 희석된 50㎕의 항-플래그-M2 antibody (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Germany)와 함께 인큐베이션 되었다. 항체의 결합은 Fc-감마 단편 특이적이고 2% FCS를 포함하는 PBS에서 1 :100로 희석된, R-Phycoerythrin-콘주게이션이 된 친화성 정제된 F(ab')2 단편, 염소의 항-생쥐 IgG로 검출되었다(Jackson ImmunoResearch Europe Ltd., Newmarket, Suffolk, UK). 그 샘플들은 FACScalibur(BD biosciences, Heidelberg, Germany) 상에서 측정되었다.

16. MCSP 와 CD3 종간 교차 특이적 이중특이 단일 사슬 분자들의 생성과 특징화

인간과 침팬지가 아닌 영장류 MCSP에 종간 교차 특이적인 결합 도메인뿐만 아니라 인간과 침팬지가 아닌 영장류 CD3 입실론에 종간 교차 특이적인 결합 도메인을 각각 포함하는 이중특이성의 단일 사슬 항체 분자들이, 다음의 표 2에서 제시된 것과 같이 고안되었다:

MCSP와 CD3 종간 교차 특이적 이중특이 단일 사슬 항체들의 체제들

서열번호(nucl/prot)	단백질 구축물들의 체제들(N→C)
310/309	MCSP-G4 HL ×H2C HL
312/311	MCSP-G4 HL ×F12Q HL
314/313	MCSP-G4 HL ×I2C HL
316/315	MCSP-G4 HLP ×F6A HLP
318/317	MCSP-G4 HLP ×H2C HLP
322/321	MCSP-G4 HLP ×G4H HLP
326/325	MCSP1-G4 HLP ×E1L HLP
328/327	MCSP1-G4 HLP ×E2M HLP
332/331	MCSP1-G4 HLP ×F12Q HL
334/333	MCSP1-G4 HLP ×I2C HL
336/335	MCSP1-D2 HL ×H2C HL
338/337	MCSP1-D2 HL ×F12Q HL
340/339	MCSP1-D2 HL ×I2C HL
342/341	MCSP1-D2 HLP ×H2C HLP
344/343	MCSP1-F9 HL ×H2C HL
346/345	MCSP1-F9 HLP ×H2C HLP
348/347	MCSP1-F9 HLP ×G4H HLP

인간과 머카크(macaque) MCSP D3에 종간 교차 특이적인 가변적 무거운-사슬(VH)과 가변적 가벼운-사슬a(VL) 도메인들과 인간과 머카크(macaque) CD3에 종간 교차 특이적인 VH와 VL 도메인들을 함유하고 있는 상기한 구축물들이 유전자 합성에 의해서 획득되었다. 유전자 합성 단편들은 구축물의 진핵성 발현을 위한 Kozak 자리를 첫째로 함유하기 위한 것으로서 고안되었고, 후속적으로 19 아미노산 면역글로불린 리더 펩티드, 그 다음은 각각의 이중특이 단일 사슬 항체 분자의 암호화 서열에 의한 프레임에서, 그 다음은 6 히스티딘 태그와 종결코돈의 암호화 서열에 의한 프레임(도 1)에서 이어진다. 유전자 합성 단편은 또한 적합한 N-말단과 C-말단의 제한 자리들을 도입하기 위한 것으로서 고안되었다. 유전자 합성 단편은 이 도입된 제한 자리들을 통해서 플라스미드 지정의 pEF-DHFR(pEF-DHFR은 Raum et al. Cancer Immunol lmmunother 50 (2001) 141-150에 기술되어 있다)로 표준 프로토콜들에 따라서 클로닝되었다(Sambrook, Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 3rd edition, Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, New York (2001)). 구축물들은 표준적 프로토콜들에 따라서 DHFR-결핍 CHO-세포들(ATCC No. CRL 9096) 속으로 전기천공법에 의해서 안정적으로 또는 일시적으로 트랜스펙션되었고 또는 다른 선택으로서 HEK 293(인간 배아기 신장 세포들, ATCC Number: CRL-1573) 속으로 일시적인 방법으로 트랜스펙션되었다.

DHFR-결핍 CHO 세포들에서 진핵성 단백질 발현이 Kaufmann R.J. (1990) Methods Enzymol. 185, 537-566에 의해 설명된 것처럼 수행되었다. 구축물들의 유전자 증폭이 최종 농도가 20 nM MTX에 이르도록 메토트렉세이트의 농도들을 증가시킴으로써 유도되었다. 정지되어 있는 배양의 두 경로들 후에 세포들은 거두어 들이기 전에 7일 동안 뉴클레오시드가 없는 HyQ PF CHO 액상 대두 배지(0.1% Pluronic F - 68; HyClone을 포함하는 4.0 mM L- 글루타민)(with 4.0 mM L- 글루타민 with 0.1% Pluronic F - 68; HyClone)으로 회전병들에서 성장하였다. 세포들은 원심분리에 의해 제거되었고 그 발현된 단백질을 함유하고 있는 상층액은 -20℃에서 저장되었다.

Akta® 익스플로러 시스템(GE Health Systems)과 Unicorn® 소프트웨어가 크로마토그래피를 위해 사용되었다. 고정 금속이온 친화성 크로마토그래피("IMAC")가 프로토콜에 의해 제공된 ZnCl₂가 채워진 프락토겔 EMD 킬레이트®(Merck)를 사용하여 수행되었다. 컬럼은 완충액 A (20 mM 인산나트륨 완충용액 pH 7.2, 0.1 M NaCl)로 평형화 되었고 세포 배양 상층액(500 ml)이 3 ml/min의 유속에서 컬럼(10 ml)에 적용되었다. 컬럼은 완충액 A로 결합되지 않은 샘플을 제거하기 위해서 세척되었다. 결합된 단백질은 두 단계의 농도 구배로 완충액 B (20 mM 인산나트륨 완충용액 pH 7.2, 0.1 M NaCI, 0.5 M 이미다졸)를 사용하여 다음에 오는 단계들로 용출되었다:

단계 1 : 6개 컬럼 부피들에서 20% 완충액 B

단계 2: 6개 컬럼 부피들에서 100% 완충액 B

단계 2로부터 용출된 단백질 분획들은 또 다른 정제를 위해서 풀로 형성되었다. 모든 화학물질들은 연구 등급이었고 Sigma(Deisenhofen) 또는 Merck (Darmstadt)로부터 구매된 것이었다.

겔 여과 크로마토그래피는 Equi-buffer (25 mM Citrat, 200 mM Lysin, 5% Glycerol, pH 7.2)로 평형화된 HiLoad 16/60 Superdex 200 prep grade column (GE/Amersham) 상에서 수행되었다. 용출된 단백질 샘플들(유속 1 ml/min)은 검출을 위해 표준 SDS-PAGE와 웨스턴 블롯을 하였다. 정제 이전에, 컬럼은 분자량 결정을 위해서 검량되었다(molecular weight marker kit, Sigma MW GF-200). 단백질 농도들은 OD280 nm을 사용하여 결정되었다.

정제된 이중특이 단일 사슬 항체 단백질이 pre-cast 4-12% Bis Tris gels (Invitrogen)로 수행된 조건들을 감소시키는 중에 SDS PAGE에서 분석되었다. 샘플의 조제과 적용은 생산자들에 의해 제공된 프로토콜에 따라서 수행되었다. 분자량은 멀티마크 단백질 표준(Invitrogen)으로 결정되었다. 겔은 colloidal Coomassie (Invitrogen protocol)로 염색되었다. 고립된 단백질의 순도는 SDS-PAGE에 의해서 결정되는 것과 같이 >95%이었다.

이중특이 단일 사슬 항체는 인산염 완충 생리식염액(PBS)에서 겔 여과법에 의해 결정된 것과 같이 천연적 조건들 하에서 약 52 kDa의 분자량을 갖는다.

모든 구축물들은 상기 방법에 따라서 정제되었다.

웨스턴 블롯이 생산자들에 의해 제공된 프로토콜에 따라서 Optitran® BA-S83 멤브레인 그리고 인비트로겐 블롯 모듈을 사용하여 수행되었다. 이중특이 단일 사슬 항체 단백질 항체들의 검출을 위해서 항-His 태그 항체가 사용되었다(Penta His, Qiagen). 알카리성 포스파타제(AP) (Sigma)로 라벨링된 염소-항-생쥐 Ig 항체는 제2 항체로 사용되었고 그리고 BCIP/NBT (Sigma)는 기질로 사용되었다. 단일 밴드는 정제된 이중특이 단일 사슬 항체에 상응하여 52 kD에서 검출되었다.

다르게는, 구축물들은 DHFR이 부족한 CHO 세포들에서 일시적으로 발현되었다. 간략하게 말하자면, 구축물 하나 당 4 × 10⁵ 세포들이 10 % 우태아혈청(fetal calf serum), 1% 페니실린/스트렙토마이신 그리고 트랜스펙션 하루 전에 인큐베이터에서 37 ℃에서, 95 % 습도 그리고 7 % CO₂에서 최종농도가 10 ㎍/ml 아데노신(Adenosine), 10 ㎍/ml 데옥시아데노신(Deoxyadenosine) 그리고 10 ㎍/ml 티미딘(Thymidine)에 이르는 세포 배양 등급 시약들(Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Germany)의 저장 용액으로부터의 뉴클레오시드들로 보충된 안정화된 글루타민을 포함하는 3 ml RPMI 1640 all 배지에서 배양되었다. 트랜스펙션은 푸젠 6 트랜스펙션 리젼트(Fugene 6 Transfection Reagent)(Roche, # 11815091001)을 가지고 생산자들의 프로토콜에 따라서 수행되었다. 94㎕ OptiMEM 배지(Invitrogen) 그리고 6㎕ Fugene 6가 혼합되고 실온에서 5분 동안 인큐베이션 된다. 후속적으로 구축물 하나당 1.5 ㎍ DNA가 첨가되었고, 혼합되었으며 그 후 실온에서 15분 동안 인큐베이션 되었다. 한편, DHFR-결핍 CHO 세포들은 PBS로 1회 세척되었고 1.5 ml RPMI 1640 all 배지에서 재분산되었다. 트랜스펙션 혼합물은 600㎕ RPMI 1640 all 배지로써 희석되었고, 그 세포들에 첨가되었으며 그 후 37 ℃에서, 95 % 습도 그리고 7 % CO₂에서 하룻밤 동안 인큐베이션 되었다. 트랜스펙션 그 다음 날 개개 시도의 인큐베이션 용적은 5 ml RPMI 1640 all 배지에 달하였다. 상층액은 인큐베이션 3일 후에 거두어 들여졌다.

17. MCSP 와 CD3 종간 교차 특이적 이중특이 항체들의 유세포 결합 분석

인간 그리고 머카크(macaque) MCSP D3 그리고 CD3에 각각 결합하기 위한 능력에 관한 종간 교차 특이적 이중특이 항체 구축물들의 기능성을 실험하기 위하여, FACS 분석이 수행되었다. 이 목적을 위해 인간 MCSP D3(예 14에서 설명된 것처럼) 그리고 인간 CD3 양성 T 세포 백혈병 세포주 HPB-ALL(DSMZ, Braunschweig, ACC483)으로 트랜스펙션된 CHO 세포들이 인간 항원들에 대한 결합을 실험하기 위해서 사용되었다. 머카크(macaque) 항원들에 대한 결합 반응성이 생성된 머카크(macaque) MCSP D3 트랜스펙션 세포(예 15에서 기술된)와 머카크(macaque) T 세포주 4119LnPx (kindly provided by Prof Fickenscher, Hygiene Institute, Virology, Erlangen-Nuernberg; published in Knappe A, et al., and Fickenscher H., Blood 2000, 95, 3256-61)를 사용하는 것에 의하여 실험되었다. 각각의 세포 집단 중에 200.000 세포들이 종간 교차 특이적 이중특이 항체 구축물들 (2 ㎍/ml) 또는 종간 교차 특이적 이중특이 항체 구축물들을 발현하는 트랜스펙션 세포들의 세포 배양 상층액의 정제된 단백질 50㎕와 함께 얼음 상에서 30분 동안 인큐베이션 되었다. 세포들은 2% FCS를 포함하는 PBS에서 두 번 세척되었고 구축물들의 결합은 쥐과동물의 항-His 항체(Penta His 항체;Qiagen; 2% FCS를 포함하는 50㎕ PBS에서 2 ㎍/ml에서 1:20으로 희석됨)로 검출되었다. 세척 후에, 결합된 항 His 항체들이 2% FCS를 포함하는 PBS에서 1:100로 희석된, Phycoerythrin에 콘주게이션이 된 Fc-감마-특이적 항체(Dianova)로 검출되었다. 트랜스펙션이 되지 않은 CHO 세포들의 상층액이 T 세포주들에 결합하는 것에 대한 음성 대조군으로 사용되었다.

유세포 분석은 FACS-Calibur 장치 상에서 수행되었고; CellQuest 소프트웨어가 자료를 입수하여 분석하기 위해서 사용되었다(Becton Dickinson biosciences, Heidelberg). FACS 염색과 형광 세기의 측정이 Current Protocols in Immunology (Coligan, Kruisbeek, Margulies, Shevach and Strober, Wiley-lnterscience, 2002)에서 설명된 것처럼 수행되었다.

MCSP D3에 대하여 종간 교차 특이적인 그리고 인간과 머카크(macaque) CD3에 대하여 종간 교차 특이적인, 위에서 열거된 단일 사슬 분자들의 이중특이성의 결합은 도 14, 15, 16 그리고 58에서 도시된 것처럼 명백히 검출 가능하였다. FACS 분석에서 모든 구축물들은, 각각의 음성 대조군과 비교해서, CD3와 MCSP D3에 대한 결합을 보여주었다. 인간과 머카크(macaque) CD3에 대한 이중특이 항체들의 종간 교차 특이성이 설명되었다.

18. MCSP 의 생물 활성 그리고 CD3 종간 교차 특이적 이중특이 단일 사슬 항체들

도 17 내지 21에 도시된 것처럼, 모든 생성된 종간 교차 특이적 이중특이 단일 사슬 항체 구축물들은 인간 CD8+ 세포들에 의해서 도출되는 인간 MSCP 양성 표적 세포들과 머카크(macaque) T 세포주 4119LnPx에 의해서 도출되는 사이노몰거스(cynomolgus) MSCP 양성 표적 세포들에 대항하는 세포 독성 활성을 밝혀 주었다. 다른 표적 특이성을 가지는 이중특이 단일 사슬 항체는 음성 대조군으로 사용된다.

19. MCSP 와 CD3 종간 교차 특이적 이중특이 단일 사슬 항체들의 혈장 안정성

인간 혈장에서 생성된 이중특이 단일 사슬 항체들은 37℃와 4℃에서 24시간동안 50% 인간 혈장에서 이중특이 단일 사슬 항체들의 인큐베이션과 후속적으로 생물활성의 실험에 의해서 분석되었다. 생물활성은 MCSP 양성 CHO 세포주(예 14 또는 15에 따라서 클로닝된 것과 같이 MCSP를 발현하여)을 표적으로 사용하고 활성화된 인간 CD8 양성 T 세포들를 작동체 세포들로 사용하는 시험관내 세포 독성 실험에서의 크로뮴 51 (⁵¹Cr) 방출에서 연구되었다.

위에서 설명된 것처럼 분석 프로그램에 의해서 계산된 EC₅₀ 값들은, 혈장의 첨가 없이 또는 실험 바로 직전에 혈장의 동일한 양으로 혼합되어 이중특이 단일 사슬 항체들과 각각, 37℃와 4℃에서 24시간동안 50% 인간 혈장에서 이중특이 단일 사슬 항체들의 인큐베이션 된 이중특이 단일 사슬 항체들의 생물활성의 비교를 위해서 사용되었다.

도 22와 표 3에서 도시된 것과 같이, G4 H-L × I2C H-L, G4 H-L × H2C H-L 그리고 G4 H-L × F12Q H-L 이중특이 항체들의 생물활성은 혈장의 첨가 없이 또는 생물활성 실험 바로 직전에 혈장이 첨가되는 대조군들과 비교해서 현저히 감소하지는 않았다.

혈장의 첨가 없이 또는 혈장 첨가시의 이중특이 항체들의 생물 활성

구축물	혈장첨가 없음	혈장첨가 있음	혈장 37℃	혈장 4℃
G4 H-L ×I2C H-L	300	796	902	867
G4 H-L ×H2C H-L	496	575	2363	1449
G4 H-L ×F12Q H-L	493	358	1521	1040

20. 인간 EGFR 과 CD3 종간 교차 특이적 이중특이 단일 사슬 분자들의 생성

인간 EGFR에 종간 교차 특이적인 결합 도메인뿐만 아니라 인간과 사이노몰거스(cynomolgus) CD3에 종간 교차 특이적인 결합 도메인을 포함하는 이중특이성의 단일 사슬 항체 분자들이 다음에 오는 도 4에서 제시되는 것과 같이 고안되었다 :

EGFR과 CD3 종간 교차 특이적 이중특이 단일 사슬 항체들의 체제들

서열번호 (nucl/prot)	단백질 구축물들의 체제(N→C)
390/389	EGFR H-L×I2C HL
392/391	EGFR L-H×I2C HL
394/393	EGFR H-L×F12Q HL
396/395	EGFR L-H×F12Q HL
398/397	EGFR H-L×H2C HL
400/399	EGFR L-H×H2C HL
448/447	EGFR HL×H2C HL
450/449	EGFR HL×F12Q LH
452/451	EGFR H-L×I2C HL

인간과 사이노몰거스(cynomolgus) EGFR에 종간 교차 특이적인 가변적 가벼운-사슬(L) 도메인들과 가변적 무거운-사슬(H) 도메인들을 함유하고 있는 상기한 구축믈들이 유전자 합성에 의해서 획득되었다. 유전자 합성 단편들은 구축물의 진핵성 발현을 위한 Kozak 자리를 첫째로 함유하기 위한 것으로서 고안되었고, 후속적으로 19 아미노산 면역글로불린 리더 펩티드, 그 다음은 각각의 이중특이 단일 사슬 항체 분자의 암호화 서열에 의한 프레임에서, 그 다음은 6 히스티딘 태그와 종결코돈의 암호화 서열에 의한 프레임에서 이어진다.

유전자 합성 단편은 또한 적합한 N-말단과 C-말단의 제한 자리들을 도입하기 위한 것으로서 고안되었다. 유전자 합성 단편은 이 도입된 제한 자리들을 통해서 플라스미드 지정의 pEF-DHFR(pEF-DHFR은 Raum et al. Cancer Immunol lmmunother 50 (2001) 141-150에 기술되어 있다)로 표준 프로토콜들에 따라서 클로닝되었다(Sambrook, Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 3rd edition, Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, New York (2001)). 구축물들은 예 10에서 설명된 것처럼 생산되고 정제되었을 뿐만 아니라 DHFR-결핍 CHO-세포들(ATCC No. CRL 9096) 속으로 안정적으로 트랜스펙션되었다.

21. 인간 EGFR 과 CD3 종간 교차 특이적 이중특이 단일 사슬 분자들의 생성

인간 EGFR에 종간 교차 특이적인 결합 도메인뿐만 아니라 인간과 사이노몰거스(cynomolgus) CD3에 종간 교차 특이적인 결합 도메인을 포함하는 이중특이성의 단일 사슬 항체 분자들이 다음에 오는 도 5에서 제시되는 것과 같이 고안되었다 :

EGFR과 CD3 종간 교차 특이적 이중특이 단일 사슬 항체들의 체제들

서열번호 (nucl/prot)	단백질 구축물들의 체제(N→C)
410/409	EGFR H-L×I2C HL
412/411	EGFR L-H×I2C HL
414/413	EGFR H-L×F12Q HL
416/415	EGFR L-H×F12Q HL
418/417	EGFR H-L×H2C HL
420/419	EGFR L-H×H2C HL

인간과 사이노몰거스(cynomolgus) EGFR에 종간 교차 특이적인 가변적 가벼운-사슬(L) 도메인들과 가변적 무거운-사슬(H) 도메인들을 함유하고 있는 상기한 구축믈들이 유전자 합성에 의해서 획득되었다. 유전자 합성 단편들은 구축물의 진핵성 발현을 위한 Kozak 자리를 첫째로 함유하기 위한 것으로서 고안되었고, 후속적으로 19 아미노산 면역글로불린 리더 펩티드, 그 다음은 각각의 이중특이 단일 사슬 항체 분자의 암호화 서열에 의한 프레임에서, 그 다음은 6 히스티딘 태그와 종결코돈의 암호화 서열에 의한 프레임에서 이어진다.

유전자 합성 단편은 또한 적합한 N-말단과 C-말단의 제한 자리들을 도입하기 위한 것으로서 고안되었다. 유전자 합성 단편은 이 도입된 제한 자리들을 통해서 플라스미드 지정의 pEF-DHFR(pEF-DHFR은 Raum et al. Cancer Immunol lmmunother 50 (2001) 141-150에 기술되어 있다)로 표준 프로토콜들에 따라서 클로닝되었다(Sambrook, Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 3rd edition, Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, New York (2001)). 구축물들은 예 10에서 설명된 것처럼 생산되고 정제되었을 뿐만 아니라 DHFR-결핍 CHO-세포들(ATCC No. CRL 9096) 속으로 안정적으로 트랜스펙션되었다.

22. 인간 HER2 / neu 과 CD3 종간 교차 특이적 이중특이 단일 사슬 분자들의 생성

인간 HER2/neu에 종간 교차 특이적인 결합 도메인뿐만 아니라 인간과 사이노몰거스(cynomolgus) CD3에 종간 교차 특이적인 결합 도메인을 포함하는 이중특이성의 단일 사슬 항체 분자들이 다음에 오는 도 5에서 제시되는 것과 같이 고안되었다 :

인간 HER2/neu과 CD3 종간 교차 특이적 이중특이 단일 사슬 항체들의 체제들

서열번호 (nucl/prot)	단백질 구축물들의 체제(N→C)
430/439	HER2/neu VH-VL×I2C VH VL
432/431	HER2/neu VL-VH×I2C VH VL
434/433	HER2/neu VH-VL×F12Q VH VL
436/435	HER2/neu VL-VH×F12Q VH VL
438/437	HER2/neu VH-VL×H2C VH VL
440/439	HER2/neu VL-VH×H2C VH VL

인간과 사이노몰거스(cynomolgus) Her2/neu에 종간 교차 특이적인 가변적 가벼운-사슬(L) 도메인들과 가변적 무거운-사슬(H) 도메인들을 함유하고 있는 상기한 구축믈들이 유전자 합성에 의해서 획득되었다. 유전자 합성 단편들은 구축물의 진핵성 발현을 위한 Kozak 자리를 첫째로 함유하기 위한 것으로서 고안되었고, 후속적으로 19 아미노산 면역글로불린 리더 펩티드, 그 다음은 각각의 이중특이 단일 사슬 항체 분자의 암호화 서열에 의한 프레임에서, 그 다음은 6 히스티딘 태그와 종결코돈의 암호화 서열에 의한 프레임에서 이어진다.

유전자 합성 단편은 또한 적합한 N-말단과 C-말단의 제한 자리들을 도입하기 위한 것으로서 고안되었다. 유전자 합성 단편은 이 도입된 제한 자리들을 통해서 플라스미드 지정의 pEF-DHFR(pEF-DHFR은 Raum et al. Cancer Immunol lmmunother 50 (2001) 141-150에 기술되어 있다)로 표준 프로토콜들에 따라서 클로닝되었다(Sambrook, Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 3rd edition, Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, New York (2001)). 구축물들은 예 10에서 설명된 것처럼 생산되고 정제되었을 뿐만 아니라 DHFR-결핍 CHO-세포들(ATCC No. CRL 9096) 속으로 안정적으로 트랜스펙션되었다.

23.1. 인간 HER2 를 발현하는 CHO 세포들의 생성

유전자은행(Accession number X03363)에서 공개된 것과 같이 인간 HER2의 암호화 서열이 표준 프로토콜에 따라서 유전자 합성에 의해서 획득되었다. 유전자 합성 단편은 리더 펩티드(leader peptide)을 포함하는 인간 HER2 단백질의 암호화 서열을 함유하기 위한 것으로서 고안되었다(구축물의 cDNA 서열과 아미노산 서열은 서열번호: 459 그리고 460 아래에 열거되어 있다). 유전자 합성 단편은 또한 그 단편의 시작점에서와 종결점에서 제한 자리들을 포함하기 위한 것으로서 고안되었다. 도입된 제한 자리들, 5' end에서 Xbal와 3' end에서 Sall은 다음에 오는 클로닝 공정들에서 사용된다. 유전자 합성 단편은 그 다음 Xbal 그리고 Sall을 통해서 플라스미드 지정의 pEF-DHFR (pEF-DHFR는 Mack et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 (1995) 7021-7025에 기술되어 있다) 다음에 오는 표준 프로토콜들에 따라서 클로닝되었다. 서열이 검증된 뉴클레오티드 서열을 가지는 클론은 구축물의 진핵성 발현을 위한 DHFR-결핍 CHO-세포들 속으로 트랜스펙션이 된다. DHFR-결핍 CHO 세포들에서 진핵성 단백질 발현이 Kaufmann R.J. (1990) Methods Enzymol. 185, 537-566에 의해 설명된 것처럼 수행되었다. 구축물들의 유전자 증폭이 최종 농도가 20 nM MTX에 이르도록 메토트렉세이트의 농도들을 증가시킴에 의해서 유도되었다.

23.2. 머카크 ( macaque ) Her2 의 세포외 도메인을 발현하는 CHO 세포들의 생성

유전자은행(Accession number XP_001090430)에서 공개된 것과 같이 머카크(macaque) Her2 단백질의 아미노산들 123 내지 1038을 암호화하기 위해서 위에서 설명된 것처럼 인간 HER2의 암호화 서열이 변형된다. 이 키메릭 단백질을 위한 암호화 서열은 표준적 프로토콜들에 따라서 유전자 합성에 의해 획득된다(구축물의 cDNA 서열과 아미노산 서열은 서열번호: 461 그리고 462 아래에 열거되어 있다). 유전자 합성 단편들은 또한 구축물의 진핵성 발현과 그 단편의 시작점에서와 종결점에서 제한 자리들을 위한 Kozak 자리를 함유하기 위한 것으로서 고안되었다. 도입된 제한 자리들, 5' end에서 Xbal와 3' end에서 Sall은 다음에 오는 클로닝 공정들에서 사용된다. 유전자 합성 단편은 그 다음 Xbal 그리고 Sall을 통해서 플라스미드 지정의 pEF-DHFR (pEF-DHFR는 Mack et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 (1995) 7021-7025에 기술되어 있다) 속으로 클로닝된다. 이 플라스미드의 서열이 검증된 클론이 상기한 것과 같이 CHO/dhfr-세포들을 트랜스펙션하기 위해서 사용된다.

23.3. HER2 와 CD3 종간 교차 특이적 이중특이 단일 사슬 분자들의 생성

3.1. 종간 교차 특이적 결합 분자들의 클로닝

일반적으로, 인간과 머카크(macaque) HER2에 종간 교차 특이적인 결합 특이성을 가진 도메인뿐만 아니라 인간과 머카크(macaque) CD3 입실론에 종간 교차 특이적인 결합 특이성을 가진 도메인을 각각 포함하는 이중특이성의 단일 사슬 항체 분자들이 다음에 오는 도 7에서 제시되는 것과 같이 고안되었다 :

항-CD3와 항-HER2 종간 교차 특이적 이중특이성의 단일 사슬 항체 분자들의 체제들

서열번호 (nucl/prot)	단백질 구축물들의 체제(N→C)
432/431	HER2 LH×I2C HL
436/435	HER2 LH×F12Q HL
440/439	HER2 LH×H2C HL
430/429	HER2 HL×I2C HL
434/433	HER2 HL×F12Q HL
438/437	HER2 HL×H2C HL

인간과 머카크(macaque) HER2에 종간 교차 특이적인 가변적 가벼운-사슬(L) 도메인들과 가변적 무거운-사슬(H) 도메인들과, 인간과 머카크(macaque) HER2에 종간 교차 특이적인 CD3 특이적인 VH와 VL 조합물들을 함유하고 있는 상기한 구축믈들이 유전자 합성에 의해서 획득되었다. 유전자 합성 단편들은 구축물의 진핵성 발현을 위한 Kozak 자리를 첫째로 함유하기 위한 것으로서 고안되었고, 후속적으로 19 아미노산 면역글로불린 리더 펩티드, 그 다음은 각각의 이중특이 단일 사슬 항체 분자의 암호화 서열에 의한 프레임에서, 그 다음은 6 히스티딘 태그와 종결코돈의 암호화 서열에 의한 프레임에서 이어진다. 유전자 합성 단편은 또한 그 단편의 시작점에서와 종결점에서 적절한 제한 자리들을 도입하기 위한 것으로서 고안되었다. 도입된 제한 자리들은 다음에 오는 클로닝 공정들에서 사용된다. 유전자 합성 단편은 제한 자리들을 통해서 플라스미드 지정의 pEF-DHFR (pEF-DHFR는 Mack et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 (1995) 7021-7025에 기술되어 있다) 속으로 다음에 오는 표준 프로토콜들에 따라서 클로닝 된다. 상기한 공정들은 다음에 오는 표준 프로토콜들에 따라서 수행된다(Sambrook, Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 3rd edition, Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, New York (2001)). 서열이 검증된 뉴클레오티드 서열을 가지는 클론은 구축물의 진핵성 발현을 위한 DHFR-결핍 CHO-세포들 속으로 트랜스펙션이 된다. DHFR-결핍 CHO 세포들에서 진핵성 단백질 발현이 Kaufmann R.J. (1990) Methods Enzymol. 185, 537-566에 의해 설명된 것처럼 수행된다. 구축물의 유전자 증폭이 최종 농도가 20 nM MTX에 이르도록 메토트렉세이트의 농도들을 증가시킴에 의해서 유도된다.

3.2. 이중특이성의 단일 사슬 항체 분자들의 발현과 정제

이중특이성의 단일 사슬 항체 분자들이 중국 햄스터 난소 세포들(CHO)에서 발현된다. DHFR-결핍 CHO 세포들에서 진핵성 단백질 발현이 Kaufmann R.J. (1990) Methods Enzymol. 185, 537-566에 의해 설명된 것처럼 수행된다. 구축물들의 유전자 증폭이 최종 농도가 20 nM MTX에 이르도록 메토트렉세이트의 농도들을 증가시킴에 의해서 유도된다. 정지되어 있는 배양의 두 경로들 후에 세포들은 거두어 들이기 전에 7일 동안 뉴클레오시드가 없는 HyQ PF CHO 액상 대두 배지(0.1% Pluronic F - 68; HyClone을 포함하는 4.0 mM L- 글루타민)으로 회전병들에서 성장한다. 세포들은 원심분리에 의해 제거되고 그 발현된 단백질을 함유하는 상층액은 -80℃에서 저장된다. 트랜스펙션은 생산자들의 프로토콜들에 따라서 293fectin reagent(Invitrogen, #12347-019)으로 수행된다.

Akta® 익스플로러 시스템(GE Health Systems)과 Unicorn® 소프트웨어가 크로마토그래피를 위해 사용된다. 고정 금속이온 친화성 크로마토그래피("IMAC")가 생산자들에 의해 제공된 ZnCl₂가 채워진 프락토겔 EMD 킬레이트®(Merck)를 사용하여 수행된다. 컬럼은 완충액 A (20 mM 인산나트륨 완충용액 pH 7.2, 0.1 M NaCl)로 평형화(equilibrated) 되고 세포 배양 상층액(500 ml)이 3 ml/min의 유속에서 컬럼(10 ml)에 적용된다. 컬럼은 완충액 A로 결합되지 않은 샘플을 제거하기 위해서 세척된다. 결합된 단백질은 두 단계의 농도 구배로 완충액 B (20 mM 인산나트륨 완충용액 pH 7.2, 0.1 M 염화나트륨, 0.5 M 이미다졸)를 사용하여 다음에 오는 단계들로 용출된다:

단계 1: 6개 컬럼 부피들에서 20% 완충액 B

단계 2: 6개 컬럼 부피들에서 100% 완충액 B

단계 2로부터의 용출된 단백질 분획들은 또 다른 정제를 위해서 풀로 형성된다. 모든 화학물질들은 연구 등급이고 Sigma (Deisenhofen) 또는 Merck (Darmstadt)로부터 구매된 것이다.

겔 여과 크로마토그래피는 Equi-buffer (25 mM Citrat, 200 mM Lysin, 5% Glycerol, pH 7.2)로 평형화된 HiLoad 16/60 Superdex 200 prep grade column (GE/Amersham) 상에서 수행된다. 용출된 단백질 샘플들(유속 1 ml/min)은 검출을 위해 표준 SDS-PAGE와 웨스턴 블롯을 하게 된다. 정제 이전에, 컬럼은 분자량 결정을 위해서 검량되었다(molecular weight marker kit, Sigma MW GF-200). 단백질 농도들은 OD280 nm을 사용하여 결정된다.

정제된 이중특이 단일 사슬 항체 단백질이 pre-cast 4-12% Bis Tris gels (Invitrogen)로 수행된 조건들을 감소시키는 중에 SDS PAGE에서 분석된다. 샘플의 조제과 적용은 생산자들에 의해 제공된 프로토콜에 따라서 수행된다. 분자량은 멀티마크 단백질 표준(Invitrogen)을 이용하여 결정된다. 겔은 콜로이드상의 Coomassie (Invitrogen protocol)로 염색된다. 고립된 단백질의 순도는 SDS-PAGE에 의해서 결정되는 것과 같이 >95%이다.

이중특이 단일 사슬 항체는 PBS에서 겔 여과법에 의해 결정된 것과 같이 천연적 조건들 하에서 약 52 kDa의 분자량을 갖는다. 모든 구축물들은 상기 방법에 따라서 정제된다.

웨스턴 블롯이 생산자들에 의해 제공된 프로토콜에 따라서 Optitran® BA-S83 멤브레인 그리고 인비트로겐 블롯 모듈을 사용하여 수행된다. 이중특이 단일 사슬 항체 단백질 항체들의 검출을 위해서 항-His 태그 항체(Penta His, Qiagen)가 사용된다. 알칼리성 포스파타아제(alkaline phosphatase)(AP)(Sigma)로 라벨링된 염소-항-생쥐 Ig 항체가 제2 항체로서 사용되고 BCIP/NBT (Sigma)가 기질로 사용된다. 단일 밴드는 정제된 이중특이 단일 사슬 항체에 상응하여 52 kD에서 검출된다.

23.4. HER2 와 CD3 종간 교차 특이적 이중특이 항체들의 유세포 결합 분석

인간 그리고 머카크(macaque) HER2 그리고 CD3에 각각 결합하기 위한 능력에 관한 종간 교차 특이적 이중특이 항체 구축물들의 기능성을 실험하기 위하여, FACS 분석이 수행된다. 이 목적을 위해 예 23.1에서 설명된 것처럼 인간 HER2로 트랜스펙션된 CHO 세포들 그리고 인간 CD3 양성 T 세포 백혈병 세포주 HPB-ALL(DSMZ, Braunschweig, ACC483)으로 트랜스펙션된 CHO 세포들이 인간 항원들에 대한 결합을 실험하기 위해서 사용된다. 머카크(macaque) 항원들에 대한 결합 반응성이 예 23.1에서 설명된 것처럼 생성된 머카크(macaque) HER2 트랜스펙션 세포와 머카크(macaque) T 세포주 4119LnPx (kindly provided by Prof Fickenscher, Hygiene Institute, Virology, Erlangen-Nuernberg; published in Knappe A, et al., and Fickenscher H., Blood 2000, 95, 3256-61)를 사용하는 것에 의하여 실험된다. 각각의 세포 집단 중에 200.000 세포들이 종간 교차 특이적 이중특이 항체 구축물들 (2 ㎍/ml)의 정제된 단백질 50㎕와 함께 얼음 상에서 30분 동안 인큐베이션 된다. 세포들은 2% FCS를 포함하는 PBS에서 두 번 세척되고 구축물들의 결합은 쥐과동물의 항-His 항체(Penta His 항체;Qiagen; 2% FCS를 포함하는 50㎕ PBS에서 2 ㎍/ml에서 1:20으로 희석됨)로 검출된다. 세척 후에, 결합된 항 His 항체들이 2% FCS를 포함하는 PBS에서 1:100로 희석된, Phycoerythrin에 콘주게이션이 된 Fc-감마-특이적 항체(Dianova)로 검출된다. 2% FCS를 포함하는 PBS가 HER2로 트랜스펙션된 CHO 세포들뿐만 아니라 T 세포주들에 결합하는 것에 대한 음성 대조군으로 사용된다.

유세포 분석은 FACS-Calibur 장치 상에서 수행되고; CellQuest 소프트웨어가 자료를 입수하여 분석하기 위해서 사용된다(Becton Dickinson biosciences, Heidelberg). FACS 염색과 형광 세기의 측정이 Current Protocols in Immunology (Coligan, Kruisbeek, Margulies, Shevach and Strober, Wiley-lnterscience, 2002)에서 설명된 것처럼 수행된다.

HER2에 대하여 종간 교차 특이적인 그리고 인간과 침팬지가 아닌 영장류 CD3에 대하여 종간 교차 특이적인, 위에서 열거된 단일 사슬 분자들의 이중특이성의 결합은 도 23에서 도시된 것처럼 명백히 검출 가능하였다. FACS 분석에서 모든 구축물들은, 각각의 음성 대조군과 비교해서 CD3와 HER2에 대한 결합을 보여주었다. 인간과 머카크(macaque) CD3와 HER2 항원들에 대한 이중특이 항체들의 종간 교차 특이성이 설명된다.

23.5. HER2 과 CD3 종간 교차 특이적 이중특이 단일 사슬 항체들의 생물활성

생성된 이중특이 단일 사슬 항체들의 생물활성이 예 23.1과 23.2에서 기술된 HER2 양성 세포주들을 사용하는 세포 독성 실험들에서 크로뮴 51 (⁵¹Cr) 방출에 의해서 분석된다. 작동체 세포들로써 활성화된 인간 CD4/CD56 고갈된 PBMC 또는 머카크(macaque) T 세포주 4119LnPx가 각각의 도면들에서 특정된 것과 같이 사용된다.

활성화된 인간 CD4/CD56 고갈된 PBMC의 생성이 다음과 같이 수행된다:

페트리 접시(85 mm 직경, Nunc)가 37℃에서 한 시간 동안 1 ㎍/ml의 최종 농도로 상업적으로 이용 가능한 항-CD3 특이적 항체로 코팅된다. 결합되지 않은 단백질은 PBS로 일회의 세척 단계에 의해서 제거된다. 새로운 PBMCs이 표준적 프로토콜들에 따라서 Ficoll 밀도구배 원심분리에 의해서 말초 혈액(30-50 ml의 인간 혈액)으로부터 격리된다. 3-5×10⁷ PBMCs이 50 ml의 RPMI 1640 / 10% FCS / IL-2 20 U/ml (Proleukin, Chiron)로 전코팅된 페트리 접시에 첨가되고 2일 동안 자극을 받는다. 3 일째 되는 날 세포들이 수집되고, RPMI 1640로 1회 세척된다. IL-2가 20 U/ml의 최종 농도에 첨가되고 하루 동안 상기한 것과 동일한 세포 배양 배지에서 다시 배양된다. CD8+ 세포독성 T 임파구들 (CTLs)은 표준적 프로토콜들에 따라서 CD4+ T 세포들과 CD56+ NK 세포들의 고갈에 의해서 농축된다.

표적 세포들은 PBS로 2회 세척되고 37℃에서 45분 동안 50% FCS를 함유한 100㎕ RPMI의 최종 부피에서 11,1 MBq ⁵¹Cr로 라벨링된다. 후속적으로 라벨링된 표적 세포들은 5 ml RPMI로 3회 세척되고 그 다음 세포 독성 실험에서 사용된다. 실험은, 각각의 도면들에서 특정된 것과 같이, 1:1 또는 10:1의 E:T 비율로 총 부피 250㎕의 보충된 RPMI(상기한 바와 같이)로 96 well plate에서 수행된다. 1 ㎍/ml의 종간 교차 특이적 이중특이성의 단일 사슬 항체 분자들과 그 분자들의 15-21개의 5배의 희석액들이 적용된다. 실험 시간은 18 시간들이고 세포 독성은 최대의 세포 용해(Triton-X의 첨가)와 자발적 세포 용해(작동체 세포들이 없이)의 차이에 관련된 상층액에서 방출된 크로뮴의 상대적 값들로서 측정된다. 모든 측정들이 4중으로 시행된다. 상층액들에서의 크로뮴 활성의 측정은 Wizard 3" gammacounter(Perkin Elmer Life Sciences GmbH, KoIn, Germany)로 수행된다. 실험적 자료의 분석은 Prism 4 for Windows (version 4.02, GraphPad Software Inc., San Diego, California, USA)에 의해 수행된다. 에스자 용량 반응 곡선들은 전형적으로 그 소프트웨어에 의해서 결정된 것과 같이 R² 값들 >0.90을 가지고 있었다. 분석 프로그램에 의해서 계산된 EC50 값들은 생물활성의 비교를 위해서 사용된다.

도 24에서 도시된 것처럼, 모든 생성된 종간 교차 특이적 이중특이 단일 사슬 항체 구축물들은 활성화된 인간 CD4/CD56 depleted PBMC에 의해서 도출되는 인간 HER2 양성 표적 세포들과 머카크(macaque) T 세포주 4119LnPx에 의해서 도출되는 머카크(macaque) HER2 양성 표적 세포들에 대항하는 세포 독성 활성을 설명해 준다.

예 24: IgE 의 인간과 머카크 ( macaque ) 세포막 결합 형태의 클로닝과 발현

생쥐 세포주 J558L (lnterlab Project, lstituto Nazionale per Ia Ricerca sul Cancro, Genova, Italy, ECACC 88032902로부터 획득된), 람다 가벼운 사슬을 합성하고 분비하는 자발적으로 무거운 사슬이 손실된 변종 골수종 세포주(variant myeloma cell line)가 인간과 머카크(macaque) IgE의 세포막에 결합된 무거운 사슬 변종에 의해 보완되기 위해서 각각 사용되었다. 그러한 구축물들을 생성시키기 위해서 합성 분자들이 표준적 프로토콜들에 따라서 유전자 합성에 의해서 획득되었다(그 구축물들의 뉴클레오티드 서열들이 서열번호: 507 그리고 508 아래에 열거되어 있다). 상기 구축물들에서 인간과 머카크(macaque) c 입실론 사슬에 대한 암호화 서열은 IgE의 인간의 막 통과 부위에 각각 융합되었다.

정립된 VH 사슬의 특이성은 햅텐(hapten)(4-히드록시-3- 니트로-페닐)아세틸) (NP)에 대항하여 지시된다. 유전자 합성 단편들은 또한 구축물의 진핵성 발현과 DNA의 시작점에서와 종결점에서 제한 자리들을 위한 Kozak 자리를 함유하기 위한 것으로서 고안되었다. 도입된 제한 자리들, 5' end에서 EcoRI와 3' end에서 Sall은 발현 플라스미드 지정의 pEF-DHFR 속으로의 클로닝 공정들에서 사용되었다. 서열의 검증 후에(macaque: XM_001116734 macaca mulatta Ig epsilon C region, mRNA; human: NC_000014 Homo sapiens chromosome 14, complete sequence, National Center for Biotechnology Information, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez ) 그 플라스미드들은 상기한 것과 같이 CHO/dhfr-세포들을 트랜스펙션하기 위해서 사용되었다. DHFR이 결핍된 CHO 세포들에서 진핵성 단백질 발현이 Kaufmann R.J. (1990) Methods Enzymol. 185, 537-566에서 설명된 것처럼 수행되었다. 구축물의 유전자 증폭이 최종 농도가 20 nM MTX에 이르도록 메토트렉세이트의 농도들을 증가시킴에 의해서 유도되었다.

예 25: Generation of IgE 그리고 CD3 종간 교차 특이적 이중특이 단일 사슬 분자들

일반적으로, 인간과 머카크(macaque) IgE 항원에 대한 결합 특이성을 가진 도메인뿐만 아니라 인간과 사이노몰거스(cynomolgus) CD3 항원에 결합 특이성을 가진 도메인을 각각 포함하는 이중특이성의 단일 사슬 항체 분자들이 다음에 오는 도 8에서 제시되는 것과 같이 고안되었다:

항-CD3와 anti-lgE 종간 교차 특이적 이중특이성의 단일 사슬 항체 분자들의 체제들

서열번호 (nucl/prot)	단백질 구축물들의 체제(N→C)
496/495	lgE HL×H2C HL
498/497	lgE HL×F12Q HL
500/499	lgE HL×I2C HL
502/501	lgE LH×H2C HL
504/503	lgE LH×F12Q HL
506/505	lgE LH×I2C HL

인간과 머카크(macaque) lgE에 대하여 종간 교차 특이적인 가변적 가벼운-사슬(L) 도메인들과 가변적 무거운-사슬(H) 도메인들 그리고 인간과 머카크(macaque) lgE에 대하여 종간 교차 특이적인 CD3 특이적 VH와 VL 조합물들을 함유하고 있는 상기한 구축믈들이 유전자 합성에 의해서 획득되었다. 유전자 합성 단편들은 구축물의 진핵성 발현을 위한 Kozak 자리를 첫째로 함유하기 위한 것으로서 고안되었고, 후속적으로 19 아미노산 면역글로불린 리더 펩티드, 그 다음은 각각의 이중특이 단일 사슬 항체 분자의 암호화 서열에 의한 프레임에서, 그 다음은 6 히스티딘 태그와 종결코돈의 암호화 서열에 의한 프레임에서 이어진다. 유전자 합성 단편은 또한 그 단편의 시작점에서와 종결점에서 적절한 제한 자리들을 도입하기 위한 것으로서 고안되었다. 도입된 제한 자리들은 다음에 오는 클로닝 공정들에서 사용된다. 유전자 합성 단편은 그 제한 자리들을 통해서 플라스미드 지정의 pEF-DHFR (pEF-DHFR는 Mack et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 (1995) 7021-7025에 기술되어 있다) 속으로 다음에 오는 표준 프로토콜들에 따라서 클로닝되었다. 서열이 검증된 뉴클레오티드 서열을 가지는 클론은 구축물의 진핵성 발현을 위한 DHFR-결핍 CHO-세포들 속으로 트랜스펙션이 된다. DHFR-결핍 CHO 세포들에서 진핵성 단백질 발현이 Kaufmann R.J. (1990) Methods Enzymol. 185, 537-566에 의해 설명된 것처럼 수행되었다. 구축물들의 유전자 증폭이 최종 농도가 20 nM MTX에 이르도록 메토트렉세이트의 농도들을 증가시킴에 의해서 유도되었다. 대안적으로 그 구축물들은 표준 프로토콜들에 따라서 일시적인 방법으로 DHFR-결핍 CHO-세포들 속으로 트랜스펙션이 된다.

FACS 결합 실험들이 인간 IgE에 대한 결합 능력을 평가하기 위하여 인간 IgE 트랜스펙션된 J558L 세포주를 사용하여 수행되었다. 머카크(macaque) IgE 양성 세포들에 대한 종간 교차 특이성은 머카크(macaque) IgE로 트랜스펙션된 J558L 세포들을 전개함에 의해서 실험되었다. 세포주들에서의 동일한 변화들이 IgE 그리고 CD3 종간 교차 특이적 이중특이 단일 사슬 항체들로 수행된 세포 독성 실험들에도 적용된다. 상기와는 다르게 실험들이 예 4와 5에서 설명된 것처럼 수행된다.

도 23에서 표현된 것과 같이, 생성된 IgE 그리고 CD3 종간 교차 특이적 이중특이 단일 사슬 항체들은 인간과 사이노몰거스(cynomolgus) 항원들 양쪽 모두에 결합하는 것을 설명해 주었고 완전히 종간 교차 특이적인 것으로 증명해 주었다.

도 24에서 도시된 것처럼, 모든 생성된 종간 교차 특이적 이중특이 단일 사슬 항체 구축물들은 인간 CD8+ 세포들에 의해서 도출되는 인간 IgE 양성 표적 세포들과 머카크(macaque) T 세포주 4119LnPx에 의해서 도출되는 머카크(macaque) IgE 양성 표적 세포들에 대항하는 세포 독성 활성을 밝혀 주었다. 음성 대조군으로서, 연관성이 없는 이중특이 단일 사슬 항체가 사용되어 왔다.

예 26: scFv 클론들의 인간 CD3 입실론의 N-말단에 대한 특이적 결합

26.1. E. coli XL1 Blue 에서 scFv 구축물들의 세균성 발현

위에서 언급한 것처럼, VL-조각과 VH-조각을 함유하고 있는 tpComb3H5BHis로 형질전환된 E. coli XL1 Blue는 gene III 단편의 삭제와 1 mM IPTG의 유입 후에 충분한 양으로 가용성 scFv를 생산한다. scFv-사슬은 그 사슬이 기능적 입체 구조들 속으로 접혀 들어가는 곳에서 주변 세포질으로 수송된다.

다음의 scFv 클론들은 본 실험을 위해 선택되었다:

i) WO 2004/106380에서 설명된 것처럼 ScFvs 4-10, 3-106, 3-114, 3-148, 4-48, 3-190 그리고 3-271.

ii) 여기서 설명된 것처럼 인간 항-CD3 입실론 결합 클론들 H2C, F12Q 그리고 I2C로부터의 ScFvs.

주변 세포질의 조제물들을 대해서, 주변 세포질에서의 발현을 가능하게 하는 플라스미드들을 함유하는 각각의 scFv로 형질전환된 세균 세포들이 20 mM MgCI₂와 카르베니실린 50㎍/ml로 보충된 SB-배지에서 성장되었고 그리고 거두어 들인 후에 PBS에서 재용해되었다. -70℃에서 동결시키고 37℃에서 해동시키는 4 라운드들에 의해서, 세균들의 외막은 온도로 인한 충격으로 파괴되었고 scFv들을 포함하는 가용성 주변 세포질 단백질들은 상층액 속으로 방출되었다. 원심분리에 의한 손상되지 않은 세포들과 세포 잔여물의 제거 후에, 인간의 항-인간 CD3-scFv들을 함유하고 있는 상층액이 수집되었고 또 다른 실험을 위해 사용되었다. scFv들을 포함하는 이 원상태의 상층액들은 주변 세포질의 조제물들(periplasmic preparations (PPP))로서 명명된다.

26.2. 인간 CD3 입실론 ( aa 1-27)- Fc 융합 단백질에 대한 scFvs 의 결합

ELISA 실험들은 하룻밤 동안 4 ℃에서 96 웰 플라스틱 플레이트(Nunc, maxisorb)의 웰들에 인간 CD3 입실론 (aa 1-27)- Fc 융합 단백질을 코팅함에 의해서 수행되었다. 항원 코팅 용액은 그 다음 제거되었고, 웰들은 PBS/0.05 % Tween 20으로 1회 세척되었으며 그리고 후속적으로 적어도 한 시간 동안 PBS/3% BSA로 차단되었다. 차단 용액의 제거 후에, PPPs와 대조 용액들은 웰들에 첨가되었고 실온에서 한 시간 동안 전형적으로 인큐베이션 되었다. 그 다음에 웰들은 PBS/0.05 % Tween 20으로 3회 세척되었다. 고정 항원들에 결합된 scFvs의 검출이 비오틴(Biotin)으로 라벨링 된 항 플래그-태그 항체(전형적으로 1 ㎍/ml PBS의 최종 농도에서, M2 anti Flag-Bio, Sigma)를 사용하여 수행되었고 퍼옥시다아제로 라벨링 된 스트렙타비딘(Dianova, 1 ㎍/ml PBS)으로 검출되었다. 신호는 ABTS 기질 용액을 첨가함에 의해서 전개되었고 405 nm에서 측정되었다. 차단제(blocking agent) 그리고/또는 인간 CD3 입실론 (aa 1-27)- Fc 융합 단백질의 인간 IgGI 부분에 대한 실험-샘플들의 불특정한 결합이 인간 IgGI (Sigma)로 코팅되었던 ELISA 평판들 상에 동일산 시약들과 동일한 타이밍으로 동일한 실험을 수행함에 의해서 실험되었다. PBS는 음성 대조군으로 사용되었다.

도 25에 도시된 것처럼, scFvs H2C, F12Q 그리고 I2C는 인간 CD3 입실론 (aa 1-27)- Fc 융합 단백질 상에 강력한 결합 신호들을 보여준다. 인간 scFvs 3-106, 3-114, 3- 148, 3-190, 3-271, 4-10 그리고 4-48 (WO 2004/106380에서 설명된 것처럼)은 음성 대조 수준을 상회 하는 어떤 현저한 결합도 보여주지 않는다.

인간 CD3 입실론 (aa 1-27)- Fc 융합 단백질으로 코팅된 웰들에 대한 scFvs H2C, F12Q 그리고 I2C의 양성 결합이 BSA (차단제로서 사용된) 그리고/또는 인간 CD3 입실론 (aa 1-27)- Fc 융합 단백질의 인간 IgGI Fc-감마-부분에 대한 결합에 기인할 수 있다는 가능성을 배제하기 위해서, 2차 ELISA 실험이 나란히 수행되었다. 상기 2차 ELISA 실험에서는, 모든 파라미터들이, 이차 ELISA 실험에서 인간 IgGI (Sigma)가 인간 CD3 입실론 (aa 1- 27)- Fc 융합 단백질 대신에 코팅되었던 사실을 제외하면, 초회의 ELISA 실험에서의 파라미터들과 동일하였다. 도 26에서 도시된 것처럼, 실험된 scFvs의 어느 것도 BSA 그리고/또는 인간 IgGI에 대한 기본 수준을 상회 하는 어떤 현저한 결합도 보여주지 않았다.

종합해 볼 때, 상기 결과들은 scFvs 4-10, 3-271, 3-148, 3-190, 4-48, 3-106 그리고 3-114가 인간 CD3 입실론 (aa 1-27)- 부위에 특별하게 결합하지 않고, 그에 반하여, scFvs H2C, F12Q 그리고 I2C가 인간 CD3 입실론의 N-말단 27 아미노산들에 대한 특이적 결합을 명백히 보여준다는 결론을 가능하게 한다.

서열목록

Claims (35)

1. 인간의 그리고 침팬지가 아닌 영장류의 CD3ε(입실론) 사슬의 에피토프에 결합할 수 있는 제1 결합 도메인과, 인간의 그리고/또는 침팬지가 아닌 영장류의 EGFR, Her2/neu 또는 IgE에 결합할 수 있는 제2 결합 도메인을 포함하고,

   상기 에피토프가 서열번호: 2, 4, 6 또는 8로 이루어진 그룹에 포함되는 아미노산 서열의 일부분인 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
2. 제 1 항에 있어서,

   상기 인간의 그리고 침팬지가 아닌 영장류의 CD3ε(입실론) 사슬의 에피토프에 결합할 수 있는 상기 제1 결합 도메인은 인간의 기원인 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
3. 제 1 항 또는 제 2 항 중 어느 한 항에 있어서,

   상기 인간의 그리고 침팬지가 아닌 영장류 CD3ε(입실론) 사슬의 에피토프에 결합할 수 있는 상기 제1 결합 도메인은,

   (a) 서열번호: 27에서 표현된 CDR-L1, 서열번호: 28에서 표현된 CDR-L2 및 서열번호: 29에서 표현된 CDR-L3;

   (b) 서열번호: 117에서 표현된 CDR-L1, 서열번호: 118에서 표현된 CDR-L2 및 서열번호: 119에서 표현된 CDR-L3; 및

   (c) 서열번호: 153에서 표현된 CDR-L1, 서열번호: 154에서 표현된 CDR-L2 및 서열번호: 155에서 표현된 CDR-L3로부터 선택되는 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3을 포함하는 VL 부위를 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
4. 제 1 항 또는 제 2 항 중 어느 한 항에 있어서,

   상기 인간의 그리고 침팬지가 아닌 영장류의 CD3ε(입실론) 사슬의 에피토프에 결합할 수 있는 제1 결합 도메인은,

   (a) 서열번호: 12에서 표현된 CDR-H1, 서열번호: 13에서 표현된 CDR-H2 및 서열번호: 14에서 표현된 CDR-H3;

   (b) 서열번호: 30에서 표현된 CDR-H1, 서열번호: 31에서 표현된 CDR-H2 및 서열번호: 32에서 표현된 CDR-H3;

   (C) 서열번호: 48에서 표현된 CDR-H1, 서열번호: 49에서 표현된 CDR-H2 및 서열번호: 50에서 표현된 CDR-H3;

   (d) 서열번호: 66에서 표현된 CDR-H1, 서열번호: 67에서 표현된 CDR-H2 및 서열번호: 68에서 표현된 CDR-H3;

   (e) 서열번호: 84에서 표현된 CDR-H1, 서열번호: 85에서 표현된 CDR-H2 및 서열번호: 86에서 표현된 CDR-H3;

   (f) 서열번호: 102에서 표현된 CDR-H1, 서열번호: 103에서 표현된 CDR-H2 및 서열번호: 104에서 표현된 CDR-H3;

   (g) 서열번호: 120에서 표현된 CDR-H1, 서열번호: 121에서 표현된 CDR-H2 및 서열번호: 122에서 표현된 CDR-H3;

   (h) 서열번호: 138에서 표현된 CDR-H1, 서열번호: 139에서 표현된 CDR-H2 및 서열번호: 140에서 표현된 CDR-H3;

   (i) 서열번호: 156에서 표현된 CDR-H1, 서열번호: 157에서 표현된 CDR-H2 및 서열번호: 158에서 표현된 CDR-H3; 및

   (j) 서열번호: 174에서 표현된 CDR-H1, 서열번호: 175에서 표현된 CDR-H2 및 서열번호: 176에서 표현된 CDR-H3로부터 선택되는 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3를 포함하는 VH 부위를 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
5. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,

   상기 인간의 그리고 침팬지가 아닌 영장류의 CD3ε(입실론) 사슬의 에피토프에 결합할 수 있는 제1 결합 도메인이 서열번호: 35, 39, 125, 129, 161 또는 165에서 표현된 VL 부위로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 VL 부위를 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
6. 제 1 항, 제 2 항 및 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,

   상기 인간의 그리고 침팬지가 아닌 영장류의 CD3ε(입실론) 사슬의 에피토프에 결합할 수 있는 제1 결합 도메인이 서열번호: 15, 19, 33, 37, 51, 55, 69, 73, 87, 91, 105, 109, 123, 127, 141, 145, 159, 163, 177 또는 181에서 표현된 VH 부위로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 VH 부위를 포함하는 것을 특징으로 하는 폴 리펩티드.
7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,

   상기 인간의 그리고 침팬지가 아닌 영장류의 CD3ε(입실론) 사슬의 에피토프에 결합할 수 있는 제1 결합 도메인은,

   (a) 서열번호: 17 또는 21에서 표현된 VL 부위 및 서열번호: 15 또는 19에서 표현된 VH 부위;

   (b) 서열번호: 35 또는 39에서 표현된 VL 부위 및 서열번호: 33 또는 37에서 표현된 VH 부위;

   (c) 서열번호: 53 또는 57에서 표현된 VL 부위 및 서열번호: 51 또는 55에서 표현된 VH 부위;

   (d) 서열번호: 71 또는 75에서 표현된 VL 부위 및 서열번호: 69 또는 73에서 표현된 VH 부위;

   (e) 서열번호: 89 또는 93에서 표현된 VL 부위 및 서열번호: 87 또는 91에서 표현된 VH 부위;

   (f) 서열번호: 107 또는 111에서 표현된 VL 부위 및 서열번호: 105 또는 109에서 표현된 VH 부위;

   (g) 서열번호: 125 또는 129에서 표현된 VL 부위 및 서열번호: 123 또는 127에서 표현된 VH 부위;

   (h) 서열번호: 143 또는 147에서 표현된 VL 부위 및 서열번호: 141 또는 145 에서 표현된 VH 부위;

   (i) 서열번호: 161 또는 165에서 표현된 VL 부위 및 서열번호: 159 또는 163에서 표현된 VH 부위; 및

   (j) 서열번호: 179 또는 183에서 표현된 VL 부위 및 서열번호: 177 또는 181에서 표현된 VH 부위로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 VL 부위 및 VH 부위를 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
8. 제 7 항에 있어서,

   상기 인간의 그리고 침팬지가 아닌 영장류의 CD3ε(입실론) 사슬의 에피토프에 결합할 수 있는 제1 결합 도메인이 서열번호들: 23, 25, 41, 43, 59, 61, 77, 79, 95, 97, 113, 115, 131, 133, 149, 151, 167, 169, 185 또는 187로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
9. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서,

   상기 폴리펩티드가 이중특이적인(bispecific) 단일 사슬의 항체 분자인 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
10. 제 9 항에 있어서,

    상기 이중특이 단일 사슬의 항체 분자가 서열번호: 441 내지 446, 서열번호: 453 내지 458, 서열번호: 463 내지 468, 서열번호: 481 내지 486으로부터 선택되는 제2 결합 도메인에서 CDR H1, CDR H2, CDR H3, CDR L1, CDR L2 및 CDR L3와 같은 서열들의 그룹을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
11. 제 9 항에 있어서,

    상기 이중특이 단일 사슬의 항체 분자는,

    (a) 서열번호들: 389, 391, 393, 395, 397, 399, 409, 411, 413, 415, 417, 419, 429, 431, 433, 435, 437, 439, 447, 449, 451, 469, 471, 473, 475, 477, 479, 495, 497, 499, 501, 503 및 505 중 어느 하나에서 표현된 아미노산 서열; 및

    (b) 서열번호들: 390, 392, 394, 396, 398, 400, 410, 412, 414, 416, 418, 420, 430, 432, 434, 436, 438, 440, 448, 450, 452, 470, 472, 474, 476, 478, 480, 496, 498, 500, 502, 504 및 506 중 어느 하나에서 표현된 핵산 서열에 의해 암호화된 아미노산 서열로부터 선택되는 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
12. 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에서 정의된 폴리펩티드를 암호화하는 것을 특징으로 하는 핵산 서열.
13. 제 12 항에서 정의된 핵산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 벡터.
14. 제 13 항에 있어서,

    상기 벡터는 제 12 항에서 정의된 상기 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 조절 서열을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 벡터.
15. 제 14 항에 있어서,

    상기 벡터는 발현 벡터인 것을 특징으로 하는 벡터.
16. 제 13 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에서 정의된 벡터를 이용하여 형질전환되거나 또는 트랜스펙션된 것을 특징으로 하는 숙주.
17. 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드를 제조하기 위한 방법으로서,

    상기 방법은, 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에서 정의된 폴리펩티드를 발현할 수 있고 제조된 폴리펩티드를 배양물로부터 회수할 수 있는 조건하에서, 제 16 항에서 정의된 숙주를 배양하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드 제조방법.
18. 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드, 또는 제 17 항의 방법에 따라 제조되는 폴리펩티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
19. 제 18 항에 있어서,

    담체들, 안정화제들 그리고/또는 부형제들의 적절한 제형을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
20. 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드 또는 제 17 항의 방법에 따라 제조된 폴리펩티드를 포함하는 것을 특징으로 하는, 증식성 질환, 종양성 질환, 또는 면역학적 장애로부터 선택되는 질환의 예방, 치료 또는 개선을 위한 약학적 조성물.
21. 제 20 항에 있어서,

    담체들, 안정화제들 그리고/또는 부형제들의 적절한 제형을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
22. 질환의 예방, 치료 또는 개선을 위한 약학적 조성물의 제조를 위한, 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에서 정의된 폴리펩티드 또는 제 17 항에 따라 제조된 폴리펩티드의 용도.
23. 제 22 항에 있어서,

    상기 질환은 증식성 질환, 종양성 질환, 또는 면역학적 장애인 것을 특징으로 하는 폴리펩티드의 용도.
24. 제 23 항에 있어서,

    상기 종양성 질환은 악성 질환인 것을 특징으로 하는 폴리펩티드의 용도.
25. 제 22 항 내지 제 24 항 중 어느 한 항에 있어서,

    상기 약학적 조성물은 추가적인 약제와 병용하여 투여되기에 적합한 것을 특징으로 하는 폴리펩티드의 용도.
26. 제 25 항에 있어서,

    상기 약제는 비-단백질성 화합물 또는 단백질성 화합물인 것을 특징으로 하는 폴리펩티드의 용도.
27. 제 26 항에 있어서,

    상기 단백질성 화합물 또는 비-단백질성 화합물은 제 18 항 또는 제 19 항에 따른 약학적 조성물과 동시에 투여되거나, 비-동시적으로(non-simultaneously) 투여되는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드의 용도.
28. 질환의 예방, 치료 또는 개선의 필요성이 있는 피검자에게서 질환의 예방, 치료 또는 개선을 위한 방법으로서,

    상기 방법은 제 18 항 또는 제 19 항의 약학적 조성물의 유효량을 투여하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
29. 제 28 항에 있어서,

    상기 질환은 증식성 질환, 종양성 질환, 또는 면역학적 장애인 것을 특징으로 하는 방법.
30. 제 29 항에 있어서,

    상기 종양성 질환은 악성 질환인 것을 특징으로 하는 방법.
31. 제 28 항 내지 제 30 항 중 어느 한 항에 있어서,

    상기 약학적 조성물은 추가적인 약제와 병용하여 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
32. 제 31 항에 있어서,

    상기 약제는 비-단백질성 화합물이거나 또는 단백질성 화합물인 것을 특징으로 하는 방법.
33. 제 32 항에 있어서, 상기 단백질성 화합물 또는 비-단백질성 화합물은 제 18 항 또는 제 19 항에 따른 약학적 조성물과 동시에 투여되거나, 비-동시적으로 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
34. 제 28 항 내지 제 33 항 중 어느 한 항에 있어서,

    상기 피검자는 인간인 것을 특징으로 하는 방법.
35. 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에서 정의된 폴리펩티드, 제 12 항에서 정의된 핵산 분자, 제 13 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에서 정의된 벡터, 또는 제 16 항에서 정의된 숙주를 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.

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