ES2432792T3 - Dominio de unión a CD3-épsilon específico de especies cruzadas - Google Patents

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Abstract

Un polipéptido que comprende un dominio de unión que es un anticuerpo capaz de unirse a un epítopo de la cadena CD3ε humana y de Callithrix jacchus, Saguinus oedipus o Saimiri sciureus, en la que el epítopo forma parte de una secuencia de aminoácidos comprendida en el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 2, 4, 6 u 8 y comprende al menos la secuencia de aminoácidos Gln-Asp-Gly-Asn-Glu.

Description

Dominio de unión a CD3-épsilon específico de especies cruzadas.
La presente invención se refiere a un polipéptido que comprende un primer dominio de unión humano que es un anticuerpo capaz de unirse a un epítopo de CD3 (épsilon) humana y de primate distinto de chimpancé, así como a un procedimiento para la producción del polipéptido mencionado. La invención se refiere además a ácidos nucleicos que codifican el polipéptido, a vectores que lo comprenden y a células huésped que comprenden el vector. En otro aspecto, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende el polipéptido mencionado y usos médicos del polipéptido.
El reconocimiento de linfocitos T está mediado por receptores de linfocitos T (TcR) alfa beta y gamma delta con distribución clonotípica que interaccionan con las moléculas cargadas con péptidos del péptido MHC (pMHC) (Davis y Bjorkman, Nature 334 (1988), 395-402). Las cadenas específicas de antígeno del TcR no poseen dominios de señalización sino que se acoplan al aparato de señalización multisubunidades conservado CD3 (Call, Cell 111 (2002), 967-979, Alarcon, Immunol. rev. 191 (2003), 38-46, Malissen Immunol. rev. 191 (2003), 7-27). El mecanismo por el cual la unión al TcR se comunica directamente al aparato de señalización sigue siendo una cuestión fundamental en la biología de los linfocitos T (Alarcon, loc. cit.; Davis, Cell 110 (2002), 285-287). Parece evidente que las respuestas de linfocitos T sostenidas implican la participación de un correceptor, la oligomerización del TcR y un ordenamiento de grado superior de complejos de TcR-pMHC en la sinapsis inmunológica (Davis y van der Merwe, Curr. Biol. 11 (2001), R289-R291, Davis, Nat. Immunol. 4 (2003), 217-224). Sin embargo, la señalización de TcR muy temprana se produce en ausencia de estos acontecimientos y puede implicar un cambio conformacional inducido por ligando en CD3 épsilon (Alarcon, loc. cit., Davis (2002), loc. cit., Gil, J. Biol. Chem. 276 (2001), 1117411179, Gil, Cell 109 (2002), 901-912). Las subunidades épsilon, gamma, delta y zeta del complejo de señalización se asocian entre sí para formar un heterodímero de CD3 épsilon-gamma, un heterodímero de CD3 épsilon-delta y un homodímero de CD3 zeta-zeta (Call, loc. cit.). Diversos estudios han revelado que las moléculas CD3 son importantes para la expresión correcta en la superficie celular del TcR alfa beta y el desarrollo normal de los linfocitos T (Berkhout, J. Biol. Chem. 263 (1988), 8528-8536, Wang, J. Exp. Med. 188 (1998), 1375-1380, Kappes, Curr. Opin. Immunol. 7 (1995), 441-447). La resolución de la estructura de los fragmentos del ectodominio del heterodímero de CD3 épsilon gamma de ratón mostró que ambas subunidades épsilon gamma son dominios Ig de tipo C2 que interaccionan entre sí para formar una configuración yuxtapuesta inusual del dímero (Sun, Cell 105 (2001), 913-923). Aunque parece que el tallo rico en cisteína desempeña un papel importante en el control de la dimerización de CD3 (Su, loc. cit., Borroto, J. Biol. Chem. 273 (1998), 12807-12816), la interacción por medio de los dominios extracelulares de CD3 épsilon y CD3 gamma es suficiente para el ensamblaje de estas proteínas con el TcR beta (Manolios, Eur. J. Immunol. 24 (1994), 84-92, Manolios y Li, Immunol. Cell Biol. 73 (1995), 532-536). Aunque todavía es controvertido, lo más probable es que la estequiometría dominante del TcR comprenda un TcR alfa beta, un heterodímero de CD3 épsilon gamma, un heterodímero de CD3 épsilon delta y un homodímero de CD3 zeta zeta (Call, loc. cit.). Dado el papel clave del heterodímero de CD3 épsilon gamma humana en la respuesta inmunitaria, se ha dilucidado recientemente la estructura cristalina de este complejo unido al anticuerpo terapéutico OKT3 (Kjer-Nielsen, PNAS 101, (2004), 7675-7680).
Varias estrategias terapéuticas modulan la inmunidad de linfocitos T dirigiéndose a la señalización de TcR, en particular, los anticuerpos monoclonales (Acm) anti-CD3 humana que se usan ampliamente en el ámbito clínico en regímenes inmunosupresores. El Acm de ratón específico de CD3 OKT3 fue el primer Acm autorizado para su uso en seres humanos (Sgro, Toxicology 105 (1995), 23-29) y se usa ampliamente en el ámbito clínico como agente inmunosupresor en trasplantes (Chatenoud, Clin. Transplant 7 (1993), 422-430, Chatenoud, Nat. Rev. Immunol. 3 (2003), 123-132, Kumar, Transplant. Proc. 30 (1998), 1351-1352), diabetes de tipo 1 (Chatenoud (2003), loc. cit) y psoriasis (Utset, J. Rheumatol. 29 (2002), 1907-1913). Además, los Acm anti-CD3 pueden inducir señalización de linfocitos T parcial y anergia clonal (Smith, J. Exp. Med. 185 (1997), 1413-1422). En la literatura se ha descrito el OKT3 como un potente mitógeno de linfocitos T (Van Wauve, J. Immunol. 124 (1980), 2708-18) y como un potente destructor de linfocitos T (Wong, Transplantation 50 (1990), 683-9). El OKT3 presenta estas dos actividades de manera dependiente del tiempo; después de la activación temprana de linfocitos T que da lugar a la liberación citocinas, tras la administración adicional, el OKT3 bloquea posteriormente todas las funciones de linfocitos T conocidas. Es debido a este bloqueo posterior de la función de linfocitos T por lo que el OKT3 ha encontrado una aplicación tan amplia como inmunosupresor en regímenes terapéuticos para la reducción o incluso la eliminación del rechazo tisular de aloinjertos.
Lo más probable es que el OKT3 revierta el rechazo tisular de aloinjertos mediante el bloqueo de la función de todos los linfocitos T, que desempeñan un papel principal en el rechazo agudo. El OKT3 reacciona con y bloquea la función del complejo CD3 de la membrana de linfocitos T humanos, que se asocia con la estructura de reconocimiento de antígenos de los linfocitos T (TCR) y es esencial para la transducción de señales. A qué subunidad del TCR/CD3 se une el OKT3 ha sido objeto de múltiples estudios. Aunque algunas pruebas han apuntado a una especificidad del OKT3 por la subunidad épsilon del complejo de TCR/CD3 (Tunnacliffe, Int. Immunol. 1 (1989), 546-50; Kjer-Nielsen, PNAS 101, (2004), 7675-7680), pruebas adicionales han mostrado que la unión del OKT3 al complejo de TCR/CD3 requiere que estén presentes otras subunidades de este complejo (Salmeron, J. Immunol. 147 (1991), 3047-52).
Otros anticuerpos bien conocidos específicos para la molécula CD3 se enumeran en Tunnacliffe, Int. Immunol. 1 (1989), 546-50. Como se indica anteriormente, tales anticuerpos específicos frente a CD3 pueden inducir diversas respuestas de linfocitos T tales como producción de linfocinas (Von Wussow, J. Immunol. 127 (1981), 1197; Palacious, J. Immunol. 128 (1982), 337), proliferación (Van Wauve, J. Immunol. 124 (1980), 2708-18) e inducción de linfocitos T supresores (Kunicka, en "Lymphocyte Typing II" 1 (1986), 223). Esto es, en función de las condiciones experimentales, el anticuerpo monoclonal específico de CD3 puede inhibir o inducir citotoxicidad (Leewenberg, J. Immunol. 134 (1985), 3770; Phillips, J. Immunol. 136 (1986) 1579; Platsoucas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78 (1981), 4500; Itoh, Cell. Immunol. 108 (1987), 283-96; Mentzer, J. Immunol. 135 (1985), 34; Landegren, J. Exp. Med. 155 (1982), 1579; Choi (2001), Eur. J. Immunol. 31, 94-106; Xu (2000), Cell Immunol. 200, 16-26; Kimball (1995), Transpl. Immunol. 3, 212-221).
El documento WO 2007/033230 divulga anticuerpos frente a la secuencia EMGGITQTPYKVSISGT de CD3 que corresponde a los residuos 6-22 de la CD3épsilon humana.
Aunque se ha informado de que muchos de los anticuerpos frente a CD3 descritos en la técnica reconocen la subunidad CD3 épsilon del complejo CD3, la mayoría de ellos se unen en realidad a epítopos conformacionales y, por tanto, sólo reconocen la CD3 épsilon en el contexto nativo del TCR. Los epítopos conformacionales se caracterizan por la presencia de dos o más residuos de aminoácido distintos que están separados en la secuencia primaria, pero se juntan sobre la superficie de la molécula cuando el polipéptido se pliega en la proteína/antígeno nativo (Sela, (1969) Science 166, 1365 y Laver, (1990) Cell 61, 553-6). Los epítopos conformacionales unidos a anticuerpos frente a CD3 épsilon descritos en la técnica pueden separarse en dos grupos. En el grupo principal, dichos epítopos están formados por dos subunidades CD3, p. ej., por la cadena CD3 épsilon y la cadena CD3 gamma o CD3 delta. Por ejemplo, se ha descubierto en varios estudios que los anticuerpos monoclonales frente a CD3 épsilon de uso más extendido, OKT3, WT31, UCHT1, 7D6 y Leu-4, no se unían a células transfectadas únicamente con la cadena CD3-épsilon. Sin embargo, estos anticuerpos tiñeron células doblemente transfectadas con una combinación de CD3 épsilon más CD3 gamma o CD3 delta (Tunnacliffe, loc. cit.; Law, Int. Immunol. 14 (2002), 389-400; Salmeron, J. Immunol. 147 (1991), 3047-52; Coulie, Eur. J. Immunol. 21 (1991), 1703-9). En un segundo grupo más pequeño, el epítopo conformacional se forma dentro de la propia subunidad CD3 épsilon. Por ejemplo, un miembro de este grupo es el Acm APA 1/1 que se ha obtenido contra CD3 épsilon desnaturalizada (Risueno, Blood 106 (2005), 601-8). Tomados en conjunto, la mayoría de los anticuerpos frente a CD3 épsilon descritos en la técnica reconocen epítopos conformacionales situados sobre dos o más subunidades CD3. De este modo, los residuos de aminoácido distintos que forman la estructura tridimensional de estos epítopos pueden estar situados en la propia subunidad CD3 épsilon o en la subunidad CD3 épsilon y otras subunidades CD3 tales como CD3 gamma o CD3 delta.
Otro problema con respecto a los anticuerpos frente a CD3 es que se ha descubierto que muchos anticuerpos frente a CD3 son específicos de especie. Los anticuerpos monoclonales anti-CD3, como sucede en general con cualquier otro anticuerpo monoclonal, funcionan por medio de reconocimiento altamente específico de sus moléculas objetivo. Sólo reconocen un único sitio, o epítopo, sobre su molécula CD3 objetivo. Por ejemplo, uno de los anticuerpos monoclonales de uso más extendido y mejor caracterizados específicos para el complejo CD3 es el OKT-3. Este anticuerpo reacciona con CD3 de chimpancé pero no con el CD3 homólogo de otros primates, tales como macacos,
o con CD3 de perro (Sandusky et al., J. Med. Primatol. 15 (1986), 441-451). El anticuerpo monoclonal anti-CD3 UCHT-1 también reacciona con CD3 de chimpancé pero no con CD3 de macacos (datos propios). Por otro lado, también existen ejemplos de anticuerpos monoclonales que reconocen antígenos de macaco, pero no sus correspondientes humanos. Un ejemplo de este grupo es el anticuerpo monoclonal FN-18 dirigido a CD3 de macacos (Uda et al., J. Med. Primatol. 30 (2001), 141-147). Curiosamente, se ha descubierto que los linfocitos periféricos de aproximadamente el 12 % de los monos cynomolgus carecen de reactividad con el anticuerpo monoclonal anti-CD3 de mono rhesus (FN-18) debido a un polimorfismo del antígeno CD3 en macacos. Uda et al. describieron una sustitución de dos aminoácidos en la secuencia de CD3 de monos cynomolgus, que no reaccionan con anticuerpos FN-18, en comparación con CD3 derivados de animales que reaccionan con anticuerpos FN-18 (Uda et al., J Med Primatol. 32 (2003), 105-10; Uda et al., J Med Primatol. 33 (2004), 34-7).
Esta capacidad discriminatoria, es decir, la especificidad de especie, inherente a los anticuerpos monoclonales frente a CD3 y fragmentos de los mismos, es un impedimento significativo para su desarrollo como agentes terapéuticos para el tratamiento de enfermedades en seres humanos. Para obtener la autorización para su comercialización, cualquier medicación candidata nueva debe pasar por pruebas rigurosas. Estas pruebas pueden subdividirse en las fases preclínica y clínica. Mientras que esta última, dividida además en las fases clínicas I, II y III generalmente conocidas, se realiza en pacientes humanos, la anterior se realiza en animales. El objetivo de las pruebas preclínicas es demostrar que el fármaco candidato tiene la actividad deseada y, lo más importante, es seguro. Sólo cuando se han establecido la seguridad en animales y la posible eficacia del fármaco candidato en pruebas preclínicas, la autoridad reguladora correspondiente aprobará este fármaco candidato para pruebas clínicas en seres humanos. Puede probarse la seguridad de los fármacos candidatos en animales de las tres maneras siguientes: (i) en una especie pertinente, es decir, una especie en la que los fármacos candidatos puedan reconocer los antígenos ortólogos, (ii) en un animal transgénico que contenga los antígenos humanos y (iii) mediante el uso de un sustituto del fármaco candidato que pueda unirse a los antígenos ortólogos presentes en el animal. Las limitaciones de los animales transgénicos son que esta tecnología se limita típicamente a los roedores. Entre los roedores y el ser humano existen diferencias significativas en la fisiología y no pueden extrapolarse fácilmente los resultados de seguridad a seres humanos. Las limitaciones de un sustituto para el fármaco candidato son la diferente composición de materia en comparación con el fármaco candidato real y que, a menudo, los animales usados son roedores con la limitación comentada anteriormente. Por lo tanto, los datos preclínicos generados en roedores tienen una potencia predictiva limitada con respecto al fármaco candidato. El enfoque de elección para las pruebas de seguridad es el uso de especies pertinentes, preferentemente un primate inferior. La limitación ahora de las moléculas de unión a CD3 adecuadas para intervención terapéutica en el ser humano descritas en la técnica es que las especies pertinentes son primates superiores, en particular chimpancés. Los chimpancés se consideran una especie en peligro de extinción y, debido a su naturaleza parecida a los seres humanos, se ha prohibido el uso de tales animales para pruebas de seguridad de fármacos en Europa y está altamente restringido en otros lugares.
Un polipéptido que comprende un dominio de unión que es un anticuerpo capaz de unirse a un epítopo de la cadena CD3ε humana y de Callithrix jacchus, Saguinus oedipus o Saimiri sciureus, en la que el epítopo forma parte de una secuencia de aminoácidos comprendida en el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 2, 4, 6 u 8 y comprende al menos la secuencia de aminoácidos Gln-Asp-Gly-Asn-Glu. Las secuencias mostradas en las SEQ ID NO: 2, 4, 6 y 8 y sus fragmentos son epítopos de CD3 independientes del contexto.
La ventaja de la presente invención es la provisión de un polipéptido que comprende un dominio de unión que es un anticuerpo que muestra especificidad de especies cruzadas frente a la cadena CD3ε (épsilon) humana y de primate distinto de chimpancé, que puede usarse para la evaluación preclínica de la seguridad, la actividad y/o el perfil farmacocinético de estos dominios de unión en primates y, en una forma idéntica, como fármacos en seres humanos. Se puede usar la misma molécula en estudios preclínicos en animales, así como en estudios clínicos en seres humanos. Esto da lugar a resultados altamente comparables y a un gran aumento de la potencia predictiva de los estudios en animales en comparación con las moléculas sustitutas específicas de especie. En la presente invención, se identificó de forma sorprendente un fragmento polipeptídico N-terminal de 1-27 residuos de aminoácido del dominio extracelular de la CD3 épsilon que, en contraste con todos los demás epítopos de CD3 épsilon conocidos descritos en la técnica, mantiene su integridad estructural tridimensional cuando se saca de su entorno nativo en el complejo CD3 (y se fusiona con una secuencia de aminoácidos heteróloga tal como EpCAM o una porción Fc de inmunoglobulina).
La independencia del contexto del epítopo de CD3 proporcionado en la presente invención corresponde a los primeros 27 aminoácidos N-terminales de CD3 épsilon o fragmentos funcionales de este tramo de 27 aminoácidos. La expresión "independiente del contexto", como se usa en el presente documento en relación con el epítopo de CD3, quiere decir que la unión de las moléculas de unión/moléculas de anticuerpo de la invención descritas en el presente documento no da lugar a un cambio o modificación de la conformación, secuencia o estructura que rodea al determinante antigénico o epítopo. En contraste, el epítopo de CD3 reconocido por una molécula de unión a CD3 convencional (p. ej., como se divulga en los documentos WO 99/54440 o WO 04/106380) está situado en la cadena CD3 épsilon, en C-terminal con respecto a los aminoácidos 1-27 N-terminales del epítopo independiente del contexto, donde sólo adopta la conformación correcta si está incluido en el resto de la cadena épsilon y se mantiene en la posición adecuada mediante heterodimerización de la cadena épsilon con cualquiera de las cadenas CD3 gamma o delta.
Las moléculas de unión anti-CD3 como parte de una molécula de unión biespecífica proporcionadas en el presente documento y generadas (y dirigidas) contra un epítopo de CD3 independiente del contexto permiten una mejoría clínica sorprendente con respecto a la redistribución de linfocitos T y, por tanto, un perfil de seguridad más favorable. Sin comprometerse con ninguna teoría, dado que el epítopo de CD3 es independiente del contexto, lo que forma un subdominio autónomo autosuficiente sin mucha influencia sobre el resto del complejo CD3, las moléculas de unión a CD3 proporcionadas en el presente documento inducen menos cambios alostéricos en la conformación de CD3 que las moléculas de unión a CD3 convencionales (como las moléculas proporcionadas en el documento WO 99/54440), que reconocen epítopos de CD3 dependientes del contexto.
La independencia del contexto del epítopo de CD3 de las moléculas de unión a CD3 de la invención como parte de una molécula de unión biespecífica se asocia con menos redistribución de linfocitos T durante la fase inicial del tratamiento con moléculas de unión a CD3 de la invención, dando lugar a un mejor perfil de seguridad de las moléculas de unión a CD3 de la invención en comparación con las moléculas de unión a CD3 convencionales conocidas en la técnica, que reconocen epítopos de CD3 dependientes del contexto. En particular, debido a que la redistribución de linfocitos T durante la fase inicial del tratamiento con moléculas de unión a CD3 es un factor de riesgo principal para acontecimientos adversos en el SNC, las moléculas de unión a CD3 de la invención, mediante el reconocimiento de un epítopo de CD3 independiente del contexto en lugar de dependiente del contexto, tienen una ventaja de seguridad sustancial con respecto a las moléculas de unión a CD3 conocidas en la técnica. Los pacientes con tales acontecimientos adversos en el SNC relacionados con la redistribución de linfocitos T durante la fase inicial del tratamiento con moléculas de unión a CD3 convencionales suelen padecer confusión y desorientación, en algunos casos también incontinencia urinaria. La confusión es un cambio del estado mental en el que el paciente no es capaz de pensar con el nivel de claridad habitual. Habitualmente, el paciente tiene dificultades para concentrarse y el pensamiento no sólo es confuso y poco claro, sino que a menudo se ralentiza significativamente. Los pacientes con acontecimientos adversos del SNC relacionados con la redistribución de linfocitos T durante la fase inicial del tratamiento con moléculas de unión a CD3 convencionales también pueden sufrir pérdida de memoria. Frecuentemente, la confusión da lugar a la pérdida de capacidad para reconocer personas y/o lugares o decir la hora y la fecha. En la confusión son frecuentes sensaciones de desorientación y se deteriora la capacidad de tomar decisiones. Los acontecimientos adversos del SNC relacionados con la redistribución de linfocitos T durante la fase inicial del tratamiento con moléculas de unión a CD3 convencionales pueden comprender además dificultad para hablar y/o dificultad para encontrar las palabras. Este trastorno puede deteriorar tanto la expresión como la comprensión del lenguaje, así como la lectura y la escritura. Además de la incontinencia urinaria, también el vértigo y mareos pueden acompañar a los acontecimientos adversos del SNC relacionados con la redistribución de linfocitos T durante la fase inicial del tratamiento con moléculas de unión a CD3 convencionales en algunos pacientes.
El mantenimiento de la estructura tridimensional dentro del fragmento polipeptídico N-terminal de 27 aminoácidos de CD3 épsilon mencionado puede usarse para generar dominios de unión preferentemente humanos que se unen al fragmento polipeptídico de CD3 épsilon N-terminal in vitro y al complejo CD3 nativo (su subunidad CD3 épsilon) en linfocitos T in vivo con la misma afinidad de unión. Estos datos indican claramente que el fragmento N-terminal descrito en el presente documento adopta una conformación terciaria, que es similar a su estructura existente normalmente in vivo. Se realizó una prueba muy sensible para determinar la importancia de la integridad estructural de los aminoácidos 1-27 del fragmento polipeptídico N-terminal de CD3 épsilon. Se cambiaron aminoácidos individuales de los aminoácidos 1-27 del fragmento polipeptídico N-terminal de CD3 épsilon por alanina (barrido de alanina) para probar la sensibilidad de los aminoácidos 1-27 del fragmento polipeptídico N-terminal de CD3 épsilon a alteraciones menores. Se usaron moléculas de anticuerpo específico para CD3 como parte de una molécula de unión biespecífica de la invención para probar la unión a los mutantes de alanina de los aminoácidos 1-27 del fragmento polipeptídico N-terminal de CD3 épsilon (véase el ejemplo 5 adjunto). Los intercambios individuales de los primeros cinco residuos de aminoácido justo en el extremo N-terminal del fragmento y dos de los aminoácidos de las posiciones 23 y 25 de los aminoácidos 1-27 del fragmento polipeptídico N-terminal de CD3 épsilon fueron críticos para la unión de las moléculas de anticuerpo. La sustitución de residuos de aminoácido en la región de la posición 1-5 que comprende los residuos Q (glutamina en la posición 1), D (ácido aspártico en la posición 2), G (glicina en la posición 3), N (asparagina en la posición 4) y E (ácido glutámico en la posición 5) por alanina suprimió la unión de las moléculas de unión preferentemente humanas de la invención a dicho fragmento. Si bien, para al menos algunas de las moléculas de unión preferentemente humanas de la invención, dos residuos de aminoácido del extremo C-terminal de fragmento mencionado, T (treonina en la posición 23) e I (isoleucina en la posición 25), redujeron la energía de unión a las moléculas de unión preferentemente humanas de la invención.
Inesperadamente, se ha descubierto que las moléculas de unión preferentemente humanas aisladas de este modo no sólo reconocen el fragmento N-terminal de CD3 épsilon humana, sino también los fragmentos homólogos correspondientes de CD3 épsilon de diversos primates, incluidos monos del Nuevo Mundo (titíes, Callithrix jacchus; Saguinus oedipus; Saimiri sciureus) y monos del Viejo Mundo (Macaca fascicularis, también conocido como mono cynomolgus; o Macaca mulatta, también conocido como mono rhesus). Por tanto, se detectó especificidad multiprimate de las moléculas de unión a CD3 de la invención. Los análisis de secuencia siguientes confirmaron que los seres humanos y los primates comparten un tramo de secuencia altamente homóloga en el extremo N-terminal del dominio extracelular de CD3 épsilon.
Como se define en las reivindicaciones, se ha descubierto en la presente invención que es posible generar moléculas de unión preferentemente humanas específicas para CD3 épsilon en las que puede usarse la misma molécula en pruebas preclínicas en animales, así como en estudios clínicos e incluso en tratamiento en seres humanos. Esto se debe a la inesperada identificación de moléculas de unión preferentemente humanas que, además de unirse a CD3 épsilon humana (y probablemente debido a la similitud genética con la correspondiente de chimpancé), también se unen a los homólogos de dichos antígenos de primates distintos de chimpancé, incluidos monos del Nuevo Mundo y monos del Viejo Mundo. Como se muestra en los ejemplos siguientes, dichas moléculas de unión preferentemente humanas específicas de CD3 épsilon pueden integrarse en anticuerpos monocatenarios biespecíficos con el fin de generar agentes terapéuticos contra diversas enfermedades, incluidas, entre otras, el cáncer o trastornos inmunológicos. Por tanto, desaparece la necesidad de construir un dominio de unión a CD3 épsilon sustituto o un anticuerpo monocatenario biespecífico que lo incluya para probarlo en una especie filogenéticamente alejada (de los seres humanos). Como consecuencia, puede usarse exactamente la misma molécula en pruebas preclínicas en animales que la que se pretende administrar a seres humanos en pruebas clínicas, así como en la posterior aprobación para su comercialización y administración terapéutica de fármacos. La capacidad de usar la misma molécula para pruebas preclínicas en animales que en la administración posterior a seres humanos prácticamente elimina, o al menos reduce considerablemente, el peligro de que los datos obtenidos en pruebas preclínicas en animales tengan aplicabilidad limitada para el caso de seres humanos. En resumen, la obtención de datos de seguridad preclínicos en animales usando la misma molécula que se va a administrar realmente a seres humanos, contribuye mucho a garantizar la aplicabilidad de los datos en un escenario pertinente a seres humanos. En contraste, en los enfoques convencionales que usan moléculas sustitutas, se han de adaptar molecularmente dichas moléculas sustitutas al sistema de prueba en animales usado para la evaluación de la seguridad preclínica. Por tanto, la molécula que se va a usar en el tratamiento de seres humanos difiere de hecho en la secuencia y probablemente también en la estructura de la molécula sustituta usada en las pruebas preclínicas de parámetros farmacocinéticos y/o actividad biológica, con la consecuencia de que los datos obtenidos en las pruebas preclínicas en animales tienen aplicabilidad / transferibilidad limitadas para el caso de los seres humanos. El uso de moléculas sustitutas requiere la construcción, producción, purificación y caracterización de una construcción totalmente nueva. Esto da lugar a costes y tiempo de desarrollo adicionales necesarios para obtener esa molécula. En resumen, se tienen que desarrollar los sustitutos por separado además del fármaco real que se va a usar en el tratamiento de seres humanos, por lo que deben llevarse a cabo dos líneas de desarrollo para dos moléculas. Por lo tanto, una ventaja principal de la molécula de unión humana o una construcción a base de anticuerpo que presentan especificidad de especie cruzada descrita en el presente documento es que puede usarse la misma molécula para tratamientos en seres humanos y en pruebas preclínicas en animales.
Se prefiere que las moléculas de unión de la invención capaces de unirse a un epítopo de la cadena CD3 épsilon humana y de primate distinto de chimpancé sean de origen humano. Además, debido al origen humano de las moléculas de unión humanas de la invención se excluye en la mayor medida posible la generación de una reacción inmunitaria contra dichas moléculas de unión tras la administración de las moléculas de unión a pacientes humanos.
Otra ventaja principal de las moléculas de unión humanas específicas de CD3 épsilon preferentemente humanas como parte de una molécula de unión biespecífica de la invención es su aplicabilidad para pruebas preclínicas en diversos primates. Idealmente, el comportamiento de un fármaco candidato en animales debería ser indicativo del comportamiento esperado de este fármaco candidato tras la administración a seres humanos. Como consecuencia, los datos obtenidos a partir de tales pruebas preclínicas deberían tener, por lo tanto, una potencia predictiva alta para el caso de seres humanos. Sin embargo, como se aprendió del resultado trágico del reciente ensayo clínico de fase I de TGN1412 (un anticuerpo monoclonal frente a CD28), un fármaco candidato puede actuar de forma diferente en una especie de primate y en seres humanos: aunque en las pruebas preclínicas de dicho anticuerpo no se habían observado efectos adversos o eran sólo limitados en estudios realizados con monos cynomolgus, seis pacientes humanos desarrollaron insuficiencia multiorgánica tras la administración de dicho anticuerpo (Lancet 368 (2006), 2206-7). Los resultados de estos acontecimiento negativos no deseados indican que puede no ser suficiente limitar las pruebas preclínicas a una sola especie (de primates). El hecho de que las moléculas de unión humanas específicas de CD3 épsilon de la invención se unan a una serie de monos del Nuevo Mundo y del Viejo Mundo puede ayudar a superar los problemas que se presentaron en el caso mencionado anteriormente. En consecuencia, la presente invención como se define en las reivindicaciones proporciona medios y procedimientos para reducir al mínimo las diferencias entre especies en los efectos cuando se desarrollan y se prueban fármacos para el tratamiento de seres humanos.
Con el dominio de unión a CD3 épsilon específico de especies cruzadas, preferentemente humano, como parte de una molécula de unión biespecífica de la invención también deja de ser necesario adaptar el animal de prueba al fármaco candidato que se pretende administrar a seres humanos, tal como, p. ej., la creación de animales transgénicos. Las moléculas de unión específicas de CD3 épsilon preferentemente humanas (o anticuerpos monocatenarios biespecíficos que las contienen), que presentan especificidad de especies cruzadas de acuerdo con los usos y los procedimientos de la invención pueden usarse directamente para realizar pruebas preclínicas en primates distintos de chimpancé, sin manipular genéticamente a los animales. Como bien saben los expertos en la técnica, los enfoques en los que se adapta el animal de prueba al fármaco candidato siempre conllevan el riesgo de que los resultados obtenidos en las pruebas de seguridad preclínicas sean menos representativas y predictivas para seres humanos debido a la modificación del animal. Por ejemplo, en animales transgénicos, las proteínas codificadas por los transgenes están frecuentemente muy sobreexpresadas. Por tanto, los datos obtenidos para la actividad biológica de un anticuerpo contra el antígeno de esta proteína pueden tener un valor predictivo limitado para seres humanos, en los que la proteína se expresa a niveles mucho menores, más fisiológicos.
Una ventaja adicional de los usos de las moléculas de unión específicas de CD3 épsilon preferentemente humanas (o anticuerpos monocatenarios biespecíficos que las contienen) que presentan especificidad de especies cruzadas es el hecho de que se evitan los chimpancés, como especie en peligro de extinción, para las pruebas en animales. Los chimpancés son los parientes más cercanos a los seres humanos y se agruparon recientemente en la familia de los homínidos, basándose en los datos de secuenciación del genoma (Wildman et al., PNAS 100 (2003), 7181). Por lo tanto, los datos obtenidos con los chimpancés se consideran en general altamente predictivos para seres humanos. Sin embargo, debido a su condición de especie en peligro de extinción, el número de chimpancés que se pueden usar para experimentos médicos está altamente restringido. Por lo tanto, como se ha indicado anteriormente, el mantenimiento de chimpancés para realizar pruebas en animales es tanto costoso como éticamente problemático. Los usos de moléculas de unión específicas de CD3 épsilon preferentemente humanas de la invención (o anticuerpos monocatenarios biespecíficos que las contienen) evita tanto las objeciones éticas como la carga económica durante las pruebas preclínicas sin perjudicar a la calidad, es decir, la aplicabilidad, de los datos de las pruebas en animales obtenidos. En vista de esto, los usos de moléculas de unión específicas de CD3 épsilon preferentemente humanas (o anticuerpos monocatenarios biespecíficos que las contienen) proporciona una alternativa razonable a los estudios en chimpancés.
Una ventaja adicional las moléculas de unión específicas de CD3 épsilon preferentemente humanas de la invención (o anticuerpos monocatenarios biespecíficos que las contienen) es la capacidad de extraer varias muestras de sangre cuando se usa como parte de pruebas preclínicas en animales, por ejemplo, durante el curso de estudios farmacocinéticos en animales. Las extracciones de sangre múltiples se pueden obtener mucho más fácilmente con un primate distinto de chimpancé que con animales inferiores, p. ej., un ratón. La extracción de varias muestras de sangre permite probar parámetros sanguíneos de forma continua para la determinación de los efectos biológicos inducidos por la molécula de unión preferentemente humana de la invención (o anticuerpo monocatenario biespecífico). Además, la extracción de varias muestras de sangre permite al investigador evaluar el perfil farmacocinético de la molécula de unión preferentemente humana (o anticuerpo monocatenario biespecífico que la contiene) definida en el presente documento. Además, se pueden medir los efectos secundarios potenciales que puede inducir dicha molécula de unión preferentemente humana (o anticuerpo monocatenario biespecífico) reflejados en los parámetros sanguíneos en diferentes muestras de sangre extraídas durante el curso de la administración de dicho anticuerpo. Esto permite la determinación del perfil de toxicidad potencial de la molécula de unión preferentemente humana (o anticuerpo monocatenario biespecífico que la contiene) definida en el presente documento.
Las ventajas de las moléculas de unión preferentemente humanas (o anticuerpos monocatenarios biespecíficos) definidas en el presente documento que presentan especificidad de especies cruzadas pueden resumirse brevemente como sigue:
En primer lugar, las moléculas de unión preferentemente humanas (o anticuerpos monocatenarios biespecíficos) definidas en el presente documento usadas en pruebas preclínicas son las mismas que se usan en el tratamiento de seres humanos. Por tanto, ya no es necesario desarrollar dos moléculas independientes, que pueden diferir en sus propiedades farmacocinéticas y su actividad biológica. Esto es altamente ventajoso en que, p. ej., los resultados farmacocinéticos pueden transferirse y aplicarse más directamente al entorno humano que, p. ej., en enfoques de sustitutos convencionales.
En segundo lugar, los usos de las moléculas de unión preferentemente humanas (o anticuerpos monocatenarios biespecíficos) definidas en el presente documento para la preparación de tratamientos para seres humanos es menos costoso y laborioso que los enfoques de sustitutos.
En tercer lugar, las moléculas de unión preferentemente humanas (o anticuerpos monocatenarios biespecíficos) definidas en el presente documento pueden usarse para realizar pruebas preclínicas no sólo en una especie de primate, sino en una serie de especies de primates diferentes, limitando de este modo el riesgo de posibles diferencias de especie entre primates y seres humanos.
En cuarto lugar, se evita el chimpancé, como especie en peligro de extinción, para realizar pruebas en animales.
En quinto lugar, pueden extraerse varias muestras de sangre para estudios farmacocinéticos extensos.
En sexto lugar, debido al origen humano de las moléculas de unión preferentemente humanas de acuerdo con una realización preferente de la invención, se reduce al mínimo la generación de una reacción inmunitaria contra dichas moléculas de unión cuando se administra a pacientes humanos. Queda excluida la inducción de una respuesta inmunitaria con anticuerpos específicos frente a un fármaco candidato derivado de una especie no humana como, p. ej., un ratón que dé lugar al desarrollo de anticuerpos humanos anti-ratón (HAMA) contra moléculas terapéuticas de origen murino.
El término "proteína" se conoce bien en la técnica y describe compuestos biológicos. Las proteínas comprenden una
o más cadenas de aminoácidos (polipéptidos), donde los aminoácidos se enlazan entre sí a través de un enlace peptídico. El término "polipéptido" como se usa en el presente documento describe un grupo de moléculas que consisten en más de 30 aminoácidos. De acuerdo con la invención, el grupo de polipéptidos comprende "proteínas" siempre que las proteínas consistan en un único polipéptido. También en línea con la definición, el término "polipéptido" describe fragmentos de proteínas siempre que estos fragmentos consistan en más de 30 aminoácidos. Además, los polipéptidos pueden formar multímeros tales como dímeros, trímeros y oligómeros superiores, es decir, que consisten en más de una molécula de polipéptido. Las moléculas de polipéptido que forman tales dímeros, trímeros etc. pueden ser idénticas o no idénticas. Las estructuras de orden superior correspondientes de tales multímeros se denominan, en consecuencia, homo- o heterodímeros, homo- o heterotrímeros etc. Un ejemplo de un heteromultímero es una molécula de anticuerpo que, en su forma natural, consiste en dos cadenas polipeptídicas ligeras idénticas y dos cadenas polipeptídicas pesadas idénticas. Los términos "polipéptido" y "proteína" también se refieren a polipéptidos/proteínas modificados de forma natural en los que la modificación se efectúa, p. ej., por modificaciones postraduccionales como glucosilación, acetilación, fosforilación y similares. Las modificaciones de este tipo se conocen bien en la técnica.
Como se usa en el presente documento, "humano" y "ser humano" se refiere a la especie Homo sapiens. Por lo que respecta a los usos médicos de las construcciones descritas en el presente documento, debe tratarse a los pacientes humanos con la misma molécula.
El término "origen humano" como se usa en el contexto con las moléculas de la invención describe moléculas derivables de colecciones humanas o que tienen una estructura/secuencia correspondiente al equivalente humano. En consecuencia, se entiende que proteínas que tienen una secuencia de aminoácidos correspondiente a la secuencia humana análoga, p. ej., un fragmento de anticuerpo que tiene secuencias de aminoácidos estructural correspondiente a las secuencias humanas de línea germinal, son moléculas de origen humano.
Como se usa en el presente documento, un "primate distinto de chimpancé" o "primate no-chimp." o variantes gramaticales de los mismos, se refiere a cualquier primate distinto del chimpancé, es decir, distinto de un animal perteneciente al género Pan, e incluidas las especies Pan paniscus y Pan troglodytes, también conocidas como Anthropopithecus troglodytes o Simia satyrus. Un "primate", "especie de primate", "primates" o variantes gramaticales de los mismos, designa/n un orden de mamíferos euterios divididos en los dos subórdenes de prosimios y antropoides y que comprenden el ser humano, simios, monos y lemures. Específicamente, "primates" como se usa en el presente documento comprende el suborden Strepsirrhini (prosimios no tarseros), incluido el infraorden Lemuriformes (que incluye a su vez las superfamilias Cheirogoleidae y Lemuroidae), el infraorden Chiromyiformes (que incluye a su vez la familia Daubentoniidae) y el infraorden Lorisiformes (que incluye a su vez las familias Lorisidae y Galagidae). "Primates" como se usa en el presente documento comprende también el suborden Haplorrhini, incluido el infraorden Tarsiiformes (que incluye a su vez la familia Tarsiidae), el infraorden Simiiformes (que incluye a su vez los Platyrrhini o monos del Nuevo Mundo, y los Catarrhini, incluidos los Cercopithecidae o monos del Viejo Mundo).
Dentro del significado de la invención, se puede entender que las especies de primates distintas de chimpancé son un lemur, un tarsero, un gibón, un tití (perteneciente a los monos del Nuevo Mundo de la familia Cebidae) o un mono del Viejo Mundo (perteneciente a la superfamilia Cercopithecoidae).
Como se usa en el presente documento, un "mono del Viejo Mundo" comprende cualquier mono que entre dentro de la superfamilia Cercopithecoidae, que se subdivide a su vez en las familias: Cercopithecinae, que son principalmente africanos pero incluyen los diversas géneros de macacos que son asiáticos y norteafricanos; y Colobinae, que incluyen la mayoría de los géneros asiáticos, pero también los monos colobos africanos.
Específicamente, dentro de la subfamilia Cercopithecinae, un primate distinto de chimpancé ventajoso puede ser de la tribu Cercopithecini, dentro del género Allenopithecus (mono de Allen, Allenopithecus nigroviridis); dentro del género Miopithecus (talapoin angoleño, Miopithecus talapoin; talapoin de Gabón, Miopithecus ogouensis); dentro del género Erythrocebus (mono patas, Erythrocebus patas); dentro del género Chlorocebus (mono verde, Chlorocebus sabaceus; tota verde, Chlorocebus aethiops; mono verde de las montañas Bale, Chlorocebus djamdjamensis; mono tántalo, Chlorocebus tantalus; mono vervet, Chlorocebus pygerythrus; Malbrouck, Chlorocebus cynosuros); o dentro del género Cercopithecus (mono de Dryas o mono de Salongo, Cercopithecus dryas; mono diana, Cercopithecus diana; mono Roloway, Cercopithecus roloway, cercopiteco grande de nariz blanca, Cercopithecus nictitans; mono azul, Cercopithecus mitis; mono de plata, Cercopithecus doggetti; mono de oro, Cercopithecus kandti; mono de Sykes, Cercopithecus albogularis; cercopiteco mona, Cercopithecus mona; cercopiteco mona de Campbell, Cercopithecus campbelli; cercopiteco mona de Lowe, Cercopithecus lowei; cercopiteco mona coronado, Cercopithecus pogonias; cercopiteco mona de Wolf, Cercopithecus wolfi; cercopiteco mona de Dent, Cercopithecus denti; cercopiteco menor de nariz blanca, Cercopithecus petaurista; cercopiteco de garganta blanca, Cercopithecus erythrogaster, cercopiteco de Sclater, Cercopithecus sclateri; cercopiteco de orejas rojas, Cercopithecus erythrotis; mono de hocico azul, Cercopithecus cephus; cercopiteco de cola roja, Cercopithecus ascanius; cercopiteco de L'Hoest, Cercopithecus Ihoesti; cercopiteco de Preuss, Cercopithecus preussi; cercopiteco de Gabón, Cercopithecus solatus; cercopiteco de Hamlyn o cercopiteco de cara de búho, Cercopithecus hamlyni; cercopiteco de Brazza, Cercopithecus neglectus).
De forma alternativa, un primate distinto de chimpancé ventajoso, también dentro de la subfamilia Cercopithecinae pero dentro de la tribu Papionini, puede ser del género Macaca (macaco de Berbería, Macaca sylvanus; macaco de cola de león, Macaca silenus; macaco cola de cerdo sureño o Beruk, Macaca nemestrina; macaco cola de cerdo norteño, Macaca leonina; macaco de la isla Pagai o Bokkoi, Macaca pagensis; macaco de Siberut, Macaca siberu; macaco moro, Macaca maura; macaco calzado, Macaca ochreata; macaco de Togian, Macaca tonkeana; macaco de Heck, Macaca hecki; macaco de Gorontalo, Macaca nigriscens; macaco crestado de Célebes o "simio" negro, Macaca nigra; mono cynomolgus o macaco cangrejero o macaco de cola larga o Kera, Macaca fascicularis; macaco rabón o macaco oso, Macaca arctoides; macaco rhesus, Macaca mulatta; macaco de Formosa, Macaca cyclopis; macaco japonés, Macaca fuscata; macaco de cofia, Macaca sinica; macado coronado, Macaca radiata; macaco de Berbería, Macaca sylvanus; macaco de Assam, Macaca assamensis; macaco tibetano o macaco de Milne-Edwards, Macaca thibetana; macaco de Arunachal o munzala, Macaca munzala); dentro del género Lophocebus (mangabeye de mejillas grises, Lophocebus albigena; Lophocebus albigena albigena; Lophocebus albigena osmani; Lophocebus albigena johnstoni; mangabeye de cresta negra, Lophocebus aterrimus; mangabeye de Opdenbosch, Lophocebus opdenboschi; mangabeye de las tierras altas, Lophocebus kipunji); dentro del género Papio (papión sagrado, Papio hamadryas; papión de Guinea, Papio papio; papión oliva, Papio anubis; papión amarillo, Papio cynocephalus; papión chacma, Papio ursinus); dentro del género Theropithecus (Gelada, Theropithecus gelada); dentro del género Cercocebus (mangabeye gris, Cercocebus atys; Cercocebus atys atys; Cercocebus atys lunulatus; mangabeye de boina roja, Cercocebus torquatus; mangabeye ágil, Cercocebus agilis; mangabeye de vientre dorado, Cercocebus chrysogaster: mangabeye del río Tana, Cercocebus galeritus; mangabeye del río Sanje, Cercocebus sanjei); o dentro del género Mandrillus (mandril, Mandrillus sphinx; dril, Mandrillus leucophaeus).
El más preferente es el Macaca fascicularis (también conocido como mono cynomolgus y, por lo tanto, denominado en los ejemplos "cynomolgus") y el Macaca mulatta (mono rhesus, denominado "rhesus").
Dentro de la subfamilia Colobinae, un primate distinto de chimpancé ventajoso puede ser del grupo africano, dentro del género Colobus (colobo negro, Colobus satanas; colobo angoleño, Colobus angolensis; colobo rey, Colobus polykomos; colobo ursino, Colobus vellerosus; colobo oriental negro y blanco, Colobus guereza); dentro del género
Piliocolobus (colobo rojo occidental, Piliocolobus badius; Piliocolobus badius badius; Piliocolobus badius temminckii; Piliocolobus badius waldronae; colobo de Pennant, Piliocolobus pennantii; Piliocolobus pennantii pennantii; Piliocolobus pennantii epieni; Piliocolobus pennantii bouvieri; colobo rojo de Preuss, Piliocolobus preussi; colobo rojo de Thollon, Piliocolobus tholloni, colobo rojo centroafricano, Piliocolobus foai; Piliocolobus foai foai; Piliocolobus foai ellioti; Piliocolobus foai oustaleti; Piliocolobus foai semlikiensis; Piliocolobus foai parmentierorum; colobo rojo ugandés, Piliocolobus tephrosceles; colobo rojo de Uzyngwa, Piliocolobus gordonorum; colobo rojo de Zanzíbar, Piliocolobus kirkii; colobo rojo del río Tana, Piliocolobus rufomitratus); o dentro del género Procolobus (colobo oliva, Procolobus verus).
Dentro de la subfamilia Colobinae, un primate no chimpancé ventajoso puede ser, de forma alternativa, del grupo de los langures (mono de hoja), dentro del género Semnopithecus (langur gris de Nepal, Semnopithecus schistaceus; langur gris de Cachemira, Semnopithecus ajax; langur gris de Tarai, Semnopithecus hector; langur hanumán, Semnopithecus entellus; langur gris de pies negros, Semnopithecus hypoleucos; langur gris de las planicies del sur, Semnopithecus dussumieri; langur gris moñudo, Semnopithecus priam); dentro del grupo T. vetulus o el género Trachypithecus (langur de cara púrpura, Trachypithecus vetulus; langur de Nilgiri, Trachypithecus johnii); dentro del grupo T. cristatus del género Trachypithecus (langur javanés, Trachypithecus auratus; mono de hoja plateado o langur plateado, Trachypithecus cristatus; langur de Indochina, Trachypithecus germaini; langur de Tenasserim, Trachypithecus barbei); dentro del grupo T. obscurus del género Trachypithecus (langur oscuro o langur de anteojos, Trachypithecus obscurus; langur de Phayre, Trachypithecus phayrei); dentro del grupo T. pileatus del género Trachypithecus (langur de gorra, Trachypithecus pileatus; langur de Shortridge, Trachypithecus shortridgei; langur dorado de Gee, Trachypithecus geei); dentro del grupo T. francoisi del género Trachypithecus (langur de Francois, Trachypithecus francoisi; langur de Ha tinh, Trachypithecus hatinhensis; langur de cabeza blanca, Trachypithecus poliocephalus; langur laosiano, Trachypithecus laotum; langur de Delacour, Trachypithecus delacouri; langur negro de Indochina, Trachypithecus ebenus); o dentro del género Presbytis (surili de Sumatra, Presbytis melalophos; surili de bandas, Presbytis femoralis; surili de Sarawak, Presbytis chrysomelas; surili de muslos blancos, Presbytis siamensis; surili de frente blanca, Presbytis frontata; surili javanés, Presbytis comata; langur de Thomas, Presbytis thomasi; langur de Hose, Presbytis hosei; langur marrón, Presbytis rubicunda; langur de Mentawai o Joja, Presbytis potenziani; surili de la isla Natuna, Presbytis natunae).
Dentro de la subfamilia Colobinae, un primate distinto de chimpancé ventajoso puede ser, de forma alternativa, del grupo platirrino, dentro del género Pygathrix (duc de canillas rojas, Pygathrix nemaeus; duc de canillas negras, Pygathrix nigripes; duc de canillas grises, Pygathrix cinerea); dentro del género Rhinopithecus (langur chato dorado, Rhinopithecus roxellana; langur negro de nariz chata, Rhinopithecus bieti; langur gris de nariz chata, Rhinopithecus brelichi; langur de nariz chata de Tonkin, Rhinopithecus avunculus); dentro del género Nasalis (mono narigudo, Nasalis larvatus); o dentro del género Simias (langur cola de cerdo, Simias concolor).
Como se usa en el presente documento, el término "tití" designa cualquier mono del Nuevo Mundo del género Callithrix, por ejemplo, perteneciente a los titíes atlánticos del subgénero Callithrix (¡sic!) (tití común, Callithrix (Callithrix) jacchus; tití de pincel negro, Callithrix (Callithrix) penicillata; tití de orejas negras, Callithrix (Callithrix) kuhlii; tití de cabeza blanca, Callithrix (Callithrix) geoffroyi; tití de cabeza beige, Callithrix (Callithrix) flaviceps; tití de orejas blancas, Callithrix (Callithrix) aurita); pertenecientes a los titíes amazónicos del subgéneros Mico (tití del río Acarí, Callithrix (Mico) acariensis; tití de Manicoré, Callithrix (Mico) manicorensis; tití plateado, Callithrix (Mico) argentata; tití blanco, Callithrix (Mico) leucippe; tití de Snethlage, Callithrix (Mico) emiliae; tití de cabeza negra, Callithrix (Mico) nigriceps; tití de Marca, Callithrix (Mico)marcai; tití de cola negra, Callithrix (Mico) melanura; tití oreja de borla, Callithrix (Mico) humeralifera; tití de Maues, Callithrix (Mico) mauesi; tití dorado y blanco, Callithrix (Mico) chrysoleuca; tití de Aripuana, Callithrix (Mico) intermedia; tití de cara blanca, Callithrix (Mico) saterei; tití enano de Roosmalens perteneciente al subgénero Callibella (Callithrix (Callibella) humilis); o el tití pigmeo perteneciente al subgénero Cebuella (Callithrix (Cebuella) pygmaea).
Otros géneros de monos del Nuevo Mundo comprenden tamarinos del género Saguinus (que comprende el grupo S. oedipus, el grupo S. midas, el grupo S. nigricollis, el grupo S. mystax, el grupo S. bicolor y el grupo S. inustus) y monos ardilla del género Saimiri (p. ej. Saimiri sciureus, Saimiri oerstedii, Saimiri ustus, Saimiri boliviensis, Saimiri vanzolini).
En relación con la presente invención, el término "dominio de unión" caracteriza un dominio de un polipéptido que se une/interacciona específicamente con un antígeno/estructura/epítopo dado. Por tanto, el dominio de unión es un "sitio de interacción con antígeno". El término "sitio de interacción con antígeno" define, de acuerdo con la presente invención, un motivo de un polipéptido, que es capaz de interaccionar específicamente con un antígeno específico o un grupo de antígenos específico, p. ej., el mismo antígeno en diferentes especies. Se entiende que dicha unión/interacción también define un "reconocimiento específico". La expresión "que reconoce específicamente" significa, de acuerdo con la presente invención, que la molécula de anticuerpo es capaz de interaccionar específicamente con y/o unirse a al menos dos, preferentemente al menos tres, más preferentemente al menos cuatro, aminoácidos de un antígeno, p. ej., el antígeno de CD3 humana como se define en el presente documento. Tal unión se puede ejemplificar mediante la especificidad de un "principio de cerradura y llave". Por tanto, motivos específicos de la secuencia de aminoácidos del dominio de unión y el antígeno se unen entre sí como consecuencia de su estructura primaria, secundaria o terciaria, y también como consecuencia de las modificaciones secundarias de dicha estructura. La interacción específica del sitio de interacción con antígeno con su antígeno específico puede dar lugar también a una unión sencilla de dicho sitio al antígeno. Además, de forma alternativa, la interacción específica del sitio de interacción con antígeno con su antígeno específico puede dar lugar a la iniciación de una señal, p. ej., debido a la inducción de un cambio de la conformación del antígeno, una oligomerización del antígeno, etc. Un ejemplo preferente de un dominio de unión de acuerdo con la presente invención es un anticuerpo. El dominio de unión puede ser un anticuerpo monoclonal o policlonal o derivado de un anticuerpo monoclonal o policlonal.
El término "anticuerpo" comprende derivados o fragmentos funcionales del mismo que aún mantienen la especificidad de unión. En la técnica se conocen bien técnicas para la producción de anticuerpos y se describen, p. ej., en Harlow y Lane "Antibodies, A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988 y en Harlow y Lane "Using Antibodies: A Laboratory Manual" Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999. El término "anticuerpo" también comprende inmunoglobulinas (Ig) de diferentes clases (es decir, IgA, IgG, IgM, IgD e IgE) y subclases (tales como lgG1, lgG2, etc.). Estos anticuerpos se pueden usar, por ejemplo, para la inmunoprecipitación, la purificación por afinidad y la inmunolocalización de los polipéptidos o proteínas de fusión de la invención, así como para realizar un seguimiento de la presencia y la cantidad de dichos polipéptidos, por ejemplo, en cultivos de células u organismos procariotas o eucariotas recombinantes.
La definición del término "anticuerpo" también incluye realizaciones tales como anticuerpos quiméricos, monocatenarios y humanizados, así como fragmentos de anticuerpo como, entre otros, fragmentos Fab. Los fragmentos de anticuerpo o derivados comprenden además fragmentos F(ab')2, Fv, scFv o anticuerpos de dominio único, anticuerpos de dominio variable único o dominio variable único de inmunoglobulina que comprende sólo un dominio variable, que puede ser VH o VL, que se une específicamente a un antígeno o epítopo independientemente de otras regiones o dominios V; véase, por ejemplo, Harlow y Lane (1988) y (1999), loc. cit. Tal dominio variable único de inmunoglobulina comprende no sólo un polipéptido de dominio variable único de anticuerpo aislado, sino también polipéptidos más grandes que comprenden uno o más monómeros de una secuencia polipeptídica de dominio variable único de anticuerpo.
Se conocen en la técnica diversos procedimientos y pueden usarse para la producción de tales anticuerpos y/o fragmentos. Por tanto, pueden producirse los derivados (de anticuerpo) mediante peptidomiméticos. Además, pueden adaptarse técnicas descritas para la producción de anticuerpos monocatenarios (véase, entre otras, la patente de EE. UU. 4.946.778) para producir anticuerpos monocatenarios específicos para polipéptido(s) elegido(s). Asimismo, pueden usarse animales transgénicos para expresar anticuerpos humanizados específicos para polipéptidos y proteínas de fusión de la presente invención. Para la preparación de anticuerpos monoclonales, puede usarse cualquier técnica que proporcione anticuerpos producidos mediante cultivos de línea celular continua. Los ejemplos de técnicas de este tipo incluyen la técnica de hibridoma (Kohler y Milstein Nature 256 (1975), 495497), la técnica de trioma, la técnica de hibridoma de linfocitos B humanos (Kozbor, Immunology Today 4 (1983), 72) y la técnica de hibridoma-VEB para producir anticuerpos monoclonales humanos (Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc. (1985), 77-96). Puede usarse la resonancia de plasmón superficial como se emplea en el sistema BIAcore para aumentar la eficacia de anticuerpos en fagos que se unen a un epítopo de un polipéptido objetivo, tal como CD3 épsilon (Schier, Human Antibodies Hybridomas 7 (1996), 97105; Malmborg, J. Immunol. Methods 183 (1995), 7-13). También se contempla en el contexto de la presente invención que el término "anticuerpo" comprenda construcciones de anticuerpo, que pueden expresarse en un huésped como se describe en el presente documento más adelante, p. ej., construcciones de anticuerpo que se pueden transfectar y/o transducir a través de, entre otros, virus o vectores plasmídicos.
El término "interacción específica" como se usa de acuerdo con la presente invención significa que la molécula de unión (dominio) no presenta reactividad cruzada, o no es significativa, con polipéptidos que tienen estructura similar a la de los unidos por la molécula de unión, y que se podría expresar por las mismas células que el polipéptido de interés. Puede probarse la reactividad cruzada de un conjunto de moléculas de unión en investigación, por ejemplo, evaluando la unión de dicho conjunto de moléculas de unión en condiciones convencionales (véase, p. ej., Harlow y Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988 y Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999). Los ejemplos de la interacción de un dominio de unión con un antígeno específico comprenden la especificidad de un ligando por su receptor. Dicha definición comprende, en particular, la interacción de ligandos, que inducen una señal tras la unión a su receptor específico. Un ejemplo de dicha interacción, comprendida también en particular por dicha definición, es la interacción de un determinante antigénico (epítopo) con el dominio de unión (sitio de unión antigénico) de un anticuerpo.
El término "especificidad de especies cruzadas" o "especificidad interespecies" como se usa en el presente documento significa la unión de un dominio de unión descrito en el presente documento a la misma molécula objetivo en seres humanos y en primates distintos de chimpancé. Por tanto, debe entenderse "especificidad de especies cruzadas" o "especificidad interespecies" como una reactividad interespecies por la misma molécula X expresada en especies diferentes, pero no por una molécula distinta de X. La especificidad de especies cruzadas de un anticuerpo monoclonal que reconoce, p. ej., CD3 épsilon humana, por la CD3 épsilon de un primate distinto de chimpancé, p. ej., CD3 épsilon de macaco, se puede determinar, por ejemplo, mediante análisis de FACS. El análisis de FACS se lleva a cabo de manera que se prueba la unión del anticuerpo monoclonal correspondiente a células humanas y de primate distinto de chimpancé, p. ej., células de macaco, que expresan dichos antígenos de CD3 épsilon humana y de primate distinto de chimpancé, respectivamente. En los ejemplos siguientes se muestra un ensayo apropiado.
Como se usa en el presente documento, CD3 épsilon designa una molécula expresada como parte del receptor de linfocitos T y tiene el significado que se le atribuye normalmente en la técnica anterior. En seres humanos engloba de forma individual o combinada independientemente, todas las subunidades CD3 conocidas, por ejemplo CD3 épsilon, CD3 delta, CD3 gamma, CD3 zeta, CD3 alfa y CD3 beta. Los antígenos de CD3 de primate distinto de chimpancé a los que se hace referencia en el presente documento son, por ejemplo, CD3 de Macaca fascicularis y CD3 de Macaca mulatta. En Macaca fascicularis, engloba CD3 épsilon negativa para FN-18 y CD3 épsilon positiva para FN-18, CD3 gamma y CD3 delta. En Macaca mulatta, engloba CD3 épsilon, CD3 gamma y CD3 delta. Preferentemente, dicha CD3 como se usa en el presente documento es CD3 épsilon.
La CD3 épsilon humana se indica en el número de acceso de GenBank NM_000733 y comprende la SEQ ID NO: 1. La CD3 gamma humana se indica en el número de acceso de GenBank NM_000073. La CD3 delta humana se indica en el número de acceso de GenBank NM_000732.
La CD3 épsilon "negativa para FN-18" de Macaca fascicularis (es decir, CD3 épsilon no reconocida por el anticuerpo monoclonal FN-18 debido a un polimorfismo, como se expone anteriormente) se indica en el número de acceso de GenBank AB073994.
La CD3 épsilon "positiva para FN-18" de Macaca fascicularis (es decir, la CD3 épsilon reconocida por el anticuerpo monoclonal FN-18) se indica en el número de acceso de GenBank AB073993. La CD3 gamma de Macaca fascicularis se indica en el número de acceso de GenBank AB073992. La CD3 delta de Macaca fascicularis se indica en el número de acceso de GenBank AB073991.
Las secuencias de ácidos nucleicos y las secuencias de aminoácidos de los homólogos correspondientes de CD3 épsilon, gamma y delta de Macaca mulatta se pueden identificar y aislar mediante técnicas recombinantes descritas en la técnica (Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, 3ª edición 2001). Esto es aplicable, con los cambios oportunos, a los homólogos de CD3 épsilon, gamma y delta de otros primates distintos de chimpancé definidos en el presente documento. En los ejemplos adjuntos se describe la identificación de la secuencia de aminoácidos de Callithrix jacchus, Saimiri sciureus y Saguinus oedipus. La secuencia de aminoácidos del dominio extracelular de la CD3 épsilon de Callithrix jacchus se representa en la SEQ ID NO: 3, la de Saguinus oedipus se representa en la SEQ ID NO: 5 y la de Saimiri sciureus se representa en la SEQ ID NO: 7.
De acuerdo con lo anterior, el término "epítopo" define un determinante antigénico, al que se une/lo identifica específicamente una molécula de unión como se define anteriormente. El dominio o las moléculas de unión pueden unirse a/interaccionar específicamente con epítopos conformacionales o continuos, que son exclusivos para la estructura objetivo, p. ej., la cadena CD3 épsilon humana y de primate distinto de chimpancé. Un epítopo conformacional o discontinuo se caracteriza para antígenos polipeptídicos por la presencia de dos o más residuos de aminoácido distintos que están separados en la secuencia primaria, pero se juntan sobre la superficie de la molécula cuando el polipéptido se pliega en la proteína/antígeno nativo (Sela, (1969) Science 166, 1365 y Laver, (1990) Cell 61, 553-6). Los dos o más residuos de aminoácido distintos que constituyen el epítopo están presentes en secciones separadas de una o más cadena(s) polipeptídica(s). Estos residuos se juntan sobre la superficie de la molécula cuando la(s) cadena(s) polipeptídica(s) se pliegan(n) en una estructura tridimensional para constituir el epítopo. En contraste, un epítopo lineal o continuo consiste en dos o más residuos de aminoácido distintos, que están presentes en un único segmento lineal de una cadena polipeptídica. Dentro de la presente invención, un epítopo de CD3 "dependiente del contexto" se refiere a la conformación de dicho epítopo. Un epítopo dependiente del contexto de este tipo, situado en la cadena épsilon de CD3, sólo puede desarrollar su conformación correcta si se incluye en el resto de la cadena épsilon y se mantiene en la posición adecuada mediante heterodimerización de la cadena épsilon con la cadena CD3 gamma o delta. En contraste, un epítopo de CD3 independiente del contexto como se proporciona en el presente documento se refiere a un polipéptido N-terminal de 1-27 residuos de aminoácido o uno de sus fragmentos funcionales de CD3 épsilon. Este polipéptido N-terminal de 1-27 residuos de aminoácido o uno de sus fragmentos funcionales mantiene su integridad estructural tridimensional y la conformación correcta cuando se saca de su entorno nativo en el complejo CD3. La independencia del contexto del polipéptido Nterminal de 1-27 residuos de aminoácido o uno de sus fragmentos funcionales, que forma parte del dominio extracelular de CD3 épsilon representa, por tanto, un epítopo que es completamente diferente de los epítopos de CD3 épsilon descritos en relación con un procedimiento para la preparación de moléculas de unión humanas en el documento WO 2004/106380. Dicho procedimiento usaba CD3 épsilon recombinante expresada exclusivamente. La conformación de esta CD3 épsilon recombinante expresada exclusivamente difería de la adoptada en su forma natural, es decir, la forma en que la subunidad CD3-épsilon del complejo TCR/CD3 existe como parte de un complejo no covalente con la subunidad CD3-delta o la CD3-gamma del complejo TCR/CD3. Cuando se usa dicha proteína CD3-épsilon recombinante expresada exclusivamente como antígeno para la selección de anticuerpos a partir de una colección de anticuerpos, se identifican anticuerpos específicos para este antígeno a partir de la colección, aunque tal colección no contenga anticuerpos con especificidad por antígenos propios/autoantígenos. Esto se debe al hecho de que la proteína CD3-épsilon recombinante expresada exclusivamente no existe in vivo; no es un autoantígeno. En consecuencia, no se han eliminado las subpoblaciones de linfocitos B que expresan anticuerpos específicos para esta proteína in vivo; una colección de anticuerpos construida a partir de tales linfocitos B contendría material genético para anticuerpos específicos para la proteína CD3-épsilon recombinada expresada exclusivamente.
Sin embargo, dado que el polipéptido de N-terminal de 1-27 residuos de aminoácido independiente del contexto o uno de sus fragmentos funcionales es un epítopo, que se pliega en su forma nativa, no se pueden identificar dominios de unión de acuerdo con la presente invención mediante procedimientos basados en el enfoque descrito en el documento WO 04/106380. Por lo tanto, podría verificarse en pruebas que las moléculas de unión divulgadas en el documento WO 04/106380 no pueden unirse a los residuos de aminoácido 1-27 N-terminales de la cadena CD3 épsilon. Por tanto, las moléculas de unión anti-CD3 o las moléculas de anticuerpo anti-CD3 convencionales (p. ej., las divulgadas en el documento WO 99/54440) se unen a la cadena CD3 épsilon en una posición que se sitúa más cerca del extremo C-terminal que el polipéptido N-terminal de 1-27 residuos de aminoácido o uno de sus fragmentos funcionales proporcionados en el presente documento. Las moléculas de anticuerpo de la técnica anterior OKT3 y UCHT-1 también tienen una especificidad por la subunidad épsilon del complejo TCR/CD3 entre los residuos de aminoácido 35 y 85 y, en consecuencia, el epítopo de estos anticuerpos también se sitúa más cerca del extremo C-terminal. Además, el UCHT-1 se une a la cadena CD3 épsilon en una región entre los residuos de aminoácido de 43 a 77 (Tunnacliffe, Int. Immunol. 1 (1989), 546-50; Kjer-Nielsen, PNAS 101, (2004), 7675-7680; Salmeron, J. Immunol. 147 (1991), 3047-52). Por lo tanto, las moléculas anti-CD3 de la técnica anterior no se unen a y no se dirigen contra el epítopo de los residuos de aminoácido 1-27 N-terminales independiente de contexto definido en el presente documento (o uno de sus fragmentos funcionales).
Para generar un dominio de unión preferentemente humano comprendido en un polipéptido de la invención, p. ej., en un anticuerpo monocatenario biespecífico como se define en el presente documento, pueden usarse, p. ej., anticuerpos monoclonales que se unan a CD3 épsilon tanto humana como de primate distinto de chimpancé (p. ej., CD3 épsilon de macaco).
En una realización preferente del polipéptido de la invención, el primate distinto de chimpancé es un mono del Viejo Mundo. En una realización más preferente del polipéptido, el mono del Viejo Mundo es un mono del género Papio o del género macaco. Lo más preferentemente, el mono del género macaco es un macaco de Assam (Macaca assamensis), macaco de Berbería (Macaca sylvanus), macaco coronado (Macaca radiata), macaco calzado o calzado de Sulawesi (Macaca ochreata), macaco crestado de Célebes (Macaca nigra), macaco de Formosa (Macaca cyclopsis), macaco japonés o macaco de cara roja (Macaca fuscata), mono cynomolgus o macaco cangrejero o macaco de cola larga o macaco de Java (Macaca fascicularis), macaco de cola de león (Macaca silenus), macaco cola de cerdo (Macaca nemestrina), macaco rhesus (Macaca mulatta), macaco tibetano (Macaca thibetana), macaco de Togian (Macaca tonkeana), macaco de cofia (Macaca sinica), macaco rabón o macaco de cara roja o macaco oso (Macaca arctoides), o macaco moro (Macaca maurus). Lo más preferentemente, el mono del género Papio es papión sagrado, Papio hamadryas; papión de Guinea, Papio papio; papión oliva, Papio anubis; papión amarillo, Papio cynocephalus; papión chacma, Papio ursinus.
En una realización preferente de forma alternativa del polipéptido de la invención, el primate distinto de chimpancé es un mono del Nuevo Mundo. En una realización más preferente del polipéptido, el mono del Nuevo Mundo es un mono del género Callithrix (tití), del género Saguinus o del género Saimiri. Lo más preferentemente, el mono del género Callithrix es Callithrix jacchus, el mono del género Saguinus es Saguinus oedipus y el mono del género Saimiri es Saimiri sciureus.
Como se describe anteriormente en el presente documento, el polipéptido de la invención se une con el primer dominio de unión que es un anticuerpo a un epítopo de la cadena CD3ε (épsilon) humana y de primate distinto de chimpancé, en la que el epítopo forma parte de una secuencia de aminoácidos comprendida en el grupo que consiste en 27 residuos de aminoácido como se representa en las SEQ ID NO: 2, 4, 6 u 8 o un fragmento funcional de las mismas.
En línea con la presente invención, se prefiere para el polipéptido de la invención que dicho epítopo forme parte de una secuencia de aminoácidos que comprenda 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6 o 5 aminoácidos. Más preferentemente, en la que dicho epítopo comprende al menos la secuencia de aminoácidos Gln-Asp-Gly-Asn-Glu (Q-D-G-N-E-D).
Dentro de la presente invención, un "fragmento funcional de los residuos de aminoácido 1-27 N-terminales" significa que dicho fragmento funcional sigue siendo un epítopo independiente del contexto que mantiene su integridad estructural tridimensional cuando se saca de su entorno nativo en el complejo CD3 (y se fusiona con una secuencia de aminoácidos heteróloga tal como EpCAM o una porción Fc de inmunoglobulina, p. ej., como se muestra en el ejemplo 3.1). El mantenimiento de la estructura tridimensional dentro del fragmento polipeptídico N-terminal de 27 aminoácidos de CD3 épsilon o uno de sus fragmentos funcionales puede usarse para generar dominios de unión que se unen al fragmento polipeptídico de CD3 épsilon N-terminal in vitro y al complejo CD3 nativo (su subunidad CD3 épsilon) en linfocitos T in vivo con la misma afinidad de unión. Dentro de la presente invención, un fragmento funcional de los 1-27 residuos de aminoácido N-terminales significa que las moléculas de unión a CD3 proporcionadas en el presente documento todavía pueden unirse a tales fragmentos funcionales de manera independiente del contexto. El experto en la técnica conoce los procedimientos de mapeo de epítopos para determinar qué residuos de aminoácido de un epítopo reconocen tales moléculas de unión anti-CD3 (p. ej., barrido de alanina o análisis PepSpot).
En una realización preferente de la invención, el polipéptido de la invención comprende un (primer) dominio de unión como se define en la reivindicación 1 o 2 y un segundo dominio de unión capaz de unirse a un antígeno de superficie celular.
El término "antígeno de superficie celular" como se usa en el presente documento designa una molécula que se presenta en la superficie de una célula. En la mayoría de los casos, esta molécula estará situada en o sobre la membrana plasmática de la célula, de forma que al menos parte de esta molécula sigue siendo accesible desde fuera de la célula en forma terciaria. Un ejemplo no limitante de una molécula de superficie celular que está situada en la membrana plasmática es una proteína transmembranaria que comprende, en su conformación terciaria, regiones de hidrofilicidad e hidrofobicidad. En este caso, al menos una región hidrófoba permite que la molécula de superficie celular esté incluida o insertada en la membrana plasmática hidrófoba de la célula mientras que las regiones hidrófilas se extienden en ambos lados de la membrana plasmática en el citoplasma y el espacio extracelular, respectivamente. Ejemplos no limitantes de moléculas de superficie celular que están situadas sobre la membrana plasmática son proteínas que se han modificado en un residuo de cisteína para que porten un grupo palmitoílo, proteínas modificadas en un residuo de cisteína C-terminal para que porten un grupo farnesilo o proteínas que se han modificado en el extremo C-terminal para que porten un anclaje glucosil fosfatidil inositol ("GPI"). Estos grupos permiten la unión covalente de proteínas a la superficie externa de la membrana plasmática, donde permanecen accesibles para que las reconozcan moléculas extracelulares tales como anticuerpos. Los ejemplos de antígenos de superficie celular incluyen EGFR, EGFRvlll, MCSP, anhidrasa carbónica IX (CAIX), CD30, CD33, Her2/neu, IgE, CD44v6 y Muc-1. Adicionalmente, los ejemplos de antígenos de superficie celular correspondientes comprenden antígenos que son característicos de una enfermedad o dolencia específica, es decir, cáncer, enfermedades autoinmunitarias o enfermedades infecciosas, incluidas las infecciones víricas. En consecuencia, el término "antígenos de superficie celular" incluye explícitamente proteínas víricas tales como proteínas víricas no procesadas nativas expuestas sobre la superficie de células infectadas (descrito, entre otras, para proteínas de la envoltura del virus de la hepatitis B y C y el VIH-1).
Una función de defensa de los linfocitos T citotóxicos es la destrucción de células infectadas por virus, por lo tanto, la propiedad exclusiva de las moléculas de unión biespecíficas de la invención de activar y redirigir los linfocitos T citotóxicos independientemente de su especificidad autóctona tiene un gran impacto sobre el amplio campo de las infecciones víricas crónicas. Para la mayoría de estas infecciones, la única oportunidad de curación es la eliminación de células infectadas de forma persistente. Actualmente, se están desarrollando tratamientos de linfocitos T adoptivos contra infecciones crónicas por CMV y VEB (Rooney, CM., et al., Use of gene-modified virusspecific T lymphocytes to control Epstein-Barr-virus-related lymphoproliferation. Lancet, 1995. 345 (8941): pág. 9-13; Walter, E.A., et al., Reconstitution of cellular immunity against cytomegalovirus in recipients of allogeneic bone marrow by transfer of T-cell clones from the donor. N Engl J Med, 1995. 333 (16): pág. 1038-44).
La infección crónica por hepatitis B es claramente una de las indicaciones más interesantes y gratificantes. En todo el mundo hay entre 350 y 400 millones de personas infectadas con el VHB. El tratamiento actual de la hepatitis crónica por VHB se basa en interferón γ y análogos de nucleósidos o nucleótidos, un tratamiento de larga duración con considerables efectos secundarios tales como la inducción de reagudizaciones de la hepatitis, fiebre, mialgias, trombocitopenia y depresión. Aunque ahora existen más de 4 regímenes de tratamiento aprobados, rara vez se consigue eliminar el virus. Una inflamación persistente en la hepatitis B crónica conduce a la cirrosis hepática y al carcinoma hepatocelular en más del 25 % de los pacientes. Además, hasta el 40 % de los pacientes con hepatitis B crónica morirán por complicaciones graves, que suponen de 0,6 a 1,0 millones de muertes al año en todo el mundo.
El VHB, el prototipo de los hepadnavirus es un virus con envoltura cuyo genoma circular relajado (cr) se transcribe de forma inversa a un pregenoma de ARN. Después de la infección, se importa el ADN cr al núcleo del hepatocito donde se completa hasta obtener un ADN circular cerrado covalentemente (ADNccc) que contiene cuatro marcos de lectura solapados. Sirve como molde de transcripción para el ARN pregenómico y tres ARN subgenómicos. El pregenoma de ARN funciona como ARNm para la traducción de la proteína del núcleo y la polimerasa víricas. Las células infectadas producen de forma continua proteína de superficie del VHB (HBsAg) a partir de ADNccc incluso cuando se detiene la duplicación del VHB. El HBsAg consiste en las proteínas de superficie pequeñas (S) con muy pocas porciones de proteínas de superficie medianas y grandes (L). Tanto las VHB S como las L se dirigen a la membrana del retículo endoplásmico (RE), desde donde se transportan en vesículas de membrana a través de la cara trans del aparato de Golgi hasta la membrana plasmática (Gorelick, F.S. y C. Shugrue, Exiting the endoplasmic reticulum. Mol Cell Endocrinol, 2001. 177 (1-2): pág. 13-8). Las proteínas S y L se expresan permanentemente sobre la superficie de hepatocitos en los que se duplica el VHB como se mostró recientemente (Chu, CM. y Y.F. Liaw, Membrane staining for hepatitis B surface antigen on hepatocytes: a sensitive and specific marker of active viral replication in hepatitis B. J Clin Pathol, 1995. 48(5): pág. 470-3).
Prototipos de virus que exponen proteínas de la envoltura en la superficie celular son el virus de la hepatitis B (VHB), el virus de la hepatitis C (VHC) y el VIH-1, todos los cuales suponen una enorme carga de enfermedad en todo el mundo. Para la indicación del virus VIH-1, se ha mostrado recientemente que los linfocitos T modificados por un TCR quimérico con una construcción de anticuerpo Fv dirigida a la proteína de la envoltura gp120 pueden destruir células objetivo infectadas (Masiero, S., et al., T-cell engineering by a chimeric T-cell receptor with antibodytype specificity for the HIV-1 gp120. Gene Ther, 2005. 12 (4): pág. 299-310). De los hepadnavirus, el virus de la hepatitis B (VHB) expresa el complejo proteínico de la envoltura HBsAg, producido continuamente a partir de ADNccc episómico incluso cuando disminuye la duplicación del VHB.
La expresión como proteínas S y L de VHB intactas sobre la superficie celular las hace accesibles para anticuerpos que son la característica fundamental de la seroconversión cuando los pacientes se recuperan de la fase aguda de las infecciones y cambian de HBsAg en circulación a antiHBs. Si no se produce la seroconversión, hasta el 30 % de los hepatocitos continúan expresando la proteína S del VHB también después de un tratamiento antivírico altamente activo de larga duración. Por tanto, además de que los linfocitos T reconocen específicamente péptidos del VHB procesados intracelularmente y presentados por moléculas MHC en la superficie celular, son factibles otras formas de unión de linfocitos T dirigidas a proteínas de superficie intactas tales como antígenos S y L accesibles en la membrana celular externa. Usando fragmentos de anticuerpos monocatenarios que reconocen proteínas de la envoltura del virus de la hepatitis B pequeñas (S) y grandes (L), se han generado receptores de linfocitos T artificiales que permiten dirigir linfocitos T injertados a hepatocitos infectados y, tras el contacto con el antígeno, activar estos linfocitos T para secretar citocinas y destruir los hepatocitos infectados.
La limitación de este enfoque es, (i) que es necesario modificar los linfocitos T in vitro, (ii) los retrovirus usados para transferir los receptores de linfocitos T pueden provocar mutagénesis de inserción en los linfocitos T y (iii) que una vez que se han transferido los linfocitos T, no puede limitarse la respuesta citotóxica.
Para superar estas limitaciones, pueden generarse moléculas de anticuerpo monocatenario biespecífico que comprenden un primer dominio con una especificidad de unión por el antígeno de CD3 épsilon humana y de primate distinto de chimpancé (como se proporciona en el presente documento en el contexto de la presente invención) así como un segundo dominio con una especificidad de unión por proteínas de la envoltura del VHB o el VHC de hepatocitos infectados, y están dentro del alcance de la presente invención.
Dentro de la presente invención también se prefiere que el segundo dominio de unión se una al antígeno de superficie celular humano y/o de primate distinto de chimpancé.
Para la generación del segundo dominio de unión del polipéptido de la invención, p. ej., anticuerpos monocatenarios biespecíficos como se definen en el presente documento, pueden utilizarse anticuerpos monoclonales que se unen a ambos de los respectivos antígenos de superficie celular humanos y/o de primate distinto de chimpancé. Pueden derivarse dominios de unión apropiados para el polipéptido biespecífico definido en el presente documento, p. ej., a partir de anticuerpos monoclonales específicos de especies cruzadas mediante procedimientos recombinantes descritos en la técnica. Un anticuerpo monoclonal que se une a un antígeno de superficie celular humano y al homólogo de dicho antígeno de superficie celular en un primate distinto de chimpancé se puede probar mediante ensayos FACS como se expone anteriormente. Es evidente para los expertos en la técnica que también pueden generarse anticuerpos específicos de especies cruzadas mediante técnicas de hibridoma descritas en la literatura (Kohler y Milstein, Nature 256 (1975), 495-7). Por ejemplo, pueden inmunizarse ratones de forma alternativa con CD33 humana y de primate distinto de chimpancé. A partir de estos ratones, se aíslan células de hibridoma productoras de anticuerpos específicos de especies cruzadas por medio de tecnología de hibridoma y se analizan por FACS como se expone anteriormente. En los ejemplos siguientes se muestra la generación y el análisis de polipéptidos biespecíficos tales como anticuerpos monocatenarios biespecíficos que presentan especificidad de especies cruzadas como se describe en el presente documento. Las ventajas de los anticuerpos monocatenarios biespecíficos que presentan especificidad de especies cruzadas incluyen los puntos que se enumeran a continuación.
Se prefiere particularmente para el polipéptido de la invención que el primer dominio de unión capaz de unirse a un
epítopo de la cadena CD3ε humana y de primate distinto de chimpancé comprenda una región VL que comprenda
CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 seleccionadas de:
(a)
CDR-L1 como se representa en la SEQ ID NO: 27, CDR-L2 como se representa en la SEQ ID NO: 28 y CDR-L3 como se representa en la SEQ ID NO: 29;
(b)
CDR-L1 como se representa en la SEQ ID NO: 117, CDR-L2 como se representa en la SEQ ID NO: 118 y CDR-L3 como se representa en la SEQ ID NO: 119; y
(c)
CDR-L1 como se representa en la SEQ ID NO: 153, CDR-L2 como se representa en la SEQ ID NO: 154 y CDR-L3 como se representa en la SEQ ID NO: 155.
En la técnica se entiende que las regiones variables, es decir, la cadena ligera variable ("L" o "VL") y la cadena pesada variable ("H" o "VH"), proporcionan el dominio de unión de un anticuerpo. Estas regiones variables albergan las regiones determinantes de complementariedad. El término "región determinante de la complementariedad" (CDR) es bien conocido en la técnica para determinar la especificidad de antígeno de un anticuerpo. El término "CDR-L" o "CDR L" se refiere a CDR de la VL, mientras que el término "CDR-H" o "CDR H" se refiere a las CDR de la VH.
En una realización preferente de forma alternativa del polipéptido de la invención el primer dominio de unión capaz
de unirse a un epítopo de la cadena CD3ε humana y de primate distinto de chimpancé comprende una región VL
que comprende CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3 seleccionadas de entre:
(a)
CDR-H1 como se representa en la SEQ ID NO: 12, CDR-H2 como se representa en la SEQ ID NO: 13 y CDR-H3 como se representa en la SEQ ID NO: 14;
(b)
CDR-H1 como se representa en la SEQ ID NO: 30, CDR-H2 como se representa en la SEQ ID NO: 31 y CDR-H3 como se representa en la SEQ ID NO: 32;
(c)
CDR-H1 como se representa en la SEQ ID NO: 48, CDR-H2 como se representa en la SEQ ID NO: 49 y CDR-H3 como se representa en la SEQ ID NO: 50;
(d)
CDR-H1 como se representa en la SEQ ID NO: 66, CDR-H2 como se representa en la SEQ ID NO: 67 y CDR-H3 como se representa en la SEQ ID NO: 68;
(e)
CDR-H1 como se representa en la SEQ ID NO: 84, CDR-H2 como se representa en la SEQ ID NO: 85 y CDR-H3 como se representa en la SEQ ID NO: 86;
(f)
CDR-H1 como se representa en la SEQ ID NO: 102, CDR-H2 como se representa en la SEQ ID NO: 103 y CDR-H3 como se representa en la SEQ ID NO: 104;
(g)
CDR-H1 como se representa en la SEQ ID NO: 120, CDR-H2 como se representa en la SEQ ID NO: 121 y CDR-H3 como se representa en la SEQ ID NO: 122;
(h)
CDR-H1 como se representa en la SEQ ID NO: 138, CDR-H2 como se representa en la SEQ ID NO: 139 y CDR-H3 como se representa en la SEQ ID NO: 140;
(i)
CDR-H1 como se representa en la SEQ ID NO: 156, CDR-H2 como se representa en la SEQ ID NO: 157 y CDR-H3 como se representa en la SEQ ID NO: 158; y
(j)
CDR-H1 como se representa en la SEQ ID NO: 174, CDR-H2 como se representa en la SEQ ID NO: 175 y CDR-H3 como se representa en la SEQ ID NO: 176.
Se prefiere además que el primer dominio de unión capaz de unirse a un epítopo de la cadena CD3ε humana y de primate distinto de chimpancé comprenda una región VL seleccionada del grupo que consiste en una región VL como se representa en las SEQ ID NO: 35, 39, 125, 129, 161 o 165.
Se prefiere de forma alternativa que el primer dominio de unión capaz de unirse a un epítopo de la cadena CD3ε humana y de primate distinto de chimpancé comprenda una región VH seleccionada del grupo que consiste en una región VH como se representa en las SEQ ID NO: 15, 19, 33, 37, 51, 55, 69, 73, 87, 91, 105, 109, 123, 127, 141, 145, 159, 163, 177 o 181.
Más preferentemente, el polipéptido de la invención se caracteriza por el primer dominio de unión capaz de unirse a
un epítopo de la cadena CD3ε humana y de primate distinto de chimpancé, que comprende una región VL y una
región VH seleccionadas del grupo que consiste en:
(a)
una región VL como se representa en las SEQ ID NO: 17 o 21 y una región VH como se representa en las SEQ ID NO: 15 o 19;
(b)
una región VL como se representa en las SEQ ID NO: 35 o 39 y una región VH como se representa en las SEQ ID NO: 33 o 37;
(c)
una región VL como se representa en las SEQ ID NO: 53 o 57 y una región VH como se representa en las SEQ ID NO: 51 o 55;
(d)
una región VL como se representa en las SEQ ID NO: 71 o 75 y una región VH como se representa en las SEQ ID NO: 69 o 73;
(e)
una región VL como se representa en las SEQ ID NO: 89 o 93 y una región VH como se representa en las SEQ ID NO: 87 o 91;
(f)
una región VL como se representa en las SEQ ID NO: 107 o 111 y una región VH como se representa en las SEQ ID NO: 105 o 109;
(g)
una región VL como se representa en las SEQ ID NO: 125 o 129 y una región VH como se representa en las SEQ ID NO: 123 o 127;
(h)
una región VL como se representa en las SEQ ID NO: 143 o 147 y una región VH como se representa en las SEQ ID NO: 141 o 145;
(i)
una región VL como se representa en las SEQ ID NO: 161 o 165 y una región VH como se representa en las SEQ ID NO: 159 o 163; y
(j)
una región VL como se representa en las SEQ ID NO: 179 o 183 y una región VH como se representa en las SEQ ID NO: 177 o 181.
De acuerdo con una realización preferente del polipéptido de la invención, los pares de regiones VH y regiones VL están en formato de un anticuerpo monocatenario (scFv). Las regiones VH y VL se disponen en el orden VH-VL o VL-VH. Se prefiere que la región VH se sitúe en posición N-terminal con respecto a una secuencia enlazadora. La región VL se sitúa en posición C-terminal con respecto a la secuencia enlazadora.
Una realización preferente del polipéptido de la invención descrito anteriormente se caracteriza por el primer
dominio de unión capaz de unirse a un epítopo de la cadena CD3ε humana y de primate distinto de chimpancé que
comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 23, 25, 41, 43, 59, 61, 77, 79, 95, 97, 113, 115, 131, 133, 149, 151, 167, 169, 185 o 187.
La invención se refiere además a un polipéptido descrito anteriormente en el que el segundo dominio de unión se une a un antígeno de superficie celular que, preferentemente, es un antígeno tumoral.
El término "antígeno tumoral" como se usa en el presente documento puede entenderse como los antígenos que están presentes en las células tumorales. Estos antígenos pueden presentarse en la superficie celular con una porción extracelular, que a menudo se combina con una porción transmembranaria y citoplásmica de la molécula. A veces, estos antígenos pueden presentarse sólo por células tumorales y nunca por las normales. Los antígenos tumorales pueden expresarse exclusivamente en células tumorales o pueden representar una mutación específica de tumor en comparación con células normales. En este caso, se denominan antígenos específicos de tumor. Son más frecuentes los antígenos presentados por células tumorales y células normales, y se denominan antígenos asociados a tumores. Estos antígenos asociados a tumores pueden estar sobreexpresados en comparación con células normales o son accesibles para la unión del anticuerpo en células tumorales debido a la estructura menos compacta del tejido tumoral en comparación con el tejido normal. Ejemplos no limitantes de antígenos tumorales que se usan en el presente documento son EGFR (Liu, Br. J. Cancer 82/12 (2000), 1991-1999; Bonner, Semin. Radiat. Oncol. 12 (2002), 11-20; Kiyota, Oncology 63/1 (2002), 92-98; Kuan, Brain Tumor Pathol. 17/2 (2000), 7178), anhidrasa carbónica IX (MN/CA IX) (Uemura, Br. J. Cancer 81/4 (1999), 741-746; Longcaster, Cancer Res. 61/7 (2001), 6394-6399; Chia, J. Clin. Oncol. 19/16 (2001), 3660-3668; Beasley, Cancer Res. 61/13 (2001), 5262-5267), CD33 (Abutalib, Curr Pharm Biotechnol. 7 (2006), 343-69), MCSP (Campoli, Crit Rev Immunol. 24 (2004), 267-96) o IgE (Infuhr, Allergy 60 (2005), 977-85).
Se prefiere que el antígeno tumoral se seleccione de entre EGFR, EGFRvIII, MCSP, EpCAM, anhidrasa carbónica IX (CAIX), CD30, CD33, Her2/neu, CD44v6 y Muc-1.
El EGFR (también conocido como c-erb1 o HER1) pertenece a la familia erbB de receptores tirosina cinasa. Cuando se activa por la unión de un ligando de la familia de factores de crecimiento EGF, el EGFR homodimeriza o heterodimeriza con un segundo EGFR u otro miembro de la familia de receptores erbB, respectivamente, iniciando una cascada de señalización a través de proteínas cinasas activadas por mitógenos y otros factores de transcripción que da lugar a la proliferación, diferenciación y reparación (Olayioye, EMBO J. 19 (2000), 3159-67). El EGFR está sobreexpresado en muchos cánceres epiteliales, incluidos el cáncer colorrectal, de mama, de pulmón y de cabeza y cuello (Mendelsohn, J. Clin. Oncol. 21 (2003), 2787-99; Mendelsohn, J. Clin. Oncol. 20 (18, supl.)(2002), 1S-13S; Prewett, Clin. Cancer Res. 8 (2002), 994-1003). La sobreexpresión y/o la mutación del EGFR en células malignas da lugar a la activación constitutiva de la actividad cinasa, dando lugar a proliferación, angiogénesis, invasión, metástasis e inhibición de la apoptosis (Mendelsohn (2003, loc. cit.; Ciardiello, Clin. Cancer Res. 7 (2001), 2958-70; Perez-Soler, Oncologist 9 (2004), 58-67). Se ha mostrado la eficacia de anticuerpos monoclonales que se dirigen al dominio de unión a ligando extracelular o la cascada de señalización de tirosina cinasas intracelular del EGFR como objetivo antitumoral (Laskin, Cancer Treat. Review 30 (2004), 1-17). Por ejemplo, el cetuximab (Erbitux), un anticuerpo monoclonal humanizado frente al EGFR, que inhibe de forma competitiva el dominio extracelular del EGFR para inhibir la activación de ligando del receptor, fue aprobado por la Administración de Alimentos y Medicamentos de Estados Unidos (FDA, por sus siglas en inglés) en 2004 para el tratamiento de cáncer de colon metastásico en combinación con el inhibidor de topoisomerasa irinotecán.
El proteoglucano condroitín sulfato de superficie celular asociado al melanoma (MCSP), conocido también como antígeno de alto peso molecular asociado al melanoma (HMW-MAA) o proteoglucano asociado al melanoma, es un proteoglucano de superficie celular grande de más de 450 kDa que comprende un núcleo glucoproteínico de 250 kDa y cadenas de glucosaminoglucanos unidas a él (Pluschke, PNAS 93 (1996), 9710; Nishiyama, J. Cell Biol. 114 (1991), 359). La función exacta del MCSP se desconoce todavía. Puede que actúe como receptor de adhesión que media las interacciones celulares con la matriz extracelular (MEC) y probablemente está implicado en la angiogénesis, la invasión tisular y la diseminación celular (Burg, Cancer Res. 59 (1999), 2869; Ida, J. Biol. Chem. 276 (2001) 18786; Eisenmann, Nat. Cell Biol. 1 (1999), 507; Ida, Cancer Res. 55 (1995), 2177; Campoli (2004), loc. cit). El MCSP puede potenciar la unión del ligando mediante una integrina a4b1 y la activación del MCSP puede potenciar la diseminación celular mediada por integrinas por mecanismos dependientes de cdc42 y p130cas.El
MCSP se asocia a través del condroitín sulfato con la MT3-MMP, que puede degradar diversas proteínas de la MEC. Puede localizar específicamente la MT3-MMP en sitios de adhesión de la MEC. Por tanto, parece que ambas moléculas son necesarias para la invasión del colágeno de tipo I y la degradación de la gelatina de tipo I (Ida (2001), loc. cit.)El MCSP es un marcador principal del melanoma, donde se expresa en gran cantidad en la superficie de las células tumorales. Se expresa en la menos el 90 % de las lesiones de melanoma (Natali, J. Natl. Cancer Inst. 72 (1984), 13). Entre todos los antígenos asociados al melanoma, el MCSP presenta el menor grado de heterogeneidad (Natali, Cancer Res. 45 (1985), 2883). En contraste con los tumores primarios del melanoma que se extiendo de forma superficial (frecuencia: 60 %), el melanoma nodular (frecuencia: 20 %) y el melanoma maligno lentigo (frecuencia: 10 %), que suelen ser positivos para MCSP (Reza Ziai 1987 Cancer Res. 47:2474), los tumores primarios de melanoma lentiginoso acral (frecuencia: 5 %) son frecuentemente negativos para MCSP (Kageshita, Cancer Res. 51 (1991), 1726). Actualmente, existen 53.600 casos de melanoma de nuevo diagnóstico al año en EE. UU. (2002). En general, la incidencia del melanoma está aumentando.
En una realización preferente de la invención el polipéptido es una molécula de anticuerpo monocatenario biespecífico.
Los problemas descritos anteriormente en el presente documento con respecto al desarrollo de moléculas sustitutas para estudios preclínicos se agravan adicionalmente si el fármaco candidato es un anticuerpo biespecífico, p. ej., un anticuerpo monocatenario biespecífico. Un anticuerpo biespecífico de este tipo requiere que ambos antígenos reconocidos sean específicos de especies cruzadas con una especie animal dada para permitir que las pruebas en dicho animal sean seguras.
Como también se destaca anteriormente en el presente documento, la presente invención proporciona polipéptidos que comprenden un primer dominio de unión que es un anticuerpo capaz de unirse a un epítopo de la cadena CD3ε humana y de primate distinto de chimpancé y un segundo dominio de unión capaz de unirse a un antígeno de superficie celular, en el que el segundo dominio de unión preferentemente también se une a un antígeno de superficie celular humano y/o de primate distinto de chimpancé. La ventaja de las moléculas de anticuerpo monocatenario biespecífico como fármacos candidatos que cumplen los requisitos del polipéptido preferente de la invención es el uso de tales moléculas en pruebas preclínicas en animales, así como en estudios clínicos e incluso para el tratamiento de seres humanos. En una realización preferente de los anticuerpos monocatenarios biespecíficos específicos de especies cruzadas de la invención, el segundo dominio de unión capaz de unirse a un antígeno de superficie celular es de origen humano. En una molécula biespecífica específica de especies cruzadas de acuerdo con la invención el dominio de unión capaz de unirse a un epítopo de la cadena CD3 épsilon humana y de primate distinto de chimpancé está situado en el orden VH-VL o VH-VL en el extremo N-terminal o en el extremo C-terminal de la molécula biespecífica. En los ejemplos adjuntos se describen ejemplos de moléculas biespecíficas específicas de especies cruzadas de acuerdo con la invención en diferentes disposiciones de la cadena VH y VL en el primer y el segundo dominio de unión.
Como se usa en el presente documento, un "anticuerpo monocatenario biespecífico" designa a una sola cadena polipeptídica que comprende dos dominios de unión. Cada dominio de unión comprende una región variable de una cadena pesada de anticuerpo ("región VH"), en el que la región VH del primer dominio de unión se une específicamente a la molécula CD3ε, y la región VH del segundo dominio de unión se une específicamente a un antígeno de superficie celular, como se define con más detalle a continuación. Opcionalmente, los dos dominios de unión están enlazados entre sí por un espaciador polipeptídico corto. Un ejemplo no limitante de espaciador polipeptídico es Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (G-G-G-S) y repeticiones del mismo. Adicionalmente, cada dominio de unión puede comprender una región variable de una cadena ligera de anticuerpo ("región VL"), la región VH y la región VL dentro de cada uno de los dominios de unión primero y segundo que se enlazan entre sí a través de un enlazador polipeptídico, por ejemplo del tipo divulgado y reivindicado en el documento EP 623679 B1, pero en cualquier caso suficientemente largo para permitir que se apareen entre sí la región VH y la región VL del primer dominio de unión y la región VH y la región VL del segundo dominio de unión de forma que, juntos, son capaces de unirse específicamente a la primera y la segunda moléculas correspondientes.
De acuerdo con una realización preferente de la invención, una molécula de anticuerpo monocatenario biespecífico caracterizada anteriormente comprende un grupo de las siguientes secuencias como CDR H1, CDR H2, CDR H3, CDR L1, CDR L2 y CDR L3 en el segundo dominio de unión seleccionadas del grupo que consiste en:
SEQ ID NO 189-194, SEQ ID NO:201-206, SEQ ID NO:219-224, SEQ ID NO:237-242, SEQ ID NO:255-260, SEQ ID NO:273-279, SEQ ID NO:382-384 y 387-389, SEQ ID NO:400-402 y 405-407, SEQ ID NO:418-420 y 423-425, SEQ ID NO:436-438 y 441-443, SEQ ID NO:454-456 y 459-461, SEQ ID NO:472-474 y 477-479, SEQ ID NO:490-492 y 495-497, SEQ ID NO:508-510 y 513-515,
SEQ ID NO:530-532 y 1568 a 1570, SEQ ID NO:545-547 y 550-552, SEQ ID NO:559-561 y 564-566,
SEQ ID NO:577-579 y 582-584,
SEQ ID NO:615-617 y 620-622, SEQ ID NO:633-635, 638, 639 y 1571, SEQ ID NO:650-652 y 655-657, SEQ ID NO:668-670 y 673-675, SEQ ID NO:682-684 y 687-689, SEQ ID NO:696-698 y 701-703, SEQ ID NO:710-712 y 715717, SEQ ID NO:724-726 y 729-731, SEQ ID NO:738-740 y 743-745, SEQ ID NO:752-754 y 757-759, SEQ ID NO:766- 768 y 771-773, SEQ ID NO:780-782 y 785-787, SEQ ID NO:794-796 y 799-801, SEQ ID NO:808-810 y 813815, SEQ ID NO:822-824 y 827-829, SEQ ID NO:836-838 y 841-843, SEQ ID NO:850-852 y 855-857,
SEQ ID NO:866-868 y 871-873, SEQ ID NO:884-886 y 889-891, SEQ ID NO:902-904 y 907-909, SEQ ID NO:920922 y 925-927, SEQ ID NO:938-940 y 943-945, SEQ ID NO:956-958 y 961-963, SEQ ID NO:974-976 y 979-981 , SEQ ID NO:992-994 y 997-999, SEQ ID NO:1006- 1008 y 1011 -1013, SEQ ID NO:1020-1022 y 1025-1027, SEQ ID NO:1034-1036 y 1039-1041 , SEQ ID NO:1048-1050 y 1053-1055, SEQ ID NO:1062-1064 y 1067-1069, SEQ ID NO:1076-1078 y 1081-1083, SEQ ID NO:1090-1092 y 1095-1097,
SEQ ID NO:1114-1116 y 1119-1121, SEQ ID NO:1128-1130 y 1133-1135, SEQ ID NO:1141-1143 y 1146-1148, SEQ ID NO:1155-1157 y 1160-1162, SEQ ID NO:1169-1171 y 1174-1176, SEQ ID NO:1183-1185 y 1188-1190, SEQ ID NO:1197-1199 y 1202-1204, SEQ ID NO:1211-1225 1213 y 1216-1218, SEQ ID NO 1225-1227 y 1230-1232, SEQ ID NO:1239-1241 y 1244-1246, SEQ ID NO: 1253-1255 y 1258-1260, SEQ ID NO:1267-1269 y 1272-1274, SEQ ID NO:1281-1283 y 1286-1288, SEQ ID NO:1295-1297 y 1300-1302, SEQ ID NO:1309-1311 y 1314-1316, SEQ ID NO:1323-1325 y 1328-1330 SEQ ID NO:1343-1345 y 1348-1350, SEQ ID NO:1361-1363 y 1366-1368, SEQ ID NO:1375-1377 y 1380-1382, SEQ ID NO:1389-1391 y 1394-1396, SEQ ID NO:1403-1405 y 1408-1410, SEQ ID NO:1417-1419 y 1422-1424, SEQ ID NO:1431-1433 y 1436-1438, SEQ ID NO:1445-1447 y 1450-1452, SEQ ID NO:1459-1461 y 1464-1466, SEQ ID NO:1473-1475 y 1478-1480, SEQ ID NO:1486-1491, SEQ ID NO: 1492-1497,
SEQ ID NO:1505-1507 y 1510-1512, SEQ ID NO:1531-1533 y 1536-1538, SEQ ID NO: 1573-1575 y 1578-1580, SEQ ID NO: 1591-1593 y 1596-1598, SEQ ID NO:1605-1607 y 1610-1612, SEQ ID NO:1619-1621 y 1624-1626, SEQ ID NO: 1634-1636 y 1639-1641, SEQ ID NO:1652-1654 y SEQ ID NO:1657-1659 y SEQ ID NO: 1669-1674.
Una realización particularmente preferente de la invención se refiere a un polipéptido caracterizado anteriormente, en el que la molécula de anticuerpo monocatenario biespecífico comprende una secuencia seleccionada de:
(a)
una secuencia de aminoácidos como se representa en cualquiera de las SEQ ID NO:291, 293, 295, 297, 299, 301, 303, 305, 307, 309, 311, 313, 315, 317, 319, 321, 323, 325, 327, 329, 331, 333, 335, 337, 339, 341, 343, 345, 347, 393, 395, 397, 411, 413, 415, 429, 431, 433, 447, 449, 451, 465, 467, 469, 483, 485, 487, 501, 503, 505, 519, 521, 523, 1336, 1338, 1340, 538, 540, 542, 556, 570, 572, 574, 588, 590, 592, 626, 628, 630, 643, 645, 647, 661, 663, 665, 679, 693, 707, 721, 735, 749, 763, 777, 791, 805, 819, 833, 847, 861, 863, 877, 879, 881, 895, 897, 899, 913, 915, 917, 931, 933, 935, 949, 951, 953, 967, 969, 971, 985, 987, 989, 1003, 1017, 1031, 1045, 1059, 1073, 1087, 1101, 1125, 1138, 1152, 1166, 1180, 1194, 1208, 1222, 1236, 1250, 1264, 1278, 1292, 1306, 1320, 1334, 1354, 1356, 1358, 1372, 1386, 1400, 1414, 1428, 1442, 1456, 1470, 1484, 1500, 1502, 1518, 1520, 1522, 1524, 1526, 1528, 1544, 1546, 1548, 1550, 1552, 1554, 1556, 1558, 1560, 1562, 1564, 1566, 1586, 1588, 1602, 1616, 1630, 1647, 1649 o 1663; y
(b)
una secuencia de aminoácidos codificada por un ácido nucleico como se representa en cualquiera de las SEQ ID NO:292, 294, 296, 298, 300, 302, 304, 306, 308, 310, 312, 314, 316, 318, 320, 322, 324, 326, 328, 330, 332, 334, 336, 338, 340, 342, 344, 346, 348, 394, 396, 398, 412, 414, 416, 430, 432, 434, 448, 450, 452, 466, 468, 470, 484, 486, 488, 502, 504, 506, 520, 522, 524, 1337, 1339, 1341, 539, 541, 543, 557, 571, 573, 575, 589, 591, 593, 627, 629, 631, 644, 646, 648, 662, 664, 666, 680, 694, 708, 722, 736, 750, 764, 778, 792, 806, 820, 834, 848, 862, 864, 878, 880, 882, 896, 898, 900, 914, 916, 918, 932, 934, 936, 950, 952, 954, 968, 970, 972, 986, 988, 990, 1004, 1018, 1032, 1046, 1060, 1074, 1088, 1102, 1126, 1139, 1153, 1167, 1181, 1195, 1209, 1223, 1237, 1251, 1265, 1279, 1293, 1307, 1321, 1335, 1355, 1357, 1359, 1373, 1387, 1401, 1415, 1429, 1443, 1457, 1471, 1485, 1501, 1503, 1519, 1521, 1523, 1525, 1527, 1529, 1545, 1547, 1549, 1551, 1553, 1555, 1557, 1559, 1561, 1563, 1565, 1567, 1587, 1589, 1603, 1617, 1631, 1648, 1650 o 1664.
En una realización preferente de la invención, los anticuerpos monocatenarios biespecíficos son específicos de especies cruzadas para CD3 épsilon y para el antígeno de superficie celular reconocido por su segundo dominio de unión. En una realización más preferente, estos anticuerpos monocatenarios biespecíficos son específicos de especies cruzadas para CD3 épsilon humana y de primate distinto de chimpancé y para MCSP, EGFR, EGFRvIII, anhidrasa carbónica IX, CD30, CD33, IgE, CD44v6, Muc-1, VHB y VHC humanos y de primate distinto de chimpancé. En una realización alternativa, la presente invención proporciona una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un polipéptido de la invención descrito anteriormente.
La presente invención también se refiere a un vector que comprende la molécula de ácido nucleico de la presente invención.
Los expertos en biología molecular conocen muchos vectores adecuados, cuya elección dependerá de la función deseada e incluyen plásmidos, cósmidos, virus, bacteriófagos y otros vectores usados convencionalmente en ingeniería genética. Pueden usarse procedimientos bien conocidos por los expertos en la técnica para construir diversos plásmidos y vectores; véanse, por ejemplo, las técnicas descritas en Sambrook et al. (loc cit.) y Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates y Wiley Interscience, N.Y. (1989), (1994). De forma alternativa, pueden reconstituirse los polinucleótidos y vectores de la invención en liposomas para su administración a las células objetivo. Como se analiza con más detalle a continuación, se usó un vector de clonación para aislar secuencias individuales de ADN. Pueden transferirse secuencias pertinentes en vectores de expresión cuando sea necesaria la expresión de un polipéptido en particular. Los vectores de clonación típicos incluyen pBluescript SK, pGEM, pUC9, pBR322 y pGBT9. Los vectores de expresión típicos incluyen pTRE, pCAL-n-EK, pESP-1, pOP13CAT.
Preferentemente, dicho vector comprende una secuencia de ácidos nucleicos que es una secuencia reguladora enlazada de forma funcional a dicha secuencia de ácidos nucleicos definida en el presente documento.
El término "secuencia reguladora" se refiere a secuencias de ADN que son necesarias para llevar a cabo la expresión de secuencias codificantes a las que están ligadas. La naturaleza de tales secuencias de control varía en función del organismo huésped. En procariotas, las secuencias de control suelen incluir un promotor, un sitio de unión del ribosoma y terminadores. En eucariotas las secuencias de control generalmente incluyen promotores, terminadores y, en algunos casos, potenciadores, transactivadores o factores de transcripción. Se pretende que el término "secuencia de control" incluya, como mínimo, todos los componentes cuya presencia es necesaria para la expresión, y también puede incluir componentes ventajosos adicionales.
El término "enlazado de forma funcional" se refiere a una yuxtaposición en la que los componentes descritos se encuentran en una relación que les permite funcionar de la manera pretendida. Una secuencia de control "enlazada de forma funcional" a una secuencia codificante está ligada de tal forma que se logra la expresión de la secuencia codificante en condiciones compatibles con las secuencias de control. En el caso de que la secuencia de control sea un promotor, resulta evidente para un experto que, preferentemente, se usa un ácido nucleico bicatenario.
Por tanto, el mencionado vector es, preferentemente, un vector de expresión. Un "vector de expresión" es una construcción que puede usarse para transformar un huésped seleccionado y permite la expresión de una secuencia codificante en el huésped seleccionado. Los vectores de expresión pueden ser, por ejemplo, vectores de clonación, vectores binarios o vectores de integración. La expresión comprende la transcripción de la molécula de ácido nucleico, preferentemente en un ARNm traducible. Los expertos en la técnica conocen bien elementos reguladores que garantizan la expresión en células procariotas y/o eucariotas. En el caso de las células eucariotas, normalmente comprenden promotores que garantizan la iniciación de la transcripción y, opcionalmente, señales de poli-A que garantizan la terminación de la transcripción y la estabilización del transcrito. Los posibles elementos reguladores que permiten la expresión en células huésped procariotas comprenden, p. ej., el promotor PL, lac, trp o tac promotor de E. coli, y son ejemplos de elementos reguladores que permiten la expresión en células huésped eucariotas los promotores AOX1 o GAL1 de levaduras o el promotor del CMV, del SV40 o del VSR (virus del sarcoma de Rous), el potenciador de CMV, el potenciador de SV40 o un intrón de la globina de células de mamífero y otras células animales.
Además de los elementos que son responsables de la iniciación de la transcripción, tales elementos reguladores también pueden comprender señales de terminación de la transcripción, tales como el sito SV40-poli-A o el sitio tkpoli-A, corriente abajo del polinucleótido. Además, en función del sistema de expresión usado, pueden añadirse a la secuencia codificante de la mencionada secuencia de ácido nucleicos secuencias líder capaces de dirigir el polipéptido a un compartimiento celular o secretarlo al medio y se conocen bien en la técnica; véanse también los ejemplos adjuntos. La(s) secuencia(s) líder se ensambla(n) en una fase apropiada con secuencias de iniciación y terminación de la traducción y, preferentemente, una secuencia líder capaz de dirigir la secreción de la proteína traducida, o una parte de la misma, al espacio periplásmico o al medio extracelular. Opcionalmente, la secuencia heteróloga puede codificar una proteína de fusión que incluye un péptido de identificación N-terminal que confiere características deseadas, p. ej., estabilización o purificación simplificada del producto recombinante expresado; véase anteriormente En este contexto, se conocen en la técnica vectores de expresión adecuados tales como el vector de expresión de ADNc pcDV1 de Okayama-Berg (Pharmacia), pCDM8, pRc/CMV, pcDNAI, pcDNA3 (Invitrogen), pEF-DHFR, pEF-ADA o pEF-neo (Mack et al. PNAS (1995) 92, 7021-7025 y Raum et al. Cancer Immunol Immunother (2001) 50(3), 141-150) o pSPORTI (GIBCO BRL).
Preferentemente, las secuencias de control de la expresión serán sistemas promotores eucariotas en vectores capaces de transformar o transfectar células huésped eucariotas, pero también pueden usarse secuencias de control para huéspedes procariotas. Una vez que se ha incorporado el vector en el huésped apropiado, el huésped se mantiene en condiciones adecuadas para la expresión de altos niveles de las secuencias de nucleótidos y si se desea, a continuación se puede recoger y purificar el polipéptido de la invención; véanse, p. ej., los ejemplos adjuntos.
Una sistema de expresión alternativo que se puede usar para expresar una proteína que interacciona con el ciclo celular es un sistema de insecto. En un sistema de este tipo se usa el virus de la poliedrosis nuclear de Autographa californica (AcNPV) como vector para expresar genes exógenos en células de Spodoptera frugiperda o en larvas de Trichoplusia. Se puede clonar la secuencia codificante de una de las molécula de ácido nucleico mencionadas en una región no esencial del virus, tal como el gen de la poliedrina, y colocarla bajo el control del promotor de la poliedrina. La inserción exitosa de dicha secuencia de codificación hará que se inactive el gen de la poliedrina y se producirán virus recombinantes que carecen de recubrimiento de proteína de recubrimiento. Los virus recombinantes se usan después para infectar células de S. frugiperda o larvas de Trichoplusia en las que se expresa la proteína de la invención (Smith, J. Virol. 46 (1983), 584; Engelhard, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 91 (1994), 3224-3227).
Los elementos reguladores adicionales pueden incluir potenciadores transcripcionales, así como traduccionales. De forma ventajosa, los vectores de la invención descritos anteriormente comprenden un marcador que se puede seleccionar y/o valorar.
Los genes marcadores seleccionables útiles para la selección de células transformadas y, p. ej., tejido vegetal y plantas, son bien conocidos por los expertos en la técnica y comprenden, por ejemplo, la resistencia antimetabolito como la base de selección para dhfr, que confiere resistencia al metotrexato (Reiss, Plant Physiol. (Life Sci. Adv.) 13 (1994), 143-149); npt, que confiere resistencia a los aminoglucósidos neomicina, kanamicina y paromicina (Herrera-Estrella, EMBO J. 2 (1983), 987-995) e hygro, que confiere resistencia a la higromicina (Marsh, Gene 32 (1984), 481-485). Se han descrito genes seleccionables adicionales, a saber, trpB, que permite que las células utilicen indol en lugar de triptófano; hisD, que permite que las células utilicen histinol en lugar de histidina (Hartman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988), 8047); manosa-6-fosfato isomerasa que permite que las células utilicen manosa (en el documento WO 94/20627) y ODC (ornitina descarboxilasa) que confiere resistencia al inhibidor de la ornitina descarboxilasa, 2-(difluorometil)-DL-ornitina, DFMO (McConlogue, 1987, en: Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory ed.) o la desaminasa de Aspergillus terreus, que confiere resistencia a la blasticidina S (Tamura, Biosci. Biotechnol. Biochem. 59 (1995), 2336-2338).
Los expertos en la técnica también conocen marcadores útiles que se pueden valorar y están comercialmente disponibles. De forma ventajosa, dicho marcador es un gen que codifica la luciferasa (Giacomin, PI. Sci. 116 (1996), 59-72; Scikantha, J. Bact. 178 (1996), 121), la proteína verde fluorescente (Gerdes, FEBS Lett. 389 (1996), 44-47) o la β-glucuronidasa (Jefferson, EMBO J. 6 (1987), 3901-3907). Esta realización es particularmente útil para el rastreo rápido y sencillo de células, tejidos y organismos que contienen uno de los vectores mencionados.
Como se describe anteriormente, la molécula de ácido nucleico mencionada se puede usar sola o como parte de un vector para expresar el polipéptido de la invención en células, p. ej., para purificación, pero también con fines de tratamiento génico. Las moléculas de ácido nucleico o los vectores que contienen la(s) secuencia(s) de ADN que codifican cualquiera de los polipéptidos de la invención descritos anteriormente se introducen en las células, que a su vez producen el polipéptido de interés. El tratamiento génico, que se basa en la introducción de genes terapéuticos en células mediante técnicas ex vivo o in vivo es una de las aplicaciones más importantes de la transferencia génica. En la literatura se describen vectores, procedimientos o sistemas de administración de genes adecuados para tratamiento génico in vitro o in vivo y son conocidos por los expertos en la técnica; véanse, p. ej., Giordano, Nature Medicine 2 (1996), 534-539; Schaper, Circ. Res. 79 (1996), 911-919; Anderson, Science 256 (1992), 808-813; Verma, Nature 389 (1994), 239; Isner, Lancet 348 (1996), 370-374; Muhlhauser, Circ. Res. 77 (1995), 1077-1086; Onodera, Blood 91 (1998), 30-36; Verma, Gene Ther. 5 (1998), 692-699; Nabel, Ann. N.Y. Acad. Sci. 811 (1997), 289-292; Verzeletti, Hum. Gene Ther. 9 (1998), 2243-51; Wang, Nature Medicine 2 (1996), 714-716; los documentos WO 94/29469, WO 97/00957, US 5.580.859, US 5,589,466; o Schaper, Current Opinion in Biotechnology 7 (1996), 635-640. Las moléculas de ácido nucleico y los vectores mencionados se pueden diseñar para su introducción directa o para su introducción por medio de liposomas o vectores víricos (p. ej., adenovíricos, retrovíricos) en la célula. Preferentemente, dicha célula es una célula de línea germinal, una célula embrionaria o un óvulo o una derivada de las mismas, lo más preferentemente dicha célula es una célula madre. Un ejemplo de célula madre embrionaria puede ser, entre otras, una célula madre como se describe en Nagy, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993), 8424-8428.
La invención también proporciona una célula huésped transformada o transfectada con un vector de la invención. Dicha célula huésped se puede producir introduciendo en la célula huésped el vector de la invención descrito anteriormente o la molécula de ácido nucleico de la invención descrita anteriormente. La presencia de al menos un vector o al menos una molécula de ácido nucleico en la célula huésped puede mediar la expresión de un gen que codifica las construcciones de anticuerpo monocatenario descritas anteriormente.
La molécula de ácido nucleico o el vector de la invención descritos anteriormente, que se introducen en la célula huésped, pueden integrarse en el genoma de la célula huésped o pueden mantenerse fuera de los cromosomas.
La célula huésped puede ser cualquier célula procariota o eucariota.
Se pretende que el término "procariota" incluya todas las bacterias que se pueden transformar o transfectar con moléculas de ADN o ARN para la expresión de una proteína de la invención. Las células huésped procariotas pueden incluir bacterias gramnegativas, así como bacterias grampositivas, tales como, por ejemplo, E. coli, S. typhimurium, Serratia marcescens y Bacillus subtilis. Se pretende que el término "eucariota" incluya células de levaduras, plantas superiores, insectos y, preferentemente, de mamíferos. En función de la célula huésped empleada en un procedimiento de producción recombinante, la proteína codificada por el polinucleótido de la presente invención puede ser glucosilada o puede ser no glucosilada. Se prefiere especialmente el uso de un plásmido o un virus que contenga la secuencia codificante del polipéptido de la invención y, genéticamente fusionado a ella, una marca FLAG N-terminal y/o una marca His C-terminal. Preferentemente, la longitud de dicha marca FLAG es de aproximadamente 4 a 8 aminoácidos, lo más preferentemente de 8 aminoácidos. Puede usarse un polinucleótido descrito anteriormente para transformar o transfectar la célula huésped usando cualquiera de las técnicas comúnmente conocidas por los expertos en la técnica. Además, se conocen bien en la técnica procedimientos para preparar genes enlazados de forma funcional fusionados y expresarlos, p. ej., en células de mamífero y bacterias (Sambrook, loc cit.).
Preferentemente, la célula huésped es una bacteria o una célula de insecto, fúngica, vegetal o animal.
En particular, se contempla que la célula huésped mencionada pueda ser una célula de mamífero. La células huésped particularmente preferentes comprenden células CHO, células COS, líneas celulares de mieloma como SP2/0 o NS/0. Como se ilustra en los ejemplos adjuntos, se prefieren particularmente las células CHO como huéspedes.
Más preferentemente, dicha célula huésped es una célula humana o línea celular humana, p. ej., per.c6 (Kroos, Biotechnol. Prog., 2003, 19:163-168).
En una realización adicional, la presente invención se refiere por tanto a un procedimiento para la producción de un polipéptido de la invención, comprendiendo dicho procedimiento cultivar una célula huésped de la invención en condiciones que permitan la expresión del polipéptido de la invención y recuperar el polipéptido producido del cultivo.
Las células huésped transformadas pueden hacerse crecer en fermentadores y cultivarse de acuerdo con técnicas conocidas en la técnica para lograr un crecimiento celular óptimo. El polipéptido de la invención se puede aislar después a partir del medio de cultivo, lisados celulares o fracciones de membrana celular. El aislamiento y la purificación de los polipéptidos expresados, p. ej., en microbios, se pueden realizar por cualquier medio convencional tal como, por ejemplo, separaciones cromatográficas preparativas y separaciones inmunológicas tales como las que implican el uso de anticuerpos monoclonales o policlonales dirigidos, p. ej., contra una marca del polipéptido de la invención o como se describe en los ejemplos adjuntos.
En la técnica se sabe que las condiciones para el cultivo de una célula huésped que permiten la expresión dependen del sistema huésped y del sistema/vector de expresión usado en tal procedimiento. Los parámetros que han de modificarse para lograr condiciones que permitan la expresión de un polipéptido recombinante se conocen en la técnica. Por tanto, el experto en la técnica puede determinar las condiciones adecuadas en ausencia de contribuciones adicionales de la invención.
Una vez expresado, puede purificarse el polipéptido de la invención de acuerdo con procedimientos estándar de la técnica, incluidos precipitación con sulfato de amonio, columnas de afinidad, cromatografía en columna, electroforesis en gel y similares; véase, Scopes, "Protein Purification", Springer-Verlag, N.Y. (1982). Para usos farmacéuticos se prefieren polipéptidos sustancialmente puros con una homogeneidad de al menos aproximadamente el 90 al 95 %, y los más preferentes son con una homogeneidad del 98 al 99 % o más. Una vez purificado, parcialmente o hasta la homogeneidad deseada, el polipéptido de la invención pueden usarse después terapéuticamente (incluyendo extracorpóreamente) o en el desarrollo y la realización de procedimientos de ensayo. Además, en los ejemplos adjuntos se describen con detalle ejemplos de procedimientos para la recuperación del polipéptido de la invención de un cultivo.
Además, la invención proporciona una composición que comprende un polipéptido de la invención o un polipéptido producido mediante el procedimiento divulgado anteriormente. Preferentemente, dicha composición es una composición farmacéutica.
De acuerdo con la invención, el término "composición farmacéutica" se refiere a una composición para su administración a un paciente, preferentemente un paciente humano. La composición farmacéutica particularmente preferente de esta invención comprende moléculas de unión dirigidas contra y generadas contra epítopos de CD3 independientes del contexto. Preferentemente, la composición farmacéutica comprende formulaciones adecuadas de vehículos, estabilizantes y/o excipientes. En una realización preferente, la composición farmacéutica comprende una composición para administración parenteral, transdérmica, intraluminal, intraarterial, intratecal y/o intranasal o mediante inyección directa en el tejido. Se contempla en particular que dicha composición se administre a un paciente a través de infusión o inyección. La administración de las composiciones adecuadas puede efectuarse de diferentes maneras, p. ej., mediante administración intravenosa, intraperitoneal, subcutánea, intramuscular, tópica o intradérmica. En particular, la presente invención proporciona la composición adecuada para una administración ininterrumpida. Como ejemplo no limitante, la administración ininterrumpida, es decir, continua, se puede realizar mediante un sistema de bomba pequeño que lleva el paciente para medir el flujo de entrada de agente terapéutico en el organismo del paciente. La composición farmacéutica que comprende las moléculas de unión dirigidas contra y generadas contra epítopos de CD3 independientes del contexto de la invención se puede administrar mediante el uso de dichos sistemas de bomba. En la técnica se conocen de forma general tales sistemas de bomba y comúnmente se basan en el intercambio periódico de cartuchos que contienen el agente terapéutico que se va a infundir. Al intercambiar el cartucho en un sistema de bomba de este tipo, puede producirse una interrupción temporal del flujo de otro modo ininterrumpido del agente terapéutico en el organismo del paciente. En tal caso, la fase de administración anterior al reemplazo del cartucho y la fase de administración posterior al reemplazo del cartucho seguirían incluyéndose en el significado de los medios y procedimientos farmacéuticos de la invención, que constituyen conjuntamente una "administración ininterrumpida" de tal agente terapéutico.
La administración continua o ininterrumpida de estas moléculas de unión dirigidas contra y generadas contra epítopos de CD3 independientes del contexto de la presente invención puede ser intravenosa o subcutánea por medio de un dispositivo de administración de líquidos o un sistema de bomba pequeño que incluya un mecanismo de dirección para dirigir los líquidos hacia fuera de un depósito y un mecanismo de control para controlar el mecanismo de dirección. Los sistemas de bomba para administración subcutánea pueden incluir una aguja o una cánula para atravesar la piel de un paciente y administrar la composición adecuada al organismo del paciente. Dichos sistemas de bomba pueden fijarse o unirse directamente a la piel del paciente independientemente de una vena, arteria o vaso sanguíneo, permitiendo de este modo un contacto directo entre el sistema de bomba y la piel del paciente. El sistema de bomba puede estar unido a la piel del paciente durante de 24 horas hasta varios días. El sistema de bomba puede ser de tamaño pequeño con un depósito para volúmenes pequeños. Como ejemplo no limitante, el volumen del depósito para la composición farmacéutica adecuada que se va a administrar puede ser de entre 0,1 y 50 ml.
La administración continua puede ser transdérmica por medio de un parche que se coloca sobre la piel y se reemplaza a intervalos. Un experto en la técnica conoce sistemas de parche para administración de fármacos adecuados para este propósito. Cabe destacar que la administración transdérmica es especialmente adecuada para la administración ininterrumpida, ya que el intercambio de un primer parche agotado se puede llevar a cabo de forma ventajosa simultáneamente con la colocación de un segundo parche nuevo, por ejemplo, en la superficie de la piel inmediatamente adyacente al primer parche agotado e inmediatamente antes de la retirada del primer parche agotado. No surgen problemas de interrupción del flujo o de insuficiencia del suministro celular.
La composición de la presente invención, que comprende, en particular, moléculas de unión dirigidas contra y generadas contra epítopos de CD3 independientes del contexto, puede comprender además un vehículo farmacéuticamente aceptable. Los ejemplos de vehículos farmacéuticos adecuados son bien conocidos en la técnica e incluyen soluciones, p. ej., soluciones salinas tamponadas con fosfato, agua, emulsiones, tales como emulsiones de aceite/agua, diversos tipos de agentes humectantes, soluciones estériles, liposomas, etc. Pueden formularse composiciones que comprenden tales vehículos por procedimientos convencionales bien conocidos. Las formulaciones pueden comprender hidratos de carbono, soluciones tampón, aminoácidos y/o tensioactivos. Los hidratos de carbono pueden ser azúcares no reductores, preferentemente trehalosa, sacarosa, octasulfato, sorbitol o xilitol. Tales formulaciones se pueden usar para administraciones continuas que pueden ser intravenosas o subcutáneas con y/o sin sistemas de bomba. Los aminoácidos pueden ser aminoácidos cargados, preferentemente lisina, acetato de lisina, arginina, glutamato y/o histidina. Los tensioactivos pueden ser detergentes, preferentemente con un peso molecular de >1,2 KD y/o un poliéter, preferentemente con un peso molecular de >3 KD. Son ejemplos no limitantes de detergentes preferentes Tween 20, Tween 40, Tween 60, Tween 80 o Tween 85. Son ejemplos no limitantes de poliéteres preferentes PEG 3000, PEG 3350, PEG 4000 o PEG 5000. Los sistemas de tampón usados en la presente invención pueden tener un pH preferente de 5-9 y pueden comprender citrato, succinato, fosfato, histidina y acetato. Las composiciones de la presente invención se pueden administrar al sujeto a una dosis adecuada que se puede determinar, p. ej., mediante estudios de dosis crecientes mediante la administración de dosis crecientes del polipéptido de la invención que muestra especificidad de especies cruzadas descrito en el presente documento a primates distintos de chimpancé, por ejemplo, macacos. Como se expone anteriormente, el polipéptido de la invención que muestra especificidad de especies cruzadas descrito en el presente documento se puede usar ventajosamente en la misma forma en pruebas preclínicas en primates distintos de chimpancé y como fármaco en seres humanos. Estas composiciones también se pueden administrar en combinación con otros fármacos proteináceos y no proteináceos. Estos fármacos se pueden administrar simultáneamente con la composición que comprende el polipéptido de la invención definido en el presente documento o por separado antes
o después de la administración de dicho polipéptido en dosis e intervalos definidos oportunamente. El régimen de dosificación será determinado por el médico encargado y los factores clínicos. Como se conoce bien en la técnica médica, las dosificaciones para cualquier paciente dependen de muchos factores, incluidos la talla del paciente, el área de superficie corporal, la edad, el compuesto concreto que se ha de administrar, el sexo, el tiempo y la vía de administración, la salud general y otros fármacos que se estén administrando simultáneamente. Las preparaciones para administración parenteral incluyen emulsiones, suspensiones y soluciones estériles acuosas o no acuosas. Ejemplos de disolventes no acuosos son propilenglicol, polietilenglicol, aceites vegetales tales como aceite de oliva, y ésteres orgánicos inyectables, tales como oleato de etilo. Los vehículos acuosos incluyen agua, soluciones alcohólicas/acuosas, emulsiones o suspensiones, incluidos medios salinos y tamponados. Los vehículos parenterales incluyen solución de cloruro de sodio, dextrosa de Ringer, dextrosa y cloruro de sodio, Ringer con lactato o aceites fijos. Los vehículos intravenosos incluyen regeneradores de fluidos y nutrientes, regeneradores de electrolitos (tales como los basados en la dextrosa de Ringer) y similares. También pueden estar presentes conservantes y otros aditivos tales como, por ejemplo, antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes, gases inertes y similares. Además, la composición de la presente invención puede comprender vehículos proteináceos, como, p. ej., seroalbúmina o inmunoglobulina, preferentemente de origen humano. Se contempla que la composición de la invención puede comprender, además del polipéptido de la invención definido en el presente documento, agentes biológicamente activos adicionales, en función del uso previsto de la composición. Tales agentes pueden ser fármacos que actúan en el aparato gastrointestinal, fármacos que actúan como citostáticos, fármacos que evita la hiperuricemia, fármacos que inhiben inmunorreacciones (p. ej., corticoesteroides), fármacos que modulan la respuesta inflamatoria, fármacos que actúan sobre el sistema circulatorio y/o agentes tales como citocinas conocidos en la técnica.
La actividad biológica de la composición farmacéutica definida en el presente documento se puede determinar, por ejemplo, mediante ensayos de citotoxicidad, como se describe en los siguientes ejemplos, en el documento WO 99/54440 o por Schlereth et al. (Cancer Immunol. Immunother. 20 (2005), 1 - 12). "Eficacia" o "eficacia in vivo" como se usa en el presente documento se refiere a la respuesta al tratamiento por la composición farmacéutica de la invención, usando, p. ej., criterios de respuesta normalizados del NCI. El éxito o la eficacia in vivo del tratamiento usando una composición farmacéutica de la invención se refiere a la eficacia de la composición para su propósito deseado, es decir, la capacidad de la composición para provocar su efecto deseado, es decir, la eliminación de células patológicas, p. ej., células tumorales. La eficacia in vivo puede monitorizarse mediante procedimientos estándar establecidos para las entidades patológicas correspondientes que incluyen, entre otros, recuentos de leucocitos, diferenciales, separación de células activadas por fluorescencia, aspirado de médula ósea. Además, pueden usarse diversos parámetros de bioquímica clínica específicos de diversas enfermedades y otros procedimientos estándar establecidos. Además, se pueden usar tomografía asistida por ordenador, rayos X, tomografía de resonancia magnética nuclear (p. ej., para la evaluación de la respuesta basada en los criterios del National Cancer Institute [Cheson BD, Horning SJ, Coiffier B, Shipp MA, Fisher Rl, Connors JM, Lister TA, Vose J, Grillo-Lopez A, Hagenbeek A, Cabanillas F, Klippensten D, Hiddemann W, Castellino R, Harris NL, Armitage JO, Carter W, Hoppe R, Canellos GP. Informe de un seminario internacional de normalización de los criterios de respuesta para linfomas no hodgkinianos. Grupo de trabajo internacional patrocinado por el NCI. J Clin Oncol. 1999 abr; 17(4): 1244]), escáner de tomografía de emisión de positrones, recuentos de leucocitos, diferenciales, separación de células activadas por fluorescencia, aspirado de médula ósea, biopsias/histologías de ganglio linfático y diversos parámetros de bioquímica clínica específicos del linfoma (p. ej., lactato deshidrogenasa) y otros procedimientos estándar establecidos.
Otro gran reto en el desarrollo de fármacos tales como la composición farmacéutica de la invención es la modulación predecible de las propiedades farmacocinéticas. Con este fin, se establece un perfil farmacocinético del fármaco candidato, es decir, un perfil de los parámetros farmacocinéticos que afectan a la capacidad de un fármaco concreto para tratar una afección dada. Los parámetros farmacocinéticos del fármaco que influyen sobre la capacidad de un fármaco para tratar una entidad patológica en particular incluyen, entre otros: la semivida, el volumen de distribución, el metabolismo hepático de primer paso y el grado de unión a suero sanguíneo. La eficacia de un agente farmacológico dado puede estar influenciada por cada uno de los parámetros mencionados anteriormente.
"Semivida" significa el tiempo en el que el 50 % de un fármaco administrado se elimina a través de procesos biológicos, p. ej., metabolismo, excreción, etc.
Con "metabolismo hepático de primer paso" quiere decirse la propensión de un fármaco a ser metabolizado tras el primer contacto con el hígado, es decir, durante su primer paso a través del hígado.
"Volumen de distribución" significa el grado de retención de un fármaco a lo largo de los diversos compartimentos del organismo como, p. ej., espacios intracelulares y extracelulares, tejidos y órganos, etc. y la distribución del fármaco dentro de estos compartimentos.
"Grado de unión a suero sanguíneo" significa la propensión de un fármaco a interaccionar con y unirse a proteínas del suero sanguíneo, tales como albúmina, dando lugar a una disminución o pérdida de la actividad biológica del fármaco.
Los parámetros farmacocinéticos también incluyen biodisponibilidad, tiempo de demora (Tlag), Tmáx, velocidades de absorción, más aparición y/o Cmáx para una cantidad dada de fármaco administrada.
"Biodisponibilidad" significa la cantidad de un fármaco en el compartimento sanguíneo.
"Tiempo de demora" significa el lapso de tiempo entre la administración del fármaco y su detección y posibilidad de medirlo en la sangre o el plasma.
"Tmáx" es el tiempo después del cual se alcanza la concentración sanguínea máxima del fármaco y "Cmáx" es la concentración sanguínea máxima que puede obtenerse con un fármaco dado. El tiempo para alcanzar una concentración sanguínea o tisular del fármaco necesaria para su efecto biológico está influenciado por todos los parámetros. Los parámetros farmacocinéticos de anticuerpos monocatenarios biespecíficos, una realización preferente del polipéptido de la invención, que presentan especificidad de especies cruzadas, que se pueden determinar en pruebas preclínicas en animales en primates distintos de chimpancé, como se resume anteriormente, se exponen también, p. ej., en la publicación por Schlereth et al. (Cancer Immunol. Immunother. 20 (2005), 1-12).
El término "toxicidad" como se usa en el presente documento se refiere a los efectos tóxicos de un fármaco manifestados en acontecimientos adversos o acontecimientos adversos graves. Estos acontecimientos adversos se pueden referir a una falta de tolerabilidad del fármaco en general y/o a una falta de tolerancia local después de la administración. La toxicidad también podría incluir efectos teratogénicos o carcinogénicos provocados por el fármaco.
El término "seguridad", "seguridad in vivo" o "tolerabilidad" como se usa en el presente documento define la administración de un fármaco sin inducir acontecimientos adversos graves directamente después de la administración (tolerancia local) y durante un periodo de tiempo más largo de aplicación del fármaco. La "seguridad", la "seguridad in vivo" o la "tolerabilidad" se pueden evaluar, p. ej., a intervalos regulares durante el tratamiento y el periodo de seguimiento. La medidas incluyen evaluación clínica, p. ej., manifestaciones orgánicas, y rastreo de anomalías analíticas. Se puede llevar a cabo la evaluación clínica y registrar/codificar las desviaciones de los resultados normales de acuerdo con los estándares del NCI-CTC y/o el MedDRA. Las manifestaciones orgánicas pueden incluir criterios tales como alergia/inmunología, sangre/médula ósea, arritmia cardíaca, coagulación y similares, como se expone, p. ej., en la versión 3.0 de los criterios terminológicos comunes para acontecimientos adversos (CTCAE, por sus siglas en inglés). Los parámetros analíticos que se pueden probar, incluyen, por ejemplo, hematología, bioquímica clínica, perfil de coagulación y análisis de orina y examen de otros líquidos corporales, tales como suero, plasma, líquido linfático o cefalorraquídeo, líquidos y similares. Así, puede evaluarse la seguridad, p. ej., mediante exploración física, técnicas de formación de imágenes (es decir, ultrasonidos, rayos x, escáneres de TC, formación de imágenes de resonancia magnética (RMN), otras medidas con dispositivos técnicos (es decir, electrocardiograma), constantes vitales, midiendo parámetros analíticos y registrando acontecimientos adversos. Por ejemplo, los acontecimientos adversos en primates distintos de chimpancé en los usos y procedimientos de acuerdo con la invención se pueden examinar mediante procedimientos histopatológicos y/o histoquímicos.
El término "dosis eficaz y no tóxica" como se usa en el presente documento se refiere a un dosis tolerable del anticuerpo monocatenario biespecífico definido en el presente documento que es lo suficientemente alta como para provocar la eliminación de células patológicas, la eliminación del tumor, la reducción del tumor o la estabilización de la enfermedad sin o esencialmente sin grandes efectos tóxicos. Tales dosis eficaces y no tóxicas se pueden determinar. p. ej., mediante estudios de dosis crecientes descritos en la técnica y deberían estar por debajo de la dosis que induce acontecimientos secundarios graves (toxicidad limitante de la dosis, TLD).
También se hace referencia a los términos anteriores, p. ej., en la evaluación preclínica de la seguridad de agentes farmacéuticos de origen biotecnológico S6; Directrices Tripartitas Armonizadas del ICH; reunión del ICH Steering Committee del 16 de julio de 1997.
Además, la invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende un polipéptido de la presente invención (es decir, un polipéptido que comprende al menos un dominio de unión que es un anticuerpo capaz de unirse a un epítopo de la cadena CD3 épsilon humana y de primate distinto de chimpancé, en la que el epítopo forma parte de una secuencia de aminoácidos comprendida en el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 2, 4, 6 u 8 de acuerdo con la presente invención o producida de acuerdo con el procedimiento de acuerdo con la invención) para evitar, tratar o mejorar una enfermedad seleccionada de entre una enfermedad proliferativa, una enfermedad tumoral o un trastorno inmunológico. Preferentemente, dicha composición farmacéutica comprende además formulaciones adecuadas de vehículos, estabilizantes y/o excipientes.
Un aspecto adicional de la invención se refiere a un uso de un polipéptido definido anteriormente en el presente documento o producido de acuerdo con un procedimiento definido anteriormente en el presente documento, para la preparación de una composición farmacéutica para evitar, tratar o mejorar una enfermedad. Preferentemente, dicha enfermedad es una enfermedad proliferativa, una enfermedad tumoral o un trastorno inmunológico. Se prefiere además que dicha enfermedad tumoral sea una enfermedad maligna, preferentemente cáncer.
En otra realización preferente del uso del polipéptido de la invención dicha composición farmacéutica es adecuada para su administración en combinación con un fármaco adicional, es decir, como parte de un cotratamiento. En dicho cotratamiento, se puede incluir opcionalmente un agente activo en la misma composición farmacéutica que el polipéptido de la invención o se puede incluir en una composición farmacéutica diferente. En este último caso, dicha composición farmacéutica diferente es adecuada para su administración antes de, simultáneamente o después de la administración de dicha composición farmacéutica que comprende el polipéptido de la invención. El fármaco o la composición farmacéutica adicional puede ser un compuesto no proteináceo o un compuesto proteináceo. En el caso de que el fármaco adicional sea un compuesto proteináceo, es ventajoso que el compuesto proteináceo sea capaz de proporcionar una señal de activación para células efectoras inmunitarias.
Preferentemente, dicho compuesto proteináceo o compuesto no proteináceo se puede administrar simultáneamente
o no simultáneamente con el polipéptido de la invención, una molécula de ácido nucleico definida anteriormente en el presente documento, un vector definido anteriormente en el presente documento o un huésped definido anteriormente en el presente documento.
Otro aspecto de la invención se refiere a una composición farmacéutica de la invención para su uso en un procedimiento para el tratamiento o la mejora de una enfermedad en un sujeto que lo necesita. Preferentemente, dicha enfermedad es una enfermedad proliferativa, una enfermedad tumoral o un trastorno inmunológico. Aún más preferente, dicha enfermedad tumoral es una enfermedad maligna, preferentemente cáncer.
En otra realización preferente dicha composición farmacéutica es adecuada para su administración en combinación con un fármaco adicional, es decir, como parte de un cotratamiento. En dicho cotratamiento, se puede incluir opcionalmente un agente activo en la misma composición farmacéutica que el polipéptido de la invención o se puede incluir en una composición farmacéutica diferente. En este último caso, dicha composición farmacéutica diferente es adecuada para su administración antes de, simultáneamente o después de la administración de dicha composición farmacéutica que comprende el polipéptido de la invención. El fármaco o la composición farmacéutica adicional puede ser un compuesto no proteináceo o un compuesto proteináceo. En el caso de que el fármaco adicional sea un compuesto proteináceo, es ventajoso que el compuesto proteináceo sea capaz de proporcionar una señal de activación para células efectoras inmunitarias.
Preferentemente, dicho compuesto proteináceo o compuesto no proteináceo se puede administrar simultáneamente
o no simultáneamente con el polipéptido de la invención, una molécula de ácido nucleico definida anteriormente en el presente documento, un vector definido anteriormente en el presente documento o un huésped definido anteriormente en el presente documento.
Para el procedimiento de la invención descrito anteriormente se prefiere que dicho sujeto sea un ser humano.
En un aspecto adicional, la invención se refiere a un kit que comprende un polipéptido de la invención, una molécula de ácido nucleico de la invención, un vector de la invención o un huésped de la invención.
La presente divulgación proporciona además la siguiente lista de puntos:
Punto 1. Un procedimiento para la identificación de (un) polipéptido(s) que comprende un dominio de unión
específico de especies cruzadas capaz de unirse a un epítopo de la cadena CD3 épsilon (CD3ε) humana y de
primate distinto de chimpancé, comprendiendo el procedimiento las etapas de:
(a)
poner en contacto el/los polipéptido(s) con un fragmento N-terminal del dominio extracelular de CD3ε de 27 aminoácidos como máximo que comprende la secuencia de aminoácidos Gln-Asp-Gly-Asn-Glu-Glu-Met-Gly (SEQ ID NO: 381) o Gln-Asp-Gly-Asn-Glu-Glu-lle-Gly (SEQ ID NO: 382), fijado a través de su extremo C-terminal a una fase sólida;
(b)
eluir el/los polipéptido(s) unido(s) de dicho fragmento; y
(c)
aislar el/los polipéptido(s) a partir del eluato de (b).
Se prefiere que el/los polipéptido(s) identificados mediante el procedimiento de la invención anterior sean de origen humano.
El presente "procedimiento para la identificación de (un) polipéptido(s)" se entiende como un procedimiento para el aislamiento de uno o más polipéptidos diferentes con la misma especificidad por el fragmento del dominio extracelular de CD3ε que comprende en su extremo N-terminal la secuencia de aminoácidos Gln-Asp-Gly-Asn-Glu-Glu-Met-Gly (SEQ ID NO: 381) o Gln-Asp-Gly-Asn-Glu-Glu-lle-Gly (SEQ ID NO: 382) a partir de una pluralidad de polipéptidos candidatos así como un procedimiento para la purificación de un polipéptido a partir de una solución. Las realizaciones no limitantes de un procedimiento del aislamiento de uno o más polipéptidos diferentes con la misma especificidad por el fragmento del dominio extracelular de CD3ε comprenden procedimientos para la selección de entidades de unión específicas de antígeno, p. ej., procedimientos de fijación como los usados comúnmente para el rastreo de hibridomas, el rastreo de clones transfectados de forma transitoria/estable de células huésped eucariotas o en procedimientos de presentación en fagos. Un ejemplo no limitante del último procedimiento para la purificación de un polipéptido a partir de una solución es, p. ej., la purificación de un polipéptido expresado de forma recombinante a partir de un sobrenadante de cultivo o una preparación a partir de dicho cultivo.
Como se ha indicado anteriormente el fragmento usado en este procedimiento es un fragmento N-terminal del
dominio extracelular de la molécula CD3ε de primate. La secuencia de aminoácidos del dominio extracelular de la moléculas CD3ε de diferentes primates se representa en las SEQ ID NO: 1, 3, 5 y 7. Las dos formas del octámero
N-terminal se representan en las SEQ ID NO: 381 y 382. Se prefiere que este extremo N-terminal esté libremente disponible para la unión de los polipéptidos que se quieren identificar mediante el procedimiento de la invención. El término "libremente disponible" se entiende en el contexto de la invención como sin motivos adicionales tales como una marca His. La interferencia de una marca His de este tipo con una molécula de unión identificada mediante el procedimiento de la invención se describe en los ejemplos 6 y 34 adjuntos.
De acuerdo con el procedimiento mencionado anteriormente dicho fragmento se fija a través de su extremo Cterminal a una fase sólida. El experto en la técnica elegirá fácilmente y sin más actividad inventiva un soporte en fase sólida adecuado en función de la realización del procedimiento de la invención usada. Los ejemplos de soporte sólido comprenden, entre otros, matrices como perlas (p. ej., perlas de agarosa, perlas de sefarosa, perlas de poliestirol, perlas de dextrano), placas (placas de cultivo o placas multipocillo) así como chips conocidos, p.ej., de Biacore®. La selección de los medios y procedimientos para la fijación/inmovilización del fragmento a dicho soporte sólido dependen de la elección del soporte sólido. Un procedimiento usado comúnmente para la fijación/inmovilización es un acoplamiento a través de un éster de N-hidroxisuccinimida (NHS). El experto en la técnica conoce la química subyacente a este acoplamiento, así como procedimientos alternativos para la fijación/inmovilización, p. ej., de Hermanson "Bioconjugate Techniques", Academic Press, Inc. (1996). Para la fijación a/inmovilización sobre soportes cromatográficos se usan comúnmente los siguientes medios: sefarosa activada con NHS (p. ej., HiTrap-NHS de GE Life Science - Amersham), sefarosa activada con CnBr (p. ej., GE Life Science - Amersham), perlas de dextrano activadas con NHS (Sigma) o polimetacrilato activado. Estos reactivos también se pueden usar en un enfoque discontinuo. Además, se pueden usar perlas de dextrano que comprende óxido de hierro (p. ej., disponibles de Miltenyi) en un enfoque discontinuo. Estas perlas se pueden usar en combinación con un imán para la separación de las perlas a partir de una solución. Los polipéptidos se pueden inmovilizar sobre un chip de Biacore (p. ej., chips CM5) mediante el uso de carboximetildextrano activado con NHS. Ejemplos adicionales de un soporte sólido apropiado son las placas multipocillo aminorreactivas (p. ej., placas Nunc Immobilizer™).
De acuerdo con el procedimiento mencionado anteriormente dicho fragmento del dominio extracelular de CD3 épsilon se puede acoplar directamente al soporte sólido o por medio de un tramo de aminoácidos, que podría ser un enlazador u otro resto de proteína/polipéptido. De forma alternativa, el dominio extracelular de CD3 épsilon se puede acoplar indirectamente a través de una o más molécula adaptadoras.
En la técnica se conocen bien medios y procedimientos para la elución de un péptido unido a un epítopo inmovilizado. Lo mismo se mantiene para procedimientos para el aislamiento del/de los polipéptido(s) identificado(s) a partir del eluato.
En consonancia con la divulgación, un procedimiento para el aislamiento de uno o más polipéptidos diferentes con la misma especificidad por el fragmento del dominio extracelular de CD3ε que comprende en su extremo N-terminal la secuencia de aminoácidos Gln-Asp-Gly-Asn-Glu-Glu-X-Gly a partir de una pluralidad de polipéptidos candidatos pueden comprender una o más etapas de los procedimientos siguientes para la selección de entidades específicas de antígeno:
Se pueden seleccionar moléculas de unión específicas de CD3ε a partir de repertorios derivados de anticuerpo. Se
puede construir una colección de presentación en fagos basándose en procedimientos estándar, como se divulga, por ejemplo, en "Phage Display: A Laboratory Manual"; Ed. Barbas, Burton, Scott y Silverman; Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001. El formato de los fragmentos de anticuerpo de la colección de anticuerpos puede ser scFv, pero en general también puede ser un fragmento Fab o incluso un fragmento de anticuerpo de dominio único. Para el aislamiento de fragmentos de anticuerpos se pueden usar colecciones de fragmentos de anticuerpos indiferenciados. Para la selección de entidades de unión potencialmente poco inmunógenas en el uso terapéutico posterior, pueden ser favorables colecciones de fragmentos de anticuerpos humanos para la selección directa de fragmentos de anticuerpos humanos. En algunos casos pueden constituir la base para colecciones de anticuerpos sintéticos (Knappik, et al. J Mol. Biol. 2000, 296:57 y siguientes). El formato correspondiente puede ser Fab, scFv (como se describe a continuación) o anticuerpos de dominio (Acd, como se revisó en Holt et al., Trends Biotechnol. 2003, 21:484 y siguientes).
También se conoce en la técnica que en muchos casos no existe ninguna fuente inmunitaria de anticuerpos humanos disponible contra el antígeno objetivo. Por lo tanto, se inmunizan animales con el antígeno objetivo y las correspondientes colecciones de anticuerpos aisladas a partir de tejido animal como, p. ej., el bazo o PBMC. El fragmento N-terminal puede estar biotinilado o enlazado covalentemente a proteínas como KLH o seroalbúmina bovina (BSA). De acuerdo con enfoques comunes, se usan roedores para la inmunización. Algunos repertorios inmunitarios de anticuerpos de origen no humano pueden ser especialmente favorables por otros motivos, p. ej., por la presencia de anticuerpos de dominio único (VHH) derivados de especies de camélidos (como se describe en Muyldermans, J Biotechnol. 74:277; De Genst et al. Dev Como Immunol. 2006, 30:187 y siguientes). Por lo tanto, un formato correspondiente de la colección de anticuerpos puede ser Fab, scFv (como se describe a continuación) o anticuerpos de dominio único (VHH).
En un posible enfoque, se pueden inmunizar ratones F1 a partir de cruces de balb/c x C57black de diez semanas de edad con células completas, p. ej., que expresan EpCAM transmembranaria que presenta en el extremo N-terminal como fusión traduccional los aminoácidos 1 a 27 N-terminales de la cadena CD3ε madura. De forma alternativa, se pueden inmunizar ratones con la proteína de fusión 1-27 CD3 épsilon-Fc (se describe un enfoque correspondiente en el ejemplo 2 adjunto). Después de inmunización(es) de refuerzo, se pueden extraer muestras de sangre y se puede probar la valoración sérica de anticuerpos contra los linfocitos T positivos para CD3, p. ej., en análisis de FACS. Habitualmente, las valoraciones séricas son significativamente más altas en animales inmunizados que en no inmunizados.
Los animales inmunizados pueden constituir la base para la construcción de colecciones inmunitarias de anticuerpos. Los ejemplos de tales colecciones comprenden colecciones de presentación en fago. En general, se pueden construir colecciones de este tipo basándose en procedimientos estándar, como se divulga, por ejemplo, en "Phage Display: A Laboratory Manual"; Ed. Barbas, Burton, Scott y Silverman; Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001.
Los anticuerpos no humanos también se pueden humanizar a través de presentación en fagos debido a la generación de colecciones de anticuerpos más variables que se pueden enriquecer posteriormente para agentes de unión durante la selección.
En un enfoque de presentación en fagos, cualquiera de los conjuntos de fagos que presentan las colecciones de anticuerpos constituye una base para seleccionar entidades de unión usando el antígeno correspondiente como molécula objetivo. La etapa central en la que se aíslan los fagos unidos a antígeno, específicos de antígeno, se denomina fijación. Debido a la presentación de los fragmentos de anticuerpo en la superficie de los fagos, este procedimiento general se denomina presentación en fagos. Un procedimiento de selección preferente es el uso de proteínas pequeñas tales como el dominio N2 del fago filamentoso traduccionalmente fusionado al extremo Nterminal del scFv presentado por el fago. Otro procedimiento de presentación conocido en la técnica, que se puede usar para aislar entidades de unión es el procedimiento de presentación en ribosomas (revisado en Groves y Osbourn, Expert Opin Biol Ther. 2005, 5:125 y siguientes; Lipovsek y Pluckthun, J Immunol Methods 2004, 290:52 y siguientes).
Con el fin de demostrar la unión de partículas de fagos de scFv a una proteína de fusión 1-27 CD3ε-Fc se puede recoger una colección de fagos portadores del repertorio scFv clonado del sobrenadante de cultivo correspondiente mediante PEG (polietilenglicol). Se pueden incubar partículas de fagos de scFv con proteína de fusión CD3ε Fc inmovilizada. La proteína de fusión CD3ε Fc inmovilizada se puede recubrir sobre una fase sólida. Se pueden eluir
entidades de unión y usar el eluato para la infección de huéspedes bacterianos no infectados nuevos. Los huéspedes bacterianos transducidos exitosamente con una copia de fagémido, que codifica un fragmento scFv humano, se pueden seleccionar de nuevo por su resistencia a carbenicilina e infectarse posteriormente con, p. ej., el fago colaborador VCMS 13 para iniciar el segundo ciclo de presentación de anticuerpos y selección in vitro. Normalmente, se llevan a cabo un total de 4 a 5 ciclos de selección.
La unión de entidades de unión aisladas se puede probar en células Jurkat positivas para CD3épsilon, células HPBall, PBMC o células eucariotas transfectadas portadoras de la secuencia N-terminal de CD3ε fusionada a la EpCAM presentada en superficie usando un ensayo de citometría de flujo (véase el ejemplo 4 adjunto).
Punto 2. El procedimiento del punto 1, en el que el/los polipéptido(s) comprende(n) el dominio de unión identificado como el primer dominio de unión y un segundo dominio de unión capaz de unirse a un antígeno de superficie celular.
Para la generación del segundo dominio de unión del polipéptido identificado mediante el procedimiento mencionado anteriormente, p. ej., anticuerpos monocatenarios biespecíficos como se definen en el presente documento, pueden utilizarse anticuerpos monoclonales que se unen a ambos de los respectivos antígenos de superficie celular humanos y/o de primate distinto de chimpancé. Pueden derivarse dominios de unión apropiados para el polipéptido biespecífico definido en el presente documento, p. ej., a partir de anticuerpos monoclonales específicos de especies cruzadas mediante procedimientos recombinantes descritos en la técnica. Un anticuerpo monoclonal que se une a un antígeno de superficie celular humano y al homólogo de dicho antígeno de superficie celular en un primate distinto de chimpancé se puede probar mediante ensayos de FACS como se expone anteriormente. También se pueden usar técnicas de hibridoma descritas en la literatura (Kohler y Milstein, Nature 256 (1975), 495-7) para la generación de anticuerpos específicos de especies cruzadas. Por ejemplo, pueden inmunizarse ratones de forma alternativa con CD33 humana y de primate distinto de chimpancé. A partir de estos ratones, se pueden aislar células de hibridoma productoras de anticuerpos específicos de especies cruzadas por medio de tecnología de hibridoma y analizarlos por FACS como se expone anteriormente. En los ejemplos siguientes se muestran la generación y el análisis de polipéptidos biespecíficos tales como anticuerpos monocatenarios biespecíficos que presentan especificidad de especies cruzadas descritos en el presente documento. Las ventajas de los anticuerpos monocatenarios biespecíficos que presentan especificidad de especies cruzadas incluyen los puntos que se enumeran a continuación.
Punto 3. El procedimiento del punto 2, en el que el segundo dominio de unión se une a un antígeno de superficie celular humano y de un primate distinto de chimpancé.
Punto 4. El procedimiento de cualquiera de los puntos 1 a 3, en el que el primer dominio de unión es un anticuerpo.
Punto 5. El procedimiento del punto 4, en el que el anticuerpo es un anticuerpo monocatenario.
Punto 6. El procedimiento de cualquiera de los puntos 2 a 5, en el que el segundo dominio de unión es un anticuerpo.
Punto 7. El procedimiento de cualquiera de los puntos 1 a 6, en el que el fragmento del dominio extracelular de CD3ε consiste en uno o más fragmentos de un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos de una cualquiera representada en la SEQ ID NO: 2, 4, 6 u 8.
Punto 8. El procedimiento del punto 7, en el que dicho fragmento tiene 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 residuos de aminoácido de longitud.
Punto 9. El procedimiento de cualquiera de los puntos 1 a 8, en el que el procedimiento de identificación es un procedimiento de rastreo de una pluralidad de polipéptidos que comprenden un dominio de unión específico de especies cruzadas capaz de unirse a un epítopo de CD3ε humana y de primate distinto de chimpancé.
Punto 10. El procedimiento de cualquiera de los puntos 1 a 8, en el que el procedimiento de identificación es un procedimiento de purificación/aislamiento de un polipéptido que comprende un dominio de unión específico de especies cruzadas que se une a un epítopo de CD3ε humana y de primate distinto de chimpancé.
La presente invención se caracteriza además por la siguiente lista de puntos
Punto 11. Uso de un fragmento N-terminal del dominio extracelular de CD3ε de 27 aminoácidos como máximo que comprende la secuencia de aminoácidos Gln-Asp-Gly-Asn-Glu-Glu-Met-Gly (SEQ ID NO: 381) o Gln-Asp-Gly-Asn-Glu-Glu-lle-Gly (SEQ ID NO: 382) para la generación de un dominio de unión específico de especies cruzadas.
De conformidad con dicho uso de la divulgación, se prefiere que el dominio de unión específico de especies cruzadas sea de origen humano.
Punto 12. Uso de acuerdo con el punto 11, en el que el dominio de unión específico de especies cruzadas es un anticuerpo.
Punto 13. Uso de acuerdo con el punto 12, en el que el anticuerpo es un anticuerpo monocatenario.
Punto 14. Uso de acuerdo con los puntos 12 a 13, en el que el anticuerpo es un anticuerpo biespecífico.
Estas y otras realizaciones se divulgan y engloban en la descripción y se elaboran en los ejemplos de la presente invención. Se describen técnicas recombinantes y procedimientos en inmunología, p. ej., en Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, 3ª edición 2001; Lefkovits; Immunology Methods Manual; The Comprehensive Sourcebook of Techniques; Academic Press, 1997; Golemis; Protein-Protein Interactions: A Molecular Cloning Manual; Cold Spring Laboratory Press, 2002. Se puede recuperar literatura adicional concerniente a cualquiera de los anticuerpos, procedimientos, usos y compuestos que han de emplearse de acuerdo con la presente invención de bibliotecas y bases de datos públicas usando, por ejemplo, dispositivos electrónicos. Por ejemplo, se puede utilizar la base de datos pública "Medline", disponible en Internet, por ejemplo, en http:// www.ncbi.nlm.nih.gov/PubMed/medline.html. El experto en la técnica conoce bases de datos y direcciones adicionales tales como http:// www.ncbi.nlm.nih.gov/o enumeradas en la página de inicio de los servicios del EMBL http:// www.embl.de/services/index.html y también se pueden obtener usando, p. ej., http:// www.google.com.
Las figuras muestran:
Figura 1
Fusión de los aminoácidos 1-27 N-terminales de CD3 épsilon de primate a una proteína soluble heteróloga.
Figura 2
La figura muestra los valores de absorción promedio de muestras por cuadruplicado medidos en un ensayo ELISA de detección de la presencia de una construcción que consiste en los aminoácidos 1-27 N-terminales de la cadena CD3 épsilon humana madura fusionados con la porción de bisagra y gamma Fc de lgG1 humana y una marca Cterminal de 6 histidinas en un sobrenadante de células 293 transfectadas de forma transitoria. La primera columna
etiquetada "27 aa huCD3Ε" muestra el valor promedio de la absorción para la construcción, la segunda columna
etiquetada "SN no pert." muestra el valor promedio para un sobrenadante de células 293 transfectadas con una construcción no pertinente como control negativo. La comparación de los valores obtenidos para la construcción con los valores obtenidos para el control negativo demuestra claramente la presencia de la construcción recombinante.
Figura 3
La figura muestra los valores de absorción promedio de muestras por cuadruplicado medidos en un ensayo ELISA de detección de la unión de las moléculas de unión anti-CD3 específicas de especies cruzadas en forma de preparaciones en bruto de anticuerpos monocatenarios expresados en el periplasma frente a una construcción que comprende los aminoácidos 1-27 N-terminales de la cadena CD3 épsilon humana madura fusionados a la porción de bisagra y gamma Fc de la IgG1 humana y una marca His6 C-terminal. Las columnas muestran, de izquierda a derecha, los valores de absorción promedio para las especificidades denominadas A2J HLP, I2C HLP, E2M HLP, F7O HLP, G4H HLP, H2C HLP, E1L HLP, F12Q HLP, F6A HLP y H1E HLP. La columna del extremo de la derecha etiquetada "contr. neg." muestra el valor de absorción promedio para la preparación de anticuerpo monocatenario de un anticuerpo murino anti-CD3 humana como control negativo. La comparación de los valores obtenidos para las especificidades anti-CD3 con los valores obtenidos para el control negativo demuestra claramente la unión fuerte de las especificidades anti-CD3 a los aminoácidos 1-27 N-terminales de la cadena CD3 épsilon humana madura.
Figura 4
Fusión de los aminoácidos 1-27 N-terminales de CD3 épsilon de primate a una proteína unida a membrana heteróloga.
Figura 5
Superposiciones de gráficas de diferentes transfectantes probados en un ensayo de FACS de detección de la presencia de proteínas de fusión transmembranarias recombinantes que consisten en EpCAM de cynomolgus y los aminoácidos 1-27 N-terminales de la cadena CD3 épsilon humana, de tití, tamarino, mono ardilla y cerdo doméstico, respectivamente. Las superposiciones de gráficas, de izquierda a derecha y de arriba abajo, muestran los resultados para los transfectantes que expresan las construcciones que comprenden el 27 mero humano, el 27 mero de tití, el 27 mero de tamarino, el 27 mero de mono ardilla y el 27 mero de cerdo, respectivamente. En las superposiciones individuales, la línea fina representa una muestra incubada con PBS con FCS al 2 % en lugar de anticuerpo anti-Flag M2 como control negativo y la línea gruesa representa una muestra incubada con el anticuerpo anti-Flag M2. Para cada construcción, la superposición de las gráficas muestra la unión del anticuerpo anti-Flag M2 a los transfectantes, lo que demuestra claramente la expresión de las construcciones recombinantes en los transfectantes.
Figura 6
Superposiciones de gráficas de diferentes transfectantes probados en un ensayo de FACS de detección de la unión de moléculas de unión anti-CD3 específicas de especies cruzadas en forma de preparaciones en bruto de anticuerpos monocatenarios expresados en el periplasma frente a los aminoácidos 1-27 N-terminales de la cadena CD3 épsilon humana, de tití, tamarino y mono ardilla, respectivamente, fusionados a EpCAM de cynomolgus.
Figura 6A:
Las superposiciones de gráficas, de izquierda a derecha y de arriba abajo, muestran los resultados para los transfectantes que expresan la 1-27 CD3-EpCAM que comprende el 27 mero humano probada con las moléculas de unión específicas de CD3 designadas H2C HLP, F12Q HLP, E2M HLP y G4H HLP, respectivamente.
Figura 6B:
Las superposiciones de gráficas, de izquierda a derecha y de arriba abajo, muestran los resultados para los transfectantes que expresan la 1-27 CD3-EpCAM que comprende el 27 mero de tití probada con las moléculas de unión específicas de CD3 designadas H2C HLP, F12Q HLP, E2M HLP y G4H HLP, respectivamente.
Figura 6C:
Las superposiciones de gráficas, de izquierda a derecha y de arriba abajo, muestran los resultados para los transfectantes que expresan la 1-27 CD3-EpCAM que comprende el 27 mero de tamarino probada con las moléculas de unión específicas de CD3 designadas H2C HLP, F12Q HLP, E2M HLP y G4H HLP, respectivamente.
Figura 6D:
Las superposiciones de gráficas, de izquierda a derecha y de arriba abajo, muestran los resultados para los transfectantes que expresan la 1-27 CD3-EpCAM que comprende el 27 mero de mono ardilla probada con las moléculas de unión específicas de CD3 designadas H2C HLP, F12Q HLP, E2M HLP y G4H HLP, respectivamente.
Figura 6E:
Las superposiciones de gráficas, de izquierda a derecha y de arriba abajo, muestran los resultados para los transfectantes que expresan la 1-27 CD3-EpCAM que comprende el 27 mero de cerdo probada con las moléculas de unión específicas de CD3 designadas H2C HLP, F12Q HLP, E2M HLP y G4H HLP, respectivamente.
En las superposiciones individuales, la línea fina representa una muestra incubada con una preparación monocatenaria de un anticuerpo murino anti-CD3 humana como control negativo y la línea gruesa muestra una muestra incubada con las moléculas de unión anti-CD3 correspondientes indicadas. Teniendo en cuenta la falta de unión a los transfectantes con 27 mero de cerdo y los niveles de expresión de las construcciones mostrados en la figura 5, las superposiciones de las gráficas muestran unión específica y fuerte de las especificidades anti-CD3 probadas de los anticuerpos monocatenarios biespecíficos humanos totalmente específicos de especies cruzadas a células que expresan las proteínas de fusión transmembranarias recombinantes que comprenden los aminoácidos 1-27 N-terminales de la cadena CD3 épsilon humana, de tití, tamarino y mono ardilla, respectivamente, fusionados a EpCAM de cynomolgus y, por lo tanto, muestran la especificidad de especies cruzadas multiprimate de las moléculas de unión anti-CD3.
Figura 7
Ensayo de FACS para la detección de CD3 épsilon humana en linfocitos T EL4 murinos transfectados. El análisis gráfico muestra una superposición de gráficas. La línea gruesa muestra células transfectadas incubadas con el anticuerpo anti-CD3 humana UCHT-1. La línea fina representa células incubadas con un control de isotipo de IgG1 de ratón. La unión del anticuerpo anti-CD3 UCHT1 muestra claramente la expresión de la cadena CD3 épsilon humana en la superficie celular de linfocitos T EL4 murinos transfectados.
Figura 8
Unión de anticuerpos anti-CD3 específicos de especies cruzadas a mutantes de alanina en un experimento de barrido de alanina. En las figuras individuales, las columnas muestran, de izquierda a derecha, los valores de unión calculados en unidades arbitrarias de escala logarítmica para el transfectante natural (WT) y para todos los mutantes de alanina, de la posición 1 a la 27. Los valores de unión se calculan usando la fórmula siguiente:
Muestra(x,y) - Contr._neg(x)
valor_muestra(x,y) = WT(y) - Contr._neg(wt)
(UCHT - 1(x) - Contr._neg(x))*
UCHT - 1(wt) - Contr._neg(wt)
En esta ecuación valor_muestra significa el valor en unidades arbitrarias de unión que representa el grado de unión de un anticuerpo anti-CD3 específico a un mutante de alanina específico mostrado en la figura, Muestra significa la media geométrica del valor de fluorescencia obtenido para un anticuerpo anti-CD3 específico ensayado en un transfectante de barrido de alanina específico, Contr._neg significa la media geométrica del valor de fluorescencia obtenido para el control negativo ensayado en un mutante de alanina específico, UCTH-1 significa la media geométrica del valor de fluorescencia obtenido para el anticuerpo UCHT-1 ensayado en un mutante de alanina específico, WT significa la media geométrica del valor de fluorescencia obtenido para un anticuerpo anti-CD3 específico ensayado en el transfectante natural, x especifica el transfectante correspondiente, y especifica el anticuerpo anti-CD3 correspondiente y wt especifica que el transfectante correspondiente es el natural. Las posiciones de mutantes de alanina individuales se etiquetan con el código de una sola letra del aminoácido natural y el número de la posición.
Figura 8A:
La figura muestra los resultados para el anticuerpo anti-CD3 específico de especies cruzadas A2J HLP expresado como molécula de IgG quimérica. Se observa una disminución de la actividad de unión para mutaciones de alanina en la posición 4 (asparagina), en la posición 23 (treonina) y en la posición 25 (isoleucina). Se observa una pérdida total de unión para mutaciones de alanina en la posición 1 (glutamina), en la posición 2 (aspartato), en la posición 3 (glicina) y en la posición 5 (glutamato).
Figura 8B:
La figura muestra los resultados para el anticuerpo anti-CD3 específico de especies cruzadas E2M HLP expresado como molécula de IgG quimérica. Se observa una disminución de la actividad de unión para mutaciones de alanina en la posición 4 (asparagina), en la posición 23 (treonina) y en la posición 25 (isoleucina). Se observa una pérdida total de unión para mutaciones de alanina en la posición 1 (glutamina), en la posición 2 (aspartato), en la posición 3 (glicina) y en la posición 5 (glutamato).
Figura 8C:
La figura muestra los resultados para el anticuerpo anti-CD3 específico de especies cruzadas H2C HLP expresado como molécula de IgG quimérica. Se observa una disminución de la actividad de unión para mutaciones de alanina en la posición 4 (asparagina). Se observa una pérdida total de unión para mutaciones de alanina glutamina en la posición 1 (glutamina), en la posición 2 (aspartato), en la posición 3 (glicina) y en la posición 5 (glutamato).
Figura 8D:
Muestra los resultados para el anticuerpo anti-CD3 específico de especies cruzadas F12Q HLP, probado como anticuerpo monocatenario expresado en el periplasma. Se observa una pérdida total de unión para mutaciones de alanina en la posición 1 (glutamina), en la posición 2 (aspartato), en la posición 3 (glicina) y en la posición 5 (glutamato).
Figura 9
Ensayo de FACS de detección de la unión de la molécula de unión anti-CD3 específica de especies cruzadas H2C HLP a CD3 humana con y sin marca His6 N-terminal.
Se realizan superposiciones de gráficas de la línea celular EL4 transfectada con la cadena CD3 épsilon humana natural (gráfica de la izquierda) o la cadena CD3 épsilon humana con una marca His6 N-terminal (gráfica de la derecha) probada en un ensayo de FACS de detección de la unión de la molécula de unión específica de especies cruzadas H2C HLP. Las muestras se incuban con un control de isotipo apropiado como control negativo (línea fina), con el anticuerpo anti-CD3 humana UCHT-1 como control positivo (línea discontinua) y con el anticuerpo anti-CD3 específico de especies cruzadas H2C HLP en forma de molécula de IgG quimérica (línea gruesa).
Las superposiciones de gráficas muestran una unión comparable del anticuerpo UCHT-1 a ambos transfectantes en comparación con el control de isotipo, lo que demuestra la expresión de ambas construcciones recombinantes. Las superposiciones de gráficas también muestran la unión de la molécula de unión anti-CD3 H2C HLP sólo a la cadena CD3 épsilon humana natural, pero no a la cadena CD3 épsilon humana-His6. Estos resultados demuestran que un extremo N-terminal libre es esencial para la unión de la molécula de unión anti-CD3 específica de especies cruzadas H2C HLP.
Figura 10
Unión saturante de EGFR-21-63 LH x H2C sobre PBMC positivas para CD3 humana para determinar el valor de la KD de la unión de CD3 sobre células por análisis de FACS. El ensayo se realiza como se describe en el ejemplo 7.
Figura 11
Análisis de FACS de unión de construcciones monocatenarias biespecíficas específicas de especies cruzadas designadas a células CHO transfectadas con EGFR humano, la línea de linfocitos T CD3+ humana HPB-ALL, células CHO transfectadas con EGFR de cynomolgus y una línea de linfocitos T de macaco 4119 LnPx. La tinción de FACS se realiza como se describe en el ejemplo 12. La línea gruesa representa células incubadas con 2 µg/ml de proteína purificada que después se incuban con el anticuerpo anti-His y el anticuerpo de detección marcado con PE. La línea fina de la gráfica refleja el control negativo: células incubadas sólo con el anticuerpo anti-His y el anticuerpo de detección.
Figura 12
Actividad citotóxica inducida por construcciones monocatenarias específicas de especies cruzadas designadas redirigidas a líneas celulares objetivo indicadas. A) Se usan PBMC humanas CD4-/CD56- estimuladas como células efectoras, células CHO transfectadas con EGFR humano como células objetivo. B) Se usa la línea de linfocitos T de macaco 4119 LnPx como células efectoras, células CHO transfectadas con EGFR de cynomolgus como células objetivo. El ensayo se realiza como se describe en el ejemplo 13.
Figura 13
Actividad citotóxica inducida por construcciones monocatenarias específicas de especies cruzadas designadas redirigidas a líneas celulares objetivo indicadas. A) Se usan PBMC humanas CD4-/CD56- estimuladas como células efectoras, células CHO transfectadas con EGFR humano como células objetivo. B) Se usa la línea de linfocitos T de macaco 4119 LnPx como células efectoras, células CHO transfectadas con EGFR de cynomolgus como células objetivo. El ensayo se realiza como se describe en el ejemplo 13.
Figura 14
Análisis de FACS de unión de construcciones monocatenarias biespecíficas específicas de especies cruzadas designadas a células CHO transfectadas con MCSP D3 humana, la línea de linfocitos T CD3+ humana HPB-ALL, células CHO transfectadas con MCSP D3 de cynomolgus y una línea de linfocitos T de macaco 4119 LnPx. La tinción de FACS se realiza como se describe en el ejemplo 17. La línea gruesa representa células incubadas con 2 µg/ml de proteína purificada que después se incuban con el anticuerpo anti-His y el anticuerpo de detección marcado con PE. La línea fina de la gráfica refleja el control negativo: células incubadas sólo con el anticuerpo anti-His y el anticuerpo de detección.
Figura 15
Análisis de FACS de unión de construcciones monocatenarias biespecíficas específicas de especies cruzadas designadas a células CHO transfectadas con MCSP D3 humana, la línea de linfocitos T CD3+ humana HPB-ALL, células CHO transfectadas con MCSP D3 de cynomolgus y una línea de linfocitos T de macaco 4119 LnPx. La tinción de FACS se realiza como se describe en el ejemplo 17. La línea gruesa representa células incubadas con 2 µg/ml de proteína purificada que después se incuban con el anticuerpo anti-His y el anticuerpo de detección marcado con PE. La línea fina de la gráfica refleja el control negativo: células incubadas sólo con el anticuerpo anti-His y el anticuerpo de detección.
Figura 16
Análisis de FACS de unión de construcciones monocatenarias biespecíficas específicas de especies cruzadas designadas a células CHO transfectadas con MCSP D3 humana, la línea de linfocitos T CD3+ humana HPB-ALL, células CHO transfectadas con MCSP D3 de cynomolgus y una línea de linfocitos T de macaco 4119 LnPx. La tinción de FACS se realiza como se describe en el ejemplo 17. La línea gruesa representa células incubadas con 2 µg/ml de proteína monomérica purificada que después se incuban con el anticuerpo anti-His y el anticuerpo de detección marcado con PE. La línea fina de la gráfica refleja el control negativo: células incubadas sólo con el anticuerpo anti-His y el anticuerpo de detección.
Figura 17
Actividad citotóxica inducida por construcciones monocatenarias específicas de MCSP específicas de especies cruzadas designadas redirigidas a líneas celulares objetivo indicadas. A) Se usan PBMC humanas CD4-/CD56estimuladas como células efectoras, células CHO transfectadas con MCSP D3 humana como células objetivo. B) Se usa la línea de linfocitos T de macaco 4119 LnPx como células efectoras, células CHO transfectadas con MCSP D3 de cynomolgus como células objetivo. El ensayo se realiza como se describe en el ejemplo 18.
Figura 18
Actividad citotóxica inducida por construcciones monocatenarias específicas de MCSP específicas de especies cruzadas designadas redirigidas a líneas celulares objetivo indicadas. A) y B) Se usa la línea de linfocitos T de macaco 4119 LnPx como células efectoras, células CHO transfectadas con MCSP D3 de cynomolgus como células objetivo. El ensayo se realiza como se describe en el ejemplo 18.
Figura 19
Actividad citotóxica inducida por construcciones monocatenarias específicas de MCSP específicas de especies cruzadas designadas redirigidas a líneas celulares objetivo indicadas. A) y B) Se usan PBMC humanas CD4-/CD56estimuladas como células efectoras, células CHO transfectadas con MCSP D3 humana como células objetivo. El ensayo se realiza como se describe en el ejemplo 18.
Figura 20
Actividad citotóxica inducida por construcciones monocatenarias específicas de MCSP específicas de especies cruzadas designadas redirigidas a líneas celulares objetivo indicadas. A) Se usan PBMC humanas CD4-/CD56estimuladas como células efectoras, células CHO transfectadas con MCSP D3 humana como células objetivo. B) Se usa la línea de linfocitos T de macaco 4119 LnPx como células efectoras, células CHO transfectadas con MCSP D3 de cynomolgus como células objetivo. El ensayo se realiza como se describe en el ejemplo 18.
Figura 21
Actividad citotóxica inducida por construcciones monocatenarias específicas de MCSP específicas de especies cruzadas designadas redirigidas a líneas celulares objetivo indicadas. A) Se usan PBMC humanas CD4-/CD56estimuladas como células efectoras, células CHO transfectadas con MCSP D3 humana como células objetivo. B) Se usa la línea de linfocitos T de macaco 4119 LnPx como células efectoras, células CHO transfectadas con MCSP D3 de cynomolgus como células objetivo. El ensayo se realiza como se describe en el ejemplo 18.
Figura 22
Estabilidad en plasma de anticuerpos monocatenarios biespecíficos específicos de especies cruzadas de MCSP y CD3 probada mediante la medida de la actividad citotóxica inducida por muestras de las construcciones monocatenarias designadas incubadas con plasma humano al 50 % a 37 °C y a 4 °C durante 24 horas, respectivamente, o con la adición de plasma humano al 50 % inmediatamente antes de probar la citotoxicidad o sin la adición de plasma. Se usan células CHO transfectadas con MCSP humana como línea celular objetivo y se usan PBMC humanas CD4-/CD56-como células efectoras. El ensayo se realiza como se describe en el ejemplo 19.
Figura 23
Disminución inicial y recuperación (es decir, redistribución) de los recuentos absolutos de linfocitos T (cuadrados blancos), en sangre periférica de pacientes con LNH-B (pacientes número 1, 7, 23, 30, 31, y 33 de la tabla 4), que esencialmente no tenían linfocitos B objetivo positivos para CD19 circulantes (triángulos negros), durante la fase inicial de la infusión intravenosa con la molécula de unión a CD3 CD19xCD3 que reconoce un epítopo de CD3 dependiente del contexto convencional. Los recuentos celulares absolutos se dan en 1000 células por microlitro de sangre. El primer punto de datos muestra recuentos de referencia inmediatamente antes del comienzo de la infusión. La dosis de CD19xCD3 se da entre paréntesis al lado del número de paciente.
Figura 24
(A)
Redistribución de linfocitos T repetida (cuadrados blancos) en el paciente con LNH-B n.º 19 (tabla 4) que no tenía linfocitos B objetivo positivos para CD19 circulantes (triángulos negros) y que desarrolló síntomas en el SNC bajo infusión intravenosa continua con CD19xCD3 a una dosis inicial de 5 µg/m2/24 h durante un día seguida de un aumento repentino de la dosis hasta 15 µg/m2/24 h. Los recuentos celulares absolutos se dan en 1000 células por microlitro de sangre. El primer punto de datos muestra recuentos de referencia inmediatamente antes del inicio de la
infusión. Después de la recuperación de linfocitos T circulantes del primer episodio de redistribución desencadenado por el inicio del tratamiento a 5 µg/m2/24 h, el aumento escalonado de la dosis desde 5 hasta 15 µg/m2/24 h desencadenó un segundo episodio de redistribución de linfocitos T que se asoció con el desarrollo de síntomas en el SNC dominados por la confusión y la desorientación.
(B)
Redistribución de linfocitos T repetida en un paciente con LNH-B, que desarrolló síntomas en el SNC bajo infusión intravenosa rápida repetida con CD19xCD3 a 1,5 µg/m2/24 h. Los recuentos celulares absolutos se dan en 1000 células por microlitro de sangre. El tiempo de infusión para cada administración intravenosa rápida fue de 2 a 4 horas. Las flechas verticales indican el inicio de las infusiones intravenosas rápidas. Los puntos de datos al principio de cada administración intravenosa rápida muestran los recuentos de linfocitos T inmediatamente antes del inicio de la infusión intravenosa rápida. Cada infusión intravenosa rápida desencadenó un episodio de redistribución de linfocitos T seguido de la recuperación de los recuentos de linfocitos T antes de la siguiente infusión intravenosa rápida. Por último, el tercer episodio de redistribución de linfocitos T se asoció con el desarrolló de síntomas en el SNC en este paciente.
Figura 25
Patrón complejo de redistribución de linfocitos T (cuadrado blancos) en el paciente con LNH-B n.º 20 (tabla 4) sin linfocitos B objetivo positivos para CD19 circulantes (triángulos negros), durante el inicio gradual de la infusión de CD19xCD3, es decir, un aumento gradual uniforme del caudal desde casi cero hasta 15 µg/m2/24 h durante las primeras 24 horas de tratamiento. Los recuentos celulares absolutos se dan en 1000 células por microlitro de sangre. El primer punto de datos muestra recuentos de referencia inmediatamente antes del inicio de la infusión. La dosis de CD19xCD3 se da entre paréntesis al lado del número de paciente. Se induce parcialmente la desaparición de nuevo de la sangre circulante de los linfocitos T que reaparecen en la sangre circulante después de la redistribución inicial desencadenada por la primera exposición a CD19xCD3 aumentando aún más los niveles de CD19xCD3 durante la fase gradual.
Figura 26
Recuentos de linfocitos T y B durante el tratamiento con CD19xCD3 del paciente con LNH-B n.º 13 (tabla 4) que tenía una cantidad significativa de linfocitos B objetivo positivos para CD19 circulantes (linfoma) (triángulos negros). Los recuentos celulares absolutos se dan en 1000 células por microlitro de sangre. El primer punto de datos muestra recuentos de referencia inmediatamente antes del inicio de la infusión. La dosis de CD19xCD3 se da entre paréntesis al lado del número de paciente. Los linfocitos T (cuadrados blancos) desaparecen completamente de la circulación tras el inicio de la infusión con CD19xCD3 y no reaparecen hasta que se eliminan los linfocitos B positivos para CD19 circulantes (linfoma) (triángulos negros) de la sangre periférica.
Figura 27
Redistribución de linfocitos T repetida (cuadrados blancos) en el paciente con LNH-B n.º 24 (tabla 4), que esencialmente no tenía linfocitos B objetivo positivos para CD19 (triángulos negros) y desarrolló síntomas en el SNC tras el inicio de la infusión de CD19xCD3 sin HSA adicional necesaria para la estabilización del fármaco (panel superior). Después de la primera recuperación de linfocitos T de la redistribución inicial, el flujo de fármaco desigual debido a la falta de HSA estabilizante desencadenó un segundo episodio de redistribución de linfocitos T que se asoció con el desarrollo de síntomas en el SNC dominados por la confusión y la desorientación. Cuando el mismo paciente comenzó de nuevo correctamente con solución de CD19xCD3 que contenía HSA adicional para la estabilización del fármaco, no se observó redistribución de linfocitos T repetida (panel inferior) y el paciente no desarrolló otra vez síntomas en el SNC. Los recuentos celulares absolutos se dan en 1000 células por microlitro de sangre. El primer punto de datos muestra recuentos de referencia inmediatamente antes del inicio de la infusión. La dosis de CD19xCD3 se da entre paréntesis al lado del número de paciente.
Figura 28
Modelo de adhesión de linfocitos T a células endoteliales inducida por la unión monovalente a epítopos de CD3 dependientes del contexto. La interacción monovalente de una molécula de unión a CD3 convencional a su epítopo dependiente del contexto sobre CD3 épsilon puede conducir a un cambio alostérico en la conformación de CD3 seguido del reclutamiento de Nck2 al dominio citoplásmico de CD3 épsilon (Gil et al. (2002) Cell 109: 901). Dado que Nck2 se une directamente a las integrinas por medio de PINCH e ILK (Legate et al. (2006) Nat Rev Mol Cell Biol 7: 20), el reclutamiento de Nck2 al dominio citoplásmico de CD3 épsilon después de un cambio alostérico en la conformación de CD3 a través de la unión de una molécula de unión a CD3 convencional (como la CD19xCD3 del ejemplo 20) a su epítopo dependiente del contexto sobre CD3 épsilon, puede aumentar la capacidad de adhesión de los linfocitos T a las células endoteliales mediante el cambio transitorio de las integrinas de la superficie de los linfocitos T a su isoforma más adhesiva por medio de señalización de dentro a fuera.
Figura 29
Actividad citotóxica del material de prueba de CD33-AF5 VH-VL x I2C VH-VL usado para el estudio in vivo en monos cynomolgus como se describe en el ejemplo 21. Se determinó la lisis específica de células objetivo positivas para CD33 en un ensayo estándar de liberación de 51cromo a concentraciones crecientes de CD33-AF5 VH-VL x I2C VH-VL. La duración del ensayo fue de 18 horas. La línea de linfocitos T de macaco 4119 LnPx se usó como fuente de células efectoras. Sirvieron como células objetivo células CHO transfectadas con CD33 de cynomolgus. La proporción de células efectoras y objetivo (proporción E:O) fue de 10:1. La concentración de CD33-AF5 VH-VL x I2C VH-VL necesaria para la lisis semimáxima de células objetivo (CE50) se calculó a partir de la curva de respuesta a dosis con un valor de 2,7 ng/ml.
Figura 30
(A)
Eliminación dependiente de la dosis y del tiempo de monocitos positivos para CD33 de la sangre periférica de monos cynomolgus por medio de infusión intravenosa continua de CD33-AF5 VH-VL x I2C VH-VL como se describe en el ejemplo 21. El porcentaje relativo al valor de referencia (es decir, el 100 %) de los recuentos absolutos de monocitos positivos para CD33 circulantes después de la duración del tratamiento como se indica sobre las columnas se muestra para cada uno de dos monos cynomolgus por nivel de dosis. El nivel de dosis (es decir, el caudal de infusión) se indica debajo de las columnas. No se observó eliminación de monocitos positivos para CD33 circulantes en los animales 1 y 2 tratados durante 7 días a una dosis de 30 µg/m2/24 h. En los animales 3 y 4 tratados durante 7 días a una dosis de 60 µg/m2/24 h, los recuentos de monocitos positivos para CD33 circulantes disminuyeron hasta el 68 % y el 40 % del valor de referencia, respectivamente. A 240 µg/m2/24 h la práctica totalidad de los monocitos positivos para CD33 circulantes se habían eliminado de la sangre periférica después de 3 días de tratamiento (animales 5 y 6). A 1000 µg/m2/24 h, la eliminación de monocitos positivos para CD33 circulantes de la sangre periférica ya se había completado después de 1 día de tratamiento (animales 7 y 8).
(B)
Curso de los recuentos de linfocitos T y monocitos CD33 en sangre periférica de dos monos cynomolgus durante la infusión continua de CD33-AF5 VH-VL x I2C VH-VL durante 14 días a 120 µg/m2/24 h. Los recuentos celulares absolutos se dan en 1000 células por microlitro de sangre. El primer punto de datos muestra recuentos de referencia inmediatamente antes del inicio de la infusión. Después de la movilización inicial de monocitos CD33 durante las primeras 12 horas tras el inicio de la infusión se eliminan dos tercios (animal 9) y el 50 % (animal 10) de los monocitos CD33 en sangre periférica (triángulos negros) con relación a los respectivos recuentos de referencia durante el curso posterior de la infusión. Los recuentos de linfocitos T circulantes (cuadrados blancos) muestran una disminución inicial limitada seguida de la recuperación todavía durante la presencia de células objetivo monocíticas positivas para CD33.
Figura 31
Actividad citotóxica del material de prueba MCSP-G4 VH-VL x I2C VH-VL usado para el estudio in vivo en monos cynomolgus como se describe en el ejemplo 22. Se determinó la lisis específica de células objetivo positivas para MCSP en un ensayo estándar de liberación de 51cromo a concentraciones crecientes de MCSP-G4 VH-VL x I2C VH-VL. La duración del ensayo fue de 18 horas. La línea de linfocitos T de macaco 4119 LnPx se usó como fuente de células efectoras. Sirvieron como células objetivo células CHO transfectadas con MCSP de cynomolgus. La proporción de células efectoras y objetivo (proporción E:O) fue de 10:1. La concentración de MCSP-G4 VH-VL x I2C VH-VL necesaria para la lisis semimáxima de células objetivo (CE50) se calculó a partir de la curva de respuesta a dosis con un valor de 1,9 ng/ml.
Figura 32
Ausencia de episodios iniciales de disminución y posterior recuperación de recuentos absolutos de linfocitos T (es decir, redistribución) en sangre periférica de monos cynomolgus durante la fase inicial de la infusión intravenosa con la molécula de unión a CD3 MCSP-G4 VH-VL x I2C VH-VL que reconoce un epítopo de CD3 esencialmente independiente del contexto. Los recuentos celulares absolutos se dan en 1000 células por microlitro de sangre. El primer punto de datos muestra recuentos de referencia inmediatamente antes del inicio de la infusión. La dosis de MCSP-G4 VH-VL x I2C VH-VL se da entre paréntesis al lado del número de animal. En la ausencia conocida de células objetivo positivas para MCSP de la sangre circulante de monos cynomolgus, no hay inducción de la redistribución de linfocitos T (es decir, un episodio inicial de disminución y posterior recuperación de los recuentos absolutos de linfocitos T) a través de entrecruzamiento de CD3 mediado por células objetivo. Además, la inducción de la redistribución de linfocitos T (es decir, un episodio inicial de disminución y posterior recuperación de los recuentos de linfocitos T) a través de una señal, que los linfocitos T pueden recibir a través de la interacción exclusiva sólo con un sitio de unión a CD3, se puede evitar mediante el uso de moléculas de unión a CD3 como MCSP-G4 VH-VL x I2C VH-VL que reconocen un epítopo de CD3 esencialmente independiente del contexto.
Figura 33
Análisis de FACS de unión de construcciones biespecíficas específicas de especies cruzadas designadas a células CHO transfectadas con CD33 humana, la línea de linfocitos T CD3+ humana HPB-ALL, células CHO transfectadas con CD33 de macaco y PBMC de macaco, respectivamente. La tinción de FACS se realiza como se describe en el ejemplo 23.4. Las líneas gruesas representan células incubadas con 5 µg/ml de construcción monocatenaria biespecífica purificada o sobrenadante de cultivo celular de células transfectadas que expresan las construcciones de anticuerpo biespecífico específico de especies cruzadas. Las gráficas negras reflejan los controles negativos. Se usó sobrenadante de células CHO no transfectadas como control negativo. Para cada construcción monocatenaria biespecífica específica de especies cruzadas, la superposición de las gráficas muestra la unión específica de la construcción a CD33 humana y de macaco y a CD3 humana y de macaco.
Figura 34
Los diagramas muestran los resultados de ensayos de liberación de cromo para medir la actividad citotóxica inducida por construcciones monocatenarias específicas de CD33 específicas de especies cruzadas designadas redirigidas a las líneas celulares objetivo indicadas. También se usaron células efectoras como se indica. Los ensayos se realizan como se describe en el ejemplo 23.5. Los diagramas demuestran claramente para cada construcción el potente reclutamiento de actividad citotóxica de células efectoras humanas y de macaco contra células CHO transfectadas con CD33 humana y de macaco, respectivamente.
Figura 35
Análisis de FACS de unión de construcciones monocatenarias biespecíficas específicas de especies cruzadas designadas a células CHO transfectadas con CAIX humana, la línea de linfocitos T CD3+ humana HPB-ALL, células CHO transfectadas con CAIX de macaco y la línea de linfocitos T de macaco 4119 LnPx, respectivamente. La tinción de FACS se realizó como se describe en el ejemplo 24.5. Las líneas gruesas representan células incubadas con 2 µg/ml de construcción monocatenaria biespecífica purificada. Las gráficas negras reflejan los controles negativos. El sobrenadante de células CHO no transfectadas se usó como control negativo para la unión a las líneas de linfocitos
T. Como control negativo para la unión a las células CHO transfectadas con CAIX, se usó una construcción monocatenaria con especificidad de objetivo no pertinente. Para cada construcción monocatenaria biespecífica específica de especies cruzadas, la superposición de las gráficas muestra la unión específica de la construcción a CAIX humana y de macaco y a CD3 humana y de macaco.
Figura 36
Los diagramas muestran los resultados de ensayos de liberación de cromo para medir la actividad citotóxica inducida por construcciones monocatenarias específicas de CAIX específicas de especies cruzadas designadas redirigidas a las líneas celulares objetivo indicadas. También se usaron células efectoras como se indica. Los ensayos se realizan como se describe en el ejemplo 24.6. Los diagramas demuestran claramente para cada construcción el potente reclutamiento de actividad citotóxica de células efectoras humanas y de macaco contra células CHO transfectadas con CAIX humana y de macaco, respectivamente.
Figura 37
Actividad citotóxica inducida por construcciones monocatenarias específicas de EpCAM designadas contra células CHO transfectadas con EpCAM humana usando linfocitos T humanos como células efectoras. El ensayo se realizó como se describe en la sección de ejemplos. Los diagramas demuestran claramente un potente reclutamiento de actividad citotóxica por cada construcción.
Células efectoras: PBMC humanas con eliminación de CD4/CD56 estimuladas.
Células objetivo: CHO transfectadas con EpCAM humana.
Figura 38
Análisis de FACS de unión de construcciones monocatenarias biespecíficas designadas a células CHO transfectadas con EpCAM humana (2a), células CHO no transfectadas como línea celular negativa para EpCAM y CD3 (2b), PBMC humanas (2c) y la línea de linfocitos T de macaco 4119 LnPx (2d), respectivamente. Se incubaron las células con sobrenadante que contenía la construcción monocatenaria biespecífica correspondiente. La tinción de FACS se realiza como se describe en la sección de ejemplos. Para cada construcción monocatenaria biespecífica específica de especies cruzadas, la superposición de las gráficas muestra la unión específica de la construcción a EpCAM humana y a CD3 humana y de macaco.
a: CHO-EpCAM (humana)
b: CHO (no transfectadas)
c: PBMC humanas
d: 4119LnPx de macaco (CD3+).
Figura 39
Análisis de FACS de unión de construcciones monocatenarias biespecíficas específicas de especies cruzadas designadas a células CHO transfectadas con EGFRvIII humano, la línea de linfocitos T positivos para CD3 humana HPB-ALL, células CHO transfectadas con EGFRvIII de cynomolgus y una línea de linfocitos T de macaco 4119 LnPx. La tinción de FACS se realiza como se describe en el ejemplo 26.3. La línea gruesa representa células incubadas con 2 µg/ml de proteína monomérica purificada que después se incuban con el anticuerpo anti-His y el anticuerpo de detección marcado con PE. La línea fina de la gráfica refleja el control negativo: células cultivadas sólo con el anticuerpo anti-His y el anticuerpo de detección.
Figura 40
Actividad citotóxica inducida por construcciones monocatenarias específicas de especies cruzadas designadas redirigidas a líneas celulares objetivo indicadas. A) Se usan PBMC humanas CD4-/CD56- estimuladas como células efectoras, células CHO transfectadas con EGFRvIII humano como células objetivo. B) Se usa la línea de linfocitos T de macaco 4119 LnPx como células efectoras, células CHO transfectadas con EGFRvIII de cynomolgus como células objetivo. El ensayo se realiza como se describe en el ejemplo 26.3.
Figura 41
Análisis de FACS de unión de construcciones monocatenarias biespecíficas específicas de especies cruzadas designadas a células J558L transfectadas con IgE humana, la línea de linfocitos T CD3+ humana HPB-ALL, células J558L transfectadas con IgE de macaco y una línea de linfocitos T de macaco 4119 LnPx. La tinción de FACS se realiza como se describe en el ejemplo 27.2. La línea gruesa representa células incubadas con sobrenadante de cultivo celular de células CHO transfectadas con construcción monocatenaria biespecífica específica de especies cruzadas designada que se incuban posteriormente con el anticuerpo anti-His y el anticuerpo de detección marcado con PE. La línea fina de la gráfica refleja el control negativo: células cultivadas sólo con el anticuerpo anti-His y el anticuerpo de detección.
Figura 42
Actividad citotóxica inducida por construcciones monocatenarias específicas de especies cruzadas designadas redirigidas a líneas celulares objetivo indicadas. A) Se usan PBMC humanas CD4-/CD56- estimuladas como células efectoras, células J558L transfectadas con IgE humana como células objetivo. B) Se usa la línea de linfocitos T de macaco 4119 LnPx como células efectoras, células J558L transfectadas con IgE de macaco como células objetivo. El ensayo se realiza como se describe en el ejemplo 27.2.
Figura 43
Análisis de FACS de unión de construcciones monocatenarias biespecíficas específicas de especies cruzadas designadas a células CHO transfectadas con CD44 humana, la línea de linfocitos T CD3+ humana HPB-ALL, células CHO transfectadas con CD44 de macaco y PBMC de macaco, respectivamente. La tinción de FACS se realizó como se describe en el ejemplo 28.6. Las líneas gruesas representan células incubadas con 5 µg/ml de construcción monocatenaria biespecífica purificada. Las gráficas negras reflejan los controles negativos. Se usó PBS con FCS al 2 % como control negativo. Para cada construcción monocatenaria biespecífica específica de especies cruzadas, la superposición de las gráficas muestra la unión específica de la construcción a CD44 humana y de macaco y a CD3 humana y de macaco.
Figura 44
Análisis de FACS de unión de construcciones monocatenarias biespecíficas específicas de especies cruzadas designadas a células CHO transfectadas con CD44 humana que carece del exón v6. La tinción de FACS se realiza como se describe en el ejemplo 28.6. Como control para la expresión de CD44, las células CHO transfectadas con CD44 humana que carece del exón v6 y las células CHO transfectadas con la CD44 humana de longitud completa se incubaron con un anticuerpo anti-CD44. Las líneas gruesas representan células incubadas con 5 µg/ml de construcción monocatenaria biespecífica purificada o el anticuerpo anti-CD44 (5 µg/ml), según se indique. Las gráficas negras reflejan los controles negativos. Se usó PBS con FCS al 2 % como control negativo. Para cada construcción monocatenaria biespecífica específica de especies cruzadas, la superposición de las gráficas muestra la ausencia de unión de la construcción a CD44 humana que carece del exón v6. La presencia de CD44 sobre las células CHO transfectadas con CD44 humana que carece del exón v6 se demostró por unión comparable del anticuerpo anti-CD44 a estas células y a las células transfectadas con CD44 humana de longitud completa. El análisis de FACS de unión mostró la especificidad de las construcciones monocatenarias biespecíficas específicas de especies cruzadas para el exón v6 de CD44.
Figura 45
El diagrama muestra los resultados de un ensayo de liberación de cromo que mide la actividad citotóxica inducida por construcciones monocatenarias específicas de CD44 específicas de especies cruzadas designadas redirigidas a células CHO transfectadas con CD44 humana como se describe en el ejemplo 28.1. Como células efectoras se usaron PBMC humanas con eliminación de CD4 y CD56 estimuladas con una proporción de E:O de 10:1. El ensayo se realiza como se describe en el ejemplo 28.7. El diagrama demostró para cada construcción el potente reclutamiento de actividad citotóxica de células efectoras humanas contra células CHO transfectadas con CD44 humana.
Figura 46
Análisis de FACS de unión de construcciones monocatenarias biespecíficas específicas de especies cruzadas designadas a células CHO transfectadas con CD30 humana, la línea de linfocitos B CD30+ humana MEC-1, la línea de linfocitos T CD3+ humana HPB-ALL, células CHO transfectadas con CD30 de macaco y PBMC de macaco, respectivamente. La tinción de FACS se realizó como se describe en el ejemplo 29.5. Las líneas gruesas representan células incubadas con 5 µg/ml de construcción monocatenaria biespecífica purificada. Las gráficas negras reflejan los controles negativos. Se usó PBS con FCS al 2 % como control negativo. Para cada construcción monocatenaria biespecífica específica de especies cruzadas, la superposición de las gráficas muestra la unión específica de la construcción a CD30 humana y de macaco y a CD3 humana y de macaco.
Figura 47
Los diagramas muestran los resultados de ensayos de liberación de cromo para medir la actividad citotóxica inducida por construcciones monocatenarias específicas de CD30 específicas de especies cruzadas designadas redirigidas a las líneas celulares objetivo indicadas. También se usaron células efectoras como se indica. Los ensayos se realizaron como se describe en el ejemplo 29.6. Los diagramas demuestran claramente para cada construcción el potente reclutamiento de actividad citotóxica de células efectoras humanas y de macaco contra células positivas para CD30 humana y de macaco, respectivamente.
Figura 48
Análisis de FACS de unión de construcciones monocatenarias biespecíficas específicas de especies cruzadas designadas a células CHO transfectadas con HER2 humano, la línea de linfocitos T positivos para CD3 humana HPB-ALL, células CHO transfectadas con EGFR de macaco y la línea de linfocitos T de macaco 4119 LnPx, respectivamente. La tinción de FACS se realizó como se describe en el ejemplo 30.5. Las líneas gruesas representan células incubadas con 2 µg/ml de construcción monocatenaria biespecífica purificada. Las líneas finas reflejan los controles negativos. Se usó PBS con FCS al 2 % como control negativo. Para cada construcción monocatenaria biespecífica específica de especies cruzadas, la superposición de las gráficas muestra la unión específica de la construcción a HER2 humano y de macaco y a CD3 humana y de macaco.
Figura 49
Los diagramas muestran los resultados de ensayos de liberación de cromo para medir la actividad citotóxica inducida por construcciones monocatenarias específicas de HER2 específicas de especies cruzadas designadas redirigidas a las líneas celulares objetivo indicadas. También se usaron células efectoras como se indica. Los ensayos se realizaron como se describe en el ejemplo 30.6. Los diagramas demuestran claramente para cada construcción el potente reclutamiento de actividad citotóxica de células efectoras humanas y de macaco contra células CHO transfectadas con HER2 humano y de macaco, respectivamente.
Figura 50
Gel de SDS PAGE y transferencia de bandas western de seguimiento de la purificación de la molécula monocatenaria biespecífica específica de especies cruzadas designada E292F3 HL x I2C HL. Se analizaron muestras del eluato, el sobrenadante de cultivo celular (SN) y el flujo a través de la columna (FT) como se indica. Se aplicó un marcador proteínico (M) como referencia de tamaño. Una banda de proteína intensa con un peso molecular entre 50 y 60 kDa en el gel de SDS PAGE demuestra la purificación eficaz de la molécula monocatenaria biespecífica específica de especies cruzadas en un grado muy alto de pureza con el procedimiento de purificación en una etapa descrito en el ejemplo 31.2. La transferencia de bandas western de detección de la marca histidina6 confirma la identidad de la banda de proteína del eluato como la molécula monocatenaria biespecífica específica de especies cruzadas. La señal débil de la muestra que fluye a través en este procedimiento de detección sensible muestra además la captura casi completa de moléculas monocatenarias biespecíficas por el procedimiento de purificación.
Figura 51
Gel de SDS PAGE y transferencia de bandas western de seguimiento de la purificación de la molécula monocatenaria biespecífica específica de especies cruzadas designada V207C12 HL x H2C HL. Se analizaron muestras del eluato, el sobrenadante de cultivo celular (SN) y el flujo a través de la columna (FT) como se indica. Se aplicó un marcador proteínico (M) como referencia de tamaño. Una banda de proteína intensa con un peso molecular entre 50 y 60 kDa en el gel de SDS PAGE demuestra la purificación eficaz de la molécula monocatenaria biespecífica específica de especies cruzadas en un grado muy alto de pureza con el procedimiento de purificación en una etapa descrito en el ejemplo 31.2. La transferencia de bandas western de detección de la marca histidina6 confirma la identidad de la banda de proteína del eluato como la molécula monocatenaria biespecífica específica de especies cruzadas. La señal débil de la muestra que fluye a través en este procedimiento de detección sensible muestra además la captura casi completa de moléculas monocatenarias biespecíficas por el procedimiento de purificación.
Figura 52
Gel de SDS PAGE y transferencia de bandas western de seguimiento de la purificación de la molécula monocatenaria biespecífica específica de especies cruzadas designada AF5HLxF12QHL. Se analizaron muestras del eluato, el sobrenadante de cultivo celular (SN) y el flujo a través de la columna (FT) como se indica. Se aplicó un marcador proteínico (M) como referencia de tamaño. Una banda de proteína intensa con un peso molecular entre 50 y 60 kDa en el gel de SDS PAGE demuestra la purificación eficaz de la molécula monocatenaria biespecífica específica de especies cruzadas en un grado muy alto de pureza con el procedimiento de purificación en una etapa descrito en el ejemplo 31.2. La transferencia de bandas western de detección de la marca histidina6 confirma la identidad de la banda de proteína del eluato como la molécula monocatenaria biespecífica específica de especies cruzadas. La señal de la muestra que fluye a través en este procedimiento de detección sensible se explica por la saturación de la columna de afinidad debida a la alta concentración de moléculas monocatenarias biespecíficas en el sobrenadante.
Figura 53
Curva de calibrado de AF5HLxl2CHL en suero de mono macaco al 50 %. El diagrama superior muestra la curva de calibrado generada para el ensayo como se describe en el ejemplo 32.2.
El diagrama inferior muestra resultados de las muestras de control de calidad de AF5HLxl2CHL en suero de mono macaco al 50 %. Las tasas de recuperación son superiores al 90 % para la muestra de QC alto y medio y superiores al 80 % para la muestra de QC bajo.
Por tanto, el ensayo permite la detección de AF5HLxl2CHL en muestras de suero en el intervalo de desde 10 ng/ml hasta 200 ng/ml (antes de la dilución).
Figura 54
Curva de calibrado de MCSP-G4 HL x I2C HL en suero de mono macaco al 50 %. El diagrama superior muestra la curva de calibrado generada para el ensayo como se describe en el ejemplo 32.2.
El diagrama inferior muestra resultados de las muestras de control de calidad de MCSP-G4 HL x I2C HL en suero de mono macaco al 50 %. Las tasas de recuperación son superiores al 98% para la muestra de QC alto y medio y superiores al 85% para la muestra de QC bajo.
Por tanto, el ensayo permite la detección de MCSP-G4 HL x I2C HL en muestras de suero en el intervalo de desde 10 ng/ml hasta 200 ng/ml (antes de la dilución).
Figura 55
Análisis de FACS de unión de un anticuerpo anti-Flag a células CHO transfectadas con los aminoácidos 1-27 Nterminales de CD3 épsilon de las especies designadas fusionados a EpCAM de cynomolgus. La tinción de FACS se realizó como se describe en el ejemplo 33.1. Las líneas gruesas representan células incubadas con el anticuerpo anti-Flag. Las gráficas negras reflejan los controles negativos. Se usó PBS con FCS al 2 % como control negativo. Las gráficas muestran la unión fuerte y comparable del anticuerpo anti-Flag a todos los transfectantes, lo que indica una expresión fuerte e igual de las construcciones transfectadas.
Figura 56
Análisis de FACS de unión de la construcción de IgG1 I2C a células CHO que expresan los aminoácidos 1-27 Nterminales de CD3 épsilon de las especies designadas fusionados a EpCAM de cynomolgus. La tinción de FACS se realiza como se describe en el ejemplo 33.3. Las líneas gruesas representan células incubadas con 50 µl de sobrenadante de cultivo celular de células que expresan la construcción de IgG1 I2C. Las gráficas negras reflejan el control negativo. Como control negativo se usaron células que expresan los aminoácidos 1-27 N-terminales de CD3 épsilon de cerdo fusionados con EpCAM de cynomolgus. En comparación con el control negativo, las gráficas demuestran claramente la unión de la construcción de IgG1 I2C a los aminoácidos 1-27 N-terminales de CD3 épsilon de ser humano, tití, tamarino y mono ardilla.
Figura 57
Análisis de FACS de unión de la construcción de IgG1 I2C como se describe en el ejemplo 33.2 a CD3 humana con y sin marca His6 N-terminal como se describe en los ejemplos 6.1 y 5.1, respectivamente. Las líneas gruesas representan células incubadas con el anticuerpo anti-CD3 humana UCHT-1, el anticuerpo penta-His (Qiagen) y el sobrenadante de cultivo celular de células que expresan la construcción de IgG1 I2C, respectivamente según se indique. Las gráficas negras reflejan células incubadas con un anticuerpo de IgG1 murina no pertinente como control negativo.
Las dos superposiciones de gráficas superiores muestran una unión comparable del anticuerpo UCHT-1 a ambos transfectantes en comparación con el control de isotipo, lo que demuestra la expresión de ambas construcciones recombinantes. Las superposiciones de gráficas del centro muestran una unión del anticuerpo penta his a las células que expresan la cadena CD3 épsilon humana-His6 (CD3-His6) pero no las células que expresan la cadena CD3 épsilon natural (CD3-WT). Las superposiciones de gráficas inferiores muestran la unión de la construcción de IgG1 I2C a la cadena CD3 épsilon humana natural, pero no a la cadena CD3 épsilon humana-His6. Estos resultados demuestran que un extremo N-terminal libre es esencial para la unión de la molécula de unión I2C anti-CD3 específica de especies cruzadas a la cadena CD3 épsilon.
Figura 58
Análisis de FACS de unión de construcciones monocatenarias biespecíficas específicas de especies cruzadas designadas a células CHO transfectadas con MCSP D3 humana, la línea de linfocitos T CD3+ humana HPB-ALL, células CHO transfectadas con MCSP D3 de macaco y la línea de linfocitos T de macaco 4119 LnPx, respectivamente. La tinción de FACS se realizó como se describe en el ejemplo 17. Las líneas gruesas representan células incubadas con 2 µg/ml de construcción monocatenaria biespecífica purificada o sobrenadante celular que contiene la construcción monocatenaria biespecífica, respectivamente. Las gráficas negras reflejan los controles negativos. El sobrenadante de células CHO no transfectadas se usó como control negativo para la unión a las líneas de linfocitos T. Como control negativo para la unión a las células CHO transfectadas con MCSP D3, se usó una construcción monocatenaria con especificidad de objetivo no pertinente. Para cada construcción monocatenaria biespecífica específica de especies cruzadas, la superposición de las gráficas muestra la unión específica de la construcción a MCSP D3 humana y de macaco y a CD3 humana y de macaco.
Figura 59
Actividad citotóxica inducida por construcciones monocatenarias específicas de MCSP D3 específicas de especies cruzadas designadas redirigidas a las líneas celulares objetivo indicadas. También se usaron células efectoras y una proporción de efectoras y objetivo como se indica. El ensayo se realiza como se describe en el ejemplo 18. Los diagramas demuestran claramente un potente reclutamiento específico de especies cruzadas de actividad citotóxica por cada construcción.
Figura 60
Análisis de FACS de unión de construcciones monocatenarias biespecíficas específicas de especies cruzadas designadas a células CHO transfectadas con CD33 humana, la línea de linfocitos T CD3+ humana HPB-ALL, células CHO transfectadas con CD33 de macaco y PBMC de macaco, respectivamente. La tinción de FACS se realizó como se describe en el ejemplo 36,2. Las líneas gruesas representan células incubadas con sobrenadante de cultivo celular de células transfectadas que expresan las construcciones de anticuerpo biespecífico específico de especies cruzadas. Las gráficas negras reflejan los controles negativos. Se usó sobrenadante de células CHO no transfectadas como control negativo. Para cada construcción monocatenaria biespecífica específica de especies cruzadas, la superposición de las gráficas muestra la unión específica de la construcción a CD33 humana y de macaco y a CD3 humana y de macaco.
Figura 61
Los diagramas muestran los resultados de ensayos de liberación de cromo para medir la actividad citotóxica inducida por construcciones monocatenarias específicas de CD33 específicas de especies cruzadas designadas redirigidas a las líneas celulares objetivo indicadas. También se usaron células efectoras como se indica. Los ensayos se realizan como se describe en el ejemplo 36.3. Los diagramas demuestran claramente para cada construcción el potente reclutamiento de actividad citotóxica de células efectoras humanas y de macaco contra células CHO transfectadas con CD33 humana y de macaco, respectivamente.
Figura 62
Redistribución de linfocitos T en un chimpancé con infusión intravenosa rápida semanal con PBS/HSA al 5 % y PBS/HSA al 5 % más construcción monocatenaria de anticuerpo biespecífico de EpCAM/CD3 a dosis de 1,6, 2,0, 3,0 y 4,5 µg/kg. El tiempo de infusión para cada administración intravenosa rápida fue de 2 horas. La flechas verticales indican el inicio de las infusiones intravenosas rápidas. Los puntos de datos al principio de cada administración intravenosa rápida muestran los recuentos de linfocitos T inmediatamente antes del inicio de la infusión intravenosa rápida. Cada infusión intravenosa rápida de la construcción monocatenaria de anticuerpo biespecífico de EpCAM/CD3, que reconoce un epítopo de CD3 dependiente del contexto convencional, desencadenó un episodio de redistribución de linfocitos T seguido de la recuperación de linfocitos T hasta valores de referencia antes de la siguiente infusión intravenosa rápida.
Figura 63
Análisis ELISA específico de CD3 de preparaciones periplásmicas que contienen fragmentos de proteína scFv marcados con Flag de clones seleccionados. Se añadieron preparaciones periplásmicas de fragmentos de proteína scFv soluble a pocillos de una placa de ELISA, que se habían recubierto con proteína de fusión CD3 épsilon humana (aa 1-27)-Fc y, adicionalmente, se habían bloqueado con PBS con BSA al 3 %. Se realizó la detección mediante un anticuerpo monoclonal anti-Flag marcado con biotina seguido de estreptavidina conjugada con peroxidasa. El ELISA se reveló mediante una solución de sustrato ABTS. Los valores de DO (eje y) se midieron a 405 nm mediante un lector de ELISA. En el eje x se presentan los nombres de los clones.
Figura 64
Análisis ELISA de preparaciones periplásmicas que contienen fragmentos de proteína scFv marcados con Flag de clones seleccionados. Se añadieron las mismas preparaciones periplásmicas de fragmentos de proteína scFv soluble que en la figura 63 a pocillos de una placa de ELISA que no se habían recubierto con proteína de fusión CD3 épsilon humana (aa 1-27)-Fc sino con huIgG1 (Sigma) y bloqueados con PBS con BSA al 3 %.
Se realizó la detección mediante un anticuerpo monoclonal anti-Flag marcado con biotina seguido de estreptavidina conjugada con peroxidasa. El ELISA se reveló mediante una solución de sustrato ABTS. Los valores de DO (eje y) se midieron a 405 nm mediante un lector de ELISA. En el eje x se presentan los nombres de los clones.
Figura 65
Análisis de FACS de unión de construcciones monocatenarias biespecíficas específicas de especies cruzadas designadas a células CHO transfectadas con CD44 humana, la línea de linfocitos T CD3+ humana HPB-ALL, células CHO transfectadas con CD44 de macaco y la línea de linfocitos T de macaco 4119 LnPx, respectivamente. Se usaron células CHO transfectadas con CD44delv6 humana como control para enfatizar la especificidad de las construcciones monocatenarias biespecíficas específicas de especies cruzadas designadas para CD44. La tinción de FACS se realiza como se describe en el ejemplo 39.3. Las líneas gruesas representan células incubadas con sobrenadante celular que contenía la construcción monocatenaria biespecífica. Las gráficas negras reflejan los controles negativos. El sobrenadante de células CHO no transfectadas se usó como control negativo para la unión a las líneas de linfocitos T. Como control negativo para la unión a las células CHO transfectadas con CD44 y CD44delv6, se usó una construcción monocatenaria con especificidad de objetivo no pertinente. Para cada construcción monocatenaria biespecífica específica de especies cruzadas, la superposición de las gráficas muestra la unión específica de la construcción a CD44 humana y de macaco y a CD3 humana y de macaco. La superposición de las gráficas para cada construcción no muestra unión específica a las células CHO transfectadas con CD44delv6 humana.
Figura 66
Actividad citotóxica inducida por construcciones monocatenarias específicas de CD44 específicas de especies cruzadas designadas redirigidas a líneas celulares objetivo indicadas. También se usaron células efectoras y una proporción de efectoras y objetivo como se indica. El ensayo se realiza como se describe en el ejemplo 39.4. Los diagramas demuestran claramente la potencia de mediar la citotoxicidad por cada una de las construcciones biespecíficas.
Figura 67
Análisis de FACS de unión de construcciones monocatenarias biespecíficas específicas de especies cruzadas designadas como se describe en el ejemplo 41.
Figura 68
Actividad citotóxica inducida por moléculas de unión específicas de especies cruzadas designadas como se describe en el ejemplo 41.
La presente invención se describe adicionalmente por medio de los siguientes ejemplos ilustrativos no limitantes que permiten una mejor comprensión de la presente invención y de sus muchas ventajas.
Ejemplos
1. Identificación de secuencias de CD3épsilon a partir de muestras de sangre de primates no humanos
Se usaron muestras de sangre de los siguientes primates no humanos para la identificación de CD3épsilon: Callithrix jacchus, Saguinus oedipus y Saimiris sciureus. Se prepararon muestras de sangre completa tratadas con heparina recién preparada para aislar el ARN celular total de acuerdo con el protocolo del fabricante (QIAamp RNA Blood Mini Kit, Qiagen). El ARNm extraído se transcribió en ADNc de acuerdo con protocolos publicados. Brevemente, se incubaron 10 µl de ARN precipitado con 1,2 µl de mezcla de hexanucleótidos 10x (Roche) a 70 °C durante 10 minutos y se almacenaron en hielo. Se añadió una mezcla de reacción que consistía en 4 µl de tampón Superscript II 5x, 0,2 µl de ditiotreitol 0,1 M, 0,8 µl de Superscript II (Invitrogen), 1,2 µl de desoxirribonucleósidos trifosfato (25 µM), 0,8 µl de inhibidor de RNasa (Roche) y 1,8 µl de agua sin DNasa y RNasa (Roth). La mezcla de reacción se incubó a temperatura ambiente durante 10 minutos seguido de incubación a 42 °C durante 50 minutos y después a 90 °C durante 5 minutos. La reacción se enfrió en hielo antes de añadir 0,8 µl de RNasaH (1 U/µl, Roche) y se incubó durante 20 minutos a 37 °C.
Se sometieron los ADNc de la primera hebra de cada especie a reacciones en cadena de la polimerasa de 35 ciclos por separado usando la polimerasa de ADN Taq (Sigma) y las siguientes combinaciones de cebadores diseñados de acuerdo con la búsqueda en bases de datos: cebador directo 5'-AGAGTTCTGGGCCTCTGC-3' (SEQ ID NO: 377); cebador inverso 5'-CGGATGGGCTCATAGTCTG-3' (SEQ ID NO: 378);. Las bandas amplificadas de 550 pb se purificaron en gel (kit de extracción en gel, Qiagen) y se secuenciaron (Sequiserve, Vaterstetten/Alemania, véase el listado de secuencias).
CD3épsilon de Callithrix jacchus
Nucleótidos
20 Aminoácidos
2. Generación de fragmentos de anticuerpo monocatenario (scFv) específico de especies cruzadas que se
unen a los aminoácidos 1-27 N-terminales de CD3épsilon humana y de diferentes primates distintos de chimpancé
2.1. Inmunización de ratones usando el extremo N-terminal de CD3épsilon separado de su contexto de CD3 nativo mediante fusión a una proteína soluble heteróloga
Se inmunizaron ratones F1 a partir de cruces balb/c x C57black de diez semanas de edad con la proteína de fusión CD3épsilon-Fc portadora de los aminoácidos 1-27 más próximos al extremo N-terminal de la cadena CD3épsilon madura (1-27 CD3-Fc) humana y/o de Saimiris sciureus. Con este fin, se inyectaron 40 µg por ratón de la proteína de fusión 1-27 CD3-Fc con 10 nmol de un CpG-oligonucleótido modificado con tioato (5'-tccatgacgttcctgatgct-3') en 300 μl de PBS por vía intraperitoneal. Los ratones reciben inmunizaciones de refuerzo después de 21, 42 y, opcionalmente, 63 días de la misma manera. Diez días después de la primera inmunización de refuerzo, se tomaron muestras de sangre y se probaron las valoraciones séricas de anticuerpo contra la proteína de fusión 1-27 CD3-Fc mediante ELISA. Adicionalmente, se probó la valoración contra la línea de linfocitos T positivos para CD3 humana HPBall en citometría de flujo de acuerdo con protocolos estándar. Las valoraciones séricas fueron significativamente más altas en animales inmunizados que en no inmunizados.
2.2. Generación de una colección inmunitaria de scFv de anticuerpos murinos: Construcción de una colección de anticuerpos combinatoria y presentación en fagos
Tres días después de la última inyección se recogieron las células de bazo murinas para la preparación de ARN total de acuerdo con protocolos estándar.
Se construyó una colección de fragmentos de ADN de región variable de cadena ligera (kappa) (VK) de inmunoglobulina (Ig) y de región variable de cadena pesada (VH) de Ig murinas por RT-PCR sobre ARN de bazo murino usando cebadores específicos de VK y VH. Se sintetizó ADNc de acuerdo con protocolos estándar.
Los cebadores se diseñaron de manera que dieran lugar a un sitio de reconocimiento 5'-Xhol y uno 3'-BstEII para los fragmentos V de cadena pesada amplificados y a un sitio de reconocimiento 5'-Sacl y uno 3'-Spel para fragmentos de ADN VK amplificados.
Para la amplificación por PCR de los fragmentos de ADN VH se combinaron cada uno de ocho cebadores específicos de la familia 5'-VH diferentes (MVH1(GC)AG GTG CAG CTC GAG GAG TCA GGA CCT; MVH2 GAG GTC CAG CTC GAG CAG TCT GGA CCT; MVH3 CAG GTC CAA CTC GAG CAG CCT GGG GCT; MVH4 GAG GTT CAG CTC GAG CAG TCT GGG GCA; MVH5 GA(AG) GTG AAG CTC GAG GAG TCT GGA GGA; MVH6 GAG GTG AAG CTT CTC GAG TCT GGA GGT; MVH7 GAA GTG AAG CTC GAG GAG TCT GGG GGA; MVH8 GAG GTT CAG CTC GAG CAG TCT GGA GCT) con un cebador de 3'-VH (3'MuVHBstEII tga gga gac ggt gac cgt ggt ccc ttg gcc cca g); para la amplificación por PCR de los fragmentos de cadena VK se combinaron cada uno de siete cebadores específicos de la familia 5'-VK diferentes (MUVK1 CCA GTT CCG AGC TCG TTG TGA CTC AGG AAT CT; MUVK2 CCA GTT CCG AGC TCG TGT TGA CGC AGC CGC CC; MUVK3 CCA GTT CCG AGC TCG TGC TCA CCC AGT CTC CA; MUVK4 CCA GTT CCG AGC TCC AGA TGA CCC AGT CTC CA; MUVK5 CCA GAT GTG AGC TCG TGA TGA CCC AGA CTC CA; MUVK6 CCA GAT GTG AGC TCG TCA TGA CCC AGT CTC CA; MUVK7 CCA GTT CCG AGC TCG TGA TGA CAC AGT CTC CA) con un cebador de 3'-VK (3'MuVkHindlll/BsiW1 tgg tgc act agt cgt acg ttt gat etc aag ctt ggt ccc).
Se usó el programa de PCR siguiente para la amplificación: desnaturalización a 94 °C durante 20 s; alineación de cebadores a 52 °C durante 50 s y extensión de cebadores a 72 °C durante 60 s y 40 ciclos, seguido de una extensión final de 10 minutos a 72 °C.
Se ligaron 450 ng de los fragmentos de cadena ligera kappa (digeridos con Sacl-Spel) con 1400 ng del fagémido pComb3H5Bhis (digerido con Sacl-Spel; fragmento grande). La colección de anticuerpos combinatoria resultante se transformó después en 300 ul de células de Escherichia coli XL1 Blue electrocompetentes por electroporación (2,5 kV, cubeta de 0,2 cm de paso, 25 uFD, 200 Ohm, Biorad gen-pulser) dando lugar a un tamaño de colección de más de 107 clones independientes. Después de una hora de expresión del fenotipo, se seleccionaron los transformantes positivos por su resistencia a carbenicilina codificada por el vector pComb3H5BHis en 100 ml cultivo en super broth líquido (SB) durante la noche. Después, se recogieron las células por centrifugación y se llevó a cabo la preparación de plásmidos usando un kit de preparación de plásmidos comercialmente disponible (Qiagen).
Se ligaron 2800 ng de este ADN plasmídico que contenía la colección VK (digerido con Xhol-BstEII; fragmento grande) con 900 ng de los fragmentos V de cadena pesada (digeridos con Xhol-BstEII) y se transformaron de nuevo en dos alícuotas de 300 ul de células de E. coli XL1 Blue electrocompetentes por electroporación (2,5 kV, cubeta de 0,2 cm de paso, 25 uFD, 200 Ohm) dando lugar a un tamaño total de colección de scFv VH-VK (fragmento variable monocatenario) de más de 107 clones independientes.
Después de la expresión del fenotipo y la adaptación lenta a la carbenicilina, se transfirieron las células de E. coli que contenían la colección de anticuerpos a medio de selección SB-carbenicilina (50 ug/ml). Después, se infectaron las células de E. coli que contenían la colección de anticuerpos con una dosis infecciosa de 1012 partículas de fago colaborador VCSM13, dando lugar a la producción y secreción de fago filamentoso M13, en el que la partícula de fago contiene ADN de pComb3H5BHis monocatenario que codifica un fragmento scFv murino y que presentaba la proteína scFv correspondiente como una fusión traduccional a la proteína de cubierta III del fago. Este conjunto de fagos que presentaban la colección de anticuerpos se usó posteriormente para la selección de entidades de unión a antígeno.
2.3. Selección de agentes de unión específicos de CD3 basada en presentación en fagos
Se recogió la colección de fagos portadores del repertorio de scFv clonado del correspondiente sobrenadante de cultivo mediante precipitación con PEG8000/NaCI y centrifugación. Se resuspendieron de aproximadamente 1011 a 1012 partículas scFv de fagos en 0,4 ml de PBS/BSA al 0,1 % y se incubaron con de 105 a 107 células Jurkat (una línea de linfocitos T positivos para CD3 humana) durante 1 hora en hielo con agitación lenta. Estas células Jurkat se hicieron crecer previamente en medio RPMI enriquecido con suero bovino fetal (al 10 %), glutamina y penicilina/estreptomicina, se recogieron por centrifugación, se lavaron en PBS y se resuspendieron en PBS/FCS al 1 % (que contenía azida de Na). Los fagos scFv que no se unieron específicamente a las células Jurkat se eliminaron mediante hasta cinco etapas de lavado con PBS/FCS al 1 % (que contenía azida de Na). Después del lavado, se eluyeron entidades de unión de las células resuspendiendo las células en HCI-glicina a pH 2,2 (10 min de incubación con agitación en vórtex posterior) y, tras la neutralización con Tris 2 M a pH 12, se usó el eluato para la infección de un cultivo recién preparado de células de E. coli XL1 Blue no infectadas (DO600 > 0,5). El cultivo de E. coli contenía células de E. coli transducidas exitosamente con una copia de fagémido, que codifica un fragmento scFv humano; se seleccionaron de nuevo por su resistencia a carbenicilina y se infectaron posteriormente con el fago colaborador VCMS 13 para iniciar el segundo ciclo de presentación de anticuerpos y selección in vitro. Normalmente, se llevaron a cabo un total de 4 a 5 ciclos de selección.
2.4. Rastreo de agentes de unión específicos de CD3
Se aisló ADN plasmídico correspondiente a 4 y 5 ciclos de fijación a partir de cultivos de E. coli después de la selección. Para la producción de proteína scFv soluble, se escindieron fragmentos de ADN VH-VL de los plásmidos (Xhol-Spel). Estos fragmentos se clonaron por medio de los mismos sitios de restricción en el plásmido pComb3H5BFlag/His que difería del pComb3H5BHis original en que la construcción de expresión (p. ej., scFv) incluye una marca Flag (TGD YKDDDDK) entre el scFv y la marca His6 y las proteínas de fago adicionales se eliminaron. Después de la ligación, se transformó cada conjunto (distintos ciclos de fijación) de ADN plasmídico en 100 µl de E. coli TG1 o XLI Blue competentes para choque térmico y se plaquearon sobre LB-agar con carbenicilina. Se tomaron colonias individuales en 100 ul de LB carb (50 ug/ml).
Las E. coli transformadas con pComb3H5BHis que contenían un segmento VL y VH producen scFv soluble en cantidades suficientes después de la escisión del fragmento del gen III y la inducción con IPTG 1 mM. Debido a una secuencia señal adecuada, se exportó la cadena scFv al periplasma, donde se pliega en una conformación funcional.
Se tomaron colonias individuales bacterianas de E. coli TG1 de las placas de transformación para preparaciones periplásmicas a pequeña escala y se hicieron crecer en medio SB (p. ej., 10 ml) suplementado con MgCl2 20 mM y 50 µg/ml de carbenicilina (y se redisolvieron en PBS (p. ej., 1 ml) después de recogerlas. Mediante cuatro ciclos de congelación a -70 °C y descongelación a 37 °C, se destruyó la membrana externa de las bacterias por choque térmico y se liberaron las proteínas solubles periplásmicas, incluidos los scFv, al sobrenadante. Después de la eliminación de las células intactas y los residuos celulares por centrifugación, se recogió el sobrenadante que contenía los scFv humanos anti-CD3 humana y se usó para examinarlo adicionalmente.
2.5. Identificación de agentes de unión específicos de CD3
La unión de los scFv aislados se probó mediante citometría de flujo en células eucariotas, que en su superficie expresan una proteína heteróloga que presenta en su extremo N-terminal los primeros 27 aminoácidos N-terminales de CD3épsilon.
Como se describe en el ejemplo 4, los primeros aminoácidos 1-27 de la secuencia N-terminal de la cadena CD3 épsilon madura del complejo receptor de linfocitos T humanos (secuencia de aminoácidos: QDGNEEMGGITQTPYKVSISGTTVILT) se fusionaron al extremo N-terminal de la proteína transmembranaria EpCAM de forma que el extremo N-terminal se situó en la superficie exterior de la célula. Adicionalmente, se insertó un epítopo FLAG entre la secuencia 1-27 N-terminal de CD3épsilon y la secuencia de EpCAM. Este producto de fusión se expresó en células de riñón embrionario humano (HEK) y de ovario de hámster chino (CHO).
Se prepararon de la misma manera células eucariotas que presentaban los 27 aminoácidos más próximos al extremo N-terminal de CD3épsilon madura de otras especies de primates para Saimiri sciureus (mono ardilla) (secuencia de aminoácidos N-terminal de CD3épsilon: QDGNEEIGDTTQNPYKVSISGTTVTLT), para Callithrix jacchus (secuencia de aminoácidos N-terminal de CD3épsilon: QDGNEEMGDTTQNPYKVSISGTTVTLT) y para Saguinus oedipus (secuencia de aminoácidos N-terminal de CD3épsilon: QDGNEEMGDTTQNPYKVSISGTTVTLT).
Por citometría de flujo se incuban 2,5x105 células con 50 ul de sobrenadante o con 5 µg/ml de las construcciones purificadas en 50 µl de PBS con FCS al 2 %. Se detectó la unión de las construcciones con un anticuerpo anti-His (anticuerpo Penta-His, sin BSA, Qiagen GmbH, Hilden, RFA) a 2 µg/ml en 50 µl de PBS con FCS al 2 %. Como reactivo de segunda etapa se usó un fragmento F(ab')2 purificado por afinidad conjugado con R-ficoeritrina de IgG de cabra anti-ratón (específico de fragmento Fc-gamma), diluido 1:100 en 50 µl de PBS con FCS al 2 % (Dianova, Hamburgo, RFA). Las muestras se midieron en un FACSscan (BD biosciences, Heidelberg, RFA).
La unión se confirmó siempre por citometría de flujo como se describe en el párrafo anterior en linfocitos T primarios humanos y de diferentes primates (p. ej., Saimiris sciureus, Callithrix jacchus, Saguinus oedipus).
2.6. Generación de equivalentes humanos/humanizados de scFv específicos de CD3épsilon no humanas
Se alineó la región VH del scFv anti-CD3 murino contra secuencias de aminoácidos de línea germinal de anticuerpos humanos. Se escogió la secuencia VH de línea germinal de anticuerpos humanos que tenía la mayor homología con la VH no humana y se realizó una alineación directa de las dos secuencias de aminoácidos. Se observaron una serie de residuos estructurales de la VH no humana que diferían de las regiones estructurales de la VH humana ("diferentes posiciones estructurales"). Algunos de estos residuos pueden contribuir a la unión y la actividad del anticuerpo frente a su objetivo.
Para construir una colección que contiene las CDR murinas y, en cada posición estructural que difiere de la secuencia de VH humana elegida, ambas posibilidades (el residuo de aminoácido humano y murino materno), se sintetizaron oligonucleótidos degenerados. Estos oligonucleótidos incorporan en las posiciones que difieren el residuo humano con una probabilidad de 75 % y el residuo murino con una probabilidad del 25 %. Para una VH humana, p. ej., se tuvieron que sintetizar seis de estos oligonucleótidos que solapaban en un tramo final de aproximadamente 20 nucleótidos. Con este fin cada segundo cebador era un cebador antisentido. Se eliminaron los sitios de restricción necesarios para la clonación posterior del interior de los oligonucleótidos.
Estos cebadores pueden tener una longitud de 60 a 90 nucleótidos, en función del número de cebadores que se necesitaran para abarcar toda la secuencia V.
Estos seis cebadores, p. ej., se mezclaron en cantidades iguales (p. ej., 1 µl de cada cebador (soluciones madre de cebador de 20 a 100 µM) a una reacción de PCR de 20 µl) y se añadieron a una mezcla de PCR que consistía en tampón de PCR, nucleótidos y polimerasa Taq. Esta mezcla se incubó a 94 °C durante 3 minutos, a 65 °C durante 1 minuto, a 62 °C durante 1 minuto, a 59 °C durante 1 minuto, a 56 °C durante 1 minuto, a 52 °C durante 1 minuto, a 50 °C durante 1 minuto y a 72 °C durante 10 minutos en un ciclador de PCR. Posteriormente se hizo correr el producto en una electroforesis en gel de agarosa y se aisló el producto de un tamaño de 200 a 400 a partir del gel de acuerdo con procedimientos estándar.
Este producto de PCR se usó después como molde para una reacción de PCR estándar usando cebadores que incorporan sitios de restricción para clonación N-terminales y C-terminales adecuados. El fragmento de ADN del tamaño correcto (para una VH, aproximadamente 350 nucleótidos) se aisló mediante electroforesis en gel de agarosa de acuerdo con procedimientos estándar. De este modo, se amplificó suficiente fragmento de ADN de VH. Este fragmento de VH era en ese momento un conjunto de fragmentos de VH, cada uno con una cantidad diferente de residuos humanos y murinos en las correspondientes posiciones estructurales (conjunto de VH humanizadas). Se realizó el mismo procedimiento para la región VL de los scFv murinos anti-CD3 (conjunto de VL humanizadas).
El conjunto de VH humanizadas se combinó después con el conjunto de VL humanizadas en el vector de presentación en fagos pComb3H5Bhis para formar una colección de scFv funcionales a partir de la cual, después de la presentación en fagos filamentosos, se seleccionaron, rastrearon, identificaron y confirmaron agentes de unión anti-CD3 como se describe anteriormente para los scFv anti-CD3 no humanos (murinos) originales. Después, se analizaron clones individuales para detectar propiedades y secuencias de aminoácidos favorables. Se prefieren aquellos scFv que se encontraban más próximos en homología de secuencia de aminoácidos a los segmentos V de línea germinal humana, particularmente aquellos en los que al menos una CDR entre las CDR I y II de VH y las CDR I y II de VLkappa o las CDR I y II de VLIambda muestra más del 80 % de identidad de secuencia de aminoácidos con la CDR más próxima correspondiente de todos los segmentos V de línea germinal humana. Se convirtieron los scFv anti-CD3 en anticuerpos monocatenarios biespecíficos recombinantes como se describe en los ejemplos 10 y 16 siguientes y se caracterizaron adicionalmente.
3. Generación de una proteína de fusión recombinante de los aminoácidos 1-27 N-terminales de la cadena CD3 épsilon humana fusionados con la porción Fc de una lgG1 (1-27 CD3-Fc).
3.1. Clonación y expresión de 1-27 CD3-Fc
La secuencia codificante de los aminoácidos 1-27 N-terminales de la cadena CD3 épsilon humana fusionados a la región bisagra y la Fc gamma de la inmunoglobulina humana lgG1, así como una marca de 6 histidinas, se obtuvieron mediante síntesis génica de acuerdo con protocolos estándar (la secuencia de ADNc y la secuencia de aminoácidos de la proteína de fusión recombinante se enumeran en las SEQ ID NO: 350 y 349). El fragmento de síntesis génica se diseñó para que contuviera un primer sitio de Kozak para la expresión eucariota de la construcción, seguido por un péptido líder de inmunoglobulina de 19 aminoácidos, seguido en fase por la secuencia codificante de los primeros 27 aminoácidos de la porción extracelular de la cadena CD3 épsilon humana madura, seguida en fase por la secuencia codificante de la región bisagra y la porción Fc gamma de la lgG1 humana, seguida en fase por la secuencia codificante de una marca de 6 histidinas y un codón de detención (figura 1). El fragmento de síntesis génica también se diseñó para introducir sitios de restricción al principio y al final del ADNc que codifica la proteína de fusión. Los sitios de restricción introducidos, EcoRI en el extremo 5' y SalI en el extremo 3', se utilizan en los procedimientos de clonación siguientes. El fragmento de síntesis génica se clonó a través de EcoRI y SalI en un plásmido denominado pEF-DHFR (pEF-DHFR se describe en Mack et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 (1995) 7021-7025) siguiendo protocolos estándar. Se usó un plásmido de secuencia comprobada para la transfección en el sistema de expresión Freestyle 293 (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, Alemania) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Después de 3 días se recogieron los sobrenadantes de cultivo celular de los transfectantes y se probó la presencia de la construcción recombinante en un ensayo ELISA. Se diluyó un anticuerpo de cabra anti-IgG humana específico de fragmento Fc-gamma (obtenido de Jackson ImmunoResearch Europe Ltd., Newmarket, Suffolk, RU) en PBS hasta 5 µg/ml y se recubrió con 100 µl por pocillo en una placa de ELISA de 96 pocillos MaxiSorp (Nunc GmbH y Co. KG, Wiesbaden, Alemania) durante la noche a 4 °C. Se lavaron los pocillos con PBS con Tween 20 al 0,05 % (PBS/Tween y se bloquearon con BSA en PBS al 3 % (albúmina bovina, fracción V, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Alemania) durante 60 minutos a temperatura ambiente (TA). Posteriormente, se lavaron los pocillos de nuevo con PBS/Tween y después se incubaron con sobrenadantes de cultivo celular durante 60 minutos a TA. Después del lavado, se incubaron los pocillos con un anticuerpo anti-His6 conjugado con peroxidasa (Roche Diagnostics GmbH, Roche Applied Science, Mannheim, Alemania) diluido 1:500 en PBS con BSA al 1 % durante 60 minutos a TA. Posteriormente, se lavaron los pocillos con 200 µl de PBS/Tween y se añadieron 100 µl de OPD SIGMAFAST (solución de sustrato de OPD [diclorhidrato de o-fenilendiamina] SIGMAFAST (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Alemania) de acuerdo con el protocolo del fabricante. La reacción se detuvo mediante la adición de 100 µl de H2SO4 1 M. Se midió la reacción de color en un espectrofotómetro para microplacas PowerWaveX (BioTek Instruments, Inc., Winooski, Vermont, EE. UU.) a 490 nm y restando la absorción de fondo a 620 nm. Como se muestra en la figura 2, la presencia de la construcción en comparación con el sobrenadante no pertinente de células HEK 293 con transfección simulada usadas como control negativo era claramente detectable.
3.2. Ensayo de unión de anticuerpos monocatenarios específicos de especies cruzadas a 1-27 CD3-Fc.
Se probó la unión de preparaciones en bruto de anticuerpos monocatenarios específicos de especies cruzadas expresados en el periplasma específicos para CD3 épsilon a 1-27 CD3-Fc en un ensayo ELISA. Se diluyó un anticuerpo de cabra anti-IgG humana específico de fragmento Fc-gamma (Jackson ImmunoResearch Europe Ltd., Newmarket, Suffolk, RU) en PBS hasta 5 µg/ml y se recubrió con 100 µl por pocillo en una placa de ELISA de 96 pocillos MaxiSorp (Nunc GmbH y Co. KG, Wiesbaden, Alemania) durante la noche a 4 °C. Se lavaron los pocillos con PBS con Tween 20 al 0,05 % (PBS/Tween y se bloquearon con PBS con BSA al 3 % (albúmina bovina, fracción V, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Alemania) durante 60 minutos a TA. Posteriormente, se lavaron los pocillos con PBS/Tween y se incubaron con sobrenadantes de células que expresaban la construcción de 1-27 CD3-Fc durante 60 minutos a TA. Se lavaron los pocillos con PBS/Tween y se incubaron con preparaciones en bruto de anticuerpos monocatenarios específicos de especies cruzadas expresados en el periplasma descritos anteriormente durante 60 minutos a temperatura ambiente. Después del lavado con PBS/Tween, se incubaron los pocillos con anticuerpo anti-Flag M2 conjugado con peroxidasa (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Alemania) diluido 1:100 en PBS con BSA al 1 % durante 60 minutos a TA. Se lavaron los pocillos con PBS/Tween y se incubaron con 100 µl de OPD SIGMAFAST (solución de sustrato de OPD [diclorhidrato de o-fenilendiamina] (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Alemania) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Se detuvo la reacción de color con 100 µl de H2SO4 1 M y se midió en un espectrofotómetro para microplacas PowerWaveX (BioTek Instruments, Inc., Winooski, Vermont, EE. UU.) a 490 nm y restando la absorción de fondo a 620 nm. Se observó una unión fuerte anticuerpos monocatenarios humanos específicos de especies cruzadas específicos de CD3 épsilon a la construcción de 1-27 CD3-Fc en comparación con un anticuerpo monocatenario anti-CD3 murino (figura 3).
4. Generación de proteínas de fusión transmembranarias recombinantes de los aminoácidos 1-27 Nterminales de CD3 épsilon de diferentes primates distintos de chimpancé fusionados a EpCAM de mono cynomolgus (1-27 CD3-EpCAM).
4.1. Clonación y expresión de 1-27 CD3-EpCAM
Se aisló la CD3 épsilon de diferentes primates distintos de chimpancé (tití, tamarino, mono ardilla) y de cerdo. Las secuencias codificantes de los aminoácidos 1-27 N-terminales de la cadena CD3 épsilon humana madura, de tití común (Callithrix jacchus), de tamarino cabeza de algodón (Saguinus oedipus), de mono ardilla común (Saimiri sciureus) y de cerdo doméstico (Sus scrofa; usado como control negativo) fusionadas al extremo N-terminal de EpCAM de cynomolgus marcada con Flag se obtuvieron mediante síntesis génica de acuerdo con protocolos estándar. La secuencia de ADNc y la secuencia de aminoácidos de las proteínas de fusión recombinantes se enumeran en las SEQ ID NO: 351 a 360). Los fragmentos de síntesis génica se diseñaron para que contuvieran en primer lugar un sitio BsrGI para permitir la fusión en el marco de lectura correcto con la secuencia codificante de un péptido líder de inmunoglobulina de 19 aminoácidos ya presente en el vector de expresión objetivo, que va seguido en fase por la secuencia codificante de los aminoácidos 1-27 N-terminales de la porción extracelular de las cadenas CD3 épsilon maduras, que va seguida en fase por la secuencia codificante de una marca Flag y seguida en fase por la secuencia codificante de la proteína EpCAM transmembranaria de cynomolgus madura (figura 4). Los fragmentos de síntesis génica también se diseñaron para introducir un sitio de restricción al final del ADNc que codifica la proteína de fusión. Los sitios de restricción introducidos, BsrGI en el extremo 5' y SalI en el extremo 3', se utilizaron en los procedimientos de clonación siguientes. Los fragmentos de síntesis génica se clonaron después a través de BsrGI y SalI en un derivado del plásmido denominado pEF DHFR (pEF-DHFR se describe en Mack et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 (1995) 7021-7025), que ya contenía la secuencia codificante del péptido líder de inmunoglobulina de 19 aminoácidos siguiendo protocolos estándar. Se usaron plásmidos de secuencia comprobada para transfectar de forma transitoria células HEK-293 usando el reactivo MATra-A (IBA GmbH, Gottingen, Alemania) y 12 µg de ADN plasmídico para células HEK-293 adherentes en matraces de cultivo celular de 175 ml de acuerdo con el protocolo del fabricante. Después de 3 días de cultivo celular, se probaron los transfectantes para determinar la expresión en la superficie celular de la proteína transmembranaria recombinante por medio de un ensayo de FACS de acuerdo con protocolos estándar. Para ese propósito, se incubó una cantidad de 2,5x105 células con el anticuerpo anti-Flag M2 (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Alemania) a 5 µg/ml en PBS con FCS al 2 %. Se detectó el anticuerpo unido con un fragmento F(ab')2 purificado por afinidad conjugado con R-ficoeritrina de IgG de cabra antiratón específica de fragmento Fc-gamma, diluido 1:100 en PBS con FCS al 2 % (Jackson ImmunoResearch Europe Ltd., Newmarket, Suffolk, RU). Las muestras se midieron en un FACScalibur (BD biosciences, Heidelberg, Alemania). La expresión de las proteínas de fusión transmembranarias recombinantes marcadas con Flag que consistían en EpCAM de cynomolgus y los aminoácidos 1-27 N-terminales de la cadena CD3 épsilon humana, de tití, de tamarino, de mono ardilla y de cerdo, respectivamente, en células transfectadas era claramente detectable (figura 5).
4.2. Unión de anticuerpos monocatenarios anti-CD3 específicos de especies cruzadas a la 1-27 CD3-EpCAM.
Se probó la unión de preparaciones en bruto de anticuerpos monocatenarios anti-CD3 específicos de especies cruzadas expresados en el periplasma a los aminoácidos 1-27 N-terminales de las cadenas CD3 épsilon humana, de tití, de tamarino y de mono ardilla, respectivamente fusionados con EpCAM de cynomolgus en un ensayo de FACS de acuerdo con protocolos estándar. Para ese propósito, se incubó una cantidad de 2,5x105 células con preparaciones en bruto de anticuerpos monocatenarios anti-CD3 específicos de especies cruzadas expresados en el periplasma (la preparación se realizó como se describe anteriormente y de acuerdo con protocolos estándar) y un anticuerpo monocatenario murino anti-CD3 humana como control negativo. Como anticuerpo secundario se usó el anticuerpo Penta-His (Qiagen GmbH, Hildesheim, Alemania) a 5 µg/ml en 50 µl de PBS con FCS al 2 %. Se detectó la unión del anticuerpo con un fragmento F(ab')2 purificado por afinidad conjugado con R-ficoeritrina de IgG de cabra anti-ratón específica de fragmento Fc-gamma, diluido 1:100 en PBS con FCS al 2 % (Jackson ImmunoResearch Europe Ltd., Newmarket, Suffolk, RU). Las muestras se midieron en un FACScalibur (BD biosciences, Heidelberg, Alemania). Como se muestra en las figuras 6 (A a E), se observó unión de anticuerpos monocatenarios a los transfectantes que expresaban las proteínas de fusión transmembranarias recombinantes que consistían en los aminoácidos 1-27 N-terminales de CD3 épsilon humana, de tití, de tamarino o de mono ardilla fusionados a EpCAM de cynomolgus. No se observó unión de anticuerpos monocatenarios específicos de especies cruzadas a una proteína de fusión que consistía en los aminoácidos 1-27 N-terminales de CD3 épsilon de cerdo fusionados a EpCAM de cynomolgus usada como control negativo. Se mostró la especificidad de especies cruzadas multiprimate de los anticuerpos monocatenarios anti-CD3. Las señales obtenidas con el anticuerpo anti-Flag M2 y los anticuerpos monocatenarios específicos de especies cruzadas eran comparables, lo que indica una fuerte actividad de unión de los anticuerpos monocatenarios específicos de especies cruzadas a los aminoácidos 1-27 Nterminales de CD3 épsilon.
5. Análisis de unión de anticuerpos monocatenarios anti-CD3 específicos de especies cruzadas mediante barrido de alanina de células de ratón transfectadas con la cadena CD3 épsilon humana y sus mutantes de alanina
5.1. Clonación y expresión de CD3 épsilon humana natural
Se obtuvo la secuencia codificante de la cadena CD3 épsilon humana mediante síntesis génica de acuerdo con protocolos estándar (la secuencia de ADNc y la secuencia de aminoácidos de la cadena CD3 épsilon humana se enumeran en las SEQ ID NO. 362 y 361). El fragmento de síntesis génica se diseñó para que contuviera un sitio de Kozak para la expresión eucariota de la construcción y sitios de restricción al principio y al final del ADNc que codifica la CD3 épsilon humana. Los sitios de restricción introducidos, EcoRI en el extremo 5' y SalI en el extremo 3', se utilizaron en los procedimientos de clonación siguientes. El fragmento de síntesis génica se clonó después por medio de EcoRI y SalI en un plásmido denominado pEF NEO siguiendo protocolos estándar. pEF NEO se derivó de pEF DHFR (Mack et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 (1995) 7021-7025) reemplazando el ADNc del DHFR con el ADNc de la resistencia a neomicina por clonación molecular convencional. Se usó un plásmido de secuencia comprobada para transfectar la línea de linfocitos T murina EL4 (N.º de la ATCC TIB-39) cultivada en RPMI con Lglutamina estabilizada suplementado con FCS al 10 %, penicilina/estreptomicina al 1 % HEPES al 1 %, piruvato al 1 %, aminoácidos no esenciales al 1 % (todos de Biochrom AG, Berlín, Alemania) a 37 °C, 95 % de humedad y 7 % de CO2. La transfección se realizó con el reactivo de transfección SuperFect (Qiagen GmbH, Hilden, Alemania) y 2 µg de ADN plasmídico de acuerdo con el protocolo del fabricante. Después de 24 horas, se lavaron las células con PBS y se cultivaron de nuevo en el medio de cultivo celular mencionado anteriormente con 600 µg/ml de G418 para selección (PAA Laboratories GmbH, Pasching, Austria). De 16 a 20 días después de la transfección, se observó el crecimiento de células resistentes. Después de otros 7 a 14 días se probaron las células para determinar la expresión de CD3 épsilon humana por análisis de FACS de acuerdo con protocolos estándar. Se incubaron 2,5x105 células con anticuerpo anti-CD3 humana UCHT-1 (BD biosciences, Heidelberg, Alemania) a 5 µg/ml en PBS con FCS al 2 %. Se detectó la unión del anticuerpo con un fragmento F(ab')2 purificado por afinidad conjugado con Rficoeritrina de IgG de cabra anti-ratón específica de fragmento Fc-gamma, diluido 1:100 en PBS con FCS al 2 % (Jackson ImmunoResearch Europe Ltd., Newmarket, Suffolk, RU). Las muestras se midieron en un FACScalibur (BD biosciences, Heidelberg, Alemania). La expresión de CD3 humana natural en células EL4 transfectadas se muestra en la figura 7.
5.2. Clonación y expresión de los anticuerpos monocatenarios anti-CD3 específicos de especies cruzadas como anticuerpos lgG1
Con el fin de proporcionar mejores medios de detección de la unión de los anticuerpos anti-CD3 monocatenarios específicos de especies cruzadas H2C HLP, A2J HLP y E2M HLP, se convirtieron en anticuerpos lgG1 con lgG1 murina y regiones constantes lambda humanas. Se obtuvieron las secuencias de ADNc que codifican las cadenas pesada y ligera de los anticuerpos IgG correspondientes mediante síntesis génica de acuerdo con protocolos estándar. Los fragmentos de síntesis génica para cada especificidad se diseñaron para que contuvieran en primer lugar un sitio de Kozak para permitir la expresión eucariota de la construcción, que va seguido por un péptido líder de inmunoglobulina de 19 aminoácidos (SEQ ID NO: 364 y 363), que va seguido en fase por la secuencia codificante de la correspondiente región variable de cadena pesada o la correspondiente región variable de cadena ligera, seguida en fase por la secuencia codificante de la región constante de cadena pesada de IgG1 murina (SEQ ID N.º 366 y 365) o la secuencia codificante de la región constante de cadena ligera lambda humana (SEQ ID N.º 368 y 367), respectivamente. Se introdujeron sitios de restricción al principio y al final del ADNc que codifica la proteína de fusión. Los sitios de restricción introducidos, EcoRI en el extremo 5' y SalI en el extremo 3', se usaron en los procedimientos de clonación siguientes. Los fragmentos de síntesis génica se clonaron mediante EcoRI y SalI en un plásmido denominado pEF DHFR (Mack et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 (1995) 7021-7025) para las construcciones de cadena pesada y pEF ADA (pEF ADA se describe en Raum et al., Cancer Immunol lmmunother., 50(3), (2001), 141-50) para las construcciones de cadena ligera) de acuerdo con protocolos estándar. Se usaron plásmidos de secuencia comprobada para la cotransfección de las correspondientes construcciones de cadena ligera y cadena pesada en el sistema de expresión Freestyle 293 (invitrogen GmbH, Karlsruhe, Alemania) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Después de 3 días, se recogieron los sobrenadantes de cultivo celular de los transfectantes y se usaron para el experimento de barrido de alanina.
5.3. Clonación y expresión de mutantes de alanina de CD3 épsilon humana para barrido de alanina
Se obtuvieron por síntesis génica 27 fragmentos de ADNc que codifica la cadena CD3 épsilon humana con un intercambio de un codón de la secuencia natural de CD3 épsilon humana por un codón que codifica alanina (GCC) para cada aminoácido de los aminoácidos 1-27 del dominio extracelular de la cadena CD3 épsilon humana madura, respectivamente. Excepto por el codón intercambiado, los fragmentos de ADNc eran idénticos al fragmento de ADNc de CD3 humana natural mencionado anteriormente. Sólo se reemplazó un codón en cada construcción en comparación con el fragmento de ADNc de CD3 humana natural descrito anteriormente. Se introdujeron los sitios de restricción EcoRI y SalI en los fragmentos de ADNc en posiciones idénticas en comparación con la construcción natural. Se clonaron todas las construcciones de barrido de alanina en pEF NEO y se transfectaron plásmidos de secuencia comprobada en células EL4. La transfección y la selección de los transfectantes se realizó como se describe anteriormente. Como resultado, se obtuvo un grupo de construcciones expresadas en las que el primer aminoácido de la cadena CD3 épsilon humana, glutamina (Q, Gln) en la posición 1, se reemplazó con alanina. El último aminoácido reemplazado con alanina fue la treonina (T, Thr) en la posición 27 de la CD3 épsilon humana natural madura. Para cada aminoácido entre la glutamina 1 y la treonina 27, se generaron los transfectantes correspondientes con un intercambio del aminoácido natural por alanina.
5.4. Experimento de barrido de alanina
Se probaron anticuerpos IgG quiméricos descritos en 2) y anticuerpos monocatenarios específicos de especies cruzadas específicos para CD3 épsilon en un experimento de barrido de alanina. La unión de los anticuerpos a las líneas celulares EL4 transfectadas con las construcciones mutantes de alanina de CD3 épsilon humana descritas en 3) se probó mediante un ensayo de FACS de acuerdo con protocolos estándar. Se incubaron 2,5x105 células de los transfectantes correspondientes con 50 µl de sobrenadante de cultivo celular que contenía los anticuerpos IgG quiméricos o con 50 µl de preparaciones en bruto de anticuerpos monocatenarios expresados en el periplasma. Para las muestras incubadas con preparaciones en bruto de anticuerpos monocatenarios expresados en el periplasma se usó como anticuerpo secundario el anticuerpo anti-Flag M2 (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Alemania) a 5 µg/ml en 50 µl de PBS con FCS al 2 %. Para las muestras incubadas con los anticuerpos IgG quiméricos no fue necesario un anticuerpo secundario. Para todas las muestras, se detectó la unión de las moléculas de anticuerpo con un fragmento F(ab')2 purificado por afinidad conjugado con R-ficoeritrina de IgG de cabra anti-ratón específica de fragmento Fc-gamma, diluido 1:100 en PBS con FCS al 2 % (Jackson ImmunoResearch Europe Ltd., Newmarket, Suffolk, RU). Las muestras se midieron en un FACSCalibur (BD biosciences, Heidelberg, Alemania). Se detectó la unión diferencial de las moléculas de IgG quiméricas o los anticuerpos monocatenarios específicos de especies cruzadas a las líneas celulares EL4 transfectadas con
mutantes de alanina de CD3 épsilon humana. Como control negativo se usaron, respectivamente, un control de isotipo o una preparación en bruto de un anticuerpo monocatenario expresado en el periplasma de especificidad no pertinente. Se usó anticuerpo UCHT-1 como control positivo para el nivel de expresión de los mutantes de alanina de CD3 épsilon humana. Las líneas celulares EL4 transfectadas con los mutantes de alanina para los aminoácidos tirosina en la posición 15, valina en la posición 17, isoleucina en la posición 19, valina en la posición 24 o leucina en la posición 26 de la cadena CD3 épsilon madura no se evaluaron debido a niveles de expresión muy bajos (datos no mostrados). En la figura 8 (A-D) se muestra la unión de los anticuerpos monocatenarios específicos de especies cruzadas y los anticuerpos monocatenarios en formato IgG quimérica a las líneas celulares EL4 transfectadas con los mutantes de alanina de CD3 épsilon humana como unión relativa en unidades arbitrarias con la media geométrica de los valores de fluorescencia de los correspondientes controles negativos restada de todas las medias geométricas de los valores de fluorescencia de las muestras correspondientes. Para compensar los diferentes niveles de expresión, después se dividieron todos los valores de las muestras para un transfectante determinado entre la media geométrica del valor de fluorescencia del anticuerpo UCHT-1 para el transfectante correspondiente. Para la comparación con el valor de la muestra natural de una especificidad, finalmente se dividieron todos los valores de las muestras de las especificidades correspondientes entre el valor de la muestra natural, fijando de este modo el valor de la muestra natural en 1 unidad arbitraria de unión.
Los cálculos usados se muestran con detalle en la fórmula siguiente:
Muestra(x,y) - Contr._neg(x)
valor_muestra(x,y) = WT(y) - Contr._neg(wt)
(UCHT - 1(x) - Contr._neg(x))*
UCHT - 1(wt) - Contr._neg(wt)
En esta ecuación valor_muestra significa el valor en unidades arbitrarias de unión que representa el grado de unión de un anticuerpo anti-CD3 específico a un mutante de alanina específico mostrado en la figura 8 (A-D), Muestra significa la media geométrica del valor de fluorescencia obtenido para un anticuerpo anti-CD3 específico ensayado en un transfectante de barrido de alanina específico, Contr._neg significa la media geométrica del valor de fluorescencia obtenido para el control negativo ensayado en un mutante de alanina específico, UCTH-1 significa la media geométrica del valor de fluorescencia obtenido para el anticuerpo UCHT-1 ensayado en un mutante de alanina específico, WT significa la media geométrica del valor de fluorescencia obtenido para un anticuerpo anti-CD3 específico ensayado en el transfectante natural, x especifica el transfectante correspondiente, y especifica el anticuerpo anti-CD3 correspondiente y wt especifica que el transfectante correspondiente es el natural.
Como se puede observar en la figura 8 (A-D), el anticuerpo IgG A2J HLP mostró una pérdida de unión pronunciada para los aminoácidos asparagina en la posición 4, treonina en la posición 23 e isoleucina en la posición 25 de la cadena CD3 épsilon madura. Se observó una pérdida total de la unión del anticuerpo IgG A2J HLP para los aminoácidos glutamina en la posición 1, aspartato en la posición 2, glicina en la posición 3 y glutamato en la posición 5 de la cadena épsilon CD3 madura. El anticuerpo IgG E2M HLP mostró una pérdida de unión pronunciada para los aminoácidos asparagina en la posición 4, treonina en la posición 23 e isoleucina en la posición 25 de la cadena CD3 épsilon madura. El anticuerpo IgG E2M HLP mostró una pérdida total de unión para los aminoácidos glutamina en la posición 1, aspartato en la posición 2, glicina en la posición 3 y glutamato en la posición 5 de la cadena épsilon CD3 madura. El anticuerpo IgG H2C HLP mostró una pérdida de unión intermedia para el aminoácido asparagina en la posición 4 de la cadena épsilon CD3 madura y mostró una pérdida total de la unión para los aminoácidos glutamina en la posición 1, aspartato en la posición 2, glicina en posición 3 y glutamato en la posición 5 de la cadena épsilon CD3 madura. El anticuerpo monocatenario F12Q HLP mostró una pérdida de unión esencialmente total para los aminoácidos glutamina en la posición 1, aspartato en la posición 2, glicina en la posición 3 de la cadena épsilon CD3 madura y glutamato en la posición 5 de la cadena CD3 épsilon madura.
6. Análisis de unión de la molécula de unión anti-CD3 específica de especies cruzadas H2C HLP a la cadena CD3 épsilon humana con y sin marca His6 N-terminal transfectada en la línea de linfocitos T murina EL4.
6.1. Clonación y expresión de la cadena CD3 épsilon humana con marca de seis histidinas (marca His6) Nterminal
Se obtuvo un fragmento de ADNc que codifica la cadena CD3 épsilon humana con una marca His6 N-terminal mediante síntesis génica. El fragmento de síntesis génica se diseñó para que contuviera en primer lugar un sitio de Kozak para la expresión eucariota de la construcción, que va seguido en fase por la secuencia codificante de un péptido líder de inmunoglobulina de 19 aminoácidos, que va seguida en fase por la secuencia codificante de una marca His6 que va seguida en fase por la secuencia codificante de la cadena CD3 épsilon humana madura (las secuencias de ADNc y de aminoácidos de la construcción se enumeran como SEQ ID NO: 380 y 379). El fragmento de síntesis génica también se diseñó para que contuviera sitios de restricción al principio y al final del ADNc. Los sitios de restricción introducidos, EcoRI en el extremo 5' y SalI en el extremo 3', se usaron en los procedimientos de clonación siguientes. El fragmento de síntesis génica se clonó después por medio de EcoRI y SalI en un plásmido denominado pEF-NEO (descrito anteriormente) siguiendo protocolos estándar. Se usó un plásmido de secuencia comprobada para transfectar la línea de linfocitos T murina EL4. La transfección y la selección de los transfectantes se realizaron como se describe anteriormente. Después de 34 días de cultivo celular, se usaron los transfectantes para el ensayo descrito a continuación.
6.2. Ensayo de unión de la molécula de unión anti-CD3 específica de especies cruzadas H2C HLP a la cadena CD3 épsilon humana con y sin marca His6 N-terminal
Se probó un anticuerpo IgG quimérico con la especificidad de unión H2C HLP específica para CD3 épsilon para determinar la unión a CD3 épsilon humana con y sin marca His6 N-terminal. La unión del anticuerpo a las líneas celulares EL4 transfectadas con la CD3 épsilon humana-His6 y CD3 épsilon humana natural, respectivamente, se probó mediante un ensayo de FACS de acuerdo con protocolos estándar. Se incubaron 2,5x105 células de los transfectantes con 50 µl de sobrenadante de cultivo celular que contenía el anticuerpo IgG quimérico o 50 µl de los anticuerpos de control correspondientes a 5 µg/ml en PBS con FCS al 2 %. Se usaron respectivamente, como control negativo, un control de isotipo apropiado y como control positivo de la expresión de las construcciones, el anticuerpo específico de CD3 UCHT-1. Se detectó la unión de los anticuerpos con un fragmento F(ab')2 purificado por afinidad conjugado con R-ficoeritrina de IgG de cabra anti-ratón específica de fragmento Fc-gamma, diluido
1:100 en PBS con FCS al 2 % (Jackson ImmunoResearch Europe Ltd., Newmarket, Suffolk, RU). Las muestras se midieron en un FACSCalibur (BD biosciences, Heidelberg, Alemania). En comparación con la línea celular EL4 transfectada con CD3 épsilon humana natural, se detectó una clara pérdida de unión de la IgG quimérica con especificidad de unión H2C HLP a CD3 épsilon humana con una marca His6 N-terminal. Estos resultados mostraron que un extremo N-terminal libre de CD3 épsilon es esencial para la unión de la especificidad de unión H2C HLP anti-CD3 específica de especies cruzadas a la cadena CD3 épsilon humana (figura 9).
7. Determinación de la constante de unión KD de anticuerpos monocatenarios biespecíficos específicos de especies cruzadas para EGFR de primate y CD3 de primate (EGFR LH x H2C HLP) a la proteína de fusión 127 CD3-Fc por medida de resonancia de plasmón superficial en comparación con la unión a PBMC que expresan CD3 medida con un clasificador de células activadas por fluorescencia (FACS)
7.1. Medida de resonancia de plasmón superficial
Para determinar la afinidad de unión del anticuerpo monocatenario biespecífico totalmente específico de especies cruzadas EGFR-21-63 LH x H2C HLP a los aminoácidos 1-27 del extremo N-terminal de la cadena CD3 épsilon humana se realizó una medida de resonancia de plasmón superficial con una proteína de fusión recombinante que consistía en los aminoácidos 1-27 N-terminales de la cadena CD3 humana madura fusionados a una porción Fc de IgG1 humana (1-27 CD3-Fc). Con este fin se instaló un chip CM5 de carboximetildextrano de Biacore (Biacore, Uppsala, Suecia) en un sistema Biacore 2000® (Biacore, Uppsala, Suecia). Se activó una celda de flujo mediante una solución de clorhidrato de N-(3-dimetilaminopropil)-N'-etilcarbodiimida/N-hidroxisuccinimida de acuerdo con procedimientos estándar. Posteriormente, se añadió una solución de la proteína de fusión 1-27 CD3-Fc, dando lugar al enlace covalente estable de la proteína a la capa de dextrano del chip de Biacore. Se retiró la proteína no unida mediante un lavado exhaustivo seguido del bloqueo de los grupos carboxilo activados con NHS que quedaban sin reaccionar mediante la adición de una solución de etanolamina. Se confirmó el éxito del acoplamiento de la proteína por medio de una señal más elevada medida como unidades de respuesta en comparación con la señal antes del acoplamiento. Se preparó una celda de referencia como se describe, pero sin añadir una solución de proteína.
El anticuerpo biespecífico EGFR-21-63 LH x H2C HLP purificado se dializó exhaustivamente contra tampón HBS-EP (Biacore, Uppsala, Suecia) en una miniunidad de diálisis Slide-A-Lyzer® (Pierce, Rockford-M, EE. UU.). La concentración de proteína después de la diálisis se determinó mediante absorción UV a 280 nm, dando lugar a una concentración de 43 µg/ml.
La solución de proteína se transfirió a una placa de 96 pocillos y se realizó una dilución seriada con tampón HBS-EP en una proporción de 1:1 a 10 pocillos más.
Las medidas de resonancia de plasmón superficial se realizaron por separado tomando muestras de los 11 pocillos. Las celdas de flujo se regeneraron con tampón acetato entre las medidas para liberar la proteína unida.
Se obtuvieron señales de unión de moléculas de anticuerpo biespecífico restando la señal de la celda de referencia de la señal de la celda de medida conjugada con la proteína 1-27 CD3-Fc. Se midieron curvas de asociación y disociación como unidades de respuesta y se registraron. Las constantes de unión se calcularon usando el programa informático de ajuste de curvas de Biacore® basado en el modelo de Langmuir.
Se determinó que la constante de unión KD calculada a lo largo de las primeras cinco concentraciones era de 1,52x10-7 M.
7.2. Determinación de la constante de unión a CD3 mediante medida de FACS
Con el fin de probar la afinidad de las moléculas de anticuerpo biespecífico específico de especies cruzadas con respecto a la fuerza de unión a CD3 humana nativa, se realizó un análisis de unión saturante adicional por FACS. Se usó la molécula de anticuerpo biespecífico elegida, EGFR-21-63 LH x H2C HLP, para establecer una serie de dilución con un factor de 1:1,5 una concentración de partida de 63,3 µg/ml. Se incubó la molécula de anticuerpo biespecífico a estas concentraciones diferentes con 1,25 x 105 PBMC humanas en cada caso durante 1 hora a 4 °C seguido de dos etapas de lavado en PBS a 4 °C. La detección de las moléculas de anticuerpo específico unidas se llevó a cabo usando un anticuerpo Penta-His (Qiagen GmbH, Hildesheim, Alemania) a 5 µg/ml en 50 µl de PBS con FCS al 2 %. Tras la incubación durante 45 minutos a 4 °C y dos etapas de lavado, se detectó la unión del anticuerpo Penta-His con un fragmento F(ab')2 purificado por afinidad conjugado con R-ficoeritrina de IgG de cabra anti-ratón específica de fragmento Fc-gamma 1:100, diluido en PBS con FCS al 2 % (Jackson ImmunoResearch Europe Ltd., Newmarket, Suffolk, RU). Se realizó una citometría de flujo en un aparato FACS-Canto II, se usó el programa informático FACS Diva para adquirir y analizar los datos (Becton Dickinson biosciences, Heidelberg). La tinción de FACS y la medida de la intensidad de fluorescencia se realizaron como se describe en Current Protocols in Immunology (Coligan, Kruisbeek, Margulies, Shevach y Strober, Wiley-lnterscience, 2002). Los valores medios de la intensidad de fluorescencia adquiridos se representaron gráficamente como una función de la concentración de molécula de anticuerpo biespecífico usada y se analizaron mediante el programa informático biomatemático Prism en un análisis de unión de un lado (hipérbola). El programa informático calculó el valor de KD correspondiente que describía la unión de un ligando (la molécula de anticuerpo biespecífico) a un receptor (la subfracción de PBMC positiva para CD3) que sigue la ley de acción de masas. La fórmula subyacente es la siguiente: Y = Bmáx x X / (Kd+X) siendo Bmáx la unión máxima. KD es la concentración de ligando necesaria para alcanzar la unión semimáxima. La tinción de FACS se llevó a cabo en duplicados, los valores de R2 fueron mejores de 0,95.
La unión semimáxima determinada para la molécula de anticuerpo biespecífico EGFR-21-63 LH x H2C HLP se alcanzó a una concentración de 8472 ng/ml, que corresponde a 154 nM (1,54 x 10-7 M) a un masa molecular dada de 55000 Dalton (figura 10). Por tanto, la afinidad de EGFR-21-63 LH x H2C HLP por los aminoácidos 1-27 Nterminales de la cadena CD3 épsilon humana separados de su contexto de CD3 nativo resultó ser igual a las afinidad de EGFR-21-63 LH x H2C HLP por CD3 nativa sobre linfocitos T intactos.
8. Generación de células CHO transfectadas con EGFR humano
Se usó la línea celular positiva para EGFR humano, A431 (línea celular de carcinoma epidermoide, CRL-1555, American Type Culture Collection, Rockville, MD) para obtener el RNA total que se aisló de acuerdo con las instrucciones del manual del kit (Qiagen, RNeasy Mini Kit, Hilden, Alemania). El ARN obtenido se usó para síntesis de ADNc mediante transcripción inversa cebada aleatoriamente. Para la clonación de la secuencia de longitud completa del antígeno de EGFR humano se usaron los oligonucleótidos siguientes:
5' EGFR AG Xbal 5'-GGTCTAGAGCATGCGACCCTCCGGGACGGCCGGG-3'
3' EGFR AG SalI 5'-TTTTAAGTCGACTCATGCTCCAATAAATTCACTGCT-3'
La secuencia codificante se amplificó por PCR (desnaturalización a 94 °C durante 5 min, alineación a 58 °C durante 1 min, elongación a 72 °C durante 2 min durante el primero ciclo; desnaturalización a 94 °C durante 1 min, alineación a 58 °C durante 1 min, elongación a 72 °C durante 2 min durante 30 ciclos; extensión final a 72 °C durante 5 min). El producto de PCR se digirió posteriormente con Xbal y SalI, se ligó en el vector de expresión digerido de forma apropiada pEF-DHFR (Raum et al., Cancer Immunol. Immunother. 2001; 50: 141-150) y se transformó en E. coli. Los procedimientos mencionados anteriormente se llevaron a cabo de acuerdo con protocolos estándar (Sambrook, Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 3ª edición, Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, Nueva York (2001)). Se transfectó un clon con secuencia nucleotídica comprobada (SEQ ID 370, secuencia de aminoácidos SEQ ID 369) en células CHO deficientes en DHFR para la expresión eucariota de la construcción. La expresión eucariota de proteínas en células CHO deficientes en DHFR se realizó como se describe por Kaufmann R.J. (1990) Methods Enzymol. 185, 537-566. La amplificación de genes de la construcción se indujo mediante el aumento de las concentraciones metotrexato (MTX) hasta una concentración final de hasta MTX 20 nM.
9. Generación de células CHO que expresan el dominio extracelular de EGFR de cynomolgus
Se obtuvo la secuencia de ADNc del dominio extracelular del EGFR de cynomolgus mediante un conjunto de dos PCR sobre ADNc de colon de mono cynomolgus (n.º de Cat.: C1534090-Cy-BC; obtenido de BioCat GmbH, Heidelberg, Alemania) usando las siguientes condiciones de reacción: 1 ciclo a 94 °C durante 3 minutos seguido por 35 ciclos con 94 °C durante 1 minuto, 53 °C durante 1 minuto y 72 °C durante 2 minutos, seguidos de un ciclo final de 72 °C durante 3 minutos. Se utilizaron los siguientes cebadores:
1.
cebador directo: 5'- CGCTCTGCCCGGCGAGTCGGGC -3'
2.
cebador directo: 5'- ACATCCGGAGGTGACAGATCACGGCTCGTGC -3'
cebador inverso: 5'- CCGTCTTCCTCCATCTCATAGC -3'
cebador inverso: 5'- CAGGATATCCGAACGATGTGGCGCCTTCGC -3'
Esos fragmentos de PCR generaron dos fragmentos solapantes (A: 1-869, B: 848-1923), que se aislaron y se secuenciaron de acuerdo con protocolos estándar usando los cebadores de PCR y, de este modo, proporcionaron una porción de 1923 pb de la secuencia de ADNc de EGFR de cynomolgus desde el tercer nucleótido del codón +1
de la proteína madura hasta el 21er codón del dominio transmembranario. Para generar una construcción para la expresión de EGFR de cynomolgus se obtuvo un fragmento de ADNc mediante síntesis génica de acuerdo con protocolos estándar (las secuencias de ADNc y de aminoácidos de la construcción se enumeran en las SEQ ID NO: 372 y 371). En esta construcción se fusionó la secuencia que codifica el EGFR de cynomolgus desde el aminoácido 5 +2 hasta el +641 de la proteína EGFR madura en la secuencia codificante de EGFR humano, reemplazando la secuencia codificante de los aminoácidos +2 a +641. El fragmento de síntesis génica también se diseñó para que contuviera un sitio de Kozak para la expresión eucariota de la construcción y sitios de restricción al principio y al final del ADNc que codifica esencialmente el dominio extracelular de EGFR de cynomolgus fusionado a los dominios transmembranario e intracelular del EGFR humano. Además, se introdujo una mutación conservadora en el 10 aminoácido 627 (4º aminoácido del dominio transmembranario), mutando la valina a leucina para generar un sitio de restricción (SphI) con fines de clonación. Los sitios de restricción introducidos, XbaI en el extremo 5' y SalI en el extremo 3', se utilizaron en los procedimientos de clonación siguientes. El fragmento de síntesis génica se clonó después a través de XbaI y SalI en un plásmido denominado pEF-DHFR (pEF-DHFR se describe en Mack et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 (1995) 7021-7025). Se usó un clon de secuencia comprobada de este plásmido para
15 transfectar células CHO/dhfr-como se describe anteriormente.
10. Generación de moléculas monocatenarias biespecíficas específicas de especies cruzadas de EGFR y CD3
10.1. Clonación de moléculas de unión específicas de especies cruzadas
En general, se diseñaron moléculas de anticuerpo monocatenario biespecífico, comprendiendo cada uno un dominio
20 con una especificidad de unión de especies cruzadas específico para CD3épsilon humana y de primate distinto de chimpancé, así como un dominio con una especificidad de unión de especies cruzadas específico para EGFR humano y de primate distinto de chimpancé, como se expone en la siguiente tabla 1:
Tabla 1: Formatos de moléculas de anticuerpo monocatenario biespecífico específico de especies cruzadas anti-CD3 y anti-EGFR
SEQ ID (nucl/prot)
Formatos de construcciones proteínicas (N � C)
294 / 293
EGFR-21-63 LH x H2C HL
296 / 295
EGFR-21-63 LH x H2C HLP
302 / 301
EGFR-21-63 LH x A2J HLP
298 / 297
EGFR-21-63 LH x H1E HLP
306 / 305
EGFR-21-63 LH x E2M HLP
308 / 307
EGFR-21-63 LH x F7O HLP
864 / 863
EGFR-21-63 LH X I2C HL
900 / 899
E291C4 HL x I2C HL
898 / 897
E291C4 HL x F12Q HL
896 / 895
E291C4 HL x H2C HL
882 / 881
E291H8 HL x I2C HL
918 / 917
E292F3 HL x I2C HL
936 / 935
E98H5 HL x I2C HL
932 / 931
E98H5 HL x H2C HL
934 / 933
E98H5 HL x F12Q HL
972 / 971
E97H9 HL x I2C HL
970 / 969
E97H9 HL x F12Q HL
968 / 967
E97H9 HL x H2C HL
954 / 953
E98C3 HL x I2C HL
952 / 951
E98C3 HL x F12Q HL
950 / 949
E98C3 HL x H2C HL
990 / 989
E97B11 HL x I2C HL
988 / 987
E97B11 HL x F12Q HL
986 / 985
E97B11 HL x H2C HL
1018 / 1017
E12E3 HL x I2C HL
45 (continuación)
SEQ ID (nucl/prot)
Formatos de construcciones proteínicas (N � C)
1032 / 1031
E12B7 HL x I2C HL
1046 / 1045
E12E6 HL x I2C HL
1060 / 1059
E12F12 HL x I2C HL
1004 / 1003
E13B4 HL x I2C HL
1074 / 1073
E13B4 HL x I2C HL
1088 / 1087
E13E6 HL x I2C HL
1102 / 1101
E13E2 HL x I2C HL
Las construcciones mencionadas anteriormente que contenían los dominios variable de cadena ligera (L) y variable de cadena pesada (H) específicos de especies cruzadas para EGFR humano y de cynomolgus se obtuvieron mediante síntesis génica. Los fragmentos de síntesis génica se diseñaron para que contuvieran en primer lugar un sitio de Kozak para la expresión eucariota de la construcción, seguido por un péptido líder de inmunoglobulina de 19 aminoácidos, seguido en fase por la secuencia codificante de la molécula de anticuerpo monocatenario biespecífico correspondiente, seguida en fase por la secuencia codificante de una marca de 6 histidinas y un codón de detención. El fragmento de síntesis génica también se diseñó para introducir sitios de restricción adecuados al principio y al final del fragmento. Los sitios de restricción introducidos se utilizaron en los procedimientos de clonación siguientes. El fragmento de síntesis génica también se diseñó para introducir sitios de restricción adecuados N- y C-terminales. El fragmento de síntesis génica se clonó a través de estos sitios de restricción en un plásmido denominado pEF-DHFR (pEF-DHFR se describe en Raum et al. Cancer Immunol Immunother 50 (2001) 141-150) de acuerdo con protocolos estándar (Sambrook, Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 3ª edición, Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, Nueva York (2001)). Se transfectó un clon de secuencia nucleotídica comprobada en células de ovario de hámster chino (CHO) deficientes en dihidrofolato reductasa (DHFR) para la expresión eucariota de la construcción.
Las construcciones se transfectaron de forma estable o transitoria en células CHO deficientes en DHFR (N.º de la ATCC: CRL 9096) por electroporación o, de forma alternativa, en células HEK 293 (células de riñón embrionario humano, número de la ATCC: CRL-1573) de manera transitoria de acuerdo con protocolos estándar.
10.2. Expresión y purificación de las moléculas de anticuerpo monocatenario biespecífico
Las moléculas de anticuerpo monocatenario biespecífico se expresaron en células de ovario de hámster chino (CHO). La expresión eucariota de proteínas en células CHO deficientes en DHFR se realizó como se describe por Kaufmann R.J. (1990) Methods Enzymol. 185, 537-566. La amplificación de genes de las construcciones se indujo mediante el aumento de las concentraciones finales de MTX hasta 20 nM. Después de dos pasos de cultivo estacionario, las células se hicieron crecer en frascos rotatorios con medio líquido de soja HyQ PF CHO sin nucleósidos (con L-glutamina 4,0 mM con Pluronic F - 68 al 0,1 %; HyClone) durante 7 días antes de recogerlas. Se retiraron las células por centrifugación y se almacenó el sobrenadante que contenía la proteína expresada a -20 °C. De forma alternativa, las construcciones se expresaron de forma transitoria en células HEK 293. La transfección se realizó con reactivo 293fectin (Invitrogen, N.º 12347-019) de acuerdo con el protocolo del fabricante.
Para la cromatografía se usaron el sistema de exploración Äkta® (GE Health Systems) y el programa informático Unicorn®. Se realizó una cromatografía de afinidad de metales inmovilizados ("IMAC") usando un quelato Fractogel EMD® (Merck) que se cargó con ZnCI2 de acuerdo con el protocolo proporcionado por el fabricante. Se equilibró la columna con tampón A (tampón de fosfato de sodio 20 mM a pH 7,2, NaCl 0,1 M) y se aplicó el sobrenadante de cultivo celular (500 ml) a la columna (10 ml) a una caudal de 3 ml/min. La columna se lavó con tampón A para retirar la muestra no unida. La proteína unida se eluyó usando un gradiente en dos etapas de tampón B (tampón de fosfato de sodio 20 mM a pH 7,2, NaCl 0,1 M, imidazol 0,5 M) de acuerdo con lo siguiente:
Etapa 1: tampón B al 20 % en 6 volúmenes de columna
Etapa 2: tampón B al 100 % en 6 volúmenes de columna
Las fracciones de proteína eluida a partir de la etapa 2 se agruparon para su purificación adicional. Todos los productos químicos eran de calidad de investigación y comprados de Sigma (Deisenhofen) o Merck (Darmstadt).
La cromatografía de filtración en gel se realizó en una columna de calidad prep HiLoad 16/60 Superdex 200 (GE/Amersham) equilibrada con tampón de equilibrado (citrato 25 mM, lisina 200 mM, glicerol al 5 %, a pH 7,2). Las muestras de proteína eluidas (caudal 1 ml/min) se sometieron a SDS-PAGE estándar y transferencia de bandas
western para su detección. Antes de la purificación, se calibró la columna para la determinación del peso molecular (kit de marcadores de peso molecular, Sigma MW GF-200). Las concentraciones de proteína se determinaron usando la DO a 280 nm.
La proteína de anticuerpo monocatenario biespecífico purificada se analizó en SDS PAGE en condiciones reductoras realizada con geles bis-tris preformados al 4-12 % (Invitrogen). La preparación y la aplicación de las muestras se realizaron de acuerdo con el protocolo proporcionado por el fabricante. Se determinó el peso molecular con patrón proteínico MultiMark (Invitrogen). El gel se tiñó con Coomassie coloidal (protocolo de Invitrogen). La pureza de la proteína aislada fue > 95 %, determinada por SDS-PAGE.
El anticuerpo monocatenario biespecífico tiene un peso molecular de aproximadamente 52 kDa en condiciones nativas, determinado por filtración en gel en PBS. Todas las construcciones se purificaron de acuerdo con este procedimiento.
La transferencia de bandas western se realizó usando una membrana Optitran® BA-S83 y el módulo de transferencia de bandas de Invitrogen de acuerdo con el protocolo proporcionado por el fabricante. Se usaron anticuerpos dirigidos contra la marca His (Penta His, Qiagen) e Ig de cabra anti-ratón marcada con fosfatasa alcalina (AP) (Sigma) y BCIP/NBT (Sigma) como sustrato. Se detectó una única banda a 52 kD correspondiente al anticuerpo monocatenario biespecífico purificado.
11. Determinación de la constante de unión KD de anticuerpos monocatenarios biespecíficos totalmente específicos de especies cruzadas a la proteína de fusión 1-27 CD3-Fc por medida de resonancia de plasmón superficial
Para determinar las afinidades de unión de moléculas de anticuerpo monocatenario biespecífico específico de especies cruzadas de EGFR de primate y CD3 de primate a los aminoácidos 1-27 del extremo N-terminal de la cadena CD3 épsilon humana madura se realizó una medida de resonancia de plasmón superficial con una proteína de fusión recombinante que consistía en los aminoácidos 1-27 N-terminales de la cadena CD3 épsilon humana fusionados a una porción Fc de IgG1 humana (1-27 CD3-Fc). Con este fin se instaló un chip CM5 de carboximetildextrano de Biacore (Biacore, Uppsala, Suecia) en un sistema Biacore 2000® (Biacore, Uppsala, Suecia). Se activó una celda de flujo mediante una solución de clorhidrato de N-(3-dimetilaminopropil)-N'etilcarbodiimida/N-hidroxisuccinimida de acuerdo con procedimientos estándar. Posteriormente, se añadió una solución de la proteína de fusión 1-27 CD3-Fc, dando lugar al enlace covalente estable de la proteína a la capa de dextrano del chip de Biacore. Se retiró la proteína no unida mediante un lavado exhaustivo seguido del bloqueo de los grupos carboxilo activados con NHS que quedaban sin reaccionar mediante la adición de una solución de etanolamina. Se confirmó el éxito del acoplamiento de la proteína mediante la detección de una señal más elevada medida como unidades de respuesta en comparación con la señal antes del acoplamiento. Se preparó una celda de referencia como se describe, pero sin añadir la solución de proteína.
Los anticuerpos monocatenarios biespecíficos purificados enumerados a continuación se ajustaron a 5 µg/ml con tampón HBS-EP (Biacore, Uppsala, Suecia) y se transfirieron a una placa de 96 pocillos, cada uno a un volumen de 150 µl.
Se realizaron medidas de resonancia de plasmón superficial para todas las muestras y se regeneraron las celdas de flujo con tampón acetato entre las medidas para liberar la proteína unida (todo de acuerdo con protocolos estándar).
Se obtuvieron señales de unión de las moléculas de anticuerpo monocatenario biespecífico restando la señal de la celda de referencia de la señal de la celda de medida conjugada con la proteína 1-27 CD3-Fc.
Se midieron curvas de asociación y disociación como unidades de respuesta y se registraron. Las constantes de unión se calcularon usando el programa informático de ajuste de curvas de Biacore® basado en el modelo de Langmuir. Las afinidades calculadas para las moléculas monocatenarias biespecíficas totalmente específicas de especies cruzadas probadas por los aminoácidos 1-27 N-terminales de la CD3 épsilon humana se dan como valores de KD a continuación y varían de 2,54x10-6 M a 2,49x10-7 M. "LH" se refiere a una disposición de dominios variables en el orden VL-VH. "HL" se refiere a una disposición de dominios variables en el orden VH-VL. G4H, F7O, A2J, E1L, E2M, H1E y F6A se refieren a diferentes moléculas de unión a CD3 específicas de especies cruzadas.
Molécula de anticuerpo biespecífico KD(M)
EGFR LH x F7O HLP 1,01x10-6
EGFR LH x A2J HLP 2,49x10-7
EGFR LH x E2M HLP 2,46x10-6
EGFR LH x H1E HLP 2,54x10-6
12. Análisis de unión por citometría de flujo de los anticuerpos biespecíficos específicos de especies cruzadas de EGFR y CD3
Con el fin de probar la funcionalidad de las construcciones de anticuerpo biespecífico específico de especies cruzadas con respecto a la capacidad de unión a EGFR y CD3 humanos y de cynomolgus, respectivamente, se llevó a cabo un análisis de FACS. Para este propósito se usaron células CHO transfectadas con EGFR humano como se describe en el ejemplo 8 y la línea celular humana de leucemia de linfocitos T positivos para CD3 HPB-ALL (DSMZ, Braunschweig, ACC483) para probar la unión a antígenos humanos. La reactividad de unión frente a antígenos de cynomolgus se probó usando el transfectante de EGFR de cynomolgus generado descrito en el ejemplo 9 y una línea de linfocitos T de macaco 4119LnPx (proporcionada amablemente por el Prof. Fickenscher, Instituto de Higiene, Virología, Erlangen-Núremberg; publicado en Knappe A, et al., y Fickenscher H., Blood 2000, 95, 3256-61). Se incubaron 200.000 células de la población celular correspondiente durante 30 min en hielo con 50 µl de la proteína purificada de las construcciones de anticuerpo biespecífico específico de especies cruzadas (2 µg/ml). De forma alternativa, se usó el sobrenadante del cultivo celular de proteínas producidas de forma transitoria. Se lavaron las células dos veces en PBS y se detectó la unión de la construcción con un anticuerpo Penta His murino (Qiagen; diluido 1:20 en 50 µl de PBS con FCS al 2 %). Después del lavado, se detectaron anticuerpos anti-His unidos con un anticuerpo específico de Fc gamma (Dianova) conjugado con ficoeritrina, diluido 1:100 en PBS con FCS al 2 %. Como control negativo se usó medio de cultivo recién preparado.
Se realizó una citometría de flujo en un aparato FACS-Calibur, se usó el programa informático CellQuest para adquirir y analizar los datos (Becton Dickinson biosciences, Heidelberg). La tinción de FACS y la medida de la intensidad de fluorescencia se realizaron como se describe en Current Protocols in Immunology (Coligan, Kruisbeek, Margulies, Shevach y Strober, Wiley-lnterscience, 2002).
La capacidad de unión de varias moléculas monocatenarias biespecíficas que son específicas para EGFR y específicas de especies cruzadas para CD3 humana y de primate distinto de chimpancé era claramente detectable como se muestra en la figura 11. En el análisis de FACS, todas las construcciones mostraron unión a CD3 y EGFR en comparación con el medio de cultivo y el primer y el segundo anticuerpo de detección como controles negativos. Se demostró la especificidad de especies cruzadas del anticuerpo biespecífico de antígenos de CD3 y EGFR humanos y de cynomolgus.
13. Bioactividad de anticuerpos monocatenarios biespecíficos específicos de especies cruzadas de EGFR y CD3
La bioactividad de los anticuerpos monocatenarios biespecíficos generados se analizó mediante ensayos de citotoxicidad in vitro de liberación de cromo 51 (51Cr) usando las líneas celulares positivas para EGFR descritas en los ejemplos 8 y 9. Como células efectoras se usaron linfocitos T positivos para CD8 humanos o la línea de linfocitos T de macaco 4119LnPx, respectivamente.
La generación de los linfocitos T CD8+ estimulados se realizó como sigue:
Se recubrió previamente una placa de Petri (145 mm de diámetro, Greiner) con un anticuerpo específico anti-CD3 comercialmente disponible en una concentración final de 1 µg/ml durante 1 hora a 37 °C. La proteína no unida se retiró mediante una etapa de lavado con PBS. Se aislaron las PBMC recién obtenidas a partir de sangre periférica (30 - 50 ml de sangre humana) por centrifugación en gradiente de Ficoll de acuerdo con protocolos estándar. Se añadieron 3 - 5 x 107 PBMC a la placa de Petri recubierta previamente en 120 ml de RPMI 1640 / FCS al 10 % / 20 U/ml de IL-2 (Proleukin, Chiron) y se estimularon durante 2 días. En el tercer día se recogieron las células, se lavaron una vez con RPMI 1640, se añadió IL-2 a un concentración final de 20 U/ml y se cultivaron de nuevo durante un día. Se aislaron linfocitos T citotóxicos (LTC) CD8+ por eliminación de linfocitos T CD4+ y linfocitos NK CD56+.
Las células objetivo se lavaron dos veces con PBS y se marcaron con 11,1 MBq de 51Cr en un volumen final de 100 µl de RPMI con FCS al 50 % durante 45 minutos a 37 °C. Posteriormente, las células objetivo marcadas se lavaron 3 veces con 5 ml de RPMI y después se usaron en el ensayo de citotoxicidad. El ensayo se realizó en una placa de 96 pocillos en un volumen total de 250 µl de RPMI suplementado (como anteriormente) con una proporción E:O de
10:1. Se aplicaron 1 µg/ml de las moléculas de anticuerpo monocatenario biespecífico específico de especies cruzadas y 20 diluciones de tres veces de las mismas. De forma alternativa, el sobrenadante de cultivo celular de proteínas producidas de forma transitoria se diluyó en serie en etapas de 1:2. El tiempo de ensayo es de 18 horas y la citotoxicidad se midió como valores relativos de cromo liberado en el sobrenadante en relación con la diferencia de lisis máxima (adición de Triton-X) y lisis espontánea (sin células efectoras). Todas las medidas se realizaron en cuadruplicados. La medida de la actividad del cromo en los sobrenadantes se realizó con un contador gamma Wizard 3" (Perkin Elmer Life Sciences GmbH, Colonia, Alemania). El análisis de los datos experimentales se realizó con Prism 4 para Windows (versión 4.02, GraphPad Software Inc., San Diego, California, EE. UU.). Típicamente, las curvas sigmoidales de respuesta a dosis tenían valores de R2 > 0,90, determinados por el programa informático. Los valores de CE50 calculados por el programa de análisis se usaron para la comparación de la bioactividad.
Como se muestra en las figuras 12 y 13, todas las construcciones de anticuerpo monocatenario biespecífico específico de especies cruzadas generadas revelaron actividad citotóxica contra células objetivo positivas para EGFR humano provocada por linfocitos CD8+ humanos y células objetivo positivas para EGFR de cynomolgus provocada por la línea de linfocitos T de macaco 4119LnPx. Como control negativo se usó un anticuerpo
monocatenario biespecífico con diferente especificidad de objetivo.
14. Clonación y expresión de los dominios C-terminal, transmembranario y extracelular truncado de MCSP humana
Se obtuvo la secuencia codificante del dominio C-terminal, transmembranario y extracelular truncado de MCSP humana (aminoácidos 1538 - 2322) mediante síntesis génica de acuerdo con protocolos estándar (la secuencia de ADNc y la secuencia de aminoácidos de la construcción recombinante para la expresión del dominio C-terminal transmembranario y extracelular truncado de MCSP humana (denominado D3 humana) se enumeran en las SEQ ID NO: 374 y 373). El fragmento de síntesis génica se diseñó para que contuviera en primer lugar un sitio de Kozak para permitir la expresión eucariota de la construcción seguido por la secuencia codificante de un péptido líder de inmunoglobulina de 19 aminoácidos seguida en fase por una marca FLAG, seguida en fase por una secuencia que contiene varios sitios de restricción con fines de clonación y que codifica un enlazador artificial de 9 aminoácidos (SRTRSGSQL), seguida en fase por la secuencia codificante del dominio C-terminal, transmembranario y extracelular truncado de MCSP humana y un codón de detención. Se introdujeron sitios de restricción al principio y al final del fragmento de ADN. Los sitios de restricción introducidos, EcoRI en el extremo 5' y SalI en el extremo 3', se usaron en los procedimientos de clonación siguientes. El fragmento se digirió con EcoRI y SalI y se clonó en pEF-DHFR (pEF-DHFR se describe en Mack et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 (1995) 7021-7025) siguiendo protocolos estándar. Se usó un plásmido de secuencia comprobada para transfectar células CHO/dhfr- (N.º de la ATCC: CRL 9096). Las células se cultivaron en RPMI 1640 con glutamina estabilizada, suplementado con FCS al 10 %, penicilina/estreptomicina al 1 % (todos obtenidos de Biochrom AG, Berlín, Alemania) y nucleósidos de una solución madre de reactivos de calidad para cultivo celular (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Alemania) a una concentración final de 10 µg/ml de adenosina, 10 µg/ml de desoxiadenosina y 10 µg/ml de timidina, en una incubadora a 37 °C, al 95 % de humedad y CO2 al 7 %. La transfección se realizó usando el reactivo de transfección PolyFect (Qiagen GmbH, Hilden, Alemania) y 5 µg de ADN plasmídico de acuerdo con el protocolo del fabricante. Después de cultivarlas durante 24 horas, se lavaron las células una vez con PBS y se cultivaron de nuevo en RPMI 1640 con glutamina estabilizada y penicilina/estreptomicina al 1 %. Por tanto, el medio de cultivo celular no contenía nucleósidos y, de este modo, se aplicó la selección en las células transfectadas. Aproximadamente 14 días después de la transfección, se observó el crecimiento de células resistentes. Después de otros 7 a 14 días, se probaron los transfectantes para determinar la expresión de la construcción por análisis de FACS. Se incubaron 2,5x105 células con 50 µl de un anticuerpo anti-Flag M2 (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Alemania) diluido a 5 µg/ml en PBS con FCS al 2 %. Se detectó la unión del anticuerpo con un fragmento F(ab')2 purificado por afinidad conjugado con R-ficoeritrina de IgG de cabra anti-ratón específica de fragmento Fc-gamma, diluido 1:100 en PBS con FCS al 2 % (ImmunoResearch Europe Ltd., Newmarket, Suffolk, RU). Las muestras se midieron en un FACSCalibur (BD biosciences, Heidelberg, Alemania).
15. Clonación y expresión de los dominios C-terminal, transmembranario y extracelular truncado de MCSP de macaco
Se obtuvo la secuencia de ADNc del dominio C-terminal, transmembranario y extracelular truncado de MCSP de macaco (denominado D3 de macaco) mediante un conjunto de tres PCR sobre ADNc de piel de macaco (N.º de Cat. C1534218-Cy-BC; BioCat GmbH, Heidelberg, Alemania) usando las siguientes condiciones de reacción: 1 ciclo a 94 °C, 3 min, 40 ciclos con 94 °C durante 0,5 min, 52 °C durante 0,5 min y 72 °C durante 1,75 min, ciclo final de 72 °C durante 3 min. Se utilizaron los siguientes cebadores:
cebador directo: 5'-GATCTGGTCTACACCATCGAGC-3'
cebador inverso: 5'-GGAGCTGCTGCTGGCTCAGTGAGG-3'
cebador directo: 5'- TTCCAGCTGAGCATGTCTGATGG-3'
cebador inverso: 5'- CGATCAGCATCTGGGCCCAGG-3'
cebador directo: 5'- GTGGAGCAGTTCACTCAGCAGGACC-3'
cebador inverso: 5'- GCCTTCACACCCAGTACTGGCC-3'
Esos fragmentos de PCR generaron tres fragmentos solapantes (A: 1-1329, B: 1229-2428, C: 1782-2547) que se aislaron y se secuenciaron de acuerdo con protocolos estándar usando los cebadores de PCR y, de este modo, proporcionaron una porción de 2547 pb de la secuencia del ADNc de MCSP de macaco (la secuencia de ADNc y la secuencia de aminoácidos de esta porción de MCSP de macaco se enumeran en las SEQ ID NO: 376 y 375) desde 74 pb corriente arriba de la secuencia codificante del dominio C-terminal hasta 121 pb corriente abajo del codón de detención. Se usó otra PCR usando las siguientes condiciones de reacción: 1 ciclo a 94 °C durante 3 min, 10 ciclos con 94 °C durante 1 min, 52 °C durante 1 min y 72 °C durante 2,5 min, ciclo final de 72 °C durante 3 min, para fusionar los productos de PCR de las reacciones Ay B mencionadas anteriormente. Se usan los siguientes cebadores:
cebador directo: 5'-tcccgtacgagatctggatcccaattggatggcggactcgtgctgttctcacacagagg-3'
cebador inverso: 5'-agtgggtcgactcacacccagtactggccattcttaagggcaggg-3'
Los cebadores para esta PCR se diseñaron para introducir sitios de restricción al principio y al final del fragmento de ADNc que codifica los dominios C-terminal, transmembranario y extracelular truncado de MCSP de macaco. Los sitios de restricción introducidos, MfeI en el extremo 5' y SalI en el extremo 3', se usaron en los procedimientos de clonación siguientes. El fragmento de PCR se clonó después por medio de MfeI y SalI en un plásmido Bluescript que contenía el fragmento EcoRI/MfeI del plásmido pEF-DHFR mencionado anteriormente (pEF-DHFR se describe en Raum et al. Cancer Immunol Immunother 50 (2001) 141-150) reemplazando los dominios C-terminal, transmembranario y extracelular truncado de MCSP humana. El fragmento de síntesis génica contenía las secuencias codificantes del péptido líder de inmunoglobulina y la marca Flag, así como el enlazador artificial (SRTRSGSQL) en fase con el extremo 5' del fragmento de ADNc que codifica los dominios C-terminal, transmembranario y extracelular truncado de MCSP de macaco. Este vector se usó para transfectar células CHO/dhfr- (N.º de la ATCC: CRL 9096). Las células se cultivaron en RPMI 1640 con glutamina estabilizada, suplementado con FCS al 10 %, penicilina/estreptomicina al 1 % (todos de Biochrom AG, Berlín, Alemania) y nucleósidos de una solución madre de reactivos de calidad para cultivo celular (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Alemania) a una concentración final de 10 µg/ml de adenosina, 10 µg/ml de desoxiadenosina y 10 µg/ml de timidina, en una incubadora a 37 °C, al 95 % de humedad y CO2 al 7 %. La transfección se realizó con el reactivo de transfección PolyFect (Qiagen GmbH, Hilden, Alemania) y 5 µg de ADN plasmídico de acuerdo con el protocolo del fabricante. Después de cultivarlas durante 24 horas, se lavaron las células una vez con PBS y se cultivaron de nuevo en RPMI 1640 con glutamina estabilizada y penicilina/estreptomicina al 1 %. Por tanto, el medio de cultivo celular no contenía nucleósidos y, de este modo, se aplicó la selección en las células transfectadas. Aproximadamente 14 días después de la transfección, se observó el crecimiento de células resistentes. Después de otros 7 a 14 días, se probaron los transfectantes para determinar la expresión de la construcción recombinante por análisis de FACS. Se incubaron 2,5x105 células con 50 µl de un anticuerpo anti-Flag M2 (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Alemania) diluido a 5 µg/ml en PBS con FCS al 2 %. Se detectó el anticuerpo unido con un fragmento F(ab')2 purificado por afinidad conjugado con R-ficoeritrina de IgG de cabra anti-ratón específica de fragmento Fc-gamma, diluido 1:100 en PBS con FCS al 2 % (Jackson ImmunoResearch Europe Ltd., Newmarket, Suffolk, RU). Las muestras se midieron en un FACSCalibur (BD biosciences, Heidelberg, Alemania).
16. Generación y caracterización de moléculas monocatenarias biespecíficas específicas de especies cruzadas de MCSP y CD3
Se diseñaron moléculas de anticuerpo monocatenario biespecífico, comprendiendo cada uno un dominio de unión específico de especies cruzadas para CD3 épsilon humana y de primate distinto de chimpancé, así como un dominio de unión específico de especies cruzadas para MCSP humana y de primate distinto de chimpancé, como se expone en la siguiente tabla 2:
Tabla 2: Formatos de anticuerpos monocatenarios biespecíficos específicos de especies cruzadas de MCSP y CD3
SEQ ID (nucl/prot)
Formatos de construcciones proteínicas (N � C)
310 / 309
MCSP-G4 HL x H2C HL
312 / 311
MCSP-G4HL x F12QHL
314 / 313
MCSP-G4 HL x I2C HL
316 / 315
MCSP-G4 HLP x F6A HLP
318 / 317
MCSP-G4 HLP x H2C HLP
322 / 321
MCSP-G4 HLP x G4H HLP
326 / 325
MCSP-G4HLP x E1L HLP
328 / 327
MCSP-G4 HLP x E2M HLP
332 / 331
MCSP-G4 HLP x F12Q HL
334 / 333
MCSP-G4 HLP x I2C HL
336 / 335
MCSP-D2 HL x H2C HL
338 / 337
MCSP-D2HL x F12QHL
340 / 339
MCSP-D2 HL x I2C HL
342 / 341
MCSP-D2 HLP x H2C HLP
344 / 343
MCSP-F9 HL x H2C HL
346 / 345
MCSP-F9 HLP x H2C HLP
348 / 347
MCSP-F9 HLP x G4H HLP
35 (continuación)
SEQ ID (nucl/prot)
Formatos de construcciones proteínicas (N � C)
1355 / 1354
MCSP-A9 HL x H2C HL
1357 / 1356
MCSP-A9 HL x H2C F12Q
1359 / 1358
MCSP-A9 HL x I2C HL
1373 / 1372
MCSP-C8 HL x I2C HL
1401 / 1400
MCSP-B7 HL x I2C HL
1387 / 1386
MCSP-B8 HL x I2C HL
1415 / 1414
MCSP-G8 HL x I2C HL
1429 / 1428
MCSP-D5 HL x I2C HL
1443 / 1442
MCSP-F7 HL x I2C HL
1457 / 1456
MCSP-G5 HL x I2C HL
1471 / 1470
MCSP-F8 HL x I2C HL
1485 / 1484
MCSP-G10 HL x I2C HL
Se obtuvieron por síntesis génica las construcciones mencionadas anteriormente que contenían los dominios variable de cadena pesada (VH) y variable de cadena ligera (VL) específicos de especies cruzadas para MCSP D3 humana y de macaco y los dominios VH y VL específicos de especies cruzadas para CD3 humana y de macaco. Los fragmentos de síntesis génica se diseñaron para que contuvieran en primer lugar un sitio de Kozak para la expresión eucariota de la construcción, seguido por un péptido líder de inmunoglobulina de 19 aminoácidos, seguido en fase por la secuencia codificante de la molécula de anticuerpo monocatenario biespecífico correspondiente, seguida en fase por la secuencia codificante de una marca de 6 histidinas y un codón de detención. El fragmento de síntesis génica también se diseñó para introducir sitios de restricción adecuados N- y C-terminales. El fragmento de síntesis génica se clonó a través de estos sitios de restricción en un plásmido denominado pEF-DHFR (pEF-DHFR se describe en Raum et al. Cancer Immunol Immunother 50 (2001) 141-150) de acuerdo con protocolos estándar (Sambrook, Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 3ª edición, Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, Nueva York (2001)). Las construcciones se transfectaron de forma estable o transitoria en células CHO deficientes en DHFR (N.º de la ATCC: CRL 9096) por electroporación o, de forma alternativa, en células HEK 293 (células de riñón embrionario humano, número de la ATCC: CRL-1573) de manera transitoria de acuerdo con protocolos estándar.
La expresión eucariota de proteínas en células CHO deficientes en DHFR se realizó como se describe por Kaufmann R.J. (1990) Methods Enzymol. 185, 537-566. La amplificación de genes de las construcciones se indujo mediante la adición de concentraciones crecientes de metotrexato (MTX) hasta concentraciones finales de MTX 20 nM. Después de dos pasos de cultivo estacionario, las células se hicieron crecer en frascos rotatorios con medio líquido de soja HyQ PF CHO sin nucleósidos (con L-glutamina 4,0 mM con Pluronic F - 68 al 0,1 %; HyClone) durante 7 días antes de recogerlas. Se retiraron las células por centrifugación y el sobrenadante que contenía la proteína expresada se almacenó a -20 °C.
Para la cromatografía se usaron el sistema de exploración Äkta® (GE Health Systems) y el programa informático Unicorn®. Se realizó una cromatografía de afinidad de metales inmovilizados ("IMAC") usando un quelato Fractogel EMD® (Merck) que se cargó con ZnCI2 de acuerdo con el protocolo proporcionado por el fabricante. Se equilibró la columna con tampón A (tampón de fosfato de sodio 20 mM a pH 7,2, NaCl 0,1 M) y se aplicó el sobrenadante de cultivo celular (500 ml) a la columna (10 ml) a una caudal de 3 ml/min. La columna se lavó con tampón A para retirar la muestra no unida. La proteína unida se eluyó usando un gradiente en dos etapas de tampón B (tampón de fosfato de sodio 20 mM a pH 7,2, NaCl 0,1 M, imidazol 0,5 M) de acuerdo con lo siguiente:
Etapa 1: tampón B al 20 % en 6 volúmenes de columna
Etapa 2: tampón B al 100 % en 6 volúmenes de columna
Las fracciones de proteína eluida a partir de la etapa 2 se agruparon para su purificación adicional. Todos los productos químicos son de calidad de investigación y comprados de Sigma (Deisenhofen) o Merck (Darmstadt).
La cromatografía de filtración en gel se realizó en una columna de calidad prep HiLoad 16/60 Superdex 200 (GE/Amersham) equilibrada con tampón de equilibrado (citrato 25 mM, lisina 200 mM, glicerol al 5 %, a pH 7,2). Las muestras de proteína eluidas (caudal de 1 ml/min) se sometieron a SDS-PAGE estándar y transferencia de bandas western para su detección. Antes de la purificación, se calibró la columna para la determinación del peso molecular (kit de marcadores de peso molecular, Sigma MW GF-200). Las concentraciones de proteína se determinaron usando la DO a 280 nm.
La proteína de anticuerpo monocatenario biespecífico purificada se analizó en SDS PAGE en condiciones reductoras realizada con geles bis-tris preformados al 4-12 % (Invitrogen). La preparación y la aplicación de las muestras se realizaron de acuerdo con el protocolo proporcionado por el fabricante. Se determinó el peso molecular con patrón proteínico MultiMark (Invitrogen). El gel se tiñó con Coomassie coloidal (protocolo de Invitrogen). La pureza de la proteína aislada fue > 95 %, determinada por SDS-PAGE.
El anticuerpo monocatenario biespecífico tiene un peso molecular de aproximadamente 52 kDa en condiciones nativas, determinado por filtración en gel en solución salina tamponada con fosfato (PBS). Todas las construcciones se purificaron de acuerdo con este procedimiento.
La transferencia de bandas western se realizó usando una membrana Optitran® BA-S83 y el módulo de transferencia de bandas de Invitrogen de acuerdo con el protocolo proporcionado por el fabricante. Para la detección de los anticuerpos de proteína de anticuerpo monocatenario biespecífico se usó un anticuerpo anti-marca His (Penta His, Qiagen). Como anticuerpo secundario se usó un anticuerpo Ig de cabra anti-ratón marcado con fosfatasa alcalina (AP) (Sigma) y como sustrato, BCIP/NBT (Sigma). Se detectó una única banda a 52 kD correspondiente al anticuerpo monocatenario biespecífico purificado.
De forma alternativa, las construcciones se expresaron de forma transitoria en células CHO deficientes en DHFR. Brevemente, se cultivaron 4 x 105 células por construcción en 3 ml de medio completo RPMI 1640 con glutamina estabilizada suplementado con suero bovino fetal al 10 %, penicilina/estreptomicina al 1 % y nucleósidos de una solución madre de reactivos de calidad para cultivo celular (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Alemania) a una concentración final de 10 µg/ml de adenosina, 10 µg/ml de desoxiadenosina y 10 µg/ml de timidina, en una incubadora a 37 °C, al 95 % de humedad y CO2 al 7 % un día antes de la transfección. La transfección se realizó con reactivo de transfección Fugene 6 (Roche, N.º 11815091001) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Se mezclan 94 µl de medio OptiMEM (Invitrogen) y 6 µl de Fugene 6 y se incuban durante 5 minutos a temperatura ambiente. Posteriormente, se añadieron 1,5 µg de ADN por construcción, se mezclaron y se incubaron durante 15 minutos a temperatura ambiente. Mientras tanto, las células CHO deficientes en DHFR se lavaron 1x con PBS y se resuspendieron en 1,5 ml de medio completo RPMI 1640. Se diluyó la mezcla de transfección con 600 µl de medio completo RPMI 1640, se añadió a las células y se incubaron durante la noche a 37 °C, al 95 % de humedad y CO2 al 7 %. El día después de la transfección, se aumentó el volumen de incubación de cada enfoque hasta 5 ml de medio completo RPMI 1640. Después de 3 días de incubación, se recogió el sobrenadante.
17. Análisis de unión por citometría de flujo de los anticuerpos biespecíficos específicos de especies cruzadas de MCSP y CD3
Con el fin de probar la funcionalidad de las construcciones de anticuerpo biespecífico específico de especies cruzadas con respecto a la capacidad de unión a MCSP D3 y CD3 humana y de macaco, respectivamente, se llevó a cabo un análisis de FACS. Para este propósito se usaron células CHO transfectadas con MCSP D3 humana (como se describe en el ejemplo 14) y la línea celular humana de leucemia de linfocitos T positivos para CD3 HPB-ALL (DSMZ, Braunschweig, ACC483) para probar la unión a antígenos humanos. La reactividad de unión a antígenos de macaco se probó usando el transfectante de MCSP D3 de macaco generado (descrito en el ejemplo 15) y una línea de linfocitos T de macaco 4119LnPx (proporcionada amablemente por el Prof. Fickenscher, Instituto de Higiene, Virología, Erlangen-Núremberg; publicado en Knappe A, et al., y Fickenscher H., Blood 2000, 95, 325661). Se incubaron 200.000 células de las respectivas líneas celulares durante 30 min en hielo con 50 µl de la proteína purificada de las construcciones de anticuerpo biespecífico específico de especies cruzadas (2 µg/ml) o sobrenadante de cultivo celular de células transfectadas que expresan las construcciones de anticuerpo biespecífico específico de especies cruzadas. Se lavaron las células dos veces en PBS con FCS al 2 % y se detectó la unión de la construcción con un anticuerpo anti-His murino (anticuerpo Penta His; Qiagen; diluido 1:20 en 50 µl de PBS con FCS al 2 %). Después del lavado, se detectaron anticuerpos anti-His unidos con un anticuerpo específico de Fc gamma (Dianova) conjugado con ficoeritrina, diluido 1:100 en PBS con FCS al 2 %. El sobrenadante de células CHO no transfectadas se usó como control negativo para la unión a las líneas de linfocitos T. Como control negativo para la unión a las células CHO transfectadas con MCSP-D3 se usó una construcción monocatenaria con especificidad de objetivo no pertinente.
Se realizó una citometría de flujo en un aparato FACS-Calibur; se usó el programa informático CellQuest para adquirir y analizar los datos (Becton Dickinson biosciences, Heidelberg). La tinción de FACS y la medida de la intensidad de fluorescencia se realizaron como se describe en Current Protocols in Immunology (Coligan, Kruisbeek, Margulies, Shevach y Strober, Wiley-lnterscience, 2002).
La unión biespecífica de las moléculas monocatenarias enumeradas anteriormente, que son específicas de especies cruzadas para MCSP D3 y específicas de especies cruzadas para CD3 humana y de macaco era claramente detectable, como se muestra en las figuras 14, 15, 16 y 58. En el análisis de FACS, todas las construcciones mostraron unión a CD3 y MCSP D3 en comparación con los correspondientes controles negativos. Se demostró la especificidad de especies cruzadas de los anticuerpos biespecíficos frente a antígenos de CD3 y MCSP D3 humana y de macaco.
18. Bioactividad de anticuerpos monocatenarios biespecíficos específicos de especies cruzadas de MCSP y CD3
Se analizó la bioactividad de los anticuerpos monocatenarios biespecíficos generados mediante ensayos de citotoxicidad in vitro de liberación de cromo 51 (51Cr) usando las líneas celulares positivas para MCDP D3 descritas en los ejemplos 14 y 15. Como células efectoras se usaron PBMC humanas con eliminación de CD4/CD56 estimuladas, PBMC humanas estimuladas o la línea de linfocitos T de macaco 4119LnPx, según se especifique en las figuras correspondientes.
La generación de PBMC con eliminación de CD4/CD56 estimuladas se realizó como sigue:
Se llevo a cabo el recubrimiento de una placa de Petri (145 mm de diámetro, Greiner bio-one GmbH, Kremsmünster) con un anticuerpo específico anti-CD3 comercialmente disponible (p. ej., OKT3, Othoclone) en una concentración final de 1 µg/ml durante 1 hora a 37 °C. La proteína no unida se retiró mediante una etapa de lavado con PBS. Se aislaron las PBMC recién obtenidas a partir de sangre periférica (30 - 50 ml de sangre humana) por centrifugación en gradiente de Ficoll de acuerdo con protocolos estándar. Se añadieron 3 - 5 x 107 PBMC a la placa de Petri recubierta previamente en 120 ml de RPMI 1640 con glutamina estabilizada / FCS al 10 % / 20 U/ml de IL-2 (Proleukin, Chiron) y se estimularon durante 2 días. En el tercer día se recogieron las células y se lavaron una vez con RPMI 1640. Se añadió IL-2 hasta una concentración final de 20 U/ml y se cultivaron las células de nuevo durante un día en el mismo medio de cultivo celular que anteriormente. Mediante la eliminación de linfocitos T CD4+ y linfocitos NK CD56+ de acuerdo con protocolos estándar, se enriquecieron los linfocitos T citotóxicos (LTC) CD8+.
Las células objetivo se lavaron dos veces con PBS y se marcaron con 11,1 MBq de 51Cr en un volumen final de 100 µl de RPMI con FCS al 50 % durante 45 minutos a 37 °C. Posteriormente, las células objetivo marcadas se lavaron 3 veces con 5 ml de RPMI y después se usaron en el ensayo de citotoxicidad. El ensayo se realizó en una placa de 96 pocillos en un volumen total de 250 µl de RPMI suplementado (como anteriormente) con una proporción E:O de
10:1. Se aplicaron 1 µg/ml de las moléculas de anticuerpo biespecífico específico de especies cruzadas y 20 diluciones de tres veces de las mismas. En caso de que se usara sobrenadante que contenía las moléculas de anticuerpo biespecífico específico de especies cruzadas, se aplicaron 21 diluciones de dos veces y 20 de tres veces del mismo para el ensayo de citotoxicidad de macaco y humano, respectivamente. El tiempo de ensayo fue de 18 horas y la citotoxicidad se midió como valores relativos de cromo liberado en el sobrenadante en relación con la diferencia de lisis máxima (adición de Triton-X) y lisis espontánea (sin células efectoras). Todas las medidas se realizaron en cuadruplicados. La medida de la actividad del cromo en los sobrenadantes se realizó con un contador gamma Wizard 3" (Perkin Elmer Life Sciences GmbH, Colonia, Alemania). El análisis de los datos experimentales se realizó con Prism 4 para Windows (versión 4.02, GraphPad Software Inc., San Diego, California, EE. UU.). Típicamente, las curvas sigmoidales de respuesta a dosis tienen valores de R2 > 0,90, determinados por el programa informático. Los valores de CE50 calculados por el programa de análisis se usaron para la comparación de la bioactividad.
Como se muestra en las figuras 17 a 21 y 59, todas las construcciones de anticuerpo monocatenario biespecífico específico de especies cruzadas generadas demuestran actividad citotóxica contra células objetivo positivas para MCSP D3 humana provocada por PBMC humanas con eliminación de CD4/CD65 estimuladas o PBMC estimuladas y contra las células objetivo positivas para MCSP D3 de macaco provocada por la línea de linfocitos T de macaco 4119LnPx.
19. Estabilidad en plasma de anticuerpos monocatenarios biespecíficos específicos de especies cruzadas de MCSP y CD3
Se analizó la estabilidad de los anticuerpos monocatenarios biespecíficos generados en plasma humano mediante la incubación de los anticuerpos monocatenarios biespecíficos en plasma humano al 50 % a 37 °C y a 4 °C durante 24 horas y la posterior realización de pruebas de bioactividad. Se estudió la bioactividad en un ensayo de citotoxicidad in vitro de liberación de cromo 51 (51Cr) usando una línea celular CHO positiva para MCSP (que expresa MCSP clonado de acuerdo con el ejemplo 14 o 15) como objetivo y linfocitos T humanos positivos para CD8 como células efectoras.
Los valores de CE50 calculados por el programa de análisis descrito anteriormente se usaron para la comparación de la bioactividad de anticuerpos monocatenarios biespecíficos incubados con plasma humano al 50 % durante 24 horas a 37 °C y a 4 °C, respectivamente, con anticuerpos monocatenarios biespecíficos sin adición de plasma o mezclados con la misma cantidad de plasma inmediatamente antes del ensayo.
Como se muestra en la figura 22 y en la tabla 3, la bioactividad de los anticuerpos biespecíficos G4 H-L x I2C H-L, G4 H-L x H2C H-L y G4 H-L x F12Q H-L no disminuyó significativamente en comparación con los controles sin la adición de plasma o con la adición de plasma inmediatamente antes de realizar las pruebas de bioactividad.
55 Tabla 3: bioactividad de los anticuerpos biespecíficos sin o con la adición de plasma
Construcción
Sin plasma Con plasma Plasma a 37 °C Plasma a 4 °C
G4 H-L x I2C H-L
300 796 902 867
G4 H-L x H2C H-L
496 575 2363 1449
G4 H-L x F12Q H-L
493 358 1521 1040
20. La redistribución de linfocitos T circulantes en ausencia de células objetivo circulantes mediante una primera exposición a moléculas de unión a CD3 dirigidas epítopos de CDE convencionales, es decir, dependientes del contexto, es un factor de riesgo principal para acontecimientos adversos relacionados con el inicio del tratamiento
Redistribución de linfocitos T en pacientes con linfoma no hodgkiniano de linfocitos B (LNH-B) después del inicio del tratamiento con la molécula de unión a CD3 convencional
Una molécula de unión a CD19xCD3 convencional es una molécula de unión a CD3 de formato scFv en tándem biespecífico (Loffler (2000, Blood, volumen 95, número 6) o en el documento WO 99/54440). Consiste en dos porciones de unión diferentes dirigidas contra (i) CD19 sobre la superficie de linfocitos B humanos normales y malignos y (ii) CD3 sobre linfocitos T humanos. Al entrecruzar el CD3 de linfocitos T con el CD19 de linfocitos B, esta construcción desencadena la lisis redirigida de linfocitos B normales y malignos por la actividad citotóxica de los linfocitos T. El epítopo de CD3 reconocido por una molécula de unión a CD3 convencional de este tipo está situado en la cadena épsilon de CD3, donde sólo adopta la conformación correcta si se incluye en el resto de la cadena épsilon y se mantiene en la posición adecuada por heterodimerización de la cadena épsilon con la cadena CD3 gamma o delta. La interacción de este epítopo altamente dependiente del contexto con una molécula de unión a CD3 convencional (véase, p. ej., Loffler (2000, Blood, volumen 95, número 6) o el documento WO 99/54440), incluso cuando se produce de manera puramente monovalente y sin entrecruzamiento alguno, puede inducir un cambio alostérico en la conformación de CD3, dando lugar a la exposición de una región rica en prolina, de lo contrario oculta, del dominio citoplásmico de CD3 épsilon. Una vez expuesta, la región rica en prolina puede reclutar la molécula de transducción de señales Nck2, que es capaz de desencadenar señales intracelulares adicionales. Aunque esto no es suficiente para la activación total de los linfocitos T, que definitivamente requiere el entrecruzamiento de varias moléculas de CD3 sobre la superficie de un linfocito T, p. ej., por entrecruzamiento de varias moléculas anti-CD3 unidas a varias moléculas CD3 sobre un linfocito T por varias moléculas CD19 sobre la superficie de un linfocito B, la interacción monovalente pura de moléculas de unión a CD3 convencionales a su epítopo dependiente del contexto sobre CD3 épsilon sigue sin ser inerte a los linfocitos T en términos de señalización. Sin comprometerse con ninguna teoría, las moléculas de unión a CD3 monovalentes convencionales (conocidas en la técnica) pueden inducir algunas reacciones de linfocitos T cuando se infunden en seres humanos, incluso en aquellos casos en los que no existan células objetivo circulantes disponibles para el entrecruzamiento de CD3. Una reacción de linfocitos T importante a la infusión intravenosa de una molécula de unión CD19xCD3 monovalente convencional en pacientes con LNH-B que esencialmente no tienen linfocitos B positivos para CD19 circulantes es la redistribución de linfocitos T tras el comienzo del tratamiento. En un ensayo clínico de fase I se ha descubierto que esta reacción de linfocitos T se produce durante la fase de comienzo de la infusión intravenosa de la molécula de unión a CD19xCD3 en todos los individuos sin linfocitos B objetivo positivos para CD19 circulantes de forma esencialmente independiente de la dosis de molécula de unión a CD19xCD3 (fig. 23). Sin embargo, se ha descubierto que los aumentos repentinos de la exposición a la molécula de unión a CD19xCD3 desencadenan prácticamente la misma reacción de redistribución de linfocitos T en estos pacientes que la exposición inicial de los linfocitos T a la molécula de unión a CD19xCD3 al comienzo del tratamiento (fig. 24 A) e incluso los aumentos graduales de la exposición a la molécula de unión a CD19xCD3 pueden tener aún efectos de redistribución sobre los linfocitos T circulantes (fig. 25). Además, se ha descubierto que esta reacción de redistribución de linfocitos T esencialmente independiente de la dosis en ausencia de células objetivo circulantes desencadenada por moléculas de unión a CD3 convencionales como la molécula de unión a CD19xCD3 (p. ej., divulgada en el documento WO 99/54440) en el 100 % de todos los individuos tratados es un factor de riesgo principal para acontecimientos adversos relacionados con el inicio del tratamiento.
De acuerdo con el protocolo del estudio, se incluyeron pacientes con linfoma no hodgkiniano de linfocitos B (LNH-B) de escasa malignidad en recidiva confirmada histológicamente, incluido el linfoma de células del manto, en un ensayo abierto multicentro de fase I con aumento de dosis entre pacientes. El protocolo del estudio fue aprobado por los comités de ética independientes de todos los centros participantes y se envió para su notificación a la autoridad reguladora responsable.
Para la inclusión en el estudio se requirió la existencia de enfermedad medible (al menos una lesión ≥ 1,5 cm) documentada por TAC. Los pacientes recibieron molécula de unión a CD19xCD3 convencional por infusión intravenosa continua con un sistema de minibomba portátil durante cuatro semanas a un caudal (es decir, nivel de dosis) constante. Se hospitalizó a los pacientes durante las primeras dos semanas de tratamiento antes de que se les diera el alta y continuaran con el tratamiento en casa. A los pacientes sin pruebas de progresión de la enfermedad después de cuatro semanas se les ofreció continuar con el tratamiento durante cuatro semanas más.
Hasta ese momento, se habían probado seis niveles de dosis diferentes sin alcanzar una dosis máxima tolerada (DMT): 0,5, 1,5, 5, 15, 30 y 60 µg/m2/24 h. De no observarse acontecimientos adversos definidos por el protocolo del estudio como TLD (toxicidad limitante de la dosis), las cohortes consistieron en tres pacientes cada una. En caso de una TLD entre los tres primeros pacientes, se amplió la cohorte a seis pacientes, lo que, que ausencia de una segunda TLD, permitió un aumento de dosis adicional. En consecuencia, se consideraron seguros los niveles de dosis sin TLD en cohortes con 3 pacientes o con una TLD en cohortes con 6 pacientes. En todos los pacientes que desarrollaron una TLD se retiró el tratamiento del estudio. A 15 y 30 µg/m2/24 h, se probaron diferentes modos de inicio del tratamiento durante las primeras 24 h en varias cohortes adicionales: (i) Aumento escalonado después de 5 µg/m2/24 h durante las primeras 24 h hasta la dosis de mantenimiento de 15 µg/m2/24 h (cohorte de pacientes 15escalonada), (ii) aumento continuo uniforme del caudal desde casi cero hasta 15 o 30 µg/m2/24 h (cohorte de pacientes 15-gradual y 30-gradual) y (iii) comienzo con la dosis de mantenimiento desde el principio (cohortes de pacientes 15-fija, 30-fija y 60-fija). Todas las cohortes de pacientes a los niveles de dosis 0,5, 1,5 y 5 µg/m2/24 h comenzaron con la dosis de mantenimiento desde el principio (es decir, inicio con dosis fija).
Se determinaron los cursos temporales de los recuentos absolutos de linfocitos B y T en sangre periférica mediante un análisis de FACS de cuatro colores como sigue.
Recogida de muestras de sangre y análisis rutinario
En las cohortes de pacientes 15-gradual, 15-fija, 30-gradual, 30-fija y 60-fija se obtuvieron muestras de sangre (6 ml) antes y 0,75, 2, 6, 12, 24, 30, 48 horas después del comienzo de la infusión de molécula de unión a CD19xCD3 (como se divulga en el documento WO 99/54440), así como en los días de tratamiento 8, 15, 17, 22, 24, 29, 36, 43, 50, 57 y 4 semanas después del final de la infusión de molécula de unión a CD19xCD3 convencional usando tubos Vacutainer™ que contenían EDTA (Becton Dickinson) que se enviaron para su análisis a 4 °C. En la cohorte de pacientes 15-escalonada se obtuvieron muestras de sangre (6 ml) antes y 6, 24, 30, 48 horas después del comienzo de la infusión de molécula de unión a CD19xCD3, así como en los días de tratamiento 8, 15, 22, 29, 36, 43, 50, 57 y 4 semanas después del final de la infusión de molécula de unión a CD19xCD3. A los niveles de dosis de 0,5, 1,5 y 5 µg/m2/24 h se obtuvieron muestras de sangre (6 ml) antes y 6, 24, 48 horas después del comienzo de la infusión de molécula de unión a CD19xCD3, así como en los días de tratamiento 8, 15, 22, 29, 36, 43, 50, 57 y 4 semanas después del final de la infusión de molécula de unión a CD19xCD3. En algunos casos se produjeron ligeras variaciones de estos puntos temporales por razones operativas. El análisis de FACS de las subpoblaciones linfocitarias se realizó en un plazo de 24 - 48 h después de la recogida de muestras de sangre. Las cantidades absolutas de subpoblaciones leucocitarias en las muestras de sangre se determinaron por medio de análisis de sangre diferenciales en un CoulterCounter™ (Coulter).
Aislamiento de PBMC a partir de muestras de sangre
El aislamiento de PBMC (células mononucleares de sangre periférica) se realizó mediante un protocolo de
separación en gradiente de Ficoll™ adaptado. Se transfirió la sangre a temperatura ambiente a tubos Leucosep™ de 10 ml (Greiner) precargados con 3 ml de solución Biocoll™ (Biochrom).
Se llevó a cabo la centrifugación en un rotor basculante durante 15 min a 1700 x g y 22 °C sin desaceleración. Se aislaron las PBMC por encima de la capa de Biocoll™, se lavaron una vez con tampón de FACS (PBS / FBS al 2 % [suero fetal bovino; Biochrom]), se centrifugaron y se resuspendieron en tampón de FACS. La centrifugación durante todas las etapas de lavado se llevó a cabo en un rotor basculante durante 4 min a 800 x g y 4 °C. En caso necesario, se realizó la lisis de los eritrocitos incubando las PBMC aisladas en 3 ml de tampón de lisis de eritrocitos (8,29 g de NH4CI, 1,00 g de KHCO3, 0,037 g de EDTA y 1,0 l de H2Obidest, a pH 7,5) durante 5 min a temperatura ambiente seguido de una etapa de lavado con tampón de FACS.
Tinción de PBMC con anticuerpos marcados con fluorescencia contra moléculas de superficie celular
Se obtuvieron anticuerpos monoclonales de Invitrogen (1N.º de cat. MHCD1301, 2N.º de cat. MHCD1401), Dako (5N.º de cat. C7224) o Becton Dickinson (3N.º de cat. 555516, 4N.º de cat. 345766) y se usaron de acuerdo con las recomendaciones de los fabricantes. Se tiñeron 5x105 - 1x106 células con la siguiente combinación de anticuerpos: anti-CDIS1 / anti-CD142 (FITC) x anti-CD563 (PE) x anti-CD34 (PerCP) x anti-CD195 (APC). Se sedimentaron las células en placas de multivaloración de 96 pocillos en forma de V (Greiner) y se retiró el sobrenadante. Se resuspendieron los sedimentos celulares en un volumen total de 100 µl que contenía los anticuerpos específicos diluidos en tampón de FACS. Se llevó a cabo la incubación a oscuras durante 30 min a 4 °C. Posteriormente, se lavaron las muestras dos veces con tampón de FACS y se resuspendieron los sedimentos celulares en tampón de FACS para el análisis por citometría de flujo.
Detección por citometría de flujo de linfocitos teñidos por FACS
Se realizó la recogida de datos con un FACSCalibur™ BD de 4 colores (Becton Dickinson). Para cada medida, se
adquirieron 1x104 células de subpoblaciones linfocitarias definidas. Se realizó el análisis estadístico con el programa
CellQuest Pro™ (Becton Dickinson) para obtener los porcentajes de las subpoblaciones linfocitarias y para clasificar
la intensidad de expresión de moléculas de superficie celular. Posteriormente, se correlacionaron los porcentajes de subconjuntos de linfocitos individuales con relación a los linfocitos totales (es decir, linfocitos B más T más NK, excluyendo cualquier célula mielógena por tinción de CD13/14) determinados por FACS con el recuento linfocitario de los análisis de sangre diferenciales para calcular la cantidad absoluta de linfocitos T (CD3+, CD56-, CD13/14-) y linfocitos B (CD19+, CD13/14-).
En la fig. 23 se muestra la redistribución de linfocitos T durante la fase inicial del tratamiento con molécula de unión a CD19xCD3 convencional (p. ej., la divulgada en el documento WO 99/54440) en todos los pacientes que no tenían esencialmente linfocitos B positivos para CD19 al inicio del tratamiento. Para su comparación, en la fig. 26 se muestra un ejemplo representativo de redistribución de linfocitos T durante la fase inicial del tratamiento con molécula de unión a CD19xCD3 en un paciente con una cantidad significativa de linfocitos B positivos para CD19 circulantes.
En ambos casos (es decir, esencialmente ninguno o muchos linfocitos B circulantes) los recuentos de linfocitos T circulantes disminuyen rápidamente tras el inicio del tratamiento. Sin embargo, en ausencia de linfocitos B circulantes, los linfocitos T tienden a volver a la sangre circulante muy pronto, mientras que la vuelta de los linfocitos T a la sangre circulante de los pacientes que tienen una cantidad significativa de linfocitos B circulantes al inicio del tratamiento se suele retrasar hasta la eliminación de estos linfocitos B circulantes. Así, los patrones de redistribución de linfocitos T difieren principalmente en la cinética de la reaparición de linfocitos T en la sangre circulante.
Se llevó a cabo la evaluación de la eficacia basada en TAC por radiología de referencia central después de 4 semanas de tratamiento y en pacientes que recibieron 4 semanas adicionales, también después de 8 semanas de tratamiento más, en todos los casos, cuatro semanas después del final del tratamiento. Se contó como respuesta completa (RC) la desaparición y/o normalización del tamaño de todas las lesiones conocidas (incluida la esplenomegalia) más la eliminación de células de linfoma de la médula ósea en casos de infiltración en la médula ósea. La reducción en al menos el 50 % respecto al valor de referencia de la suma de los productos de los dos diámetros mayores (SPD) de cada lesión objetivo predefinida se definió como respuesta parcial (RP); una reducción de al menos el 25 % se consideró una respuesta mínima (RM). Se definió la enfermedad progresiva (EP) como un aumento de > 50 % del SPD con respecto al valor de referencia. Las desviaciones del SPD con respecto al valor de referencia entre el +50 % y -25 % se consideraron como enfermedad estable (EE).
En la tabla 4 se resumen los datos demográficos de los pacientes, la dosis recibidas y la respuesta clínica de 34 pacientes. La actividad clínica antitumoral de la molécula de unión a CD19xCD3 era claramente dependiente de la dosis. Se observó una eliminación consistente de linfocitos B positivos para CD19 circulantes (linfoma) en la sangre periférica desde 5 µg/m2/24 h en adelante. A 15 µg/m2/24 h y 30 µg/m2/24 h se registraron las primeras respuestas clínicas objetivas (RP y RC), así como casos de eliminación parcial y completa de células de linfoma B de la médula ósea infiltrada. Por último, a 60 µg/m2/24 h la tasa de respuesta aumentó al 100 % (RP y RC) y la eliminación de células de linfoma B de la médula ósea fue completa en todos los casos evaluables.
La mayoría de los pacientes toleraron bien la molécula de unión a CD19xCD3. En la tabla 5 se resumen los acontecimientos adversos más frecuentes de grados 1-4 en 34 pacientes, independientemente de la causalidad. Los acontecimientos adversos relacionados con la molécula de unión a CD19xCD3 fueron habitualmente transitorios y totalmente reversibles. En particular, hubo 2 pacientes (pacientes n.º 19 y n.º 24 de la tabla 4) esencialmente sin linfocitos B positivos para CD19 circulantes cuyo tratamiento se retiró antes debido a acontecimientos adversos en el SNC (síntomas principales: confusión y desorientación) relacionados con la redistribución de linfocitos T repetida durante la fase inicial de la infusión de molécula de unión a CD19xCD3.
Uno de estos pacientes (n.º 19) estaba en la cohorte 15-escalonada. Recibió 5 µg/m2/24 h de molécula de unión a CD19xCD3 durante las primeras 24 h, seguido de un aumento repentino a la dosis de mantenimiento de 15 µg/m2/24
h. El patrón de redistribución de linfocitos T correspondiente muestra que los recuentos de linfocitos T circulantes disminuyeron rápidamente tras la infusión a 5 µg/m2/24 h, seguido de la reaparición temprana de linfocitos T en la sangre circulante esencialmente sin linfocitos B positivos para CD19 circulantes. Como consecuencia, los recuentos de linfocitos T periféricos se habían recuperado totalmente cuando se aumentó la dosis de molécula de unión a CD19xCD3 después de 24 h desde 5 hasta 15 µg/m2/24 h. Por lo tanto, el aumento escalonado de la dosis podría desencadenar un segundo episodio de redistribución de linfocitos T como se muestra en la fig. 24 A. Esta redistribución de linfocitos T repetida se relacionó con efectos secundarios en el SNC (síntomas principales: confusión y desorientación) en este paciente, que condujeron a la retirada de la infusión. La relación entre la redistribución de linfocitos T repetida y estos acontecimientos adversos en el SNC también se observó en ensayos clínicos de fase I anteriores en pacientes con LNH-B que recibieron molécula de unión a CD19xCD3 (p. ej., la divulgada en el documento WO 99/54440) como infusión intravenosa rápida repetida durante de 2 a 4 horas cada una, seguida habitualmente de un intervalo de 2 días sin tratamiento (fig. 24 B). Cada infusión intravenosa rápida individual desencadenó un episodio de redistribución de linfocitos T que consistió en una rápida disminución de los recuentos de linfocitos T circulantes y recuperación de linfocitos antes de la siguiente infusión intravenosa rápida. En total, se observaron acontecimientos adversos en el SNC relacionados con la redistribución de linfocitos T repetida en 5 de 21 pacientes. La fig. 24 B muestra el ejemplo representativo de un paciente de los ensayos de infusión intravenosa rápida que desarrolló síntomas en el SNC después del tercer episodio de redistribución de linfocitos T. Típicamente, los pacientes con acontecimientos adversos en el SNC en los ensayos de infusión intravenosa rápida también tenían recuentos bajos de linfocitos B circulantes.
El segundo paciente (n.º 24) del ensayo de infusión continua, cuyo tratamiento se retiró pronto debido a acontecimientos adversos en el SNC (síntomas principales: confusión y desorientación) relacionados con la redistribución de linfocitos T repetida durante la fase inicial de la infusión de molécula de unión a CD19xCD3, estaba en la cohorte 15-fija. Por error, este paciente recibió una infusión de molécula de unión a CD19xCD3 sin HSA adicional, necesaria para la estabilización del fármaco. El flujo irregular de fármaco resultante desencadenó episodios repetidos de redistribución de linfocitos T en lugar de sólo uno (fig. 27 A) con la consecuencia de que hubo que retirar la infusión debido al desarrollo de síntomas en el SNC. Sin embargo, cuando el mismo paciente comenzó de nuevo correctamente con solución de molécula de unión a CD19xCD3 que contenía HSA adicional para la estabilización del fármaco (p. ej., la divulgada en el documento WO 99/54440), no se observó redistribución de linfocitos T repetida y el paciente no desarrolló otra vez síntomas en el SNC (fig. 27 B). Debido a que este paciente tampoco tenía esencialmente linfocitos B circulantes, los linfocitos T circulantes pudieron reaccionar con una cinética de redistribución rápida incluso ante cambios sutiles en la exposición al fármaco, como se observa. Los acontecimientos adversos en el SNC relacionados con la redistribución de linfocitos T en pacientes que esencialmente no tienen células objetivo circulantes se pueden explicar por un aumento transitorio de la capacidad de adhesión de los linfocitos T a las células endoteliales seguido de la adhesión simultánea masiva de linfocitos T circulantes a las paredes de los vasos sanguíneos con un descenso consecutivo de la cantidad de linfocitos T en la sangre circulante, como se observa. La unión simultánea masiva de linfocitos T a las paredes de los vasos sanguíneos puede provocar un aumento de la permeabilidad endotelial y de la activación de las células endoteliales. Las consecuencias del aumento de la permeabilidad endotelial son los desplazamientos de fluidos desde el compartimento intravascular hasta los compartimentos de tejido intersticial, incluido el intersticio del SNC. La activación de las células endoteliales por linfocitos T unidos puede tener efectos procoagulantes (Monaco et al. J Leukoc Biol 71 (2002) 659-668) con posibles alteraciones del flujo sanguíneo (incluido el flujo sanguíneo cerebral), en particular con respecto a la microcirculación capilar. Por tanto, los acontecimientos adversos en el SNC relacionados con la redistribución de linfocitos T en pacientes esencialmente sin células objetivo circulantes puede ser consecuencia de fugas capilares y/o alteraciones en la microcirculación capilar a través de la adherencia de linfocitos T a las células endoteliales. La mayoría de los pacientes tolera el estrés endotelial provocado por un episodio de redistribución de linfocitos T, mientras que el estrés endotelial potenciado provocado por la redistribución de linfocitos T repetida provoca frecuentemente acontecimientos adversos en el SNC. Más de un episodio de redistribución de linfocitos T puede ser menos peligroso sólo en pacientes que tienen recuentos de referencia bajos de linfocitos T circulantes. Sin embargo, también el estrés endotelial limitado provocado por un episodio de redistribución de linfocitos T puede provocar acontecimientos adversos en el SNC en casos poco frecuentes de aumento de la susceptibilidad a acontecimientos de este tipo, como se observa en 1 de 21 pacientes en los ensayos de infusión intravenosa rápida con la molécula de unión a CD19xCD3.
Sin comprometerse con ninguna teoría, el aumento transitorio de la capacidad de adhesión de los linfocitos T a las células endoteliales en pacientes que esencialmente no tienen células objetivo circulantes se puede explicar como la reacción de los linfocitos T a la interacción monovalente de una molécula de unión a CD3 convencional, como la molécula de unión a CD19xCD3 (p. ej., en el documento WO 99/54440), a su epítopo dependiente del contexto sobre CD3 épsilon, dando lugar a un cambio alostérico en la conformación de CD3 seguido por el reclutamiento de Nck2 al dominio citoplásmico de CD3 épsilon como se describe anteriormente. Dado que Nck2 se une directamente a las integrinas por medio de PINCH e ILK (fig. 28), el reclutamiento de Nck2 al dominio citoplásmico de CD3 épsilon después de un cambio alostérico en la conformación de CD3 a través de la unión a una molécula de unión a CD3 convencional, como la molécula de unión a CD19xCD3, a su epítopo dependiente del contexto sobre CD3 épsilon, puede aumentar la capacidad de adhesión de los linfocitos T a las células endoteliales mediante el cambio transitorio de las integrinas de la superficie de los linfocitos T a su isoforma más adhesiva por medio de señalización de dentro a fuera.
Tabla 4. Datos demográficos del paciente y respuesta clínica
Cohorte
Paciente Edad/ Sexo Enfermedad (clasificación de Ann Arbor) Nivel de dosis [mg/m2/día] Eliminación de médula ósea Mejor respuesta* (duración de la RC en meses o semanas)
1
1
71/m IC, Binet C 0,0005 Nada EE
2
67/f MCL, estadio IV/A/E 0,0005 n.d. EP
3
67/m CLL, estadio IV/B/E 0,0005 n.d. RM
2
4 69/m MCL, estadio IV/B 0,0015 n.i. EE
5
49/m MCL, estadio IV/A/s 0,0015 n.d. EE
6
71/m MCL, estadio IV/B/E 0,0015 n.i. EP
7
77/m MCL, estadio IV/B/E/S 0,0015 n.i. EE
8
65/m CLL, estadio IV/B/E/S 0,0015 n.d. EP
9
75/m FL, estadio II/B 0,0015 n.i. EE
(continuación)
Cohorte
Paciente Edad/ Sexo Enfermedad (clasificación de Ann Arbor) Nivel de dosis [mg/m2/día] Eliminación de médula ósea Mejor respuesta* (duración de la RC en meses o semanas)
3
10 58/m MCL, estadio III/B/S 0,005 n.i. EP
11
68/f FL, estadio IV/B 0,005 n.d. EE
12
65/m MCL, estadio III/A/E 0,005 n.i. EE
4a
13 60/m SLL, estadio IV/B/S 0,015 Completa RP
14
73/m MCL, estadio II/A/E 0,015 n.i. EE
15
44/m FL, estadio IV/B/E/S 0,015 Parcial RP
16
61/m FL, estadio IV/A/S 0,015 Completa RC (7m)
17
67/m MZL, estadio IV/B/S 0,015 n.i. n.e.
18
64/m FL, estadio IV/A/E 0,015 n.i. EP
19
75/m MCL, estadio III/A 0,015 n.i. n.e.
20
65/f FL; estadio III/A 0,015 n.i. EE
21
60/m MCL, estadio IV/A/E 0,015 Ninguno EE
22
67/f FL, estadio IV/B 0,015 Completa RM
23
67/m DLBCL, estadio III/B 0,015 n.i. n.e.
24
65/f FL, estadio III/A 0,015 n.d. EE
25
74/f WD, estadio IV/B 0,015 Parcial EE
5
26 67/m MCL, estadio IV/A 0,03 Completa EE
27
48/m FL, estadio III/A 0,03 n.i. EP
28
58/m MCL, estadio III/A 0,03 n.i. RC (10m+)
29
45/f MCL, estadio IV/B 0,03 Parcial EP
30
59/m MZL, estadio III/A 0,03 n.i. n.e.
31
43/m FL, estadio III/A 0,03 n.i. RM
6
32 72/m MCL, estadio IV/A 0,06 Completa RP
33
55/m MCL, estadio IV/B 0,06 Completa RC (4m+)
34
52/m FL, estadio IV/A 0,06 n.i. RCb(1s+)
*Respuestas completas (RC) y parciales (RP) confirmadas centralmente por los criterios de Cheson en negrilla; RM, 5 respuesta mínima (≥25 a <50 %); EE, enfermedad estable; EP, enfermedad progresiva; duración desde la primera
documentación de la respuesta entre paréntesis; + indica una respuesta en curso ase amplió la cohorte 4 para estudiar tres pautas de inicio de tratamiento diferentes bRP después de 8 semanas de tratamiento que se convirtió en una RC después de un ciclo de tratamientos adicional de 4 semanas a la misma dosis después de un intervalo de 7 semanas sin tratamiento
10 n.e.: no evaluable, por periodo de tratamiento <7 d n.d.: no determinado (infiltrado, pero no se realiza segunda biopsia al final del tratamiento) n.i.: no infiltrado al inicio del tratamiento Tabla 5. Incidencia de acontecimientos adversos observados durante el tratamiento
Acontecimientos adversos independientemente de la relación, producidos en > 3 pacientes (N-34)
Grado 1-4 N (%) Grado 3-4 N (%)
Pirexia
22 (64,7) 2 (5,9)
Leucocitopenia
21 (61,8) 11 (32,4)
Linfocitopenia
21 (61,8) 21 (61,8)
Coagulopatía (aumento de dímeros D)
16 (47,1) 6 (17,6)
Anomalía enzimática (AP, LDH, CRP)
16 (47,1) 10 (29,4)
(continuación)
Acontecimientos adversos independientemente de la relación, producidos en > 3 pacientes (N-34)
Grado 1-4 N (%) Grado 3-4 N (%)
Anomalía de la función hepática (ALT, AST, GGT)
16 (47,1) 1 (2,9)
Anemia
13 (38,2) 5 (14,7)
Escalofríos
13 (38,2) 0 (0,0)
Cefalea
12 (35,3) 1 (2,9)
Hipopotasiemia
12 (35,3) 2 (5,9)
Trombocitopenia
12 (35,3) 6 (17,6)
Aumento de peso
12 (35,3) 0 (0,0)
Hiperglucemia
11 (32,4) 2 (5,9)
Neutrocitopenia
11 (32,4) 8 (23,5)
Hematuria
10 (29,4) 0 (0,0)
Edema periférico
10 (29,4) 2 (5,9)
Anorexia
9 (26,5) 1 (2,9)
Diarrea
9 (26,5) 0 (0,0)
Disminución de peso
9 (26,5) 0 (0,0)
Fatiga
8 (23,5) 1 (2,9)
Proteinuria
8 (23,5) 0 (0,0)
Hipocalciemia
7 (20,6) 2 (5,9)
Anomalía en enzimas pancreáticas
7 (20,6) 0 (0,0)
Tos
6 (17,6) 0 (0,0)
Disnea
6 (17,6) 0 (0,0)
Dolor de espalda
5 (14,7) 0 (0,0)
Dolor en el sitio del catéter
5 (14,7) 0 (0,0)
Hiperbilirrubinemia
5 (14,7) 2 (5,9)
Hipoalbuminemia
5 (14,7) 0 (0,0)
Hipogammaglobulinemia
5 (14,7) 1 (2,9)
Hipoproteinemia
5 (14,7) 0 (0,0)
Derrame pleural
5 (14,7) 1 (2,9)
Vómitos
5 (14,7) 0 (0,0)
Astenia
4 (11,8) 1 (2,9)
Estado confuso
4 (11,8) 0 (0,0)
Estreñimiento
4 (11,8) 0 (0,0)
Mareo
4 (11,8) 0 (0,0)
Hipertensión
4 (11,8) 0 (0,0)
Hiponatremia
4 (11,8) 2 (5,9)
Sequedad de las mucosas
4 (11,8) 0 (0,0)
Espasmos musculares
4 (11,8) 0 (0,0)
Náuseas
4 (11,8) 0 (0,0)
Sudores nocturnos
4 (11,8) 0 (0,0)
Dolor abdominal
3 (8,8) 1 (2,9)
Ascitis
3 (8,8) 0 (0,0)
Hipercoagulación
3 (8,8) 0 (0,0)
Hiperhidrosis
3 (8,8) 0 (0,0)
Hipoglobulinemia
3 (8,8) 0 (0,0)
Insomnio
3 (8,8) 0 (0,0)
Trastorno hepático
3 (8,8) 1 (2,9)
Nasofaringitis
3 (8,8) 0 (0,0)
Prurito
3 (8,8) 0 (0,0)
Las abreviaturas usadas son: AA, acontecimiento adverso; AP, fosfatasa alcalina; LDH, lactato deshidrogenasa; CRP, proteína C reactiva; ALT, alanina transaminasa; AST, aspartato transaminasa; GGT, gamma-glutamil
65
transferasa; Datos de AA del ciclo de tratamiento adicional del paciente 34 no incluidos todavía.
Como se explica anteriormente, las moléculas de unión a CD3 convencionales (p. ej., las divulgadas en el documento WO 99/54440) capaces de unirse a un epítopo dependiente del contexto, si bien son funcionales, conducen al efecto indeseado de redistribución de linfocitos T en pacientes, provocando acontecimientos adversos en el SNC. En contraste, las moléculas de unión de la presente invención, al unirse a los aminoácidos 1-27 Nterminales independientes del contexto de la cadena épsilon del CD3, no conducen a estos efectos de redistribución de linfocitos T. Como consecuencia, las moléculas de unión a CD3 de la invención se asocian con un perfil de seguridad mejor en comparación con las moléculas de unión a CD3 convencionales.
21. Las moléculas de unión a CD3 biespecíficas de la invención que inducen lisis de células objetivo mediada por linfocitos T mediante el reconocimiento de un antígeno de superficie eliminan las células positivas para el antígeno objetivo in vivo
Una molécula de unión a CD3 biespecífica de la invención que reconoce CD33 como antígeno objetivo elimina los monocitos positivos para CD33 circulantes de la sangre periférica de monos cynomolgus
Se produjo CD33-AF5 VH-VL x I2C VH-VL (secuencia de aminoácidos: SEQ ID NO: 415) mediante la expresión en células CHO usando la secuencia de nucleótidos codificante SEQ ID NO: 416. Las secuencias codificantes de (i) un líder N-terminal de cadena pesada de inmunoglobulina que comprende un codón de inicio incluido en una secuencia de consenso de Kozak y (ii) una marca His6 C-terminal seguida de un codón de detención, se unieron en fase con la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO 416 antes de la inserción del fragmento de ADN resultante obtenido por síntesis génica en el sitio de clonación múltiple del vector de expresión pEF-DHFR (Raum et al. Cancer Immunol Immunother 50 (2001) 141-150). La transfección estable de células CHO deficientes en DHFR, la selección de transfectantes positivos para DHFR que segregaban la molécula de unión a CD3 CD33-AF5 VH-VL x I2C VH-VL en el sobrenadante de cultivo y la amplificación de genes con metotrexato para aumentar los niveles de expresión se llevaron a cabo como se describe (Mack et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 (1995) 7021-7025). El material de prueba para el tratamiento de monos cynomolgus se produjo en un fermentador de 20 litros. La purificación de proteínas a partir de lo recogido en 3 ciclos de producción fue a base de cromatografía de afinidad IMAC dirigida a la marca His6 C-terminal de CD33-AF5 VH-VL x I2C VH-VL, seguido de cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) preparativa. El rendimiento total de material de prueba sin endotoxinas fue de 60 mg. El perfil analítico de la SEC de CD33-AF5 VH-VL x I2C VH-VL para su uso en monos cynomolgus reveló que el material de prueba consistía casi exclusivamente en monómero. La potencia del material de prueba se midió en un ensayo de citotoxicidad como se describe en el ejemplo 23.5, usando células CHO transfectadas con CD33 de cynomolgus como células objetivo y la línea de linfocitos T de macaco 4119LnPx como fuente de células efectoras (fig. 29). Se determinó que la concentración de CD33-AF5 VH-VL x I2C VH-VL necesaria para la lisis semimáxima de células objetivo por los linfocitos T efectores (CE50) era de 2,7 ng/ml.
Se trataron monos cynomolgus (Macaca fascicularis) adultos jóvenes (de aprox. 3 años de edad) por infusión intravenosa continua de molécula de unión a CD3 CD33-AF5 VH-VL x I2C VH-VL a diferentes caudales (es decir, niveles de dosis) para estudiar la eliminación de monocitos positivos para CD33 circulantes de la sangre periférica. Esta situación es equivalente al tratamiento con la molécula de unión a CD3 convencional CD19xCD3 (específica para CD19 sobre linfocitos B y CD3 sobre linfocitos T) de los pacientes con LNH-B, que tienen linfocitos B objetivo positivos para CD19 circulantes (véase, p. ej. el documento WO 99/54440). La eliminación de los linfocitos B objetivo positivos para CD19 circulantes de la sangre periférica resultó un sustituto válido de la eficacia clínica general de la molécula de unión a CD3 convencional (CD19xCD3 como se proporciona en el documento WO99/54440) en pacientes con neoplasias malignas de linfocitos B positivos para CD19 como el LNH-B. Análogamente, la eliminación de monocitos positivos para CD33 circulantes de la sangre periférica se considera un sustituto válido de la eficacia clínica general de las moléculas de unión a CD33 biespecíficas dirigidas a CD3 de la invención como CD33-AF5 VH-VL x I2C VH-VL en pacientes con neoplasias malignas mielógenas positivas para CD33 como la LMA (leucemia mielógena aguda).
La infusión continua se llevó a cabo de acuerdo con el procedimiento de Swivel como sigue:
Se cateteriza a los monos por la vena femoral hacia la vena cava inferior usando un catéter venoso. Se introduce el catéter por vía subcutánea hacia la región posterior del hombro y se saca al exterior en el omóplato inferior. Después, se pasa un tubo a través de una funda y un resorte de protección. Se fija la funda alrededor del animal y se conecta el catéter, por medio del tubo, a una bomba de infusión.
Se infundió solución de administración (lisina 1,25 M, Tween 80 al 0,1 %, a pH 7) sin material de prueba de forma continua a 48 ml/24 h durante 7 días antes del inicio del tratamiento para permitir la aclimatación de los animales a las condiciones de infusión. Se inició el tratamiento mediante la adición de material de prueba de CD33-AF5 VH-VL x I2C VH-VL a la solución de administración en la cantidad necesaria para cada nivel de dosis individual que se quería probar (es decir, caudal de CD33-AF5 VH-VL x I2C VH-VL). Se cambió el depósito de infusión cada día durante toda la aclimatación y la fase de tratamiento. La duración planeada del tratamiento fue de 7 días, excepto para el nivel de dosis de 120 µg/m2/24 h, donde los animales recibieron 14 días de tratamiento.
Los cursos temporales de los recuentos absolutos de linfocitos T y monocitos positivos para CD33 circulantes se determinaron por análisis de FACS de 4 o 3 colores, respectivamente.
Recogida de muestras de sangre y análisis rutinario
Se obtuvieron muestras de sangre (1 ml) antes y 0,75, 2, 6, 12, 24, 30, 48, 72 horas después de inicio de la infusión continua con MCSP-G4 VH-VL x I2C VH-VL, así como después de 7 y 14 días (y después de 9 días al nivel de dosis de 120 µg/m2/24 h) de tratamiento usando tubos Vacutainer™ que contenían EDTA (Becton Dickinson) que se enviaron para su análisis a 4 °C. En algunos casos se produjeron ligeras variaciones de estos puntos temporales por razones operativas. El análisis de FACS de las subpoblaciones linfocitarias se realizó en un plazo de 24 -48 h después de la recogida de muestras de sangre. Las cantidades absolutas de subpoblaciones leucocitarias en las muestras de sangre se determinaron por medio de análisis de sangre diferenciales en un laboratorio veterinario de rutina.
Aislamiento de PBMC a partir de muestras de sangre
El aislamiento de PBMC (células mononucleares de sangre periférica) se realizó mediante un protocolo de
separación en gradiente de Ficoll™ adaptado. Se transfirió la sangre a temperatura ambiente a tubos Falcon™ de 5 ml precargados con 1 ml de solución Biocoll™ (Biochrom). Se llevó a cabo la centrifugación en un rotor basculante durante 15 min a 1700 x g y 22 °C sin desaceleración. Se aislaron las PBMC por encima de la capa de Biocoll™, se lavaron una vez con tampón de FACS (PBS / FBS al 2 % [suero fetal bovino; Biochrom]), se centrifugaron y se resuspendieron en tampón de FACS. La centrifugación durante todas las etapas de lavado se llevó a cabo en un rotor basculante durante 4 min a 800 x g y 4 °C. En caso necesario, se realizó la lisis de los eritrocitos incubando las PBMC aisladas en 3 ml de tampón de lisis de eritrocitos (8,29 g de NH4CI, 1,00 g de KHCO3, 0,037 g de EDTA y 1,0 l de H2Obidest, a pH 7,5) durante 5 min a temperatura ambiente seguido de una etapa de lavado con tampón de FACS.
Tinción de PBMC con anticuerpos marcados con fluorescencia contra moléculas de superficie celular
Se obtuvieron anticuerpos monoclonales reactivos con antígenos de cynomolgus de Becton Dickinson (1N.º de cat. 345784, 2N.º de cat. 556647, 3N.º de cat. 552851, 6N.º de cat. 557710), Beckman Coulter (4N.º de cat. IM2470) y Miltenyi (5N.º de cat. 130-091-732) y se usaron de acuerdo con las recomendaciones de los fabricantes. Se tiñeron 5x105 - 1x106 células con las siguientes combinaciones de anticuerpos: anti-CD141 (FITC) x anti-CD562 (PE) x anti-CD33 (PerCP) x anti-CD194 (APC) y anti-CD141 (FITC) x anti-CD335 (PE) x anti-CD166 (Alexa Fluor 647™). Se sedimentaron las células en placas de multivaloración de 96 pocillos en forma de V (Greiner) y se retiró el sobrenadante. Se resuspendieron los sedimentos celulares en un volumen total de 100 µl que contenía los anticuerpos específicos diluidos en tampón de FACS. Se llevó a cabo la incubación a oscuras durante 30 min a 4 °C. Posteriormente, se lavaron las muestras dos veces con tampón de FACS y se resuspendieron los sedimentos celulares en tampón de FACS para el análisis por citometría de flujo.
Detección por citometría de flujo de linfocitos teñidos por FACS
Se realizó la recogida de datos con un FACSCalibur™ BD de 4 colores (Becton Dickinson). Para cada medida, se
adquirieron 1x104 células de subpoblaciones linfocitarias definidas. Se realizó el análisis estadístico con el programa CellQuest Pro™ (Becton Dickinson) para obtener los porcentajes de las subpoblaciones linfocitarias y para clasificar la intensidad de expresión de moléculas de superficie celular. Posteriormente, se correlacionaron los porcentajes de subconjuntos de linfocitos individuales con relación a los linfocitos totales (es decir, linfocitos B más T más NK, excluyendo las células mielógenas por tinción de CD14) determinados por FACS con el recuento linfocitario de los análisis de sangre diferenciales para calcular las cantidades celulares absolutas de linfocitos T (CD3+, CD56-, CD14). Las cantidades absolutas de monocitos positivos para CD33 se calcularon multiplicando los recuentos de monocitos de los análisis de sangre diferenciales con las proporciones correspondientes de monocitos positivos para CD33 (CD33+, CD14+) respecto a todos los monocitos (CD14+) determinadas por FACS.
En la fig. 30 A se muestra el porcentaje comparado con el valor de referencia (es decir el 100 %) de los recuentos absolutos de monocitos positivos para CD33 circulantes al final del tratamiento con CD33-AF5 VH-VL x I2C VH-VL en 4 cohortes de 2 monos cynomolgus con aumento de dosis inter-cohorte desde 30 pasando por 60 y 240 hasta 1000 µg/m2/24 h.
Como se muestran en la fig. 30 A, la infusión intravenosa continua de CD33-AF5 VH-VL x I2C VH-VL induce la eliminación de monocitos positivos para CD33 circulantes de una manera dependiente de la dosis. Aunque a 30 µg/m2/24 h todavía no existía una eliminación detectable de monocitos positivos para CD33 circulantes, después de 7 días de tratamiento a 60 µg/m2/24 h se hizo visible una primera tendencia hacia una reducción de los recuentos de monocitos positivos para CD33. A 240 µg/m2/24 h la práctica totalidad de los monocitos positivos para CD33 circulantes se habían eliminado de la sangre periférica después de 3 días de tratamiento. Esto se logró aún más rápido a 1000 µg/m2/24 h, donde la eliminación de los monocitos positivos para CD33 circulantes de la sangre periférica ya se había completado después de 1 día de tratamiento. Este descubrimiento se confirmó mediante los resultados mostrados en la figura 30 B, que demuestran la eliminación de monocitos positivos para CD33 circulantes en dos tercios y el 50 % en comparación con el valor de referencia correspondiente en dos monos cynomolgus tratados por infusión continua con CD33-AF5 VH-VL x I2C VH-VL a 120 µg/m2/24 h durante 14 días.
Este resultado es una señal clara de eficacia clínica de las moléculas de unión a CD3 de la invención en general y de las moléculas de unión a CD3 dirigidas a CD33 biespecíficas de la invención para el tratamiento de neoplasias malignas positivas para CD33 como la LMA en particular.
Además, la redistribución de linfocitos T durante la fase inicial del tratamiento con CD33-AF5 VH-VL x I2C VH-VL en presencia de células objetivo circulantes (es decir, monocitos positivos para CD33) parece menos pronunciada que la redistribución de linfocitos T durante la fase inicial del tratamiento con construcciones CD19xCD3 convencionales, como se describe en el documento WO99/54440 en pacientes con LNH-B con una cantidad significativa de células objetivo circulantes (es decir, linfocitos B positivos para CD19) como se muestra en la fig. 26. Aunque los linfocitos T desaparecen completamente de la circulación tras el inicio de la infusión de CD19xCD3 y no reaparecen hasta la eliminación de los linfocitos B positivos para CD19 circulantes de la sangre periférica (fig. 26), la desaparición inicial de linfocitos T circulantes es incompleta tras el inicio de la infusión con CD33-AF5 VH-VL x I2C VH-VL y los recuentos de linfocitos T se recuperan aun durante la presencia de células objetivo positivas para CD33 circulantes (fig. 30 B). Esto confirma que las moléculas de unión a CD3 de la invención (dirigidas contra y generadas contra un
epítopo de la cadena CD3ε (épsilon) humana y de primates distintos de chimpancé y que son una parte o fragmento
o la secuencia de aminoácidos de longitud completa como se proporciona en las SEQ ID NO: 2, 4, 6 u 8) al reconocer un epítopo de CD3 independiente del contexto, muestran un perfil de redistribución de linfocitos T más favorable que las moléculas de unión a CD3 convencionales que reconocen un epítopo de CD3 dependiente del contexto, como las moléculas de unión proporcionadas en el documento WO99/54440.
22. Las moléculas de unión a CD3 de la invención dirigidas a epítopos de CD3 esencialmente independientes del contexto, al inducir menos redistribución de linfocitos T circulantes en ausencia de células objetivo circulantes, reducen el riesgo de acontecimientos adversos relacionados con el inicio del tratamiento
Redistribución de linfocitos T reducida en monos cynomolgus después del inicio del tratamiento con una molécula de unión a CD3 específica de especies cruzadas representativa de la invención
Se produjo MCSP-G4 VH-VL x I2C VH-VL (secuencia de aminoácidos: SEQ ID NO: 313) mediante la expresión en células CHO usando la secuencia de nucleótidos codificante SEQ ID NO: 314. Las secuencias codificantes de (i) un líder N-terminal de cadena pesada de inmunoglobulina que comprende un codón de inicio incluido en una secuencia de consenso de Kozak y (ii) una marca His6 C-terminal seguida de un codón de detención, se unieron en fase con la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO 314 antes de la inserción del fragmento de ADN resultante obtenido por síntesis génica en el sitio de clonación múltiple del vector de expresión pEF-DHFR (Raum et al. Cancer Immunol Immunother 50 (2001) 141-150). Para aumentar los niveles de expresión, se llevaron a cabo la transfección estable de células CHO deficientes en DHFR, la selección de transfectantes positivos para DHFR que segregaban la molécula de unión a MCSP-G4 VH-VL x I2C VH-VL en el sobrenadante de cultivo y la amplificación de genes con metotrexato como se describe (Mack et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 (1995) 7021-7025). El material de prueba para el tratamiento de monos cynomolgus se produjo en un fermentador de 200 litros. La purificación de proteínas a partir de lo recogido fue a base de cromatografía de afinidad IMAC dirigida a la marca His6 C-terminal de MCSP-G4 VH-VL x I2C VH-VL, seguido de cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) preparativa. El rendimiento total de material de prueba sin endotoxinas final fue de 40 mg. El material de prueba consistía en un 70 % de monómero, un 30 % de dímero y una pequeña contaminación de multímero superior. La potencia del material de prueba se midió en un ensayo de citotoxicidad como se describe en el ejemplo 18, usando células CHO transfectadas con MCSP de cynomolgus como células objetivo y la línea de linfocitos T de macaco 4119LnPx como fuente de células efectoras (fig. 30). Se determinó que la concentración de MCSP-G4 VH-VL x I2C VH-VL necesaria para la lisis semimáxima de células objetivo por los linfocitos T efectores (CE50) era de 1,9 ng/ml.
Se trataron monos cynomolgus (Macaca fascicularis) adultos jóvenes (de aprox. 3 años de edad) por infusión intravenosa continua de molécula de unión a CD3 MCSP-G4 VH-VL x I2C VH-VL a diferentes caudales (es decir, niveles de dosis) para estudiar la redistribución de linfocitos T circulantes tras el inicio del tratamiento en ausencia de células circulantes. Aunque la molécula de unión a CD3 MCSP-G4 VH-VL x I2C VH-VL puede reconocer tanto MCSP de cynomolgus como CD3 de cynomolgus, no existen células sanguíneas circulantes que expresen MCSP. Por lo tanto, la única interacción posible en la sangre circulante es la unión del brazo específico para CD3 de MCSP-G4 VH-VL x I2C VH-VL a CD3 sobre linfocitos T. Esta situación es equivalente al tratamiento con la molécula de unión a CD3 convencional (molécula de unión a CD19xCD3 específica para CD19 sobre linfocitos B y CD3 sobre linfocitos T) de los pacientes con LNH-B, que no tienen linfocitos B objetivo positivos para CD19 circulantes como se describe en el ejemplo 20.
La infusión continua se llevó a cabo de acuerdo con el procedimiento de Swivel como sigue:
Se cateteriza a los monos por la vena femoral hacia la vena cava inferior usando un catéter venoso. Se introduce el catéter por vía subcutánea hacia la región posterior del hombro y se saca al exterior en el omóplato inferior. Después, se pasa un tubo a través de una funda y un resorte de protección. Se fija la funda alrededor del animal y se conecta el catéter, por medio del tubo, a una bomba de infusión.
Se infundió solución de administración (lisina 1,25 M, Tween 80 al 0,1 %, a pH 7) sin material de prueba de forma continua a 48 ml/24 h durante 7 días antes del inicio del tratamiento para permitir la aclimatación de los animales a las condiciones de infusión. Se inició el tratamiento mediante la adición de material de prueba de MCSP-G4 VH-VL x I2C VH-VL a la solución de administración en la cantidad necesaria para cada nivel de dosis individual que se quería probar (es decir, caudal de MCSP-G4 VH-VL x I2C VH-VL). Se cambió el depósito de infusión cada día durante toda la aclimatación y la fase de tratamiento. La duración de tratamiento fue de 7 días.
Se determinaron los cursos temporales de los recuentos absolutos de linfocitos T en sangre periférica mediante un análisis de FACS de cuatro colores como sigue.
Recogida de muestras de sangre y análisis rutinario
Se obtuvieron muestras de sangre (1 ml) antes y 0,75, 2, 6, 12, 24, 30, 48, 72 horas después de inicio de la infusión continua con MCSP-G4 VH-VL x I2C VH-VL, así como después de 7 días de tratamiento usando tubos Vacutainer™ que contenían EDTA (Becton Dickinson) que se enviaron para su análisis a 4 °C. En algunos casos se produjeron ligeras variaciones de estos puntos temporales por razones operativas. El análisis de FACS de las subpoblaciones linfocitarias se realizó en un plazo de 24 - 48 h después de la recogida de muestras de sangre. Las cantidades absolutas de subpoblaciones leucocitarias en las muestras de sangre se determinaron por medio de análisis de sangre diferenciales en un laboratorio veterinario de rutina.
Aislamiento de PBMC a partir de muestras de sangre
El aislamiento de PBMC (células mononucleares de sangre periférica) se realizó mediante un protocolo de separación en gradiente de Ficoll™ adaptado. Se transfirió la sangre a temperatura ambiente a tubos Falcon™ de 5 ml precargados con 1 ml de solución Biocoll™ (Biochrom). Se llevó a cabo la centrifugación en un rotor basculante durante 15 min a 1700 x g y 22 °C sin desaceleración. Se aislaron las PBMC por encima de la capa de Biocoll™, se lavaron una vez con tampón de FACS (PBS / FBS al 2 % [suero fetal bovino; Biochrom]), se centrifugaron y se resuspendieron en tampón de FACS. La centrifugación durante todas las etapas de lavado se llevó a cabo en un rotor basculante durante 4 min a 800 x g y 4 °C. En caso necesario, se realizó la lisis de los eritrocitos incubando las PBMC aisladas en 3 ml de tampón de lisis de eritrocitos (8,29 g de NH4CI, 1,00 g de KHCO3, 0,037 g de EDTA y 1,0 l de H2Obidest, a pH 7,5) durante 5 min a temperatura ambiente seguido de una etapa de lavado con tampón de FACS.
Tinción de PBMC con anticuerpos marcados con fluorescencia contra moléculas de superficie celular
Se obtuvieron anticuerpos monoclonales reactivos con antígenos de cynomolgus de Becton Dickinson (1N.º de cat. 345784, 2N.º de cat. 556647, 3N.º de cat. 552851) y Beckman Coulter (4N.º de cat. IM2470) y se usaron de acuerdo con las recomendaciones de los fabricantes. Se tiñeron 5x105 - 1x106 células con la siguiente combinación de anticuerpos: anti-CD141 (FITC) x anti-CD562 (PE) x anti-CD33 (PerCP) x anti-CD194 (APC). Se sedimentaron las células en placas de multivaloración de 96 pocillos en forma de V (Greiner) y se retiró el sobrenadante. Se resuspendieron los sedimentos celulares en un volumen total de 100 µl que contenía los anticuerpos específicos diluidos en tampón de FACS. Se llevó a cabo la incubación a oscuras durante 30 min a 4 °C. Posteriormente, se lavaron las muestras dos veces con tampón de FACS y se resuspendieron los sedimentos celulares en tampón de FACS para el análisis por citometría de flujo.
Detección por citometría de flujo de linfocitos teñidos por FACS
Se realizó la recogida de datos con un FACSCalibur™ BD de 4 colores (Becton Dickinson). Para cada medida, se
adquirieron 1x104 células de subpoblaciones linfocitarias definidas. Se realizó el análisis estadístico con el programa CellQuest Pro™ (Becton Dickinson) para obtener los porcentajes de las subpoblaciones linfocitarias y para clasificar la intensidad de expresión de moléculas de superficie celular. Posteriormente, se correlacionaron los porcentajes de subconjuntos de linfocitos individuales con relación a los linfocitos totales (es decir, linfocitos B más T más NK, excluyendo las células mielógenas por tinción de CD14) determinados por FACS con el recuento linfocitario de los análisis de sangre diferenciales para calcular las cantidades celulares absolutas de linfocitos T (CD3+, CD56-, CD14).
En la figura 32 se muestra la redistribución de linfocitos T durante la fase inicial del tratamiento con MCSP-G4 VH-VL x I2C VH-VL en monos cynomolgus a niveles de dosis de 60, 240 y 1000 µg/m2/24 h. Estos animales no mostraron en absoluto signos de redistribución de linfocitos T alguna durante la fase inicial del tratamiento, es decir, los recuentos de linfocitos T aumentaron en lugar de disminuir tras el inicio del tratamiento. Dado que la redistribución de linfocitos T se observa de forma consistente en el 100 % de los pacientes sin células objetivo circulantes, después del inicio del tratamiento con la molécula de unión a CD3 convencional (p. ej., la construcción CD19xCD3 descrita en el documento WO 99/54440) contra un epítopo de CD3 dependiente del contexto, se demostró que se puede observar sustancialmente menos redistribución de linfocitos T en ausencia de células objetivo circulantes después del inicio del tratamiento con una molécula de unión a CD3 de la invención dirigida y generada contra un epítopo de la cadena CD3 épsilon humana y de primate distinto de chimpancé definida por la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 2, 4, 6 u 8 o un fragmentos de las mismas. Esto está en claro contraste con las moléculas de unión a CD3 dirigidas contra un epítopo de CD3 dependiente del contexto, como las construcciones descritas en el documento WO 99/54440. Las moléculas de unión contra epítopos de CD3 independientes del contexto, como (entre otras) las proporcionadas en una cualquiera de las SEQ ID NO: 2, 4, 6 u 8 (o fragmentos de estas secuencias) permiten esta redistribución de linfocitos T (perjudicial y no deseada) sustancialmente menor. Debido a que la redistribución de linfocitos T durante la fase inicial del tratamiento con moléculas de unión a CD3 es un factor de riesgo principal para acontecimientos adversos en el SNC, la moléculas de unión a CD3 proporcionadas en el presente documento y capaces de reconocer un epítopo de CD3 independiente del contexto tienen una ventaja sustancial con respecto a las moléculas de unión a CD3 conocidas en la técnica y dirigidas contra epítopos de CD3 dependientes del contexto. De hecho, ninguno de los monos cynomolgus tratados con MCSP-G4 VH-VL x I2C VH-VL mostró ningún signo de síntomas en el SNC.
En el presente documento se demuestra la independencia del contexto del epítopo de CD3 y corresponde a los primeros 27 aminoácidos N-terminales de CD3 épsilon o fragmentos de este tramo de 27 aminoácidos. Este epítopo independiente del contexto se saca de su entorno original dentro del complejo de CD3 y se fusiona a secuencias de aminoácidos heterólogas sin pérdida de su integridad estructural. Las moléculas de unión anti-CD3 proporcionadas en el presente documento y generadas (y dirigidas) contra un epítopo de CD3 independiente del contexto permiten una mejoría clínica sorprendente con respecto a la redistribución de linfocitos T y, por tanto, un perfil de seguridad más favorable. Sin comprometerse con ninguna teoría, dado que su epítopo de CD3 es independiente del contexto, lo que forma un subdominio autónomo autosuficiente sin mucha influencia sobre el resto del complejo CD3, las moléculas de unión a CD3 proporcionadas en el presente documento inducen menos cambios alostéricos en la conformación de CD3 que las moléculas de unión a CD3 convencionales (como las moléculas proporcionadas en el documento WO 99/54440), que reconocen epítopos de CD3 dependientes del contexto como las moléculas proporcionadas en el documento WO 99/54440. Como consecuencia (de nuevo sin comprometerse con ninguna teoría), también se reduce la inducción del reclutamiento intracelular de NcK2 por las moléculas de unión a CD3 proporcionadas en el presente documento, lo que da lugar a menos cambio de isoforma de las integrinas de los linfocitos T y menos adhesión de los linfocitos T a las células endoteliales. Se prefiere que las preparaciones de moléculas de unión a CD3 de la invención (dirigidas contra y generadas contra un epítopo independiente del contexto como se define en el presente documento) consistan esencialmente en moléculas monoméricas. Estas moléculas monoméricas son incluso más eficaces (que las moléculas diméricas o multiméricas) para evitar la redistribución de linfocitos T y, por tanto, el riesgo de acontecimientos adversos en el SNC durante la fase inicial del tratamiento.
23. Generación y caracterización de moléculas monocatenarias biespecíficas específicas de especies cruzadas de CD33 y CD3
23.1. Generación de células CHO que expresan CD33 humana
La secuencia codificante de CD33 humana publicada en GenBank (número de acceso NM_001772) se obtuvo por síntesis génica de acuerdo con protocolos estándar. El fragmento de síntesis génica se diseñó para que contuviera en primer lugar un sitio de Kozak para la expresión eucariota de la construcción, seguido por un péptido líder de inmunoglobulina de 19 aminoácidos, seguido en fase por la secuencia codificante de la proteína CD33 humana madura, seguida en fase por la secuencia codificante de un dipéptido de serina y glicina, una marca histidina6 y un codón de detención (las secuencias de ADNc y de aminoácidos de la construcción se enumeran como SEQ ID NO: 525 y 526). El fragmento de síntesis génica también se diseñó para introducir sitios de restricción al principio y al final del fragmento. Los sitios de restricción introducidos, EcoRI en el extremo 5' y SalI en el extremo 3', se utilizaron en los procedimientos de clonación siguientes. El fragmento de síntesis génica se clonó a través de EcoRI y SalI en un plásmido denominado pEF-DHFR (pEF-DHFR se describe en Raum et al. Cancer Immunol Immunother 50 (2001) 141-150) siguiendo protocolos estándar. Los procedimientos mencionados anteriormente se llevaron a cabo de acuerdo con protocolos estándar (Sambrook, Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 3ª edición, Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, Nueva York (2001)). Se transfectó un clon con secuencia nucleotídica comprobada en células CHO deficientes en DHFR para la expresión eucariota de la construcción. La expresión eucariota de proteínas en células CHO deficientes en DHFR se realizó como se describe por Kaufmann
R.J. (1990) Methods Enzymol. 185, 537-566. La amplificación de genes de la construcción se indujo mediante el aumento de las concentraciones metotrexato (MTX) hasta una concentración final de hasta MTX 20 nM.
23.2. Generación de células CHO que expresan el dominio extracelular de CD33 de macaco
Se obtuvo la secuencia de ADNc de CD33 de macaco mediante un conjunto de 3 PCR en un ADNc de médula ósea de macaco preparada de acuerdo con protocolos estándar. Se usaron las siguientes condiciones de reacción: 1 ciclo a 94 °C durante 3 minutos seguido de 35 ciclos con 94 °C durante 1 minuto, 53 °C durante 1 minuto y 72 °C durante 2 minutos seguido de un ciclo terminal de 72 °C durante 3 minutos y los siguientes cebadores:
3. cebador directo:
5'-gaggaattcaccatgccgctgctgctactgctgcccctgctgtgggcaggggccctggctatgg-3'
cebador inverso: 5'-gatttgtaactgtatttggtacttcc-3'
4.
cebador directo: 5'-attccgcctccttggggatcc-3'
cebador inverso: 5'-gcataggagacattgagctggatgg-3'
5.
cebador directo: 5'-gcaccaacctgacctgtcagg-3'
cebador inverso: 5'-agtgggtcgactcactgggtcctgacctctgagtattcg-3'
Esas PCR generan tres fragmentos solapantes, que se aislaron y se secuenciaron de acuerdo con protocolos
5 estándar usando los cebadores de PCR, y se este modo proporcionaron una porción de la secuencia de ADNc de CD33 de macaco desde el segundo nucleótido del codón +2 hasta el tercer nucleótido del codón +340 de la proteína madura. Para generar una construcción para la expresión de CD33 de macaco se obtuvo un fragmento de ADNc mediante síntesis génica de acuerdo con protocolos estándar (las secuencias de ADNc y de aminoácidos de la construcción se enumeran en las SEQ ID NO: 527 y 528). En esta construcción, se fusionó la secuencia codificante
10 de CD33 de macaco desde el aminoácido +3 hasta el +340 de la proteína CD33 madura en la secuencia codificante de CD33 humana, reemplazando la secuencia codificante humana de los aminoácidos +3 a +340. El fragmento de síntesis génica también se diseñó para que contuviera un sitio de Kozak para la expresión eucariota de la construcción y sitios de restricción al principio y al final del fragmento que contiene el ADNc codificante esencialmente para el dominio extracelular completo de la CD33 de macaco, el dominio transmembranario de la
15 CD33 de macaco y un dominio de CD33 intracelular quimérico de macaco-humano. Los sitios de restricción introducidos, XbaI en el extremo 5' y SalI en el extremo 3', se utilizaron en los procedimientos de clonación siguientes. Después, el fragmento de síntesis génica se clonó a través de XbaI y SalI en un plásmido denominado pEF-DHFR (pEF-DHFR se describe en Raum et al. Cancer Immunol Immunother 50 (2001) 141-150). Se usó un clon de secuencia comprobada de este plásmido para transfectar células CHO/dhfr- como se describe anteriormente.
20 23.3. Generación de moléculas de anticuerpo biespecíficas específicas de especies cruzadas de CD33 y CD3
Clonación de moléculas de unión específicas de especies cruzadas
En general, se diseñaron moléculas de anticuerpo biespecífico, comprendiendo cada uno un dominio con una especificidad de unión de especies cruzadas específico para CD3 épsilon humana y de primate distinto de chimpancé, así como un dominio con una especificidad de unión de especies cruzadas específico para CD33
25 humana y de primate distinto de chimpancé, como se expone en la siguiente tabla 6:
Tabla 6: Formatos de moléculas biespecíficas específicas de especies cruzadas anti-CD3 y anti-CD33 Se obtuvieron por síntesis génica las construcciones mencionadas anteriormente que contenían los dominios variable de cadena ligera (L) y variable de cadena pesada (H) específicas de especies cruzadas para CD33 humana y de macaco y las combinaciones de VH y VL específicas para CD3 específicas de especies cruzadas para CD3 humana y de macaco. Los fragmentos de síntesis génica se diseñaron para que contuvieran en primer lugar un sitio de Kozak para la expresión eucariota de la construcción, seguido por un péptido líder de inmunoglobulina de 19 aminoácidos, seguido en fase por la secuencia codificante de la molécula de anticuerpo biespecífico correspondiente, seguida en fase por la secuencia codificante de una marca histidina6 y un codón de detención. El fragmento de síntesis génica también se diseñó para introducir sitios de restricción adecuados al principio y al final del fragmento. Los sitios de restricción introducidos se utilizaron en los procedimientos de clonación siguientes. El fragmento de síntesis génica se clonó a través de estos sitios de restricción en un plásmido denominado pEF-DHFR (pEF-DHFR se describe en Raum et al. Cancer Immunol Immunother 50 (2001) 141-150) siguiendo protocolos estándar. Los procedimientos mencionados anteriormente se llevaron a cabo de acuerdo con protocolos estándar (Sambrook, Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 3ª edición, Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, Nueva York (2001)). Se transfectó un clon con secuencia nucleotídica comprobada en células CHO deficientes en DHFR para la expresión eucariota de la construcción. La expresión eucariota de proteínas en células CHO deficientes en DHFR se realizó como se describe por Kaufmann R.J. (1990) Methods Enzymol. 185, 537-566. La amplificación de genes de la construcción se indujo mediante el aumento de las concentraciones metotrexato (MTX) hasta una concentración final de hasta MTX 20 nM.
SEQ ID (nucl/prot)
Formatos de construcciones de proteína (N�C)
448/447
AH11HL x H2CHL
394/393
AH3HL x H2CHL
430/429
AC8HL x H2CHL
412/411
AF5HL x H2CHL
484/483
F2HL x H2CHL
520/519
E11HL x H2CHL
466/465
B3HL x H2CHL
502/501
B10HL x H2CHL
450/449
AH11HL x F12QHL
396/395
AH3HL x F12QHL
432/431
AC8HL x F12QHL
414/413
AF5HL x F12QHL
486/485
F2HL x F12QHL
522/521
E11HL x F12QHL
468/467
B3HL x F12QHL
504/503
B10HL x F12QHL
452/451
AH11HL x I2CHL
398/397
AH3HL x l2CHL
434/433
AC8HL x l2CHL
416/415
AF5HL x l2CHL
488/487
F2HL x l2CHL
524/523
E11HL x l2CHL
470/469
B3HL x l2CHL
Expresión y purificación de las moléculas de anticuerpo biespecífico
Las moléculas de anticuerpo biespecífico se expresan en células de ovario de hámster chino (CHO). La expresión eucariota de proteínas en células CHO deficientes en DHFR se realizó como se describe por Kaufmann R.J. (1990) Methods Enzymol. 185, 537-566. La amplificación de genes de las construcciones se indujo mediante la adición de concentraciones crecientes de MTX hasta concentraciones finales de MTX de 20 nM. Después de dos pasos de cultivo estacionario, las células se hicieron crecer en frascos rotatorios con medio líquido de soja HyQ PF CHO sin nucleósidos (con L-glutamina 4,0 mM con Pluronic F - 68 al 0,1 %; HyClone) durante 7 días antes de recogerlas. Se retiraron las células por centrifugación y se almacenó el sobrenadante que contenía la proteína expresada a -20 °C. De forma alternativa, las construcciones se expresaron de forma transitoria en células HEK 293. La transfección se realizó con reactivo 293fectin (Invitrogen, N.º 12347-019) de acuerdo con el protocolo del fabricante.
Para la cromatografía se usaron el sistema de exploración Äkta® (GE Health Systems) y el programa informático Unicorn®. Se realizó una cromatografía de afinidad de metales inmovilizados ("IMAC") usando un quelato Fractogel EMD® (Merck) que se cargó con ZnCl2 de acuerdo con el protocolo proporcionado por el fabricante. Se equilibró la columna con tampón A (tampón de fosfato de sodio 20 mM a pH 7,2, NaCl 0,1 M) y se aplicó el sobrenadante de cultivo celular (500 ml) a la columna (10 ml) a una caudal de 3 ml/min. La columna se lavó con tampón A para retirar la muestra no unida. La proteína unida se eluyó usando un gradiente en dos etapas de tampón B (tampón de fosfato de sodio 20 mM a pH 7,2, NaCl 0,1 M, imidazol 0,5 M) de acuerdo con lo siguiente:
Etapa 1: tampón B al 20 % en 6 volúmenes de columna
Etapa 2: tampón B al 100% en 6 volúmenes de columna
Las fracciones de proteína eluidas a partir de la etapa 2 se agruparon para su purificación adicional. Todos los productos químicos eran de calidad de investigación y comprados de Sigma (Deisenhofen) o Merck (Darmstadt).
La cromatografía de filtración en gel se realizó en una columna de calidad prep HiLoad 16/60 Superdex 200 (GE/Amersham) equilibrada con tampón de equilibrado (citrato 25 mM, lisina 200 mM, glicerol al 5 %, a pH 7,2). Las muestras de proteína eluidas (caudal 1 ml/min) se sometieron a SDS-PAGE estándar y transferencia de bandas western para su detección. Antes de la purificación, se calibró la columna para la determinación del peso molecular (kit de marcadores de peso molecular, Sigma MW GF-200). Las concentraciones de proteína se determinaron usando la DO a 280 nm.
La proteína de anticuerpo biespecífico purificada se analizó en SDS PAGE en condiciones reductoras realizada con geles bis-tris preformados al 4-12 % (Invitrogen). La preparación y la aplicación de las muestras se realizaron de acuerdo con el protocolo proporcionado por el fabricante. Se determinó el peso molecular con patrón proteínico MultiMark (Invitrogen). El gel se tiñó con Coomassie coloidal (protocolo de Invitrogen). La pureza de la proteína aislada fue > 95 %, determinada por SDS-PAGE.
El anticuerpo biespecífico tiene un peso molecular de aproximadamente 52 kDa en condiciones nativas, determinado por filtración en gel en PBS. Todas las construcciones se purificaron de acuerdo con este procedimiento.
La transferencia de bandas western se realizó usando una membrana Optitran® BA-S83 y el módulo de transferencia de bandas de Invitrogen de acuerdo con el protocolo proporcionado por el fabricante. Para la detección de los anticuerpos de proteína de anticuerpo biespecífico se usó un anticuerpo anti-marca His (Penta His, Qiagen). Como anticuerpo secundario se usó un anticuerpo Ig de cabra anti-ratón marcado con fosfatasa alcalina (AP) (Sigma) y como sustrato, BCIP/NBT (Sigma). Se detectó una sola banda a 52 kD correspondiente al anticuerpo biespecífico purificado.
23.4. Análisis de unión por citometría de flujo de los anticuerpos biespecíficos específicos de especies cruzadas de CD33 y CD3
Con el fin de probar la funcionalidad de las construcciones de anticuerpo biespecífico específico de especies cruzadas con respecto a la capacidad de unión a CD33 y CD3 humana y de macaco, respectivamente, se llevó a cabo un análisis de FACS. Para este propósito se usaron células CHO transfectadas con CD33 humana como se describe en el ejemplo 23.1 y la línea celular de leucemia de linfocitos T positivos para CD3 humana HPB-ALL (DSMZ, Braunschweig, ACC483) para probar la unión a antígenos humanos. La reactividad de unión a antígenos de macaco se probó usando el transfectante de CD33 de macaco generado descrito en el ejemplo 23.2 y las PBMC de macaco (la preparación de PBMC de macaco se realizó por centrifugación en gradiente de Ficoll de sangre periférica de macacos de acuerdo con protocolos estándar). Se incubaron 200.000 células de las respectivas líneas celulares de PBMC durante 30 min en hielo con 50 µl de la proteína purificada de las construcciones de anticuerpo biespecífico específico de especies cruzadas (5 µg/ml) o sobrenadante de cultivo celular de células transfectadas que expresan las construcciones de anticuerpo biespecífico específico de especies cruzadas. Se lavaron las células dos veces en PBS con FCS al 2 % y se detectó la unión de la construcción con un anticuerpo anti-His murino (anticuerpo Penta His; Qiagen; diluido 1:20 en 50 µl de PBS con FCS al 2 %). Después del lavado, se detectaron anticuerpos anti-His unidos con un anticuerpo específico frente a Fc gamma (Dianova) conjugado con ficoeritrina, diluido 1:100 en PBS con FCS al 2 %. Se usó sobrenadante de células CHO no transfectadas como control negativo.
Se realizó una citometría de flujo en un aparato FACS-Calibur; se usó el programa informático CellQuest para adquirir y analizar los datos (Becton Dickinson biosciences, Heidelberg). La tinción de FACS y la medida de la intensidad de fluorescencia se realizaron como se describe en Current Protocols in Immunology (Coligan, Kruisbeek, Margulies, Shevach y Strober, Wiley-lnterscience, 2002).
La unión específica de la CD3 humana y de primate distinto de chimpancé de las moléculas de unión a CD3 de la invención era claramente detectable, como se muestra en la figura 33. En el análisis de FACS todas las construcciones muestran unión a CD3 y CD33 en comparación con los controles negativos respectivos. Se demuestra la especificidad de especies cruzadas de los anticuerpos biespecíficos frente a antígenos de CD3 y CD33 humanas y de macaco.
23.5. Bioactividad de anticuerpos biespecíficos específicos de especies cruzadas de CD33 y CD3
Se analizó la bioactividad de los anticuerpos biespecíficos generados mediante ensayos de citotoxicidad in vitro de liberación de cromo 51 (51Cr) usando las líneas celulares positivas para CD33 descritas en los ejemplos 23.1 y 23.2. Como células efectoras se usaron PBMC humanas con eliminación de CD4/CD65 estimuladas o la línea de linfocitos T de macaco 4119LnPx, como se especifica en las respectivas figuras.
La generación de linfocitos PBMC humanos estimulados se realizó como sigue:
Se recubrió una placa de Petri (85 mm de diámetro, Nunc) con un anticuerpo específico anti-CD3 comercialmente disponible (p. ej., OKT3, Othoclone) en una concentración final de 1 µg/ml durante 1 hora a 37 °C. La proteína no unida se retiró mediante una etapa de lavado con PBS. Se aislaron las PBMC recién obtenidas a partir de sangre periférica (30 - 50 ml de sangre humana) por centrifugación en gradiente de Ficoll de acuerdo con protocolos estándar. Se añadieron 3 - 5 x 107 PBMC a la placa de Petri recubierta previamente en 50 ml de RPMI 1640 con glutamina estabilizada / FCS al 10 % / 20 U/ml de IL-2 (Proleukin, Chiron) y se estimularon durante 2 días. Al tercer día se recogieron las células y se lavaron una vez con RPMI 1640. Se añadió IL-2 a una concentración final de 20 U/ml y se cultivaron de nuevo las células durante un día en el mismo medio de cultivo celular que anteriormente.
Las células objetivo se lavaron dos veces con PBS y se marcaron con 11,1 MBq de 51Cr en un volumen final de 100 µl de RPMI con FCS al 50 % durante 45 minutos a 37 °C. Posteriormente, las células objetivo marcadas se lavaron 3 veces con 5 ml de RPMI y después se usaron en el ensayo de citotoxicidad. El ensayo se realizó en una placa de 96 pocillos en un volumen total de 250 µl de RPMI suplementado (como anteriormente) con una proporción E:O de
10:1. Se aplicaron 1 µg/ml de las moléculas de anticuerpo biespecífico específico de especies cruzadas y 20 diluciones de tres veces de las mismas. El tiempo de ensayo fue de 18 horas y la citotoxicidad se midió como valores relativos de cromo liberado en el sobrenadante en relación con la diferencia de lisis máxima (adición de Triton-X) y lisis espontánea (sin células efectoras). Todas las medidas se realizaron en cuadruplicados. La medida de la actividad del cromo en los sobrenadantes se realizó con un contador gamma Wizard 3" (Perkin Elmer Life Sciences GmbH, Colonia, Alemania). El análisis de los datos experimentales se realizó con Prism 4 para Windows (versión 4.02, GraphPad Software Inc., San Diego, California, EE. UU.). Típicamente, las curvas sigmoidales de respuesta a dosis tienen valores de R2 > 0,90, determinados por el programa informático. Los valores de CE50 calculados por el programa de análisis se usaron para la comparación de la bioactividad.
Como se muestra en la figura 34, todas las construcciones biespecíficas específicas de especies cruzadas
generadas demuestran actividad citotóxica contra células objetivo positivas para CD33 humana provocada por PBMC humanas con eliminación de CD4/CD56 estimuladas y contra células objetivo positivas para CD33 de macaco provocada por la línea de linfocitos T de macaco 4119LnPx.
24. Generación y caracterización de moléculas monocatenarias biespecíficas específicas de especies cruzadas de CAIX y CD3
24.1. Generación de células CHO que expresan CAIX humana
La secuencia codificante de CAIX humana publicada en GenBank (número de acceso NM_001216) se obtuvo por síntesis génica de acuerdo con protocolos estándar. El fragmento de síntesis génica se diseñó para que contuviera la secuencia codificante de la proteína CAIX humana, incluido su péptido líder (las secuencias de ADNc y de aminoácidos de la construcción se enumeran en las SEQ ID NO: 604 y 605). El fragmento de síntesis génica también se diseñó para introducir sitios de restricción al principio y al final del fragmento. Los sitios de restricción introducidos, XbaI en el extremo 5' y SalI en el extremo 3', se utilizaron en los procedimientos de clonación siguientes. El fragmento de síntesis génica se clonó a través de XbaI y SalI en un plásmido denominado pEF-DHFR (pEF-DHFR se describe en Raum et al. Cancer Immunol Immunother 50 (2001) 141-150) siguiendo protocolos estándar. Los procedimientos mencionados anteriormente se llevaron a cabo de acuerdo con protocolos estándar (Sambrook, Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 3ª edición, Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, Nueva York (2001)). Se transfectó un clon con secuencia nucleotídica comprobada en células CHO deficientes en DHFR para la expresión eucariota de la construcción. La expresión eucariota de proteínas en células CHO deficientes en DHFR se realizó como se describe por Kaufmann R.J. (1990) Methods Enzymol. 185, 537-566. La amplificación de genes de la construcción se indujo mediante el aumento de las concentraciones metotrexato (MTX) hasta una concentración final de hasta MTX 20 nM.
24.2. Generación de células CHO que expresan CAIX de macaco
La secuencia codificante de CAIX de macaco publicada en GenBank (número de acceso XM_001088481) se obtuvo por síntesis génica de acuerdo con protocolos estándar. El fragmento de síntesis génica se diseñó para que contuviera la secuencia codificante de la proteína CAIX de macaco, incluido su péptido líder (las secuencias de ADNc y de aminoácidos de la construcción se enumeran en las SEQ ID NO: 606 y 607). El fragmento de síntesis génica también se diseñó para introducir sitios de restricción al principio y al final del fragmento. Los sitios de restricción introducidos, XbaI en el extremo 5' y SalI en el extremo 3', se utilizaron en los procedimientos de clonación siguientes. El fragmento de síntesis génica se clonó a través de XbaI y SalI en un plásmido denominado pEF-DHFR (pEF-DHFR se describe en Raum et al. Cancer Immunol Immunother 50 (2001) 141-150) siguiendo protocolos estándar. Los procedimientos mencionados anteriormente se llevaron a cabo de acuerdo con protocolos estándar (Sambrook, Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 3ª edición, Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, Nueva York (2001)). Se transfectó un clon con secuencia nucleotídica comprobada en células CHO deficientes en DHFR para la expresión eucariota de la construcción. La expresión eucariota de proteínas en células CHO deficientes en DHFR se realizó como se describe por Kaufmann R.J. (1990) Methods Enzymol. 185, 537-566. La amplificación de genes de la construcción se indujo mediante el aumento de las concentraciones metotrexato (MTX) hasta una concentración final de hasta MTX 20 nM.
24.3. Generación de moléculas monocatenarias biespecíficas específicas de especies cruzadas de CAIX y CD3
Clonación de moléculas de unión específicas de especies cruzadas
En general, se diseñaron moléculas de anticuerpo monocatenario biespecífico, comprendiendo cada uno un dominio con una especificidad de unión de especies cruzadas específico para CD3épsilon humana y de primate distinto de chimpancé, así como un dominio con una especificidad de unión de especies cruzadas específico para CAIX humana y de primate distinto de chimpancé, como se expone en la siguiente tabla 7:
Tabla 7: Formatos de moléculas de anticuerpo monocatenario biespecífico específico de especies cruzadas anti-CD3 y anti-CAIX
SEQ ID (nucl/prot)
Formatos de construcciones de proteína (N�C)
539/538
CA9-A8 HL x H2C HL
571/570
CA9-B2 HL x H2C HL
557/556
CA9-E8 HL x I2C HL
543/542
CA9-A8 HL x I2C HL
575/574
CA9-B2 HL x I2C HL
541/540
CA9-A8HL x F12QHL
573/572
CA9-B2HL x F12QHL
Se obtuvieron por síntesis génica las construcciones mencionadas anteriormente que contenían los dominios variable de cadena ligera (L) y variable de cadena pesada (H) específicas de especies cruzadas para CAIX humana y de macaco y las combinaciones de VH y VL específicas para CD3 específicas de especies cruzadas para CD3 humana y de macaco. Los fragmentos de síntesis génica se diseñaron para que contuvieran en primer lugar un sitio de Kozak para la expresión eucariota de la construcción, seguido por un péptido líder de inmunoglobulina de 19 aminoácidos, seguido en fase por la secuencia codificante de la molécula de anticuerpo monocatenario biespecífico correspondiente, seguida en fase por la secuencia codificante de una marca de 6 histidinas y un codón de detención. El fragmento de síntesis génica también se diseñó para introducir sitios de restricción adecuados al principio y al final del fragmento. Los sitios de restricción introducidos se utilizaron en los procedimientos de clonación siguientes. El fragmento de síntesis génica se clonó a través de estos sitios de restricción en un plásmido denominado pEF-DHFR (pEF-DHFR se describe en Raum et al. Cancer Immunol Immunother 50 (2001) 141-150) siguiendo protocolos estándar. Los procedimientos mencionados anteriormente se llevaron a cabo de acuerdo con protocolos estándar (Sambrook, Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 3ª edición, Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, Nueva York (2001)). Se transfectó un clon con secuencia nucleotídica comprobada en células CHO deficientes en DHFR para la expresión eucariota de la construcción. La expresión eucariota de proteínas en células CHO deficientes en DHFR se realizó como se describe por Kaufmann R.J. (1990) Methods Enzymol. 185, 537-566. La amplificación de genes de la construcción se indujo mediante el aumento de las concentraciones metotrexato (MTX) hasta una concentración final de hasta MTX 20 nM.
24.4. Expresión y purificación de las moléculas de anticuerpo monocatenario biespecífico
Las moléculas de anticuerpo monocatenario biespecífico se expresaron en células de ovario de hámster chino (CHO). La expresión eucariota de proteínas en células CHO deficientes en DHFR se realizó como se describe por Kaufmann R.J. (1990) Methods Enzymol. 185, 537-566. La amplificación de genes de las construcciones se indujo mediante la adición de concentraciones crecientes de MTX hasta concentraciones finales de MTX de 20 nM. Después de dos pasos de cultivo estacionario, las células se hicieron crecer en frascos rotatorios con medio líquido de soja HyQ PF CHO sin nucleósidos (con L-glutamina 4,0 mM con Pluronic F - 68 al 0,1 %; HyClone) durante 7 días antes de recogerlas. Se retiraron las células por centrifugación y se almacenó el sobrenadante que contenía la proteína expresada a -20 °C. De forma alternativa, las construcciones se expresaron de forma transitoria en células HEK 293. La transfección se realizó con reactivo 293fectin (Invitrogen, N.º 12347-019) de acuerdo con el protocolo del fabricante.
Para la cromatografía se usaron el sistema de exploración Äkta® (GE Health Systems) y el programa informático Unicorn®. Se realizó una cromatografía de afinidad de metales inmovilizados ("IMAC") usando un quelato Fractogel EMD® (Merck) que se cargó con ZnCl2 de acuerdo con el protocolo proporcionado por el fabricante. Se equilibró la columna con tampón A (tampón de fosfato de sodio 20 mM a pH 7,2, NaCl 0,1 M) y se aplicó el sobrenadante de cultivo celular (500 ml) a la columna (10 ml) a una caudal de 3 ml/min. La columna se lavó con tampón A para retirar la muestra no unida. La proteína unida se eluyó usando un gradiente en dos etapas de tampón B (tampón de fosfato de sodio 20 mM a pH 7,2, NaCl 0,1 M, imidazol 0,5 M) de acuerdo con lo siguiente:
Etapa 1: tampón B al 20 % en 6 volúmenes de columna
Etapa 2: tampón B al 100% en 6 volúmenes de columna
Las fracciones de proteína eluidas a partir de la etapa 2 se agruparon para su purificación adicional. Todos los productos químicos son de calidad de investigación y comprados de Sigma (Deisenhofen) o Merck (Darmstadt).
La cromatografía de filtración en gel se realizó en una columna de calidad prep HiLoad 16/60 Superdex 200 (GE/Amersham) equilibrada con tampón de equilibrado (citrato 25 mM, lisina 200 mM, glicerol al 5 %, a pH 7,2). Las muestras de proteína eluidas (caudal 1 ml/min) se sometieron a SDS-PAGE estándar y transferencia de bandas western para su detección. Antes de la purificación, se calibró la columna para la determinación del peso molecular (kit de marcadores de peso molecular, Sigma MW GF-200). Las concentraciones de proteína se determinaron usando la DO a 280 nm.
La proteína de anticuerpo monocatenario biespecífico purificada se analizó en SDS PAGE en condiciones reductoras realizada con geles bis-tris preformados al 4-12 % (Invitrogen). La preparación y la aplicación de las muestras se realizaron de acuerdo con el protocolo proporcionado por el fabricante. Se determinó el peso molecular con patrón proteínico MultiMark (Invitrogen). El gel se tiñó con Coomassie coloidal (protocolo de Invitrogen). La pureza de la proteína aislada fue > 95 %, determinada por SDS-PAGE.
El anticuerpo monocatenario biespecífico tiene un peso molecular de aproximadamente 52 kDa en condiciones nativas, determinado por filtración en gel en PBS. Todas las construcciones se purificaron de acuerdo con este procedimiento.
La transferencia de bandas western se realizó usando una membrana Optitran® BA-S83 y el módulo de transferencia de bandas de Invitrogen de acuerdo con el protocolo proporcionado por el fabricante. Para la detección de los anticuerpos de proteína de anticuerpo monocatenario biespecífico se usó un anticuerpo anti-marca His (Penta His, Qiagen). Como anticuerpo secundario se usó un anticuerpo Ig de cabra anti-ratón marcado con fosfatasa alcalina (AP) (Sigma) y como sustrato, BCIP/NBT (Sigma). Se detectó una única banda a 52 kD correspondiente al anticuerpo monocatenario biespecífico purificado.
24.5. Análisis de unión por citometría de flujo de los anticuerpos biespecíficos específicos de especies cruzadas de CAIX y CD3
Con el fin de probar la funcionalidad de las construcciones de anticuerpo biespecífico específico de especies cruzadas con respecto a la capacidad de unión a CAIX y CD3 humana y de cynomolgus, respectivamente, se llevó a cabo un análisis de FACS. Para este propósito se usaron células CHO transfectadas con CAIX humana como se describe en el ejemplo 24,1 y la línea celular humana de leucemia de linfocitos T positivos para CD3 HPB-ALL (DSMZ, Braunschweig, ACC483) para probar la unión a antígenos humanos. La reactividad de unión a antígenos de macaco se probó usando el transfectante de CAIX de macaco generado descrito en el ejemplo 24.2 y una línea de linfocitos T de macaco 4119LnPx (proporcionada amablemente por el Prof. Fickenscher, Instituto de Higiene, Virología, Erlangen-Núremberg; publicado en Knappe A, et al., y Fickenscher H., Blood 2000, 95, 3256-61). Se incubaron 200.000 células de las respectivas poblaciones celulares durante 30 min en hielo con 50 µl de la proteína purificada de las construcciones de anticuerpo biespecífico específico de especies cruzadas (2 µg/ml) o sobrenadante de cultivo celular de células transfectadas que expresan las construcciones de anticuerpo biespecífico específico de especies cruzadas. Se lavaron las células dos veces en PBS con FCS al 2 % y se detectó la unión de la construcción con un anticuerpo anti-His murino (anticuerpo Penta His; Qiagen; diluido 1:20 en 50 µl de PBS con FCS al 2 %). Después del lavado, se detectaron anticuerpos anti-His unidos con un anticuerpo específico frente a Fc gamma (Dianova) conjugado con ficoeritrina, diluido 1:100 en PBS con FCS al 2 %. El sobrenadante de células CHO no transfectadas se usó como control negativo para la unión a las líneas de linfocitos T. Como control negativo para la unión a las células CHO transfectadas con CAIX, se usó una construcción monocatenaria con especificidad de objetivo no pertinente.
Se realizó una citometría de flujo en un aparato FACS-Calibur; se usó el programa informático CellQuest para adquirir y analizar los datos (Becton Dickinson biosciences, Heidelberg). La tinción de FACS y la medida de la intensidad de fluorescencia se realizaron como se describe en Current Protocols in Immunology (Coligan, Kruisbeek, Margulies, Shevach y Strober, Wiley-lnterscience, 2002).
La unión biespecífica de las moléculas monocatenarias enumeradas anteriormente, que son específicas de especies cruzadas para CAIX y específicas de especies cruzadas para CD3 humana y de primate distinto de chimpancé, era claramente detectable, como se muestra en la figura 35. En el análisis de FACS todas las construcciones mostraron unión a CD3 y CAIX en comparación con los controles negativos respectivos. Se demostró la especificidad de especies cruzadas de los anticuerpos biespecíficos frente a antígenos de CD3 y CAIX humanas y de primate distinto de chimpancé.
24.6. Bioactividad de anticuerpos monocatenarios biespecíficos específicos de especies cruzadas de CAIX y CD3
Se analizó la bioactividad de los anticuerpos monocatenarios biespecíficos generados mediante ensayos de citotoxicidad in vitro de liberación de cromo 51 (51Cr) usando las líneas celulares positivas para CAIX descritas en los ejemplos 24.1 y 24.2. Como células efectoras se usaron PBMC humanas con eliminación de CD4/CD65 estimuladas, PBMC humanas estimuladas o la línea de linfocitos T de macaco 4119LnPx, como se especifica en las respectivas figuras.
La generación de linfocitos PBMC humanos estimulados se realizó como sigue:
Se recubrió una placa de Petri (145 mm de diámetro, Greiner) con un anticuerpo específico anti-CD3 comercialmente disponible (p. ej., OKT3, Othoclone) en una concentración final de 1 µg/ml durante 1 hora a 37 °C. La proteína no unida se retiró mediante una etapa de lavado con PBS. Se aislaron las PBMC recién obtenidas a partir de sangre periférica (30 - 50 ml de sangre humana) por centrifugación en gradiente de Ficoll de acuerdo con protocolos estándar. Se añadieron 3 - 5 x 107 PBMC a la placa de Petri recubierta previamente en 120 ml de RPMI 1640 con glutamina estabilizada / FCS al 10 % / 20 U/ml de IL-2 (Proleukin, Chiron) y se estimulan durante 2 días. Al tercer día se recogieron las células y se lavaron una vez con RPMI 1640. Se añadió IL-2 a una concentración final de 20 U/ml y se cultivaron de nuevo las células durante un día en el mismo medio de cultivo celular que anteriormente.
La generación de las PBMC con eliminación de CD4/CD56 se realizó como sigue:
Se recubrió una placa de Petri (145 mm de diámetro, Greiner) con un anticuerpo específico anti-CD3 comercialmente disponible (p. ej., OKT3, Othoclone) en una concentración final de 1 µg/ml durante 1 hora a 37 °C. La proteína no unida se retiró mediante una etapa de lavado con PBS. Se aislaron las PBMC recién obtenidas a partir de sangre periférica (30 - 50 ml de sangre humana) por centrifugación en gradiente de Ficoll de acuerdo con protocolos estándar. Se añadieron 3 - 5 x 107 PBMC a la placa de Petri recubierta previamente en 120 ml de RPMI 1640 con glutamina estabilizada / FCS al 10 % / 20 U/ml de IL-2 (Proleukin, Chiron) y se estimulan durante 2 días. Al tercer día se recogieron las células y se lavaron una vez con RPMI 1640. Se añadió IL-2 a una concentración final de
20 U/ml y se cultivaron de nuevo las células durante un día en el mismo medio de cultivo celular que anteriormente. Mediante la eliminación de linfocitos T CD4+ y linfocitos NK CD56+ de acuerdo con protocolos estándar, se enriquecen los linfocitos T citotóxicos (LTC) CD8+.
Las células objetivo se lavaron dos veces con PBS y se marcaron con 11,1 MBq de 51Cr en un volumen final de 100 µl de RPMI con FCS al 50 % durante 45 minutos a 37 °C. Posteriormente, las células objetivo marcadas se lavaron 3 veces con 5 ml de RPMI y después se usaron en el ensayo de citotoxicidad. El ensayo se realizó en una placa de 96 pocillos en a volumen total de 250 µl de RPMI suplementado (como anteriormente) con proporciones E:O de desde
5:1 hasta 50:1, que se especifican en las respectivas figuras. Se aplicaron 1 µg/ml de las moléculas de anticuerpo monocatenario biespecífico específico de especies cruzadas y 20 diluciones de tres veces de las mismas. El tiempo de ensayo fue de 16 horas y la citotoxicidad se midió como valores relativos de cromo liberado en el sobrenadante en relación con la diferencia de lisis máxima (adición de Triton-X) y lisis espontánea (sin células efectoras). Todas las medidas se realizaron en cuadruplicados. La medida de la actividad del cromo en los sobrenadantes se realizó con un contador gamma Wizard 3" (Perkin Elmer Life Sciences GmbH, Colonia, Alemania). El análisis de los datos experimentales se realizó con Prism 4 para Windows (versión 4.02, GraphPad Software Inc., San Diego, California, EE. UU.). Típicamente, las curvas sigmoidales de respuesta a dosis tienen valores de R2 > 0,90, determinados por el programa informático. Los valores de CE50 calculados por el programa de análisis se usaron para la comparación de la bioactividad.
Como se muestra en la figura 36, todas las construcciones de anticuerpo monocatenario biespecífico específico de especies cruzadas generadas demostraron actividad citotóxica contra células objetivo positivas para CAIX humana provocada por PBMC humanas con eliminación de CD4/CD56 estimuladas o PBMC estimuladas y contra células objetivo positivas para CAIX de macaco provocada por la línea de linfocitos T de macaco 4119LnPx.
25. Generación y caracterización de moléculas monocatenarias biespecíficas específicas de especies cruzadas de EpCAM y CD3
Construcción de anticuerpos biespecíficos específicos de EpCAM
La base para la construcción de anticuerpos biespecíficos específicos de EpCAM fue el anticuerpo totalmente humano específico de EpCAM HD69 (Raum et al. Cancer Immunol Immunother (2001) 50: 141 y siguientes). La VH y la VL se amplificaron por PCR a partir de ADN de HD69 de acuerdo con procedimientos estándar. Posteriormente, se clonaron la VH y la VL en un plásmido, formando así un scFv funcional (orientación VH-enlazador-VL) de acuerdo con protocolos estándar. Esta construcción de scFv se amplificó después por PCR usando cebadores que introducían un sitio de restricción BsrGI N-terminal y uno BspE1 C-terminal útiles para la clonación funcional en el formato de anticuerpo biespecífico (5'-HD69-BsrG1: 5'-gacaggtgtacactccgaggtgcagctgctcgagtctgg-3'; 3'-HD69-BspE1: 5'-tgatagtccggatttgatctccagcttggtcc-3'). Después, se clonó el producto de PCR en tres vectores de expresión adecuados, que comprendían cada uno una combinación de VH y VL específica de CD3 específica de especies cruzadas para CD3 humana y de macaco (H2C HL, F12Q HL e I2C, respectivamente), codificando por tanto tres construcciones biespecíficas funcionales HD69 HL x H2C HL, HD69 HL x F12Q HL y HD69 HL x I2C HL. Las construcciones se transfectaron después en células CHO deficientes en DHFR por electroporación para transfección estable de acuerdo con procedimientos estándar, dando lugar a tres conjuntos de células transfectadas, expresando cada conjunto uno de los tres productos biespecíficos.
Tabla 8: Formatos de moléculas de anticuerpo monoclonal biespecífico anti-EpCAM que comprenden una porción anti-CD3 de especificidad cruzada para humano-cynomolgus
SEQ ID (nucl/prot)
Formatos de construcciones de proteína (N�C)
589/588
HD69 HL x H2C HL
591/590
HD69HL x F12QHL
593/592
HD69 HL x I2C HL
La bioactividad de los anticuerpos monocatenarios biespecíficos generados (en sobrenadantes de cultivo de células CHO que expresan las construcciones biespecíficas respectivas) se analizó mediante ensayos de citotoxicidad in vitro de liberación de cromo 51 usando como células objetivo la línea de células CHO-EpCAM transfectadas positivas para EpCAM (que expresa EpCAM humana unida a la superficie, publicado en Raum et al. Cancer Immunol Immunother (2001) 50: 141 y siguientes). Como células efectoras se usaron linfocitos T positivos para CD8 humanos estimulados. Como se muestra en la figura 37, todas las construcciones de anticuerpo monocatenario biespecífico generadas revelaron actividad citotóxica contra células objetivo positivas para EpCAM humanas provocada por linfocitos CD8+ humanos. Como control negativo se usó sobrenadante de cultivo de células CHO no transfectadas, que no reveló citotoxicidad detectable.
Para demostrar la actividad de especificidad cruzada de las construcciones biespecíficas generadas sobre el brazo de CD3, se realizaron análisis de citometría de flujo en los que se comprobó la unión de las construcciones a células que expresan CD3 humana y a células que expresan CD3 de macaco. Además, se examinó la especificidad para células positivas para EpCAM.
Brevemente, se usaron células CHO transfectadas con linfocitos T positivos para EpCAM humana y CD3 humana en PBMC humanas aisladas para probar la unión a antígenos humanos. La reactividad de unión al antígeno de CD3 de macaco se probó usando una línea de linfocitos T de macaco 4119LnPx (proporcionada amablemente por el Prof. Fickenscher, Instituto de Higiene, Virología, Erlangen-Núremberg; publicada en Knappe A, et al., y Fickenscher H., Blood 2000, 95, 3256-61). Se incubaron 200.000 células de las respectivas líneas celulares durante 30 min en hielo con sobrenadante de cultivo celular de células transfectadas que expresaban las construcciones de anticuerpo biespecífico específico de especies cruzadas de CD3. Se lavaron las células dos veces en PBS con FCS al 2 % y se detectó la unión de la construcción con un anticuerpo anti-His murino (anticuerpo Penta His; Qiagen; diluido 1:20 en 50 µl de PBS con FCS al 2 %). Después del lavado, se detectaron anticuerpos anti-His unidos con un anticuerpo específico frente a Fc gamma (Dianova) conjugado con ficoeritrina, diluido 1:100 en PBS con FCS al 2 %. El sobrenadante de células CHO no transfectadas se usó como control negativo para la unión a las líneas de linfocitos
T.
Se realizó una citometría de flujo en un aparato FACS-Calibur y se usó el programa informático CellQuest para adquirir y analizar los datos (Becton Dickinson biosciences, Heidelberg). La tinción de FACS y la medida de la intensidad de fluorescencia se realizaron como se describe en Current Protocols in Immunology (Coligan, Kruisbeek, Margulies, Shevach y Strober, Wiley-lnterscience, 2002).
La unión biespecífica de las moléculas monocatenarias, que son específicas para EpCAM humana y específicas de especies cruzadas para CD3 humana y de macaco, era claramente detectable, como se muestra en la figura 38. En el análisis por citometría de flujo, todas las construcciones mostraron unión a CD3 y EpCAM en comparación con los controles negativos correspondientes y la línea celular de CHO negativa para EpCAM/CD3.
26. Generación y caracterización de moléculas monocatenarias biespecíficas específicas de especies cruzadas de EGFRvIII y CD3
26.1. Generación y expresión de células CHO transfectadas con EGFRvIII humano
La secuencia codificante del dominio C-terminal, transmembranario y citoplásmico del receptor del factor de crecimiento epidérmico mutante (DeltaEGFR, de2-7 EGFR o EGFRvlll se usan como sinónimos) que contiene una deleción de 267 aminoácidos del dominio extracelular (Kuan CT, Wikstrand CJ, Bigner DD: EGF mutant receptor vlll as a molecular target in cancer therapy; Endocr Relat Cancer. 2001 Jun;8(2):83-96) se obtuvo por síntesis génica de acuerdo con protocolos estándar. El fragmento de síntesis génica se diseñó para que contuviera en primer lugar un sitio de Kozak para permitir la expresión eucariota de la construcción seguido de la secuencia codificante de un péptido líder de 24 aminoácidos seguido en fase por la secuencia codificante del dominio extracelular C-terminal humano, el dominio transmembranario y citoplásmico y un codón de detención. El fragmento de síntesis génica también se diseñó para introducir sitios de restricción al principio y al final del fragmento de ADN. Con fines de clonación, se añadieron sitios de reconocimiento de enzimas de restricción Xbal y SalI en los extremos 5' y 3', respectivamente. Posteriormente, se digirió el ADN del gen sintético con Xbal y SalI, se ligó en el vector de expresión pEF-DHFR digerido apropiadamente y se transformó en E.coli. Se transfectó un clon con secuencia nucleotídica comprobada (la secuencia de ADN y la secuencia de aminoácidos de la construcción recombinante se enumeran en las SEQ ID 599 y 598) en células CHO deficientes en DHFR para la expresión eucariota de la construcción. La expresión eucariota de proteínas en células CHO deficientes en DHFR se realizó como se describe anteriormente.
26.2 Generación y expresión del EGFR vlll de cynomolgus
En analogía con el ejemplo 26.1 se creó la variante de EGFR vlll de cynomolgus por deleción de los 267 aminoácidos del dominio extracelular y la inserción del nuevo aminoácido glicina en el sitio de fusión (aminoácido n.º 6). El fragmento de síntesis génica se diseñó para que contuviera en primer lugar un sitio de Kozak para permitir la expresión eucariota de la construcción seguido de la secuencia codificante de un péptido líder de 24 aminoácidos seguido en fase por la secuencia codificante del dominio extracelular C-terminal de cynomolgus, el dominio transmembranario y citoplásmico (ambos humanos) y un codón de detención. El fragmento de síntesis génica también se diseñó para introducir sitios de restricción al principio y al final del fragmento de ADN. Los sitios de restricción introducidos, XbaI en el extremo 5' y SalI en el extremo 3', se utilizaron en los procedimientos de clonación siguientes. Se digirió el fragmento con Xbal/SalI y se clonó en pEF-DHFR siguiendo protocolos estándar. Se usó un plásmido de secuencia comprobada para transfectar células CHO/dhfr- (N.º de la ATCC CRL9096; cultivadas en RPMI 1640 con glutamina estabilizada obtenidas de Biochrom AG, Berlín, Alemania, suplementado con FCS al 10 %, penicilina/estreptomicina al 1 %, todos obtenidos de Biochrom AG, Berlín, Alemania y nucleósidos de una solución madre de reactivos de calidad para cultivo celular obtenidos de Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Alemania, hasta una concentración final de 10 µg/ml de adenosina, 10 µg/ml de desoxiadenosina y 10 µg/ml de timidina, en una incubadora a 37 °C, con el 95 % de humedad y el 7 % de CO2). La transfección se realizó usando el reactivo de transfección PolyFect (Qiagen GmbH, Hilden, Alemania) y 5 µg de ADN plasmídico de acuerdo
con el protocolo del fabricante. Después de 24 horas de cultivo, se lavaron las células una vez con PBS y se cultivaron de nuevo en el medio ce cultivo celular mencionado anteriormente, excepto porque el medió no estaba suplementado con nucleósidos y que se usó FCS dializado (obtenido de Biochrom AG, Berlín, Alemania). Por tanto, el medio de cultivo celular no contenía nucleósidos y, de este modo, se aplicó la selección en las células transfectadas. Aproximadamente 14 días después de la transfección, se observó el crecimiento de células resistentes. Después de otros 7 a 14 días, se probaron los transfectantes positivos para la expresión de la construcción por medio de FACS.
26.3. Generación de moléculas monocatenarias biespecíficas específicas de especies cruzadas de EGFRvlll y CD3
En general, se diseñaron moléculas de anticuerpo monocatenario biespecífico, comprendiendo cada uno un dominio con una especificidad de unión por el antígeno de CD3 humana y de primate distinto de chimpancé, así como un dominio con una especificidad de unión por el antígeno de EGFRvIII humano y de primate distinto de chimpancé, como se expone en la siguiente tabla 9:
Tabla 9: Formatos de moléculas de anticuerpo monocatenario biespecífico específico de especies cruzadas anti-CD3 y anti-EGFRvIII
SEQ ID (nucl/prot)
Formatos de construcciones de proteína (N�C)
708/707
V90F5 HL x I2C HL
680/679
V96A9 HL x I2C HL
694/693
V98B11 HL x I2CHL
722/721
V11A11 HL x l2CHL
736/735
V11F6HL x l2CHL
750/749
V11G7HL x l2CHL
764/763
V17F5HL x I2CHL
778/777
V11A4HL x l2CHL
792/791
V17C8HL x l2CHL
806/805
V17G9HL x l2CHL
820/819
V17B11 HL x l2CHL
834/833
V17F11 HL x l2CHL
848/847
V16B7HL x l2CHL
862/861
V17A4HL x l2CHL
648/647
V207C12HL x l2CHL
Se obtuvieron por síntesis génica las construcciones mencionadas anteriormente que contenían los dominios variable de cadena ligera (L) y variable de cadena pesada (H) específicas de especies cruzadas para EGFRvIII humano y de cynomolgus y las combinaciones de VH y VL específicas para CD3 específicas de especies cruzadas para CD3 humana y de macaco. Los fragmentos de síntesis génica se diseñaron para que contuvieran en primer lugar un sitio de Kozak para la expresión eucariota de la construcción, seguido por un péptido líder de inmunoglobulina de 19 aminoácidos, seguido en fase por la secuencia codificante de la molécula de anticuerpo monocatenario biespecífico correspondiente, seguida en fase por la secuencia codificante de una marca de 6 histidinas y un codón de detención. El fragmento de síntesis génica también se diseñó para introducir sitios de restricción adecuados al principio y al final del fragmento. Los sitios de restricción introducidos se utilizaron en los procedimientos de clonación siguientes. El fragmento de síntesis génica se clonó a través de estos sitios de restricción en un plásmido denominado pEF-DHFR siguiendo protocolos estándar. Se transfectó un clon con secuencia nucleotídica comprobada en células CHO deficientes en DHFR para la expresión eucariota de la construcción. La expresión eucariota de proteínas en células CHO deficientes en DHFR se realizó como se describe por Kaufmann R.J. (1990) Methods Enzymol. 185, 537-566. La amplificación de genes de la construcción se indujo mediante el aumento de las concentraciones metotrexato (MTX) hasta una concentración final de hasta MTX 20 nM. De forma alternativa, las construcciones se transfectaron en células CHO deficientes en DHFR de forma transitoria de acuerdo con protocolos estándar.
Los experimentos de FACS de unión se realizaron con la línea de células CHO transfectadas con EGFRvIII humano para evaluar la capacidad de unión al antígeno de EGFRvIII humano. La especificidad de especies cruzadas para tejido de cynomolgus se probó desplegando las células CHO transfectadas con el EGFRvIII de cynomolgus. Se aplican los mismos cambios en las líneas celulares a los ensayos de citotoxicidad realizados con los anticuerpos monocatenarios biespecíficos específicos de especies cruzadas de EGFRvIII y CD3. Aparte de esto, los ensayos se realizaron como se describe en los ejemplos 4 y 5.
Como se representa en la figura 39, los anticuerpos monocatenarios biespecíficos específicos de especies cruzadas de EGFRvIII y CD3 generados demostraron unión a los antígenos tanto humanos como de cynomolgus y resultaron ser totalmente específicos de especies cruzadas.
Como se muestra en la figura 40, todas las construcciones de anticuerpo monocatenario biespecífico específico de especies cruzadas generadas revelaron actividad citotóxica contra células objetivo positivas para EGFRvIII humano provocada por linfocitos CD8+ humanos y células objetivo positivas para EGFRvIII de cynomolgus provocada por la línea de linfocitos T de macaco 4119LnPx. Como control negativo, se ha usado un anticuerpo monocatenario biespecífico no pertinente.
27. Generación y caracterización de moléculas monocatenarias biespecíficas específicas de especies cruzadas de IgE y CD3
27.1 Clonación y expresión de la forma de IgE unida a membrana humana y de macaco
Se usó la línea celular de ratón J558L (obtenida de Interlab Project, Istituto Nazionale per la Ricerca sul Cancro, Génova, Italia, ECACC 88032902), una línea celular de mieloma espontánea de variante de pérdida de cadena pesada que sintetiza y secreta una cadena ligera lambda, para complementarla con una variante de cadena pesada unida a membrana de la IgE humana y de macaco, respectivamente. Con el fin de generar construcciones de este tipo se obtuvieron moléculas sintéticas por síntesis génica de acuerdo con protocolos estándar (las secuencias de nucleótidos de las construcciones se enumeran en las SEQ ID NO: 595 y 594). En estas construcciones, se fusionó la secuencia de codificación de CD3 épsilon humana y de macaco, respectivamente, a la región transmembranaria de IgE humana. La especificidad incorporada en la cadena VH se dirige contra el hapteno (4-hidroxi-3-nitrofenil)acetil) (NP). El fragmento de síntesis génica también se diseñó para que contuviera un sitio de Kozak para la expresión eucariota de la construcción y un líder de inmunoglobulina y sitios de restricción al principio y al final del ADN. Los sitios de restricción introducidos, EcoRI en el extremo 5' y SalI en el extremo 3', se utilizaron durante la etapa de clonación en el plásmido de expresión denominado pEF-DHFR. Después de comprobar la secuencia (macaco: XM_001116734 región C de Ig épsilon de Macaca mulatta, ARNm; ser humano: NC_000014 cromosoma 14 de Homo sapiens, secuencia completa, National Center for Biotechnology Information, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez) se usaron los plásmidos para transfectar células CHO/dhfr- como se describe anteriormente. La expresión eucariota de proteínas en células CHO deficientes en DHFR se realiza como se describe por Kaufmann R.J. (1990) Methods Enzymol. 185, 537-566. La amplificación de genes de la construcción se induce mediante el aumento de las concentraciones metotrexato (MTX) hasta una concentración final de hasta MTX 20 nM.
27.2. Generación de moléculas monocatenarias biespecíficas específicas de especies cruzadas de IgE y CD3
En general, se diseñaron moléculas de anticuerpo monocatenario biespecífico, comprendiendo cada uno un dominio con una especificidad de unión por el antígeno de CD3 humana y de primate distinto de chimpancé, así como un dominio con una especificidad de unión por el antígeno de IgE humana y de primate distinto de chimpancé, como se expone en la siguiente tabla 10:
Tabla 10: Formatos de moléculas de anticuerpo monocatenario biespecífico específico de especies cruzadas anti-CD3 y anti-IgE
SEQ ID (nucl/prot)
Formatos de construcciones de proteína (N�C)
1549/1548
IgE G9 HL x I2C HL
1547/1546
lgE G9 HL x F12QHL
1545/1544
IgE G9 HL x H2C HL
1555/1554
IgE G9 LH x I2C HL
1553/1552
IgE G9 LH x F12Q HL
1551/1550
IgE G9 LH x H2C HL
1529/1528
IgE D4 LH x I2C HL
1527/1526
IgE D4 LH x F12Q HL
1525/1524
IgE D4 LH x H2C HL
1523/1522
IgE D4 HL x I2C HL
1521/1520
lgE D4 HL x F12Q HL
1519/1518
IgE D4 HL x H2C HL
1557/1556
H2C HL x lgE-G9 HL
1559/1558
F12Q HL x lgE-G9 HL
1567/1566
IgE G9 LH x I2C LH
1561/1560
I2C HL x IgE G9 HL
1563/1562
I2C HL x IgE G9 LH
1565/1564
I2C LH x IgE G9 LH
Se obtuvieron por síntesis génica las construcciones mencionadas anteriormente que contenían los dominios variable de cadena ligera (L) y variable de cadena pesada (H) específicas de especies cruzadas para IgE humana y de macaco y las combinaciones de VH y VL específicas para CD3 específicas de especies cruzadas para CD3 humana y de macaco. Los fragmentos de síntesis génica se diseñaron para que contuvieran en primer lugar un sitio de Kozak para la expresión eucariota de la construcción, seguido por un péptido líder de inmunoglobulina de 19 aminoácidos, seguido en fase por la secuencia codificante de la molécula de anticuerpo monocatenario biespecífico correspondiente, seguida en fase por la secuencia codificante de una marca de 6 histidinas y un codón de detención. El fragmento de síntesis génica también se diseñó para introducir sitios de restricción adecuados al principio y al final del fragmento. Los sitios de restricción introducidos se utilizaron en los procedimientos de clonación siguientes. El fragmento de síntesis génica se clonó a través de estos sitios de restricción en un plásmido denominado pEF-DHFR siguiendo protocolos estándar. Se transfectó un clon con secuencia nucleotídica comprobada en células CHO deficientes en DHFR para la expresión eucariota de la construcción. La expresión eucariota de proteínas en células CHO deficientes en DHFR se realizó como se describe por Kaufmann R.J. (1990) Methods Enzymol. 185, 537-566. La amplificación de genes de la construcción se indujo mediante el aumento de las concentraciones metotrexato (MTX) hasta una concentración final de hasta MTX 20 nM. De forma alternativa, las construcciones se transfectaron en células CHO deficientes en DHFR de forma transitoria de acuerdo con protocolos estándar.
Los experimentos de FACS de unión se realizaron con la línea celular humana J558L transfectada con IgE para evaluar la capacidad de unión a la IgE humana. La especificidad de especies cruzadas para células positivas para IgE de macaco se probó desplegando las células J558L transfectadas con la IgE de macaco. También se usó la línea celular J558L para los ensayos de citotoxicidad realizados con los anticuerpos monocatenarios biespecíficos específicos de especies cruzadas de IgE y CD3. Los experimentos de unión, así como los ensayos de citotoxicidad, se realizaron como se describe anteriormente.
Como se representa en la figura 41, los anticuerpos monocatenarios biespecíficos específicos de especies cruzadas de IgE y CD3 generados demostraron unión a los antígenos tanto humanos como de cynomolgus y resultaron ser totalmente específicos de especies cruzadas.
Como se muestra en la figura 42, todas las construcciones de anticuerpo monocatenario biespecífico específico de especies cruzadas generadas revelaron actividad citotóxica contra células objetivo positivas para IgE humana provocada por linfocitos CD8+ humanos y células objetivo positivas para IgE de macaco provocada por la línea de linfocitos T de macaco 4119LnPx. Como control negativo, se ha usado un anticuerpo monocatenario biespecífico no pertinente.
28. Generación y caracterización de moléculas monocatenarias biespecíficas específicas de especies cruzadas de CD44 y CD3
28.1. Generación de células CHO que expresan CD44 humana
La secuencia codificante de CD44 humana publicada en GenBank (número de acceso AJ251595) y que también contenían el exón CD44v6 se obtuvo por síntesis génica de acuerdo con protocolos estándar. El fragmento de síntesis génica se diseñó para que contuviera en primer lugar un sitio de Kozak para la expresión eucariota de la construcción, seguido de la secuencia codificante de la proteína CD44 humana y un codón de detención (las secuencias de ADNc y de aminoácidos de la construcción se enumeran en las SEQ ID NO: 608 y 609). El fragmento de síntesis génica también se diseñó para introducir sitios de restricción al principio y al final del fragmento. Los sitios de restricción introducidos, EcoRI en el extremo 5' y SalI en el extremo 3', se utilizaron en los procedimientos de clonación siguientes. El fragmento de síntesis génica se clonó a través de EcoRI y SalI en un plásmido denominado pEF-DHFR (pEF-DHFR se describió en Raum et al. Cancer Immunol Immunother 50 (2001) 141-150) siguiendo protocolos estándar. Los procedimientos mencionados anteriormente se llevaron a cabo de acuerdo con protocolos estándar (Sambrook, Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 3ª edición, Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, Nueva York (2001)). Se transfectó un clon con secuencia nucleotídica comprobada en células CHO deficientes en DHFR para la expresión eucariota de la construcción. La expresión eucariota de proteínas en células CHO deficientes en DHFR se realizó como se describe por Kaufmann R.J. (1990) Methods Enzymol. 185, 537-566. La amplificación de genes de la construcción se indujo mediante el aumento de las concentraciones metotrexato (MTX) hasta una concentración final de hasta MTX 20 nM.
28.2. Generación de células CHO que expresan CD44 humana sin el exón v6
La secuencia codificante de CD44 humana publicada en GenBank (número de acceso AJ251595) con la secuencia del exón v6 eliminada se obtuvo por síntesis génica de acuerdo con protocolos estándar. El fragmento de síntesis génica se diseñó para que contuviera en primer lugar un sitio de Kozak para la expresión eucariota de la construcción, seguido de la secuencia codificante de la proteína CD44 humana sin el exón v6 y un codón de detención (las secuencias de ADNc y de aminoácidos de la construcción se enumeran en las SEQ ID NO: 610 y
611). El fragmento de síntesis génica también se diseñó para introducir sitios de restricción al principio y al final del fragmento. Los sitios de restricción introducidos, EcoRI en el extremo 5' y SalI en el extremo 3', se utilizaron en los procedimientos de clonación siguientes. El fragmento de síntesis génica se clonó por medio de EcoRI y SalI en un plásmido denominado pEF-DHFR (pEF-DHFR se describe en Raum et al. Cancer Immunol Immunother 50 (2001) 141-150) siguiendo protocolos estándar. Los procedimientos mencionados anteriormente se llevaron a cabo de acuerdo con protocolos estándar (Sambrook, Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 3ª edición, Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, Nueva York (2001)). Se transfectó un clon con secuencia nucleotídica comprobada en células CHO deficientes en DHFR para la expresión eucariota de la construcción. La expresión eucariota de proteínas en células CHO deficientes en DHFR se realizó como se describe por Kaufmann
R.J. (1990) Methods Enzymol. 185, 537-566. La amplificación de genes de la construcción se indujo mediante el aumento de las concentraciones de metotrexato (MTX) hasta una concentración final de hasta MTX 20 nM.
28.3 Generación de células CHO que expresan CD44 de macaco
La secuencia codificante de la CD44 de macaco publicada en GenBank (número de acceso XM_001115359) y que también contenía el exón CD44v6 se obtuvo por síntesis génica de acuerdo con protocolos estándar (la secuencia de ADNc y de aminoácidos de la construcción se enumera en las SEQ ID NO 612 y 613). En la construcción utilizada la secuencia codificante corresponde a la CD44 de macaco excepto por una mutación puntual en la posición 1 del codón del quinto aminoácido del péptido señal de la proteína CD44, lo que da lugar a una mutación de arginina a triptófano que corresponde a la secuencia humana. El fragmento de síntesis génica también se diseñó para que contuviera un sitio de Kozak para la expresión eucariota de la construcción y sitios de restricción al principio y al final del fragmento. Los sitios de restricción introducidos, EcoRI en el extremo 5' y SalI en el extremo 3', se utilizaron en los procedimientos de clonación siguientes. Después, el fragmento de síntesis génica se clonó a través de EcoRI y SalI en un plásmido denominado pEF-DHFR (pEF-DHFR se describe en Raum et al. Cancer Immunol Immunother 50 (2001) 141-150). Se usó un clon de secuencia comprobada de este plásmido para transfectar células CHO/dhfr-como se describe anteriormente.
28.4. Generación de moléculas monocatenarias biespecíficas específicas de especies cruzadas de CD44v6 y CD3
En general, se diseñan moléculas de anticuerpo monocatenario biespecífico, comprendiendo cada uno un dominio con una especificidad de unión de especies cruzadas específico para CD3épsilon humana y de primate distinto de chimpancé, así como un dominio con una especificidad de unión de especies cruzadas específico para CD44v6 humana y de primate distinto de chimpancé, como se expone en la siguiente tabla 11:
Tabla 11: Formatos de moléculas de anticuerpo monocatenario biespecífico específico de especies cruzadas anti-CD3 y anti-CD44v6
SEQ ID (nucl/prot)
Formatos de construcciones de proteína (N�C)
1589/1588
CD44-A8LH x l2C HL
1587/1586
CD44-A8HL x I2C HL
Se obtuvieron por síntesis génica las construcciones mencionadas anteriormente que contenían los dominios variable de cadena ligera (L) y variable de cadena pesada (H) específicas de especies cruzadas para CD44 humana y de macaco y las combinaciones de VH y VL específicas para CD3 específicas de especies cruzadas para CD3 humana y de macaco. Los fragmentos de síntesis génica se diseñaron para que contuvieran en primer lugar un sitio de Kozak para la expresión eucariota de la construcción, seguido por un péptido líder de inmunoglobulina de 19 aminoácidos, seguido en fase por la secuencia codificante de la molécula de anticuerpo monocatenario biespecífico correspondiente, seguida en fase por la secuencia codificante de una marca histidina6 y un codón de detención. El fragmento de síntesis génica también se diseñó para introducir sitios de restricción adecuados al principio y al final del fragmento. Los sitios de restricción introducidos se utilizaron en los procedimientos de clonación siguientes. El fragmento de síntesis génica se clonó a través de estos sitios de restricción en un plásmido denominado pEF-DHFR (pEF-DHFR se describe en Raum et al. Cancer Immunol Immunother 50 (2001) 141-150) siguiendo protocolos estándar. Los procedimientos mencionados anteriormente se llevaron a cabo de acuerdo con protocolos estándar (Sambrook, Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 3ª edición, Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, Nueva York (2001)). Se transfectó un clon con secuencia nucleotídica comprobada en células CHO deficientes en DHFR para la expresión eucariota de la construcción. La expresión eucariota de proteínas en células CHO deficientes en DHFR se realizó como se describe por Kaufmann R.J. (1990) Methods Enzymol. 185, 537-566. La amplificación de genes de la construcción se indujo mediante el aumento de las concentraciones metotrexato (MTX) hasta una concentración final de hasta MTX 20 nM.
28.5 Expresión y purificación de las moléculas de anticuerpo monocatenario biespecífico
Las moléculas de anticuerpo monocatenario biespecífico se expresaron en células de ovario de hámster chino (CHO). La expresión eucariota de proteínas en células CHO deficientes en DHFR se realizó como se describe por Kaufmann R.J. (1990) Methods Enzymol. 185, 537-566. La amplificación de genes de las construcciones se indujo mediante la adición de concentraciones crecientes de MTX hasta concentraciones finales de MTX de 20 nM. Después de dos pasos de cultivo estacionario, las células se hicieron crecer en frascos rotatorios con medio líquido de soja HyQ PF CHO sin nucleósidos (con L-glutamina 4,0 mM con Pluronic F - 68 al 0,1 %; HyClone) durante 7 días antes de recogerlas. Se retiraron las células por centrifugación y se almacenó el sobrenadante que contenía la proteína expresada a -20 °C. De forma alternativa, las construcciones se expresaron de forma transitoria en células HEK 293. La transfección se realizó con reactivo 293fectin (Invitrogen, N.º 12347-019) de acuerdo con el protocolo del fabricante.
Para la cromatografía se usaron el sistema de exploración Äkta® (GE Health Systems) y el programa informático Unicorn®. Se realizó una cromatografía de afinidad de metales inmovilizados ("IMAC") usando un quelato Fractogel EMD® (Merck) que se cargó con ZnCl2 de acuerdo con el protocolo proporcionado por el fabricante. Se equilibró la columna con tampón A (tampón de fosfato de sodio 20 mM a pH 7,2, NaCl 0,1 M) y se aplicó el sobrenadante de cultivo celular (500 ml) a la columna (10 ml) a una caudal de 3 ml/min.
La columna se lavó con tampón A para retirar la muestra no unida. La proteína unida se eluyó usando un gradiente en dos etapas de tampón B (tampón de fosfato de sodio 20 mM a pH 7,2, NaCl 0,1 M, imidazol 0,5 M) de acuerdo con lo siguiente:
Etapa 1: tampón B al 20 % en 6 volúmenes de columna
Etapa 2: tampón B al 100 % en 6 volúmenes de columna
Las fracciones de proteína eluida a partir de la etapa 2 se agruparon para su purificación adicional. Todos los productos químicos eran de calidad de investigación y comprados de Sigma (Deisenhofen) o Merck (Darmstadt).
La cromatografía de filtración en gel se realizó en una columna de calidad prep HiLoad 16/60 Superdex 200 (GE/Amersham) equilibrada con tampón de equilibrado (citrato 25 mM, lisina 200 mM, glicerol al 5 %, a pH 7,2). Las muestras de proteína eluidas (caudal 1 ml/min) se sometieron a SDS-PAGE estándar y transferencia de bandas western para su detección. Antes de la purificación, se calibró la columna para la determinación del peso molecular (kit de marcadores de peso molecular, Sigma MW GF-200). Las concentraciones de proteína se determinaron usando la DO a 280 nm.
La proteína de anticuerpo monocatenario biespecífico purificada se analizó en SDS PAGE en condiciones reductoras realizada con geles bis-tris preformados al 4-12 % (Invitrogen). La preparación y la aplicación de las muestras se realizaron de acuerdo con el protocolo proporcionado por el fabricante. Se determina el peso molecular con patrón proteínico MultiMark (Invitrogen). El gel se tiñó con Coomassie coloidal (protocolo de Invitrogen). La pureza de la proteína aislada fue > 95 %, determinada por SDS-PAGE.
El anticuerpo monocatenario biespecífico tiene un peso molecular de aproximadamente 52 kDa en condiciones nativas, determinado por filtración en gel en PBS. Todas las construcciones se purificaron de acuerdo con este procedimiento.
La transferencia de bandas western se realizó usando una membrana Optitran® BA-S83 y el módulo de transferencia de bandas de Invitrogen de acuerdo con el protocolo proporcionado por el fabricante. Se usaron anticuerpos dirigidos contra la marca histidina6 (Penta His, Qiagen) e Ig de cabra anti-ratón marcada con fosfatasa alcalina (AP) (Sigma) y BCIP/NBT (Sigma) como sustrato. Se detectó una única banda a 52 kD correspondiente al anticuerpo monocatenario biespecífico purificado.
28.6. Análisis de unión por citometría de flujo de los anticuerpos biespecíficos específicos de especies cruzadas de CD44 y CD3
Con el fin de probar la funcionalidad de las construcciones de anticuerpo biespecífico específico de especies cruzadas con respecto a la capacidad de unión a CD44 y CD3 humana y de macaco, respectivamente, se llevó a cabo un análisis de FACS. Para este propósito se usaron células CHO transfectadas con CD44 humana como se describe en el ejemplo 28.1 y la línea celular humana de leucemia de linfocitos T positivos para CD3 HPB-ALL (DSMZ, Braunschweig, ACC483) para probar la unión a antígenos humanos. La reactividad de unión a antígenos de macaco se probó usando el transfectante de CD44 de macaco generado descrito en el ejemplo 28.3 y las PBMC de macaco (la preparación de PBMC de macaco se realizó por centrifugación en gradiente de Ficoll de sangre periférica de macacos de acuerdo con protocolos estándar). Se probó la especificidad por el exón v6 de CD44 usando las células CHO transfectadas que expresaban CD44 humana sin el exón v6 generadas como se describe en el ejemplo
28.2. Se incubaron 200.000 células de las respectivas líneas celulares o PBMC de macaco durante 30 min en hielo con 50 µl de la proteína purificada de las construcciones de anticuerpo biespecífico específico de especies cruzadas (5 µg/ml) o 50 µl de un anticuerpo anti-CD44 comercialmente disponible (Becton Dickinson biosciences, Heidelberg; también 5 µg/ml). Se lavaron las células dos veces en PBS con FCS al 2 % y se detectó la unión de la construcción con un anticuerpo anti-His murino (anticuerpo Penta His; Qiagen; diluido 1:20 en 50 µl de PBS con FCS al 2 %). El anticuerpo anti-His se omitió para las muestras incubadas con el anticuerpo anti-CD44 comercialmente disponible.
Después del lavado, se detectó anticuerpo anti-His unido o anticuerpo anti-CD44 con un anticuerpo específico frente a Fc gamma (Dianova) conjugado con ficoeritrina, diluido 1:100 en PBS con FCS al 2 %. Se usó PBS con FCS al 2 % como control negativo.
Se realizó una citometría de flujo en un aparato FACS-Calibur; se usó el programa informático CellQuest para adquirir y analizar los datos (Becton Dickinson biosciences, Heidelberg). La tinción de FACS y la medida de la intensidad de fluorescencia se realizaron como se describe en Current Protocols in Immunology (Coligan, Kruisbeek, Margulies, Shevach y Strober, Wiley-lnterscience, 2002).
La unión biespecífica de las moléculas monocatenarias enumeradas anteriormente, que eran específicas de especies cruzadas para CD44 y específicas de especies cruzadas para CD3 humana y de primate distinto de chimpancé, era claramente detectable, como se muestra en la figura 43. En el análisis de FACS todas las construcciones mostraron unión a CD3 y CD44 en comparación con los controles negativos respectivos. Se demostró la especificidad de especies cruzadas de los anticuerpos biespecíficos frente a antígenos de CD3 y CD44 humanas y de macaco.
Se demostró la especificidad por el exón v6 de CD44 en la figura 44 por ausencia de unión de las construcciones a células CHO transfectadas con CD44 humana que carece del exón v6. Se demostró la expresión de CD44 por estas células por unión comparable del anticuerpo anti-CD44 comercialmente disponible a esas células y a las células CHO transfectadas con la CD44 humana de longitud completa.
28.7. Bioactividad de anticuerpos monocatenarios biespecíficos específicos de especies cruzadas de CD44 y CD3
Se analizó la bioactividad de los anticuerpos monocatenarios biespecíficos generados mediante ensayos de citotoxicidad in vitro de liberación de cromo 51 (51Cr) usando las líneas celulares positivas para CD44 descritas en el ejemplo 28.1. Como células efectoras se usaron PBMC humanas con eliminación de CD4/CD56 estimuladas.
La generación de PBMC humanas estimuladas se realizó como sigue:
Se recubrió una placa de Petri (145 mm de diámetro, Greiner) con un anticuerpo específico anti-CD3 comercialmente disponible (p. ej., OKT3, Othoclone) en una concentración final de 1 µg/ml durante 1 hora a 37 °C. La proteína no unida se retiró mediante una etapa de lavado con PBS. Se aislaron las PBMC recién obtenidas a partir de sangre periférica (30 - 50 ml de sangre humana) por centrifugación en gradiente de Ficoll de acuerdo con protocolos estándar. Se añadieron 3 - 5 x 107 PBMC a la placa de Petri recubierta previamente en 120 ml de RPMI 1640 con glutamina estabilizada / FCS al 10 % / 20 U/ml de IL-2 (Proleukin, Chiron) y se estimulan durante 2 días. Al tercer día se recogieron las células y se lavaron una vez con RPMI 1640. Se añadió IL-2 a una concentración final de 20 U/ml y se cultivaron de nuevo las células durante un día en el mismo medio de cultivo celular que anteriormente.
Mediante la eliminación de linfocitos T CD4+ y linfocitos NK CD56+ de acuerdo con protocolos estándar, se enriquecieron los linfocitos T citotóxicos (LTC) CD8+.
Las células objetivo se lavaron dos veces con PBS y se marcaron con 11,1 MBq de 51Cr en un volumen final de 100 µl de RPMI con FCS al 50 % durante 45 minutos a 37 °C. Posteriormente, las células objetivo marcadas se lavaron 3 veces con 5 ml de RPMI y después se usaron en el ensayo de citotoxicidad. El ensayo se realizó en una placa de 96 pocillos en un volumen total de 250 µl de RPMI suplementado (como anteriormente) con una proporción E:O de
10:1. Se aplicaron 1 µg/ml de las moléculas de anticuerpo monocatenario biespecífico específico de especies cruzadas y 20 diluciones de tres veces de las mismas. El tiempo de ensayo fue de 18 horas y la citotoxicidad se midió como valores relativos de cromo liberado en el sobrenadante en relación con la diferencia de lisis máxima (adición de Triton-X) y lisis espontánea (sin células efectoras). Todas las medidas se realizaron en cuadruplicados. La medida de la actividad del cromo en los sobrenadantes se realizó con un contador gamma Wizard 3" (Perkin Elmer Life Sciences GmbH, Colonia, Alemania). El análisis de los datos experimentales se realizó con Prism 4 para Windows (versión 4.02, GraphPad Software Inc., San Diego, California, EE. UU.). Típicamente, las curvas sigmoidales de respuesta a dosis tienen valores de R2 > 0,90, determinados por el programa informático. Los valores de CE50 calculados por el programa de análisis se usaron para la comparación de la bioactividad.
Como se muestra en la figura 45, las construcciones de anticuerpo monocatenario biespecífico específico de especies cruzadas generadas demostraron actividad citotóxica contra células objetivo positivas para CD44 humanas provocada por PBMC humanas con eliminación de CD4/CD56 estimuladas.
29. Generación y caracterización de moléculas monocatenarias biespecíficas específicas de especies cruzadas de CD30 y CD3
29.1 Generación de células CHO que expresan CD30 humana
La secuencia codificante de CD30 humana publicada en GenBank (número de acceso M83554) se obtuvo por síntesis génica de acuerdo con protocolos estándar. El fragmento de síntesis génica se diseñó para que contuviera en primer lugar un sitio de Kozak para la expresión eucariota de la construcción, seguido de un péptido líder de
inmunoglobulina de 19 aminoácidos, seguido en fase de la secuencia codificante de la proteína CD30 humana madura y un codón de detención (las secuencias de ADNc y de aminoácidos de la construcción se enumeran en las SEQ ID NO: 1103 y 1104). El fragmento de síntesis génica también se diseñó para introducir sitios de restricción al principio y al final del fragmento. Los sitios de restricción introducidos, EcoRI en el extremo 5' y SalI en el extremo 3', se utilizaron en los procedimientos de clonación siguientes. Se eliminaron los sitios de restricción internos por mutación silenciosa de la secuencia codificante del fragmento de síntesis génica (BsrGI: nucleótido 243 desde T hasta C; SalI: nucleótido 327 desde A hasta G; SalI: nucleótido 852 desde A hasta G; EcoRI: nucleótido 1248 desde T hasta C). El fragmento de síntesis génica se clonó a través de EcoRI y SalI en un plásmido denominado pEF-DHFR (pEF-DHFR se describe en Raum et al. Cancer Immunol Immunother 50 (2001) 141-150) siguiendo protocolos estándar. Los procedimientos mencionados anteriormente se llevaron a cabo de acuerdo con protocolos estándar (Sambrook, Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 3ª edición, Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, Nueva York (2001)). Se transfectó un clon con secuencia nucleotídica comprobada en células CHO deficientes en DHFR para la expresión eucariota de la construcción. La expresión eucariota de proteínas en células CHO deficientes en DHFR se realizó como se describe por Kaufmann R.J. (1990) Methods Enzymol. 185, 537-566. La amplificación de genes de la construcción se indujo mediante el aumento de las concentraciones metotrexato (MTX) hasta una concentración final de hasta MTX 20 nM.
29.2 Generación de células CHO que expresan CD30 de macaco
Se obtuvo la secuencia de ADNc de CD30 de macaco mediante un conjunto de 4 PCR en un ADNc de médula ósea de macaco preparada de acuerdo con protocolos estándar. Se usaron las siguientes condiciones de reacción: 1 ciclo a 94 °C durante 2 minutos seguido de 35 ciclos con 94 °C durante 1 minuto, 55°C durante 1 minuto y 72 °C durante 2 minutos seguido de un ciclo terminal de 72 °C durante 3 minutos y los siguientes cebadores:
6.
cebador directo: 5'-cctcgccgcgctgggactgc-3'
cebador inverso: 5'-ggtgccactggagggttccttgc-3'
7.
cebador directo: 5'-gcttcttccattctgtctgcccagcagg-3'
cebador inverso: 5'-ggtaggggacacagcgggcacaggagttgg-3*
8.
cebador directo: 5'-cctggcatgatctgtgccacatcagcc-3'
cebador inverso: 5'-gcgttgagctcctcctgggtctgg-3'
9.
cebador directo: 5'-cctcccrgcccaagctagagcttgtgg-3'
cebador inverso: 5'-cgactctagagcggccgctcactttccagaggcagctgtgggcaaggggtcttctttcccttcc-3'
Las reacciones de PCR se realizaron con la adición de betaína de calidad para PCR a una concentración final de 1
M. Esas PCR generan cuatro fragmentos solapantes, que se aislaron y se secuenciaron de acuerdo con protocolos estándar usando los cebadores de PCR y, de este modo, proporcionan una porción de la secuencia codificante de ADNc de CD30 de macaco desde el codón 12 del péptido líder hasta el codón 562 de la proteína madura. Para generar una construcción para la expresión de CD30 de macaco se obtuvo un fragmento de ADNc mediante síntesis génica de acuerdo con protocolos estándar (las secuencias de ADNc y de aminoácidos de la construcción se enumeran en las SEQ ID NO: 1105 y 1106). En esta construcción, se fusionó la secuencia codificante de CD30 de macaco desde el aminoácido 12 del péptido líder hasta el aminoácido 562 de la proteína CD30 madura en la secuencia codificante de CD30 humana, reemplazando la parte correspondiente de la secuencia codificante humana. El fragmento de síntesis génica también se diseñó para que contuviera un sitio de Kozak para la expresión eucariota de la construcción y sitios de restricción al principio y al final del fragmento que contiene el ADNc codificante para el dominio extracelular completo de la CD30 de macaco, el dominio transmembranario de la CD30 de macaco y un dominio de CD30 intracelular quimérico de macaco-humano. Los sitios de restricción introducidos, XbaI en el extremo 5' y SalI en el extremo 3', se utilizaron en los procedimientos de clonación siguientes. Después, el fragmento de síntesis génica se clonó a través de XbaI y SalI en un plásmido denominado pEF-DHFR (pEF-DHFR se describe en Raum et al. Cancer Immunol Immunother 50 (2001) 141-150). Se usó un clon de secuencia comprobada de este plásmido para transfectar células CHO/dhfr- como se describe anteriormente.
29.3. Generación de moléculas monocatenarias biespecíficas específicas de especies cruzadas de CD30 y CD3
Clonación de moléculas de unión específicas de especies cruzadas
En general, se diseñaron moléculas de anticuerpo monocatenario biespecífico, comprendiendo cada uno un dominio con una especificidad de unión de especies cruzadas específico para CD3épsilon humana y de primate distinto de chimpancé, así como un dominio con una especificidad de unión de especies cruzadas específico para CD30 humana y de primate distinto de chimpancé, como se expone en la siguiente tabla 12:
Tabla 12: Formatos de moléculas de anticuerpo monocatenario biespecífico específico de especies cruzadas anti-CD3 y anti-CD30
SEQ ID (nucl/prot)
Formatos de construcciones de proteína (N�C)
1126/1125
M911HL x l2CHL
1139/1138
SR3HL x l2CHL
Se obtuvieron por síntesis génica las construcciones mencionadas anteriormente que contenían los dominios variable de cadena ligera (L) y variable de cadena pesada (H) específicas de especies cruzadas para CD30 humana y de macaco y las combinaciones de VH y VL específicas para CD3 específicas de especies cruzadas para CD3 humana y de macaco. Los fragmentos de síntesis génica se diseñaron para que contuvieran en primer lugar un sitio de Kozak para la expresión eucariota de la construcción, seguido por un péptido líder de inmunoglobulina de 19 aminoácidos, seguido en fase por la secuencia codificante de la molécula de anticuerpo monocatenario biespecífico correspondiente, seguida en fase por la secuencia codificante de una marca de 6 histidinas y un codón de detención. El fragmento de síntesis génica también se diseñó para introducir sitios de restricción adecuados al principio y al final del fragmento. Los sitios de restricción introducidos se utilizaron en los procedimientos de clonación siguientes. El fragmento de síntesis génica se clonó a través de estos sitios de restricción en un plásmido denominado pEF-DHFR (pEF-DHFR se describe en Raum et al. Cancer Immunol Immunother 50 (2001) 141-150) siguiendo protocolos estándar. Los procedimientos mencionados anteriormente se llevaron a cabo de acuerdo con protocolos estándar (Sambrook, Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 3ª edición, Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, Nueva York (2001)). Se transfectó un clon con secuencia nucleotídica comprobada en células CHO deficientes en DHFR para la expresión eucariota de la construcción. La expresión eucariota de proteínas en células CHO deficientes en DHFR se realizó como se describe por Kaufmann R.J. (1990) Methods Enzymol. 185, 537-566. La amplificación de genes de la construcción se indujo mediante el aumento de las concentraciones metotrexato (MTX) hasta una concentración final de hasta MTX 20 nM.
29.4. Expresión y purificación de las moléculas de anticuerpo monocatenario biespecífico
Las moléculas de anticuerpo monocatenario biespecífico se expresaron en células de ovario de hámster chino (CHO). La expresión eucariota de proteínas en células CHO deficientes en DHFR se realizó como se describe por Kaufmann R.J. (1990) Methods Enzymol. 185, 537-566.
La amplificación de genes de las construcciones se indujo mediante la adición de concentraciones crecientes de MTX hasta concentraciones finales de MTX de 20 nM. Después de dos pasos de cultivo estacionario, las células se hicieron crecer en frascos rotatorios con medio líquido de soja HyQ PF CHO sin nucleósidos (con L-glutamina 4,0 mM con Pluronic F -68 al 0,1 %; HyClone) durante 7 días antes de recogerlas. Se retiraron las células por centrifugación y se almacenó el sobrenadante que contenía la proteína expresada a -20 °C. De forma alternativa, las construcciones se expresaron de forma transitoria en células HEK 293. La transfección se realizó con reactivo 293fectin (Invitrogen, N.º 12347-019) de acuerdo con el protocolo del fabricante.
Para la cromatografía se usaron el sistema de exploración Äkta® (GE Health Systems) y el programa informático Unicorn®. Se realizó una cromatografía de afinidad de metales inmovilizados ("IMAC") usando un quelato Fractogel EMD® (Merck) que se cargó con ZnCl2 de acuerdo con el protocolo proporcionado por el fabricante. Se equilibró la columna con tampón A (tampón de fosfato de sodio 20 mM a pH 7,2, NaCl 0,1 M) y se aplicó el sobrenadante de cultivo celular (500 ml) a la columna (10 ml) a una caudal de 3 ml/min. La columna se lavó con tampón A para retirar la muestra no unida. La proteína unida se eluyó usando un gradiente en dos etapas de tampón B (tampón de fosfato de sodio 20 mM a pH 7,2, NaCl 0,1 M, imidazol 0,5 M) de acuerdo con el procedimiento siguiente:
Etapa 1: tampón B al 20 % en 6 volúmenes de columna
Etapa 2: tampón B al 100 % en 6 volúmenes de columna
Las fracciones de proteína eluida a partir de la etapa 2 se agruparon para su purificación adicional. Todos los productos químicos son de calidad de investigación y comprados de Sigma (Deisenhofen) o Merck (Darmstadt).
La cromatografía de filtración en gel se realizó en una columna de calidad prep HiLoad 16/60 Superdex 200 (GE/Amersham) equilibrada con tampón de equilibrado (citrato 25 mM, lisina 200 mM, glicerol al 5 %, a pH 7,2). Las muestras de proteína eluidas (caudal 1 ml/min) se sometieron a SDS-PAGE estándar y transferencia de bandas western para su detección. Antes de la purificación, se calibró la columna para la determinación del peso molecular (kit de marcadores de peso molecular, Sigma MW GF-200). Las concentraciones de proteína se determinaron usando la DO a 280 nm.
La proteína de anticuerpo monocatenario biespecífico purificada se analizó en SDS PAGE en condiciones reductoras realizada con geles bis-tris preformados al 4-12 % (Invitrogen). La preparación y la aplicación de las muestras se realizaron de acuerdo con el protocolo proporcionado por el fabricante. Se determinó el peso molecular con patrón proteínico MultiMark (Invitrogen). El gel se tiñó con Coomassie coloidal (protocolo de Invitrogen). La pureza de la proteína aislada fue > 95 %, determinada por SDS-PAGE.
El anticuerpo monocatenario biespecífico tiene un peso molecular de aproximadamente 52 kDa en condiciones nativas, determinado por filtración en gel en PBS. Todas las construcciones se purificaron de acuerdo con este procedimiento.
La transferencia de bandas western se realizó usando una membrana Optitran® BA-S83 y el módulo de transferencia de bandas de Invitrogen de acuerdo con el protocolo proporcionado por el fabricante. Se usaron anticuerpos dirigidos contra la marca His (Penta His, Qiagen) e Ig de cabra anti-ratón marcada con fosfatasa alcalina (AP) (Sigma) y BCIP/NBT (Sigma) como sustrato. Se detectó una única banda a 52 kD correspondiente al anticuerpo monocatenario biespecífico purificado.
29.5. Análisis de unión por citometría de flujo de los anticuerpos biespecíficos específicos de especies cruzadas de CD30 y CD3
Con el fin de probar la funcionalidad de las construcciones de anticuerpo biespecífico específico de especies cruzadas con respecto a la capacidad de unión a CD30 y CD3 humana y de macaco, respectivamente, se llevó a cabo un análisis de FACS. Para este propósito se usaron células CHO transfectadas con CD30 humana como se describe en el ejemplo 29.1, la línea de linfocitos B humanos positivos para CD30 MEC-1(DSMZ, Braunschweig, ACC 497) y la línea celular humana de leucemia de linfocitos T positivos para CD3 HPB-ALL (DSMZ, Braunschweig, ACC483) para probar la unión a antígenos humanos. La reactividad de unión a antígenos de macaco se probó usando el transfectante de CD30 de macaco generado descrito en el ejemplo 29.2 y una línea de linfocitos T de macaco 4119LnPx (proporcionada amablemente por el Prof. Fickenscher, Instituto de Higiene, Virología, Erlangen-Núremberg; publicado en Knappe A, et al., y Fickenscher H., Blood 2000, 95, 3256-61). Se incubaron 200.000 células de las respectivas líneas celulares 30 min en hielo con 50 µl de la proteína purificada de las construcciones de anticuerpo biespecífico específico de especies cruzadas (5 µg/ml). Se lavaron las células dos veces en PBS con FCS al 2 % y se detectó la unión de la construcción con un anticuerpo murino Penta His (Qiagen; diluido 1:20 en 50 µl de PBS con FCS al 2 %). Después del lavado, se detectaron anticuerpos anti-His unidos con un anticuerpo específico frente a Fc gamma (Dianova) conjugado con ficoeritrina, diluido 1:100 en PBS con FCS al 2 %. Se usó PBS con FCS al 2 % como control negativo.
Se realizó una citometría de flujo en un aparato FACS-Calibur; se usó el programa informático CellQuest para adquirir y analizar los datos (Becton Dickinson biosciences, Heidelberg). La tinción de FACS y la medida de la intensidad de fluorescencia se realizaron como se describe en Current Protocols in Immunology (Coligan, Kruisbeek, Margulies, Shevach y Strober, Wiley-lnterscience, 2002).
La unión biespecífica de las moléculas monocatenarias enumeradas anteriormente, que son específicas de especies cruzadas para CD30 y específicas de especies cruzadas para CD3 humana y de primate distinto de chimpancé, era claramente detectable, como se muestra en la figura 46. En el análisis de FACS todas las construcciones mostraron unión a CD3 y CD30 en comparación con el control negativo. Se demostró la especificidad de especies cruzadas de los anticuerpos biespecíficos frente a antígenos de CD3 y CD30 humanas y de macaco.
29.6. Bioactividad de anticuerpos monocatenarios biespecíficos específicos de especies cruzadas de CD30 y CD3
Se analizó la bioactividad de los anticuerpos monocatenarios biespecíficos por ensayos de citotoxicidad in vitro de liberación de cromo 51 (51Cr) usando la línea de linfocitos B positivos para CD30 humanos MEC-1 (DSMZ, Braunschweig, ACC 497) y las células CHO transfectadas con CD30 de macaco descritas en el ejemplo 29.2. Como células efectoras se usaron PBMC humanas con eliminación de CD4/CD65 estimuladas o la línea de linfocitos T de macaco 4119LnPx, respectivamente.
La generación de PBMC humanas estimuladas se realizó como sigue:
Se recubrió una placa de Petri (145 mm de diámetro, Greiner bio-one GmbH, Kremsmunster) con un anticuerpo específico anti-CD3 comercialmente disponible (p. ej., OKT3, Othoclone) en una concentración final de 1 µg/ml durante 1 hora a 37 °C. La proteína no unida se retiró mediante una etapa de lavado con PBS. Se aislaron las PBMC recién obtenidas a partir de sangre periférica (30 - 50 ml de sangre humana) por centrifugación en gradiente de Ficoll de acuerdo con protocolos estándar. Se añadieron 3-5 x 107 PBMC a la placa de Petri recubierta previamente en 120 ml de RPMI 1640 con glutamina estabilizada / FCS al 10 % / 20 U/ml de IL-2 (Proleukin, Chiron) y se estimulan durante 2 días. Al tercer día se recogieron las células y se lavaron una vez con RPMI 1640. Se añadió IL-2 a una concentración final de 20 U/ml y se cultivaron de nuevo las células durante un día en el mismo medio de cultivo celular que anteriormente.
Mediante la eliminación de linfocitos T CD4+ y linfocitos NK CD56+ de acuerdo con protocolos estándar, se enriquecen los linfocitos T citotóxicos (LTC) CD8+.
Las células objetivo se lavaron dos veces con PBS y se marcaron con 11,1 MBq de 51Cr en un volumen final de 100 µl de RPMI con FCS al 50 % durante 60 minutos a 37 °C. Posteriormente, las células objetivo marcadas se lavaron 3 veces con 5 ml de RPMI y después se usaron en el ensayo de citotoxicidad. El ensayo se realizó en una placa de 96 pocillos en un volumen total de 250 µl de RPMI suplementado (como anteriormente) con una proporción E:O de
10:1. Se aplicaron 1 µg/ml de las moléculas de anticuerpo monocatenario biespecífico específico de especies cruzadas y 20 diluciones de tres veces de las mismas. El tiempo de ensayo fue de 4 horas para el ensayo que usó MEC-1 y PBMC con eliminación de CD4/CD56 humanas y de 18 horas para en ensayo que usó las CHO transfectadas con CD30 de macaco y la línea de linfocitos T de macaco 4119LnPx. La citotoxicidad se midió como valores relativos de cromo liberado en el sobrenadante en relación con la diferencia de lisis máxima (adición de Triton-X) y lisis espontánea (sin células efectoras). Todas las medidas se realizaron en cuadruplicados. La medida de la actividad del cromo en los sobrenadantes se realizó con un contador gamma Wizard 3" (Perkin Elmer Life Sciences GmbH, Colonia, Alemania). El análisis de los datos experimentales se realizó con Prism 4 para Windows (versión 4.02, GraphPad Software Inc., San Diego, California, EE. UU.). Típicamente, las curvas sigmoidales de respuesta a dosis tienen valores de R2 > 0,90, determinados por el programa informático. Los valores de CE50 calculados por el programa de análisis se usaron para la comparación de la bioactividad.
Como se muestra en la figura 47, todas las construcciones de anticuerpo monocatenario biespecífico específico de especies cruzadas generadas demostraron actividad citotóxica contra células objetivo positivas para CD30 humana provocada por PBMC humanas con eliminación de CD4/CD56 estimuladas y células objetivo positivas para CD30 de macaco provocada por la línea de linfocitos T de macaco 4119LnPx.
30. Generación y caracterización de moléculas monocatenarias biespecíficas específicas de especies cruzadas de HER2 y CD3
30.1. Generación de células CHO que expresan HER2 humano
La secuencia codificante del HER2 humano publicada en GenBank (número de acceso X03363) se obtuvo por síntesis génica de acuerdo con protocolos estándar. El fragmento de síntesis génica se diseñó para que contuviera la secuencia codificante de la proteína HER2 humano, incluido su péptido líder (las secuencias de ADNc y de aminoácidos de la construcción se enumeran en las SEQ ID NO: 1107 y 1108). El fragmento de síntesis génica también se diseñó para introducir sitios de restricción al principio y al final del fragmento. Los sitios de restricción introducidos, XbaI en el extremo 5' y SalI en el extremo 3', se utilizaron en los procedimientos de clonación siguientes. El fragmento de síntesis génica se clonó a través de XbaI y SalI en un plásmido denominado pEF-DHFR (pEF-DHFR se describe en Raum et al. Cancer Immunol Immunother 50 (2001) 141-150) siguiendo protocolos estándar. Los procedimientos mencionados anteriormente se llevaron a cabo de acuerdo con protocolos estándar (Sambrook, Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 3ª edición, Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, Nueva York (2001)). Se transfectó un clon con secuencia nucleotídica comprobada en células CHO deficientes en DHFR para la expresión eucariota de la construcción. La expresión eucariota de proteínas en células CHO deficientes en DHFR se realizó como se describe por Kaufmann R.J. (1990) Methods Enzymol. 185, 537-566. La amplificación de genes de la construcción se indujo mediante el aumento de las concentraciones metotrexato (MTX) hasta una concentración final de hasta MTX 20 nM.
30.2. Generación de células CHO que expresan el dominio extracelular de HER2 de macaco
La secuencia de codificación del HER2 humano descrita anteriormente se modifica para que codifique los aminoácidos 123 a 1038 de la proteína HER2 de macaco publicada en GenBank (número de acceso XP_001090430). La secuencia codificante de esta proteína quimérica se obtuvo por síntesis génica de acuerdo con protocolos estándar (las secuencias de ADNc y de aminoácidos de la construcción se enumeran en las SEQ ID N.º 1109 y 1110). El fragmento de síntesis génica también se diseñó para que contuviera un sitio de Kozak para la expresión eucariota de la construcción y sitios de restricción al principio y al final del fragmento. Los sitios de restricción introducidos, XbaI en el extremo 5' y SalI en el extremo 3', se utilizaron en los procedimientos de clonación siguientes. Después, el fragmento de síntesis génica se clonó a través de XbaI y SalI en un plásmido denominado pEF-DHFR (pEF-DHFR se describe en Raum et al. Cancer Immunol Immunother 50 (2001) 141-150). Se usó un clon de secuencia comprobada de este plásmido para transfectar células CHO/dhfr- como se describe anteriormente.
30.3. Generación de moléculas monocatenarias biespecíficas específicas de especies cruzadas de HER2 y CD3
Clonación de moléculas de unión específicas de especies cruzadas
En general, se diseñan moléculas de anticuerpo monocatenario biespecífico, comprendiendo cada uno un dominio con una especificidad de unión de especies cruzadas específico para CD3épsilon humana y de primate distinto de chimpancé, así como un dominio con una especificidad de unión de especies cruzadas específico para HER2 humano y de macaco, como se expone en la siguiente tabla 13:
Tabla 13: Formatos de moléculas de anticuerpo monocatenario biespecífico específico de especies cruzadas anti-CD3 y anti-HER2
SEQ ID (nucl/prot)
Formatos de construcciones de proteína (N�C)
1153/1152
2D3 HL x l2C HL
1167/1166
3E1 HL x I2C HL
Se obtuvieron por síntesis génica las construcciones mencionadas anteriormente que contenían los dominios variable de cadena ligera (L) y variable de cadena pesada (H) específicas de especies cruzadas para HER2 humano y de macaco y las combinaciones de VH y VL específicas para CD3 específicas de especies cruzadas para CD3 humana y de macaco. Los fragmentos de síntesis génica se diseñaron para que contuvieran en primer lugar un sitio de Kozak para la expresión eucariota de la construcción, seguido por un péptido líder de inmunoglobulina de 19 aminoácidos, seguido en fase por la secuencia codificante de la molécula de anticuerpo monocatenario biespecífico correspondiente, seguida en fase por la secuencia codificante de una marca de 6 histidinas y un codón de detención. El fragmento de síntesis génica también se diseñó para introducir sitios de restricción adecuados al principio y al final del fragmento. Los sitios de restricción introducidos se utilizaron en los procedimientos de clonación siguientes. El fragmento de síntesis génica se clonó a través de estos sitios de restricción en un plásmido denominado pEF-DHFR (pEF-DHFR se describe en Raum et al. Cancer Immunol Immunother 50 (2001) 141-150) siguiendo protocolos estándar. Los procedimientos mencionados anteriormente se llevaron a cabo de acuerdo con protocolos estándar (Sambrook, Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 3ª edición, Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, Nueva York (2001)). Se transfectó un clon con secuencia nucleotídica comprobada en células CHO deficientes en DHFR para la expresión eucariota de la construcción. La expresión eucariota de proteínas en células CHO deficientes en DHFR se realizó como se describe por Kaufmann R.J. (1990) Methods Enzymol. 185, 537-566. La amplificación de genes de la construcción se indujo mediante el aumento de las concentraciones metotrexato (MTX) hasta una concentración final de hasta MTX 20 nM.
30.4. Expresión y purificación de las moléculas de anticuerpo monocatenario biespecífico
Las moléculas de anticuerpo monocatenario biespecífico se expresaron en células de ovario de hámster chino (CHO). La expresión eucariota de proteínas en células CHO deficientes en DHFR se realizó como se describe por Kaufmann R.J. (1990) Methods Enzymol. 185, 537-566. La amplificación de genes de las construcciones se indujo mediante la adición de concentraciones crecientes de MTX hasta concentraciones finales de MTX de 20 nM. Después de dos pasos de cultivo estacionario, las células se hacen crecer en frascos rotatorios con medio líquido de soja HyQ PF CHO sin nucleósidos (con L-glutamina 4,0 mM con Pluronic F - 68 al 0,1 %; HyClone) durante 7 días antes de recogerlas. Las células se retiraron por centrifugación y el sobrenadante que contenía la proteína expresada se almacenó a -80 °C. La transfección se realizó con reactivo 293fectin (Invitrogen, N.º 12347-019) de acuerdo con el protocolo del fabricante.
Para la cromatografía se usaron el sistema de exploración Äkta® (GE Health Systems) y el programa informático Unicorn®. Se realizó una cromatografía de afinidad de metales inmovilizados ("IMAC") usando un quelato Fractogel EMD® (Merck) que se cargó con ZnCl2 de acuerdo con el protocolo proporcionado por el fabricante. Se equilibró la columna con tampón A (tampón de fosfato de sodio 20 mM a pH 7,2, NaCl 0,1 M) y se aplicó el sobrenadante de cultivo celular (500 ml) a la columna (10 ml) a una caudal de 3 ml/min. La columna se lavó con tampón A para retirar la muestra no unida. La proteína unida se eluyó usando un gradiente en dos etapas de tampón B (tampón de fosfato de sodio 20 mM a pH 7,2, NaCl 0,1 M, imidazol 0,5 M) de acuerdo con lo siguiente:
Etapa 1: tampón B al 20 % en 6 volúmenes de columna
Etapa 2: tampón B al 100 % en 6 volúmenes de columna
Las fracciones de proteína eluida a partir de la etapa 2 se agruparon para su purificación adicional. Todos los productos químicos eran de calidad de investigación y comprados de Sigma (Deisenhofen) o Merck (Darmstadt).
La cromatografía de filtración en gel se realizó en una columna de calidad prep HiLoad 16/60 Superdex 200 (GE/Amersham) equilibrada con tampón de equilibrado (citrato 25 mM, lisina 200 mM, glicerol al 5 %, a pH 7,2). Las muestras de proteína eluidas (caudal 1 ml/min) se sometieron a SDS-PAGE estándar y transferencia de bandas western para su detección. Antes de la purificación, se calibró la columna para la determinación del peso molecular (kit de marcadores de peso molecular, Sigma MW GF-200). Las concentraciones de proteína se determinaron usando la DO a 280 nm.
La proteína de anticuerpo monocatenario biespecífico purificada se analizó en SDS PAGE en condiciones reductoras realizada con geles bis-tris preformados al 4-12 % (Invitrogen). La preparación y la aplicación de las muestras se realizaron de acuerdo con el protocolo proporcionado por el fabricante. Se determinó el peso molecular con patrón proteínico MultiMark (Invitrogen). El gel se tiñó con Coomassie coloidal (protocolo de Invitrogen). La pureza de la proteína aislada fue > 95 %, determinada por SDS-PAGE.
El anticuerpo monocatenario biespecífico tiene un peso molecular de aproximadamente 52 kDa en condiciones nativas, determinado por filtración en gel en PBS. Todas las construcciones se purificaron de acuerdo con este procedimiento.
La transferencia de bandas western se realizó usando una membrana Optitran® BA-S83 y el módulo de transferencia de bandas de Invitrogen de acuerdo con el protocolo proporcionado por el fabricante. Para la detección de los anticuerpos de proteína de anticuerpo monocatenario biespecífico se usó un anticuerpo anti-marca His (Penta His, Qiagen). Como anticuerpo secundario se usó un anticuerpo Ig de cabra anti-ratón marcado con fosfatasa alcalina (AP) (Sigma) y como sustrato, BCIP/NBT (Sigma). Se detectó una única banda a 52 kD correspondiente al anticuerpo monocatenario biespecífico purificado.
30.5. Análisis de unión por citometría de flujo de los anticuerpos biespecíficos específicos de especies cruzadas de HER2 y CD3
Con el fin de probar la funcionalidad de las construcciones de anticuerpo biespecífico específico de especies cruzadas con respecto a la capacidad de unión a HER2 y CD3 humanos y de macaco, respectivamente, se llevó a cabo un análisis de FACS. Para este propósito se usan células CHO transfectadas con HER2 humano como se describe en el ejemplo 30.1 y la línea celular humana de leucemia de linfocitos T positivos para CD3 HPB-ALL (DSMZ, Braunschweig, ACC483) para probar la unión a antígenos humanos. La reactividad de unión a antígenos de macaco se probó usando el transfectante de HER2 de macaco generado descrito en el ejemplo 30.2 y una línea de linfocitos T de macaco 4119LnPx (proporcionada amablemente por el Prof. Fickenscher, Instituto de Higiene, Virología, Erlangen-Núremberg; publicado en Knappe A, et al., y Fickenscher H., Blood 2000, 95, 3256-61). Se incubaron 200.000 células de las respectivas líneas celulares 30 min en hielo con 50 µl de la proteína purificada de las construcciones de anticuerpo biespecífico específico de especies cruzadas (2 µg/ml). Se lavaron las células dos veces en PBS con FCS al 2 % y se detectó la unión de la construcción con un anticuerpo murino anti-His (anticuerpo Penta His; Qiagen; diluido 1:20 en 50 µl de PBS con FCS al 2 %). Después del lavado, se detectaron anticuerpos anti-His unidos con un anticuerpo específico frente a Fc gamma (Dianova) conjugado con ficoeritrina, diluido 1:100 en PBS con FCS al 2 %. Se usó PBS con FCS al 2 % como control negativo para la unión a las líneas de linfocitos T, así como a las células CHO transfectadas con HER2.
Se realizó una citometría de flujo en un aparato FACS-Calibur; se usó el programa informático CellQuest para adquirir y analizar los datos (Becton Dickinson biosciences, Heidelberg). La tinción de FACS y la medida de la intensidad de fluorescencia se realizaron como se describe en Current Protocols in Immunology (Coligan, Kruisbeek, Margulies, Shevach y Strober, Wiley-lnterscience, 2002).
La unión biespecífica de las moléculas monocatenarias enumeradas anteriormente, que son específicas de especies cruzadas para HER2 y específicas de especies cruzadas para CD3 humana y de primate distinto de chimpancé, era claramente detectable, como se muestra en la figura 48. En el análisis de FACS todas las construcciones mostraron unión a CD3 y HER2 en comparación con los controles negativos respectivos. Se demostró la especificidad de especies cruzadas de los anticuerpos biespecíficos frente a antígenos de CD3 y HER2 humanos y de macaco.
30.6. Bioactividad de anticuerpos monocatenarios biespecíficos específicos de especies cruzadas de HER2 y CD3
Se analizó la bioactividad de los anticuerpos monocatenarios biespecíficos generados mediante ensayos de citotoxicidad in vitro de liberación de cromo 51 (51Cr) usando las líneas celulares positivas para HER2 descritas en los ejemplos 30.1 y 30.2. Como células efectoras se usaron PBMC humanas con eliminación de CD56 no estimuladas o la línea de linfocitos T de macaco 4119LnPx, como se especifica en las respectivas figuras.
La generación de PBMC humanas no estimuladas se realizó como sigue:
Se aislaron las PBMC recién obtenidas a partir de sangre periférica (30-50 ml de sangre humana) por centrifugación en gradiente de Ficoll de acuerdo con protocolos estándar. La eliminación de linfocitos NK CD56+ se llevó a cabo de acuerdo con protocolos estándar.
Las células objetivo se lavaron dos veces con PBS y se marcaron con 11,1 MBq de 51Cr en un volumen final de 100 µl de RPMI con FCS al 50 % durante 45 minutos a 37 °C. Posteriormente, las células objetivo marcadas se lavaron 3 veces con 5 ml de RPMI y después se usaron en el ensayo de citotoxicidad. El ensayo se realizó en una placa de 96 pocillos en un volumen total de 250 µl de RPMI suplementado (como anteriormente) con una proporción E:O de
10:1. Se aplicaron 1 µg/ml de las moléculas de anticuerpo monocatenario biespecífico específico de especies cruzadas y 15-21 diluciones de cinco veces de las mismas. El tiempo de ensayo fue de 18 horas y la citotoxicidad se midió como valores relativos de cromo liberado en el sobrenadante en relación con la diferencia de lisis máxima (adición de Triton-X) y lisis espontánea (sin células efectoras). Todas las medidas se realizaron en cuadruplicados. La medida de la actividad del cromo en los sobrenadantes se realizó con un contador gamma Wizard 3" (Perkin Elmer Life Sciences GmbH, Colonia, Alemania). El análisis de los datos experimentales se realizó con Prism 4 para Windows (versión 4.02, GraphPad Software Inc., San Diego, California, EE. UU.). Típicamente, las curvas sigmoidales de respuesta a dosis tienen valores de R2 > 0,90, determinados por el programa informático. Los valores de CE50 calculados por el programa de análisis se usaron para la comparación de la bioactividad.
Como se muestra en la figura 49, todas las construcciones de anticuerpo monocatenario biespecífico específico de especies cruzadas generadas demostraron actividad citotóxica contra células objetivo positivas para HER2 humano provocada por PBMC con eliminación de CD56 no estimuladas y contra células objetivo positivas para HER2 de macaco provocada por la línea de linfocitos T de macaco 4119LnPx.
31. Purificación de moléculas monocatenarias biespecíficas específicas de especies cruzadas por un procedimiento de afinidad basado en el epítopo de CD3 épsilon independiente del contexto correspondiente a los aminoácidos 1-27 N-terminales
31.1 Generación de una columna de afinidad que presenta el epítopo de CD3 épsilon independiente del contexto humano correspondiente a los aminoácidos 1-27 N-terminales aislado
El plásmido para la expresión de la construcción 1-27 CD3-Fc que consiste en los aminoácidos 1-27 N-terminales de la cadena CD3 épsilon humana fusionados con la región bisagra y Fc gamma de la inmunoglobulina lgG1 descrita anteriormente (ejemplo 3; la secuencia de ADNc y la secuencia de aminoácidos se la proteína de fusión recombinante se enumeran en las SEQ ID NO 350 y 349) se transfectó en células CHO deficientes para DHFR para la expresión eucariota de la construcción. La expresión eucariota de proteínas en células CHO deficientes en DHFR se realizó como se describe por Kaufmann R.J. (1990) Methods Enzymol. 185, 537-566. La amplificación de genes de la construcción se indujo mediante el aumento de las concentraciones metotrexato (MTX) hasta una concentración final de hasta MTX 20 nM. Después de dos pasos de cultivo estacionario, las células se hicieron crecer en frascos rotatorios con medio líquido de soja HyQ PF CHO sin nucleósidos (con L-glutamina 4,0 mM con Pluronic F - 68 al 0,1 %; HyClone) durante 7 días antes de recogerlas. Se retiraron las células por centrifugación y el sobrenadante que contenía la proteína expresada se almacenó a -20 °C. Para el aislamiento de la proteína de fusión se preparó una columna de afinidad de cabra anti-Fc humana de acuerdo con protocolos estándar usando un anticuerpo de cabra específico anti-fragmento Fc de IgG humana purificado por afinidad comercialmente disponible con reactividad cruzada mínima con proteínas séricas bovinas, de caballo y de ratón (Jackson ImmunoResearch Europe Ltd.). Usando esta columna de afinidad se aisló la proteína de fusión del sobrenadante de cultivo en un sistema de exploración Äkta (GE Amersham) y se eluyó mediante ácido cítrico. El eluato se neutralizó y se concentró. Después de dializarla contra tampón de acoplamiento sin aminas, se acopló la proteína de fusión purificada a una columna HiTrap de 1 ml activada con N-hidroxisuccinimida NHS (GE Amersham).
Después del acoplamiento, se bloquearon los grupos NHS restantes y se lavó la columna y se almacenó a 5 °C en tampón de almacenamiento que contenía azida de sodio al 0,1 %.
31.2 Purificación de moléculas monocatenarias biespecíficas específicas de especies cruzadas usando una columna de afinidad de péptido de CD3 humana
200 ml de sobrenadante de cultivo de células que expresaban moléculas monocatenarias biespecíficas específicas de especies cruzadas se esterilizaron por filtrado de 0,2 μm y se aplicaron a la columna de afinidad de péptido deCD3 usando un sistema de exploración Äkta (GE Amersham).
Después, se lavó la columna con solución salina tamponada con fosfato PBS a pH 7,4 para lavar la muestra no unida. La elución se realizó con un tampón ácido a pH 3,0 que contenía ácido cítrico 20 mM y cloruro sódico 1 M. La proteína eluida se neutralizó inmediatamente mediante trishidroximetilamina TRIS 1 M a pH 8,3 contenida en los tubos de recogida del colector de fracciones.
Se realizó el análisis de la proteína por SDS PAGE y transferencia de bandas western.
Para el SDS PAGE se usan geles BisTris al 4-12 % (Invitrogen). El tampón de desplazamiento era 1 x MES-SDS-Puffer (Invitrogen). Como patrón proteínico se aplicaron 15 µl de patrón Sharp Protein Standard (Invitrogen) teñido previamente. La electroforesis se realizó durante 60 minutos a 200 voltios y 120 mA máx. Se lavaron los geles en agua desmineralizada y se tiñeron con Coomassie durante una hora. Se destiñeron los geles en agua desmineralizada durante 3 horas. Se toman fotografías con un sistema de documentación de geles de Syngene.
Para la transferencia de bandas western se generó un doble del gel de SDS PAGE y se electrotransfirieron las proteínas sobre una membrana de nitrocelulosa. Se bloqueó la membrana con seroalbúmina bovina al 2 % en PBS y se incubó con un anticuerpo murino Penta His biotinilado (Qiagen). Como agente secundario se usó un conjugado de estreptavidina y fosfatasa alcalina (DAKO). Las transferencias de bandas se revelaron con solución de sustrato BCIP/NBT (Pierce).
Como se demuestra en las figuras 50, 51 y 52, el uso de una columna de afinidad de péptido de CD3 humana como se describe anteriormente, permite la purificación altamente eficaz de las moléculas monocatenarias biespecíficas a partir del sobrenadante de cultivo celular. Por lo tanto, los anticuerpos monocatenarios específicos de especies cruzadas anti-CD3 contenidos en las moléculas monocatenarias biespecíficas permiten, por medio de sus propiedades de unión específica, un procedimiento de purificación en una etapa genérico eficaz para las moléculas monocatenarias biespecíficas específicas de especies cruzadas, sin necesidad de unir marcas exclusivamente con fines de purificación.
32. Ensayo farmacocinético genérico para moléculas monocatenarias biespecíficas específicas de especies cruzadas
32.1 Producción de 1-27 CD3-Fc para su uso en el ensayo farmacocinético
La secuencia codificante de los aminoácidos 1-27 N-terminales de la cadena CD3 épsilon humana fusionados a la región bisagra y la Fc gamma de la inmunoglobulina humana lgG1, se obtuvo mediante síntesis génica de acuerdo con protocolos estándar (la secuencia de ADNc y la secuencia de aminoácidos de la proteína de fusión recombinante se enumeran en las SEQ ID NO: 1111 y 1112). El fragmento de síntesis génica se diseñó para que contuviera un primer sitio de Kozak para la expresión eucariota de la construcción, seguido por un péptido líder de inmunoglobulina de 19 aminoácidos, seguido en fase por la secuencia codificante de los primeros 27 aminoácidos de la porción extracelular de la cadena CD3 épsilon humana madura, seguido en fase por la secuencia codificante de la región bisagra y la porción Fc gamma de la lgG1 humana y un codón de detención. El fragmento de síntesis génica también se diseñó para introducir sitios de restricción al principio y al final del ADNc que codifica la proteína de fusión. Los sitios de restricción introducidos, EcoRI en el extremo 5' y SalI en el extremo 3', se utilizaron en los procedimientos de clonación siguientes. El fragmento de síntesis génica se clonó a través de EcoRI y SalI en un plásmido denominado pEF-DHFR (pEF-DHFR se describe en Raum et al. Cancer Immunol Immunother 50 (2001) 141-150) siguiendo protocolos estándar. Los procedimientos mencionados anteriormente se llevaron a cabo de acuerdo con protocolos estándar (Sambrook, Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 3ª edición, Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, Nueva York (2001)). Se transfectó un clon con secuencia nucleotídica comprobada en células CHO deficientes en DHFR para la expresión eucariota de la construcción. La expresión eucariota de proteínas en células CHO deficientes en DHFR se realizó como se describe por Kaufmann
R.J. (1990) Methods Enzymol. 185, 537-566. La amplificación de genes de la construcción se indujo mediante el aumento de las concentraciones metotrexato (MTX) hasta una concentración final de hasta MTX 20 nM. Después de dos pasos de cultivo estacionario, las células se hicieron crecer en frascos rotatorios con medio líquido de soja HyQ PF CHO sin nucleósidos (con L-glutamina 4,0 mM con Pluronic F - 68 al 0,1 %; HyClone) durante 7 días antes de recogerlas. Se retiraron las células por centrifugación y el sobrenadante que contenía la proteína expresada se almacenó -20 °C. Para el aislamiento de la proteína de fusión se preparó una columna de afinidad de cabra anti-Fc humana de acuerdo con protocolos estándar usando un anticuerpo de cabra específico anti-fragmento Fc de IgG humana purificado por afinidad comercialmente disponible con reactividad cruzada mínima con proteínas séricas bovinas, de caballo y de ratón (Jackson ImmunoResearch Europe Ltd.). Usando esta columna de afinidad se aisló laproteína de fusión del sobrenadante de cultivo en un sistema de exploración Äkta (GE Amersham) y se eluyó mediante ácido cítrico. El eluato se neutralizó y se concentró.
32.2 Ensayo farmacocinético para moléculas monocatenarias biespecíficas específicas de especies cruzadas
El ensayo se basa en la tecnología ECL-ELISA usando detección de marcaje con rutenio sobre placas de carbono medido en un dispositivo Sektor Imager (MSD). En una primera etapa, se recubrieron placas de carbono (placas de alta unión de 96 pocillos de MSD, Cat: L15xB-3) con 5 µl/pocillo a 50 ng/ml del 1-27 CD3-Fc purificado descrito en el ejemplo 32.1. Después, se secó la placa durante la noche a 25 °C. Posteriormente, se bloquearon las placas con BSA al 5 % (Paesel&Lorei, n º 100568) en PBS a 150 µl/pocillo durante 1h a 25 °C en una incubadora con agitación al mismo tiempo (700 rpm). En la etapa siguiente se lavaron las placas tres veces con Tween al 0,05% en PBS. Se generó una curva de calibrado en suero de macaco al 50 % en PBS por dilución seriada 1:4 partiendo de 100 ng/ml de la molécula monocatenaria biespecífica específica de especies cruzadas correspondiente que se iba a detectar en el ensayo. Se prepararon muestras de control de calidad (QC) en suero de macaco al 50 % en PBS que iban desde 1 ng/ml hasta 50 ng/ml de la molécula monocatenaria biespecífica específica de especies cruzadas correspondiente en función de las concentraciones séricas de muestra esperadas. Se transfirieron muestras de patrón, de QC o desconocidas a las placas de carbono a 10 µl/pocillo y se incubaron durante 90 min a 25 °C en la incubadora con agitación al mismo tiempo (700 rpm). Posteriormente, se lavaron las placas tres veces con Tween al 0,05% en PBS. Para la detección, se añadieron 25 µl/pocillo de anticuerpo penta-His-biotina (Qiagen, 200 µg/ml en Tween al 0,05 % en PBS) y se incubó durante 1 h a 25 °C en una incubadora con agitación al mismo tiempo (700 rpm). En una segunda etapa de detección, se añadieron 25 µl/pocillo de solución de estreptavidina-marca sulfo (MSD; Cat: R32AD-1; Lote: W0010903) y se incubó durante 1 h a 25 °C en una incubadora con agitación al mismo tiempo (700 rpm). Posteriormente, se lavaron las placas tres veces con Tween al 0,05% en PBS. Por último, se añadieron 150 µl/pocillo de tampón de lectura de MSD (MSD, Cat: R9ZC-1) y se leyeron las placas en el dispositivo Sektor Imager.
Las figuras 53 y 54 demuestran la viabilidad de la detección de moléculas monocatenarias biespecíficas específicas de especies cruzadas en muestras de suero de macacos para moléculas monocatenarias biespecíficas específicas de especies cruzadas. Por lo tanto, los anticuerpos monocatenarios específicos de especies cruzadas anti-CD3 contenidos en las moléculas monocatenarias biespecíficas permiten, por medio de sus propiedades de unión específica, un ensayo genérico altamente sensible para la detección de las moléculas monocatenarias biespecíficas específicas de especies cruzadas. El ensayo expuesto anteriormente se puede usar en el contexto de estudios toxicológicos formales que son necesarios para el desarrollo de fármacos y que se pueden adaptar fácilmente para medir muestras de pacientes en relación con la aplicación clínica de moléculas monocatenarias biespecíficas específicas de especies cruzadas.
33. Generación de proteínas de fusión transmembranarias recombinantes de los aminoácidos 1-27 Nterminales de CD3 épsilon de diferentes primates distintos de chimpancé fusionados a EpCAM de mono cynomolgus (1-27 CD3-EpCAM).
33.1. Clonación y expresión de 1-27 CD3-EpCAM
Se aisló la CD3 épsilon de diferentes primates distintos de chimpancé (tití, tamarino, mono ardilla) y de cerdo. Las secuencias codificantes de los aminoácidos 1-27 N-terminales de la cadena CD3 épsilon humana madura, de tití común (Callithrix jacchus), de tamarino cabeza de algodón (Saguinus oedipus), de mono ardilla común (Saimiri sciureus) y de cerdo doméstico (Sus scrofa; usado como control negativo) fusionadas al extremo N-terminal de EpCAM de cynomolgus marcada con Flag se obtuvieron mediante síntesis génica de acuerdo con protocolos estándar (la secuencia de ADNc y la secuencia de aminoácidos de las proteínas de fusión recombinantes se enumeran en las SEQ ID NO: 351 a 360). Los fragmentos de síntesis génica se diseñaron para que contuvieran en primer lugar un sitio BsrGI para permitir la fusión en el marco de lectura correcto con la secuencia codificante de un péptido líder de inmunoglobulina de 19 aminoácidos ya presente en el vector de expresión objetivo, que iba seguido en fase por la secuencia codificante de los aminoácidos 1-27 N-terminales de la porción extracelular de las cadenas CD3 épsilon maduras, que iba seguida en fase por la secuencia codificante de una marca Flag y seguida en fase por la secuencia codificante de la proteína EpCAM transmembranaria de cynomolgus madura (figura 4). Los fragmentos de síntesis génica también se diseñaron para introducir un sitio de restricción al final del ADNc que codifica la proteína de fusión. Los sitios de restricción introducidos, BsrGI en el extremo 5' y SalI en el extremo 3', se utilizaron en los procedimientos de clonación siguientes. Después, los fragmentos de síntesis génica se clonaron a través de BsrGI y SalI en un plásmido denominado pEF-DHFR (pEF-DHFR se describe en Raum et al. Cancer Immunol Immunother 50 (2001) 141-150), que ya contiene la secuencia codificante del péptido líder de inmunoglobulina de 19 aminoácidos siguiendo protocolos estándar. Se usaron plásmidos de secuencia comprobada para transfectar células CHO deficientes en DHFR para la expresión eucariota de la construcción. La expresión eucariota de proteínas en células CHO deficientes en DHFR se realizó como se describe por Kaufmann R.J. (1990) Methods Enzymol. 185, 537-566. La amplificación de genes de la construcción se indujo mediante el aumento de las concentraciones metotrexato (MTX) hasta una concentración final de hasta MTX 20 nM.
Se probaron los transfectantes para determinar la expresión en la superficie celular de la proteína transmembranaria recombinante por medio de un ensayo de FACS de acuerdo con protocolos estándar. Para ese propósito, se incubó una cantidad de 2,5x105 células con el anticuerpo anti-Flag M2 (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Alemania) a 5 µg/ml en PBS con FCS al 2 %. Se detectó el anticuerpo unido con un fragmento F(ab')2 purificado por afinidad conjugado con R-ficoeritrina de IgG de cabra anti-ratón específica de fragmento Fc-gamma, diluido 1:100 en PBS con FCS al 2 % (Jackson ImmunoResearch Europe Ltd., Newmarket, Suffolk, RU). Se realizó una citometría de flujo en un aparato FACS-Calibur; se usó el programa informático CellQuest para adquirir y analizar los datos (Becton Dickinson biosciences, Heidelberg). La tinción de FACS y la medida de la intensidad de fluorescencia se realizaron como se describe en Current Protocols in Immunology (Coligan, Kruisbeek, Margulies, Shevach y Strober, Wiley-lnterscience, 2002).
La expresión de las proteínas de fusión transmembranarias recombinantes marcadas con Flag que consistían en EpCAM de cynomolgus y los aminoácidos 1-27 N-terminales de la cadena CD3 épsilon humana, de tití, de tamarino, de mono ardilla y de cerdo, respectivamente, en células transfectadas era claramente detectable (figura 55).
33.2. Clonación y expresión del anticuerpo monocatenario anti-CD3 específico de especies cruzadas I2C HL en forma de un anticuerpo lgG1
Con el fin de proporcionar mejores medios de detección de la unión del anticuerpo anti-CD3 monocatenario específico de especies cruzadas, se convierte la especificidad del I2C VHVL en un anticuerpo lgG1 con lgG1 murina y regiones constantes kappa murinas. Se obtuvieron las secuencias de ADNc que codifican la cadena pesada del anticuerpo IgG mediante síntesis génica de acuerdo con protocolos estándar. Los fragmentos de síntesis génica se diseñaron para que contuvieran en primer lugar un sitio de Kozak para permitir la expresión eucariota de la construcción, que va seguido por un péptido líder de inmunoglobulina de 19 aminoácidos, que va seguido en fase por la secuencia codificante de la región variable de cadena pesada o región variable de cadena ligera, seguida en fase por la secuencia codificante de la región constante de cadena pesada de IgG1 murina publicada en GenBank (número de acceso AB097849) o la secuencia codificante de la región constante de cadena ligera kappa murina publicada en GenBank (número de acceso D14630), respectivamente.
Se introdujeron sitios de restricción al principio y al final del ADNc que codifica la proteína de fusión. Los sitios de restricción introducidos, EcoRI en el extremo 5' y SalI en el extremo 3', se usaron en los procedimientos de clonación siguientes. Los fragmentos de síntesis génica se clonaron a través de EcoRI y SalI en un plásmido denominado pEF-DHFR (pEF-DHFR se describe en Raum et al. Cancer Immunol Immunother 50 (2001) 141-150) para la construcción de cadena pesada y pEFADA (pEFADA se describe en Raum et al. Cancer Immunol Immunother 50 (2001) 141-150) para la construcción de cadena ligera de acuerdo con protocolos estándar. Se usaron plásmidos de secuencia comprobada para la cotransfección de las correspondientes construcciones de cadena ligera y pesada en células CHO deficientes en DHFR para la expresión eucariota de la construcción. La expresión eucariota de proteínas en células CHO deficientes en DHFR se realizó como se describe por Kaufmann R.J. (1990) Methods Enzymol. 185, 537-566. La amplificación de genes de las construcciones se indujo por concentraciones crecientes de metotrexato (MTX) hasta una concentración final de hasta MTX 20 nM y desoxicoformicina (dCF) hasta una concentración final de hasta dCF 300 nM.
Después de dos pasos de cultivo celular estacionario se recogió el sobrenadante de cultivo y se uso en el experimento posterior.
33.3. Unión del anticuerpo monocatenario anti-CD3 específico de especies cruzadas I2C HL en forma de un anticuerpo lgG1 a 1-27 CD3-EpCAM
Se probó la unión de la construcción de IgG1 I2C a los aminoácidos 1-27 N-terminales de las cadenas CD3 épsilon humana, de tití, de tamarino y de mono ardilla, respectivamente fusionados con EpCAM de cynomolgus como se describe en el ejemplo 33.1 en un ensayo de FACS de acuerdo con protocolos estándar. Para ese propósito se incubó una cantidad de 2,5x105 células con 50 µl de sobrenadante de cultivo celular que contenía la construcción de IgG1 I2C como se describe en el ejemplo 33.2. Se detectó la unión del anticuerpo con un fragmento F(ab')2 purificado por afinidad conjugado con R-ficoeritrina de IgG de cabra anti-ratón específica de fragmento Fc-gamma, diluido 1:100 en PBS con FCS al 2 % (Jackson ImmunoResearch Europe Ltd., Newmarket, Suffolk, RU). Se realizó una citometría de flujo en un aparato FACS-Calibur; se usó el programa informático CellQuest para adquirir y analizar los datos (Becton Dickinson biosciences, Heidelberg). La tinción de FACS y la medida de la intensidad de fluorescencia se realizaron como se describe en Current Protocols in Immunology (Coligan, Kruisbeek, Margulies, Shevach y Strober, Wiley-lnterscience, 2002).
Como se muestra en la figura 56, se observó la unión de la construcción de IgG1 I2C a los transfectantes que expresan las proteínas de fusión transmembranarias recombinantes que consisten en los aminoácidos 1-27 Nterminales de CD3 épsilon humana, de tití, de tamarino o de mono ardilla fusionados a EpCAM de cynomolgus en comparación con el control negativo que consiste en los aminoácidos 1-27 N-terminales de CD3 épsilon de cerdo fusionados a EpCAM de cynomolgus. Por tanto, se demostró la especificidad de especies cruzadas de varios primates de I2C. Las señales obtenidas con el anticuerpo anti-Flag M2 y la construcción de IgG1 I2C eran comparables, lo que indica una fuerte actividad de unión de la especificidad I2C específica de especies cruzadas a los aminoácidos 1-27 N-terminales de CD3 épsilon.
34. Unión de la molécula de unión anti-CD3 específica de especies cruzadas I2C a la cadena CD3 épsilon humana con y sin marca His6 N-terminal.
Se probó un anticuerpo IgG1 quimérico con la especificidad de unión I2C como se describe en el ejemplo 33.2 específica para CD3 épsilon para determinar la unión a CD3 épsilon humana con y sin marca His6 N-terminal. La unión del anticuerpo a las líneas celulares EL4 transfectadas con la CD3 épsilon humana-His6 como se describe en el ejemplo 6.1 y CD3 épsilon humana natural como se describe en el ejemplo 5.1, respectivamente, se probó mediante un ensayo de FACS de acuerdo con protocolos estándar. Se incubaron 2,5x105 células de los transfectantes con 50 µl de sobrenadante de cultivo celular que contenía la construcción de IgG1 I2C o 50 µl de los anticuerpos de control correspondientes a 5 µg/ml en PBS con FCS al 2 %. Se usaron respectivamente, como control negativo, un control de isotipo apropiado y como control positivo de la expresión de las construcciones, el anticuerpo específico de CD3 UCHT-1. La detección de la marca His6 se realizó con el anticuerpo Penta His (Qiagen). Se detectó la unión de los anticuerpos con un fragmento F(ab')2 purificado por afinidad conjugado con Rficoeritrina de IgG de cabra anti-ratón específica de fragmento Fc-gamma, diluido 1:100 en PBS con FCS al 2 % (Jackson ImmunoResearch Europe Ltd., Newmarket, Suffolk, RU). Se realizó una citometría de flujo en un aparato FACS-Calibur; se usó el programa informático CellQuest para adquirir y analizar los datos (Becton Dickinson biosciences, Heidelberg). La tinción de FACS y la medida de la intensidad de fluorescencia se realizaron como se describe en Current Protocols in Immunology (Coligan, Kruisbeek, Margulies, Shevach y Strober, Wiley-lnterscience, 2002).
La unión comparable del anticuerpo anti-CD3 humana UCHT-1 a ambos transfectantes demuestra niveles de expresión de las construcciones aproximadamente iguales. La unión del anticuerpo Penta His confirmó la presencia de la marca His6 sobre la construcción His6-CD3 humana, pero no en la construcción natural.
En comparación con la línea celular EL4 transfectada con CD3 épsilon humana natural, se detectó una clara pérdida de unión de la construcción de IgG1 I2C a CD3 épsilon humana con una marca His6 N-terminal. Estos resultados muestran que un extremo N-terminal libre de CD3 épsilon es esencial para la unión de la especificidad de unión I2C anti-CD3 específica de especies cruzadas a la cadena CD3 épsilon humana (figura 57).
35. Construcciones de anticuerpo monocatenario biespecífico dirigidas contra CD3 humana y de primate distinto de chimpancé y contra epítopos de Muc-1 específicos de tumores
Se escogió la secuencia VH de anticuerpos de línea germinal humanos VH3 3-72 (http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/) como contexto estructural para la CDRH1 (SEQ ID 1486), la CDRH2 (SEQ ID 1487) y la CDRH3 (SEQ ID 1488). Análogamente, se escogió la secuencia VH de anticuerpos de línea germinal humanos VH3 3-73 (http://vbase.mrccpe.cam.ac.uk/) como contexto estructural para la CDRH1 (SEQ ID 1492), la CDRH2 (SEQ ID 1493) y la CDRH3 (SEQ ID 1494). Para cada VH humana hubo que sintetizar varios oligonucleótidos degenerados que solapaban en un tramo final de aproximadamente 15-20 nucleótidos. Con este fin, cada segundo cebador era un cebador antisentido. Para VH3 3-72, se usaron los siguientes oligonucleótidos:
Para VH3 3-73, los oligonucleótidos fueron los siguientes:
Cada uno de estos conjuntos de cebadores abarca la secuencia de VH correspondiente completa.
Dentro de cada conjunto, se mezclaron los cebadores en cantidades iguales (p. ej., 1 µl de cada cebador (soluciones
5 madre de cebador de 20 a 100 µM) a una reacción de PCR de 20 µl) y se añadieron a una mezcla de PCR que consistía en tampón de PCR, nucleótidos y polimerasa Taq. Esta mezcla se incubó a 94 °C durante 3 minutos, a 65 °C durante 1 minuto, a 62 °C durante 1 minuto, a 59 °C durante 1 minuto, a 56 °C durante 1 minuto, a 52 °C durante 1 minuto, a 50 °C durante 1 minuto y a 72 °C durante 10 minutos en un ciclador de PCR. Posteriormente se hizo correr el producto en una electroforesis en gel de agarosa y se aisló el producto de un tamaño de 200 a 400 a
10 partir del gel de acuerdo con procedimientos estándar.
El producto de PCR de cada VH se usó después como molde para una reacción de PCR estándar usando cebadores que incorporan sitios de restricción para clonación N-terminales y C-terminales adecuados. El fragmento de ADN del tamaño correcto (para una VH, aproximadamente 350 nucleótidos) se aisló mediante electroforesis en gel de agarosa de acuerdo con procedimientos estándar. De este modo, se amplificó suficiente fragmento de ADN
15 de VH.
Se escogió la secuencia VL de anticuerpos de línea germinal humanos VkII 3-72 (http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/) como contexto estructural para la CDRH1 (SEQ ID 1489), la CDRH2 (SEQ ID 1490) y la CDRH3 (SEQ ID 1491). Análogamente, se escogió la secuencia VL de anticuerpos de línea germinal humanos VL7 7a (http://vbase.mrccpe.cam.ac.uk/) como contexto estructural para la CDRL1 (SEQ ID 1495), la CDRL2 (SEQ ID 1496) y la CDRL3
20 (SEQ ID 1497). Para cada VL humana hubo que sintetizar varios oligonucleótidos degenerados que solapaban en un tramo final de aproximadamente 15-20 nucleótidos. Con este fin, cada segundo cebador era un cebador antisentido. Se eliminaron los sitios de restricción necesarios para la clonación posterior del interior de los oligonucleótidos. Para Vkll A18, se usaron los siguientes oligonucleótidos:
Para VL7 7a, los oligonucleótidos fueron los siguientes:
Cada uno de estos conjuntos de cebadores abarca la secuencia de VL correspondiente completa.
10 Dentro de cada conjunto, se mezclaron los cebadores en cantidades iguales (p. ej., 1 µl de cada cebador (soluciones madre de cebador de 20 a 100 µM) a una reacción de PCR de 20 µl) y se añadieron a una mezcla de PCR que consistía en tampón de PCR, nucleótidos y polimerasa Taq. Esta mezcla se incubó a 94 °C durante 3 minutos, a 65 °C durante 1 minuto, a 62 °C durante 1 minuto, a 59 °C durante 1 minuto, a 56 °C durante 1 minuto, a 52 °C durante 1 minuto, a 50 °C durante 1 minuto y a 72 °C durante 10 minutos en un ciclador de PCR. Posteriormente, se
15 hizo correr el producto en una electroforesis en gel de agarosa y el producto de un tamaño de desde 200 hasta 400 se aisló del gel de acuerdo con procedimientos estándar.
El producto de PCR de cada VL se usó después como molde para una reacción de PCR estándar usando cebadores que incorporan sitios de restricción para clonación N-terminales y C-terminales adecuados. El fragmento de ADN del tamaño correcto (para una VL, aproximadamente 330 nucleótidos) se aisló mediante electroforesis en gel de
20 agarosa de acuerdo con procedimientos estándar. De este modo, se amplificó suficiente fragmento de ADN de VL.
Después, se combinó el producto final de PCR de VH basado en VH3 3-72 (es decir, el repertorio de VH humanas/humanizadas) con el producto final de PCR de VL basado en Vkll A18 (es decir, el repertorio de VL humanas/humanizadas) y el producto final de PCR de VH basado en VH3 3-73 (es decir, el repertorio de VH humanas/humanizadas) con el producto final de PCR de VL basado en VL7 7a (es decir, el repertorio de VL
25 humanas/humanizadas) en el vector de presentación en fagos pComb3H5Bhis para formar dos colecciones diferentes de scFv funcionales de entre las que, después de la presentación en fagos filamentosos, se seleccionaron, cribaron, identificaron y confirmaron agentes de unión anti-Muc-1 como se describe a continuación:
Se ligaron 450 ng de los fragmentos de cadena ligera (digeridos con Sacl-Spel) con 1400 ng del fagémido pComb3H5Bhis (digerido con Sacl-Spel; fragmento grande). La colección de anticuerpos combinatoria resultante se transformó después en 300 μl de células de Escherichia coli XL1 Blue electrocompetentes por electroporación (2,5 kV, cubeta de 0,2 cm de paso, 25 uFD, 200 Ohm, Biorad Gen Pulser) dando lugar a un tamaño de colección de más de 107 clones independientes. Después de una hora de expresión del fenotipo, se seleccionaron los transformantes positivos por su resistencia a carbenicilina codificada por el vector pComb3H5BHis en 100 ml cultivo en super broth líquido (SB) durante la noche. Después, se recogieron las células por centrifugación y se llevó a cabo la preparación de plásmidos usando un kit de preparación de plásmidos comercialmente disponible (Qiagen).
Se ligaron 2800 ng de este ADN plasmídico que contenía la colección VK (digerido con Xhol-BstEII; fragmento grande) con 900 ng de los fragmentos V de cadena pesada (digeridos con Xhol-BstEII) y se transformaron de nuevo en dos alícuotas de 300 ul de células de E. coli XL1 Blue electrocompetentes por electroporación (2,5 kV, cubeta de 0,2 cm de paso, 25 uFD, 200 Ohm) dando lugar a un tamaño total de colección de scFv VH-VK (fragmento variable monocatenario) de más de 107 clones independientes.
Después de la expresión del fenotipo y la adaptación lenta a la carbenicilina, se transfirieron las células de E. coli que contenían la colección de anticuerpos a medio de selección SB-carbenicilina (50 µg/ml). Después, se infectaron las células de E. coli que contenían la colección de anticuerpos con una dosis infecciosa de 1012 partículas de fago colaborador VCSM13, dando lugar a la producción y secreción de fagos filamentosos M13, en el que la partícula de fago contiene ADN de pComb3H5BHis monocatenario que codifica un fragmento scFv murino y presentaba la proteína scFv correspondiente como una fusión traduccional a la proteína de cubierta III del fago. Este conjunto de fagos que presentaban la colección de anticuerpos se usó para la selección de entidades de unión a antígeno.
Generación de células CHO que expresan MUC-1 humana
La secuencia codificante del MUC-1 humana publicada en GenBank (número de acceso J05581) se obtuvo por síntesis génica de acuerdo con protocolos estándar. El fragmento de síntesis génica se diseñó para que contuviera en primer lugar un sitio de Kozak para la expresión eucariota de la construcción, seguido de la secuencia codificante de la proteína MUC-1 humana y un codón de detención (las secuencias de ADNc y de aminoácidos de la construcción se enumeran en las SEQ ID NO: 1498 y 1499). En el fragmento de síntesis génica la secuencia de repetición interna (nucleótidos 382 a 441) de MUC-1, que está contenida una sola vez en la versión depositada en Gen Bank, está contenida dieciséis veces, lo que refleja las múltiples repeticiones en la MUC-1 que se expresa fisiológicamente. El fragmento de síntesis génica también se diseñó para introducir sitios de restricción al principio y al final del fragmento. Los sitios de restricción introducidos, EcoRI en el extremo 5' y SalI en el extremo 3', se utilizaron en los procedimientos de clonación siguientes. Se eliminaron los sitios de restricción internos de Xmal por mutación silenciosa de la secuencia codificante en el fragmento de síntesis génica (el nucleótido 441 desde C hasta T; este es el último nucleótido de la primera repetición y, por lo tanto, muta de forma idéntica en las 15 secuencias de repetición posteriores; y el nucleótido 2160 desde G hasta C). El fragmento de síntesis génica se clonó a través de EcoRI y SalI en un plásmido denominado pEF-DHFR (pEF-DHFR se describe en Raum et al. Cancer Immunol Immunother 50 (2001) 141-150) siguiendo protocolos estándar. Los procedimientos mencionados anteriormente se llevaron a cabo de acuerdo con protocolos estándar (Sambrook, Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 3ª edición, Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, Nueva York (2001)). Se transfectó un clon con secuencia nucleotídica comprobada en células CHO deficientes en DHFR para la expresión eucariota de la construcción. La expresión eucariota de proteínas en células CHO deficientes en DHFR se realizó como se describe por Kaufmann R.J. (1990) Methods Enzymol. 185, 537-566. La amplificación de genes de la construcción se indujo mediante el aumento de las concentraciones metotrexato (MTX) hasta una concentración final de hasta MTX 20 nM.
Para la selección de entidades de unión a antígeno, se recogió la colección de fagos portadores del repertorio de scFv clonado del correspondiente sobrenadante de cultivo mediante precipitación con PEG8000/NaCI y centrifugación. Se resuspendieron de aproximadamente 1011 a 1012 partículas scFv de fagos en 0,4 ml de PBS/BSA al 0,1 % y se incubaron con de 105 a 107 células CHO (véase el ejemplo Muc-1 RoK) durante 1 hora en hielo con agitación lenta. Estas células CHO transfectadas con Muc-1 se recogieron por adelantado por centrifugación, se lavaron en PBS y se resuspendieron en PBS/FCS al 1 % (que contenía azida de Na). Los fagos scFv que no se unen específicamente a las células CHO transfectadas con Muc-1 se eliminaron mediante hasta cinco etapas de lavado con PBS/FCS al 1 % (que contenía azida de Na). Después del lavado, se eluyeron entidades de unión de las células resuspendiendo las células en HCI-glicina a pH 2,2 (10 min de incubación con agitación en vórtex posterior) y tras la neutralización con Tris 2 M a pH 12, se usó el eluato para la infección de un cultivo recién preparado de células de E. coli XL1 Blue no infectadas (DO600 > 0,5). El cultivo de E. coli contenía células de E. coli transducidas exitosamente con una copia de fagémido, que codifica un fragmento scFv humano/humanizado; se seleccionaron de nuevo por su resistencia a carbenicilina y se infectaron posteriormente con el fago colaborador VCMS 13 para iniciar el segundo ciclo de presentación de anticuerpos y selección in vitro. Normalmente, se llevaron a cabo un total de 4 a 5 ciclos de selección.
Con el fin de cribar los agentes de unión específicos de Muc-1, se aisló ADN plasmídico correspondiente a 4 y 5 ciclos de fijación a partir de cultivos de E. coli después de la selección. Para la producción de proteína scFv soluble, se escindieron fragmentos de ADN VH-VL de los plásmidos (Xhol-Spel). Estos fragmentos se clonaron por medio de los mismos sitios de restricción en el plásmido pComb3H5BFlag/His que difería del pComb3H5BHis original en que la construcción de expresión (p. ej., scFv) incluye una marca Flag (DYKDDDDK) entre el scFv y la marca His6 y las proteínas de fago adicionales se eliminaron. Después de la ligación, se transformó cada conjunto (distintos ciclos de fijación) de ADN plasmídico en 100 µl de E. coli TG1 o XLI Blue competentes para choque térmico y se plaquearon sobre LB-agar con carbenicilina. Se tomaron colonias individuales en 100 μl de LB carb (50 μg/ml).
Las E. coli transformadas con pComb3H5BHis que contenían un segmento VL y VH producen scFv soluble en cantidades suficientes después de la escisión del fragmento del gen III y la inducción con IPTG 1 mM Debido a una secuencia señal adecuada, se exportó la cadena scFv al periplasma, donde se pliega en una conformación funcional.
Se tomaron colonias individuales bacterianas de E. coli TG1 de las placas de transformación para preparaciones periplásmicas a pequeña escala y se hicieron crecer en medio SB (p. ej., 10 ml) suplementado con MgCl2 20 mM y 50 µg/ml de carbenicilina (y se redisolvieron en PBS (p. ej., 1 ml) después de recogerlas. Mediante cuatro ciclos de congelación a -70 °C y descongelación a 37 °C, se destruyó la membrana externa de las bacterias por choque térmico y se liberaron las proteínas solubles periplásmicas, incluidos los scFv, al sobrenadante. Después de la eliminación de las células intactas y los desechos celulares por centrifugación, se recogió el sobrenadante que contenía los scFv anti-Muc-1 y se usó para la identificación de agentes de unión específicos de Muc-1 como sigue:
Se probó la unión de scFv a Muc-1 por citometría de flujo en células CHO transfectadas con Muc-1; se usaron células CHO no transfectadas como control negativo.
Para la citometría de flujo, se incubaron 2,5x105 células con 50 ul de preparación de scFv periplásmico o con 5 µg/ml de scFv purificado en 50 µl de PBS con FCS al 2 %. Se detectó la unión de scFv con un anticuerpo anti-His (anticuerpo Penta-His, sin BSA, Qiagen GmbH, Hilden, RFA) a 2 µg/ml en 50 µl de PBS con FCS al 2 %. Como reactivo de segunda etapa se usó un fragmento F(ab')2 purificado por afinidad conjugado con R-ficoeritrina de IgG de cabra anti-ratón (específico de fragmento Fc-gamma), diluido 1:100 en 50 µl de PBS con FCS al 2 % (Dianova, Hamburgo, RFA). Las muestras se midieron en un FACSscan (BD biosciences, Heidelberg, RFA).
Después, se analizaron clones individuales para detectar propiedades y secuencias de aminoácidos favorables. Se convirtieron los scFv específicos de Muc-1 en anticuerpos monocatenarios biespecíficos recombinantes uniéndolos por medio de un enlazador Gly4Ser1 con el scFv específico de CD3 I2C (SEQ ID 185) o cualquier otro scFv específico de CD3 de la invención para dar lugar a construcciones con la disposición de dominios VHMuc1 -(Gly4Ser1)3 - VLMuc1 - Gly4Ser1 - VHCD3 - (Gly4Ser1)3 - VLCD3 o disposiciones de dominios alternativas. Para la expresión en células CHO, las secuencias codificantes de (i) un líder N-terminal de cadena pesada de inmunoglobulina que comprende un codón de inicio incluido en una secuencia de consenso de Kozak y (ii) una marca His6 C-terminal seguida de un codón de detención, se unieron en fase con la secuencia de nucleótidos que codifica los anticuerpos monocatenarios biespecíficos antes de la inserción del fragmento de ADN resultante obtenido por síntesis génica en el sitio de clonación múltiple del vector de expresión pEF-DHFR (Raum et al. Cancer Immunol Immunother 50 (2001) 141-150). La transfección estable de células CHO deficientes en DHFR, la selección de transfectantes positivos para DHFR que segregaban los anticuerpos monocatenarios biespecíficos en el sobrenadante de cultivo y la amplificación de genes con metotrexato para aumentar los niveles de expresión se llevaron a cabo como se describe (Mack et al. Proc. Natl. Acad. Set. USA 92 (1995) 7021-7025). Todos los demás procedimientos del estado de la técnica se llevaron a cabo de acuerdo con protocolos estándar (Sambrook, Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 3ª edición, Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, Nueva York (2001)).
La identificación de construcciones funcionales de anticuerpo monocatenario biespecífico se llevó a cabo mediante análisis por citometría de flujo del sobrenadante de cultivo de células CHO transfectadas. Para este propósito, se probó la unión a CD3 sobre la línea celular humana de leucemia de linfocitos T positivos para CD3 HPB-ALL (DSMZ, Braunschweig, ACC483) y sobre la línea de linfocitos T de macaco 4119LnPx. Se probó la unión a epítopos de Muc1 específicos de tumores sobre células CHO transfectadas con Muc-1. Se incubaron 200.000 células de la línea celular correspondiente durante 30 min en hielo con 50 µl de sobrenadante de cultivo celular. Se lavaron las células dos veces en PBS con FCS al 2 % y se detectó la construcción de anticuerpo monocatenario biespecífico unido con un anticuerpo murino anti-His (anticuerpo Penta His; Qiagen; diluido 1:20 en 50 µl de PBS con FCS al 2 %). Después del lavado, se detectaron anticuerpos anti-His unidos con un anticuerpo específico frente a Fc gamma (Dianova) conjugado con ficoeritrina, diluido 1:100 en PBS con FCS al 2 %. Se usó sobrenadante de células CHO no transfectadas como control negativo.
Se realizó una citometría de flujo en un aparato FACS-Calibur; se usó el programa informático CellQuest para adquirir y analizar los datos (Becton Dickinson biosciences, Heidelberg). La tinción de FACS y la medida de la intensidad de fluorescencia se realizaron como se describe en Current Protocols in Immunology (Coligan, Kruisbeek, Margulies, Shevach y Strober, Wiley-lnterscience, 2002).
Sólo se seleccionaron para su uso posterior las construcciones que mostraban unión biespecífica a CD3 humana y de macaco, así como a epítopos de Muc-1 específicos de tumores.
Para la producción de proteínas, las células CHO que expresaban anticuerpo monocatenario biespecífico totalmente funcional y adaptadas a medio líquido de soja HyQ PF CHO sin nucleósidos (con L-glutamina 4,0 mM con Pluronic F-68 al 0,1 %; HyClone) se hicieron crecer en frascos rotatorios durante 7 días. Se retiró el sobrenadante de cultivo de las células por centrifugación y se almacenó a -20 °C hasta su purificación. Como equipo de cromatografía para la purificación del anticuerpo monocatenario a partir del sobrenadante de cultivo, se usaron el sistema de exploraciónÄkta® (GE Health Systems) y el programa informático Unicorn®. Se realizó una cromatografía de afinidad de metales inmovilizados ("IMAC") usando un quelato Fractogel EMD® (Merck) que se cargó con ZnCl2 de acuerdo con el protocolo proporcionado por el fabricante. Se equilibró la columna con tampón A (tampón de fosfato de sodio 20 mM a pH 7,2, NaCl 0,1 M) y se aplicó el sobrenadante de cultivo celular (500 ml) a la columna (10 ml) a una caudal de 3 ml/min. La columna se lavó con tampón A para retirar la muestra no unida. La proteína unida se eluyó usando un gradiente en dos etapas de tampón B (tampón de fosfato de sodio 20 mM a pH 7,2, NaCl 0,1 M, imidazol 0,5 M) de acuerdo con lo siguiente:
Etapa 1: tampón B al 20 % en 6 volúmenes de columna
Etapa 2: tampón B al 100 % en 6 volúmenes de columna
Las fracciones de proteína eluida a partir de la etapa 2 se agruparon para su purificación adicional. Todos los productos químicos eran de calidad de investigación y comprados de Sigma (Deisenhofen) o Merck (Darmstadt).
La cromatografía de filtración en gel se realizó en una columna de calidad prep HiLoad 16/60 Superdex 200 (GE/Amersham) equilibrada con tampón de equilibrado (citrato 25 mM, lisina 200 mM, glicerol al 5 %, a pH 7,2). Las muestras de proteína eluidas (caudal 1 ml/min) se sometieron a SDS-PAGE estándar y transferencia de bandas western para su detección. Antes de la purificación, se calibró la columna para la determinación del peso molecular (kit de marcadores de peso molecular, Sigma MW GF-200). Las concentraciones de proteína se determinaron usando la DO a 280 nm.
La proteína de anticuerpo monocatenario biespecífico purificada se analizó en SDS PAGE en condiciones reductoras realizada con geles bis-tris preformados al 4-12 % (Invitrogen). La preparación y la aplicación de las muestras se realizaron de acuerdo con el protocolo proporcionado por el fabricante. Se determinó el peso molecular con patrón proteínico MultiMark (Invitrogen). El gel se tiñó con Coomassie coloidal (protocolo de Invitrogen). La pureza de la proteína aislada fue > 95 %, determinada por SDS-PAGE.
El anticuerpo monocatenario biespecífico tiene un peso molecular de aproximadamente 52 kDa en condiciones nativas, determinado por filtración en gel en PBS. Todas las construcciones se purificaron de acuerdo con este procedimiento.
La transferencia de bandas western se realizó usando una membrana Optitran® BA-S83 y el módulo de transferencia de bandas de Invitrogen de acuerdo con el protocolo proporcionado por el fabricante. Para la detección de los anticuerpos de proteína de anticuerpo monocatenario biespecífico se usó un anticuerpo anti-marca His (Penta His, Qiagen). Como anticuerpo secundario se usó un anticuerpo Ig de cabra anti-ratón marcado con fosfatasa alcalina (AP) (Sigma) y como sustrato, BCIP/NBT (Sigma). Se detectó una única banda a 52 kD correspondiente al anticuerpo monocatenario biespecífico purificado.
Se determinó la potencia de los anticuerpos monocatenarios biespecíficos que interaccionan con CD3 humana y de macaco y con epítopos de Muc-1 específicos de tumores en el sistema humano y de primate distinto de chimpancé mediante un ensayo de citotoxicidad basado en la liberación de cromo 51 (51Cr) usando células CHO transfectadas con Muc-1 como células objetivo y PBMC humanas con eliminación de CD4/CD56 estimuladas o la línea de linfocitos T de macaco 4119LnPx como células efectoras.
La generación de PBMC humanas estimuladas se realizó como sigue:
Se recubrió una placa de Petri (145 mm de diámetro, Nunc) con un anticuerpo específico anti-CD3 comercialmente disponible (p. ej., OKT3, Othoclone) en una concentración final de 1 µg/ml durante 1 hora a 37 °C. La proteína no unida se retiró mediante una etapa de lavado con PBS. Se aislaron las PBMC recién obtenidas a partir de sangre periférica (30 - 50 ml de sangre humana) por centrifugación en gradiente de Ficoll de acuerdo con protocolos estándar. Se añadieron 3 - 5 x 107 PBMC a la placa de Petri recubierta previamente en 120 ml de RPMI 1640 con glutamina estabilizada / FCS al 10 % / 20 U/ml de IL-2 (Proleukin, Chiron) y se estimulan durante 2 días. Al tercer día se recogieron las células y se lavaron una vez con RPMI 1640. Se añadió IL-2 a una concentración final de 20 U/ml y se cultivaron de nuevo las células durante un día en el mismo medio de cultivo celular que anteriormente.
Las células objetivo se lavaron dos veces con PBS y se marcaron con 11,1 MBq de 51Cr en un volumen final de 100 µl de RPMI con FCS al 50 % durante 45 minutos a 37 °C. Posteriormente, las células objetivo marcadas se lavaron 3 veces con 5 ml de RPMI y después se usaron en el ensayo de citotoxicidad. El ensayo se realizó en una placa de 96 pocillos en un volumen total de 250 µl de RPMI suplementado (como anteriormente) con una proporción E:O de 10:1. Se aplicaron 1 µg/ml de las moléculas de anticuerpo monocatenario biespecífico específico de especies cruzadas y 20 diluciones de tres veces de las mismas. El tiempo de ensayo fue de 18 horas y la citotoxicidad se midió como valores relativos de cromo liberado en el sobrenadante en relación con la diferencia de lisis máxima (adición de Triton-X) y lisis espontánea (sin células efectoras). Todas las medidas se realizaron en cuadruplicados. La medida de la actividad del cromo en los sobrenadantes se realizó con un contador gamma Wizard 3" (Perkin Elmer Life Sciences GmbH, Colonia, Alemania). El análisis de los datos experimentales se realizó con Prism 4 para Windows
(versión 4.02, GraphPad Software Inc., San Diego, California, EE. UU.). Típicamente, las curvas sigmoidales de respuesta a dosis tienen valores de R2 > 0,90, determinados por el programa informático. Se calcularon los valores de EC50 como medida de la potencia mediante el programa de análisis.
36. Generación de moléculas monocatenarias biespecíficas específicas de especies cruzadas de CD33 y CD3
36.1. Generación de moléculas monocatenarias biespecíficas específicas de especies cruzadas de CD33 y CD3
En general, se diseñaron moléculas de anticuerpo monocatenario biespecífico, comprendiendo cada uno un dominio con una especificidad de unión de especies cruzadas específico para CD3épsilon humana y de macaco, así como un dominio con una especificidad de unión de especies cruzadas específico para CD33 humana y de macaco, como se expone en la siguiente tabla 14:
Tabla 14: Formatos de moléculas de anticuerpo monocatenario biespecífico específico de especies cruzadas anti-CD3 y anti-CD33
SEQ ID (nucl/prot)
Formatos de construcciones de proteína (N�C)
1341/1340
I2CHL x AF5HL
1339/1338
F12QHL x AF5HL
1337/1336
H2CHL x AF5HL
Se obtuvieron por síntesis génica las construcciones mencionadas anteriormente que contenían los dominios variable de cadena ligera (L) y variable de cadena pesada (H) específicas de especies cruzadas para CD33 humana y de macaco y las combinaciones de VH y VL específicas para CD3 específicas de especies cruzadas para CD3 humana y de macaco. Los fragmentos de síntesis génica se diseñaron para que contuvieran en primer lugar un sitio de Kozak para la expresión eucariota de la construcción, seguido por un péptido líder de inmunoglobulina de 19 aminoácidos, seguido en fase por la secuencia codificante de la molécula de anticuerpo monocatenario biespecífico correspondiente, seguida en fase por la secuencia codificante de una marca histidina6 y un codón de detención. El fragmento de síntesis génica también se diseñó para introducir sitios de restricción adecuados al principio y al final del fragmento. Los sitios de restricción introducidos se utilizaron en los procedimientos de clonación siguientes. El fragmento de síntesis génica se clonó a través de estos sitios de restricción en un plásmido denominado pEF-DHFR (pEF-DHFR se describe en Raum et al. Cancer Immunol Immunother 50 (2001) 141-150) siguiendo protocolos estándar. Los procedimientos mencionados anteriormente se llevaron a cabo de acuerdo con protocolos estándar (Sambrook, Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 3ª edición, Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, Nueva York (2001)). Se transfectó un clon con secuencia nucleotídica comprobada en células CHO deficientes en DHFR para la expresión eucariota de la construcción. La expresión eucariota de proteínas en células CHO deficientes en DHFR se realizó como se describe por Kaufmann R.J. (1990) Methods Enzymol. 185, 537-566. La amplificación de genes de la construcción se indujo mediante el aumento de las concentraciones metotrexato (MTX) hasta una concentración final de hasta MTX 20 nM. Después de dos pasos de cultivo celular estacionario se recogió el sobrenadante de cultivo y se uso en los experimentos posteriores.
36.2. Análisis de unión por citometría de flujo de los anticuerpos biespecíficos específicos de especies cruzadas de CD33 y CD3
Con el fin de probar la funcionalidad de las construcciones de anticuerpo biespecífico específico de especies cruzadas con respecto a la capacidad de unión a CD33 y CD3 humana y de cynomolgus, respectivamente, se lleva a cabo un análisis de FACS. Para este propósito se usaron células CHO transfectadas con CD33 humana como se describe en el ejemplo 23.1 y la línea celular humana de leucemia de linfocitos T positivos para CD3 HPB-ALL (DSMZ, Braunschweig, ACC483) para probar la unión a antígenos humanos. La reactividad de unión a antígenos de macaco se probó usando el transfectante de CD33 de macaco generado descrito en el ejemplo 23.2 y las PBMC de macaco (la preparación de PBMC de macaco se realizó por centrifugación en gradiente de Ficoll de sangre periférica de macacos de acuerdo con protocolos estándar). Se incubaron 200.000 células de las respectivas líneas celulares
o PBMC durante 30 min en hielo con 50 µl de sobrenadante de cultivo celular de células transfectadas que expresaban las construcciones de anticuerpo biespecífico específico de especies cruzadas. Se lavaron las células dos veces en PBS con FCS al 2 % y se detectó la unión de la construcción con un anticuerpo anti-His murino (anticuerpo Penta His; Qiagen; diluido 1:20 en 50 µl de PBS con FCS al 2 %). Después del lavado, se detectaron anticuerpos anti-His unidos con un anticuerpo específico frente a Fc gamma (Dianova) conjugado con ficoeritrina, diluido 1:100 en PBS con FCS al 2 %. Se usó sobrenadante de células CHO no transfectadas como control negativo.
Se realizó una citometría de flujo en un aparato FACS-Calibur; se usó el programa informático CellQuest para adquirir y analizar los datos (Becton Dickinson biosciences, Heidelberg). La tinción de FACS y la medida de la intensidad de fluorescencia se realizaron como se describe en Current Protocols in Immunology (Coligan, Kruisbeek, Margulies, Shevach y Strober, Wiley-lnterscience, 2002).
La unión biespecífica de las moléculas monocatenarias enumeradas anteriormente, que eran específicas de especies cruzadas para CD33 y específicas de especies cruzadas para CD3 humana y de primate distinto de chimpancé, era claramente detectable, como se muestra en la figura 60. En el análisis de FACS todas las construcciones mostraron unión a CD3 y CD33 en comparación con los controles negativos respectivos. Se demostró la especificidad de especies cruzadas de los anticuerpos biespecíficos frente a antígenos de CD3 y CD33 humanas y de macaco.
36.3. Bioactividad de anticuerpos monocatenarios biespecíficos específicos de especies cruzadas de CD33 y CD3
Se analizó la bioactividad de los anticuerpos monocatenarios biespecíficos generados mediante ensayos de citotoxicidad in vitro de liberación de cromo 51 (51Cr) usando las líneas celulares positivas para CD33 descritas en los ejemplos 23.1 y 23.2. Como células efectoras se usaron PBMC humanas con eliminación de CD4/CD56 estimuladas o la línea de linfocitos T de macaco 4119LnPx, como se especifica en las respectivas figuras.
Se recubrió una placa de Petri (145 mm de diámetro, Greiner bio-one GmbH, Kremsmunster) con un anticuerpo específico anti-CD3 comercialmente disponible (p. ej., OKT3, Othoclone) en una concentración final de 1 µg/ml durante 1 hora a 37 °C. La proteína no unida se retiró mediante una etapa de lavado con PBS. Se aislaron las PBMC recién obtenidas a partir de sangre periférica (30 - 50 ml de sangre humana) por centrifugación en gradiente de Ficoll de acuerdo con protocolos estándar. Se añadieron 3-5 x 107 PBMC a la placa de Petri recubierta previamente en 120 ml de RPMI 1640 con glutamina estabilizada / FCS al 10 % / 20 U/ml de IL-2 (Proleukin, Chiron) y se estimulan durante 2 días. Al tercer día se recogieron las células y se lavaron una vez con RPMI 1640. Se añade IL-2 a una concentración final de 20 U/ml y se cultivaron de nuevo las células durante un día en el mismo medio de cultivo celular que anteriormente.
Mediante la eliminación de linfocitos T CD4+ y linfocitos NK CD56+ de acuerdo con protocolos estándar, se enriquecen los linfocitos T citotóxicos (LTC) CD8+.
Las células objetivo se lavaron dos veces con PBS y se marcaron con 11,1 MBq de 51Cr en un volumen final de 100 µl de RPMI con FCS al 50 % durante 45 minutos a 37 °C. Posteriormente, las células objetivo marcadas se lavaron 3 veces con 5 ml de RPMI y después se usaron en el ensayo de citotoxicidad. El ensayo se realizó en una placa de 96 pocillos en un volumen total de 250 µl de RPMI suplementado (como anteriormente) con una proporción E:O de
10:1. Se aplicaron sobrenadante de células que expresaban las moléculas de anticuerpo monocatenario biespecífico específico de especies cruzadas y en una concentración final del 50 % y 20 diluciones de tres veces del mismo. El tiempo de ensayo es de 18 horas y la citotoxicidad se midió como valores relativos de cromo liberado en el sobrenadante en relación con la diferencia de lisis máxima (adición de Triton-X) y lisis espontánea (sin células efectoras). Todas las medidas se realizaron en cuadruplicados. La medida de la actividad del cromo en los sobrenadantes se realizó con un contador gamma Wizard 3" (Perkin Elmer Life Sciences GmbH, Colonia, Alemania). El análisis de los datos experimentales se realizó con Prism 4 para Windows (versión 4.02, GraphPad Software Inc., San Diego, California, EE. UU.). Típicamente, las curvas sigmoidales de respuesta a dosis tienen valores de R2 > 0,90, determinados por el programa informático. Los valores de CE50 calculados por el programa de análisis se usaron para la comparación de la bioactividad.
Como se muestra en la figura 61, todas las construcciones de anticuerpo monocatenario biespecífico específico de especies cruzadas generadas demuestran actividad citotóxica contra células objetivo positivas para CD33 humana provocada por PBMC humanas con eliminación de CD4/CD56 estimuladas y contra células objetivo positivas para CD33 de macaco provocada por la línea de linfocitos T de macaco 4119LnPx.
37. Redistribución de linfocitos T circulantes de chimpancé tras la exposición a una molécula de unión a CD3 biespecífica convencional dirigida a una molécula objetivo que está ausente en células sanguíneas circulantes
Se sometió a un único chimpancé macho a aumento de dosis con construcción de anticuerpo biespecífico de EpCAM/CD3 monocatenario por vía intravenosa (Schlereth (2005) Cancer Res 65: 2882). Como en la construcción de anticuerpo biespecífico de CD19/CD3 monocatenario convencional (Loffler (2000, Blood, volumen 95, número 6)
o en el documento WO 99/54440), el brazo de CD3 de dicha construcción de EpCAM/CD3 también se dirige contra un epítopo dependiente del contexto convencional de CD3 humana y de chimpancé. En el día 0, el animal recibió 50 ml de PBS/HSA al 5 % sin material de prueba, seguido de 50 ml de PBS/HSA al 5 % más construcción de anticuerpo biespecífico de EpCAM/CD3 monocatenario a 1,6, 2,0, 3,0 y 4,5 µg/kg en los días 7, 14, 21 y 28, respectivamente. El periodo de infusión fue de 2 horas por administración. Para cada infusión semanal, se sedó al chimpancé con 2-3 mg/kg de Telazol por vía intramuscular, se le intubó y se le anestesió con isoflurano/O2 con tensión arterial media estable. Se le colocó un segundo catéter intravenoso en una extremidad opuesta para extraer muestras de sangre completa (heparinizada) en los puntos temporales indicados en la figura 62 para el análisis de FACS de células sanguíneas circulantes. Después de la lisis estándar de eritrocitos, se tiñeron los linfocitos T con un anticuerpo marcado con FITC que reaccionaba con CD2 de chimpancé (Becton Dickinson) y se determinó el porcentaje de linfocitos T por linfocitos totales por citometría de flujo. Como se muestra en la figura 62, cada administración de construcción de anticuerpo biespecífico de EpCAM/CD3 monocatenario indujo una rápida disminución de linfocitos T circulantes como se observa con la construcción de anticuerpo biespecífico de CD19/CD3 monocatenario en pacientes con LNH-B, que esencialmente no tenían linfocitos (de linfoma) B objetivo circulantes. Como no hay células objetivo positivas para EpCAM en la sangre circulante de seres humanos y chimpancés, la disminución de linfocitos T circulantes tras la exposición a la construcción de anticuerpo biespecífico de EpCAM/CD3 monocatenario se puede atribuir exclusivamente a una señal que reciben los linfocitos T a través de la interacción pura del brazo de CD3 de la construcción con un epítopo de CD3 dependiente del contexto convencional en ausencia de entrecruzamiento mediado por células objetivo. Como la redistribución de linfocitos T inducida a través de su exposición a la construcción de anticuerpo biespecífico de CD19/CD3 monocatenario en pacientes con LNH-B, que esencialmente no tenían linfocitos (de linfoma) B objetivo circulantes, la redistribución de linfocitos T en el chimpancé tras la exposición a la construcción de anticuerpo biespecífico de EpCAM/CD3 monocatenario se puede explicar por un cambio conformacional de CD3 después del acontecimiento de unión a un epítopo de CD3 dependiente del contexto que da lugar además al aumento transitorio de la capacidad de adhesión de los linfocitos T al endotelio de los vasos sanguíneos (véase el ejemplo 20). Este descubrimiento confirma que las moléculas de unión a CD3 convencionales dirigidas a epítopos de CD3 dependientes del contexto, exclusivamente a través de esta interacción, pueden dar lugar a un patrón de redistribución de linfocitos T de sangre periférica, que se asocia con el riesgo de acontecimientos adversos en el SNC en seres humanos como se describe en el ejemplo 20.
38. Unión específica de clones de scFv al extremo N-terminal de CD3 épsilon humana
38.1. Expresión bacteriana de construcciones de scFv en E. coli XL1 Blue
Como se menciona anteriormente, las E. coli XL1 Blue transformadas con pComb3H5Bhis/Flag que contenían un segmento VL y VH producen scFv soluble en cantidades suficientes después de la escisión del fragmento del gen III y la inducción con IPTG 1 mM. La cadena scFv se exporta al periplasma, donde se pliega en una conformación funcional. Para este experimento se escogieron los clones de scFv siguientes:
i) ScFv 4-10, 3-106, 3-114, 3-148, 4-48, 3-190 y 3-271 descritos en el documento WO 2004/106380.
ii) ScFv de los clones humanos de unión anti-CD3 épsilon H2C, F12Q e I2C descritos en el presente documento.
Para las preparaciones periplásmicas, se hicieron crecer células bacterianas transformadas con los plásmidos que contenían los scFv correspondientes que permiten la expresión periplásmica en medio SB suplementado con MgCl2 20 mM y carbenicilina 50 µg/ml y se redisolvieron en PBS después de recogerlas. Mediante cuatro ciclos de congelación a -70 °C y descongelación a 37 °C, se destruyó la membrana externa de las bacterias por choque osmótico y se liberaron las proteínas solubles periplásmicas, incluidos los scFv, al sobrenadante. Después de la eliminación de las células intactas y los residuos celulares por centrifugación, se recogió el sobrenadante que contenía los scFv humanos anti-CD3 humana y se usó para examinarlo adicionalmente. Estos sobrenadantes en bruto que contenían scFv se denominarán en lo sucesivo preparaciones periplásmicas (PPP).
38.2. Unión de scFv a la proteína de fusión CD3 épsilon humana (aa 1-27)-Fc
Se llevaron a cabo experimentos ELISA recubriendo la proteína de fusión CD3 épsilon (aa 1-27)-Fc en los pocillos de placas de 96 pocillos de plástico (Nunc, maxisorb), típicamente a 4 °C durante la noche. Después, se retiró la solución de recubrimiento de antígenos, se lavaron los pocillos una vez con PBS/Tween 20 al 0,05 % y posteriormente se bloquearon con PBS/BSA al 3 % durante al menos una hora. Después de retirar la solución de bloqueo, se añadieron las PPP y las soluciones de control a los pocillos y, típicamente, se incubaron durante una hora a temperatura ambiente. Después, se lavaron los pocillos tres veces con PBS/Tween 20 al 0,05 % . La detección de scFv unidos a antígenos inmovilizados se llevó a cabo usando un anticuerpo anti-marca FLAG marcado con biotina (M2 anti-Flag-Bio, Sigma, normalmente a un concentración final de 1 µg/ml de PBS) y se detectó con estreptavidina marcada con peroxidasa (Dianova, 1 µg/ml de PBS). La señal se reveló mediante la adición de solución de sustrato ABTS y se midió a una longitud de onda de 405 nm. La unión inespecífica de las muestras de prueba al agente de bloqueo y/o a la porción de IgG1 humana de la proteína de fusión CD3 épsilon (aa 1-27)-Fc se estudió llevando a cabo el mismo ensayo con los mismos reactivos y la misma secuencia temporal en placas de ELISA que se recubrieron con lgG1 humana (Sigma). Se usó PBS como control negativo.
Como se muestra en la figura 63, los scFv H2C, F12Q e I2C muestran fuertes señales de unión a la proteína de fusión CD3 épsilon humana (aa 1-27)-Fc. Los scFv humanos 3-106, 3-114, 3-148, 3-190, 3-271, 4-10 y 4-48 (descritos en el documento WO 2004/106380) no muestran ninguna unión significativa por encima del nivel de control negativo.
Para excluir la posibilidad de que la unión positiva de los scFv H2C, F12Q e I2C a pocillos recubiertos con la proteína de fusión CD3 épsilon humana (aa 1-27)-Fc pudiera deberse a la unión a BSA (usado como agente bloqueante) y/o la porción Fc-gamma de lgG1 humana de la proteína de fusión CD3 épsilon humana (aa 1-27)-Fc, se realizó un segundo experimento ELISA en paralelo. En este segundo experimento ELISA, todos los parámetros fueron idénticos a los del primer experimento ELISA, excepto que en el segundo experimento ELISA se recubrió lgG1 humana (Sigma) en lugar de proteína de fusión CD3 épsilon humana (aa 1-27)-Fc. Como se muestra en la figura 64, ninguno de los scFv probados mostró ninguna unión significativa a BSA y/o a lgG1 humana por encima del nivel de base.
Tomados conjuntamente, estos resultados permiten concluir que las moléculas de unión a CD3 convencionales que reconocen un epítopo de CD3 épsilon dependiente del contexto (p. ej., como se divulga en el documento WO 2004/106380) no se unen específicamente a la región de CD3 épsilon humana (aa 1-27), mientras que los scFv H2C, F12Q e I2C que se unen a un epítopo de CD3 épsilon independiente del contexto muestran claramente unión específica a los 27 aminoácidos N-terminales de la CD3 épsilon humana.
39. Generación de moléculas monocatenarias biespecíficas específicas de especies cruzadas de CD44 y CD3
39.1. Clonación de moléculas de unión específicas de especies cruzadas
En general, se diseñan moléculas de anticuerpo monocatenario biespecífico, comprendiendo cada uno un dominio con una especificidad de unión de especies cruzadas específico para CD3 épsilon humana y de macaco, así como un dominio con una especificidad de unión de especies cruzadas específico para CD44 humana y de macaco, como se expone en la siguiente tabla 15:
Tabla 15: Formatos de moléculas de anticuerpo monocatenario biespecífico específico de especies cruzadas anti-CD3 y anti-CD44
SEQ ID (nucl/prot)
Formatos de construcciones de proteína (N�C)
1589/1588
CD44-A8 LH x I2C HL
1603/1602
CD44-C2 HL x I2C HL
1631/1630
CD44-H3 HL x I2C HL
1617/1616
CD44-F6 HL x I2C HL
Se obtuvieron por síntesis génica las construcciones mencionadas anteriormente que contenían los dominios variable de cadena pesada (VH) y variable de cadena ligera (VH) específicos de especies cruzadas para CD44 humana y de macaco y los dominios VH y VL específicos de especies cruzadas para CD3 humana y de macaco. Los fragmentos de síntesis génica se diseñaron para que contuvieran en primer lugar un sitio de Kozak para la expresión eucariota de la construcción, seguido por un péptido líder de inmunoglobulina de 19 aminoácidos, seguido en fase por la secuencia codificante de la molécula de anticuerpo monocatenario biespecífico correspondiente, seguida en fase por la secuencia codificante de una marca histidina6 y un codón de detención. El fragmento de síntesis génica también se diseñó para introducir sitios de restricción adecuados N- y C-terminales. El fragmento de síntesis génica se clonó a través de estos sitios de restricción en un plásmido denominado pEF-DHFR (pEF-DHFR se describe en Raum et al. Cancer Immunol Immunother 50 (2001) 141-150) de acuerdo con protocolos estándar (Sambrook, Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 3ª edición, Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, Nueva York (2001)). Se transfectó un clon de secuencia nucleotídica comprobada en células de ovario de hámster chino (CHO) deficientes en dihidrofolato reductasa (DHFR) para la expresión eucariota de la construcción.
39.2. Expresión de las moléculas de anticuerpo monocatenario biespecífico
Las construcciones biespecíficas se expresaron de forma transitoria en células CHO deficientes en DHFR. Brevemente, se cultivaron 4 x 105 células por construcción en 3 ml de medio completo RPMI 1640 con glutamina estabilizada suplementado con suero bovino fetal al 10 %, penicilina/estreptomicina al 1 % y nucleósidos de una solución madre de reactivos de calidad para cultivo celular (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Alemania) a una concentración final de 10 µg/ml de adenosina, 10 µg/ml de desoxiadenosina y 10 µg/ml de timidina, en una incubadora a 37 C, al 95 % de humedad y CO2 al 7 % un día antes de la transfección. La transfección se realizó con reactivo de transfección Fugene HD (Roche, N.º 04709691001) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Se mezclaron 94 µl de medio OptiMEM (Invitrogen) y 6 µl de Fugene HD y se incubaron durante 5 minutos a temperatura ambiente. Posteriormente, se añadieron 1,5 µg de ADN por construcción, se mezclaron y se incubaron durante 15 minutos a temperatura ambiente. Mientras tanto, las células CHO deficientes en DHFR se lavaron 1x con PBS y se resuspendieron en 1,5 ml de medio completo RPMI 1640. Se diluyó la mezcla de transfección con 600 µl de medio completo RPMI 1640, se añadió a las células y se incubaron durante la noche a 37 °C, al 95 % de humedad y CO2 al 7 %. El día después de la transfección, se aumentó el volumen de incubación de cada enfoque hasta 5 ml de medio completo RPMI 1640. Después de 3 días de incubación, se recogió el sobrenadante.
39.3. Análisis de unión por citometría de flujo de los anticuerpos biespecíficos específicos de especies cruzadas de CD44 y CD3
Con el fin de probar la funcionalidad de las construcciones de anticuerpo biespecífico específico de especies cruzadas con respecto a la capacidad de unión a CD44 y CD3 humana y de cynomolgus, respectivamente, se llevó a cabo un análisis de FACS. Para este propósito se usaron células CHO transfectadas con CD44 humana como se describe en el ejemplo 28.1 y la línea celular humana de leucemia de linfocitos T positivos para CD3 HPB-ALL (DSMZ, Braunschweig, ACC483) para probar la unión a antígenos humanos. La reactividad de unión a antígenos de macaco se probó usando el transfectante de CD44 de macaco generado descrito en el ejemplo 28.3 y una línea de linfocitos T de macaco 4119LnPx (proporcionada amablemente por el Prof. Fickenscher, Instituto de Higiene, Virología, Erlangen-Núremberg; publicado en Knappe A, et al., y Fickenscher H., Blood 2000, 95, 3256-61). Para demostrar la especificidad de las construcciones de anticuerpo biespecífico específico de especies cruzadas para CD44, se probó la unión a CD44delv6 humana (CD44 con el exón v6 eliminado) usando células CHO transfectadas con CD44delv6 humana (generación descrita en el ejemplo 28.2).
Se incubaron 200.000 células de las respectivas líneas celulares durante 30 min en hielo con 50 µl de los sobrenadantes celulares de células transfectadas que expresaban las construcciones de anticuerpo biespecífico específico de especies cruzadas. Se lavaron las células dos veces en PBS con FCS al 2 % y se detectó la unión de la construcción con un anticuerpo anti-His murino (anticuerpo Penta His; Qiagen; diluido 1:20 en 50 µl de PBS con FCS al 2 %). Después del lavado, se detectaron anticuerpos anti-His unidos con un anticuerpo específico frente a Fc gamma (Dianova) conjugado con ficoeritrina, diluido 1:100 en PBS con FCS al 2 %. El sobrenadante de células CHO no transfectadas se usó como control negativo para la unión a las líneas de linfocitos T. Como control negativo para la unión a las células CHO transfectadas con CD44 y CD44delv6, se usó una construcción monocatenaria con especificidad de objetivo no pertinente.
Se realizó una citometría de flujo en un aparato FACS-Calibur; se usó el programa informático CellQuest para adquirir y analizar los datos (Becton Dickinson biosciences, Heidelberg). La tinción de FACS y la medida de la intensidad de fluorescencia se realizaron como se describe en Current Protocols in Immunology (Coligan, Kruisbeek, Margulies, Shevach y Strober, Wiley-lnterscience, 2002).
La unión biespecífica de las moléculas monocatenarias enumeradas anteriormente, que son específicas de especies cruzadas para CD44 y específicas de especies cruzadas para CD3 humana y de macaco, era claramente detectable como se muestra en la figura 65 a-d. En la figura 65 e no se observó unión de las moléculas a CD44delv6. Por lo tanto, se demostró claramente la especificidad de especies cruzadas de los anticuerpos biespecíficos por los antígenos CD3 y CD44 humanas y de macaco.
39.4. Bioactividad de anticuerpos monocatenarios biespecíficos específicos de especies cruzadas de CD44 y CD3
Se analizó la bioactividad de los anticuerpos monocatenarios biespecíficos generados mediante ensayos de citotoxicidad in vitro de liberación de cromo 51 (51Cr) usando las líneas celulares positivas para CD44 descritas en el ejemplo 28.1. Como células efectoras se usaron PBMC humanas con eliminación de CD4/CD56 estimuladas, PBMC humanas estimuladas como se especifica en las respectivas figuras.
La generación de las PBMC con eliminación de CD4/CD56 se realizó como sigue:
Se recubrió una placa de Petri (145 mm de diámetro, Greiner bio-one GmbH, Kremsmunster) con un anticuerpo específico anti-CD3 comercialmente disponible (p. ej., OKT3, Othoclone) en una concentración final de 1 µg/ml durante 1 hora a 37 °C. La proteína no unida se retiró mediante una etapa de lavado con PBS. Se aislaron las PBMC recién obtenidas a partir de sangre periférica (30 - 50 ml de sangre humana) por centrifugación en gradiente de Ficoll de acuerdo con protocolos estándar. Se añadieron 3 - 5 x 107 PBMC a la placa de Petri recubierta previamente en 120 ml de RPMI 1640 con glutamina estabilizada / FCS al 10 % / 20 U/ml de IL-2 (Proleukin, Chiron) y se estimulan durante 2 días. Al tercer día se recogieron las células y se lavaron una vez con RPMI 1640. Se añade IL-2 a una concentración final de 20 U/ml y se cultivaron de nuevo las células durante un día en el mismo medio de cultivo celular que anteriormente. Mediante la eliminación de linfocitos T CD4+ y linfocitos NK CD56+ de acuerdo con protocolos estándar, se enriquecen los linfocitos T citotóxicos (LTC) CD8+.
Las células objetivo se lavaron dos veces con PBS y se marcaron con 11,1 MBq de 51Cr en un volumen final de 100 µl de RPMI con FCS al 50 % durante 45 minutos a 37 °C. Posteriormente, las células objetivo marcadas se lavaron 3 veces con 5 ml de RPMI y después se usaron en el ensayo de citotoxicidad. El ensayo se realizó en una placa de 96 pocillos en un volumen total de 250 µI de RPMI suplementado (como anteriormente) con una proporción E:O de 10:1. Para el ensayo de citotoxicidad humana se aplicaron sobrenadante celular que contenía las moléculas de anticuerpo monocatenario biespecífico específico de especies cruzadas y 20 diluciones de dos veces del mismo. El tiempo de ensayo fue de 18 horas y la citotoxicidad se midió como valores relativos de cromo liberado en el sobrenadante en relación con la diferencia de lisis máxima (adición de Triton-X) y lisis espontánea (sin células efectoras). Todas las medidas se realizaron en cuadruplicados. La medida de la actividad del cromo en los sobrenadantes se realizó con un contador gamma Wizard 3" (Perkin Elmer Life Sciences GmbH, Colonia, Alemania). El análisis de los datos experimentales se realizó con Prism 4 para Windows (versión 4.02, GraphPad Software Inc., San Diego, California, EE. UU.). Típicamente, las curvas sigmoidales de respuesta a dosis tienen valores de R2 > 0,90, determinados por el programa informático. Los valores de CE50 calculados por el programa de análisis se usaron para la comparación de la bioactividad.
Como se muestra en la figura 66, todas las construcciones de anticuerpo monocatenario biespecífico específico de especies cruzadas generadas demostraron actividad citotóxica contra células objetivo positivas para CD44 provocada por PBMC humanas con eliminación de CD4/CD56 estimuladas.
40. Generación de un fragmento de anticuerpo monocatenario en tándem biespecífico específico de especies cruzadas de CD3 y antígeno de VHC
40.1. Generación de células CHO que expresan la glucoproteína de la envoltura del VHC E2 (genotipos de VHC 1a y 1b)
Las secuencias codificantes de la glucoproteína de la envoltura del virus de la hepatitis C (VHC) E2 (genotipo de VHC 1a y 1b, aislados de VHC de los subtipos respectivos; secuencias determinadas de acuerdo con protocolos estándar), cada una como una proteína de fusión traduccional con el dominio transmembranario e intracelular de CD4 humana, se obtuvieron por síntesis génica de acuerdo con protocolos estándar. Los fragmentos de síntesis génica se diseñaron para que contuvieran en primer lugar un sitio de Kozak para la expresión eucariota de la construcción, seguido de la secuencia codificante de un péptido señal de 14 aminoácidos, seguida de la secuencia codificante de los primeros 278 (genotipo 1a) o 279 (genotipo 1b) aminoácidos de la glucoproteína de la envoltura del VHC E2, una secuencia duplicada del epítopo myc y la secuencia codificante del dominio transmembranario e intracelular de CD4 humana correspondiente a los aminoácidos 372 a 433 de la proteína madura (publicada en GenBank con el número de acceso M12807) y un codón de detención (las secuencias de ADNc y aminoácidos de las construcciones se enumeraron con las SEQ ID NO VHC-1 a VHC-4, genotipos 1a y 1b, respectivamente). Los fragmentos de síntesis génica también se diseñaron para introducir sitios de restricción al principio y al final del fragmento. Los sitios de restricción introducidos, EcoRI en el extremo 5' y SalI en el extremo 3', se utilizaron en los procedimientos de clonación siguientes. Los fragmentos de síntesis génica se clonaron a través de EcoRI y SalI en un plásmido denominado pEF-DHFR (pEF-DHFR se describe en Raum et al. Cancer Immunol Immunother 50 (2001) 141-150) siguiendo protocolos estándar. Los procedimientos mencionados anteriormente se llevaron a cabo de acuerdo con protocolos estándar (Sambrook, Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 3ª edición, Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, Nueva York (2001)). Se transfectó un clon con secuencia nucleotídica comprobada en células CHO deficientes en DHFR para la expresión eucariota de la construcción. La expresión eucariota de proteínas en células CHO deficientes en DHFR se realizó como se describe por Kaufmann
R.J. (1990) Methods Enzymol. 185, 537-566. La amplificación de genes de la construcción se indujo mediante el aumento de las concentraciones metotrexato (MTX) hasta una concentración final de hasta MTX 20 nM. Por último, se generaron dos líneas celulares: una línea de células CHO con el dominio E2 de VHC de genotipo 1a expresado sobre la superficie y otra línea de células CHO con el dominio E2 de VHC de genotipo 1b expresado sobre la superficie.
40.2 Clonación de un fragmento monocatenario de anticuerpo en tándem biespecífico de especies cruzadas
En general, se diseñó un fragmento de anticuerpo monocatenario en tándem biespecífico, que comprendía un dominio con una especificidad de unión de especies cruzadas específico para CD3épsilon humana y de macaco, así como un dominio con una especificidad de unión para VHC, como se expone en la siguiente tabla 16:
Tabla 16: Formato de un fragmento de anticuerpo monocatenario en tándem biespecífico específico de especies cruzadas anti-CD3 y específico de antígeno anti-VHC
SEQ ID (nucl/prot)
Formato de la construcción de la proteína (N�C)
1664/1663
HC1LH x l2CHL
Se obtuvieron por síntesis génica las construcciones mencionadas anteriormente que contenían los dominios variable de cadena ligera (L) y variable de cadena pesada (H) específicas para antígenos de VHC y las combinaciones de VH y VL específicas de especies cruzadas para CD3 humana y de macaco. El fragmento de síntesis génica se diseñó para que contuvieran en primer lugar un sitio de Kozak para la expresión eucariota de la construcción, seguido por un péptido líder de inmunoglobulina de 19 aminoácidos, seguido en fase por la secuencia codificante de la molécula de anticuerpo monocatenario biespecífico correspondiente, seguida en fase por la secuencia codificante de una marca histidina6 y un codón de detención. El fragmento de síntesis génica también se diseñó para introducir sitios de restricción adecuados al principio y al final del fragmento. Los sitios de restricción introducidos se utilizaron en los procedimientos de clonación siguientes. El fragmento de síntesis génica se clonó a través de estos sitios de restricción en un plásmido denominado pEF-DHFR (pEF-DHFR se describe en Raum et al. Cancer Immunol Immunother 50 (2001) 141-150) siguiendo protocolos estándar. Los procedimientos mencionados anteriormente se llevaron a cabo de acuerdo con protocolos estándar (Sambrook, Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 3ª edición, Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, Nueva York (2001)). Se transfectó un clon con secuencia nucleotídica comprobada en células CHO deficientes en DHFR para la expresión eucariota del fragmento de anticuerpo monocatenario en tándem biespecífico. La expresión de la proteína eucariota en células CHO deficientes en DHFR se realizó como se describe por Kaufmann R.J. (1990) Methods Enzymol. 185, 537-566. La amplificación de genes de la construcción se indujo mediante el aumento de las concentraciones metotrexato (MTX) hasta una concentración final de hasta MTX 20 nM.
40.3 Expresión y purificación del fragmento de anticuerpo monocatenario en tándem biespecífico
El fragmento de anticuerpo monocatenario en tándem biespecífico se expresó en células de ovario de hámster chino (CHO). La expresión eucariota de proteínas en células CHO deficientes en DHFR se realizó como se describe por Kaufmann R.J. (1990) Methods Enzymol. 185, 537-566. La amplificación de genes de las construcciones se indujo mediante la adición de concentraciones crecientes de MTX hasta concentraciones finales de MTX de 20 nM. Después de dos pasos de cultivo estacionario, las células se hicieron crecer en frascos rotatorios con medio líquido de soja HyQ PF CHO sin nucleósidos (con L-glutamina 4,0 mM con Pluronic F - 68 al 0,1 %; HyClone) durante 7 días antes de recogerlas. Se retiraron las células por centrifugación y se almacenó el sobrenadante que contenía la proteína expresada a -20 °C. De forma alternativa, las construcciones se expresaron de forma transitoria en células HEK 293. La transfección se realiza con reactivo 293fectin (Invitrogen, N.º 12347-019) de acuerdo con el protocolo del fabricante.
Para la cromatografía se usaron el sistema de exploración Äkta® (GE Health Systems) y el programa informático Unicorn®. Se realizó una cromatografía de afinidad de metales inmovilizados ("IMAC") usando un quelato Fractogel EMD® (Merck) que se cargó con ZnCl2 de acuerdo con el protocolo proporcionado por el fabricante. Se equilibró la columna con tampón A (tampón de fosfato de sodio 20 mM a pH 7,2, NaCl 0,1 M) y se aplicó el sobrenadante de cultivo celular (500 ml) a la columna (10 ml) a una caudal de 3 ml/min. La columna se lavó con tampón A para retirar la muestra no unida. La proteína unida se eluyó usando un gradiente en dos etapas de tampón B (tampón de fosfato de sodio 20 mM a pH 7,2, NaCl 0,1 M, imidazol 0,5 M) de acuerdo con lo siguiente:
Etapa 1: tampón B al 20 % en 6 volúmenes de columna
Etapa 2: tampón B al 100 % en 6 volúmenes de columna
Las fracciones de proteína eluida a partir de la etapa 2 se agruparon para su purificación adicional. Todos los productos químicos eran de calidad de investigación y comprados de Sigma (Deisenhofen) o Merck (Darmstadt).
La cromatografía de filtración en gel se realizó en una columna de calidad prep HiLoad 16/60 Superdex 200 (GE/Amersham) equilibrada con tampón de equilibrado (citrato 25 mM, lisina 200 mM, glicerol al 5 %, a pH 7,2). Las muestras de proteína eluidas (caudal 1 ml/min) se sometieron a SDS-PAGE estándar y transferencia de bandas western para su detección. Antes de la purificación, se calibró la columna para la determinación del peso molecular (kit de marcadores de peso molecular, Sigma MW GF-200). Las concentraciones de proteína se determinaron usando la DO a 280 nm.
El fragmento de anticuerpo monocatenario en tándem biespecífico se analizó en SDS PAGE en condiciones reductoras realizad con geles Bis Tris preformados al 4-12 % (Invitrogen). La preparación y la aplicación de las muestras se realizaron de acuerdo con el protocolo proporcionado por el fabricante. Se determinó el peso molecular con patrón proteínico MultiMark (Invitrogen). El gel se tiñó con Coomassie coloidal (protocolo de Invitrogen). La pureza de la proteína aislada fue > 95 %, determinada por SDS-PAGE.
El fragmento de anticuerpo monocatenario en tándem biespecífico tiene un peso molecular de aproximadamente 52 kDa en condiciones nativas, determinado por filtración en gel en PBS. La transferencia de bandas western se realizó usando una membrana Optitran® BA-S83 y el módulo de transferencia de bandas de Invitrogen de acuerdo con el protocolo proporcionado por el fabricante. Se usaron anticuerpos dirigidos contra la marca His (Penta His, Qiagen) e Ig de cabra anti-ratón marcada con fosfatasa alcalina (AP) (Sigma) y BCIP/NBT (Sigma) como sustrato. Se detectó una única banda a 52 kD correspondiente al fragmento de anticuerpo monocatenario en tándem biespecífico purificado.
40.4 Análisis de unión por citometría de flujo del fragmento de anticuerpo monocatenario en tándem biespecífico específico de especies cruzadas de CD3 y antígeno de VHC
Con el fin de probar la funcionalidad del fragmento de anticuerpo monocatenario en tándem biespecífico específico de especies cruzadas con respecto a la capacidad de unión a antígeno de VHC y a CD3 humana y de macaco, respectivamente, se llevó a cabo un análisis de FACS. Para este propósito, se usaron células CHO transfectadas con antígeno E2 de VHC de dos genotipos diferentes de VHC (1a y 1b) como se describe en el ejemplo 40.1, la línea celular humana de leucemia de linfocitos T positivos para CD3 HPB-ALL (DSMZ, Braunschweig, ACC483) y la línea de linfocitos T de macaco 4119LnPx para probar la unión a los respectivos antígenos. Se incubaron 200.000 células de las respectivas líneas celulares durante 30 min en hielo con 50 µl de sobrenadante de cultivo celular de células transfectadas que expresaban la construcción de anticuerpo biespecífico específico de especies cruzadas. Se lavaron las células dos veces en PBS con FCS al 2 % y se detectó la unión del fragmento de anticuerpo monocatenario en tándem biespecífico con un anticuerpo murino anti-His (anticuerpo Penta His; Qiagen; diluido 1:20 en 50 µl de PBS con FCS al 2 %). Después del lavado, se detectaron anticuerpos anti-His unidos con un anticuerpo específico frente a Fc gamma (Dianova) conjugado con ficoeritrina, diluido 1:100 en PBS con FCS al 2 %. PBS con FCS al 2%.
Se realizó una citometría de flujo en un aparato FACS-Calibur; se usó el programa informático CellQuest para adquirir y analizar los datos (Becton Dickinson biosciences, Heidelberg). La tinción de FACS y la medida de la intensidad de fluorescencia se realizaron como se describe en Current Protocols in Immunology (Coligan, Kruisbeek, Margulies, Shevach y Strober, Wiley-lnterscience, 2002).
Como se muestra en la figura 67, la unión biespecífica del fragmento de anticuerpo monocatenario en tándem biespecífico al antígeno de VHC y a CD3 humana y de primate distinto de chimpancé era claramente detectable. En el análisis de FACS el fragmento de anticuerpo monocatenario en tándem biespecífico mostró unión a antígenos de CD3 y VHC en comparación con los controles negativos respectivos. Se demostró, por un lado, la especificidad de especies cruzadas del fragmento de anticuerpo monocatenario en tándem biespecífico para CD3 humana y de macaco, y por otro, la especificidad para VHC.
40.5 Bioactividad del fragmento de anticuerpo monocatenario en tándem biespecífico específico de especies cruzadas de CD3 y antígeno de VHC
Se analizó la bioactividad del fragmento de anticuerpo monocatenario en tándem biespecífico generado mediante ensayos de citotoxicidad in vitro de liberación de cromo 51 (51Cr) usando la línea celular positiva para antígeno de VHC descrita en el ejemplo 40.1. Como células efectoras se usaron PBMC humanas con eliminación de CD4/CD56 estimuladas de dos donantes diferentes.
Se recubrió una placa de Petri (145 mm de diámetro, Greiner bio-one GmbH, Kremsmunster) con un anticuerpo específico anti-CD3 comercialmente disponible (p. ej., OKT3, Othoclone) en una concentración final de 1 µg/ml durante 1 hora a 37 °C. La proteína no unida se retiró mediante una etapa de lavado con PBS. Se aislaron las PBMC recién obtenidas a partir de sangre periférica (30 - 50 ml de sangre humana) por centrifugación en gradiente de Ficoll de acuerdo con protocolos estándar. Se añadieron 3 - 5 x 107 PBMC a la placa de Petri recubierta previamente en 120 ml de RPMI 1640 con glutamina estabilizada / FCS al 10 % / 20 U/ml de IL-2 (Proleukin, Chiron) y se estimulan durante 2 días. Al tercer día se recogieron las células y se lavaron una vez con RPMI 1640. Se añadió IL-2 a una concentración final de 20 U/ml y se cultivaron de nuevo las células durante un día en el mismo medio de cultivo celular que anteriormente. Mediante la eliminación de linfocitos T CD4+ y linfocitos NK CD56+ de acuerdo con protocolos estándar, se enriquecen los linfocitos T citotóxicos (LTC) CD8+.
Las células objetivo se lavaron dos veces con PBS y se marcaron con 11,1 MBq de 51Cr en un volumen final de 100 µl de RPMI con FCS al 50 % durante 45 minutos a 37 °C. Posteriormente, las células objetivo marcadas se lavaron 3 veces con 5 ml de RPMI y después se usaron en el ensayo de citotoxicidad. El ensayo se realizó en una placa de 96 pocillos en un volumen total de 250 µl de RPMI suplementado (como anteriormente) con una proporción E:O de
10:1. Se aplicaron 76,4 µg/ml del fragmento de anticuerpo monocatenario en tándem biespecífico específico de especies cruzadas y 20 diluciones de dos veces del mismo. El tiempo de ensayo fue de 18 horas y la citotoxicidad se midió como valores relativos de cromo liberado en el sobrenadante en relación con la diferencia de lisis máxima (adición de Triton-X) y lisis espontánea (sin células efectoras). Todas las medidas se realizaron en cuadruplicados. La medida de la actividad del cromo en los sobrenadantes se realizó con un contador gamma Wizard 3" (Perkin Elmer Life Sciences GmbH, Colonia, Alemania). El análisis de los datos experimentales se realizó con Prism 4 para Windows (versión 4.02, GraphPad Software Inc., San Diego, California, EE. UU.).
Como se muestra en la figura 68, el fragmento de anticuerpo monocatenario en tándem biespecífico específico de especies cruzadas demostró actividad citotóxica contra células objetivo humanas positivas para antígeno de VHC.
41. Fragmentos de anticuerpo monocatenario en tándem biespecífico dirigidos contra CD3 humana y de primate distinto de chimpancé y contra antígenos del virus de la hepatitis presentados sobre la superficie de células infectadas
41.1 Virus de la hepatitis B (VHB)
Se usaron los siguientes oligonucleótidos degenerados, que solapan mutuamente en un tramo terminal de aproximadamente 15-20 nucleótidos y en los que cada segundo cebador es un cebador antisentido, para proporcionar un contexto de secuencia VH humana para la CDRH1 (SEQ ID 1634), la CDRH2 (SEQ ID 1635) y la CDRH3 (SEQ ID 1636):
5 Este conjunto de cebadores abarca la secuencia de VH completa. Dentro de este conjunto, se mezclaron los cebadores en cantidades iguales (p. ej., 1 µl de cada cebador (soluciones madre de cebador de 20 a 100 µM) a una reacción de PCR de 20 µl) y se añadieron a una mezcla de PCR que consistía en tampón de PCR, nucleótidos y polimerasa Taq. Esta mezcla se incubó a 94 °C durante 3 minutos, a 65 °C durante 1 minuto, a 62 °C durante 1 minuto, a 59 °C durante 1 minuto, a 56 °C durante 1 minuto, a 52 °C durante 1 minuto, a 50 °C durante 1 minuto y a
10 72 °C durante 10 minutos en un ciclador de PCR. Posteriormente se hizo correr el producto en una electroforesis en gel de agarosa y se aisló el producto de un tamaño de 200 a 400 a partir del gel de acuerdo con procedimientos estándar.
El producto de PCR de VH se usó después como molde para una reacción de PCR estándar usando cebadores que incorporan sitios de restricción para clonación N-terminales y C-terminales adecuados (cebador 5'C8-VH-A-Xhol y
15 cebador 3'C8-VH-E-BstEII). El fragmento de ADN del tamaño correcto (para una VH, aproximadamente 350 nucleótidos) se aisló mediante electroforesis en gel de agarosa de acuerdo con procedimientos estándar. De este modo, se amplificó suficiente fragmento de ADN de VH.
Se usaron los siguientes oligonucleótidos degenerados, que solapan mutuamente en un tramo terminal de aproximadamente 15-20 nucleótidos y en los que cada segundo cebador es un cebador antisentido, para
20 proporcionar un contexto de secuencia VL humana para la CDRL1 (SEQ ID 1639), la CDRL2 (SEQ ID 1640) y la CDRL3 (SEQ ID 1641), que acompañaban a la CDRH1 (SEQ ID 1634), la CDRH2 (SEQ ID 1635) y la CDRH3 (SEQ ID 1636):
Este conjunto de cebadores abarca la secuencia de VL completa. Dentro de este conjunto, se mezclaron los cebadores en cantidades iguales (p. ej., 1 µl de cada cebador (soluciones madre de cebador de 20 a 100 µM) a una reacción de PCR de 20 µl) y se añadieron a una mezcla de PCR que consistía en tampón de PCR, nucleótidos y polimerasa Taq. Esta mezcla se incubó a 94 °C durante 3 minutos, a 65 °C durante 1 minuto, a 62 °C durante 1 minuto, a 59 °C durante 1 minuto, a 56 °C durante 1 minuto, a 52 °C durante 1 minuto, a 50 °C durante 1 minuto y a 72 °C durante 10 minutos en un ciclador de PCR. Posteriormente se hace correr el producto en una electroforesis en gel de agarosa y se aisló el producto de un tamaño de 200 a 400 a partir del gel de acuerdo con procedimientos estándar. El producto de PCR de VL se usó después como molde para una reacción de PCR estándar usando cebadores que incorporan sitios de restricción para clonación N-terminales y C-terminales adecuados (cebador 5'C8VI-A-Sacl y cebador 3'C8-VI-E-BsiWI/Spel). El fragmento de ADN del tamaño correcto (para una VL, aproximadamente 330 nucleótidos) se aisló mediante electroforesis en gel de agarosa de acuerdo con procedimientos estándar. De este modo, se amplificó suficiente fragmento de ADN de VL.
El producto final de PCR de VH (es decir, el repertorio de VH humanas/humanizadas) se combinó después con su producto final de PCR de VL correspondiente (es decir, el repertorio de VL humanas/humanizadas) en el vector de presentación en fagos pComb3H5Bhis para formar una colección de fragmentos de anticuerpo scFv funcionales de entre los que, tras la presentación en fagos filamentosos, se seleccionaron, cribaron, identificaron y confirmaron agentes de unión anti-HBS como se describe a continuación:
Se ligaron 450 ng de los fragmentos de cadena ligera (digeridos con Sacl-Spel) con 1400 ng del fagémido pComb3H5Bhis (digerido con Sacl-Spel; fragmento grande). La colección de anticuerpos combinatoria resultante se transformó después en 300 μl de células de Escherichia coli XL1 Blue electrocompetentes por electroporación (2,5 kV, cubeta de 0,2 cm de paso, 25 uFD, 200 Ohm, Biorad Gen Pulser) dando lugar a un tamaño de colección de más de 107 clones independientes. Después de una hora de expresión del fenotipo, se seleccionaron los transformantes positivos por su resistencia a carbenicilina codificada por el vector pComb3H5BHis en 100 ml cultivo en super broth líquido (SB) durante la noche. Después, se recogieron las células por centrifugación y se llevó a cabo la preparación de plásmidos usando un kit de preparación de plásmidos comercialmente disponible (Qiagen).
Se ligaron 2800 ng de este ADN plasmídico que contenía la colección VK (digerido con Xhol-BstEII; fragmento grande) con 900 ng de los fragmentos V de cadena pesada (digeridos con Xhol-BstEII) y se transformaron de nuevo en dos alícuotas de 300 µl de células de E. coli XL1 Blue electrocompetentes por electroporación (2,5 kV, cubeta de 0,2 cm de paso, 25 uFD, 200 Ohm) dando lugar a un tamaño total de colección de scFv VH-VK (fragmento variable monocatenario) de más de 107 clones independientes.
Después de la expresión del fenotipo y la adaptación lenta a la carbenicilina, se transfirieron las células de E. coli que contenían la colección de anticuerpos a medio de selección SB-carbenicilina (50 µg/ml). Después, se infectaron las células de E. coli que contenían la colección de anticuerpos con una dosis infecciosa de 1012 partículas de fago colaborador VCSM13, dando lugar a la producción y secreción de fagos filamentosos M13, en el que la partícula de fago contiene ADN de pComb3H5BHis monocatenario que codifica un fragmento de anticuerpo scFv y presentaba el fragmento de anticuerpo scFv correspondiente como una fusión traduccional a la proteína de cubierta III del fago. Este conjunto de fagos que presentaban la colección de anticuerpos se usó para la selección de entidades de unión a antígeno.
Análogamente, se aplicó el procedimiento anterior para otro agente de unión objetivo. Para este propósito, se usaron los siguientes oligonucleótidos degenerados, que solapan mutuamente en un tramo terminal de aproximadamente 15-20 nucleótidos y en los que cada segundo cebador es un cebador antisentido, para proporcionar un contexto de secuencia VH humana para la CDRH1 (SEQ ID 1669), la CDRH2 (SEQ ID 1670) y la CDRH3 (SEQ ID 1671):
Como cebadores para la reacción final de PCR estándar para incorporar sitios de restricción para clonación Nterminales y C-terminales adecuados en VH, se usaron los oligonucleótidos 5'C9-VH-A-Xhol y 3'C9-VH-E-BstEII.
10 Del mismo modo que para VH, se usaron los siguientes oligonucleótidos degenerados, que solapan mutuamente en un tramo terminal de aproximadamente 15-20 nucleótidos y en los que cada segundo cebador es un cebador antisentido, para proporcionar un contexto de secuencia VL humana para la CDRL1 (SEQ ID 1672), la CDRL2 (SEQ ID 1673) y la CDRL3 (SEQ ID 1674), que acompañan a la CDRH1 (SEQ ID 1669), la CDRH2 (SEQ ID 1670) y la CDRH3 (SEQ ID 1671):
Como cebadores para la reacción final de PCR estándar para incorporar sitios de restricción para clonación Nterminales y C-terminales adecuados en VL, se usaron los oligonucleótidos 5'C9-VI-A-Sacl y 3'C9-VI-E-BsiWI/SpelI.
Para la selección de entidades de unión a antígeno, se recogió la colección de fagos portadores del repertorio de scFv clonado del correspondiente sobrenadante de cultivo mediante precipitación con PEG (polietilenglicol) 8000/NaCI y centrifugación. Se resuspenden de aproximadamente 1011 a 1012 partículas de fago scFv en 0,4 ml de PBS/BSA al 0,1 % y se incuban con antígeno de HBS inmovilizado (p. ej., EngerixR -B, GlaxoSmithKline, Alemania; HBvaxProTM, Aventis Pasteur MSD SNC, Francia) durante 2 h con agitación suave a 37 °C. Se recubrió el antígeno de HBS inmovilizado (p. ej., 5 µg/ml de PBS) en los pocillos y a continuación se bloquearon los pocillos de acuerdo con protocolos estándar.
Las partículas de fago que presentaban fragmentos de anticuerpo scFv que no se unen específicamente al antígeno objetivo se eliminaron mediante etapas de lavado con PBS/BSA al 0,1 % (se puede añadir Tween 20 a la solución de lavado para aumentar la rigurosidad del lavado). Después del lavado, se eluyeron entidades de unión usando HCIglicina a pH 2,2 y, tras la neutralización con Tris 2 M a pH 12, se usó el eluato para la infección de un cultivo recién preparado de E. coli XL1 Blue no infectadas.
Para eluir las entidades de unión fuerte que quedan en los pocillos eluidos, se añadieron 200 µl de un cultivo recién preparado de E. coli XL1 blue (DO600 > 0,5) a los pocillos eluidos y se incubaron durante otros 10 minutos con agitación suave. Después, se mezclaron ambos cultivos de E. coli y las células transducidas exitosamente con una copia de fagémido, que codifica un fragmento de anticuerpo scFv humano, se seleccionaron de nuevo por su resistencia a carbenicilina y se infectaron posteriormente con el fago colaborador VCMS 13 para comenzar el segundo ciclo de presentación de anticuerpos y selección in vitro. Normalmente, se llevaron a cabo un total de 4 a 5 ciclos de selección.
Con el fin de cribar los agentes de unión específicos de HBS, se aisló ADN plasmídico correspondiente a 4 y 5 ciclos de fijación a partir de cultivos de E. coli después de la selección. Para la producción de fragmento de anticuerpo scFv soluble, se escindieron fragmentos de ADN VH-VL de los plásmidos (Xhol-Spel). Estos fragmentos se clonaron por medio de los mismos sitios de restricción en el plásmido pComb3H5BFlag/His que difería del pComb3H5BHis original en que la construcción de expresión (p. ej., el fragmento de anticuerpo scFv) incluye una marca Flag (DYKDDDDK) entre el fragmento de anticuerpo scFv y la marca His6 y las proteínas de fago adicionales se eliminaron. Después de la ligación, se transformó cada conjunto (distintos ciclos de fijación) de ADN plasmídico en 100 µl de E. coli TG1 o XLI Blue competentes para choque térmico y se plaquearon sobre LB-agar con carbenicilina.
Se tomaron colonias individuales en 100 μl de LB carb (50 μg/ml).
Las E. coli transformadas con pComb3H5BHis que contenían un segmento VL y VH producen fragmento de anticuerpo scFv soluble en cantidades suficientes después de la escisión del fragmento del gen III y la inducción con IPTG 1 mM Debido a una secuencia señal adecuada, se exportó el fragmento de anticuerpo scFv al periplasma, donde se pliega en una conformación funcional.
Se tomaron colonias individuales bacterianas de E. coli TG1 de las placas de transformación para preparaciones periplásmicas a pequeña escala y se hicieron crecer en medio SB (p. ej., 10 ml) suplementado con MgCl2 20 mM y 50 µg/ml de carbenicilina (y se redisolvieron en PBS (p. ej., 1 ml) después de recogerlas. Mediante cuatro ciclos de congelación a -70 °C y descongelación a 37 °C, se destruyó la membrana externa de las bacterias por choque térmico y se liberaron las proteínas solubles periplásmicas, incluidos los fragmentos de anticuerpo scFv, al sobrenadante. Después de la eliminación de las células intactas y los desechos celulares por centrifugación, se recogió el sobrenadante que contenía los fragmentos de anticuerpo scFv anti-HBS y se usó para la identificación de agentes de unión específicos de HBS como sigue:
Se recubrió antígeno de HBS sobre placas de 96 pocillos de plástico (Nunc, maxisorb), típicamente a 4 °C durante la noche. Se lavaron los pocillos una vez con PBS/Tween 20 al 0,05 % y posteriormente se bloquearon con PBS/BSA al 3 % durante al menos una hora. Después de retirar la solución de bloqueo, se añadieron las preparaciones de periplasma y las soluciones de control a los pocillos y, típicamente, se incubaron durante una hora a temperatura ambiente. Después, se lavaron los pocillos tres veces con PBS/Tween 20 al 0,05% . La detección de fragmentos de anticuerpo scFv y anticuerpos de control unidos a antígeno inmovilizado se llevó a cabo usando un anticuerpo monoclonal murino anti-His6 o anti-marca FLAG (Qiagen anti-PentaHis y M2 anti-Flag Sigma, típicamente, cada uno a una concentración final de 1 µg/ml de PBS) detectado con un anticuerpo policlonal de cabra marcado con peroxidasa anti-fragmento Fab de ratón (Dianova,1 µg/ml de PBS). La señal se reveló mediante la adición de solución de sustrato ABTS y se midió a una longitud de onda de 405 nm. Se examinó la unión inespecífica de las muestras de prueba al agente de bloqueo llevando a cabo ensayos idénticos con reactivos idénticos y esquema temporal idéntico sobre placas de ELISA que no estaban recubiertas con antígeno, sino bloqueadas con BSA solo.
Para excluir la posibilidad de que la unión positiva se pudiera deber a la unión a BSA (que se debe usar como agente de bloqueo en el primer experimento de ELISA), se realizó un segundo experimento de ELISA en paralelo. En este segundo experimento de ELISA, todos los parámetros fueron idénticos a los del primer experimento de ELISA, excepto porque en el segundo experimento de ELISA no se produce recubrimiento con antígeno, sino sólo bloqueo con BSA.
Con el fin de identificar los fragmentos de anticuerpo scFv específicos de HBS identificados por ELISA, que también se unen a antígeno de HBS presentado sobre la superficie de células infectadas por el VHB, se llevó a cabo una inmunofluorescencia indirecta con fragmento de anticuerpo scFv marcado con FLAG seguido de anticuerpo anti-FLAG conjugado con FITC sobre células HepG2.2.15 (Bohne F, Chmielewski M, Ebert G, et al. T cells redirected against hepatitis B virus surface proteins eliminate infected hepatocytes. Gastroenterology 2008; 134:239-47) de acuerdo con protocolos estándar (p. ej., Current Protocols in Immunology, Coligan, Kruisbeek, Margulies, Shevach y Strober, Wiley-lnterscience, 2002, unidad 21.3). Las células HepG2 no infectadas sirvieron como control negativo. Las condiciones de cultivo de células HepG2.2.15 para su presentación óptima de antígeno de HBS sobre la superficie celular fueron descritas por Bohne et al. (Bohne F, Chmielewski M, Ebert G, et al. T cells redirected against hepatitis B virus surface proteins eliminate infected hepatocytes. Gastroenterology 2008; 134:239-47).
Después, se analizaron los clones de unión específica confirmada al antígeno de HBS sobre la superficie de células infectadas por el VHB para determinar propiedades proteínicas favorables y la secuencia de aminoácidos. Se convirtieron los fragmentos de anticuerpo scFv específicos de HBS en fragmentos de anticuerpo monocatenario en tándem biespecífico recombinante uniéndolos por medio de un enlazador Gly4Ser1 con el fragmento de anticuerpo scFv específico de CD3 I2C (SEQ ID 185) o cualquier otro fragmento de anticuerpo scFv específico de CD3 de la invención para dar lugar a construcciones con la disposición de dominios VHMuc1 - (Gly4Ser1)3 -VLMUC1 Gly4Ser1 -VHCD3 - (Gly4Ser1)3 - VLCD3 o disposiciones de dominios alternativas. Para la expresión en células CHO, las secuencias codificantes de (i) un líder N-terminal de cadena pesada de inmunoglobulina que comprende un codón de inicio incluido en una secuencia de consenso de Kozak y (ii) una marca His6 C-terminal seguida de un codón de detención, se unieron en fase con la secuencia de nucleótidos que codifica los fragmentos de anticuerpo monocatenario en tándem biespecífico antes de la inserción del fragmento de ADN resultante obtenido por síntesis génica en el sitio de clonación múltiple del vector de expresión pEF-DHFR (Raum et al. Cancer Immunol Immunother 50 (2001) 141-150). La transfección estable de células CHO deficientes en DHFR, la selección de transfectantes positivos para DHFR que segregaban los anticuerpos monocatenarios biespecíficos en el sobrenadante de cultivo y la amplificación de genes con metotrexato para aumentar los niveles de expresión se llevaron a cabo como se describe (Mack et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 (1995) 7021-7025). Todos los demás procedimientos del estado de la técnica se llevaron a cabo de acuerdo con protocolos estándar (Sambrook, Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 3ª edición, Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, Nueva York (2001)).
Los fragmentos de anticuerpo monocatenario en tándem biespecífico funcionales se identificaron por ELISA y citometría de flujo usando sobrenadante de cultivo de células CHO transfectadas. Para este propósito, se probó la unión a CD3 sobre la línea celular humana de leucemia de linfocitos T positivos para CD3 HPB-ALL (DSMZ, Braunschweig, ACC483) y sobre la línea de linfocitos T de macaco 4119LnPx. Se incubaron 200.000 células de la línea celular correspondiente durante 30 min en hielo con 50 µl de sobrenadante de cultivo celular. Se lavaron las células dos veces en PBS con FCS al 2 % y se detectó el fragmento de anticuerpo monocatenario en tándem biespecífico unido con un anticuerpo murino anti-His (anticuerpo Penta His; Qiagen; diluido 1:20 en 50 µl de PBS con FCS al 2 %). Después del lavado, se detectaron anticuerpos anti-His unidos con un anticuerpo específico frente a Fc gamma (Dianova) conjugado con ficoeritrina, diluido 1:100 en PBS con FCS al 2 %. Se usó sobrenadante de células CHO no transfectadas como control negativo.
Se realizó una citometría de flujo en un aparato FACS-Calibur; se usa el programa informático CellQuest para adquirir y analizar los datos (Becton Dickinson biosciences, Heidelberg). La tinción FACS y la medida de la intensidad de fluorescencia se realizan como se describe en Current Protocols in Immunology (Coligan, Kruisbeek, Margulies, Shevach y Strober, Wiley-lnterscience, 2002). Se probó la unión a antígeno de HBS por ELISA como se describe anteriormente. Se llevó a cabo la detección de fragmento de anticuerpo monocatenario en tándem biespecífico unido usando un anticuerpo monoclonal murino anti-His6 (anti-PentaHis de Qiagen, típicamente a una concentración final de 1 µg/ml de PBS) seguido de un anticuerpo policlonal de cabra marcado con peroxidasa antifragmento Fab de ratón (Dianova, 1 µg/ml de PBS).
Sólo se seleccionaron para su uso posterior las construcciones que mostraban unión biespecífica a CD3 humana y de macaco, así como a antígeno de HBS.
Para la producción de proteínas, las células CHO que expresaban fragmentos de anticuerpo monocatenario en tándem biespecífico totalmente funcionales y adaptadas a medio líquido de soja HyQ PF CHO sin nucleósidos (con L-glutamina 4,0 mM con Pluronic F-68 al 0,1 %; HyClone) se hicieron crecer en frascos rotatorios durante 7 días. Se retiró el sobrenadante de cultivo de las células por centrifugación y se almacenó a -20 °C hasta su purificación. Como equipo de cromatografía para la purificación del fragmento de anticuerpo monocatenario en tándem a partirdel sobrenadante de cultivo, se usaron el sistema de exploración Äkta® (GE Health Systems) y el programa informático Unicorn®. Se realizó una cromatografía de afinidad de metales inmovilizados ("IMAC") usando un quelato Fractogel EMD® (Merck) que se cargó con ZnCl2 de acuerdo con el protocolo proporcionado por el fabricante. Se equilibró la columna con tampón A (tampón de fosfato de sodio 20 mM a pH 7,2, NaCl 0,1 M) y se aplicó el sobrenadante de cultivo celular (500 ml) a la columna (10 ml) a una caudal de 3 ml/min. La columna se lavó con tampón A para retirar la muestra no unida. La proteína unida se eluyó usando un gradiente en dos etapas de tampón B (tampón de fosfato de sodio 20 mM a pH 7,2, NaCl 0,1 M, imidazol 0,5 M) de acuerdo con lo siguiente:
Etapa 1: tampón B al 20 % en 6 volúmenes de columna
Etapa 2: tampón B al 100 % en 6 volúmenes de columna
Las fracciones de proteína eluida a partir de la etapa 2 se agruparon para su purificación adicional. Todos los productos químicos son de calidad de investigación y comprados de Sigma (Deisenhofen) o Merck (Darmstadt).
La cromatografía de filtración en gel se realizó en una columna de calidad prep HiLoad 16/60 Superdex 200 (GE/Amersham) equilibrada con tampón de equilibrado (citrato 25 mM, lisina 200 mM, glicerol al 5 %, a pH 7,2). Las muestras de proteína eluidas (caudal 1 ml/min) se sometieron a SDS-PAGE estándar y transferencia de bandas western para su detección. Antes de la purificación, se calibró la columna para la determinación del peso molecular (kit de marcadores de peso molecular, Sigma MW GF-200). Las concentraciones de proteína se determinan usando la DO a 280 nm.
El fragmento de anticuerpo monocatenario en tándem biespecífico purificado se analizó en SDS PAGE en condiciones reductoras realizad con geles Bis Tris preformados al 4-12 % (Invitrogen). La preparación y la aplicación de las muestras se realizaron de acuerdo con el protocolo proporcionado por el fabricante. Se determinó el peso molecular con patrón proteínico MultiMark (Invitrogen). El gel se tiñó con Coomassie coloidal (protocolo de Invitrogen). La pureza de la proteína aislada fue > 95 %, determinada por SDS-PAGE.
El fragmento de anticuerpo monocatenario en tándem biespecífico tiene un peso molecular de aproximadamente 52 kDa en condiciones nativas, determinado por filtración en gel en PBS. Todas las construcciones se purificaron de acuerdo con este procedimiento.
La transferencia de bandas western se realizó usando una membrana Optitran® BA-S83 y el módulo de transferencia de bandas de Invitrogen de acuerdo con el protocolo proporcionado por el fabricante. Para la detección de los fragmentos de anticuerpo monocatenario en tándem biespecífico se usó un anticuerpo anti-marca His (Penta His, Qiagen). Como anticuerpo secundario se usó un anticuerpo Ig de cabra anti-ratón marcado con fosfatasa alcalina (AP) (Sigma) y como sustrato, BCIP/NBT (Sigma). Se detectó una única banda a 52 kD correspondiente al fragmento de anticuerpo monocatenario en tándem biespecífico purificado.
Se determinó la potencia de los fragmentos de anticuerpo monocatenario en tándem biespecífico que interaccionan con CD3 humana y de macaco y con antígeno de HBS en el sistema humano y de primate distinto de chimpancé mediante un ensayo de citotoxicidad no radioactivo usando células HepG2.2.15 como células objetivo como se describe por Bohne et al. (Bohne F, Chmielewski M, Ebert G, et al. T cells redirected against hepatitis B virus surface proteins eliminated infected hepatocytes. Gastroenterology 2008; 134:239-47) y PBMC humanas con eliminación de CD4/CD56 estimuladas o la línea de linfocitos T de macaco 4119LnPx en lugar de linfocitos T transducidos con un receptor de linfocitos T quiméricos como células efectoras. Con el fin de obtener curvas de respuesta a dosis, en el ensayo de citotoxicidad se valoró la concentración de cada fragmento de anticuerpo monocatenario en tándem biespecífico (en lugar de la proporción E:O como se describe por Bohne et al.) a una proporción de E:O fija (p. ej.
10:1 o 5:1).
La generación de PBMC humanas estimuladas se realizó como sigue:
Se recubrió una placa de Petri (85 mm de diámetro, Nunc) con un anticuerpo específico anti-CD3 comercialmente disponible (p. ej., OKT3, Othoclone) en una concentración final de 1 µg/ml durante 1 hora a 37 °C. La proteína no unida se retiró mediante una etapa de lavado con PBS. Se aislaron las PBMC recién obtenidas a partir de sangre periférica (30 - 50 ml de sangre humana) por centrifugación en gradiente de Ficoll de acuerdo con protocolos estándar. Se añadieron 3 - 5 x 107 PBMC a la placa de Petri recubierta previamente en 50 ml de RPMI 1640 con glutamina estabilizada / FCS al 10 % / 20 U/ml de IL-2 (Proleukin, Chiron) y se estimulan durante 2 días. Al tercer día se recogieron las células y se lavaron una vez con RPMI 1640. Se añadió IL-2 a una concentración final de 20 U/ml y se cultivaron de nuevo las células durante un día en el mismo medio de cultivo celular que anteriormente.
El análisis de los datos experimentales del ensayo de citotoxicidad se realizó con Prism 4 para Windows (versión 4.02, GraphPad Software Inc., San Diego, California, EE. UU.). Típicamente, las curvas sigmoidales de respuesta a 5 dosis tienen valores de R2 > 0,90, determinados por el programa informático. Se calcularon los valores de EC50 como medida de la potencia mediante el programa de análisis.
41.2 Virus de la hepatitis C (VHC)
Se usan los siguientes oligonucleótidos degenerados, que solapan mutuamente en un tramo terminal de aproximadamente 15-20 nucleótidos y en los que cada segundo cebador es un cebador antisentido, para 10 proporcionar un contexto de secuencia VH humana para la CDRH1 (SEQ ID 1652), la CDRH2 (SEQ ID 1653) y la CDRH3 (SEQ ID 1654):
Este conjunto de cebadores abarca la secuencia de VH completa. Dentro de este conjunto, se mezclaron los cebadores en cantidades iguales (p. ej., 1 µl de cada cebador (soluciones madre de cebador de 20 a 100 µM) a una 20 reacción de PCR de 20 µl) y se añadieron a una mezcla de PCR que consistía en tampón de PCR, nucleótidos y polimerasa Taq. Esta mezcla se incubó a 94 °C durante 3 minutos, a 65 °C durante 1 minuto, a 62 °C durante 1 minuto, a 59 °C durante 1 minuto, a 56 °C durante 1 minuto, a 52 °C durante 1 minuto, a 50 °C durante 1 minuto y a 72 °C durante 10 minutos en un ciclador de PCR. Posteriormente se hizo correr el producto en una electroforesis en gel de agarosa y se aisló el producto de un tamaño de 200 a 400 a partir del gel de acuerdo con procedimientos
25 estándar.
El producto de PCR de VH se usó después como molde para una reacción de PCR estándar usando cebadores que incorporan sitios de restricción para clonación N-terminales y C-terminales adecuados (cebador 5'HCI-VH-A-Xhol y cebador 3'HC1-VH-F-BstEII). El fragmento de ADN del tamaño correcto (para una VH, aproximadamente 350 nucleótidos) se aisló mediante electroforesis en gel de agarosa de acuerdo con procedimientos estándar. De este modo, se amplificó suficiente fragmento de ADN de VH.
Se usaron los siguientes oligonucleótidos degenerados, que solapan mutuamente en un tramo terminal de
5 aproximadamente 15-20 nucleótidos y en los que cada segundo cebador era un cebador antisentido, para proporcionar un contexto de secuencia VL humana para la CDRL1 (SEQ ID 1657), la CDRL2 (SEQ ID 1658) y la CDRL3 (SEQ ID 1659), que acompañaban a la CDRH1 (SEQ ID 1652), la CDRH2 (SEQ ID 1653) y la CDRH3 (SEQ ID HC1 1654):
15 Este conjunto de cebadores abarca la secuencia de VL completa. Dentro de este conjunto, se mezclaron los cebadores en cantidades iguales (p. ej., 1 µl de cada cebador (soluciones madre de cebador de 20 a 100 µM) a una reacción de PCR de 20 µl) y se añadieron a una mezcla de PCR que consistía en tampón de PCR, nucleótidos y polimerasa Taq. Esta mezcla se incubó a 94 °C durante 3 minutos, a 65 °C durante 1 minuto, a 62 °C durante 1 minuto, a 59 °C durante 1 minuto, a 56 °C durante 1 minuto, a 52 °C durante 1 minuto, a 50 °C durante 1 minuto y a
20 72 °C durante 10 minutos en un ciclador de PCR. Posteriormente se hizo correr el producto en una electroforesis en gel de agarosa y se aisló el producto de un tamaño de 200 a 400 a partir del gel de acuerdo con procedimientos estándar.
El producto de PCR de VL resultante se usó después como molde para una reacción de PCR estándar usando cebadores que incorporan sitios de restricción para clonación N-terminales y C-terminales adecuados (cebador
25 5'HC1-VI-A-Sacl y cebador 3'HC1-VI-E-BsiWI/Spel). El fragmento de ADN del tamaño correcto (para una VL, aproximadamente 330 nucleótidos) se aisló mediante electroforesis en gel de agarosa de acuerdo con procedimientos estándar. De este modo, se amplificó suficiente fragmento de ADN de VL.
El producto final de PCR de VH (es decir, el repertorio de VH humanas/humanizadas) se combinó después con su producto final de PCR de VL correspondiente (es decir, el repertorio de VL humanas/humanizadas) en el vector de 30 presentación en fagos pComb3H5Bhis para formar una colección de fragmentos de anticuerpo scFv funcionales de
entre los que, tras la presentación en fagos filamentosos, se seleccionaron, cribaron, identificaron y confirmaron agentes de unión anti-HBS como se describe a continuación:
Se ligan 450 ng de los fragmentos de cadena ligera (digeridos con Sacl-Spel) con 1400 ng del fagémido pComb3H5Bhis (digerido con Sacl-Spel; fragmento grande). La colección de anticuerpos combinatoria resultante se transformó después en 300 μl de células de Escherichia coli XL1 Blue electrocompetentes por electroporación (2,5 kV, cubeta de 0,2 cm de paso, 25 uFD, 200 Ohm, Biorad Gen Pulser) dando lugar a un tamaño de colección de más de 107 clones independientes. Después de una hora de expresión del fenotipo, se seleccionaron los transformantes positivos por su resistencia a carbenicilina codificada por el vector pComb3H5BHis en 100 ml cultivo en super broth líquido (SB) durante la noche. Después, se recogen las células por centrifugación y se llevó a cabo la preparación de plásmidos usando un kit de preparación de plásmidos comercialmente disponible (Qiagen).
Se ligaron 2800 ng de este ADN plasmídico que contenía la colección VL (digerido con Xhol-BstEII; fragmento grande) con 900 ng de los fragmentos V de cadena pesada (digeridos con Xhol-BstEII) y se transformaron de nuevo en dos alícuotas de 300 µl de células de E. coli XL1 Blue electrocompetentes por electroporación (2,5 kV, cubeta de 0,2 cm de paso, 25 uFD, 200 Ohm) dando lugar a un tamaño total de colección de scFv VH-VK (fragmento variable monocatenario) de más de 107 clones independientes.
Después de la expresión del fenotipo y la adaptación lenta a la carbenicilina, se transfirieron las células de E. coli que contenían la colección de anticuerpos a medio de selección SB-carbenicilina (50 µg/ml). Después, se infectaron las células de E. coli que contenían la colección de anticuerpos con una dosis infecciosa de 1012 partículas de fago colaborador VCSM13, dando lugar a la producción y secreción de fagos filamentosos M13, en el que la partícula de fago contiene ADN de pComb3H5BHis monocatenario que codifica un fragmento de anticuerpo scFv y presentaba el fragmento de anticuerpo scFv correspondiente como una fusión traduccional a la proteína de cubierta III del fago. Este conjunto de fagos que presentaban la colección de anticuerpos se usó para la selección de entidades de unión a antígeno.
Para este propósito, se recogió la colección de fagos portadores del repertorio clonado de fragmentos de anticuerpo scFv del correspondiente sobrenadante de cultivo mediante precipitación con PEG8000/NaCI y centrifugación. Se resuspenden de aproximadamente 1011 a 1012 partículas de fago que presentaban fragmento de anticuerpo scFv en 0,4 ml de PBS/BSA al 0,1 % y se incuban con de 105 a 107 células CHO transfectadas con antígeno de VHC E2 de VHC de genotipos 1a y/o 1b como se describe en el ejemplo 40.1 durante 1 hora en hielo con agitación lenta. Estas células CHO transfectadas con antígeno de VHC se recogieron por adelantado por centrifugación, se lavaron en PBS y se resuspendieron en PBS/FCS al 1 % (que contenía azida de Na). Las partículas de fago que presentaban fragmentos de anticuerpo scFv que no se unen específicamente a las células CHO transfectadas con antígeno de VHC, se eliminaron mediante hasta cinco etapas de lavado con PBS/FCS al 1 % (que contenía azida de Na). Después del lavado, se eluyeron entidades de unión de las células resuspendiendo las células en HCI-glicina a pH 2,2 (10 min de incubación con agitación en vórtex posterior) y tras la neutralización con Tris 2 M a pH 12, se usó el eluato para la infección de un cultivo recién preparado de células de E. coli XL1 Blue no infectadas (DO600 > 0,5). El cultivo de E. coli contenía células de E. coli transducidas exitosamente con una copia de fagémido, que codifica un fragmento de anticuerpo scFv humano/humanizado; se seleccionaron de nuevo por su resistencia a carbenicilina y se infectaron posteriormente con el fago colaborador VCMS 13 para iniciar el segundo ciclo de presentación de anticuerpos y selección in vitro. Normalmente, se llevan a cabo un total de 4 a 5 ciclos de selección.
Con el fin de cribar los agentes de unión específicos de HBS, se aisló ADN plasmídico correspondiente a 4 y 5 ciclos de fijación a partir de cultivos de E. coli después de la selección. Para la producción de fragmento de anticuerpo scFv soluble, se escindieron fragmentos de ADN VH-VL de los plásmidos (Xhol-Spel). Estos fragmentos se clonaron por medio de los mismos sitios de restricción en el plásmido pComb3H5BFlag/His que difería del pComb3H5BHis original en que la construcción de expresión (p. ej., el fragmento de anticuerpo scFv) incluye una marca Flag (DYKDDDDK) entre el fragmento de anticuerpo scFv y la marca His6 y las proteínas de fago adicionales se eliminaron. Después de la ligación, se transformó cada conjunto (distintos ciclos de fijación) de ADN plasmídico en 100 µl de E. coli TG1 o XLI Blue competentes para choque térmico y se plaquearon sobre LB-agar con carbenicilina.
Se tomaron colonias individuales en 100 μl de LB carb (50 μg/ml).
Las E. coli transformadas con pComb3H5BHis que contenían un segmento VL y VH producen fragmento de anticuerpo scFv soluble en cantidades suficientes después de la escisión del fragmento del gen III y la inducción con IPTG 1 mM Debido a una secuencia señal adecuada, se exportó el fragmento de anticuerpo scFv al periplasma, donde se pliega en una conformación funcional.
Se tomaron colonias individuales bacterianas de E. coli TG1 de las placas de transformación para preparaciones periplásmicas a pequeña escala y se hicieron crecer en medio SB (p. ej., 10 ml) suplementado con MgCl2 20 mM y 50 µg/ml de carbenicilina (y se redisolvieron en PBS (p. ej., 1 ml) después de recogerlas. Mediante cuatro ciclos de congelación a -70 °C y descongelación a 37 °C, se destruyó la membrana externa de las bacterias por choque térmico y se liberan las proteínas solubles periplásmicas, incluidos los fragmentos de anticuerpo scFv, al sobrenadante. Después de la eliminación de las células intactas y los desechos celulares por centrifugación, se recogió el sobrenadante que contenía los fragmentos de anticuerpo scFv anti-VHC y se usó para la identificación de agentes de unión específicos de antígeno de VHC como sigue:
Se prueba la unión de fragmentos de anticuerpo scFv al VHC por citometría de flujo en células CHO transfectadas con antígeno de VHC; se usaron células CHO no transfectadas como control negativo.
Para la citometría de flujo, se incubaron 2,5x105 células con 50 µl de preparación periplásmica de fragmento de anticuerpo scFv o con 5 µg/ml de fragmentos de anticuerpo scFv purificados en 50 µl de PBS con FCS al 2 %. Se detectó la unión de fragmento de anticuerpo scFv con un anticuerpo anti-His (anticuerpo Penta-His, sin BSA, Qiagen GmbH, Hilden, RFA) a 2 µg/ml en 50 µl de PBS con FCS al 2 %. Como reactivo de segunda etapa se usó un fragmento F(ab')2 purificado por afinidad conjugado con R-ficoeritrina de IgG de cabra anti-ratón (específico de fragmento Fc-gamma), diluido 1:100 en 50 µl de PBS con FCS al 2 % (Dianova, Hamburgo, RFA). Las muestras se midieron en un FACSscan (BD biosciences, Heidelberg, RFA).
Después, se analizaron clones individuales para detectar propiedades y secuencias de aminoácidos favorables. Se convirtieron los fragmentos de anticuerpo scFv específicos de VHC en fragmentos de anticuerpo monocatenario en tándem biespecífico recombinante uniéndolos por medio de un enlazador Gly4Ser1 con el fragmento de anticuerpo scFv específico de CD3 I2C (SEQ ID 185) o cualquier otro fragmento de anticuerpo scFv específico de CD3 de la invención para dar lugar a construcciones con la disposición de dominios VHVHC - (Gly4Ser1)3 - VLVHC - Gly4Ser1 -VHCD3 - (Gly4Ser1)3 - VLCD3 o disposiciones de dominios alternativas. Para la expresión en células CHO, las secuencias codificantes de (i) un líder N-terminal de cadena pesada de inmunoglobulina que comprende un codón de inicio incluido en una secuencia de consenso de Kozak y (ii) una marca His6 C-terminal seguida de un codón de detención, se unieron en fase con la secuencia de nucleótidos que codifica los fragmentos de anticuerpo monocatenario en tándem biespecífico antes de la inserción del fragmento de ADN resultante obtenido por síntesis génica en el sitio de clonación múltiple del vector de expresión pEF-DHFR (Raum et al. Cancer Immunol Immunother 50 (2001) 141-150). La transfección estable de células CHO deficientes en DHFR, la selección de transfectantes positivos para DHFR que segregaban los fragmentos de anticuerpo monocatenario en tándem biespecífico en el sobrenadante de cultivo y la amplificación de genes con metotrexato para aumentar los niveles de expresión se llevaron a cabo como se describe (Mack et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 (1995) 7021-7025). Todos los demás procedimientos del estado de la técnica se llevaron a cabo de acuerdo con protocolos estándar (Sambrook, Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 3ª edición, Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, Nueva York (2001)).
La identificación de fragmentos de anticuerpo monocatenario en tándem biespecífico funcionales se llevó a cabo mediante análisis por citometría de flujo del sobrenadante de cultivo de células CHO transfectadas. Para este propósito, se probó la unión a CD3 sobre la línea celular humana de leucemia de linfocitos T positivos para CD3 HPB-ALL (DSMZ, Braunschweig, ACC483) y sobre la línea de linfocitos T de macaco 4119LnPx. Se probó la unión al VHC en células CHO transfectadas con antígeno de VHC (véase el ejemplo 40.1). Se incubaron 200.000 células de la línea celular correspondiente durante 30 min en hielo con 50 µl de sobrenadante de cultivo celular. Se lavaron las células dos veces en PBS con FCS al 2 % y se detectó el fragmento de anticuerpo monocatenario en tándem biespecífico unido con un anticuerpo murino anti-His (anticuerpo Penta His; Qiagen; diluido 1:20 en 50 µl de PBS con FCS al 2 %). Después del lavado, se detectaron anticuerpos anti-His unidos con un anticuerpo específico frente a Fc gamma (Dianova) conjugado con ficoeritrina, diluido 1:100 en PBS con FCS al 2 %. Se usó sobrenadante de células CHO no transfectadas como control negativo.
Se realizó una citometría de flujo en un aparato FACS-Calibur; se usó el programa informático CellQuest para adquirir y analizar los datos (Becton Dickinson biosciences, Heidelberg). La tinción de FACS y la medida de la intensidad de fluorescencia se realizaron como se describe en Current Protocols in Immunology (Coligan, Kruisbeek, Margulies, Shevach y Strober, Wiley-lnterscience, 2002).
Sólo se seleccionaron para su uso posterior las construcciones que mostraban unión biespecífica a CD3 humana y de macaco, así como a antígeno de VHC.
Para la producción de proteínas, las células CHO que expresaban fragmento de anticuerpo monocatenario en tándem biespecífico totalmente funcional y adaptadas a medio líquido de soja HyQ PF CHO sin nucleósidos (con Lglutamina 4,0 mM con Pluronic F-68 al 0,1 %; HyClone) se hicieron crecer en frascos rotatorios durante 7 días. Se retiró el sobrenadante de cultivo de las células por centrifugación y se almacenó a -20 °C hasta su purificación. Como equipo de cromatografía para la purificación del fragmento de anticuerpo monocatenario en tándem a partirdel sobrenadante de cultivo, se usaron el sistema de exploración Äkta® (GE Health Systems) y el programa informático Unicorn®. Se realizó una cromatografía de afinidad de metales inmovilizados ("IMAC") usando un quelato Fractogel EMD® (Merck) que se cargó con ZnCl2 de acuerdo con el protocolo proporcionado por el fabricante. Se equilibró la columna con tampón A (tampón de fosfato de sodio 20 mM a pH 7,2, NaCl 0,1 M) y se aplicó el sobrenadante de cultivo celular (500 ml) a la columna (10 ml) a una caudal de 3 ml/min. La columna se lavó con tampón A para retirar la muestra no unida.
La proteína unida se eluyó usando un gradiente en dos etapas de tampón B (tampón de fosfato de sodio 20 mM a pH 7,2, NaCl 0,1 M, imidazol 0,5 M) de acuerdo con lo siguiente:
Etapa 1: tampón B al 20 % en 6 volúmenes de columna
Etapa 2: tampón B al 100 % en 6 volúmenes de columna
Las fracciones de proteína eluida a partir de la etapa 2 se agruparon para su purificación adicional. Todos los productos químicos son de calidad de investigación y comprados de Sigma (Deisenhofen) o Merck (Darmstadt).
La cromatografía de filtración en gel se realizó en una columna de calidad prep HiLoad 16/60 Superdex 200 (GE/Amersham) equilibrada con tampón de equilibrado (citrato 25 mM, lisina 200 mM, glicerol al 5 %, a pH 7,2). Las muestras de proteína eluidas (caudal 1 ml/min) se sometieron a SDS-PAGE estándar y transferencia de bandas western para su detección. Antes de la purificación, se calibró la columna para la determinación del peso molecular (kit de marcadores de peso molecular, Sigma MW GF-200). Las concentraciones de proteína se determinaron usando la DO a 280 nm.
El fragmento de anticuerpo monocatenario en tándem biespecífico se analizó en SDS PAGE en condiciones reductoras realizad con geles Bis Tris preformados al 4-12 % (Invitrogen). La preparación y la aplicación de las muestras se realizaron de acuerdo con el protocolo proporcionado por el fabricante. Se determinó el peso molecular con patrón proteínico MultiMark (Invitrogen). El gel se tiñó con Coomassie coloidal (protocolo de Invitrogen). La pureza de la proteína aislada fue > 95 %, determinada por SDS-PAGE.
El fragmento de anticuerpo monocatenario en tándem biespecífico tiene un peso molecular de aproximadamente 52 kDa en condiciones nativas, determinado por filtración en gel en PBS. Todas las construcciones se purificaron de acuerdo con este procedimiento.
La transferencia de bandas western se realizó usando una membrana Optitran® BA-S83 y el módulo de transferencia de bandas de Invitrogen de acuerdo con el protocolo proporcionado por el fabricante. Para la detección de los fragmentos de anticuerpo monocatenario en tándem biespecífico se usó un anticuerpo anti-marca His (Penta His, Qiagen). Como anticuerpo secundario se usó un anticuerpo Ig de cabra anti-ratón marcado con fosfatasa alcalina (AP) (Sigma) y como sustrato, BCIP/NBT (Sigma). Se detectó una única banda a 52 kD correspondiente al fragmento de anticuerpo monocatenario en tándem biespecífico purificado.
Se determinó la potencia de los fragmentos de anticuerpo monocatenario en tándem biespecífico que interaccionan con CD3 humana y de macaco y con antígeno de VHC en el sistema humano y de primate distinto de chimpancé mediante un ensayo de citotoxicidad basado en la liberación de cromo 51 (51Cr) usando células CHO transfectadas con antígeno de VHC como células objetivo (véase el ejemplo 40.1) y PBMC humanas con eliminación de CD4/CD56 estimuladas o la línea de linfocitos T de macaco 4119LnPx como células efectoras.
La generación de PBMC humanas estimuladas se realizó como sigue:
Se recubrió una placa de Petri (85 mm de diámetro, Nunc) con un anticuerpo específico anti-CD3 comercialmente disponible (p. ej., OKT3, Othoclone) en una concentración final de 1 µg/ml durante 1 hora a 37 °C. La proteína no unida se retiró mediante una etapa de lavado con PBS. Se aislaron las PBMC recién obtenidas a partir de sangre periférica (30 - 50 ml de sangre humana) por centrifugación en gradiente de Ficoll de acuerdo con protocolos estándar. Se añadieron 3 - 5 x 107 PBMC a la placa de Petri recubierta previamente en 50 ml de RPMI 1640 con glutamina estabilizada / FCS al 10 % / 20 U/ml de IL-2 (Proleukin, Chiron) y se estimulan durante 2 días. Al tercer día se recogieron las células y se lavaron una vez con RPMI 1640. Se añadió IL-2 a una concentración final de 20 U/ml y se cultivaron de nuevo las células durante un día en el mismo medio de cultivo celular que anteriormente.
Las células objetivo se lavaron dos veces con PBS y se marcaron con 11,1 MBq de 51Cr en un volumen final de 100 µl de RPMI con FCS al 50 % durante 45 minutos a 37 °C. Posteriormente, las células objetivo marcadas se lavaron 3 veces con 5 ml de RPMI y después se usaron en el ensayo de citotoxicidad. El ensayo se realizó en una placa de 96 pocillos en un volumen total de 250 µl de RPMI suplementado (como anteriormente) con una proporción E:O de
10:1. Se aplicaron 1 µg/ml del fragmentos de anticuerpo monocatenario en tándem biespecífico específico de especies cruzadas y 20 diluciones de tres veces de los mismos. El tiempo de ensayo fue de 18 horas y la citotoxicidad se midió como valores relativos de cromo liberado en el sobrenadante en relación con la diferencia de lisis máxima (adición de Triton-X) y lisis espontánea (sin células efectoras). Todas las medidas se realizaron en cuadruplicados. La medida de la actividad del cromo en los sobrenadantes se realizó con un contador gamma Wizard 3" (Perkin Elmer Life Sciences GmbH, Colonia, Alemania). El análisis de los datos experimentales se realizó con Prism 4 para Windows (versión 4.02, GraphPad Software Inc., San Diego, California, EE. UU.). Típicamente, las curvas sigmoidales de respuesta a dosis tienen valores de R2 > 0,90, determinados por el programa informático. Se calcularon los valores de EC50 como medida de la potencia mediante el programa de análisis.

Claims (22)

  1. REIVINDICACIONES
    1.
    Un polipéptido que comprende un dominio de unión que es un anticuerpo capaz de unirse a un epítopo de la cadena CD3ε humana y de Callithrix jacchus, Saguinus oedipus o Saimiri sciureus, en la que el epítopo forma parte de una secuencia de aminoácidos comprendida en el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 2, 4, 6 u 8 y comprende al menos la secuencia de aminoácidos Gln-Asp-Gly-Asn-Glu.
  2. 2.
    El polipéptido como se define en la reivindicación 1, en el que el epítopo forma parte de una secuencia de aminoácidos comprendida en el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 2, 4, 6 y 8 y comprende al menos la secuencia de aminoácidos Gln-Asp-Gly-Asn-Glu.
  3. 3.
    El polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, en el que el polipéptido comprende además un segundo dominio de unión capaz de unirse a un antígeno de superficie celular.
  4. 4.
    El polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones1 a 3, en el que el primer dominio de unión comprende una región VL que comprende CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 seleccionadas de entre:
    (a)
    CDR-L1 como se representa en la SEQ ID NO: 27, CDR-L2 como se representa en la SEQ ID NO: 28 y CDR-L3 como se representa en la SEQ ID NO: 29;
    (b)
    CDR-L1 como se representa en la SEQ ID NO: 117, CDR-L2 como se representa en la SEQ ID NO: 118 y CDR-L3 como se representa en la SEQ ID NO: 119; y
    (c)
    CDR-L1 como se representa en la SEQ ID NO: CDR-L2 como se representa en la SEQ ID NO: 154 y CDR-L3 como se representa en la SEQ ID NO: 155.
  5. 5. El polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el primer dominio de unión comprende una región VH que comprende CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3 seleccionadas de:
    (a)
    CDR-H1 como se representa en la SEQ ID NO: 12, CDR-H2 como se representa en la SEQ ID NO: 13 y CDR-H3 como se representa en la SEQ ID NO: 14;
    (b)
    CDR-H1 como se representa en la SEQ ID NO: 30, CDR-H2 como se representa en la SEQ ID NO: 31 y CDR-H3 como se representa en la SEQ ID NO: 32;
    (c)
    CDR-H1 como se representa en la SEQ ID NO: 48, CDR-H2 como se representa en la SEQ ID NO: 49 y CDR-H3 como se representa en la SEQ ID NO: 50;
    (d)
    CDR-H1 como se representa en la SEQ ID NO: 66, CDR-H2 como se representa en la SEQ ID NO: 67 y CDR-H3 como se representa en la SEQ ID NO: 68;
    (e)
    CDR-H1 como se representa en la SEQ ID NO: 84, CDR-H2 como se representa en la SEQ ID NO: 85 y CDR-H3 como se representa en la SEQ ID NO: 86;
    (f)
    CDR-H1 como se representa en la SEQ ID NO:102, CDR-H2 como se representa en la SEQ ID NO: 103 y CDR-H3 como se representa en la SEQ ID NO: 104;
    (g)
    CDR-H1 como se representa en la SEQ ID NO: 120, CDR-H2 como se representa en la SEQ ID NO: 121 y CDR-H3 como se representa en la SEQ ID NO: 122;
    (h)
    CDR-H1 como se representa en la SEQ ID NO: 138, CDR-H2 como se representa en la SEQ ID NO: 139 y CDR-H3 como se representa en la SEQ ID NO: 140;
    (i)
    CDR-H1 como se representa en la SEQ ID NO: 156, CDR-H2 como se representa en la SEQ ID NO: 157 y CDR-H3 como se representa en la SEQ ID NO: 158; y
    (j)
    CDR-H1 como se representa en la SEQ ID NO: 174, CDR-H2 como se representa en la SEQ ID NO: 175 y CDR-H3 como se representa en la SEQ ID NO: 176.
  6. 6.
    El polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el primer dominio de unión comprende una región VL seleccionada del grupo que consiste en una región VL representada en las SEQ ID NO: 35, 39, 125, 129, 161 o 165.
  7. 7.
    El polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 y 5, en el que el primer dominio de unión comprende una región VH seleccionada del grupo que consiste en una región VH representada en las SEQ ID NO: 15, 19, 33, 37, 51, 55, 69, 73, 87, 91, 105, 109, 123, 127, 141, 145, 159, 163, 177 o 181.
  8. 8.
    El polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el primer dominio de unión comprende una región VL y una región VH seleccionadas del grupo que consiste en:
    (a)
    una región VL como se representa en las SEQ ID NO: 17 o 21 y una región VH como se representa en las SEQ ID NO: 15 o 19;
    (b)
    una región VL como se representa en las SEQ ID NO: 35 o 39 y una región VH como se representa en las SEQ ID NO: 33 o 37;
    (c)
    una región VL como se representa en las SEQ ID NO: 53 o 57 y una región VH como se representa en las SEQ ID NO: 51 o 55;
    (d)
    una región VL como se representa en las SEQ ID NO: 71 o 75 y una región VH como se representa en las SEQ ID NO: 69 o 73;
    (e)
    una región VL como se representa en las SEQ ID NO: 89 o 93 y una región VH como se representa en las SEQ ID NO: 87 o 91;
    (f)
    una región VL como se representa en las SEQ ID NO: 107 o 111 y una región VH como se representa en las SEQ ID NO: 105 o 109;
    (g)
    una región VL como se representa en las SEQ ID NO: 125 o 129 y una región VH como se representa en las SEQ ID NO: 123 o 127;
    (h)
    una región VL como se representa en las SEQ ID NO: 143 o 147 y una región VH como se representa en las SEQ ID NO:141 o 145;
    (i)
    una región VL como se representa en las SEQ ID NO: 161 o 165 y una región VH como se representa en las SEQ ID NO: 159 o 163; y
    (j)
    una región VL como se representa en las SEQ ID NO:179 o 183 y una región VH como se representa en las SEQ ID NO:177 o 181.
  9. 9.
    El polipéptido de acuerdo con la reivindicación 8, en el que el primer dominio de unión comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 23, 25, 41, 43, 59, 61, 77, 79, 95, 97, 113, 115, 131, 133, 149, 151, 167, 169, 185 o 187.
  10. 10.
    El polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 9, en el que el antígeno de superficie celular es un antígeno tumoral.
  11. 11.
    El polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 9, en el que el antígeno de superficie celular se selecciona de entre EGFR, EGFRvlll, MCSP, anhidrasa carbónica IX, CD30, CD33, CD44v6, EpCAM, Her2/neu, MUC1, IgE, VHB y VHC.
  12. 12.
    El polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 11, en el que dicho polipéptido es una molécula de anticuerpo monocatenario biespecífico.
  13. 13.
    El polipéptido de acuerdo con la reivindicación 12, en el que la molécula de anticuerpo monocatenario biespecífico comprende un grupo de las siguientes secuencias como CDR H1, CDR H2, CDR H3, CDR L1, CDR L2 y CDR L3 en el segundo dominio de unión seleccionado del grupo que consiste en:
    SEQ ID NO 189-194, SEQ ID NO:201-206, SEQ ID NO:219-224, SEQ ID NO:237-242, SEQ ID NO:255-260, SEQ ID NO:273-279, SEQ ID NO:382-384 y 387-389, SEQ ID NO:400-402 y 405-407, SEQ ID NO:418-420 y 423-425, SEQ ID NO:436-438 y 441-443, SEQ ID NO:454-456 y 459-461, SEQ ID NO:472-474 y 477-479, SEQ ID NO:490-492 y 495-497, SEQ ID NO:508-510 y 513-515,
    SEQ ID NO:530-532 y 1568 a 1570, SEQ ID NO:545-547 y 550-552, SEQ ID NO:559-561 y 564-566,
    SEQ ID NO:577-579 y 582-584,
    SEQ ID NO:615-617 y 620-622, SEQ ID NO:633-635, 638, 639 y 1571, SEQ ID NO:650-652 y 655-657, SEQ ID NO:668-670 y 673-675, SEQ ID NO:682-684 y 687-689, SEQ ID NO:696-698 y 701-703, SEQ ID NO:710-712 y 715717, SEQ ID NO:724-726 y 729-731, SEQ ID NO:738-740 y 743-745, SEQ ID NO:752-754 y 757-759, SEQ ID NO:766- 768 y 771-773, SEQ ID NO:780-782 y 785-787, SEQ ID NO:794-796 y 799-801, SEQ ID NO:808-810 y 813815, SEQ ID NO:822-824 y 827-829, SEQ ID NO:836-838 y 841-843, SEQ ID NO:850-852 y 855- 857,
    SEQ ID NO:866-868 y 871-873, SEQ ID NO:884-886 y 889-891, SEQ ID NO:902-904 y 907-909, SEQ ID NO:920922 y 925-927, SEQ ID NO:938-940 y 943-945, SEQ ID NO:956-958 y 961-963, SEQ ID NO:974-976 y 979-981 , SEQ ID NO:992-994 y 997-999, SEQ ID NO:1006- 1008 y 1011 -1013, SEQ ID NO:1020-1022 y 1025-1027, SEQ ID NO:1034-1036 y 1039-1041 , SEQ ID NO:1048-1050 y 1053-1055, SEQ ID NO:1062-1064 y 1067-1069, SEQ ID NO:1076-1078 y 1081-1083, SEQ ID NO:1090-1092 y 1095-1097,
    SEQ ID NO:1114-1116 y 1119-1121, SEQ ID NO:1128-1130 y 1133-1135, SEQ ID NO:1141-1143 y 1146-1148, SEQ ID NO:1155-1157 y 1160-1162, SEQ ID NO:1169-1171 y 1174-1176, SEQ ID NO:1183-1185 y 1188-1190, SEQ ID NO:1197-1199 y 1202-1204, SEQ ID NO:1211-1225 1213 y 1216-1218, SEQ ID NO 1225-1227 y 1230-1232, SEQ ID NO:1239-1241 y 1244-1246, SEQ ID NO: 1253-1255 y 1258-1260, SEQ ID NO:1267-1269 y 1272-1274, SEQ ID NO:1281-1283 y 1286-1288, SEQ ID NO:1295-1297 y 1300-1302, SEQ ID NO:1309-1311 y 1314-1316, SEQ ID NO:1323-1325 y 1328-1330
    SEQ ID NO:1343-1345 y 1348-1350, SEQ ID NO:1361-1363 y 1366-1368, SEQ ID NO:1375-1377 y 1380-1382, SEQ ID NO:1389-1391 y 1394-1396, SEQ ID NO:1403-1405 y 1408-1410, SEQ ID NO:1417-1419 y 1422-1424, SEQ ID NO:1431-1433 y 1436-1438, SEQ ID NO:1445-1447 y 1450-1452, SEQ ID NO:1459-1461 y 1464-1466, SEQ ID NO:1473-1475 y 1478-1480,
    SEQ ID NO:1486-1491, SEQ ID NO: 1492-1497,
    SEQ ID NO:1505-1507 y 1510-1512, SEQ ID NO:1531-1533 y 1536-1538,
    SEQ ID NO: 1573-1575 y 1578-1580, SEQ ID NO: 1591-1593 y 1596-1598, SEQ ID NO:1605-1607 y 1610-1612, SEQ ID NO:1619-1621 y 1624-1626, SEQ ID NO: 1634-1636 y 1639-1641, SEQ ID NO:1652-1654 y SEQ ID NO:1657-1659 y SEQ ID NO: 1669-1674.
  14. 14. El polipéptido de acuerdo con la reivindicación 12, en el que la molécula de anticuerpo monocatenario biespecífico comprende una secuencia seleccionada de:
    (a) una secuencia de aminoácidos como se representa en cualquiera de las SEQ ID NO:291, 293, 295, 297, 299, 301, 303, 305, 307, 309, 311, 313, 315, 317, 319, 321, 323, 325, 327, 329, 331, 333, 335, 337, 339, 341, 343, 345, 347, 393, 395, 397, 411, 413, 415, 429, 431, 433, 447, 449, 451, 465, 467, 469, 483, 485, 487, 501, 503, 505, 519, 521, 523, 1336, 1338, 1340, 538, 540, 542, 556, 570, 572, 574, 588, 590, 592, 626, 628, 630, 643, 645, 647, 661, 663, 665, 679, 693, 707, 721, 735, 749, 763, 777, 791, 805, 819, 833, 847, 861, 863, 877, 879, 881, 895, 897, 899, 913, 915, 917, 931, 933, 935, 949, 951, 953, 967, 969, 971, 985, 987, 989, 1003, 1017, 1031, 1045, 1059, 1073, 1087, 1101, 1125, 1138, 1152, 1166, 1180, 1194, 1208, 1222, 1236, 1250, 1264, 1278, 1292, 1306, 1320, 1334, 1354, 1356, 1358, 1372, 1386, 1400, 1414, 1428, 1442, 1456, 1470, 1484, 1500, 1502, 1518, 1520, 1522, 1524, 1526, 1528, 1544, 1546, 1548, 1550, 1552, 1554, 1556, 1558, 1560, 1562, 1564, 1566, 1586, 1588, 1602, 1616, 1630, 1647, 1649 o 1663; y
    (b) una secuencia de aminoácidos codificada por un ácido nucleico como se representa en cualquiera de las SEQ ID NO:292, 294, 296, 298, 300, 302, 304, 306, 308, 310, 312, 314, 316, 318, 320, 322, 324, 326, 328, 330, 332, 334, 336, 338, 340, 342, 344, 346, 348, 394, 396, 398, 412, 414, 416, 430, 432, 434, 448, 450, 452, 466, 468, 470, 484, 486, 488, 502, 504, 506, 520, 522, 524, 1337, 1339, 1341, 539, 541, 543, 557, 571, 573, 575, 589, 591, 593, 627, 629, 631, 644, 646, 648, 662, 664, 666, 680, 694, 708, 722, 736, 750, 764, 778, 792, 806, 820, 834, 848, 862, 864, 878, 880, 882, 896, 898, 900, 914, 916, 918, 932, 934, 936, 950, 952, 954, 968, 970, 972, 986, 988, 990, 1004, 1018, 1032, 1046, 1060, 1074, 1088, 1102, 1126, 1139, 1153, 1167, 1181, 1195, 1209, 1223, 1237, 1251, 1265, 1279, 1293, 1307, 1321, 1335, 1355, 1357, 1359, 1373, 1387, 1401, 1415, 1429, 1443, 1457, 1471, 1485, 1501, 1503, 1519, 1521, 1523, 1525, 1527, 1529, 1545, 1547, 1549, 1551, 1553, 1555, 1557, 1559, 1561, 1563, 1565, 1567, 1587, 1589, 1603, 1617, 1631, 1648, 1650 o 1664.
  15. 15. Una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un polipéptido como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14.
  16. 16. Un vector, que comprende una secuencia de ácidos nucleicos como se define en la reivindicación 15.
  17. 17. Una célula huésped transformada o transfectada con un vector como se define en la reivindicación 16.
  18. 18. Un procedimiento para la producción de un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, comprendiendo dicho procedimiento cultivar una célula huésped como se define en la reivindicación 17 en condiciones que permitan la expresión del polipéptido como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14 y recuperar el polipéptido producido del cultivo.
  19. 19. Una composición farmacéutica que comprende un polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14 o producido de acuerdo con el procedimiento de la reivindicación 18.
  20. 20. El polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14 o producido de acuerdo con el procedimiento de la reivindicación 18 para su uso en la prevención, el tratamiento o la mejora de una enfermedad seleccionada de entre una enfermedad proliferativa, una enfermedad tumoral o un trastorno inmunológico.
  21. 21. Un kit que comprende un polipéptido como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, una molécula de ácido nucleico como se define en la reivindicación 15, un vector como se define en la reivindicación 16 o una célula huésped como se define en la reivindicación 17.
  22. 22. Uso de un fragmento N-terminal del dominio extracelular de CD3ε de 27 aminoácidos como máximo que comprende la secuencia de aminoácidos Gln-Asp-Gly-Asn-Glu-Glu-Met-Gly o Gln-Asp-Gly-Asn-Glu-Glu-lle-Gly para
    la generación de un polipéptido de la reivindicación 1.
    Figura 1 Figura 2
    Figura 4 Figura 5
    Figura 7
    Figura 10
    Figura 18
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Families Citing this family (318)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2526343T3 (es) 2004-06-03 2015-01-09 Novimmune Sa Anticuerpos anti-CD3 y métodos de uso de los mismos
DK1940881T3 (en) 2005-10-11 2017-02-20 Amgen Res (Munich) Gmbh COMPOSITIONS WITH ARTICLE CROSS-SPECIFIC ANTIBODIES AND APPLICATIONS THEREOF
RU2561457C2 (ru) † 2007-04-03 2015-08-27 Эмджен Рисерч (Мьюник) Гмбх Cd3-эпсилон-связывающий домен с межвидовой специфичностью
US20100183615A1 (en) * 2007-04-03 2010-07-22 Micromet Ag Cross-species-specific bispecific binders
US20100150918A1 (en) * 2007-04-03 2010-06-17 Micromet Ag Cross-species-specific binding domain
RU2547600C2 (ru) * 2008-10-01 2015-04-10 Эмджен Рисерч (Мьюник) Гмбх Pscaxcd3, cd19xcd3, c-metxcd3, эндосиалинxcd3, epcamxcd3, igf-1rxcd3 или fap-альфаxcd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
ME02485B (me) * 2008-10-01 2017-02-20 Amgen Res Munich Gmbh Bispecifično jednolančano protutijelo psmaxcd3 s međuvrsnom specifičnošću
DK2352763T4 (da) 2008-10-01 2022-10-17 Amgen Res Munich Gmbh Bispecifikke enkeltkædede antistoffer med specificitet for højmolekylære målantigener
EP2352765B1 (en) * 2008-10-01 2018-01-03 Amgen Research (Munich) GmbH Cross-species-specific single domain bispecific single chain antibody
RS54655B2 (sr) 2009-10-27 2021-04-29 Amgen Res Munich Gmbh Dozni režim za primenu cd19xcd3 bispecifičnog antitela
ES2748347T3 (es) 2010-03-12 2020-03-16 Debiopharm Int Sa Moléculas de unión a CD37 e inmunoconjugados de las mismas
TWI653333B (zh) * 2010-04-01 2019-03-11 安進研究（慕尼黑）有限責任公司 跨物種專一性之ＰＳＭＡｘＣＤ３雙專一性單鏈抗體
UA112062C2 (uk) 2010-10-04 2016-07-25 Бьорінгер Інгельхайм Інтернаціональ Гмбх Cd33-зв'язувальний агент
CN108403702A (zh) 2010-11-10 2018-08-17 安进研发（慕尼黑）股份有限公司 由cd3特异性结合结构域导致的不良作用的预防
US20130273055A1 (en) * 2010-11-16 2013-10-17 Eric Borges Agents and methods for treating diseases that correlate with bcma expression
US9249217B2 (en) * 2010-12-03 2016-02-02 Secretary, DHHS Bispecific EGFRvIII x CD3 antibody engaging molecules
KR20140031883A (ko) 2011-04-01 2014-03-13 이뮤노젠 아이엔씨 Cd37-결합 분자 및 그의 면역콘주게이트
JP6276175B2 (ja) 2011-04-28 2018-02-07 アムジェン リサーチ （ミュニック） ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング 潜在的有害作用リスクのある患者にＣＤ１９ｘＣＤ３二特異性抗体を投与するための投薬レジメン
WO2012158818A2 (en) * 2011-05-16 2012-11-22 Fabion Pharmaceuticals, Inc. Multi-specific fab fusion proteins and methods of use
SG195072A1 (en) 2011-05-21 2013-12-30 Macrogenics Inc Cd3-binding molecules capable of binding to human and non-human cd3
PT2748202T (pt) 2011-08-23 2018-10-08 Roche Glycart Ag Moléculas de ligação ao antigénio biespecíficas
US20130078250A1 (en) 2011-08-23 2013-03-28 Oliver Ast Bispecific t cell activating antigen binding molecules
BR112014004168A2 (pt) 2011-08-23 2017-12-12 Roche Glycart Ag anticorpo biespecífico, composição farmacêutica, uso do anticorpo biespecífico, célula hospedeira procariótica ou eucariótica, método de produção de anticorpo e invenção
HUE038225T2 (hu) 2011-08-23 2018-10-29 Roche Glycart Ag Bispecifikus, T-sejtaktiváló antigénkötõ, molekulák
ES2732712T3 (es) 2011-10-31 2019-11-25 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Molécula de unión a antígeno que tiene una conjugación regulada entre la cadena pesada y la cadena ligera
TWI679212B (zh) 2011-11-15 2019-12-11 美商安進股份有限公司 針對ｂｃｍａ之e3以及ｃｄ３的結合分子
WO2013083809A1 (en) 2011-12-09 2013-06-13 Amgen Research (Munich) Gmbh Prevention of adverse effects caused by epcamxcd3 bispecific antibodies
JP6407726B2 (ja) * 2012-03-01 2018-10-24 アムゲン リサーチ （ミュンヘン） ゲーエムベーハーＡＭＧＥＮ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｍｕｎｉｃｈ）ＧｍｂＨ 長寿命ポリペプチド結合分子
CN103382223B (zh) 2012-04-01 2015-06-10 上海益杰生物技术有限公司 针对表皮生长因子受体隐蔽表位和t细胞抗原的多功能抗体多肽
EP2861619A4 (en) * 2012-06-07 2016-01-27 Univ Duke HUMAN BISPECIFIC ANTIBODY MOLECULAR EGFRVII
EP2862875B1 (en) 2012-06-14 2023-09-06 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha ANTIGEN-BINDING MOLECULE CONTAINING MODIFIED Fc REGION
WO2014004549A2 (en) 2012-06-27 2014-01-03 Amgen Inc. Anti-mesothelin binding proteins
JOP20200236A1 (ar) 2012-09-21 2017-06-16 Regeneron Pharma الأجسام المضادة لمضاد cd3 وجزيئات ربط الأنتيجين ثنائية التحديد التي تربط cd3 وcd20 واستخداماتها
WO2014056783A1 (en) 2012-10-08 2014-04-17 Roche Glycart Ag Fc-free antibodies comprising two fab-fragments and methods of use
KR20150082328A (ko) 2012-11-06 2015-07-15 바이엘 파마 악티엔게젤샤프트 이중특이성 t-세포 연계체(bites)의 제제
ES2728936T3 (es) 2013-01-25 2019-10-29 Amgen Inc Anticuerpos dirigidos contra CDH19 para melanoma
JO3519B1 (ar) * 2013-01-25 2020-07-05 Amgen Inc تركيبات أجسام مضادة لأجل cdh19 و cd3
EP2762497A1 (en) 2013-02-05 2014-08-06 EngMab AG Bispecific antibodies against CD3epsilon and BCMA
EP2762496A1 (en) 2013-02-05 2014-08-06 EngMab AG Method for the selection of antibodies against BCMA
WO2014122143A1 (en) 2013-02-05 2014-08-14 Engmab Ag Method for the selection of antibodies against bcma
JO3529B1 (ar) * 2013-02-08 2020-07-05 Amgen Res Munich Gmbh مضاد التصاق خلايا الدم البيض من أجل التخفيف من الاثار السلبية الممكنة الناتجة عن مجالات ارتباط cd3- المحدد
US9486475B2 (en) 2013-02-08 2016-11-08 Amgen Research (Munich) Gmbh PPS for the prevention of potential adverse effects caused by CD3 specific binding domains
GB201302447D0 (en) 2013-02-12 2013-03-27 Oxford Biotherapeutics Ltd Therapeutic and diagnostic target
RU2015140917A (ru) 2013-02-26 2017-04-03 Роше Гликарт Аг Биспецифические антигенсвязывающие молекулы, активирующие т-клетки
SG11201504497TA (en) 2013-02-26 2015-09-29 Roche Glycart Ag Bispecific t cell activating antigen binding molecules
KR20150122761A (ko) 2013-02-26 2015-11-02 로슈 글리카트 아게 Ｔ 세포 활성화 항원 결합 분자
SI2970449T1 (sl) 2013-03-15 2019-11-29 Amgen Res Munich Gmbh Enoverižne vezavne molekule, ki vsebujejo N-terminalni ABP
EP2970446A1 (en) 2013-03-15 2016-01-20 Amgen Research (Munich) GmbH Antibody constructs for influenza m2 and cd3
AR095374A1 (es) 2013-03-15 2015-10-14 Amgen Res (Munich) Gmbh Moléculas de unión para bcma y cd3
US20140302037A1 (en) 2013-03-15 2014-10-09 Amgen Inc. BISPECIFIC-Fc MOLECULES
EP2789630A1 (en) 2013-04-09 2014-10-15 EngMab AG Bispecific antibodies against CD3e and ROR1
SG11201509361TA (en) * 2013-05-28 2015-12-30 Numab Ag Novel antibodies
EP3016681B1 (en) 2013-07-05 2019-12-18 Genmab A/S Humanized or chimeric cd3 antibodies
JP6242484B2 (ja) * 2013-07-09 2017-12-06 デューク ユニバーシティー 特定の改善されたヒト二重特異性ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体結合分子
KR102216088B1 (ko) 2013-07-25 2021-02-15 싸이톰스 테라퓨틱스, 인크. 다중특이성 항체, 다중특이성 활성화 가능한 항체 및 그의 사용 방법
AR097648A1 (es) 2013-09-13 2016-04-06 Amgen Inc Combinación de factores epigenéticos y compuestos biespecíficos que tienen como diana cd33 y cd3 en el tratamiento de leucemia mieloide
CN111606998A (zh) * 2013-09-16 2020-09-01 健康与环境慕尼黑德国研究中心赫姆霍茨中心（有限责任公司） 用于治疗hbv感染和相关病症的双或多特异性多肽
JPWO2015068847A1 (ja) 2013-11-11 2017-03-09 中外製薬株式会社 改変された抗体可変領域を含む抗原結合分子
CN105899535A (zh) 2013-12-17 2016-08-24 豪夫迈·罗氏有限公司 用pd-1轴结合拮抗剂和抗cd20抗体治疗癌症的方法
NZ720515A (en) 2013-12-17 2022-12-23 Genentech Inc Methods of treating cancers using pd-1 axis binding antagonists and taxanes
MX2016007958A (es) 2013-12-17 2016-08-03 Genentech Inc Anticuerpos anti-cd3 y metodos de uso.
DK3447493T3 (da) * 2014-01-07 2020-08-17 Bioatla Llc Proteinrettede ortologer
TWI754319B (zh) 2014-03-19 2022-02-01 美商再生元醫藥公司 用於腫瘤治療之方法及抗體組成物
DK3531133T3 (da) 2014-05-30 2023-11-06 Amgen Res Munich Gmbh Risikostratificering af patienter med b-precursor akut lymfoblastisk leukæmi
US9840553B2 (en) 2014-06-28 2017-12-12 Kodiak Sciences Inc. Dual PDGF/VEGF antagonists
EP3164417A1 (en) * 2014-07-01 2017-05-10 Pfizer Inc. Bispecific heterodimeric diabodies and uses thereof
US9212225B1 (en) * 2014-07-01 2015-12-15 Amphivena Therapeutics, Inc. Bispecific CD33 and CD3 binding proteins
ES2832704T3 (es) 2014-07-25 2021-06-11 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Moléculas de unión a HER2 y CD3 biespecíficas
US11820832B2 (en) 2014-07-25 2023-11-21 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Bispecific HER2 and CD3 binding molecules
CN107108738A (zh) 2014-07-25 2017-08-29 西托姆克斯治疗公司 抗cd3抗体、可活化抗cd3抗体、多特异性抗cd3抗体、多特异性可活化抗cd3抗体及其使用方法
MX2017001401A (es) 2014-07-31 2017-08-07 Amgen Res (Munich) Gmbh Constructos de anticuerpos de cadena sencilla biespecifica especificos para especies cruzadas optimizadas.
AR101669A1 (es) 2014-07-31 2017-01-04 Amgen Res (Munich) Gmbh Constructos de anticuerpos para cdh19 y cd3
TW201609811A (zh) 2014-07-31 2016-03-16 安美基研究（慕尼黑）公司 具有增強之組織分布之雙特異性單鏈抗體構築體
PE20170263A1 (es) 2014-08-04 2017-03-30 Hoffmann La Roche Moleculas biespecificas de union a antigeno activadoras de celulas t
PE20170670A1 (es) 2014-09-12 2017-06-06 Genentech Inc Anticuerpos anti-cll-1 e inmunoconjugados
JP6708635B2 (ja) 2014-10-09 2020-06-10 エンクマフ エスアーエールエル ＣＤ３εおよびＲＯＲ１に対する二特異性抗体
SI3215525T1 (sl) 2014-11-05 2020-11-30 Genentech, Inc. Postopki produkcije dvoverižnih proteinov v bakterijah
KR20170075793A (ko) 2014-11-05 2017-07-03 제넨테크, 인크. 박테리아 내 2쇄 단백질을 생산하는 방법
US11154615B2 (en) 2014-11-11 2021-10-26 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Library of antigen-binding molecules including modified antibody variable region
DK3221359T3 (da) 2014-11-17 2020-06-22 Regeneron Pharma Fremgangsmåder til tumorbehandling ved anvendelse af CD3XCD20-bispecifikt antistof
SG11201704056XA (en) 2014-11-20 2017-06-29 Hoffmann La Roche Combination therapy of t cell activating bispecific antigen binding molecules cd3 abd folate receptor 1 (folr1) and pd-1 axis binding antagonists
SI3221357T1 (sl) 2014-11-20 2020-09-30 F. Hoffmann-La Roche Ag Pogoste lahke verige in načini uporabe
RU2726446C2 (ru) * 2014-11-24 2020-07-14 Регенерон Фармасьютикалз, Инк. Не относящиеся к человеку животные, экспрессирующие гуманизированный комплекс cd3
EP3029067A1 (en) 2014-12-01 2016-06-08 Deutsches Krebsforschungszentrum Use of blocking-reagents for reducing unspecific T cell-activation
PL3247725T3 (pl) * 2015-01-23 2021-01-11 Sanofi Przeciwciała anty-CD3, przeciwciała anty-CD123 i przeciwciała bispecyficzne specyficznie wiążące się z CD3 i/lub CD123
DK3283524T3 (da) 2015-04-17 2023-05-30 Amgen Res Munich Gmbh BISPECIFIKKE ANTISTOFKONSTRUKTIONER MOD CDH3 og CD3
WO2016179003A1 (en) * 2015-05-01 2016-11-10 Genentech, Inc. Masked anti-cd3 antibodies and methods of use
WO2016184931A1 (en) 2015-05-20 2016-11-24 Amgen Research (Munich) Gmbh B-cell depletion as a diagnostic marker
KR20180013881A (ko) 2015-05-29 2018-02-07 제넨테크, 인크. 암에서의 pd-l1 프로모터 메틸화
CN114652827A (zh) 2015-05-29 2022-06-24 安普希韦纳治疗公司 双特异性cd33和cd3结合蛋白质的使用方法
AU2016276158B2 (en) 2015-06-08 2022-06-30 Debiopharm International, S.A. Anti-CD37 immunoconjugate and anti-CD20 antibody combinations
JP6996983B2 (ja) 2015-06-16 2022-02-21 ジェネンテック， インコーポレイテッド 抗ｃｌｌ－１抗体及び使用方法
CR20180031A (es) 2015-06-16 2018-05-07 Genentech Inc Anticuerpos madurados por afinidad y humanizados para fcrh5 y métodos para su uso
EP3310815A1 (en) 2015-06-17 2018-04-25 F. Hoffmann-La Roche AG Methods of treating locally advanced or metastatic breast cancers using pd-1 axis binding antagonists and taxanes
JP2018524373A (ja) * 2015-07-15 2018-08-30 ザイムワークス，インコーポレイテッド 薬物がコンジュゲートされた二重特異性抗原結合コンストラクト
IL310467A (en) 2015-07-15 2024-03-01 Genmab As Human CD3 antibodies or chimeras
CN106349391A (zh) * 2015-07-17 2017-01-25 中国科学院深圳先进技术研究院 Hbv特异性双靶向抗体及其制备方法和应用、含该双靶向抗体表达盒的微环dna及应用
TWI829617B (zh) 2015-07-31 2024-01-21 德商安美基研究（慕尼黑）公司 Ｆｌｔ３及ｃｄ３抗體構築體
TWI744242B (zh) * 2015-07-31 2021-11-01 德商安美基研究（慕尼黑）公司 Egfrviii及cd3抗體構築體
TWI796283B (zh) * 2015-07-31 2023-03-21 德商安美基研究（慕尼黑）公司 Ｍｓｌｎ及ｃｄ３抗體構築體
TWI717375B (zh) * 2015-07-31 2021-02-01 德商安美基研究（慕尼黑）公司 Ｃｄ７０及ｃｄ３抗體構築體
TW202346349A (zh) 2015-07-31 2023-12-01 德商安美基研究（慕尼黑）公司 Dll3及cd3抗體構築體
HUE048939T2 (hu) 2015-08-03 2020-09-28 Engmab Sarl Human B sejt érési antigén elleni monoklonális antitestek (BCMA)
JO3620B1 (ar) 2015-08-05 2020-08-27 Amgen Res Munich Gmbh مثبطات نقطة فحص مناعية للاستخدام في علاج سرطانات محمولة عبر الدم
PT3337824T (pt) 2015-08-17 2020-09-10 Janssen Pharmaceutica Nv Anticorpos anti-bcma, moléculas de ligação a antigénio biespecíficas que ligam bcma e cd3, e suas utilizações
KR20180038560A (ko) 2015-08-28 2018-04-16 아뮤닉스 오퍼레이팅 인코포레이티드 키메라 폴리펩티드 조립체와 이의 제조 및 사용 방법
BR112018003147A2 (pt) 2015-08-28 2018-09-18 Debiopharm International S.A. anticorpos e testes para detecção de cd37
AR106188A1 (es) 2015-10-01 2017-12-20 Hoffmann La Roche Anticuerpos anti-cd19 humano humanizados y métodos de utilización
WO2017055395A1 (en) 2015-10-02 2017-04-06 F. Hoffmann-La Roche Ag Anti-cd3xrob04 bispecific t cell activating antigen binding molecules
CN107849137B (zh) 2015-10-02 2021-11-26 豪夫迈·罗氏有限公司 双特异性抗ceaxcd3 t细胞活化性抗原结合分子
WO2017055392A1 (en) * 2015-10-02 2017-04-06 F. Hoffmann-La Roche Ag Anti-cd3xcd44v6 bispecific t cell activating antigen binding molecules
CA3003899A1 (en) 2015-11-02 2017-05-11 Janssen Pharmaceutica Nv Anti-il1rap antibodies, bispecific antigen binding molecules that bind il1rap and cd3, and uses thereof
WO2017097723A2 (en) 2015-12-09 2017-06-15 F. Hoffmann-La Roche Ag Treatment method
EP3178848A1 (en) 2015-12-09 2017-06-14 F. Hoffmann-La Roche AG Type ii anti-cd20 antibody for reducing formation of anti-drug antibodies
US11066465B2 (en) 2015-12-30 2021-07-20 Kodiak Sciences Inc. Antibodies and conjugates thereof
ES2837428T3 (es) 2016-01-08 2021-06-30 Hoffmann La Roche Procedimientos de tratamiento de cánceres positivos para CEA usando antagonistas de unión al eje PD-1 y anticuerpos biespecíficos anti-CEA/anti-CD3
EP3192810A1 (en) 2016-01-14 2017-07-19 Deutsches Krebsforschungszentrum Psma binding antibody and uses thereof
EA039325B1 (ru) * 2016-02-03 2022-01-13 Эмджен Рисерч (Мюник) Гмбх Конструкции биспецифических антител, связывающиеся с дпб3 (dll3) и кд3 (cd3)
KR20180103084A (ko) 2016-02-03 2018-09-18 암젠 리서치 (뮌헨) 게엠베하 Bcma 및 cd3 이중특이성 t 세포 맞물림 항체 작제물
MX2018009386A (es) * 2016-02-03 2018-11-09 Amgen Res Munich Gmbh Constructos de anticuerpo biespecificos para psma y cd3 que se ligan a celulas t.
EA039859B1 (ru) * 2016-02-03 2022-03-21 Эмджен Рисерч (Мюник) Гмбх Биспецифические конструкты антител, связывающие egfrviii и cd3
CN109476756B (zh) 2016-03-15 2022-05-31 埃泰美德(香港)有限公司 一种多特异性Fab融合蛋白及其用途
ES2947230T3 (es) 2016-03-22 2023-08-03 Hoffmann La Roche Moléculas biespecíficas para linfocitos T activadas por proteasa
JOP20170091B1 (ar) 2016-04-19 2021-08-17 Amgen Res Munich Gmbh إعطاء تركيبة ثنائية النوعية ترتبط بـ cd33 وcd3 للاستخدام في طريقة لعلاج اللوكيميا النخاعية
CA3059010A1 (en) 2016-06-02 2018-12-06 F. Hoffmann-La Roche Ag Type ii anti-cd20 antibody and anti-cd20/cd3 bispecific antibody for treatment of cancer
EP3252078A1 (en) 2016-06-02 2017-12-06 F. Hoffmann-La Roche AG Type ii anti-cd20 antibody and anti-cd20/cd3 bispecific antibody for treatment of cancer
US11613572B2 (en) 2016-06-21 2023-03-28 Teneobio, Inc. CD3 binding antibodies
TWI781108B (zh) 2016-07-20 2022-10-21 比利時商健生藥品公司 抗ｇｐｒｃ５ｄ抗體、結合ｇｐｒｃ５ｄ與ｃｄ３之雙特異性抗原結合分子及其用途
EP3494139B1 (en) 2016-08-05 2022-01-12 F. Hoffmann-La Roche AG Multivalent and multiepitopic anitibodies having agonistic activity and methods of use
CN109476748B (zh) 2016-08-08 2023-05-23 豪夫迈·罗氏有限公司 用于癌症的治疗和诊断方法
PE20190976A1 (es) 2016-09-14 2019-07-09 Teneobio Inc Anticuerpos de union a cd3
CN109843926B (zh) 2016-09-30 2023-01-20 豪夫迈·罗氏有限公司 针对cd3的双特异性抗体
SG11201903359RA (en) 2016-11-02 2019-05-30 Engmab Sarl Bispecific antibody against bcma and cd3 and an immunological drug for combined use in treating multiple myeloma
US11278629B2 (en) 2016-11-02 2022-03-22 Debiopharm International, S.A. Methods for improving anti-CD37 immunoconjugate therapy
EP3541843A1 (en) 2016-11-15 2019-09-25 Genentech, Inc. Dosing for treatment with anti-cd20/anti-cd3 bispecific antibodies
TWI829628B (zh) 2016-12-19 2024-01-21 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 與靶向4-1bb (cd137)促效劑併用之組合療法
WO2018114748A1 (en) 2016-12-20 2018-06-28 F. Hoffmann-La Roche Ag Combination therapy of anti-cd20/anti-cd3 bispecific antibodies and 4-1bb (cd137) agonists
WO2018119215A1 (en) 2016-12-21 2018-06-28 Teneobio, Inc. Anti-bcma heavy chain-only antibodies
IL311136A (en) 2016-12-22 2024-04-01 Daiichi Sankyo Co Ltd Anti-CD3 antibody for use in the treatment or prevention of cancer and molecules containing the antibody
US11046768B2 (en) 2017-01-27 2021-06-29 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Bispecific HER2 and CD3 binding molecules
JOP20190189A1 (ar) 2017-02-02 2019-08-01 Amgen Res Munich Gmbh تركيبة صيدلانية ذات درجة حموضة منخفضة تتضمن بنيات جسم مضاد يستهدف الخلية t
CA3055438A1 (en) 2017-03-29 2018-10-04 Glycotope Gmbh Multispecific antibody constructs binding to muc1 and cd3
ES2955852T3 (es) 2017-04-03 2023-12-07 Hoffmann La Roche Anticuerpos de unión a STEAP-1
UY37726A (es) 2017-05-05 2018-11-30 Amgen Inc Composición farmacéutica que comprende constructos de anticuerpos biespecíficos para almacenamiento y administración mejorados
EP3409322A1 (en) 2017-06-01 2018-12-05 F. Hoffmann-La Roche AG Treatment method
WO2018224441A1 (en) 2017-06-05 2018-12-13 Numab Innovation Ag Novel anti-cd3 antibodies
MX2019015563A (es) 2017-06-20 2020-07-28 Teneoone Inc Anticuerpos anti-bcma unicamente de cadena pesada.
KR102324568B1 (ko) 2017-06-21 2021-11-10 길리애드 사이언시즈, 인코포레이티드 HIV gp120 및 CD3을 표적화하는 다중특이적 항체
US20200157224A1 (en) * 2017-06-25 2020-05-21 Systimmune, Inc. Multi-specific antibodies and methods of making and using thereof
WO2019000223A1 (en) 2017-06-27 2019-01-03 Nanjing Legend Biotech Co., Ltd. ENABLERS OF IMMUNE EFFECTOR CELLS OF CHIMERIC ANTIBODIES AND METHODS OF USE THEREOF
DK3661954T3 (da) 2017-08-03 2022-04-19 Amgen Inc Interleukin-21-muteiner og fremgangsmåder til behandling
EP3664814A4 (en) 2017-08-11 2021-05-05 City of Hope RNA APTAMERS AGAINST TRANSFERRIN RECEPTOR (TFR)
EP3668898B1 (en) 2017-08-14 2023-07-05 MorphoSys AG Humanized antibodies for cd3
WO2019051122A2 (en) * 2017-09-08 2019-03-14 Maverick Therapeutics, Inc. CONDITIONAL ACTIVATED BOND FRACTIONS CONTAINING FC REGIONS
AU2018328291B2 (en) 2017-09-08 2022-10-27 Takeda Pharmaceutical Company Limited Constrained conditionally activated binding proteins
IL293443A (en) 2017-09-08 2022-07-01 Amgen Inc kras g12c inhibitors and methods of using them
JP7305624B2 (ja) 2017-09-21 2023-07-10 ウーシー バイオロジクス アイルランド リミテッド 新規抗ＣＤ３ε抗体
SG11202002384VA (en) 2017-10-14 2020-04-29 Cytomx Therapeutics Inc Antibodies, activatable antibodies, bispecific antibodies, and bispecific activatable antibodies and methods of use thereof
CA3079036A1 (en) 2017-11-01 2019-05-09 F. Hoffmann-La Roche Ag Combination therapy with targeted ox40 agonists
US10426424B2 (en) 2017-11-21 2019-10-01 General Electric Company System and method for generating and performing imaging protocol simulations
WO2019111871A1 (en) 2017-12-05 2019-06-13 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antigen-binding molecule comprising altered antibody variable region binding cd3 and cd137
EP3724229A1 (en) * 2017-12-11 2020-10-21 Amgen Inc. Continuous manufacturing process for bispecific antibody products
AU2018390881A1 (en) 2017-12-21 2020-07-02 F. Hoffmann-La Roche Ag Antibodies binding to HLA-A2/WT1
US11873336B2 (en) 2017-12-22 2024-01-16 Teneobio, Inc. Heavy chain antibodies binding to CD22
KR20200103765A (ko) 2017-12-22 2020-09-02 제넨테크, 인크. 핵산의 표적화된 통합
UY38041A (es) * 2017-12-29 2019-06-28 Amgen Inc Construcción de anticuerpo biespecífico dirigida a muc17 y cd3
CR20200330A (es) 2018-01-12 2020-12-23 Amgen Inc Anticuerpos anti-pd-1 y métodos de tratamiento
JP2021511782A (ja) 2018-01-31 2021-05-13 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ 安定化された免疫グロブリンドメイン
WO2019149716A1 (en) 2018-01-31 2019-08-08 F. Hoffmann-La Roche Ag Bispecific antibodies comprising an antigen-binding site binding to lag3
PE20211116A1 (es) 2018-02-08 2021-06-23 Genentech Inc Moleculas biespecificas de union al antigeno y metodos de uso
TWI829667B (zh) 2018-02-09 2024-01-21 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 結合gprc5d之抗體
AU2019236372A1 (en) 2018-03-13 2020-07-30 F. Hoffmann-La Roche Ag Therapeutic combination of 4-1 BB agonists with anti-CD20 antibodies
TW202003561A (zh) 2018-03-13 2020-01-16 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 使用靶向4-1bb (cd137)之促效劑的組合療法
KR20200135510A (ko) 2018-03-29 2020-12-02 제넨테크, 인크. 포유류 세포들에서 젖분비자극 활성의 조절
MA52204A (fr) 2018-04-12 2021-02-17 Amgen Inc Procédés de préparation de compositions protéiques stables
AR115052A1 (es) 2018-04-18 2020-11-25 Hoffmann La Roche Anticuerpos multiespecíficos y utilización de los mismos
CN117815404A (zh) 2018-05-18 2024-04-05 第一三共株式会社 抗-muc1抗体-药物缀合物
JOP20190116A1 (ar) 2018-05-24 2019-11-24 Janssen Biotech Inc الأجسام المضادة لتكتل التمايز 33 (cd33)، والأجسام المضادة ثنائية النوعية لتكتل التمايز 33 (cd33)/تكتل التمايز 3 (cd3) واستخداماتها
EP3802611A2 (en) 2018-06-01 2021-04-14 Novartis AG Binding molecules against bcma and uses thereof
US20210221908A1 (en) 2018-06-03 2021-07-22 Lamkap Bio Beta Ltd. Bispecific antibodies against ceacam5 and cd47
WO2020025532A1 (en) 2018-07-30 2020-02-06 Amgen Research (Munich) Gmbh Prolonged administration of a bispecific antibody construct binding to cd33 and cd3
AU2019316164A1 (en) 2018-07-31 2021-01-21 Amgen Inc. Dosing regimen for BCMA-CD3 bispecific antibodies
CA3107192A1 (en) 2018-08-03 2020-02-06 Amgen Research (Munich) Gmbh Antibody constructs for cldn18.2 and cd3
JP2021535142A (ja) 2018-08-31 2021-12-16 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッドRegeneron Pharmaceuticals, Inc. Ｃｄ３／ｃ２０二重特異性抗体のサイトカイン放出症候群を軽減する投与戦略
EP3623383A1 (en) 2018-09-11 2020-03-18 Deutsches Krebsforschungszentrum, Stiftung des öffentlichen Rechts Improved bispecific flt3xcd3 antigen binding proteins
EP3850010A1 (en) 2018-09-11 2021-07-21 Deutsches Krebsforschungszentrum, Stiftung des öffentlichen Rechts Improved anti-flt3 antigen binding proteins
AR114732A1 (es) 2018-09-18 2020-10-07 Hoffmann La Roche Utilización de un inhibidor de catepsina s contra la formación de anticuerpos antifármaco
EP4249917A3 (en) 2018-09-21 2023-11-08 F. Hoffmann-La Roche AG Diagnostic methods for triple-negative breast cancer
CN112703204A (zh) 2018-09-28 2021-04-23 安进公司 针对可溶性bcma的抗体
AU2019356573A1 (en) 2018-10-11 2021-05-27 Inhibrx, Inc. PD-1 single domain antibodies and therapeutic compositions thereof
EP3863721A1 (en) 2018-10-11 2021-08-18 Inhibrx, Inc. 5t4 single domain antibodies and therapeutic compositions thereof
TW202028246A (zh) 2018-10-11 2020-08-01 美商英伊布里克斯公司 B7h3單域抗體及其治療性組合物
WO2020076977A2 (en) 2018-10-11 2020-04-16 Inhibrx, Inc. Dll3 single domain antibodies and therapeutic compositions thereof
CA3114802A1 (en) 2018-10-11 2020-04-16 Amgen Inc. Downstream processing of bispecific antibody constructs
WO2020086635A1 (en) 2018-10-23 2020-04-30 Amgen Inc. Automatic calibration and automatic maintenance of raman spectroscopic models for real-time predictions
WO2020089437A1 (en) 2018-10-31 2020-05-07 Engmab Sàrl Combination therapy
EP3877407A1 (en) 2018-11-05 2021-09-15 F. Hoffmann-La Roche AG Methods of producing two chain proteins in prokaryotic host cells
US20200179500A1 (en) * 2018-12-05 2020-06-11 Wayne State University Methods and immunogenic compositions relating to her2 with selective sequence modifications
WO2020132165A1 (en) 2018-12-21 2020-06-25 Genentech, Inc. Targeted integration of nucleic acids
CR20210325A (es) 2018-12-21 2021-07-20 Hoffmann La Roche Anticuerpos que se unen a cd3
MX2021008561A (es) 2019-01-23 2021-08-19 Genentech Inc Metodos de produccion de proteinas multimericas en celulas huesped eucariotas.
TW202043253A (zh) 2019-01-28 2020-12-01 美商安進公司 藉由將藥物物質和藥物產品過程整體化的生物製劑製造之連續製造過程
EP3934762A1 (en) 2019-03-05 2022-01-12 Takeda Pharmaceutical Company Limited Constrained conditionally activated binding proteins
JP2022535924A (ja) * 2019-06-06 2022-08-10 ジャナックス セラピューティクス，インク． 腫瘍活性化ｔ細胞エンゲージャーに関する組成物および方法
AU2020289587A1 (en) 2019-06-07 2021-12-23 Amgen Inc. Bispecific binding constructs with selectively cleavable linkers
TW202045711A (zh) 2019-06-13 2020-12-16 美商安進公司 生物製品製造中基於生物量之自動灌注控制
AR119746A1 (es) 2019-06-14 2022-01-05 Teneobio Inc Anticuerpos multiespecíficos de cadena pesada que se unen a cd22 y cd3
SG11202112491WA (en) 2019-07-31 2021-12-30 Hoffmann La Roche Antibodies binding to gprc5d
CN114174338A (zh) 2019-07-31 2022-03-11 豪夫迈·罗氏有限公司 与gprc5d结合的抗体
MX2022002981A (es) 2019-09-10 2022-04-06 Amgen Inc Metodo de purificacion para polipeptidos de union a antigeno biespecificos con capacidad de union dinamica de captura de proteina l mejorada.
CA3150265A1 (en) 2019-09-18 2021-03-25 Sara MAJOCCHI BISPECIFIC ANTIBODIES DIRECTED AGAINST CEACAM5 AND CD3
BR112022004972A2 (pt) 2019-09-18 2022-06-28 Genentech Inc Anticorpos, ácidos nucleicos isolados, células hospedeiras isoladas, métodos de produção de um anticorpo, de produção de um anticorpo biespecífico e de tratamento de um indivíduo, anticorpos biespecíficos, composição farmacêutica, anticorpo, anticorpo biespecífico ou composição farmacêutica, combinação de um anticorpo, uso do anticorpo, uso de uma combinação do anticorpo e métodos para reduzir a inflamação e para melhorar a descamação e/ou de erupção cutânea e combinação para uso
WO2021067762A1 (en) 2019-10-03 2021-04-08 Amgen Inc. Method for conducting solid state nmr on macromolecule-containing solid state formulations
WO2021072265A1 (en) 2019-10-10 2021-04-15 Kodiak Sciences Inc. Methods of treating an eye disorder
WO2021091906A1 (en) 2019-11-04 2021-05-14 Amgen Inc. Methods for treating leukemia
EP3819312A1 (en) 2019-11-10 2021-05-12 Amgen, Inc Dosing regimen for anti-dll3 agents
EP3819007A1 (en) 2019-11-11 2021-05-12 Amgen Research (Munich) GmbH Dosing regimen for anti-bcma agents
AU2020381536A1 (en) 2019-11-13 2022-04-21 Amgen Inc. Method for reduced aggregate formation in downstream processing of bispecific antigen-binding molecules
EP3822288A1 (en) 2019-11-18 2021-05-19 Deutsches Krebsforschungszentrum, Stiftung des öffentlichen Rechts Antibodies targeting, and other modulators of, the cd276 antigen, and uses thereof
WO2021108543A1 (en) * 2019-11-27 2021-06-03 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Anti-cd3 scfv and cytokine producing artificial antigen presenting cells
EP3831849A1 (en) 2019-12-02 2021-06-09 LamKap Bio beta AG Bispecific antibodies against ceacam5 and cd47
AU2020403145A1 (en) 2019-12-13 2022-07-07 Genentech, Inc. Anti-Ly6G6D antibodies and methods of use
JP7296467B2 (ja) 2019-12-18 2023-06-22 エフ・ホフマン－ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト Ｈｌａ－ａ２／ｍａｇｅ－ａ４に結合する抗体
MX2022007688A (es) 2019-12-20 2022-07-19 Amgen Inc Constructos de anticuerpo multiespecificos agonistas de cd40 dirigidos a mesotelina para el tratamiento de tumores solidos.
MX2022007746A (es) 2019-12-23 2022-10-07 Genentech Inc Anticuerpos especificos de apolipoproteina l1 y metodos de uso.
US20230093169A1 (en) 2020-01-22 2023-03-23 Amgen Research (Munch) Gmbh Combinations of antibody constructs and inhibitors of cytokine release syndrome and uses thereof
US20230071627A1 (en) 2020-02-03 2023-03-09 Amgen Inc. Multivariate Bracketing Approach for Sterile Filter Validation
EP4114860A1 (en) 2020-03-06 2023-01-11 Go Therapeutics, Inc. Anti-glyco-cd44 antibodies and their uses
EP4118113A1 (en) 2020-03-12 2023-01-18 Amgen Inc. Method for treatment and prophylaxis of crs in patients comprising a combination of bispecifc antibodies binding to cds x cancer cell and tnfalpha or il-6 inhibitor
WO2021188851A1 (en) 2020-03-19 2021-09-23 Amgen Inc. Antibodies against mucin 17 and uses thereof
CN115315512A (zh) 2020-03-26 2022-11-08 基因泰克公司 具有降低的宿主细胞蛋白质的经修饰的哺乳动物细胞
CN115397866A (zh) 2020-03-31 2022-11-25 中外制药株式会社 靶向dll3的多特异性抗原结合分子及其用途
PE20230078A1 (es) 2020-04-24 2023-01-11 Hoffmann La Roche Modulacion de enzimas y vias con compuestos de sulfhidrilo y sus derivados
MX2022013453A (es) 2020-04-29 2022-11-16 Teneobio Inc Anticuerpos de cadena pesada multiespecificos con regiones constantes de cadena pesada modificadas.
WO2021222552A1 (en) 2020-04-30 2021-11-04 Celgene Corporation Methods of treating cytokine-related adverse events
MX2022013876A (es) 2020-05-04 2023-02-09 Immunorizon Ltd Constructos de anticuerpos triespecificos precursores y metodos de uso de los mismos.
CN116249548A (zh) 2020-05-11 2023-06-09 詹森生物科技公司 用于治疗多发性骨髓瘤的方法
AU2021275049A1 (en) 2020-05-19 2022-12-22 Amgen Inc. MAGEB2 binding constructs
JP2023527972A (ja) 2020-05-29 2023-07-03 アムジエン・インコーポレーテツド Ｃｄ３３及びｃｄ３に結合する二重特異性コンストラクトの有害作用軽減投与
WO2021247812A1 (en) 2020-06-04 2021-12-09 Amgen Inc. Bispecific binding constructs
CR20220659A (es) 2020-06-08 2023-08-21 Hoffmann La Roche Anticuerpos anti-hbv y metodos de uso
KR20230025691A (ko) 2020-06-16 2023-02-22 제넨테크, 인크. 삼중 음성 유방암을 치료하기 위한 방법과 조성물
EP4168456A1 (en) 2020-06-19 2023-04-26 F. Hoffmann-La Roche AG Antibodies binding to cd3
TWI811703B (zh) 2020-06-19 2023-08-11 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 與ｃｄ３及ｃｄ１９結合之抗體
EP4168446A1 (en) 2020-06-19 2023-04-26 F. Hoffmann-La Roche AG Antibodies binding to cd3 and folr1
WO2021255146A1 (en) 2020-06-19 2021-12-23 F. Hoffmann-La Roche Ag Antibodies binding to cd3 and cea
EP4172346A1 (en) 2020-06-24 2023-05-03 Genentech, Inc. Targeted integration of nucleic acids
CA3184747A1 (en) 2020-06-24 2021-12-30 Genentech, Inc. Apoptosis resistant cell lines
US20230303682A1 (en) 2020-07-17 2023-09-28 Genentech, Inc. Anti-Notch2 Antibodies and Methods of Use
CN114057882B (zh) * 2020-07-31 2023-01-06 山东博安生物技术股份有限公司 多价多特异性抗体
JP2023537104A (ja) 2020-08-10 2023-08-30 ユリウス－マクシミリアン－ウニヴェルシテート・ヴュルツブルク シグレック６結合ポリペプチド
KR20230080399A (ko) 2020-08-11 2023-06-07 재눅스 테라퓨틱스 인크. 절단 가능한 링커 조성물 및 방법
EP4200337A1 (en) * 2020-08-24 2023-06-28 Janux Therapeutics, Inc. Antibodies targeting trop2 and cd3 and uses thereof
TW202227625A (zh) 2020-08-28 2022-07-16 美商建南德克公司 宿主細胞蛋白質之ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９多重剔除
WO2022053655A1 (en) 2020-09-10 2022-03-17 Genmab A/S Bispecific antibody against cd3 and cd20 in combination therapy for treating follicular lymphoma
BR112023004321A2 (pt) 2020-09-10 2023-04-04 Genmab As Método para tratar linfoma de célula b grande difusa em um sujeito humano
KR20230066581A (ko) 2020-09-10 2023-05-16 젠맵 에이/에스 미만성 대 b-세포 림프종을 치료하기 위한 조합 요법에서의 cd3 및 cd20에 대한 이중특이적 항체
WO2022053656A1 (en) 2020-09-10 2022-03-17 Genmab A/S Bispecific antibody against cd3 and cd20 in combination therapy for treating follicular lymphoma
JP2023541858A (ja) 2020-09-10 2023-10-04 ジェンマブ エー／エス 慢性リンパ球性白血病を治療するためのｃｄ３及びｃｄ２０に対する二重特異性抗体
US20230331856A1 (en) 2020-09-11 2023-10-19 Amgen Inc. Materials and methods to reduce protein aggregation
CN116829183A (zh) 2020-09-16 2023-09-29 美国安进公司 施用治疗剂量的双特异性t细胞接合分子治疗癌症的方法
WO2022060878A1 (en) 2020-09-16 2022-03-24 Amgen Inc. Methods for treating prostate cancer
WO2022063819A1 (en) 2020-09-24 2022-03-31 Morphosys Ag Novel human antibodies binding to human cd3 epsilon
JP2023547520A (ja) 2020-11-05 2023-11-10 メンドゥス・ベスローテン・フェンノートシャップ 免疫療法における腫瘍非依存性抗原の使用
BR112023008629A2 (pt) 2020-11-06 2023-10-03 Amgen Inc Construtos de polipeptídeos que se ligam seletivamente a cldn6 e cd3
CN116635421A (zh) 2020-11-06 2023-08-22 安进公司 与cd3结合的多肽构建体
UY39508A (es) 2020-11-06 2022-05-31 Amgen Res Munich Gmbh Moléculas de unión a antígeno biespecíficas con múltiples dianas de selectividad aumentada
KR20230098335A (ko) 2020-11-06 2023-07-03 암젠 인크 클리핑 비율이 감소된 항원 결합 도메인
WO2022103781A1 (en) 2020-11-10 2022-05-19 Amgen Inc. Methods for administering a bcma x cd3 binding molecule
CN116783217A (zh) 2020-12-03 2023-09-19 安进公司 具有多个结合结构域的免疫球蛋白构建体
CA3201588A1 (en) 2020-12-09 2022-06-16 David Campbell Compositions and methods related to tumor activated antibodies targeting psma and effector cell antigens
AU2021399841A1 (en) 2020-12-17 2023-07-06 F. Hoffmann-La Roche Ag Anti-hla-g antibodies and use thereof
JP2024505600A (ja) 2021-02-03 2024-02-06 モーツァルト セラピューティクス， インコーポレイテッド 結合剤およびそれを使用する方法
JP2024509695A (ja) 2021-02-03 2024-03-05 ジェネンテック， インコーポレイテッド 多重特異性結合タンパク質分解プラットフォームおよび使用方法
KR20230146578A (ko) 2021-02-16 2023-10-19 얀센 파마슈티카 엔브이 Bcma, gprc5d, 및 cd3을 표적화하는 삼중특이적 항체
JP2024512324A (ja) 2021-03-05 2024-03-19 ジーオー セラピューティクス，インコーポレイテッド 抗グリコｃｄ４４抗体およびその使用
CN116997357A (zh) * 2021-03-08 2023-11-03 免疫医疗有限责任公司 针对gdf-15的抗体
US20240051990A1 (en) 2021-03-10 2024-02-15 Amgen Inc. Methods for purification of recombinant proteins
CA3208770A1 (en) 2021-03-10 2022-09-15 Amgen Inc. Parallel chromatography systems and methods
WO2022192647A1 (en) 2021-03-12 2022-09-15 Genentech, Inc. Anti-klk7 antibodies, anti-klk5 antibodies, multispecific anti-klk5/klk7 antibodies, and methods of use
WO2022200443A1 (en) 2021-03-24 2022-09-29 Janssen Pharmaceutica Nv TRISPECIFIC ANTIBODY TARGETING CD79b, CD20, AND CD3
CA3215594A1 (en) 2021-04-02 2022-10-06 Agnieszka KIELCZEWSKA Mageb2 binding constructs
EP4319820A1 (en) 2021-04-10 2024-02-14 Profoundbio Us Co. Folr1 binding agents, conjugates thereof and methods of using the same
EP4326855A1 (en) 2021-04-19 2024-02-28 Genentech, Inc. Modified mammalian cells
WO2022226317A1 (en) 2021-04-23 2022-10-27 Profoundbio Us Co. Anti-cd70 antibodies, conjugates thereof and methods of using the same
IL307821A (en) 2021-04-30 2023-12-01 Hoffmann La Roche Dosage for treatment with BISPIFIC ANTI-CD20/ANTI-CD3 antibody
CN117321078A (zh) 2021-04-30 2023-12-29 豪夫迈·罗氏有限公司 针对用抗cd20/抗cd3双特异性抗体和抗cd79b抗体药物缀合物进行组合治疗的给药
CN117279947A (zh) 2021-05-06 2023-12-22 安进研发（慕尼黑）股份有限公司 用于在增殖性疾病中使用的靶向cd20和cd22的抗原结合分子
WO2022246259A1 (en) 2021-05-21 2022-11-24 Genentech, Inc. Modified cells for the production of a recombinant product of interest
CN115536740A (zh) * 2021-06-30 2022-12-30 苏州方德门达新药开发有限公司 介导细胞内有效滞留cd3的空间构象表位及其应用
TW202320857A (zh) 2021-07-06 2023-06-01 美商普方生物製藥美國公司 連接子、藥物連接子及其結合物及其使用方法
WO2023287663A1 (en) 2021-07-13 2023-01-19 Genentech, Inc. Multi-variate model for predicting cytokine release syndrome
CA3219606A1 (en) 2021-07-22 2023-01-26 F. Hoffmann-La Roche Ag Heterodimeric fc domain antibodies
WO2023012147A1 (en) 2021-08-03 2023-02-09 F. Hoffmann-La Roche Ag Bispecific antibodies and methods of use
CA3228178A1 (en) 2021-08-05 2023-02-09 Go Therapeutics, Inc. Anti-glyco-muc4 antibodies and their uses
AU2022339667A1 (en) 2021-09-03 2024-04-11 Go Therapeutics, Inc. Anti-glyco-cmet antibodies and their uses
WO2023034571A1 (en) 2021-09-03 2023-03-09 Go Therapeutics, Inc. Anti-glyco-lamp1 antibodies and their uses
AU2022361691A1 (en) 2021-10-08 2024-03-28 Genmab A/S Antibodies binding to cd30 and cd3
TW202332695A (zh) 2021-10-15 2023-08-16 德商安美基研究（慕尼黑）公司 結合ｃｄ１９的ｔ細胞接合劑之皮下投與
WO2023076876A1 (en) 2021-10-26 2023-05-04 Mozart Therapeutics, Inc. Modulation of immune responses to viral vectors
WO2023076318A1 (en) 2021-10-27 2023-05-04 Amgen Inc. Deep learning-based prediction for monitoring of pharmaceuticals using spectroscopy
CA3233696A1 (en) 2021-11-03 2023-05-11 Joachim Koch Bispecific cd16a binders
WO2023079493A1 (en) 2021-11-03 2023-05-11 Affimed Gmbh Bispecific cd16a binders
AR127887A1 (es) 2021-12-10 2024-03-06 Hoffmann La Roche Anticuerpos que se unen a cd3 y plap
WO2023110918A1 (en) 2021-12-14 2023-06-22 Cdr-Life Ag Dual mhc-targeting t cell engager
WO2023141445A1 (en) 2022-01-19 2023-07-27 Genentech, Inc. Anti-notch2 antibodies and conjugates and methods of use
WO2023164474A1 (en) 2022-02-23 2023-08-31 Amgen Inc. Cancer treatment targeting dll3
WO2023183231A1 (en) 2022-03-21 2023-09-28 Amgen Inc. Combination therapy methods with t-cell engaging molecules for treatment of prostate cancer
US20230414750A1 (en) 2022-03-23 2023-12-28 Hoffmann-La Roche Inc. Combination treatment of an anti-cd20/anti-cd3 bispecific antibody and chemotherapy
WO2023178645A1 (zh) * 2022-03-25 2023-09-28 嘉和生物药业有限公司 靶向cd3的抗体及其应用
TW202346337A (zh) 2022-03-29 2023-12-01 美商恩格姆生物製藥公司 Ilt3及cd3結合劑以及其使用方法
WO2023198727A1 (en) 2022-04-13 2023-10-19 F. Hoffmann-La Roche Ag Pharmaceutical compositions of anti-cd20/anti-cd3 bispecific antibodies and methods of use
TW202346368A (zh) 2022-05-12 2023-12-01 德商安美基研究（慕尼黑）公司 具有增加的選擇性的多鏈多靶向性雙特異性抗原結合分子
WO2024020564A1 (en) 2022-07-22 2024-01-25 Genentech, Inc. Anti-steap1 antigen-binding molecules and uses thereof
WO2024030956A2 (en) 2022-08-03 2024-02-08 Mozart Therapeutics, Inc. Cd39-specific binding agents and methods of using the same
WO2024059675A2 (en) 2022-09-14 2024-03-21 Amgen Inc. Bispecific molecule stabilizing composition
WO2024056758A1 (en) 2022-09-14 2024-03-21 Cdr-Life Ag Mage-a4 peptide dual t cell engagers
WO2024077044A1 (en) 2022-10-05 2024-04-11 Amgen Inc. Combination therapies comprising t-cell redirecting therapies and agonistic anti-il-2r antibodies or fragments thereof

Family Cites Families (27)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
DE3856559T2 (de) 1987-05-21 2004-04-29 Micromet Ag Multifunktionelle Proteine mit vorbestimmter Zielsetzung
DD272473B3 (de) * 1988-06-13 1993-01-21 Univ Leipzig Verfahren zur herstellung monoklonaler antikoerper gegen die epsilon-kettedes cd 3-antigens humaner t-lymphozyten
US5703055A (en) 1989-03-21 1997-12-30 Wisconsin Alumni Research Foundation Generation of antibodies through lipid mediated DNA delivery
DE69032484T4 (de) † 1989-10-27 1999-09-16 Arch Dev Corp Zusammensetzungen und deren verwendung zur förderung der immunopotentiation
GB9304200D0 (en) 1993-03-02 1993-04-21 Sandoz Ltd Improvements in or relating to organic compounds
DE69434447T2 (de) 1993-06-07 2006-05-18 Vical, Inc., San Diego Für die gentherapie verwendbare plasmide
US6037453A (en) † 1995-03-15 2000-03-14 Genentech, Inc. Immunoglobulin variants
WO1997000957A1 (en) 1995-06-23 1997-01-09 President And Fellows Of Harvard College Transcriptional regulation of genes encoding vascular endothelial growth factor receptors
US20020173629A1 (en) † 1997-05-05 2002-11-21 Aya Jakobovits Human monoclonal antibodies to epidermal growth factor receptor
US5994511A (en) † 1997-07-02 1999-11-30 Genentech, Inc. Anti-IgE antibodies and methods of improving polypeptides
ATE244758T1 (de) † 1998-04-21 2003-07-15 Micromet Ag Cd19xcd3 spezifische polypeptide und deren verwendung
US20020142000A1 (en) † 1999-01-15 2002-10-03 Digan Mary Ellen Anti-CD3 immunotoxins and therapeutic uses therefor
SE524615C2 (sv) 1999-06-30 2004-09-07 Volvo Personvagnar Ab Arrangemang för minskning av galvanisk korrosion mellan metallkomponenter
RU2179862C1 (ru) * 2000-12-26 2002-02-27 Общество с ограниченной ответственностью Научно-производственный центр "МедБиоСпектр" Лекарственное средство для предотвращения отторжения трансплантата, моноклональное антитело к cd3-антигену т-лимфоцитов человека, гибридома и способ лечения больных, имеющих реакцию острого отторжения трансплантата после пересадки почки
AU2003224916B2 (en) † 2002-04-10 2009-01-08 Genentech, Inc. Anti-HER2 antibody variants
EP1629013B1 (en) † 2003-05-31 2018-01-24 Amgen Research (Munich) GmbH Pharmaceutical composition comprising a bispecific antibody specific for epcam
DK1629011T3 (da) 2003-05-31 2010-05-03 Micromet Ag Humane anti-humane-DC3-bindingsmolekyler
US20050142133A1 (en) † 2003-12-03 2005-06-30 Xencor, Inc. Optimized proteins that target the epidermal growth factor receptor
US7235641B2 (en) * 2003-12-22 2007-06-26 Micromet Ag Bispecific antibodies
ATE470453T1 (de) † 2004-04-06 2010-06-15 Novimmune Sa Verfahren zur behandlung von atherosklerose
ES2526343T3 (es) † 2004-06-03 2015-01-09 Novimmune Sa Anticuerpos anti-CD3 y métodos de uso de los mismos
EP1904105A4 (en) * 2005-07-11 2010-02-17 Macrogenics Inc METHOD FOR THE TREATMENT OF AUTOIMMUNE DISEASES WITH IMMUNOSUPPRESSIVE MONOCLONAL ANTIBODIES WITH REDUCED TOXICITY
UA92505C2 (ru) * 2005-09-12 2010-11-10 Новиммюн С.А. Композиции на основе антитела против cd3
DK1940881T3 (en) * 2005-10-11 2017-02-20 Amgen Res (Munich) Gmbh COMPOSITIONS WITH ARTICLE CROSS-SPECIFIC ANTIBODIES AND APPLICATIONS THEREOF
US20100183615A1 (en) 2007-04-03 2010-07-22 Micromet Ag Cross-species-specific bispecific binders
RU2561457C2 (ru) † 2007-04-03 2015-08-27 Эмджен Рисерч (Мьюник) Гмбх Cd3-эпсилон-связывающий домен с межвидовой специфичностью

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