CN114867494B - 抗ly6g6d抗体及使用方法 - Google Patents

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Abstract

本文提供抗Ly6G6D(淋巴细胞抗原6复合物，基因座G61)抗体及其使用方法。

Description

抗LY6G6D抗体及使用方法
序列表
本申请含有序列表，所述序列表已经以ASCII格式以电子方式提交并且以全文引用的方式并入本文中。所述ASCII副本创建于2020年12月10日，命名为50474-184WO2_Sequence_Listing_12.10.20_ST25，并且大小为146,127个字节。
技术领域
本文提供抗Ly6G6D(淋巴细胞抗原6复合物，基因座G61)抗体及其使用方法。
背景技术
癌症仍然是对人类健康最致命的威胁之一。在美国，癌症每年侵袭超过170万新患者并且是仅次于心脏病的第二大死亡原因，约占死亡人数的四分之一。特别是结直肠癌(CRC)是美国癌症死亡的第三大原因，晚期CRC患者的五年存活率很低。癌症，诸如CRC，代表了重大且不断增加的社会威胁和负担。
癌症治疗的长期方法包括化学疗法、放射疗法和去除实体瘤的手术。最近，已经开发了基于双特异性抗体的免疫疗法。此类双特异性抗体能够同时结合细胞毒性细胞和肿瘤细胞上的细胞表面抗原，目的是经结合的细胞毒性细胞将摧毁经结合的肿瘤细胞。
该领域对开发用于癌症(例如，CRC)治疗的有效的基于双特异性抗体的免疫疗法(例如，基于双特异性抗LY6G6D抗体的免疫疗法)的需求未得到满足。
发明内容
本发明提供用于治疗癌症的组合物。还提供配制物和使用方法。
在第一方面，本发明的特征在于一种分离的抗体，其与抗淋巴细胞抗原6家族成员G6D(LY6G6D)结合，其中抗体包含LY6G6D结合结构域，该结合结构域包含重链多肽(H1)和轻链多肽(L1)，其中H1包含重链可变(VH)结构域(VH1)，该VH1包含以下互补决定区(CDR)：(a)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:111的氨基酸序列；(b)CDR-H2，其包含SEQ IDNO:5、SEQ ID NO:112或SEQ ID NO:113的氨基酸序列；和(c)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列；且L1包含轻链可变(VL)结构域(VL1)，该VL1包含以下CDR：(d)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列；(e)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列；和(f)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:99至107中任一者的氨基酸序列。在一些方面，该抗体包含LY6G6D结合结构域，该结合结构域包含重链多肽(H1)和轻链多肽(L1)，其中H1包含重链可变(VH)结构域(VH1)，该VH1包含以下互补决定区(CDR)：(a)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列；(b)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列；和(c)CDR-H3，其包含SEQ IDNO:6的氨基酸序列；且L1包含轻链可变(VL)结构域(VL1)，该VL1包含以下CDR：(d)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列；(e)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列；和(f)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列。在一些方面，该抗体包含LY6G6D结合结构域，该结合结构域包含重链多肽(H1)和轻链多肽(L1)，其中H1包含重链可变(VH)结构域(VH1)，该VH1包含以下互补决定区(CDR)：(a)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列；(b)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列；和(c)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列；且L1包含轻链可变(VL)结构域(VL1)，该VL1包含以下CDR：(d)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列；(e)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列；和(f)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:99至107中任一者的氨基酸序列。在一些方面，该抗体包含LY6G6D结合结构域，该结合结构域包含重链多肽(H1)和轻链多肽(L1)，其中H1包含重链可变(VH)结构域(VH1)，该VH1包含以下互补决定区(CDR)：(a)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:111的氨基酸序列；(b)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列；和(c)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列；且L1包含轻链可变(VL)结构域(VL1)，该VL1包含以下CDR：(d)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列；(e)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列；和(f)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列。在一些方面，该抗体包含LY6G6D结合结构域，该结合结构域包含重链多肽(H1)和轻链多肽(L1)，其中H1包含重链可变(VH)结构域(VH1)，该VH1包含以下互补决定区(CDR)：(a)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列；(b)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:112或SEQ ID NO:113的氨基酸序列；和(c)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列；且L1包含轻链可变(VL)结构域(VL1)，该VL1包含以下CDR：(d)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列；(e)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列；和(f)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列。
在一些方面，(a)VH1包含与SEQ ID NO:10的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；(b)VL1包含与SEQ ID NO:11的氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列；或(c)抗体包含如(a)中所述的VH1和如(b)中所述的VL1。
在一些方面，VH1包含以下框架区(FR)：(a)FR-H1，其包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列；(b)FR-H2，其包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列；(c)FR-H3，其包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列；和(d)FR-H4，其包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列。在一些方面，VH1包含SEQ IDNO:10的氨基酸序列。
在一些方面，VH1包含以下FR：(a)FR-H1，其包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列；(b)FR-H2，其包含SEQ ID NO:58的氨基酸序列；(c)FR-H3，其包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列；和(d)FR-H4，其包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列。在一些方面，VH1包含SEQ ID NO:59的氨基酸序列。
在一些方面，VL1包含以下FR：(a)FR-L1，其包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列；(b)FR-L2，其包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列；(c)FR-L3，其包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列；和(d)FR-L4，其包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列。在一些方面，VL1包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列。
在一些方面，VL1包含以下FR：(a)FR-L1，其包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列；(b)FR-L2，其包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列；(c)FR-L3，其包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列；和(d)FR-L4，其包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列。在一些方面，VL1包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列。
在另一方面，本公开的特征在于一种分离的抗体，其与LY6G6D结合，其中该抗体包含LY6G6D结合结构域，该LY6G6D结合结构域包含重链多肽(H1)和轻链多肽(L1)，其中H1包含VH结构域(VH1)，该VH1包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列，且L1包含VL结构域(VL1)，该VL1包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列。
在另一方面，本公开的特征在于一种分离的抗体，其与LY6G6D结合，其中该抗体包含LY6G6D结合结构域，该LY6G6D结合结构域包含重链多肽(H1)和轻链多肽(L1)，其中H1包含VH结构域(VH1)，该VH1包含SEQ ID NO:59的氨基酸序列，且L1包含VL结构域(VL1)，该VL1包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列。
在一些方面，抗体在37℃以约100pM至10nM的KD结合人LY6G6D多肽，如使用BIAcore测定所测量。在一些方面，抗体以6.0nM或更低、4nM或更低、或2nM或更低的KD结合人LY6G6D多肽。
在一些方面，抗体为单克隆抗体、人抗体、人源化抗体或嵌合抗体。
在一些方面，抗体为结合LY6G6D的抗体片段。在一些方面，抗体片段选自由以下项组成的组：Fab、Fab'-SH、Fv、scFv和(Fab')2片段。
在一些方面，抗体为全长抗体或IgG抗体。
在一些方面，抗体为单特异性抗体、多特异性抗体或双特异性抗体。
在一些方面，双特异性抗体与分化簇3(CD3)结合并且包含CD3结合结构域，该CD3结合结构域包含重链多肽(H2)和轻链多肽(L2)，其中H2包含VH结构域(VH2)，且L2包含VL结构域(VL2)。
在一些方面，CD3结合结构域能够与人CD3多肽或食蟹猴CD3多肽结合。在一些方面，人CD3多肽或食蟹猴CD3多肽分别为人CD3ε多肽或食蟹猴CD3ε多肽。在一些方面，人CD3多肽或食蟹猴CD3多肽分别为人CD3γ多肽或食蟹猴CD3γ多肽。
在一些方面，抗体在37℃以约1nM至500nM的KD结合人CD3ε多肽，如使用BIAcore测定所测量。在一些方面，CD3结合结构域以250nM或更低的KD结合人CD3ε多肽。在一些方面，CD3结合结构域以100nM或更低的KD结合人CD3ε多肽。在一些方面，CD3结合结构域以15nM或更低的KD结合人CD3ε多肽。在一些方面，CD3结合结构域以10nM或更低的KD结合人CD3ε多肽。在一些方面，CD3结合结构域以5nM或更低的KD结合人CD3ε多肽。
在一些方面，VH2包含以下CDR:(a)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列；(b)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列；和(c)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列；并且VL2包含以下CDR：(d)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列；(e)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列；和(f)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列。
在一些方面，VH2包含与SEQ ID NO:20的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；(b)VL2包含与SEQ ID NO:21的氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列；或(c)抗体包含如(a)中所述的VH2和如(b)中所述的VL2。在一些方面，VH2包含SEQ IDNO:20的氨基酸序列。在一些方面，VL2包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列。
在一些方面，VH2包含以下CDR:(a)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列；(b)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列；和(c)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列；并且VL2包含以下CDR：(d)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列；(e)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列；和(f)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列；
在一些方面，(a)VH2包含与SEQ ID NO:20的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；(b)VL2包含与SEQ ID NO:55的氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列；或(c)抗体包含如(a)中所述的VH2和如(b)中所述的VL2。在一些方面，VH2包含SEQ IDNO:20的氨基酸序列。在一些方面，VL2包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列。
在一些方面，VH2包含以下FR：(a)FR-H1，其包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列；(b)FR-H2，其包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列；(c)FR-H3，其包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列；和(d)FR-H4，其包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列。
在一些方面，VH2包含以下FR：(a)FR-H1，其包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列；(b)FR-H2，其包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列；(c)FR-H3，其包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列；和(d)FR-H4，其包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列。
在一些方面，VL2包含以下FR：(a)FR-L1，其包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列；(b)FR-L2，其包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列；(c)FR-L3，其包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列；和(d)FR-L4，其包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列。
在一些方面，VL2包含以下FR：(a)FR-L1，其包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列；(b)FR-L2，其包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列；(c)FR-L3，其包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列；和(d)FR-L4，其包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列。
在一些方面，H1和H2各自进一步包含重链恒定结构域(CH1)，且L1和L2各自进一步包含轻链恒定结构域(CL)。在一些方面，H1的CH1在S183(EU编号)处包含氨基酸取代，且L1的CL在V133(EU编号)处包含氨基酸取代。在一些方面，H1的CH1包含S183K突变，且L1的CL包含V133E突变。在一些方面，H2的CH1包含S183E突变，且L2的CL包含V133K突变。在一些方面，H1的CH1包含S183E突变，且L1的CL包含V133K突变。在一些方面，H2的CH1包含S183K突变，且L2的CL包含V133E突变。
在另一方面，本公开的特征在于一种双特异性抗体，其与LY6G6D和CD3结合，其中该双特异性抗体包含：包含重链多肽(H1)和轻链多肽(L1)的LY6G6D结合结构域，和包含重链多肽(H2)和轻链多肽(L2)的CD3结合结构域，其中每个H1和H2包含重链可变结构域(VH)和重链恒定结构域(CH1)，并且每个L1和L2包含轻链可变结构域(VL)和轻链恒定结构域(CL)，其中：(a)LY6G6D结合结构域包含以下六个CDR：(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:4或SEQID NO:111的氨基酸序列；(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:112或SEQ ID NO:113的氨基酸序列；(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列；(iv)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列；(v)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列；和(vi)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:99至107中任一者的氨基酸序列；(b)CD3结合结构域包含以下六个CDR：(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列；(ii)CDR-H2，其包含SEQ IDNO:16的氨基酸序列；(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列；(iv)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列；(v)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列；和(vi)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列；(c)H1的CH1在S183(EU编号)处包含氨基酸取代且L1的CL在V133(EU编号)处包含氨基酸取代和/或H2的CH1在S183(EU编号)处包含氨基酸取代且L2的CL在V133(EU编号)处包含氨基酸取代；并且(d)H1的VH在位置Q39处包含氨基酸取代且L1的VL在位置Q38处包含氨基酸取代和/或H2的VH在位置Q39处包含氨基酸取代且L2的VL在位置Q38处包含氨基酸取代(全部为Kabat编号)。在一些方面，(a)LY6G6D结合结构域包含以下六个CDR：(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列；(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列；(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列；(iv)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列；(v)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列；和(vi)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列；(b)CD3结合结构域包含以下六个CDR：(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列；(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列；(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列；(iv)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列；(v)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列；和(vi)CDR-L3，其包含SEQ IDNO:14的氨基酸序列；(c)H1的CH1在S183(EU编号)处包含氨基酸取代且L1的CL在V133(EU编号)处包含氨基酸取代和/或H2的CH1在S183(EU编号)处包含氨基酸取代且L2的CL在V133(EU编号)处包含氨基酸取代；并且(d)H1的VH在位置Q39处包含氨基酸取代且L1的VL在位置Q38处包含氨基酸取代和/或H2的VH在位置Q39处包含氨基酸取代且L2的VL在位置Q38处包含氨基酸取代(全部为Kabat编号)。
在一些方面，(a)LY6G6D结合结构域包含以下六个CDR：(i)CDR-H1，其包含SEQ IDNO:4的氨基酸序列；(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列；(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列；(iv)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列；(v)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列；和(vi)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:99至107中任一者的氨基酸序列；(b)CD3结合结构域包含以下六个CDR：(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列；(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列；(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列；(iv)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列；(v)CDR-L2，其包含SEQ IDNO:13的氨基酸序列；和(vi)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列；(c)H1的CH1在S183(EU编号)处包含氨基酸取代且L1的CL在V133(EU编号)处包含氨基酸取代和/或H2的CH1在S183(EU编号)处包含氨基酸取代且L2的CL在V133(EU编号)处包含氨基酸取代；并且(d)H1的VH在位置Q39处包含氨基酸取代且L1的VL在位置Q38处包含氨基酸取代和/或H2的VH在位置Q39处包含氨基酸取代且L2的VL在位置Q38处包含氨基酸取代(全部为Kabat编号)。
在一些方面，(a)LY6G6D结合结构域包含以下六个CDR：(i)CDR-H1，其包含SEQ IDNO:111的氨基酸序列；(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列；(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列；(iv)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列；(v)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列；和(vi)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列；(b)CD3结合结构域包含以下六个CDR：(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列；(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列；(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列；(iv)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列；(v)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列；和(vi)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列；(c)H1的CH1在S183(EU编号)处包含氨基酸取代且L1的CL在V133(EU编号)处包含氨基酸取代和/或H2的CH1在S183(EU编号)处包含氨基酸取代且L2的CL在V133(EU编号)处包含氨基酸取代；并且(d)H1的VH在位置Q39处包含氨基酸取代且L1的VL在位置Q38处包含氨基酸取代和/或H2的VH在位置Q39处包含氨基酸取代且L2的VL在位置Q38处包含氨基酸取代(全部为Kabat编号)。在一些方面，(a)LY6G6D结合结构域包含以下六个CDR：(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列；(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:112或SEQ ID NO:113的氨基酸序列；(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列；(iv)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列；(v)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列；和(vi)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列；(b)CD3结合结构域包含以下六个CDR：(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列；(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列；(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列；(iv)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列；(v)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列；和(vi)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列；(c)H1的CH1在S183(EU编号)处包含氨基酸取代且L1的CL在V133(EU编号)处包含氨基酸取代和/或H2的CH1在S183(EU编号)处包含氨基酸取代且L2的CL在V133(EU编号)处包含氨基酸取代；并且(d)H1的VH在位置Q39处包含氨基酸取代且L1的VL在位置Q38处包含氨基酸取代和/或H2的VH在位置Q39处包含氨基酸取代且L2的VL在位置Q38处包含氨基酸取代(全部为Kabat编号)。
在另一方面，本发明的特征在于一种双特异性抗体，其与LY6G6D和CD3结合，其中该双特异性抗体包含：包含重链多肽(H1)和轻链多肽(L1)的LY6G6D结合结构域，和包含重链多肽(H2)和轻链多肽(L2)的CD3结合结构域，其中每个H1和H2包含重链可变结构域(VH)和重链恒定结构域(CH1)，且每个L1和L2包含轻链可变结构域(VL)和轻链恒定结构域(CL)，其中：(a)LY6G6D结合结构域包含以下六个CDR：(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:4或SEQ IDNO:111的氨基酸序列；(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:112或SEQ ID NO:113的氨基酸序列；(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列；(iv)CDR-H1，其包含SEQID NO:1的氨基酸序列；(v)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列；和(vi)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:99至107中任一者的氨基酸序列；(b)CD3结合结构域包含以下六个CDR：(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列；(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列；(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列；(iv)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列；(v)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列；和(vi)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列；(c)H1的CH1在S183(EU编号)处包含氨基酸取代且L1的CL在V133(EU编号)处包含氨基酸取代和/或H2的CH1在S183(EU编号)处包含氨基酸取代且L2的CL在V133(EU编号)处包含氨基酸取代；并且(d)H1的VH在位置Q39处包含氨基酸取代且L1的VL在位置Q38处包含氨基酸取代和/或H2的VH在位置Q39处包含氨基酸取代且L2的VL在位置Q38处包含氨基酸取代(全部为Kabat编号)。在一些方面，(a)LY6G6D结合结构域包含以下六个CDR：(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列；(ii)CDR-H2，其包含SEQ IDNO:5的氨基酸序列；(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列；(iv)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列；(v)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列；和(vi)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列；(b)CD3结合结构域包含以下六个CDR：(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列；(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列；(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列；(iv)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列；(v)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列；和(vi)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列；(c)H1的CH1在S183(EU编号)处包含氨基酸取代且L1的CL在V133(EU编号)处包含氨基酸取代和/或H2的CH1在S183(EU编号)处包含氨基酸取代且L2的CL在V133(EU编号)处包含氨基酸取代；并且(d)H1的VH在位置Q39处包含氨基酸取代且L1的VL在位置Q38处包含氨基酸取代和/或H2的VH在位置Q39处包含氨基酸取代且L2的VL在位置Q38处包含氨基酸取代(全部为Kabat编号)。在一些方面，(a)LY6G6D结合结构域包含以下六个CDR：(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列；(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列；(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列；(iv)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列；(v)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列；和(vi)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:99至107中任一者的氨基酸序列；(b)CD3结合结构域包含以下六个CDR：(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列；(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列；(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列；(iv)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列；(v)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列；和(vi)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列；(c)H1的CH1在S183(EU编号)处包含氨基酸取代且L1的CL在V133(EU编号)处包含氨基酸取代和/或H2的CH1在S183(EU编号)处包含氨基酸取代且L2的CL在V133(EU编号)处包含氨基酸取代；并且(d)H1的VH在位置Q39处包含氨基酸取代且L1的VL在位置Q38处包含氨基酸取代和/或H2的VH在位置Q39处包含氨基酸取代且L2的VL在位置Q38处包含氨基酸取代(全部为Kabat编号)。
在一些方面，(a)LY6G6D结合结构域包含以下六个CDR：(i)CDR-H1，其包含SEQ IDNO:111的氨基酸序列；(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列；(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列；(iv)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列；(v)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列；和(vi)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列；(b)CD3结合结构域包含以下六个CDR：(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列；(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列；(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列；(iv)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列；(v)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列；和(vi)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列；(c)H1的CH1在S183(EU编号)处包含氨基酸取代且L1的CL在V133(EU编号)处包含氨基酸取代和/或H2的CH1在S183(EU编号)处包含氨基酸取代且L2的CL在V133(EU编号)处包含氨基酸取代；并且(d)H1的VH在位置Q39处包含氨基酸取代且L1的VL在位置Q38处包含氨基酸取代和/或H2的VH在位置Q39处包含氨基酸取代且L2的VL在位置Q38处包含氨基酸取代(全部为Kabat编号)。在一些方面，(a)LY6G6D结合结构域包含以下六个CDR：(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:111的氨基酸序列；(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:112或SEQ ID NO:113的氨基酸序列；(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列；(iv)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列；(v)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列；和(vi)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列；(b)CD3结合结构域包含以下六个CDR：(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列；(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列；(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列；(iv)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列；(v)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列；和(vi)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列；(c)H1的CH1在S183(EU编号)处包含氨基酸取代且L1的CL在V133(EU编号)处包含氨基酸取代和/或H2的CH1在S183(EU编号)处包含氨基酸取代且L2的CL在V133(EU编号)处包含氨基酸取代；并且(d)H1的VH在位置Q39处包含氨基酸取代且L1的VL在位置Q38处包含氨基酸取代和/或H2的VH在位置Q39处包含氨基酸取代且L2的VL在位置Q38处包含氨基酸取代(全部为Kabat编号)。
在一些方面，H1的VH在Q39(Kabat编号)处包含氨基酸取代，且L1的VL在Q38(Kabat编号)处包含氨基酸取代。在一些方面，H2的CH1在S183(EU编号)处包含氨基酸取代，且L2的CL在V133(EU编号)处包含氨基酸取代。在一些方面，H2的VH进一步在位置Q39(Kabat编号)处包含氨基酸取代，且L2的VL进一步在位置Q38(Kabat编号)处包含氨基酸取代。在一些方面，H1的CH1包含S183K突变(EU编号)且L1的CL包含V133E突变(EU编号)，并且H2的CH1包含S183E突变(EU编号)且L2的CL包含V133K突变(EU编号)。在一些方面，H1的VH包含Q39E(Kabat编号)突变，L1的VL包含Q38K突变，H2的VH包含Q39K突变，且L2的VL包含Q38E突变(Kabat编号)。在一些方面，H1的CH1包含S183E突变(EU编号)且L1的CL包含V133K突变(EU编号)，并且H2的CH1包含S183K突变(EU编号)且L2的CL包含V133E突变(EU编号)。在一些方面，H1的VH包含Q39K突变(Kabat编号)，L1的VL包含Q38E突变(Kabat编号)，H2的VH包含Q39E突变(Kabat编号)，且L2的VL包含Q38K突变(Kabat编号)。
在一些方面，H2的VH包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列，和/或L2的VL包含SEQ IDNO:21的氨基酸序列。在一些方面，H1的VH包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列，且L1的VL包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列。
在一些方面，H2的VH包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列，和/或L2的VL包含SEQ IDNO:55的氨基酸序列。在一些方面，H1的VH包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列，且L1的VL包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列。
在一些方面，H1的Fc区的第一CH3结构域(CH31)和H2的Fc区的第二CH3结构域(CH32)各自包含突起或空腔，并且其中在CH31中的突起或空腔分别可定位在CH32的空腔或突起中。在一些方面，CH31和CH32在突起与空腔之间的界面处相遇。
在一些方面，H1的Fc区的CH31包含突起，且H2的Fc区的CH32包含空腔。在一些方面，(a)H1的Fc区的CH31包含突起，该突起包含T366W氨基酸取代突变(EU编号)；(b)H2的Fc区的CH32包含空腔，该空腔包含T366S、L368A或Y407V氨基酸取代突变(EU编号)或其组合；或(c)兼具(a)和(b)。
在一些方面，(a)H1的Fc区的CH31包含突起，该突起包含T366W氨基酸取代突变(EU编号)；(b)H2的Fc区的CH32包含空腔，该空腔包含T366S、L368A和Y407V氨基酸取代突变(EU编号)；或(c)兼具(a)和(b)。在一些方面，(a)H1的Fc区的CH31包含突起，该突起包含T366W氨基酸取代突变(EU编号)；且(b)H2的Fc区的CH32包含空腔，该空腔包含T366S、L368A和Y407V氨基酸取代突变(EU编号)。
在一些方面，H1的Fc区的CH31包含空腔，且H2的Fc区的CH32包含突起。在一些方面，(a)H1的Fc区的CH31包含空腔，该空腔包含T366S、L368A或Y407V氨基酸取代突变(EU编号)或其组合；(b)H2的Fc区的CH32包含突起，该突起包含T366W氨基酸取代突变(EU编号)；或(c)兼具(a)和(b)。在一些方面，(a)H1的Fc区的CH31包含空腔，该空腔包含T366S、L368A和Y407V氨基酸取代突变(EU编号)；(b)H2的Fc区的CH32包含突起，该突起包含T366W氨基酸取代突变(EU编号)；或(c)兼具(a)和(b)。在一些方面，(a)H1的Fc区的CH31包含空腔，该空腔包含T366S、L368A和Y407V氨基酸取代突变(EU编号)；并且(b)第二重链多肽的Fc区的CH32包含突起，该突起包含T366W氨基酸取代突变(EU编号)。
在一些方面，Fc区为人IgG同种型Fc区，或其Fc区变体。在一些方面，Fc区为人IgG同种型Fc区变体。在一些方面，人IgG同种型Fc区变体各自在氨基酸残基N297(EU编号)处包含导致糖基化不存在的突变。在一些方面，在氨基酸残基N297处的突变为取代突变。在一些方面，在氨基酸残基N297处的突变降低Fc区的效应子功能。
在一些方面，取代突变为N297G或N297A突变。在一些方面，人IgG同种型Fc区变体各自包含N297G突变。在一些方面，人IgG同种型Fc区变体各自包含降低Fc区效应子功能的突变。
在一些方面，降低Fc区效应子功能的突变为取代突变。在一些方面，取代突变在氨基酸残基E233、L234、L235、D265和/或P329(EU编号)处。在一些方面，取代突变为E233P、L234A、L234V、L235A、D265A或P329G突变。在一些方面，人IgG同种型Fc区变体各自包含P329G突变。在一些方面，人IgG同种型Fc区变体各自包含N297G和P329G突变。
在一些方面，人IgG同种型Fc区变体为人IgG1或IgG3同种型Fc区变体，各自进一步包含L234A或L235A突变。在一些方面，人IgG同种型Fc区变体为人IgG1或IgG3同种型Fc区变体，各自进一步包含L234A和L235A突变。
在一些方面，人IgG同种型Fc区变体为人IgG1或IgG3同种型Fc区变体，各自进一步包含以下取代突变E233P、L234V和L235A(EU编号)以及残基G236(EU编号)的缺失。在一些方面，人IgG同种型Fc区变体为人IgG1同种型Fc区变体。
在一些方面，人IgG同种型Fc区变体为人IgG4同种型Fc区变体，各自进一步包含以下取代突变E233P、F234V和L235A(EU编号)以及残基G236(EU编号)的缺失。
在一些方面，Fc复合物之Fc区为无效应子Fc区。
在一些方面，H1包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列，且L2包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列。在一些方面，H2包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列，且L2包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列。在一些方面，H2包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列，且L2包含SEQ ID NO:57的氨基酸序列。
在另一方面，本公开的特征在于一种双特异性抗体，其与LY6G6D和CD3结合，其中该双特异性抗体包含LY6G6D结合结构域和CD3结合结构域，该LY6G6D结合结构域包含重链多肽(H1)和轻链多肽(L1)，该CD3结合结构域包含重链多肽(H2)和轻链多肽(L2)，并且其中：(a)H1包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列；(b)L1包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列；(c)H2包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列；且(d)L2包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列。
在另一方面，本公开的特征在于一种双特异性抗体，其与LY6G6D和CD3结合，其中该双特异性抗体包含LY6G6D结合结构域和CD3结合结构域，该LY6G6D结合结构域包含重链多肽(H1)和轻链多肽(L1)，该CD3结合结构域包含重链多肽(H2)和轻链多肽(L2)，并且其中：(a)H1包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列；(b)L1包含SEQ ID NO:65的氨基酸序列；(c)H2包含SEQ ID NO:69的氨基酸序列；且(d)L2包含SEQ ID NO:70的氨基酸序列。
在另一方面，本公开的特征在于一种双特异性抗体，其与LY6G6D和CD3结合，其中该双特异性抗体包含LY6G6D结合结构域和CD3结合结构域，该LY6G6D结合结构域包含重链多肽(H1)和轻链多肽(L1)，该CD3结合结构域包含重链多肽(H2)和轻链多肽(L2)，并且其中：(a)H1包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列；(b)L1包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列；(c)H2包含SEQ ID NO:67的氨基酸序列；且(d)L2包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列。
在另一方面，本公开的特征在于一种双特异性抗体，其与LY6G6D和CD3结合，其中该双特异性抗体包含LY6G6D结合结构域和CD3结合结构域，该LY6G6D结合结构域包含重链多肽(H1)和轻链多肽(L1)，该CD3结合结构域包含重链多肽(H2)和轻链多肽(L2)，并且其中：(a)H1包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列；(b)L1包含SEQ ID NO:65的氨基酸序列；(c)H2包含SEQ ID NO:68的氨基酸序列；且(d)L2包含SEQ ID NO:70的氨基酸序列。
在另一方面，本公开的特征在于一种双特异性抗体，其与LY6G6D和CD3结合，其中该双特异性抗体包含LY6G6D结合结构域和CD3结合结构域，该LY6G6D结合结构域包含重链多肽(H1)和轻链多肽(L1)，该CD3结合结构域包含重链多肽(H2)和轻链多肽(L2)，并且其中：(a)H1包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列；(b)L1包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列；(c)H2包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列；且(d)L2包含SEQ ID NO:57的氨基酸序列。
在另一方面，本公开的特征在于一种双特异性抗体，其与LY6G6D和CD3结合，其中该双特异性抗体包含LY6G6D结合结构域和CD3结合结构域，该LY6G6D结合结构域包含重链多肽(H1)和轻链多肽(L1)，该CD3结合结构域包含重链多肽(H2)和轻链多肽(L2)，并且其中：(a)H1包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列；(b)L1包含SEQ ID NO:65的氨基酸序列；(c)H2包含SEQ ID NO:69的氨基酸序列；且(d)L2包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列。
在另一方面，本公开的特征在于一种双特异性抗体，其与LY6G6D和CD3结合，其中该双特异性抗体包含LY6G6D结合结构域和CD3结合结构域，该LY6G6D结合结构域包含重链多肽(H1)和轻链多肽(L1)，该CD3结合结构域包含重链多肽(H2)和轻链多肽(L2)，并且其中：(a)H1包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列；(b)L1包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列；(c)H2包含SEQ ID NO:67的氨基酸序列；且(d)L2包含SEQ ID NO:57的氨基酸序列。
在另一方面，本公开的特征在于一种双特异性抗体，其与LY6G6D和CD3结合，其中该双特异性抗体包含LY6G6D结合结构域和CD3结合结构域，该LY6G6D结合结构域包含重链多肽(H1)和轻链多肽(L1)，该CD3结合结构域包含重链多肽(H2)和轻链多肽(L2)，并且其中：(a)H1包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列；(b)L1包含SEQ ID NO:65的氨基酸序列；(c)H2包含SEQ ID NO:68的氨基酸序列；且(d)L2包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列。
在一些方面，抗体具有约10ml/kg/天至约35ml/kg/天之间的静脉注射后清除率。
在另一方面，本公开的特征在于一种或多种分离的核酸，其编码上述任一方面的抗体，或其包含与LY6G6D结合的结合结构域的部分。
在另一方面，本公开的特征在于一种或多种载体，其包含上一方面的一种或多种分离的核酸。
在另一方面，本公开的特征在于的一种或多种宿主细胞，其包含上一方面的一种或多种载体。
在一些方面，一种或多种宿主细胞为一种或多种哺乳动物宿主细胞。在一些方面，一种或多种哺乳动物宿主细胞为一种或多种中国仓鼠卵巢(CHO)宿主细胞。
在一些方面，一种或多种宿主细胞为一种或多种原核宿主细胞。在一些方面，一种或多种原核宿主细胞为一种或多种大肠杆菌宿主细胞。
在另一方面，本公开的特征在于一种产生上述任一方面的抗体的方法，该方法包括在培养基中培养上述方面的一种或多种宿主细胞。在一些方面，该方法进一步包括从一种或多种宿主细胞或培养基中回收抗LY6G6D抗体。
在另一方面，本公开的特征在于包含上述任一方面的载体抗体的组合物。在一些方面，该组合物进一步包含药用赋形剂或稀释剂。在一些方面，药用赋形剂为缓冲剂、载剂、稳定剂或防腐剂。在一些方面，该组合物为药物组合物。
在另一方面，本公开的特征在于上述任一方面的抗体，其用作药物。
在另一方面，本公开的特征在于上述任一方面的抗体或上述任一方面的组合物，其用于治疗有此需要的受试者的LY6G6D阳性癌症或延迟有此需要的受试者的LY6G6D阳性癌症的进展。在一些方面，LY6G6D阳性癌症为结直肠癌。在一些方面，LY6G6D阳性癌症具有的微卫星不稳定性(MSI)状态为微卫星稳定(MSS)或微卫星不稳定性低(MSI-L)。
在另一方面，本公开的特征在于上述任一方面的抗体或上述任一方面的组合物的用途，其用于制备用于治疗受试者的LY6G6D阳性癌症或延迟受试者的LY6G6D阳性癌症的进展的药物。在一些方面，LY6G6D阳性癌症为结直肠癌。在一些方面，LY6G6D阳性癌症具有的MSI状态为MSS或MSI-L。
在另一方面，本公开的特征在于一种治疗有此需要的受试者的LY6G6D阳性癌症或延迟有此需要的受试者的LY6G6D阳性癌症的进展的方法，该方法包括向受试者施用上述任一方面的抗体或上述任一方面的组合物。在一些方面，LY6G6D阳性癌症为结直肠癌。在一些方面，LY6G6D阳性癌症具有的MSI状态为MSS或MSI-L。
在另一方面，本公开的特征在于一种试剂盒，其包含上述任一方面的抗体和包装插页，该包装插页包含关于使用抗体用于治疗受试者的LY6G6D阳性癌症或延迟受试者的LY6G6D阳性癌症的进展的使用说明。在一些方面，LY6G6D阳性癌症为结直肠癌。在一些方面，LY6G6D阳性癌症具有的MSI状态为MSS或MSI-L。在一些方面，受试者为人。
在另一方面，本公开的特征在于一种分离的抗体，其与CD3结合，其中该抗体包含结合结构域，该结合结构域包含以下CDR：(a)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列；(b)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列；(c)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列；(d)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列；(e)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列；以及(f)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列。在一些方面，抗体包含：(a)VH，其包含与SEQ ID NO:20的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；(b)VL，其包含与SEQ ID NO:21的氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列；或(c)如(a)中所述的VH和如(b)中所述的VL。在一些方面，VH包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列。在一些方面，VL包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列。
在另一方面，本公开的特征在于一种分离的抗体，其与CD3结合，其中该抗体包含结合结构域，该结合结构域包含以下CDR：(a)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列；(b)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列；(c)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列；(d)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列；(e)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列；以及(f)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列。在一些方面，抗体包含：(a)VH，其包含与SEQ ID NO:20的氨基序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；(b)VL，其包含与SEQ ID NO:55的氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列；或(c)如(a)中所述的VH和如(b)中所述的VL。在一些方面，VH包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列。在一些方面，VL包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列。
在一些实施例中，VH包含以下FR：(a)FR-H1，其包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列；(b)FR-H2，其包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列；(c)FR-H3，其包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列；和(d)FR-H4，其包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列。
在一些实施例中，VH包含以下FR：(a)FR-H1，其包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列；(b)FR-H2，其包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列；(c)FR-H3，其包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列；和(d)FR-H4，其包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列。
在一些实施例中，VL包含以下FR：(a)FR-L1，其包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列；(b)FR-L2，其包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列；(c)FR-L3，其包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列；和(d)FR-L4，其包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列。
在一些实施例中，VL包含以下FR：(a)FR-L1，其包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列；(b)FR-L2，其包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列；(c)FR-L3，其包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列；和(d)FR-L4，其包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列。
在一些方面，抗体在37℃以约1nM至500nM的KD结合人CD3ε多肽，如使用BIAcore测定所测量。在一些方面，抗体以250nM或更低、100nM或更低、15nM或更低、10nM或更低、或5nM或更低的KD结合人CD3ε多肽。
在一些方面，抗体为单克隆抗体、人抗体、人源化抗体或嵌合抗体。
在一些方面，抗体为结合CD3的抗体片段。在一些方面，抗体片段选自由以下项组成的组：Fab、Fab'-SH、Fv、scFv和(Fab')2片段。
在一个方面，抗体为全长抗体。
在一些方面，抗体为IgG抗体。
在一些方面，抗CD3抗体为单特异性抗体。
在另一方面，本公开的特征在于一种分离的抗体，其与LY6G6D结合，其中该抗体包含结合结构域，该结合结构域包含以下互补决定区(CDR)：(a)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列；(b)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列；(c)CDR-H3，其包含SEQ IDNO:29的氨基酸序列；(d)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列；(e)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列；以及(f)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列。
在一些方面，抗体包含：(a)VH，其包含与SEQ ID NO:32的氨基序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；(b)VL，其包含与SEQ ID NO:33的氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列；或(c)如(a)中所述的VH和如(b)中所述的VL。在一些方面，VH包含SEQ IDNO:32的氨基酸序列。在一些方面，VL包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列。
在一些方面，本公开的特征在于一种分离的抗体，其与LY6G6D结合，其中该抗体包含：重链，其包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列；和轻链，其包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列。
附图说明
图1A为图，其以归一化读数每千碱基百万(normalized reads per kilobasemillion(nRPKM))为单位示出癌症基因组图谱(TCGA)中LY6G6D和LY6G6F在正常(黑色)和肿瘤(红色)组织中的表达。LY6G6D在结肠肿瘤组织中显著过表达。
图1B为图，其以nRPKM为单位示出公共GTEx项目数据中LY6G6D和LY6G6F在正常组织中的表达。
图1C为一组箱形图，其以nRPKM为单位示出LY6G6D在具有的微卫星不稳定性(MSI)状态为微卫星稳定(MSS)、微卫星不稳定性低(MSI-L)或微卫星不稳定性高(MSI-H)的结直肠癌(CRC)中的表达。指示了CRC的MSI状态与预后之间的关联。
图2A为正常结肠组织的显微照片，其示出针对LY6G6D的免疫组织化学(IHC)染色。
图2B为原发性结肠肿瘤的显微照片，其示出针对LY6G6D的弱(1+)IHC染色。
图2C为原发性结肠肿瘤的显微照片，其示出针对LY6G6D的中度(2+)IHC染色。
图2D为原发性结肠肿瘤的显微照片，其示出针对LY6G6D的强(3+)IHC染色。
图3A为一对曲线图，其示出包含抗LY6G6D 1G4臂和抗CD3 38E4v1或40G5c臂的LY6G6D T细胞依赖性双特异性抗体(TDB)对补充有来自供体#1或供体#2的10X人PBMC的HT55细胞(人结肠癌细胞系)的体外杀伤。列出了每个TDB的EC50值。
图3B为一组曲线图，其示出在用包含抗LY6G6D 1G4臂和抗CD340G5c或38E4v1臂的LY6G6D TDB治疗后，NSGTM小鼠中异种移植物HT55肿瘤的肿瘤体积(mm2)。用健康的供体PBMC对小鼠进行人源化。提供包含递送媒介物和PMBC的治疗或者包含LY6G6D TDB但不包含PMBC的治疗作为对照。
图3C为曲线图，其示出包含嵌合或人源化抗LY6G6D 1G4臂和抗CD3 38E4v1臂的LY6G6D TDB对补充有人PBMC的HT55细胞的体外杀伤；以及附表，其示出该嵌合或人源化1G4臂在BIAcore测定中的亲和力。
图3D为一组曲线图，其示出在用包含嵌合或人源化抗LY6G6D 1G4臂和抗CD338E4v1臂的LY6G6D TDB治疗后，NSGTM小鼠中异种移植物HT55肿瘤的肿瘤体积(mm2)。用健康的供体PBMC对小鼠进行人源化。提供包含递送媒介物和PMBC的治疗或者包含LY6G6D TDB但不包含PMBC的治疗作为对照。
图4A为带状图，其示出在LY6G6D多肽的结构同源模型中经工程改造的糖基化位点(红色、粉色、绿色和蓝色圆圈)的位置。糖基化位点基于它们对抗体结合的影响进行颜色编码。在由红色圆圈标记的位点处的糖基化破坏1G4的结合。在由粉红色圆圈标记的位点处的糖基化破坏16D7的结合。在由蓝色圆圈标记的位点出的糖基化不破坏1G4或16D7的结合。绿色圆圈标记连接至Fc的接头中的经工程改造的糖基化位点。
图4B为图表，其示出候选抗LY6G6D抗体与在所指示的残基处包含经工程改造的糖基化位点的LY6G6D多肽的结合。标记有X的单元格指示未检测到结合。标记有W的单元格指示结合显著降低。
图4C为一对示意图，其示出在第一取向和已旋转180°的第二取向下，LY6G6D多肽的结构同源模型中经工程改造的糖基化位点的位置。破坏图4A的箱(Bin)1、2、3和4的抗体结合的糖基化位点分别用绿色、紫色、蓝色和橙色圆圈指示。
图4D为经注释的LY6G6D多肽序列，其中受糖基化突变影响的氨基酸残基如图4C所示用颜色编码，且图4A的箱1、2、3和4用下划线指示。
图4E为示意图，其示出放置在四个不同表位箱中的兔抗LY6G6D抗体克隆物。箱1包括三组序列且包括20A12、rf.1G4、6E10和4H7。箱2包括六组序列且包括f.16D7。箱3和箱4各包括三组序列。
图4F为曲线图，其示出包含来自图4E的箱1、2、3或4的所指示的抗LY6G6D臂和抗CD3 40G5c臂的兔抗人LY6G6D TDB与HT55细胞(人结肠癌细胞系)的结合。结合测量为平均荧光强度(MFI)。
图4G为曲线图，其示出包含来自图4E的箱1、2、3或4的抗LY6G6D臂和抗CD3 40G5c臂的LY6G6D TDB对补充有人PBMC的HT55细胞的体外杀伤。
图4H为一组曲线图，其示出1G4和兔抗LY6G6D抗体6E10、20A12和4H7与Ly6G6D多肽的结合，如使用BIAcore测定所测量。将兔抗体表达为具有兔可变结构域和人恒定结构域的嵌合抗原结合片段(Fab)。将Ly6G6D-Fc直接固定在芯片上，且使Fab在37℃流过。KD在每个曲线图下方指示。
图5A为示意图，其示出根据Kabat编号系统的20A12.QNTv12(双细胞)的重链可变区(SEQ ID NO：22)的氨基酸序列。指示了互补决定区(CDR)CDR H1、CDR H2和CDR H3。根据Kabat编号系统的CDR序列是加下划线的。
图5B为示意图，其示出根据Kabat编号系统的20A12.QNTv12(双细胞)的轻链可变区(SEQ ID NO：23)的氨基酸序列。指示了CDR的CDR H1、CDR H2和CDR H3。根据Kabat定义的CDR序列是加下划线的。
图5C为示意图，其示出20A12.QNTv12(单细胞)的在框架区(FR)2中包含Q39E氨基酸取代突变(加框)的重链可变区(SEQ ID NO：10)的氨基酸序列。这种重链可变区序列对于TDB的单细胞制备特别有用。互补决定区(CDR)CDR H1、CDR H2和CDR H3根据接触、Chothia和Kabat定义指示。根据Kabat定义的CDR序列是加下划线的。
图5D为示意图，其示出20A12.QNTv12(单细胞)的在FR2中包含Q38K突变(加框)的轻链可变区(SEQ ID NO：11)的氨基酸序列。这种轻链可变区序列对于TDB的单细胞制备特别有用。互补决定区(CDR)CDR H1、CDR H2和CDR H3根据接触、Chothia和Kabat定义指示。根据Kabat定义的CDR序列是加下划线的。
图6A为蛋白质结构模型，其示出与包含LY6G6D的氨基酸残基94-103的多肽(RDCYLGDLCN；SEQ ID NO:78)结合的20A12.QNTv12抗体的片段抗原结合区(Fab)。
图6B为蛋白质结构模型的一个区，其示出十个重叠的包含与LY6G6D的氨基酸残基94-103结合的20A12.QNTv12抗体的Fab的复合物。20A12.QNTv12显示为带状图。包含LY6G6D残基94-103的多肽显示为棒状示意图，并标记氨基酸残基。
图6C为蛋白质结构模型的一个区，其示出与LY6G6D的氨基酸残基94-103结合的20A12.QNTv12抗体的重链(HC；粉红色)和轻链(LC；绿色)。包含LY6G6D残基94-103的多肽显示为棒状示意图，并标记氨基酸残基。
图6D为蛋白质结构模型的一个区，其示出与LY6G6D的氨基酸残基94-103结合的20A12.QNTv12抗体的HC(粉红色)和LC(绿色)。包含LY6G6D残基94-103的多肽显示为棒状示意图，其中2Fo-Fc电子密度图的轮廓为1.0σ(蓝色)。
图6E为蛋白质结构模型的一个区，其示出与LY6G6D的氨基酸残基94-103结合的20A12.QNTv12抗体。20A12.QNTv12的重链可变区的CDR H1、CDR H2和CDR H3(分别为H1、H2和H3)以及20A12.QNTv12的轻链可变区的CDR L1、CDR L2和CDR L3(分别为L1、L2和L3)在带状模型中用颜色标记并指示。包含LY6G6D残基94-103的多肽显示为棒状示意图。
图6F为蛋白质结构模型的一个区，其示出与LY6G6D的氨基酸残基94-103结合的20A12.QNTv12抗体。20A12.QNTv12作为空间填充模型示出。标记了20A12.QNTv12的重链可变区的CDR H1、CDR H2和CDR H3(分别为H1、H2和H3)以及20A12.QNTv12的轻链可变区的CDRL1、CDR L2和CDR L3(分别为L1、L2和L3)。标记了20A12.QNTv12的选定残基，并且20A12.QNTv12与LY6G6D多肽之间的相互作用由红色虚线指示。包含LY6G6D残基94-103的多肽显示为棒状示意图。
图7A为蛋白质结构模型的一个区，其示出与LY6G6D的氨基酸残基94-103结合的1G4抗体。1G4的重链可变区的CDR H1、CDR H2和CDR H3以及1G4的轻链可变区CDR L1、CDRL2和CDR L3在带状模型中用颜色标记并指示。包含LY6G6D残基94-103的多肽显示为棒状示意图。
图7B为蛋白质结构模型的一个区，其示出与LY6G6D的氨基酸残基94-103结合的20A12.QNTv12抗体。20A12.QNTv12的重链可变区的CDR H1、CDR H2和CDR H3以及20A12.QNTv12的轻链可变区CDR L1、CDR L2和CDR L3在带状模型中用颜色标记并指示。包含LY6G6D残基94-103的多肽显示为棒状示意图。
图7C为蛋白质结构模型，其示出与包含LY6G6D的氨基酸残基93-104(HRDCYLGDLCNS；SEQ ID NO:87)的多肽结合的20A12.QNTv12抗体的片段抗原结合区(Fab)的重链(SEQ ID NO:96)和轻链(SEQ ID NO:97)；以及LY6G6D残基93-104的序列示意图，其示出20A12.QNTv12与之相互作用的特定残基(橙色并加下划线)。这些残基中的每一个都定位在Fab的范围内。
图7D为蛋白质结构模型的一个区，其示出与包含LY6G6D的氨基酸残基93-104(HRDCYLGDLCNS；SEQ ID NO:87)的多肽结合的20A12.QNTv12抗体的片段抗原结合区(Fab)的重链(SEQ ID NO:96)和轻链(SEQ ID NO:97)。标记了20A12.QNTv12中与LY6G6D多肽相互作用的残基。HC指示残基在20A12.QNTv12重链中；LC指示残基在20A12.QNTv12轻链中。
图7E为蛋白质结构模型，其示出与包含LY6G6D的氨基酸残基93-104(HRDCYLGDLCNS；SEQ ID NO:87)的多肽结合的1G4抗体的片段抗原结合区(Fab)的重链(SEQID NO:94)和轻链(SEQ ID NO:95)；以及LY6G6D残基93-104的序列示意图，其示出1G4与之相互作用的特定残基(橙色并加下划线)。这些残基中的每一个都定位在Fab的范围内。
图7F为蛋白质结构模型的一个区，其示出与包含LY6G6D的氨基酸残基93-104(HRDCYLGDLCNS；SEQ ID NO:87)的多肽结合的1G4抗体的片段抗原结合区(Fab)的重链(SEQID NO:94)和轻链(SEQ ID NO:95)。标记了1G4中与LY6G6D多肽相互作用的残基。HC指示残基在1G4重链中；LC指示残基在1G4轻链中。
图8A为原理示意图，其示出具有与抗LY6G6D 20A12.QNTv12臂(双细胞)(其包含具有形成“杵”区的T366W氨基取代代突变以及N297G突变的Fc区)配对的抗CD3 38E4v1臂(其包含具有形成“臼”区的T366S、L368A和Y407V氨基酸取代突变以及N297G突变的Fc区)的LY6G6D TDB的制备，其中抗CD3臂和抗LY6G6D臂形成全长IgG1KTDB。
图8B为原理示意图，其示出使用两种宿主细胞系(双细胞技术)制备双特异性抗体的工作流程。包含臼区的抗体的第一臂在第一宿主细胞系中产生，并且包含杵区的抗体的第二臂在第二宿主细胞系中产生。抗体的臂从宿主细胞系中纯化并在体外组装。
图8C为原理示意图，其示出使用单一宿主细胞系(单细胞技术)制备双特异性抗体的工作流程。包含臼区的抗体的第一臂和包含杵区的抗体的第二臂在单一宿主细胞系中产生并纯化。抗体的第一臂和第二臂包含如图8D或图8E所示的氨基酸取代突变。
图8D为示意图，其示出使用单一细胞系产生的双特异性抗体。指示了引入电荷对的氨基酸取代突变。电荷对包括第一臂的VH中的Q39K取代突变和第一臂的VL中的Q38E取代突变；第一臂的CH1中的S183E取代突变和第一臂的CL中的V133K取代突变；第二臂的VH中的Q39E取代突变和第二臂的VL中的Q38K取代突变；以及第二臂的CH1中的S183K取代突变和第二臂的CL中的V133E取代突变。
图8E为示意图，其示出使用单一细胞系产生的双特异性抗体。指示了氨基酸取代突变。指示了引入电荷对的氨基酸取代突变。电荷对包括第一臂的VH中的Q39E取代突变和第一臂的VL中的Q38E取代突变；第二臂的VH中的Q39K取代突变和第二臂的VL中的Q38E取代突变；以及第二臂的CH1中的S183E取代突变和第二臂的CL中的V133K取代突变。该抗体还包含第一臂的CH1中的Rosetta YT65突变A141I、F170S、S181M、S183A和V185A突变以及第一臂的CL中的F116A、L135V、S174A、S176F和T178V突变。
图9A为曲线图，其示出包含抗LY6G6D 20A12.QNTv12臂(双细胞)和抗CD3 38E4v1或40G5c臂的LY6G6D TDB对HT55细胞的体外杀伤。在测定中，将杀伤量化为细胞毒性的百分比。以0.01至10,000ng/mL的浓度提供TDB。
图9B为曲线图，其示出包含抗LY6G6D 20A12.QNTv12臂(双细胞)和抗CD3 38E4v1或40G5c臂的LY6G6D TDB对CD4+ T细胞的体外活化。使用荧光活化细胞分选(FACS)测量CD4+ T细胞活化。
图9C为曲线图，其示出包含抗LY6G6D臂20A12.QNTv12(双细胞)和抗CD3臂38E4v1或40G5c的LY6G6D TDB对CD8+ T细胞的体外活化。使用FACS测量CD8+ T细胞活化。
图10A为曲线图，其示出包含抗LY6G6D 20A12.v1臂和抗CD3 38E4v1或40G5c臂、抗LY6G6D 20A12.QNTv12臂(双细胞)和抗CD3 38E4v1或40G5c臂、或者抗LY6G6D 1G4臂和抗CD3 38E4v1或40G5c臂的LY6G6D TDB对HT55细胞的体外杀伤。在测定中，将杀伤量化为细胞毒性的百分比。以0.01至10,000ng/mL的浓度提供TDB。
图10B为曲线图，其示出包含抗LY6G6D 20A12.v1臂和抗CD3 38E4v1或40G5c臂、抗LY6G6D 20A12.QNTv12臂(双细胞)和抗CD3 38E4v1或40G5c臂、或者抗LY6G6D 1G4臂和抗CD3 38E4v1或40G5c臂的LY6G6D TDB对CD4+ T细胞的体外活化。使用FACS测量CD4+ T细胞活化。
图10C为曲线图，其示出包含抗LY6G6D 20A12.v1臂和抗CD3 38E4v1或40G5c臂、抗LY6G6D 20A12.QNTv12臂(双细胞)和抗CD3 38E4v1或40G5c臂、或者抗LY6G6D 1G4臂和抗CD3 38E4v1或40G5c臂的LY6G6D TDB对CD8+ T细胞的体外活化。使用FACS测量CD8+ T细胞活化。
图10D为曲线图，其示出包含抗LY6G6D 20A12.QNTv12臂(双细胞)和抗CD3 38E4v1或40G5c臂、抗LY6G6D 20A12.SNVv12臂和抗CD3 38E4v1或40G5c臂、或者抗LY6G6D6E10.v23臂和抗CD3 38E4v1或40G5c臂的LY6G6D TDB对HT55细胞的体外杀伤。在 测定中，将杀伤量化为细胞毒性的百分比。
图11A为曲线图，其示出包含抗LY6G6D 20A12.QNTv12臂(双细胞)和抗CD3 38E4v1臂的LY6G6D TDB对Colo320DM、HT55和LS1034细胞的体外杀伤。在测定中，将杀伤量化为细胞毒性的百分比。
图11B为一组曲线图，其示出包含抗LY6G6D 20A12.QNTv12臂(双细胞)和抗CD338E4v1臂的LY6G6D TDB对Colo320DM、HT55和LS1034细胞的抗原结合能力，如通过FACS所测量。
图11C为一组显微照片，其示出在细胞沉淀中和在异种移植肿瘤样品中的IHC染色。
图11D为曲线图，其示出包含抗LY6G6D 20A12.QNTv12臂(双细胞)和抗CD3 38E4v1或40G5c臂、或者抗LY6G6D 1G4臂和抗CD3 38E4v1或40G5c臂的LY6G6D TDB在24小时后对补充有来自健康供体的人PBMC的HT55细胞的体外杀伤。
图11E为曲线图，其示出包含抗LY6G6D 20A12.QNTv12臂(双细胞)和抗CD3 38E4v1或40G5c臂、或者抗LY6G6D 1G4臂和抗CD3 38E4v1或40G5c臂的LY6G6D TDB在48小时后对补充有来自健康供体的人PBMC的HT55细胞的体外杀伤。每种TDB的KD在括号中指示。
图11F为曲线图，其示出包含抗LY6G6D 20A12.QNTv12臂(双细胞)和抗CD3 38E4v1臂的LY6G6D TDB对补充有来自十位供体的人PBMC的HT55细胞的体外杀伤。
图11G为曲线图，其示出包含抗LY6G6D 20A12.QNTv12臂(双细胞)和抗CD3 38E4v1臂的LY6G6D TDB对CD8+ T细胞的体外活化。使用FACS测量CD8+ T细胞活化。
图11H为表，其示出十位PBMC供体的细胞杀伤和CD8+ T细胞活化的EC50值。
图11I为曲线图，其示出包含抗LY6G6D 20A12.QNTv12臂(双细胞)和抗CD3 38E4v1臂的LY6G6D TDB在Colo320DM、HT55和LS1034细胞中对CD8+ T细胞的体外活化。使用FACS测量CD8+ T细胞活化。
图12为曲线图，其示出在用包含抗LY6G6D 20A12.QNTv12臂(双细胞)和抗CD338E4.v1臂的LY6G6D TDB治疗后，小鼠中异种移植物COLO320DM肿瘤的肿瘤体积(mm2)。用健康供体外周血单核细胞(PBMC)对小鼠进行人源化。提供包含递送媒介物和PMBC的治疗或者包含TDB但不包含PMBC的治疗作为对照。
图13A为曲线图，其示出包含抗LY6G6D臂rb6E、rb11A11、rb5D3、rb7F2、rb20F12、rb20A12、rb5E4、rb3A4、rb17F11、rb4H7、rb3D3或人源化1G4和抗CD3 40G5c臂的LY6G6D TDB对CD4+ T细胞的体外活化。使用FACS测量CD4+ T细胞活化。
图13B为曲线图，其示出包含抗LY6G6D臂rb6E、rb11A11、rb5D3、rb7F2、rb20F12、rb20A12、rb5E4、rb3A4、rb17F11、rb4H7、rb3D3或人源化1G4和抗CD3 40G5c臂的LY6G6D TDB对CD8+ T细胞的体外活化。使用FACS测量CD8+ T细胞活化。
图13C为曲线图，其示出包含抗LY6G6D臂rb6E、rb11A11、rb5D3、rb7F2、rb20F12、rb20A12、rb5E4、rb3A4、rb17F11、rb4H7、rb3D3或人源化1G4和抗CD3 40G5c臂的LY6G6D TDB对补充有来自供体#2的PMBC的HT55细胞的体外杀伤。在测定中，将杀伤量化为细胞毒性的百分比。
图13D为曲线图，其示出包含抗LY6G6D臂rb6E、rb11A11、rb5D3、rb7F2、rb20F12、rb20A12、rb5E4、rb3A4、rb17F11、rb4H7、rb3D3或人源化1G4和抗CD3 40G5c臂的LY6G6D TDB对CD4+ T细胞的体外活化。使用FACS测量CD4+ T细胞活化。
图13E为曲线图，其示出包含抗LY6G6D臂rb6E、rb11A11、rb5D3、rb7F2、rb20F12、rb20A12、rb5E4、rb3A4、rb17F11、rb4H7、rb3D3或人源化1G4和抗CD3臂40G5c的LY6G6D TDB对CD8+ T细胞的体外活化。使用FACS测量CD8+ T细胞活化。
图14A为曲线图，其示出使用双细胞系统组装并且包含抗LY6G6D 20A12.QNTv12臂(双细胞)和抗CD3臂38E4.v1 MD1、38E4.v1 MD2、38E4.v1 MD3或38E4.v1(WT)的LY6G6D TDB以及使用单细胞系统组装并且包含抗LY6G6D 20A12.QNTv12臂(单细胞)和抗CD3臂38E4.v1MD1,38E4.v1 MD2、38E4.v1 MD3、38E4.v1 MD4或38E4.v1(WT)的TDB对补充有来自供体#1的PMBC的HT55细胞的体外杀伤。MD2、MD3和MD4中已经相对于WT 38E4.v1序列发生突变的特定残基在括号中指示。在测定中，将杀伤量化为细胞毒性的百分比。
图14B为曲线图，其示出使用双细胞系统组装并且包含抗LY6G6D 20A12.QNTv12臂(双细胞)和抗CD3臂38E4.v1 MD1、38E4.v1 MD2、38E4.v1 MD3或38E4.v1(WT)的LY6G6D TDB以及使用单细胞系统组装并且包含抗LY6G6D 20A12.QNTv12臂(单细胞)和抗CD3臂38E4.v1MD1,38E4.v1 MD2、38E4.v1 MD3、38E4.v1 MD4或38E4.v1(WT)的TDB对CD4+ T细胞的体外活化。使用FACS测量CD4+ T细胞活化。
图14C为曲线图，其示出使用双细胞系统组装并且包含抗LY6G6D 20A12.QNTv12臂(双细胞)和抗CD3臂38E4.v1 MD1、38E4.v1 MD2、38E4.v1 MD3或38E4.v1(WT)的LY6G6D TDB以及使用单细胞系统组装并且包含抗LY6G6D 20A12.QNTv12臂(单细胞)和抗CD3臂38E4.v1MD1,38E4.v1 MD2、38E4.v1 MD3、38E4.v1 MD4或38E4.v1(WT)的LY6G6D TDB对CD8+ T细胞的体外活化。使用FACS测量CD8+ T细胞活化。
图15A为曲线图，其示出使用双细胞系统组装并且包含抗LY6G6D 20A12.QNTv12臂(双细胞)和抗CD3臂38E4.v1 MD1、38E4.v1 MD2、38E4.v1 MD3或38E4.v1(WT)的LY6G6D TDB以及使用单细胞系统组装并且包含抗LY6G6D 20A12.QNTv12臂(单细胞)和抗CD3臂38E4.v1MD1,38E4.v1 MD2、38E4.v1 MD3、38E4.v1 MD4或38E4.v1(WT)的TDB对补充有来自供体#2的PMBC的HT55细胞的体外杀伤。在 测定中，将杀伤量化为细胞毒性的百分比。
图15B为曲线图，其示出使用双细胞系统组装并且包含抗LY6G6D 20A12.QNTv12臂(双细胞)和抗CD3臂38E4.v1 MD1、38E4.v1 MD2、38E4.v1 MD3或38E4.v1(WT)的LY6G6D TDB以及使用单细胞系统组装并且包含抗LY6G6D 20A12.QNTv12臂(单细胞)和抗CD3臂38E4.v1MD1,38E4.v1 MD2、38E4.v1 MD3、38E4.v1 MD4或38E4.v1(WT)的LY6G6D TDB对CD4+ T细胞的体外活化。使用FACS测量CD4+ T细胞活化。
图15C为曲线图，其示出使用双细胞系统组装并且包含抗LY6G6D 20A12.QNTv12臂(双细胞)和抗CD3臂38E4.v1 MD1、38E4.v1 MD2、38E4.v1 MD3或38E4.v1(WT)的LY6G6D TDB以及使用单细胞系统组装并且包含抗LY6G6D 20A12.QNTv12臂(单细胞)和抗CD3臂38E4.v1MD1,38E4.v1 MD2、38E4.v1 MD3、38E4.v1 MD4或38E4.v1(WT)的LY6G6D TDB对CD8+ T细胞的体外活化。使用FACS测量CD8+ T细胞活化。
图16A为曲线图，其示出在用包含抗LY6G6D 20A12.QNTv12臂(双细胞)和抗CD340G5c或38E4.v1臂的LY6G6D TDB治疗后，NSGTM小鼠中异种移植物LS1034肿瘤的肿瘤体积(mm2)。用健康供体外周血单核细胞(PBMC)对小鼠进行人源化。提供包含递送媒介物和PMBC的治疗或者包含LY6G6D TDB但不包含PMBC的治疗作为对照。“3+”指示细胞系的LY6G6D IHC评分。
图16B为曲线图，其示出在施用单一剂量的包含抗LY6G6D 20A12.QNTv12臂(双细胞)和抗CD3 40G5c或38E4.v1臂的LY6G6D TDB后，LS1034 NSGTM小鼠中该TDB的血清浓度(以μg/mL为单位)。
图16C为一组曲线图，其示出图16A中所示的肿瘤体积测定的原始数据。
图17A为曲线图，其示出在用包含抗LY6G6D 20A12.QNTv12臂(双细胞)和抗CD340G5c或38E4.v1臂的LY6G6D TDB治疗后，NSGTM小鼠中异种移植物HT55肿瘤的肿瘤体积(mm2)。用健康的供体PBMC对小鼠进行人源化。提供包含递送媒介物和PMBC的治疗或者包含TDB但不包含PMBC的治疗作为对照。“2+”指示细胞系的LY6G6D IHC评分。
图17B为一组曲线图，其示出图17A中所示的肿瘤体积测定的原始数据。
图17C为曲线图，其示出在施用单一剂量的包含抗LY6G6D 20A12.QNTv12臂(双细胞)和抗CD3 40G5c或38E4.v1臂的LY6G6D TDB后，HTT55 NSGTM小鼠中该TDB的血清浓度(以μg/mL为单位)，如使用通用免疫球蛋白药代动力学(GRIP)ELISA所测量。
图18为曲线图和表，其示出在静脉施用单次5mg/kg剂量的抗LY6G6D臂20A12.QNTv12(双细胞)和抗CD3臂40G5c或38E4.v1LY6G6D TDB以及抗gD B56抗体后，严重联合免疫缺陷(SCID)小鼠中这两种抗体的血清浓度(以μg/mL为单位)。Cmax：最大血清浓度；AUC0-28：曲线下面积；CL：清除率；t1/2：半衰期。
图19为原理示意图和表，其示出包含抗LY6G6D 20A12.QNTv12臂(双细胞)和抗CD338E4.v1臂的LY6G6D TDB在食蟹猴(cyno)中的毒性研究。
图20A为曲线图，其示出在静脉施用所指示剂量的包含抗LY6G6D 20A12.QNTv12臂(双细胞)和抗CD3 38E4.v1臂的LY6G6D TDB后，食蟹猴中该TDB的血清浓度(以μg/mL为单位)。
图20B为曲线图，其示出在静脉施用单次1mg/kg剂量的包含与抗CD3 38E4v1或405Gc臂配对的各种肿瘤靶向臂的TDB后，食蟹猴中该TDB的血清浓度(以μg/mL为单位)和清除率(CL)。
图21为一组显微照片，其示出第6003号动物的脑中的血管周围/血管单核浸润物，该动物已给药15mg/kg剂量的包含抗LY6G6D 20A12.QNTv12臂(双细胞)和抗CD3 38E4v1臂的LY6G6D TDB。左上图示出对照(正常)脑膜血管。左下图示出第6003号动物的异常脑膜血管。右图示出异常脑膜血管的放大视图。
图22A为一组曲线图，其示出在用所指示剂量的包含抗LY6G6D 20A12.QNTv12臂(双细胞)和抗CD3 38E4.v1臂的LY6G6D TDB进行单次剂量治疗后的食蟹猴中和在对照(未经治疗的)食蟹猴中，细胞因子G-CSF、IL-1Ra、MCP-1、TNF-a、IL-13和IL-8的浓度(以pg/mL为单位)。
图22B为散点图，其示出在用所指示剂量的包含抗LY6G6D 20A12.QNTv12臂(双细胞)和抗CD3 38E4.v1臂的LY6G6D TDB进行单次剂量治疗后的食蟹猴中和在对照(未经治疗的)食蟹猴中，C反应蛋白的浓度(CRP；以pg/mL为单位)。
图23A为一对曲线图，其示出在流式细胞术测定中，在用所指示剂量的包含抗LY6G6D 20A12.QNTv12臂(双细胞)和抗CD3 38E4.v1臂的LY6G6D TDB进行单次剂量治疗的食蟹猴中和在对照(未经治疗的)食蟹猴中，被选通为表达CD3+/CD4+/CD5+CD25的T辅助(Th)淋巴细胞(左图)和表达CD3+/CD8+/CD5+CD25的T细胞毒性(Tc)淋巴细胞(右图)的细胞百分比。在治疗前7天(第-7天)和治疗当天(第1天前)进行测量并取平均值(给药前平均值)。输注结束(EOI)后，分别在2小时、6小时、24小时和168小时进行测量。用箭头标记显示轻度T细胞活化的峰。
图23B为一对曲线图，其示出在流式细胞术测定中，在用所指示剂量的包含抗LY6G6D 20A12.QNTv12臂(双细胞)和抗CD3 38E4.v1臂的LY6G6D TDB进行单次剂量治疗的食蟹猴中和在对照(未经治疗的)食蟹猴中，被选通为CD45+/CD3+ T淋巴细胞的细胞百分比。用箭头标记显示T细胞恢复的峰。
图23C为一对曲线图，其示出在流式细胞术测定中，在用所指示剂量的包含抗LY6G6D 20A12.QNTv12臂(双细胞)和抗CD3 38E4.v1臂的LY6G6D TDB进行单次剂量治疗的食蟹猴中和在对照(未经治疗的)食蟹猴中，被选通为CD45+/CD20+B淋巴细胞的细胞百分比。用箭头标记显示B细胞恢复的峰。
图23D为一对曲线图，其示出在流式细胞术测定中，在用所指示剂量的包含抗LY6G6D 20A12.QNTv12臂(双细胞)和抗CD3 38E4.v1臂的LY6G6D TDB进行单次剂量治疗的食蟹猴中和在对照(未经治疗的)食蟹猴中，被选通为CD45+/CD16+天然杀伤(NK)淋巴细胞的细胞百分比。
图24A为一对曲线图，其示出包含抗LY6G6D 20A12.QNTv12臂(双细胞)和抗CD338E4.v1臂的LY6G6D TDB对人(左图)和食蟹猴(右图)Ly6G6D多肽的结合，如使用BIAcore测定所测量。将Ly6G6D-Fc直接固定在芯片上，且使TDB在37℃流过。
图24B为一对曲线图，其示出包含抗LY6G6D 20A12.QNTv12臂(双细胞)和抗CD340G5c臂的LY6G6D TDB对人(左图)和食蟹猴(右图)Ly6G6D多肽的结合，如使用BIAcore测定所测量。将Ly6G6D-Fc直接固定在芯片上，且使TDB在37℃流过。
图24C为一对曲线图，其示出包含抗LY6G6D 1G4臂和抗CD3 38E4.v1臂的LY6G6DTDB对人(左图)和食蟹猴(右图)Ly6G6D多肽的结合，如使用BIAcore测定所测量。将Ly6G6D-Fc直接固定在芯片上，且使TDB在37℃流过。
图24D为一对曲线图，其示出包含抗LY6G6D 1G4臂和抗CD3 40G5c臂的LY6G6D TDB对人(左图)和食蟹猴(右图)Ly6G6D多肽的结合，如使用BIAcore测定所测量。将Ly6G6D-Fc直接固定在芯片上，且使TDB在37℃流过。
图25为一组曲线图，其示出包含抗LY6G6D 20A12.QNTv12臂(双细胞)和抗CD3臂38E4.v1(左图)、抗LY6G6D 20A12.QNTv12臂(单细胞)和抗CD3臂38E4.v1 MD1(中图)、或者抗LY6G6D 20A12.QNTv12臂(单细胞)和抗CD3臂38E4.v1 MD4(右图)的LY6G6D TDB与人Ly6G6D多肽的结合。如使用BIAcore测定所测量。将Ly6G6D-Fc直接固定在芯片上，且使TDB在37℃流过。
图26A为曲线图，其示出用使用大细胞系统组装且包含抗LY6G6D 20A12.QNTv12臂(单细胞)和抗CD3臂38E4v1 MD1、38E4v1 MD4或38E4v1(WT)的LY6G6D TDB治疗以及通过使用双细胞系统组装且包含抗LY6G6D 20A12.QNTv12臂(双细胞)和抗CD3 38E4v1(WT)臂的LY6G6D TDB治疗后，NSGTM小鼠中异种移植物HT55肿瘤的肿瘤体积(mm2)。提供包含递送媒介物和PMBC的治疗或者包含TDB但不包含PMBC的治疗作为对照。
图26B为一组曲线图，其示出图26A中所示的肿瘤体积测定的原始数据。
图27为曲线图，其示出使用双细胞系统组装且包含抗LY6G6D 20A12.QNTv12臂(双细胞)和抗CD3 38E4v1(WT)的LY6G6D TDB以及使用单细胞系统组装的包含抗LY6G6D20A12.QNTv12臂(单细胞)和抗CD3 38E4v1 MD1或38E4v1 MD4臂的LY6G6D TDB的血清浓度(以μg/mL为单位)。
图28为曲线图，其示出使用单细胞系统组装的抗LY6G6D 20A12.QNTv12臂(单细胞)和抗CD3 38E4v1 MD1或38E4v1 MD4臂的LY6G6D TDB以及使用双细胞系统组装且包含抗LY6G6D 20A12.QNTv12臂(双细胞)和抗CD3 38E4v1(WT)臂的LY6G6D TDB的血清浓度(以μg/mL为单位)。
图29A为序列比对，其示出抗CD3克隆物38E4v1、40G5c、38E4v1 MD1(MD1)和38E4v1MD4(MD4)的VL的氨基酸序列。互补决定区(CDR)CDR L1、CDR L2和CDR L3根据接触、Chothia和Kabat定义指示。根据Kabat定义的CDR序列是加下划线的。
图29B为序列比对，其示出抗CD3克隆物38E4v1、40G5c、38E4v1 MD1(MD1)和38E4v1MD4(MD4)的VH的氨基酸序列。互补决定区(CDR)CDR L1、CDR L2和CDR L3根据接触、Chothia和Kabat定义指示。根据Kabat定义的CDR序列是加下划线的。
图29C为曲线图，其示出包括抗CD3 38E4v1、MD1、38E4v1.S43P、38E4v1.T51A、38E4v1.K55E和38E4v1.K89T臂的瞬时转染生产测定的结果。
图29D为曲线图，其示出包含抗LY6G6D臂或抗FcRH5臂和抗CD3臂38E4v1(WT)、MD1或具有单个氨基取代(在括号中指示)的变体38E4v1臂的LY6G6D TDB在靶标臂轻链(LC)DNA与抗CD3臂DNA(靶臂LC：CD3 LC)的不同比率下产生的经正确配对的双特异性抗体的百分比。
图29E为曲线图，其示出在向CB-17SCID小鼠(每个时间点n＝3)施用单次5mg/kg剂量的包含抗CD3臂38E4v1、40G5c、MD1、MD4或38E4v1 K55E的单特异性、双价抗CD3抗体后的血清浓度(以μg/mL为单位)。示出抗gD抗体作为对照。单个数据点(符号)与连接的平均值(实线)一起示出。
图29F为序列比对，其示出在框架区(FR)2中包含Q38E氨基酸取代突变(加框)的抗CD3克隆物38E4v1、40G5c、MD1和MD4的VL的氨基酸序列的序列比对。这种轻链可变区序列对于TDB的单细胞制备特别有用。互补决定区(CDR)CDR L1、CDR L2和CDR L3根据接触、Chothia和Kabat定义指示。根据Kabat定义的CDR序列是加下划线的。
图29G为序列比对，其示出在框架区(FR)2中包含Q39K氨基酸取代突变(加框)的抗CD3克隆物38E4v1、40G5c、MD1和MD4的VH的氨基酸序列的序列比对。这种重链可变区序列对于TDB的单细胞制备特别有用。互补决定区(CDR)CDR L1、CDR L2和CDR L3根据接触、Chothia和Kabat定义指示。根据Kabat定义的CDR序列是加下划线的。
图30为曲线图，其示出对于抗LY6G6D 1G4臂的两个制备复制物的瞬时转染生产测定的结果。提供抗CD3臂38E4v1和抗GFR1臂作为对照。
图31A为兔克隆物20A12的轻链(LC)和重链(HC)的示意图，其示出在CDR-L3处的糖基化位点以及在CDR-H1及CDR-L2的两个半胱氨酸残基之间的二硫键。
图31B为一组曲线图，其示出包含兔20A12 CDR以及hIGKV.1-5、hIGKV.1-39和hIGKV.4-1的人轻链框架区的抗LY6G6D臂20A12的变体与hIGHV.3-23和hIGHV.3-30的人重链框架区的结合，如使用BIAcore测定所测量。示出了人类种系序列与rb.20A12序列的百分比同一性和每个变体中游标(Vernier)位置的数量。
图31C为表，其示出各种人VL种系序列与rb.20A12序列的百分比同一性；每个人类种系序列中游标位置的数量；以及该种系序列在人类中的盛行率。
图31D为表，其示出各种人VH种系序列与rb.20A12序列的百分比同一性；每个人类种系序列中游标位置的数量；以及该种系序列在人类中的盛行率。
图32A为兔克隆物20A12的轻链(LC)和重链(HC)的示意图，其示出在CDR-L3处的糖基化位点以及在CDR-H1及CDR-L2的两个半胱氨酸残基之间的二硫键。
图32B为人源化20A12变体20A12.v1的LC和HC的示意图，其示出在CDR-L3处的糖基化位点以及消除在CDR-H1及CDR-L2的两个半胱氨酸残基之间的二硫键的C35S和C50A氨基酸取代突变。20A12.v1包含hIGHV.3-23的VH框架区和hIGKV.1-39的VL框架区。人框架区已在九个位置(圆圈)进行了修饰，以包含源自20A12兔序列的游标残基。
图32C为修整的人源化20A12变体的LC和HC的示意图，其示出在CDR-L3处的糖基化位点以及消除在CDR-H1及CDR-L2的两个半胱氨酸残基之间的二硫键的C35S和C50A氨基酸取代突变。修整的20A12变体包含hIGHV.3-23的VH框架区和hIGKV.1-5的VL框架区。人框架区已在四个位置(圆圈)进行了修饰，以包含源自20A12兔序列的游标残基。
图32D为一对示意图和表，其示出rb.20A12及其各种人源化变体的KD。中列指示相对于hIGHV.3-23的人框架区重链(H)序列和人框架区轻链(L)序列的氨基酸取代突变，这些氨基酸取代突变将该氨基酸位置恢复为兔游标残基。
图33A为表，其示出各种人VL种系序列与rb.6E10序列的百分比同一性；每个人类种系序列中游标位置的数量；以及该种系序列在人类中的盛行率。
图33B为表，其示出各种人VH种系序列与rb.6E10序列的百分比同一性；每个人类种系序列中游标位置的数量；以及该种系序列在人类中的盛行率。
图34A为一组曲线图，其示出rb.20A12和多种具有rb.20A12可变结构域和人恒定区的嵌合Fab与Ly6G6D多肽结合的图，如使用BIAcore测定所测量。每个嵌合Fab在CDR-H1的C35和CDR-H2)的C50中的每一个处包含氨基酸突变，如下：C35S-C50A(SA)、C35S-C50S(SS)、C35I-C50A(IA)、C35I-C50S(IS)和C35I-C50I(II)。指示了每个嵌合Fab的KD。
图34B为序列示意图，其示出具有序列NNT的在rb.20A12的CDR-L3处的糖基化位点；以及表，其示出在糖基化位点处具有氨基酸取代突变的上述修整的人源化20A12轻链序列的变体的KD，如使用对于与LY6G6D结合的BIAcore测定所测量。
图34C为一组曲线图，其示出兔20A12、包含C35I和C50A(IA)突变的兔20A12、以及图34B的在糖基化位点处具有QNT氨基酸取代突变的修整的人源化20A12的Fab变体与LY6G6D的结合，如使用BIAcore测定所测量。将Ly6G6D-Fc捕获在蛋白A芯片上，且使Fab在37℃流过。
图34D为一组曲线图，其示出图34B的在糖基化位点处具有QNV、SNV、GNT和SNA氨基酸取代突变的修整的人源化20A12轻链序列的Fab变体与Ly6G6D多肽的结合，如使用BIAcore测定所测量。将Ly6G6D-Fc捕获在蛋白A芯片上，且使Fab在37℃流过。
图35A为示意图，其示出图32A的兔20A12；以及曲线图，其示出图解的抗体与LY6G6D的结合，如使用BIAcore测定所测量。
图35B为示意图，其示出修整的人源化20A12变体20A12.QNTv12；以及曲线图，其示出图解的抗体与LY6G6D的结合，如使用BIAcore测定所测量。
图36为一组曲线图，其示出20A12.QNTv12、6E10.v114和1G4与人和食蟹猴LY6G6D多肽的结合；以及表，其总结每次测定的KD，如使用BIAcore测定所测量。将Ly6G6D-Fc直接固定在芯片上，且使TDB在37℃流过。
图37为曲线图，其示出对于抗LY6G6D 20A12.QNTv.1和20A12.QNTv12臂的瞬时转染生产测定的结果。提供抗CD3臂38E4v1和抗FGFR1臂作为对照。
图38为表，其示出对于抗LY6G6D 20A12.QNTv12(20A12.ver1.修整的)臂的非特异性清除的杆状病毒(BV)ELISA测定的结果。
图39为表，其示出包含抗LY6G6D 20A12.QNTv12臂和抗CD3 38E4v1或40G5c臂的TDB的分子评估(MA)分析的结果。绿色着色指示对其的测定没有发现明显问题。
图40A为序列比对，其示出20A12的人源化变体的氨基酸序列，这些人源化变体包含rb.20A12的CDR以及人类种系序列hIGHV.3-23或hIGHV.3-30的VH框架区和人类种系序列hIGHV.1-5、hIGKV.1-39或hIGKV.4-1的VL框架区，每个氨基酸序列都具有兔游标残基。指示了互补决定区(CDR)CDR L1、CDR L2和CDR L3。强调了序列之间不同的残基。
图40B为序列比对，其示出rb.20A12以及人源化变体20A12.QNTv.1和20A12.QNTv12的氨基酸序列。指示了互补决定区(CDR)CDR L1、CDR L2和CDR L3。强调了序列之间不同的残基。
图40C为序列比对，其示出人类种系序列hIGHV.3-23的VH、人类种系序列hIGHV.1-5的VL、以及人源化20A12变体20A12 QNTv.1和20A12.QNTv12的VH和VL的氨基酸序列。存在于20A12.QNTv.1和20A12.QNTv12中的兔游标残基用椭圆指示。指示了互补决定区(CDR)CDRL1、CDR L2和CDR L3。强调了序列之间不同的残基。
图41为表，其示出6E10v1 Fab的分子评价(MA)分析的结果。绿色着色指示对其的测定没有发现明显问题；红色着色指示发现问题。
图42为一组曲线图，其示出包含兔6E10 CDR以及人类种系序列hIGHV.3-53、hIGHV.4-4或hIGHV.3-48的VH框架区的抗LY6G6D臂6E10的变体与人类种系序列hIGHV.1-5、hIGKV.3-20或hIGKV.4-1的VL框架区的结合，如使用BIAcore测定所测量。示出了每个变体中的游标位置数。
图43A为序列比对，其示出6E10的人源化变体的氨基酸序列，这些人源化变体包含rb.6E10的CDR以及人类种系序列hIGHV.3-53、hIGHV.4-4或hIGHV.3-48的VH框架区和人类种系序列hIGHV.1-5、hIGKV.3-20或hIGKV.4-1的VL框架区。指示了互补决定区(CDR)CDRL1、CDR L2和CDR L3。强调了序列之间不同的残基。
图43B为序列比对，其示出rb.6E10以及人源化变体6E10.v23和6E10.v114的氨基酸序列。指示了互补决定区(CDR)CDR L1、CDR L2和CDR L3。强调了序列之间不同的残基。
图43C为序列比对，其示出人类种系序列hIGHV.3-53*01的VH、人类种系序列hIGHV.3-20*01的VL、以及rb.6E10和人源化6E10变体6E10.v114的VH和VL的氨基酸序列。存在于rb.6E10和6E10.v114中的兔游标残基用椭圆指示。指示了互补决定区(CDR)CDR L1、CDR L2和CDR L3。强调了序列之间不同的残基。
图43D为序列比对，其示出人类种系序列hIGHV.3-48*01的VH、人类种系序列hIGHV.1-5*01的VL、以及rb.6E10和人源化6E10变体6E10.v23的VH和VL的氨基酸序列。存在于rb.6E10和6E10.v23中的兔游标残基用椭圆指示。指示了互补决定区(CDR)CDR L1、CDRL2和CDR L3。强调了序列之间不同的残基。
具体实施方式
I.定义
如本文所用的术语“约”是指为此技术领域中的技术人员容易知晓的相应值的常见误差范围。在本文中提及“约”值或参数包含(且描述)涉及该值或参数本身的方面。
应当理解，本文所述的发明的方面包括“包含”、“由以下组成”和“基本上由以下组成”的方面。
如本文所用，术语“Ly6G6D”或“淋巴细胞抗原6复合物，基因座G61”是指来自任何脊椎动物来源的任何天然Ly6G6D，该脊椎动物包括哺乳动物如灵长类动物(例如人)和啮齿动物(例如，小鼠和大鼠)，除非另有说明，且涵盖“全长”、未加工的Ly6G6D，以及在细胞中加工产生的任何形式的Ly6G6D。该术语还涵盖Ly6G6D的天然存在变体，包括，例如，剪接变体或等位基因变体。Ly6G6D也称为G6D、Ly6-D、C6orf23、巨核细胞增强基因转录物1(MEGT1)和NG25，并在通过引用全文并入本文的美国专利号7,951,546中作为TAT201公开，具有SEQ IDNO:75的氨基酸序列和SEQ ID NO:76的核苷酸序列DNA234441。Ly6G6D包括例如，人Ly6G6D蛋白(NCBI RefSeq No.NP_067079.2)，其长度为133个氨基酸。
术语“抗LY6G6D抗体”和“结合LY6G6D的抗体”是指这样的抗体，其能够以足够的亲和力结合LY6G6D，使得所述抗体可用作靶向LY6G6D的诊断和/或治疗剂。在一个实施例中，例如通过放射免疫测定(RIA)所测量的，抗LY6G6D抗体与不相关的非LY6G6D蛋白的结合程度小于该抗体与LY6G6D的结合程度的约10％。在某些实施例中，与LY6G6D结合的抗体的解离常数(KD)为≤1μM、≤250nM、≤100nM、≤15nM、≤10nM、≤6nM、≤4nM、≤2nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM或≤0.001nM(例如，10-8M或更小，例如10-8M至10-13M，例如10-9M至10-13M)。在某些实施例中，抗LY6G6D抗体与LY6G6D的表位结合，该表位在来自不同物种的LY6G6D中是保守的。
除非另外指明，否则如本文所用的术语“分化簇3”或“CD3”是指来自任何脊椎动物来源的任何天然CD3，所述脊椎动物来源包括诸如灵长类动物(例如，人)和啮齿动物(例如，小鼠和大鼠)，包括，例如，CD3ε、CD3γ、CD3α和CD3β链。该术语涵盖“全长”的未加工CD3(例如，未加工或未修饰的CD3ε或CD3γ)，以及通过细胞中加工产生的任何形式的CD3。该术语还涵盖CD3的天然存在变体，包括，例如，剪接变体或等位基因变体。CD3包括，例如，长度为207个氨基酸的人CD3ε蛋白(NCBI RefSeq No.NP_000724)和长度为182个氨基酸的人CD3γ蛋白(NCBI RefSeq No.NP_000064)。
术语“抗CD3抗体”和“结合CD3的抗体”是指这样的抗体，其能够以足够的亲和力结合CD3，使得所述抗体可用作靶向CD3的诊断和/或治疗剂。在一个实施例中，例如通过放射免疫测定(RIA)所测量的，抗CD3抗体与不相关的非CD3蛋白的结合程度小于该抗体与CD3的结合程度的约10％。在某些实施例中，与CD3结合的抗体的解离常数(KD)为≤1μM、≤250nM、≤100nM、≤15nM、≤10nM、≤5nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM或≤0.001nM(例如，10-8M或更小，例如10-8M至10-13M，例如10-9M至10-13M)。在某些实施例中，抗CD3抗体与CD3的表位结合，该表位在来自不同物种的CD3中是保守的。
本文的术语“抗体”以最广泛的含义使用，并且涵盖各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和抗体片段(例如，双Fab)，只要它们表现出所需的抗原结合活性即可。
“亲和力”是指分子(例如，抗体)的单个结合位点与其结合配偶体(例如，抗原)之间的非共价交互作用的总和的强度。除非另有说明，否则如本文所用，“结合亲和力”是指内在结合亲和力，其反映了结合对的成员(例如，抗体和抗原)之间的1:1相互作用。分子X对其配偶体Y的亲和力一般可由解离常数(KD)表示。亲和力可以通过本领域已知的常规方法测量，包括本文所述的那些方法。下文描述用于测量结合亲和力的具体的说明性和示例性方面。
“亲和力成熟的”的抗体是指在一个或多个高变区(HVR)中具有一个或多个改变的抗体，与不具有此类改变的亲本抗体相比，此类改变导致了抗体对抗原的亲和力的改善。
术语“全长抗体”、“完整抗体”及“全抗体”在本文中可互换地用于指代具有基本上类似于天然抗体结构的结构或具有含有如本文所定义的Fc区的重链的抗体。
“抗体片段”是指除了完整抗体以外的分子，其包含完整抗体的一部分且结合完整抗体结合的抗原。抗体片段的实例包括但不限于：双Fab；Fv；Fab；Fab，Fab’-SH；F(ab’)2；双体抗体；线性抗体；单链抗体分子(例如，scFv、ScFab)；以及由抗体片段形成的多特异性抗体。
“单结构域抗体”是指包含抗体的全部或部分重链可变结构域或全部或部分轻链可变结构域的抗体片段。在某些方面，单结构域抗体为人单结构域抗体(参见，例如美国专利号6,248,516B1)。单结构域抗体的实例包括但不限于VHH。
Fab片段是通过木瓜蛋白酶消化抗体产生的抗原结合片段并且由完整L链以及H链的可变区结构域(VH)和一条重链的第一恒定结构域(CH1)组成。木瓜蛋白酶消化抗体产生两个相同的Fab片段。胃蛋白酶处理抗体产生单个大F(ab')2片段，其大致相当于两个通过二硫键连接的具有二价抗原结合活性并且仍能够交联抗原的Fab片段。Fab'片段与Fab片段的不同之处在于Fab'片段在CH1结构域的羧基末端添加了一些残基，这些残基包含来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。Fab'-SH是本文中关于其中恒定结构域的半胱氨酸残基带有游离硫醇基的Fab'的命名。F(ab')2抗体片段最初是作为在其间具有铰链半胱氨酸的成对Fab'片段而产生的。抗体片段的其他化学偶合也是已知的。
“Fv”由一个重链可变区结构域和一个轻链可变区结构域的紧密、非共价缔合的二聚体组成。由这两个结构域的折叠产生六个高变环(H链和L链各产生3个环)，这些环贡献氨基酸残基以实现抗原结合，并且时抗体具有抗原结合特异性。但是，即使单个可变结构域(或Fv的一半，仅包含三个对抗原具有特异性的CDR)也具有识别和结合抗原的能力，尽管其亲和力经常低于完整结合位点。
本文的术语“Fc区”用于定义免疫球蛋白重链的C末端区域，该C末端区域包括天然序列Fc区和变体Fc区。尽管免疫球蛋白重链Fc区的边界可能变化，但是人IgG重链Fc区通常被定义为从位置Cys226处的氨基酸残基或从Pro230延伸至该重链的羧基末端。Fc区的C末端赖氨酸(根据EU编号系统的残基447)可在例如抗体的生产或纯化过程中或通过重组设计编码抗体重链的核酸而去除。因此，完整抗体的组合物可包括去除所有Lys447残基的抗体群体、未去除Lys447残基的抗体群体以及具有含和不含Lys447残基的抗体混合物的抗体群体。
“功能性Fc区”具有天然序列Fc区的“效应子功能”。示例性的“效应子功能”包括C1q结合；CDC；Fc受体结合；ADCC；吞噬作用；细胞表面受体(例如，B细胞受体；BCR)的下调等。此类效应子功能通常需要Fc区与结合结构域(例如，抗体可变结构域)组合，并且可使用例如本文定义中所公开的各种测定进行评估。
“天然序列Fc区”包含与自然界中发现的Fc区的氨基酸序列相同的氨基酸序列。天然序列人Fc区包括天然序列人IgG l Fc区(非A和A同种异型)；天然序列人IgG2 Fc区；天然序列人IgG3 Fc区；以及天然序列人IgG4 Fc区及其天然存在的变体。
“变体Fc区”包含不同于天然序列Fc区的氨基酸序列，其借助于至少一个氨基酸修饰、优选一个或多个氨基酸取代而实现。优选地，与天然序列Fc区或亲本多肽的Fc区相比，变体Fc区具有至少一个氨基酸取代，例如，在天然序列的Fc区或亲本多肽的Fc区中具有约一个至约十个氨基酸取代，并且优选地具有约一个至约五个氨基酸取代。本文所述的变体Fc区优选地与天然序列Fc区和/或与亲本多肽的Fc区具有至少约80％的同源性，优选地与其具有至少约90％的同源性，或优选地与其具有至少约95％的同源性。
如本文所用，“Fc复合物”是指两个Fc区的CH3结构域相互作用在一起以形成二聚体，或者在某些方面，两个Fc区相互作用以形成二聚体，其中铰链区和/或CH3结构域中的半胱氨酸残基通过键和/或力(例如，范德华力、疏水力、氢键、静电力或二硫键)相互作用。
如本文所用，“Fc组分”是指Fc区的铰链区、CH2结构域或CH3结构域。
“铰链区”通常定义为从IgG的约残基216延伸至230(EU编号)、从IgG的大约残基226延伸243(Kabat编号)或从约IgG的残基1延伸至15(IMGT唯一编号)。
Fc区的“下铰链区”通常定义为紧邻铰链区C端延伸的一段残基，即Fc区的残基233至239(EU编号)。
“变体Fc区”包含不同于天然序列Fc区的氨基酸序列，其借助于至少一个氨基酸修饰、优选一个或多个氨基酸取代而实现。优选地，与天然序列Fc区或亲本多肽的Fc区相比，变体Fc区具有至少一个氨基酸取代，例如，在天然序列的Fc区或亲本多肽的Fc区中具有约一个至约十个氨基酸取代，并且优选地具有约一个至约五个氨基酸取代。本文所述的变体Fc区优选地与天然序列Fc区和/或与亲本多肽的Fc区具有至少约80％的同源性，并且优选地与其具有至少约90％的同源性，更优选地与其具有至少约95％的同源性。
“Fc受体”或“FcR”是指与抗体的Fc区结合的受体。优选的FcR为天然序列人FcR。此外，优选的FcR是一种结合IgG抗体(一种γ受体)的FcR，并且包括FcγRI、FcγRII和FcγRIII亚类的受体，其包括这些受体的等位基因变体和可变剪接形式。FcγRII受体包括FcγRIIA(“活化受体”)和FcγRIIB(“抑制受体”)，这两者具有相似的氨基酸序列，主要区别在于其胞质结构域。活化受体FcγRIIA在其胞质结构域中包含基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)。抑制受体FcγRIIB在其细胞质结构域中含有基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)(参见Annu.Rev.Immunol.15:203-234,1997中的综述M.)。FcR在Ravetchand Kinet,Annu.Rev.Immunol.9:457-492(1991)；Capel等人，Immunomethods 4:25-34(1994)；和de Haas等人，J.Lab.Clin.Med.126:330-41(1995)中综述。本文中的术语“FcR”涵盖其他FcR，其中包括有待将来鉴定的那些。该术语还包括新生儿受体FcRn，该受体负责将母体IgG转移给胎儿(Guyer等人，J.Immunol.117:587(1976)和Kim等人，J.Immunol.24:249(1994))。
如本文所述，术语“杵臼(knob-into-hole)”或“KnH”技术是指通过在其相互作用的界面将突起(杵)引入一个多肽并将空腔(臼)引入其他多肽，从而引导在体内或体外将两个多肽配对在一起的技术。例如，已在抗体的Fc:Fc相互作用界面、CL:CH1界面或VH/VL界面中引入KnH(参见，例如，US2007/0178552、WO 96/027011、WO 98/050431和Zhu等人，1997,Protein Science 6:781-788)。这尤其可用于在多特异性抗体的制备期间驱动两个不同的重链配对在一起。例如，在其Fc区中具有KnH的多特异性抗体可以进一步包含与各自Fc区连接的单个可变结构域，或进一步包含与相同、相似或不同的轻链可变结构域配对的不同的重链可变结构域。KnH技术还可以用于将两个不同的受体细胞外结构域或包含不同靶标识别序列的任何其他多肽序列配对在一起。
“框架”或“FR”是指除高变区(HVR)残基之外的可变结构域残基。可变结构域的FR通常由以下四个FR结构域组成：FR1、FR2、FR3和FR4。因此，HVR和FR序列通常在VH(或VL)中以如下序列出现：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。
“CH1区”或“CH1结构域”包含从IgG的约残基118到残基215(EU编号)、从IgG的约残基114到223(Kabat编号)或从IgG的约残基1.4到残基121(IMGT唯一编号)延伸的一段残基(Lefranc M-P,Giudicelli V,Duroux P,Jabado-Michaloud J,Folch G,Aouinti S,Carillon E,Duvergey H,Houles A,Paysan-Lafosse T,Hadi-Saljoqi S,Sasorith S,Lefranc G,Kossida S.the international ImMunoGeneTics information25years on.Nucleic Acids Res.2015Jan；43(Database issue):D413-22)。IL-15多肽或IL-15Rα多肽可以直接共价连接至CH1结构域的第一个残基，或者替代性地，可以共价连接至CH1第一个残基的C端位置处的残基。在替代性的方面，IL-15多肽或IL-15Rα多肽可以通过本文定义的接头与CH1共价连接。
人IgG Fc区的“CH2结构域”通常从IgG的约244延伸至约360(Kabat编号)，从IgG的约231延伸至约340(EU编号)，或从IgG的约1.6延伸至约125(IGMT唯一编号)。CH2结构域的独特之处在于它与另一个结构域的配对不紧密。相反，两个N连接的支链碳水化合物链介于完整天然IgG分子的两个CH2结构域之间。据推测，碳水化合物可能为结构域-结构域配对提供替代物，并有助于稳定CH2结构域。Burton,Molec.Immunol.22:161-206(1985)。
“CH3结构域”包含Fc区中CH2结构域C端延伸的一段残基(即，从IgG的约氨基酸残基361到约氨基酸残基478(Kabat编号)，从IgG的约氨基酸残基341到约氨基酸残基447(EU编号)，或从IgG的约氨基酸残基1.4到约氨基酸残基130(IGMT唯一编号))。
“CL结构域”或“恒定轻结构域”包含轻链可变结构域(VL)C端延伸的一段残基。抗体的轻链可以为卡帕(κ)(“Cκ”)或兰姆达(λ)(“Cλ”)轻链区。Cκ区通常从IgG的约残基108延伸到残基214(Kabat或EU编号)或从IgG的约残基1.4延伸到残基126(IMGT唯一编号)。Cλ残基通常从约残基107a延伸到残基215(Kabt编号)或从约残基1.5延伸到残基127(IMGT唯一编号)(Lefranc M-P,Giudicelli V,Duroux P,Jabado-Michaloud J,Folch G,Aouinti S,Carillon E,Duvergey H,Houles A,Paysan-Lafosse T,Hadi-Saljoqi S,Sasorith S,Lefranc G,Kossida S.the international ImMunoGeneTics information25years on.Nucleic Acids Res.2015Jan；43(Database issue):D413-22)。
来源于任何脊椎动物的轻链(LC)基于其恒定结构域的氨基酸序列，可以配属为两种明显不同的类型中的一种，这两种类型分别称为κ和λ。免疫球蛋白基于其重链恒定结构域(CH)的氨基酸序列，可以配属为不同的类别或同种型。存在以下五类免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM具有分别称为α、δ、γ、ε和μ的重链。γ和α类别基于CH序列和功能的相对较小的差异进一步分为子类，例如，人类表达以下子类：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。
如本文所用，术语“带电区”是指多肽(例如抗体)的位置，其包括一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)碱性或酸性氨基酸，当带电区域及其同源带电区域具有相反的总体相对电荷时，这些氨基酸能够与具有一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)或碱性或酸性氨基酸形成电荷对。
如本文所用，术语“电荷对”是指在两个具有相反总电荷的带电区之间形成的键。
术语“嵌合”抗体是指这样的抗体，在所述抗体中重链和/或轻链的一部分来源于特定来源或物种，而重链和/或轻链的其余部分来源于不同的来源或物种。
抗体的“类别”是指抗体的重链所具有的恒定结构域或恒定区的类型。存在五大类抗体：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且这些抗体中的一些可以进一步分为亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。对应于不同类别的免疫球蛋白的重链恒定结构域分别称为α、δ、ε、γ和μ。
“人抗体”是这样的抗体，该抗体具有的氨基酸序列对应于由人或人细胞产生的抗体的氨基酸序列，或来源于利用人抗体全套库或其他人抗体编码序列的非人源的抗体的氨基酸序列。人抗体的该定义特别地排除了包含非人抗原结合残基的人源化抗体。可以使用本领域已知的各种技术产生人抗体，包括噬菌体展示文库。Hoogenboom和Winter.J.Mol.Biol.227:381,1991；Marks等人J.Mol.Biol.222:581,1991。还可用于制备人类单克隆抗体的方法如Cole等人，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,AlanR.Liss,p.77(1985)；Boerner等人，J.Immunol.,147(1):86-95,1991中所述。另见van Dijk和van de Winkel。Curr.Opin.Pharmacol.5:368-74,2001。可以通过向转基因动物施用抗原来制备人抗体，该转基因动物已经修饰以对抗原攻击产生应答而产生此类抗体，但其内源基因座已失效，例如，免疫异种小鼠(参见，例如，U.S.Pat.Nos.6,075,181和6,150,584关于XENOMOUSETM技术)。另见，例如，Li等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA。103:3557-3562,2006关于经由人类B细胞杂交瘤技术生成的人类抗体。
“人共有框架”是这样的框架，其表示在人免疫球蛋白VL或VH框架序列的选择中最常存在的氨基酸残基。一般而言，人免疫球蛋白VL或VH序列的选择来自于可变结构域序列的亚组。一般而言，序列的亚组为如Kabat等人，Sequences of Proteins ofImmunological Interest，第五版，NIH Publication 91-3242,Bethesda MD(1991)，第1-3卷中所述的亚组。在一个方面，对于VL，该亚组为如Kabat等人，出处同上中的亚组κI。在一个方面，对于VH，该亚组是如上述Kabat等人的文献中所述的亚组III。
“人源化”抗体是指这样的嵌合抗体，其包含来自非人HVR的氨基酸残基和来自人FR的氨基酸残基。在某些方面，人源化抗体将基本上包含所有的至少一个，通常两个可变结构域，其中所有或基本上所有的HVR(例如CDR)对应于非人抗体的HVR，并且所有或基本上所有的FR对应于人抗体的FR。在其中人源化抗体的所有或基本上所有的FR均对应于人抗体的FR的某些方面，人源化抗体的任何FR可以含有一个或多个来自非人FR的氨基酸残基(例如，FR的一个或多个游标位置残基)。人源化抗体任选地可以包含来源于人抗体的抗体恒定区的至少一部分。“人源化形式”的抗体，例如，非人抗体，是指已经进行过人源化的抗体。
术语“可变区”或“可变结构域”是指抗体重链或轻链的参与抗体与抗原结合的结构域。天然抗体的重链和轻链的可变结构域(分别为VH和VL)通常具有相似的结构，其中每个结构域包含四个保守框架区(FR)和三个高变区(HVR)。(参见，例如，Kindt等人，KubyImmunology，第6版，W.H.Freeman and Co.，第91页(2007)。)单个VH或VL结构域可足以赋予抗原结合特异性。此外，结合特定抗原的抗体可分别使用来自结合该抗原的抗体的VH或VL结构域来进行分离，以筛选互补VL或VH结构域的文库。参见，例如，Portolano等人J.Immunol.150:880-887,1993；Clarkson等人Nature 352:624-628,1991。
如本文所用的术语“高变区”或“HVR”是指抗体可变结构域中在序列上高变的各个区域(互补决定区或CDR)。通常，抗体包含六个CDR；三个在VH中(CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3)，并且三个在VL中的(CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3)。本文中的示例性CDR包括：
(a)在氨基酸残基26-32(L1)、50-52(L2)、91-96(L3)、26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)处存在的CDR(Chothia和Lesk，J.Mol.Biol.196:901-917,1987)；
(b)在氨基酸残基24-34(L1)、50-56(L2)、89-97(L3)、31-35b(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)处存在的CDR(Kabat等人，Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，第5版，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD(1991))；和
(c)在氨基酸残基27c-36(L1)、46-55(L2)、89-96(L3)、30-35b(H1)、47-58(H2)和93-101(H3)处存在的抗原接触点(MacCallum等人，J.Mol.Biol.262:732-745,1996)。
除非另外指明，否则可变结构域中的HVR残基和其他残基(例如，FR残基)在本文中根据Kabat等人，出处同上编号。
“单链Fv”也缩写为“sFv”或“scFv”，是包含连接至单个多肽链中的VH和VL抗体结构域的抗体片段。优选地，scFv多肽在VH和VL结构域之间进一步包含多肽接头，使scFv形成所需的抗原结合结构。有关scFv的综述，参见Pluckthun的《单克隆抗体的药理学》(ThePharmacology of Monoclonal Antibodies)，第113卷，Rosenburg和Moore主编，Springer-Verlag，New York，第269-315页(1994)；Malmborg等人,J.Immunol.Methods 183:7-13,1995。
“靶向结构域”意为与靶标表位、抗原、配体或受体特异性结合的化合物或分子的一部分。靶向结构域包括但不限于抗体(例如，单克隆抗体、多克隆抗体、重组抗体、人源化抗体和嵌合抗体)、抗体片段或其部分(例如，双-Fab片段、Fab片段、Fab'2、scFab、scFv抗体、SMIP、单结构域抗体、双体抗体、微抗体、scFv-Fc、亲和体、纳米抗体以及抗体的VH和/或VL结构域)、受体、配体、适体、肽靶向结构域(例如，半胱氨酸结蛋白(CKP))和其他具有鉴定出的结合配偶体的分子。靶向结构域可以靶向、阻断、激动或拮抗与它结合的抗原。
如本文所用，术语“单克隆抗体”是指从基本上同质的抗体群体获得的抗体，即，除了可能的变异抗体(例如，含有天然存在的突变或在单克隆抗体制备物的生产过程中产生，此类变体通常以少量形式呈递)之外，包含该群体的各个抗体是相同的和/或结合相同的表位。与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相反，单克隆抗体制剂中的每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。因此，修饰语“单克隆”表示抗体的特征是从基本上同质的抗体群体获得的，并且不应解释为需要通过任何特定方法产生抗体。例如，根据本发明使用的单克隆抗体可通过多种技术制备，包括但不限于杂交瘤方法、重组DNA方法、噬菌体展示方法，以及利用含有全部或部分人免疫球蛋白基因座的转基因动物的方法，在本文中描述了用于制备单克隆抗体的此类方法和其他示例性方法。
术语“多特异性抗体”在最广泛的意义上使用，并且具体涵盖具有多表位特异性的抗体。在一个方面，多特异性抗体与两个不同的靶标结合(例如，双特异性抗体)。此类多特异性抗体包括但不限于，包含重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)的抗体，其中VH/VL单元具有多表位特异性；具有两个或更多个VL和VH结构域的抗体，其中每个VH/VL单元与不同表位结合；具有两个或更多个单可变结构域的抗体，其中每个单可变结构域与不同表位结合；全长抗体；抗体片段诸如Fab、Fv、dsFv、scFv、双体抗体、双特异性双体抗体和三体抗体、共价或非共价连接的抗体片段。“多表位特异性”是指特异性结合相同或不同靶位上的两个或更多个不同表位的能力。“单特异性”是指仅结合一个抗原的能力。在一个方面，单特异性双表位抗体结合相同靶标/抗原上的两个不同表位。在一个方面，单特异性多表位抗体与相同靶标/抗原的多个不同表位结合。根据一个方面，多特异性抗体为以5μM至0.001pM、3μM至0.001pM、1μM至0.001pM、0.5μM至0.001pM、或0.1μM至0.001pM的亲和力与各自表位结合的IgG抗体。
“裸抗体”是指不缀合至异源部分(例如，细胞毒性部分)或放射性标记的抗体。裸抗体可存在于药物制剂中。
“天然抗体”是指具有不同结构的天然存在的免疫球蛋白分子。例如，天然IgG抗体是约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白，由经二硫键合的两条相同轻链和两条相同重链构成。从N端至C端，每条重链均具有可变区(VH)，亦称为可变重链结构域或重链可变结构域，随后为三个恒定结构域(CH1、CH2和CH3)。类似地，自N末端至C末端，各轻链具有可变区(VL)，也称为可变轻链结构域或轻链可变结构域，继之以恒定轻链(CL)结构域。抗体的轻链基于其恒定结构域的氨基酸序列，可以归属于两种类型中的一种，这两种类型称为卡帕(κ)和兰姆达(λ)。
如本文所用，术语“免疫粘附素”表示将异源蛋白(“粘附素”)的结合特异性与免疫球蛋白恒定结构域的效应子功能组合的分子。在结构上，免疫粘附素包含具有所期望的结合特异性的氨基酸序列与免疫球蛋白恒定结构域序列(例如，IgG的CH2和/或CH3序列)的融合物，该氨基酸序列不是抗体的抗原识别和结合位点(即，与抗体的恒定区相比是“异源的”)。粘附素和免疫球蛋白恒定结构域可任选地由氨基酸间隔序列隔开。示例性粘附素序列包括连续的氨基酸序列，其包含与目标蛋白质结合的受体或配体的一部分。粘附素序列也可以为与目标蛋白质结合的序列，但不是受体或配体序列(例如，肽体中的粘附素序列)。此类多肽序列可以通过各种方法选择或鉴定，包括噬菌体展示技术和高通量分选方法。免疫粘附素中的免疫球蛋白恒定域序列可以获自任何免疫球蛋白，诸如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亚型、IgA(包括IgA1和IgA2)、IgE、IgD或IgM。
“化疗剂”包括可用于治疗癌症的化学化合物。化疗剂的实例包括厄洛替尼(Genentech/OSI Pharm.)、硼替佐米(/>MillenniumPharm.)、双硫仑、表没食子儿茶素没食子酸酯、盐孢菌酰胺A(salinosporamide A)、卡非佐米、17-AAG(geldanamycin)、根赤壳菌素、乳酸脱氢酶A(LDH-A)、氟维司群(AstraZeneca)、sunitib(/>Pfizer/Sugen)、来曲唑(Novartis)、甲磺酸伊马替尼(/>Novartis)、finasunate(Novartis)、奥沙利铂(/>Sanofi)、5-FU(5-氟尿嘧啶)、亚叶酸、雷帕霉素(Sirolimus，/>Wyeth)、拉帕替尼(/>GSK572016，Glaxo Smith Kline)、Lonafamib(SCH 66336)、索拉非尼(/>Bayer Labs)、吉非替尼(/>AstraZeneca)、AG1478、烷基化剂如噻替派和环磷酰胺；烷基磺酸盐，例如白消安、英丙舒凡和哌泊舒凡；氮丙啶类，例如苯佐替派(benzodopa)、卡巴醌(carboquone)、美妥替哌(meturedopa)和乌瑞替哌(uredopa)；乙烯亚胺类和甲基蜜胺类，包括六甲密胺、三亚乙基密胺(triethylenemelamine)、三亚乙基磷酰胺(triethylenephosphoramide)、三亚乙基硫代磷酰胺(triethylenethiophosphoramide)和三甲基密胺(trimethylomelamine)；acetogenins(特别是bullatacin和bullatacinone)；喜树碱(包括拓扑替康和伊立替康)；苔藓抑素(bryostatin)；callystatin；CC-1065(包括其adozelesin、carzelesin和bizelesin合成类似物)；念珠藻素类(cryptophycin)(尤其是念珠藻素1和念珠藻素8)；肾上腺皮质类固醇(包括泼尼松和泼尼松龙)；醋酸环丙孕酮；5α-还原酶，包括非那雄胺和度他雄胺)；伏立诺他、罗米地辛、泛比司他、丙戊酸、莫西司他多拉司丁(mocetinostatdolastatin)；阿地白介素、滑石倍癌霉素(包括合成类似物KW-2189和CB1-TM1)；五加素(eleutherobin)；水鬼蕉碱(pancratistatin)；sarcodictyin；海绵抑制素(spongistatin)；氮芥类，如苯丁酸氮芥、萘氮芥(chlomaphazine)、氯磷酰胺、雌莫司汀、异环磷酰胺、甲氮芥、盐酸甲氧氮芥、美法仑、新霉素、苯芥胆甾醇、泼尼莫司汀(prednimustine)、曲洛磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶芥(uracil mustard)；亚硝基脲类，例如卡莫司汀、氯唑霉素、铁莫司汀、洛莫斯汀、尼莫斯汀和雷莫司汀(ranimnustine)；抗生素类，例如烯二炔抗生素类(诸如卡奇霉素(calicheamicin)，特别是卡奇霉素γ1I和卡奇霉素ω1I(Angew Chem.Intl.Ed.Engl.1994 33:183-186)；dynemicin，包括dynemicin A；双膦酸盐类，例如氯膦酸盐；esperamicin；以及新制癌菌素发色团和相关的发色团蛋白烯二炔抗生素发色团)、阿克拉霉素(aclacnomysins)、放线菌素、氨茴霉素(Authramycin)、重氮丝氨酸(azaserine)、博来霉素(bleomycins)、cactinomycin、卡拉比星(carabicin)、洋红霉素(caminomycin)、嗜癌素(carzinophilin)、色霉素(chromomycinis)、更生霉素、道诺霉素、地托比星(detorubicin)、6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸、/>(阿霉素)、吗啉代-阿霉素、氰基吗啉代-阿霉素、2-吡咯烷-阿霉素和脱氧阿霉素)、表柔比星(epirubicin)、伊索比星(esorubicin)、伊达比星(idarubicin)、马赛霉素(marcellomycin)、丝裂霉素例如丝裂霉素C、霉酚酸、诺加霉素、橄榄霉素、培洛霉素(peplomycin)、泊非罗霉素(porfiromycin)、嘌呤霉素、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑菌素(streptonigrin)、链脲霉素、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司、净司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代谢物，例如甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，例如二甲叶酸(denopterin)、甲氨蝶呤、蝶罗呤(pteropterin)、三甲蝶呤；嘌呤类似物，例如氟达拉滨、6-巯基嘌呤、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鸟嘌呤；嘧啶类似物，例如安西他滨(ancitabine)、阿扎胞苷、6-氮杂尿苷、卡莫呋(carmofur)、阿糖胞苷、双脱氧尿苷(dideoxyuridine)、多西氟啶(doxifluridine)、恩诺西汀(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine)；雄激素，例如钙雌酮、屈他雄酮丙酸酯、环硫雄醇、美雄烷、睾内酯；抗肾上腺素，例如氨基谷氨酰胺、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；叶酸补充剂，例如叶酸；醋葡醛内酯(aceglatone)；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamide glycoside)；氨基乙酰丙酸(aminolevulinic acid)；恩尿嘧啶(eniluracil)；安吖啶(amsacrine)；bestrabucil；比生群(bisantrene)；edatraxate；defofamine；地美可辛(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；elfomithine；依利醋铵(elliptinium acetate)；埃博霉素(epothilone)；乙环氧啶(etoglucid)；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖(lentinan)；lonidainine；美登素类(maytansinoids)，例如美登素(maytansine)和安丝菌素(ansamitocins)；米托瓜(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫匹丹醇(mopidamnol)；nitraerine；喷司他丁(pentostatin)；phenamet；吡柔比星(pirarubicin)；洛索蒽醌(losoxantrone)；鬼臼酸(podophyllinic acid)；2-乙基肼；甲苄肼；/>多糖复合物(JHS Natural Products，Eugene，Oreg.)；雷佐生(razoxane)；根瘤菌素(rhizoxin)；sizofuran；锗螺胺(spirogermanium)；细交链格孢酮酸(tenuazonic acid)；三亚胺醌(triaziquone)；2,2',2”-三氯三乙胺；单端孢霉烯族毒素类(特别是T-2毒素，verracurin A，漆斑菌素A(roridin A)和anguidine)；乌拉坦(urethan)；长春地辛(vindesine)；达卡巴嗪(dacarbazine)；甘露莫司汀(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴卫矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；gacytosine；阿糖胞苷(“Ara-C”)；环磷酰胺；塞替派(thiotepa)；紫杉烷类，例如TAXOL(紫杉醇；Bristol-MyersSquibb Oncology，Princeton,N.J.)、/>(不含克列莫佛)、紫杉醇的白蛋白工程化纳米颗粒制剂(American Pharmaceutical Partners，Schaumberg,Ill.)和(多西他赛、多西他赛；Sanofi-Aventis)；苯丁酸氮芥(chloranmbucil)；(吉西他滨)；6-硫鸟嘌呤；巯嘌呤；甲氨蝶呤；铂类似物，例如顺铂和卡铂；长春碱；依托泊苷(VP-16)；异环磷酰胺；米托蒽醌；长春新碱；/>(长春瑞滨)；诺消灵(novantrone)；替尼泊苷；依达曲塞(edatrexate)；道诺霉素(daunomycin)；氨喋呤；卡培他滨/>伊班膦酸盐(ibandronate)；CPT-11；拓扑异构酶抑制剂RFS2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；视黄醇类，例如视黄酸；以及任何上述的药用盐、酸和衍生物。
化疗剂还包括：(i)起到调节或抑制激素对肿瘤的作用的抗激素剂，例如抗雌激素和选择性雌激素受体调节剂(SERM)，包括诸如他莫昔芬(包括枸橼酸他莫昔芬)、雷洛昔芬、屈洛昔芬(droloxifene)、iodoxyfene、4-羟基他莫昔芬、曲奥昔芬(trioxifene)、雷洛昔芬盐酸盐(keoxifene)、LY117018、奥那司酮(onapristone)和(枸橼酸托米芬(toremifine citrate))；(ii)抑制芳香化酶的芳香化酶抑制剂，该酶可调节肾上腺的雌激素产生，例如4(5)-咪唑、氨鲁米特(aminoglutethimide)、/>(醋酸甲地孕酮)、/>(依西美坦；Pfizer)、福美司坦(formestanie)、法屈唑(fadrozole)、/>(伏洛唑(vorozole))、/>(来曲唑；Novartis)和/>(阿那曲唑；AstraZeneca)；(iii)抗雄激素，例如氟他胺(flutamide)，尼鲁米特(nilutamide)、比卡鲁胺(bicalutamide)、亮丙瑞林(leuprolide)和戈舍瑞林(goserelin)；布舍瑞林(buserelin)、曲普瑞林(tripterelin)、醋酸甲羟孕酮、己烯雌酚、倍美力、氟甲睾酮、所有反式视黄酸、维甲酰酚胺(fenretinide)以及曲沙他滨(1,3-二氧戊环核苷胞嘧啶类似物)；(iv)蛋白激酶抑制剂；(v)脂质激酶抑制剂；(vi)反义寡核苷酸，特别是那些抑制与异常细胞增殖有关的信号传导途径中的基因表达的寡核苷酸，例如PKC-α、Ralf和H-Ras；(vii)核酶，例如VEGF表达抑制剂(如/>)和HER2表达抑制剂；(viii)疫苗，例如基因治疗疫苗，诸如/>和/> rIL-2；拓扑异构酶1抑制剂，例如/>/>以及(ix)任何上述的药用盐、酸和衍生物。
化疗剂还包括抗体，例如阿仑单抗(Campath)、贝伐单抗(Genentech)；西妥昔单抗(/>Imclone)；帕尼单抗(/>Amgen)、利妥昔单抗(rituximab)(/>Genentech/Biogen Idec)、帕妥珠单抗(2C4，Genentech)、曲妥珠单抗(trastuzumab)(/>Genentech)、托西莫单抗(tositumomab)(Bexxar，Corixia)和抗体药缀合物、吉妥珠单抗奥佐米星(/>Wyeth)。与本发明的化合物联用作为试剂具有治疗潜力的其它人源化单克隆抗体包括：阿泊珠单抗(apolizumab)、阿塞珠单抗(aselizumab)、阿替珠单抗(atlizumab)、巴匹珠单抗(bapineuzumab)、莫比伐珠单抗(bivatuzumab mertansine)、莫坎妥珠单抗(cantuzumab mertansine)、西地珠单抗(cedelizumab)、聚乙二醇结合赛妥珠单抗(certolizumab pegol)、cidfusituzumab、cidtuzumab、达利珠单抗(daclizumab)、依库珠单抗(eculizumab)、依法珠单抗(efalizumab)、依帕珠单抗(epratuzumab)、厄立珠单抗(erlizumab)、泛维珠单抗(felvizumab)、芳妥珠单抗(fontolizumab)、吉妥珠单抗奥佐米星(gemtuzumab ozogamicin)、奥英妥珠单抗奥佐米星(inotuzumab ozogamicin)、伊匹单抗(ipilimumab)、拉贝珠单抗(labetuzumab)、林妥珠单抗(lintuzumab)、马妥珠单抗(matuzumab)、美泊利单抗(mepolizumab)、莫维珠单抗(motavizumab)、motovizumab、那他珠单抗、尼妥珠单抗、nolovizumab、numavizumab、ocrelizumab、奥马珠单抗、帕利珠单抗、帕考珠单抗、pecfusituzumab、帕妥珠单抗(pectuzumab)、培克珠单抗(pexelizumab)、ralivizumab、兰尼单抗(ranibizumab)、reslivizumab、瑞利珠单抗(reslizumab)、resyvizumab、罗维珠单抗(rovelizumab)、卢利珠单抗(ruplizumab)、西罗珠单抗(sibrotuzumab)、西利珠单抗(siplizumab)、索土珠单抗(sontuzumab)、tacatuzumabtetraxetan、他度珠单抗(tadocizumab)、他利珠单抗(talizumab)、替非珠单抗(tefibazumab)、托珠单抗(tocilizumab)、托利珠单抗(toralizumab)、西莫白介素单抗(tucotuzumab celmoleukin)、tucusituzumab、乌玛珠单抗(umavizumab)、乌珠单抗(urtoxazumab)、优特克单抗(ustekinumab)、维西珠单抗(visilizumab)和抗白介素12(ABT-874/J695，Wyeth Research and Abbott Laboratories)，这是一种经基因修饰以识别白介素12p40蛋白的重组的专门用于人类序列的全长IgG1λ抗体。
化疗剂还包括“EGFR抑制剂”，是指与EGFR结合或直接相互作用并且阻止或降低其信号传导活性的化合物，并且替代地称为“EGFR拮抗剂”。此类试剂的实例包括与EGFR结合的抗体和小分子。与EGFR结合的抗体的示例包括MAb 579(ATCC CRL HB 8506)、MAb 455(ATCC CRL HB8507)、MAb 225(ATCC CRL 8508)、MAb 528(ATCC CRL 8509)(参见，美国专利号4,943,533，Mendelsohn等人)及其变体，例如嵌合的225(C225或西妥昔单抗；)和重塑的人225(H225)(参见，WO 96/40210，Imclone Systems Inc.)；IMC-11F8，一种靶向EGFR的完全人抗体(Imclone)；结合II型突变体EGFR的抗体(美国专利号5,212,290)；如美国专利号5,891,996中所述结合EGFR的人源化和嵌合抗体；以及结合EGFR的人抗体，卡诸如ABX-EGF或帕尼单抗(参见WO98/50433，安尼克斯(Abgenix)/Amgen)；EMD55900(Stragliotto等人Eur.J.Cancer 32A:636-640(1996))；EMD7200(马妥珠单抗)，一种针对EGFR的人源化EGFR抗体，与EGF和TGF-α竞争而与EGFR结合(EMD/默克公司(Merck))；人EGFR抗体，HuMax-EGFR(GenMab)；完全人抗体，称为E1.1、E2.4、E2.5、E6.2、E6.4、E2.11、E6。3和E7.6.3，并在US 6,235,883中进行了描述；MDX-447(梅达雷克斯公司(Medarex Inc))；以及mAb 806或人源化mAb 806(Johns等人,J.Biol.Chem.279(29):30375-30384(2004))。可以将抗EGFR抗体与细胞毒性剂缀合，从而生成免疫缀合物(参见，例如，EP659,439A2，默克专利公司(Merck Patent GmbH))。EGFR拮抗剂包括小分子，例如美国专利号5,616,582、5,457,105、5,475,001、5,654,307、5,679,683、6,084,095、6,265,410、6,455,534、6,521,620、6,596,726、6,713,484、5,770,599、6,140,332、5,866,572、6,399,602、6,344,459、6,602,863、6,391,874、6,344,455、5,760,041、6,002,008和5,747,498，以及以下PCT出版物：WO98/14451、WO98/50038、WO99/09016和WO99/24037中所述描述的化合物。特定的小分子EGFR拮抗剂包括OSI-774(CP-358774，厄洛替尼，/>Genentech/OSIPharmaceuticals)；PD 183805(CI 1033，2-丙烯酰胺，N-[4-[(3-氯-4-氟苯基)氨基]-7-[3-(4-吗啉基)丙氧基]-6-喹唑啉基]-，二盐酸盐，辉瑞公司)；ZD1839，吉非替尼(4-(3’-氯-4’-氟苯胺基)-7-甲氧基-6-(3-吗啉代丙氧基)喹唑啉，阿斯利康)；ZM 105180((6-氨基-4-(3-甲基苯基-氨基)-喹唑啉，捷利康公司(Zeneca))；BIBX-1382(N8-(3-氯-4-氟-苯基)-N2-(1-甲基-哌啶-4-基)-嘧啶基[5,4-d]嘧啶-2,8-二胺，勃林格殷格翰(Boehringer Ingelheim))；PKI-166((R)-4-[4-[(1-苯乙基)氨基]-1H-吡咯烷酮[2,3-d]嘧啶-6-基]-苯酚)；(R)-6-(4-羟苯基)-4-[(1-苯乙基)氨基]-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶)；CL-387785(N-[4-[(3-溴苯基)氨基]-6-喹唑啉基]-2-丁炔酰胺)；EKB-569(N-[4-[(3-氯-4-氟苯基)氨基]-3-氰基-7-乙氧基-6-喹啉基]-4-(二甲基氨基)-2-丁烯酰胺)(惠氏)；AG1478(辉瑞)；AG1571(SU 5271；辉瑞)；双重EGFR/HER2酪氨酸激酶抑制剂，诸如拉帕替尼(/>GSK572016或N-[3-氯-4-[(3氟苯基)甲氧基]苯基]-6[5[[[2(甲基磺酰基)乙基]氨基]甲基]-2-呋喃基]-4-喹唑啉胺)。
化疗剂还包括“酪氨酸激酶抑制剂”，包括上段所述的EGFR靶向药物；小分子HER2酪氨酸激酶抑制剂，诸如可从武田制药公司(Takeda)获得的TAK165；CP-724714，一种ErbB2受体酪氨酸激酶的口服选择性抑制剂(辉瑞和OSI)；双重HER抑制剂，诸如EKB-569(可从惠氏获得)，其优先结合EGFR但同时抑制过表达HER2和EGFR的细胞；拉帕替尼(GSK572016；可从葛兰素史克公司获得)，一种口服HER2和EGFR酪氨酸激酶抑制剂；PKI-166(可从诺华公司获得)；泛HER抑制剂，诸如卡那替尼(CI-1033；法玛西亚公司(Pharmacia))；Raf-1抑制剂，诸如可从ISIS制药公司获得的抑制Raf-1信号传导的反义剂ISIS-5132；非HER靶向的TK抑制剂，诸如甲磺酸伊马替尼(可从葛兰素史克公司获得)；多靶向酪氨酸激酶抑制剂，诸如舒尼替尼(/>可从辉瑞获得)；VEGF受体酪氨酸激酶抑制剂，诸如瓦他拉尼(PTK787/ZK222584，可从诺华/先灵公司(Schering AG)获得)；MAPK细胞外调节的激酶I抑制剂CI-1040(可从法玛西亚公司获得)；喹唑啉类，诸如PD 153035,4-(3-氯苯胺基)喹唑啉；吡啶并嘧啶类；嘧啶并嘧啶类；吡咯并嘧啶类，诸如CGP 59326、CGP 60261和CGP62706；吡唑并嘧啶类，4-(苯氨基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶；姜黄素(二氟甲酰甲烷，4,5-双(4-氟苯胺基)邻苯二甲酰亚胺)；含有硝基噻吩部分的酪氨酸酪氨酸；PD-0183805(华纳-兰伯特公司(Warner-Lamber))；反义分子(例如与HER编码核酸结合的分子)；喹噁啉类(美国专利号5,804,396)；酪氨酸磷酸化抑制剂(美国专利号5,804,396)；ZD6474(阿斯利康)；PTK-787(诺华/先灵公司)；泛HER抑制剂，诸如CI-1033(辉瑞)；Affinitac(ISIS 3521；Isis/礼来制药公司(Lilly))；甲磺酸伊马替尼/>PKI166(诺华公司)；GW2016(葛兰素史克公司)；CI-1033(辉瑞)；EKB-569(惠氏)；塞马替尼(辉瑞)；ZD6474(阿斯利康)；PTK-787(诺华/先灵公司)；INC-1C11(Imclone),、雷帕霉素(西罗莫司，)；或以下任何专利出版物中所述：美国专利号5,804,396、WO 1999/09016(American Cyanamid)、WO 1998/43960(American Cyanamid)、WO 1997/38983(WarnerLambert)、WO 1999/06378(Warner Lambert)、WO 1999/06396(Warner Lambert)、WO 1996/30347(Pfizer,Inc)、WO 1996/33978(Zeneca)、WO 1996/3397(Zeneca)和WO 1996/33980(Zeneca)。
化疗剂还包括地塞米松、干扰素、秋水仙碱、氯苯氨啶(metoprine)、环孢菌素、两性霉素、甲硝唑、阿仑单抗(alemtuzumab)、阿利维甲酸(alitretinoin)、别嘌醇(allopurinol)、氨磷汀(amifostine)、三氧化二砷、天冬酰胺酶、活BCG、贝伐珠单抗、贝沙罗汀(bexarotene)、克拉屈滨(cladribine)、克罗拉滨(clofarabine)、达依泊汀α(darbepoetin alfa)、地尼白介素(denileukin)、右雷佐生(dexrazoxane)、依泊汀α(epoetin alfa)、厄洛替尼(elotinib)、非格司亭(filgrastim)、醋酸组氨瑞林(histrelinacetate)、替伊莫单抗(ibritumomab)、干扰素α-2a、干扰素α-2b、来那度胺(lenalidomide)、左旋咪唑、美司钠(mesna)、甲氧沙林、诺龙(nandrolone)、奈拉滨(nelarabine)、诺非妥莫单抗(nofetumomab)、奥普瑞白介素(oprelvekin)、帕利夫明(palifermin)、帕米膦酸钠(pamidronate)、培加酶(pegademase)、培门冬酶(pegaspargase)、培非格司亭(pegfilgrastim)、培美曲塞二钠(pemetrexed disodium)、光辉霉素(plicamycin)、卟吩姆钠(porfimer sodium)、奎纳克林(quinacrine)、拉布立酶(rasburicase)、沙格司亭(sargramostim)、替莫唑胺(temozolomide)、VM-26、6-TG、托瑞米芬(toremifene)、维甲酸(tretinoin)、ATRA、戊柔比星(valrubicin)、唑来膦酸盐(zoledronate)和唑来膦酸(zoledronic acid)及其药用盐。
化疗剂还包括氢化可的松、醋酸氢化可的松、醋酸可的松、特戊酸硫氢可的松、曲安奈德、曲安奈德醇、莫米松、安西奈德、布地奈德、地奈德、醋酸氟氢松、肤轻松、倍他米松、磷酸倍他米松钠、地塞米松、磷酸地塞米松钠、氟可龙、氢化可的松-17-丁酸酯、氢化可的松-17-戊酸酯、二丙酸阿氯米松(aclometasone dipropionate)、戊酸倍他米松、二丙酸倍他米松、泼尼卡酯、氯倍他松-17-丁酸酯、氯倍他索-17-丙酸酯、氟可龙己酸酯、氟可龙戊酸酯和醋酸氟泼尼定；免疫选择性抗炎肽(ImSAID)，诸如苯丙氨酸-谷氨酰胺-甘氨酸(FEG)及其D-异构体形式(feG)(伊姆兰生物治疗剂有限公司(IMULAN BioTherapeutics，LLC))；抗风湿药物，诸如硫唑嘌呤、环孢素(环孢霉素A)、D-青霉胺、金盐、羟氯喹、来氟米特、米诺环素、柳氮磺吡啶；肿瘤坏死因子α(TNFα)阻断剂，诸如依那西普(Enbrel)、英夫利昔单抗(Remicade)、阿达木单抗(Humira)、赛妥珠单抗(Cimzia)、戈利木单抗(Simponi)；白介素1(IL-1)阻断剂，诸如阿那白滞素(Kineret)；T细胞共刺激阻断剂，诸如阿巴西普(Orencia)；白介素6(IL-6)阻断剂，诸如托珠单抗白介素13(IL-13)阻断剂，诸如来瑞珠单抗(lebrikizumab)；干扰素α(IFN)阻断剂，诸如罗那珠单抗；β7整联蛋白阻断剂，诸如rhuMAbβ7；IgE通路阻断剂，诸如抗M1引物；分泌的同源三聚体LTa3和膜结合异源三聚体LTa1/β2阻断剂，诸如抗淋巴毒素α(LTa)；放射性同位素(例如At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212和Lu的放射性同位素)；各种各样的试验药剂，诸如硫铂、PS-341、苯基丁酸酯、ET-18-OCH3或法呢基转移酶抑制剂(L-739749,L-744832)；多酚类物质，诸如槲皮素、白藜芦醇、苦味酚、表没食子儿茶素没食子酸酯、茶黄素、黄烷醇、原花青素、桦木酸及其衍生物；自噬抑制剂，诸如氯喹；δ-9-四氢大麻酚(屈大麻酚，/>)；β-拉帕酮；拉帕酚；秋水仙碱；桦木酸；乙酰喜树碱、莨菪亭(scopolectin)和9-氨基喜树碱)；鬼臼毒素；替加氟/>贝沙罗汀/>双膦酸盐，诸如氯膦酸盐(例如，/>或/>)、依替膦酸盐/>NE-58095、唑来膦酸/唑来膦酸盐/>阿仑膦酸盐/>帕米膦酸盐/>替罗膦酸盐/>或利塞膦酸盐/>和表皮生长因子受体(EGF-R)；疫苗，诸如/>疫苗；哌立福辛；COX-2抑制剂(例如，塞来昔布或依托昔布)；蛋白体抑制剂(例如，PS341)；CCI-779；替吡法尼(R11577)；奥拉非尼，ABT510；Bcl-2抑制剂，诸如奥利美森钠(oblimersen sodium)/>匹杉琼(pixantrone)；法呢基转移酶抑制剂，诸如洛那法尼(lonafarnib)(SCH 6636,SARASARTM)；以及以上任一项的药用盐、酸或衍生物；以及上述两种或多种的组合，诸如CHOP(环磷酰胺、阿霉素、长春新碱和泼尼松龙的组合疗法的缩写)；以及FOLFOX(奥沙利铂(ELOXATINTM)与5-FU和亚叶酸钙组合治疗方案的缩写)。
化疗剂还包括具有镇痛、解热和抗炎作用的非甾体抗炎药。NSAID包括环氧化酶的非选择性抑制剂。NSAID的具体示例包括阿司匹林、丙酸衍生物(诸如布洛芬、芬诺洛芬、酮洛芬、氟比洛芬、奥沙普嗪和萘普生)、乙酸衍生物(诸如吲哚美辛、舒林酸、依托度酸、双氯芬酸)、烯醇酸衍生物(诸如吡罗昔康、美洛昔康、替诺昔康、屈昔康和氯诺昔康)、芬那酸衍生物(诸如甲芬那酸、甲氯芬那酸、氟苯那酸、甲苯磺那酸)和COX-2抑制剂(诸如塞来昔布、依托考昔、鲁美昔布、派瑞昔布、罗非考昔和伐地昔布)。NSAID可适用于减轻病症的症状，诸如类风湿性关节炎、骨关节炎、炎性关节炎、强直性脊柱炎、银屑病关节炎、莱特综合征、急性痛风、痛经、转移性骨痛、头痛和偏头痛、术后疼痛、由于炎症和组织损伤、发热、肠梗阻和肾绞痛引起的轻度至中度疼痛。
如本文所用，术语“细胞毒性剂”是指抑制或阻止细胞功能和/或导致细胞死亡或破坏的物质。细胞毒性剂包括但不限于放射性同位素(例如，At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212和Lu的放射性同位素)；化疗剂或药物(例如甲氨蝶呤、阿霉素、长春花生物碱(长春新碱、长春花碱、依托泊苷)、多柔比星、美法仑、丝裂霉素C、苯丁酸氮芥、柔红霉素或其他嵌入剂)；生长抑制剂；酶及其片段诸如溶核酶；抗生素；毒素诸如细菌、真菌、植物或动物来源的小分子毒素或酶活性毒素，包括其片段和/或变体；以及以下公开的各种抗肿瘤或抗癌药物。
“病症”是将从治疗获益的任何病状，包括但不限于慢性和急性病症或疾病，包括那些使哺乳动物易患所述病症的病理性病状。在一个方面，疾患为癌症，例如，结直肠癌。
术语“细胞增殖性疾病”和“增殖性疾病”是指与某种程度的异常细胞增殖相关的病症。在一个方面，细胞增殖性疾患为癌症。在一个方面，细胞增殖性疾患为肿瘤。
如本文所用，术语“肿瘤”是指所有赘生性细胞生长和增殖，无论是恶性还是良性，以及所有前癌性和癌性细胞和组织。术语“癌症”、“癌性”、“细胞增生性病症”、“增生性病症”和“肿瘤”在本文中并不互相排斥。
术语“癌症”和“癌性”是指或描述哺乳动物中通常以细胞生长/增殖不受控制为特征的生理状况。癌症方面包括实体瘤癌症和非实体瘤癌症。实体癌肿瘤包括但不限于结直肠癌、黑素瘤、乳腺癌、肺癌、头颈部癌、膀胱癌、肾癌、卵巢癌、胰腺癌或前列腺癌，或其转移形式。癌症可能是LY6G6D阳性癌症。
在一些方面，癌症为结直肠癌。如本文所用，术语“结直肠癌”、“CRC”、“结肠癌”或“肠癌”是指从大肠，例如结肠或直肠发展而来的癌症。在一些方面，CRC为左侧肿瘤，即，肿瘤发生在远端结肠中(例如，横结肠的远端三分之一、脾曲、降结肠、乙状结肠或直肠)。在其他方面，CRC为右侧肿瘤，即，肿瘤发生在近端结肠中(例如，横结肠的近端三分之二、升结肠和盲肠)。右侧肿瘤可能与降低的OS相关联。在一些方面，CRC为转移性的。在一些方面，CRC具有的微卫星不稳定性状态为“微卫星稳定”(“MSS”)或“微卫星不稳定性低”(“MSI-L”)。在其他方面，CRC具有的微卫星不稳定性状态为“微卫星不稳定性高”(“MSI-H”)。在一些方面，CRC为LY6G6D阳性(LY6G6D+)CRC。
如本文所用，“微卫星不稳定性状态”或“MSI状态”是指患者肿瘤组织中微卫星稳定性的表征。患者的肿瘤组织可以表征为“微卫星不稳定性高”(“MSI-H”)、“微卫星不稳定性低”(“MSI-L”)或“微卫星稳定”(“MSS”)。例如，可以通过使用基于PCR的方法来评估MSI状态，诸如MSI分析系统(Promega,Madison,WI)，它由5个假单态单核苷酸重复序列(BAT-25、BAT-26、NR-21、NR-24和MONO-27)构成以检测MSI和2个五核苷酸基因座(PentaC和PendaD)，以确认正常与肿瘤样品之间的同一性。每个微卫星基因座的碱基大小可以例如通过凝胶电泳确定，并且如果两个或更多个单核苷酸基因座与种系DNA相比长度不同，则可以将肿瘤指定为MSI-H。参见例如Le等人NEJM 372:2509-2520,2015。
在一些方面，根据美国癌症联合委员会(AJCC)/国际癌症控制联盟(UICC)恶性肿瘤TNM分类(TNM)分类系统评估CRC的分期。在TNM系统中，将癌症指定为字母T(肿瘤大小)、N(可触及的结节)和/或M(转移灶)。T1、T2、T3和T4描述原发灶的大小增加。T1、T2、T3和T4可另外分类为a或b(例如，T4a或T4b)，以提供有关癌症状态(例如，局部进展)的进一步信息。N0、N1、N2、N3表示渐进性节点受累；且M0和M1反映远端转移的不存在或存在。在一些方面，个体的CRC为I期、II期或III期CRC，例如I期、II期或III期结肠癌。在一些方面，个体没有IV期CRC。在一些方面，个体没有转移性CRC。在一些方面，参考群体中个体的CRC为I期、II期、III期或IV期CRC，例如I期、II期、III期或IV期结肠癌。
在一些方面，癌症为乳腺癌。乳腺癌的进一步方面包括激素受体阳性(HR+)乳腺癌，例如雌激素受体阳性(ER+)乳腺癌、孕酮受体阳性(PR+)乳腺癌或ER+/PR+乳腺癌。乳腺癌的其他方面包括HER2阳性(HER2+)乳腺癌。乳腺癌的其他方面还包括三阴性乳腺癌(TNBC)。在一些方面，乳腺癌为早期乳腺癌。在一些方面，癌症为肺癌。肺癌的进一步方面包括表皮生长因子受体阳性(EGFR+)肺癌。肺癌的其他方面包括表皮生长因子受体阴性(EGFR-)肺癌。肺癌的其他方面还包括非小细胞肺癌，例如鳞状肺癌或非鳞状肺癌。肺癌的其他方面包括小细胞肺癌。在一些方面，癌症为头颈部癌。头颈部癌的进一步方面包括头颈部鳞状细胞癌(SCCHN)。在一些方面，癌症为膀胱癌。膀胱癌的其他方面包括尿路上皮癌(UBC)、肌肉浸润性膀胱癌(MIBC)或非肌肉浸润性膀胱癌(NMIBC)。在一些方面，癌症为肾癌。肾癌的进一步方面包括肾细胞癌(RCC)。在一些方面，癌症为肝癌。肝癌的进一步方面包括肝细胞癌。在一些方面，癌症为前列腺癌。前列腺癌的进一步方面包括去势抵抗性前列腺癌(CRPC)。在一些方面，癌症是实体瘤的转移形式。在一些方面，实体瘤的转移形式是黑素瘤、乳腺癌、结直肠癌、肺癌、头颈部癌、膀胱癌、肾癌、卵巢癌、胰腺癌或前列腺癌的转移形式。在一些方面，癌症为非实体瘤癌症。非实体瘤癌症包括但不限于血液学癌症，例如B细胞淋巴瘤。B细胞淋巴瘤的进一步方面包括，例如，慢性淋巴细胞白血病(CLL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、滤泡性淋巴瘤、骨髓增生异常综合征(MDS)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、多发性骨髓瘤、急性髓性白血病(AML)或蕈状真菌病(MF)。
“效应子功能”是指可归因于抗体的Fc区、随着抗体同种型的变化而变化的那些生物学活性。抗体效应子功能的实例包括：C1q结合和补体依赖性细胞毒性(CDC)；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体(例如，B细胞受体)的下调；以及B细胞活化。
“补体依赖性细胞毒性”或“CDC”是指在补体存在下靶细胞的裂解。经典补体途径的活化通过补体系统的第一种成分(C1q)结合至与其同源性抗原结合的抗体(适当的亚类)而开始。为评估补体活化，可执行CDC测定，例如，如Gazzano-Santoro等人J.Immunol.Methods 202:163(1996)中所述。
“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”或“ADCC”是指一种细胞毒性形式，其中分泌的Ig结合到存在于某些细胞毒性细胞(例如，自然杀伤(NK)细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞)上的Fc受体(FcR)上，使这些细胞毒性效应细胞与带有抗原的靶标细胞特异性结合，随后用细胞毒性剂杀死靶标细胞。抗体“武装”细胞毒性细胞，并且是此类杀伤作用所必需的。介导ADCC的主要细胞NK细胞仅表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。造血细胞上的FcR表达总结在Ravetch和Kinet.Annu.Rev.Immunol.9:457-92,1991第464页的表3中。为评估目标分子的ADCC活性，可执行体外ADCC测定，诸如美国专利号5,500,362或5,821,337中所述。用于此类测定的有用效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和自然杀伤(NK)细胞。替代性地或另外地，目标分子的ADCC活性可以在体内评估，例如，在动物模型(诸如在Clynes等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA.95:652-656,1998中公开的)中评估。
如本文所用，“复合”或“复合的”是指通过非肽键的键和/或力(例如，范德华力、疏水力、亲水力)彼此相互作用的两个或更多个分子的缔合。在一个方面，复合物为异源多聚体。应当理解，如本文所用，术语“蛋白质复合物”或“多肽复合物”包含具有缀合至蛋白质复合物中的蛋白质的非蛋白质实体的复合物(例如，包括但不限于化学分子，诸如毒素或检测剂)。
如本文所用，病症或疾病的“延迟进展”意指延缓、阻碍、减缓、延迟、稳定和/或推迟疾病或病症(例如，细胞增殖性病症，例如，癌症)的发展。这种延迟可以具有不同的时间长度，这取决于病史和/或待治疗的个体。对于本领域技术人员显而易见的是，充分或显著延迟实际上可以涵盖预防，因为个体不会患该病。例如，晚期癌症，诸如转移的发展，可能被延迟。
化合物(例如，本发明的抗LY6G6D抗体)或其组合物(例如，药物组合物)的“有效量”至少为获得所期望的治疗或预防结果所需的最小量，该结果诸如特定疾患(例如，细胞增殖性疾患，例如，癌症)的可测量的改善或预防。本文的有效量可以根据诸如患者的疾病状态、年龄、性别和体重以及抗体在个体中引起预期应答的能力等因素而变化。有效量也是治疗有益作用超过治疗的任何毒性或有害作用的量。对于预防用途，有益或预期结果包括诸如消除或降低风险，减轻严重程度或延迟疾病发作，其包括疾病的生化、组织学和/或行为症状、其并发症以及在疾病发展过程中出现的中间病理表型。对于治疗用途、有益或预期结果包括临床结果，诸如减少由疾病引起的一种或多种症状、提高患病者的生活质量、减少治疗该疾病所需的其他药物的剂量、增强其他药物的效果(诸如通过靶向、延缓疾病进展和/或延长存活)。在癌症或肿瘤的情况下，有效量的药物可能减少癌细胞的数量；减小肿瘤大小；抑制(即在某种程度上减慢或预期停止)癌细胞浸润进入周围器官中；抑制(即在某种程度上减慢并预期停止)肿瘤转移；在某种程度上抑制肿瘤的生长；以及/或在某种程度上减轻与病症有关的一种或多种症状。有效量可以一次或多次施用。出于本发明的目的，药物、化合物或药物组合物的有效量为足以直接或间接地进行预防或治疗的量。如在临床背景中所理解的，与另一药物、化合物或药物组合物结合可以达到或不能达到有效量的药物、化合物或药物组合物。因此，可以在施用一种或多种治疗剂的情况下考虑“有效量”，并且如果与一种或多种其他试剂结合可以获得或实现预期结果，则可以考虑给予有效量的单一药剂。
术语“表位”是指抗体结合的抗原分子上的特定位点。在一些方面，抗体与之结合的抗原分子上的特定位点通过羟基自由基足迹确定。在一些方面，抗体与之结合的抗原分子上的特定位点通过晶体学确定。
当在本文中使用时，“生长抑制剂”是指在体外或体内抑制细胞生长的化合物或组合物。在一个方面，生长抑制剂是生长抑制抗体，其防止或减少表达该抗体结合的抗原的细胞的增殖。在另一方面，生长抑制剂可以是显著降低S期细胞百分比的抑制剂。生长抑制剂的方面包括阻断细胞周期进程(在除S期以外的地方)的药剂，诸如诱导G1阻滞和M期阻滞的药剂。经典的M期阻滞剂包括长春花(长春新碱和长春碱)、紫杉烷类和拓扑异构酶II抑制剂(例如阿霉素、表柔比星、柔红霉素、依托泊苷和博来霉素)。那些阻滞G1的试剂也溢出到S期阻滞中，例如DNA烷基化剂，诸如他莫昔芬、泼尼松、达卡巴嗪、氮芥、顺铂、甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶和ara-C。进一步的信息可见于Mendelsohn和Israel编辑的《癌症的分子基础》(TheMolecular Basis of Cancer)中Murakami等人所著的第1章，标题为“细胞周期调节，癌基因和抗肿瘤药”(W.B.Saunders,Philadelphia,1995)，例如，第13页。紫杉烷类(紫杉醇和多西他赛)都是抗癌药，均来源于紫杉。多西他赛(Rhone-Poulenc Rorer)源自欧洲紫杉，是紫杉醇的半合成类似物(/>Bristol-Myers Squibb)。紫杉醇和多西他赛促进微管蛋白二聚体的微管组装，并通过防止解聚作用稳定微管，从而抑制细胞的有丝分裂。
术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”可互换使用，并且是指外源核酸已被引入其中的细胞，包括此类细胞的子代。宿主细胞包括“转化体”和“转化细胞”，其包括原代转化细胞和来源于所述原代转化细胞的子代，不考虑传代次数。子代可能不与亲本细胞的核酸内容物完全一致，而是可能含有突变。本文包括如在原始转化细胞中筛选或选择的具有相同功能或生物活性的突变子代。
如本文所用的术语“载体”是指能够载运与其相连的另一核酸的核酸分子。该术语包括作为自我复制核酸结构的载体，以及并入其已被引入的宿主细胞的基因组中的载体。某些载体能够指导与其可操作地连接的核酸的表达。此类载体在本文中称为“表达载体”。
“免疫缀合物”是与一种或多种异源分子(包括但不限于细胞毒性剂)缀合的抗体。
术语“免疫调节剂”是指一类改变免疫系统应答或免疫系统功能的分子。免疫调节剂包括但不限于，PD-1轴结合拮抗剂、T细胞依赖性双特异性抗体和基于mRNA的个性化癌症疫苗，以及沙利度胺(α-N-邻苯二甲酰亚胺-戊二酰亚胺)及其类似物(阿普斯特)、/>(来那度胺)和ACTI-MIDTM(泊马度胺)及其药用盐或酸。
“受试者”或“个体”为哺乳动物。哺乳动物包括但不限于驯养的动物(例如牛、绵羊、猫、犬和马)、灵长类动物(例如人和非人灵长类动物，诸如猴)、兔以及啮齿类动物(例如小鼠和大鼠)。在某些方面，受试者或个体为人。
“分离的”蛋白质或肽为已经从其自然环境的组分中分离的蛋白质或肽。在一些方面，通过例如电泳(例如，SDS-PAGE、等电聚焦(IEF)、毛细管电泳)或色谱(例如，离子交换或反相HPLC)确定，将蛋白质或肽纯化至大于95％或99％的纯度。
“分离的”核酸是指已从其自然环境的组分中分离的核酸分子。分离的核酸包括这样的核酸分子，其包含在通常含有所述核酸分子的细胞中，但所述核酸分子存在于染色体外或与其天然染色体位置不同的染色体位置处。
术语“PD-1轴结合拮抗剂”是指一种分子，该分子抑制PD-1轴结合配偶体与其一个或多个结合配偶体的相互作用以消除由PD-1信号传导轴上的信号传导引起的T细胞功能障碍，其结果是恢复或增强T细胞功能(例如，增殖、细胞因子产生、靶细胞杀伤)。如本文所用，PD-1轴结合拮抗剂包括PD-1结合拮抗剂、PD-L1结合拮抗剂和PD-L2结合拮抗剂。
术语“PD-1结合拮抗剂”是指减少、阻断、抑制、消除或干扰由PD-1与其一种或多种结合配偶体(诸如PD-L1、PD-L2)相互作用产生的信号传导的分子。在一些方面，PD-1结合拮抗剂是抑制PD-1与其一种或多种结合配偶体的结合的分子。在具体方面，PD-1结合拮抗剂抑制PD-1与PD-L1和/或PD-L2的结合。例如，PD-1结合拮抗剂包括抗PD-1抗体及其抗原结合片段、免疫粘附素、融合蛋白、寡肽以及其它减少、阻断、抑制、消除或干扰由PD-1与PD-L1和/或PD-L2相互作用产生的信号传导的分子。在一个方面，PD-1结合拮抗剂可减少由或通过T淋巴细胞上表达的细胞表面蛋白介导的通过PD-1的信号传导所介导的负共刺激信号，从而使功能障碍的T细胞功能障碍较少(例如，提高效应子对抗原识别的响应)。在一些方面，PD-1结合拮抗剂为抗PD-1抗体。在一个具体方面，PD-1结合拮抗剂为MDX-1106(纳武单抗)。在另一具体方面，PD-1结合拮抗剂为MK-3475(派姆单抗)。在另一具体方面，PD-1结合拮抗剂为AMP-224。在另一具体方面，PD-1结合拮抗剂为MED1-0680。在另一具体方面，PD-1结合拮抗剂为PDR001。在另一具体方面，PD-1结合拮抗剂为REGN2810。在另一具体方面，PD-1结合拮抗剂为BGB-108。
术语“PD-L1结合拮抗剂”是指减少、阻断、抑制、消除或干扰由PD-L1与其一种或多种结合配偶体(诸如PD-1、B7-1)相互作用产生的信号传导的分子。在一些方面，PD-L1结合拮抗剂是抑制PD-L1与其结合配偶体的结合的分子。在具体方面，PD-L1结合拮抗剂抑制PD-L1至PD-1和/或B7-1的结合。在一些方面，PD-L1结合拮抗剂包括抗PD-L1抗体，其抗原结合片段、免疫粘附素、融合蛋白、寡肽和其他减少、阻断、抑制、消除或干扰由PD-L1与其一个或多个结合配偶体(诸如PD-1、B7-1)相互作用产生的信号传导的分子。在一个方面，PD-L1结合拮抗剂可减少由或通过T淋巴细胞上表达的细胞表面蛋白介导的通过PD-L1的信号传导所介导的负共刺激信号，从而使功能障碍的T细胞功能障碍较少(例如，提高效应子对抗原识别的响应)。在一些方面，PD-L1结合拮抗剂是抗PD-L1抗体。在又一具体方面，抗PD-L1抗体是MPDL3280A(阿特珠单抗，以具有WHO药物信息的TECENTRIQTM(药物的国际非专属名称)上市，推荐INN：目录74，第29卷，No.3，2015(参见第387页))。在某一具体方面，抗PD-L1抗体为YW243.55.S70。在另一具体方面，抗PD-L1抗体为MDX-1105。在另一具体方面，抗PD-L1抗体为MSB0015718C。在仍另一具体方面，抗PD-L1抗体为MEDI4736。
术语“PD-L2结合拮抗剂”是指减少、阻断、抑制、消除或干扰由PD-L2与其一种或多种结合配偶体(诸如PD-1)的相互作用产生的信号传导的分子。在一些方面，PD-L2结合拮抗剂是抑制PD-L2与其一个或多个结合配偶体的结合的分子。在具体方面，PD-L2结合拮抗剂抑制PD-L2与PD-1的结合。在一些方面，PD-L2拮抗剂包括抗PD-L2抗体，其抗原结合片段、免疫粘附素、融合蛋白、寡肽和其他减少、阻断、抑制、消除或干扰由PD-L2与其一个或多个结合配偶体(诸如PD-1)相互作用产生的信号传导的分子。在一个方面，PD-L2结合拮抗剂可减少由或通过T淋巴细胞上表达的细胞表面蛋白介导的通过PD-L2的信号传导所介导的负共刺激信号，从而使功能障碍的T细胞功能障碍较少(例如，提高效应子对抗原识别的响应)。在一些方面，PD-L2结合拮抗剂为免疫粘附素。
除非另外指明，否则如本文所用的术语“蛋白质”是指来自任何脊椎动物来源的任何天然蛋白质，该脊椎动物来源包括哺乳动物诸如灵长类动物(例如，人)和啮齿动物(例如，小鼠和大鼠)。该术语包括“全长”的未加工蛋白，以及通过细胞中加工产生的任何形式的蛋白。该术语还涵盖天然存在的蛋白变体，例如剪接变体或等位基因变体。
相对于参照多肽序列的“氨基酸序列同一性百分比(％)”被定义为在比对候选序列与参考多肽序列并引入空位(如果必要的话)以实现最大的序列同一性百分比之后，并且在不考虑将任何保守取代作为序列同一性的组成部分的情况下，候选序列中的氨基酸残基与参考多肽序列中的氨基酸残基相同的百分比。用于确定氨基酸序列同一性百分比的比对可以以本领域技术范围内的各种方式实现，例如使用可公开获得的计算机软件，诸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可确定用于比对序列的适当参数，包括在所比较的序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。然而，为了本文的目的，使用序列比较计算机程序ALIGN-2来生成氨基酸序列同一性％的值。ALIGN-2序列比较计算机程序由基因泰克公司(Genentech,Inc.)编写，并且源代码已经与用户文档一起提交到U.S.Copyright Office,Washington D.C.,20559，在那里以美国版权登记号TXU510087注册。ALIGN-2程序可从基因泰克公司(Genentech,Inc.,South San Francisco,California)公开获得，或者可以从所述源代码编译。ALIGN-2程序应经编译以在UNIX操作系统上使用，所述UNIX操作系统包括数字UNIX V4.0D。所有序列比较参数均由ALIGN-2程序设置并且不变。
在采用ALIGN-2进行氨基酸序列比较的情况下，给定氨基酸序列A与给定氨基酸序列B的氨基酸序列同一性％(其可以替代地表达为给定氨基酸序列A具有或包含与给定氨基酸序列B的某一氨基酸序列同一性％)计算如下：
100乘以分数X/Y
其中X是由序列比对程序ALIGN-2在该程序对A和B的比对中评分为相同匹配的氨基酸残基的数目，而其中Y是B中氨基酸残基的总数。应当理解，在氨基酸序列A的长度不等于氨基酸序列B的长度的情况下，A与B的氨基酸序列同一性％将不等于B与A的氨基酸序列同一性％。除非另外特别指明，否则本文所使用的所有氨基酸序列同一性％的值是如前一段中所述使用ALIGN-2计算机程序获得的。
术语“药物制剂”是指处于允许包含在其中的活性成分的生物活性有效的形式，并且不含对于将被施用制剂的受试者具有不可接受的毒性的另外组分的制剂。
“药用载剂”是指药物制剂中除活性成分外的对受试者无毒的成分。药用载剂包括但不限于缓冲剂、赋形剂、稳定剂，或防腐剂。
“放射疗法”是指使用定向γ射线或β射线以诱导对细胞的足够损害，从而限制细胞正常发挥功能或完全破坏细胞的能力。将理解的是，在本领域中将有许多已知方法可以确定治疗的剂量和持续时间。典型治疗为一次施用，典型剂量范围为每天10到200单位(Gray)。
如本文所用，“治疗(treatment)”(及其语法变型，诸如“治疗(treat)”或“治疗(treating)”)是指试图改变所治疗个体的自然进程的临床干预，并且可以是为了预防或在临床病理学的进程中进行。治疗的期望效果包括但不限于预防疾病的发生或复发、减轻症状、削弱疾病的任何直接或间接病理学后果、预防转移、降低疾病进展的速率、改善或减轻疾病状态，以及缓解或改善预后。在一些方面，本发明的抗体(例如，本发明的抗LY6G6D抗体)用于延迟疾病的发展或减缓疾病的进展。
“减少”或“抑制”意指引起整体降低的能力，例如，总体降低20％或以上、50％或以上，或75％、85％、90％、95％或以上。在某些方面，减少或抑制可以指由抗体Fc区介导的抗体的效应子功能，这种效应子功能具体包括补体依赖性细胞毒性(CDC)、抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)。
根据本发明，术语“疫苗”涉及一种药物制备物(药物组合物)或产品，其在施用后诱导免疫应答，特别是细胞免疫应答，其识别并攻击病原体或患病细胞，诸如癌症细胞。疫苗可用于预防或治疗疾病。疫苗可以为癌症疫苗。如本文所用，“癌症疫苗”为一种组合物，其刺激受试者针对癌症的免疫应答。癌症疫苗典型地由癌症相关材料或细胞(抗原)来源组成，这些材料或细胞(抗原)对于受试者而言可能是自体的(来自自身)或同种异体的(来自他人)，连同其他成分(例如，佐剂)以进一步刺激和促进对抗原的免疫应答。癌症疫苗可导致刺激受试者的免疫系统以产生针对一种或几种特定抗原的抗体，和/或产生杀伤T细胞以攻击具有那些抗原的癌细胞。
术语“个性化癌症疫苗”(“PCV”)是指适应个体癌症患者的需要或特殊情况的癌症疫苗。在一些方面，PCV刺激针对存在于患者癌细胞中的一种或多种癌症特异性体细胞突变的免疫应答，如例如PCT公开号WO2014/082729和WO2012/159754中所述。癌症特异性体细胞突变可存在于患者的任何癌细胞，例如肿瘤细胞，例如循环肿瘤细胞中。在一些方面，癌症特异性体细胞突变是使用下一代测序发现的。在一些方面，将包含癌症特异性体细胞突变的多肽或编码包含癌症特异性体细胞突变的多肽的核酸(例如，RNA，例如，体外转录的RNA)施用至患者以刺激患者的免疫应答。
如本文所用，“施用”意为向受试者给予一定剂量的化合物(例如，本发明的抗LY6G6D抗体)的方法。在一些方面，本文方法中使用的组合物是静脉内施用的。本文描述的方法中使用的组合物可以，例如，肌内地、静脉内地、皮内地、经皮地、动脉内地、腹腔内地、病灶内地、颅内地、关节内地、前列腺内地、胸膜内地、气管内地、鼻内地、玻璃体内地、阴道内地、直肠内地、外用地、肿瘤内地、腹膜地、皮下地、结膜下地、囊内地、粘膜地、心包内地、脐内地、眼内地、口服地、外用地、局部地、通过吸入、通过注射、通过输注、通过连续输注、通过局部灌注直接灌洗靶细胞、通过导管、通过灌洗、以乳剂或以脂质组合物的形式来施用。施用方法可以根据多种因素而变化(例如，待施用的化合物或组合物以及待治疗的病症、疾病或疾患的严重程度)。
II.组合物和方法
在一个方面，本发明部分地基于抗淋巴细胞抗原6复合物、基因座G61(抗LY6G6D)抗体。在某些实施例中，抗LY6G6D抗体为多特异性的(例如，双特异性的)并且除了与LY6G6D或其片段结合之外，还与第二生物分子(例如，T细胞的表面抗原，例如，分化簇3(CD3))结合。本发明的抗体可用于，例如，治疗或延迟细胞增殖性疾患(例如，癌症，例如结直肠癌(CRC)(例如，LY6G6D阳性CRC))的进展，或用于增强患有这种疾患的受试者的免疫功能。
A.示例性抗LY6G6D抗体
在一个方面，本发明提供分离的抗体，其与LY6G6D结合。在一些方面，抗LY6G6D抗体与人LY6G6D多肽(SEQ ID NO:75)或食蟹猴(cyno)LY6G6D多肽(SEQ ID NO:77)结合。在一些方面，抗LY6G6D抗体与包含或位于LY6G6D(例如，人LY6G6D)的氨基酸93-104(SEQ ID NO:87)、94-103(SEQ ID NO:78)或99-101(SEQ ID NO:79)内的表位结合。在一些方面，抗LY6G6D抗体与LY6G6D的残基Arg94、Leu101、Cys102和Asn103中的一个、两个、三个或所有四个残基结合。在一些方面，抗LY6G6D抗体与包含LY6G6D的残基Arg94、Asp95、Cys96、Tyr97、Leu98、Gly99、Asp100、Leu101、Cys102和Asn103的表位结合。在一些方面，抗LY6G6D抗体与由LY6G6D的残基Arg94、Asp95、Cys96、Tyr97、Leu98、Gly99、Asp100、Leu101、Cys102和Asn103组成的表位结合。
LY6G6D表位可以通过与该表位的肽片段结合的抗LY6G6D抗体的LY6G6D结合结构域来确定。LY6G6D表位也可以通过丙氨酸扫描诱变来确定。在一个实施例中，LY6G6D结合结构域与突变的LY6G6D的结合减少20％、30％、50％、80％或更多指示在丙氨酸扫描诱变测定中突变的LY6G6D的氨基酸残基为LY6G6D结合结构域的表位残基。替代性地，可以通过质谱法确定LY6G6D表位。在一些实施例中，表位通过晶体学(例如，晶体学方法)确定。
在一些实施例中，LY6G6D表位可以通过结晶学方法确定，通过将溶解在特定条件(例如，0.15M NaCl，25mM tris，pH 7.5，10mg/ml)中的抗LY6G6D抗体Fab与摩尔过量(例如，2倍摩尔过量)的LY6G6D肽合并，并最初以静滴或悬滴蒸气扩散形式筛选沉淀剂基质。例如，优化的晶体可以从含有70％v/v甲基戊二醇的储液池溶液与0.1M HEPES缓冲液pH 7.5的1:1混合物中生长。储液池可用作冷冻保护剂。晶体可以通过突然浸入液氮中而转移到低温温度。
晶体的衍射数据可以在光束线处收集。可以使用程序诸如HKL2000对所记录的衍射进行积分和缩放。
结构可以通过分子置换法(MR)定相，例如，使用程序诸如Phaser。例如，MR搜索模型为从HGFA/Fab复合物的晶体结构导出的Fab亚基(PDB代码：2R0L)。基于Fo-Fc图，将LY6G6D肽构建到结构中。随后可以使用程序REFMAC5和PHENIX使用最大似然目标函数、各向异性个体B因子细化方法和TLS细化方法来细化结构，以实现收敛。
在一些方面，本发明提供一种具有结合结构域的抗LY6G6D抗体，该结合结构域包含选自以下项的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个CDR：(a)CDR-H1，其包含SEQ IDNO:4的氨基酸序列；(b)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列；(c)CDR-H3，其包含SEQID NO:6的氨基酸序列；(d)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列；(e)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列；和(f)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:99至107中任一者的氨基酸序列。
在一些方面，本发明提供一种具有结合结构域的抗LY6G6D抗体，该结合结构域包含以下所有六项：(a)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:111的氨基酸序列；(b)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:112或SEQ ID NO:113的氨基酸序列；(c)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列；(d)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列；(e)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列；和(f)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:99至107中任一者的氨基酸序列。
在一些方面，本发明提供一种具有结合结构域的抗LY6G6D抗体，该结合结构域包含以下所有六项：(a)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列；(b)CDR-H2，其包含SEQ IDNO:5的氨基酸序列；(c)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列；(d)CDR-L1，其包含SEQID NO:1的氨基酸序列；(e)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列；和(f)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列。
在一些方面，本发明提供一种具有结合结构域的抗LY6G6D抗体，该结合结构域包含以下所有六项：(a)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列；(b)CDR-H2，其包含SEQ IDNO:5的氨基酸序列；(c)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列；(d)CDR-L1，其包含SEQID NO:1的氨基酸序列；(e)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列；和(f)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:99的氨基酸序列。
在一些方面，本发明提供一种具有结合结构域的抗LY6G6D抗体，该结合结构域包含以下所有六项：(a)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列；(b)CDR-H2，其包含SEQ IDNO:5的氨基酸序列；(c)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列；(d)CDR-L1，其包含SEQID NO:1的氨基酸序列；(e)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列；和(f)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:100的氨基酸序列。
在一些方面，本发明提供一种具有结合结构域的抗LY6G6D抗体，该结合结构域包含以下所有六项：(a)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列；(b)CDR-H2，其包含SEQ IDNO:5的氨基酸序列；(c)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列；(d)CDR-L1，其包含SEQID NO:1的氨基酸序列；(e)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列；和(f)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:101的氨基酸序列。
在一些方面，本发明提供一种具有结合结构域的抗LY6G6D抗体，该结合结构域包含以下所有六项：(a)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列；(b)CDR-H2，其包含SEQ IDNO:5的氨基酸序列；(c)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列；(d)CDR-L1，其包含SEQID NO:1的氨基酸序列；(e)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列；和(f)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:102的氨基酸序列。
在一些方面，本发明提供一种具有结合结构域的抗LY6G6D抗体，该结合结构域包含以下所有六项：(a)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列；(b)CDR-H2，其包含SEQ IDNO:5的氨基酸序列；(c)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列；(d)CDR-L1，其包含SEQID NO:1的氨基酸序列；(e)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列；和(f)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:103的氨基酸序列。
在一些方面，本发明提供一种具有结合结构域的抗LY6G6D抗体，该结合结构域包含以下所有六项：(a)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列；(b)CDR-H2，其包含SEQ IDNO:5的氨基酸序列；(c)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列；(d)CDR-L1，其包含SEQID NO:1的氨基酸序列；(e)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列；和(f)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:104的氨基酸序列。
在一些方面，本发明提供一种具有结合结构域的抗LY6G6D抗体，该结合结构域包含以下所有六项：(a)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列；(b)CDR-H2，其包含SEQ IDNO:5的氨基酸序列；(c)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列；(d)CDR-L1，其包含SEQID NO:1的氨基酸序列；(e)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列；和(f)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:105的氨基酸序列。
在一些方面，本发明提供一种具有结合结构域的抗LY6G6D抗体，该结合结构域包含以下所有六项：(a)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列；(b)CDR-H2，其包含SEQ IDNO:5的氨基酸序列；(c)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列；(d)CDR-L1，其包含SEQID NO:1的氨基酸序列；(e)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列；和(f)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:106的氨基酸序列。
在一些方面，本发明提供一种具有结合结构域的抗LY6G6D抗体，该结合结构域包含以下所有六项：(a)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列；(b)CDR-H2，其包含SEQ IDNO:5的氨基酸序列；(c)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列；(d)CDR-L1，其包含SEQID NO:1的氨基酸序列；(e)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列；和(f)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:107的氨基酸序列。
在一些方面，本发明提供一种具有结合结构域的抗LY6G6D抗体，该结合结构域包含以下所有六项：(a)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:111的氨基酸序列；(b)CDR-H2，其包含SEQID NO:5的氨基酸序列；(c)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列；(d)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列；(e)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列；和(f)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列。
在一些方面，本发明提供一种具有结合结构域的抗LY6G6D抗体，该结合结构域包含以下所有六项：(a)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列；(b)CDR-H2，其包含SEQ IDNO:112的氨基酸序列；(c)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列；(d)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列；(e)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列；和(f)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列。
在一些方面，本发明提供一种具有结合结构域的抗LY6G6D抗体，该结合结构域包含以下所有六项：(a)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列；(b)CDR-H2，其包含SEQ IDNO:113的氨基酸序列；(c)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列；(d)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列；(e)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列；和(f)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列。
在一些方面，抗LY6G6D抗体可具有：VH结构域，其包含与SEQ ID NO:10的序列具有至少90％序列同一性(例如，至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列，或包含SEQ ID NO:10的序列；和/或VL结构域，其包含与SEQ ID NO:11的序列具有至少90％序列同一性(例如，至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列，或包含SEQ ID NO:11的序列。在特定情况下，抗LY6G6D抗体可以为20A12.QNTv12(包括单细胞和双细胞制备变体)或其衍生物或克隆亲属。在一些方面，抗LY6G6D抗体具有：VH结构域，其包含SEQ ID NO:59的氨基酸序列；或VL结构域，其包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列。在一些方面，抗LY6G6D抗体具有：VH结构域，其包含SEQ ID NO:59的氨基酸序列；和VL结构域，其包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列
在一些方面，抗LY6G6D抗体可包含选自以下项的至少一项(例如，1、2、3或4项)：(a)FR-H1，其包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列；(b)FR-H2，其包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列；(c)FR-H3，其包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列；和(d)FR-H4，其包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列。在一些方面，抗LY6G6D抗体可包含选自以下项的至少一项(例如，1、2、3或4项)：(a)FR-L1，其包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列；(b)FR-L2，其包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列；(c)FR-L3，其包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列；和(d)FR-L4，其包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列。
在一些方面，抗LY6G6D抗体包含以下所有四项：(a)FR-H1，其包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列；(b)FR-H2，其包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列；(c)FR-H3，其包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列；和(d)FR-H4，包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列，和/或包含以下所有四项：(a)FR-L1，其包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列；(b)FR-L2，其包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列；(c)FR-L3，其包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列；和(d)FR-L4，其包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列。在一些方面，抗LY6G6D抗体可具有：VH结构域，其包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列；和/或VL结构域，其包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列。
在一些方面，抗LY6G6D抗体可包含选自以下项的至少一项(例如，1、2、3或4项)：(a)FR-H1，其包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列；(b)FR-H2，其包含SEQ ID NO:58的氨基酸序列；(c)FR-H3，其包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列；和(d)FR-H4，其包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列。在一些方面，抗LY6G6D抗体可包含选自以下项的至少一项(例如，1、2、3或4项)：(a)FR-L1，其包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列；(b)FR-L2，其包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列；(c)FR-L3，其包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列；和(d)FR-L4，其包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列。
在一些方面，抗LY6G6D抗体包含以下所有四项：(a)FR-H1，其包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列；(b)FR-H2，其包含SEQ ID NO:58的氨基酸序列；(c)FR-H3，其包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列；和(d)FR-H4，包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列，和/或包含以下所有四项：(a)FR-L1，其包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列；(b)FR-L2，其包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列；(c)FR-L3，其包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列；和(d)FR-L4，其包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列。在一些方面，抗LY6G6D抗体可具有：VH结构域，其包含SEQ ID NO:59的氨基酸序列；和/或VL结构域，其包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列。
在任何上述方面，抗LY6G6D抗体可以经人源化。在一个实施例中，抗LY6G6D抗体包含任何上述实施例中的CDR，并且进一步包含受体人框架，例如人免疫球蛋白框架或人共有框架。
在本发明的又一方面，根据任何上述实施例的抗LY6G6D抗体为单克隆抗体。在一些方面，抗LY6G6D抗体为嵌合抗体或人抗体。在一个方面，抗LY6G6D抗体为抗体片段，例如，Fv、Fab、Fab'、scFv、双体抗体或F(ab')2片段。在另一方面，抗体为全长抗体，例如本文所定义的完整IgG抗体(例如完整IgG1抗体)或其他抗体类别或同种型。
在又一方面，根据任何上述实施例的抗LY6G6D抗体可单独或组合地并入如以下1-8节所述的特征。
B.示例性抗CD3抗体
在另一方面，本发明提供分离的抗体，其与分化簇3(CD3)(例如，CD3ε和/或CD3γ)结合并具有以下六个CDR序列：(a)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列；(b)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列；(c)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列；(d)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列；(e)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:13或SEQ IDNO:50的氨基酸序列；和(f)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:51的氨基酸序列；VL序列，其包含SEQ ID NO:21、55、90或92；VL和VH序列，其分别包含SEQ ID NO:21或55以及SEQ ID NO:20；或者VL和VH序列，其分别包含SEQ ID NO:90或92以及SEQ ID NO:89。在一些情况下，抗CD3抗体与人CD3多肽或食蟹猴(cyno)CD3多肽结合。在一些情况下，人CD3多肽或食蟹猴CD3多肽分别为人CD3ε多肽(SEQ ID NO:80)或食蟹猴CD3ε多肽(SEQ ID NO:81)。在一些情况下，人CD3多肽或食蟹猴CD3多肽分别为人CD3γ多肽(SEQ ID NO:82)或食蟹猴CD3γ多肽(SEQ ID NO:83)。在一些情况下，抗CD3抗体与由人CD3ε的氨基酸1-26(SEQ ID NO:84)或1-27(SEQ ID NO:85)组成的CD3(例如，人CD3ε)的片段内的表位结合。
在一些方面，本发明提供一种具有结合结构域的抗CD3抗体，该结合结构域包含以下所有六项：(a)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列；(b)CDR-H2，其包含SEQ IDNO:16的氨基酸序列；(c)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列；(d)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列；(e)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列；和(f)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列。
在一些方面，本发明提供一种具有结合结构域的抗CD3抗体，该结合结构域包含以下所有六项：(a)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列；(b)CDR-H2，其包含SEQ IDNO:16的氨基酸序列；(c)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列；(d)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列；(e)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列；和(f)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列。
在一些情况下，抗CD3抗体可具有：VH结构域，其包含具有SEQ ID NO:20或89的序列的氨基酸序列；和VL结构域，其包含具有SEQ ID NO:21或90的序列的氨基酸序列。在特定情况下，抗CD3抗体可以为38E4.v1 MD1或其衍生物或克隆亲属。
在一些情况下，抗CD3抗体可具有：VH结构域，其包含具有SEQ ID NO:20或89的序列的氨基酸序列；和VL结构域，其包含具有SEQ ID NO:55或92的序列的氨基酸序列。在特定情况下，抗CD3抗体可以为38E4.v1 MD4或其衍生物或克隆亲属。
在一些方面，抗CD3抗体包含以下至少一项(例如，1、2、3或4项)：(a)FR-H1，其包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列；(b)FR-H2，其包含SEQ ID NO:43或SEQ ID NO:62的氨基酸序列；(c)FR-H3，其包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列；和(d)FR-H4，包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列，和/或包含以下至少一项(例如，1、2、3或4项)：(a)FR-L1，其包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列；(b)FR-L2，其包含SEQ ID NO:47或SEQ ID NO:63的氨基酸序列；(c)FR-L3，其包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列；和(d)FR-L4，其包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列。
在一些方面，抗CD3抗体包含以下所有四项：(a)FR-H1，其包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列；(b)FR-H2，其包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列；(c)FR-H3，其包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列；和(d)FR-H4，包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列，和/或包含以下所有四项：(a)FR-L1，其包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列；(b)FR-L2，其包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列；(c)FR-L3，其包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列；和(d)FR-L4，其包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列。
在一些方面，抗CD3抗体包含以下所有四项：(a)FR-H1，其包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列；(b)FR-H2，其包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列；(c)FR-H3，其包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列；和(d)FR-H4，包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列，和/或包含以下所有四项：(a)FR-L1，其包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列；(b)FR-L2，其包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列；(c)FR-L3，其包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列；和(d)FR-L4，其包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列。
在任何上述实施例中，抗CD3抗体可以经人源化。在一个实施例中，抗CD3抗体包含任何上述实施例中的CDR，并且进一步包含受体人框架，例如人免疫球蛋白框架或人共有框架。
在另一方面，提供一种抗CD3抗体，其中该抗体包含如以上提供的任何实施例中的VH和如以上提供的任何实施例中的VL，其中一个或两个可变结构域序列包括翻译后修饰。
在又一方面，本发明提供一种抗体，其与本文所提供的抗CD3抗体所结合的相同表位结合。例如，在某些实施例中，提供一种与抗CD3抗体所结合的相同表位结合的抗体，该抗CD3抗体包含SEQ ID NO:20的VH序列和SEQ ID NO:21的VL序列或者包含SEQ ID NO:20的VH序列和SEQ ID NO:55的VL序列。在某些实施例中，提供一种抗体，其与由人CD3ε的氨基酸1-26(SEQ ID NO:84)或1-27(SEQ ID NO:85)组成的CD3(例如人CD3ε)的片段内的表位结合。
在本发明的又一方面，根据任何上述实施例的抗CD3抗体为单克隆抗体。在其他实施例中，抗CD3抗体为嵌合抗体或人抗体。在一个实施例中，抗CD3抗体为抗体片段，例如，Fv、Fab、Fab'、scFv、双体抗体或F(ab')2片段。在另一实施例中，抗体为全长抗体，例如本文所定义的完整IgG抗体(例如完整IgG1抗体)或其他抗体类别或同种型。
在又一方面，根据任何上述实施例的抗CD3抗体可单独或组合地并入如以下1-8节所述的特征。
1.抗体亲和力
在某些实施例中，本文所提供的抗体的解离常数(KD)为≤1μM、≤250nM、≤100nM、≤15nM、≤10nM、≤6nM、≤4nM、≤2nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM或≤0.001nM(例如，10-8M或更小，例如10-8M至10-13M，例如10-9M至10-13M)。
在一个实施例中，通过放射性标记的抗原结合测定法(RIA)测量KD。在一个实施例中，用目标抗体的Fab形式及其抗原执行RIA。例如，通过在一系列未标记的抗原滴定存在下用最小浓度(125I)的标记的抗原平衡Fab，然后用抗Fab抗体包被的板捕获结合的抗原，来测量Fab对抗原的溶液结合亲和力(参见，例如，Chen等人J.Mol.Biol.293:865-881,1999)。为了确定用于测定法的条件，用在50mM碳酸钠(pH 9.6)中的5μg/ml捕获抗Fab抗体(CappelLabs)包被多孔板(Thermo Scientific)过夜，并且随后在室温(大约23℃)，用在PBS中的2％(w/v)牛血清白蛋白阻断二至五小时。在非吸附板(Nunc#269620)中，将100pM或26pM[125I]-抗原与目标Fab的连续稀释液(例如，与Presta等人Cancer Res.57:4593-4599,1997中抗VEGF抗体(Fab-12)的评估相一致)混合。然后将目标Fab孵育过夜；然而，孵育可以持续更长时间(例如，约65小时)以确保达到平衡。此后，将混合物转移至捕获板以在室温下孵育(例如，一小时)。然后去除溶液并用在PBS中的0.1％聚山梨酯20洗涤所述板八次。当板已干燥时，添加150μl/孔的闪烁体(MICROSCINT-20TM；Packard)，并且在TOPCOUNTTMγ计数器(Packard)上对板计数十分钟。选择给出小于或等于20％最大结合的各Fab的浓度以用于竞争性结合测定中。
根据另一实施例，使用表面等离子体共振测定法测量KD。例如，使用或/>(BIAcore,Inc.,Piscataway,NJ)在37℃下用固定的抗原CM5芯片以～10个响应单位(RU)进行测定。在一个实施例中，根据供应商说明书，用N-乙基-N'-(3-二甲基氨基丙基)-碳化二亚胺盐酸盐(EDC)及N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化羧甲基化的葡聚糖生物感测器芯片(CM5,BIACORE,Inc.)。将抗原用10mM乙酸钠，pH 4.8稀释至5μg/ml(约0.2μM)，之后以5μL/分钟的流速进行注射以获得大约10响应单位(RU)的偶联蛋白质。注射抗原之后，注射1M乙醇胺以阻断未反应的基团。关于动力学测量，在37℃，以大约25μl/min的流量，注射在含有0.05％聚山梨酯20(吐温-20TM)表面活性剂(PBST)的PBS中的Fab的两倍连续稀释液(0.78nM至500nM)。使用简单的一对一Langmuir结合模型(/>评价软件3.2版)，通过同时拟合缔合与解离感测图来计算缔合速率(kon或ka)与解离速率(koff或kd)。平衡解离常数(KD)计算为比率koff/kon。参见，例如，Chen等人，J.Mol.Biol.293:865-881(1999)。如果通过上述表面等离子体共振测定得到的缔合速率超过106M-1s-1，则可以通过使用荧光猝灭技术确定缔合速率，该技术在递增浓度的抗原存在下，测量在37℃在PBS(pH 7.2)中的20nM抗抗原抗体(Fab形式)的荧光发射强度(激发＝295nm；发射＝340nm，16nm带通)的增加或减少，如在分光计(诸如配备止流装置的分光光度计(Aviv Instruments)或8000系列SLM-AMINCOTM分光光度计(ThermoSpectronic))中用搅拌比色杯所测量。
在一些实施例中，本文提供的抗LY6G6D抗体在37℃以约1nM至500nM的KD结合人LY6G6D多肽，如使用BIAcore测定所测量，例如，以≤1μM、≤250nM、≤100nM、≤40nM、≤30nM、≤15nM、≤10nM、≤6nM、≤4nM、≤2nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM或≤0.001nM的KD结合人LY6G6D。在一些实施例中，本文提供的抗LY6G6D抗体以约100nM至0.01nM、约50nM至5nM、约40nM至10nM、约35nM至15nM、或约30nM至20nM的KD结合人LY6G6D多肽。
在一些实施例中，本文提供的抗CD3抗体在37℃以约100pM至10nM的KD结合人CD3多肽，如使用BIAcore测定所测量，例如，以≤1μM、≤250nM、≤100nM、≤40nM、≤30nM、≤15nM、≤10nM、≤5nM、≤2nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM或≤0.001nM的KD结合人CD3。在一些实施例中，本文提供的抗CD3抗体以约100nM至0.01nM、约50nM至5nM、约40nM至10nM、约35nM至15nM、或约30nM至20nM的KD结合人CD3多肽。
2.抗体片段
在某些实施例中，本文提供的抗体(例如，抗LY6G6D抗体或抗CD3抗体)为抗体片段。抗体片段包括但不限于Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab’)2、Fv、和scFv片段，以及下文描述的其他片段。关于某些抗体片段的综述，参见Hudson等人，Nat.Med.9:129-134(2003)。关于scFv片段的综述，参见例如，Pluckthün在The harmacology of Monoclonal Antibodies,vol.113,Rosenburg and Moore eds.,(Springer-Verlag,New York),pp.269-315(1994)中所述；还可参见WO 93/16185；以及美国专利号5,571,894和5,587,458。关于对包含补救受体结合表位残基并具有增加的体内半衰期的Fab和F(ab')2片段的讨论，请参见美国专利号5,869,046。
双体抗体是具有两个抗原结合位点的抗体片段，其可以是二价或双特异性的。参见例如，EP 404,097；WO 1993/01161；Hudson等人，Nat.Med.9:129-134(2003)；和Hollinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448(1993)。三体抗体和四体抗体也在Hudson等人，Nat.Med.9:129-134(2003)中进行了描述。
单结构域抗体为包含抗体的全部或部分重链可变结构域或全部或部分轻链可变结构域的抗体片段。在某些实施例中，单结构域抗体是人单结构域抗体(Domantis,Inc.,Waltham,MA；参见，例如，美国专利号6,248,516B1)。
抗体片段可以通过各种技术制备，包括但不限于完整抗体的蛋白水解消化以及由重组宿主细胞(例如大肠杆菌(E.coli)或噬菌体)产生，如本文所述。
3.嵌合抗体和人源化抗体
在某些实施例中，本文提供的抗体(例如，抗LY6G6D抗体或抗CD3抗体)为嵌合抗体。某些嵌合抗体描述于例如，美国专利号4,816,567和Morrison等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851-6855(1984)中。在一个实例中，嵌合抗体包含非人可变区(例如，衍生自小鼠、大鼠、仓鼠、兔或非人灵长动物诸如猴的可变区)和人恒定区。在另一个实例中，嵌合抗体为其中类别或亚类已经与亲本抗体的类别或亚类改变的“类别转换”抗体。嵌合抗体包括其抗原结合片段。
在某些实施例中，嵌合抗体是人源化抗体。通常，将非人抗体人源化以减少对人的免疫原性，同时保留亲本非人抗体的特异性和亲和力。通常，人源化抗体包含一个或多个可变结构域，其中HVR(或其部分)例如源自非人抗体，并且FR(或其部分)源自人抗体序列。人源化抗体任选地还将包含人恒定区的至少一部分。在一些实施例中，人源化抗体中的一些FR残基被来自非人抗体(例如，HVR残基所来源于的抗体)的相应残基取代，例如以恢复或改善抗体特异性或亲和力。
人源化抗体及其制备方法在例如Almagro和Fransson,Front.Biosci.13:1619-1633(2008)中综述，并且进一步描述于例如Riechmann等人，Nature 332:323-329(1988)；Queen等人，Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 86:10029-10033(1989)；美国专利号5,821,337、7,527,791、6,982,321和7,087,409；Kashmiri等人，Methods 36:25-34(2005)(描述了特异性决定区(SDR)移植)；Padlan,Mol.Immunol.28:489-498(1991)(描述了“表面再塑”)；Dall’Acqua等人，Methods 36:43-60(2005)(描述了“FR改组”)；以及Osbourn等人，Methods 36:61-68(2005)和Klimka等人，Br.J.Cancer,83:252-260(2000)(描述了用于FR改组的“指导选择”方法)中。
可用于人源化的人框架区包括但不限于：使用“最佳拟合”方法选择的框架区(参见，例如，Sims等人J.Immunol.151:2296(1993))；来源于轻链或重链可变区的特定亚组的人抗体的共有序列的框架区(参见，例如，Carter等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:4285(1992)；以及Presta等人J.Immunol.,151:2623(1993))；人成熟(体细胞突变)框架区或人种系框架区(参见，例如，Almagro和Fransson,Front.Biosci.13:1619-1633(2008))；以及来源于筛选FR文库的框架区(参见，例如，Baca等人,J.Biol.Chem.272:10678-10684(1997)和Rosok等人,J.Biol.Chem.271:22611-22618(1996))。
4.人抗体
在某些实施例中，本文提供的抗体(例如，抗LY6G6D抗体或抗CD3抗体)为人抗体。可以使用本领域已知的各种技术来产生人抗体。人抗体一般描述于van Dijk和van deWinkel,Curr Opin Pharmacol.5:368-74(2001)和Lonberg,Curr Opin Immunol.20:450-459(2008)中。
可以通过以下方式来制备人抗体：将免疫原施用于转基因动物，所述转基因动物已被修饰以响应于抗原激发而产生具有人可变区的完整人抗体或完整抗体。此类动物通常含有全部或部分人免疫球蛋白基因座，所述全部或部分人免疫球蛋白基因座替代内源性免疫球蛋白基因座，或者在动物的染色体外存在或随机整合至动物的染色体中。在此类转基因小鼠中，内源性免疫球蛋白基因座通常已被灭活。关于从转基因动物获得人抗体的方法的综述，参见Lonberg,Nat.Biotech.23:1117-1125(2005)。还参见例如描述XENOMOUSETM技术的美国专利号6,075,181和6,150,584；描述技术的美国专利号5,770,429；描述/>技术的美国专利号7,041,870，以及描述/>技术的美国专利申请公开号US 2007/0061900)。可以进一步修饰来自由此类动物产生的完整抗体的人可变区，例如通过与不同的人恒定区组合。
人抗体也可以通过基于杂交瘤的方法制备。已经描述了用于产生人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人杂交骨髓瘤细胞系。(参见例如Kozbor J.Immunol.,133:3001(1984)；Brodeur等人，Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications，第51-63页(Marcel Dekker,Inc.,New York,1987)；以及Boerner等人,J.Immunol.,147:86(1991)。)经由人B细胞杂交瘤技术产生的人抗体也如Li等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,103:3557-3562(2006)所述。另外的方法包括例如在美国专利号7,189,826(描述了从杂交瘤细胞系产生单克隆人IgM抗体)和Ni,Xiandai Mianyixue,26(4):265-268(2006)(描述了人-人杂交瘤)中描述的那些方法。人类杂交瘤技术(Trioma技术)也描述于Vollmers和Brandlein,Histology and Histopathology,20(3):927-937(2005)和Vollmers和Brandlein,Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology,27(3):185-91(2005)中。
人抗体还可以通过分离选自人源噬菌体展示文库的Fv克隆可变结构域序列产生。然后可以将此类可变结构域序列与预期的人恒定结构域结合。从抗体文库中选择人抗体的技术描述如下。
5.源自文库的抗体
本发明的抗体(例如，抗LY6G6D抗体或抗CD3抗体)可以通过筛选组合文库中具有所期望活性的抗体来分离。例如，本领域已知多种方法用于产生噬菌体展示文库并筛选此类文库以获得具有所需结合特征的抗体。此类方法在，例如，Hoogenboom等人，Methods inMolecular Biology 178:1-37(O'Brien等人，编，Human Press,Totowa,NJ,2001)中综述并且进一步描述于，例如，在McCafferty等人，Nature 348:552-554；Clackson等人，Nature352:624-628(1991)；Marks等人，J.Mol.Biol.222:581-597(1992)；Marks和Bradbury,inMethods in Molecular Biology 248:161-175(Lo,ed.,Human Press,Totowa,NJ,2003)；Sidhu等人，J.Mol.Biol.338(2):299-310(2004)；Lee等人，J.Mol.Biol.340(5):1073-1093(2004)；Fellouse,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101(34)；12467-12472(2004)；和Lee等人，J.Immunol.Methods 284(1-2):119-132(2004)中。
在某些噬菌体展示方法中，将VH和VL基因的所有组成成分通过聚合酶链式反应(PCR)单独克隆，并在噬菌体文库中随机重组，然后可以从该噬菌体文库中筛选抗原结合噬菌体，如在Winter等人，Ann.Rev.Immunol.,12:433-455(1994)中所描述的。噬菌体通常将抗体片段展示为单链Fv(scFv)片段或Fab片段。来自经免疫的来源的文库提供针对免疫原的高亲和力抗体，而无需构建杂交瘤。替代地，可以克隆初始组库(例如，来自人)以提供针对广泛的非自身抗原和自身抗原的抗体的单一来源，而无需任何免疫，如Griffiths等人,EMBO J,12:725-734(1993)所描述的。最后，还可通过以下方式来制得初始文库：克隆来自干细胞的未重排的V基因区段；以及使用含有随机序列的PCR引物来编码高度可变的CDR3区域并完成体外重排，如由Hoogenboom和Winter,J.Mol.Biol.,227:381-388(1992)所述。描述人抗体噬菌体文库的专利出版物包括，例如：美国专利号5,750,373，和美国公开号2005/0079574、2005/0119455、2005/0266000、2007/0117126、2007/0160598、2007/0237764、2007/0292936和2009/0002360。
在本文中从人抗体文库分离出的抗体或抗体片段被认为是人抗体或人抗体片段。
6.多特异性抗体
在上述任一方面，本文提供的抗LY6G6D或抗CD3抗体为多特异性抗体，例如，双特异性抗体。多特异性抗体为对至少两个不同位点具有结合特异性的抗体(例如，单克隆抗体)。在一些方面，双特异性抗体可以与LY6G6D的两个不同表位结合。在一些方面，结合特异性中的一种是针对LY6G6D的，并且另一种是针对任何其他抗原(例如，第二生物分子，例如，T细胞的表面抗原，例如，CD3)的。在一些方面，结合特异性中的一种是针对CD3的，并且另一种是针对任何其他抗原(例如，第二生物分子，例如，细胞表面抗原，例如，肿瘤抗原)的。在一些方面，结合特异性中的一种是针对LY6G6D的，并且另一种是针对CD3的。
在一些方面，抗LY6G6D抗体包含：(a)LY6G6D结合结构域，其包含重链多肽(H1)和轻链多肽(L1)，该H1包含重链可变(VH)结构域(VH1)，该L1包含轻链可变(VL)结构域(VL1)；和(b)CD3结合结构域，其包含重链多肽(H2)和轻链多肽(L2)，该H2包含重链可变(VH)结构域(VH2)，该L2包含轻链可变(VL)结构域(VL2)。
在一些方面，具有第一结合结构域(其包含：(a)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列；(b)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列；(c)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列；(d)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列；(e)CDR-L2，其包含SEQID NO:13或SEQ ID NO:50的氨基酸序列；和(f)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:51的氨基酸序列，诸如38E4.v1 MD1或38E4.v1MD4)的抗CD3抗体可具有第二结合结构域，该第二结合结构域与除免疫效应细胞外的靶标细胞上的细胞表面抗原(例如，肿瘤抗原，例如，LY6G6D)结合。
在一些方面，细胞表面抗原可以在靶标细胞上以低拷贝数表达。例如，在一些方面，细胞表面抗原以每个靶标细胞少于35,000个拷贝表达或存在。在一些实施例中，低拷贝数细胞表面抗原以每个靶标细胞100至35,000个拷贝、每个靶标细胞100至30,000个拷贝、每个靶标细胞100至25,000个拷贝、每个靶标细胞100至20,000个拷贝、每个靶标细胞100至15,000个拷贝、每个靶标细胞100至10,000个拷贝、每个靶标细胞100至5,000个拷贝、每个靶标细胞100至2,000个拷贝、每个靶标细胞100至1,000个拷贝、或每个靶标细胞100至500个拷贝存在。例如，可以使用标准Scatchard图来确定细胞表面抗原的拷贝数。
例如，在一些方面，具有结合结构域(其包含以下所有六项：(a)CDR-H1，其包含SEQID NO:4的氨基酸序列；(b)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列；(c)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列；(d)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列；(e)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列；和(f)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列)的抗LY6G6D抗体可具有与CD3结合的第二结合结构域。在一些方面，结合LY6G6D的第一结合结构域包含：重链框架区FR-H1、FR-H2、FR-H3和FR-H4中的至少一个(例如，1、2、3或4个)，其分别包含SEQ ID NO:34至37的序列；和/或轻链框架区FR-L1、FR-L2、FR-L3和FR-L4中的至少一个(例如，1、2、3或4个)，其分别包含SEQ ID NO:38至41的序列。在其他方面，结合LY6G6D的第一结合结构域包含：重链框架区FR-H1、FR-H2、FR-H3和FR-H4中的至少一个(例如，1、2、3或4个)，其分别包含SEQ ID NO:34、58、36和37的序列；和/或轻链框架区FR-L1、FR-L2、FR-L3和FR-L4中的至少一个(例如，1、2、3或4个)，其分别包含SEQ ID NO:38、61、40和41的序列。在一些方面，与LY6G6D结合的第一结合结构域可例如包含：(a)VH1结构域，其包含与SEQID NO:10的序列具有至少90％序列同一性(例如，至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)或具有SEQ ID NO:10的序列的氨基酸序列；和(b)VL1结构域，其包含与SEQ ID NO:11的序列具有至少90％序列同一性(例如，至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)或具有SEQ ID NO:11的序列的氨基酸序列，诸如本文所述的抗LY6G6D抗体20A12.QNTv12所具备的。在一些方面，与LY6G6D结合的第一结合结构域包含：(a)VH1结构域，其包含具有SEQ ID NO:59的序列的氨基酸序列和(b)VL1结构域，其包含具有SEQ ID NO:60的序列的氨基酸序列。
在上述具有与CD3结合的第二结合结构域的抗LY6G6D抗体的一些方面，与CD3结合的第二结构域包含选自以下项的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个CDR：(a)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列；(b)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列；(c)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列；(d)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列；(e)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:50的氨基酸序列；和(f)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:51的氨基酸序列。
在一些方面，与CD3结合的第二结构域包含以下所有六项：(a)CDR-H1，其包含SEQID NO:15的氨基酸序列；(b)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列；(c)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列；(d)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列；(e)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列；和(f)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列。
在一些方面，与CD3结合的第二结构域包含结合结构域，该结合结构域包含以下所有六项：(a)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列；(b)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列；(c)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列；(d)CDR-L1，其包含SEQ IDNO:12的氨基酸序列；(e)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列；和(f)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列。
在一些情况下，与CD3结合的第二结构域包含：VH2结构域，其包含与SEQ ID NO:20的序列具有至少90％序列同一性(例如，至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)或具有SEQ ID NO:20的序列的氨基酸序列；和/或VL2结构域，其包含与SEQ ID NO:21的序列具有至少90％序列同一性(例如，至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)或具有SEQ ID NO:21的序列的氨基酸序列。在特定情况下，抗CD3抗体可以为38E4.v1 MD1或其衍生物或克隆亲属。
在一些情况下，与CD3结合的第二结构域可具有：VH2结构域，其包含与SEQ ID NO:20的序列具有至少90％序列同一性(例如，至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)或具有SEQ ID NO:20的序列的氨基酸序列；和/或VL2结构域，其包含与SEQ ID NO:55的序列具有至少90％序列同一性(例如，至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)或具有SEQ ID NO:55的序列的氨基酸序列。在特定情况下，抗CD3抗体可以为38E4.v1 MD4或其衍生物或克隆亲属。
在一些方面，与CD3结合的第二结构域可包含以下至少一项(例如，1、2、3或4项)：(a)FR-H1，其包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列；(b)FR-H2，其包含SEQ ID NO:43或SEQ IDNO:62的氨基酸序列；(c)FR-H3，其包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列；和(d)FR-H4，包含SEQID NO:45的氨基酸序列，和/或包含以下至少一项(例如，1、2、3或4项)：(a)FR-L1，其包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列；(b)FR-L2，其包含SEQ ID NO:47或SEQ ID NO:63的氨基酸序列；(c)FR-L3，其包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列；和(d)FR-L4，其包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列。
在一些方面，抗CD3抗体包含以下所有四项：(a)FR-H1，其包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列；(b)FR-H2，其包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列；(c)FR-H3，其包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列；和(d)FR-H4，包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列，和/或包含以下所有四项：(a)FR-L1，其包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列；(b)FR-L2，其包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列；(c)FR-L3，其包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列；和(d)FR-L4，其包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列。在一些方面，抗LY6G6D抗体可具有：VH2结构域，其包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列；和/或VL2结构域，其包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列。在其他方面，抗LY6G6D抗体可具有：VH2结构域，其包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列；和/或VL2结构域，其包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列。
在一些方面，抗CD3抗体包含以下所有四项：(a)FR-H1，其包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列；(b)FR-H2，其包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列；(c)FR-H3，其包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列；和(d)FR-H4，包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列，和/或包含以下所有四项：(a)FR-L1，其包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列；(b)FR-L2，其包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列；(c)FR-L3，其包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列；和(d)FR-L4，其包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列。
在一些实施例中，双特异性抗体可用于将细胞毒性剂定位于表达肿瘤抗原例如Ly6G6D的细胞。双特异性抗体可以制备为全长抗体或抗体片段。
制备多特异性抗体的技术包括但不限于，具有不同特异性的两个免疫球蛋白重链-轻链对的重组共表达(参见，Milstein和Cuello,Nature 305:537(1983)、WO 93/08829和Traunecker等人,EMBO J.10:3655(1991))和“杵臼”工程化(参见，例如，美国专利号5,731,168)。可以利用多特异性抗体的“杵臼(knob-in-hole)”工程化改造以生成包含杵的第一臂和包含臼的第二臂，其中第一臂的杵可以结合在该臼中。在一个实施例中，本发明的多特异性抗体的杵可以为抗CD3臂。替代性地，在一个实施例中，本发明的多特异性抗体的杵可以为抗靶标/抗原臂。在一个实施例中，本发明的多特异性抗体的臼可以为抗CD3臂。替代性地，在一个实施例中，本发明的多特异性抗体的臼可以为抗靶标/抗原臂。多特异性抗体也可以使用免疫球蛋白交叉(也称为Fab结构域交换或CrossMab形式)技术进行工程化改造(参见，例如，WO2009/080253；Schaefer等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,108:11187-11192(2011))。还可以通过工程化改造静电操纵效应来制备多特异性抗体，以制备抗体Fc-异二聚体分子(WO 2009/089004A1)；交联两种或更多种抗体或片段(参见，例如，美国专利号4,676,980，和Brennan等人,Science,229:81(1985))；使用亮氨酸拉链产生双特异性抗体(参见，例如，Kostelny等人，J.Immunol.,148(5):1547-1553(1992))；使用“双体抗体”技术制备双特异性抗体片段(参见，例如,Hollinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:6444-6448(1993))；以及使用单链Fv(sFv)二聚体(参见，例如Gruber等人，J.Immunol.,152:5368(1994))；以及制备如例如在Tutt等人，J.Immunol.147:60(1991)中所述的三特异性抗体。
具有三个或更多个功能性抗原结合位点的工程化改造的抗体，包括“章鱼抗体”，也包括在本文中(参见，例如US 2006/0025576A1)。
抗体或其抗原结合片段还可以包括“双重作用FAb”或“DAF”，其包含与CD3以及另一种不同抗原(例如，第二生物分子)结合的抗原结合位点(参见例如，US 2008/0069820)。
7.抗体变体
在一些方面，考虑了本发明的抗LY6G6D和/或抗CD3抗体的氨基酸序列变体(例如，本发明的双特异性抗LY6G6D抗体，其与LY6G6D例如以高亲和力结合(例如，20A12.QNTv12)且与第二生物分子(例如CD3)结合，诸如本发明的TDB抗体或其变体)。例如，可能期望改善抗体的结合亲和力和/或其他生物特性。抗体的氨基酸序列变体可以通过向编码抗体的核苷酸序列中引入适当的修饰或通过肽合成来制备。此类修饰包括例如抗体氨基酸序列内残基的缺失、和/或插入和/或取代。可以进行缺失、插入和取代的任何组合以实现最终构建体，前提条件为最终构建体具有所需特征，例如，抗原结合。
a.取代、插入和删除性变体
在某些实施例中，提供了具有一或多个氨基酸取代的抗体变体。用于取代诱变的目标位点包括CDR和FR。保守取代在表1中的“优选取代”标题下示出。更多实质性改变提供于表1的“示例性取代”标题下，并且在下文参考氨基酸侧链类别进行了进一步描述。可以将氨基酸取代引入目标抗体中，并且对产物进行所需活性(例如，保留/改善的抗原结合、降低的免疫原性，或改善的ADCC或CDC)筛选。
表1.示例性和优选的氨基酸取代
可根据共同的侧链特性将氨基酸分组：
(1)疏水性：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；
(2)中性亲水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；
(3)酸性：Asp、Glu；
(4)碱性：His、Lys、Arg；
(5)影响链取向的残基：Gly，Pro；
(6)芳族：Trp、Tyr、Phe。
非保守性取代将需要用这些类别中的一个的成员交换另一类别。
一种类型的取代变体涉及取代亲本抗体(例如，人源化抗体或人抗体)的一个或多个高可变区残基。通常，相对于亲本抗体，选为用于进一步研究的一个或多个所得变体将在某些生物学特性方面(例如，亲和力增加、免疫原性降低)有改变(例如，改善)和/或将基本上保留亲本抗体的某些生物学特性。示例性取代变体是亲和力成熟抗体，其可例如使用诸如本文所述的那些基于噬菌体展示的亲和力成熟技术方便地生成。简言之，将一个或多个CDR残基突变并且将变体抗体展示在噬菌体上并针对特定生物活性(例如结合亲和力)进行筛选。
例如，可在CDR中作出改变(例如，取代)，以改善抗体亲和力。此类改变可发生于CDR“热点”中，即由体细胞成熟过程中发生高频突变的密码子编码的残基(参见例如Chowdhury，Methods Mol.Biol.207:179-196,2008)和/或与抗原接触的残基(测试所得变体VH或VL的结合亲和力)。通过构建并自二级文库重新选择而实现的亲和力成熟已被例如Hoogenboom等人在Methods in Molecular Biology 178:1-37(O'Brien等人编，HumanPress,Totowa,NJ,(2001))中进行描述。在亲和力成熟的一些实施例中，利用多种方法(例如，易错PCR、链改组或寡核苷酸定点诱变基因)中的任一种将多样性引入选择用于成熟的可变基因中。然后创建一个二级文库。随后对该文库进行筛选以鉴别具有所需亲和力的任何抗体变体。引入多样性的另一种方法涉及CDR定向方法，其中将若干CDR残基(例如，每次4-6个残基)随机化。参与抗原结合的CDR残基可例如使用丙氨酸扫描突变或建模来特异性地鉴别。具体而言，常常靶向CDR-H3和CDR-L3。
在某些实施例中，取代、插入或缺失可发生在一个或多个CDR内，只要此类改变不基本上降低抗体的抗原结合能力即可。例如，可在CDR中进行基本上不降低结合亲和力的保守性改变(例如，如本文提供的保守性取代)。这样的改变可以例如在CDR中的抗原接触残基的外部。在上文提供的变体VH和VL序列的某些实施例中，每个CDR保持不变，或含有不超过一个、两个或三个氨基酸取代。
可用于鉴别可被靶向突变的抗体残基或区域的方法称作“丙氨酸扫描突变”，如Cunningham and Wells,(1989)Science,244:1081-1085中所述。在此方法中，鉴别残基或一组靶残基(例如，带电残基，诸如arg、asp、his、lys和glu)并用中性或带负电的氨基酸(例如，丙氨酸或多丙氨酸)替换以确定抗体与抗原的相互作用是否受到影响。可在对初始取代展示功能敏感性的氨基酸位置引入其他取代。可替代地或另外地，利用抗原-抗体复合物的晶体结构鉴别抗体与抗原之间的接触点。可靶向或消除作为取代的候选的此类接触残基和相邻残基。可筛选变体以确定它们是否具备期望的特性。
氨基酸序列插入包括长度范围为一个残基至含有一百个或更多个残基的多肽的氨基和/或羧基末端融合，以及一个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的实例包括具有N末端甲硫氨酰残基的抗体。抗体分子的其他插入变体包括与增加抗体的血清半衰期的酶(例如对于ADEPT)或多肽的抗体的N末端或C末端的融合。
b.糖基化变体
在某些实施例中，可以改变本发明的抗LY6G6D和/或抗CD3抗体(例如，本发明的双特异性抗LY6G6D抗体，其与LY6G6D优选以高亲和力结合(例如，20A12.QNTv12)且与第二生物分子(例如，CD3)结合)以增加或减少抗体糖基化的程度。本发明的抗LY6G6D抗体添加或缺失糖基化位点可以通过改变氨基酸序列以创建或去除一个或多个糖基化位点来方便地实现。
当抗体包含Fc区时，附接于其上的碳水化合物可以被改变。由哺乳动物细胞产生的天然抗体通常包含具有支链的双触角寡糖，所述双触角寡糖通常通过N-键结连接于Fc区的CH2结构域的Asn297。参见，例如，Wright等人TIBTECH 15:26-32(1997)。寡糖可包括各种碳水化合物，例如，甘露糖、N-乙酰基葡糖胺(GlcNAc)、半乳糖和唾液酸，以及附接于双触角寡糖结构的“主干”中的GlcNAc的岩藻糖。在一些实施例中，可以对本发明的抗体中的寡糖进行修饰，以便产生具有某些改善的特性的抗体变体。
在一个实施例中，提供抗LY6G6D抗体和/或抗CD3抗体变体，其具有缺乏(直接或间接)附接至Fc区的岩藻糖的碳水化合物结构。例如，此类抗体中岩藻糖的含量可以为1％至80％、1％至65％、5％至65％或20％至40％。岩藻糖的量为通过计算相对于通过MALDI-TOF质谱测得的与Asn 297附接的所有糖结构(例如，复合、杂合和高甘露糖结构)的总和，糖链中在Asn297处的岩藻糖的平均量，确定，如WO 2008/077546中所述。Asn297是指位于Fc区中约297位的天冬酰胺残基(Fc区残基的EU编号)；然而，由于抗体中的微小序列变化，Asn297也可以位于297位上游或下游大约±3个氨基酸，即在294位和300位之间。此类岩藻糖基化变体可以具有改善的ADCC功能。参见例如美国专利公开号US 2003/0157108(Presta,L.)；US 2004/0093621(Kyowa Hakko Kogyo Co.,Ltd)。与“去岩藻糖基化”或“岩藻糖缺陷型”抗体变体有关的出版物的实例包括：US 2003/0157108；WO 2000/61739；WO 2001/29246；US2003/0115614；US 2002/0164328；US 2004/0093621；US 2004/0132140；US 2004/0110704；US 2004/0110282；US 2004/0109865；WO 2003/085119；WO 2003/084570；WO 2005/035586；WO 2005/035778；WO2005/053742；WO2002/031140；Okazaki等人，J.Mol.Biol.336:1239-1249(2004)；Yamane-Ohnuki等人，Biotech.Bioeng.87:614(2004)。能够产生去岩藻糖基化抗体的细胞系的示例包括蛋白岩藻糖基化缺陷的Lec13CHO细胞(Ripka等人Arch.Biochem.Biophys.249:533-545(1986)；美国专利申请号US 2003/0157108 A1,Presta,L；和WO 2004/056312 A1，Adams等人，特别是实例11)，和敲除细胞系，诸如α-1,6-岩藻糖基转移酶基因(FUT8)敲除的CHO细胞(参见，例如，Yamane-Ohnuki等人Biotech.Bioeng.87:614(2004)；Kanda,Y.等人,Biotechnol.Bioeng.,94(4):680-688(2006)；和WO2003/085107)。
抗LY6G6D抗体和/或抗CD3抗体变体进一步提供有二等分的寡糖，例如，其中附接至抗体的Fc区的双触角寡糖被GlcNAc二等分。此类抗体变体可以具有减少的岩藻糖基化和/或改善的ADCC功能。此类抗体变体的实例描述于例如WO 2003/011878(Jean-Mairet等人)、美国专利号6,602,684(Umana等人)和US 2005/0123546(Umana等人)中。还提供了在连接于Fc区的寡糖中具有至少一个半乳糖残基的抗体变体。这样的抗体变体可以具有改善的CDC功能。此类抗体变体描述于例如WO 1997/30087(Patel等人)；WO 1998/58964(Raju,S.)；以及WO 1999/22764(Raju,S.)中。
c.Fc区变体
在某些实施例中，可以将一个或多个氨基酸修饰引入本发明的抗LY6G6D和/或抗CD3抗体(例如，本发明的双特异性抗LY6G6D抗体，其优选地以高亲和力与LY6G6D结合(例如，20A12.QNTv12)且与第二生物分子(例如，CD3)结合)的Fc区，从而生成Fc区变体(参见例如，US 2012/0251531)。Fc区变体可以包含人Fc区序列(诸如人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc区)，其在一个或多个氨基酸位置上包含氨基酸修饰(诸如，取代)。
在某些实施例中，本发明考虑了一种抗LY6G6D和/或抗CD3抗体变体，其具备具有一些但不是全部效应子功能，这使其成为应用的期望候选物，其中体内的抗体的半衰期为重要的而某些效应子功能(诸如补体和ADCC)为不必要的或有害的。可以进行体外和/或体内细胞毒性测定，以确认CDC和/或ADCC活性的降低/耗尽。例如，可以进行Fc受体(FcR)结合测定以确保抗体缺乏FcγR结合(因此可能缺乏ADCC活性)，但是保留FcRn结合能力。介导ADCC的主要细胞NK细胞仅表达Fc(RIII，而单核细胞表达Fc(RI、Fc(RII和Fc(RIII。造血细胞上的FcR表达总结在Ravetch和Kinet，Kinet,Annu.Rev.Immunol.9:457-492(1991)的第464页的表3中。用于评估目标分子的ADCC活性的体外测定的非限制性实例描述于美国专利号5,500,362(参见例如Hellstrom,I.等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83:7059-7063(1986))和Hellstrom,I等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:1499-1502(1985)；5,821,337(参见Bruggemann,M.等人，J.Exp.Med.166:1351-1361(1987))。可替代地，可使用非放射性测定方法(参见例如，用于流式细胞术的ACTITM非放射性细胞毒性测定(CellTechnology,Inc.Mountain View,CA)；以及CytoTox非放射性细胞毒性测定(Promega,Madison,WI)。用于此类测定的有用效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和自然杀伤(NK)细胞。替代地或另外地，可例如在诸如在Clynes等人，Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 95:652-656(1998)中公开的动物模型中体内评估目标分子的ADCC活性。也可以进行C1q结合测定以确认抗体不能结合C1q，因此缺乏CDC活性。参见例如WO 2006/029879和WO 2005/100402中的C1q和C3c结合ELISA。为评估补体激活，可以执行CDC测定(参见例如Gazzano-Santoro等人J.Immunol.Methods202:163(1996)；Cragg,M.S.等人.Blood.101:1045-1052(2003)；以及Cragg,M.S.和M.J.Glennie Blood.103:2738-2743(2004))。FcRn结合和体内清除率/半衰期测定也可以使用本领域已知的方法执行(参见例如Petkova,S.B.等人，Int’l.Immunol.18(12):1759-1769(2006))。
具有降低的效应子功能的抗体包括具有一个或多个Fc区残基238、265、269、270、297、327和329的取代的那些(美国专利号6,737,056和8,219,149)。此类Fc突变体包括在两个或多个第265、269、270、297和327位氨基酸处具有取代的Fc突变体，包括所谓的“DANA”Fc突变体，其残基265和297被取代为丙氨酸(美国专利号7,332,581和8,219,149)。
在某些实施例中，抗体中野生型人Fc区的位置329处的脯氨酸被甘氨酸或精氨酸或足够大的氨基酸残基取代，以摧毁在Fc的脯氨酸329与FcgRIII的色氨酸残基Trp 87和Trp 110之间形成的Fc/Fcγ受体界面内的脯氨酸夹层(Sondermann等人Nature.406,267-273,2000)。在某些实施例中，抗体包含至少一个进一步的氨基酸取代。在另一个实施例中，该另外的氨基酸取代为S228P、E233P、L234A、L235A、L235E、N297A、N297D或P331S，并且在又一个实施例中，该至少一个另外的氨基酸取代为人IgG1 Fc区的L234A和L235A或人IgG4 Fc区的S228P和L235E(参见例如US 2012/0251531)，并且在又一个实施例中，该至少一个另外的氨基酸取代为人IgG1 Fc区的L234A和L235A以及P329G。
描述了具有改善的或降低的与FcR的结合的某些抗体变体。(参见例如美国专利号6,737,056；WO 2004/056312；以及Shields等人，J.Biol.Chem.9(2):6591-6604(2001)。)
在某些实施例中，抗体变体包含具有一个或多个氨基酸取代的Fc区，取代改善ADCC，例如，在Fc区的298、333和/或334位(残基的EU编号)处的取代。
在一些实施例中，在Fc区中作出改变，导致改变的(即，改善的或减少的)C1q结合和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)，例如，如美国专利号6,194,551，WO 99/51642和Idusogie等人J.Immunol.164:4178-4184(2000)所述。
具有延长的半衰期和改善的新生儿Fc受体(FcRn)结合、负责将母体IgG转移至胎儿(Guyer等人，J.Immunol.117:587(1976)；以及Kim等人，J.Immunol.24:249(1994))的抗体描述于US2005/0014934A1(Hinton等人)中。那些抗体包含这样的Fc区，所述Fc区中具有改善Fc区与FcRn的结合的一个或多个取代。此类Fc变体包括在以下Fc区残基中的一处或多处具有取代的Fc变体：238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424或434，例如对Fc区残基434的取代(美国专利号7,371,826)。
有关Fc区变体的其他实例，另外参见：Duncan和Winter，Nature 322:738-40(1988)；美国专利号5,648,260；美国专利号5,624,821；以及WO 94/29351。
在一些方面，抗LY6G6D和/或抗CD3抗体(例如，双特异性抗LY6G6D抗体)包含Fc区，该Fc区包含N297G突变。在一些实施例中，包含N297G突变的抗LY6G6D抗体包含抗LY6G6D臂，该臂包含第一结合结构域，该第一结合结构域包含以下六个CDR：(a)CDR-H1，其包含SEQ IDNO:4的氨基酸序列；(b)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列；(c)CDR-H3，其包含SEQID NO:6的氨基酸序列；(d)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列；(e)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列；以及(f)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列；以及抗CD3臂。
在一些实施例中，包含N297G突变的抗LY6G6D抗体包含抗CD3臂，该臂包含第一结合结构域，该第一结合结构域包含：(a)VH域，其包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列,和(b)VL域，其包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列；以及抗CD3臂。在其他实施例中，包含N297G突变的抗LY6G6D抗体包含抗CD3臂，该臂包含第一结合结构域，该第一结合结构域包含：(a)VH域，其包含SEQ ID NO:59的氨基酸序列,和(b)VL域，其包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列；以及抗CD3臂。
在一些实施例中，包含N297G突变的LY6G6D抗体包含一个或多个重链恒定结构域，其中该一个或多个重链恒定结构域选自第一CH1(CH11)结构域、第一CH2(CH21)结构域、第一CH3(CH31)结构域、第二CH1(CH12)结构域、第二CH2(CH22)结构域和第二CH3(CH32)结构域。在一些方面，一个或多个重链恒定结构域中的至少一个与另一个重链恒定结构域配对。在一些方面，CH31和CH32结构域各自包含突起或腔，并且其中CH31结构域中的突起或腔分别可定位在CH32结构域中的腔或突起中。在一些方面，CH31和CH32结构域在所述突起和空腔之间的界面处相遇。在一些方面，CH21和CH22结构域各自包含突起或腔，并且其中CH21结构域中的突起或腔分别可定位在CH22结构域中的腔或突起中。在其他情况下，CH21和CH22结构域在所述突起与空腔之间的界面处相遇。在一些方面，抗LY6G6D抗体为IgG1抗体。
在一些实施例中，包含N297G突变的抗CD3抗体包含抗LY6G6D臂，该臂包含第一结合结构域，该第一结合结构域包含：(a)VH域，其包含SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:59的氨基酸序列，和(b)VL结构域，其包含SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:60的氨基酸序列；以及抗CD3臂，其中(a)抗LY6G6D臂包含T366S、L368A、Y407V和N297G取代突变，并且(b)抗CD3臂包含T366W和N297G取代突变。
在其他实施例中，包含N297G突变的抗CD3抗体包含抗LY6G6D臂，该臂包含第一结合结构域，该第一结合结构域包含：(a)VH域，其包含SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:59的氨基酸序列，和(b)VL结构域，其包含SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:60的氨基酸序列；以及抗CD3臂，其中(a)抗LY6G6D臂包含T366W和N297G取代突变，并且(b)抗CD3臂包含T366S、L368A、Y407V和N297G取代突变。
d.半胱氨酸工程抗体变体
在某些实施例，可期望产生经半胱氨酸工程化改造的抗体，例如“thioMAbs”，其中抗体的一个或多个残基被半胱氨酸残基取代。在特定实施例中，取代的残基存在于抗体的可接近位点。如本文进一步描述的，通过用半胱氨酸取代那些残基，从而将反应性硫醇基团定位于抗体的可接近位点，并且可用于将抗体与其他部分(诸如药物部分或接头-药物部分)缀合，以产生免疫缀合物。在某些实施例中，可用半胱氨酸取代下列残基中的任何一个或多个：轻链的V205(Kabat编号)；重链的A118(EU编号)；以及重链Fc区的S400(EU编号)。可例如美国专利号7,521,541中所述生成半胱氨酸工程化改造的抗体。
e.抗体衍生物
在某些实施例中，本文提供的本发明的抗LY6G6D抗体(例如，本发明的双特异性抗LY6G6D抗体，其与LY6G6D优选以高亲和力结合(例如，20A12.QNTv12)且与第二生物分子(例如，CD3)结合)可进一步经修饰以包含本领域已知且容易获得的另外的非蛋白质部分。适合于抗体衍生化的部分包括但不限于水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性示例包括但不限于聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇的共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1,3-二氧戊环、聚-1,3,6-三噁烷、乙烯/马来酸酐共聚物、聚氨基酸(均聚物或随机共聚物)和葡聚糖或聚(n-乙烯吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、聚氧乙烯化多元醇(例如甘油)、聚乙烯醇以及它们的混合物。由于其在水中的稳定性，聚乙二醇丙醛在制造中可具有优势。聚合物可具有任何分子量，并且可以具有支链或不具有支链。附接至抗体的聚合物的数目可变，并且如果附接了多于一个聚合物，那么它们可以为相同或不同的分子。通常，可基于以下考虑因素测定用于衍生化的聚合物的数目和/或类型，包括但不限于抗体待改善的特定特性或功能、抗体衍生物是否将用于限定条件下的疗法等。
在另一个实施例中，提供了抗体和可通过暴露于辐射而选择性地加热的非蛋白质部分的缀合物。在一个实施例中，非蛋白质部分是碳纳米管(Kam等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102:11600-11605(2005))。辐射可具有任何波长，并且包括但不限于对普通细胞没有伤害、但是将非蛋白质性部分加热至抗体-非蛋白质性部分近端的细胞被杀死的温度的波长。
8.带电区
在一些方面，结合LY6G6D或CD3的结合结构域包含：包含带电区(CR1)的VH1和包含带电区(CR2)的VL1，其中VH1中的CR1与VL1中的CR2形成电荷对。在一些方面，CR1包含碱性氨基酸残基，且CR2包含酸性氨基酸残基。在一些方面，CR1包含Q39K取代突变(Kabat编号)。在一些方面，CR1由Q39K取代突变组成。在一些方面，CR2包含Q38E取代突变(Kabat编号)。在一些方面，CR2由Q38E取代突变组成。在一些方面，结合CD3的第二结合结构域包含：包含带电区(CR3)的VH2和包含带电区(CR4)的VL2，其中VL2中的CR4与VH2中的CR3形成电荷对。在一些方面，CR4包含碱性氨基酸残基，且CR3包含酸性氨基酸残基。在一些方面，CR4包含Q38K取代突变(Kabat编号)。在一些方面，CR4由Q38K取代突变组成。在一些方面，CR3包含Q39E取代突变(Kabat编号)。在一些方面，CR3由Q39E取代突变组成。在一些方面，VL1结构域连接至轻链恒定结构域(CL1)结构域，且VH1连接至第一重链恒定结构域(CH1)，其中CL1包含带电区(CR5)，且CH1包含带电区(CR6)，并且其中CL1中的CR5与CH11中的CR6形成电荷对。在一些方面，CR5包含碱性氨基酸残基，且CR6包含酸性残基。在一些方面，CR5包含V133K取代突变(EU编号)。在一些方面，CR5由V133K取代突变组成。在一些方面，CR6包含S183E取代突变(EU编号)。在一些方面，CR6由S183E取代突变组成。
在其他方面，VL2结构域连接至CL结构域(CL2)，且VH2连接至CH1结构域(CH12)，其中CL2包含带电区(CR7)，且CH12包含带电区(CR8)，并且其中CH12中的CR8与CL2中的CR7形成电荷对。在一些方面，CR8包含碱性氨基酸残基，且CR7包含酸性氨基酸残基。在一些方面，CR8包含S183K取代突变(EU编号)。在一些方面，CR8由S183K取代突变组成。在一些方面，CR7包含V133E取代突变(EU编号)。在一些方面，CR7由V133E取代突变组成。
在其他方面，VL2结构域连接至CL结构域(CL2)，且VH2连接至CH1结构域(CH12)，其中(a)CL2在氨基酸残基F116、L135、S174、S176和/或T178(EU编号)处包含一个或多个突变，且(b)CH12在氨基酸残基A141、F170、S181、S183和/或V185(EU编号)处包含一个或多个突变。在一些方面，CL2包含以下取代突变中的一个或多个：F116A、L135V、S174A、S176F和/或T178V。在一些方面，CL2包含以下取代突变：F116A、L135V、S174A、S176F和T178V。在一些方面，CH12包含以下取代突变中的一个或多个：A141I、F170S、S181M、S183A和/或V185A。在一些方面，CH12包含以下取代突变：A141I、F170S、S181M、S183A和V185A。
在其他方面，结合LY6G6D或CD3的结合结构域包含：包含带电区(CR1)的VH结构域(VH1)和包含带电区(CR2)的VL结构域(VL1)，其中VL1中的CR2与VH1中的CR1形成电荷对。在一些方面，CR2包含碱性氨基酸残基，且CR1包含酸性氨基酸残基。在一些方面，CR2包含Q38K取代突变(Kabat编号)。在一些方面，CR2由Q38K取代突变组成。在一些方面，CR1包含Q39E取代突变(Kabat编号)。在一些方面，CR1由Q39E取代突变组成。在一些方面，结合CD3的第二结合结构域包含：包含带电区(CR3)的VH结构域(VH2)和包含带电区(CR4)的VL结构域(VL2)，其中VH2中的CR3与VL2中的CR4形成电荷对。在一些方面，CR3包含碱性氨基酸残基，且CR4包含酸性氨基酸残基。在一些方面，CR3包含Q39K取代突变(Kabat编号)。在一些方面，CR3由Q39K取代突变组成。在一些方面，CR4包含Q38E取代突变(Kabat编号)。在一些方面，CR4由Q38E取代突变组成。在一些方面，VL1结构域连接至轻链恒定结构域(CL1)，且VH1连接至第一重链恒定结构域(CH11)，其中CL1包含带电区(CR5)，且CH11包含带电区(CR6)，并且其中CH11中的CR6与CL1中的CR5形成电荷对。在一些方面，CR6包含碱性氨基酸残基，且CR5包含酸性氨基酸残基。在一些方面，CR6包含S183K取代突变(EU编号)。在一些方面，CR6由S183K取代突变组成。在一些方面，CR5包含V133E取代突变(EU编号)。在一些方面，CR5由V133E取代突变组成。
在其他方面，VL2结构域连接至CL结构域(CL2)，且VH2连接至CH1结构域(CH12)，其中CL2包含带电区(CR7)，且CH12包含带电区(CR8)，并且其中CL2中的CR7与CH12中的CR8形成带电对。在一些方面，CR7包含碱性氨基酸残基，且CR8包含酸性残基。在一些方面，CR7包含V133K取代突变(EU编号)。在一些方面，CR7由V133K取代突变组成。在一些方面，CR8包含S183E取代突变(EU编号)。在一些方面，CR8由S183E取代突变组成。
在其他方面，VL2结构域连接至CL结构域(CL2)，且VH2连接至CH1结构域(CH12)，其中(a)CL2在氨基酸残基F116、L135、S174、S176和/或T178(EU编号)处包含一个或多个突变，且(b)CH12在氨基酸残基A141、F170、S181、S183和/或V185(EU编号)处包含一个或多个突变。在一些方面，CL2包含以下取代突变中的一个或多个：F116A、L135V、S174A、S176F和/或T178V。在一些方面，CL2包含以下取代突变：F116A、L135V、S174A、S176F和T178V。在一些方面，CH12包含以下取代突变中的一个或多个：A141I、F170S、S181M、S183A和/或V185A。在一些方面，CH12包含以下取代突变：A141I、F170S、S181M、S183A和V185A。在一些方面，抗FcRH5抗体包含一个或多个重链恒定结构域，其中该一个或多个重链恒定结构域选自第一CH2结构域(CH21)、第一CH3结构域(CH31)、第二CH2结构域(CH22)和第二CH3结构域(CH32)。在一些方面，一个或多个重链恒定结构域中的至少一个与另一个重链恒定结构域配对。在一些方面，CH31和CH32各自包含突起(P1)或空腔(C1)，并且其中CH31中的P1或C1分别可定位在CH32中的C1或P1中。在一些方面，CH31和CH32在P1与C1之间的界面处相遇。在一些方面，CH21和CH22各自包含(P2)或空腔(C2)，并且其中CH21中的P2或C2分别可定位在CH22中的C2或P2中。在一些方面，CH21和CH22在P2与C2之间的界面处相遇。
B.重组方法和组合物
本发明的抗LY6G6D抗体(例如，本发明的双特异性抗LY6G6D抗体，其与LY6G6D优选以高亲和力结合(例如，20A12.QNTv12)且与第二生物分子(例如，CD3)结合)和/或本发明的抗CD3抗体(例如，38E4v1 MD1(MD1)和38E4v1 MD4(MD4))可以使用重组方法和组合物产生，例如，如美国专利号4,816,567中所述。在一个实施例中，提供一种编码本文所述的抗LY6G6D抗体的分离的核酸。此类核酸可编码构成抗体的VL的氨基酸序列和/或构成抗体的VH的氨基酸序列(例如抗体的轻链和/或重链)。在另一实施例中，提供一种编码本文所述的抗CD3抗体的分离的核酸。此类核酸可编码构成抗体的VL的氨基酸序列和/或构成抗体的VH的氨基酸序列(例如抗体的轻链和/或重链)。在进一步实施例中，提供了包含此类核酸的一种或多种载体(例如表达载体)。在进一步的实施例中，提供了包括此类核酸的宿主细胞。在一个此类实施例中，宿主细胞包含以下(例如已被用以下转化)：(1)包含核酸的载体，所述核酸编码包含抗体的VL的氨基酸序列和包含抗体的VH的氨基酸序列；或(2)第一载体和第二载体，所述第一载体包含核酸，所述核酸编码抗体的VL的氨基酸序列，所述第二载体包含核酸，所述核酸编码包含抗体的VH的氨基酸序列。在一个实施例中，宿主细胞为真核细胞，例如，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或淋巴样细胞(例如，Y0、NS0、Sp20细胞)。在一个实施例中，提供一种制备抗LY6G6D抗体的方法，其中该方法包括在适于表达抗体的条件下培养如上所提供的包含编码该抗体的核酸的宿主细胞，以及任选地从宿主细胞(或宿主细胞培养基)回收该抗体。
关于抗LY6G6D抗体和/或抗CD3抗体的重组生产，将编码例如上文所述抗体的核酸分离并插入到一个或多个载体中以用于在宿主细胞中进一步克隆和/或表达。可以使用常规程序来容易地对此类核酸进行分离和测序(例如，通过使用能够与编码抗体的重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)。
1.用于制备双特异性抗体的双细胞方法
在一些方面，本发明的抗体(例如，LY6G6D TDB，例如，具有抗CD3臂和抗Ly6G6D臂(例如，20A12.QNTv12)的LY6G6D TDB)使用包含两种宿主细胞系的方法制备。在一些方面，抗体的第一臂(例如，包含臼区的第一臂)在第一宿主细胞系中产生，并且抗体的第二臂(例如，包含杵区的第二臂)在第二宿主细胞系中产生。抗体的臂从宿主细胞系中纯化并在体外组装。
2.用于制备双特异性抗体的单细胞方法
在一些方面，本发明的抗体(例如，LY6G6D TDB，例如，具有抗CD3臂(例如，38E4.v1MD1或38E4.v1 MD4)和抗Ly6G6D臂(例如，20A12.QNTv12)的LY6G6D TDB)使用包含单一宿主细胞系的方法制备。在一些方面，抗体的第一臂(例如，包含臼区的第一臂)和抗体的第二臂(例如，包含杵区的第二臂)在单一宿主细胞系中产生并纯化。优选地，第一臂和第二臂在宿主细胞中以相当的水平表达，例如在宿主细胞中均以高水平表达。相似水平的表达增加了有效TDB生产的可能性并降低了TDB组分的轻链(LC)错配的可能性。抗体的第一臂和第二臂可各自进一步包含引入电荷对的氨基酸取代突变，如本文第IIB(8)节所述。电荷对促进双特异性抗体每条臂的重链和轻链同源对的配对，从而最大限度地减少错配。
3.宿主细胞
用于克隆或表达编码抗体的载体的合适宿主细胞包括本文所述的原核或真核细胞。例如，可以在细菌中产生抗体，特别是当不需要糖基化和Fc效应子功能时。关于在细菌中表达抗体片段和多肽，参见例如美国专利No.5,648,237、No.5,789,199和No.5,840,523。(另请参见Charlton,Methods in Molecular Biology，第248卷(B.K.C.Lo编，HumanaPress,Totowa,NJ,2003)，第245-254页，其描述抗体片段在大肠杆菌中的表达。)抗体可在表达后在可溶性级分中从细菌细胞糊中分离，并且可以进一步纯化。
除了原核生物外，诸如丝状真菌或酵母等真核微生物也是用于编码抗体的载体的合适克隆或表达宿主，所述真核微生物包括这样的真菌和酵母菌株，其糖基化途径已经“人源化”，从而导致产生具有部分或完全人糖基化模式的抗体。参见Gerngross,Nat.Biotech.22:1409-1414(2004),和Li et al.,Nat.Biotech.24:210-215(2006)。
用于表达糖基化抗体的合适宿主细胞也来源于多细胞生物(无脊椎动物和脊椎动物)。无脊椎动物细胞的实例包括植物细胞和昆虫细胞。已经鉴定出了许多可以与昆虫细胞一起使用的杆状病毒株，特别是用于转染草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞。
植物细胞培养物也可用作宿主。参见例如，美国专利号5,959,177、6,040,498、6,420,548、7,125,978和6,417,429(描述了用于在转基因植物中产生抗体的PLANTIBODIESTM技术)。
脊椎动物细胞也可用作宿主。例如，适于在悬浮液中生长的哺乳动物细胞系可能是有用的。有用的哺乳动物宿主细胞系的其他示例为由SV40转化的猴肾CV1系(COS-7)；人胚肾系(293或293细胞，如例如在Graham et al.,J.Gen Virol.36:59(1977)中所述)；幼仓鼠肾细胞(BHK)；小鼠塞尔托利氏细胞(TM4细胞，如例如在Mather,Biol.Reprod.23:243-251(1980)中所述)；猴肾细胞(CV1)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76)；人宫颈癌细胞(HELA)；犬肾细胞(MDCK)；布法罗大鼠肝细胞(BRL 3A)；人肺细胞(W138)；人肝细胞(Hep G2)；小鼠乳腺肿瘤细胞(MMT 060562)；TRI细胞(如例如在Mather et al.,Annals N.Y.Acad.Sci.383:44-68(1982)中所述)；MRC 5细胞；以及FS4细胞。其他有用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，其包括DHFR-CHO细胞(Urlaub等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216(1980))；以及骨髓瘤细胞系诸如Y0、NS0和Sp2/0。关于适用于抗体生产的某些哺乳动物宿主细胞系的综述，参见例如Yazaki和Wu，Methods in Molecular Biology，第248卷(B.K.C.Lo编，Humana Press,Totowa,NJ)，第255-268页(2003)。
C.测定
本发明的抗LY6G6D抗体(例如，本发明的双特异性抗LY6G6D抗体，其与LY6G6D优选以高亲和力结合(例如，20A12.QNTv12)且与第二生物分子(例如CD3)结合，诸如本文提供的本发明的TDB抗体或其变体)可以通过本领域已知的各种测定来鉴定、筛选或表征它们的物理/化学特性和/或生物活性。
1.结合测定和其他测定
在一个方面，例如，通过已知方法诸如ELISA、Western印迹等，测试本发明的抗LY6G6D或抗CD3抗体的抗原结合活性。
在另一方面，竞争测定可用于鉴定与本发明的抗LY6G6D抗体竞争结合LY6G6D的抗体或鉴定与本发明的抗CD3抗体竞争结合CD3的抗体。
在示例性竞争测定中，将固定的LY6G6D在包含与LY6G6D结合的第一标记的抗体和正在测试其与第一抗原竞争与LY6G6D结合的能力的第二未标记的抗体的溶液中孵育。该第二抗体可存在于杂交瘤上清液中。作为对照，将固定化LY6G6D在包含第一标记抗体而非包含第二未标记抗体的溶液中温育。在容许第一抗体与LY6G6D结合的条件下温育之后，去除过量未结合的抗体，并且测量与固定化LY6G6D缔合的标记的量。若与固定化LY6G6D缔合的标记的量相对于对照样品在测试样品中基本上减少，则表明第二抗体与第一抗体竞争结合LY6G6D。参见，例如，Harlow和Lane(1988)Antibodies:A Laboratory Manual.Ch.14(ColdSpring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,NY)。另一示例性竞争测定包括固定的CD3和与CD3结合的第一标记的抗体，其中该测定如上所述执行。
2.活性测定
在一个方面，提供用于鉴定其具有生物活性的抗LY6G6D抗体的测定。生物活性可以包括例如在体内、体外或间接体内与LY6G6D(例如，肿瘤表面上的LY6G6D)或其肽片段结合。在本发明的多特异性(例如，双特异性)抗LY6G6D抗体(例如，TDB抗体，其具有一个抗LY6G6D臂(例如，20A12.QNTv12)和一个识别第二生物分子(例如，细胞表面抗原，例如，CD3)的臂)的情况下，生物活性还可以包括，例如，效应细胞活化(例如，T细胞(例如，CD8+和/或CD4+ T细胞)活化)、效应细胞群扩增(即，增加T细胞计数)、靶标细胞群减少(即，在其细胞表面上表达LY6G6D的细胞群减少)和/或靶标细胞杀伤。提供在体内和/或体外具有这种共生物活性的抗体。在某些实施例中，测试本发明的抗体的这种生物活性，如在本文实例中所详细描述。
此外，可以在补充有GlutaMax、青霉素和链霉素的含有10％FBS的RPMI培养基中洗涤细胞，并将约20万个悬浮细胞添加到96孔U型底板中。细胞可在加湿标准细胞培养箱中在37℃在补充有10％FBS的RPMI1640中培养。对于BJAB细胞杀伤测定，可以在各种浓度的TDB抗体存在下，将20,000个BJAB细胞与效应细胞(作为huPBMC或纯化的T细胞)按测定所指示的比率一起孵育24小时。
D.免疫缀合物
本发明还提供免疫缀合物，其包含与一种或多种细胞毒性剂缀合的本发明的抗LY6G6D抗体和/或抗CD3抗体，该一种或多种细胞毒性剂为诸如化疗剂或药物、生长抑制剂、毒素(例如细菌、真菌、植物或动物来源的蛋白质毒素、酶活性毒素，或它们的片段)或放射性同位素。
在一个实施例中，免疫缀合物为抗体-药物缀合物(ADC)，其中抗体缀合至一种或多种药物，包括但不限于美登木素类(参见美国专利号5,208,020、5,416,064和欧洲专利EP0 425 235B1)；auristatin，诸如单甲基auristatin药物部分DE和DF(MMAE和MMAF)(参见美国专利号5,635,483和5,780,588以及7,498,298)；多拉司他汀；卡奇霉素或其衍生物(参见美国专利号5,712,374、5,714,586、5,739,116、5,767,285、5,770,701、5,770,710、5,773,001和5,877,296；Hinman等人，Cancer Res.53:3336-3342(1993)；和Lode等人，CancerRes.58:2925-2928(1998))；蒽环类药物，诸如柔红霉素或阿霉素(参见Kratz等人，CurrentMed.Chem.13:477-523(2006)；Jeffrey等人，Bioorganic&Med.Chem.Letters 16:358-362(2006)；Torgov等人，Bioconj.Chem.16:717-721(2005)；Nagy等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97:829-834(2000)；Dubowchik等人，Bioorg.&Med.Chem.Letters 12:1529-1532(2002)；King等人，J.Med.Chem.45:4336-4343(2002)；以及美国专利号6,630,579)；甲氨蝶呤；长春地碱；紫杉烷，诸如多西他赛、紫杉醇、拉罗他赛、替塞他赛和奥他他赛；单端孢霉毒素和CC1065。
在另一实施例中，免疫缀合物包含与酶活性毒素或其片段缀合的本文所述的抗LY6G6D抗体和/或抗CD3抗体，该酶活性毒素或其片段包括但不限于白喉A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单胞菌)、蓖麻毒蛋白质A链、相思豆毒蛋白质A链、蒴莲根毒素A链、α-帚曲霉素、油桐蛋白、石竹黄素蛋白、美洲商陆抗病毒蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜抑制剂、姜黄素、巴豆素、肥皂草抑制剂、明胶、米托菌素、局限曲霉素、酚霉素、依诺霉素和单端孢菌素。
在另一实施例中，免疫缀合物包含本文所述的抗LY6G6D抗体和/或抗CD3抗体，该抗体与放射性原子缀合以形成放射性缀合物。多种放射性同位素可用于生产放射性缀合物。实例包括At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212和Lu的放射性同位素。当放射性缀合物用于检测时，它可能包含用于闪烁显像研究的放射性原子，例如，tc99m或I123，或用于核磁共振(NMR)成像(也称为磁共振成像，mri)的自旋标记物，诸如碘-123、碘-131、铟-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、钆、锰或铁。
可以使用多种双功能蛋白偶联剂，诸如N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯(SMCC)、亚氨基硫杂环戊烷(IT)、亚氨基酯的双官能衍生物(诸如己二酸二甲酯盐酸盐)、活性酯(诸如辛二酸二琥珀酰亚胺基酯)、醛(诸如戊二醛)、双叠氮基化合物(诸如双(对叠氮基苯甲酰基)己二胺)、双重氮衍生物(诸如双-(对重氮苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯(诸如甲苯2,6-二异氰酸酯)和双活性氟化合物(诸如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)制备抗体和细胞毒剂的缀合物。例如，可以如Vitetta等人,Science 238:1098(1987)中所述制备蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳-14标记的1-异硫氰基苄基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)为一种示例性螯合剂，用于将放射性核苷酸缀合至抗体。参见WO94/11026。接头可以为促进细胞中细胞毒性药物释放的“可切割接头”。例如，可以使用对酸不稳定的接头、肽酶敏感的接头、对光不稳定的接头、二甲基接头或含二硫键的接头(Chari等人，Cancer Res.52:127-131(1992)；美国专利号5,208,020)。
本文的免疫缀合物或ADC明确考虑但不限于用交联剂制备的此类缀合物，包括但不限于市售的(例如，来自Pierce Biotechnology,Inc.,Rockford,IL.,U.S.A)BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、磺基-EMCS、磺基-GMBS、磺基-KMUS、磺基-MBS、磺基-SIAB、磺基-SMCC、磺基-SMPB和SVSB(琥珀酰亚胺基-(4-乙烯基砜)苯甲酸酯)。
E.用于诊断和检测的方法和组合物
在某些实施例中，本发明的任何抗LY6G6D和/或抗CD3抗体(例如，本发明的双特异性抗LY6G6D抗体，其与LY6G6D优选以高亲和力结合(例如，20A12.QNTv12)且与第二生物分子(例如，CD3)结合)可用于检测生物样品中LY6G6D和/或CD3的存在。如本文所用，术语“检测”涵盖定量检测或定性检测。在某些实施例中，生物样品包含细胞或组织。
在一个实施例中，提供了用于诊断或检测方法中的抗LY6G6D抗体。在另一方面，提供了检测生物样品中的LY6G6D的存在的方法。在某些实施例中，该方法包括在允许抗LY6G6D抗体与LY6G6D结合的条件下使生物样品与本文所述的抗LY6G6D抗体接触，以及检测是否在抗LY6G6D抗体与LY6G6D之间形成复合物。这种方法可以是体外或体内方法。
在另一实施例中，提供一种用于诊断或检测方法中的抗CD3抗体。在另一方面，提供了检测生物样品中的CD3的存在的方法。在某些实施例中，该方法包括在允许抗CD3抗体和CD3两者结合的条件下使生物样品与抗CD3抗体接触，以及检测是否在抗CD3抗体与CD3之间形成了复合物。这种方法可以是体外或体内方法。
在某些实施例中，提供标记的抗LY6G6D抗体和/或抗CD3抗体。标记包括但不限于直接检测的标记或部分(诸如荧光标记、发色标记、电子致密标记、化学发光标记，以及放射性标记)，以及间接(例如通过酶促反应或分子相互作用)检测的部分(诸如酶或配体)。示例性标记包括但不限于放射性同位素32P、14C、125I、3H和131I；荧光团，诸如稀土螯合物或荧光素及其衍生物、罗丹明及其衍生物、丹酰、伞形酮；荧光素酶(luceriferase)，例如萤火虫荧光素酶和细菌荧光素酶(美国专利号4,737,456)；虫荧光素、2,3-二氢二氮杂萘二酮、辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、溶菌酶；糖氧化酶，例如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶；杂环氧化酶，诸如尿酸氧化酶和黄嘌呤氧化酶；与采用过氧化氢来氧化染料前体的酶(诸如HRP、乳过氧化物酶，或微过氧化物酶)偶联；生物素/抗生物素蛋白、纺丝标记、噬菌体标记、稳定自由基，等等。
F.药物制剂
本发明的抗LY6G6D抗体和/或抗CD3抗体(例如，本发明的双特异性抗LY6G6D抗体，其与LY6G6D优选以高亲和力结合(例如，20A12.QNTv12)且与第二生物分子(例如，CD3)结合)的药物制剂可以通过将具有所期望纯度的这种抗体与一种或多种任选的药用载剂(Remington's Pharmaceutical Sciences第16版，Osol，A.Ed.(1980))混合来制备，其形式为冻干制剂或水溶液。药用载剂在所采用的剂量和浓度下通常对受体无毒，包括但不限于：缓冲剂，例如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(例如十八烷基二甲基苄基氯化铵；六甲基氯化铵；苯扎氯铵；苄索氯铵；苯酚，丁醇或苄醇；对羟基苯甲酸烷基酯，例如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖，二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，如EDTA；糖，如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐的抗衡离子，例如钠；金属络合物(例如锌蛋白络合物)；和/或非离子表面活性剂，例如聚乙二醇(PEG)。本文的示例性药用的载剂还包括间质药物分散剂例如可溶性中性活性透明质酸酶糖蛋白(sHASEGP)，诸如人可溶性PH-20透明质酸酶糖蛋白，例如rHuPH20(Baxter International,Inc.)。某些示例性sHASEGP和使用方法(包括rHuPH20)描述于美国专利公布号2005/0260186和2006/0104968中。在一个方面中，将sHASEGP与一种或多种另外的糖胺聚糖酶(诸如软骨素酶)组合。
示例性的冻干抗体制剂描述于美国专利号6,267,958中。水性抗体制剂包括在美国专利号6,171,586和WO2006/044908中描述的那些，后一者中的制剂包含组氨酸-乙酸盐缓冲剂。
本文的制剂还可含有多于一种对于所治疗的特定适应症是必需的活性成分，优选是具有不会彼此不利地影响的互补活性的活性成分。例如，可以期望进一步提供另外的治疗剂(例如，化疗剂、细胞毒性剂、生长抑制剂和/或抗激素剂，诸如上文所述的那些)。此类活性成分适当地以对预期目的有效的量组合存在。
活性成分可以包埋在例如通过凝聚技术或通过界面聚合而制备的微胶囊(例如分别为羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)中；包埋在胶体药物递送系统(例如，脂质体、白蛋白微球、微乳液、纳米粒子和纳米胶囊)中；或包埋在粗乳液中。此类技术公开于Remington'sPharmaceutical Sciences第16版，Osol,A.编(1980)。
可以制备缓释制备物。缓释制备物的合适实例包括含有抗体的固态疏水聚合物的半透性基质，所述基质是例如膜或微胶囊等成型制品的形式。
用于体内施用的制剂通常是无菌的。例如，无菌可以通过无菌过滤膜过滤而容易地实现。
G.治疗方法和组合物
本发明的任何抗LY6G6D抗体和/或抗CD3抗体(例如，本发明的双特异性抗LY6G6D抗体，其与LY6G6D优选以高亲和力结合(例如，20A12.QNTv12)且与第二生物分子(例如，CD3)结合，例如，具有抗Ly6G6D臂(诸如20A12.QNTv12)和抗CD3臂(诸如38E4.v1 MD1或38E4.v1 MD4)的LY6G6D TDB)可用于治疗方法中。
在一个方面，提供一种用作药物的抗LY6G6D抗体。在又一些方面，提供一种抗LY6G6D抗体，例如，具有抗CD3臂(例如，38E4.v1 MD1或38E4.v1 MD4)和抗Ly6G6D臂(例如，20A12.QNTv12)的LY6G6D TDB，其用于治疗细胞增殖性疾患(例如，癌症，例如，结直肠癌)或延迟细胞增殖性疾患(例如，癌症，例如，结直肠癌)的进展。在一些实施例中，癌症为LY6G6D阳性癌症(例如，LY6G6D阳性结直肠癌)。在某些实施例中，提供一种用于治疗方法中的抗LY6G6D抗体。在某些实施例中，本发明提供一种抗LY6G6D抗体(例如，具有抗CD3臂(例如，38E4.v1 MD1或38E4.v1 MD4)和抗Ly6G6D臂(例如，20A12.QNTv12)的LY6G6D TDB)，其用于治疗患有细胞增殖性疾患的个体的方法中，该方法包括向个体施用有效量的抗LY6G6D抗体。在一个此类实施例中，该方法进一步包括例如如下文所述向个体施用有效量的至少一种附加的治疗剂。在又一些实施例中，本发明提供一种抗LY6G6D抗体(例如，具有抗CD3臂(例如，38E4.v1 MD1或38E4.v1 MD4)和抗Ly6G6D臂(例如，20A12.QNTv12)的LY6G6D TDB)，其用于增强患有细胞增殖性疾患的个体的免疫功能。在某些实施例中，本发明提供一种用于增强患有细胞增殖性疾患的个体的免疫功能的方法中的抗LY6G6D抗体，该方法包括向个体施用有效的抗LY6G6D抗体(例如，本发明的双特异性抗LY6G6D抗体，其与第二生物分子(例如，CD3)结合)，例如，以活化效应细胞(例如，T细胞，例如，CD8+和/或CD4+ T细胞)、扩张(增加)效应细胞群、减少靶标细胞(例如，表达被本发明的抗LY6G6D抗体(诸如本发明的双特异性TDB抗体)识别的第二生物分子的细胞)群、和/或杀伤靶标细胞(例如，靶标肿瘤细胞)。根据任何上述实施例的“个体”可以为人。
在又一方面，本发明提供抗LY6G6D抗体在制备或制造药物中的用途。在一个实施例中，该药物用于治疗细胞增殖性疾患(例如，癌症，例如，结直肠癌)。在一些实施例中，癌症为LY6G6D阳性癌症(例如，LY6G6D阳性结直肠癌)。在又一实施例中，该药物用于治疗细胞增殖性疾患的方法中，该方法包括向患有细胞增殖性疾患的个体施用有效量的该药物。在一个此类实施例中，该方法进一步包括例如如下文所述向个体施用有效量的至少一种附加的治疗剂。在又一实施例中，该药物用于在个体中活化效应细胞(例如，T细胞，例如，CD8+和/或CD4+ T细胞)、扩张(增加)效应细胞群、减少靶标细胞群(例如，表达LY6G6D的细胞群)、和/或杀伤的靶标细胞(例如，靶标肿瘤细胞)。在又一实施例中，该药物用于增强患有细胞增殖性疾患的个体的免疫功能的方法中，该方法包括向该个体施用有效量的该药物以活化效应细胞(例如，T细胞，例如，CD8+和/或CD4+ T细胞)、扩张(增加)效应细胞群、减少靶标细胞群(例如，表达LY6G6D的细胞群)、和/或杀死靶标细胞(例如，靶标肿瘤细胞)。根据任何上述实施例的“个体”可以为人。
在又一方面，本发明提供一种治疗细胞增殖性疾患(例如，癌症，例如，结直肠癌)的方法。在一些实施例中，癌症为LY6G6D阳性癌症(例如，LY6G6D阳性结直肠癌)。在一个实施例中，该方法包括向患有这种细胞增殖性疾患的个体施用有效量的抗LY6G6D抗体，例如，具有抗CD3臂(例如，38E4.v1 MD1或38E4.v1 MD4)和抗Ly6G6D臂(例如，20A12.QNTv12)的LY6G6D TDB。在一个此类实施例中，该方法进一步包括例如如下文所述向个体施用有效量的至少一种附加的治疗剂。根据任何上述实施例的“个体”可以为人。
在又一方面，本发明提供一种用于增强患有细胞增殖性疾患的个体的免疫功能的方法。在一个实施例中，该方法包括向个体施用有效量的抗LY6G6D抗体(例如，具有抗CD3臂(例如，38E4.v1 MD1或38E4.v1 MD4)和抗Ly6G6D臂(例如，20A12.QNTv12)的LY6G6D TDB)，以活化效应细胞(例如，T细胞，例如，CD8+和/或CD4+ T细胞)、扩张(增加)效应细胞群、减少靶标细胞群(例如，表达LY6G6D的细胞群)、和/或杀死靶标细胞(例如，靶标肿瘤细胞)。在一个实施例中，“个体”为人。
在又一方面，本发明提供一种用于治疗结直肠癌、食管癌、胃癌、小肠癌、大肠癌或腺癌(例如，结肠直肠腺癌、胃腺癌或胰腺腺癌)的方法，该腺癌可以为转移性腺癌(例如，转移性结直肠腺癌、转移性胃腺癌或转移性胰腺腺癌)，该方法通过施用有效量的本发明的抗LY6G6D抗体，诸如本发明的双特异性TDB抗体，诸如抗Ly6G6D靶向TDB，诸如具有高亲和力抗CD3臂(诸如38E4.v1 MD1或38E4.v1 MD4)和抗Ly6G6D臂(诸如20A12.QNTv12)的Ly6G6D TDB进行。在一些方面，癌症具有的微卫星不稳定性状态为“微卫星稳定”(“MSS”)或“微卫星不稳定性低”(“MSI-L”)。在其他方面，癌症具有的微卫星不稳定性状态为“微卫星不稳定性高”(“MSI-H”)。在一些方面，癌症为LY6G6D阳性的。
在一些方面，本发明提供一种用于治疗结直肠癌(例如，具有的微卫星不稳定性状态为“微卫星稳定”(“MSS”)或“微卫星不稳定性低”(“MSI-L”)的结直肠癌)的方法，该方法通过施用有效量的本发明的抗LY6G6D抗体，诸如本发明的双特异性TDB抗体，诸如抗Ly6G6D靶向TDB，诸如具有高亲和力抗CD3臂(诸如38E4.v1 MD1或38E4.v1 MD4)和抗Ly6G6D臂(诸如20A12.QNTv12)的Ly6G6D TDB进行。
在又一方面，本发明提供包含本文提供的任何抗LY6G6D抗体(例如，具有抗CD3臂(例如，38E4.v1 MD1或38E4.v1 MD4)和抗Ly6G6D臂(例如，20A12.QNTv12)的LY6G6D TDB)的药物制剂，其例如用于任何上述治疗方法。在一个实施例中，药物制剂包含本文提供的任何抗LY6G6D抗体以及药用载剂。在另一实施例中，药物制剂包含任本文提供的任何抗LY6G6D抗体和例如本文所述的至少一种另外的治疗剂。
本发明的抗体(和/或任何另外的治疗剂)可以通过任何合适的方式施用，包括肠胃外、肺内和鼻内，并且如果期望的话用于局部治疗、病灶内施用。肠胃外输注包括肌内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下施用。在一些实施例中，抗体通过静脉内施用方式施用。在其他实施例中，抗体通过皮下施用方式施用。在一些实施例中，通过皮下注射施用的抗LY6G6D抗体在患者中表现出比通过静脉内注射施用的相同的抗LY6G6D抗体更低的毒性应答。给药可以通过任何合适的途径进行，例如，通过注射，诸如静脉内或皮下注射，部分取决于施用是短暂的还是长期的。本文考虑了各种给药时间安排，包括但不限于在各个时间点处的单次或多次施用、推注施用和脉冲输注。
本发明的抗体将以符合良好医学实践的方式配制、给药和施用。在这种情况下需要考虑的因素包括所治疗的特定疾患、所治疗的特定哺乳动物、个体患者的临床病症、疾患的原因、药剂的递送部位、施用方法、施用的时间安排，以及执业医师已知的其他因素。抗体不是必须地而是任选地与一种或多种目前用于预防或治疗所讨论的疾患的制剂共同配制。此类其他药剂的有效量取决于所用制剂中存在的抗体的量、疾患或治疗的类型，以及上面讨论的其他因素。这些通常以与本文所述相同的剂量和施用途径使用，或以本文所述剂量的约1％至99％使用，或以任何剂量且通过经验/临床上确定为合适的任何途径使用。
为了预防或治疗疾病，本发明的抗体(例如，抗LY6G6D抗体，例如，具有抗CD3臂(例如，38E4.v1 MD1或38E4.v1 MD4)和抗Ly6G6D臂(例如，20A12.QNTv12)的LY6G6D TDB)的适当剂量(当单独使用或与一种或多种其他另外治疗剂组合使用时)将取决于待治疗的疾病类型、抗体的类型、疾病的严重程度和病程、施用抗体用于预防还是治疗目的、先前疗法、患者的病史和对抗体的应答以及主治医师的酌处权。抗体适当地一次或在一系列治疗中施用于患者。
作为一般建议，抗LY6G6D抗体(例如，具有抗CD3臂(例如，38E4.v1 MD1或38E4.v1MD4)和抗Ly6G6D臂(例如，20A12.QNTv12)的LY6G6D TDB)施用至人的治疗有效量将在约0.01至约100mg/kg患者体重的范围内，无论是通过一次或多次施用。在一些实施例中，使用的抗体以，例如约0.01至约45mg/kg、约0.01至约40mg/kg、约0.01至约35mg/kg、约0.01至约30mg/kg、约0.01至约25mg/kg、约0.01至约20mg/kg、约0.01至约15mg/kg、约0.01至约10mg/kg、约0.01至约5mg/kg或约0.01至约1mg/kg来每日施用。在一个实施例中，将本文所述的抗LY6G6D抗体在21天周期的第1天以约100mg、约200mg、约300mg、约400mg、约500mg、约600mg、约700mg、约800mg、约900mg、约1000mg、约1100mg、约1200mg、约1300mg或约1400mg的剂量施用于人。该剂量可以以单剂量或多剂量(例如，2或3个剂量)诸如输注的形式施用。对于历时数天或更长时间的重复施用，取决于病症，治疗通常会持续直至发生期望的疾病症状抑制。抗体的一种示例性剂量的范围为约0.05mg/kg至约10mg/kg。因此，可以向患者施用约0.5mg/kg、2.0mg/kg、4.0mg/kg或10mg/kg(或它们的任何组合)的一种或多种剂量。此类剂量可以间歇地施用，例如每周或每三周施用(例如，使得患者接受约2至约20或例如约6个剂量的抗LY6G6D抗体)。可以施用初始较高的负荷剂量，之后施用一次或多次较低剂量。这种疗法的进展易于通过常规的技术和测定法来监测。
H.另外的治疗剂
本发明的抗体可以单独使用或与其他药剂组合用于疗法中。例如，本发明的抗体可与至少一种另外的治疗剂共同施用。在某些实施例中，另外的治疗剂为化疗剂、生长抑制剂、细胞毒性剂、用于放射疗法的药剂、抗血管生成剂、凋亡剂、抗微管蛋白剂或其他药剂，诸如表皮生长因子受体(EGFR)拮抗剂(例如，酪氨酸激酶抑制剂)、HER1/EGFR抑制剂(例如，厄洛替尼(TARCEVATM)、血小板衍生生长因子抑制剂(例如，GLEEVECTM(甲磺酸伊马替尼(Imatinib Mesylate)))、COX-2抑制剂(例如，塞来昔布)、干扰素、细胞因子、除本发明的抗CD3抗体外的抗体，诸如与以下靶标中的一者或多者结合的抗体：ErbB2、ErbB3、ErbB4、PDGFR-β、BlyS、APRIL、BCMA VEGF或VEGF受体、TRAIL/Apo2、PD-1、PD-L1、PD-L2或其他生物活性或有机化学剂。
上述此类组合疗法涵盖组合施用(其中两种或更多种治疗剂包括在相同或单独的制剂中)和单独施用，在单独施用的情况下，本发明的抗体的施用可以在施用另外的治疗剂或药剂之前、同时和/或之后进行。在一个实施例中，抗LY6G6D抗体的施用和附加的治疗剂的施用在彼此相距约一个月内，或在约一周、两周或三周内，或在约一天、二天、三天、四天、五天或六天之内进行。本发明的抗LY6G6D抗体(例如，本发明的双特异性抗LY6G6D抗体，其与第二生物分子(例如，CD3)结合)也可以与放射疗法组合使用。在一些实施例中，另外的疗法可以为手术、基因疗法、DNA疗法、病毒疗法、RNA疗法、免疫疗法、骨髓移植、纳米疗法、单克隆抗体疗法或前述的组合。附加疗法可以是辅助疗法或新辅助疗法的形式。在一些实施例中，附加疗法是施用小分子酶抑制剂或抗转移剂。在一些实施例中，另外的疗法是施用副作用限制剂(例如，旨在降低治疗副作用发生率和/或严重性的试剂，例如止吐剂等)。在一些实施例中，附加疗法为手术。在一些实施例中，附加疗法为放疗与手术的组合。
在一些实施例中，Ly6G6D TDB(例如，具有抗CD3臂(例如，38E4.v1 MD1或38E4.v1MD4)和抗Ly6G6D臂(例如，20A12.QNTv12)的LY6G6D TDB)与一种或多种另外的治疗剂共同施用(同时，作为单一或多个组合物(例如，制剂))，该另外的治疗剂为诸如以下任何一种、两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种或所有十一种：FOLFOX(奥沙利铂(ELOXATINTM)与5-氟尿嘧啶和甲酰四氢叶酸组合)、卡培他滨5-氟尿嘧啶(5-FU)、CapeOx(XELOX；卡培他滨与奥沙利铂组合)、甲酰四氢叶酸(亚叶酸)、贝伐单抗西妥昔单抗/>帕尼单抗/>瑞戈非尼伊立替康(CPT-11；/>)和FLOX(5-氟尿嘧啶与奥沙利铂)。在其他实施例中，Ly6G6D TDB在一种或多种另外的治疗剂之前施用，该另外的治疗剂为诸如以下任何一种、两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种或所有十一种：FOLFOX(奥沙利铂(ELOXATINTM)与5-氟尿嘧啶和甲酰四氢叶酸组合)、卡培他滨5-氟尿嘧啶(5-FU)、CapeOx(XELOX；卡培他滨与奥沙利铂组合)、甲酰四氢叶酸(亚叶酸)、贝伐单抗/>西妥昔单抗/>帕尼单抗瑞戈非尼/>伊立替康(CPT-11；/>)和FLOX(5-氟尿嘧啶与奥沙利铂)。在其他实施例中，Ly6G6D TDB在一种或多种另外的治疗剂之后施用，该另外的治疗剂为诸如以下任何一种、两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种或所有十一种：FOLFOX(奥沙利铂(ELOXATINTM)与5-氟尿嘧啶和甲酰四氢叶酸组合)、卡培他滨/>5-氟尿嘧啶(5-FU)、CapeOx(XELOX；卡培他滨与奥沙利铂组合)、甲酰四氢叶酸(亚叶酸)、贝伐单抗/>西妥昔单抗/>帕尼单抗/>瑞戈非尼/>伊立替康(CPT-11；)和FLOX(5-氟尿嘧啶与奥沙利铂)。
i.生长抑制剂
在一些方面，另外的治疗剂是生长抑制剂。示例性的生长抑制剂包括将细胞周期进程阻断在S期以外的地方的药剂，例如诱导G1阻滞的药剂(例如DNA烷化剂，诸如他莫昔芬、泼尼松、达卡巴嗪、甲氯乙胺、顺铂、甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶、或ara-C)或M期阻滞的药剂(例如，长春新碱、长春碱、紫杉烷类(例如，紫杉醇和多西他赛)、多柔比星、表柔比星、柔红霉素、依托泊苷或博来霉素)。
ii.放射疗法
在一些方面，另外的治疗剂是放疗。放疗包括使用定向γ射线或β射线以诱导对细胞的足够损害，从而限制细胞正常发挥功能或完全破坏细胞的能力。典型治疗作为一次施用给予，且典型剂量范围为每天10到200单位(戈瑞(Gy))。
iii.细胞毒性剂
在一些方面，另外的治疗剂是细胞毒性剂，例如抑制或阻止细胞功能和/或导致细胞死亡或破坏的物质。细胞毒性剂包括但不限于放射性同位素(例如，At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212和Lu的放射性同位素)；化疗剂或药物(例如甲氨蝶呤、阿霉素、长春花生物碱(长春新碱、长春花碱、依托泊苷)、多柔比星、美法仑、丝裂霉素C、苯丁酸氮芥、柔红霉素或其他嵌入剂)；生长抑制剂；酶及其片段诸如溶核酶；抗生素；毒素诸如细菌、真菌、植物或动物来源的小分子毒素或酶活性毒素，包括其片段和/或变体；以及抗肿瘤或抗癌药。
iv.免疫调节剂
在一些方面，另外的治疗剂为免疫调节剂，例如，PD-L1轴结合拮抗剂，其可以为PD-1结合拮抗剂、PD-L1结合拮抗剂或PD-L2结合拮抗剂。PD-1(程序性死亡1)在本领域中也称为“程序性细胞死亡1”、“PDCD1”、“CD279”和“SLEB2”。示例性人PD-1示出在UniProtKB/Swiss-Prot登录号Q15116中。PD-L1(程序性死亡配体1)在本领域中也称为“程序性细胞死亡1配体1”、“PDCD1LG1”、“CD274”、“B7-H”和“PDL1”。示例性人PD-L1示出在UniProtKB/Swiss-Prot登录号Q9NZQ7.1中。PD-L2(程序性死亡配体2)在本领域中也称为“程序性细胞死亡1配体2”、“PDCD1LG2”、“CD273”、“B7-DC”、“Btdc”和“PDL2”。示例性人PD-L2示出在UniProtKB/Swiss-Prot登录号Q9BQ51中。在一些情况下，PD-1、PD-L1和PD-L2为人PD-1、PD-L1和PD-L2。
在一些方面，PD-1结合拮抗剂是抑制PD-1与其配体结合配偶体结合的分子。在具体方面，PD-1配体结合配偶体为PD-L1和/或PD-L2。在另一情况下，PD-L1结合拮抗剂是抑制PD-L1与其结合配体结合的分子。在具体方面，PD-L1结合配偶体是PD-1和/或B7-1。在另一种情况下，PD-L2结合拮抗剂为抑制PD-L2与其配体结合配偶体结合的分子。在具体方面，PD-L2结合配体配偶体是PD-1。拮抗剂可以是抗体、其抗原结合片段、免疫粘附素、融合蛋白或寡肽。
在一些方面，PD-1结合拮抗剂是抗PD-1抗体(例如，人抗体、人源化抗体或嵌合抗体)。
在一些方面，PD-L1结合拮抗剂是例如如下所述的抗PD-L1抗体。在一些方面，抗PD-L1抗体能够抑制PD-L1与PD-1之间和/或PD-L1与B7-1之间的结合。在一些方面，抗PD-L1抗体是单克隆抗体。在一些方面，抗PD-L1抗体是选自由Fab、Fab'-SH、Fv、scFv和(Fab')2片段组成的组的抗体片段。在一些方面，抗PD-L1抗体是人源化抗体。在一些方面，抗PD-L1抗体是人抗体。
在一些方面，免疫检查点抑制剂是针对共抑制分子(例如，CTLA-4拮抗剂(例如，抗CTLA-4抗体)、TIM-3拮抗剂(例如，抗TIM-3抗体)，或LAG-3拮抗剂(例如，抗LAG-3抗体))或其任何组合的拮抗剂。
在一些方面，免疫检查点抑制剂是针对TIGIT的拮抗剂(例如，抗TIGIT抗体)。
在一些方面，另外的治疗剂为5-氟尿嘧啶(5-FU)；伊立替康；卡培他滨；奥沙利铂；西妥昔单抗；贝伐单抗；帕尼单抗；阿柏西普、瑞戈非尼；雷莫芦单抗、TAS-102(曲氟尿苷和替吡嘧啶)；派姆单抗；纳武单抗；纳武单抗和伊匹单抗(ipilimumab)；威罗非尼；FOLFOXIRI和贝伐单抗(一种与BRAF和/或MEK抑制剂组合的抗EGFR疗法，任选地包括细胞毒性剂)；FOLFOX/FOLFIRI和一种抗EGFR疗法；或FOLFOX/FOLFIRI/FOLFOXIRI和贝伐单抗。
I.制品
在本发明的另一个方面中，提供了一种制品，其含有可用于治疗、预防和/或诊断上述病症的物质。该制品包括容器和在该容器上或与该容器相关的标签或包装说明书。合适的容器包括例如瓶子、小瓶、注射器、IV溶液袋等。所述容器可以由诸如玻璃或塑料等多种材料形成。所述容器容纳组合物，该组合物本身或与另一种组合物组合能够有效地治疗、预防和/或诊断病症，并且所述容器可以具有无菌进入口(例如，所述容器可以是静脉内溶液袋或具有可由皮下注射针刺穿的塞子的小瓶)。组合物中的至少一种活性剂是本发明的抗体。标签或包装插页指示该组合物用于治疗所选择的病症。此外，所述制品可包括(a)第一容器，所述第一容器中含有其中包含本发明的抗体的组合物；以及(b)第二容器，所述第二容器中含有其中包含另外的细胞毒性剂或其他治疗剂组合物。本发明该实施例中的制品还可包含包装插页，该包装插页指示组合物可用于治疗特定病症。替代性地或除此之外，所述制品可以还包括第二(或第三)容器，该二(或第三)容器包含药用缓冲剂，诸如抑菌性注射用水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格氏液和右旋糖溶液。所述制品可以还包括从商业和用户角度来看所需的其他物质，包括其他缓冲剂、稀释剂、过滤器、针头和注射器。
III.实例
以下是本发明的方法和组合物的实施例。应当理解，鉴于上面提供的一般描述，可以实践各种其他方面，并且实例不旨在限制权利要求的范围。
实例1.LY6G6D为结直肠癌细胞的表面标志物且在正常组织中的表达受限
淋巴细胞抗原6家族成员G6D(LY6G6D)(SEQ ID NO:75)在人类正常和肿瘤组织中的表达使用癌症基因组图谱(TCGA)(Grossman等人，New England Journal of Medicine,375(12):1109-1112)和基因型-组织表达项目(GTEx)数据(Pierson等人,PLoS ComputBiol,11,e1004220,2015)和免疫组织化学(IHC)来评估。
A.LY6G6D的表达
图1A示出TCGA数据中LY6G6D和淋巴细胞抗原6家族成员G6F(LY6G6F)在人体组织中的正常和肿瘤组织中的表达。在肿瘤组织中，具有最高LY6G6D表达指征的为结肠，且LY6G6D仅在结肠肿瘤组织中显著过表达。正常结肠组织也显示出一定程度的LY6G6D表达，但水平要低得多。值得关注的LY6G6F表达(>1nRPKM)主要见于结肠肿瘤组织中。图1B示出公共GTEx项目数据中LY6G6D和LY6G6F在正常组织中的表达。LY6G6D在前列腺、睾丸、宫颈和阴道组织中表达最高，且在正常结肠组织和一部分皮肤样品中发现相当高的表达。LY6G6F在血液中表达最高，其次是睾丸、脾、甲状腺和肺组织。
B.LY6G6D在MSS和MSI-L CRC中的表达
LY6G6D在具有的微卫星不稳定性(MSI)状态为微卫星稳定(MSS)、微卫星不稳定性低(MSI-L)或微卫星不稳定性高(MSI-H)的结直肠癌(CRC)中表达最高；MSS CRC与较差的预后相关联(图1C)。
C.LY6G6D的IHC染色
对人CRC肿瘤进行针对LY6G6D的染色。通过IHC，将约20％的原发性CRC病例鉴定为LY6G6D阳性。评估了141个组织微阵列(TMA)原发性结肠肿瘤。21个肿瘤显示出弱(1+)IHC染色(14％)，5个显示中度(2+)染色，且4个显示强(3+)染色(总计6-7％)(图2A)。图2B至2D示出针对原发性结肠肿瘤组织中LY6G6D的弱(1+)、中度(2+)和强(3+)IHC染色。
实例2.抗LY6G6D 1G4臂、抗LY6G6D克隆物生成、表位定位和人源化的制造责任
A.抗LY6G6D 1G4臂的制造责任
包含嵌合抗LY6G6D 1G4臂和抗CD3 38E4.v1臂的抗LY6G6D TDB证明了HT55细胞(人结肠癌细胞系)的体外杀伤(图3A)和针对异种移植物LS1034和HT55肿瘤在NSGTM小鼠中的体内活性(图3B)。1G4为小鼠杂交瘤抗体；嵌合1G4(ch1G4)为一种小鼠/人嵌合抗体，其中1G4的小鼠可变结构域(VH和VL)分别与具有在CH2中的N297G氨基酸取代突变且包含“臼”区的人重链恒定结构域(CH1、CH2和CH3)和人轻链恒定结构域(CL)基因融合。生成了1G4臂的人源化版本，并显示出体外和体内功效(图3C和3D)。
对人源化1G4轻链(LC)CDR2(WASTRIS；SEQ ID NO:110)的氨基酸残基W50鉴定了分子评估(MA)责任。简而言之，在化学条件下用AAPH(2,2-偶氮双(2-脒基丙烷)二盐酸盐)测试人源化IG4的应激，AAPH是一种已知会生成自由基的小分子(参见，例如，Ji等人，J.Pharm.Sci.98(12):4485-4500,2009)，以及在不同pH值的热条件下测试应激(在40℃、pH5.5下进行为期两周的热应激测试)。经鉴定，轻链残基W50在AAPH应激后具有增加的氧化(72.0％氧化)。
热应激测定模拟了产品保质期内的稳定性。将样品缓冲液交换到20mM组氨酸醋酸盐、240mM蔗糖，pH 5.5中，并稀释至1mg/mL的浓度。使一mL的每个样品在40℃应激2周，且将第二个样品在-70℃储存作为对照。然后使用胰蛋白酶消化两个样品以创建可以使用液相色谱(LC)-质谱(MS)分析进行分析的肽。对于样品中的每种肽，获取保留时间(使用液相色谱测量)以及高分辨率精确质量和肽离子碎片信息(氨基酸序列信息)。在+/-10ppm的窗口处，从数据集中为目标肽(例如，天然和修饰的肽离子)生成提取离子色谱图(XIC)，并对峰进行积分以确定面积。通过取(修饰的肽的面积)除以(修饰的肽的面积加上天然肽的面积)乘以100，为每个样品计算修饰的相对百分比。
此外，1G4臂未能通过对于生产的瞬时转染测定(图30)。W50被所有18种替代性氨基酸(不包括Cys)置换，但结合亲和力似乎受到该置换的影响。最后，如图3A所示，1G4臂仅在与高亲和力38E4.v1臂配对时有效，而在与低亲和力40G5c配对时无效。因此，开展了一项针对抗LY6G6D抗体的新发现活动。
B.兔抗huLY6G6D mAb的生成
在兔中生成抗人LY6G6D(huLY6G6D)单克隆抗体(mAb)。用人Ly6G6D对新西兰白兔进行免疫，并使用Offner等人PLoS ONE,9(2),2014中的改进方案从免疫兔中分离单个B细胞。该改进的工作流程包括将IgG+huLy6G6D+B细胞直接FACS分选到单个孔中。通过ELISA测定B细胞培养上清液与人Ly6G6D和不相关的对照蛋白的结合。将Ly6G6D特异性B细胞裂解并立即在-80℃冷冻保存直至进行分子克隆。如前所述(Offner等人PloS ONE,9(2),2014)，将每个兔B细胞单克隆抗体的可变区(VH和VL)从提取的mRNA中克隆到表达载体中。使个体重组兔抗体在Expi293细胞中表达，随后用蛋白A纯化。然后对纯化的抗Ly6G6D抗体进行功能活性测定和动力学筛选。生成了约280个抗Ly6G6D ELISA+克隆物。随后将96个克隆物分箱成四个不同的表位分箱组，如下所述。
C.使用糖工程化改造的LY6G6D进行动力学分析和抗LY6G6D表
位分箱
使用基于阵列的SPR成像系统(USA)对一组96种兔抗huLY6G6D单克隆抗体(包括1G4)进行动力学测试和表位分箱。对于表位分箱，将LY6G6D多肽工程化改造以在整个分子表面引入糖基化位点(图4A和4B)。为了便于添加糖基化位点，同时对天然序列的破坏最小而选择位点。测试了候选抗LY6G6D抗体与糖工程化改造的LY6G6D多肽的相互作用(图4B)。纯化的抗体在10mM醋酸钠缓冲液,pH 4.5中以10μg/ml的浓度稀释。使用胺偶联，使用SPRi-Continuous Flow MicrospotterTM(/>USA)将抗体直接固定在SPRsensorprism CMD 200M芯片(XanTec Bioanalytics,Germany)上以创建96种抗体的阵列。对于分析，使用IBIS MX96 SPRi(/>USA)评价分析物与固定的配体的结合。对于动力学分析，将人Ly6G6D从0到300nM以3倍稀释注射3分钟，然后进行10分钟的解离期。对于表位分箱，首先将人Ly6G6D的每种糖基化突变体以50nM注射4分钟，然后将个体单克隆抗体以10μg/ml进行第二个4分钟注射。在循环之间，用10mM甘氨酸，pH 1.5进行表面再生。该实验在25℃在HBS-T缓冲液(0.01M HEPES pH 7.4、0.15M NaCl、0.05％表面活性剂P20)的运行缓冲液中执行。使用Scrubber 2.0(BioLogic Software)处理动力学数据，并使用Wasatch分箱软件工具(/>USA)处理表位分箱数据。/>
在具有G99N.L101S氨基酸取代突变的糖工程化改造的LY6G6D多肽中，1G4和兔抗LY6G6D抗体20A12与LY6G6D多肽的结合被破坏(图4B)。其他兔抗LY6G6D抗体的结合被P60A.P61S、A73N.H75S、V80S、V80N、T82N或D87N氨基酸取代突变不同程度地破坏(图4B)。基于糖工程化改造测定的结果，将兔抗体克隆物和1G4放入四个不同的表位箱中(图4E)：箱1包括三组序列且包括1G4、20A12、6E10和4H7；箱4包括六组序列且包括f.16D7；以及，箱3和箱4各包括三组序列。受糖基化突变影响的氨基酸残基用颜色编码，并且在图4D(SEQ IDNO:88)中通过加下划线指示箱1、2、3和4。抗LY6G6D抗体1G4和16D7与抗原相对侧的表位结合，如图4C所示。
D.基于细胞的细胞毒性测定
为了评价新的兔抗体组靶向Ly6G6D阳性肿瘤细胞系的能力，制备了双特异性T细胞依赖性抗体(TDB)，该抗体包含与不同兔抗LY6G6D臂配对的抗CD3 40G5c臂。将来自每个表位箱(箱1、2、3和4)的代表性兔抗体重新格式化为具有包含“杵”区的Fc区、嵌合兔可变结构域以及具有N297G和T366W突变的人恒定结构域的半抗体。纯化后，将“杵”抗LY6G6D臂与具有包含“臼”区的Fc区的抗CD3 40G5c臂退火，并测定其与HT55细胞的结合和体外杀伤(图4F、4G和13A至13E)。发现，来自箱1(包括1G4的箱)的兔抗体(例如，20A12和6E10)在结合和杀伤HT55细胞两方面均最有效。
E.动力学分析
使用BIAcoreTMT200机器(GE Healthcare Life Sciences)确定抗LY6G6D兔抗体对LY6G6D的结合亲和力。简而言之，根据供应商的说明，用1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)试剂活化BIAcoreTM研究级CM5芯片。对于动力学测量，将Ly6G6D蛋白与芯片偶联以在每个流动池中实现大约100个应答单位(RU)。未反应的偶联基团用1M乙醇胺阻断。将兔抗体表达为具有兔可变结构域和人恒定结构域的嵌合抗原结合片段(Fab)。在37℃以30μL/min的流速将Fab的十倍系列稀释液注入HBS-P缓冲液中。使用1:1Langmuir结合模型(BIAcoreTMT200评价软件2.0版)计算结合率(ka)和解离率(kd)。将平衡解离常数(KD)计算为比率kd/ka(图4H)。
F.兔抗体的人源化
如下所述，将箱1兔单克隆抗体20A12和6E10人源化。残基编号是根据Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991)。
20A12的人源化
兔抗体人源化的一个挑战为兔与人序列之间的差异大于啮齿动物与人类序列之间的差异。因此，多个框架被应用于20A12的人性化。
将来自每种兔抗体的高变区，即VL结构域中的位置24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)以及VH结构域中的位置26-35(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)，各自移植到两个人受体框架中。rb.20A12轻链变体基于人轻链种系序列hIGHV.1-5、hIGKV.1-39和hIGKV.4-1生成，且rb.20A12重链变体基于人重链种系序列hIGHV.3-23和hIGHV.3-30生成(图31B、31C和40A)。这些种系序列是根据它们的高血清盛行率和与rb.20A12的高序列同一性来选择的(图31C和31D)。选择VL CDR KV1-5*01和VH CDR HV3-23*01进行进一步分析。包含完全人框架区的20A12序列在图32D中显示为L2H10。
将人源化20A12变体评估为Fab。人种系框架(VL和VH)在所有假定的兔游标位置进行了修饰，使得每个游标位置均包含存在于兔抗体序列(即rb20A12)中的氨基酸。兔游标位置基于已知的啮齿动物游标位置确定。其中所有重链和轻链游标位置均已恢复为兔氨基酸的变体在图32D中称为L1H1(hu20A12.L1H1)。所有重链和轻链兔游标位置均包含人氨基酸的变体称为L2H10。为了评估每个兔游标位置是否影响该抗体或huLY6G6D的结合亲和力，将兔游标位置分别恢复为相应人类序列的氨基酸，即KV1-5*01或HV3-23*01。制备了一种轻链变体L2和另外八种重链变体H2至H9。L2包含相对于KV1-5*01序列的P43A氨基酸取代突变。H2至H9分别包含相对于HV3-23*01序列的Q2V、I48V、A49S、K71R、S73N、V78L、F91Y和P105R氨基酸取代突变。使用BIAcore测定将变体抗体的结合亲和力与包含完全人框架序列(L2H10)的亲本克隆物的结合亲和力进行比较(图32D)。基于上述变体抗体的结合亲和力评价，将兔重链残基S73、T76、V78和P105确定为关键的兔游标残基。
图32C示出人源化20A12的修整版本，其包含兔重链残基S73、T76、V78和P105，以及在所有其他兔游标位置处的人残基。还将修整的人源化20A12修饰为包含C35S或C35I和C50A氨基酸取代，如下所述。还将S73、V78和P105兔Vernier残基、另外的兔游标残基T76以及C35S和C50A氨基酸取代移植到人种系HV3-30*1上，以生成另外的人源化、修整版本的rb.20A12。
约20-40％的兔抗体含有额外的半胱氨酸残基。例如，兔20A12克隆物在CDR-H1和CDR-H2中含有半胱氨酸对(CDR-H1上的C35和CDR-H2上的C50)(图31A；图40B)。这两个位置处的半胱氨酸很常见，并且据信形成二硫键。为了去除这对半胱氨酸(这可能是开发过程中的责任)，将rb.20A12的C35和C50同时突变为C35S-C50A、C35S-C50S、C35I-C50A、C35I-C50S、C35I-C50I和C35G-C50T，并且评估变体与LY6G6D的结合。每种变体均以具有兔可变结构域和人恒定区的嵌合Fab的形式进行评估。发现变体rb20A12.IA(C35I-C50A)保留了亲本的大部分亲和力(KD 0.86nM)(图34A和34C)。因此，C35I-C50A突变被包括在上述修整的人源化20A12重链序列中。
此外，兔20A12轻链序列在CDR3中含有糖基化基序(NNT)(图32A和图40B)，并证实该位点被糖基化。为了去除该糖基化位点，在兔/人嵌合体骨架中制造了一系列变体：NNT由QNT、QNV、SNA、SNV、ANT、GNT、NNV或NNA置换(图34B)。将QNT、QNV、SNV、GNT和SNA取代并入上述修整的人源化20A12轻链序列中，并测定其与LY6G6D的结合(图34B-34D)。
20A12.QNTv12
选择20A12.QNTv12变体作为人源化rb.20A12抗体。20A12.QNTv12
包含KV1-5*01的VL框架区；CDR HV3-23*01的VH框架区，其具有氨基酸取代S73、T76、V78和P105(源自兔游标位置)修饰；和rb.20A12的CDR，其CDR-H1和CDR-H2中的半胱氨酸残基分别由I和A置换，且具有在CDR-L3中糖基化位点处的NNT到QNT突变(图32A、40B和40C)。对于rb.20A12的KD为0.23nM，且对于20A12.QNTv12为0.14nM。
与LY6G6D结合
将人源化rb.20A12变体20A12.QNTv12、人源化rb.6E10变体6E10.v114和抗LY6G6D1G4臂与抗CD3 38E4v1或40G5c臂配对为TDB，并在测定中测试对于人和食蟹猴LY6G6D的亲和力。另外测定兔20A12、兔6E10以及人源化20A12.QNTv12和20A12.SNVv12作为抗原结合片段(Fab)的结合。将LY6G6D-Fc直接固定在芯片上，使TDB在37℃流过，除了rb6E10 Fab是在25℃测定。结果如下表2所示。
表2. 20A12和6E10 Fab和TDB变体的结合特性
样品 ka(1/Ms) kd(1/s) KD(M)
rb20A12 Fab 4.12E+05 1.76E-04 4.26E-10
hu20A12.QNTv12 fab 1.67E+06 2.27E-04 1.36E-10
hu20A12.SNVv12 fab 2.18E+06 4.26E-05 1.95E-11
hu20A12.QNTv12/38E4v1 TDB 2.20E+05 4.44E-04 2.02E-09
hu20A12.QNTv12/40G5c TDB 8.06E+04 4.53E-04 5.62E-09
rb6E10 Fab(@25℃) 2.00E+05 6.37E-05 3.18E-10
hu6E10.v114/38E4v1 TDB 1.98E+05 3.12E-04 1.58E-09
hu6E10.v114/40G5c TDB 1.01E+05 2.92E-04 2.89E-09
瞬时转染生产测定
在瞬时转染生产测定中评估两种人源化rb.20A12变体，即20A12.QNTv1和20A12.QNTv12。在转染中国仓鼠卵巢(CHO)细胞一天后，将生长培养基更换为专属生产培养基。在添加生产培养基一天后，收集上清液并使用Fc结合ELISA评价抗体滴度。生产产量针对38E4v1进行归一化。aFGFR1.杵作为对照提供。20A12.QNTv.1和20A12.QNTv12两者均具有可接受的产量(图37)。
20A12.v1、20A12.v1.修整的(20A12.QNTv12)和1G4当与38E4v1或40G5c抗CD3臂配对时在BV ELISA测定(非典型清除风险的体外测试；Hotzel等人，MAbs,4:753-760,2012)中全部显示良好的结果(图38)。将结果归一化至抗Lye6E，一种在BV ELISA测定中用作高结合信号对照的抗体。
使用热应激和AAPH氧化应激测试来评估包含抗LY6G6D臂20A12.QNTv12和抗CD3臂38E4v1或40G5c的LY6G6D TDB的分子评估责任。未发现任何责任(图39)。
将人源化rb.20A12变体20A12.QNTv12、人源化rb.6E10变体6E10.v114和抗LY6G6D1G4臂与抗CD3 38E4v1臂配对为TDB，并在测定中测试对于人和食蟹猴LY6G6D的亲和力。将LY6G6D-Fc直接固定在芯片上，并使TDB在37℃流过。对于人类和食蟹猴LY6G6D两者，包含1G4臂的TDB的KD实质性地高于20A12.QNTv12臂或6E10.v114臂(图36)。
rb.6E10的人源化
将多个框架应用于6E10的人性化。将rb6E10 VL CDR移植到人类种系序列KV1-5*01和KV3-20*01中，并且将VH CDR移植到人类种系序列HV3-53*01和HV3-48*01中(图43A)。这些种系序列是根据它们的高血清盛行率和与rb.6E10的高序列同一性来选择的(图33A和33B)。如上文针对20A12所述，将来自兔抗体的所有VL和VH游标位置移植到它们各自的人种系框架中。在游标位置具有所有兔氨基酸的移植物称为版本1(对于KV1-5/HV3-53为hu.6E10.v1a；对于KV1-5/HV3-48为hu.6E10.v1b；且对于K3-20/HV3-53为hu.6E10.v1c)。为每个种系制造了五个另外的轻链变体(KV1-5:L2-L6和KV3-20:L2-L6)，并且为HV3-53制造了十个另外的重链变体(H2-H11)。对于KV1-5轻链，基于上述变体抗体的结合亲和力评价(数据未显示)，将Ala2、Phe36和Arg43(L3)确定为关键的兔游标残基。同样，对于KV3-20轻链，将Ala2、Phe36和Val58(L4)确定为关键的兔游标残基。对于重链，发现移植到HV3-53*01(H11)中的CDR足以维持对huLy6G6D的亲和力；不包括兔游标位置。在种系HV3-48*01(3-48H2)中制造了另外的CDR移植物。重链H11与KV3-20.L4配对为6E10v114。重链HV3-48.H2与KV1-5.L3配对为6E10v23(图43A-43D)。
对于6E10v1变体的分子评估(MA)测定的结果如图41所示。发现CDR-H2中的D(54)G和D(58)Y不稳定，历时两周异构化增加了30.2％。
实例3.抗LY6G6D抗体hu.20A12.QNTv12的序列和晶体结构
如实例2所述，经鑑定，具有与1G4重叠表位的人源化兔抗体20A12.QNTv12(实例2)为有效的抗LY6G6D抗体。20A12.QNTv12作为TDB在37℃表现出针对人Ly6G6D的高结合亲和力(KD为约2nM，而对于1G4为约16nM)，与人和食蟹猴LY6G6D的结合亲和力相当，并且在BVELISA测定、表达测试和分子评估(MA)热和氧化测试中表现出良好的结果。20A12.QNTv12的氨基酸序列，包括经过修饰以包含用于单细胞制备的电荷对的变体，以及与LY6G6D结合的20A12.QNTv12的晶体结构如下所述。
A.20A12.QNTv12的氨基酸序列
20A12.QNTv12的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列在图5A和5B中示出(SEQID NO:22和23)。20A12.QNTv12变体的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列经修饰以包含用于单细胞制备的电荷对，如图5C和5D中所示(SEQ ID NO:10和11)。
B.与LY6G6D结合的20A12.QNTv12抗体的晶体结构
为了确定与LY6G6D结合的20A12.QNTv12的晶体结构，将包含LY6G6D的氨基酸93-104的多肽(SEQ ID NO:78)与20A12.QNTv12抗体的片段抗原结合区(Fab)共结晶(图6A-6F)。20A12.QNTv12-LY6G6D复合物的晶体结构解析为R/Rfree 19.9/24.3％；P1空间群：82、138、139、68、75、90。测试了十个20A12.QNTv12 Fab。将LY6G6D残基94-103解析为与所有十个拷贝结合。Ly6G6D 94-103多肽在抗LY6G6D 1G4的晶体结构中形成二聚体，并作为单体与20A12.QNTv12结合。
C.20A12.QNTv12与1G4的晶体结构
此外，将包含LY6G6D的氨基酸93-104的多肽(SEQ ID NO:87)与20A12.QNTv12抗体(SEQ ID NO:96至97)的片段抗原结合区(Fab)或1G4的Fab(SEQ ID NO:94和95)共结晶。由于二硫键，肽骨架构象在1G4与20A12.QNTv12结构之间相似，而侧链显示出显著的构象运动性(图7A和7B)。发现20A12.QNTv12和1G4与LY6G6D肽的不同残基结合，如图7C至7F以及表3和4所示。
图7C和7D示出20A12.QNTv12与LY6G6D的相互作用。20A12.QNTv12中与LY6G6D相互作用的残基如图7D所标记。表3总结了20A12.QNTv12 Fab:LY6G6D复合物中的界面残基。人LY6G6D上20A12.QNTv12 Fab的表位由残基Arg94、Asp95、Cys96、Tyr97、Leu98、Gly99、Asp100、Leu101、Cys102和Asn103(RDCYLGDLCN)组成。这些残基中的每一个都定位在Fab的范围内。20A12.QNTv12Fab利用重链残基(来自CDRH1的Asn31、Asn32、Ala33和Met34，来自CDRH2的Ser52，以及来自CDRH3的Arg98、Gly99和Asp100)和轻链残基(来自CDRL3的Thr91、Ser92、Phe93和Arg94)与LY6G6D相互作用。
表3. 20A12.QNTv12 Fab中的界面残基的总结：LY6G6D复合物
图7E和7F示出1G4与LY6G6D的相互作用。1G4中与LY6G6D相互作用的残基如图7F所标记。表4总结了1G4 Fab:LY6G6D复合物中的界面残基。人LY6G6D上1G4 Fab的表位由残基His93、Asp95、Cys96、Tyr97、Leu98、Gly99和Asp100组成；这些残基中的每一个都定位在Fab的范围内。与20A12.QNTv12不同，未发现1G4与LY6G6D残基Arg94、Leu101、Cys102或Asn103相互作用。因此，LY6G6D残基Arg94、Leu101、Cys102和Asn103为与20A12.QNTv12唯一结合的表位残基。
1G4 Fab利用重链残基(来自CDRH1的Thr31、Tyr3和Val33，以及来自CDRH3的Arg99和Asn100)和轻链残基(来自CDRL3的Ser97、Tyr98、Ser99和Ala100)与LY6G6D相互作用。
表4. 1G4 Fab中的界面残基的总结：LY6G6D复合物
实例4.体外TDB活性测定
细胞毒性、细胞结合、T细胞活化和细胞杀伤
使用HT55细胞(人结肠癌细胞系)测试与抗CD3臂38E4v1或40G5c配对的LY6G6DTDB(例如，具有抗LY6G6D臂20A12.QNTv12或其变体的LY6G6D TDB)的体外活性，该细胞内源性地表达中等水平的LY6G6D(图9A-9C、10A-10D和11F-11H)。40G5c和38E4v1为从用跨越人CD3εN端27个氨基酸的KLH(匙孔血蓝蛋白)缀合肽免疫的小鼠获得的人源化杂交瘤抗体。先前已观察到40G5c对CD3具有相对低的亲和力，而已观察到38E4v1具有高亲和力(美国公布号2015-0166661)。
通过Ficoll梯度从健康供体的全血中分离人外周血单个核细胞(PBMC)并用作效应细胞。将人PBMC和HT55细胞(E:T＝10:1)的共培养物在不同浓度的LY6G6D TDB存在下孵育。在孵育72小时后，测量靶标细胞杀伤和T细胞活化。通过在测定中测量发光强度(RLU)，将靶标细胞杀伤定量为细胞毒性百分比。使用以下等式计算靶标细胞杀伤的百分比：
靶标细胞杀伤的百分比＝{(未经处理的孔中的RLU-经TDB处理的孔中的RLU)/(未经处理孔的中的RLU)}x 100。
使用荧光活化细胞分选(FACS)测量CD4+ T细胞和CD8+ T细胞的活化。对于CD8+ T细胞，检测到CD69和CD25的表面表达，并将CD69+CD25+的CD8+ T细胞的百分比报告为CD8+T细胞活化。
包含抗LY6G6D 20A12.QNTv12臂和抗CD3 38E4v1臂的LY6G6D TDB以剂量依赖性方式有效地诱导T细胞活化(图9B、9C、10B、10C、11G和11I)和针对HT55的体外靶标细胞杀伤(图9A、10A、10D、11D至11F和11H)。当与高亲和力抗CD3臂38E4v1配对时，20A12.QNTv12具有与1G4相当的体外细胞杀伤效力。当20A12.QNTv12臂与低亲和力抗CD3臂40G5c配对时，细胞杀伤效力低于38E4v1臂；然而，包含20A12.QNTv12和40G5c臂的TDB具有比包含1G4和40G5c臂的TDB更高的细胞杀伤效力。(图11D和11E)。兔20A12也显示出高于1G4的对HT55细胞的结合亲和力(图4F)。
在使用来自十位健康人类供体的PMBC的测定中，包含抗LY6G6D 20A12.QNTv12臂和抗CD3 38E4v1臂的TDB的平均细胞杀伤EC50为约1.04ng/ml(7pM)；平均CD8+T细胞活化EC50为约87ng/ml(583pM)(图11F-11H)。还在Colo320DM(人Dukes'C型，结直肠腺癌细胞系)和LS1034(人Dukes'C型，结直肠腺癌细胞系)细胞中测试了细胞杀伤和CD8+ T细胞活化(图11A)，这些细胞表达不同水平的LY6G6D(图11B和11I)。
实例5.体内TDB活性和清除率测定
A.肿瘤体积
在NSGTM小鼠中测试了包含抗LY6G6D 20A12.QNTv12臂和抗CD3 40G5c或38E4.v1臂的候选LY6G6D TDB对异种移植物LS1034和HT55肿瘤的体内活性(图16A至16C、17A至17C)。用健康供体外周血单核细胞(PBMC)对小鼠进行人源化。提供包含递送媒介物和PMBC的治疗或者包含TDB但不包含PMBC的治疗作为对照。在施用单次剂量的TDB后，使用通用免疫球蛋白药代动力学(GRIP)ELISA测定测量TDB的血清浓度(Yang等人，J.Immunol.Methods,8-20,2008)。
确立了包含抗LY6G6D 20A12.QNTv12臂和抗CD3 40G5c或38E4.v1臂的LY6G6D TDB针对LS1034肿瘤(LY6G6D IHC评分3+)和HT55肿瘤(LY6G6D IHC评分2+)的体内功效。对于LS1034和HT55肿瘤模型，对于包含高亲和力抗CD3 38E4.v1臂的TDB(1mg/kg，单次剂量，IV，D0)观察到更大的功效(图16A和17A)。包含38E4.v1的LY6G6D TDB的疗效和PK为剂量依赖性的，并且观察到包含38E4v1的LY6G6D TDB与包含40G5c的LY6G6D TDB之间的血清PK存在小的差异(图16A-16C和17A-17C)。还针对Colo320DM肿瘤测试了包含抗LY6G6D 20A12.QNTv12臂和抗CD3 38E4.v1臂的LY6G6D TDB的体内功效(图11J)。
B.在SCID小鼠中的清除率
在使用单次5mg/kg剂量的抗体静脉内施用后，使用GRIP ELISA测定，在严重联合免疫缺陷(SCID)小鼠中测量了包含抗LY6G6D臂20A12.QNTv12和抗CD3 40G5c或38E4.v1臂的LY6G6D TDB的清除率(图18)。清除率(7.67mL/天/kg)与其他与38E4v1抗CD3臂配对的TDB相当。清除率范围为8.6至16mL/kg/天。包含20A12.QNTv12和38E4v1的TDB在SCID小鼠中具有可接受的药代动力学(PK)，并且与对照抗体抗gD 5B6相比，其全身CL差异小于两倍。在非结合物种中，对于包含20A12.QNTv12和38E4v1臂的LY6G6D TDB，无PK责任(非典型PK)明显。所有给药溶液均在标称剂量的±20％范围内回收。
实例6.食蟹猴安全性测定
A.在食蟹猴中的毒性研究
在食蟹猴(cyno)中进行了包含抗LY6G6D 20A12.QNTv12臂和抗CD3 38E4.v1臂的LY6G6D TDB的毒性研究。该研究采用了具有迭代和交错剂量组的自适应设计(图19)。第2组在第1天(D1)用LY6G6D TDB的单次剂量(1mg/kg)IV输注进行治疗。第3、4和5组用单次剂量(分别为2、4和8mg/kg)IV输注进行治疗，第6组用单次剂量(15mg/kg)IV输注进行治疗。在D8进行终末尸检以进行组织病理学评价(图19)。该研究的目的为降低LY6G6D靶标在健康动物中的风险并测试剂量范围。基于之前的TDB经验，包括PK/PD和标准毒性终点。
使用GRIP ELISA测定评估所有治疗组的静脉内PK。结果显示大于剂量比例的全身暴露量(剂量归一化的AUC0-7)。清除率(CL)随着TDB剂量(4mg/kg及以上)的增加而降低，表明在这些剂量下靶标介导(CD3介导，在外周血中)的药物处置(TMDD)的饱和(图20A；表5)。在1mg/kg剂量下的PK与其他TDB在食蟹猴中的历史数据相当，例如gD/38E4v1 TDB，其CL为约20mL/kg/天(图20A和20B)。给药溶液在标称值的±20％范围内回收
表5.用TDB治疗的食蟹猴的静脉内PK
使用包含抗LY6G6D臂20A12.QNTv12和抗CD3 38E4.v1臂的LY6G6D TDB的单次剂量IV治疗在高达15mg/kg的剂量下具有良好的耐受性。临床观察包括没有接受兽医治疗，以及对死亡率、体重或食物消耗没有影响。在15mg/kg剂量下，在给药后4至5小时，仅在第6001号动物中观察到呕吐(中度)并且在第6003号动物中观察到面色苍白和颤抖(轻微)。临床病理学未显示炎症或者肝损伤和轻度C反应蛋白(CRP)升高的证据(图22B)。解剖病理学发现，在15mg/kg剂量下，一只动物的脑中出现血管周围/血管单核浸润(第6003号动物，有明显的轻微震颤)(图21)。
在治疗后，测量细胞因子G-CSF、IL-1Ra、MCP-1、TNF-α、IL-13、IL-8和C反应蛋白(CRP)的浓度(图22A和22B)。在剂量>1mg/kg时，一些细胞因子的浓度显示轻度增加。没有明显的剂量应答关系。在>4mg/kg下观察到MCP-1的轻度增加(图22A)。在治疗后24小时，所有变化均已恢复至基线。
表达CD3+/CD4+/CD5+CD25的T辅助(Th)淋巴细胞、表达CD3+/CD8+/CD5+CD25的T细胞毒性(Tc)淋巴细胞、CD45+/CD3+ T淋巴细胞、CD45+/CD20+B淋巴细胞和CD45+/CD16+自然杀伤细胞的计数通过流式细胞仪测量(图23A-23D)。在治疗前7天(第-7天)和治疗当天(第1天前)进行测量并取平均值以提供给药前平均值。输注结束后，分别在2小时、6小时、24小时和168小时进行测量。观察到显示轻度T细胞活化(图23A)、T细胞恢复(图23B)和B细胞恢复(图23C)的峰。
实例7.亲和力的BIAcore测定
使用BIAcore测定来测定包含抗LY6G6D 20A12.QNTv12臂和抗CD3 38E4.v1臂(图24A)或40G5C臂(图24B)的TDB对人和食蟹猴Ly6G6D多肽的亲和力。将Ly6G6D-Fc直接固定在芯片上，且使TDB在37℃流过。对包含抗LY6G6D 1G4臂和抗CD3 38E4.v1臂(图24C)或40G5C臂(图24D)的TDB执行类似的测定。这些测定的结果提供在表6中。
表6.对于针对人类和食蟹猴LY6G6D-Fc的TDB的BIAcore分析
使用双细胞系统制备且包含抗LY6G6D 20A12.QNTv12臂和抗CD3 38E4.v1臂的LY6G6D TDB，具有针对人和食蟹猴LY6G6D多肽以及CD3的人和食蟹猴细胞外结构域(ECD)的高结合亲和力(表7)。
表7.对于针对人和食蟹猴LY6G6D-Fc和CD3 ECD的TDB的BIAcore分析
使用BIAcore测定来测定包含抗LY6G6D臂20A12.QNTv12和抗CD3 38E4.v1(左图；使用双细胞制备系统产生)、38E4.v1 MD1(中图；使用单细胞制备系统产生)或38E4.v1 MD4臂(右图；使用单细胞制备系统产生)的TDB对人Ly6G6D多肽的亲和力(图25)。这些测定的结果提供在表8中。
表8.对于针对人类和食蟹猴LY6G6D-Fc的TDB的BIAcore分析
实例8.开发用于单细胞制备的MD1和MD4抗CD3臂
A.单细胞和双细胞制备系统
将抗LY6G6D抗体(例如，20A12.QNTv12)制备为具有第一臂(其具有抗LY6G6D特异性)和第二臂(其具有抗CD3特异性)的LY6G6D T细胞依赖性双特异性抗体(LY6G6D TDB)，如图8A所示。TDB使用双细胞系统(图8B)或单细胞系统(图8C)制备。对于单细胞制备，重要的是在宿主细胞中以相当的水平表达第一臂和第二臂：表达水平的巨大差异会增加轻链(LC)错配的可能性并降低TDB正确配对的可能性。抗CD3 38E4v1臂被相对差地表达，而抗LY6G6D臂20A12.QNTv12被高度表达(图37)。在评估TDB组装的瞬时转染测定中，包含38E4v1臂和20A12.QNTv12臂的LY6G6D TDB未达到>80％的正确配对，即使将编码各自臂的DNA的比例修改为1:16的比例也是如此(图29D)。
开发抗CD3 38E4v1臂的两个变体，即38E4v1 MD1(MD1)和38E4v1 MD4(MD4)，以具有比38E4v1改善的表达，并因此能够改善单细胞格式LY6G6D TDB(例如，单具有抗LY6G6D臂20A12.QNTv12的细胞格式LY6G6D TDB)的制备。发现MD1和MD4具有良好的双特异性与LC错配杂质比率(即正确形成的LY6G6D TDB的高纯度)以及与野生型38E4v1相当的体外效力、体内效力和PK。
使用单细胞系统制备的TDB经另外修饰以包含引入电荷对的氨基酸取代突变，如图8D或8E所示，并且如本文所述。
B.20A12.QNTv12的单细胞变体
为了便于在单细胞系统中制备，20A12.QNTv12臂的重链和轻链序列经修饰以包含引入电荷对的氨基酸取代突变(图5C、5D和8A-8E)。
C.38E4v1表达变体MD1和MD4的生成
为了创建适合在单细胞系统中制备的38E4v1的表达改善的变体，用来自40G5c(一种具有比38E4v1更好的表达的抗CD3抗体)的残基修饰38E4v1的VL序列，如下所述。两种38E4v1变体38E4v1 MD1(MD1)和38E4v1 MD4(MD4)具有良好的双特异性与LC错配杂质比率以及与野生型(WT)38E4v1相当的体外效力、体内效力和在小鼠中的PK。
生成了38E4v1轻链可变区(VL)的变体，其包含一个或多个源自低亲和力抗CD3抗体40G5c的轻链序列的氨基酸取代(图29A)。38E4v1 MD1 VL含有相对于38E4v1的序列的四个氨基酸取代：S43P、T51A、K55E和K89T(图29A)。MD4 VL仅含有S43P和T51A取代(图29A)。还生成了仅包含S43P、T51A、K55E或K89T氨基酸取代的变体。所有38E4v1变体包含38E4v1的重链可变区(VH)序列(图29B)。
C.瞬时转染测定
在中国仓鼠卵巢(CHO)11-9宿主细胞中，在瞬时转染测定中评价38E4v1、MD1和仅包含相对于38E4v1的S43P、T51A、K55E或K89T氨基酸取代的变体的表达水平。
转染一天后，将生长培养基更换为生产培养基。在添加生产培养基一天后，收集上清液并使用Fc结合ELISA评价抗体滴度。生产产量针对38E4v1进行归一化。38E4v1轻链似乎限制抗体表达的产量。出乎意料的是，用来自低亲和力抗CD3抗体40G5c的残基置换38E4v1轻链中的个体位置(S43P、T51A或K89T)导致产量适度提高(图29C)，并且当这些变化在包含所有S43P、T51A、K55E、K89T氨基酸取代的MD1变体中组合时观察到产量的更显著增加(图29A和29C)。
在对于TDB组装的瞬时转染测定中，表达改善的38E4v1变体MD1和MD4在靶标臂(抗LY6G6D)轻链(LC)DNA与抗CD3臂DNA的比率为1:4时达到95％的完整抗体组装，而38E4v1即使在LC DNA与抗CD3臂DNA比率为1:16时也没有达到>80％的正确配对(图29D)。提供成功的细胞系开发克隆物xFcRH5作为对照。因此，MD1和MD4允许产生高百分比的正确配对的双特异性抗体。
D.结合动力学测定
38E4v1 MD1和MD4臂的结合动力学显示对人和食蟹猴CD3配体的亲和力与高亲和力野生型抗CD3 38E4v1臂(WT)的亲和力相当(表9)。因此，MD1和MD4变体保留了38E4v1的高亲和力。使用BIAcore T200执行测定：将27mer人和食蟹猴CD3多肽与生物素缀合并固定在SA CM5芯片上，并且使TDB在37℃以100μl/min的速度流过。
表9.对于针对人类和食蟹猴CD3的TDB的BIAcore分析
E.药代动力学测定
为了评估各种抗CD3臂的药代动力学(PK)，在单剂量施用每种变体后，在CB-17SCID小鼠中测量了38E4v1、40G5c、MD1、MD4和38E4v1.K55E的PK谱。抗gD抗体用作对照。抗gD抗体为一种靶向单纯疱疹病毒糖蛋白D表位的非结合对照IgG。所有抗体均作为具有人IgG1同种型的单特异性二价抗CD3抗体进行测试，该抗体具有N297G突变以减弱FcγR介导的效应器功能。
以5mg/kg的剂量对六组雌性CB-17.SCID小鼠(每组n＝12；Charles RiverLaboratories，251)施用每种抗体的单次IV剂量。为方便起见，使用了雌性小鼠。从历史上看，我们没有观察到使用雄性或雌性小鼠的PK研究有任何差异。在选定的时间点通过股静脉收集血液样品(每个时间点重复3次)，持续长达21天。通过GRIP ELISA(包被有抗人IgG并用抗人IgG检测的板)确定血清中的总抗体浓度，检测限为15.6ng/mL，并用于PK评价。对于抗gD、38E4v1、40G5c、MD1、MD4和38E4v1.K55E，给药溶液回收率分别为111％、110％、106％、97.8％、103％和106％。给药回收率在20％以内；因此，使用标称剂量进行进一步分析。
汇集在不同时间点来自不同小鼠的PK谱。标称样品收集时间和实际剂量溶液浓度用于数据分析中。非房室分析(NCA)参数使用Phoenix64进行估计，采用稀疏采样和IV推注输入。提供了标准误差值。用异氟醚(5％异氟醚与2L/min的O2)麻醉后对小鼠实施安乐死。所有过程均经基因泰克机构动物护理和使用委员会(IACUC)批准并符合准则和原则，并在国际实验室动物护理评估和认证协会认可的设施中执行。
抗CD3抗体变体不与小鼠CD3发生交叉反应；因此，包含抗CD3抗体变体的TDB的小鼠PK谱提供了将靶标结合不存在时该等变体的PK和非特异性消除率进行比较的机会。连同抗gD对照，评估了抗CD3抗体变体的血清浓度时间曲线(图29E)。每组的PK数据通过NCA表征(表10)。
与施用抗CD3抗体变体的组相比，施用抗gD的组具有最高的暴露量。基于其AUClast值，40G5c施用组具有与抗gD施用组相比略低的暴露量，并且具有与其余抗CD3抗体变体相比最高的暴露量。另一方面，基于其AUClast，38E4v1具有与其余抗CD3抗体变体相比最低的暴露量。
在MD1、MD4和K55E三个变体中，基于其AUClast，MD1具有最高的暴露量，并且其PK曲线与40G5c施用组相似。基于其AUClast，MD4施用组具有三个变体中最低的暴露量，且其PK曲线与38E4v1施用组相似。此外，基于在小鼠中的AUCinf，MD1将38E4v1暴露量提高约3倍。此外，抗gD、40G5c和38E4v1.MD1施用组具有相当的Vss值，这些值比38E4v1、MD4和K55E施用组的Vss值低大约2倍(表10)。
表10.抗CD3ε抗体变体的PK参数
在适用的情况下提供标准误差值。Cmax＝观察到的最大血清浓度，AUClast＝从时间0到最后测量时间点(第28天)的血清浓度时间曲线下面积。AUCinf＝从时间0外推到无穷大的血清浓度时间曲线下面积。CL＝清除率。Vss＝稳态分布体积。t1/2＝终末半衰期。
鉴于38E4v1的暴露量与40G5c相比较低，接下来评估是否存在可能对观察到的较低暴露量具有非特异性贡献的CD3臂特征。我们使用计算机模拟清除评估工具(iCAT)估计38E4v1和40G5c的抗体可变区(Fv)电荷和疏水性，iCAT是一种基于序列的计算工具，其提供对食蟹猴中抗体清除的理论风险评估(Sharma等人，Proc Natl Acad Sci USA，111：18601-6，2014)。该评估基于从Fv域序列计算的参数。进行了抗CD3二价抗体的iCAT评分评价。38E4v1的计算Fv电荷为+7.6，超出了可接受的体内清除范围(可接受的范围包括Fv电荷≥0且≤+6.2)，而40G5c的计算Fv电荷为+5.6，在可接受的范围内。MD1的计算Fv电荷为+4.7，且MD4为+7.6。因此，与38E4v1相比，MD1具有改善的Fv电荷，并且具有可接受的在食蟹猴中清除的理论风险。
此外，使用杆状病毒(BV)ELISA测试了抗CD3变体。BV ELISA为一种用于评估非特异性清除的体外工具(Hotzel等人，MAbs,4:753-760,2012)。该评估基于对与杆状病毒颗粒的非特异性结合的ELISA检测，并且可以鉴定快速清除的风险增加的抗体。38E4v1的BVELISA评分为1.15，超出了预测可接受的体内清除范围(BV ELISA评分>1.0指示快速清除的可能性很高)。相比之下，MD1的BV ELISA评分为0.15，且MD4为0.72；因此，MD1和MD4两者均在可接受的范围内。有趣的是，尽管MD4通过了BV ELISA测试以进行进一步的体内测试，但体内小鼠PK数据表明，与MD1相比，MD4并未改善38E4v1的暴露量。
实例9.单细胞系统产生的抗体的TDB活性测定
测试了使用单细胞系统组装(图8C至8E)且包含抗LY6G6D 20A12.QNTv12臂和抗CD3 38E4v1 MD1(MD1)、38E4v1 MD4(MD4)或38E4v1(WT)臂的候选LY6G6D TDB的体外活性、体内活性以及与CD3多肽的亲和力。使用双细胞系统(图8B)组装且包含抗LY6G6D20A12.QNTv12臂和抗CD3 38E4v1臂的TDB用作对照。
A.体外细胞毒性、细胞结合和T细胞活化
测试了使用单细胞系统组装且包含抗LY6G6D 20A12.QNTv12臂和抗CD3 38E4v1MD1、38E4v1 MD4或38E4v1臂(WT)的LY6G6D TDB在补充有来自健康供体PBMC的HT55细胞中的体外活性、CD4+ T细胞活化和CD8+ T细胞活化(图14A-14C和15A-15C)。如实例2所述，在测定中将杀伤定量为细胞毒性百分比，并使用荧光活化细胞分选(FACS)测量CD4+ T细胞和CD8+ T细胞。所有TDB均以1mg/kg给药。包含变体38E4v1臂的LY6G6D TDB有效地诱导T细胞活化(图14B、14C、15B和15C)和针对HT55的体外靶标细胞杀伤(图14A和15A)。因此，MD1和MD4变体保留了38E4v1的高体外效力，同时在单细胞系统中提供了改善的可制备性。
B.体内活性
在NSGTM小鼠中，测试了使用单细胞系统组装的包含抗LY6G6D 20A12.QNTv12臂和变体38E4v1抗CD3臂的LY6G6D TDB针对异种移植物HT55肿瘤的体内活性(图26A和26B)。用健康供体外周血单核细胞(PBMC)对小鼠进行人源化。提供包含递送媒介物和PMBC的治疗或者包含TDB但不包含PMBC的治疗作为对照。包含抗CD3 38E4v1 MD1或38E4v1 MD4臂的单细胞变体显示出与双细胞LY6G6D TDB相当的肿瘤消退。
在静脉内施用单次剂量的抗体后，使用GRIP ELISA测定在HT55肿瘤模型小鼠和SCID小鼠中测量TDB的清除率(图27和28)。包含抗CD3 38E4v1 MD1或38E4v1 MD4臂的单细胞变体的PK与双细胞TDB的PK相当。对于单细胞TDB变体，鉴定无PK责任(例如，非典型PK)。给药溶液在标称值的±20％范围内回收。
C.对CD3的亲和力的测定
使用单细胞系统组装且包含抗CD3 38E4v1 MD1或38E4v1 MD4臂的候选LY6G6DTDB显示出对CD3的亲和力与使用单细胞系统或双细胞系统组装且包含抗CD3 38E4v1臂(MD1和MD4，如38E4v1，因此是高亲和力抗CD3臂)的TDB相当(表11)。使用BIAcore T200执行测定。将27mer人和食蟹猴CD3多肽与生物素缀合并固定在SA CM5芯片上。使LY6G6D TDB在37℃流过。
表11.对于针对人类和食蟹猴CD3的TDB的BIAcore分析
尽管为了清楚理解的目的先前已通过举例说明和实施例相当详细地描述了本发明，但是这些描述和实施例不应理解为限制本发明的范围。本文引用的所有专利和科学文献的公开内容均全文以引用方式明确地并入。
序列表
<110> 基因泰克公司
<120> 抗 LY6G6D 抗体及使用方法
<130> 50474-184WO2
<150> US 62/948,097
<151> 2019-12-13
<160> 147
<170> PatentIn 版本 3.5
<210> 1
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
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Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
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Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
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Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
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Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
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Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
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<223> 合成构建体
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 17
Asp Gly Tyr Ser Arg Tyr Tyr Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 18
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 18
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Lys Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Trp Ile Tyr Pro Glu Asn Asp Asn Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Gly Tyr Ser Arg Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Glu Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260 265 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Gly Ser Thr Tyr Arg Val
290 295 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340 345 350
Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser
355 360 365
Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370 375 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420 425 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
Lys
<210> 19
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 19
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
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Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
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Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
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Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
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<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 20
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Ser Tyr
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 21
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
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<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 22
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asp Phe Val Asn Asn
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Ala Met Ile Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Ser Ala Leu Ser Phe Ala Asp Asn Thr Ala Tyr Tyr Ala Thr Trp Ala
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Ser Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ser Ser Lys Thr Thr Val Tyr
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Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 23
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Glu Ser Ile Thr Arg Tyr
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Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
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Tyr Asp Ala Ser Lys Leu Pro Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
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65 70 75 80
Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Ser Thr Ser Phe Arg Gly Arg
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
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Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser Asp Gly Arg Thr Tyr Leu His
1 5 10 15
<210> 25
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 25
Leu Val Ser Asn Leu Asp Ser
1 5
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<212> PRT
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<220>
<223> 合成构建体
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Trp Gln Gly Thr His Leu Pro Phe Thr
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<220>
<223> 合成构建体
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Ser Tyr Trp Ile Gln
1 5
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<220>
<223> 合成构建体
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1 5 10 15
Gly Lys
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<220>
<223> 合成构建体
<400> 29
Trp Phe Ala Tyr
1
<210> 30
<211> 443
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 30
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Met Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Tyr
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Trp Ile Gln Trp Ile Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Ile
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115 120 125
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Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr
165 170 175
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Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro
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Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr
245 250 255
Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn
260 265 270
Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg
275 280 285
Glu Glu Gln Tyr Gly Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val
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Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser
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Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys
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Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu
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Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
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Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
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Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly
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<210> 31
<211> 219
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 31
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Thr Leu Ser Val Thr Ile Gly
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His Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser
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Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
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Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
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Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
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Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
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<210> 32
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 32
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Met Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Tyr
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Trp Ile Gln Trp Ile Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Ile
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Ala
<210> 33
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 33
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Thr Leu Ser Val Thr Ile Gly
1 5 10 15
His Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser
20 25 30
Asp Gly Arg Thr Tyr Leu His Trp Leu Phe Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Arg Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Asn Leu Asp Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
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Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly
85 90 95
Thr His Leu Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
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<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 34
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asp Phe Val
20 25 30
<210> 35
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 35
Trp Val Arg Glu Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser
1 5 10
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<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 36
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ser Ser Lys Thr Thr Val Tyr Leu Gln
1 5 10 15
Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Met Arg
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 37
Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
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<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 38
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys
20
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<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 39
Trp Tyr Gln Lys Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
1 5 10 15
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<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 40
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr
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Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys
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<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 41
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
1 5 10
<210> 42
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 42
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr
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<210> 43
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 43
Trp Val Arg Glu Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly
1 5 10
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<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 44
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 45
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 46
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 46
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20
<210> 47
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 47
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
1 5 10 15
<210> 48
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 48
Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
1 5 10 15
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys
20 25 30
<210> 49
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 49
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
1 5 10
<210> 50
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 50
Trp Ala Ser Thr Arg Lys Ser
1 5
<210> 51
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 51
Lys Gln Ser Phe Ile Leu Arg Thr Phe
1 5
<210> 52
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 52
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Ser Tyr
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<210> 53
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 53
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
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<400> 54
000
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 55
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 57
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
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Ser Phe Ile Leu Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115 120 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Lys Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 58
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 58
Trp Val Arg Lys Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser
1 5 10
<210> 59
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 59
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asp Phe Val Asn Asn
20 25 30
Ala Met Ile Trp Val Arg Lys Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Leu Ser Phe Ala Asp Asn Thr Ala Tyr Tyr Ala Thr Trp Ala
50 55 60
Ser Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ser Ser Lys Thr Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Met Arg Gly Asp Leu Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
100 105 110
<210> 60
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 60
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Glu Ser Ile Thr Arg Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Glu Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Lys Leu Pro Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Ser Thr Ser Phe Arg Gly Arg
85 90 95
Ser Tyr Gln Asn Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 61
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 61
Trp Tyr Gln Glu Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
1 5 10 15
<210> 62
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 62
Trp Val Arg Lys Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly
1 5 10
<210> 63
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 63
Trp Tyr Gln Gln Glu Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
1 5 10 15
<210> 64
<211> 442
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 64
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asp Phe Val Asn Asn
20 25 30
Ala Met Ile Trp Val Arg Lys Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Leu Ser Phe Ala Asp Asn Thr Ala Tyr Tyr Ala Thr Trp Ala
50 55 60
Ser Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ser Ser Lys Thr Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Met Arg Gly Asp Leu Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
100 105 110
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
115 120 125
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
130 135 140
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
145 150 155 160
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
165 170 175
Leu Glu Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
180 185 190
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
195 200 205
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
210 215 220
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
225 230 235 240
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
245 250 255
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
260 265 270
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
275 280 285
Glu Gln Tyr Gly Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
290 295 300
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
305 310 315 320
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
325 330 335
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
340 345 350
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
355 360 365
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
370 375 380
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
385 390 395 400
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
405 410 415
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
420 425 430
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440
<210> 65
<211> 218
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 65
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Glu Ser Ile Thr Arg Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Glu Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Lys Leu Pro Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Ser Thr Ser Phe Arg Gly Arg
85 90 95
Ser Tyr Gln Asn Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105 110
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
115 120 125
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Lys Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
130 135 140
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
145 150 155 160
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
165 170 175
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
180 185 190
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
195 200 205
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 66
<211> 442
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 66
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asp Phe Val Asn Asn
20 25 30
Ala Met Ile Trp Val Arg Lys Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Leu Ser Phe Ala Asp Asn Thr Ala Tyr Tyr Ala Thr Trp Ala
50 55 60
Ser Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ser Ser Lys Thr Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Met Arg Gly Asp Leu Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
100 105 110
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
115 120 125
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
130 135 140
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
145 150 155 160
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
165 170 175
Leu Glu Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
180 185 190
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
195 200 205
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
210 215 220
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
225 230 235 240
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
245 250 255
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
260 265 270
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
275 280 285
Glu Gln Tyr Gly Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
290 295 300
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
305 310 315 320
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
325 330 335
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
340 345 350
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr
355 360 365
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
370 375 380
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
385 390 395 400
Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
405 410 415
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
420 425 430
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440
<210> 67
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 67
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Lys Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Trp Ile Tyr Pro Glu Asn Asp Asn Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Gly Tyr Ser Arg Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Glu Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260 265 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Gly Ser Thr Tyr Arg Val
290 295 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340 345 350
Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp
355 360 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370 375 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420 425 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
Lys
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<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 68
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Glu Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Trp Ile Tyr Pro Glu Asn Asp Asn Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Gly Tyr Ser Arg Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Lys Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260 265 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Gly Ser Thr Tyr Arg Val
290 295 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340 345 350
Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp
355 360 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370 375 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420 425 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
Lys
<210> 69
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 69
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Ser Tyr
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Tyr Ile His Trp Val Arg Glu Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Trp Ile Tyr Pro Glu Asn Asp Asn Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Gly Tyr Ser Arg Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Lys Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260 265 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Gly Ser Thr Tyr Arg Val
290 295 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340 345 350
Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser
355 360 365
Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370 375 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420 425 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
Lys
<210> 70
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 70
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
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Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Lys Lys Pro Gly Gln
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Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Glu Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
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Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
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<400> 71
000
<210> 72
<400> 72
000
<210> 73
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 73
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Lys Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Lys Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gln
85 90 95
Ser Phe Ile Leu Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115 120 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Glu Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 74
<400> 74
000
<210> 75
<211> 133
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 75
Met Lys Pro Gln Phe Val Gly Ile Leu Leu Ser Ser Leu Leu Gly Ala
1 5 10 15
Ala Leu Gly Asn Arg Met Arg Cys Tyr Asn Cys Gly Gly Ser Pro Ser
20 25 30
Ser Ser Cys Lys Glu Ala Val Thr Thr Cys Gly Glu Gly Arg Pro Gln
35 40 45
Pro Gly Leu Glu Gln Ile Lys Leu Pro Gly Asn Pro Pro Val Thr Leu
50 55 60
Ile His Gln His Pro Ala Cys Val Ala Ala His His Cys Asn Gln Val
65 70 75 80
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Ala Gly Ile Leu Ala Ala Ala Ala Thr Ala Leu Thr Cys Leu Leu Pro
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Gly Leu Trp Ser Gly
130
<210> 76
<211> 2449
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 76
atgaaacccc agtttgttgg gatcttgctc agctccctgc taggggctgc cttgggtaag 60
gaggcggcca gctagcttct cacacaggcc ttctgccagc cggctccacc gagggcccag 120
gtccagcgcc tcttttctcc tgccaggaaa ccgaatgcgg tgctacaact gtggtggaag 180
ccccagcagt tcttgcaaag aggccgtgac cacctgtggc gagggcagac cccagccagg 240
cctggaacag atcaagctac ctggaaaccg tgagtcctca gtttctccct cttccagcag 300
cctttccctg cctccagccc catgtcaatc cttctggctt ccagaaccct ccaggctcag 360
tctggctctg ggcagatggt gcagctgtta gaggagagca gtctgtaccc cttctggctc 420
ctggcacgga gcccctgaga ggcccacagt ccttgtgccc ccacttcccc acctccttat 480
tctcctaaaa gaatctcata ggcccattag ctcacaaatg aagagctctg gccctgaaag 540
gccaaagtta aaaccaaact tcaaattttc ggcattagtt aaggaccagg gaggggtgtg 600
tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtacatg tttttaatat tttattttaa 660
cataattttg gattgacaga aaagttgcag aaatactcaa cttctcctaa tgctaacatc 720
ttacataacc atagcacaat tatcaaaatc acaaaataac tgatacaata ctactaacta 780
atctacagac tttatttgat ttagcaagat cctacattgc atttagctct catgtcttct 840
tagtctcctc tgatctgtgc cagttctgtt tttctttgtc tttcatgacc ctgacacatt 900
tgaagagccc tgataaatta ttttatacct ggagtttaaa aaattacttt tagggccagt 960
gcagtcactc gcacctgtaa tcccagcact ttaggaggcc aaggtgggag gaccacttga 1020
gcccaagagt tgagaccagc ctgggcaaca tagggagacc ctgtctctac aaaaaacaaa 1080
caaacaaaca aacaaacaga ttaaaaaatt agttgggtgt ggtggcacat gcttgtagtc 1140
ctagctactc agggggctga agagggagga tcgcttgagc ctgggagatt gaagctacaa 1200
tgagccatga tcacgccact acactccagc ctggggaaca aaatgagacc ctgtctcaaa 1260
aataataata ataataattt ttaggctagg cttggtggca cacacttgta atcccagcac 1320
tttgggaggc caaggctgaa gagtcacctg aggtcaggag tttgacacca gcctgggcag 1380
caaagtgaga cccccatctc tacaaaaaat gtttttaaaa aattagccag gcatagtggc 1440
acacacctgt aatctcagtt tcctgagagg ctgaggcagg aggattactt gagcccagga 1500
gtttgaggct atagggaggt atgattgcac caccacactc cagcctgagt gagagagcaa 1560
gatcttttct ctaaaattaa ataaaatcat ttttagatta aacaaaaatt acgtgccgga 1620
tgcagtggct cacgcctgta atcccagcac tttgggaggc caaggcgggt ggataacctg 1680
aggtcgggag ttcaagacca gcctgatcaa tgtggagaaa tctcgtctct actaaaaata 1740
caaaattagc cgggtgtagt ggtgcccgcc tgtaatacca gctactcggg aacctgaggc 1800
aggagaattg cttgaaccca agaggtggag gtcgcggtga gccgagatca caccattgca 1860
ctccagctgg gcaataagag tgaaactccg tctcaaaaaa aaaaaaaaaa ttacagatac 1920
ttgaaatact aaaaattatt ttatagaatg tccctcgata tttatttatc tgatatttgc 1980
catgatgaga ttgaggtcat gcattttaag caagaatact gcagaagtga tgttgcatcc 2040
ttcttgctgc atcacatcag gagtttacaa ggtcaatgca ttaactttga tcacttggtt 2100
tcagggaggt gttttttgag ggggctgaaa atccctttgg gctccttgaa atcacatctg 2160
ctctgcccca gaaggcaagt cctgaagcca ggagtccaac accccagttt cattctctct 2220
ctcagcccca gtgaccttga ttcaccaaca tccagcctgc gtcgcagccc atcattgcaa 2280
tcaagtggag acagagtcgg tgggagacgt gacttatcca gcccacaggg actgctacct 2340
gggagacctg tgcaacagcg ccgtggcaag ccatgtggcc cctgcaggca ttttggctgc 2400
agcagctacc gccctgacct gtctcttgcc aggactgtgg agcggatag 2449
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<220>
<223> 合成构建体
<400> 77
Met Lys Pro Gln Phe Val Gly Ile Leu Leu Ser Ser Leu Leu Gly Ala
1 5 10 15
Ala Leu Gly Asn Arg Met Arg Cys Tyr Asn Cys Gly Gly Ser Pro Ser
20 25 30
Ser Ser Cys Lys Glu Ala Val Thr Thr Cys Gly Glu Gly Arg Pro Gln
35 40 45
Pro Gly Leu Glu Gln Ile Lys Leu Pro Gly Asn Pro Pro Val Thr Leu
50 55 60
Ile His Gln His Pro Ala Cys Val Ala Ala His His Cys Asn Gln Val
65 70 75 80
Glu Thr Glu Ser Val Gly Asp Val Thr Tyr Pro Ala His Arg Asp Cys
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Tyr Leu Gly Asp Leu Cys Asn Ser Ala Val Ala Ser His Val Ala Pro
100 105 110
Ala Gly Ile Leu Ala Ala Ala Ala Thr Ala Leu Thr Cys Leu Leu Pro
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Gly Leu Trp Ser Gly
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
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Arg Asp Cys Tyr Leu Gly Asp Leu Cys Asn
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 79
Gly Asp Leu
1
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 80
Met Gln Ser Gly Thr His Trp Arg Val Leu Gly Leu Cys Leu Leu Ser
1 5 10 15
Val Gly Val Trp Gly Gln Asp Gly Asn Glu Glu Met Gly Gly Ile Thr
20 25 30
Gln Thr Pro Tyr Lys Val Ser Ile Ser Gly Thr Thr Val Ile Leu Thr
35 40 45
Cys Pro Gln Tyr Pro Gly Ser Glu Ile Leu Trp Gln His Asn Asp Lys
50 55 60
Asn Ile Gly Gly Asp Glu Asp Asp Lys Asn Ile Gly Ser Asp Glu Asp
65 70 75 80
His Leu Ser Leu Lys Glu Phe Ser Glu Leu Glu Gln Ser Gly Tyr Tyr
85 90 95
Val Cys Tyr Pro Arg Gly Ser Lys Pro Glu Asp Ala Asn Phe Tyr Leu
100 105 110
Tyr Leu Arg Ala Arg Val Cys Glu Asn Cys Met Glu Met Asp Val Met
115 120 125
Ser Val Ala Thr Ile Val Ile Val Asp Ile Cys Ile Thr Gly Gly Leu
130 135 140
Leu Leu Leu Val Tyr Tyr Trp Ser Lys Asn Arg Lys Ala Lys Ala Lys
145 150 155 160
Pro Val Thr Arg Gly Ala Gly Ala Gly Gly Arg Gln Arg Gly Gln Asn
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Lys Glu Arg Pro Pro Pro Val Pro Asn Pro Asp Tyr Glu Pro Ile Arg
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Lys Gly Gln Arg Asp Leu Tyr Ser Gly Leu Asn Gln Arg Arg Ile
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 81
Met Gln Ser Gly Thr Arg Trp Arg Val Leu Gly Leu Cys Leu Leu Ser
1 5 10 15
Ile Gly Val Trp Gly Gln Asp Gly Asn Glu Glu Met Gly Ser Ile Thr
20 25 30
Gln Thr Pro Tyr Gln Val Ser Ile Ser Gly Thr Thr Val Ile Leu Thr
35 40 45
Cys Ser Gln His Leu Gly Ser Glu Ala Gln Trp Gln His Asn Gly Lys
50 55 60
Asn Lys Glu Asp Ser Gly Asp Arg Leu Phe Leu Pro Glu Phe Ser Glu
65 70 75 80
Met Glu Gln Ser Gly Tyr Tyr Val Cys Tyr Pro Arg Gly Ser Asn Pro
85 90 95
Glu Asp Ala Ser His His Leu Tyr Leu Lys Ala Arg Val Cys Glu Asn
100 105 110
Cys Met Glu Met Asp Val Met Ala Val Ala Thr Ile Val Ile Val Asp
115 120 125
Ile Cys Ile Thr Leu Gly Leu Leu Leu Leu Val Tyr Tyr Trp Ser Lys
130 135 140
Asn Arg Lys Ala Lys Ala Lys Pro Val Thr Arg Gly Ala Gly Ala Gly
145 150 155 160
Gly Arg Gln Arg Gly Gln Asn Lys Glu Arg Pro Pro Pro Val Pro Asn
165 170 175
Pro Asp Tyr Glu Pro Ile Arg Lys Gly Gln Gln Asp Leu Tyr Ser Gly
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Leu Asn Gln Arg Arg Ile
195
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
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Met Glu Gln Gly Lys Gly Leu Ala Val Leu Ile Leu Ala Ile Ile Leu
1 5 10 15
Leu Gln Gly Thr Leu Ala Gln Ser Ile Lys Gly Asn His Leu Val Lys
20 25 30
Val Tyr Asp Tyr Gln Glu Asp Gly Ser Val Leu Leu Thr Cys Asp Ala
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Glu Ala Lys Asn Ile Thr Trp Phe Lys Asp Gly Lys Met Ile Gly Phe
50 55 60
Leu Thr Glu Asp Lys Lys Lys Trp Asn Leu Gly Ser Asn Ala Lys Asp
65 70 75 80
Pro Arg Gly Met Tyr Gln Cys Lys Gly Ser Gln Asn Lys Ser Lys Pro
85 90 95
Leu Gln Val Tyr Tyr Arg Met Cys Gln Asn Cys Ile Glu Leu Asn Ala
100 105 110
Ala Thr Ile Ser Gly Phe Leu Phe Ala Glu Ile Val Ser Ile Phe Val
115 120 125
Leu Ala Val Gly Val Tyr Phe Ile Ala Gly Gln Asp Gly Val Arg Gln
130 135 140
Ser Arg Ala Ser Asp Lys Gln Thr Leu Leu Pro Asn Asp Gln Leu Tyr
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Gln Pro Leu Lys Asp Arg Glu Asp Asp Gln Tyr Ser His Leu Gln Gly
165 170 175
Asn Gln Leu Arg Arg Asn
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
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Met Val Gln Gly Lys Gly Leu Thr Gly Phe Ile Leu Ala Ile Ile Leu
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Leu Gln Gly Ser Leu Ala Gln Ser Phe Glu Glu Asn Arg Lys Leu Asn
20 25 30
Val Tyr Asn Gln Glu Asp Gly Ser Val Leu Leu Thr Cys His Val Lys
35 40 45
Asn Thr Asn Ile Thr Trp Phe Lys Glu Gly Lys Met Ile Asp Ile Leu
50 55 60
Thr Ala His Lys Asn Lys Trp Asn Leu Gly Ser Asn Thr Lys Asp Pro
65 70 75 80
Arg Gly Val Tyr Gln Cys Lys Gly Ser Lys Asp Lys Ser Lys Thr Leu
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Gln Val Tyr Tyr Arg Met Cys Gln Asn Cys Ile Glu Leu Asn Ala Ala
100 105 110
Thr Ile Leu Gly Phe Val Phe Ala Glu Ile Ile Ser Ile Phe Phe Leu
115 120 125
Ala Val Gly Val Tyr Phe Ile Ala Gly Gln Asp Gly Val Arg Gln Ser
130 135 140
Arg Ala Ser Asp Lys Gln Thr Leu Leu Pro Asn Asp Gln Leu Tyr Gln
145 150 155 160
Pro Leu Lys Asp Arg Glu Asp Asp Gln Tyr Ser His Leu Gln Gly Asn
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Gln Leu Arg Met Asn
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 84
Met Gln Ser Gly Thr His Trp Arg Val Leu Gly Leu Cys Leu Leu Ser
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Val Gly Val Trp Gly Gln Asp Gly Asn Glu
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
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Met Gln Ser Gly Thr His Trp Arg Val Leu Gly Leu Cys Leu Leu Ser
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Val Gly Val Trp Gly Gln Asp Gly Asn Glu Glu
20 25
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
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Gln Asp Gly Asn Glu Glu Met Gly Gly Ile Thr Gln Thr Pro Tyr Lys
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
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His Arg Asp Cys Tyr Leu Gly Asp Leu Cys Asn Ser
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 88
Asn Arg Met Arg Cys Tyr Asn Cys Gly Gly Ser Pro Ser Ser Ser Cys
1 5 10 15
Lys Glu Ala Val Thr Thr Cys Gly Glu Gly Arg Pro Gln Pro Gly Leu
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Asp Leu Cys Asn Ser Ala Gly Asn Ser Val Thr
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 89
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Glu Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Trp Ile Tyr Pro Glu Asn Asp Asn Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala Arg Asp Gly Tyr Ser Arg Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 90
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Lys Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Gln
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Ser Phe Ile Leu Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
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<400> 91
000
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 92
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Lys Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Lys Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gln
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Ser Phe Ile Leu Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 93
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Thr Ser Thr Arg Lys Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gln
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Ser Phe Ile Leu Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 94
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Lys Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gln
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Ser Phe Ile Leu Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 95
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 95
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr
20 25 30
Val Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Gly Arg Arg Asn Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
100 105 110
Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser
115 120 125
Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys
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Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu
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Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu
165 170 175
Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr
180 185 190
Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val
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<211> 216
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 96
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asp Phe Val Asn Asn
20 25 30
Ala Met Ile Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Leu Ser Phe Ala Asp Asn Thr Ala Tyr Tyr Ala Thr Trp Ala
50 55 60
Ser Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ser Ser Lys Thr Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Met Arg Gly Asp Leu Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
100 105 110
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
115 120 125
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
130 135 140
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
145 150 155 160
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
165 170 175
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
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Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 97
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Glu Ser Ile Thr Arg Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Lys Leu Pro Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Ser Thr Ser Phe Arg Gly Arg
85 90 95
Ser Tyr Gln Asn Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105 110
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
115 120 125
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
130 135 140
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
145 150 155 160
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
165 170 175
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
180 185 190
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
195 200 205
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 98
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
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Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asn Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Ser Tyr Ser Asn Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
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<213> 人工序列
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<223> 合成构建体
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Gln Ser Thr Ser Phe Arg Gly Arg Ser Tyr Gln Asn Val
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 101
Gln Ser Thr Ser Phe Arg Gly Arg Ser Tyr Ser Asn Thr
1 5 10
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<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 102
Gln Ser Thr Ser Phe Arg Gly Arg Ser Tyr Ser Asn Ala
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<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 103
Gln Ser Thr Ser Phe Arg Gly Arg Ser Tyr Ala Asn Thr
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<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 104
Gln Ser Thr Ser Phe Arg Gly Arg Ser Tyr Asn Asn Ala
1 5 10
<210> 105
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 105
Gln Ser Thr Ser Phe Arg Gly Arg Ser Tyr Asn Asn Val
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<213> 人工序列
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<223> 合成构建体
<400> 106
Gln Ser Thr Ser Phe Arg Gly Arg Ser Tyr Gly Asn Thr
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<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 107
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1 5 10
<210> 108
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 108
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Lys Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Thr Ser Thr Arg Lys Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gln
85 90 95
Ser Phe Ile Leu Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 109
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Lys Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asn Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Ser Tyr Ser Asn Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
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<220>
<223> 合成构建体
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<220>
<223> 合成构建体
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1 5
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<220>
<223> 合成构建体
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1 5 10 15
Gly
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<220>
<223> 合成构建体
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Ile Leu Ser Phe Ala Asp Asn Thr Ala Tyr Tyr Ala Thr Trp Ala Ser
1 5 10 15
Gly
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 114
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asp Phe Val Asn Asn
20 25 30
Ala Met Ile Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Leu Ser Phe Ala Asp Asn Thr Ala Tyr Tyr Ala Thr Trp Ala
50 55 60
Ser Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ser Ser Lys Thr Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Met Arg Gly Asp Leu Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
100 105 110
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
115 120 125
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
130 135 140
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
145 150 155 160
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
165 170 175
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
180 185 190
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
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Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
210 215 220
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
225 230 235 240
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
245 250 255
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
260 265 270
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
275 280 285
Glu Gln Tyr Gly Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
290 295 300
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
305 310 315 320
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
325 330 335
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
340 345 350
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
355 360 365
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
370 375 380
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
385 390 395 400
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
405 410 415
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
420 425 430
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440
<210> 115
<211> 218
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 115
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Glu Ser Ile Thr Arg Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Lys Leu Pro Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Ser Thr Ser Phe Arg Gly Arg
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Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
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Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
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Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
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Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
165 170 175
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
180 185 190
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
195 200 205
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
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<220>
<223> 合成构建体
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1 5
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<211> 111
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 117
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 118
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
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Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Pro Pro Lys Leu Leu Ile
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Tyr Asp Ala Ser Lys Leu Pro Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
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Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
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Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Ser Thr Ser Phe Arg Gly Arg
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100 105 110
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<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 119
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
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Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Gln Ala Ser Glu Ser Ile Thr Arg Tyr
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Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile
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<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 120
Glu Gln Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asp Phe Val Asn Asn
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Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
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65 70 75 80
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 121
Glu Gln Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asp Phe Val Asn Asn
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
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Ala Ala Leu Ser Phe Ala Asp Asn Thr Ala Tyr Tyr Ala Thr Trp Ala
50 55 60
Ser Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Ser Ser Lys Asn Thr Val Tyr
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<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 122
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Glu Ser Ile Thr Arg Tyr
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Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Pro Pro Lys Leu Leu Ile
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Tyr Asp Ala Ser Lys Leu Pro Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
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65 70 75 80
Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Ser Thr Ser Phe Arg Gly Arg
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 123
Glu Gln Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asp Phe Val Asn Asn
20 25 30
Ala Met Ile Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
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50 55 60
Ser Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Ser Ser Lys Asn Thr Val Tyr
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Met Arg Gly Asp Leu Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 124
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp
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Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
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Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
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Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Ser Leu
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 125
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
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65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala Lys Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
100 105 110
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<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 126
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Glu Lys Pro Gly Gln
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Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Thr Ser Thr Arg Lys Ser Gly Val
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65 70 75 80
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Ser Phe Ile Leu Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 127
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
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Tyr Ile His Trp Val Arg Glu Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
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Ala Arg Asp Ser Tyr Ser Asn Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 128
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 128
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 129
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 130
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 131
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<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 132
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 133
Asp Ala Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 134
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 135
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 136
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 137
Glu Gln Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Leu Ser Leu Ser Thr Asn
20 25 30
Ser Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Tyr His Gly Asp Gly Ile Ala Asp Tyr Ala Ser Trp Ala
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Ser Ala Lys Asn Ser Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Ser Gly Ala Gly Tyr Ser Leu Phe Thr Leu Trp Gly Pro Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 138
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 138
Ala Ala Val Leu Thr Gln Thr Pro Ser Pro Val Ser Ala Ala Val Gly
1 5 10 15
Gly Thr Ile Thr Ile Asn Cys Gln Ser Ser Glu Ser Val Trp His Asn
20 25 30
Asn Trp Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Arg Pro Arg Leu
35 40 45
Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Thr Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asp Val
65 70 75 80
Gln Cys Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Gly Gly Tyr Ser Ser
85 90 95
Ser Asp Ala His Val Phe Gly Arg Gly Thr Ala Val Val Val Lys
100 105 110
<210> 139
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 139
Asp Ala Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ser Ser Glu Ser Val Trp His Asn
20 25 30
Asn Trp Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Arg Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu
65 70 75 80
Gln Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Gly Gly Tyr Ser Ser
85 90 95
Ser Asp Ala His Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
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<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 140
Glu Ala Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Gln Ser Ser Glu Ser Val Trp His Asn
20 25 30
Asn Trp Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu
35 40 45
Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu
65 70 75 80
Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Gly Gly Tyr Ser Ser
85 90 95
Ser Asp Ala His Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
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<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 141
Gln Ser Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly Thr
1 5 10 15
Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Leu Ser Leu Ser Thr Asn Ser
20 25 30
Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly
35 40 45
Tyr Ile Tyr His Gly Asp Gly Ile Ala Asp Tyr Ala Ser Trp Ala Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Ser Thr Thr Val Thr Leu Arg
65 70 75 80
Met Thr Ser Leu Thr Val Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Ser
85 90 95
Gly Ala Gly Tyr Ser Leu Phe Thr Leu Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 142
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 142
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Leu Ser Leu Ser Thr Asn
20 25 30
Ser Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Tyr Ile Tyr His Gly Asp Gly Ile Ala Asp Tyr Ala Ser Trp Ala
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ser Gly Ala Gly Tyr Ser Leu Phe Thr Leu Trp Gly Arg Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 143
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 143
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Leu Ser Leu Ser Thr Asn
20 25 30
Ser Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Tyr Ile Tyr His Gly Asp Gly Ile Ala Asp Tyr Ala Ser Trp Ala
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ser Gly Ala Gly Tyr Ser Leu Phe Thr Leu Trp Gly Arg Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 144
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 144
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro
85 90 95
Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 145
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 145
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Ser Asn
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Val Ile Tyr Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
100 105 110
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 146
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Ser Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
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65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
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100 105 110
<210> 147
<211> 220
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 147
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Leu Ser
20 25 30
Gly Asn Gln Glu Asn Tyr Leu Ala Trp His Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Thr Leu Ile Thr Trp Ala Ser Thr Arg Ile Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Ser Tyr Ser Ala Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile
100 105 110
Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp
115 120 125
Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn
130 135 140
Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu
145 150 155 160
Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp
165 170 175
Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr
180 185 190
Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser
195 200 205
Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215 220

Claims (41)

1.一种双特异性抗体，其与淋巴细胞抗原6家族成员G6D(LY6G6D)和分化簇3(CD3)结合，其中所述双特异性抗体包含：包含重链多肽H1和轻链多肽L1的LY6G6D结合结构域，和包含重链多肽H2和轻链多肽L2的CD3结合结构域，其中H1和H2各自包含重链可变结构域VH和重链恒定结构域CH1，且L1和L2各自包含轻链可变结构域VL和轻链恒定结构域CL，其中：
(a)所述LY6G6D结合结构域包含以下六个CDR：
(i)SEQ ID NO:4的氨基酸序列所示的CDR-H1；
(ii)SEQ ID NO:5的氨基酸序列所示的CDR-H2；
(iii)SEQ ID NO:6的氨基酸序列所示的CDR-H3；
(iv)SEQ ID NO:1的氨基酸序列所示的CDR-L1；
(v)SEQ ID NO:2的氨基酸序列所示的CDR-L2；和
(vi)SEQ ID NO:3的氨基酸序列所示的CDR-L3；并且
(b)所述CD3结合结构域包含以下六个CDR：
(i)SEQ ID NO:15的氨基酸序列所示的CDR-H1；
(ii)SEQ ID NO:16的氨基酸序列所示的CDR-H2；
(iii)SEQ ID NO:17的氨基酸序列所示的CDR-H3；
(iv)SEQ ID NO:12的氨基酸序列所示的CDR-L1；
(v)SEQ ID NO:13的氨基酸序列所示的CDR-L2；和
(vi)SEQ ID NO:14的氨基酸序列所示的CDR-L3。
2.根据权利要求1所述的双特异性抗体，其中：
(a)所述H1的CH1在位置S183处包含氨基酸取代且所述L1的CL在位置V133处包含氨基酸取代，和/或所述H2的CH1在位置S183处包含氨基酸取代且所述L2的CL在位置V133处包含氨基酸取代，其中在所述H1的CH1中位置S183处的经取代残基与在所述L1的CL中位置V133处的经取代残基形成电荷对，和/或所述H2的CH1中位置S183处的经取代残基与在所述L2的CL中位置V133处的经取代残基形成电荷对，其中位置S183和V133是根据EU编号系统的编号；并且
(b)所述H1的VH在位置Q39处包含氨基酸取代且所述L1的VL在位置Q38处包含氨基酸取代，和/或所述H2的VH在位置Q39处包含氨基酸取代且所述L2的VL在位置Q38处包含氨基酸取代，其中在所述H1的VH中位置Q39处的经取代残基与在所述L1的VL中位置Q38处的经取代残基形成电荷对，和/或所述H2的VH中位置Q39处的经取代残基与在所述L2的VL中位置Q38处的经取代残基形成电荷对，其中位置Q39和Q38是根据Kabat编号系统的编号。
3.根据权利要求2所述的双特异性抗体，其中：
(a)所述H1的CH1包含S183K突变；所述L1的CL包含V133E突变；所述H2的CH1包含S183E突变；且所述L2的CL包含V133K突变，其中位置S183和V133是根据EU编号系统的编号；并且
(b)所述H1的VH包含Q39E突变；所述L1的VL包含Q38K突变；所述H2的VH包含Q39K突变；且所述L2的VL包含Q38E突变，其中位置Q39和Q38是根据Kabat编号系统的编号。
4.根据权利要求2所述的双特异性抗体，其中：
(a)所述H1的CH1包含S183E突变且所述L1的CL包含V133K突变，并且所述H2的CH1包含S183K突变且所述L2的CL包含V133E突变，其中位置S183和V133是根据EU编号系统的编号；并且
(b)所述H1的VH包含Q39K突变，所述L1的VL包含Q38E突变，所述H2的VH包含Q39E突变，且所述L2的VL包含Q38K突变，其中位置Q39和Q38是根据Kabat编号系统的编号。
5.根据权利要求1所述的双特异性抗体，其中所述L2的VL中S43处的氨基酸被替换为脯氨酸，并且其中位置S43是根据Kabat编号系统的编号。
6.根据权利要求1至3和5中任一项所述的双特异性抗体，其中所述VH1包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列；所述VL1包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列；所述VH2包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列；并且所述VL2包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列。
7.根据权利要求1、2、4和5中任一项所述的双特异性抗体，其中所述VH1包含SEQ IDNO:59的氨基酸序列；所述VL1包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列；所述VH2包含SEQ ID NO:89的氨基酸序列；并且所述VL2包含SEQ ID NO:90的氨基酸序列。
8.根据权利要求1至5中任一项所述的双特异性抗体，其中所述抗体是全长抗体。
9.根据权利要求1至5中任一项所述的双特异性抗体，其中所述H1的Fc区的第一CH3结构域CH31和所述H2的Fc区的第二CH3结构域CH32各自包含突起或空腔，并且其中在所述CH31中的所述突起或空腔能够分别定位在所述CH32的所述空腔或突起中。
10.根据权利要求9所述的双特异性抗体，其中所述CH31和所述CH32在所述突起与空腔之间的界面处相遇。
11.根据权利要求9所述的双特异性抗体，其中所述H1的所述Fc区的所述CH31包含突起，且所述H2的所述Fc区的所述CH32包含空腔。
12.根据权利要求9述的双特异性抗体，其中(a)所述H1的所述Fc区的所述CH31包含突起，所述突起包含T366W氨基酸取代突变，其中位置T366是根据EU编号系统的编号；(b)所述H2的所述Fc区的所述CH32包含空腔，所述空腔包含T366S、L368A或Y407V氨基酸取代突变或其组合，其中位置T366、L368和Y407是根据EU编号系统的编号；或(c)兼具(a)和(b)两者。
13.根据权利要求12所述的双特异性抗体，其中(a)所述H1的所述Fc区的所述CH31包含突起，所述突起包含T366W氨基酸取代突变，其中位置T366是根据EU编号系统的编号；(b)所述H2的所述Fc区的所述CH32包含空腔，所述空腔包含T366S、L368A和Y407V氨基酸取代突变，其中位置T366、L368和Y407是根据EU编号系统的编号；或(c)兼具(a)和(b)两者。
14.根据权利要求13所述的双特异性抗体，其中(a)所述H1的所述Fc区的所述CH31包含突起，所述突起包含T366W氨基酸取代突变，其中位置T366是根据EU编号系统的编号；并且(b)所述H2的所述Fc区的所述CH32包含空腔，所述空腔包含T366S、L368A和Y407V氨基酸取代突变，其中位置T366、L368和Y407是根据EU编号系统的编号。
15.根据权利要求9所述的双特异性抗体，其中所述H1的所述Fc区的所述CH31包含空腔，且所述H2的所述Fc区的所述CH32包含突起。
16.根据权利要求9所述的双特异性抗体，其中(a)所述H1的所述Fc区的所述CH31包含空腔，所述空腔包含T366S、L368A或Y407V氨基酸取代突变或其组合，其中位置T366、L368和Y407是根据EU编号系统的编号；(b)所述H2的所述Fc区的所述CH32包含突起，所述突起包含T366W氨基酸取代突变，其中位置T366是根据EU编号系统的编号；或(c)兼具(a)和(b)两者。
17.根据权利要求16所述的双特异性抗体，其中(a)所述H1的所述Fc区的所述CH31包含空腔，所述空腔包含T366S、L368A和Y407V氨基酸取代突变，其中位置T366、L368和Y407是根据EU编号系统的编号；(b)所述H2的所述Fc区的所述CH32包含突起，所述突起包含T366W氨基酸取代突变，其中位置T366是根据EU编号系统的编号；或(c)兼具(a)和(b)两者。
18.根据权利要求17所述的双特异性抗体，其中(a)所述H1的所述Fc区的所述CH31包含空腔，所述空腔包含T366S、L368A和Y407V氨基酸取代突变，其中位置T366、L368和Y407是根据EU编号系统的编号；并且(b)所述H2的Fc区的所述CH32包含突起，所述突起包含T366W氨基酸取代突变，其中位置T366是根据EU编号系统的编号。
19.根据权利要求9所述的双特异性抗体，其中所述Fc区为人IgG同种型Fc区或其Fc区变体。
20.根据权利要求19所述的双特异性抗体，其中所述Fc区为人IgG同种型Fc区变体。
21.根据权利要求20所述的双特异性抗体，其中所述人IgG同种型Fc区变体各自在氨基酸残基N297处包含导致糖基化不存在的突变，并且其中位置N297是根据EU编号系统的编号。
22.根据权利要求21所述的双特异性抗体，其中在氨基酸残基N297处的所述突变为取代突变。
23.根据权利要求21或22所述的双特异性抗体，其中在氨基酸残基N297处的所述突变降低所述Fc区的效应子功能。
24.根据权利要求22所述的双特异性抗体，其中所述取代突变为N297G或N297A突变。
25.根据权利要求24所述的双特异性抗体，其中所述人IgG同种型Fc区变体各自包含所述N297G突变。
26.根据权利要求1至3和5中任一项所述的双特异性抗体，其中：
(a)H1包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列；
(b)L1包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列；
(c)H2包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列；并且
(d)L2包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列。
27.根据权利要求1、2、4和5中任一项所述的双特异性抗体，其中：
(a)H1包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列；
(b)L1包含SEQ ID NO:65的氨基酸序列；
(c)H2包含SEQ ID NO:69的氨基酸序列；并且
(d)L2包含SEQ ID NO:70的氨基酸序列。
28.根据权利要求1至3和5中任一项所述的双特异性抗体，其中：
(a)H1包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列；
(b)L1包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列；
(c)H2包含SEQ ID NO:67的氨基酸序列；并且
(d)L2包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列。
29.根据权利要求1、2、4和5中任一项所述的双特异性抗体，其中：
(a)H1包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列；
(b)L1包含SEQ ID NO:65的氨基酸序列；
(c)H2包含SEQ ID NO:68的氨基酸序列；并且
(d)L2包含SEQ ID NO:70的氨基酸序列。
30.一种或多种分离的核酸，其编码根据权利要求1至29中任一项所述的双特异性抗体。
31.一种或多种载体，其包含根据权利要求30所述的一种或多种分离的核酸。
32.一种宿主细胞，其包含根据权利要求31所述的一种或多种载体。
33.一种产生与LY6G6D和CD3结合的双特异性抗体的方法，所述方法包括在培养基中培养根据权利要求32所述的宿主细胞。
34.一种组合物，其包含根据权利要求1至29中任一项所述的双特异性抗体。
35.一种药物，其包含根据权利要求1至29中任一项所述的双特异性抗体。
36.根据权利要求1至29中任一项所述的双特异性抗体在制备用于治疗有此需要的受试者的LY6G6D阳性癌症或延迟有此需要的受试者的LY6G6D阳性癌症的进展的药物中的用途。
37.根据权利要求36所述的用途，其中所述LY6G6D阳性癌症为LY6G6D阳性结直肠癌(CRC)。
38.根据权利要求37所述的用途，其中所述LY6G6D阳性CRC具有的微卫星不稳定性(MSI)状态为微卫星稳定(MSS)或微卫星不稳定性低(MSI-L)。
39.一种用于治疗有此需要的受试者的LY6G6D阳性癌症或延迟有此需要的受试者的LY6G6D阳性癌症的进展的药物，其包含有效量的根据权利要求1至29中任一项所述的双特异性抗体。
40.根据权利要求39所述的药物，其中所述LY6G6D阳性癌症为LY6G6D阳性CRC。
41.根据权利要求40所述的药物，其中所述LY6G6D阳性CRC具有的MSI状态为MSS或MSI-L。
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