CN110567926A - 时间分辨荧光微球偶联新型工艺及荧光微球的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种时间分辨荧光微球偶联新型工艺，包括活化步骤、标记步骤、封闭步骤和离心重悬步骤，活化反应后不需要离心，直接将标记混合溶液加入到活化后的溶液中，将最终产物在2‑8℃保存备用；产物可用于胃蛋白酶原I检测、胃蛋白酶原II检测和铁蛋白检测。本发明提供的抗体标记的时间分辨荧光微球偶联的新型工艺，克服了现有技术中的缺点，简化了繁琐流程，节省了操作时间，提高了生产效率，重复性好，成本低，便于大规模生产应用。

Description

时间分辨荧光微球偶联新型工艺及荧光微球的应用
技术领域：
本发明涉及生物分析技术，尤其涉及一种抗体标记的时间分辨荧光微球偶联的新型工艺及抗体标记的时间分辨荧光微球的应用。
背景技术：
对某些抗原或特异性蛋白进行检测时，通常会应用到免疫标记技术。免疫标记技术是将既容易测定又具有高敏感性的物质标记到特异性抗原或抗体蛋白上。
时间分辨荧光免疫法是较常用的超敏免疫分析方法，时间分辨荧光微球是一种特殊的功能微球，每个微球中可包裹成千上万个荧光分子，大大提高了荧光的标记效率。目前，在时间分辨荧光微球抗体标记过程中，操作步骤繁琐，生产效率低。
发明内容：
本发明的目的是针对现有技术的缺陷，提供一种能够解决上述问题的时间分辨荧光微球偶联的新型工艺及抗体标记的时间分辨荧光微球的应用。
实现本发明目的的技术方案是：一种时间分辨荧光微球偶联新型工艺，包括以下步骤：
(1)活化：依次向反应器中加入1500-2000ul水，200-300ul浓度50mM、 pH5.0-8.0的MES活化缓冲液，450-550ul浓度1％的时间分辨荧光微球溶液， 100-150ul浓度1％的EDC溶液，混合均匀，25-30℃恒温反应30-60min；
(2)标记：依次将1500-2000ul水，200-300ul浓度50mM、pH6.0-9.0的 HEPES标记偶联缓冲液，400-600ul浓度1.0mg/ml的抗体溶液在试剂瓶中混合均匀，再将混合溶液直接加入到活化后的溶液中，超声混匀后，25-30℃恒温反应1-3小时；
(3)封闭：标记反应结束后，向标记反应后的溶液中加入100-150ul浓度 5％的酪蛋白封闭液，25-30℃恒温反应1-3h；
(4)离心重悬：封闭完成后，将封闭反应后的溶液离心处理，舍弃上清液，沉淀物用2000-3000ul、浓度10mM、pH8.0的Tris缓冲液重悬，进行超声混匀后，在2-8℃保存备用。
优选的，所述荧光微球的粒径为0.1-0.3um。
优选的，所述步骤(4)中离心参数为：转速12000-14500rpm、温度5-10℃、离心时间30-60min。
优选的，所述恒温反应通过恒温摇床完成。
优选的，所述抗体为鼠源抗体。
本发明还提供了抗体标记的时间分辨荧光微球的应用，可用于胃蛋白酶原I(PGI)检测、胃蛋白酶原II(PGII)检测和铁蛋白检测。
本发明的有益效果是：本发明提供了一种抗体标记的时间分辨荧光微球偶联的新型工艺，克服了现有技术中的缺点，简化了繁琐流程，节省了操作时间，提高了生产效率，重复性好，成本低，便于大规模生产应用。
具体实施方式：
下面对本发明的较佳实施例进行详细阐述，以使本发明的优点和特征能更易被本领域人员理解，从而对本发明的保护范围做出更为清楚明确的界定。
实施例1
一种时间分辨荧光微球偶联新型工艺，包括以下步骤：
(1)活化：依次向反应器中加入1500ul水，300ul浓度50mM、pH6.0的 MES活化缓冲液，450ul浓度1％的时间分辨荧光微球溶液，150ul浓度1％的EDC 溶液，混合均匀，25恒温反应30min；
(2)标记：依次将1500ul水，300ul浓度50M、pH6.0的HEPES标记偶联缓冲液，600ul浓度1.0mg/ml的抗体溶液在试剂瓶中混合均匀，再将混合溶液直接加入到活化后的溶液中，超声混匀后，25℃恒温反应1小时；
(3)封闭：标记反应结束后，向标记反应后的溶液中加入100ul浓度5％的酪蛋白封闭液，25℃恒温反应3h；
(4)离心重悬：封闭完成后，将封闭反应后的溶液离心处理，舍弃上清液，沉淀物用3000ul、浓度10mM、pH8.0的Tris缓冲液重悬，进行超声混匀后，在2℃保存备用。
其中，所述荧光微球的粒径优选为0.1-0.3um，所述离心处理的离心参数为：转速12000-14500rpm、温度5-10℃、离心时间30-60min，所述恒温反应通过恒温摇床完成，浓度5％的酪蛋白封闭液的溶剂为1％的氢氧化钠溶液，所述抗体为鼠源抗体。
鼠源抗体可以为Anti-h PGI 8009 SPTN-1、Anti-h PGII 8101 SPTN-1或Anti-hFerritin 8806 SPTN-5，均采购于Medix Biochemica。
Anti-h PGI 8009 SPTN-1和Anti-h PGII 8101 SPTN-1标记的时间分辨荧光微球可分别用于胃蛋白酶原I检测和胃蛋白酶原II检测。用于定量检测人体血清或血浆中胃蛋白酶原I和II的含量，评价胃粘膜的功能状态。血清PGI和PGII 反映胃黏膜腺体和细胞的数量，也间接反映胃黏膜不同部位的分泌功能。当胃黏膜发生病理变化时，血清PG含量也随之改变。因此，监测血清中PG的浓度可以作为监测胃黏膜状态和功能的手段。
PGI与PGII，联合PGR(PGI/PGII比值)诊断，主要与胃底黏膜病变的相关性较大(相对于胃窦粘膜)。PGI升高，PGII也升高，PGR下降时与胃浅表性胃炎、幽门螺杆菌感染、消化性溃疡有关；PGI降低，PGII升高，可能与轻、中度萎缩性胃炎相关；PGI下降，PGII降低，PGR下降可能与重度萎缩性胃炎、肠化生有关；因而血清或者血浆PGI PGII水平联合PGR可作为判定胃炎的无创性检测方法。
Anti-h Ferritin 8806 SPTN-5标记的时间分辨荧光微球可用于铁蛋白检测，用于定量检测人体血清、血浆或全血中铁蛋白的含量。铁是人体必需微量元素中含量最高的一种，与人体的健康和疾病密切相关。人体内铁代谢异常会引起许多疾病，如铁缺乏引起的免疫系统功能降低、生殖障碍、机体黏膜受损、贫血等。因此，临床上准确地测定人体铁含量对疾病的诊断、治疗及预防均有重要的现实意义。
实施例2
一种时间分辨荧光微球偶联新型工艺，包括以下步骤：
(1)活化：依次向反应器中加入1650ul水，250ul浓度50mM、pH6.5的 MES活化缓冲液，500ul浓度1％的时间分辨荧光微球溶液，100浓度1％的EDC 溶液，混合均匀，30℃恒温反应60min；
(2)标记：依次将1750ul水，250ul浓度50mM、pH8.0的HEPES标记偶联缓冲液，500ul浓度1.0mg/ml的抗体溶液在试剂瓶中混合均匀，再将混合溶液直接加入到活化后的溶液中，超声混匀后，26℃恒温反应2小时；
(3)封闭：标记反应结束后，向标记反应后的溶液中加入100-150ul浓度 5％的酪蛋白封闭液，30℃恒温反应2h；
(4)离心重悬：封闭完成后，将封闭反应后的溶液离心处理，舍弃上清液，沉淀物用2500ul、浓度10mM、pH8.0的Tris缓冲液重悬，进行超声混匀后，在8℃保存备用。
其他条件同实施例1.
实施例3
一种时间分辨荧光微球偶联新型工艺，包括以下步骤：
(1)活化：依次向反应器中加入1750ul水，250ul浓度50mM、pH6.5的 MES活化缓冲液，500ul浓度1％的时间分辨荧光微球溶液，125ul浓度1％的EDC 溶液，混合均匀，25℃恒温反应60min；
(2)标记：依次将1750ul水，250ul浓度50mM、pH7.5的HEPES标记偶联缓冲液，500ul浓度1.0mg/ml的抗体溶液在试剂瓶中混合均匀，再将混合溶液直接加入到活化后的溶液中，超声混匀后，25℃恒温反应2小时；
(3)封闭：标记反应结束后，向标记反应后的溶液中加入125ul浓度5％的酪蛋白封闭液，25℃恒温反应3h；
(4)离心重悬：封闭完成后，将封闭反应后的溶液离心处理，舍弃上清液，沉淀物用2500ul、浓度10mM、pH8.0的Tris缓冲液重悬，进行超声混匀后，在6℃保存备用。
其他条件同实施例1。
对比例
一种时间分辨荧光微球偶联工艺，包括以下步骤：
(1)活化：依次向反应器中加入1650ul水，250ul浓度50mM、pH6.5的 MES活化缓冲液，500ul浓度1％的时间分辨荧光微球溶液，100浓度1％的EDC 溶液，混合均匀，30℃恒温反应60min，反应结束后，在离心参数12000-14500rpm 下，5-10℃离心1h，舍弃上清液，保留离心沉淀；
(2)标记：依次将1750ul水，250ul浓度50mM、pH8.0的HEPES标记偶联缓冲液，500ul浓度1.0mg/ml的抗体溶液在试剂瓶中混合均匀，再将混合溶液作为复溶液加入到步骤(1)离心后的沉淀中进行复溶，进行超声混匀后，26℃恒温反应2小时；
(3)封闭：标记反应结束后，向标记反应后的溶液中加入100-150ul浓度 5％的酪蛋白封闭液，30℃恒温反应2h；
(4)离心重悬：封闭完成后，将封闭反应后的溶液离心处理，舍弃上清液，将沉淀物用2500ul、浓度10mM、pH8.0的Tris缓冲液重悬，进行超声混匀后，在8℃保存备用。
对比例中活化反应后需要离心，离心后保留离心沉淀，并在标记过程中加入标记混合液中复溶，而在实施例1-3中，活化反应后不需要离心，直接将标记混合溶液加入到活化后的溶液中，简化了之前的繁琐工艺流程，节省了操作时间，提高了生产效率。
对比例的产品用于PGI及PGII检测，其性能指标分别见表1-1至表1-6，本发明实施例2的产品用于PGI及PGII检测，其性能指标分别见表2-1至表2-6。分别检测了线性、检测限、重复性、批间差、准确度、特异性，通过对比可知，本发明简化了繁琐的工艺流程，其产品仍具有优异的性能。
表1-1
表1-2
表1-3
表1-4
表1-5
表1-6
表2-1
表2-2
表2-3
表2-4
表2-5
表2-6
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

Claims (6)

1.一种时间分辨荧光微球偶联新型工艺，其特征在于，包括以下步骤：
(1)活化：依次向反应器中加入1500-2000ul水，200-300ul浓度50mM、pH5.0-8.0的MES活化缓冲液，450-550ul浓度1％的时间分辨荧光微球溶液，100-150ul浓度1％的EDC溶液，混合均匀，25-30℃恒温反应30-60min；
(2)标记：依次将1500-2000ul水，200-300ul浓度50mM、pH6.0-9.0的HEPES标记偶联缓冲液，400-600ul浓度1.0mg/ml的抗体溶液在试剂瓶中混合均匀，再将混合溶液直接加入到活化后的溶液中，超声混匀后，25-30℃恒温反应1-3小时；
(3)封闭：标记反应结束后，向标记反应后的溶液中加入100-150ul浓度5％的酪蛋白封闭液，25-30℃恒温反应1-3h；
(4)离心重悬：封闭完成后，将封闭反应后的溶液离心处理，舍弃上清液，沉淀物用2000-3000ul、浓度10mM、pH8.0的Tris缓冲液重悬，进行超声混匀后，在2-8℃保存备用。
2.根据权利要求1所述的时间分辨荧光微球偶联新型工艺，其特征在于，所述荧光微球的粒径为0.1-0.3um。
3.根据权利要求1所述的时间分辨荧光微球偶联新型工艺，其特征在于，所述步骤(4)中离心参数为：转速12000-14500rpm、温度5-10℃、离心时间30-60min。
4.根据权利要求1所述的时间分辨荧光微球偶联新型工艺，其特征在于，所述恒温反应通过恒温摇床完成。
5.根据权利要求1所述的时间分辨荧光微球偶联新型工艺，其特征在于，所述抗体为鼠源抗体。
6.根据权利要求1-5任一所述的新型工艺得到的抗体标记的时间分辨荧光微球的应用，其特征在于，用于胃蛋白酶原I检测、胃蛋白酶原II检测和铁蛋白检测。
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