CN108548932A - 基于微流控芯片的促甲状腺激素tsh试剂盒及制备和检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于微流控芯片的促甲状腺激素TSH试剂盒及制备和检测方法，该试剂盒的制备方法，包括以下步骤：(1)微流控芯片包被；(2)荧光微球标记；(3)微流控芯片组装；(4)定标品的制备；(5)得基于微流控芯片的促甲状腺激素TSH试剂盒。制备得到的促甲状腺激素TSH试剂盒采用双抗体夹心法进行测定，选取高灵敏度的时间分辨荧光物作为标记物，在荧光微球上进行抗体的标记，利用抗体对的免疫反应进行分析检测，所制备的试剂性能可达同等化学发光试剂的水平。免疫反应后，使用清洗液将多余组分完全去除后，对免疫反应结合上的荧光微球进行检测读数，避免了引入显色液进入芯片内部反应不充分或者显色后读数不及时的问题。

Description

基于微流控芯片的促甲状腺激素TSH试剂盒及制备和检测 方法

技术领域

本发明属于免疫检测领域，尤其是涉及一种基于微流控芯片的促甲状腺激素TSH检测试剂盒及其制备和检测方法。

背景技术

微流控芯片技术是以微管道网络为结构特征，采用微加工技术在几平方厘米大小的芯片上刻蚀出微管道网络和其它功能单元，从而制备出包含进样、反应、分离、检测于一体的快速、高效、低耗的微型分析装置。微流控芯片在检测平台中具有试剂消耗少，反应时间短，自动化程度高的特点。在目前的研究中，芯片的微型化却给前期样品分离和配套集成带来不少困难，同时在样品固定，洗脱等方面也存在不少问题。

微流控芯片检测主要有以下几点优势：

1)器件微小且没有对人为操作，试剂消耗量很少；

2)通过设计不同微流路实现在同一芯片中不同试剂的混合反应，减少繁琐的生物实验操作缩短检测所需时间；

3)微流控芯片可与电路接合实现自动化控制；

4)微流控芯片以及配套检测设备体积小巧，易于便携。

促甲状腺激素(TSH)是一种分子量为30kD的蛋白质，由二种亚单位组成。β亚单位携带TSH特异的免疫学和生物学信息；α亚单位携带种族特异性信息，与LH、FSH和hCG的α链上的某些氨基酸组成的肽段有一致性。

TSH在垂体前叶的特异性嗜碱细胞内生成。垂体释放TSH是机体发挥甲状腺素生理作用的中枢调节机制，刺激甲状腺素的生成和分泌，并有增生效应。

TSH检测是查明甲状腺功能的初筛试验。游离甲状腺浓度的微小变化就会带来TSH浓度向反方向的显著调整。因此，TSH是测试甲状腺功能的非常敏感的特异性参数，特别适合于早期检测或排除下丘脑-垂体-甲状腺中枢调节环路的功能紊乱。

一般来说，TSH浓度在甲状腺技能亢进的患者样本中较低，而在原发性甲状腺机能底下症状的样本中较高。

在中国专利文献CN104614521A中公开了一种微流控芯片，包括柔性聚合物层和基片，柔性聚合物层和基片键合在一起，所述芯片中设有微沟道系统，所述微沟道系统包括缓冲液入口、样品入口、磁珠入口、废液出口、微阀、微泵区、磁珠塞区、循环区及检测区。

上述技术方案采用灵敏度较低的比浊法，检测免疫磁珠和待测物之间的免疫反应所形成的络合物进行反应物前后的浊度变化，来进行判定待测物的浓度。相对而言，在采用免疫比浊这一方法学来说，由于不需要额外的配对抗体以及发光标记物，因此整体芯片结构设计较为简单。通过磁场在芯片沟道中形成的特定区域富集磁珠，样品持续通过此部分磁珠塞后与另一测磁珠结合，从而形成两个以上的磁珠团聚。

采用其他现有技术或(1)芯片的结构过于复杂，无法对反应做出精确的调控，清洗步骤以及液体传导存在较大的污染；或(2)使用了多个液体腔室和固相载体(磁珠以及荧光微球同时使用)，试剂整体设计过于复杂；或(3)免疫反应采用了非均相反应，意为固相载体与固相载体的表面进行反应，反应不充分，灵敏度和重复性受到限制。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种选取高灵敏度的时间分辨荧光物作为标记物，在荧光微球上进行抗体的标记，利用抗体对的免疫反应进行分析检测，所制备的试剂性能可达同等化学发光试剂的水平，免疫反应效率更高更充分的基于微流控芯片的促甲状腺激素TSH试剂盒的制备方法。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是，该基于微流控芯片的促甲状腺激素TSH试剂盒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)微流控芯片包被：取促甲状腺激素TSH抗体TSH beta antibody 10-T25B，加入至pH9.6的CB缓冲液中，按照单个芯片25μL加入微流控芯片的反应腔室内，温浴后对芯片进行清洗；

(2)荧光微球标记：取促甲状腺激素TSH抗体TSH beta antibody 10-T25C加入至荧光微球溶液中，并涡旋混匀，其中，荧光微球是经过活化处理的，反应结束后，加入终止液对反应进行终止，后离心清洗，加入封闭液进行封闭，封闭后的荧光微球进行离心清洗，使用微球储存液进行保存；

(3)微流控芯片组装：向微流控芯片的反应腔室预先进行封闭处理，封闭液添加后在烘箱中进行烘干处理，在封闭后的中层芯片背部反应腔室下部内加入所述步骤(2)中的荧光微球溶液，于真空烘箱中真空干燥，荧光微球在芯片中呈现小液滴形态，不发生扩散；

芯片准备完毕后采用超声键合的方式，依据芯片结构依次将滤血垫，加样密封垫，导电橡胶，吸水纸以及密封圈加入芯片内部，将三层芯片按照超声键合线完成合并；

(4)定标品的制备：定标品由A组分和B组分构成；

根据抗原浓缩液的估算浓度，用定标品稀释液将抗原浓缩液稀释作为定标品抗原母液备用；

定标品稀释液即为定标品A组分，浓度为0.5ng/mL，2-8℃保存；

定标品B组分：用定标品稀释液将促甲状腺激素TSH抗原母液稀释至2ng/mL，2-8℃保存；

(5)得基于微流控芯片的促甲状腺激素TSH试剂盒。

在本发明中，定标品稀释液主要为Tris-HCl的缓冲体系，浓度为50mM，pH8.5，包含牛血清、BSA、表面活性剂RPE1740、RPE2520以及叠氮钠；

在所述步骤(3)中，稀释标记促甲状腺激素TSH抗体TSH beta antibody 10-T25C微球，预先将微球水浴超声混匀，取20微升微球+80微升抽干保存液，混匀水浴超声，在封闭好的芯片下层反应槽正中间加5微升荧光微球溶液，真空干燥30min，将处理好的芯片组装起来，超声键合，最后铝箔袋保存并加入干燥剂。

在上述技术方案中，试剂基于微流控芯片作为载体，在微流控芯片内部的微流道反应器中进行免疫检测反应，单个芯片供单人份测试使用；制备得到的试剂盒进行检测，在手动加样后，仪器实现待测物在微流控芯片内的液体流动控制，免疫反应的调控以及反应结束后的清洗步骤，仪器通过收集荧光信号并计算出具体的反应值；该试剂早期检测或排除下丘脑-垂体-甲状腺中枢调节环路的功能紊乱；本发明技术方案制备得到的促甲状腺激素(TSH)试剂盒采用双抗体夹心法进行测定，一株抗TSH抗体预先包被在芯片中的特定位置上，另一株TSH抗体标记在荧光微球上，荧光微球抽干后以干燥状态密封放置在芯片内特定位置上。待测血样进入芯片内部后，溶解荧光微球，血样中的TSH组分分别与荧光微球以及包被抗体发生反应，待反应结束后清洗除去多余未结合的TSH和荧光微球，通过对芯片在360nm波长下激发，检测捕获的荧光微球在615nm下的荧光，测定其产生的荧光信号，以相对发光单位(RLU)进行表示。样本中的TSH浓度与仪器测定的RLU成反比关系，通过自动计算获得浓度值。

此外，上述制备方法中采用的微流控芯片为在中国专利文献CN107219360A中公布的技术方案，申请人在此予以引入；选取高灵敏度的时间分辨荧光物作为标记物，在荧光微球上进行TSH抗体的标记，利用抗体捕获血样中TSH以及包被抗体进行免疫反应形成复合物，通过对免疫复合物进行分析检测，所制备的试剂性能可达同等化学发光试剂的水平。反应采用均相反应，在微流控芯片腔室内通过超声混合，避免了单线程的层析流动反应，使得反应效率更高更充分。免疫反应后，使用清洗液将多余组分完全去除后，对免疫反应结合上的荧光微球进行直接检测读数，避免引入显色液进入芯片内部反应不充分或者显色后读数不及时等问题。

在微流控芯片的中层芯片中段固定荧光标记物，在下层芯片包被抗体，微流控芯片预先使用隔离缓冲液进行涂覆并烘干，在塑料芯片的表层形成一层保护膜后再加入荧光微球标记物，两者均通过烘干的方式固定在芯片内部，在加入样本以及稀释液后，可重新复溶并与待测物反应，而隔离组分(即封闭液)不参与反应，并且可放置荧光标记物以及免疫磁珠在烘干过程中保持生物活性，并避免与芯片发生非特异结合。

进一步的改进在于，在所述步骤(2)中，所述荧光微球活化处理的方法为：称取EDC使用Mes缓冲液配置成为1mg/mL的溶液，量取1mg羧基荧光微球，微球固型物含量为10mg/mL，体积即为100μL，置于EP管中，加入0.45mL Mes缓冲液稀释，从1mg/mL的EDC活化剂溶液中取5μL迅速加入微球溶液中，涡旋混匀，于超声清洗器中超声10min，后置于滚轴混匀器上震荡反应20min，总反应时间为30min。

进一步的改进在于，在所述步骤(3)中，所述封闭液还有2％BSA、0.5％Tween-20、10％海藻糖以及0.2％甘露醇。

进一步的改进在于，在所述步骤(3)中，封闭处理的方法为：向微流控芯片的反应腔室预先进行封闭处理，其中第二层芯片的背面反应腔室内需要添加6μL+6μL的封闭液进行封闭，第三层正面的反应腔室内，分别需要添加5μL+5μL+5μL的封闭液进行封闭。

进一步的改进在于，在所述步骤(3)中，所述微流控芯片为三片式结构，包括由上到下依次层叠的上层芯片、中层芯片以及下层芯片；上层芯片、中层芯片以及下层芯片两两之间均通过定位柱、定位孔配合连接的方式实现相互间的层叠。

本发明要解决的另一个问题是提供一种基于微流控芯片的促甲状腺激素TSH试剂盒，包括有微流控芯片，还包括有定标品，所述定标品由A组分和B组分构成，其中，定标品稀释液即为定标品A组分，浓度为0.5ng/mL；定标品B组分为用所述定标品稀释液促甲状腺激素TSH抗原母液稀释至2ng/mL；促甲状腺激素TSH抗体TSH beta antibody 10-T25C标记的荧光微球在所述微流控芯片内进行干燥处理；另一促甲状腺激素TSH抗体TSH betaantibody 10-T25B包被在微流控芯片反应腔内。

上述技术方案中的试剂盒即是采用本发明方法制备得到的基于微流控芯片的促甲状腺激素TSH试剂盒，促甲状腺激素TSH试剂盒采用双抗体夹心法进行测定，一株抗TSH抗体包被在微流控芯片反应腔内，作为固定相，另一株TSH抗体包被在荧光微球上。通过对免疫复合物进行分析检测。

本发明要解决的另一个问题是提供一种基于微流控芯片检测促甲状腺激素TSH的方法，采用前述的基于微流控芯片的促甲状腺激素TSH试剂盒的制备方法得到的试剂盒，包括以下步骤：

(1)移液器加样，吸取100μL的样本加入加样孔内，将微流控芯片进入检测仪器内，气路装置缓慢充气，推动样本往前移动，气体由透气口流出，液体在以PS为基材的微流控芯片内流入反应腔室内，样本接触反应舱室末端的导电橡胶，电容变化会触动，关闭流道阀门，同时关闭气路开关，停止加压；

(2)仪器开启超声装置，超声混匀3-10分钟，超声探头置于三层芯片底部，位于反应腔室的中间部分，避免直接超声对芯片包被抗体的影响，反应结束后气体推动样本进行向前移动，吹干加样孔和流道样本，清洗液路装置启动，进入反应腔室内，混匀1-3分钟，进行清洗；加样口处的气体推动清洗液继续进行移动，吹干反应腔室和流道液体；

(3)开启激发光源，对免疫反应结合固定的荧光微球进行测定，仪器读取芯片反应腔室的下面部分荧光强度，获得数据后通过计算并给出相应结果报告。

样本或样本稀释液通过加样口(微流控芯片的中层)进入微流控芯片内部，对加样口附加一定的压力，液体流入反应腔室后，预先接触烘干状态的荧光微球标记物，通过导电橡胶控制反应腔室内的液体总量，停止加样口的压力，对芯片的反应舱室进行超声处理，使得芯片上包被抗体与荧光微球标记物待测物质进行混合反应，反应时间在5-10分钟即可达到反应的平台期；反应结束后，通过微流控芯片的侧口对芯片内部注入清洗液，将多余的样本以及荧光标记物清洗至废液回收区，清洗后，再由芯片侧口注入一段空气，排除腔室内的清洗液；清洗步骤重复三次，待清洗结束后，直接对芯片进行激光激发检测，通过计算免疫反应结合上的荧光微球含量，推算出样本中待测物的含量，因此可以分析计算样本中待测物的浓度。

具体实施方式

下面结合本发明的实施方式进一步详细说明：

本发明的基于微流控芯片的促甲状腺激素TSH试剂盒，包括有微流控芯片，还包括有定标品，所述定标品由A组分和B组分构成，其中，定标品稀释液即为定标品A组分，浓度为0.5ng/mL；定标品B组分为用所述定标品稀释液促甲状腺激素TSH抗原母液稀释至2ng/mL；促甲状腺激素TSH抗体TSH beta antibody 10-T25C(生产厂家Fitzgerald，10-T25C)标记的荧光微球在所述微流控芯片内进行干燥处理；另一促甲状腺激素TSH抗体TSH betaantibody 10-T25B(生产厂家Fitzgerald，10-T25B)包被在微流控芯片反应腔内。

在本实施例中，上述基于微流控芯片的促甲状腺激素TSH试剂盒的制备方法，包括以下步骤：

(1)微流控芯片包被：

取促甲状腺激素(TSH)抗体TSH beta antibody 10-T25B 1mg，加50mM pH9.6的CB缓冲液至1mL，按照单个芯片25μL加入微流控芯片反应腔室内，温浴2小时后对芯片进行清洗；

对比了不同包被缓冲液在进行芯片包被时的性能分析，结果来看使用CB缓冲液进行包被时试剂的信噪比最高，因此选择使用CB缓冲液作为包被缓冲液，具体数据如下表1：

表1

(2)荧光微球标记：

称取EDC使用Mes缓冲液配置成为10mg/mL的溶液，后使用Mes缓冲液进一步稀释成为1mg/mL的溶液。使用200uL移液器量取1mg羧基荧光微球，微球固型物含量为10mg/mL，体积即为100μL。置于EP管中，加入0.45mL Mes缓冲液稀释。从1mg/mL的EDC活化剂溶液中取5μL迅速加入微球溶液中，涡旋混匀，与超声清洗器中超声10min，后置于滚轴混匀器上震荡反应20分钟，总反应时间为30min。此步骤产生的沉淀属于正常现象，通常在与目标抗体偶联后消失，活化比(微球比活化剂)为1:0.01。活化结束，不离心处理直接取促甲状腺激素(TSH)抗体TSH beta antibody 10-T25C(根据抗体浓度，质量与微球比为0.2:1)加入荧光微球溶液，并立刻涡旋混匀。反应5min后，微球产生较为明显的沉淀现象，使用探头超声，功率5W，超声3S，间隔3S。超声5min后，置于滚轴混匀反应2小时。反应结束，加入500μL终止液对反应进行终止，滚轴反应20min后离心清洗，加入0.5mL的封闭液进行封闭，封闭1小时。封闭后的微球，进行离心清洗，转速15000rpm，离心时间45min，清洗一次，以0.5mL的微球储存液进行保存。微球在使用前对其进行探头式超声重悬分散，超声功率为5％，超声时间10min，超声工作3S，暂停3S；

在本实施例中，使用下面三种不同的微球，测试6份不同浓度的样本，考察相关性等参数，具体数据如下表2：

表2

综上，Bangs微球100nm具有明显优于其他两种微球的功能，相关性达到0.9697，信噪比也较高，符合试剂盒开发的要求，因此选择Bangs微球100nm作为微球固型物。

(3)微流控芯片组装：

向微流控芯片的反应腔室预先进行封闭处理(封闭液含有2％BSA、0.5％Tween-20、10％海藻糖以及0.2％甘露醇)，其中第二层芯片的背面反应腔室内需要添加6μL+6μL的封闭液进行封闭，第三层正面的反应腔室内，分别需要添加5μL+5μL+5μL的封闭液进行封闭。封闭液添加后在45℃烘箱中进行烘干处理5min，在封闭后的第二层芯片背部反应腔室下部内加入5μL的荧光微球溶液，于45℃真空烘箱中真空干燥30min，荧光微球在芯片中呈现小液滴形态，不发生扩散；

芯片准备完毕后采用超声键合的方式，依据芯片结构依次将滤血垫，加样密封垫，导电橡胶，吸水纸以及密封圈加入芯片内部，将三层芯片按照超声键合线完成合并。

(4)定标品的制备

根据抗原浓缩液的估算浓度，用定标品稀释液将抗原浓缩液稀释至一定浓度(如500ng/mL)，作为定标品抗原母液备用。抗原母液-20℃以下保存，有效期十二个月。

取定标品抗原母液，将其用定标品稀释液以一定的稀释比例稀释，稀释比例至少为2个以上(如稀释比例为1:10，1:100)。将上述配制好的两个促甲状腺激素(TSH)定标品抗原母液稀释度用参比体系的试剂进行定值或上一批次促甲状腺激素(TSH)校准品建立的曲线测定定标品抗原母液各稀释度的促甲状腺激素(TSH)浓度，测定至少复孔，将结果乘以各自的稀释倍数后得出各自的定标品抗原母液浓度，将所有定标品抗原母液浓度结果取平均值后得到定标品抗原母液的估算浓度。

定标品A的制备：

定标品稀释液即为定标品A，浓度为0.5ng/mL，2-8℃保存。

定标品B的制备：

用定标品稀释液将促甲状腺激素(TSH)抗原母液稀释至2ng/mL，2-8℃保存。

在本实施例中，定标品稀释液主要为Tris-HCl的缓冲体系，浓度为50mM，pH8.5，包含牛血清、BSA、表面活性剂RPE1740、RPE2520以及叠氮钠；

在所述步骤(3)中，稀释标记促甲状腺激素(TSH)抗体TSH beta antibody 10-T25C微球，预先将微球水浴超声混匀，取20微升微球+80微升抽干保存液，混匀水浴超声，在封闭好的芯片下层反应槽正中间加5微升荧光微球溶液，真空干燥30min，将处理好的芯片组装起来，超声键合，最后铝箔袋保存并加入干燥剂。

基于微流控芯片检测促甲状腺激素(TSH)的方法，采用上述方法制备得到的试剂盒，具体的有：

移液器加样，吸取100μL的样本加入加样孔内，将芯片进入检测仪器内，气路装置缓慢充气，推动样本往前移动，气体由透气口流出，液体在以PS为基材的芯片内流入反应腔室内。样本接触反应舱室末端的导电橡胶，电容变化会触动，关闭流道阀门，同时关闭气路开关，停止加压；

仪器开启超声装置，超声混匀3-10分钟，超声探头置于三层芯片底部，位于反应腔室的中间部分，避免直接超声对芯片包被抗体的影响。反应结束后气体推动样本进行向前移动，吹干加样孔和流道样本，清洗液路装置启动，进入反应腔室内，混匀1-3分钟，进行清洗；加样口处的气体推动清洗液继续进行移动，吹干反应腔室和流道液体。最后开启激发光源，对免疫反应结合的荧光微球进行测定。仪器读取芯片反应腔室的下面部分荧光强度，获得数据后通过计算并给出相应结果报告。

在本实施例中，使用微流控芯片作为检测平台，进行了促甲状腺激素(TSH)项目的检测，与免疫层析平台的促甲状腺激素(TSH)项目对比，检测试剂的灵敏度有极大的提高，并且由于在免疫反应采用了均相的反应体系，避免层析释放不均匀以及反应线性单一的问题，在检测准确度上有了极大的改善；将荧光微球标记抗体试剂在芯片内进行干燥存放，采用了独有的隔离缓冲液组分，可以有效隔断液体试剂，使其不易发生随意的流动，同时在加入样本以及稀释液时可以迅速溶解并保持原有的生物活性。隔离缓冲液同时还起到防止荧光标记物在芯片内的吸附的作用，荧光标记物由于不直接与芯片接触，因此降低了非特异性的吸附。

使用了探头超声作为微流控芯片的混匀方法，超声作用于芯片的左侧方，在不影响芯片的光洁度的光学性能前提上，超声的能量传递又将在反应腔室内将荧光微球标记抗体进行复溶并反应，在单一腔室内单一液体的反应保证了无交叉污染。超声处理的作用可将免疫反应的效率大大的提高，由常规反应的30分钟或以上降低至5-10分钟即达反应的平台期。

在微流控芯片上使用了侧路清洗以及添加增强液的加样模式，使用密封垫圈，在保证侧口不发生漏液的前提下，通过外压将清洗液或者增强液注入反应芯片腔室内部的方法，一方面简化了芯片的结构，避免芯片内出现多个腔室，另一方面对微流控芯片内的反应腔室起到充分清洗的作用，避免了液体的回流以及样本的污染；采用时间分辨荧光作为荧光标示物，检测信号相较传统的免疫检测试剂有了极大的提高，芯片反应腔室的设计采用透明的光学器件，可以有效的检测光信号，且荧光分子稳定存在，不受时间和激发次数的影响。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征及优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims (7)

1.一种基于微流控芯片的促甲状腺激素TSH试剂盒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)微流控芯片包被：取促甲状腺激素TSH抗体TSH beta antibody 10-T25B，加入至pH9.6的CB缓冲液中，按照单个芯片25μL加入微流控芯片的反应腔室内，温浴后对芯片进行清洗；

(2)荧光微球标记：取促甲状腺激素TSH抗体TSH beta antibody 10-T25C加入至荧光微球溶液中，并涡旋混匀，其中，荧光微球是经过活化处理的，反应结束后，加入终止液对反应进行终止，后离心清洗，加入封闭液进行封闭，封闭后的荧光微球进行离心清洗，使用微球储存液进行保存；

(3)微流控芯片组装：向微流控芯片的反应腔室预先进行封闭处理，封闭液添加后在烘箱中进行烘干处理，在封闭后的中层芯片背部反应腔室下部内加入所述步骤(2)中的荧光微球溶液，于真空烘箱中真空干燥，荧光微球在芯片中呈现小液滴形态，不发生扩散；

芯片准备完毕后采用超声键合的方式，依据芯片结构依次将滤血垫，加样密封垫，导电橡胶，吸水纸以及密封圈加入芯片内部，将三层芯片按照超声键合线完成合并；

(4)定标品的制备：定标品由A组分和B组分构成；

根据抗原浓缩液的估算浓度，用定标品稀释液将抗原浓缩液稀释作为定标品抗原母液备用；

定标品稀释液即为定标品A组分，浓度为0.5ng/mL，2-8℃保存；

定标品B组分：用定标品稀释液将促甲状腺激素TSH抗原母液稀释至2ng/mL，2-8℃保存；

(5)得基于微流控芯片的促甲状腺激素TSH试剂盒。

2.根据权利要求1所述的基于微流控芯片的促甲状腺激素TSH试剂盒的制备方法，其特征在于，在所述步骤(2)中，所述荧光微球活化处理的方法为：称取EDC使用Mes缓冲液配置成为1mg/mL的溶液，量取1mg羧基荧光微球，微球固型物含量为10mg/mL，体积即为100μL，置于EP管中，加入0.45mL Mes缓冲液稀释，从1mg/mL的EDC活化剂溶液中取5μL迅速加入微球溶液中，涡旋混匀，于超声清洗器中超声10min，后置于滚轴混匀器上震荡反应20min，总反应时间为30min。

3.根据权利要求1所述的基于微流控芯片的促甲状腺激素TSH试剂盒的制备方法，其特征在于，在所述步骤(3)中，所述封闭液还有2％BSA、0.5％Tween-20、10％海藻糖以及0.2％甘露醇。

4.根据权利要求3所述的基于微流控芯片的促甲状腺激素TSH试剂盒的制备方法，其特征在于，在所述步骤(3)中，封闭处理的方法为：向微流控芯片的反应腔室预先进行封闭处理，其中第二层芯片的背面反应腔室内需要添加6μL+6μL的封闭液进行封闭，第三层正面的反应腔室内，分别需要添加5μL+5μL+5μL的封闭液进行封闭。

5.根据权利要求1所述的基于微流控芯片的促甲状腺激素TSH试剂盒的制备方法，其特征在于，在所述步骤(3)中，所述微流控芯片为三片式结构，包括由上到下依次层叠的上层芯片、中层芯片以及下层芯片；上层芯片、中层芯片以及下层芯片两两之间均通过定位柱、定位孔配合连接的方式实现相互间的层叠。

6.一种基于微流控芯片的促甲状腺激素TSH试剂盒，包括有微流控芯片，其特征在于，还包括有定标品，所述定标品由A组分和B组分构成，其中，定标品稀释液即为定标品A组分，浓度为0.5ng/mL；定标品B组分为用所述定标品稀释液促甲状腺激素TSH抗原母液稀释至2ng/mL；促甲状腺激素TSH抗体TSH beta antibody 10-T25C标记的荧光微球在所述微流控芯片内进行干燥处理；另一促甲状腺激素TSH抗体TSH beta antibody 10-T25B包被在微流控芯片反应腔内。

7.一种基于微流控芯片检测促甲状腺激素TSH的方法，其特征在于，采用权利要求1-5任一项所述的基于微流控芯片的促甲状腺激素TSH试剂盒的制备方法得到的试剂盒，包括以下步骤：

(1)移液器加样，吸取100μL的样本加入加样孔内，将微流控芯片进入检测仪器内，气路装置缓慢充气，推动样本往前移动，气体由透气口流出，液体在以PS为基材的微流控芯片内流入反应腔室内，样本接触反应舱室末端的导电橡胶，电容变化会触动，关闭流道阀门，同时关闭气路开关，停止加压；

(2)仪器开启超声装置，超声混匀3-10分钟，超声探头置于三层芯片底部，位于反应腔室的中间部分，避免直接超声芯片对包被抗体的影响，反应结束后气体推动样本进行向前移动，吹干加样孔和流道样本，清洗液路装置启动，进入反应腔室内，混匀1-3分钟，进行清洗；加样口处的气体推动清洗液继续进行移动，吹干反应腔室和流道液体；

(3)开启激发光源，对免疫反应结合固定的荧光微球进行测定，仪器读取芯片反应腔室的下面部分荧光强度，获得数据后通过计算并给出相应结果报告。