CN105866404A - 基于膜材料的微流控芯片 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种微流控芯片,尤其涉及一种基于膜材料的微流控芯片;包括依次相互连通的加样口、流体通道、检测区和液体收集区,其中,流体通道用于将自加样口添加的样本在毛细作用下输送至检测区,检测区内设置有用于对样本进行侧向层析检测的检测膜,液体收集区内设置有用于吸收多余样本的收集装置,检测膜的一端与流体通道相接、另一端与收集装置相接;本发明的基于膜材料的微流控芯片,有效提高侧向层析技术的精密度及准确度。
Description
技术领域
本发明涉及一种微流控芯片,尤其涉及一种基于膜材料的微流控芯片。
背景技术
微流控芯片又称芯片实验室(Lab-on-a-Chip),是一种微型全分析系统(μ-TAS),它是一种操控微小体积的流体在微小通道或构件中流动的系统,涉及到物理、化学、生物等多个基础学科领域。它以微流控技术为基础,制备出小尺度(从微米到纳米)的通道、腔、阀、泵等器件,并利用各种物理手段研究小尺度上器件的特异性质,发展小尺度控制流体运动和物理化学变化。现有的微流控芯片技术主要驱动力为压力驱动、电渗驱动、离心驱动等,需要借助外力对芯片内物质进行控制,无法实现自主流动。
侧向层析技术(lateral flow)起源于二十世纪七十年代,探索于八、九十年代,进入二十一世纪后开始逐步步入成熟期。目前侧向层析技术是全球体外诊断产业(IVD)的热点之一,因其简便快速准确等诸多优点,在多个检测等各个领域迅猛发展。但是侧向层析技术没有较好的控制手段,没有办法整合芯片精度级别结构,这限制了侧向层析技术在精密度及准确度上的提升。
有鉴于侧向层析技术的上述缺陷,本设计人,积极加以研究创新,以期结合微流控芯片技术和侧向层析技术,创设一种新型结构的基于膜材料的微流控芯片,使其更具有产业上的利用价值。
发明内容
为解决上述技术问题,本发明的目的是提供一种有效提高侧向层析技术的精密度及准确度的基于膜材料的微流控芯片。
本发明的基于膜材料的微流控芯片,包括依次相互连通的加样口、流体通道、检测区和液体收集区,其中,所述流体通道用于将自加样口添加的样本在毛细作用下输送至检测区,所述检测区内设置有用于对样本进行侧向层析检测的检测膜,所述液体收集区内设置有用于吸收多余样本的收集装置,所述检测膜的一端与所述流体通道相接、另一端与所述收集装置相接。
进一步的,还包括分散流道,所述分散流道设置在流体通道的出口侧,所述分散流道用于将样本分散后输送至所述检测膜。
具体的,所述分散流道包括沿液体流动方向上开口逐渐增大的主流道、以及设置在主流道内的多个隔水柱,所述隔水柱的数量沿液体流动方向逐渐增加。
具体的,所述主流道的深度沿液体流动方向逐渐变小,所述隔水柱的顶面与所述主流道的顶面齐平。
进一步的,所述检测膜包括多个相互独立对样本进行侧向层析检测的检测膜片,所述液体通道中包括分流结构,所述分流结构用于将样本分流后分别输送至各个检测膜片。
具体的,所述分流结构包括至少一级多通通道,所述多通通道包括位于液体流动方向前侧的前通道、以及位于液体流动方向后侧的且连接在前通道后端的至少两个后通道。
进一步的,所述液体通道中包括混匀结构,所述混匀结构用于将样本混合均匀后输送至检测区。
具体的,所述混匀结构为直线混匀槽道、S型混匀槽道或圆型混匀槽道,其中,所述S型混匀槽道为呈S型排布的毛细管槽;所述圆型混匀槽道包括前毛细槽道和后毛细槽道,所述前毛细槽道的后段与后毛细槽道的前段相互并排并呈螺旋形排布、并且前毛细槽道的后端与后毛细槽道的前端相连。
具体的,所述前毛细槽道的后端与后毛细槽道的前端的连接处设置有混匀腔,所述混匀腔内设置有圆柱形的混匀柱。
进一步的,所述加样口还设置有芯片转接头。
进一步的,还包括芯片上片和芯片下片,所述加样口和流体通道设置在所述芯片上片上,所述检测区和液体收集区设置在所述芯片下片上,所述芯片上片密封在所述芯片下片顶面。
具体的,所述芯片上片和芯片下片为聚甲基丙烯酸甲酯芯片、环烯烃共聚物、或聚碳酸酯材质的芯片上片和芯片下片。
进一步的,所述流体通道的出口侧叠加在所述检测区一侧的上方。
进一步的,所述检测区为槽状主体,所述检测膜设置在所述槽状主体内,所述检测膜为通过浇注、3D打印或静电纺丝而成的硝酸纤维素检测膜、表面改性的硝基纤维素膜、再生纤维素膜或尼龙膜。
进一步的,所述收集装置为吸水材料,例如吸水纸。
借由上述方案,本发明至少具有以下优点:1)采用微流控芯片和膜材料结合的方法。通过在微流控芯片中制作膜材料多孔结构做为反应区,不再使用外原动力作为反应动力源,实现芯片上的自主流动反应体系;2)实现了检测膜上的多通道同时检测,降低了不同检测项目之间的干扰因素;也可以实现在多通道中检测同一个项目,计算检测结果的平均值,大幅度提高了结果的精密度;3)本发明制备的检测试剂检测仪器设计简单,操作简单,无需专业操作人员;检测快速,10~20分钟即可得到检测结果;试剂盒储存方便。
上述说明仅是本发明技术方案的概述,为了能够更清楚了解本发明的技术手段,并可依照说明书的内容予以实施,以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后。
附图说明
图1是本发明的结构示意图;
图2是本发明芯片上片和芯片下片的组装图;
图3是本发明芯片上片的结构示意图;
图4是本发明中芯片转接头俯视的结构示意图;
图5是本发明中芯片转接头仰视的结构示意图;
图6是本发明中S型混匀槽道的结构示意图;
图7是本发明中第一种圆型混匀槽道的结构示意图;
图8是本发明中第二种圆型混匀槽道的结构示意图;
图9是本发明中分流结构的结构示意图;
图10是本发明中分散流道的结构示意图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例,对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明,但不用来限制本发明的范围。
实施例一
参见图1,本发明一较佳实施例的基于膜材料的微流控芯片,包括依次相互连通的加样口1、流体通道2、检测区3和液体收集区4,其中,流体通道2用于将自加样口添加的样本在毛细作用下输送至检测区,检测区3内设置有用于对样本进行侧向层析检测的检测膜,液体收集区4内设置有用于吸收多余样本的收集装置,检测膜的一端与流体通道相接、另一端与收集装置相接。应当说明的是,本发明的基于膜材料的微流控芯片,其与现有技术的主要区别点在于采用微流控技术,使样本液体在毛细作用下自主流动,不再使用外原动力作为反应动力源,实现芯片上的自主流动反应体系,不仅定量、稳定,而且检测准确性较高。
对于前述微流控芯片,可以通过多种方式实现,例如采用激光烧制孔道的方式制成流体通道,或者采用注塑的方式制作芯片,或者如图2和图3所示,采用芯片上片5和芯片下片6的分体式设计,然后通过激光、热压或蚀刻的方式分别在芯片上片和芯片下片成型微流控结构,如加样口1和流体通道2设置在芯片上片5上,检测区3和液体收集区4设置在芯片下片6上,然后将芯片上片5封装在芯片下片6的顶面。附图2和3中,并未对液体收集区做进一步说明。
为了使流体通道流出的样本稳定均匀地流至检测区,避免流体通道2与检测区3接触不良导致的断流问题,流体通道2的出口侧叠加在检测区3一侧的上方;应当说明的是,检测膜可以设置为如硝酸纤维素试纸的多种侧向层析试纸,然而试纸需要切条后夹装在芯片上片和芯片下片之间,存在安装不稳定的问题,也可将检测区3设置为槽状主体,将检测膜设置在槽状主体内,而检测膜为通过浇注、3D打印或静电纺丝而成的硝酸纤维素检测膜、表面改性的硝基纤维素膜、再生纤维素膜或尼龙膜,检测膜上可设置有检测线301和控制线302。
为了实现芯片上片和芯片下片的稳定固定连接,可将其设置为硬质的聚甲基丙烯酸甲酯、环烯烃共聚物、或聚碳酸酯芯片材质的芯片上片和芯片下片,而芯片上片与芯片下片之间的封装形式,可采用胶装、卡装、夹装等多种方式中的一种,也可相互配合使用;其中,胶装可采用双面胶、热固化胶、光固化胶等方式,卡装可采用在芯片上片和芯片下片上分别设置相互配合的卡件和卡槽以卡装固定,夹装可采用单独配置的夹具,将芯片上片和芯片下片夹装固定。
应当说明的是,收集装置的作用在于吸收来自检测膜的多余样本,一方面可以避免液体堆积在检测膜上阻碍检测效果,另一方面提供液体自流动的动力,收集装置通过毛细作用、吸水作用或其它具有吸附液体功能的装置如多孔结构等来实现样本吸附;凡是能够实现这一功能的收集装置均应落入本发明的保护范围,较为简单的,为了降低生产加工成本,可以将收集装置设置为吸水材料,例如吸水纸。
另外,为了方便本发明的微流控芯片与其他芯片相接使用,如图4和图5所示,加样口1还设置有芯片转接头7,该芯片转接头7可以通过插接的方式实现芯片和芯片之间的流道连接,并在侧面设置螺纹或环状突起/凹陷,用于与其它芯片上的相应结构匹配,以实现位置固定。
应当说明的是,液体通道的作用在于将将自加样口添加的样本在毛细作用下输送至检测区,然而该过程中涉及到加样的样本混合均匀、分流、分散注入检测膜等问题。因而,液体通道中还包括混匀结构,混匀结构用于将样本混合均匀后输送至检测区。应当说明的是,凡是能够实现样本混匀的微流控结构,均应落入本发明的保护范围,具体可以如图6所示,混匀结构设置为S型混匀槽道,或者如图7和图8所示,设置为圆型混匀槽道,也可简单设置为直线混匀槽道,其中,S型混匀槽道为呈S型排布的毛细管槽201,利用液体在细弯管中过弯路径不一样引发液体内部搅动,以实现混匀;圆型混匀槽道包括前毛细槽道202和后毛细槽道203,前毛细槽道202的后段与后毛细槽道203的前段相互并排并呈螺旋形排布、并且前毛细槽道的后端与后毛细槽道的前端相连;圆型混匀槽道同样利用液体在细弯管中过弯路径不一样引发液体内部搅动,以实现混匀,然而过弯角度和长度大于S型混匀槽道,混匀效果较好。
为了进一步提高混匀效果,如图7所示,前毛细槽道202的后端与后毛细槽道203的前端的连接处设置有混匀腔204,混匀腔204内设置有圆柱形的混匀柱205,通过在中心区域形成对流以增加混合的效果。
应当说明的是,检测膜可以单通道对样本进行检验,也可实现多通道对样本进行检验,即检测膜包括多个相互独立对样本进行侧向层析检测的检测膜片,相应的,如图9所示,液体通道中包括分流结构206,分流结构206用于将样本分流后分别输送至各个检测膜片,实现了检测膜上的多通道同时检测,降低了不同检测项目之间的干扰因素;也可以实现在多通道中检测同一个项目,计算检测结果的平均值,大幅度提高了结果的精密度。
分流结构206包括至少一级多通通道,多通通道包括位于液体流动方向前侧的前通道、以及位于液体流动方向后侧的且连接在前通道后端的至少两个后通道;如图3所示,包括一级多通通道,每一个多通通道包括一个前通道和三个后通道,实现样本单通道分为3通道,可在3个通道内对样本进行检测;如图9所示,还可包括两级多通通道,每一个多通通道包括一个前通道207和两个后通道208,实现样本单通道分为4通道,可在4个通道内对样本进行检测。
为了提高液体分散流入检测膜的效果,如图10所示,还包括分散流道209,分散流道209设置在流体通道的出口侧,分散流道209用于将样本分散后输送至检测膜。分散流道209包括沿液体流动方向上开口逐渐增大的主流道210、以及设置在主流道内的多个菱形的隔水柱211,隔水柱211的数量沿液体流动方向逐渐增加;由于主通道内的流量有限,为了均匀化分散主通道内的样本,主流道的深度沿液体流动方向逐渐变小,隔水柱的顶面与主流道的顶面齐平。
应当说明的是,为了保证分散流道出口处齐平,出口处的隔水柱设置为三角形,而主通道内隔水柱211的数量,并不做进一步的限定;若菱形隔水柱的数量为零,则在出口处设置1至2个三角形的隔水柱即可,使样本液体有更多的表面积接触检测膜,更快更均匀的让检测膜接触吸收样本液体。
实施例二
本发明提供一种前述基于膜材料的微流控芯片的制备方法,包括以下步骤:
S1、芯片制备:将芯片上片和芯片下片加工成如图1至图10所示的结构;
S2、检测膜制备:将膜材料原料浇注到检测区中,定型后去除掉多余的易挥发成分,形成用于检测检测膜;
S3、流道加工:在软件上设计流道需要被灼烧去除的部分,使用激光根据设计在检测膜上加工出流道,形成多个检测膜片;
S4、探针制备:将侧向层析检测过程中所需抗体偶联到荧光蛋白;
S5、免疫试剂制备:将所需抗体或抗原分别包被在层析试纸的检测线和控制线上,干燥烘干;
S6、键合:将经过上述加工的芯片下片和芯片上片键合到一起,形成完整的检测芯片。
S7、样品稀释液制备:若检测样本为血液,则样品稀释液为含有牛血清白蛋白、蛋白保护剂、表面活性剂和防腐剂的缓冲液;
S8、样品检验:将血清样品与冻干探针混合分散一段时间后,取出一定量加入样品稀释液中,待混合均匀后滴加至免疫层析试纸条上进行免疫层析反应;随后在荧光检测器下采用与两种荧光胶乳微粒相对应的两种发射光波长进行荧光检测。检测用荧光检测器,包含激发检测模块、前置放大模块、控制分析模块以及软件系统。其中激发检测模块的光源为发射波长为300~500nm的发光二极管,前置放大模块为一前置放大电路。
上述步骤S1中,所用的芯片上片和芯片下片是使用聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、环烯烃共聚物、或聚碳酸酯等材料,在PS底板上通过吹塑等方式加工制备而成,然后使用机械加工、激光加工,亲水处理等方式按图样加工出流体通道等微观结构。
上述步骤S2中,采用乙醇、丙酮、或二甲基亚砜等有机溶剂,溶解硝酸纤维素等膜纤维材料,然后浇注在检测区内,待定型后挥发掉有机溶剂,使膜材料固定成约200ul厚多孔结构。
上述步骤S3中,流道加工使用的是激光、热压、蚀刻等方式去多余的膜材料;若使用激光,其使用能量为1W~50W。具体而言,将所需加工分割的流道在激光加工画图软件中画出,用试片估计加工位置,将加工定型后的芯片固定在CO2激光工作台面的加工位置上,调整激光加工强度为10w,开启激光加工,灼烧掉多余部分,使检测膜形成多个检测膜片,即实现多通道。
实施例三
本发明提供一种实施例一所述的基于膜材料的微流控芯片的使用方法。本实施例采用常规单克隆抗体技术制备的肌红蛋白单克隆抗体,在检测膜的靠后区域分别固定肌红蛋白抗体及兔IgG形成检测线和控制线,同时将结合不同抗原表位的肌红蛋白单克隆抗体和羊抗兔IgG与荧光微球(直径200nm)进行偶联作为探针溶液,然后利用双抗体夹心法检测样本中的肌红蛋白抗原,检测待测液体样品中的肌红蛋白的含量。
具体步骤如下:
S1、探针制备
1)取500μl发射光波长为550nm到700nm的荧光胶乳微粒溶液(含羧基)用pH6.0 MES缓冲液洗涤离心分离三次后,沉淀用pH6.0 MES缓冲液稀释,加入10mg EDC混匀后,在室温下反应活化30min,离心分离后,沉淀继续用pH6.0MES缓冲液洗涤三遍,随后沉淀用pH6.0 MES缓冲液稀释,加入125μg肌红蛋白抗体,室温下反应3h,加入BSA封闭,继续反应30min,离心后沉淀用pH7.4PBS缓冲液洗涤四次,得到标记有荧光胶乳微粒的肌红蛋白抗体沉淀,同理可以得到标记有荧光胶乳微粒的羊抗兔IgG沉淀,将沉淀重悬在500μl pH7.4 PBS缓冲液中,加入15μl proclin,在4℃下保存。
2)将偶联有肌红蛋白抗体的胶乳微粒与偶联有羊抗兔IgG的胶乳微粒按体积比1:6混合得到混合胶乳微粒,混合胶乳微粒与50倍体积的5%硅藻糖水溶液漩涡混合,得到探针溶液,取30μl探针溶液加入到500μl冻存管中,密封保存在4℃冰箱。
S2、芯片制作
采用实施例二的方法加工制备微流控芯片,检测膜被加工为3个检测膜片,即3通道同时检测。
分别将与荧光胶乳微粒标记的肌红蛋白抗体位于不同表位另一株肌红蛋白抗体和兔IgG用包被液分别配制成0.5mg/ml和1mg/ml的抗体包被液。将肌红蛋白抗体包被液和兔IgG包被液以1μl/cm的线速包被在3个检测膜片上对应的检测线和控制线上,检测线和控制线间隔8mm,在湿度<30%条件下37℃烘干1h。
S3、样品稀释液配制
取0.01M pH8.5的PBS缓冲液1L,加入9.3g吐温20,15g抗体保护剂,6.1g牛血清白蛋白和0.19g叠氮钠,超声直至固体全部溶解,混匀。
S4、样本检测
1)工作原理
使用时,将血清样品加入到稀释液中,混合均匀后加入到加样口中即可;随后在荧光检测器下采用与荧光胶乳微粒相对应的发射光波长进行荧光检测。混合液体中肌红蛋白与标记有荧光胶乳微粒的肌红蛋白抗体碰撞结合形成复合物,其中的复合物继续顺着硝酸纤维素膜渗透到检测线上,与固定在检测线上的肌红蛋白抗体形成双抗体夹心的新复合物,检测线上的肌红蛋白抗体与探针中的肌红蛋白抗体,其在肌红蛋白上的表位不同;剩余的抗原-荧光标记的抗体复合物、未结合的标记有荧光胶乳微粒的所需项目抗体、以及标记有荧光胶乳微粒的羊抗兔IgG继续渗透到控制线,标记有荧光胶乳微粒的羊抗兔IgG会与控制线上固定的兔IgG结合形成抗原-抗体复合物;荧光检测器下荧光检测时,仅在控制线上检测到信号,才能证明检测结果是有效的。
2)线性、检测限和精密度评估:
采用阴性牛血清作为稀释液,将肌红蛋白标准品配制成浓度为300、270、240、210、180、150、120、90、60、30和0ng/ml的标准品溶液,取标准品100μl与100μl样品稀释液加入到含有冻干探针的冻存管中,吹打15次后取100μl加入到加样孔中,15分钟后采用荧光检测器检测。结果表明,线性的相关系数r^2大于0.99,检测限为0.60ng/ml,各浓度的检测变异系数均小于8%。各检测膜片的重复性较高。
3)线性参数的验证:
采用低值人血清和高值人血清,配制浓度为300、240、180、120、60ng/ml的肌红蛋白人血清溶液,每个样本重复4次,同时3个检测膜片作为3次重复试验,结果表明,r^2大于0.99,最高检测范围可达到300ng/ml。
4)准确度的评估
采用肌红蛋白浓度为10ng/ml的人血清样本作为基础样本,加入同体积不同浓度的肌红蛋白标准物人血清,配制成浓度为200、67、30ng/ml的肌红蛋白人血清溶液;另一份样本加入相同体积的阴性人血清,对回收样本和基础样本进行4次重复检测分析,同时3个检测膜片作为3次重复试验,进行计算。结果表明,回收率在95%—105%范围内。
应当说明的是,上述步骤S1探针制备中,根据不同检测情况,实验过程可相应调整,具体如下:
a)将荧光胶乳微粒溶液按1:5~5:1比例混合,混合均匀后加入活化剂1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐室温下反应0.5~2h,其中,1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐与荧光胶乳微粒的重量比为0.5:100~5:100。
b)需偶联抗体与活化荧光胶乳微粒的混合比例为0.5:100~5:100,混合后室温下偶联反应2~5h;
c)按1:3~1:6的比例混合待检抗体荧光胶乳微粒和质控抗体荧光胶乳微粒,得到混合荧光胶乳微粒,将混合荧光胶乳微粒用含糖量5~30%的硅藻糖水溶液稀释10~50倍。
应当说明的是,上述步骤S3样品稀释液配制中,根据不同检测情况,实验过程可相应调整,具体如下:
若检测样本为血样,样品稀释液通常含有缓冲液、牛血清白蛋白、蛋白保护剂、表面活性剂和防腐剂;其中,缓冲液包括PBS缓冲液、检测ris缓冲液、甘氨酸缓冲液、MES缓冲液、HEPES缓冲液中的一种或几种,表面活性剂为吐温20、吐温80、曲拉通X-100或聚乙二醇,防腐剂为叠氮钠或procline。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,并不用于限制本发明,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明技术原理的前提下,还可以做出若干改进和变型,这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种基于膜材料的微流控芯片,其特征在于:包括依次相互连通的加样口、流体通道、检测区和液体收集区,其中,所述流体通道用于将自加样口添加的样本在毛细作用下输送至检测区,所述检测区内设置有用于对样本进行侧向层析检测的检测膜,所述液体收集区内设置有用于吸收多余样本的收集装置,所述检测膜的一端与所述流体通道相接、另一端与所述收集装置相接。
2.根据权利要求1所述的基于膜材料的微流控芯片,其特征在于:还包括分散流道,所述分散流道设置在流体通道的出口侧,所述分散流道用于将样本分散后输送至所述检测膜。
3.根据权利要求2所述的基于膜材料的微流控芯片,其特征在于:所述分散流道包括沿液体流动方向上开口逐渐增大的主流道、以及设置在主流道内的多个隔水柱,所述隔水柱的数量沿液体流动方向逐渐增加。
4.根据权利要求1所述的基于膜材料的微流控芯片,其特征在于:所述检测膜包括多个相互独立对样本进行侧向层析检测的检测膜片,所述液体通道中包括分流结构,所述分流结构用于将样本分流后分别输送至各个检测膜片。
5.根据权利要求4所述的基于膜材料的微流控芯片,其特征在于:所述分流结构包括至少一级多通通道,所述多通通道包括位于液体流动方向前侧的前通道、以及位于液体流动方向后侧的且连接在前通道后端的至少两个后通道。
6.根据权利要求1所述的基于膜材料的微流控芯片,其特征在于:所述液体通道中包括混匀结构,所述混匀结构用于将样本混合均匀后输送至检测区。
7.根据权利要求6所述的基于膜材料的微流控芯片,其特征在于:所述混匀结构为直线混匀槽道、S型混匀槽道或圆型混匀槽道,其中,所述S型混匀槽道为呈S型排布的毛细管槽;所述圆型混匀槽道包括前毛细槽道和后毛细槽道,所述前毛细槽道的后段与后毛细槽道的前段相互并排并呈螺旋形排布、并且前毛细槽道的后端与后毛细槽道的前端相连。
8.根据权利要求1所述的基于膜材料的微流控芯片,其特征在于:还包括芯片上片和芯片下片,所述加样口和流体通道设置在所述芯片上片上,所述检测区和液体收集区设置在所述芯片下片上,所述芯片上片密封在所述芯片下片顶面。
9.根据权利要求8所述的基于膜材料的微流控芯片,其特征在于:所述流体通道的出口侧叠加在所述检测区一侧的上方。
10.根据权利要求8所述的基于膜材料的微流控芯片,其特征在于:所述检测区为槽状主体,所述检测膜设置在所述槽状主体内,所述检测膜为通过浇注、3D打印或静电纺丝而成的硝酸纤维素检测膜、表面改性的硝基纤维素膜、再生纤维素膜或尼龙膜。
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