CN105339794B - 用于检测光度测定法的前带效应的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供用于通过光度测定法测定可以显示前带效应的样品中特定分析物的量的方法，其中所述特定分析物从所述分析物与分析物特异性测定试剂相互作用之后反应混合物的光信号变化来定量。对于待测定样品中的特定分析物，经完整反应时间，在用于测定分析物的波长和至少在用于检测前带效应的额外特定波长，同时测量光信号。通过使用在用于检测前带效应的波长获得的信号来计算反应速率比率R。通过计算比率值R与预定限值的比较，判断样品中是否存在前带效应。

Description

用于检测光度测定法的前带效应的方法
发明领域
本发明涉及用于通过光度、浊度或比浊免疫测定法组合判断是否存在前带效应来测定样品中特定分析物的量的方法，其中所述特定分析物从所述分析物与分析物特异性测定试剂相互作用之后反应混合物的光信号变化来定量。
均匀免疫测定法的特征在于无分离和洗涤步骤的程序。由于其简单的一步程序，成本有效和速度均匀，免疫测定法在临床实验室中享受高的知名度，且通常用于高度自动化的临床化学分析仪上的临床诊断。
然而，均匀免疫测定法受高剂量Hook效应限制，所述Hook效应也被称为前带效应或抗原过量效应，这是其中在高分析物浓度的测定响应降低且导致产生分析物的虚低测量值的现象。该效应对于许多分析物已经报道且影响浊度和比浊测定法以及其它一步免疫测定法，且由过高浓度的分析物引起，所述过高浓度的分析物饱和抗体的结合位点，因此防止形成可检测的抗体-分析物-抗体复合物。以该方式，测定响应首先随着抗原浓度递增而增加，然后在达到临界浓度值之后，测定响应降低，得到钟形曲线，所谓的海德堡曲线(Heidelberger curve)。测定法开发商和制造商通常尽一切努力来减少Hook效应，例如通过增加抗体的量和通过减少分析所需的样品体积的量。总之，高剂量hook效应是一步免疫测定法设计固有的现象；在使用洗涤步骤来消除抗原过量的两步测定形式中，高剂量hook效应得到避免。还可以在使用非基于抗体的结合剂的其它一步结合测定法中观察到前带效应。
临床化学中使用的大多数现代自动分析仪已经安装了用于识别测量样品中的前带效应的方法。在样品显示前带效应的情况下，所述分析仪标记样品测量。对于此类标记的测量，根据仪器设置，所述分析仪推荐或甚至自动进行稀释之后样品的重新测量。
本领域状态
存在几种用于判断样品中是否存在前带效应的方法：
样品稀释方法通过测试未稀释样品和稀释后样品来验证前带效应的存在。如果稀释后的结果高于未稀释样品，则未稀释样品最可能表现出前带效应。不幸地，该方法增加劳动和试剂成本。
对于抗原再添加方法，将额外分析物在完成其测量之后添加至样品，且解读信号中的额外变化。尽管该方法在检测前带效应中是准确的，但试剂成本由于抗原添加而增加。此外，额外移取步骤增加分析仪上的工作流，因此导致通量降低。此外，抗原试剂占据分析仪上的额外空间。
动力学方法通过分析样品测量过程中获得的动力学数据来验证抗原过量的存在。在大多数情况下，反应动力学取决于分析物浓度：低浓度样品可显示渐增信号，而高浓度样品可显示在反应开始时的更快速信号增加和在反应结束时的低得多的信号增加。所述差异可以用于识别前带效应的存在。
Roche cobas c分析仪上的应用的动力学方法也被称为反应速率方法。在这里，比较最终试剂添加之后的两个不同时间的吸光度变化的速率(参见cobas c操作员手册；cobas c操作员手册训练)：表示为百分数的反应结束时的反应速率和反应开始时的反应速率的比率被定义为前带检查值PC。对于各测定法，将表明前带效应的特定PC范围(定义为下限和上限之间的范围)存储于测定设置中，并且与测量各样品之后获得的PC值进行自动比较(参见来自“cobas c 311 Analyzer – COBI CD, Compendium of BackgroundInformation”的图2、3和4)。在前带效应存在的情况下，用>Kin标记对于样品获得的结果。
任选地，至多两个不同限值(参见图4中的设置的第8个和第9个方框)可以在Rochecobas c分析仪上定义且应用于各测量，所述测量决定在分析样品的前带检查值PC之前如何进行。这些限值是信号的参考值，其通过计算特定时间段内的信号变化而在用于分析物测定的波长处从样品获得。这些限值允许从前带检查忽略具有极低反应速率的样品，且将此类样品直接分类为非Hook样品。cobas c分析仪中使用的动力学方法的缺点在于，Hook样品和非Hook样品之间的差异并不总是最优的，因此当通过进行错误标记(例如标记为“超出上限测量范围”，而不是“Hook样品”，或反之亦然)而将方法应用于来自相同测定的不同批次时引起困难。
该方法的一个进一步重要缺点在于其不适用于所有测定法，例如白蛋白测定法，且在此类情况下，必须应用上述昂贵的抗原再添加方法，其通过额外移取步骤增加分析仪上的工作流，因此导致通量降低。此外，抗原试剂占据分析仪上的额外空间。几种前带检测方法使用简单的动力学数据分析式。应用此类方法的分析仪经常关闭，这是因为假前带报警率高(Clin. Chem. Lab. Med. 1999)。
在来自JP 06213893的动力学方法中，任何测量点均用于前带检查。在JP10282099中，通过比较测量时间内的两个测量部分彼此的测量数据而辨别前带效应的存在或不存在。
在JP63019560中，计算在波长λ1和λ2检测的吸光度值A(λ1)和A(λ2)之间的比率，且与预设辨别水平进行比较，以检测前带效应。
JP 04204378描述了计算在两种不同波长的吸光度差异∆A(λ1)和∆A(λ2)的比率且将该值与预设参考值进行比较的前带检测方法。
在JP 05093725和JP 06094717中，进行在2种不同波长的测量，随后通过使用线性回归公式测定测量值和目标值之间的偏差比率。基于偏差进行前带效应的检测。
EP1845373涉及用于使用特定校准曲线测定样品中分析物与分析物结合物质的量的方法，其中在不同的校准曲线测定前带阳性样品的分析物的量。
上面提到的现有技术使用昂贵试剂，需要额外测量或复杂的信号评估程序。此外，一些方法并不总是适用于所有测定法。
待解决的问题
待解决的问题是提供用于前带检测的方法，所述方法是成本有效的(理想地无需消耗任何试剂)、快速的(理想地通过与样品定量步骤同时进行的检测方法)、容易的、安全的(理想地无假前带报警/少量假前带报警)，且可以在自动实验室分析仪中实施。
本发明的方法允许成本有效的方式，而无需消耗任何试剂。它是快速且容易的，因为所述前带检测方法与样品定量步骤同时进行，并且它是安全的，因为它检测样品中是否存在前带效应。此外，所述方法可以在自动实验室分析仪中实施。
发明概述
本发明提供用于通过分析样品测量过程中获得的动力学数据来检测前带现象的改进方法。从属权利要求中给出了本发明的实施方案。
在第一个方面，本发明的方法用于通过光度测定法测定可以显示前带效应的样品中特定分析物的量，其中所述特定分析物从所述分析物与分析物特异性测定试剂相互作用之后反应混合物的光信号变化来定量。
在第一步骤中，对于待测定样品的特定分析物生成在至少一个波长和反应时间的校准曲线，且将测量结果储存在仪器平台的数据管理系统中。
对于待测定样品中的特定分析物，经完整反应时间，在用于测定分析物的波长和至少在用于检测前带效应的额外特定波长，同时测量光信号。该额外波长不同于用于测定分析物的波长。
在下一步骤中，通过使用在用于检测前带效应的波长获得的信号来计算反应速率比率R
R = [时间段2时的反应速率 / 时间段1时的反应速率] x 100，其中
时间段2时的反应速率 = [信号(时间点4) – 信号(时间点3)] / [时间点4 – 时间点3] 且时间段1时的反应速率= [ 信号(时间点2) – 信号(时间点1)] / [时间点2 –时间点1]。
通过计算比率值R与预定限值的比较，判断样品中是否存在前带效应。
最后，通过在用于测定分析物的波长获得的光信号与校准曲线的比较来定量特定分析物的量。
本发明的一个实施方案是任选地可以定义其它限值且应用于各测量，所述测量决定之前、即计算和基于反应速率比率R判断Hook效应的存在之前如何进行。这些限值是信号的参考值，其在用于测定分析物的波长、和/或在用于检测前带效应的波长和/或其它波长测量。此限值的一个实例可以对于特定时间段内的信号变化来定义，用于从前带检查忽略具有极低反应速率的样品，且将此类样品直接分类为非Hook样品。此限值的一个进一步实例可以对于特定时间段内的信号变化来定义，用于决定具有极高反应速率的样品是否被立即分类为Hook样品或是否在计算反应速率比率R之后进行判断。
在本发明的一个进一步方面，提供使用可商购的分光光度实验室测试法的仪器平台，用于通过光度测定法测定可以显示前带效应的样品中特定分析物的量，其中所述仪器平台的数据管理系统能够处理反应时间、校准点、校准模式、波长的数据，用于从一次样品测量同时进行分析物测定和前带效应检测。
本发明的另一个方面提供用于通过光度测定法测定可以显示前带效应的样品中白蛋白的量的方法，其中根据本发明从特定分析物与分析物特异性测定试剂相互作用之后反应混合物的光信号变化来定量所述分析物。
发明详述
本发明提供用于通过分析样品测量过程中获得的动力学数据来检测前带现象的改进方法。
定义：
术语“分光光度测定法”，也称为“光度测定法”，是本领域众所周知的。光度测定法涵盖浊度和比浊免疫测定法。在浊度和比浊免疫测定法中，特定分析物从基于所述特定分析物和分析物特异性结合配偶体的凝集的反应混合物的浊度的变化来定量。
术语“浊度法(turbidimetry)和比浊法(nephelometry)”是本领域已知用于基于测量浊度对光的透射和散射的效果测定溶液中混浊的量或该浊度的方法。液体中的浊度是由细分的悬浮颗粒的存在引起的。如果使光束通过混浊样品，则其强度由散射而降低，并且散射光的量取决于颗粒的浓度、尺寸和尺寸分布。分光光度计测量增加的浊度(即，强度透射光中光的减少)，这是由于由免疫凝集反应导致的渐增的粒径引起的。这种增加的浊度是由分析物引起的免疫凝集的直接量度，或由分析物引起的免疫凝集抑制的间接量度。在比浊法中，测量散射光的强度，而在浊度法中，测量透射通过样品的光的强度。
浊度测定法涉及测量当入射光束通过样品时入射光束的强度。光束可以通过悬浮液或被颗粒吸收、反射或散射。作为结果，当光透射通过悬浮液时，光的强度降低。对于非吸收性颗粒，由于散射引起的光强度的降低表示为浊度。
比浊测定法是指当入射光束通过样品时，测量从入射光束以定义角度θ散射的光。在比浊法中，测量一段时间后的散射光的强度的变化，因为散射物质迅速增加尺寸。当在固定的抗体-胶乳复合物存在的情况下测量时，散射光与初始抗原浓度成比例。进一步的解释描述于J.A. Molina-Bolivar等人, Journal of Macromolecular Science, Part C-Polymer Review, 45:59-98, 2005。
本发明的免疫测定方法在有和没有微粒增强的情况下用所有已知凝集试验都起作用。本发明中优选使用“微粒增强光散射凝集试验”，这也被称为“颗粒增强浊度免疫测定法”(PETIA)。基于凝集的免疫测定法常规用于临床诊断中，用于在临床化学分析仪上定量血清蛋白、治疗性药物和滥用药物，因为它们具有作为不需要任何分离或洗涤步骤的准均相测定的益处。为了增强反应混合物中特定分析物和分析物特异性结合配偶体之间的光检测，将分析物或分析物特异性结合配偶体连接至合适的颗粒。由此，分析物与用分析物特异性结合配偶体包被的颗粒反应并凝集。随着分析物量逐渐增加，复合物的凝集和尺寸逐渐增加，进一步导致光散射的变化。凝集的颗粒然后通过浊度和比浊测量法来测定。
分析物包括携带对分析物具有高反应性的至少一种结合配偶体的强光散射特性的颗粒和携带对分析物具有低反应性的至少一种结合配偶体的弱光散射特性的颗粒的混合物，如EP 0898169中所述。强光散射特性的颗粒具有比弱光散射特性的颗粒更大的尺寸和/或更高的折射率。用于测定分析物的量的微粒增强光散射免疫测定法的微粒试剂，其包括直径为30至600 nm的微粒的混合物，包括携带对分析物具有高反应性配偶体的至少一种结合配偶体的强光散射特性的颗粒和携带对分析物具有低反应性的至少一种结合配偶体的弱光散射特性的颗粒。
微粒的材料可以是适合用于微粒增强光散射测定法的任何无机、有机或聚合物材料。微粒的材料可以是适合用于微粒增强光散射测定法的任何无机、有机或聚合物材料。此类材料包括例如硒、碳、金；碳、硅或锗的氮化物，例如Si3N4；铁、钛或硅的氧化物，例如TiO2或SiO2；和聚合材料，诸如例如聚苯乙烯、聚(氯乙烯)、环氧树脂、聚(偏二氯乙烯)、聚(甲基丙烯酸α萘酯)、聚(乙烯基萘)或其共聚物，特别是苯乙烯和可共聚的烯键式不饱和化合物的共聚物，例如，苯乙烯-(甲基)丙烯酸酯共聚物。由聚合材料制成的微粒，以及由从苯乙烯聚合的内核和从苯乙烯与可共聚的烯键式不饱和化合物的共聚形成的外壳组成的核-壳颗粒是特别合适的。大部分基于颗粒的测定法采用胶乳颗粒，其中主要类型是聚苯乙烯。
如本文所使用，术语“测定”意指从基于浊度或比浊测量的光度测定法的反应混合物的光信号的变化，评估、诊断、决定、鉴定、评价、定量或分类样品中的特定分析物。
如本文所使用，术语“量”涵盖分析物的绝对量或所述分析物的相对量和/或浓度和/或可以与之关联和/或可以因此推导的任何值和/或参数。
根据本发明的术语“分析物”涵盖任何“体外诊断化合物”，诸如例如血清蛋白、治疗性药物和滥用药物。代表分析物包括但不限于抗原、半抗原、抗体、蛋白、肽、氨基酸、激素、类固醇、癌细胞标记、组织细胞、病毒、维生素、核酸、杀虫剂、酶、酶底物和酶辅因子。如本文所使用，“分析物”或“特定分析物”是指样品中其存在和/或浓度待测定的物质。术语“分析物”包括针对其存在特异性反应配偶体（例如，特异性结合分析物的结合分子或物质，如抗体，或与分析物特异性反应的分子，如酶)或可以针对其制备特异性结合配偶体的任何物质。
在本发明的上下文中，术语“特定分析物”意指对于待测量的样品中的每种分析物，可以测定特定校准曲线和特定波长和反应时间，将它们针对每种特定分析物优化以定量浓度，且它们可以从分析物至分析物有差异。
如本文所使用，术语“分析物特异性反应配偶体”能够与特定分析物反应，从而形成反应复合物，如抗原-抗体免疫复合物。典型的分析物特异性反应配偶体包括，但不限于，结合蛋白、抗原、抗原片段、抗体、抗体片段、核酸、受体和颗粒增强结合配偶体。对于给定分析物特异性的此类反应配偶体可以从商业来源获得，或者可以根据本领域技术人员已知的标准程序制备。分析物特异性反应配偶体对的实例包括，但不限于，半抗原：抗体，细胞：抗体，生物素：抗生物素蛋白，激素：受体，多肽：抗体，抗体：抗体，寡核苷酸：互补DNA或RNA。术语“分析物特异性结合配偶体”可以同样用来代替“分析物特异性反应配偶体”。
如本文所使用，术语“抗体”是指响应于外来物质的检测产生的免疫球蛋白，并且包括完整分子以及其功能片段，诸如Fab、F(ab′)2、和Fv。可以用作本发明的测定法中的免疫结合配偶体的抗体包括任何物种的多克隆抗体，任何物种的单克隆抗体(包括嵌合抗体和/或重组抗体)。因为它们被无限量相同产生的能力，所以单克隆抗体或其片段通常是优选的。
如本文所使用，术语“抗原”特征在于其在抗体的抗原结合位点处被结合的能力。被抗体识别且抗体结合的抗原的区域被称为“表位”。抗原是当引入动物或人体时能够诱导免疫应答（即抗体产生）的物质。半抗原是只有当连接至大载体诸如蛋白时才可以引发免疫应答的小分子。载体可以是自身也不会引发免疫应答的载体。一旦机体已经生成针对半抗原-载体加成物的抗体，小分子半抗原也可以能够结合抗体。
如本文所使用，术语“样品”是指选自血液即全血、血浆或血清，或尿液，CSF，痰的体液的样品，或是指分离的细胞的样品，或是指来自各个个体的组织或器官的样品。体液样品可以通过众所周知的技术来分离。组织或器官样品可以从任何组织或器官通过例如组织活检来分离。分离的细胞可以从体液或组织或器官通过分离技术诸如离心或细胞分选来分离。优选地，来自细胞、组织或器官样品的裂解物从表达或产生本文所述的肽的那些细胞、组织或器官中分离。
非线性校准用于其在不同浓度的吸光度形成非线性、但可重复的图的测试。对于校准需要至少三种和最多六种校准物。典型的非线性校准类型是rodbard函数。此外，存在校准类型，其校准曲线是分段定义的内插函数，如样条(Spline)。
灵敏度、分析灵敏度、检测下限(LDL)、空白限值(LOB)、检测限值(LOD)和定量限值(LOQ)是用来描述可以通过分析方法可靠测量的量度的最小浓度的术语。所有这些术语都相关，但具有不同的定义(siehe Lit. clin biochem rev 2008, 29, 49)。例如，术语“分析灵敏度”被定义为校准曲线的斜率。
如本文所使用，术语“检测下限”(LDL)也被称为较低测量范围。估计LDL的一种典型方法由测量零校准物或空白样品的重复(诸如n= 21)，确定平均值x和标准偏差(SD)组成。LDL计算为x+2SD或x+3SD。这种用于LDL测定的方法根据Kaiser (H. Kaiser,Fresenius Zeitschrift für analytische Chemie, 1965, 209, Nr.1, 第1-18页)描述的方法。
如本文所使用，术语“检测上限”(UDL)也被称为上部测量范围。UDL是可以可靠地测定的样品中分析物的最高量。在本发明中，UDL通过评价该方法的线性度、然后选择线性范围内的最高浓度值作为UDL来测定。当从一系列样品溶液的分析物回收率(测量值)与样品溶液中分析物的实际浓度(真实值)成比例时，该方法被称为是线性的(Arch Pathol LabMed 2004, 128, 第44-48页)。校准曲线的形式(其可以是抛物线或S形的)不应当与描述测量值和真实值之间关系的方法的线性度混淆。校准曲线描述信号和浓度之间的关系。
通常的做法是通过使用至少一种“校准曲线” (通常也称为标准曲线或工作曲线)来确定分析物的浓度，所述校准曲线已经通过绘制标准样品中分析物的已知浓度和标准样品的分析测量值(光信号)诸如光密度之间的相互关系来预先绘制。当校准曲线在定量分析区域中的较宽范围内具有足够线性度时，校准曲线可以用相对较小数量的标准样品来制备，所述标准样品靠近定量分析的测定范围中的上限、下限和在中间点。然而，在实践中，存在许多通常不是线性的校准曲线。从特定波长的吸光度制备的浊度或比浊的校准曲线可以是非线性的S形校准曲线，其中灵敏度在接近零的浓度处变差，并且在较高浓度侧是饱和的。S形校准的确定需要多点校准，其中必须使用多个浓度的标准样品。
当生成用于基于反应混合物的浊度测量的凝集测定法的校准曲线时，波长的选择，除了反应时间之外，对于曲线的斜率(分析灵敏度)和可实现的上部测量范围发挥至关重要的作用。选择一个波长和对应的反应时间用于目标在于生成校准曲线的信号计算可以是分析灵敏度和上部测量范围之间的折衷。
本发明的一个实施方案是，对于待测定样品的特定分析物生成在至少一个波长和反应时间的校准曲线，且将测量结果储存在仪器平台的数据管理系统中。
其后，经完整反应时间，在用于测定分析物的波长和至少在用于检测前带效应的额外特定波长，同时测量待测定样品中的特定分析物的光信号。该(或这些)额外特定波长不同于用于测定分析物的波长。
本发明的一个实施方案是用于测定分析物的波长和至少在用于检测前带效应的额外特定波长之间的差异高于10 nm。
优选地，该(或这些)额外特定波长显示5nm、10nm或20nm的差异。在特定情况下，用于测定分析物的波长和至少在用于检测前带效应的额外特定波长之间的差异甚至高于20nm。
如本文所使用的术语“用于测定分析物的波长”，也被称为主要波长，以及至少一个用于检测前带效应的波长是指用本领域已知的多波长光度计本领域生成的波长。常见光度计是分光光度计或用于浊度免疫测定法的浊度计和用于比浊免疫测定法的比浊计。在cobas® c仪器上检测这些测定法基于具有卤钨灯作为照射源、用于生成单色光的光栅和光电二极管阵列 (产生340和800 nm之间的12个波长的12个二极管)作为检测器的光度计。光度计，例如Roche的分析仪cobas c® 311具有同时测量300 nm至800 ± 2 nm之间的12个波长的能力。优选使用的是波长340、376、415、450、480、505、546、570、600、660、700、800± 2 nm。如果用于具有同时测量多个波长的能力的自动分析仪，诸如cobas c 311，则本发明的方法是特别有利的。根据选择的分光光度计的结构和可用波长(其从设备至设备可不同)，从多个波长选择一个或多个特定波长。该测量优选在定义温度，优选20和40摄氏度之间，最优选在37℃进行。
本发明的一个实施方案是第二和其它波长任选用于校正/设空白目的。该进一步波长被测定为用于校正干扰和补偿光度噪声的空白值，也称为双色测量(clin. Chem.1979, 25, 1482 - 1484)。通常从主要波长的信号减去校正波长的信号。
如本文所使用，术语“光信号”描述通过进行反应混合物的吸光度测量而获得的信号。光信号可以是在浊度测定法的情况下的吸光度值，或比浊测定法的散射光信号。样品中特定分析物的光信号可以在多个波长在反应混合物中，优选在完整反应时间在一次运行中，同时测量。
如本发明中所使用，术语“同时”可意指小于60x秒的时间延迟，例如小于10x秒、优选小于1x秒、最优选小于1 ms或者甚至小于0.1x ms的时间延迟。最优选地，术语“同时”意指没有时间延迟。
如本文所使用的术语“前带效应”，也被称为高剂量Hook效应或抗原过量效应，是其中在高分析物浓度的测定响应降低且导致产生分析物的虚低测量值的现象。
本发明的一个实施方案是通过使用在用于检测前带效应的波长获得的信号来计算“反应速率比率R”。
如本文所使用的术语“反应速率比率R”被定义为：
R = [时间段2时的反应速率 / 时间段1时的反应速率] x 100
其中，时间段2时的反应速率 = [信号(时间点4) – 信号(时间点3)] / [时间点4– 时间点3]且时间段1时的反应速率= [ 信号(时间点2) – 信号(时间点1)] / [时间点2– 时间点1]。
通过计算比率值R与预定限值的比较，判断样品中是否存在前带效应。根据本发明的hook效应可以在相应的仪器平台上使用可商购的分光光度实验室测试来检测，而无需应用预分析样品稀释处理和/或通过分析物再添加改变测定程序。
本发明的一个实施方案是，如果稀释样品之后存在前带效应，则自动重复样品的测量。
本发明的一个进一步实施方案是，在样品中不存在前带效应的情况下，样品中特定分析物的预定量是可报告的结果。
此外，本发明的一个实施方案是，额外信号任选地在用于测定分析物的波长和/或在用于计算R的波长和/或在另一个波长测量，在计算和基于反应速率比率R判断Hook效应的存在之前通过与预定限值比较来评价。根据本发明的此预定限值可以对于特定时间段内的信号变化来定义，用于决定具有极高反应速率的样品是否被立即分类为例如Hook样品或用于从前带检查忽略具有极低反应速率的样品，且将此类样品直接分类为例如非Hook样品。
如本文所使用的术语 “预定限值”或“阈值”，用于特定时间段内的定义的信号变化，也表示为反应速率，或用于定义的反应速率比率，如上在式中对于R所述。预定限值也可以是在特定时间点所取的吸光度值。预定限值应用于本发明的方法用于检测前带效应。在测定开发过程中通过将非Hook样品与Hook样品进行比较而凭经验进行预定限值的选择。本发明的一个进一步实施方案是将包含反应时间、校准点、校准模式和测定类型的特定测量条件额外应用于根据本发明的测量方案。
如本文所使用，术语“反应时间”是在终点测定的情况下用于计算其信号值的光信号的第一(或初始)和第二(或最终)测量之间的时间段。第一(或初始)测量在将最终试剂添加至反应混合物之前或之后不久进行。在动力学测量的情况下，反应时间可以是用于计算表示每单位时间的吸光度变化的值的时间段。“反应时间”可以与“完整反应时间”相同或比其更短。完整反应时间是允许由样品和分析物特异性测定试剂构成的反应混合物在它们混合之后反应的时间。
如本文所使用，术语“完整反应时间”是在多个波长测量特定分析物的时间段。在cobas c®仪器上可用的12个不同波长同时测量样品。本免疫测定时间的典型完整反应时间在1到20分钟之间变化。优选地，多波长分光光度计光度计的完整反应时间优选为10分钟左右。本发明的一个实施方案是在完整反应时间过程中测量特定分析物的光信号。
如本文所用术语“校准点的数目”是用于生成校准曲线的也被称为样品标准品的校准物的数目。
如本文所使用，术语“校准模式”是指测量的信号[吸光度或(对于速率测定)吸光度变化的速率]和目标分析物的浓度之间的有效关系的确定。此类信号/浓度关系的图形表示是也称为工作曲线的校准曲线。分析仪使用不同类型的数学模型来描述这种关系。这些数学模型被称为校准类型或校准模式。存在两种基本校准模式，线性和非线性校准模式。当针对校准物浓度绘制的吸光度读数位于一条直线上时，线性校准用于测试。如果线性校准基于两个校准物测量，则它被称为线性两点校准。如果校准基于多于两种校准物，则其被称为线性多点校准。多点校准通常用于非线性校准。
如本文所使用，术语“测定类型”是指分析仪上的两种基本类型的光度测定法：终点测定法和速率测定法。测量由光度计在特定时间点进行。如果测量在反应完成后进行，则吸光度(或浊度)是样品组分浓度的指标。这些被称为终点测定法。对于速率测定法，反应速率的速率(或吸光度变化速率)与分析的样品组分的浓度成比例。测量在反应进行时进行。在该仪器中可能还存在这两种技术的改良，以及两者的组合。
本发明的一个进一步方面是用于通过光度测定法测定可以显示前带效应的样品中白蛋白的量的方法，其中从特定分析物与分析物特异性测定试剂相互作用之后反应混合物的光信号变化来定量所述特定分析物。
对于待测定样品中的白蛋白生成在至少一个波长和反应时间的校准曲线，且将测量结果储存在仪器平台的数据管理系统中。
经完整反应时间，在用于测定分析物的波长和至少在用于检测前带效应的额外特定波长，同时测量待测定样品中的白蛋白的光信号。
通过使用在用于检测前带效应的波长获得的信号来计算反应速率比率R
R = [时间段2时的反应速率 / 时间段1时的反应速率] x 100
其中时间段2时的反应速率 = [信号(时间点4) – 信号(时间点3)] / [时间点4– 时间点3] 且
时间段1时的反应速率= [ 信号(时间点2) – 信号(时间点1)] / [时间点2 – 时间点1]。
通过将计算比率值R与预定限值进行比较来判断样品中是否存在前带效应，通过将在用于测定分析物的波长获得的光信号与校准曲线进行比较来定量白蛋白的量。
本发明的一个实施方案是，在一些情况下，用于测定白蛋白的波长是用于检测前带效应的相同波长。在该情况下，在用于测定分析物的波长和/或在用于检测前带效应的波长测量额外限值，诸如额外信号和参考值。
因此，本发明的一个实施方案是任选地可以定义其它限值且应用于与白蛋白的量的测定相关的各测量，所述测量决定在计算R和基于反应速率比率R判断Hook效应的存在之前如何进行。这些限值是信号的参考值，其在用于测定分析物的波长、和/或在用于检测前带效应的波长和/或其它波长测量。此限值的一个实例可以对于特定时间段内的信号变化来定义，用于从前带检查忽略具有极低反应速率的样品，且将此类样品直接分类为非Hook样品。此限值的一个进一步实例可以对于特定时间段内的信号变化来定义，用于决定具有极高反应速率的样品是否被立即分类为Hook样品或是否计算反应速率比率R之后进行判断。
本发明的一个进一步方面是额外应用于测量方案的特定测量条件用于通过光度测定法测定可以显示前带效应的样品中特定分析物的量的基于分光光度的实验室测试的用途，所述特定测量条件包含测量波长、反应时间、校准点、和校准模式。
使用用于通过光度测定法测量可以显示前带效应的样品中特定分析物的量的可商购的分光光度实验室测试的仪器平台，其中所述仪器平台的数据管理系统能够处理反应时间、校准点、校准模式、波长的数据，用于选择最佳拟合校准曲线。进行根据本发明的包含测量波长、反应时间、校准模式、校准点数量的测量结果的额外校正，且针对彼此进行抵消。
附图简述
图1显示铁蛋白均匀免疫测定的海德堡曲线和重要范围(来自文献Clin. Chem.Lab. Med 1999, 37, 471-476的图)
图2显示用反应速率方法的cobas c上的前带检查
图3显示cobas c上的前带检查值计算
图4显示cobas c 311上用反应速率方法的前带检查的设置
图5显示CRP L3测试的Hook样品和非Hook样品之间的差异。
a) 用标准方法和新方法的均一化PC值(NPCV)的方案；
b) 用标准方法和新方法获得的结果以及改进因子IF的概述。
图6显示铁蛋白测定的Hook样品和非Hook样品之间的差异。
a) 用标准方法和新方法的均一化PC值(NPCV)的方案；
b) 用标准方法和新方法获得的结果以及改进因子IF的概述。
图7显示Hook样品和非Hook样品之间的差异。a) 方案：在测量波长340nm-700nm取吸光度读数。计算测量点8和测量点20之间的信号差异。信号差异限值设定为0.25。显示信号差异> 0.25的所有样品都是Hook样品。对于信号差异≤0.25的所有样品，进行前带检查。b) 方案：通过应用反应速率方法计算前带检查值(参见3.3.2.1中的设置)。在测量波长505nm-700nm生成信号，且用于前带检查值计算。具有定义限值外侧的PC的样品是Hook样品。
实施例
实施例1：用于CRP测定法的前带检测
1.1 仪器：
具有多波长分光光度计作为检测单元的Roche´s (Roche Diagnostics GmbH)cobas c311分析仪用于本实验。该仪器自动移取样品和测定试剂至反应室(reactioncells)。可以将多达3种不同试剂R1、R2和R3添加至样品。该仪器使用卤钨灯作为照射源(12V / 50 W)，并用由12个光电二极管组成的光电二极管阵列在12种不同波长(在340、376、415、450、480、505、546、570、600、660、700 和800 ± 2 nm)同时测量吸光度。光路长度为5.6 mm，且检测器的光范围为0.0000 – 3.0000吸光度。对于每个反应室(reaction cell)，测量水空白，然后在10分钟(在这里也称为完整反应时间)内57次采集吸光度读数，因此对于每个波长的吸光度得到总共57个测量点，也称为光度点或测定点。浓度可以通过使用这些测量点中的至少一个来计算。在该仪器上存在两种基本类型的光度测定法：端点测定法和速率测定法。测量在37摄氏度进行。
1.2 用于使用标准方法的CRP-测定法的程序：
选择Roche´s CRP L3测试(CRPL3, 目录号 04956842)，颗粒增强免疫浊度测定法，用于该研究。具有用单克隆抗CRP抗体包被的胶乳颗粒的人CRP聚集物；测定该聚集物浊度。cobas c包装中提供用于所有Roche测试的试剂。这些盒(cassettes)包含一至三个特别设计的试剂瓶，且具有详细的相关试剂和其它测试相关信息的条形码标记。对于CRP L3测试，盒中使用两种试剂：R1(具有牛血清白蛋白和防腐剂的TRIS缓冲液)和R2 (用甘氨酸缓冲液中的抗CRP(小鼠)抗体、免疫球蛋白(小鼠)和防腐剂包被的胶乳颗粒)。来自CRP L3测试的包装插页文件中描述的程序用作标准方法。
1.2.1移取方案：
随后将2μL样品和150μL测定缓冲液(R1)添加至反应室，随后添加胶乳试剂(R2，48μL)，用24μl稀释液(水)稀释，并混合反应混合物。
1.2.2 用于生成校准曲线的条件：
对于测量，使用570nm作为主要波长，且使用800nm作为校正波长。测定类型是两点终点测定法。两点终点测定法是执行样品空白的终点测定法。在这里考虑在两个不同测量点的两个吸光度读数：通常在添加最后试剂之前或之后不久采集第一读数；在添加最后试剂之后任何时间点采集第二读数。用于校准曲线和因此用于浓度计算的吸光度值通过从第一读数减去第二读数而获得。对于CRP L3，第一读数是在测量点8，且意指添加最终试剂之后不久，第二读数在测量点18，其对应于2.0分钟的反应时间。为了生成校准曲线，一式两份测量来自Roche (目录11355279)的6份标准品，使用样条(spline)作为校准类型，其拟合通过三阶多项式近似的测量校准物的数据点之间的范围，从而使得获得平滑校准曲线。
1.2.3 用于检测前带效应的条件：
为了检测前带效应，使用反应速率方法(还参见图2、3和4)。首先，将2种不同的限值应用于测量：计算前带测量点1 (pmp1)和前带测量点2 (pmp2)之间的信号差异和前带测量点3 (pmp3)和前带测量点4 (pmp4)之间的信号差异。将这些计算的信号(吸光度)差异与预定限值(分别地对于(Apmp2-Apmp1)为950且对于(Apmp4-Apmp3)为100)进行比较(参见图4和下表中的前带设置的第8和9列)。将计算的信号差异低于这些限值的样品直接分类为非Hook样品。然而，如果样品的计算的信号差异高于这些限值，则通过根据图3计算前带检查值PC进行前带检查：计算反应结束时的反应速率(v(pmp3，pmp4)，参见图4和下表中的前带设置的第5和6列)和反应开始时的反应速率(v(pmp1，pmp2)，参见图4和下表中的前带设置的第3和4列)的比率，表示为百分数，以获得前带检查值PC。对于各测定法，将表明前带效应的特定PC范围(定义为下限(参见图4和下表中的第1列)和上限(参见图4和下表中的第2列)之间的范围)存储于测定设置中，并且与测量各样品之后获得的PC值进行自动比较：如果样品显示PC值在下限和上限内侧(4-15)，则将样品标记为Hook样品。用于CRP L3的前带检查的设置描述于下表中(对于详述，还参见图4)：
对于前带检查、额外限值和分析物定量的所用波长：570nm (800nm校正波长)：
。
1.3 用于根据本发明的CRP-测定法的程序：
用于这些实验的试剂与用于标准方法的试剂相同：参见第1.2点。使用来自CRP L3测试的包装插页文件中描述的程序，除了用于检测前带效应的方法。
1.3.1 测量条件：
移取方案：与第1.2.1点中描述的标准方法的移取方案相同。
用于生成校准曲线的条件：与第1.2.2点中描述的标准方法中使用的校准条件相同。
1.3.2 用于根据本发明检测前带效应的条件：
为了检测前带效应，本发明的方法还使用反应速率的分析，然而，使用与用于定量分析物的波长不同的波长。首先，将2种不同的限值应用于测量：计算在波长660nm(800nm校正波长)时前带测量点7 (pmp7)和前带测量点8 (pmp8)之间的信号差异和前带测量点9(pmp9)和前带测量点10 (pmp10)之间的信号差异。将这些计算的信号(吸光度)差异与预定限值(分别地对于(Apmp8-Apmp7)为500且对于(Apmp10-Apmp9)为200)进行比较(参见下表中的第8和9列)。将计算的信号差异低于这些限值的样品直接分类为非Hook样品。
然而，如果样品的计算的信号差异高于这些限值，则通过从在用于检测前带效应的波长时获得的信号计算反应速率比率R进行前带检查：
R = [时间段2时的反应速率 / 时间段1时的反应速率] x 100 ，其中
时间段2时的反应速率= [信号(时间点4) – 信号(时间点3)] / [时间点4 – 时间点3]且时间段1时的反应速率= [ 信号(时间点2) – 信号(时间点1)] / [时间点2 – 时间点1]。
时间点4：是前带测量点4 pmp4，且与测量点4相同；时间点3：是前带测量点3pmp3，且与测量点3相同；时间点2：是前带测量点2 pmp2，且与测量点2相同；时间点1：是前带测量点1 pmp1，且与测量点1相同；还参见下表第3列至第6列。
对于各测定法，将表明前带效应的特定和预定R范围(定义为预定下限(参见下表中的第1列)和预定上限(参见下表中的第2列)之间的范围)存储于测定设置中，并且与测量各样品之后获得的R值进行自动比较：如果样品显示在下限和上限内侧(8-17.2)(根据下表中的第7列)的R值，则将样品标记为Hook样品。
用于CRP L3的前带检查的设置描述于下表中：
用于前带检查的所用波长：660nm (800nm校正波长)；
用于额外限值的所用波长：660nm (800nm校正波长)；
用于分析物定量的所用波长：570nm (800nm校正波长)。
任选地，待用于各额外限值的波长可以是不同的。在该情况下，通过对于两种额外限值使用相同的波长，获得良好的结果。
1.4 使用标准方法和根据本发明的方法的CRP-测定法的结果：
结果概述描述于图5中。CRP 测试的新方法的应用显示Hook样品和非Hook样品之间2.7倍的改善差异。新方法提供最小的实施努力；该方法的应用不需要试剂和它们的制剂的任何改变。对于其在cobas c分析仪上的应用，仅调整软件中的输入窗口：测量波长的额外设置的扩展，和使得输入带小数点单位的下/上限值(例如17.2，而非仅17)的可能性。
实施例2：用于铁蛋白测定法的前带检测
2.1 仪器：参见第1.1点。
2.2 用于使用标准方法的铁蛋白-测定法的程序：
选择Roche´s Ferr4测试(Ferr4, 目录号04885317)，颗粒增强免疫浊度测定法，用于该研究。具有用单克隆抗铁蛋白抗体包被的胶乳颗粒的人铁蛋白聚集物；浊度测定该聚集物。cobas c包装中提供用于所有Roche测试的试剂。这些盒(cassettes)包含一至三个特别设计的试剂瓶，且具有包含详细的相关试剂和其它测试相关信息的条形码标记。对于Ferr4测试，盒中使用两种试剂：R1(TRIS缓冲液，pH7.5，免疫球蛋白(兔)，防腐剂，稳定剂)和R3(含有用抗人铁蛋白抗体(兔)、防腐剂、稳定剂包被的胶乳颗粒的水性基质)。来自Ferr4测试的包装插页文件中描述的程序用作标准方法。
2.2.1 移取方案：
随后将10μL样品和80μL测定缓冲液(R1)添加至反应室，随后添加80μL胶乳试剂(R3)，并混合反应混合物。
2.2.2 用于生成校准曲线的条件：
对于测量，使用570nm作为主要波长，且使用800nm作为校正波长。测定类型是两点终点测定法。两点终点测定法是执行样品空白的终点测定法。在这里考虑在两个不同测量点的两个吸光度读数：通常在添加最后试剂之前或之后不久采集第一读数；在添加最后试剂之后任何时间点采集第二读数。用于校准曲线和因此用于浓度计算的吸光度值通过从第一读数减去第二读数而获得。对于CRP L3，第一读数是在测量点24，且意指添加最终试剂之后不久，第二读数在测量点57，其对应于5.1分钟的反应时间。为了生成校准曲线，一式两份测量来自Roche (目录11355279)的6份标准品，使用样条(spline)作为校准类型，其拟合通过三阶多项式近似的测量校准物的数据点之间的范围，从而使得获得平滑校准曲线。
2.2.3 用于检测前带效应的条件：
为了检测前带效应，使用反应速率方法(还参见图2、3和4)。首先，将一种限值应用于测量：计算前带测量点1 (pmp1)和前带测量点2 (pmp2)之间的信号差异。将该计算的信号(吸光度)差异与预定限值(对于(Apmp2-Apmp1)为1000)进行比较(参见图4和下表中的前带设置的第8列)。将计算的信号差异低于该限值的样品直接分类为非Hook样品。然而，如果样品的计算的信号差异高于该限值，则通过根据图3计算前带检查值PC进行前带检查：计算反应结束时的反应速率(v(pmp3，pmp4)，参见图4和下表中的前带设置的第5和6列)和反应开始时的反应速率(v(pmp1，pmp2)，参见图4和下表中的前带设置的第3和4列)的比率，表示为百分数，以获得前带检查值PC。对于各测定法，将表明前带效应的特定PC范围(定义为下限(参见图4和下表中的第1列)和上限(参见图4和下表中的第2列)之间的范围)存储于测定设置中，并且与测量各样品之后获得的PC值进行自动比较：如果样品显示PC值在下限和上限内侧(0-10)，则将样品标记为Hook样品。用于Ferr4的前带检查的设置描述于下表中(对于详述，还参见图4)：
对于前带检查、额外限值和分析物定量的所用波长：570nm (800nm校正波长)：
。
2.3 用于根据本发明的铁蛋白-测定法的程序：
用于这些实验的试剂与用于标准方法的试剂相同：参见第2.2点。使用来自Ferr4测试的包装插页文件中描述的程序，除了用于检测前带效应的方法。
2.3.1 测量条件：
移取方案：与第2.2.1点中描述的标准方法的移取方案相同。
用于生成校准曲线的条件：与第2.2.2点中描述的标准方法中使用的校准条件相同。
2.3.2 用于根据本发明检测前带效应的条件：
为了检测前带效应，本发明的方法还使用反应速率的分析，然而，使用与用于定量分析物的波长不同的波长。首先，将一种限值应用于测量：计算在波长505nm (800nm校正波长)时的前带测量点7 (pmp7)和前带测量点8 (pmp8)之间的信号差异。将该计算的信号(吸光度)差异与预定限值(分别地对于(Apmp8-Apmp7)为1000)进行比较(参见下表中的第8列)。将计算的信号差异低于该限值的样品直接分类为非Hook样品。然而，如果样品的计算的信号差异高于该限值，则通过从在用于检测前带效应的波长时获得的信号计算反应速率比率R进行前带检查：
R = [时间段2时的反应速率 / 时间段1时的反应速率] x 100，其中
时间段2时的反应速率 = [信号(时间点4) – 信号(时间点3)] / [时间点4 – 时间点3]且时间段1时的反应速率= [ 信号(时间点2) – 信号(时间点1)] / [时间点2 – 时间点1]。
时间点4：是前带测量点4 pmp4，且与测量点4相同； 时间点3：是前带测量点3pmp3，且与测量点3相同； 时间点2：是前带测量点2 pmp2，且与测量点2相同； 时间点1：是前带测量点1 pmp1，且与测量点1相同； 还参见下表第3列至第6列。
对于各测定法，将表明前带效应的特定和预定R范围(定义为预定下限(参见下表中的第1列)和预定上限(参见下表中的第2列)之间的范围)存储于测定设置中，并且与测量各样品之后获得的R值进行自动比较：如果样品显示在下限和上限内侧(-5至5)(根据下表中的第7列)的R值，则将样品标记为Hook样品。
用于FERR4的前带检查的设置描述于下表中：
用于前带检查的所用波长：505nm (800nm校正波长)；
用于额外限值的所用波长：505nm (800nm校正波长)；
用于分析物定量的所用波长：570nm (800nm校正波长)。
2.4 使用标准方法和根据本发明的方法的铁蛋白-测定法的结果：
结果概述描述于图6中。铁蛋白测试的新方法的应用显示Hook样品和非Hook样品之间1.8倍的改善差异。新方法提供最小的实施努力；该方法的应用不需要试剂和它们的制剂的任何改变。对于其在cobas c分析仪上的应用，仅调整软件中的输入窗口：测量波长的额外设置的扩展。
实施例3：用于白蛋白测定法的前带检测
3.1 仪器：参见第1.1点。
3.2 用于使用标准方法的白蛋白-测定法的程序：
选择Roche´s 白蛋白测试(ALBT2, 目录号04469658)，免疫浊度测定法，用于该研究。该测试用于测定尿样品中的白蛋白。人白蛋白与多克隆抗白蛋白抗体反应，形成抗原/抗体复合物；浊度测定该聚集物。
cobas c包装中提供用于所有Roche测试的试剂。这些盒(cassettes)包含一至三个特别设计的试剂瓶，且具有详细的相关试剂和其它测试相关信息的条形码标记。对于ALBT2测试，盒中使用三种试剂：R1 (TRIS缓冲液：50 mmol/L, pH 8.0, PEG：4.2 %, EDTA:2.0 mmol/L，防腐剂)、R2 (多克隆抗人白蛋白抗体(绵羊)：取决于滴度，TRIS缓冲液：100mmol/L, pH 7.2，防腐剂)和R3 (稀释血清中的白蛋白(人), NaCl: 150 mmol/L，磷酸盐缓冲液：50 mmol/L, pH 7.0，防腐剂). 试剂R3用于通过抗原再添加方法进行抗原过量检查。来自ALBT2测试的包装插页文件中描述的程序用作标准方法。
3.2.1 移取方案：
随后将6μL样品和100μL测定缓冲液(R1)添加至反应室，随后添加20μL抗体试剂(R2)，并混合反应混合物。其后，将用20μl稀释液(水)稀释的6µL试剂R3 (抗原过量检查)添加至反应混合物且混合。
3.2.2 用于生成校准曲线的条件：
对于测量，使用340nm作为主要波长，且使用700nm作为校正波长。测定类型是两点终点测定法。两点终点测定法是执行样品空白的终点测定法。在这里考虑在两个不同测量点的两个吸光度读数：通常在添加最后试剂之前或之后不久采集第一读数；在添加最后试剂之后任何时间点采集第二读数。用于校准曲线和因此用于浓度计算的吸光度值通过从第一读数减去第二读数而获得。对于ALBT2，第一读数是在测量点6，且意指添加最终试剂(R2)之前不久，第二读数在测量点15，其对应于1.8分钟的反应时间。为了生成校准曲线，一式两份测量6种来自Roche (目录号03121305)的标准品，其中RCM作为校准类型(Rodbard拟合函数)。
3.2.3 用于检测前带效应的条件：
为了检测前带效应，使用抗原再添加方法。完成测定(在测量点23和24之间)之后，将白蛋白试剂(R 3)添加至测定混合物，且解读信号的额外变化。通常，对于Hook样品，信号减小，对于非Hook样品，信号增加。用于分析物定量和用于抗原-再添加之后的信号分析的波长是相同的。
3.3 用于根据本发明的白蛋白-测定法的程序：
用于这些实验的试剂与用于标准方法的试剂相同：参见第3.2点。使用来自ALBT2测试的包装插页文件中描述的程序，除了前带检查方法。
3.3.1 测量条件：
移取方案：与第3.2.1点中描述的标准方法的移取方案相同。
用于生成校准曲线的条件：与第3.2.2点中描述的标准方法中使用的校准条件相同。
3.3.2 用于根据本发明检测前带效应的条件：
为了检测前带效应，本发明的方法还使用反应速率的分析，然而，使用与用于定量分析物的波长不同的波长。首先，将一种限值应用于测量：计算在波长340nm (700nm校正波长)时的前带测量点5 (pmp5)和前带测量点6 (pmp6)之间的信号差异。将该计算的信号(吸光度)差异与预定限值(对于(Apmp6-Apmp5)为2500)进行比较(参见下表中的第10列)。将计算的信号差异高于该限值的样品直接分类为Hook样品。然而，如果样品的计算的信号差异低于该限值，则通过从在用于检测前带效应的波长时获得的信号计算反应速率比率R进行前带检查(505nm主要波长，700nm校正波长)：
R = [时间段2时的反应速率 / 时间段1时的反应速率] x 100，其中
时间段2时的反应速率 = [信号(时间点4) – 信号(时间点3)] / [时间点4 – 时间点3]且时间段1时的反应速率= [ 信号(时间点2) – 信号(时间点1)] / [时间点2 – 时间点1]。
时间点4：是前带测量点4 pmp4，且与测量点4相同； 时间点3：是前带测量点3pmp3，且与测量点3相同； 时间点2：是前带测量点2 pmp2，且与测量点2相同； 时间点1：是前带测量点1 pmp1，且与测量点1相同； 还参见下表第3列至第6列。
对于各测定法，将表明前带效应的特定和预定R范围(定义为预定下限(参见下表中的第1列)和预定上限(参见下表中的第2列)之间的范围)存储于测定设置中，并且与测量各样品之后获得的R值进行自动比较：如果样品显示在下限和上限外侧(-5至42)(根据下表中的第7列)的R值，则将样品标记为Hook样品。
用于白蛋白测定法的前带检查的设置描述于下表中：
用于前带检查的所用波长：505nm (700nm校正波长)；
用于额外限值的所用波长：340nm (700nm校正波长)；
用于分析物定量的所用波长：340nm (700nm校正波长)。
3.4 使用标准方法和根据本发明的方法的白蛋白-测定法的结果：
结果概述描述于图7中。ALBT2测试的新方法的应用容许通过应用反应速率方法的Hook样品和非Hook样品之间的明显差异。作为结果，第二抗原添加的避免导致节省成本和时间。新方法提供最小的实施努力；该方法的应用不需要试剂和它们的制剂的任何改变。对于其在cobas c分析仪上的应用，仅调整和/或略微改变软件中的输入窗口：测量波长的额外设置的扩展，并且额外设置对于限值(最大限值)是必需的，所述限值可以被定义为特定时间段内的信号变化，用于决定具有极高反应速率的样品是否被立即分类为Hook样品或是否在计算反应速率比率R之后进行判断。

Claims (13)

1.用于通过光度测定法测定可以显示前带效应的样品中分析物的量的方法，其中所述分析物从所述分析物与分析物特异性测定试剂相互作用之后反应混合物的光信号变化来定量，所述方法包括以下步骤：
a)对于待测定样品的分析物生成在至少一个波长和反应时间的校准曲线，且将测量结果储存在仪器平台的数据管理系统中，
b)经完整反应时间，在用于测定所述分析物的波长和至少在用于检测前带效应的额外波长，同时测量待测定样品中的分析物的光信号，所述额外波长不同于用于测定所述分析物的波长，其中用于测定所述分析物的波长和至少在用于检测前带效应的额外波长之间的差异高于10 nm，使得当与相同波长用于测定分析物和检测前带效应时相比，Hook样品和非Hook样品的差异提高，
c)通过使用在用于检测前带效应的波长获得的信号来计算反应速率比率R
R = [时间段2时的反应速率 / 时间段1时的反应速率] x 100
其中
时间段2时的反应速率 = [信号(时间点4) – 信号(时间点3)] / [时间点4 – 时间点3]
且
时间段1时的反应速率= [信号(时间点2) – 信号(时间点1)] / [时间点2 – 时间点1]
d)通过计算比率值R与预定限值的比较，判断所述样品中是否存在前带效应，
e)通过在用于测定所述分析物的波长获得的光信号与所述校准曲线的比较来定量所述分析物的量。
2.根据权利要求1的方法，其中在所述样品中不存在前带效应的情况下，所述样品中的所述分析物的测定量是可报告的结果。
3.根据权利要求1或2的方法，其中任选地采用其它波长用于校正/设空白目的。
4.根据权利要求1或2的方法，其中如果存在前带效应，则自动重复稀释样品的测量。
5.根据权利要求1或2的方法，其中在计算和基于反应速率比率R判断Hook效应的存在之前，通过与预定限值比较来评价在用于测定所述分析物的波长和/或在用于计算R的波长和/或在另一个波长测量的额外信号。
6.根据权利要求1或2的方法，其中定义对于时间段内的信号变化的预定限值，用于忽略具有低于所述预定限值的反应速率的样品，且将此类样品直接分类为非Hook样品。
7.根据权利要求1或2的方法，其中定义对于时间段内的信号变化的预定限值，用于决定具有高于所述预定限值的高反应速率的样品是否被立即分类为Hook样品。
8.根据权利要求1或2的方法，其中定义对于时间段内的信号变化的预定限值，用于决定具有高于所述预定限值的高反应速率的样品是否在计算反应速率比率R之后被分类为Hook样品。
9.根据权利要求1或2的方法，其中将包含反应时间、校准点、校准模式和测定类型的测量条件额外应用于测量方案。
10.根据权利要求1或2的方法，其中可以在相应的仪器平台上使用可商购的分光光度实验室测试来检测hook效应，而无需应用预分析样品稀释处理和/或通过分析物再添加改变测定程序。
11.根据权利要求1或2的方法，其中所述分析物是白蛋白。
12.经配置以进行权利要求1-11中任一项的方法的仪器平台，其使用可商购的分光光度实验室测试法，用于通过光度测定法测定可以显示前带效应的样品中分析物的量，其中所述仪器平台的数据管理系统能够处理反应时间、校准点、校准模式、波长、血清指标的数据，用于选择最佳拟合校准曲线。
13.根据权利要求12的仪器平台，其中进行包含测量波长、反应时间、校准模式、校准点数量的测量结果的额外校正，且针对彼此进行抵消。
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