ES2636925T3 - Procedimiento para la detección del efecto prozona de ensayos fotométricos - Google Patents

Abstract

Procedimiento para la determinación de la cantidad de un analito específico en una muestra que puede presentar un efecto prozona mediante ensayos fotométricos, en el que el analito específico se cuantifica a partir del cambio en la señal óptica de la mezcla de reacción después de la interacción del analito con reactivos de ensayo específicos del analito, que comprende las siguientes etapas: a) generar una curva de calibración a al menos una longitud de onda y tiempo de reacción para el analito específico de una muestra a determinar y depositar los resultados de medición en un sistema de gestión de datos de la plataforma de instrumentos, b) medir simultáneamente la señal óptica para el analito específico en la muestra a determinar a la longitud de onda utilizada para la determinación del analito y al menos a una longitud de onda específica adicional utilizada para la detección del efecto prozona durante el tiempo de reacción completo, que es diferente de la longitud de onda utilizada para la determinación del analito, en el que la diferencia entre la longitud de onda utilizada para la determinación del analito y al menos una longitud de onda específica adicional utilizada para la detección del efecto prozona es superior a 10 nm, de tal manera que existe una diferenciación mejorada de las muestras con efecto gancho y sin efecto gancho en comparación con cuando se usa la misma longitud de onda para la determinación del analito y la detección del efecto prozona, c) calcular la relación de velocidades de reacción R utilizando las señales obtenidas a la longitud de onda utilizada para la detección del efecto prozona R >= [velocidad de reacción en el periodo de tiempo 2/velocidad de reacción en el periodo de tiempo 1] x 100 con velocidad de reacción en el período de tiempo 2 >= [señal (punto de tiempo 4) - señal (punto de tiempo 3)]/[punto de tiempo 4 - punto de tiempo 3] y velocidad de reacción en el período de tiempo 1 >= [señal (punto de tiempo 2) - señal (punto de tiempo 1)]/[punto de tiempo 2 - punto de tiempo 1] d) determinar si está presente un efecto prozona en la muestra por comparación del valor de relación calculado R con valores límite predeterminados, e) cuantificar la cantidad del analito específico por comparación de la señal óptica obtenida a la longitud de onda utilizada para la determinación del analito con la curva de calibración.

Description

DESCRIPCiÓN

Procedimiento para la detección del efecto prozona de ensayos fotométricos

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un procedimiento para la determinación de la cantidad de un analito específico en una muestra mediante inmunoensayos fotométricos, turbidimétricos o nefelomélricos combinados con una decisión de si un efecto prozona está o no presente, en el que el ana lito específico se cuantifica a partir del cambio en la señal óptica de la mezcla de reacción después de la interacción del analito con reactivos de ensayo específicos del analilo

Los inmunoensayos homogéneos se caracterizan por un procedimiento que está libre de etapas de separación y lavado. Debido a su sencillo procedimiento en un solo paso, su rentabilidad y su rapidez, los inmunoensayos homogéneos gozan de una gran popularidad en los laboratorios clínicos y se utilizan habitualmente para el diagnóstico clínico en analizadores de química clínica altamente automatizados

Sin embargo, los inmunoensayos homogéneos están limitados por el efecto hook o "gancho" a alta dosis, también llamado efecto prozona o efecto de exceso de antígeno, un fenómeno en el que la respuesta del ensayo a altas concentraciones de analito disminuye y da lugar a valores medidos del anal ita que son falsamente más bajos. Este efecto se ha observado para muchos anal itas y afecta a ensayos turbidimétricos y nefelométricos, así como a otros inmunoensayos de un solo paso, y es causado por concentraciooes excesivamente altas de analito que saturan los sitios de unión de los anticuerpos, evitando así la formación de complejos detectables anticuerpo-analito-anticuerpo. De esta manera, la respuesta del ensayo aumenta inicialmente al aumentar la concentración de antígeno y, a continuación, tras alcanzar un valor de concentración crítico, la respuesta del ensayo disminuye produciendo una curva en forma de campana, la llamada curva de Heidelberger. Los desarrolladores y los fabricantes de los ensayos hacen habitualmente todo lo posible por reducir el efecto gancho, por ejemplo, aumentando la cantidad de anticuerpos y reduciendo los volúmenes de muestra requeridos para el análisis. En conclusión, el efecto gancho a dosis alta es un fenómeno que es inherente a los diseños de inmunoensayos de un paso; en un formato de ensayo de dos pasos, que utiliza etapas de lavado para eliminar el exceso de antígeno, el efecto gancho a dosis alta se evita. Los efectos prozona también se pueden observar en otros ensayos de unión de un solo paso que utilizan aglutinantes no basados en anticuerpos.

La mayoría de los analizadores automatizados modemos usados en la química clínica han incorporado procedimientos para recooocer el efecto prozona en las muestras medidas. En el caso de que una muestra presente un efecto prozona, la medición de la muestra es marcada por el analizador. Para dichas mediciones marcadas, se recomienda realizar una nueva medición de la muestra después de una dilución o incluso que el analizador realice automáticamente la medición, dependiendo del ajuste del instrumento

Estado de la técnica

Existen varios procedimientos para determinar si una muestra presenta un efecto prozona:

El procedimiento de dilución de muestras verifica la existencia de un efecto prozona sometiendo a ensayo muestras no diluidas y muestras después de la d ilución. Si el resultado tras la dilución es más alto que el de la muestra no diluida, entonces la muestra no diluida mostraba muy probablemente el efecto prozona. Desafortunadamente, este enfoque aumenta el coste de mano de obra y de reactivos

Para el procedimiento de readición de antigeno, se añade anal ita adicional a la muestra después de que se complete su medición y se interpreta el cambio adicional en la señal. Aunque este procedimiento es preciso en la detección del efecto prozona, los costes de reactivos aumentan debido a la adición de antígeno. Además, el flujo de trabajo en el analizador se incrementa mediante la etapa de pipeteado adiciona l, lo que cooduce a un rendimiento reducido. Además, el reactivo antigénico ocupa espacio adicional en el analizador

El procedimiento cinético verifica la existencia de un exceso de antigeno mediante el análisis de los datos cinéticos obtenidos durante la medición de la muestra. En la mayoria de los casos, la cinética de reacción depende de la concentración de analito: las muestras de baja concentración pueden presentar señales crecientes, mientras que las muestras de alta concentración pueden presentar un incremento de señal más rápido al principio y mucho menor al final de la reacción, La diferencia descrita se puede usar para reconocer la presencia del efecto prozona,

El procedimiento cinético aplicado en los analizadores cobas c de Rache también se denomina procedimiento de velocidad de reacción. Aquí se compara la tasa de cambio en la absorbancia en dos momentos diferentes después de la adición final del reactivo (véanse los manuales de operador de cobas c y la formación del manual del operador de cobas c): la relación entre la velocidad de reacción al final de la reacción y la velocidad de reacción al comienzo de la reacción, expresada como porcentaje, se define como el valor de comprobación de prozona PC. Para cada ensayo, los intervalos de PC específicos, definidos como el intervalo entre un límite inferior y un límite superior, que

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indican un efecto prozona se almacenan en los ajustes de ensayo y se comparan automáticamente con los valores

de pe obtenidos después de la medición de cada muestra (véanse las figuras 2, 3 Y 4 de ~Analjzador cobas e 311casI CD, Compendium of Background Information") En caso de que esté presente un efecto prozona, el resultado obtenido para la muestra se marca con >Kin.

Opcionalmente, se pueden definir hasta dos limites diferentes (véanse las casillas 8 y 9 de los ajustes de la figura 4) en los analizadOfes cobas e de Rache y se pueden aplican a cada medida que decide cómo proceder antes de analizar el valor de comprobación de prozona pe para una muestra. Estos límites son valores de referencia para señales que se obtienen de una muestra a la longitud de onda utilizada para la determinación del analito calculando el cambio en la señal en un cierto periodo de tiempo. Estos límites permiten ignorar muestras coo velocidades de reacción extremadamente bajas procedentes de una comprobación de prozonas y dasificar dichas muestras directamente como muestras sin efecto gancho. Una desventaja del procedimiento cinético utilizado en los analizadores cobas c es que la diferenciaciórl entre las muestras con efecto gancho y sin efecto gancho no siempre es óptima, lo que provoca dificultades a la hora de aplicar el procedimiento a diferentes lotes de un mismo ensayo al crear un marcado erróneo, por ejemplo, marcado como ~Intervalo de medición superior excedido~ en lugar de ~Muestra con efecto gancho~ o viceversa

otra desventaja importante de este procedimiento es que no es aplicable para todos los ensayos, por ejemplo, el ensayo de albúmina, y, en tales casos, se debe aplicar el costoso procedimiento de readición de antígeno descrito anteriormente, aumentando el flujo de trabajo en el analizador debido a la etapa de pipeteado adicional, lo que conduce a un rendimiento reducido. Además, el reactivo antigénico ocupa espacio adicional en el analizador. Varios procedimientos de detección de prozona utilizan fórmulas simples de análisis de datos cinéticos. Los analizadores que aplican estos procedimientos se suelen desconectar debido a la alta tasa de falsas alarmas de prozona (Clin. Chem. Lab. Med. 1999).

En el procedimiento cinético del documento JP 06213893 se utiliza cualquier punto de medición para la comprobación de prozona. En el documento JP 10282099 se discrimina la presencia o ausencia de un efecto prozona comparando entre sí los datos medidos de dos secciones de medición dentro del tiempo de medición.

En JP63019560 se calcula la relación entre los valores de absorbancia A (H) Y A (;\2), detectados en las longitudes de onda"A1 y "A2, Y se compara con un nivel de discriminación preestablecido para detectar un efecto prozona

El documento JP 04204378 describe un procedimiento de detección de prozona que calcula la relación de la diferencia de absorbancia a dos longitudes de onda diferentes M ("A1) Y M (;\2) Y compara el valor con un valor de referencia preestablecido.

Las mediciones de los documentos JP 05093725 Y JP 06094717 se realizan a 2 longitudes de onda diferentes, seguidas de la determinación de la relación de desviación entre los valores medidos y un valor objetivo usando fórmulas de regresión lineal. La detección de un efecto prozona se realiza basándose en la desviación.

El documento EP1845373 se refiere a un procedimiento para determinar la cantidad de un analito con una sustancia de unión a analito en una muestra usando una curva de calibración específica, en el que la cantidad del analito de una muestra positiva a la prozona se determina en una curva de calibración diferente.

La técnica previa mencionada anteriormente utiliza reactivos caros, requiere mediciones adicionales o procedimientos complejos de evaluación de señales. Además, algunos procedimientos no siempre son aplicables a todos los ensayos

Problema a resolver

El problema a resolver es proporcionar un procedimiento para la detección de prozona que sea rentable (idealmente sin necesidad de consumir ningún reactivo), rápido (idealmente mediante un procedimiento de detección que se realiza simultáneamente en la etapa de cuantificación de la muestra), fácil, seguro (idealmente con pocas o ninguna alarma falsa de prozona) y que se pueden implementar en analizadores de laboratorio automatizados.

El procedimiento de la presente invención permite una manera rentable sin necesidad de consumir ningún reactivo. Es rápido y fácil porque el procedimiento de detección de prozona se realiza de forma simultánea a la etapa de cuantificación de la muestra y es seguro porque detecta si está presente un efecto prozona en una muestra. Además, el procedimiento se puede implementar en analizadores de laboratorio automatizados.

Sumario de la invención

La presente invención proporciona un procedimiento mejorado para detectar un fenómeno de prozooa mediante el análisis de los datos cinéticos obtenidos durante la medición de la muestra. Los modos de realización de la invención se dan en las reivindicaciones dependientes

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En un primer aspecto, el procedimiento de la presente invención para la determinación de la cantidad de un analilo específico en una muestra que puede presentar un efecto prozona mediante ensayos fotométricos, en el que el analilo específico se cuantifica a partir del cambio en la señal óptica de la mezcla de reacción después de la interacción del analilo con reactivos de ensayo específicos del analilo.

En una primera etapa, se genera una curva de ca libración a al menos una longitud de onda y tiempo de reacción para el ana lito específico de una muestra a determinar y los resultados de medición se depositan en un sistema de gestión de datos de la plataforma de instrumentos.

La señal óptica se mide simultáneamente para el analilo específico en la muestra a determinar a la longitud de onda utilizada para la determinación del ana lito y al menos a una longitud de onda especifica adicional utilizada para la detección del efecto prozona durante todo el tiempo de reacción. Esta longitud de onda adicional es diferente de la longitud de onda utilizada para la determinación del ana lito, en el que la diferencia entre la longitud de onda utilizada para la determinación del analito y al menos a una longitud de onda especifica adicional utilizada para la detección del efecto prozona es superior a 10 nm, de tal manera que existe una diferenciación mejorada de las muestras con efecto gancho y sin efecto gancho en comparación con cuando se usa la misma longitud de onda para la determinación del ana lito y la detección del efecto prozona.

En la etapa siguiente, se calcula la relación de velocidades de reacción R utilizando las señales obtenidas a la longitud de onda utilizada para la detección del efecto prozona R == [velocidad de reacción en el periodo de tiempo 2/velocidad de reacción en el periodo de tiempo 1] x 100, con la velocidad de reacción en el periodo de tiempo 2::: [señal (punto de tiempo 4) -señal (punto de tiempo 3)V[punto de tiempo 4 -punto de tiempo 3] y la velocidad de reacción en el periodo de tiempo 1 == [señal (punto de tiempo 2) -señal (punto de tiempo 1 )]/[punto de tiempo 2 -punto de tiempo 1].

Por comparación del valor de relación calculado R con los valores limite predeterminados, se determina si existe un efecto prozona en la muestra.

Finalmente, se cuantifica la cantidad del ana lito específico por comparación de la señal óptica obtenida a la longitud de onda utilizada para la determinación del ana lito con la curva de calibración.

En un modo de realización de la presente invención, opcionalmente, se pueden definir y aplicar límites adicionales a cada medida que decide cómo proceder antes, es decir, antes de calcular y determinar la presencia de un efecto gancho basado en la relación de velocidades de reacción R. Estos lim ites son va lores de referencia para señales que se miden a la longitud de onda utilizada para la determinación del analito y/o a la longitud de onda utilizada para la detección del efecto prozona y/u otras longitudes de onda. En un ejemplo, dicho límite se puede definir para un cambio en la señal en un cierto periodo de tiempo, para ignorar muestras con velocidades de reacción extremadamente bajas procedentes de una comprobación de prozonas y clasificar dichas muestras directamente como muestras sin efecto gancho. Un ejemplo adicional para dicho límite se puede definir para un cambio en la señal en un cierto periodo de tiempo, para decidir si una muestra con una velocidad de reacción extremadamente alta se clasifica inmediatamente como muestra con efecto gancho o si la decisión se toma después del cálculo de la relación de velocidades de reacción R

En un aspecto adicional de la presente invención, se proporciona una plataforma de instrumentos configurada para llevar a cabo el procedimiento mencionado anteriormente usando pruebas de laboratorio espectrofotométricas comercialmente disponibles para determinar la cantidad del ana lito específico en una muestra que puede presentar un efecto prozona mediante ensayos fotométricos, en el que el sistema de gestión de datos de la plataforma de instrumentos es capaz de procesar datos de tiempos de reacción, puntos de calibración, modo de calibración, longitudes de onda, para realizar simultáneamente la determinación de analito y la detección del efecto prozona a partir de una medición de muestra

otro aspecto de la presente invención es el procedimiento mencionado anteriormente en el que el ana lito es albúmina

Descripción detallada de la invención

La presente invención se refiere a un procedimiento mejorado para detectar un fenómeno de prozona mediante el análisis de los datos cinéticos obtenidos durante la medición de la muestra

Definic iones:

El término ~ensayo especlrofotométrico~, también denominado ~ensayo fotométrico~, se conoce bien en la técnica. Los ensayos fotométricos abarcan inmunoensayos turbidimétricos y nefelométricos. En los inmunoensayos turbidimétricos y nefelométricos, el analito específico se cuantifica a partir del cambio en la turbidez de la mezcla de reacción basada en la aglutinación del analito específico y un socio de unión específico del ana lito.

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El término "turbidimetría y nefelometría" son procedimientos conocidos en la técnica para determinar la cantidad de opacidad o turbidez en una solución basada en la medición del efecto de dicha turbidez sobre la transmisión y dispersión de la luz. La turbidez en un líquido está causada por la presencia de partículas en suspensión finamente divididas. Si se hace pasar un haz de luz a través de una muestra turbia, su intensidad se reduce por dispersiórJ y la cantidad de luz dispersada depende de la concentración, tamaño y distribución de tamaño de las partículas. El espectrofolómetro mide el aumento de la turbidez (es decir, la reducción de la intensidad de la luz transm itida), que se debe al aumento del la maño de partícula resultante de la reacción de inmunoaglutinaciórJ.

Este aumento de la turbidez es una medida directa de la inmunoaglutinación causada por el analito o una medida indirecta de la inhibición de la inmunoaglutinaciórJ causada por el analito. En nefelometría se mide la intensidad de la luz dispersada, mientras que en turbidimetria se mide la intensidad de luz transmitida a través de la muestra

Los ensayos turbidimétricos implican la medición de la intensidad del haz incidente a medida que pasa a través de la muestra. El haz de luz puede pasar a través de una suspensión o ser absorbido, reflejado o dispersado por las partículas. Como consecuencia, la intensidad de la luz disminuye a medida que se transmite a través de la suspensión. Para las particulas no absorbentes, la disminución de la intensidad luminosa debida a la dispersión se expresa como turbidez.

Los ensayos nefelométricos se refieren a la medición de la luz dispersada en un ángulo 9 definido desde el haz incidente cuando el haz incidente pasa a través de la muestra. En nefelometria se mide el cambio en la intensidad de la luz dispersada después de un tiempo, ya que las especies de dispersión aumentan rápidamente de tamaño. La luz dispersada es proporcional a las concentraciones iniciales de antígeno cuando se mide en presencia de un complejo anticuerpo-látex fijo. Se describen explicaciones adicionales en J.A. Molina-Bolivar et al., Journal of Macromolecular Science, Part C-Polymer Review, 45:59-98, 2005.

El procedimiento de inmunoensayo de la presente invención funciona con todas las pruebas de aglutinación conocidas con y sin mejora por micropartículas. Preferentemente, se utiliza dentro de la presente invención una Hprueba de aglutinación por dispersión de luz mejorada por micropartículasH, que también se denomina ~inmunoensayos turbidimétricos mejorados por partículas~ (PETIA). Los inmunoensayos basados en aglutinación se usan rutinariamente en el diagnóstico clínico para la cuantificación de proteínas séricas, fármacos terapéuticos y drogas de abuso en analizadores de química clínica, ya que tienen los beneficios de ser ensayos casi homogéneos que no requieren ninguna etapa de separación o lavado. Para potenciar la detección óptica entre el analito específico y un socio de unión específico del ana lito en la mezcla de reacción, el analito o el socio de unión específico del ana lito están unidos a partículas adecuadas. De este modo, el analito reacciona y se aglutina con las partículas que se recubren con socios de unión específicos de analito. Al aumentar la cantidad de analito, aumentan la aglutinación y el tamaño de los complejos, lo que conduce además a un cambio en la dispersión de la luz. Las partículas aglutinadas se determinan a continuación mediante mediciones turbidimétricas y nefelométricas

El ana lito comprende una mezcla de partículas con propiedades de fuerte dispersión de la luz que llevan al menos un socio de unión de alta reactividad para el analito y partículas con propiedades de débil dispersión de la luz que llevan al menos un socio de unión de baja reactividad para el ana lito, como se describe en el documento EP 0898169. Las partículas con propiedades de fuerte dispersión de la luz tienen un tamaño mayor y/o un indice de refracción superior al de las partículas con propiedades de débil dispersión de la luz. El reactivo de microparticulas para un inmunoensayo de dispersión de luz mejorada por micropartículas para determinar la cantidad de un analito, que comprende una mezcla de microparticulas de 30 a 600 nm de diámetro, que incluye particulas con propiedades de fuerte dispersión de la luz que llevan al menos un socio de unión de alta reactividad para el ana lito y partículas con propiedades de débil dispersión de la luz que llevan al menos un socio de unión de baja reactividad para el analito

El material de las micropartículas puede ser cualquier material inorgánico, orgánico o polimérico adecuado para ensayos de dispersión de luz mejorada por micropartículas. El material de las microparticulas puede ser cualquier material inorgánico, orgánico o polimérico adecuado para ensayos de dispersión de luz mejorada por microparticulas. Dichos materiales incluyen, por ejemplo, selenio, carbono, oro; nitruros de carbono, silicio o germanio, por ejemplo, Si3N4; óxidos de hierro, titanio o silicio, por ejemplo, Ti02 o Si0 2; y materiales poliméricos tales como, por ejemplo, poliestireno, poli(doruro de vinilo), resinas epoxi, poli(cloruro de vinilideno), poli(metacrilato de alfanaftilo), poli{vinilnaftaleno), o copolímeros de los mismos, en particular copolímeros de estireno y un compuesto etilénicamente insaturado copolimerizable, por ejemplo, copolímeros de estireno-(met)acrilato. Son particularmente adecuadas microparticulas hechas de materiales poliméricos, así como particulas núcleo-envoltura que consisten en un núcleo interno polimerizado a partir de estireno y una envoltura externa formada por copolimerización a partir de estireno con un compuesto etilénicamente insaturado copolimerizable. La mayoría de los ensayos basados en particulas emplean particulas de látex, siendo el tipo predominante el poliestireno

El térm ino "determinar", como se usa en el presente documento, se refiere a valorar, diagnosticar, decidir, identificar, evaluar, cuantificar o clasificar un analito especifico en una muestra a partir del cambio en la señal óptica de la mezcla de reacción de un ensayo fotométrico basado en mediciones turbidimétricas o nefelométricas.

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El término ~cantidad", como se usa en el presente documento, abarca la cantidad absoluta de un analito o la cantidad y{o concentración relativa de dicho analito yfo cualquier valor y{o parámetro que se pueda correlacionar con el mismo y{o se pueda derivar del mismo

El término "analilo" de acuerdo con la presente invención incluye cualquier "compuesto de diagnóstico in vitro" tal como, por ejemplo, proteínas séricas, fármacos terapéuticos y drogas de abuso. Los analilos representativos incluyen, pero no se limitan a, antígenos, haplenos, anticuerpos, proteínas, péplidos, aminoácidos, hormonas, esteroides, marcadores de células de cáncer, células de tejidos, virus, vitaminas, ácidos nucleicos, pesticidas, enzimas, sustratos enzimáticos y cofactores enzimáticos. Como se utiliza en el presente documento, un "analito" o "analito específico" se refiere a la sustancia cuya presencia ylo concentración en una muestra ha de determinarse. El término "analito" incluye cualquier sustancia para la que exista un socio de reacción especifico, por ejemplo, una molécula o sustancia de unión que se una específicamente al analito, como anticuerpos, o una molécula que reaccione específicamente con el analito, como enzimas), o para el que se puede preparar un socio de unión especifico

El término "analito específico" en el contexto de la presente invención significa que, para cada anal ita en una muestra a medir, se pueden determinar curvas de calibración específicas y longitudes de onda y tiempos de reacción específicos que se optimizan para cada analito específico para cuantificar la concentración y que pueden diferir de un analito a otro.

El término "socio de reacción especifico de analito", como se utiliza en el presente documento, se refiere al que es capaz de reaccionar con el analito específico para formar un complejo de reacción, como un inmunocomplejo antigeno-anticuerpo. Típicamente, los socios de reacción especificos del analito incluyen, pero no se limitan a, proteínas de unión, antígenos, fragmentos de antígeno, anticuerpos, fragmentos de anticuerpos, ácidos nUcleicos, receptores y socios de unión mejorados por particulas. Dichos socios de reacción especificos para un analito dado se pueden obtener a partir de fuentes comerciales o se pueden preparar de acuerdo con procedimientos estándar conocidos por los expertos en la técnica. Los ejemplos de pares de socios de reacción específicos del anal ita incluyen, pero no se limitan a, hapteno:anticuerpo, célula:anticuerpo, biotina:avidina, hormona:receptor, polipéptido:anticuerpo, anticuerpo:anticuerpo, oligonucleótido:ADN o ARN complementario. El término "socio de unión específico de analito" se puede utilizar igualmente en lugar de "socio de reacción específico de analito".

El término "anticuerpo", como se utiliza en el presente documento, se refiere a inmunoglobulinas que se producen en respuesta a la detección de una sustancia extraña, e incluye moléculas intactas, así como fragmentos funcionales de las mismas, tales como Fab, F(ab'h y Fv. Los anticuerpos que se pueden usar como socios de unión inmunológicos

en el ensayo de la presente invención incluyen anticuerpos policlonales de cualquier especie, anticuerpos monoclonales de cualquier especie (incluyendo anticuerpos quiméricos ylo anticuerpos recombinantes). Debido a su capacidad de producirse de forma idéntica en cantidades ilimitadas, en general son preferentes los anticuerpos monoclonales o fragmentos de los mismos.

El término "antígeno", como se usa en el presente documento, se caracteriza por su capacidad para unirse en el sitio de unión al antígeno de un anticuerpo. La región de un antígeno que es reconocida por un anticuerpo, y a la que se une el anticuerpo, se denomina "epítopo" Un antigeno es una sustancia que es capaz de inducir una respuesta inmune, es decir, producción de anticuerpos, cuando se introduce en un cuerpo animal o humano. Un hapteno es una molécula pequeña que puede provocar una respuesta inmune sólo cuando está unida a un portador grande tal como una proteína. El portador puede ser uno que tampoco provoque una respuesta inmune por sí mismo. Una vez que el cuerpo ha generado anticuerpos para un aducto hapteno-portador, el hapteno de molécula pequeña también puede ser capaz de unirse al anticuerpo.

El término "muestra", como se usa en el presente documento, se refiere a una muestra de un Huido corporal seleccionado de sangre, es decir, sangre completa, plasma o suero u orina, LCR, esputo o a una muestra de células separadas o a una muestra de un tejido o un órgano de un individuo respectivo. Las muestras de fluidos corporales se pueden aislar mediante técnicas bien conocidas. Se pueden aislar muestras de tejidos u órganos a partir de cualquier tejido u órgano mediante, por ejemplo, biopsia. Las células separadas se pueden aislar a partir de los fluidos corporales o tejidos u órganos mediante técnicas de separación tales como centrifugación o clasificación celular. Preferentemente, los lisados de las muestras de células, tejidos u órganos se aIslan a partir de dichas células, tejidos u órganos que expresan o producen los péptidos a los que se hace referencia en el presente documento

Se usan calibraciones no lineales para pruebas cuyas absorbancias a diferentes concentraciones forman una gráfica no lineal pero reproducible. Se requieren al menos tres y un máximo de seis calibradores para la calibración. Un tipo típico de calibración no lineal es la función de Rodbard. Además, existen tipos de ca libración cuyas curvas de calibración son funciones de interpolación definidas por partes, como Spline.

La sensibilidad, la sensibilidad analítica, el límite inferior de detección (LOL), el límite de blanco (LOS), el límite de detección (LOO) y el límite de cuantificación (LOO) son términos utilizados para describir la concentración más pequeña de una medida y que se pueden medir de forma fiable por un procedimiento analltico. Todos estos términos

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están relacionados pero tienen definiciones distintas (siehe Lit elin biochem rev 2008, 29, 49). Por ejemplo, el térm ino ~sensibjljdad analítica" se define como la pendiente de la curva de calibración.

El término "límite de detección inferior" (LDL), como se utiliza en el presente documento, también se denomina intervalo de medición inferior. Un enfoque típico para estimar el LDL consiste en medir réplicas, tales como n =21, de un ca librador de cero o muestra en blanco, determinando el valor medio (x) y la desviación estándar (DEl. El LDL se calcula como x+2DE o x+3DE. Este procedimiento para la determinación del LDL está de acuerdo con el procedimiento descrito por Kaiser (H. Kaiser, Fresenius Zeilschrift für analytische Chemie, 1965, 209, n.o 1, páginas 1-18)

El término "límite de detección superior" (UDL), como se utiliza en el presente documento, también se denomina intervalo de medición superior. El UDL es la cantidad más alta del analito en una muestra que se puede determinar de manera fiable. En la presente invención, el UDL se determinó evaluando la linealidad del procedimiento y luego seleccionando el valor de concentración más alto dentro del intervalo lineal como el UDL. Se dice que el procedimiento es lineal cuando la recuperación del analito de una serie de soluciones de muestra (valor medido) es proporcional a la concentración real del analito (valor rea l) en las soluciones de muestra (Arch Pathol Lab Med 2004, 128, páginas 44-48). La forma de la curva de ca libración, que puede ser parabólica o sigmoide, no debe confundirse con la linealidad del procedimiento que describe la relación entre el valor medido y el valor real. La curva de calibración describe la relación entre la señal y la concentración.

Es una práctica común determinar la concentración de un analito usando al menos una "curva de calibración" (también conocida comúnmente como curva estándar o curva de trabajo) que se ha dibujado preliminarmente trazando la interrelación entre las concentraciones conocidas del analito en las muestras estándar y los valores analíticos medidos (señales ópticas) tales como densidades ópticas de las muestras estándar. Cuando la curva de calibración tiene una linealidad adecuada en un rango más amplio en la región de análisis cuantitativo, la curva de calibración se puede preparar con un número relativamente menor de muestras estándar, que están cerca del límite superior, del límite inferior y del punto intermedio en el intervalo de determinación del análisis cuantitativo. En la práctica, sin embargo, hay muchas curvas de ca libración que no son lineales en general. La curva de calibración turbidimétrica o nefelométrica, preparada a partir de la absorbancia a una loogitud de onda específica, puede tener una curva de calibración en forma de S no lineal, en la que la sensibilidad se deteriora a una coocentración cercana a cero y se salura en un lado de mayor concentración. La determinación de la ca libración en forma de S requiere una calibración multipunto en la que es obligado el uso de las muestras estándar de la pluralidad de las concentraciones.

Al generar una curva de calibración para un ensayo de aglutinación basado en mediciones de la turbidez de la mezcla de reacción, la selección de la longitud de onda desempeña, junto al tiempo de reacción, un papel crucial para la pendiente (sensibilidad analítica) de la curva y el intervalo de medición superior alcanzable. La selección de una longitud de onda y un tiempo de reacción correspondiente para el cálculo de señales destinada a la generación de una curva de calibración puede requerir un compromiso entre la sensibilidad analítica y el intervalo de medición superior

Un modo de realización de la presente invención es generar una curva de calibración a al menos una longitud de onda y tiempo de reacción para el analito especifico de una muestra a determinar y los resultados de medición se depositan en un sistema de gestión de datos de la plataforma de instrumentos.

Posteriormente, la señal óptica para el analito específico en la muestra a determinar se mide simultáneamente a la longitud de onda utilizada para la determinación del analito y al menos a una longitud de onda especifica adicional utilizada para la detección del efecto prozona durante todo el tiempo de reacción. Esta o estas longitudes de onda especificas adicionales son diferentes de la longitud de onda usada para la determinación del analito

La diferencia entre las longitudes de onda utilizadas para la determinación del analito y al menos una longitud de onda especifica adicional utilizada para la detección del efecto prozona es superior a 10 nm

Preferentemente, esta o estas longitudes de onda específicas adicionales presentan una diferencia de 20 nm. En situaciones específicas, la diferencia entre la longitud de onda utilizada para la determinación del analito y al menos una longitud de onda especifica adicional utilizada para la detección del efecto prozooa puede ser incluso superior a 20 nm

El término "longitud de onda utilizada para la determinación del analito", también denominada longitud de onda principal, así como la al menos una longitud de onda para la detección del efecto prozona, como se usa en el presente documento, se refiere a las longitudes de onda generadas con un fotómetro de longitud de onda múltiple conocido en la técnica. Los fotómetros comunes son espectrofotómetros o turbidímetros para inmunoensayos turbidimétricos y nefelómetros para inmunoensayos nefelométricos. La detección de estos ensayos en los instrumentos cobas® c se basa en un fotómetro con una lámpara halógena de tungsteno como fuente de irradiación, una rejilla para generar luz monocromática y una matriz de fotodiodos (12 diodos que producen longitudes de onda entre 340 y 800nm) como detector. Un fotómetro, por ejemplo, el analizador cobas C® 311 de Rache tiene la

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capacidad de medir simultáneamente 12 longitudes de onda entre 300 nm y 800 ± 2 nm. Preferentemente se utilizan las longitudes de onda de 340, 376, 415, 450, 480, 505, 546, 570, 600, 660, 700, 800 ± 2 nm. El procedimiento de la presente invención es especialmente ventajoso si se usa en analizadores automatizados, tales como el cobas e 311 , que tiene la capacidad de medir múltiples longitudes de onda simultáneamente. Dependiendo de la arquitectura del espectrofolómetro elegido y de las longitudes de onda disponibles, que pueden diferir de un dispositivo a otro, se seleccionan una o más longitudes de onda específicas entre múltiples longitudes de onda. Las mediciones se realizan preferentemente a una temperatura definida, preferentemente entre 20 y 40 grados centígrados, lo más preferentemente a 37 oC.

Un modo de realización de la presente invención es el que usa opcionalmente una segunda longitud de onda o una longitud de onda adicional para fines de correcciónfborrado. Esta longitud de onda adicional se determina como un valor en blanco para la corrección de interferencias y la compensación de ruido fotométrico, también conocida como medición dicromática (Clin. Chem. 1979, 25, 1482-1484). Típicamente se realiza restando la señal a la longitud de onda de corrección de la señal a la longitud de onda principal

El término "señal óptica", como se utiliza en el presente documento, describe la señal que se obtiene realizando una medición de absorbancia de la mezcla de reacción. La señal óptica puede ser un valor de absorbancia en el caso de ensayos turbidimétricos o una señal de luz dispersada para ensayos nefelométricos. La señal óptica para el analito específico en la muestra se puede medir simultáneamente en la mezcla de reacción a múltiples loogitudes de onda, preferentemente en una sola pasada durante todo el tiempo de reacción

El término "simultáneamente", como se utiliza en la presente invención, puede implicar un retardo de tiempo menor de 60 segundos, por ejemplo, un retardo de tiempo menor de 10 segundos, preferentemente menor de 1 segundo, lo más preferentemente menor de 1 ms, o incluso menor de 0,1 ms. Lo más preferentemente, el término "simultáneamente" se refiere a ningún retardo de tiempo

El térm ino "efecto prozona" también denominado efecto gancho a dosis alta o efecto de exceso de antígeno, como se usa en el presente documento, es un fenómeno en el que la respuesta del ensayo a altas concentraciones de analito disminuye y da lugar a valores medidos del analito que son falsamente más bajos

Un modo de realización de la presente invención es calcular la "relación de velocidades de reacción R" utilizando las señales obtenidas a la longitud de ooda utilizada para la detección del efecto prozona

La expresión "relación de velocidades de reacción R", como se usa en el presente documento, se define como' R::: [velocidad de reacción en el periodo de tiempo 2/velocidad de reacción en el periodo de tiempo 1] x 100, con la velocidad de reacción en el periodo de tiempo 2 ::: [señal (punto de tiempo 4) -señal (punto de tiempo 3)]/[punto de tiempo 4 -punto de tiempo 3] y la velocidad de reacción en el periodo de tiempo 1 ::: [señal (punto de tiempo 2) señal (punto de tiempo 1 ))/[punto de tiempo 2 -punto de tiempo 1]

Por comparación del valor de relación calculado R con los valores límite predeterminados, se determina si existe un efecto prozona en la muestra. De acuerdo con la presente invención, se puede detectar un efecto gancho utilizando las pruebas de laboratorio espectrofotométricas comercialmente disponibles en la plataforma de instrumentos correspondiente sin aplicar un tratamiento de dilución de muestra preanalitica y/o sin cambiar el procedimiento de ensayo mediante readición de analito.

Un modo de realización de la presente invención es que si un efecto prozona está presente después de diluir la muestra, la medición de una muestra se repite automáticamente.

Es un modo de realización adicional de la presente invención que, en el caso en que no esté presente ningún efecto prozona en la muestra, la cantidad determinada de ana lito especifico en la muestra es un resultado que se puede notificar. Además, en un modo de realización de la presente invención, una o más señales adicionales se miden opcionalmente a la longitud de onda utilizada para la determinación del analito y/o a la longitud de ooda utilizada para el cálculo de R y/o a otra longitud de ooda se evalúan mediante comparación con valores limite predeterminados antes de calcular y determinar la presencia de un efecto gancho basado en la relación de velocidades de reacción R. De acuerdo oon la presente invención, dicho valor limite predeterminado se puede definir para un cambio en la señal en un cierto periodo de tiempo, para decidir si una muestra con una velocidad de reacción extremadamente alta se clasifica inmediatamente, por ejemplo, como muestra con efecto gancho, o para ignorar muestras con velocidades de reacción extremadamente bajas procedentes de una comprobación de prozona y clasificar dichas muestras directamente, por ejemplo, como muestras sin efecto gancho.

El término "limite predeterminado" o "valor umbral", como se utiliza en el presente documento, se utiliza para cambios en la señal definidos en un cierto período de tiempo, expresado también como velocidad de reacción, o para relaciooes de velocidades de reacción definidas, como se ha descrito anteriormente en la fórmula para R. El limite predeterminado puede ser también un valor de absorbancia tomado en un cierto punto de tiempo. Se aplica un límite predeterminado al procedimiento de la invención para la detección de un efecto prozona. La selección de los limites predeterminados se realiza empiricamente durante el desarrollo del ensayo comparando muestras sin efecto

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gancho con muestras con efecto gancho

Un modo de realización adicional de la presente invención es que condiciones de medición específicas que comprenden tiempos de reacción, puntos de calibración, modo de calibración y el tipo de ensayo se aplican adicionalmente al protocolo de medición de acuerdo con la presente invención

El término "tiempo de reacción", como se utiliza en el presente documento, es, en el caso de ensayos de punto final, el periodo de tiempo entre la primera (o inicial) y la segunda (o final) medición de la señal óptica que se usa para el cálculo de un valor de señal de la presente, La primera medición (o inicial) se realiza antes o poco después de añadir el reactivo final a la mezcla de reacción. En el caso de mediciones cinéticas, el tiempo de reacción puede ser el periodo de tiempo utilizado para el cálculo del valor que expresa el cambio de absorbancia por unidad de tiempo El "tiempo de reacción" puede ser idéntico o más corto que el tiempo de reacción completo. El tiempo de reacción completo es el tiempo que se deja reaccionar la mezcla de reacción, compuesta de reactivos de ensayo específicos de muestra y de analito, después de su mezcla

El término "tiempo de reacción completo", como se usa en el presente documento, es el periodo de tiempo de medición de un ana lito específico a una pluralidad de longitudes de onda. Las muestras se miden simultáneamente a las 12 longitudes de onda diferentes disponibles en el instrumento cobas c®. El tiempo de reacción completo típico del presente inmunoensayo varía entre 1 y 20 minutos. Preferentemente, el tiempo de reacción completo de un espectrofotómetro de longitud de onda múltiple es preferentemente de aproximadamente 10 minutos. En un modo de realización de la presente invención, las señales ópticas del analito especifico se miden durante el tiempo de reacción completo.

El término "número de puntos de calibración", como se usa en el presente documento, es el número de calibradores también denominados estándares de muestra utilizados para generar la curva de calibración

El término "modo de calibración", como se utiliza en el presente documento, se refiere a la determinación de una relación válida entre la señal medida [absorbancia o (para ensayos de velocidad) una tasa de cambio en la absorbancia] y la concentración del analito de interés La representación gráfica de dicha relación señal/concentración es la curva de calibración, también denominada curva de trabajo. Los analizadores utilizan diferentes tipos de modelos matemáticos para describir esta relación. Estos modelos matemáticos se denominan tipos de calibración o modos de ca libración. Existen dos modos básicos de ca libración, los modos de calibración lineal y no lineal. Las calibraciones lineales se utilizan para las pruebas cuando las lecturas de absOfbancia representadas frente a las concentraciones de calibradoreso se encuentran en una linea recta. Si una ca libración lineal se basa en dos mediciones de calibrador, se denomina calibración lineal de dos puntos. Si una calibración se basa en más de dos calibradOfes, se denomina calibración lineal multipunto. Típicamente, una ca libración multipunto se utiliza para ca libraciones no lineales

El término "tipo de ensayo", como se utiliza en el presente documento, se refiere a dos tipos fundamentales de ensayos fotométricos en analizadores: ensayos de punto final y ensayos de velocidad. Las mediciones son tomadas por el fotómetro en puntos de tiempo específicos. Si las mediciones se toman una vez finalizadas las reacciones, la absorbancia (o turbidez) es un indicador de la concentración del componente de la muestra. Estos son los llamados ensayos de punto final. Para los ensayos de velocidad, la relación de velocidades de reacción (tasa de cambio en absorbancia) es proporcional a la concentración del componente de muestra que se analiza. Las mediciones se toman a medida que avanza la reacción. También hay modificaciones de estas dos técnicas posibles en este instrumento, así como una combinación de las dos.

Un aspecto adicional de la presente invención es un procedimiento de la invención, en el que el analito a determinar es albúmina

Otro aspecto de la invención es una plataforma de instrumentos configurada para llevar a cabo un procedimiento de la invención utilizando pruebas de laboratorio espectrofotométricas comercialmente disponibles para determinar la cantidad del analito especifico en una muestra que puede presentar un efecto prozona mediante ensayos fotométricos, en el que el sistema de gestión de datos de la plataforma de instrumentos es capaz de procesar datos de tiempos de reacción, puntos de calibración, modo de calibración, longitudes de onda, para seleccionar la curva de calibración con el mejor ajuste. Se realizan correcciones adicionales de los resultados de medición de acuerdo con la presente invención que comprenden longitudes de onda para la medición, tiempos de reacción, modo de calibración, número de puntos de calibración y se compensan entre sí

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 presenta la curva de Heidelberger e intervalos importantes del inmunoensayo homogéneo de ferritina (figura de la bibliografía Clin. Chem. Lab. Med 1999, 37, 471-476 ).

La Figura 2 presenta la comprobación de prozona en cobas c con el procedimiento de velocidad de reacción.

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La Figura 3 presenta el cálculo del valor de comprobación de prozona en cobas e

La Figura 4 presenta los ajustes para la comprobación de prozona con el procedimiento de velocidad de reacción en

cobasc311 .

La Figura 5 presenta la diferenciación entre muestras con efecto gancho y sin efecto gancho de la prueba CRP L3

a) Esquema con valores pe normalizados (NPCV) del procedimiento estándar y del nuevo procedimiento;

b) Resumen con los resultados obtenidos con el procedimiento estándar y el nuevo procedimiento, así como los factores de mejora IF

La Figura 6 presenta la diferenciación entre muestras con efecto gancho '1 sin efecto gancho del ensayo de Ferritina.

a) Esquema con valores pe normalizados (NPCV) del procedimiento estándar y del nuevo procedimiento;

b) Resumen con los resultados obtenidos con el procedimiento estándar y el nuevo procedimiento, así como los factores de mejora IF

La Figura 7 presenta la diferenciación entre muestras con efecto gancho y sin efecto gancho a) Esquema: se toman lecturas de absorbancia a longitudes de onda de medición de 340 nm a 700 nm, Se calcula la diferencia de señal entre el punto de medición 8 y el punto de medición 20. El límite de diferencia de señal se ajusta a 0,25. Todas las muestras que presentan diferencias de señal >0,25 son muestras con efecto gancho. En todas las muestras que presentan una diferencia de señal SO,25 se realiza una comprobación de prozona. b) Esquema: los valores de comprobación de prozona se calculan aplicando el procedimiento de velocidad de reacción (véase la configuración en 3.3.2.1). Las señales se generan a longitudes de onda de medición de 505 nm-700 nm y se usan para el cálculo del valor de comprobación de prozona. Las muestras con PC fuera de los límites definidos son muestras con efecto gancho.

Ejemplos

Ejemplo 1: Detección de prozona para el ensayo de CRP

1.1 Instrumento:

Para los experimentos se utilizó el analizador cobas c311 de Rache (Rache Diagnostics GmbH), que tiene un espectrofotómetro de longitud de onda múltiple como unidad de detección. El instrumento pipetea automáticamente la muestra y los reactivos de ensayo en celdas de reacción. Se pueden añadir hasta 3 reactivos diferentes, R1 , R2 Y R3, a la muestra. El instrumento utiliza una lámpara halógena de tungsteno como fuente de irradiación (12 V/50 W) y mide la absorbancia simultáneamente a 12 longitudes de onda diferentes (a 340, 376, 415, 450, 480, 50S, 546, 570, 600, 660, 700 Y 800 ± 2 nm) con una matriz de fotodiodos que consiste en 12 fotodiodos. La longitud de la trayectoria óptica es de 5,6 mm y el intervalo óptico del detector es de 0,0000 -3,0000 de absorbancia. Para cada celda de reacción se mide un blanco en agua y luego se toman lecturas de absorbancia 57 veces en 10 minutos, aquí también denominado el tiempo de reacción completo, dando así un total de 57 puntos de medición para la absorbancia a cada longitud de onda, también denominados puntos fotométricos o puntos de ensayo. La concentración se puede calcular utilizando al menos uno de estos puntos de medición. Existen dos tipos fundamentales de ensayos fotométricos en este instrumento' ensayos de punto final y ensayos de velocidad. Las mediciones se realizan a 37 grados Celsius

1.2 Procedimiento para el ensayo de CRP utilizando el enfoque estándar:

Se seleccionó la prueba CRP L3 de Rache (CRPL3, Ref. Cat. 04956842), un ensayo inmunoturbidimétrico mejorado por particulas, para este estudio. La CRP humana se aglutina con partículas de látex revestidas con anticuerpos anti-CRP monoclonales; los agregados se determinan turbidimétricamente. Los reactivos para todas las pruebas Roche se proporcionan en paquetes cobas c. Estos casetes contienen de una a tres botellas de reactivo especialmente diseñadas y tienen etiquetas de código de barras con el reactivo detallado y otra información relacionada con la prueba. Para las pruebas CRP L3 se utilizan dos reactivos en el casete: R1 (tampón TRIS con albúmina de suero bovino y conservantes) y R2 (partículas de látex recubiertas con anti -CRP (ratón) en tampón de glicina, inmunoglobulinas (ratOO) y conservante). El procedimiento descrito en el folleto adjunto de la prueba CRP L3 se usó como procedimiento estándar.

1.2.1 Esquema de pipeteado:

Posteriormente se añadieron 2 ~I de muestra y 150 ~I de tampón de ensayo (R1) a la celda de reacción, seguido de la adición del reactivo de látex (R2, 48 ~I) , la dilución con 24 ~I de diluyente (agua) y el mezclado de la mezcla de reacción

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

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1.2.2 Condiciones para la generación de la curva de calibración:

Para las mediciones se utilizó 570 nm como longitud de onda principal y 800 nm como longitud de onda de corrección. El lipo de ensayo era un ensayo de dos puntos finales. Un ensayo de dos puntos finales es un ensayo de punto final que realiza un blanco de muestra. Aquí se consideran dos lecturas de absorbancia en dos puntos de medición diferentes: la primera lectura se loma generalmente antes o poco después de la adición del reactivo final; la segunda lectura se loma en cualquier momento después de añadir el reactivo final. El valor de absorbancia para la curva de calibración y, por lo tanto, para el cálculo de la concentración se obtiene restando la segunda lectura de la primera lectura. Para CRP L3, la primera lectura está en el punto de medición 8 y corresponde a poco después de la adición del reactivo final, y la segunda lectura está en el punto de medición 18, que corresponde a un tiempo de reacción de 2,0 minutos. Para la generación de la curva de calibración se miden 6 estándares de Roche (Ref. Cat 11355279) como duplicados con spline como tipo de calibración, que se ajusta a los intervalos entre los puntos de datos de los calibradores medidos aproximados por polinomios de tercer grado de manera que se obtenga una curva de calibración uniforme

1.2.3 Condiciones para la detección del efecto prozona:

Para la detección del efecto prozona se utiliza el procedimiento de velocidad de reacción (véanse también las figuras 2, 3 Y 4). En primer lugar, se aplican 2 límites diferentes a la medición: se calculan las diferencias de señal entre el punto de medición de prozona 1 (pmpl) y el punto de medición de prozona 2 (pmpz) y las diferencias de señal entre el punto de medición de prozona 3 (pmp3) Y el punto de medición de prozona 4 (pmp4). Estas diferencias de señal calculadas (absorbancia) se comparan con valores límite predeterminados, 950 para (Apmp2-Apmp1) y 100 para (Apmp4-Apmp3) respectivamente (véanse las columnas 8 y 9 de los ajustes de prozona en la figura 4 y en la tabla siguiente). Las muestras con diferencias de señal calculadas que están por debajo de estos límites se clasifican directamente como muestras sin efecto gancho. Sin embargo, si las diferencias de señal calculadas de una muestra están por encima de estos límites, se realiza una comprobación de prozona calculando los valores PC de acuerdo con la figura 3: la relaciórJ de la velocidades de reacción al final de la reacción (V(PIll'3.pmp4), véanse las columnas 5 y 6 de los ajustes de prozona en la figura 4 y en la tabla a continuación) y la velocidad de reacción al comienzo de la reacción (V( PIll>l .PrIl>Z) , véanse las columnas 3 y 4 del ajuste de prozona en la figura 4 y en la tabla a continuación), que se expresa como porcentaje, se calcula para obtener el valor de comprobación de prozona PC. Para cada ensayo, los intervalos PC específicos, definidos como intervalo entre un límite inferior (véase la columna 1 en la figura 4 y en la tabla a continuaciórJ) y un límite superior (véase la columna 2 en la figura 4 y en la tabla a continuación), que indican un efecto prozona, se almacenan en los ajustes del ensayo y se comparan automáticamente con los valores PC obtenidos después de la medición de cada muestra: si la muestra presenta un valor PC que está dentro del intervalo entre el límite inferior y superior (4-15), entonces la muestra se marca como muestra con efecto gancho. Los ajustes para la comprobación de prozona para CRP L3 se representan en la tabla a continuación (véase también la figura 4 para una descripción detallada)'

Longitud de onda utilizada para la comprobación de prozona, límites adicionales y cuantificación del analito: 570 nm (800 nm de longitud de onda de corrección):

Ajustes de valores de comprobación de prozona (PC) Longitud de onda 570800 nm

Ajustes de límites adicionales: Longitud de onda ' 570800 nm

Límite inferior

Límite supenor pmp1 pmp2 pmp3 pmp4 Comp. O O

4

15 8 11 16 19 dentro 950 100

1.3 Procedimiento para el ensayo de CRP de acuerdo con la invención '

Los reactivos utilizados para estos experimentos fueron idénticos a los utilizados para el procedimiento estándar: véase el punto 1.2. Se utilizó el procedimiento descrito en el folleto adjunto de la prueba CRP L3 con la excepción del procedimiento para la detección de un efecto prozona

1.3.1 Condiciones de medición:

Esquema de pipeteado: es idéntico al esquema de pipeteado del procedimiento estándar descrito en el punto 1.2.1 Condiciones para la generación de la curva de calibración: son idénticas a las condiciones de calibración utilizadas en el procedimiento estándar descrito en el punto 1.2.2.

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1.3.2 Condiciones para la detección del efecto prozona de acuerdo con la invención:

Para la detección del efecto prozona, el procedimiento de la invención también utiliza un análisis de la velocidad de reacción, aunque usando otras longitudes de onda diferentes a las utilizadas para la cuantificación del analilo. En 5 primer lugar, se aplican 2 límites diferentes a la medición: se calculan las diferencias de señal entre el punto de medición de prozona 7 (pmp7) y el punto de medición de prozona 8 (pmp8) y las diferencias de señal entre el punto de medición de prozona 9 (pmp9) y el punto de medición de prozona 10 a la longitud de onda de 660 nm (800 nm de longitud de onda de correcciÓf'l). Estas diferencias de señal calculadas (absorbancia) se comparan con valores límite predeterminados, 500 para (Apmp8-Apmp7) y 200 para (Apmp10-Apmp9) respectivamente (véanse las columnas 8 y

10 9 en la tabla a cootinuación). Las muestras con diferencias de señal calculadas que están por debajo de estos limites se clasifican directamente como muestras sin efecto gancho

Sin embargo, si las diferencias de señal calculadas de una muestra están por encima de estos limites, se rea liza una comprobación de prozona calculando la relación de velocidades de reacción R a partir de las señales obtenidas a la 15 longitud de onda utilizada para la detección del efecto prozona:

R = [velocidad de reacción en el periodo de tiempo 2Jvelocidad de reacción en el periodo de tiempo 1] x 100, con la velocidad de reacción en el periodo de tiempo 2 =[señal (punto de tiempo 4) -señal (punto de tiempo 3)]/[punto de tiempo 4 -punto de tiempo 3] y la velocidad de reacción en el periodo de tiempo 1 =[señal (punto de tiempo 2)

20 seña l (punto de tiempo 1 ))/[punto de tiempo 2 -punto de tiempo 1]

Punto de tiempo 4: es el punto de medición de prozona 4 pmp4 e idéntico al punto de medición 4; punto de tiempo 3: es el punto de medición de prozona 3 pmp3 e idéntico al punto de mediciórl 3; punto de tiempo 2: es el punto de medición de prozona 2 pmp2 e idéntico al punto de medición 2; punto de tiempo 1. es el punto de medición de

25 prozona 1 pmp1 e idéntico al punto de medición 1; véase también las columnas 3 y 6 de la tabla a continuación

Para cada ensayo, los intervalos R específicos y predeterminados, definidos como intervalo entre un límite inferior predeterminado (véase la columna 1 de la tabla a continuación) y un límite superior predeterminado (véase la columna 2 de la tabla a continuación), que indican un efecto prozona, se almacenan en los ajustes del ensayo, y se

30 comparan automáticamente con los valores de R obtenidos después de la medición de cada muestra:

si la muestra presenta un valor de R que está dentro (según la columna 7 en la tabla a continuación) del límite inferior y superior (8-17.2), entonces la muestra se marcará como muestra con efecto gancho.

35 Los ajustes para la comprobación de prozona para CRP L3 se muestran en la tabla a continuación

Longitud de onda usada para la comprobación de prozona: 660 nm (800 nm de longitud de onda de corrección): Longitud de onda utilizada para los límites adicionales: 660 nm (800 nm de longitud de onda de corrección): Longitud de onda utilizada para la cuantificación del analito: 570 nm (800 nm de longitud de onda de corrección)·

40

Parámetros/ajustes del valor de comprobación de prozona· Longitud de onda: 660-800 nm

Limites ad icionales· Longitud de onda: 660-800 nm

Limite inferior

Limite superior pmp1 pmp2 pmp3 pmp4 Comp Limite min Apmp8-Apmp7 Limite mín Apmp10Apmp9

B

17,2 B 10 17 20 dentro 500 (pmp8· 10, pmp7: 8) 200 (pmp10· 2~) pmp9: 17

Opcionalmente, las longitudes de onda a utilizar para cada uno de los límites adicionales pueden ser diferentes En este caso se obtuvieron buenos resultados utilizando la misma longitud de onda para ambos limites adicionales.

45 1.4 Resultados para el ensayo de CRP usando el enfoque estándar y el enfoque de acuerdo con la invención:

La descripción de los resultados se muestra en la figura 5. La aplicación del nuevo enfoque al ensayo de CRP muestra una diferenciación mejorada entre muestras con efecto gancho y sin efecto gancho por un factor de 2,7. El nuevo enfoque brinda mínimos esfuerzos de implementación; la aplicación del enfoque no necesita ningún cambio

50 de reactivos ni de sus formulaciones. Para su aplicación en el analizador cobas c sólo es necesario adaptar las ventanas de entrada del software: extensiórl por el ajuste adicional de la longitud de onda de medición y la posibilidad de introducir valores de límite inferiorfsuperior con unidades decimales, por ejemplo, 17,2 en lugar de solamente 17.

55

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Ejemplo 2: Detección de prozona para el ensayo de ferritina

2.1Inslrumenlo: Véase el punto 1_1

2.2 Procedimiento para el ensayo de ferritina utilizando el enfoque estándar:

Se seleccionó para este estudio la prueba Ferr4 de Rache (Ferr4, Ret. Cat. 04885317), un ensayo inmunolurbidimétrico mejorado por partículas. La ferrilina humana se aglutina con partículas de látex revestidas con anticuerpos anti-ferritina monoclonales; los agregados se determinan turbidimétricamente. Los reactivos para todas las pruebas Reche se proporcionan en paquetes cobas c. Estos casetes contienen de una a tres botellas de reactivo especialmente diseñadas y tienen etiquetas de código de barras con el reactivo detallado y otra información relacionada con la prueba. Para las pruebas Ferr4 se utilizan dos reactivos en el casete: R1 (tampón TRIS, pH 7,5, inmunoglobulinas (conejo), conservante, estabilizantes) y R3 (matriz acuosa que contiene particulas de látex revestidas con anticuerpos anti ferritina humana (conejo), conservante, estabilizantes). El procedimiento descrito en el folleto adjunto de la prueba Ferr4 se usó como procedimiento estándar

2.2.1 Esquema de pipeteado:

Se añadieron posteriormente 10 ¡JI de muestra y 80 ¡JI de tampón de ensayo (Rl) a la celda de reacción, seguido de la adición de 80 ¡JI del reactivo de látex (R3) y el mezclado de la mezcla de reacción

2.2.2 Condiciones para la generación de la curva de calibración:

Para las mediciones se utilizó 570 nm como longitud de onda principal y 800 nm como longitud de onda de corrección. El tipo de ensayo era un ensayo de dos puntos finales. Un ensayo de dos puntos finales es un ensayo de punto final que realiza un blanco de muestra. Aquí se consideran dos lecturas de absorbancia en dos puntos de medición diferentes: la primera lectura se toma generalmente antes o poco después de la adición del reactivo final; la segunda lectura se toma en cualquier momento después de añadir el reactivo final. El valor de absorbancia para la curva de calibración y, por lo tanto, para el cálculo de la concentración se obtiene restando la segunda lectura de la primera lectura. Para CRP L3, la primera lectura está en el punto de medición 24 y corresponde a poco después de la adición del reactivo final, y la segunda lectura está en el punto de medición 57, que corresponde a un tiempo de reacción de 5,1 minutos. Para la generaciórJ de la curva de cal ibración se miden 6 estándares de Roche (Ref. Cal. 11355279) como duplicados con spline como tipo de calibración, que se ajusta a los intervalos entre los puntos de datos de los calibradores medidos aproximados por polinomios de tercer grado de manera que se obtenga una curva de calibración uniforme.

2.2.3 Condiciones para la detección del efecto prozona:

Para la detección del efecto prozona se utiliza el procedimiento de velocidad de reacción (véanse también las figuras 2, 3 Y 4). En primer lugar, se aplica un límite a la medición: se calcula la diferencia de señal entre el punto de medición de prozona 1 (pmp1) y el punto de medición de prozona 2 (pmp2). Esta diferencia de señal (absorbancia) calculada se compara con el valor límite predeterminado, que es 1000 para (Apmp2 -Apmpl) (véase la columna 8 de los ajustes de prozona en la figura 4 y en la tabla a continuación). Las muestras con diferencia de señal calculada que está por debajo de este límite se clasifican directamente como muestras sin efecto gancho. Sin embargo, si la diferencia de señal calculada de una muestra está por encima de este límite, se realiza una comprobación de prozona calculando los valores PC de acuerdo con la figura 3: la relaciórJ de la velocidades de reacción al final de la reacción (v(prIl)3.Pf1l)4), véanse las columnas 5 y 6 de los ajustes de prozona en la figura 4 y en la tabla a continuación) y la velocidad de reacción al comienzo de la reacción (V(p<rl>1.P"l'2), véanse las columnas 3 y 4 del ajuste de prozona en la figura 4 y en la tabla a continuación), que se expresa como porcentaje, se calcula para obtener el valor de comprobación de prozona PC. Para cada ensayo, los intervalos PC específicos, definidos como intervalo entre un límite inferior (véase la columna 1 en la figura 4 yen la tabla a continuación) y un límite superior (véase la columna 2 en la figura 4 y en la tabla a continuación), que indican un efecto prozona, se almacenan en los ajustes de I ensayo y se comparan automáticamente con los valores PC obtenidos después de la medición de cada muestra: si la muestra presenta un valor PC que está dentro del intervalo entre el límite inferior y superior (0-10), entonces la muestra se marca como muestra con efecto gancho. Los ajustes para la comprobación de prozona para Ferr4 se representan en la tabla a continuaciórJ (véase también la figura 4 para una descripción detallada)·

Longitud de onda utilizada para la comprobación de prozona, límites adicionales y cuantificación del analito: 570 nm (800 nm de longitud de onda de correcciÓn):

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Parámetros/ajustes del valor de comprobación de prozona: Longitud de onda: 570-800 nm

Límites Longitud 800 nm adicionales: de onda: 570

Límite inferior

Límite supenor pmp1 pmp2 pmp3 pmp4 Comp. O O

O

10 25 29 43 47 dentro 1000 .

2.3 Procedimiento para el ensayo de ferritina de acuerdo con la invención:

5 Los reactivos utilizados para estos experimentos fueron idénticos a los utilizados para el procedimiento estándar véase el punto 2.2. Se utilizó el procedimiento descrito en el follelo adjunto de la prueba Ferr4 con la excepción del procedimiento para la detección de un efeclo prozona.

2.3.1 Condiciones de medición:

10

Esquema de pipeteado: es idéntico al esquema de pipeteado del procedimiento estándar descrito en el punto 2.2.1. Condiciones para la generación de la curva de calibración: son idénticas a las condiciones de calibración utilizadas en el procedimiento estándar descrito en el punlo 2.2.2.

15 2.3.2 Condiciones para la detección del efecto prozona según la invención:

Para la detección del efecto prozona, el procedimiento de la invenciÓfl también utiliza un análisis de la velocidad de reacción, aunque usando otras longitudes de onda diferentes a las utilizadas para la cuantificación del anal ita. En primer lugar, se aplica un limite a la medición: se calcula la diferencia de señal entre el punto de medición de 20 prozona 7 (pmp7) y el punto de medidón de prozona 8 (pmpB) a la longitud de onda de 505 nm (800 nm de longitud de onda de corrección). Esta diferencia de señal (absorbancia) calculada se compara con el valor límite predetenninado, que es 1000 para (Apmp8-Apmp7) (véase la columna 8 en la tabla a continuación). Las muestras con diferencias de señal calculadas que están por debajo de este límite se dasifican directamente como muestras sin efecto gancho. Sin embargo, si la diferencia de señal calculada de una muestra está por encima de este limite,

25 se realiza una comprobación de prozona calculando la relación de velocidades de reacción R a partir de las senales obtenidas a la longitud de onda utilizada para la detección del efecto prozona:

R = [velocidad de reacción en el periodo de tiempo 2lvelocidad de reacción en el periodo de tiempo 1] x 100, con la velocidad de reacción en el periodo de tiempo 2 =[señal (punto de tiempo 4) -señal (punto de tiempo 3)]/[punto de 30 tiempo 4 -punto de tiempo 3] y la velocidad de reacción en el periodo de tiempo 1 =[señal (punto de tiempo 2) señal (punto de tiempo 1 )]I[punto de tiempo 2 -punto de tiempo 1]

Punto de tiempo 4: es el punto de medición de prozona 4 pmp4 e idéntico al punto de medición 4; punto de tiempo 3· es el punto de medición de prozona 3 pmp3 e idéntico al punto de mediciÓfl 3; punto de tiempo 2: es el punto de 35 medición de prozona 2 pmp2 e idéntico al punto de medición 2; punto de tiempo 1. es el punto de medición de prozona 1 pmp1 e idéntico al punto de medición 1; véase también las columnas 3 y 6 de la tabla a continuación

Para cada ensayo, los intervalos R especificos y predetenninados, definidos como intervalo entre un limite inferior predeterminado (véase la columna 1 en la tabla a continuación) y un límite superior predeterminado (véase la

40 columna 2 en la tabla a continuación), que indican un efecto prozona, se almacenan en los ajustes del ensayo y se comparan automáticamente con los valores R obtenidos después de la medición de cada muestra: si la muestra presenta un valor R que está dentro (de acuerdo con la columna 7 en la tabla a continuación) del intervalo entre el limite inferior y superior (entre ·5 y 5), entonces la muestra se marca como muestra con efecto gancho

45 Los ajustes para la comprobación de prozona para la FERR4 se representan en la tabla a continuación:

Longitud de onda usada para la comprobación de prozona: 505 nm (800 nm de longitud de onda de corrección); Longitud de onda utilizada para los límites adicionales: 505 nm (800 nm de longitud de onda de corrección); Longitud de onda utilizada para la cuantificación del analito: 570 nm (800 nm de longitud de onda de corrección)·

50

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

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Parámetros/ajustes del valor de comprobación de prozona: Longitud de onda: 505-800 nm

Límites adicionales: Longitud de onda SOSaoo nm

inferior Limite

superior Límite pmp1 pmp2 pmp3 pmp4 Comp. Limite mín. Límite mín.

Apmp8 Apmp7

Apmp10 Apmp9

·5

5 24 26 41 43 dentro 1000 (pmp8: 26 , pmp7: 24) .

2.4 Resultados para el ensayo de ferritina usando el enfoque y el enfoque de acuerdo con la invención:

La descripción de los resultados se muestra en la figura 6. La aplicación del nuevo enfoque de ferrilina muestra una diferenciación mejorada entre muestras coo efecto gancho y sin efecto gancho por un factor de 1,8. El nuevo enfoque brinda mínimos esfuerzos de implementación; la aplicación del enfoque no necesita ningún cambio de reactivos ni de sus formulaciones. Para su aplicación en el analizador cobas c sólo se es necesario adaptar las ventanas de entrada del software: extensión por el ajuste adicional de la longitud de onda de medición

Ejemplo 3: Detección de Prozona para el ensayo de albúmina

3.1 Instrumento: Véase el punto 1.1

3.2 Procedimiento para el ensayo de albúmina utilizando el enfoque estándar:

Se seleccionó para este estudio la prueba de Albúmina de Rache (ALBT2, Ref, Cal. 04469658), un ensayo inmunoturbidimetrico. Esta prueba se uti liza para determinar la albúmina en muestras de orina. La albúmina humana reacciona con anticuerpos policlonales anti-albúmina formando complejos antígeno/anticuerpo; los agregados se determinan turbidimétricamente.

Los reactivos para todas las pruebas Rache se proporcionan en paquetes cobas c Estos casetes contienen de una a tres botellas de reactivo especialmente diseñadas y tienen etiquetas de código de barras con el reactivo detallado y otra información relacionada con la prueba. Para las pruebas ALBT2 se utilizan tres reactivos en el casete: R1 (tampén TRIS: 50 mmoUI, pH 8,0, PEG: 4,2 %, EDTA: 2,0 mmoUI, conservante), R2 (anticuerpos policlonales antialbúmina humana (oveja): dependiendo del título, tampón TRIS: 100 mmolll, pH 7,2, conservante) y R3 (albúmina en suero diluido (humano), NaCI: 150 mmol/I, tampón fosfato: 50 mmolll, pH 7,0, conservante). El reactivo R3 se utiliza para realizar la comprobación del exceso de antígeno mediante el procedimiento de readición de antigeno. El procedimiento descrito en el folleto adjunto de la prueba ALBT2 se usó como procedimiento estándar

3.2.1 Esquema de pipeteado:

Se añadieron posteriormente 6 ~I de muestra y 100 ~I de tampón de ensayo (Rl) a la celda de reacción, seguido de la adición de 20 ~I del reactivo de anticuerpo (R2) y el mezclado de la mezcla de reacción. Posteriormente se añadieron a la mezcla de reacción 6 ~I de reactivo R3 (comprobación del exceso de antigeno), se diluyó con 20 ~I de diluyente (agua) y se mezcló

3.2.2 Condiciones para la generación de la curva de calibración:

Para las mediciones se utilizó 340 nm como longitud de onda principal y 700 nm como longitud de onda de corrección. El tipo de ensayo era un ensayo de dos puntos finales. Un ensayo de dos puntos finales es un ensayo de punto final que rea liza un blanco de muestra. Aquí se consideran dos lecturas de absOfbancia en dos puntos de medición diferentes: la primera lectura se toma generalmente antes o poco después de la adición del reactivo fina l; la segunda lectura se toma en cualquier momento después de añadir el reactivo final. El valor de absorbancia para la curva de calibración y, por lo tanto, para el cálculo de la concentración se obtiene restando la segunda lectura de la primera lectura. Para ALBT2, la primera lectura está en el punto de medición 6 y corresponde a poco antes de la adición del reactivo final (R2), y la segunda lectura está en el punto de medición 15, que corresponde a un tiempo de reacción de 1,8 minutos. Para la generación de la curva de ca libración se miden 6 estándares de Rache (Ret. Cat. 03121305) como duplicados con RCM como tipo de calibración (función de ajuste de Rodbard)

3.2.3 Condiciones para la detección del efecto prozona:

Para la detección del efecto prozona se utíliza el procedimiento de readición de antígeno Después de completar el ensayo (entre los puntos de medición 23 y 24), se añade el reactivo de albúmina (R3) a la mezcla de ensayo y se

5

15

25

35

45

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interpreta el cambio adicional en la señal. Típicamente, en las muestras con efecto gancho la señal disminuye, yen las muestras sin efecto gancho la señal aumenta. Las longitudes de onda utilizadas para la cuantificación del analito y para el análisis de la señal después de la adición del antígeno son idénticas

3.3 Procedimiento para el ensayo de albúmina de acuerdo con la invención:

Los reactivos utilizados para estos experimentos fueron idénticos a los utilizados para el procedimiento estándar: véase el punto 3.2. El procedimiento descrito en el folleto adjunto de la prueba ALBT2 se usó con la excepción del procedimiento de comprobación de prozona

3.3.1 Condiciones de medición:

Esquema de pipeteado: es idéntico al esquema de pipeteado del procedimiento estándar descrito en el punto 3.2.1. Condiciones para la generación de la CUNa de calibración· son idénticas a las condiciones de calibración utilizadas en el procedimiento estándar descrito en el punto 3.2.2.

3.3.2 Condiciones para la detección del efecto prozona según la invención:

al Para la detección del efecto prozona, el procedimiento de la invención también utiliza un análisis de la velocidad de reacciÓfl, aunque usando otras longitudes de onda diferentes a las utilizadas para la cuantificación del analito. En primer lugar, se aplica un limite a la medición: se calcula la diferencia de señal entre el punto de medición de prozona 5 (pmpS) y el punto de medición de prozona 6 (pmp6) a la longitud de onda de 340 nm (700 nm de longitud de onda de corrección). Esta diferencia de señal (absorbancia) calculada se compara con el valor limite predeterminado, que es 2500 para (Apmp6-Apmp5) (véase la columna 10 en la tabla a continuación). Las muestras con diferencias de señal calculadas que están por encima de este limite se clasifican direclamente como muestras con efecto gancho. Sin embargo, si la diferencia de señal calculada de una muestra está por debajo de este limite, se realiza una comprobaciÓfl de prozona calculando la relación de velocidades de reacción R de las señales obtenidas a la loogitud de onda utilizada para la detección del efecto prozona (505 nm de longitud de onda principal, 700 nm de longitud de onda de corrección): R = [velocidad de reacción en el periodo de tiempo 2/velocidad de reacción en el periodo de tiempo 1] x 100, con la velocidad de reacción en el periodo de tiempo 2 =[señal (punto de tiempo 4) -señal (punto de tiempo 3)V[punto de tiempo 4 -punto de tiempo 3] y la velocidad de reacción en el periodo de tiempo 1 = [señal (punto de tiempo 2) -señal (punto de tiempo 1)]I[punto de tiempo 2 -punto de tiempo 1].

Punto de tiempo 4 es el punto de medición de prozona 4 pmp4 e idéntico al punto de medición 4; punto de tiempo 3· es el punto de medición de prozona 3 pmp3 e idéntico al punto de mediciórJ 3; punto de tiempo 2: es el punto de medición de prozona 2 pmp2 e idéntico al punto de medición 2; punto de tiempo 1· es el punto de medición de prozona 1 pmp1 e idéntico al punto de medición 1; véase lambién las columnas 3 y 6 de la labia a continuación

Para cada ensayo, los intervalos R específicos y predeterminados, definidos como intervalo entre un limite inferior predeterminado (véase la columna 1 en la tabla a continuación) y un limite superior predeterminado (véase la columna 2 en la tabla a continuación), que indican un efecto prozona, se almacenan en los ajustes del ensayo y se comparan automáticamente con los valores R obtenidos después de la medición de cada muestra: si la muestra presenta un valor R que está fuera (de acuerdo con la columna 7 en la tabla a continuación) del intervalo entre el limite inferior y superior (entre -5 y 42), entonces la muestra se marca como muestra con efecto gancho

Los ajustes para la comprobación de prozona para el ensayo de albúmina se muestran en la labia a continuación·

Longitud de onda usada para la comprobaciórJ de prozona: 505 nm (700 nm de longitud de onda de corrección); Longitud de onda utilizada para los limites adicionales: 340 nm (700 nm de longitud de onda de corrección); Longitud de onda utilizada para la cuantificación del ana lito: 340 nm (700 nm de longitud de onda de corrección)

Parámetros/ajustes del valor de comprobación de prozona· Longitud de onda: 505-700 nm

Límites adicionales· Loogitud de onda: 340-700 nm

Límite inferior

Límite supenor pmp1 pmp2 pmp3 pmp4 Comp. Límite mín. Apmp8Apmp7 Límite mín. Apmp10Apmp9 Límite máx. Apmp6Apmp5

5

42 6 10 14 22 fuera . . 2500 (pmp6· 23, pmp5: 8)

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3.4 Resultados para el ensayo de albúmina usando el enfoque estándar y el enfoque de acuerdo con la invención:

La descripción de los resultados se muestra en la figura 7. La aplicación del nuevo enfoque de la prueba ALBT2

5 permite una clara diferenciación entre las muestras con efecto gancho y sin efecto gancho aplicando el procedimiento de velocidad de reacción. Como consecuencia, evitar una segunda adición de antígeno conduce a un ahorro de costes y tiempo. El nuevo enfoque brinda mínimos esfuerzos de implementación; la aplicación del enfoque no necesita ningún cambio de reactivos ni de sus formulaciones. Para su aplicación en el analizador cobas e sólo se es necesario adaptar ylo modificar ligeramente las ventanas de entrada del software: la extensión por el ajuste

10 adicional de la longitud de onda de medición y un ajuste adicional necesario para un límite (límite máx.) que se puede definir como un cambio de señal en un cierto periodo de tiempo, para decidir si una muestra con una velocidad de reacción extremadamente alta se clasifica inmediatamente como muestra con efecto gancho o si la decisión se realiza después del cálculo de la relación de velocidades de reacción R.

15

Claims (10)

1. REIVINDICACIONES

   Procedimiento para la determinación de la cantidad de un analilo específico en una muestra que puede presentar un efecto prozona mediante ensayos fotométricos, en el que el analito específico se cuantifica a partir del cambio en la señal óptica de la mezcla de reacción después de la interacción del analito con reactivos de ensayo específicos del ana lito, que comprende las siguientes etapas·

   a) generar una curva de calibraciÓf'l a al menos una longitud de onda y tiempo de reacción para el analito especifico de una muestra a determinar y depositar los resultados de medición en un sistema de gestión de datos de la plataforma de instrumentos,

   b) medir simu ltáneamente la señal óptica para el analito específico en la muestra a determinar a la longitud de onda utilizada para la determinaciórl del analilo y al menos a una longitud de onda especifica adicional utilizada para la detección del efecto prozona durante el tiempo de reacción completo, que es diferente de la longitud de onda utilizada para la determinación del analito, en el que la diferencia entre la longitud de onda utilizada para la determinación del analito y al menos una longitud de onda específica adicional utilizada para la detecciórl del efecto prozona es superior a 10 nm, de tal manera que existe una diferenciación mejorada de las muestras con efecto gancho y sin efecto gancho en comparación con cuando se usa la misma longitud de onda para la determinación del analito y la detección del efecto prozona,

   c) calcular la relación de velocidades de reacción R utilizando las señales obtenidas a la longitud de onda utilizada para la detección del efecto prozona

   R =[velocidad de reacción en el periodo de tiempo 2Jvelocidad de reacción en el periodo de tiempo 1] x 100 con velocidad de reacción en el periodo de tiempo 2 = [señal (punto de tiempo 4) ~ señal (punto de tiempo 3)]/[punto de tiempo 4 ~ punto de tiempo 3) y velocidad de reacción en el período de tiempo 1 = [señal (punto de tiempo 2) ~ señal (punto de tiempo 1 »)/[punto de tiempo 2 ~ punto de tiempo 1)

   d) determinar si está presente un efecto prozona en la muestra por comparación del valor de relación calculado R con valores límite predeterminados,

   e) cuantificar la cantidad del analito específico por comparaciórl de la señal óptica obtenida a la longitud de onda utilizada para la determinación del ana lito con la curva de calibración.

2. 2.

   Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que, en el caso en que no esté presente ningún efecto prozona en la muestra, la cantidad determinada de ana lito específico en la muestra es un resultado que se puede notificar

3. 3.

   Procedimiento de acuerdo con las reivindicaciones 1-2, en el que opcionalmente se utiliza una longitud de onda adiciona l para fines de correcciónlborrado

4. 4.

   Procedimiento de acuerdo con las reivindicaciones 1·3, en el que la medición de una muestra diluida se repite automáticamente si está presente un efecto prozona.

5. 5.

   Procedimiento de acuerdo con las reivindicaciones 1-4, en el que una o más señales adicionales medidas a la longitud de onda utilizada para la determinación del analito y/o la longitud de onda utilizada para el cálculo de R y/o a otra longitud de onda se evalúan mediante comparaciórl con valores límite predeterminados antes de calcular y determinar la presencia de un efecto gancho basado en la relación de velocidades de reacción R.

6. 6.

   Procedimiento de acuerdo con las reivindicaciones 1·5, en el que se define un valor límite predeterminado para un cambio de señal en un cierto periodo de tiempo, para ignorar muestras con velocidades de reacciórl extremadamente bajas procedentes de una comprobación de prozonas y clasificar dichas muestras directamente como muestras sin efecto gancho

7. 7.

   Procedimiento de acuerdo con las reivindicaciones 1-5, en el que se define un valor límite predeterminado para un cambio de señal en un cierto período de tiempo, para decidir si una muestra con una velocidad de reacciórl extremadamente alta se clasifica inmediatamente como muestra con efecto gancho.

8. 8.

   Procedimiento de acuerdo con las reivindicaciones 1·5, en el que se define un límite predeterminado para un cambio de señal en un cierto periodo de tiempo, para decidir si una muestra con una velocidad de reacción extremadamente alta se clasifica como muestra con efecto gancho después del cálculo de la relación de velocidades de reacción R.

9. 9.

   Procedimiento de acuerdo con las reivindicaciones 1-8, en el que condiciones de medición especificas que comprenden tiempos de reacción, puntos de calibración, modo de calibración y el lipo de ensayo se aplican adicionalmente al protocolo de medición.

   18

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   5 10. Procedimiento de acuerdo con las reivindicaciones 1-9, en el que se puede delectar un efecto gancho utilizando las pruebas de laboratorio espectrofotométricas comercialmente disponibles en la plataforma de instrumentos correspondiente sin aplicar un tratamiento de dilución de muestra preanalílica y/o sin cambiar el procedimiento de ensayo mediante readición de analito.

   10 11. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en el que el analito a determinar es albúmina
10. 12. Plataforma de instrumentos configurada para llevar a cabo el procedimiento de las reivindicaciones 1-11 , utilizando pruebas de laboratorio espectrofotométricas comercialmente disponibles para determinar la cantidad del

    15 analito específico en una muestra que puede presentar un efecto prozona mediante ensayos fotométricos, en el que el sistema de gestión de datos de la plataforma de instrumentos es capaz de procesar datos de tiempos de reacción, puntos de calibración, modo de ca libración, longitudes de onda, índices de suero para seleccionar la curva de calibración con el mejor ajuste

    20 13. Plataforma de instrumentos según la reivindicación 12, en la que se realizan correcciones adicionales de los resultados de medición que comprenden longitudes de onda para la medición, tiempos de reacción, modo de calibración, número de puntos de calibración y se compensan entre sí.

    19