KR20220025829A

KR20220025829A - 2-구성요소 시스템에서 분석물을 측정하기 위한 방법 및 키트, 및 그 용도

Info

Publication number: KR20220025829A
Application number: KR1020227002372A
Authority: KR
Inventors: 차바 예네이; 피터 콜타이
Original assignee: 액토움 게엠베하
Priority date: 2019-06-25
Filing date: 2020-06-23
Publication date: 2022-03-03
Also published as: US20220298554A1; CN114041055A; CA3143616A1; ES2964575T3; EP3990919B1; JP2022538049A; IL289149A; WO2020260277A1; EP3990919A1; EP3990919C0; EP4245862A3; EP4245862A2

Abstract

본 발명은 2-구성요소 검출 방법을 사용하여 분석물의 파라미터를 측정하기 위한 방법 및 키트, 및 그의 용도에 관한 것이다. 청구된 방법은 확장된 측정가능한 농도 범위의 측정을 사용한 분석물의 희석액의 측정을 포함한다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 분석물의 희석액의 측정을 사용하여 2-구성요소 시스템의 구성요소의 해리 상수의 결정에 관한 것이다. 상기 방법은 확장된 측정가능한 농도 범위의 측정을 사용한 분석물의 희석액의 측정, 구성요소의 해리 상수의 결정, 및 2-구성요소 검출 방법의 더 양호한 정량을 또한 고도의 병렬 방식으로 포함한다.

Description

2-구성요소 시스템에서 분석물을 측정하기 위한 방법 및 키트, 및 그 용도

본 발명은 2-구성요소(bi-component) 검출 방법을 사용하여 분석물의 파라미터를 측정하는 방법 및 키트, 및 그의 용도에 관한 것이다. 청구된 방법은 확장된 측정가능한 농도 범위의 측정을 사용한 분석물의 희석액의 측정을 포함한다. 측정은 측정의 미리 결정된 비-전단사(non-bijective) 표준 곡선을 기반으로 하므로, 각각의 측정에 대해 2-구성요소 검출 방법의 비-전단사 표준 곡선을 판독하는 방법을 제공한다. 따라서 분석물의 농도를 계산하기 위한 수학적 관계가 더 넓은 측정 범위에 걸쳐 정확하게 결정된다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 구획화된 2-구성요소 검출 방법에서 측정 방법의 상기 비-전단사 미리 결정된 표준 곡선의 적용에 관한 것이다. 다시 또 다른 측면에서, 본 발명은 구획화된 2-구성요소 검출 방법에서 고유한 분자 식별 구성요소를 사용하는 측정 방법의 상기 비-전단사 미리 결정된 표준 곡선의 적용에 관한 것이다. 다시 또 다른 측면에서, 본 발명은 2-구성요소 방법의 분석물-특이적 결합 구성요소의 해리(dissociation) 상수의 결정에 관한 것이다. 청구된 방법은 확장된 측정가능한 농도 범위의 측정, 구성요소의 해리 상수의 결정, 및 2-구성요소 검출 방법의 더 양호한 정량을 또한 고도의 병렬 방식으로 포함한다.

기술분야

본 발명은 2-구성요소 검출 방법을 사용하여 분석물의 파라미터를 측정하는 방법 및 키트, 및 그의 용도에 관한 것이다. 방법 및 키트의 적용이 또한 개시된다.

관련 기술의 논의

특히, 방법 및 키트는 2-구성요소 검출 방법을 사용하여 분석물의 농도를 결정하는 데 매우 적합하고 2-구성요소 검출 방법 및 그의 용도를 사용하는 더 높은 크기의 측정 범위와 관련된다.

포화 효과 또는 "후크 효과"는 일반적으로, 구체적 결합 파트너 또는 분석물을 포획하는 데 사용되는 시약 구성요소의 포화를 포함하는 검출 시스템에 공통적인 현상이다. 그러나, 단일-구성요소 또는 2-구성요소 검출 방법의 경우 수학적 배경이 상이하다.

2-구성요소 검출 시스템은 전형적으로 두 개의 구성요소가 검출 신호를 생성하기 위해 적용되는 균질 검정에서 활용된다. 이들 검정 중 많은 것들은 근접 개념을 적용하고 분석물 및 구성요소는 신호를 생성하기 위해 근접하게 가져와야 한다. 근접 검정 기술 예컨대 FRET (형광 공명 에너지 전달), BRET (생물발광 공명 에너지 전달) (Pfleger, Seeber, & Eidne, 2006), 시안 형광 단백질 (CFP) - 황색 형광 단백질 (YFP) 쌍, PCA (단백질 보완 검정) (Morell, Ventura, & Avil

s, 2009), 알파스크린(Alphascreen) (Taouji, Dahan, Bosse, & Chevet, 2009), 및 DNA 표지 근접 방법 (PLA - 근접 라이게이션 검정, PEA - 근접 확장 검정) (S

derberg et al., 2006), 및 에멀젼(emulsion) 커플링(coupling)이라 칭해지는 비근접 기반 검정이 이분자 (2-구성요소) 검출 시스템 및 방법의 대표적인 예이다.

단일-구성요소 검출 시스템에서, 추적자라고 칭해지는 단지 하나의 검정 구성요소가 신호를 생성하는 데 필요하다. 방사성 또는 형광 추적자를 포함하는 여과 결합 검정은 단일-구성요소 검출 시스템의 좋은 예이다. 단일-구성요소 검출 시스템을 사용하여 수득한 표준 곡선은 포화 추적자 농도에서 수득된 정체기 (통상 '후크'라고도 칭해짐)로 끝나는 전형적인 S자 형상을 나타낸다. 이들 곡선은 또한 포화 곡선이라고 칭해진다.

이분자 검출 시스템으로 생성된 표준 곡선은 비정형적이다. 이들 곡선은 비-전단사이며 초기 농도-의존적 신호 증가 후 수득된 정체기에 따른 신호 감소 ('후크 효과')를 특징으로 한다. 신호가 강하하기 시작하는 표적 분자 농도의 범위는 후크 포인트(hook point)라고 칭해진다. 후크 포인트 미만에서, 검정 구성요소는 표적 분자에 의해 점진적으로 포화되고 신호 증가가 측정된다. 후크 포인트에서, 두 구성요소 모두 표적 분자로 포화되고 최대 신호가 검출된다. 후크 포인트 초과에서, 과량의 표적 분자는 구성요소를 과포화시키고, 이는 그의 회합을 억제하고 점진적인 신호 감소를 유발한다.

선행 기술에서 모든 측정이 2-세그먼트(segment) 비-전단사 표준 곡선의 점진적으로 포화된 세그먼트의 범위에서 수행되는 것을 보장하기 위해 분석물 농도의 측정을 수행하기 전에 2-세그먼트 비-전단사 표준 곡선의 후크 포인트를 결정할 필요가 있다. 과포화는 일반적으로 측정 실패로서 간주된다.

결정된 값이 비-전단사 표준 곡선 상의 분석물 농도와 고유하게 상응하지 않기 때문에 이 요건의 실패가 잘못된 측정을 결과할 수 있다.

이러한 오류를 피하기 위해, 전형적으로 측정의 동적 범위는 비-전단사 표준 곡선의 점진적으로 포화된 세그먼트의 동적 범위로 제한된다.

선행 기술에서, 특히 샌드위치 면역검정에서 후크-효과를 해결하는 일부 접근법이 공지되어 있다.

문헌 [Wu et al. 2018]은 과도한 포획 및 검출 항체로 인한 샌드위치 면역검정에서 후크-효과의 발생에 대해 논의하고 결과의 잘못된 해석을 피하기 위해 샘플을 희석할 것을 제안한다.

JP H06 109740 A는 항체-항원 반응을 사용하여 샘플에서 표적 구성요소의 정량 분석을 위한 비탁법 면역검정 (TIA)에 관한 것이다. JP H06 109740 A는 공지된 방법에서 과량의 항원에 대한 프로존의 발생에 대해 논의하며, 이는 이러한 경우애 샘플 희석액에서 테스트를 반복한다. 개선으로서 JP H06 109740 A는 상이한 농도를 갖는 샘플에 대해 둘 이상의 교정 곡선을 수득하고 가상 곡선과의 편차를 기반으로 적용가능한 교정 곡선을 결정할 것을 제안한다. 그러나, JP H06 109740 A의 개시내용은 정의된 수학적 관계로부터 검정의 더 넓은 동적 범위를 허용하지 않으면서, 위음성 측정을 피하기 위해 프로존 효과를 방지하는 것으로 개념적으로 제한된다.

EP 0 576 879 A2는 의료 샘플에서 구성요소의 농도를 결정하는 방법에 관한 것이며 항원 과잉에서 면역학적 검출 방식의 후크 효과뿐만 아니라 생성된 비-단조(non-monotonic), 비-전단사 교정 곡선에 대해 논의하며 상기 곡선은 "하이델베르거-곡선(Heidelberger-Kurve)"으로 지칭된다. EP 0 576 879 A2는 2개의 상이한 샘플 희석액을 사용하여 비-단조 교정 곡선의 모호성을 극복하는 것이 선행 기술에 공지되어 있음을 개시하고 있다. 추가 개선으로서 EP 0 576 879 A2는 측정된 입력 값을 교정 곡선의 정확한 영역과 상관시키기 위해 학습 알고리즘 및 다변수 통계의 사용을 제안한다. 그러나, EP 0 576 879 A2는 침전 검정에서의 신호전달 분석에 관한 것이고 따라서, 특히 침전이 정의되지 않은 화학량론을 가진 가변/다구성요소 반응이기 때문에 2-구성요소 검정까지 간단히 확장될 수 없다. 게다가, 학습 알고리즘을 사용하면 결과가 상이한 실험 조건에 따라 달라질 수 있으므로, 각각의 실험 조건에 대해 상이한 교정 곡선이 필요할 수 있다.

CN 106 226 516 B는 쌍곡선 교정 곡선을 포함하는 검출 방법과 관련되며 또한 후크 효과에 대처하기 위한 전략에 대해 논의한다. CN 106 226 516 B는 사전 교정 및 사후 교정 곡선으로부터의 변곡점으로부터 교정 곡선을 어셈블리하기 위해 동일한 양의 반응물을 사용하여 상이한 농도의 분석물의 표준물의 분리된 반응을 수행하는 것을 제안한다.

문헌 [Binder et al 2008]은 후크-효과를 고려할 수 있는 진칩(GeneChip) 마이크로검정에 대한 교정 알고리즘을 개시하고 로그 차이와 완벽한 일치 및 불일치 프로브 강도의 합계를 공동-처리하는 것을 포함한다.

따라서 선행 기술의 개시내용을 고려해 볼 때 2-구성요소 검출 검정을 사용하여 분석물의 농도를 결정하는 데 적합한 방법 및 키트를 제공하기 위한 개선의 여지가 있으며, 이는 신뢰할 수 있고, 효과적이며 몇 가지 추가 노력으로 이러한 2-구성요소 검출 검정의 동적 범위를 확장하고 대략적인 방법을 사용할 필요가 없는 정의된 수학적 관계를 제공할 수 있다.

또 다른 측면에서, 방법 및 키트는 2-구성요소 검출 방법을 사용하여 분석물 결합 구성요소의 해리 상수를 결정하는 데 적합하고 2-구성요소 검출 방법 및 그의 용도를 사용하여 병렬 방식으로 해리 상수의 측정에 관한 것이다.

화학, 생화학, 의료 기술 및 약리학에서, 해리 상수 (Kd)는 더 큰 복합체가 더 작은 구성요소로 가역적으로 해리되는 경향을 측정하는 구체적 유형의 평형 상수이다 (Friguet, Chaffotte, Djavadi-Ohaniance, & Goldberg, 1985). 해리 상수는 연관 상수의 역수이다. 2-구성요소 측정 방법의 특수한 경우에, 해리 상수는 두 구성요소와 분석물 사이의 해리 상수이다. 구성요소가 항체일 수 있으므로, 해리 상수의 결정은 광범위한 관심을 갖는다.

선행 기술에서 해리 상수를 결정하기 위한 일부 접근법이 공지되어 있다.

문헌 [Rossant ET AL 2015] 및 [Xiong Y. et al. (2017)]은 FRET-기반 검정을 사용하여 친화도 복합체의 평형 파라미터 (Kd)를 결정하기 위한 접근법을 개시하나, 이원 복합체에 관한 것이다.

문헌 [Rey et al. 2017]은 브루톤의(Bruon's) 티로신 키나제 (BTK)의 분해를 위한 강력한 단백질분해 표적 키메라 (PROTAC)의 설계에서 협동성의 역할을 탐구한다. 문헌 [Rey et al.]은 BTK에 대한 PROTAC 활성을 최대화하는 것이 BTK:PROTAC:CRBN의 삼원 복합체를 최대화하는 것과 연관이 있다고 제안하고 분석물로서 역할을 하는 PROTAC 라이브러리의 구성원과 리간드로서 BTK 및 CRBN을 사용하는 상기 삼원 복합체의 TR-FRET 분석을 개시하며, 이들 각각은 FRET (공여자/수용자) 형광 분자로서 표지된다. 레이(Rey) 등은 추가로 BTK 또는 CRBN과 PROTAC의 결합에 대한 해리 상수 (K_D 값)를 유도하기 위한 수치적 피팅 뿐만 아니라 분석물의 농도에 대한 삼원 복합체 형성 (및 생성된 FRET 신호)에 대한 비-전단사 곡선을 개시한다.

EP 2 837 937 A1은 삼원 친화성 복합체에서 결합 평형에 대한 수학적 모델을 개시한다. EP 2 837 937 A1은 "종-형상의" 결합 곡선 또는 "후크 효과"를 포함하여, 삼원 복합체 형성의 특색에 대해 논의한다. 평형 해리 상수와 분석물의 농도, 결합 구성요소 및/또는 삼원 복합체 농도 간의 관계에 대한 수학식이 또한 개시되어 있다.

문헌 [Rey et al. 2017] 및 EP 2 837 937 A1은 삼원 복합체 형성에서 평형 파라미터의 추정을 다루고 후크 효과의 발생을 언급하나, 상기 문헌들은 이들 효과를 적절히 고려하기 위한 해결책을 제공하지 않는다.

EP 1 460 414 A1은 약물 발견 과정에서 잠재적인 납 항체의 식별을 위한 균질한 시간 분해 FRET 검정에 관한 것이다. EP 1 460 414 A1은 단백질-단백질 상호작용을 분석하기 위해 HFRET 검정을 사용하는 예를 개시한다. 직접 결합 검정의 단점으로서 EP 1 460 414 A1은 희석되지 않은 샘플의 스크리닝이 "후크" 효과의 결과로서 위음성의 수를 증가시킬 수 있음을 개시한다. 효과를 제한하기 위해 다수의 샘플 희석액에서의 스크리닝이 제안되나, 시간과 비용에 영향을 미칠 수 있다.

조르바(Zorba) 등은 전사 활성화 도메인 p53 및 그의 리간드 사이의 상호작용을 검출하기 위해 결합 경쟁 검정으로부터 변형된 증폭된 발광 근접 균질 검정 (알파리사(AlphaLISA))의 원리를 개시한다. 조르바 등은 농도 초과시 후크 효과의 발생에 대해 논의하고 이를 회피하기 위한 적합한 적정을 제안한다.

문헌 [Douglass et al. 2013]은 단백질-단백질 상호작용을 모니터링하고 알파스크린 또는 알파리사를 포함한 억제제로서 소분자를 식별하기 위한 상이한 검정을 논의한다. 더글러스(Douglass) 등은 또한 후크 효과에 대해 논의하고 검정에 대한 후크 포인트를 피하는 단백질 농도를 선택하기 위한 적정을 시사한다.

그러나 EP 1 460 414 A1, 조르바 또는 문헌 [Douglass et al. 2013] 어는 것도 이들 검정에서 해리 상수의 추정을 다루고 있지 않다.

선행 기술의 교시내용에 비추어, 특히 병렬 방식 또는 높은 처리량 형식으로, 2-구성요소 검출 방법을 사용하여 해리 상수를 측정하기에 적합한 개선된 방법 및 키트를 제공하는 것이 바람직할 것이다.

더욱이, 선행 기술의 2-구성요소 검출 방법의 해리 상수를 결정하는 방법은 정교하고 비용이 많이 드나, 특히 병렬 방식에서는 상기 방법들은 심각하게 제한된다. 변위 ELISA, 형광 편광 방법, 및 표면 플라즈마 공명과 같이 가장 자주 사용되는 방법은 독립형 측정의 병렬화를 필요로 한다. 따라서 단순화되고 반응-수준 병렬적이지만 강력한 방법에 대한 필요성이 존재한다.

선행 기술에 비추어, 본 발명의 기초가 되는 기술적 문제는 2-구성요소 검출을 사용하여 분석물의 농도를 결정하는 것뿐만 아니라 2-구성요소 검출 방법에서 분석물-특이적 결합 구성요소의 해리 상수를 결정하는 대안적 및/또는 개선된 수단을 제공하는 것이다.

특히, 본 발명의 목적은 2-구성요소 검출 방법을 사용하여 분석물의 확장된 농도 범위를 측정하는 방법 또는 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 목적은 또한 측정의 구획화된 2-구성요소 검출 방법 및 그의 용도를 사용하여 분석물의 농도 및 분석물-2-구성요소 복합체의 해리 상수를 측정하는 방법 및 키트를 제공하는 것이다.

특히, 본 발명의 목적은 구획화된 2-구성요소 검출 방법 및 그의 용도에서 절대 정량화되고 확장된 동적 범위 및 병렬 검출로 분석물의 농도를 측정하는 방법을 제공하는 것이다.

이 목적은 독립항의 특색에 의해 해결된다. 본 발명의 바람직한 실시양태는 종속항에 의해 제공된다.

따라서 본 발명은

a. 두 개의 분석물-특이적 결합 구성요소를 상기 분석물과 접촉시켜 용액 중에 형성된 2-구성요소/분석물 복합체의 농도에 의존하는 신호를 생성하는 것을 포함하는, 상기 용액 중 2-구성요소 검출 방법을 수행하기 위한 공지된 농도의 상기 두 개의 분석물-특이적 결합 구성요소를 제공하는 단계

b. 분석물의 농도에 대한 상기 신호의 의존성을 반영하는 수학적 함수인 상기 2-구성요소 검출 방법에 대한 분석물 농도 참조 곡선을 제공하는 단계이며, 여기서 분석물 농도 참조 곡선이 전단사 함수가 아니며 바람직하게는 증가 및 감소 단조 세그먼트를 나타내는 것인 단계

c. 정의된 희석 인자(dilution factor)를 사용하여 상기 샘플의 하나 이상의 희석액을 제조하는 단계,

d. 2-구성요소 검출 방법을 샘플 및 하나 이상의 희석액에 적용하는 단계

e. 상이한 분석물 농도에서 상기 비-전단사 분석물 농도 참조 곡선에 대한 수학적 핏(fit)을 위한 제한 입력(constraining input)으로서 샘플 및 하나 이상의 희석액에서 검출된 상기 신호를 사용하여 샘플 중 분석물의 농도를 결정하는 단계

를 포함하는, 2-구성요소 검출 방법을 사용하여, 바람직하게는 미지의 농도의 분석물을 가진 샘플 중, 분석물의 농도를 측정하는 방법에 관한 것이다.

일부 실시양태에서 상기 방법은 2-구성요소 검출 방법을 적용한 후 분석물 농도 참조 곡선의 어느 지점이 샘플 중 분석물의 농도에 적용가능한지 결정하기 위해 샘플 및 하나 이상의 희석액에서 검출된 신호를 분석물 농도 참조 곡선과 비교하는 단계를 포함하며, 여기서 정의된 희석 인자가 고려된다. 일부 실시양태에서, 샘플 중 분석물의 농도를 결정하는 것은 샘플 중 2-구성요소/분석물 복합체의 형성을 반영하는 신호를 분석물 농도 참조 곡선의 적용가능한 지점과 비교하는 것을 포함한다.

바람직하게는 두 개의 분석물-특이적 결합 구성요소뿐만 아니라 분석물은 비-고정(non-immobilized)이며 용액 중에 있으며, 2-구성요소/분석물 복합체가 마찬가지로 용액 중에 형성된다. 일부 실시양태에서 방법은 샘플에 미지의 농도의 분석물을 제공하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서 방법은 시험관내 방법이며, 여기서 바람직하게는 샘플을 제공하는 단계가 살아있는 인간 또는 동물 신체의 외과적 또는 침습적 치료를 포함하지 않는다.

본 발명의 방법은 확장된 동적 범위를 가진 비-구획화 또는 구획화된 2-구성요소 검출 방법을 사용하여 공지된 분석물의 미지의 농도를 결정할 수 있게 한다.

상기에 논의한 바와 같이, 포화가능한 2-구성요소 검출 방법에 대한 참조 곡선은 소위 후크 포인트에 의해 분리된 두 개의 세그먼트를 가진 비-전단사 함수이다. 전단사 함수는 일대일 대응이 가능함을 의미한다. 수학적 용어로 전단사 함수는, 두 집합의 요소 사이의 함수이며, 여기서 한 집합의 각각의 요소가 다른 한 집합의 정확히 한 요소와 쌍을 이루고 그 반대의 경우도 마찬가지이다. 포화가능한 2-구성요소 검출 방법의 참조 곡선 또는 표준 곡선의 경우, 이는 그렇지 않는다. 2-구성요소/분석물 복합체의 농도 형성을 반영하는 동일한 신호는 적어도 두 가지 상이한 분석물 농도를 결과할 수 있다. 따라서 2-구성요소/분석물 복합체의 형성에 의해 생성된 동일한 검출가능한 신호는 두 가지 상이한 실제 분석물 농도로부터 유래할 수 있다.

모호성을 피하기 위해 따라서 선행 기술에는 분석물 농도의 측정을 수행하기 전에 2-세그먼트화된 비-전단사 참조 곡선의 후크 포인트를 추정하는 접근법이 있다. 후속적으로, 측정은 전형적으로 세그먼트 중 하나의 범위에서만 수행되므로 동적 범위가 상당히 제한된다.

본 방법을 사용하면 이러한 제한이 제거된다. 대신에, 상기 방법은 공지된 희석 인자를 사용하여 샘플의 하나 이상의 희석액을 제조하고, 2-구성요소 검출 방법을 샘플뿐만 아니라 하나 이상의 희석액에 적용한다. 2-구성요소 검출 방법을 적용하는 것은 바람직하게는 공지된 농도의 2개의 분석물-특이적 결합 구성요소가 상기 용액 중에 형성된 2-구성요소/분석물 복합체의 농도에 의존하는 신호를 생성하기 위해 샘플 및 하나 이상의 희석액과 접촉시키는 것을 의미한다.

본원에 상세히 설명된 바와 같이, 신호는 여러 가지의 형태를 취할 수 있고 사용된 2-구성요소 검출 시스템 및 방법에 의존한다. 예를 들어, FRET 검정과 같은 근접 검정의 경우에, 신호는 2-구성요소/분석물 복합체 형성을 나타내는 FRET-공여자-수용자 쌍으로부터의 형광 신호를 지칭할 수 있다. 에멀젼 커플링과 같은 구획화된 2-구성요소 방법의 경우에, 신호는 또한 구획화된 액적에서 예상된 푸아송(Poisson) 분포로부터의 편차를 기반으로 2-구성요소/분석물 복합체의 존재를 나타내는 형광 태그부착된(fluorescently tagged) PCR 생성물 또는 NGS-시퀀싱(sequencing)을 사용한 ddPCR로부터 생긴 신호를 지칭할 수 있다.

2-구성요소/분석물 복합체의 형성을 반영하는 신호는 샘플뿐만 아니라 하나 이상의 희석액에 대해 획득되므로, 신호 및 희석 인자를 사용하여 분석물 농도 참조 곡선의 어느 지점이 샘플 중 분석물의 농도에 적용가능한지 결정할 수 있다. 이를 위해 샘플뿐만 아니라 하나 이상의 희석액으로부터 유래한 신호를 참조 곡선과 비교한다.

도 1에 나타낸 바와 같이 2-구성요소 검출 방법에 대한 참조 곡선은 전형적으로 더 낮은 분석물 농도에 대해 증가하는 단조 세그먼트 및 더 높은 분석 농도 (포화 체제)에 대해 감소하는 단조 세그먼트를 가진 종 형상 곡선을 나타낼 것이다. 따라서 증가 및 감소는 분석물 농도의 의존성에 신호 교대와 관련된다.

샘플 및 희석액에서 검출된 신호에 대한 상이한 시나리오를 구상할 수 있다. 예를 들어, 샘플로부터 유래한 신호는 희석 (더 낮은 분석물 농도를 가짐)으로부터 유래한 신호보다 높을 수 있다. 이 정보로부터, 두 신호가 모두 단조 증가 세그먼트로부터 유래하거나 샘플로부터의 신호가 단조 감소 세그먼트로부터 유래하고 희석으로부터의 신호가 단조 증가 세그먼트로부터 유래한다는 것을 추론할 수 있다. 두 시나리오 사이의 차이는 샘플과 희석액 사이의 희석 인자를 피팅(fitting)하여 결정할 수 있다 (실시예 3 참조).

희석 인자를 기반으로 하여, 샘플의 분석물 농도와 하나 이상의 희석액 사이의 예상 농도 비가 알려져 있다는 점에 유의한다. 도 1의 도시된 곡선에서, 이는 수평축의 거리에 상응한다.

유리하게는, 분석물 농도의 공지된 차이/비의 두 신호에 대한 수학적 핏은 적용가능한 농도가 결정될 수 있도록 비-전단사 참조 곡선에 대한 신호의 최적 위치결정(positioning)을 충실하게 결과할 것이다. 환원하면, 다수의 신호를 공지된 희석 인자로 검출하기 위해 샘플을 희석함으로써 획득한 데이터의 수학적 핏에 대한 추가 제약이 제공되어, 샘플로부터 유래한 신호의 적용가능하고 상응하는 농도 값을 강력하게 추론할 수 있게 한다.

하나 이상의 희석으로부터 유래한 추가 신호가 결정될 수 있으며 정보는 분석물 농도 측정의 정확도를 향상시키는 데 사용될 수 있다는 점에 유의한다.

2-구성요소 방법의 비-전단사 수학적 신호-농도 관계, 즉 참조 또는 표준 곡선을 결정하고, 정의된 분석물의 희석을 사용하면 두 개의-세그먼트 비-전단사 표준 곡선의 후크 포인트 결정 실패를 피하기 위해 측정을 제한할 수 있다. 전형적인 경우에, 따라서 2-구성요소 방법의 신호의 동적 범위는 비-전단사 참조 곡선의 두 세그먼트 모두에 대해 사용될 수 있다. 선행 기술의 방법의 경우, 후크 포인트로부터 상당한 거리를 두는 것이 중요하기 때문에, 이는 동적 범위의 두 배 훨씬 초과를 야기한다.

선행 기술은 후크 효과와 연관된 모호성을 피하기 위해 희석 개념을 어느 정도 제안하지만, 본원에 기재된 방법은 바람직하게는 비-전단사 곡선의 계산 요건을 고려하여 농도를 결정할 수 있으며, 이를 위해 바람직하게는 수학적 핏을 위해 두 개의 독립적인 입력이 필요하다, 환언하면, 일반적인 광의의 희석 개념을 넘어, 본 발명은 바람직하게는 수학적 이해를 제공하여, 상당한 추가 이점을 야기한다. 특히, 바람직하게는 전체 비-전단사 분석물 농도 참조 곡선이 분석물의 농도를 결정하기 위한 교정 곡선으로서 사용될 수 있다. 일반적으로 희석 개념은 모호성을 피하는 측정을 가능하게 하는 희석을 실험적으로 찾는 것으로 제한되지만, 이들은 전체 비-전단사 곡선을 교정 곡선으로 간주하지 않는다. 대신에, 본원에 기재된 방법은 바람직하게는 2-구성요소 검출 반응을 사용하여 분석물 농도를 결정하기 위해, 비-전단사 곡선을 계산하고 전체 비-전단사 곡선을 교정 곡선으로서 고려하는 필수 파라미터를 제공할 수 있다.

한 실시양태에서, 참조 곡선은 공지된 분석물 농도의 참조 샘플을 제공하고, 상기 참조 샘플의 일련의 공지된 희석액을 생성하고, 참조 샘플 및 그의 각각의 공지된 희석액에 대해 상기 2-구성요소 검출 방법을 수행함으로써 실험적으로 수득된다.

유리하게는, 주어진 2-구성요소 검출 방법에 대한 참조 곡선은 실험적으로 한 번만 결정되어야 한다. 이를 위해, 주어진 농도에서 분석물에 대해 정의된 친화도를 가진 구성요소를 가진 2-구성요소 검출 시스템뿐만 아니라 공지된 분석물 농도의 참조 샘플도 제공된다. 참조 샘플에 대해 일련의 희석액이 생성되고 희석액 각각에 대해 2-구성요소 검출 방법이 적용되어 주어진 분석물 농도에 대한 2-구성요소/분석물 복합체의 형성을 반영하는 일련의 신호를 생성한다. 분석물 농도에 대한 2-구성요소/분석물 복합체의 형성을 반영하는 신호의 상기 실험적으로 수득된 의존성은 본원에 기재된 바와 같이 사용하기 위한 기준 또는 표준 곡선을 형성하기 위해 내삽될 수 있다.

그러나, 해석적 방법 또는 수치 시뮬레이션을 통해 참조 곡선을 제공하는 것이 또한 가능하다.

한 실시양태에서, 분석물 농도 참조 곡선은 화학적 균형(chemical balance), 및 질량 보존 방정식을 해결(solving)함으로써 분석적으로 계산되거나, 분석물과의 두 개의 분석물-특이적 결합 구성요소 각각에 대한 해리 상수의 제공을 기반으로 하여 수치적 해법(solution)에 의해 제공된다.

분석 방법 또는 수치 시뮬레이션을 기반으로 하는 참조 곡선 제공의 실례에 가 실시예 1에 제공된다.

일반적으로, 참조 곡선을 제공하기 위한 분석 및 수치 방법은 분석물과 관련하여 2-구성요소 검출 방법을 정의하는 일부 추가 파라미터를 필요로 할 것이다. 특히, 참조 곡선을 수치적으로 제공하기 위해, 2개의 분석물-특이적 결합 구성요소 각각에 대한 분석물과의 해리 상수를 추정하여야 한다. 하기 실시예에 상세히 설명된 바와 같이, 본질적으로 이 정보를 통해 2-구성요소/분석물 복합체의 형성을 반영하는 신호에 대한 참조 곡선이 효율적이고 강력한 방식으로 제공될 수 있다.

한 실시양태에서, 상기 방법은 구획화된 2-구성요소 검출 방법을 사용하여 분석물의 농도를 결정하는 데 사용될 수 있고 구획화된 2-구성요소 검출 방법 및 그의 용도를 사용하는 더 높은 크기의 측정 범위에 관한 것이다. 구획화된 2-구성요소 검출 방법은 상기 방법이 분석물의 절대 농도를 결정하는 것을 가능하게 하므로 매우 선호된다.

전형적인 구획화된 방법은 물-오일 에멀젼 액적 시스템을 이용하는 디지털 PCR (ddPCR) (Quan, Sauzade, & Brouzes, 2018) 방법이다. 액적은 주형 DNA 분자를 분리하는 파티션 (구획)을 형성하기 위해 물-오일 에멀젼에서 형성된다. 액적은 PCR 반응이 실시되는 플레이트에서 개별 시험관 또는 웰과 본질적으로 동일한 역할을 한다. 대규모 샘플 분할(partitioning)은 ddPCR 기술의 핵심 측면이다.

ddPCR 기술은 액적이 이들이 함유하는 주형 분자의 PCR 증폭을 지원하고 개별 DNA 주형 분자를 기반으로 하여 신호를 생성한다는 점에서 디지털이다. PCR 후에, 각각의 액적을 분석하거나 판독하여 원래 샘플에서 PCR-양성 액적의 분율을 결정한다. 이어서 이들 데이터를 푸아송 통계를 사용하여 분석하여 원래의 샘플 중 절대 DNA 주형 농도를 결정한다.

또 다른 실시양태에서 상기 방법은 절대 정량 원리 (Quan et al., 2018)를 2-구성요소 측정 방법에 적용하는 데 사용될 수 있다. 분석물의 신호는 구획화된 검정물-2-구성요소 복합체 및 푸아송 통계의 개별 분자 검출을 기반으로 하며, 여기서 분석물-2-구성요소 복합체는 분자의 농도 및 그의 분석 특성, 즉 해리 상수를 기반으로 하는 화학적 균형에 의해 결정된다.

이 실시양태에서, 수십, 수천 또는 수백만 (또는 더 높은 수)의 액적의 생성 및 이중-적격(bi-competent) 검출 방법에 대한 그의 적용은 수득된 비-구획화 측정의 경우에서와 같이 단일의, 본질적으로 비선형인 신호를 사용하는 대신에 절대 정량적, 고도로 선형적인 방식으로 액적의 수를 2-구성요소 방법의 주요 동적 범위로서 갖는 단일 샘플 측정을 의미한다. 이로써 구획화된 방법에 고유한 절대 정량성 및 통계적 특색을 이중-적격 방법을 사용하여 분석물의 농도 검출에 적용한다. 이들 구획화 접근법은 2-구성요소 측정 방법의 비-전단사 2-세그먼트 참조 곡선의 확장된 범위를 제공하고 측정의 이용 가능한 동적 범위를 효과적으로 배가하기 위해 본원에 기재된 방법과 조합될 수 있다.

일부 실시양태에서, 이들 방법은 상기 방법이 대개 막대한 농도 차이를 갖기 때문에 다수의 분석물 측정에 바람직하다. 이러한 실시양태에서, 에멀젼 커플링과 같은 적합한 구획화된 2-구성요소 방법을 사용하여 동일한 샘플에서 DNA 카피 수 (낮은-풍도(abundance)) 및 RNA/단백질 카피 수 (높은 풍도)를 측정할 수 있다 (하기 실시예 및 EP 3224360 참조).

디지털 선형 신호 생성 방식을 적용하면, 신호 생성 원리와 관련하여 구획 수는 상한선을 갖지 않는다. 본원에 기재된 방법을 사용함으로써 확장된 측정 범위로 인해, 구획화된 2-구성요소 방법의 특징인 감도 및 정밀도를 유지하면서, 배가된 신호 기반 동적 범위를 측정에 이용할 수 있다. 따라서 본원에 기재된 방법과 조합된 구획화된 2-구성요소 방법은 대규모 샘플 분할이 표적 분석물의 작은 배수 차이의 신뢰할 수 있는 측정을 가능하게 하기 때문에 비할 데 없는 정밀도를 제공한다. 이는 그것 샘플에서의 지배적인 주형이 희귀 표적의 검출을 방해하지 않기 때문에 증가된 신호 대 잡음비를 야기한다. 구획화된 2-구성요소 방법은 방법의 고유한 높은 희석도가 효과적인 신호 생성을 방해할 수 있는 물질을 제거하기 때문에 더욱 낮은 신호 드롭-아웃(drop-out) 오류율을 제공한다.

본 발명에 따르면, 상기-언급된 방법은 또한 2-구성요소/분석물 복합체의 해리 상수를 결정하는데 적합하다.

또 다른 측면에서, 본 발명은

a. 두 개의 분석물-특이적 결합 구성요소를 상기 분석물을 함유하는 용액과 접촉시켜 상기 용액 중에 형성된 2-구성요소/분석물 복합체의 농도에 의존하는 신호를 생성하는 단계를 포함하는, 2-구성요소 검출 방법을 수행하기 위한 공지된 농도의 상기 두 개의 분석물-특이적 결합 구성요소를 제공하는 단계

b. 2-구성요소/분석물 복합체의 농도와 분석물 및/또는 분석물-특이적 결합 구성요소의 농도를 반영하는 상기 신호에 의존하여 상기 분석물-특이적 결합 구성요소의 해리 상수 사이의 관계에 대한 수학적 함수인 상기 2-구성요소 검출 방법에 대한 해리 상수 관계를 제공하는 단계

c. 상기 샘플 또는 상기 분석물-특이적 결합 구성요소의 하나 이상의 희석액을 제조하는 단계,

e. 상이한 분석물 농도 및/또는 분석물-특이적 결합 구성요소 농도에서 상기 해리 상수 관계에 대한 수학적 핏을 위한 제한 입력으로서 샘플 및 하나 이상의 희석액에서 검출된 상기 신호를 사용하여 상기 두 개의 분석물-특이적 결합 구성요소의 해리 상수를 결정하는 단계

를 포함하는, 2-구성요소 검출 방법에서 분석물-특이적 결합 구성요소의 해리 상수를 결정하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 방법은 공지된 희석 인자로 샘플의 하나 이상의 희석액을 제조함으로써 2-구성요소 검출 시스템에 대한 해리 상수의 결정을 가능하게 하고 2-구성요소 검출 방법을 샘플뿐만 아니라 하나 이상의 희석액에 적용한다. 분석물-특이적 결합 구성요소의 해리 상수를 결정하기 위한 2-구성요소 검출 방법을 적용하는 것은 바람직하게는 상기 용액에서 형성된 2-구성요소/분석물 복합체의 농도에 의존하는 신호를 생성하기 위해 공지된 농도의 상기 두 개의 분석물-특이적 결합 구성요소가 공지된 농도의 샘플과 접촉한다는 것을 의미한다. 분석물-특이적 결합 구성요소 또는 샘플의 농도는 공지된 희석 인자로 희석을 제공하는 희석에 의해 변경된다. 샘플 및 하나 이상의 희석액에서 검출된 신호뿐만 아니라 분석물 및/또는 분석물-특이적 결합 구성요소의 농도는 수학적 핏을 위한 제한 입력으로서 사용될 수 있다.

바람직하게는 두 개의 분석물-특이적 결합 구성요소뿐만 아니라 분석물은 비-고정이며 용액 중에 있어서, 2-구성요소/분석물 복합체가 마찬가지로 용액 중에 형성된다. 일부 실시양태에서 방법은 샘플에 공지된 농도의 분석물을 제공하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서 방법은 시험관내 방법이며, 여기서 바람직하게는 샘플을 제공하는 단계가 살아있는 인간 또는 동물 신체의 외과적 또는 침습적 치료를 포함하지 않는다. 상기에 상세히 설명한 바와 같이, 신호는 여러 가지의 형태를 취할 수 있으며 사용되는 2-구성요소 감지 시스템에 의존한다. 예를 들어, FRET 검정과 같은 근접 검정의 경우에, 신호는 2-구성요소/분석물 복합체 형성을 나타내는 FRET-공여자-수용자 쌍으로부터의 형광 신호를 지칭할 수 있다. 에멀젼 커플링과 같은 구획화된 2-구성요소 방법의 경우에, 신호는 또한 구획화된 액적에서 예상된 푸아송 분포로부터의 편차를 기반으로 하여 2-구성요소/분석물 복합체의 존재를 나타내는 ddPCR 및/또는 NGS-시퀀싱으로부터 생긴 신호를 지칭할 수 있다.

실시예에 나타낸 바와 같이 (예를 들어, 실시예 2, 5 및 도 2 참조), 샘플 및 하나 이상의 희석액에서 검출된 신호를 수학적 핏에 대한 제한 입력으로서 사용하면 분석물과의 두 개의 분석물-특이적 결합 구성요소의 해리 상수의 강력한 결정을 가능하게 한다

해리 상수 관계는 화학적 균형, 및 질량 보존 방정식을 분석적으로 해결함으로써 제공될 수 있다 (실시예 2 참조; 수학식 3 참조). 일반적인 용어로, 이는 f(Kd1,c12,a0)=Kd2로서 기재될 수 있으며, 여기서 "Kd1" 및 "Kd2"는 해리 상수이고, "c12"는 2-구성요소/분석물 복합체의 형성을 반영하는 신호에 의해 결정된 바와 같은 삼원 복합체의 측정된 농도이고, "a0"는 공지된 분석물의 농도이다. 추가 입력으로서 f(Kd1,c12,a0)=Kd2는 분석물의 농도를 추가로 포함할 수 있으며, 이는 또한 공지된 두 2-구성요소 모두를 종료한다. 이들 용어는 분석물-특이적 결합 구성요소의 농도가 변화되지 않고 공지된 경우에 유효하다.

해리 상수 관계 결정의 또 다른 유리한 측면은 분석물-특이적 결합 구성요소의 농도가 변화하는 경우 제공될 수 있으며, 이는 f(Kd1,c12, b10, b20)=Kd2로서 기재될 수 있으며, 여기서 "Kd1" 및 "Kd2" 는 해리 상수이고, "c12"는 2-구성요소/분석물 복합체의 형성을 반영하는 신호에 의해 결정된 바와 같은 삼원 복합체의 측정된 농도이고 "b10" 및 "b20"은 분석물-특이적 결합 구성요소의 공지된 농도이다. 추가 입력으로서 f(Kd1,c12,b10,b20)=Kd2는 또한 공지된 분석물의 농도를 추가로 포함할 수 있다. 이들 용어는 분석물의 농도가 변화되지 않고 공지된 경우에 유효하다.

결합 구성요소의 해리 상수 ("Kd1" 및 "Kd2")를 결정하기 위해 수학식 3이 적용될 수 있다. 공지된 양의 분석물, 2-구성요소 및 결정된 양의 삼원 항체/2-구성요소 복합체를 함유하는 하나 초과의 용액을 갖는 경우, 2개의 Kd는 실시예 2에 따라 계산할 수 있다.

분석물을 포함하는 샘플의 상이한 희석액은 "c12"의 상이한 농도에 상응하므로, "f" 함수는 상이한 형태를 갖는다 (도 2 참조). 그러나 Kd는 물질 상수이기 때문에, "f" 함수의 모든 형태는 Kd의 특정 쌍 값에 의해 충족되어야 한다.

실제로, Kd1 및 Kd2에 따른 해리 상수 관계를 그래프로 표시하면, 상이한 공지된 농도의 곡선이 결정될 적용가능한 Kd 쌍인 한 지점 가까이에서 교차한다 (실시예 2 참조). 환언하면, 수학적 해결책은 바람직하게는 2-구성요소 검출 방법을 샘플뿐만 아니라 하나 이상의 희석액에 적용함으로써 제공된 바와 같은 상이한 입력 농도에 따라 달라지는 해리 상수 (Kd1-Kd2) 관계를 반영하는 곡선 사이의 교점을 찾는 것이다.

한 실시양태에서, 예를 들어, 분석물의 상이한 희석액을 제공함으로써, 다양한 실험 조건을 사용하여 해리 상수의 하나 초과의 관계를 결정하는 것은 이들 관계를 충족시키는 해리 상수의 값을 결정하는 데 도움이 될 수 있다.

바람직한 실시양태에서, 통계적 모델 및/또는 다른 수학적 도구를 사용하여 해리 상수의 값을 결정할 수 있는데, 그 이유는 측정 오류가 상이한 측정에서 혼동되기 때문이다.

또 다른 측면에서, 방법은 2-구성요소 검출 방법 및 그의 용도를 사용하여 병렬 방식으로 2-구성요소 검출 방법을 사용하여 분석물 결합 구성요소의 해리 상수를 결정하는데 적합하다.

한 실시양태에서, 분석물 결합 구성요소의 해리 상수를 결정하는 방법은 절대 정량화 가능한 구획화된 2-구성요소 검출 방법을 기반으로 한다.

본원에 기재된 방법의 또 다른 실시예에서, 병렬 판독 기술을 사용하는 것이 바람직하다. 차세대 DNA 시퀀싱은 일부 실시양태에서 2-구성요소 판독 기술로서 바람직하다. 특히 그러한 2-구성요소 방법은 검출 원리의 일부로서 고유한 DNA 신호를 생성하는 DNA 시퀀싱 기반 판독에 적합한다. 이들 방법은 근접 라이게이션, 확장 검정 및 에멀젼 커플링을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.

또 다른 실시양태에서, 2-구성요소 방법이 구획화된 2-구성요소 방법인 경우, DNA 시퀀싱 판독 기반 2-구성요소 측정 방법이 바람직하다. 구획화된 조건 하에, 고유한 DNA 신호의 생성은 비-구획화 측정과 비교하여 편향되지 않는다.

구획화된 DNA 신호 생성의 또 다른 측면에서 고유한 분자 식별자(unique molecular identifier) (UMI) (Parekh, Ziegenhain, Vieth, Enard, & Hellmann, 2017) 신호 판독을 이용하여 가능하게 하는 편향되지 않은 DNA 신호를 의미한다.

미국 특허 번호 5,213,961에 기재된 경쟁적 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR) 및 문헌 (Smith et al., 2009)에 의해 기재된 바와 같은 고유한 분자 식별자 (UMI)를 사용한 딥 바코드 시퀀싱(deep barcode sequencing)과 같은 방법을 포함하여 차세대 시퀀싱 기술을 사용하여 샘플에서 상이한 폴리뉴클레오티드의 정량화 정확도를 개선하기 위한 다양한 방법이 개발되었다.

고유한 분자 식별자, 또는 분자 바코드는 샘플에서 2-구성요소 측정 방법의 고유한 DNA 신호를 정량화하는 데 이점을 제공한다. 그러나, UMI가 첫 번째 검출보다 더 많이 관련된 경우, 동일한 UMI가 상이한 표적에 도입되어, 계수 오류를 결과할 수 있다. 또한, 원래의 UMI 방법은, 이상적이나, 비현실적인 상황- 즉, PCR 및 시퀀싱 기술 둘 다가 둘 다 완벽하고 어떤 오류도 도입되지 않는 경우를 기반으로 한다. UMI 전략은 PCR 및 시퀀싱 단계 둘 다가 근본적인 표적 및 UMI 단편을 오류 없이 보고한다는 가정 하에 작동한다. 이들 조건은 비-구획화 조건 하에 제공하기 어려우나, 구획화된 조건 하에 원활하게 제공된다. UMI 표지된 구성요소는 구획화된 2-구성요소 측정 방법에서 구획당 단일 또는 소수의 분자이며, 이는 UMI 바코드의 고유한 DNA 신호로의 효과적인 통합을 의미한다.

또 다른 측면에서, 고유한 DNA 신호를 나타내는 고유한 분자 식별자 (UMI)는 고유한 DNA 신호에 통합되고 구획화된 2-구성요소 방법으로 추가로 증폭될 수 있다. 그러나, 고유한 분자 식별자를 이용하지 않으면, 고유한 DNA 신호의 정량화가 편향된다. 증폭은 특정 고유한 DNA 신호에 특이적일 수 있어; 다른 더 이상 증폭되지 않은 고유한 DNA 신호에 대한 그의 비율의 균형을 유지한다.

또 다른 측면에서, 고유한 DNA 신호가 통합된 고유한 분자 식별자를 사용하여 2개 이상의 동일한 결합 부위를 가진 분석물 또는 2개 초과의 동일하지 않은 결합 부위를 가진 분석물을 검출할 수 있다. 이들 배열은 단백질 또는 기타 분자와 같은 상호작용하는 분석물을 검출하는 데 특히 바람직하다.

또 다른 측면에서, 병렬 판독 기술을 사용하는 2-구성요소 측정 방법의 방법 및 키트는 분석물의 농도 및 구성요소의 해리 상수 둘 다를 병렬 방식으로 측정할 수 있다. 오늘날 차세대 시퀀싱 기술은 달성 가능한 판독 병렬성에 정비례하는 수십억 개의 독립적인 판독을 제공할 수 있다.

하나의 추가 실시양태에서, 분석물은 단백질, 펩티드, 핵산 세그먼트, 탄수화물, 지질, 항체 (모노클로날 또는 폴리클로날), 항원, 올리고뉴클레오티드, 특이적 수용체 단백질, 리간드, 분자, 세포, 미생물뿐만 아니라 이들의 단편 생성물 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

한 실시양태에서, 두 개의 분석물-특이적 결합 구성요소는 핵산, 바람직하게는 RNA 및/또는 DNA 올리고뉴클레오티드, 항체, 펩티드, 단백질, 앱타머(aptamer), 분자-각인 중합체(molecularly-imprinted polymer), 세포 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

한 실시양태에서, 샘플은 둘 이상의 상이한 유형의 분석물을 포함한다.

한 실시양태에서, 상이한 종류의 분석물-특이적 결합 구성요소의 2개 이상의 쌍이 사용된다.

본원에 기재된 방법의 특별한 이점은 동일한 검정에서 하나 초과의 종류의 분석물 (예를 들어 DNA; RNA; 단백질, 상호작용 단백질 및 그의 화학적 변형) 및 유사하게 하나 초과의 종류의 결합 구성요소를 갖는 것이 심지어 가능하다는 점이다.

본원에 기재된 바와 같은 병렬 접근법을 사용하여, 상이한 종류의 분석물에 대한 분석물 농도뿐만 아니라 상이한 종류의 분석물-특이적 결합 구성요소에 대한 해리 상수를 병렬적으로 결정할 수 있다.

한 실시양태에서, 2-구성요소 방법은 근접-기반 검정(proximity-based assay)을 사용하여 2-구성요소/분석물 복합체 농도 의존 신호를 생성하는 단계를 포함하며, 여기서 근접-기반 검정은 그의 근접에 의존하여 검출가능한 신호를 생성하는 2개의 분석물-특이적 결합 구성요소를 사용한다.

한 실시양태에서 2-구성요소 방법은 공명 에너지 전달 검정, 바람직하게는 푀스테르 공명 에너지 전달 (F

rster resonance energy transfer) (FRET) 검정 또는 생물발광 공명 에너지 전달 (BRET) 검정, 단백질 보완 검정 (PCA), 알파스크린 또는 DNA 표지된 근접 검정, 바람직하게는 근접 라이게이션 검정 (PLA) 또는 근접 확장 검정 (PEA)을 사용하는 단계를 포함한다.

한 실시양태에서, 2-구성요소 검출 방법은 구획화된 검정을 사용하여 2-구성요소/분석물 복합체 농도 의존 신호를 생성하는 단계를 포함하며, 여기서 신호는 단일 구획에서 상기 두 개의 분석물-특이적 결합 구성요소의 존재를 반영한다.

한 실시양태에서, 구획화된 검정은 에멀젼 액적 방법을 사용하며, 여기서 에멀젼 중 각각의 액적은 별도의 구획을 나타낸다.

한 실시양태에서, 구획화된 검정은 에멀젼 커플링이다. 하기에 상세히 기재된 바와 같이 에멀젼 커플링은, 예를 들어, 형광 태그부착된 PCR 생성물을 사용하는 디지털 액적 PCR (ddPCR) 또는 차세대 시퀀싱 (NGS)에 의해 식별될 수 있는 에멀젼에서 이중-표지된 (2-구성요소), 개별 삼원 분자 복합체의 검출을 기반으로 하는 디지털 검정 개념을 지칭한다.

유리하게는, 이러한 접근은 분석물 농도의 절대 정량화뿐만 아니라 강력하고 효율적인 방식으로 다수의 분석물의 농도의 병렬 결정을 가능하게 한다.

한 실시양태에서, 2-구성요소 검출 방법은 절대 분자 계수 기반 분석 방법을 사용하는 단계를 포함한다. 이러한 절대 분자 계수 기반 분석 방법은 바람직하게는 디지털 PCR 또는 차세대 시퀀싱과 같은 디지털 검출 방법을 적용하는 것을 의미한다.

한 실시양태에서, 2-구성요소 검출 방법은 액적 디지털 PCR 검정을 사용하는 단계를 포함한다.

한 실시양태에서, 2-구성요소 검출 방법은 고유한 증폭가능한 핵산 표지와 연관된 분석물-특이적 결합 구성요소를 사용하는 단계를 포함하고 구획화된 검정을 사용하며, 여기서 핵산 증폭은 형광 태그부착된 증폭 생성물을 사용하여 각각의 구획에 대해 수행된다.

바람직한 실시양태에서, 핵산 증폭은 PCR이고 형광 태그부착된 증폭 생성물은 형광 태그부착된 PCR 생성물이다.

분석물-특이적 결합 구성요소 (예컨대 항체 쌍)은 바람직하게는 고유한 PCR 증폭가능한 DNA 표지에 의해 표지될 수 있으며, 즉 두 개의 분석물-특이적 결합 구성요소, 예를 들어 2개의 항체는 바람직하게는 결합 구성요소 (예를 들어 항체)을 고유하게 식별하는 단일 가닥 DNA로 표지될 수 있다. 표지된 결합 구성요소 (예를 들어 항체)는 2-구성요소/항체 복합체 형성을 가능하게 하기위해 샘플 또는 하나 이상의 희석액에 첨가된다.

후속적으로 반응은 예를 들어 바람직하게는 20,000 초과, 바람직하게는 50,000, 100,000 초과의 희석 인자에 의해 고도로 희석되어 예를 들어 액적으로의 유화에 의해, 구획화시 단일-복합체 분리를 달성한다.

핵산 증폭의 경우, 결합 구성요소 (예를 들어 항체) 특이적 고유한 증폭가능한 핵산 표지를 인식하는 형광 태그부착된 증폭 생성물이 사용된다. 예를 들어 결합 구성요소를 고유하게 식별하는 단일 가닥 DNA에 상보적인 FAM- 또는 VIC-표지된 실시간 PCR 프로브를 사용하여, 예를 들어, 형광 태그부착된 PCR 생성물을 사용할 수 있다.

핵산 증폭은 구획 각각, 예를 들어 에멀젼 액적에서 수행하며 신호 판독은 구획의 단일 형광, 예를 들어 액적의 '색'을 검출함으로써 수행할 수 있다.

바람직하게는, ddPCR이 사용되며 ddPCR의 표준 평가에 따라, 액적의 클러스터는 액적의 형광 신호에 따라 결정할 수 있다. 본원에서, 표지된 결합 구성요소 (예를 들어 항체)의 수는 각각의 반응에서 결정된다 (주어진 표지에 대한 모든 표지-양성 액적을 계수하고, 모든 반응에 대해 동일한 정의의 액적 클러스터를 사용). 게다가, 이중-색상 (2개의 상이한 결합 구성요소 표지를 가짐)의 수가 또한 결정된다.

삼원 2-구성요소/분석물 복합체의 형성 없이, 표지된 항체의 분할은 푸아송 분포를 따르고, 계산할 수 있는 수의 이중-색상 액적 (순수한 기회를 기반으로 하여 한 구획에 2개의 결합 구성요소를 가짐)을 결과한다. 반응에 삼원 복합체가 존재하는 경우에, 검출된 이중-색상 액적 (추가 삼원 복합체를 가짐)의 수는 푸아송 분포 단독에 의해 예상되는 것보다 더 크다. 따라서 이러한 분석을 기반으로 하여 삼원 복합체의 수를 계산할 수 있다. 유리하게는, 실시양태는 형성된 삼원 분석물 복합체의 절대 정량을 가능하게 한다.

본원에 기재된 방법의 한 실시양태에서, 다수의 분석물이 병렬적으로 결정된다.

한 실시양태에서, 2-구성요소 검출 방법은 핵산 바코드를 포함하는 다수의 분석물-특이적 결합 구성요소를 사용하는 단계를 포함하고 구획화된 검정을 사용하며, 여기서 핵산 증폭은 연결된 핵산 바코드를 생성하는 각각의 구획에 대해 수행되고, 구획은 공통 풀(pool)로 재결합되며 병렬 핵산 시퀀싱 기술을 사용하여 2-구성요소/분석물 복합체 농도 의존 신호를 생성한다.

본원에서 사용되는 바람직한 병렬 핵산 시퀀싱 기술은 차세대 시퀀싱 기술이다.

바람직한 실시양태에서, 핵산 바코드를 포함하는 결합 구성요소는 명명된 항체 유형에 대한 고유한 표지 및 또한 개별 분자 (고유한 분자 식별자 - UMI)에 대한 표지를 포함하는, 고유 PCR 증폭가능한 DNA 표지로 표지된 항체를 지칭한다 (또한 문헌 [Parekh et al., 2017] 참조). 이렇게 표지된 항체는 2-구성요소/항체 복합체 형성을 가능하게 하기 위해 샘플에 첨가된다.

연결된 핵산 바코드를 생성하기 위해 각각의 구획에 대한 핵산 증폭을 수행하는 것은 예를 들어 20,000 초과, 바람직하게는 50,000 초과, 보다 바람직하게는 100,000 초과의 희석 인자로 핵산 증폭 전에 샘플을 고도로 희석함으로써 달성될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 핵산 증폭은 PCR이다. PCR 시약은 유중수 에멀젼 액적당 단일-복합체 분리 및 핵산 증폭을 달성하기 위해 첨가될 수 있다. 이를 위해 액적 디지털 PCR 표준 프로토콜이 특히 적합할 수 있다.

그 후 구획, 예를 들어 에멀젼 액적은 공통 풀에서 재조합될 수 있고 병렬 핵산 시퀀싱 기술을 사용하여 항체 특이적 이량체화된 UMI 표지를 평가할 수 있다. 본원에서, 표지된 항체의 수는 주어진 항체에 대한 모든 고유한 UMI 표지를 계수하여 각각의 반응에서 결정할 수 있다 (주어진 항체로 제한되는 계수 - 예를 들어 주어진 표지 컨텍스트에서). 동일한 항체의 가능한 다중 표지는 항체당 다중 표지가 이들이 동일한 액적에서 공동-국소화됨에 따라, 주어진 항체 특이적 표지의 맥락에서 이중 UMI 표지 이량체를 나타내기 때문에, 우선적으로 이량체화된 서열을 사용하여 제거할 수 있다.

삼원 2-구성요소/항체 복합체는 항체 다중 표지에 따른 교정과 함께 그의 이량체화된 이중 UMI 표지된 PCR 생성물 2개의 상이한 항체 특이적 표지, 이종이량체라고 칭해짐)를 기반으로 계수될 수 있다.

삼원 복합체의 형성 없이, 표지된 항체의 분할은 푸아송 분포를 따르고, 액적에서 계산할 수 있는 수의 삼원 복합체 (이종이량체의 검출을 기반으로 함)를 결과한다. 반응에 삼원 복합체가 존재하는 경우에, 검출된 이종이량체의 수는 순수한 푸아송 분포에서 예상되는 것보다 더 크다. 이 측정을 기반으로 하여, 복합체의 수를 계산할 수 있다.

구획화된 2-구성요소 방법에서, 고유한 DNA 신호의 공동-국소화를 위한 코딩 단계로서 UMI를 상이한 표적에 통합하는 것이 유리하다.

바람직한 실시양태에서, 본 발명은

a. 두 개의 분석물-특이적 결합 구성요소를 상기 분석물과 접촉시켜 용액 중에 형성된 2-구성요소/분석물 복합체의 농도에 의존하는 신호를 생성하는 단계를 포함하는, 2-구성요소 검출 방법을 수행하기 위한 공지된 농도의 상기 두 개의 분석물-특이적 결합 구성요소

b. 분석물의 농도에 대한 상기 신호의 의존성을 반영하는 수학적 함수인 상기 2-구성요소 검출 방법에 대한 분석물 농도 참조 곡선이며, 여기서 분석물 농도 참조 곡선이 비-전단사 함수이며 증가 및 감소 단조 세그먼트를 나타내는 것인 상기 참조 곡선

c. 임의로 상기 샘플의 하나 이상의 희석액을 제조하고 2-구성요소 검출 방법을 샘플 및 하나 이상의 희석액에 적용하기 위한 인스트럭션(instruction)

d. 샘플 및 하나 이상의 희석액에서 검출된 신호를 샘플 중 분석물의 농도를 결정하기 위해 분석물 농도 비-전단사 참조 곡선과 비교하는 컴퓨팅적 단계를 수행하도록 구성된 컴퓨터 상에서 실행될 때 컴퓨터 프로그램

을 포함하는, 바람직하게는 본원에 기재된 바와 같은 2-구성요소 검출 방법을 사용하여 분석물의 농도를 결정하는 방법을 수행하기 위한 키트에 관한 것이다.

추가의 바람직한 실시양태에서, 본 발명은

a. 두 개의 분석물-특이적 결합 구성요소를 분석물과 접촉시켜 용액 중에 형성된 2-구성요소/분석물 복합체의 농도에 의존하는 신호를 생성하는 단계를 포함하는, 2-구성요소 검출 방법을 수행하기 위한 공지된 농도의 상기 두 개의 분석물-특이적 결합 구성요소

b. 2-구성요소/분석물 복합체의 농도 및 분석물 및/또는 분석물-특이적 결합 구성요소의 농도를 반영하는 상기 신호에 의존하여 분석물과 분석물-특이적 결합 구성요소의 해리 상수 (각각 kd1 및 Kd2) 사이의 관계에 대한 수학적 함수인 상기 2-구성요소 검출 방법에 대한 해리 상수 관계

c. 임의로 상기 샘플의 하나 이상의 희석액을 제조하고 2-구성요소 검출 방법을 정의된 희석 인자를 사용하여 샘플 및 하나 이상의 희석액에 적용하기 위한 인스트럭션

d. 주어진 분석물 및/또는 분석물-특이적 결합 구성요소 농도에서 상기 해리 상수 관계에 대한 수학적 핏에 대한 제한 입력으로서 샘플 및 하나 이상의 희석액에서 검출된 상기 신호를 사용하여 상기 두 개의 분석물-특이적 결합 구성요소의 해리 상수 kd1 및 kd2를 결정하는 컴퓨팅적 단계를 수행하도록 구성된 컴퓨터 상에서 실행될 때 컴퓨터 프로그램

을 포함하는, 바람직하게는 본원에 기재된 바와 같은 2-구성요소 검출 방법에서 해리 상수를 결정하기 위한 방법을 수행하기 위한 키트에 관한 것이다.

본원에 기재된 방법에 대해 개시된 기술적 특색은 이러한 방법에서 사용하기 위한 키트에 또한 적용된다. 따라서, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 본원에 기재된 방법의 바람직한 특색이 키트의 맥락에서도 유리하게 사용될 수 있음을 인식할 것이다.

본 발명의 방법은, 일부 실시양태에서, 또한 소프트웨어 제품과 같은 컴퓨터 프로그램 제품과 관련될 수 있다.

소프트웨어는 공통 컴퓨팅 장치 상에서 실행되도록 구성될 수 있고 본원에 기재된 방법의 단계 중 하나 이상을 수행하도록 구성된다.

한 실시양태에서, 컴퓨터 프로그램은 샘플 및 하나 이상의 희석액에서 검출된 신호를 샘플 중 분석물의 농도를 결정하도록 분석물 농도 참조 곡선과 비교하는 청구항 1의 단계 e) 또는 본원에 개시된 바와 같은 컴퓨팅적 단계의 추가의 바람직한 실시양태를 수행하도록 구성될 수 있다.

한 실시양태에서, 컴퓨터 프로그램은 주어진 결합 구성요소 및 분석물 농도에서 상기 해리 상수 관계에 대한 수학적 핏을 위한 제한 입력으로서 샘플 및 하나 이상의 샘플에서 검출된 상기 신호를 사용하여 상기 2개의 분석물-특이적 결합 구성요소의 해리 상수 kd1 및 kd2를 결정하는 컴퓨팅적 단계를 수행하는 청구항 2의 단계 e) 또는 본원에 개시된 바와 같은 컴퓨팅적 단계의 추가의 바람직한 실시양태를 수행하도록 구성될 수 있다.

한 실시양태에서, 2-구성요소 검출 방법에 대한 농도 참조 곡선 또는 2-구성요소 검출 방법에 대한 해리 상수 관계가 참조 데이터의 형태로 제공될 수 있다.

본원에서, 2-구성요소 검출 방법에 대한 농도 참조 곡선에 대한 참조 데이터는 바람직하게는 분석물의 농도에 대한 상기 용액에서 형성된 2-구성요소/분석물 복합체 형성을 반영하는 신호의 의존성을 반영하는 수학적 함수를 제공할 수 있는 임의의 데이터에 관한 것이어야 한다.

본원에서, 2-구성요소 검출 방법에 대한 해리 상수 관계에 대한 참조 데이터는 바람직하게는 2-구성요소/분석물 복합체의 농도와 분석물 및/또는 분석물-특이적 결합 구성요소의 농도를 반영하는 신호에 의존하여 분석물과 분석물-특이적 결합 구성요소 (각각 kd1 및 kd2)의 해리 상수 사이의 관계에 대한 수학적 함수를 제공할 수 있는 임의의 데이터와 관련되어야 한다-

전형적으로, 참조 데이터는 제어 유닛 상의 컴퓨터-사용가능 또는 컴퓨터-판독가능 매체 상에 저장될 수 있다. 업계에서 사용되는 임의의 형식이 적합할 수 있다. 참조 데이터는 상기에 기재한 바와 같이 샘플 중 분석물의 농도 또는 해리 상수 kd1 및 kd2를 결정하기 위한 컴퓨팅적 단계를 수행하기 위해 별도의 파일에 저장 및/또는 컴퓨터 코드 또는 소프트웨어에서 (예를 들어 소스 코드에서) 통합될 수 있다.

따라서 본 발명의 컴퓨터 프로그램을 포함하는 컴퓨터 프로그램 제품 또는 키트는 또한 본원에 제공된 방법에 대해 기재된 바와 같은 특색을 포함하고 이와 직접적으로 관련된다. 선호된 컴퓨터-기반 접근법에 대한 추가 세부사항은 본원에 기재된 바와 같은 실시예 및 관련 참고문헌에 제공된다.

발명의 상세한 설명

본 발명을 실시예와 관련하여 기재하기 전에, 본원에 사용된 용어는 단지 특정한 실시양태를 기재하기 위한 것이며 본 발명의 범위를 제한하려는 의도가 아님을 이해하여야 한다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "샘플" 또는 "샘플 용액"은 바람직하게는 미지의 농도의 분석물을 포함하는 용액을 지칭한다. 샘플의 예는 생물학적 유체 예컨대 혈청, 혈장, 소변, 눈물, 세포, 세포 혼합물, 세포 배양 상청액, 또는 하나 이상의 생물학적 표적 분자를 함유하는 세포 용해물을 포함한다. 더욱이, 샘플은 분석물을 가용성으로 만들고 검출 및 정량화에 접근하도록 하는 데 필요한 임의의 컨디셔닝 시약 (예를 들어 투과성 시약)을 또한 포함할 수 있다. 이러한 컨디셔닝 시약은 본원에 기재된 방법을 수행하기 전이나 후에 언제든지 샘플에 첨가할 수 있다.

용어 "분석물"은 본 발명의 방법에 의해 검출, 정량화 또는 달리 검정될 물질을 지칭한다. 전형적인 분석물은 단백질, 펩티드, 핵산 세그먼트, 탄수화물, 지질, 항체 (모노클로날 또는 폴리클로날), 항원, 올리고뉴클레오티드, 특이적 수용체 단백질, 리간드, 분자, 세포, 미생물, 그의 단편, 생성물 또는 조합, 또는 부착 부위, 결합 구성원 또는 수용체 (예컨대 항체)가 발달될 수 있는 임의의 물질을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 분석물은 또한 상기 실체로부터의 복합체를 지칭할 수 있다. 예를 들어, 분석물은 다수의 실체 또는 분자로 형성된 집합체 또는 복합체를 지칭할 수 있으며, 예를 들어 실체/분자의 상호작용인 단백질-단백질 복합체가 관심 대상이다.

"단백질"이란, 쇄 길이가 더 높은 수준의 3차 및/또는 4차 구조를 생성하기에 충분한 아미노산의 서열을 의미한다. "펩티드"는 바람직하게는 더 작은 분자량 단백질을 지칭한다.

용어 "핵산"은 단일- 또는 이중-가닥 형태의 DNA, RNA 및 하이브리드 또는 변형된 변이체 및 중합체 ("폴리뉴클레오티드")를 제한 없이 포함하는 임의의 핵산 분자를 지칭한다. 구체적으로 제한되지 않는 한, 상기 용어는 참조 핵산과 유사한 결합 특성을 갖고 자연 발생 뉴클레오티드와 유사한 방식으로 대사되는 천연 뉴클레오티드의 공지된 유사체를 함유하는 핵산을 포함한다. 달리 지시되지 않는 한, 특정한 핵산 분자/폴리뉴클레오티드는 또한 그의 보존적으로 변형된 변이체 (예를 들어 축퇴 코돈 치환) 및 상보적 서열뿐만 아니라 명시적으로 지시된 서열을 암시적으로 포함한다. 구체적으로, 축퇴 코돈 치환은 하나 이상의 선택된 (또는 모든) 코돈의 세 번째 위치가 혼합-염기 및/또는 데옥시이노신 잔기로 치환된 서열을 생성함으로써 달성될 수 있다 (Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19: 5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260: 2605-2608 (1985); Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8: 91-98 (1994)). 뉴클레오티드는 하기 표준 약어: 아데닌 (A), 시토신 (C), 티민 (T), 및 구아닌 (G)에 의해 그의 염기로 표시된다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "핵산 증폭"은 제한된 양의 핵산이 더 많은 양의 핵산이 생성되는 생화학적 반응을 겪는 과정을 지칭한다. 따라서 핵산 증폭은 핵산 서열의 추가 카피의 생성과 관련되며 일반적으로 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR) 또는 리가제 연쇄 반응 (LCR) 또는 관련 분야에 널리 공지된 기타 기술을 사용하여 수행된다 (예를 들어, 문헌 [Dieffenbach, C. W. and G. S. Dveksler (1995) PCR Primer, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview, N.Y.] 참조).

사용된 바와 같이, 본원에서 용어 "2-구성요소 검출 방법" 또는 "2-분자 검출 방법"은 두 개의 분석물-특이적 결합 구성요소를 사용하고 2-구성요소/분석물 복합체의 형성을 반영하는 신호를 결정하는 방법이며, 상기 두 개의 분석물-특이적 결합 구성요소는 분석물을 함유하는 용액과 접촉하게 되는 경우인 방법을 지칭한다. 용어 "2-구성요소 검출 시스템" 또는 "2-분자 검출 시스템"은 바람직하게는 2-구성요소 검출 방법을 수행하는 데 필요한 구성요소 또는 시약을 지칭한다. 이는 바람직하게는 두 개의 분석물-특이적 결합 구성요소를 포함하며, 바람직하게는 공지된 농도의 단일 또는 별도의 용액으로뿐만 아니라 임의적으로 분석할 분석물을 함유하는 샘플 용액으로 제공된다.

바람직하게는 두 개의 분석물-특이적 결합 구성요소뿐만 아니라 분석물은 비-고정이며, 즉 용액으로 제공되어, 2-구성요소/분석물 복합체가 마찬가지로 용액 중에 형성되도록 한다. 따라서 본원에 사용된 바와 같은 용어 2-구성요소 검출 방법은 바람직하게는 삼원 복합체의 액상 형성을 다루고 고체상으로서 고정화된 (1차) 포획 결합제뿐만 아니라 (2차) 검출 결합제를 포함하는 통상의 샌드위치 면역검정과 구별된다.

따라서 용어 "비-고정"은 바람직하게는 (액체) 용액 내에서 자유롭게 확산될 수 있는 분석물-특이적 결합 구성요소와 같은 구성요소를 지칭하여, 분석물에 대한 결합 동역학이 상기 액체 용액에서 동등하게 자유롭게 확산되도록 하고, 본원에 기재된 바와 같은 질량 보존 법칙 및 용액에서의 질량 법칙 작용에 대한 수학식에 의해 지배된다.

용어 "분석물-특이적 결합 구성요소" 또는 "분석물-특이적-결합 파트너"는 바람직하게는 결합 쌍의 한 구성원을 지칭하며, 여기서 제2 구성원은 분석물이고, 용어 "결합 쌍"은 면역-유형 결합 쌍 예컨대 항원/항체 또는 합텐/항-합텐 시스템의 부류 중 어느 하나; 및 또한 비면역-유형 결합 쌍, 예컨대 바이오틴/아비딘; 비오틴/스트렙타비딘; 엽산/엽산 결합 단백질; 상보적 핵산 세그먼트 예컨대 상보적 DNA 가닥 또는 상보적 RNA 가닥; 단백질 A 또는 G/면역글로불린; 및 공유 결합을 형성하는 결합 쌍, 예컨대 말레이미드 및 할로아세틸 유도체를 포함한 술프히드릴 반응기, 및 아민 반응기 예컨대 이소트리오시아네이트, 숙신이미딜 에스테르 및 술포닐 할라이드의 부류 중 어느 하나를 포함한다.

2-구성요소 검출 방법의 결합 구성요소는 바람직하게는 분석물에 대한 결합 가능성을 갖는 임의의 구성요소를 지칭할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 분석물-특이적 결합 구성요소는 핵산, 바람직하게는 RNA 및/또는 DNA 올리고뉴클레오티드, 항체, 펩티드, 단백질, 앱타머, 분자-각인 중합체, 세포 또는 이들의 조합일 수 있다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "항체"는 모노클로날 항체 (전장 모노클로날 항체 포함), 폴리클로날 항체, 다중특이적 항체 (예를 들어, 이중특이적 항체), 및 원하는 생물학적 활성을 나타내는 한 항체 단편을 포함한다.

"항체 단편"은 전장 항체의 일부, 일반적으로 그의 항원 결합 또는 가변 영역을 포함한다. 항체 단편의 예는 Fab, Fab', F(ab')₂, 및 Fv 단편; 디아바디; 선형 항체; 단일-쇄 항체 분자; 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체를 포함한다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "모노클로날 항체"는 실질적으로 균질한 항체 집단으로부터 수득된 항체를 지칭하며, 즉 집단을 포함하는 개별 항체는 소량으로 존재할 수 있는 가능한 자연 발생 돌연변이를 제외하고는 동일하다. 모노클로날 항체는 단일 항원 부위에 대해 매우 특이적으로 지시된다. 더욱이, 상이한 결정인자 (에피토프)에 대해 지시된 상이한 항체를 전형적으로 포함하는 통상적인 (폴리클로날) 항체 제제와 대조적으로, 각각의 모노클로날 항체는 항원 상의 단일 결정인자에 대해 지시된다. 변형자 "모노클로날"은 항체의 실질적으로 균질한 집단으로부터 수득되는 항체의 특성을 나타내며, 임의의 특정한 방법에 의한 항체의 생산을 필요로 하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용되는 모노클로날 항체는 문헌 [Kohler et al., Nature 256:495 (1975)]에 의해 처음 기재된 하이브리도마 방법에 의해 제조될 수 있거나, 재조합 DNA 방법에 의해 제조될 수 있다 (예를 들어, 미국 특허 번호 4,816,567 참조). "모노클로날 항체"는 또한, 예를 들어, 문헌 [Clackson et al, Nature 352:624-628 (1991)] 및 [Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991)]에 기재된 기술을 사용하여 파지 항체 라이브러리로부터 단리될 수 있다.

본원의 모노클로날 항체는 구체적으로 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정한 종으로부터 유래되거나 특정한 항체 부류 또는 아부류에 속하는 항체에서 상응하는 서열과 동일하거나 상동성인 "키메라" 항체 (면역글로불린)를 포함하며, 한편, 나머지 쇄 (들)는 또 다른 종로부터 유래하거나 또 다른 항체 부류 또는 아부류에 속하는 항체, 뿐만 아니라 원하는 생물학적 활성을 나타내는 한, 이러한 항체의 단편에서 상응하는 서열과 동일하거나 상동성이다 (미국 특허 번호 4,816,567; 및 문헌 [Morrison et al., Proc. NatL. Acad Sci. USA 81:6851-6855 (1984)]).

상보성 결정 영역 (CDR)은 B 세포에 의해 생성되는 면역글로불린 (항체)의 가변 쇄의 일부이며, 여기서 이들 분자는 그의 특이적 항원에 결합한다. 분자의 가장 가변적인 부분으로서, CDR은 면역글로불린에 의해 생성된 항원 특이성의 다양성에 결정적이다. 면역글로불린의 가변 도메인의 아미노산 서열에는 3개의 CDR (CDR1, CDR2 및 CDR3)이 비연속적으로 배열되어 있다. 면역글로불린은 전형적으로 2개의 가변 도메인 (2개의 상이한 폴리펩티드 쇄, 중쇄 및 경쇄)으로 구성되기 때문에, 항원과 집합적으로 접촉할 수 있는 각각의 항원 수용체에 대해 6개의 CDR이 있다.

게다가, 전체 항체의 단편은 결합 항원의 기능을 수행할 수 있다. 결합 단편의 예는 (i) VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fab 단편; (ii) VH 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fd 단편; (iii) 단일 항체의 VL 및 VH 도메인으로 이루어진 Fv 단편; (iv) VH 도메인으로 이루어진 dAb 단편 (Ward, E.S. et ai, Nature 341 :544-546 (1989)); (v) 단리된 CDR 영역; (vi) F(ab')2 단편, 2개의 연결된 Fab 단편을 포함하는 2가 단편 (vii) VH 도메인 및 VL 도메인이 2개의 도메인이 회합하여 항원 결합 부위를 형성가능하게 하는 펩티드 링커에 의해 연결되어 있는 단일쇄 Fv 분자 (scFv) (Bird et ai , Science 242:423-426 ( 1988); Huston et al , PNAS USA 85:5879-5883 (1988)); (viii) 이중특이적 단일쇄 Fv 이량체 (PCT/US92/09965) 및 (ix) "디아바디", 유전자 융합에 의해 구축된 다가 또는 다중특이적 단편 (WO94/13804; P. Hollinger et ai, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993))이다.

"항원 결합 도메인"은 항원에 특이적으로 결합하고 항원의 일부 또는 전부에 상보적인 영역을 포함하는 항체의 일부이다. 항원이 큰 경우 항체는 항원의 특정한 부분에만 결합할 수 있으며, 이 부분을 에피토프라고 칭한다. 항원-결합 도메인은 하나 이상의 항체 가변 도메인에 의해 제공될 수 있다. 항원-결합 도메인은 항체 경쇄 가변 영역 (VL) 및 항체 중쇄 가변 영역 (VH)을 포함할 수 있다.

일부 실시양태에서, 결합 구성요소는 조작된 단백질 스캐폴드를 기반으로 할 수 있다. 단백질 스캐폴드는 표적 분자, 즉, 관심 분석물에 대한 결합 부위를 제공하도록 변형된 안정하고 가용성인 천연 단백질 구조로부터 유래된다. 조작된 단백질 스캐폴드의 예는 a-나선 중 2개에 결합 인터페이스를 제공하는 포도상구균성 단백질 A의 Z-도메인을 기반으로 하는 어피바디 (Nygren, P. A. (2008). FEBS J 275 (1 1): 2668-76); 베타-배럴 접힘(beta-barrel fold)의 개방 말단에서 작은 리간드에 대한 결합 부위를 포함하는 리포칼린으로부터 유도된 안티칼린 (Skerra, A. (2008) FEBS J 275(1 1): 2677-83), 나노바디, 및 DARPin을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 조작된 단백질 스캐폴드는 전형적으로 항체와 동일한 항원 단백질에 결합하도록 표적화된다. 짧은 펩티드는 또한 표적 단백질에 결합하는 데 사용될 수 있다. 필로머(Phylomer)는 박테리아 게놈으로부터 유래된 천연 구조의 펩티드이다. 이러한 펩티드는 단백질 구조적 접힘의 다양한 어레이를 나타내며 생체내에서 단백질-단백질 상호작용을 억제/방해하는데 사용될 수 있다 (Watt, P. M. (2006). Nat Biotechnol 24(2): 177-83)].

2-구성요소 검출 방법에서, 바람직하게는 둘 다 분석물에 대한 결합 가능성을 나타내는 두 개의 분석물-특이적 결합 구성요소가 사용된다. 바람직하게는, 두 개의 분석물-특이적 결합 구성요소는 분석물에 대한 결합에 대해 서로 경쟁하지 않으나, 구성요소의 동시 결합이 2-구성요소/분석물 복합체를 형성할 수 있도록 선택 및 설계된다. 앞서 언급한 바와 같이, 분석물은 다수의 실체로 형성된 집합체 또는 복합체, 예를 들어 단백질-단백질 복합체를 지칭할 수 있다. 2개의 분석물-특이적 결합 구성요소 중 하나는 분석물 복합체의 하나의 실체 예를 들어 제1 단백질에 결합할 수 있으며 다른 하나는 분석물의 제2 실체, 예를 들어 제2 단백질에 결합할 수 있다. 따라서 2-구성요소/분석물 복합체는 두 단백질 모두의 상호작용의 경우에만 형성되며, 이는 차례로 결합 구성요소로 표지된다.

일부 실시양태에서, 결합 구성요소는 앱타머일 수 있다. 앱타머는 형상 상보성과 비공유 화학 결합의 조합을 통해 높은 친화도 및 특이도로 표적 분자를 인식하는 합성 올리고뉴클레오티드 (DNA 또는 RNA)이다 (Blank & Blind, Current Opin. Chem. Biol., 2005, 9:336-342). 이들 인공 리간드는 시험관내에서 수득되며 단순한 이온 (예를 들어 Pb2+, Liu & Lu, 2003. J Am Chem Soc, 125, 6642-6643)에서 뉴클레오티드, 작은 분자, 단백질, 바이러스, 및 세포에서 전체 유기체 (Menger et al., 2006. Handbook of Experimental Pharmacology, 359-373)까지에 이르는 매우 다양한 분자 부류를 인식하도록 개발될 수 있다. 저분자량 분자 예컨대 테오필린 (Jenison et al., 1994. Science, 263, 1425-1429), L-아르기닌 (Geiger et al., 1996. Nucl. Acids Res., 24, 1029-1036), 모에노마이신 (Schuerer et al., 2001. Bioorg. Med. Chem., 92, 2557-2563), 17b-에스트라디올 (Kim et al., 2007. Biosens. Bioelectron., 22, 2525-2531)의 검출뿐만 아니라 그 중에서도, 더 큰 분자 예컨대 트롬빈 (트롬빈 결합 앱타머:5'-GGTTGGTGTGGTTGG-3') (Baldrich et al., Anal Chem. 2004, 76, 23, 7053-63), 콜레라 독소 또는 HIV-1 tat 단백질 (검토를 위해 문헌 [Tombelli et al., 2007, Biomolec Eng., 24, 191-200] 참조)의 검출을 위해 널리 공지된 SELEX 방법 (Ellington & Szostak, 1990. Nature, 346, 818-822)을 통해 높은 결합 친화도 앱타머가 선택되었다.

상기-언급한 앱타머 중 일부는 마이크로플레이트 또는 바이오센서 변환기 (QCM, SPR)의 표면에 대한 ELISA-유사 검정에서 사용되었다. 샌드위치-기반 검정에서 단백질 PDGF의 결정을 위해 앱타머-변형된 AuNP 비색 시스템이 또한 개발되었다 (Huang et al., 2005, 77, 5735-5741).

본원에 사용된 바와 같이 용어 "분석물/2-구성요소 복합체" 또는 "2-구성요소/분석물 복합체"는 분석물 및 분석물-특이적 결합 구성요소 둘 다를 함유하는 삼원 복합체를 지칭한다. 이러한 2-구성요소/분석물 복합체는 2-구성요소 검출 방법을 분석물을 함유하는 용액에 적용할 때 형성된다. 보다 구체적으로, 2-구성요소 검출에서 2-구성요소/분석물 복합체의 형성은 주어진 용액에서 분석물의 존재 (및 농도)에 직접적으로 반영된다. 분석물의 실제 농도를 결정하기 위해 2-구성요소/분석물 복합체의 형성을 사용하기 위해 삼원 복합체 형성을 반영하는 신호를 획득하여야 한다.

본원에 사용된 바와 같이 표현 "2-구성요소/분석물 복합체의 농도에 의존하는 신호" 또는 "2-구성요소/분석물 복합체의 형성을 반영하는 신호"는 형성되는 삼원 2-구성요소/분석물 복합체의 양을 추론할 수 있는 임의의 정량화 가능한 정보를 지칭한다.

당연히, 신호는 적용된 2-구성요소 검출 방법에 따라 달라질 것이다. 예를 들어, 푀스테르 공명 에너지 전달 (FRET) 검정이 사용되는 경우 신호는 FRET 공여자가 매우 근접한 여기 빔을 흡수할 때 FRET 수용자가 방출할 형광 신호를 지칭할 수 있다. 2-구성요소 시스템에서, FRET-수용자 또는 FRET-공여자는 바람직하게는 두 개의 분석물-특이적 결합 구성요소와 커플링된다. 따라서 FRET-공여자-수용자로부터의 형광 신호는 각각의 결합 구성요소가 매우 근접한 경우 때만이므로, 신호는 삼원 2-구성요소/분석물 복합체의 형성시 직접적으로 반영된다.

유사하게, 퍼킨알머(PerkinElmer)가 개발하고 상업적으로 널리 이용 가능한 알파스크린 (증폭된 발광 근접 균질 검정(Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay))은 신호 생성이 생체접합을 위한 관능기를 제공하는 히드로겔 층으로 코팅된 "공여자" 및 "수용자" 비드의 근접에 의존하는 추가 프로토타입 2-구성요소 검출 방법이다. 분자 사이의 생물학적 상호작용이 비드를 근접하게 만들 때, 화학 반응의 캐스케이드가 시작되어 크게 증폭된 신호를 생성한다. 레이저 여기시, "공여자" 비드의 감광제가 주위 산소를 더 여기된 단일항 상태로 전환한다. 단일항 상태 산소 분자는 동일한 비드 내에 함유된 형광단을 추가로 활성화시키는 "수용자" 비드의 화학발광체와 반응하도록 가로질러 확산된다. 형광단은 후소적으로 520-620 nm에서 빛을 방출한다. 비드 상의 관능기는 예를 들어 특이적 항체의 형태로 두 개의 분석물-특이적 결합 구성요소를 나타낼 수 있다. 분석물과 두 개의 분석물-특이적 구성요소를 포함하는 삼원 복합체가 형성될 때만 공여자 및 수용체 비드가 매우 근접하여 검출가능한 형광 신호를 결과한다.

공여자와 수용자의 근접에 대한 FRET-검정 또는 알파스크린 검정의 의존성으로 인해 따라서 분석물-특이적 결합 구성요소 검정은 근접 기반 검출 검정이라고 칭해진다. 2-구성요소 검출 방법의 맥락에서 많은 상이한 근접 기반 검정이 관련 기술분야에 공지되어 있고 본원에 기재된 방법에서 사용될 수 있다.

본원에 사용된 바와 같이 용어 "근접 기반 2-구성요소 검출 방법"은 2-구성요소/분석물 복합체의 형성을 반영하는 신호가 두 개의 분석물-특이적 결합 구성요소의 근접을 기반으로 하는 임의의 검정을 지칭할 것이다. 통계적으로, 두 개의 분석물-특이적 결합 구성요소는 이들이 동일한 삼원 복합체의 일부를 형성하는 경우, 검출가능한 신호를 산출하기 위해 용액 중에서 매우 근접할 것으로 예상될 것이다.

근접 기반 2-구성요소 방법의 비제한적인 예는 공명 에너지 전달 검정, 바람직하게는 푀스테르 공명 에너지 전달 (FRET) 검정 또는 생물발광 공명 에너지 전달 (BRET) 검정, 단백질 보완 검정 (PCA), 단백질 보완 검정 (PCA), 알파스크린 또는 DNA 표지된 근접 검정, 바람직하게는 근접 라이게이션 검정 (PLA) 또는 근접 확장 검정 (PEA)을 사용하는 방법을 포함한다.

이들 근접 검정 기술은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. FRET 또는 BRET에 대한 추가 참조는 예를 들어 문헌 (Pfleger, Seeber, & Eidne, 2006)를, 단백질 보완 분석의 경우 문헌 [Morell, Ventura, & Avil

s, 2009]를, 알파스크린의 경우 문헌 [Taouji, Dahan, Bosse, & Chevet, 2009]를 그리고 DNA 표지된 근접 방법 예컨대 PLA (근접 라이게이션 검정) 또는 PEA (근접 확장 검정)의 경우 문헌 [S

derberg et al., 2006]을 참조한다.

근접 기반 검정은 "비-구획화 2-구성요소 검출 방법"에 특히 바람직하며, 이는 본원에 사용되어, 2-구성요소 검출 방법을 지칭하여야 하며, 여기서 2-구성요소 검출 방법을 적용시 샘플 용액의 어떤 구획화도 수행되지 않는다. 일부 비-구획화된 검정은 균질 검정이라고도 지칭된다. 환언하면, 비-구획화된 2-구성요소 방법은 바람직하게는 균질한 반응 용액에서 분석물과 2-구성요소를 접촉시키는 단계를 포함하며 및 삼원 2-구성요소/분석물 복합체의 형성을 반영하는 신호를 획득하기 위한 검출 단계는 결합되지 않은 구성요소 또는 분석물의 분리 없이 균질한 샘플 용액 상에서 수행할 수 있다.

특히 바람직한 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 방법은 구획화된 2-구성요소 검출 방법을 사용한다. 본원에 사용된 바와 같이 용어 "구획화된 2-구성요소 검출 방법"은 삼원 분석물/결합 구성요소의 형성을 정량화하기 위해 분석물 특이적 결합 구성요소를 분석물과 접촉시킨 후 샘플을 구획화하는 2-구성요소 검출 방법을 지칭할 것이다.

일반적으로, 구획화된 2-구성요소 검출 방법은 용액을 작은 구획으로 구획화하는 것을 기반으로 하여 삼원 분석물/결합 구성요소 방법이 형성 없이는 구획에 두 결합 구성요소 모두가 존재할 개연성이 없으며 푸아송 분포를 따른다.

구획화를 위해, 다양한 검정을 구상할 수 있다. 예를 들어, 에멀젼 액적 방법을 사용하여 에멀젼 (예를 들어 유중수)에서 액적을 형성할 수 있으며, 여기서 각각의 액적은 별도의 구획을 나타낸다. 구획화는 위치 또는 물리적 구획, 또는 확산 제한 환경을 포함할 수 있다.

본원에 사용된 바와 같은 "액적"이라는 용어는 바람직하게는 제2 유체에 의해 둘러싸인 제1 유체의 고립된 부분을 지칭한다. 제1 유체는 바람직하게는 물, 수성 매질, 또는 완충제와 같은 친수성 유체를 포함하고, 바람직하게는 샘플 용액 또는 그의 하나 이상의 희석액을 포함하며 여기에 2-구성요소 검출 시스템 또는 기타 시약이 첨가된다. 제2 유체는 바람직하게는 탄화수소, 실리콘유, 광유, 유기 용매와 같은 소수성 유체이다. 샘플 용액을 구획화하기 위한 에멀젼 기술은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다.

특히 바람직한 실시양태에서, 구획화된 2-구성요소 검출 방법은 에멀젼 커플링이며, 이는 에멀젼에서 이중 표지된 (2-구성요소) 개별 삼원 분자 복합체의 검출을 기반으로 하는 디지털 검정 개념을 지칭하며, 이는 예를 들어, 액적 디지털 PCR (ddPCR) 또는 차세대 시퀀싱 (NGS)에 의해 식별될 수 있다.

액적 디지털 PCR (ddPCR)은 바람직하게는 물-오일 에멀젼 액적 기술을 기반으로 하는 디지털 PCR을 수행하는 방법을 지칭한다. 오일 액적은 웰 각각에 진공을 적용하는 액적 생성기를 사용하여 제조할 수 있다 (예를 들어 문헌 [Pinheiro et al. Analytical Chemistry 84 (2):1003-11)] 참조). 전형적으로 샘플은 20,000개 이상의 액적으로 분획화될 수 있으며, 주형 분자의 PCR 증폭은 각각의 개별 액적에서 발생한다. 유리하게는, ddPCR 기술은 대부분의 표준 TaqMan 프로브-기반 검정에 사용되는 것들과 유사한 시약 및 워크플로를 사용한다.

본원에 사용된 바와 같은 "차세대 시퀀싱 (NGS)"은 전형적으로 전통적인 생어(Sanger) 접근법보다 훨씬 더 높은 처리량을 가능하게 하는 핵산의 시퀀싱을 위해 최근에 개발된 기술을 포함하여야 한다 (문헌 [(Schuster, Next-generation sequencing transforms today's biology, Nature Methods 5:16-18 (2008); Metzker, Sequencing technologies the next generation. Nat Rev Genet. 2010 January; 11(1):31-46] 참조. 이들 플랫폼은 핵산 단편의 클론 확장 또는 비증폭 단일 분자의 시퀀싱을 가능하게 할 수 있다. 특정 플랫폼은, 예를 들어, 염료-변형 프로브의 라이게이션에 의한 시퀀싱(순환 라이게이션 및 절단 포함), 파이로시퀀싱, 및 단일-분자 시퀀싱을 포함한다. 뉴클레오티드 서열 종, 증폭 핵산 종 및 그로부터 생성된 검출가능한 생성물은 이러한 서열 분석 플랫폼에 의해 분석될 수 있다. 차세대 시퀀싱은 예를 들어 하기에 기재된 바와 같이 2-구성요소/분석물 복합체의 형성을 평가하기 위해 고유한 PCR 증폭가능한 DNA 표지를 정량화는데 본 발명의 방법에서 사용될 수 있다.

바람직한 구획화된 2-구성요소 검출 방법으로서 에멀젼 커플링의 세부사항은 본원에 참조로 포함되는 EP 3224360에 기재되어 있다.

에멀젼 커플링 검정에서 ddPCR 검출을 위해, 분석물-특이적 결합 구성요소 (예컨대 항체 쌍)은 고유한 PCR 증폭가능한 DNA 표지에 의해 표지되고 따라서 표지된 결합 구성요소는 샘플 (또는 그의 희석액 (예를 들어 실시예 3 참조))에 첨가된다.

샘플을 유화하기 전에, 반응물을 고도로 희석하고 (~100,000배) PCR 시약을 첨가하여 단일-복합체 분리 및 유중수 에멀젼 액적당 PCR 증폭을 달성한다. ddPCR은 표준 ddPCR 프로토콜을 사용하여 수행할 수 있다.

반응 평가는 형광 태그부착된 PCR 생성물 (예를 들어 FAM- 또는 VIC-표지된 실시간 PCR 프로브 사용)을 사용하는 ddPCR 반응에서 표지의 분할을 기반으로 할 수 있다. dPCR 표준 평가에 따르면, 액적 클러스터는 액적의 형광 신호에 따라 결정할 수 있다. 본원에서, 표지된 결합 구성요소 (예를 들어 항체)의 수는 각각의 반응에서 결정된다 (주어진 표지에 대한 모든 표지-양성 액적을 계수하고, 모든 반응에 대해 동일한 정의의 액적 클러스터를 사용).

게다가, 이중-색상 (2개의 상이한 결합 구성요소 표지를 가짐)의 수가 또한 결정된다. 삼원 복합체 없이, 표지된 항체의 분할은 푸아송 분포를 따르고, 계산할 수 있는 수의 이중-색상 액적 (순수한 기회를 기반으로 하여 한 구획에 2개의 결합 구성요소를 가짐)을 결과한다. 반응에 삼원 복합체가 존재하는 경우에, 검출된 이중-색상 액적 (추가 삼원 복합체를 가짐)의 수는 푸아송 분포에 의해 예상되는 것보다 더 크다.

이 측정을 기반으로 하여 복합체의 수를 계산할 수 있다 (예를 들어 추가 참조용으로 EP 3224360 또는 [Karakus et al., 2019]). 이는 삼원 분석물 복합체의 절대 (분자 수) 정량을 결과한다.

에멀젼 커플링 검정에서 차세대 시퀀싱 검출을 위해 결합 구성요소는 바람직하게는 결합 구성요소 (예를 들어 항체)에 대한 특이적 표지 및 바람직하게는 또한 분자에 대한 개별 표지, 즉 고유 분자 바코드 또는 고유한 분자 식별자 - UMI를 포함하는, 고유한 PCR 증폭가능한 DNA 표지에 의해 표지될 수 있다 (문헌 [Parekh et al., 2017] 참조). 표지된 결합 구성요소는 샘플 또는 그의 희석액에 첨가될 수 있다 (실시예 3 참조).

결합 구성요소, 예를 들어 항체의 결합 후, 그리고 샘플의 유화 전에, 반응물은 고도로 희석될 수 있고 (예를 들어 ~100,000배), PCR 시약을 첨가하여 단일-복합체 분리를 달성할 수 있다. PCR 증폭은 유중수 에멀젼 액적당 수행할 수 있다. ddPCR은 ddPCR 프로토콜을 사용하여 수행할 수 있다.

반응 평가는 결합 구성요소, 예를 들어 항체의 NGS 판독, 에멀젼 커플링의 표준 프로토콜에 따라 생성된 특정 이량체화된 UMI 표지를 기반으로 할 수 있다 . 표지된 결합 구성요소, 예를 들어 항체의 수는 주어진 결합 구성요소 예를 들어 항체에 대한 모든 고유한 UMI 표지를 계수하여 각각의 반응에서 결정할 수 있다 (주어진 결합 구성요소로 제한되는 계산). 동일한 결합 구성요소, 예를 들어 항체의 가능한 다중 표지화는 우선적으로 이량체화된 서열을 사용하여 제거할 수 있다 (결합 구성요소당 다중 표지는 이들이 동일한 액적에 공동-국소화됨에 따라, 항상 주어진 항체 특이적 표지의 맥락에서 이중 UMI 표지 이량체를 결과한다).

삼원 항체/2-구성요소 복합체는 그의 이량체화된 이중 UMI 표지된 PCR 생성물 (이종이량체라고 칭해지는 두 개의 상이한 결합 구성요소 (예를 들어 항체) 특이적 표지의 맥락에서)을 기반으로 계수된다. 결합 구성요소 (예를 들어 항체)의 다중 표지화에 대한 교정은 상기에 기재한 개념에 따라 사용될 수 있으며, 이는 주어진 구성요소 (예를 들어 항체) 특이적 표지를 가진 이중 UMI 표지 이량체를 고려한다.

형광 태그부착된 PCR (액적 디지털 PCR)의 경우에서와 같이 샘플의 추가 평가를 간단히 삼원 복합체 없이 수행할 수 있으며, 표지된 항체의 분할은 푸아송 분포를 따르고, 액적에서 (이종이량체의 검출을 기반으로 하여) 계산 가능한 수의 삼원 복합체를 결과한다 (우연히 단지 2개의 항체를 가짐). 반응에 삼원 복합체가 존재하는 경우에, 검출된 이종이량체의 수는 순수한 푸아송 분포에 의해 예상되는 것보다 많다. 이 측정을 기반으로 하여, 복합체의 수를 계산할 수 있다 (EP 3224360, (Karakus et al., 2019)). 이는 삼원 복합체의 절대 (분자 수) 정량을 결과한다.

샘플의 희석은 샘플 특이적 DNA 바코드 (예를 들어 바코딩된 프라이머)를 사용하여 동일한 시퀀싱 반응에서 측정할 수 있으며 항체는 구별 가능한 구성요소 (예를 들어 항체) 특이적 표지를 가지므로 많은 측정 (상이한 항원에 대해 상이한 항체 쌍 사용)을 병렬적으로 수행할 수 있다.

에멀젼 커플링의 실시양태에서 결합 구성요소는 다수의 분석물의 검출에 적합한 결합 구성요소의 라이브러리로서 제공될 수 있다. 이들 실시양태에서, 결합 구성요소 라이브러리의 각각의 구성원은 결합 구성요소를 확인하는 데 사용될 수 있는 고유한 뉴클레오티드 서열과 연관될 수 있다.

"연관된"은 에멀젼 커플링의 맥락에서 복합체 내의 결합 구성요소의 존재가 방법에서 생성된 연결된 서열 내의 핵산 서열의 존재에 의해 검출될 수 있음을 의미할 수 있다. 뉴클레오티드 서열은 결합 구성요소에 대한 표지로서 부착될 수 있으며, 예를 들어 결합 구성요소 자체의 일부, 예를 들어 앱타머, 또는 결합 구성요소 예를 들어 파지 내의 핵산 내에 존재한다. 예를 들어, 라이브러리의 각각의 구성원은 결합 구성요소에 부착된 뉴클레오티드 서열인 고유한 뉴클레오티드 서열로 표지될 수 있다.

항체 또는 화합물과 같은 결합 구성요소에 뉴클레오티드를 부착하는 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 대안적으로, 결합 구성요소 라이브러리가 파지 표시 라이브러리인 경우, 고유한 뉴클레오티드 서열은 하나 이상의 CDR 영역 또는 표시된 결합 도메인을 코딩하는 서열일 수 있다. 예를 들어, 표시 라이브러리는 표시될 아미노산 서열을 코딩하는 서열을 공지된 위치의 파지 내로 삽입함으로써 생성될 수 있다. 이어서, 삽입된 서열을 증폭할 범용 프라이머를 사용하여 결합 서열을 식별할 수 있다.

대안적으로, 결합 구성요소가 앱타머일 수 있고 앱타머 자체가 고유한 뉴클레오티드 서열일 수 있다.

뉴클레오티드 서열은 올리고뉴클레오티드일 수 있고 RNA 또는 DNA, 단일 또는 이중 가닥을 포함할 수 있다. 결합제 또는 표적을 표지하기 위해 사용되는 뉴클레오티드는 바람직하게는 길이가 5-150개 염기, 예를 들어, 길이가 10-40개, 또는 40-80개 염기일 수 있다. 핵산을 형성하는 뉴클레오티드는 분자의 안정성을 증가시키거나, 그의 생체이용률을 개선시키거나 그에 대한 추가 활성을 부여하기 위해 화학적으로 변형될 수 있다. 예를 들어, 피리미딘 염기는 6 또는 8 위치에서 변형될 수 있고, 퓨린 염기는 5 위치에서 CH3 또는 할로겐, 예컨대 I, Br 또는 CI로 변형될 수 있다. 변형 또는 피리미딘 염기는 또한 2 NH3, 0 -CH3, N -CH3 및 N2-CH3을 포함한다. 2' 위치의 변형은 당 변형이며 전형적으로 NH2, F, 또는 OCH3 기를 포함한다. 변형은 캡핑과 같은 3' 및 5' 변형을 또한 포함할 수 있다.

대안적으로, 변형된 뉴클레오티드, 예컨대 모르폴리노 뉴클레오티드, 잠금 핵산 (LNA) 및 펩티드 핵산 (PNA)을 사용할 수 있다. 모르폴리노 올리고뉴클레오티드는 상이한 모르폴리노 소단위로부터 어셈블리되며, 이 각각은 6원 모르폴린 고리에 연결된 4가지 유전적 염기 (아데닌, 시토신, 구아닌, 및 티민) 중 하나를 함유한다. 서브유닛은 비이온성 포스포로디아미데이트 서브유닛간 연결에 의해 연결되어 모르폴리노 올리고뉴클레오티드를 제공한다. LNA 단량체는 푸라노스 고리 입체형태가 2'-O 위치를 4'-C 위치에 연결하는 메틸렌 링커에 의해 제한되는 것을 특징으로 한다. PNA는 백본이 당이 아닌 슈도펩티드인 DNA의 유사체이다.

라이브러리의 각각의 구성원은 고유한 뉴클레오티드 서열과 연관될 수 있으며, 즉 각각의 구성원은 고유한 검출가능한, 핵산 동일성 표지를 가질 수 있다. 바람직하게는, 고유한 핵산 동일성 표지가 연결될 수 있다. 연결됨은 연결 과정이 적합한 검정 조건 하에 이들 핵산 동일성 표지의 공동-국소화를 기반으로 하여 무작위 다량체 핵산 생성물을 형성할 가능성을 가짐을 의미할 수 있다. 바람직하게는, 다량체 생성물은 이량체이다. 적합한 검정 조건은 표지를 증폭하는 것을 포함할 수 있으며, 고유한 서열의 구체적 공통 증폭은 연결가능한 앰플리콘을 생성한다. 연결가능한 앰플리콘의 결합 예를 들어 구성요소 특이적 핵산은 연결된 동일성 표지를 형성하며, 이는 동일성 표지의 공동-국소화 정보를 코딩한다. 연결 반응은 증폭 기반이거나 다른 기술을 포함할 수 있다. 증폭 기반 연결은 동일한 결합 능력을 가지나, 상보적인 5' 태그 또는 이량체 링커 서열을 가진 2개 이상의 증폭 프라이머 쌍을 이용할 수 있어 폴리머라제 확장가능한 핵산 이중체를 형성할 수 있다. 태그 또는 이량체 링커 서열은 하나의 프라이머 쌍에 의해 증폭된 서열이 두 번째 프라이머 쌍에 의해 증폭된 서열에 혼성화될 것임을 의미한다. 따라서 동일성 표지는 연결된다.

동일성 표지 즉 라이브러리, 예컨대 단백질 표시 라이브러리 및 항체 라이브러리에서 사용되는 연관된 고유 뉴클레오티드 서열은 그의 생물학적 배경이 상이할 수 있으며, 하나의 프라이머 쌍은 cDNA 기반 동일성 표지와 같은 표적 서열을 증폭하고 제2 프라이머 쌍은 동일성 표지로서 사용되는 결합제 특이적 뉴클레오티드 서열을 증폭한다. 상이한 표지의 연결은 결합제 특이적 정보를 표적 정보 예를 들어 표시된 DNA에 의해 코딩된 단백질에 연결할 수 있다.

본 발명의 방법, 키트 또는 기타 컴퓨터 구현 측면은 일부 실시양태에서 프로세서, 입력 장치 예컨대 키보드 또는 마우스, 메모리 예컨대 하드 드라이브 및 휘발성 또는 비휘발성 메모리, 및 본 발명의 기능을 위한 컴퓨터 코드 (소프트웨어)를 갖는 하나 이상의 통상의 컴퓨팅 장치를 포함 및/또는 사용할 수 있다.

컴퓨팅 장치의 구성요소는 통상적일 수 있긴 하지만, 장치는 각각의 특정한 구현을 위해 맞춤-구성될 수 있다. 컴퓨터 구현 방법 단계 또는 시스템은 임의의 특정한 아키텍처, 예를 들어, 퍼스날/마이크로컴퓨터, 미니컴퓨터, 또는 메인프레임 시스템 상에서 시행할 수 있다. 예시적인 운영 체제는 애플 맥(Apple Mac) OS X 및 iOS, 마이크로소프트 윈도우즈(Microsoft Windows) 및 UNIX/리눅스(Linux); SPARC, POWER 및 이타늄 기반 시스템; 및 z/아키텍처를 포함한다. 본원에 기재된 방법의 단계를 수행하기 위한 컴퓨터 코드는 예컨대 피톤(Python), C/C++, C#, 오브젝티브(Objective)-C, 자바(Java), 베이직/비주얼베이직(Basic/VisualBasic), MATLAB, 시뮬링커(Simulink), 스테이트플로우(StateFlow), 랩 뷰(Lab View) 또는 어셈블러 그러나 이에 제한되지는 않는 임의의 프로그래밍 언어 또는 모델-기반 개발 환경으로 작성할 수 있다. 컴퓨터 코드는 회로 기판, 컨트롤러, 또는 본 발명과 함께 사용되는 기타 컴퓨터 하드웨어 구성요소의 제조업체에 특정한 독점 컴퓨터 언어로 작성된 서브루틴을 포함할 수 있다.

방법에 의해 처리 및/또는 생성된 정보, 즉 삼원 이-구성요소/분석물 복합체의 형성을 반영하는 신호의 디지털 표시는 업계에서 사용되는 모든 종류의 파일 형식을 사용할 수 있다. 임의의 적합한 컴퓨터 판독가능 매체가 이용될 수 있다. 컴퓨터-사용가능 또는 컴퓨터-판독가능 매체는, 예를 들어, 전자, 자기, 광학, 전자기, 적외선, 또는 반도체 시스템, 장비, 장치, 또는 프로그램 매체일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 컴퓨터-판독가능 매체의 보다 구체적인 예 (완벽하지 않은 목록)는 다음을 포함한다: 하나 이상의 전선을 갖는 전기 연결, 휴대용 컴퓨터 디스켓, 하드 디스크, 랜덤 액세스 메모리 (RAM), 읽기-전용 메모리 (ROM), 지울 수 있는 프로그램가능한 읽기-전용 메모리 (EPROM 또는 플래시 메모리), 휴대용 컴팩트 디스크 읽기-전용 메모리 (CD-ROM), 광학 저장 장치, 전송 매체 예컨대 인터넷 또는 인트라넷을 지원하는 것들, 클라우드 저장소 또는 자기 저장 장치일 수 있으나 이에 제한되지는 않는다.

특허 및 비특허 문헌의 모든 인용 문서는 그 전문이 참조로 여기에 포함된다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "포함하는" 또는 "포함하다"은 불특정 요소의 포함에 개방적인 발현 카세트, 리포터 벡터, 및 그의 각각의 구성요소(들)과 관련하여 사용된다.

"~로 이루어진" 용어는 실시양태의 설명에서 인용되지 않은 임의의 요소를 제외한 본원에 기재된 바와 같은 발현 카세트, 리포터 벡터, 및 그의 각각의 구성요소(들)을 지칭한다.

본 발명은 첨부된 도면을 참조하여 보다 상세하게 설명될 것이며, 여기서:
도 1은 구획화된 포화가능한 2-구성요소 프로세스의 시뮬레이션을 기반으로 하는 측정의 확장된 동적 범위의 수학적 배경의 기본 원리와 곡선을 나타낸다. 다음 파라미터가 사용되었다: 구획 수 = 20 0000, 입력 부피 = 20 microL, 유화 전 희석 인자 = 192000, 표적 농도 nM ― 다양함, 구성요소 A 농도, nM = 1, 구성요소 B 농도, nM = 0.3, 구성요소 A의 해리 상수 = 0.1 nM, 구성요소 B의 해리 상수 = 0.1 nM; (1) 분석물-2-구성요소, 삼원 복합체 (분자)의 수, (2) ― 분석물이 없는 이중-양성 구획의 수 (푸아송 배경), (3) - 표적이 있는 이중-양성 구획의 수 (푸아송 배경), 및 (4) (1)과 (3)의 합계.
도 2는 구성요소의 해리 상수의 결정을 나타낸다. 시뮬레이션 결과의 그래픽 표시. 상이한 항원 (Ag) 농도 (표시됨) 및 구성요소 농도 1 및 5 nM에서 각각 수학식 3의 교점. 액적 수: 10000, 희석 인자 10000 및 반응 부피는 20 microL이다. 이들 입력 파라미터를 사용하여, 화학적 균형, 푸아송 과정을 시뮬레이션하고 형성된 삼원 복합체의 수를 결정하였다. 수학식 3을 사용하여 계산된 Kd의 값은 입력으로서 시뮬레이션에 사용된 값과 동일하다 (실시예 3 참조).

실시예

실시예 1.

용액에서의 질량 작용 법칙 및 질량 보존 법칙에 따라, 두 결합 구성요소 (예를 들어 항체)와 분석물/표적 분자 (예를 들어 항원) 사이의 포화가능한 2-구성요소 반응은 수학식의 하기 시스템으로서 표현될 수 있다:

<수학식 1>

여기서,

는 상응하는 해리 상수 (

)를 가진 전체 농도 항체 (구성요소)이고

는 전체 항원 농도이며, 항체와 항원은 유리

또는

결합 상태에 있으며, 여기서

는 항원 (신호 비례)의 2-구성요소 (삼원) 복합체 (예를 들어 결합된 두 항체 모두)이다.

에 대한 수학식 1의 시스템을 풀면 두 근을 결과한다:

<수학식 2>

그들 둘 다 비-전단사 참조 곡선에 따른 실제 양의 근이며, 즉, 감지된 신호 (c12)와 분석물 (a0) 농도 간의 일대일 대응을 허용하지 않는다. 이들 분석물의 전체 농도가 반응에 사용할 수 있는 것이 아니라, 그 중 일부만 사용할 수 있다는 점을 고려하여, 활성/불활성 (결합 능력에 관한) 항원 및 항체의 비가 또한 이들 수학식에 추가할 수 있다. 이들 비는 실시예 2에 기재된 것과 유사한 개념을 사용하여 결정할 수 있다.

실시예 2.

에멀젼 커플링 (EC) 기술을 사용한 Kd의 결정 시뮬레이션

항원 (Ag) 및 두 개의 상이한 Ag-반응성 항체 반응 (Ab1 = 5 nM 및 Ab2 = 1 nM)을 20 마이크로리터 부피로 시뮬레이션하였다 (화학 평형 및 질량 보존 방정식 (수학식 1.)에 따라 Kd1 = 0.2 nM 및 Kd2 = 0.1 nM 세트로). 시뮬레이션된 반응 부피를 희석하고 (1e+5배) 푸아송 분포 기반 시뮬레이션을 사용하여 반응물을 100000 액적 (총 부피: 20 마이크로리터)로 분류하였다. 모든 액적은 그의 캡슐화된 반응물에 따라 분류되고 계산된다. kd1 - kd2 함수 (방정식 3)는 하기 입력: Ag [a0], Ab1 [b10], Ab2 [b20]의 총 농도와 함께 3가지 상이한 Ag 농도 [a0]에서 계산되며 시뮬레이션 결정된 Ag-Ab1-Ab2 [c12]Ab2 [c12] 복합체는 수학식에 대입되며 함수의 교점이 결정된다 (도 2 참조).

<수학식 3>

수학식 3. Ag [a0], Ab1 [b10], Ab2 [b20] 및 Ag-Ab1-Ab2 [c12]는 수학식에서 대입된다. [c12]의 경우에 그의 값은 시뮬레이션에 의해 결정되고, 나머지는 시뮬레이션의 입력 값이다.

도 2는 상이한 Ag 농도에서 수학식 3 (상기 수학식 사용) 곡선의 교점을 도시한다. 계산된 Kds의 값은 입력으로서 시뮬레이션에 사용된 값과 동일하다 (상기 참조). 도 2는 구성요소의 해리 상수의 결정을 나타낸다.

시뮬레이션 결과에 따라, 수학식 3의 교점의 결정에 의해, 두 Kd 모두를 초기 항원량, 및 항체 농도 및 분석물-2-구성요소 (삼원) 복합체의 측정된 농도로부터 계산할 수 있다. 실험에서, 쌍별 교점이 실험 Kd의 근사치로 계산되고 주어진 값이 예를 들어 혼합 가우스(Gauss) 분포 또는 기타와 같은 통계적 접근법에 의해 처리되는 경우에 유용하다.

입력 파라미터의 모든 조합이 해결가능한 시스템을 결과하는 것은 아니나, 항원 농도를 변화시킬 뿐만 아니라 항체 농도도 변화시킴으로써 적당한 조건을 항상 찾을 수 있다는 점에 유의하여야 한다. 또한, 수학식 중 단지 하나 (방정식 3)가 두 개의 양수 근을 결과할 것이고, 이는 개별 경우에 결정되어야 할 필요가 있다.

이들 분석물의 전체 농도가 반응에 사용할 수 있는 것이 아니라, 그들 중 분획만 사용할 수 있다는 점을 고려하여, 활성/불활성 (결합 능력에 관한) 항원 및 항체의 비는 또한 이들 수학식에 추가할 수 있다. 이들 비는 실시예 2에 기재된 개념을 확장하는 더 많은 희석을 사용하여 결정할 수 있다.

실시예 3.

분석물 농도의 예시적인 측정

미지의 농도의 공지된 분석물을 함유하는 샘플이 제공된다. 예시적인 경우로서, 분석물은 단백질이고, 또한 예로서 이는 HER2, EGFR (표피 성장 인자 수용체) 수용체 변이체이다. 2-구성요소 방법을 사용하여, 분석물을 검출하기 위해 알파스크린이 적용된다. 알파스크린은 신호 생성이 생체접합을 위한 관능기를 제공하는 히드로겔 층으로 코팅된 "공여자" 및 "수용자" 비드의 근접에 의존하는 프로토타입 2-구성요소 검출 방법이다. 분자 사이의 생물학적 상호작용이 비드를 근접하게 만들 때, 화학 반응의 캐스케이드가 시작되어 크게 증폭된 신호를 생성한다. 레이저 여기시, "공여자" 비드의 감광제가 주위 산소를 더 여기된 단일항 상태로 전환한다. 단일항 상태 산소 분자는 동일한 비드 내에 함유된 형광단을 추가로 활성화시키는 "수용자" 비드의 화학발광체와 반응하도록 가로질러 확산된다. 형광단은 후소적으로 520-620 nm에서 빛을 방출한다. 비드 상의 관능기는 예를 들어 특이적 항체의 형태로 두 개의 분석물-특이적 결합 구성요소를 나타낼 수 있다. 분석물과 두 개의 분석물-특이적 구성요소를 포함하는 삼원 복합체가 형성될 때만 공여자 및 수용체 비드가 매우 근접하여 검출가능한 형광 신호를 결과한다. 레이저 여기 시 "공여자" 비드의 감광제가 주변 산소를 더 여기된 단일항 상태로 전환한다. 단일항 상태 산소 분자는 동일한 비드 내에 포함된 형광단을 추가로 활성화시키는 "수용체" 비드의 화학 발광체와 반응하도록 확산된다. 형광단은 이후에 520-620 nm에서 빛을 방출한다. 생물학적 상호작용에 관여하는 관능기는 2개의 항체에 의해 제공되며, 예시적 도면인 ErbB2/Her2 항체 쌍 (노부스 바이올로지컬즈(Novus Biologicals) DP0061)으로서, 항체는 각각 공여자 및 수용체 비드의 표면에 접합된다. 공여자와 수용자 비드가 샘플에 접촉 직후, 항체는 HER2 단백질에 결합하여 삼원 복합체를 형성할 것이고, 이는 공여자와 수용자 비드를 매우 근접하게 유지하여 상기에 기재한 원리에 따라 검출가능한 형광 신호를 결과한다.

HER2 단백질 분석물의 미지의 농도를 측정하기 위해 일련의 상이한 공지된 농도의 HER2 단백질의 미리 결정된 신호와 비교할 수 있다. 2-구성요소 검정에 대한 이러한 참조 곡선은 대부분의 경우, 예를 들어 비-전단사 참조 곡선에서 2개의 분석물 농도 값에 상응하는 특정 신호 값을 특징으로 한다. 따라서, 곡선은 분석물 농도와 검출된 신호 간의 일대일 대응을 허용하지 않는다. HER2의 농도를 결정하기 위해 하나 이상의 정의된 인자 희석이 HER2의 미지의 양의 샘플로부터 이루어지고 신호 a가 결정된다. 참조 곡선과 비교하면, 희석의 각각의 신호는 두 가지 상응하는 농도를 갖는다. 추론된 농도와 그의 정의된 희석 인자의 비가 같아야 하므로, HER2 샘플의 농도를 결정할 수 있다. 수학적으로 f(x) = s1이며 여기서 f(x)는 참조 곡선 함수이며, 농도 x 및 s1의 함수는 측정된 신호이다. f(x) = s1은 두 가지 농도 x1 또는 x2로 충족될 수 있다. 그러나 f(x/c) = s2가 결정되면 x가 결정될 수 있으며, 여기서 c는 정의된 희석 인자이고 s2는 측정된 신호이며; 유사하게, 상기에서와 같이, f(x/c) = s2는 x3 또는 x4에 의해 충족될 수 있다. x1/x3 또는 x1/x4 또는 x2/x3 또는 x2/x4는 반드시 c여야 하며 그들 중 단지 하나 또는 두 개가 c와 같을 수 있고 그들 중 두 개가 같으면 이들은 동일한 x에서만 만족할 수 있으므로, 모호성이 해결될 수 있음을 증명할 수 있다. 예를 들어 s1=1000 형광 단위 (FU)인 경우, 이는 가상 참조 곡선에서 100 nM (x1) 및 5 nM (x2) HER2 단백질에 상응하며, 원래 HER2 샘플을 10배 희석하면 2000 (FU) 신호를 를 결과하며, 이는 90 nM (x3) 및 10 nM (x4) HER2 단백질에 대한 가상 참조 곡선에 상응한다. x1/x3=100/90 또는 x1/x4=100/10 또는 x2/x3=5/90 또는 x2/x4=5/10 단지 x1/x4=c로서 결과는 x = x1 = 100 nM이다.

실시예 4.

구획화된 2-구성요소 방법을 사용한 분석물 농도의 예시적인 측정

미지의 농도의 공지된 분석물을 함유하는 샘플이 제공된다. 예시적인 경우로서, 분석물은 단백질이고, 또한 예로서 이는 HER2이고, EGFR 수용체 변이체이고, ErbB2/Her2 항체 쌍 (노부스 바이올로지컬즈 DP0061)이 검출 시약, 즉 분석물-특이적 결합 구성요소로서 사용된다. 구획화된 2-구성요소 방법은 에멀젼 커플링이다 (EP 3224360, Karakus et al.). 에멀젼 커플링은, 예를 들어, ddPCR에 의해 식별되는 에멀젼에서 이중 표지된 (2-구성요소), 개별 삼원 분자 복합체의 검출을 기반으로 하는 디지털 검정 개념이다. ddPCR 검출을 위해, ErbB2/Her2 항체 쌍 (노부스 바이올로지컬즈 DP0061)은 고유한 PCR 증폭가능한 DNA 표지에 의해 표지된다. 샘플은 정의된 배수에 의해 희석되고 표지된 항체는 실시예 3에서와 같이 샘플에 추가된다. 샘플의 유화 전에, 반응물을 고도로 희석하고 (~100,000배) PCR 시약을 첨가하여 단일 복합체 분리 및 유중수 에멀젼 액적당 PCR 증폭을 달성한다. ddPCR은 표준 ddPCR 프로토콜 (바이오래드(Biorad) QX200 ddPCR)을 사용하여 수행된다.

반응 평가는 형광 태그부착된 PCR 생성물 (예를 들어 FAM- 또는 VIC-표지된 실시간 PCR 프로브 사용)을 사용하는 ddPCR 반응에서 표지의 분할을 기반으로 한다. dPCR 표준 평가에 따르면, ddPCR 표준 평가에 따르면 액적의 클러스터는 액적의 형광 신호에 따라 결정되고, 표지된 항체의 수는 각각의 반응에서 결정된다 (주어진 표지에 대한 모든 표지-양성 액적을 계수하고, 모든 반응에 대해 동일한 정의의 액적 클러스터를 사용). 게다가, 이중-색상 (2개의 상이한 항체 표지를 가짐)의 수가 또한 결정된다. 삼원 복합체 없이 (결합된 2개의 항체를 가진 HER 단백질), 표지된 항체의 분할은 푸아송 분포를 따르고, 계산할 수 있는 수의 이중-색상 액적 (순수한 기회를 기반으로 하여 2개의 항체를 가짐)을 결과한다. 반응에 삼원 복합체가 존재하는 경우에, 검출된 이중-색상 액적 (추가 삼원 복합체를 가짐)의 수는 푸아송 분포에 의해 예상되는 것보다 더 크다. 이 측정을 기반으로 하여 복합체의 수를 계산할 수 있다 (예를 들어 추가 참조용으로 EP 3224360 또는 [Karakus et al., 2019]). 이는 삼원 분석물 복합체의 절대 (분자 수) 정량을 결과한다. 수학식 1에 따르면, 공지된 해리 상수 및 적용된 항체의 활성 분율을 사용하여 분석물 (HER2)의 원래 절대 농도가 또한 계산할 수 있다. 그러나 수학식 1은 두 개의 근을 가지며, 그들 중 단지 하나가 농도이다. 주어진 실시예 3에서와 유사한 계산에 따라, 미지의 HER2 샘플의 정확한 농도가 결정될 수 있다 (수치적 예에 대해서는 실시예 3 참조).

실시예 5.

비-구획화 2-구성요소 검정에서 항체의 해리 상수의 예시적인 측정

공지된 농도의 공지된 분석물을 함유하는 샘플이 제공된다. 예시적인 경우로서, 분석물은 단백질이고, 또한 예로서 HER2, EGFR 수용체 변이체, ErbB2/Her2 항체 쌍 (노부스 바이올로지컬즈 DP0061)이 예시적인 시약으로서 사용된다. 2-구성요소 방법은 실시예 3에 기재된 희석액 및 참조 곡선을 사용하는 실시예 3에서와 같은 알파스크린이다. 알파스크린 신호와 상응하는 농도의 삼원 복합체의 관계를 결정하기 위해, 실시예 4에 기재된 방법을 알파스크린 참조 곡선 측정과 병렬적으로 사용할 수 있다. 이는 알파스크린 신호와 관련된 삼원 복합체의 절대 (분자 수) 정량을 결과한다. 항체의 해리 상수 (Kd)를 계산하기 위해, 공지된 양의 분석물과 결정된 양의 삼원 복합체로 하나 초과의 분석물 희석액을 갖는, 수학식 3이 적용되며, 후자는 삼원 복합체 농도와 알파스크린 신호 간의 결정된 대응관계를 사용하여 결정된다. 2개의 Kd는 실시예 2에 따라 계산할 수 있다. 수학적으로 f(kd1,c12,a0) = kd2가 적용되며, 여기서 kd1 및 kd2는 해리 상수이고 c12는 분석물의 삼원 복합체의 측정된 농도이고 a는 분석물의 농도이다. 분석물의 상이한 희석액은 c12의 상이한 농도에 상응하므로, f 함수는 상이한 형태를 갖는다. 그러나 Kd는 물질 상수이므로, 결과적으로 모든 형태의 f 함수는 결정될 수 있는 Kd 값의 특정 쌍에 의해 충족되어야 하며, 실시예 2를 참조한다.

실시예 6.

구획화된 2-구성요소 검정에서 항체의 해리 상수의 예시적인 측정

공지된 농도의 공지된 분석물을 함유하는 샘플이 제공된다. 예시적인 경우로서, 분석물은 단백질이고, 또한 예로서 HER2, EGFR 수용체 변이체, ErbB2/Her2 항체 쌍 (노부스 바이올로지컬즈 DP0061)이 예시적인 시약, 즉 분석물-특이적 결합 구성요소로서 사용된다. 구획화된 2-구성요소 방법은 희석액을 사용하여 실시예 4에서와 같이 검출 장치로서 바이오래드 QX200 ddPCR을 사용하는 에멀젼 커플링 (EP 3224360, (Karakus et al., 2019))이며 삼원 복합체의 수를 실시예 4에서와 같이 계산할 수 있다. 이는 삼원 복합체의 절대 (분자 수) 정량을 결과한다. 항체의 해리 상수를 계산하기 위해, 공지된 양의 분석물, 항체 및 결정된 양의 삼원 복합체로 하나 초과의 분석물 희석액을 갖는, 수학식 3이 적용되며, 두 개의 Kd는 실시예 2에 따라 계산될 수 있다. 수학적으로 f(kd1,c12,a0) = kd2가 적용되며, 여기서 kd1 및 kd2는 해리 상수이고 ac는 분석물의 삼원 복합체의 측정된 농도이고 a는 분석물의 농도이다. 상이한 희석은 'ac'의 상이한 (농도) 값에 상응하므로, f 함수는 다른 형태를 갖는다. 그러나, Kd는 물질 상수이기 때문에, 결과적으로 모든 형태의 f 함수는 결정될 수 있는 Kd 값의 특정 쌍에 의해 충족되어야 하며, 실시예 2를 참조한다.

실시예 7.

차세대 시퀀싱을 사용한 구획화된 2-구성요소 방법을 사용한 분석물 농도의 예시적인 측정

미지의 농도의 공지된 분석물을 함유하는 샘플이 제공된다. 예시적인 경우로서, 분석물은 단백질이고, 또한 예로서 이는 HER2이고, EGFR 수용체 변이체이고, ErbB2/Her2 항체 쌍 (노부스 바이올로지컬즈 DP0061)이 검출 시약, 즉 분석물-특이적 결합 구성요소로서 사용된다. 구획화된 2-구성요소 방법은 에멀젼 커플링이다 (EP 3224360, Karakus et al., 2019)). 에멀젼 커플링은, 예를 들어, 차세대 시퀀싱 (NSG)에 의해 식별되는 에멀젼에서 이중 표지된 (2-구성요소), 개별 삼원 분자 복합체의 검출을 기반으로 하는 디지털 검정 개념이다. NGS 검출을 위해 ErbB2/Her2 항체 쌍 (노부스 바이올로지컬즈 DP0061)은 고유한 PCR 증폭가능한 DNA 표지 (항체 특이적 표지)에 의해 표지화되며, 이는 또한 개별 표지 분자 고유한 분자 바코드 (UMI)를 갖는다 (Parekh et al., 2017). 실시예 3에서와 같이, 정의된 분석물 희석이 이루어지고 표지된 항체가 샘플에 추가된다. 항체 결합 후 및 샘플의 유화 전에, 반응은 고도로 희석하여 (~100,000배) 단일-복합체 분리를 달성하고, ddPCR에서와 같이 유중수 에멀젼 액적당 PCR 증폭은 ddPCR 프로토콜 (바이오래드 QX200 ddPCR)을 사용하여 수행된다.

반응 평가는 에멀젼 커플링 개념 (EP 3224360)에 따라 생성된 항체 특이적 이량체화된 UMI 표지의 NGS 판독을 기반으로 한다. 표지된 항체의 수는 주어진 항체에 대한 모든 고유한 UMI 표지를 계산함으로써 각각의 반응에서 결정되고 (주어진 항체 특이적 표지 컨텍스트로 제한되는 계수), 동일한 항체의 가능한 다중 표지는 그의 우선적으로 이량체화된 서열을 사용하여 제거하였다 (항체당 다중 표지는 항상 이들이 동일한 액적에서 공동-국소화됨에 따라, 동일한 항체 특이적 표지의 맥락에서 이중 UMI 표지 이량체를 갖는다). 삼원 복합체는 항체 다중 표지 (항체당 다중 표지의 효과를 제거하기 위해 상기에 제시된 개념에 따름)에 따라 교정된 그의 이량체화된 이중 UMI 표지된 PCR 생성물 (이종이량체라고 칭해지는 두 개의 상이한 항체 특이적 표지)을 기반으로 계산된다. 샘플의 추가 평가는 실시예 4에 따라 수행되며, 간단히 삼원 복합체 없이, 표지된 항체의 분할은 푸아송 분포를 따르며, 액적에서 (이종이량체의 검출을 기반으로 하여) 계산 가능한 수의 삼원 복합체를 결과한다 (우연히 단지 2개의 항체를 가짐). 반응에 삼원 복합체가 존재하는 경우에, 검출된 이종이량체의 수는 순수한 푸아송 분포에 의해 예상되는 것보다 많다. 이 측정을 기반으로 하여, 복합체의 수를 계산할 수 있다 (EP 3224360). 이는 삼원 분석물 복합체의 절대 (분자 수) 정량을 결과한다. 수학식 1 내지 2에 따르면, 공지된 해리 상수 및 적용된 항체의 활성 분율 (후자는 임의적임)을 사용하여 분석물 (HER2)의 원래 절대 농도가 또한 계산할 수 있다. 그러나 수학식 1 내지 2는 두 개의 근을 가지며, 그들 중 단지 하나는 항상 실수이다. 실시예 3에 기재된 바와 같이, 희석액을 사용하여 미지의 HER2 샘플의 정확한 농도가 결정될 수 있다 (수치적 예에 대해서는 실시예 3 참조). 샘플의 희석은 샘플 특이적 DNA 바코드 (예를 들어 바코드 프라이머)를 사용하여 동일한 시퀀싱 반응에서 측정할 수 있다.

실시예 8.

차세대 시퀀싱을 사용한 구획화된 2-구성요소 검정에서 항체의 해리 상수의 예시적인 측정

공지된 농도의 공지된 분석물을 함유하는 샘플이 제공된다. 예시적인 경우로서, 분석물은 단백질이고, 또한 예로서 이는 HER2, EGFR 수용체 변이체, 항체 특이적 UMI 표지로 표지된 ErbB2/Her2 항체 쌍 (노부스 바이올로지컬즈 DP0061)이다. 구획화된 2-구성요소 방법은 실시예 7에서와 같이 검출 방법으로 NGS를 사용하고 희석액 및 수학식 1-2를 사용하는 에멀젼 커플링 (EP 3224360, )이었다. 삼원 복합체의 수를 계산할 수 있다 (EP 3224360). 이는 삼원 분석물 복합체의 절대 (분자 수) 정량을 결과한다. 항체의 해리 상수 (Kd)를 계산하기 위해, 공지된 양의 분석물과 결정된 양의 삼원 복합체로 하나 초과의 분석물 희석액 (이들은 부분적으로 상기와 동일한 희석액일 수 있음)을 갖는, 수학식 3이 적용되며, 2개의 Kd는 실시예 2에 따라 계산할 수 있다. 수학적으로 f(kd1,c12,a0) = kd2가 적용되며, 여기서 kd1 및 kd2는 해리 상수이고 c12는 분석물의 삼원 복합체의 측정된 농도이고 a는 분석물의 농도이다. 분석물의 상이한 희석액은 c12의 상이한 (농도)에 상응하므로, f 함수는 상이한 형태를 갖지나, Kd는 물질 상수이므로, 결과적으로 모든 형태의 f 함수는 결정될 수 있는 Kd 값의 특정 쌍에 의해 충족되어야 하며, 실시예 2를 참조한다. 샘플의 희석은 샘플 특이적 DNA 바코드 (예를 들어 바코딩된 프라이머)를 사용하여 동일한 시퀀싱 반응에서 측정할 수 있다.

이들 분석물의 전체 농도가 반응에 사용할 수 있는 것이 아니라, 그들 중 분획만 사용할 수 있다는 점을 고려하여, 활성/불활성 (결합 능력에 관한) 항원 및 항체의 비는 또한 이들 수학식에 추가할 수 있다. 이들 비는 실시예 8에 기재된 개념을 확장하는 더 많은 희석을 사용하여 결정할 수 있다.

참고문헌

Claims

a. 2개의 비-고정 분석물-특이적 결합 구성요소를 미지의 농도의 분석물과 접촉시켜 용액 중에 형성된 2-구성요소/분석물 복합체의 농도에 의존하는 신호를 생성하는 것을 포함하는, 상기 용액 중 2-구성요소 검출 방법을 수행하기 위한 공지된 농도의 상기 2개의 비-고정 분석물-특이적 결합 구성요소를 제공하는 단계
b. 분석물의 농도에 대한 상기 신호의 의존성을 반영하는 수학적 함수인 상기 2-구성요소 검출 방법에 대한 비-전단사(non-bijective) 분석물 농도 참조 곡선을 제공하는 단계
c. 정의된 희석 인자를 사용하여 미지의 농도의 분석물을 가진 샘플의 하나 이상의 희석액을 제조하는 단계,
d. 2-구성요소 검출 방법을 상기 샘플 및 하나 이상의 희석액에 적용하는 단계
e. 상이한 분석물 농도에서 상기 비-전단사 분석물 농도 참조 곡선에 대한 수학적 핏(fit)을 위한 제한 입력(constraining input)으로서 상기 샘플 및 하나 이상의 희석액에서 검출된 상기 신호를 사용하여 분석물의 농도를 결정하는 단계
를 포함하는, 2-구성요소 검출 방법을 사용하여 상기 미지의 농도의 분석물을 가진 샘플 중 분석물의 농도를 결정하는 방법.
a. 2개의 비-고정 분석물-특이적 결합 구성요소를 분석물과 접촉시켜 용액 중에 형성된 2-구성요소/분석물 복합체의 농도에 의존하는 신호를 생성하는 것을 포함하는, 상기 용액 중 2-구성요소 검출 방법을 수행하기 위한 공지된 농도의 상기 2개의 비-고정 분석물-특이적 결합 구성요소를 제공하는 단계
b. 2-구성요소/분석물 복합체의 농도와 분석물 및 분석물-특이적 결합 구성요소의 농도를 반영하는 상기 신호에 의존하여 2개의 분석물-특이적 결합 구성요소와 분석물의 해리(dissociation) 상수 (각각 kd1 및 kd2) 간의 관계에 대한 수학적 함수인 상기 2-구성요소 검출 방법에 대한 해리 상수 관계를 제공하는 단계
c. 상기 샘플 및/또는 상기 분석물-특이적 결합 구성요소의 하나 이상의 희석액을 제조하는 단계
d. 2-구성요소 검출 방법을 샘플 및 하나 이상의 희석액에 적용하는 단계
e. 상이한 분석물 농도 및/또는 분석물-특이적 결합 구성요소 농도에서 상기 해리 상수 관계에 대한 수학적 핏을 위한 제한 입력으로서 샘플 및 하나 이상의 희석액에서 검출된 상기 신호를 사용하여 상기 두 개의 분석물-특이적 결합 구성요소의 해리 상수 kd1 및 kd2를 결정하는 단계
를 포함하는, 2-구성요소 검출 방법에서 공지된 농도의 샘플 중에 분석물과의 분석물-특이적 결합 구성요소의 해리 상수를 결정하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 비-전단사 분석물 농도 참조 곡선이 공지된 분석물 농도의 참조 샘플을 제공하고, 상기 참조 샘플의 일련의 공지된 희석액을 생성하고, 참조 샘플 및 그의 각각의 공지된 희석액에 대해 상기 2-구성요소 검출 방법을 수행함으로써 실험적으로 수득되고, 및/또는 상기 비-전단사 분석물 농도 참조 곡선이 화학적 균형(chemical balance), 및 질량 보존 방정식을 해결(solving)함으로써 분석적으로 계산되거나, 분석물과의 두 개의 분석물-특이적 결합 구성요소 각각에 대한 해리 상수의 제공을 기반으로 하여 수치적 해법(solution)에 의해 제공되는 방법.
제2항에 있어서, 상기 해리 상수 관계가 화학적 균형, 및 질량 보존 방정식을 해결함으로써 분석적으로 계산되는 방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 분석물이 단백질, 펩티드, 핵산 세그먼트(segment), 탄수화물, 지질, 항체 (모노클로날 또는 폴리클로날), 항원, 올리고뉴클레오티드, 특이적 수용체 단백질, 리간드, 분자, 세포, 미생물뿐만 아니라 그의 단편 생성물 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 및/또는 샘플이 2개 이상의 상이한 유형의 분석물을 포함하는 방법.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 두 개의 분석물-특이적 결합 구성요소가 핵산, 바람직하게는 RNA 및/또는 DNA 올리고뉴클레오티드, 항체, 펩티드, 단백질, 앱타머(aptamer), 분자-각인 중합체(molecularly-imprinted polymer), 세포 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 및/또는 상이한 종류의 분석물-특이적 결합 구성요소의 2개 이상의 쌍이 사용되는 방법.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 2-구성요소 방법이 근접-기반 검정(proximity-based assay)을 사용하여 2-구성요소/분석물 복합체 농도 의존 신호를 생성하는 단계를 포함하며, 여기서 근접-기반 검정은 그의 근접에 의존하여 검출가능한 신호를 생성하는 2개의 분석물-특이적 결합 구성요소를 사용하고, 및/또는 2-구성요소 방법이 공명 에너지 전달 검정, 바람직하게는 푀스테르 공명 에너지 전달(FRET) 검정 또는 생물발광 공명 에너지 전달(BRET) 검정, 단백질 보완 검정(PCA), 알파스크린 또는 DNA 표지된 근접 검정, 바람직하게는 근접 라이게이션 검정(PLA) 또는 근접 확장 검정(PEA)을 사용하는 단계를 포함하는 방법.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 2-구성요소 검출 방법이 구획화된 검정을 사용하여 2-구성요소/분석물 복합체 농도 의존 신호를 생성하는 단계를 포함하며, 여기서 신호는 단일 구획에서 상기 두 개의 분석물-특이적 결합 구성요소의 존재를 반영하며, 여기서 구획화된 검정은 바람직하게는 에멀젼(emulsion) 액적 방법을 사용하며, 여기서 에멀젼 중 각각의 액적은 별도의 구획을 나타내고, 보다 바람직하게는 여기서 구획화된 검정은 에멀젼 커플링(coupling)인 방법.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 다수의 분석물이 병렬적으로 결정되는 방법.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 2-구성요소 검출 방법이 절대 분자 계수 기반 분석 방법을 사용하는 단계를 포함하고, 및/또는 2-구성요소 검출 방법이 액적 디지털 PCR 검정을 사용하는 단계를 포함하는 방법.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 2-구성요소 검출 방법이 고유한 증폭가능한 핵산 표지와 연관된 분석물-특이적 결합 구성요소를 사용하는 단계를 포함하고 구획화된 검정을 사용하며, 핵산 증폭은 형광 태그부착된(fluorescently tagged) 증폭 생성물을 사용하여 각각의 구획에 대해 수행되는 방법.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 2-구성요소 검출 방법이 핵산 분자-식별 - 고유한 분자 식별자 - 바코드를 포함하는 다수의 분석물-특이적 결합 구성요소를 사용하는 단계를 포함하고 구획화된 검정을 사용하며, 연결된 분자-식별 - 고유한 분자 식별자 - 핵산 바코드를 생성하는 각각의 구획에 대해 핵산 증폭이 수행되고, 구획은 공통 풀(pool)에서 재결합되고 병렬 핵산 시퀀싱(sequencing) 기술을 사용하여 2-구성요소/분석물 복합체 농도 의존 신호를 생성하는 방법.
제11항 또는 제12항에 있어서, 병렬 핵산 시퀀싱 기술이 차세대 시퀀싱 기술 (NGS)인 방법.
a. 두 개 이상의 분석물-특이적 결합 구성요소를 상기 분석물을 함유하는 용액과 접촉시켜 상기 용액 중에 형성된 2-구성요소/분석물 복합체의 농도에 의존하는 신호를 생성하는 단계를 포함하는, 2-구성요소 검출 방법을 수행하기 위한 공지된 농도의 두 개 이상의 비-고정 분석물-특이적 결합 구성요소
b. 분석물의 농도에 대한 상기 신호의 의존성을 반영하는 수학적 함수인, 상기 2-구성요소 검출 방법에 대한 비-전단사 분석물 농도 참조 곡선에 대한 참조 데이터로서, 비-전단사 분석물 농도 참조 곡선이 증가 및 감소 단조(monotonic) 세그먼트를 나타내는, 상기 참조 데이터
c. 선택적으로, 상기 샘플의 하나 이상의 희석액을 제조하고 2-구성요소 검출 방법을 샘플 및 하나 이상의 희석액에 적용하기 위한 인스트럭션(instruction)
d. 컴퓨터 상에서 실행될 때 샘플 및 하나 이상의 희석액에서 검출된 신호를 샘플 중 분석물의 농도를 결정하기 위해 비-전단사 분석물 농도 참조 곡선과 비교하는 컴퓨팅적(computational) 단계를 수행하도록 구성된 컴퓨터 프로그램
을 포함하는, 2-구성요소 검출 방법을 사용하여 분석물의 농도를 결정하기 위한 키트.
a. 두 개 이상의 분석물-특이적 결합 구성요소를 분석물을 함유하는 용액과 접촉시켜 상기 용액 중에 형성된 2-구성요소/분석물 복합체의 농도에 의존하는 신호를 생성하는 단계를 포함하는, 2-구성요소 검출 방법을 수행하기 위한 공지된 농도의 두 개 이상의 분석물-특이적 결합 구성요소를 위한 반응 완충제
b. 2-구성요소/분석물 복합체의 농도 및 분석물 및/또는 분석물-특이적 결합 구성요소의 농도를 반영하는 상기 신호에 의존하여 kd1과 Kd2 사이의 관계에 대한 수학적 함수인 상기 2-구성요소 검출 방법에 대한 해리 상수 관계에 대한 참조 데이터
c. 선택적으로, 상기 샘플의 하나 이상의 희석액을 제조하고 2-구성요소 검출 방법을 정의된 희석 인자를 사용하여 상기 샘플 및 하나 이상의 희석액에 적용하기 위한 인스트럭션
d. 컴퓨터 상에서 실행될 때 상이한 분석물 및/또는 분석물-특이적 결합 구성요소 농도에서 상기 해리 상수 관계에 대한 수학적 핏에 대한 제한 입력으로서 샘플 및 하나 이상의 희석액에서 검출된 상기 신호를 사용하여 상기 두 개의 분석물-특이적 결합 구성요소의 해리 상수 kd1 및 kd2를 결정하는 컴퓨팅적 단계를 수행하도록 구성된 컴퓨터 프로그램
을 포함하는, 2-구성요소 검출 방법에서 해리 상수를 결정하기 위한 키트.