CN114041055A - 用于以双组分体系测量分析物的方法和试剂盒及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于使用双组分检测方法测量分析物参数的方法和试剂盒及其用途。要求保护的方法包括用测量的扩展可测量浓度范围来测量分析物的稀释液。在另一方面，本发明涉及使用分析物的稀释液的测量来确定双组分体系的组分的解离常数。所述方法包括用测量的扩展可测量浓度范围来测量分析物的稀释液，确定组分的解离常数以及还以高度并行方式更好的定量双组分检测方法。

Description

用于以双组分体系测量分析物的方法和试剂盒及其用途
本发明涉及使用双组分检测方法测量分析物参数的方法和试剂盒及其用途。要求保护的方法包括用测量的扩展可测量浓度范围来测量分析物的稀释液。测量基于测量的预定非双射标准曲线，从而为每个测量提供读取双组分检测方法的非双射标准曲线的方法。从而在更宽的测量范围内正确地确定用于计算分析物浓度的数学关系。在另一方面，本发明涉及测量方法的所述非双射预定标准曲线在区室化双组分检测方法中的应用。还在另一个方面，本发明涉及使用独特的分子鉴定组分的测量方法的所述非双射预定标准曲线在区室化双组分检测方法中的应用。还在另一方面，本发明涉及确定双组分方法的分析物特异性结合组分的解离常数。要求保护的方法涉及测量的扩展可测量浓度范围，确定组分的解离常数以及还以并行方式更好的定量双组分检测方法。
背景技术
技术领域
本发明涉及使用双组分检测方法测量分析物参数的方法和试剂盒及其用途。还公开了方法和试剂盒的应用。
相关技术的讨论
特别地，本方法和试剂盒非常适合使用双组分检测方法确定分析物浓度并且涉及使用双组分检测方法的更高量级的测量及其用途。
饱和效应或“钩状效应”是检测体系中常见的现象，通常涉及用于捕获特异性结合配偶体或分析物的试剂组分的饱和。然而，在单组分或双组分检测方法的情况下，数学背景是不同的。
通常在均相分析中利用双组分检测体系，其中应用两种组分来产生检测信号。许多这些分析应用邻位概念，并且需要将分析物和组分邻位以产生信号。邻位分析技术诸如FRET(荧光共振能量转移)、BRET(生物发光共振能量转移)(Pfleger,Seeber,&Eidne,2006)、青色荧光蛋白(CFP)–黄色荧光蛋白(YFP)对、PCA(蛋白质互补分析)(Morell,Ventura,&Avilés,2009)、Alphascreen(Taouji,Dahan,Bosse,&Chevet,2009)和DNA标记的邻位方法(PLA–邻位连接分析(proximity ligation assay))、PEA–邻位延伸分析)(
Figure BDA0003429119780000021
et al.,2006)和称为乳液耦合的基于非邻位分析是双分子(双组分)检测体系和方法的代表性实例。
在单组分检测体系中，只需要称为示踪剂的一种分析组分以产生信号。涉及放射性或荧光示踪剂的过滤结合分析是单组分检测体系的良好实例。使用单组分检测体系获得的标准曲线示出了在饱和示踪剂浓度下获得的稳定期(通常也称为“钩”)结束的典型的乙状(sigmoid)形状。这些曲线也称为饱和曲线。
双分子检测体系产生的标准曲线是非典型的。这些曲线是非双射的，并且其特征在于初始浓度依赖性信号增加之后获得的稳定期后信号减小(“钩状效应”)。其中信号开始下降的靶分子浓度范围称为钩状点(hook point)。在钩状点下方，靶分子使分析组分逐渐饱和，并测量到信号增加。在钩状点处，两种组分都被靶分子饱和，并检测到最大信号。在钩状点上方，过量的靶分子使组分过饱和，从而抑制它们的缔合并引起逐渐的信号减小。
在现有技术中，在进行分析物浓度的测量之前，有必要确定两段式非双射标准曲线的钩状点，以确保所有测量都在两段式非双射标准曲线的逐渐饱和段的范围内进行。通常将过饱和认为是测量的失败。
这种要求的失败可能导致不可靠的测量，因为确定的值不唯一地对应于非双射标准曲线上的分析物浓度。
为了避免这样的错误，通常将测量的动态范围限制在非双射标准曲线的逐渐饱和段的动态范围内。
在现有技术中，已知一些途径来解决钩状效应，尤其是在夹心免疫分析中。
Wu et al.2018讨论了夹心免疫分析中由于捕获和检测抗体过量而导致钩状效应的发生，并建议样品的稀释液以避免对结果的误解。
JP H06 109740 A涉及使用抗体-抗原反应对样品中的靶组分进行定量分析的浊度法免疫分析(TIA)。JP H06 109740 A讨论了在已知方法中出现过量抗原的前带，在这样的情况下，在样品稀释液中重复测试。作为改进，JP H06 109740 A建议对于具有不同浓度的样品获得两条或更多条校准曲线，并基于与虚拟曲线的偏差来决定哪条校准曲线是适用的。然而，JP H06 109740 A的公开在概念上限于防止前带效应(prozone effect)以避免假阴性测量，而不允许来自定义的数学关系的分析的更宽的动态范围。
EP 0 576 879 A2涉及用于确定医学样品中组分浓度的方法，并讨论了在抗原过量时免疫学检测方案中的钩状效应以及由此产生的非单调、非双射校准曲线，其称为“Heidelberger-Kurve”。EP 0 576 879 A2公开了现有技术中已知使用两种不同的样品稀释液来克服非单调校准曲线的模糊度。作为进一步的改进，EP 0 576 879 A2建议使用学习算法和多变量统计以将测量的输入值与校准曲线的正确状态相关联。然而，EP 0 576 879A2涉及沉淀分析中的信号分析，并且因此不能直接扩展到双组分分析，特别是因为沉淀是具有未限定化学计量的可变/多组分反应。此外，使用学习算法，结果可能因不同的实验条件而变化，使得对于每个实验条件可能需要不同的校准曲线。
CN 106 226 516 B涉及包括双曲线校准曲线的检测方法，并且还讨论了应对钩状效应的策略。CN 106 226 516 B建议将分析物的不同浓度的标准品与等量反应物进行单独反应，使得在校准前和校准后曲线的拐点处集合校准曲线。
Binder et al 2008公开了用于基因芯片微阵列的校准算法，该校准算法可以考虑钩状效应并且包括共处理的对数差异以及完美匹配和错配探针强度的总和。
鉴于现有技术的教导，因此对于提供适用于使用双组分检测分析来确定分析物浓度的方法和试剂盒存在改进的空间，其可以是可靠、有效且无需额外努力即可扩大这样的双组分检测分析的动态范围，并提供限定的数学关系，从而无需使用近似方法。
在另一方面，该方法和试剂盒适用于使用双组分检测方法确定分析物结合组分的解离常数，并且涉及使用双组分检测方法以并行方式测量解离常数及其用途。
在化学、生物化学、医学技术和药理学中，解离常数(Kd)是平衡常数的特异性类型，其测量较大复合物可逆解离成较小组分的倾向(Friguet,Chaffotte,Djavadi-Ohaniance,&Goldberg,1985)。解离常数是结合常数的倒数。在双组分测量方法的特殊情况下，解离常数是两种组分与分析物之间的解离常数。由于组分可以是抗体，解离常数的确定具有广泛的兴趣。
在现有技术中，用于确定解离常数的一些途径是已知的。
Rossant ET AL 2015and Xiong Y.et al.(2017)公开了用于使用基于FRET的分析确定亲和复合物的平衡参数(Kd)的途径，但涉及二元复合物。
Rey et al.2017探索了协同性在用于降解布鲁顿酪氨酸激酶(BTK)的靶向嵌合体的有效蛋白水解(PROTAC)的设计中的作用。Rey et al.提出，使BTK上的PROTAC的活性最大化与使BTK:PROTAC:CRBN的三元复合物最大化相关，并且公开了对所述三元复合物的TR-FRET分析，其中PROTAC文库的成员作为分析物，并且BTK和CRBN作为配体，每个配体都用FRET(供体/受体)荧光分子各自标记。Rey et al进一步公开了三元复合物形成(以及产生的FRET信号)随分析物浓度变化的非双射曲线，以及用于导出PROTAC与BTK或CRBN结合的解离常数(KD值)的数值拟合。
EP 2 837 937 A1公开了用于在三元亲和复合物中结合平衡的数学模型。EP 2837 937 A1讨论了三元复合物形成的特征，包括“钟形”结合曲线或“钩状效应”。还公开了平衡解离常数与分析物浓度、结合组分和/或三元复合物浓度之间的关系的方程。
虽然Rey et al.2017和EP 2 837 937 A1解决了三元复合物形成中的平衡参数的估计，并提到了钩状效应的出现，但它们没有提供适当考虑这些效应的解决方案。
EP 1 460 414 A1涉及药物探索过程中用于识别潜在铅抗体的均相时间分辨FRET分析。EP 1 460 414 A1公开了用于使用HFRET分析来分析蛋白-蛋白相互作用的实例。作为直接结合分析的缺点，EP 1 460 414 A1公开了未稀释样品的筛选可能由于“钩状”效应而增加假阴性的数量。建议在多个样品稀释液下筛选以限制效应，但可能会影响时间和成本。
Zorba et al.公开了扩增发光邻位均相分析(AlphaLISA)的原理，该分析从结合竞争分析修改而来，以检测转录激活结构域p53和其配体之间的相互作用。Zorba et al.讨论了在超过浓度时钩状效应的出现，并提出了适当的滴定用于避免。
Douglass et al.2013讨论了用于监测蛋白-蛋白相互作用和识别作为抑制剂的小分子的不同分析，包括AlphaScreen或AlphaLISA。Douglass et al.还讨论了钩状效应，并且建议滴定以选择避免分析的钩状点的蛋白浓度。
然而，EP 1 460 414 A1、Zorba和Douglass et al.2013都没有解决这些分析中解离常数的估计。
根据现有技术的教导，将期望提供适用于使用双组分检测方法测量解离常数的改进方法和试剂盒，特别是以并行方式或高通量形式。
此外，现有技术中用于确定双组分检测方法的解离常数的方法复杂且昂贵，然而特别是以并行方式时它们受到严重限制。最常使用的方法如位移ELISA(displacementELISA)、荧光偏振方法和表面等离激元共振需要独立测量的并行化。因此需要简化且反应水平并行但稳健的方法的存在。
发明内容
根据现有技术，本发明以下的技术问题为提供以下替代和/或改进的方式：用于使用双组分检测确定分析物的浓度，以及在双组分检测方法中确定分析物特异性结合组分的解离常数。
特别地，本发明的目的是提供使用双组分检测方法测量分析物浓度的扩展范围的方法或试剂盒。
本发明的目的还在于提供使用测量的区室化双组分检测方法来测量分析物浓度和分析物双组分复合物的解离常数的方法和试剂盒及其用途。
特别地，本发明的目的是提供在区室化双组分检测方法中以绝对量化、扩展动态范围和并行检测来测量分析物浓度的方法及其用途。
此目的是通过独立权利要求的特征来解决的。本发明的优选实施方式由从属权利要求提供。
本发明因此涉及一种用于使用双组分检测方法确定优选具有未知分析物浓度的样品中分析物浓度的方法，所述方法包括：
a.提供已知浓度的两种分析物特异性结合组分，用于在溶液中进行双组分检测方法，所述双组分检测方法包括使所述两种分析物特异性结合组分与所述分析物接触，以产生信号，所述信号取决于所述溶液中形成的双组分/分析物复合物浓度
b.提供用于所述双组分检测方法的分析物浓度参考曲线，所述分析物浓度参考曲线是反映所述信号对分析物浓度的依赖性的数学函数，其中所述分析物浓度参考曲线不是双射函数，并且优选呈现出单调递增和单调递减段
c.使用限定稀释因子制备所述样品的一种或多种稀释液，
d.将所述双组分检测方法应用于所述样品和所述一种或多种稀释液
e.使用在所述样品中和在所述一种或多种稀释液中检测的所述信号作为在不同分析物浓度下所述非双射分析物浓度参考曲线的数学拟合的约束输入来确定所述分析物在所述样品中的浓度。
在一些实施方式中，本方法涵盖在应用双组分检测方法后的以下步骤：比较在所述样品和所述一种或多种稀释液中检测的信号与分析物浓度参考曲线，以确定分析物浓度参考曲线的哪个点适用于所述样品中的所述分析物浓度，其中，考虑了限定的稀释因子。在一些实施方式中，确定所述样品中的所述分析物浓度包括比较反映样品中双组分/分析物复合物形成的信号与分析物浓度参考曲线的适用点。
优选地，两种分析物特异性结合组分以及分析物为非固定化的并且在溶液中，使得双组分/分析物复合物同样在溶液中形成。在一些实施方式中，本方法包括提供具有未知分析物浓度的样品的步骤。在一些实施方式中，本方法是体外方法，其中，优选地，提供样品的步骤不包括对活体人或动物身体的外科手术或侵入性治疗。
本发明的方法允许使用具有扩展动态范围的非区室化或区室化双组分检测方法来确定已知分析物的未知浓度。
如上文讨论的，可饱和双组分检测方法的参考曲线是具有由所谓的勾状点分隔的两段的非双射函数。双射函数意指一对一的对应是可能的。在数学术语中，双射函数是两个集合的元素之间的函数，其中一个集合的每一个元素恰好与另一集合的一个元素配对，并且反之亦然。对于可饱和双组分检测方法的参考曲线或标准曲线，情况并非如此。反映双组分/分析物复合物浓度的形成的相同信号可能导致至少两种不同的分析物浓度。因此，通过双组分/分析物复合物形成产生的相同可检测信号可能来源于两种不同的实际的分析物浓度。
为了避免歧义，现有技术中存在在进行分析物浓度测量之前估计两段非双射参考曲线的钩状点的途径。随后，通常仅在其中一个段的范围内进行测量，因此显著限制了动态范围。
使用本方法，消除了这样的限制。取而代之，本方法制备具有已知稀释因子的样品的一种或更多种稀释液，并且将双组分检测方法应用于样品以及一种或多种稀释液。应用双组分检测方法优选意指使已知浓度的两种分析物特异性结合组分与样品和一种或多种稀释液接触，以产生取决于所述溶液中形成的双组分/分析物复合物浓度的信号。
如本文详述的，信号可以采取多种形式，并且取决于所使用的双组分检测体系和方法。例如，在邻位分析诸如FRET分析的情况下，信号可以是指来自FRET供体-受体对的荧光信号，指示双组分/分析物复合物的形成。在区室化双组分方法诸如乳液耦合的情况下，该信号也可以是指使用荧光标记的PCR产物的ddPCR或NGS测序产生的信号，该信号指示基于与区室化液滴中预期泊松分布的偏差的双组分/分析物复合物的存在。
由于对于样品以及一种或多种稀释液，获得了反映双组分/分析物复合物形成的信号，因此可以使用信号和稀释因子确定分析物浓度参考曲线的哪个点适用于样品中分析物的浓度。为此，进行来源于样品以及一种或多种稀释液的信号与参考曲线的比较。
如图1中示出，双组分检测方法的参考曲线通常将呈现钟形状曲线，具有对于较低的分析物浓度的单调递增段，以及对于较高的分析物浓度的单调递减段(饱和状态)。因此，增加和减少涉及依赖于分析物浓度的信号交替。
可以设想在样品和稀释液中检测的信号的不同情况。例如，来源于样品的信号可能比来源于稀释液(具有更低的分析物浓度)的信号更高。根据此信息，可以推断出以下的一种：这两种信号都来源于单调递增段；或者来自样品的信号来源于单调递减段并且来自稀释液的信号来源于单调递增段。两种情况之间的差异可以通过拟合样品和稀释液之间的稀释因子来确定(参见实施例3)。
应注意，基于稀释因子，样品的分析物浓度与一种或多种稀释液之间的预期浓度比率是已知的。在图1所示的曲线中，这对应于水平轴线的距离。
有利地，用于分析物浓度的已知差值/比率的两个信号的数学拟合将忠实地得出信号在非双射参考曲线上的最佳定位，使得可以确定适用的浓度。换言之，通过稀释样品以检测具有已知稀释因子的多个信号，为所获取数据的数学拟合提供了额外的约束，这稳健地允许推断来源于样品的信号的适用且相应浓度值。
应注意，可以确定来源于一种或多种稀释液的另外的信号，并且可以使用该信息来增强分析物浓度测量的准确度。
确定双组分方法的非双射数学信号浓度关系，即参考或标准曲线，并使用分析物的限定的稀释液，因此可以约束测量以避免两段非双射标准曲线的钩状点确定的失败。在典型情况下，双组分方法的信号的动态范围因此可以用于非双射参考曲线的两段。因为对于现有技术的方法，重要的是与钩状点保持相当远的距离，这有效地导致远超过一倍的动态范围。
虽然现有技术在某些程度上推荐了稀释概念，以避免与钩状效应相关的模糊度，但本文描述的方法优选允许考虑非双射曲线的计算要求来确定浓度，对于非双射曲线，优选地需要数学拟合的两个独立输入。换言之，超出一般广义稀释概念，本发明优选提供导致显著的额外优点的数学理解。特别地，优选地，可以将整个非双射分析物浓度参考曲线用作用于确定分析物浓度的校准曲线。虽然一般稀释概念被限制于经验得出的稀释液，这使得测量能够避免模糊度，但他们并不将整个非双射曲线视为校准曲线。取而代之，本文所述的方法可以优选地提供基本参数以计算非双射曲线并将整个非双射曲线视为校准曲线，以用于使用双组分检测反应确定分析物浓度。
在一种实施方式中，通过提供已知分析物浓度的参考样品，生成所述参考样品的一系列已知稀释液，以及对所述参考样品及其每个已知稀释液进行所述双组分检测方法，实验性地获得参考曲线。
有利地，给定双组分检测方法的参考曲线必须仅实验性地确定一次。为此，提供了具有在给定浓度下对分析物具有限定亲和力的组分的双组分检测体系，以及已知分析物浓度的参考样品。对于参考样品，生成一系列稀释液，并将双组分检测方法应用于稀释液的每一个中，从而生成反映给定分析物浓度下双组分/分析物复合物的形成的一系列信号。可以插补所述实验上获得的反映双组分/分析物复合物的形成的信号对分析物浓度的依赖性，以形成参考或标准曲线，用作本文所述使用。
然而，也可以通过分析方法或数值模拟提供参考曲线。
在一种实施方式中，分析物浓度参考曲线通过求解化学平衡和质量守恒方程分析地计算，或者通过基于提供两种分析物特异性结合组分中的每一种与分析物的解离常数的数值解来提供。
实施例1中提供了基于分析方法或数值模拟的参考曲线提供的展示。
通常，用于提供参考曲线的分析和数值方法将需要限定与分析物有关的双组分检测方法的一些额外的参数。特别地，为了从数值上提供参考曲线，必须估计两种分析物特异性结合组分的每一种与分析物的解离常数。如以下实例中详述的，基本上利用此信息，可以以有效且稳健的方式提供反映双组分/分析物复合物的形成的信号的参考曲线。
在一种实施方式中，本方法可以用于使用区室化双组分检测方法确定分析物浓度，并且涉及使用区室化双组分检测方法的更高量级的测量及其用途。区室化双组分检测方法是高度优选的，因为它们允许确定分析物的绝对浓度。
典型的区室化方法是利用水-油乳液液滴体系的数字化PCR(ddPCR)(Quan,Sauzade,&Brouzes,2018)方法。液滴形成于水-油乳液中，以形成分离模板DNA分子的分区(区室)。液滴的作用基本上与其中发生PCR反应的平板中的单个试管或孔的功能相同。大规模样品分区是ddPCR技术的一个关键方面。
ddPCR技术是数字化的，因为液滴支持对其包含的模板分子的PCR扩增，并基于单个DNA模板分子生成信号。PCR之后，分析或读取每个液滴，以确定原始样品中PCR阳性液滴的部分。然后使用泊松统计分析这些数据，以确定原始样品中的绝对DNA模板浓度。
在另一种实施方式中，本方法可以用于将绝对定量原理(Quan et al.,2018)应用于双组分测量方法中。分析物的信号是基于对区室化分析物双组分复合物的单个分子的检测和泊松统计，其中分析物双组分复合物由基于分子浓度及其分析特性的化学平衡即解离常数来确定。
在这种实施方式中，数十、数千或数百万(或更高数量)液滴的生成及其在双组分检测方法中的应用意指单一样品测量具有以液滴数量作为双组分方法主要动态范围以绝对定量、高度线性的方式，而不是使用单一的，固有的非线性信号(如在非区室化测量的情况下获得的)。从而将区室化方法固有的绝对定量和统计特征引入到使用双组分方法的分析物浓度的检测中。这些区室化途径可以与本文所述方法相组合，以提供双组分测量方法的非双射两段参考曲线的扩展范围，并有效地使测量的可用动态范围加倍。
在一些实施方式中，这些方法优选用于多分析物测量，因为它们通常具有巨大的浓度差异。在这样的实施方式中，可以使用合适的区室化双组分方法诸如乳液耦合(参见下文的实施例和EP 3224360)测量同一样品中的DNA拷贝数量(低丰度)和RNA/蛋白拷贝数量(高丰度)。
如果应用数字化、线性信号生成方法，关于信号生成原理，区室的数量没有上限。由于通过使用本文所述的方法的测量的扩展范围，因此基于双倍信号的动态范围可适用于测量，同时保持灵敏度和精度，这是区室化双组分方法的特点。
因此，与本文所述方法相组合的区室化双组分方法提供了无与伦比的精度，因为大规模样品分区能够可靠地测量靶分析物中的小倍数差异。这会导致信噪比增加，因为它是样品中的主导模板，不会妨碍稀有靶的检测。由于本方法固有的高度稀释正在去除可能干扰有效信号生成的物质，因此区室化双组分方法提供了进一步的低信号丢失错误率。
根据本发明，上文提及的方法也适用于确定双组分/分析物复合物的解离常数。
在另一方面，本发明涉及用于在双组分检测方法中确定分析物特异性结合组分的解离常数的方法，所述方法包括：
a.提供已知浓度的两种分析物特异性结合组分，用于进行双组分检测方法，所述双组分检测方法包括使所述两种分析物特异性结合组分与包含所述分析物的溶液接触，以产生取决于所述溶液中形成的双组分/分析物复合物浓度的信号
b.提供用于所述双组分检测方法的解离常数关系，所述解离常数关系是所述两种分析物特异性结合组分的所述解离常数之间关系的数学函数，依赖于反映双组分/分析物复合物的浓度的所述信号以及分析物和分析物特异性结合组分的浓度
c.制备所述样品或所述分析物特异性结合组分的一种或多种稀释液，
d.将所述双组分检测方法应用于所述样品和所述一种或多种稀释液
e.使用所述样品和所述一种或多种稀释液中检测的所述信号作为在不同分析物浓度和/或分析物特异性结合组分浓度下所述解离常数关系的数学拟合的约束输入来确定所述两种分析物特异性结合组分的解离常数。
本发明的方法允许通过制备具有已知稀释因子的样品的一种或更多种稀释液来确定双组分检测体系的解离常数，并且将双组分检测方法应用于样品以及一种或多种稀释液。应用用于确定分析物特异性结合组分的解离常数的双组分检测方法优选意指使已知浓度的两种分析物特异性结合组分与已知浓度的样品接触，以产生取决于所述溶液中形成的双组分/分析物复合物的浓度的信号。分析物特异性结合组分或样品的浓度随着提供具有已知稀释因子的稀释液的稀释而变化。可以将在样品和一种或多种稀释液中检测到的信号以及分析物和/或分析物特异性结合组分的浓度作为数学拟合的约束输入。
优选地，两种分析物特异性结合组分以及分析物为非固定化的并且在溶液中，使得双组分/分析物复合物同样在溶液中形成。在一些实施方式中，本方法包括提供具有已知分析物浓度的样品的步骤。在一些实施方式中，本方法是体外方法，其中，优选地，提供样品的步骤不包括对活体人或动物身体的外科手术或侵入性治疗。如上述详述的，信号可以采取多种形式，并且取决于所使用的双组分检测体系。例如，在邻位分析诸如FRET分析的情况下，信号可以是指来自FRET供体-受体对的荧光信号，指示双组分/分析物复合物的形成。在区室化双组分方法诸如乳液耦合的情况下，该信号也可以是指使用ddPCR和/或NGS测序产生的信号，该信号指示基于与区室化液滴中预期泊松分布的偏差的双组分/分析物复合物的存在。
如实施例中示出(参见例如实施例2、5和图2)，使用在样品中和在一种或多种稀释液中检测到的信号作为数学拟合的约束输入，允许稳健地确定两种分析物特异性结合组分与分析物的解离常数。
可以通过分析地求解化学平衡和质量守恒方程来提供解离常数关系(参见实施例2；方程3)。一般而言，可以将其描述为f(Kd1,c12,a0)＝Kd2，其中“Kd1”和“Kd2”是解离常数，“c12”是三元复合物的测量浓度，由反映双组分/分析物复合物的形成的信号确定，并且“a0”是分析物的已知浓度。作为另外的输入，f(Kd1,c12,a0)＝Kd2可以进一步包括分析物以及双组分二者的浓度，这也是已知的。这些术语在分析物特异性结合组分的浓度已知且不变的情况下有效。
如果分析物特异性结合组分的浓度变化，则可以提供确定解离常数关系的另一有利方面，可以将其描述为f(Kd1,c12,b10,b20)＝Kd2，其中“Kd1”和“Kd2”是解离常数，“c12”是三元复合物的测量浓度，由反映双组分/分析物复合物的信息的信号确定，并且“b10”和“b20”是分析物特异性结合组分的已知浓度。作为另外的输入，f(Kd1,c12,b10,b20)＝Kd2可以进一步包括分析物的浓度，这也是已知的。这些术语在分析物浓度已知且不变的情况下有效。
为了确定结合组分的解离常数(“Kd1”和“Kd2”)，可以应用方程3。具有包含已知量的分析物、双组分和确定量的三元抗体/双组分复合物的多于一种的溶液，可以根据实施例2计算两个Kd。
由于包含分析物的样品的不同稀释液对应于“c12”的不同浓度，“f”函数具有不同的形式(参加图2)。然而，由于Kd是材料常数，因此“f”函数的所有形式都必须由Kd的某一对值来满足。
实际上，根据Kd1和Kd2绘制解离常数关系，不同的已知浓度的曲线相交于一点附近，这是待确定的Kd的可适用对(参见实施例2)。换言之，数学求解优选是找到曲线之间的相交点，其反映了随不同输入浓度变化的解离常数(Kd1-Kd2)关系，如通过将双组分检测方法应用于样品以及一种或多种稀释液所提供的。
在一种实施方式中，使用变化的实验条件(例如，通过提供分析物的不同稀释液)确定解离常数的多于一种的关系，可以有助于确定满足这些关系的解离常数的值。
在优选的实施方式中，可以使用统计模型和/或其他数学工具确定解离常数的值，因为测量错误在不同测量中是混杂的。
在另一方面中，本方法适用于以使用双组分检测方法的并行的方式使用双组分检测方法来确定分析物结合组分的解离常数及其用途。
在一种实施方式中，用于确定分析物结合组分的解离常数的方法基于绝对可量化的区室化双组分检测方法。
在本文所述的方法的另一实施方式中，优选使用并行读取技术。在一些实施方式中，优选下一代DNA测序作为双组分读出技术。特别是那些双组分方法适合于基于DNA测序的读出，其生成独特的DNA信号作为检测原理的一部分。这些方法包括但不限于邻位连接、延伸分析和乳液耦合。
在另一实施方式中，如果双组分方法是区室化双组分方法，则优选基于DNA测序读出的双组分测量方法。在区室化的条件下，与非区室化测量相比，独特DNA信号的生成是无偏的。
在DNA信号的区室化生成的另一方面中，意指通过使用独特的分子标识物(UMI)(Parekh,Ziegenhain,Vieth,Enard,&Hellmann,2017)信号读出而实现的无偏DNA信号。
已经开发了各种方法以改进使用下一代测序技术的样品中不同多核苷酸定量的准确度，包括诸如以下的这样的方法：美国专利号5,213,961中描述的竞争性聚合酶链反应(PCR)以及如(Smith et al.,2009)描述的使用独特分子标识物(UMI)的深识别码测序。
独特的分子标识物或分子识别码，在量化样品中双组分测量方法的独特的DNA信号中提供优势。然而，如果UMI涉及超过第一轮检测，则相同的UMI可能会被引入不同的靶，从而导致计算错误。此外，最初的UMI方法是基于一种理想但不现实的情况——即PCR和测序技术两者都是完美的，并且没有引入错误。UMI策略在以下假设上操作：PCR和测序步骤两者都报告潜在靶并且UMI片段是无错误的。这些条件很难在非区室化条件下提供，但在区室化条件下可以无瑕疵地提供。在区室化双组分测量方法中，UMI标记的组分是每个区室的单一或少数分子，这意指有效地将UMI识别码并入独特的DNA信号中。
在另一方面，代表独特的DNA信号的独特分子标识物(UMI)可以并入独特的DNA信号中，并在区室化的双组分方法中进一步扩增。然而，如果不使用独特的分子标识物，则独特的DNA信号的定量是偏倚的。扩增可以特异于某些独特的DNA信号；以平衡它们与其他未进一步扩增的独特的DNA信号的比率。
在另一方面，并入独特的DNA信号的独特分子标识物可以用于检测具有两个或更多个相同结合位点的分析物或具有大于两个的不相同结合位点的分析物。这些布置特别优选检测相互作用的分析物，如蛋白质或其他分子。
在另一方面，使用并行读取技术的双组分测量方法的方法和试剂盒可以以并行的方式测量分析物的浓度和组分的解离常数两者。如今，下一代测序技术可以提供数十亿次独立读取，这与读出的可实现并行性成正比。
在一种另外的实施方式中，所述分析物选自由以下组成的组：蛋白质、肽、核酸片段、碳水化合物、脂质、抗体(单克隆或多克隆)、抗原、寡核苷酸、特异性受体蛋白、配体、分子、细胞、微生物以及片段产物或其组合。
在一种实施方式中，两种分析物特异性结合组分选自由以下组成的组：核酸、优选RNA和/或DNA寡核苷酸、抗体、肽、蛋白质、适配体、分子印迹聚合物、细胞或其组合。
在一种实施方式中，样品包括两种或更多种不同类型的分析物。
在一种实施方式中，使用两对或更多对不同种类的分析物特异性结合组分。
本文所述的方法的特别优势是，在同一分析中，甚至可能具有多于一个种类的分析物(例如DNA；RNA；蛋白质、相互作用蛋白质及其化学修饰)以及类似地多于一个种类的结合组分。
使用如本文所述的并行途径，可以并行地确定不同种类分析物的分析物浓度以及不同种类分析物特异性结合组分的解离常数。
在一种实施方式中，双组分方法包括采用基于邻位的分析来产生双组分/分析物复合物浓度依赖性信号，其中基于邻位的分析使用产生依赖于其邻位的可检测信号的两种分析物特异性结合组分。
在一种实施方式中，双组分方法包括采用共振能量转移分析、优选弗斯特
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共振能量转移(FRET)分析或生物发光共振能量转移(BRET)分析、蛋白质互补分析(PCA)、Alphascreen或DNA标记的邻位分析，优选邻位连接分析(PLA)或邻位延伸分析(PEA)。
在一种实施方式中，双组分检测方法包括采用区室化分析以产生双组分/分析物复合物浓度依赖信号，其中所述信号反映所述两种分析物特异性结合组分在单个区室中的存在。
在一种实施方式中，区室化分析采用乳液液滴法，其中乳液中的每个液滴代表单独的区室。
在一种实施方式中，区室分析是乳液耦合。如下文详细描述的，乳液耦合是指基于检测乳液中双标记(双组分)的单个三元分子复合物的数字化分析概念，其可以例如通过使用荧光标记的PCR产物的数字液滴PCR(ddPCR)或下一代测序(NGS)进行识别。
有利的是，这样的途径允许以稳健且有效的方式绝对量化分析物浓度以及并行确定多个分析物浓度。
在一种实施方式中，双组分检测方法包括采用基于绝对分子计数的分析方法。这样的基于绝对分子计数的分析方法优选是指应用数字化检测方法，诸如数字化PCR或下一代测序。
在一种实施方式中，双组分检测方法包括采用液滴数字化PCR分析。
在一种实施方式中，所述双组分检测方法包括使用与独特的可扩增核酸标签相关的分析物特异性结合组分，并采用区室化分析，其中使用荧光标记的扩增产物对每个区室进行核酸扩增。
在优选的实施方式中，核酸扩增为PCR，并且荧光标记的扩增产物为荧光标记的PCR产物。
分析物特异性结合组分(诸如抗体对)可以优选地由独特的PCR可扩增DNA标签标记，即两种分析物特异性结合组分(例如两种抗体)可以优选地用独特识别结合组分(例如抗体)的单链DNA标记。将标记的结合组分(例如抗体)添加到样品或者一种或多种稀释液中，以允许双组分/抗体复合物形成。
随后，将反应优选地高度稀释，例如通过大于20000、优选大于50000、100000的稀释因子，以在区室下实现单一复合物分离，例如通过乳化成液滴。
对于核酸扩增，使用荧光标记的扩增产物来识别结合组分(例如抗体)特异性的独特的可扩增核酸标签。例如，可以使用荧光标记的PCR产物，例如使用FAM或VIC标记的实时PCR探针，其与独特识别结合组分的单链DNA互补。
核酸扩增在区室例如乳液液滴的每一个中进行，并且可以通过检测单个区室的荧光例如液滴的“颜色”进行信号读出。
优选地，采用ddPCR，并且根据ddPCR的标准估计，可以根据液滴的荧光信号确定液滴的簇。本文中，在每个反应中确定标记的结合组分(例如抗体)的数量(对给定标签的所有标记阳性液滴计数，并且对于所有反应使用相同限定的液滴簇)。此外，还确定了双色(具有两个不同的结合组分标签)的数量。
在没有三元双组分/分析物复合物的形成下，标记的抗体的分区遵循泊松分布，并导致可计算的数量的双色液滴(基于纯偶然性在一个区室中具有两种结合组分)。在反应中存在三元复合物的情况下，检测到的双色液滴(具有额外的三元复合物)的数量大于由单独的泊松分布所预期的数量。基于这样的分析，因此可以计算出三元复合物的数量。有利地，本实施方式允许对所形成的三元分析物复合物进行绝对定量。
在本文所述方法的一种实施方式中，并行确定多个分析物。
在一种实施方式中，所述双组分检测方法包括使用包括核酸识别码的多种分析物特异性结合组分，并且采用区室化分析，其中对产生连接核酸识别码的每个区室进行核酸扩增，所述区室在共用池中重聚，并且使用并行核酸测序技术以产生双组分/分析物复合物浓度依赖信号。
本文使用的优选的并行核酸测序技术是下一代测序技术。
在优选的实施方式中，包括核酸识别码的结合组分是指用独特的PCR可扩增DNA标签标记的抗体，所述DNA标签包括用于所述抗体类型的独特标签以及还有用于单个分子的标签(独特分子标识物-UMI)(还参见Parekh et al.,2017)。因此将标记的抗体添加到样品中，以允许双组分/抗体复合物形成。
可以通过在核酸扩增之前高度稀释样品，例如，具有的稀释因子大于20 000、优选大于50 000、更优选大于100 000来实现对每个区室进行核酸扩增以产生连接的核酸识别码。在优选实施方式中，核酸扩增为PCR。可以添加PCR试剂，以实现单个复合物分离和每个油包水乳液液滴的核酸扩增。为此，液滴数字化PCR标准方案可以是特别适合的。
之后，可以将区室(例如乳液液滴)在共用池中重组，并且可以使用并行核酸测序技术来评价抗体特异性二聚UMI标签。本文中，可以通过对给定抗体的所有独特UMI标签进行计数(计数仅限于给定抗体—例如，在给定标签环境中)来确定在每个反应中标记抗体的数量。由于每个抗体的多标签呈现出具有给定抗体特异性标签环境的双UMI标签二聚体(因为它们在同一液滴中共定位)，因此可以使用其优先二聚化的序列消除相同抗体的可能的多种标记。
可以基于三元双组分/抗体复合物的二聚化双UMI标记PCR产物(两种不同的抗体特异性标签，称为异二聚体)对三元双组分/抗体复合物计数，并根据抗体多标签进行校正。
在没有三元复合物的形成下，标记的抗体的分区遵循泊松分布，并导致三元复合物在液滴中的可计算数量(基于异二聚体的检测)。在反应中存在三元复合物的情况下，检测到的异二聚体的数量大于由纯泊松分布所预期的数量。基于此测量，可以计算复合物的数量。
在区室化双组分方法中，将UMI并入到不同的靶中作为独特DNA信号的共定位的编码步骤是有利的。
在优选实施方式中，本发明涉及试剂盒，优选地用于进行用于使用如本文所述的双组分检测方法确定分析物浓度的方法，所述试剂盒包括：
a.已知浓度的两种分析物特异性结合组分，用于进行双组分检测方法，所述双组分检测方法包括使所述两种分析物特异性结合组分与所述分析物接触，以产生信号，所述信号取决于所述溶液中形成的双组分/分析物复合物浓度
b.用于所述双组分检测方法的分析物浓度参考曲线，所述分析物浓度参考曲线是反映所述信号对分析物浓度的依赖性的数学函数，其中所述分析物浓度参考曲线不是双射函数，并且呈现出单调递增和单调递减段
c.任选地，用于制备所述样品的一种或多种稀释液以及将所述双组分检测方法应用于所述样品和所述一种或多种稀释液的说明书
d.计算机程序，当在计算机上执行时，所述计算机程序被配置为进行以下计算步骤：比较在所述样品中和所述一种或多种稀释液中检测的信号与分析物浓度非双射参考曲线，以确定所述分析物在所述样品中的浓度。
在另外的优选实施方式中，本发明涉及试剂盒，优选用于进行用于在如本文所述的双组分检测方法中确定解离常数的方法，所述试剂盒包括：
a.已知浓度的两种分析物特异性结合组分，用于进行双组分检测方法，所述双组分检测方法包括使所述两种分析物特异性结合组分与分析物接触，以产生信号，所述信号取决于所述溶液中形成的双组分/分析物复合物浓度
b.用于所述双组分检测方法的解离常数关系，所述解离常数关系是分析物特异性结合组分与所述分析物的解离常数(分别为kd1和Kd2)之间关系的数学函数，依赖于反映双组分/分析物复合物的浓度的所述信号以及分析物和分析物特异性结合组分的浓度
c.任选地，用于使用限定稀释系数制备所述样品的一种或多种稀释液以及将所述双组分检测方法应用于所述样品和所述一种或多种稀释液的说明书
d.计算机程序，当在计算机上执行时，所述计算机程序被配置为进行以下计算步骤：使用在所述样品和所述一种或多种稀释液中检测的所述信号作为在给定分析物和/或分析物特异性结合组分浓度下所述解离常数关系的数学拟合的约束输入来确定所述两种分析物特异性结合组分的解离常数kd1和kd2。
已公开用于本文所述方法的技术特征也应用于用于这样的方法的试剂盒。因此，本领域技术人员将认识到，本文所述的方法的优选特征也可以在试剂盒的环境中有利地使用。
在一些实施方式中，本发明的方法还可以涉及计算机程序产品，诸如软件产品。
软件可以被配置为在公共计算装置上执行，并且被配置为实施本文所述方法的一个或多个步骤。
在一种实施方式中，计算机程序可以被配置为进行权利要求1的步骤e)：即比较在所述样品中和在所述一种或多种稀释液中检测的信号与分析物浓度参考曲线，以确定在所述样品中的分析物浓度，或如本文公开的计算步骤的另外的优选实施方式。
在一种实施方式中，计算机程序可以被配置为进行权利要求2的步骤e)即进行以下计算步骤：使用在所述样品和所述一种或多种稀释液中检测的所述信号作为在给定结合组分和分析物浓度下的所述解离常数关系的数学拟合的约束输入来确定所述两种分析物特异性结合组分的解离常数kd1和kd2，或如本文公开的计算步骤的另外的优选实施方式。
在一种实施方式中，可以以参考数据的形式提供双组分检测方法的浓度参考曲线或双组分检测方法的解离常数关系。
本文中，双组分检测方法的浓度参考曲线的参考数据优选涉及以下的任何数据：所述数据允许提供反映了反映形成在所述溶液中的形成双组分/分析物复合物的信号对分析物浓度的依赖性的数学函数。
本文中，用于所述双组分检测方法的解离常数关系的参考数据优选涉及以下的任何数据：所述数据允许提供用于所述分析物特异性结合组分与所述分析物的所述解离常数(分别为kd1和kd2)之间关系的数学函数，依赖于反映双组分/分析物复合物的浓度以及分析物和/或分析物特异性结合组分的浓度的所述信号。
通常，参考数据可以存储在控制单元上的计算机可用或计算机可读介质上。行业中使用的任何格式都可以是适合的。参考数据可以存储在单独的文件中和/或集成在计算机代码或软件(例如源代码中)中，以进行用于确定样品中的分析物浓度或解离常数kd1和kd2的计算步骤，如上文所述的。
因此，包括本发明的计算机程序的计算机程序产品或试剂盒还涵盖并直接涉及如本文提供的方法所描述的特征。在如本文所述的实例和相关参考文献中提供了关于优选的基于计算机的途径的进一步细节。
具体实施方式
在关于实施例描述本发明之前，应理解本文所用术语仅用于描述特定实施方式的目的，并不旨在限制本发明的范围。
如本文所用，术语“样品”或“样品溶液”是指包括分析物的溶液，优选具有未知浓度的分析物。样品的实例包括包含一种或多种生物靶分子的生物流体，诸如血清、血浆、尿液、泪液、细胞、细胞混合物、细胞培养物上清液或细胞裂解物。此外，样品还可以包括使分析物可溶且易于检测和定量所需的任何调节试剂(例如，渗透试剂(permeabilisingreagent))。这样的调节试剂可以在进行本文所述的方法之前或之后的任何时间添加到样品中。
术语“分析物”是指要通过本发明的方法检测、定量或以其他方式分析的物质。典型的分析物可以包括但不限于蛋白质、肽、核酸片段、碳水化合物、脂质、抗体(单克隆或多克隆)、抗原、寡核苷酸、特异性受体蛋白、配体、分子、细胞、微生物、片段、产品及其组合，或者可以开发其附连位点、结合成员或受体(诸如抗体)的任何物质。分析物也可以指来自所述实体的复合物。例如，分析物可以指由多个实体或分子形成的聚集体或复合物，例如蛋白-蛋白复合物，其中实体/分子的相互作用是令人感兴趣的。
“蛋白”，氨基酸序列，意指链长足以产生更高水平的三级和/或四级结构。“肽”优选是指较小的分子量蛋白。
术语“核酸”是指任何核酸分子，包括但不限于单链或双链形式的DNA、RNA及其杂交体或修饰变体和聚合物(“多核苷酸”)。除非特别限制，否则该术语涵盖包含天然核苷酸的已知类似物的核酸，该类似物具有与参考核酸相似的结合特性并且以类似于天然存在的核苷酸的方式代谢。除非另有说明，否则特定的核酸分子/多核苷酸还隐含地涵盖其保守修饰的变体(例如简并密码子置换)和互补序列以及明确指出的序列。特别地，简并密码子置换可以通过生成序列来实现，在序列中，一个或多个选定(或所有)密码子的第三位置被混合碱基和/或脱氧肌苷残基置换(Batzer et al.,Nucleic Acid Res.19:5081(1991)；Ohtsuka et al.,J.Biol.Chem.260:2605-2608(1985)；Rossolini et al.,Mol.Cell.Probes 8:91-98(1994))。核苷酸通过其经由以下标准缩写的碱基表示：腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)和鸟嘌呤(G)。
如本文所用，术语“核酸扩增”是指有限量的核酸经历其中产生更大量的核酸的生化反应的过程。核酸扩增因此涉及核酸序列的额外拷贝的生成并且通常使用聚合酶链反应(PCR)或连接酶链反应(LCR)或本领域公知的其他技术来进行(参见，例如Dieffenbach,C.W.and G.S.Dveksler(1995)PCR Primer,a Laboratory Manual,Cold Spring HarborPress,Plainview,N.Y.)。
如本文所用，术语“双组分检测方法”或“双分子检测方法”是指以下的方法：使用两种分析物特异性结合组分以及当所述两种分析物特异性结合组分与包含分析物的溶液接触时，确定反映双组分/分析物复合物的形成的信号。术语“双组分检测体系”或“双分子检测体系”优选是指进行双组分检测方法所需的组分或试剂。这优选地涵盖两种分析物特异性结合组分(优选地以已知浓度在单个或单独溶液中提供)，以及任选的包含待分析的分析物的样品溶液。
优选地，提供非固定化的，即在溶液中的两种分析物特异性结合组分以及分析物，使得双组分/分析物复合物同样在溶液中形成。如本文所用，术语双组分检测方法因此优选地提出三元复合物的液相形成，并且不同于涉及固相固定化(初级)捕获结合剂以及(次级)检测结合剂的常见三明治免疫分析。
术语“非固定化的”因此优选地是指可以在(液体)溶液中自由扩散的组分，诸如分析物特异性结合组分，使得与分析物的结合动力学在所述液体溶液中同等地自由扩散，在溶液中由质量守恒定律和质量作用定律方程控制，如本文所述的。
术语“分析物特异性结合组分”或“分析物特异性结合配偶体”优选是指结合对的一个成员，其中第二个成员是分析物，并且其中术语“结合对”包括免疫型结合对的任何类别，诸如抗原/抗体或半抗原/抗半抗原体系；以及还有任何类别的非免疫型结合对，诸如生物素/抗生物素蛋白；生物素/链霉亲和素；叶酸/叶酸结合蛋白；互补核酸片段，诸如互补DNA链或互补RNA链；蛋白A或G/免疫球蛋白；以及形成共价键的结合对，诸如巯基反应基团，包括马来酰亚胺和卤代乙酰衍生物，以及胺反应基团诸如异硫氰酸盐、琥珀酰亚胺酯和磺酰卤。
双组分检测方法的结合组分优选可以是指对分析物具有结合电势的任何组分。在优选实施方式中，分析物特异性结合组分可以是核酸、优选RNA和/或DNA寡核苷酸、抗体、肽、蛋白质、适配体、分子印迹聚合物、细胞或其组合。
如本文所用，术语“抗体”涵盖单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和抗体片段，只要它们呈现出期望的生物活性。
“抗体片段”包括全长抗体的部分，通常为抗原结合区或其可变区。抗体片段的实例包括Fab、Fab′、F(ab′)2和Fv片段；双抗体；线性抗体；单链抗体分子；以及由抗体片段形成的多特异性抗体。
如本文所用，术语“单克隆抗体”是指从基本上同质性抗体群体中获得的抗体，即，除了可能以少量存在的天然存在的突变之外，包括群体的单个抗体是相同的。单克隆抗体具有高度特异性，针对单一抗原位点。此外，与通常包括针对不同决定子(表位)的不同抗体的常规(多克隆)抗体制备相比，每个单克隆抗体针对抗原上的单个决定子。修饰语“单克隆”表示抗体的特征为从抗体的基本同质性群体中获得，并且不应解释为需要通过任何特定方法生产抗体。例如，根据本发明使用的单克隆抗体可以通过由Kohler et al.,Nature256:495(1975)首先描述的杂交瘤方法制备，或者可以由重组DNA方法制备(参见，例如，美国专利号4,816,567)。也可以使用例如Clackson et al,Nature 352:624-628(1991)以及Marks et al.,J.Mol.Biol.222:581-597(1991)中描述的技术从噬菌体抗体库中分离“单克隆抗体”。
本文的单克隆抗体特定地包括“嵌合”抗体(免疫球蛋白)，其中重链和/或轻链的部分与源自特定物种或属于特定抗体类别或子类别的抗体中的相应序列相同或同源，尽管一条或多条链的其余部分与源自另一物种或属于另一抗体类别或子类别的抗体中的相应序列以及这样的抗体的片段相同或同源，只要它们呈现出期望的生物活性(美国专利号4,816,567；以及Morrison et al.,Proc.NatL.Acad Sci.USA 81:6851-6855(1984))。
互补决定区(CDR)是由B细胞生成的免疫球蛋白(抗体)中可变链的部分，其中这些分子结合到它们的特异性抗原。作为分子中的最可变部分，CDR对于由免疫球蛋白生成的抗原特异性的多样性至关重要。在免疫球蛋白的可变结构域的氨基酸序列上有非连续排列的三个CDR(CDR1、CDR2和CDR3)。由于免疫球蛋白通常由两个可变结构域(位于两条不同的多肽链上，重链和轻链)构成，因此每个抗原受体有六个CDR，它们可以共同与抗原接触。
另外，整个抗体的片段可以进行结合抗原的功能。结合片段的实例为(i)由VL、VH、CL和CH1结构域组成的Fab片段；(ii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iii)由单个抗体的VL和VH结构域组成的Fv片段；(iv)dAb片段(Ward,E.S.et ai,Nature 341:544-546(1989))，其由VH结构域组成；(v)分离的CDR区；(vi)F(ab')2片段，包括两个连接的Fab片段的二价片段(vii)单链Fv分子(scFv)其中VH结构域和VL结构域通过允许两个结构域缔合形成抗原结合位点的肽接头连接(Bird et ai,Science 242:423-426(1988)；Huston et al,PNAS USA 85:5879-5883(1988))；(viii)双特异性单链Fv二聚体(PCT/US92/09965)以及(ix)“双抗体”，通过基因融合构建的多价或多特异性片段(WO94/1 3804；P.Hollinger etai,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448(1993))。
“抗原结合结构域”是抗体的部分，其包括特异性结合部分或全部抗原并与部分或全部抗原互补的区域。当抗原大时，抗体可能仅与抗原的特定部分结合，该部分称为表位。抗原结合结构域可以由一个或多个抗体可变结构域提供。抗原结合结构域可以包括抗体轻链可变区(VL)和抗体重链可变区(VH)。
在一些实施方式中，结合组分可以基于工程化蛋白支架。蛋白支架来源于稳定的、可溶的、天然的蛋白结构，这些蛋白结构已经被修饰以提供靶分子(即感兴趣的分析物)的结合位点。工程化蛋白支架的实例包括但不限于亲和体(affibodies)，其基于在其两个a-螺旋上提供结合界面的葡萄球菌A蛋白的Z-结构域，(Nygren,P.A.(2008).FEBS J 275(11):2668-76)；抗运载蛋白(anticalin)，来源于脂质运载蛋白(lipocalin)，其在β-桶状折叠的开放端部处掺入小配体的结合位点(Skerra,A.(2008)FEBS J 275(1 1):2677-83)、纳米抗体以及DARPins。工程化蛋白支架通常靶向结合与抗体相同的抗原蛋白。短肽也可以用于结合靶蛋白。Phylomer是从细菌基因组中提取的天然结构多肽。这样的肽代表了各种系列的蛋白结构折叠，并且可以用于抑制/破坏体内的蛋白-蛋白相互作用(Watt,P.M.(2006).Nat Biotechnol 24(2):177-83)]。
在双组分检测方法中，优选使用两种分析物特异性结合组分，该两者都呈现出对分析物的结合潜力。优选地，两种分析物特异性结合组分不相互竞争与分析物的结合，而是被选择并被设计为允许组分同时结合以形成双组分/分析物复合物。如先前所述，分析物可以指由多个实体形成的聚集体或复合物，例如蛋白-蛋白复合物。两种分析物特异性结合组分中的一种可以与分析物复合物的一个实体，例如第一蛋白结合，并且另一种与分析物的第二实体，例如第二蛋白结合。因此，双组分/分析物复合物仅在两种蛋白相互作用的情况下形成，这两种蛋白反过来用结合组分标记。
在一些实施方式中，结合组分可以是适配体。适配体是合成寡核苷酸(DNA或RNA)，其通过形状互补和非共价化学键的组合以高亲和力和特异性识别靶分子(Blank&Blind,Current Opin.Chem.Biol.,2005,9:336-342)。这些人工配体是在体外获得的，并且可以被开发为识别各种各样不同的分子类别，范围从单纯的离子(例如Pb2+,Liu&Lu,2003.J AmChem Soc,125,6642-6643)到核苷酸、小分子、蛋白质、病毒和细胞直至整个生物体(Mengeret al.,2006.Handbook of Experimental Pharmacology,359-373)。通过著名的SELEX方法(Ellington&Szostak,1990.Nature,346,818-822)选择了高结合亲和力适配体，用于检测低分子量分子如茶碱(Jenison et al.,1994.Science,263,1425-1429)、L-精氨酸(Geiger et al.,1996.Nucl.Acids Res.,24,1029-1036)、默诺霉素(Schuerer et al.,2001.Bioorg.Med.Chem.,92,2557-2563)、17b-雌二醇(Kim et al.,2007.Biosens.Bioelectron.,22,2525-2531)，也适用于更大的分子如凝血酶(凝血酶结合适配体：5'-GGTTGGTGTGGTTGG-3')(Baldrich et al.,Anal Chem.2004,76,23,7053-63)、霍乱毒素或HIV-1tat蛋白，除此之外还有(有关综述，参见TTombelli et al.,2007,Biomolec Eng.,24,191-200)。
一些上文提及的适配体已经用于微孔板或生物传感器转换器(QCM,SPR)表面的类似ELISA的分析。还开发了适配体修饰的AuNP比色体系，用于在基于三明治的分析中确定蛋白PDGF(Huang et al.,2005,77,5735-5741)。
如本文所用，术语“分析物/双组分复合物”或“双组分/分析物复合物”是指包含分析物和两种分析物特异性结合组分的三元复合物。当将双组分检测方法应用于包含分析物的溶液时，形成了这样的双组分/分析物复合物。更特定地，双组分检测中双组分/分析物复合物的形成直接反映了给定溶液中分析物的存在(和浓度)。为了使用双组分/分析物复合物的形成来确定分析物的实际浓度，获取了反映三元复合物形成的信号。
如本文所用，表达式“取决于双组分/分析物复合物浓度的信号”或“反映双组分/分析物复合物形成的信号”是指允许推断形成的三元双组分/分析物复合物的数量的任何可量化信息。
当然，信号将取决于应用的双组分检测方法。例如，如果采用弗斯特共振能量转移(FRET)分析，则该信号可以指当FRET供体接近邻位吸收激发光束时，FRET受体将发出的荧光信号。在双组分体系中，FRET受体或FRET供体优选地与两种分析物特异性结合组分偶联。由于来自FRET供体-受体的荧光信号仅当各结合组分接近邻位时，因此该信号直接反映三元双组分/分析物复合物的形成。
类似地，由PerkinElmer开发并广泛商购的Alphascreen(扩增发光邻位均相分析)是另外的原型双组分检测方法，其中信号的生成依靠于包覆有为生物缀合提供官能团的水凝胶层的“供体”和“受体”珠粒的邻位。当分子之间的生物相互作用使珠粒在邻位时，引发一系列的化学反应以产生极大放大的信号。激光激发后，“供体”珠粒中的光敏剂将环境氧转化为更激发的单线态。单线态氧分子扩散穿过，以与进一步激活包含在同一珠粒中的荧光团的“受体”珠粒中的化学发光剂(chemiluminescer)反应。荧光团随后在520–620nm处发光。珠粒上的官能团可以代表两种分析物特异性结合组分，例如以特异性抗体的形式。只有当包含分析物和两种分析物特异性组分的三元复合物形成时，供体和受体珠粒才接近邻位，从而产生可检测的荧光信号。
由于FRET分析或Alphascreen分析依赖于供体和受体的邻位，并因此分析物特异性结合组分这样的分析被称为基于邻位的检测分析。在双组分检测方法的环境中，许多不同的基于邻位的分析在本领域中是已知的，并且可以在本文所述的方法中采用。
如本文所用，术语“基于邻位的双组分检测方法”应指以下任何分析，其中反映双组分/分析物复合物的形成的信号是基于两种分析物特异性结合组分的邻位。从统计学上讲，如果两种分析物特异性结合组分形成同一三元复合物的部分，则它们可能在溶液中接近邻位，以产生可检测的信号。
基于邻位双组分方法的非限制的实例包括采用以下的方法：共振能量转移分析、优选弗斯特共振能量转移(FRET)分析或生物发光共振能量转移(BRET)分析、蛋白质互补分析(PCA)、Alphascreen或DNA标记的邻位分析，优选邻位连接分析(PLA)或邻位延伸分析(PEA)。
这些邻位分析技术在本领域中是公知的。有关FRET或BRET的另外的参考，参见例如(Pfleger,Seeber,&Eidne,2006)，对于蛋白互补分析Morell,Ventura,&Avilés,2009，对于AlphascreenTaouji,Dahan,Bosse,&Chevet,2009以及对于DNA标记的邻位方法诸如PLA(邻位连接分析)或PEA(邻位延伸分析)
Figure BDA0003429119780000291
et al.,2006。
基于邻位的分析特别优选用于本文使用的“非区室化双组分检测方法”，该方法应是指其中在应用双组分检测方法时不进行样品溶液的区室化的双组分检测方法。一些非区室化分析也可以称为均相分析。换言之，非区室化双组分方法优选包括使分析物和双组分在均相反应溶液中接触的步骤，并且可以在均相样品溶液上进行检测步骤以获得反映三元双组分/分析物复合物的形成的信号，而无需分离未结合的组分或分析物。
在特别优选实施方式中，如本文所述的方法使用区室化双组分检测方法。如本文所用，术语“区室化的双组分检测方法”应是指在使分析物特异性结合组分与分析物接触后对样品区室化以量化三元分析物/结合组分的形成的的双组分检测方法。
一般地，区室化双组分检测方法基于将溶液区室化为小区室，使得在没有三元分析物的形成/结合组分方法的情况下，区室中不太可能存在两种结合组分，并且遵循泊松分布。
对于区室化，可以设想不同的分析。例如，乳液液滴法可以用于在乳液(例如油包水)中形成液滴，其中每个液滴代表单独的区室。区室化可能涉及位置或物理区室，或扩散受限的环境。
如本文所用，术语“液滴”优选是指被第二流体包围的第一流体的分离的部分。第一流体优选包括亲水性流体，诸如水、水性介质或缓冲液，并且优选包括向其中添加了双组分检测体系或其他试剂的样品溶液或其一种或多种稀释液。第二流体优选为疏水流体，诸如碳氢化合物、硅油、矿物油、有机溶剂。用于对样品溶液区室化的乳液技术在本领域中是公知的。
在特别优选实施方式中，区室化双组分检测方法是乳液耦合，其是指基于乳液中双标记(双组分)单个三元分子复合物的检测的数字化分析概念，其可以例如通过液滴数字PCR(ddPCR)或下一代测序(NGS)进行识别。
液滴数字PCR(ddPCR)优选是指用于进行基于水-油乳液液滴技术的数字PCR的方法。可以使用在孔的每一个中施加真空的液滴发生器来制备油液滴(参见例如Pinheiro etal.Analytical Chemistry 84(2):1003-11))。可以将典型的样品分为20,000个或更多个液滴，并且模板分子的PCR扩增发生在每个单个液滴中。有利的是，ddPCR技术使用的试剂和工作流与大多数标准的基于TaqMan探针的分析类似。
如本文所用，“下一代测序(NGS)”应涵盖最近开发的用于对核酸测序的技术，该技术通常允许比传统的Sanger途径的更高的通量(参见Schuster,Next-generationsequencing transforms today's biology,Nature Methods 5:16-18(2008)；Metzker,Sequencing technologies the next generation.Nat Rev Genet.2010January；11(1):31-46)。这些平台可以允许对核酸片段的克隆扩大或未扩增的单分子测序。某些平台涉及例如通过以下测序：连接染料修饰的探针(包括循环连接和裂解)、焦磷酸测序和单分子测序。可以通过这样的序列分析平台分析核苷酸序列种类、扩增核酸种类和由此生成的可检测产物。下一代测序可以用于本发明的方法，例如，以量化独特的PCR可扩增DNA标签，以评价双组分/分析物复合物的形成，如下文所述的。
在EP 3224360中描述了作为优选的区室化双组分检测方法的乳液耦合的细节，其通过援引并入本文。
对于乳液耦合分析中的ddPCR检测，通过独特的PCR可扩增DNA标签标记分析物特异性结合组分(诸如抗体对)，并因此将标记的结合组分添加到样品(或其稀释液，参见例如实施例3)中。
在样品乳化之前，将反应高度稀释(～100,000倍)，并添加PCR试剂，以实现每个油包水乳液液滴的单个复合物分离和PCR扩增。可以使用标准的ddPCR方案进行ddPCR。
反应的估计可以基于使用荧光标记的PCR产物(例如，使用FAM或VIC标记的实时PCR探针)对ddPCR反应中标签的分区。根据ddPCR，可以根据液滴的荧光信号确定液滴簇的标准估计。本文中，在每个反应中确定标记的结合组分(例如抗体)的数量(对给定标签的所有标记阳性液滴计数，并且对于所有反应使用相同限定的液滴簇)。
此外，还确定了双色(具有两个不同的结合组分标签)的数量。在没有三元复合物的情况下，标记的抗体的分区遵循泊松分布，并导致可计算的数量的双色液滴(基于纯偶然性在一个区室中具有两种结合组分)。在反应中存在三元复合物的情况下，检测到的双色液滴(具有额外的三元复合物)的数量大于由泊松分布所预期的数量。
在此测量的基础上，可以计算复合物的数量(参见EP 3224360或者Karakus etal.,2019用于另外的参考)。这导致三元分析物复合物的绝对(分子计数)定量。
对于乳液耦合分析中的下一代测序检测，结合组分可以优选地通过独特的PCR可扩增DNA标签标记，该标签包括用于结合组分(例如抗体)的特异性标签，并且优选还包括用于分子的单独标签，即独特分子识别码或独特的分子标识物-UMI(参见Parekh et al.,2017)。可以将标记的结合组分添加到样品或其稀释液中(参见实施例3)。
在结合组分(例如抗体)结合后并且在样品乳化前，可以将反应高度稀释(例如～100,000倍)，并可以添加PCR试剂以实现单个复合物分离。每个油包水乳液液滴都可以进行PCR扩增。可以使用ddPCR方案进行ddPCR。
反应的估计可以基于根据乳液耦合的标准方案生成的结合组分(例如抗体)、特异性二聚UMI标签的NGS读取。可以通过对给定结合组分(例如抗体)的所有独特UMI标签计数来确定每个反应中标记的结合组分(例如抗体)的数量(计数仅限于给定结合组分)。使用同一结合组分的优先二聚序列可以消除同一结合组分例如抗体的可能的多种标记(每种结合组分的多种标签总是导致具有给定抗体特异性标签背景的双UMI标签二聚体，因为它们在同一液滴中共定位)。
三元抗体/双组分复合物基于其二聚双UMI标记的PCR产物(在的两种不同结合组分(例如抗体)特异性标签，称为异二聚体的背景下)计数。结合组分(例如抗体)的多种标记的校正可以根据上文所述的概念使用，其考虑具有给定组分(例如抗体)特异性标签的双UMI标签二聚体。
如在荧光标记的PCR(液滴数字PCR)的情况下，可以对样品进行进一步的估计，简而言之，没有三元复合物时，标记抗体的分区遵循泊松分布，以及在液滴(偶然仅有两种抗体)中得到可计算数量的三元复合物(基于异二聚体的检测)。在反应中存在三元复合物的情况下，检测到的异二聚体的数量大于由纯泊松分布所预期的数量。在此测量的基础上，可以计算复合物的数量(EP 3224360，(Karakus et al.,2019))。这导致三元复合物的绝对(分子计数)定量。
使用样品特异性DNA识别码(例如识别码引物)可以在同一测序反应中测量样品的稀释液，并且由于抗体具有可区分的组分(例如抗体)特异性标签，因此可以并行实施许多测量(使用针对不同抗原的不同抗体对)。
在乳液耦合的实施方式中，结合组分可以作为适合于检测多种分析物的结合组分文库提供。在这些实施方式中，结合组分文库的每个成员可以与可用于识别结合组分的独特的核苷酸序列相关。
“相关的”可以在乳液耦合的环境中意指复合物中结合组分的存在可以通过在本方法中生成的连接序列内的核酸序列的存在来检测。核苷酸序列可以作为标签与结合组分附连，是结合组分本身的部分，例如适配体，或者存在于结合组分内，例如噬菌体内的核酸。例如，文库的每个成员都可以用独特的核苷酸序列标记，该核苷酸序列是与结合组分附连的核苷酸序列。
将核苷酸与结合组分诸如抗体或化合物附连的方法在本领域内是已知的。替代地，如果结合组分文库是噬菌体展示库，则独特的核苷酸序列可以是编码一个或多个CDR区或显示结合结构域的序列。例如，可以通过在已知位置将编码待显示的氨基酸序列的序列插入噬菌体中来生成显示文库。然后可以使用将扩增插入的序列的通用引物，并因此识别结合序列。替代地，如果结合组分可以是适配体并且该适配体本身可以是独特的核苷酸序列。
核苷酸序列可以是寡核苷酸并且可以包括单链或双链的RNA或DNA。用于标记结合剂或靶的核苷酸的长度可以优选为5-150个碱基，例如，长度为10-40或40-80个碱基。可以化学修饰形成核酸的核苷酸，以增加分子的稳定性，以改进其生物利用度或赋予其额外的活性。例如，嘧啶碱基可以在6或8位置处被修饰，以及在5位置的嘌呤碱基可以被CH3或卤素诸如I、Br或Cl修饰。修饰或嘧啶碱基还包括2NH3、0-CH3、N-CH3以及N2-CH3。2'位置的修饰是糖修饰并且通常包括NH2、F或OCH3基团。修饰还可以包括3'和5'修饰诸如封端。
替代地，可以使用修饰的核苷酸，诸如吗啉代核苷酸、锁核酸(LNA)和肽核酸(PNA)。吗啉代寡核苷酸由不同的吗啉代亚基组装，其每一个都包含连接至6元吗啉环的四种遗传碱基(腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤和胸腺嘧啶)之一。该亚基通过非离子磷酸二酰胺亚基键连接以形成吗啉代寡核苷酸。LNA单体的特征在于呋喃糖环构象受连接2'-0位置至4'-C位置的亚甲基接头限制。PNA是DNA的类似物，其中主链是假肽而不是糖。
文库的每个成员可以与独特的核苷酸序列相关，即每个成员可以具有独特的可检测的核酸识别标签。优选地，可以连接独特的核酸识别标签。连接可以意指在合适的分析条件下，连接过程有可能形成基于这些核酸识别标签的共定位的随机多聚体核酸产物。优选地，多聚体产物为二聚体。合适的分析条件可以包括扩增标签，并且独特序列的特异性共有扩增产生可连接的扩增子。可连接扩增子，例如组分特异性核酸的连接，形成连接的识别标签，其编码识别标签的共定位信息。连接反应可以基于扩增的或涉及其他技术。基于扩增的连接可以利用具有相同结合能力的两对或更多对扩增引物对：，但所述引物对具有导致聚合酶可延伸核酸双链体形成的互补5’标志或二聚体接头序列。标志或二聚体接头序列意指由一个引物对扩增的序列将与由第二引物对扩增的序列杂交。识别标签由此被连接。
识别标签，即文库(诸如蛋白展示文库和抗体文库)中使用的相关的独特核苷酸序列，其生物学背景可能不同，并因此扩增和连接过程基于两个不同的引物对，例如一个引物对扩增靶序列诸如基于cDNA的识别标签，并且第二引物对扩增用作识别标签的结合剂特异性核苷酸序列。不同标签的连接使得将结合剂特异性信息与靶信息(例如由展示的cDNA编码的蛋白)连接成为可能。
本发明的方法、试剂盒或其他计算机实施方面可以在一些实施方式中包括和/或采用具有以下的一个或多个传统计算装置：处理器、输入装置诸如键盘或鼠标、存储器诸如硬盘驱动器和易失性或非易失性存储器、以及用于本发明功能的计算机代码(软件)。
计算装置的部件可以是常规的，尽管该装置可以针对每个特定实施定制配置。计算机实施的方法步骤或系统可以在任何特定架构，例如个人/微型计算机、小型计算机或大型计算机系统上运行。示例性操作系统包括Apple Mac OS X和iOS、Microsoft Windows；以及UNIX/Linux；基于SPARC、POWER和Itanium的系统；以及z/架构。进行本文所述的方法的步骤的计算机代码可以用任何编程语言或基于模型的开发环境编写，诸如但不限于Python、C/C++、C#、Objective-C、Java、Basic/VisualBasic、MATLAB、Simulink、StateFlow、LabView或汇编程序。计算机代码可以包括以专有计算机语言编写的子程序，该计算机语言专用于与本发明结合使用的电路板、控制器或其他计算机硬件部件的制造商。
通过本方法处理和/或产生的信息，即反映三元双组分/分析物复合物形成的信号的数字表示，可以采用工业中使用的任何种类的文件格式。可以利用任何合适的计算机可读介质。计算机可用或计算机可读介质可以是例如但不限于电子、磁、光、电磁、红外或半导体系统、设备、装置或传播介质。计算机可读介质的更特别的实例(非详尽列表)将包括以下：具有一根或多根电线的电连接、便携式计算机软盘、硬盘、随机存取存储器(RAM)、只读存储器(ROM)、可擦除可编程只读存储器(EPROM或Flash存储器)、光纤、便携式光盘只读存储器(CD-ROM)、光存储装置、传输介质诸如支持互联网、内部网、云存储或磁存储装置的那些。
专利和非专利文献的所有引用文件均以其全部内容通过援引并入本文。
如本文所用，术语“包括(comprising)”或“包括(comprises)”用于指表达盒、报道载体及其各自的一个或多个部件，并且它们对包括未指定的元素是开放的。
术语“由...组成”是指如本文所述的表达盒、报道载体及其各自的一个或多个部件，其不包括在实施方式的描述中未列举的任何元素。
附图
本发明将通过参考附图更详细地解释，其中：
图1示出了基于区室化可饱和双组分过程的模拟，测量的扩展的动态范围的数学背景的曲线和基本原理。使用了以下参数：区室的数量＝200000，输入体积＝20微升，乳化前稀释因子＝192000，靶的浓度nM—变化的，组分A的浓度，nM＝1，组分B的浓度，nM＝0.3，组分A的解离常数＝0.1nM，组分B的解离常数＝0.1nM；(1)分析物双组分、三元复合物(分子)的数量，(2)—没有分析物的双阳性区室的数量(泊松背景)，(3)—具有靶的双阳性区室的数量(泊松背景)，以及(4)(1)和(3)之和。
图2示出了组分的解离常数的确定。模拟结果的图形表示。方程3在不同抗原(Ag)浓度(指明的)和在组分浓度分别为1和5nM的相交点。液滴数量：10000，稀释因子10000，以及反应体积为20微升。使用这些输入参数，已经确定了化学平衡，模拟泊松过程，以及形成的三元复合物的数量。使用方程3计算出的Kd值与作为输入用于模拟的值相同(参见实施例3)。
实施本发明的最佳方式
实施例
实施例1
根据溶液中的质量作用定律(law-of-mass action)和质量守恒定律，两种结合组分(例如抗体)与分析物/靶分子(例如抗原)之间的可饱和双组分反应可以表示为以下方程体系：
Figure BDA0003429119780000361
b10＝b1+c1+c12，b20＝b2+c12+c2，a0＝a+c1+c12+c2 方程1。
其中，b10、b20是具有相应解离常数(kd1，kd2)的总浓度抗体(组分)并且a0是总抗原浓度，抗体和抗原处于游离a，b1，b2或c1，c2，c 12结合状态，其中c12是抗原的双组分(三元)复合物(例如，结合的两种抗体)(信号成比例)。
求解方程1的体系，对于a0结果，有两个根：
Figure BDA0003429119780000371
Figure BDA0003429119780000372
根据非双射参考曲线，它们两者都是真正的正根，即检测的信号(c12)和分析物(a0)浓度之间不允许一对一对应。考虑到这些分析物的总浓度不适用于反应，而只适用于其中的一小部分，也可以将活性/非活性(关于结合能力)抗原和抗体的比率添加到这些方程中。可以使用类似于实施例2中的所述的概念来确定这些比率。
实施例2
使用乳液耦合(EC)技术确定Kd的模拟
在20微升体积中，模拟了抗原(Ag)和两种不同的Ag反应性抗体反应(Ab1＝5nM和Ab2＝1nM)(根据化学平衡和质量守恒方程(方程1)其中Kd1＝0.2nM且Kd2＝0.1nM设置)。将模拟反应体积稀释(1e+5倍)，并通过使用基于泊松分布的模拟将反应物分类为100000个液滴(总体积：20微升)。将所有液滴根据其封装的反应物进行分类和计数。在三种不同的Ag浓度[a0]下，用以下输入计算kd1-kd2函数(方程3)：Ag的总浓度[a0]、Ab1[b10]、Ab2[b20]，并在方程中替换模拟确定的Ag-Ab1-Ab2[c12]复合物，并确定函数的相交点(参见图2)。
Figure BDA0003429119780000381
Figure BDA0003429119780000382
方程3。在方程中替换Ag[a0]、Ab1[b10]、Ab2[b20]和Ag-Ab1-Ab2[c12]。在[c12]的情况下，其值由模拟确定，其他为模拟的输入值。
图2描绘了在不同Ag浓度下，方程3(使用上述方程)曲线的相交点。计算出的Kd值与作为输入用于模拟的值相同(参见上文)。
根据模拟结果，通过确定方程3的相交点，可以根据抗原的初始量和抗体浓度以及分析物双组分(三元)复合物的测量浓度计算两个Kd。在实验中，如果将成对相交点作为实验Kd的近似值计算，并将给定值作为统计途径例如混合正态分布或其他来进行处理，则这是有益的。
应当注意的是，并不是所有输入参数的组合都导致一个可解的体系，但总能找到足够的条件，不仅通过改变抗原浓度，而且还改变抗体的浓度。此外，只有一个方程中(方程3)将产生两个正根，其在个别情况下需要确定。
考虑到这些分析物的总浓度不适用于反应，而只适用于其中的一小部分，也可以将活性/非活性(关于结合能力)抗原和抗体的比率添加到这些方程中。可以使用扩展实施例2中所述的概念的更多稀释液来确定这些比率。
实施例3
分析物浓度的示例性测量
提供包含已知分析物的未知浓度的样品。作为示例性情况，分析物为蛋白质，也作为实例，其为HER2，一种EGFR(表皮生长因子受体)受体变体。为了使用双组分方法检测分析物，应用Alphascreen。Alphascreen是原型双组分检测方法，其中信号的生成依靠于包覆有为生物缀合提供官能团的水凝胶层的“供体”和“受体”珠粒的邻位。当分子之间的生物相互作用使珠粒在邻位时，引发一系列的化学反应以产生极大放大的信号。激光激发后，“供体”珠粒中的光敏剂将环境氧转化为更激发的单线态。单线态氧分子扩散穿过，以与进一步激活包含在同一珠粒中的荧光团的“受体”珠粒中的化学发光剂(chemiluminescer)反应。荧光团随后在520–620nm处发光。参与生物相互作用的官能团由两个抗体提供，作为示例图ErbB2/Her2抗体对(Novus Biologicals DP0061)，抗体被配置为分别与供体和受体珠粒的表面缀合。在供体和受体珠粒与样品接触后，抗体将与HER2蛋白结合以形成三元复合物，该三元复合物将供体和受体珠粒紧密地邻位，从而根据上文所述原理产生可检测的荧光信号。
为了测量HER2蛋白分析物的未知浓度，可以进行与HER2蛋白的一系列不同已知浓度的预定信号的比较。用于双组分分析的这样的参考曲线的特征在于在大多数情况下具有对应于两种分析物浓度值的某个信号值，例如非双射参考曲线。因此，该曲线不允许分析物浓度和检测信号之间的一对一对应。为了确定HER2的浓度，从未知量的HER2样品中制备一个或多个限定因子的稀释液，并确定信号a。如果与参考曲线相比，稀释液的每个信号都具有两个相应的浓度。由于推导出的浓度比率与其限定的稀释因子必须相等，因此可以确定HER2样品的浓度。数学上f(x)＝s1，其中f(x)是参考曲线函数，它是浓度x的函数，并且s1是测量信号。两种浓度x1或x2可以满足f(x)＝s1。然后，如果确定了f(x/c)＝s2，则可以确定x，其中，c是限定的稀释因子，以及s2是测量信号；类似地，如上文，x3或x4可以满足f(x/c)＝s2。由于x1/x3或x1/x4或x2/x3或x2/x4必定为c，并因此可以证明，它们中只有一个或两个可以等于c，并且如果它们中的两个相等，则它们只能在同一个x下被满足，因此可以解决模糊度。例如，如果s1＝1000荧光单位(FU)，则它在假设参考曲线中对应于100nM(x1)和5nM(x2)HER2蛋白，将原始HER2样品稀释10倍的因子产生2000(FU)信号，其在假设参考曲线中对应于90nM(x3)和10nM(x4)HER2蛋白。x1/x3＝100/90或x1/x4＝100/10或x2/x3＝5/90或x2/x4＝5/10，因为只有x1/x4＝c，则结果是x＝x1＝100nM。
实施例4
使用区室化双组分方法的分析物浓度的示例性测量。
提供包含已知分析物的未知浓度的样品。作为示例性情况，分析物是蛋白质，也作为实例，它是HER2，一种EGFR受体变体，将ErbB2/Her2抗体对(Novus Biologicals DP0061)用作检测试剂，即作为分析物特异性结合组分。区室化双组分方法为乳液耦合(EP3224360,Karakus et al.)。乳液耦合是一个数字分析概念，基于乳液中的双标记(双组分)、单个三元分子复合物的检测，其例如通过ddPCR进行识别。对于ddPCR检测，通过独特的PCR可扩增DNA标签标记ErbB2/Her2抗体对(Novus Biologicals DP0061)。将样品以限定因子稀释，并将标记的抗体添加至样品中，如实施例3。在样品乳化之前，将反应高度稀释(～100,000倍)，并添加PCR试剂，以实现每个油包水乳液液滴的单个复合物分离和PCR扩增。使用标准的ddPCR方案(Biorad QX200 ddPCR)进行ddPCR。
反应的估计基于使用荧光标记的PCR产物(使用FAM或VIC标记的实时PCR探针)对ddPCR反应中标签的分区。根据ddPCR标准估计，根据液滴的荧光信号确定液滴簇，在每个自反应中确定标记抗体的数量(对给定标签的所有标记阳性液滴计数，并使用所有反应的液滴簇的相同限定)。此外，还确定了双色(具有两个不同抗体标签)的数量。在没有三元复合物(HER2蛋白与两种抗体结合)的情况下，标记的抗体的分区遵循泊松分布，并导致可计算的数量的双色液滴(基于纯偶然性具有两种抗体)。在反应中存在三元复合物的情况下，检测到的双色液滴(具有额外的三元复合物)的数量大于由泊松分布所预期的数量。在此测量的基础上，可以计算复合物的数量(参见EP 3224360，Karakus et al.,2019用于另外的参考)。这导致三元分析物复合物的绝对(分子计数)定量。根据方程1，用已知的解离常数和应用的抗体的活性分数，也可以计算分析物(HER2)的原始绝对浓度。然而，方程1具有两个根，它们中仅有一个是浓度。在与实施例3给出类似的计算后，可以确定未知HER2样品的正确浓度(数值实例参见实施例3)。
实施例5
非区室化双组分分析中抗体解离常数的示例性测量
提供包含已知分析物的已知浓度的样品。作为示例性情况，分析物是蛋白质，也作为实例，它是HER2，一种EGFR受体变体，将ErbB2/Her2抗体对(Novus Biologicals DP0061)用作示例性试剂。双组分方法为Alphascreen，如实施例3，使用实施例3中所述的稀释液和参考曲线。为了确定Alphascreen信号与三元复合物的相应浓度的关系，我们可以使用与Alphascreen参考曲线测量并行的实施例4中所述的方法。这导致与Alphascreen信号有关的三元复合物的绝对(分子计数)定量。为了计算抗体的解离常数(Kd)，应用方程3，具有多于一个分析物稀释液，其具有已知量的分析物和确定量的三元复合物(后者是使用三元复合物浓度和Alphascreen信号之间确定的对应关系确定的)。可以根据实施例2计算两个Kd。数学上应用f(kd1,c12,a0)＝kd2，其中，kd1和kd2为解离常数，并且c12为分析物的三元复合物的测量浓度，并且a为分析物浓度。由于分析物的不同稀释液对应于c12的不同浓度，f函数具有不同的形式。然而，由于Kd是材料常数，因此f函数的所有形式都必须由Kd的某一对值来满足，这是可以确定的，参见实施例2。
实施例6
区室化双组分分析中抗体解离常数的示例性测量
提供包含已知分析物的已知浓度的样品。作为示例性情况，分析物是蛋白质，也作为实例，它是HER2，一种EGFR受体变体，将ErbB2/Her2抗体对(Novus Biologicals DP0061)用作示例性检测试剂，即作为分析物特异性结合组分。区室化双组分方法为乳液耦合(EP3224360,(Karakus et al.,2019))，使用Biorad QX200 ddPCR作为如实施例4中的检测装置，使用稀释液并且三元复合物的数量可以如实施例4中计算(EP 3224360,Karakus etal.,2019)。这导致三元复合物的绝对(分子计数)定量。为了计算抗体的解离常数，应用方程3，具有多于一个分析物稀释液，其具有已知量的分析物、抗体和确定量的三元复合物，根据实施例2可以计算两个Kd。数学上应用f(kd1,c12,a0)＝kd2，其中，kd1和kd2为解离常数，并且ac为分析物的三元复合物的测量浓度，并且a为分析物浓度。由于不同稀释液对应于‘ac’的不同(浓度)值，f函数具有不同的形式。然而，由于Kd是材料常数，因此f函数的所有形式都必须由Kd的某一对值来满足，这是可以确定的，参见实施例2。
实施例7
使用利用下一代测序的区室化双组分方法的分析物浓度的示例性测量。
提供包含已知分析物的未知浓度的样品。作为示例性情况，分析物是蛋白质，也作为实例，它是HER2，一种EGFR受体变体，将ErbB2/Her2抗体对(Novus Biologicals DP0061)用作检测试剂，即作为分析物特异性结合组分。区室化双组分方法为乳液耦合(EP3224360,Karakus et al.,2019))。乳液耦合是一个数字分析概念，基于乳液中的双标记(双组分)、单个三元分子复合物的检测，其例如通过下一代测序(NGS)识别。对于NGS检测，通过独特的PCR可扩增DNA标签标记ErbB2/Her2抗体对(Novus Biologicals DP0061)，该标签也还具有单个标签分子独特的分子识别码(UMI)(Parekh et al.,2017)。制备限定的分析物稀释液，并将标记的抗体添加到样品中，如实施例3。在抗体结合后且在样品乳化前，将反应高度稀释(～100,000倍)，以实现单个复合物分离，添加PCR试剂并且使用ddPCR方案(Biorad QX200 ddPCR)进行对每个油包水乳液液滴(如以ddPCR)的PCR扩增。
反应的估计基于根据乳液耦合概念生成的抗体特异性二聚化UMI标签的NGS读取(EP 3224360)。在每个反应中，通过对给定抗体的所有独特UMI标签计数来确定标记的抗体的数量(计数限于给定抗体特定标签背景)，并且使用同一抗体的优先二聚化序列消除了同一抗体可能的多标签(每个抗体的多标签总是具有带有相同抗体特异性标签背景的双UMI标签二聚体，因为它们在同一液滴中共定位)。基于其二聚化双UMI标记PCR产物(两种不同的抗体特异性标记，称为异二聚体)对三元复合物计数，并根据抗体多标签校正(按照上述呈现的概念，以消除每个抗体多标签的影响)。根据实施例4进行样品的进一步估计，简而言之，没有三元复合物时，标记抗体的分区遵循泊松分布，以及在液滴(偶然仅有两种抗体)中得到可计算数量的三元复合物(基于异二聚体的检测)。在反应中存在三元复合物的情况下，检测到的异二聚体的数量大于由纯泊松分布所预期的数量。在此测量的基础上，可以计算复合物的数量(EP 3224360)。这导致三元复合物的绝对(分子计数)定量。根据方程1-2，用已知的解离常数和应用的抗体的活性分数(后者是任选的)，也可以计算分析物(HER2)的原始绝对浓度。然而，方程1-2具有两个根，它们中仅有一个是真实的。如实施例3中所述，使用稀释液可以确定未知HER2样品的正确浓度(数值实例参见实施例3)。使用样品特异性DNA识别码(例如识别码引物)，可以在同一测序反应中测量样品的稀释液。
实施例8
在使用下一代测序的区室化双组分分析中抗体的解离常数的示例性测量
提供包含已知分析物的已知浓度的样品。作为示例性情况，分析物是蛋白质，也作为实例，它是HER2，一种EGFR受体变体，将ErbB2/Her2抗体对(Novus Biologicals DP0061)用抗体特异性UMI标签标记。区室化双组分方法为乳液耦合(EP 3224360,)如实施例7使用NGS作为检测方法，并使用稀释液和方程1-2，可以计算三元复合物的数量(EP 3224360)。这导致三元复合物的绝对(分子计数)定量。为了应用方程3计算抗体的解离常数(Kd)，具有多于一个分析物稀释液(这些可以与上文的稀释液部分相同)，其具有已知量的分析物和确定量的三元复合物，根据实施例2可以计算两个Kd。数学上应用f(kd1,c12,a0)＝kd2，其中，kd1和kd2为解离常数，并且c12为分析物的三元复合物的测量浓度，并且a0为分析物浓度。由于不同稀释液对应于c12的不同(浓度)值，f函数具有不同的形式，然而，由于Kd是材料常数，因此f函数的所有形式都必须由Kd的某一对值来满足，这是可以确定的，参见实施例2。使用样品特异性DNA识别码(例如识别码引物)，可以在同一测序反应中测量样品的稀释液。
考虑到这些分析物的总浓度不适用于反应，而只适用于其中的一小部分，也可以将活性/非活性(关于结合能力)抗原和抗体的比率添加到这些方程中。可以使用扩展实施例8中所述的概念的更多稀释液来确定这些比率。
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Claims (15)

1.一种用于使用双组分检测方法确定具有未知分析物浓度的样品中分析物浓度的方法，包括：
a.提供已知浓度的两种非固定化分析物特异性结合组分，用于在溶液中进行双组分检测方法，所述双组分检测方法包括使所述两种分析物特异性结合组分与所述分析物接触，以产生信号，所述信号取决于所述溶液中形成的双组分/分析物复合物浓度
b.提供用于所述双组分检测方法的非双射分析物浓度参考曲线，所述分析物浓度参考曲线是反映所述信号对所述分析物浓度依赖性的数学函数
c.使用限定稀释因子制备所述样品的一种或多种稀释液，
d.将所述双组分检测方法应用于所述样品和所述一种或多种稀释液
e.使用在所述样品和所述一种或多种稀释液中检测的所述信号作为在不同分析物浓度下所述非双射分析物浓度参考曲线的数学拟合的约束输入来确定所述分析物浓度。
2.一种用于在双组分检测方法中用已知浓度的样品中的分析物来确定分析物特异性结合组分的解离常数的方法，包括：
a.提供已知浓度的两种非固定化分析物特异性结合组分，用于在溶液中进行双组分检测方法，所述双组分检测方法包括使所述两种分析物特异性结合组分与所述分析物接触，以产生信号，所述信号取决于所述溶液中形成的双组分/分析物复合物浓度
b.提供用于所述双组分检测方法的解离常数关系，所述解离常数关系是所述两种分析物特异性结合组分与所述分析物的解离常数(分别为kd1和kd2)之间的关系的数学函数，依赖于反映双组分/分析物复合物的浓度以及分析物和分析物特异性结合组分的浓度的所述信号
c.制备所述样品和/或所述分析物特异性结合组分的一种或多种稀释液，
d.将所述双组分检测方法应用于所述样品和所述一种或多种稀释液
e.使用在所述样品和所述一种或多种稀释液中检测的所述信号作为在不同分析物浓度和/或分析物特异性结合组分浓度下所述解离常数关系的数学拟合的约束输入来确定所述两种分析物特异性结合组分的所述解离常数kd1和kd2。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述非双射分析物浓度参考曲线是通过以下实验性地获得：提供已知分析物浓度的参考样品，生成所述参考样品的一系列已知稀释液，以及对所述参考样品及其各自已知稀释液进行所述双组分检测方法，和/或其中所述非双射分析物浓度参考曲线是通过求解化学平衡和质量守恒方程分析地计算，或通过基于提供所述两种分析物特异性结合组分的每一种与所述分析物的解离常数的数值解来提供。
4.根据权利要求2所述的方法，其中，所述解离常数关系是通过求解化学平衡和质量守恒方程分析地计算的。
5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述分析物选自由以下组成的组：蛋白质、肽、核酸片段、碳水化合物、脂质、抗体(单克隆或多克隆)、抗原、寡核苷酸、特异性受体蛋白、配体、分子、细胞、微生物以及片段产物或其组合和/或其中所述样品包括两种或更多种不同类型的分析物。
6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述两种分析物特异性结合组分选自由以下组成的组：核酸、优选RNA和/或DNA寡核苷酸、抗体、肽、蛋白质、适配体、分子印迹聚合物、细胞或其组合和/或其中使用两对或更多对不同种类的分析物特异性结合组分。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述双组分方法包括采用基于邻位的分析来产生双组分/分析物复合物浓度依赖信号，其中所述基于邻位的分析使用依赖于其邻位产生可检测信号的两种分析物特异性结合组分，和/或其中所述双组分方法包括采用共振能量转移分析，优选弗斯特共振能量转移(FRET)分析或生物发光共振能量转移(BRET)分析、蛋白质互补分析(PCA)、Alphascreen或DNA标记的邻位分析，优选邻位连接分析(PLA)或邻位延伸分析(PEA)。
8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述双组分检测方法包括采用区室化分析以产生双组分/分析物复合物浓度依赖信号，其中所述信号反映所述两种分析物特异性结合组分在单个区室中的存在，其中所述区室化分析优选采用乳液液滴法，其中所述乳液中的每个液滴代表单独的区室，更优选其中所述区室化分析为乳液耦合。
9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，并行确定多种分析物。
10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述双组分检测方法包括采用基于绝对分子计数的分析方法和/或其中所述双组分检测方法包括采用液滴数字化PCR分析。
11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述双组分检测方法包括使用与独特的可扩增核酸标签相关的分析物特异性结合组分，并采用区室化分析，其中使用荧光标记的扩增产物对每个区室进行核酸扩增。
12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述双组分检测方法包括使用包括核酸分子识别—独特的分子标识物—识别码的多种分析物特异性结合组分，并且采用区室化分析，其中对产生连接分子识别—独特的分子标识物—核酸识别码的每个区室进行核酸扩增，所述区室在共用池中重聚，并且使用并行核酸测序技术以产生双组分/分析物复合物浓度依赖信号。
13.根据前述权利要求11或12中任一项所述的方法，其中，所述并行核酸测序技术是下一代测序技术(NGS)。
14.一种用于使用双组分检测方法确定分析物浓度的试剂盒：
a.已知浓度的两种或更多种非固定化分析物特异性结合组分，用于进行双组分检测方法，所述双组分检测方法包括使所述两种分析物特异性结合组分与包含所述分析物的溶液接触，以产生信号，所述信号取决于所述溶液中形成的双组分/分析物复合物浓度
b.关于用于所述双组分检测方法的非双射分析物浓度参考曲线的参考数据，所述非双射分析物浓度参考曲线是反映所述信号对分析物浓度的依赖性的数学函数，其中所述非双射分析物浓度参考曲线呈现出单调递增和单调递减区段
c.任选地，用于制备所述样品的一种或多种稀释液以及将所述双组分检测方法应用于所述样品和所述一种或多种稀释液的说明书
d.计算机程序，当在计算机上执行时，所述计算机程序被配置为进行以下计算步骤：比较在所述样品中和所述一种或多种稀释液中检测的信号与非双射分析物浓度参考曲线，以确定所述分析物在所述样品中的浓度。
15.一种用于在双组分检测方法中确定解离常数的试剂盒，包括：
a.已知浓度的两种或更多种分析物特异性结合组分的反应缓冲液，用于进行双组分检测方法，所述双组分检测方法包括使所述两种分析物特异性结合组分与包含分析物的溶液接触，以产生信号，所述信号取决于所述溶液中形成的双组分/分析物复合物浓度
b.关于用于所述双组分检测方法的解离常数关系的参考数据，所述解离常数关系是kd1和kd2之间的关系的数学函数，依赖于反映双组分/分析物复合物的浓度以及分析物和/或分析物特异性结合组分的浓度的所述信号
c.任选地，用于使用限定稀释因子制备所述样品的一种或多种稀释液以及将所述双组分检测方法应用于所述样品和所述一种或多种稀释液的说明书
d.计算机程序，当在计算机上执行时，所述计算机程序被配置为进行以下计算步骤：使用在所述样品和所述一种或多种稀释液中检测的所述信号作为在不同分析物和/或分析物特异性结合组分浓度下所述解离常数关系的数学拟合的约束输入来确定所述两种分析物特异性结合组分的解离常数kd1和kd2。
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