KR20210053816A - 단백질 복합체를 특성화하기 위한 방법 - Google Patents

단백질 복합체를 특성화하기 위한 방법 Download PDF

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리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드
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Abstract

단백질 약물 생성물과 가용성 리간드 사이에 형성된 단백질 복합체를 특성화하기 위한 방법이 본원에 제공된다. 개시된 방법을 통해 단백질 복합체의 크기, 이질성 및 형태를 결정할 수 있다.

Description

단백질 복합체를 특성화하기 위한 방법
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2018년 8월 30일자로 출원된 미국 특허 가출원 제62/724,700호의 이익을 주장하며, 그 전체는 참조로서 본원에 통합된다.
기술분야
본 발명은 일반적으로 단백질 복합체를 특성화하는 시스템 및 방법에 관한 것이다.
단클론 항체(mAb)는 성장하는 치료 분야로서, 50개가 넘는 단클론 항체가 현재 현재 시판 중이다. 둘 이상의 단클론 항체로 이루어지는 병용 요법은 기존 단독 요법의 효능을 개선할 가능성이 있다. 특정 가용성 물질, 특히 여러 개의 반복된 에피토프를 가진 다량체 물질은 두 개 이상의 항체와 결합하여 큰 복합체를 형성할 수 있다. 큰 이종 항체 복합체를 생산하는 것은 "페이퍼-돌링(paper-dolling)"으로 지칭된다. 큰 항체 복합체는 식균 작용(phagocytosis)에 의해 신속하게 제거되어 항체의 효능을 감소시킬 수 있다. 큰 단백질 복합체는 mAb의 면역원성을 증가시킬 수도 있다.
단백질 복합체는 그 크기는 나노미터에서 가시 입자까지 다양하여 단일 분석 기술에 의한 특성화를 어렵게 한다. 약 1 nm 내지 약 1 μm 크기의 입자를 결정하는데 가장 보편적으로 사용되는 기술 중 하나는 동적 광산란(DLS)이다. DLS는 단백질 크기 분포 프로파일을 결정하는 데 사용되는 분석 기술이며, 고처리량 응용에 적합하다(Zhou, M. 등의 문헌[ChemMedChem, 11:738-756 (2016)] 참조). 용액 내 단백질의 브라운 운동은 빛을 산란시키고, 이로 인한 산란 강도의 변화은 입자 크기에 따라 달라진다. 따라서, 다분산성 측면에서 분포의 평균 반경 및 폭이 결정될 수 있다. 그러나, DLS 결과는 종종 더 큰 입자에 대해 편향되며, 입자 집단을 분해하기 위해서는 적어도 3배 차이가 나야만 한다. 따라서, 단백질 복합체를 분석하는 데에는 DLS만으로는 충분하지 않다.
높은 다분산성의 많은 응집체 샘플의 경우 단백질 복합체의 크기 범위가 넓기 때문에, 보다 상세한 정보를 제공하기 위한 분리-기반 방법이 필요하다. 크기 배제 크로마토그래피(SEC)는 현재 가장 흔히 사용되는 단백질 분리용 크로마토그래피 기술이다(Brusoti 등의 문헌[ Chromatographia, 81:3-23 (2018)]). SEC에서는, 분자의 유체역학적 부피 또는 크기에 따라 분리가 일어난다. 작은 분자는 고정상의 기공 내로 확산될 수 있기 때문에 더 유지되고, 큰 분자는 기공으로부터 배제되기 때문에 먼저 용리된다. 그러나, SEC는 분자량 배제 상한, 정지상에 대한 샘플 흡착, 높은 압력과 유속에서의 전단 분해, 및 조성물에 기초한 분석물을 분리 불능성으로 인해 제한적이다.
큰 단백질과 높은 몰 질량의 중합체를 분리하는 데 있어서는 유동장 유동 분획화(FFF)가 때 SEC의 유망한 대안이다. FFF 샘플 분리에는, 분석물들이 이들의 확산 계수 차이에 의해 리본 모양의 채널을 따라 분리되는, 유동 보조 분리 및 분획화 방법(flow-assisted separation and fractionation method)이 사용된다(Fraunhofer, W. 및 Winter, G.의 문헌[Eur. J. Pharm. Biopharm, 58:369-383 (2004)]). FFF는 (나노미터에서 미크론까지) 넓은 크기 범위의 분석물을 분리할 수 있다. FFF의 개방 채널은 샘플 손실 감소, 저압 및 낮은 전단율을 제공한다. FFF는 단백질 응집체를 검출하기 위한 광산란과 같은 다른 분자 기술과 조합으로 사용되어 왔지만, mAb 및 가용성 리간드 복합체를 포함하는 단백질 복합체의 이질성 및 형태(conformation)를 보다 더 완전하게 특성화할 필요성이 여전히 증가하고 있다.
따라서, 본 발명의 목적은 큰 단백질 복합체를 형성하는 능력을 갖는 단백질 약물 생성물을 식별하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 단백질 약물 생성물 및 가용성 리간드 복합체를 식별하고 특성화하는 방법을 제공하는 것이다.
샘플에서 단백질 복합체를 특성화하기 위한 방법이 제공된다. 일 구현예는, 비대칭 유동장 유동 분획화(A4F)에 의해 샘플을 분획화하고, 다각도 레이저 광 산란(MALLS)을 사용해 샘플에서 단백질 복합체의 몰 질량, 화학량론 및 크기 분포를 결정함으로써 샘플에서 단백질 복합체의 화학량론 및 크기 분포를 평가하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 단백질 복합체는 그의 리간드에 결합된 항체 또는 융합 단백질을 함유한다. 리간드는 전형적으로 가용성 리간드이다. 리간드는 단량체 또는 다량체일 수 있다. 일 구현예에서, 리간드는 동종이량체 또는 이종이량체일 수 있다. 또 다른 구현예에서, 단백질 복합체는 항체:리간드 복합체 또는 융합 단백질:리간드 복합체를 포함하거나 이로 이루어진다.
또 다른 구현예는, 제1 단백질 약물 생성물을 이의 표적 또는 리간드에 첨가하여 단백질:리간드 복합체를 생성하고, 제2 단백질 약물 생성물을 제1 단백질 약물 생성물:리간드 복합체에 첨가하여 다중 단백질:리간드 복합체를 형성함으로써, 리드 단백질 약물 생성물을 선택하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 비대칭 유동장 유동 분획화 - MALLS를 사용해 단백질:리간드 복합체를 분리하고 단백질:리간드 복합체의 몰 질량, 화학량론, 및 크기 분포를 결정하는 단계를 포함한다. 상기 방법은 또한, 더 적은 수의 큰 단백질:리간드 복합체를 형성하는 단백질 약물 생성물을 리드 표적 단백질 약물로서 선택하는 단계를 포함한다. 일반적으로, 단백질 약물 생성물은 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 융합 단백질 또는 재조합 단백질일 수 있다. 일부 구현예에서, 리간드는 가용성 리간드이다. 리간드는 단량체 또는 다량체일 수 있다. 일부 구현예에서, 큰 단백질 복합체는 헤테로머이다.
또 다른 구현예는 전술한 방법을 사용하여 선택된 리드 단백질 약물 생성물을 함유하는 약학적 조성물을 제공한다.
일부 구현예에서, 개시된 방법은 동일한 리간드를 표적화하는 2개의 개별 항체가 큰 이종 복합체를 형성할 것인지 여부를 결정하는 데 사용될 수 있다.
또 다른 구현예는 단백질 약물 생성물 및 이의 리간드를 함유하는 샘플을 제조하여 단백질 약물 생성물:리간드 복합체를 생성함으로써, 단백질 약물 생성물과 가용성 리간드 사이에 형성된 단백질 복합체를 특성화하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 단백질 약물:리간드 복합체를 분획화하는 단계, 및 분획화된 단백질 약물:리간드 복합체를 다각도 레이저 광 산란으로 분석하여 단백질 복합체의 몰 질량 및 이질성(heterogeneity)을 결정하는 단계를 포함한다. 일 구현예에서, 총 단백질을 분획화하는 단계는 비대칭 유동장 유동 분획화에 의해 수행된다. 단백질의 농도는 UV/Vis로 결정한다.
동일한 리간드에 대해 상이한 단백질 약물 생성물에 의해 형성된 단백질 복합체의 형태 차이는 상이한 단백질 약물 생성물에 의해 형성된 단백질 약물 생성물:리간드 복합체의 용리 프로파일/시간을 비교함으로써 결정될 수 있다. 동일한 몰 질량을 갖는 복합체의 용리 프로파일/시간이 다르다는 것은 복합체가 상이한 형태 또는 형상을 가질 수 있음을 나타낸다. 일 구현예에서, 각각의 단백질 약물 생성물 및 동일한 가용성 리간드는 각각의 개별 성분에 대한 몰 질량을 계산하기 위해 개별적으로 분석되며, 여기서 각각의 성분의 몰 질량은 각각의 단백질 복합체 중 상기 성분들의 추정 화학량론을 결정하는 데 사용된다.
또 다른 구현예는 비대칭 유동장 유동 분획화를 사용해 단백질 약물 생성물:리간드 복합체를 분획화함으로써 단백질 약물 생성물과 가용성 리간드 사이에 형성된 단백질 복?d체를 특성화하고; 분획화된 단백질 약물 생성물:리간도 복합체를 다각도 레이저 광 산란에 의해 분석하여 단백질 약물:리간드 복합체의 몰 질량, 화학량론 또는 둘 다를 특성화하고; 각각의 개별 성분의 추정 크기에 대해 각 단백질 복합체의 크기를 비교함으로써 단백질 복합체의 이질성을 결정하여, 각 복합체를 구성하는 성분을 결정하는 방법을 제공한다.
도 1a는 하나의 항체와 하나의 리간드 사이에 형성된 복합체의 도시이다. 도 1b는 하나의 항체와 두 개의 리간드 사이에 형성된 복합체의 도시이다. 도 1c는 4개의 항체와 5개의 리간드 사이에 형성된 복합체의 도시으로, "페이퍼 돌링(paper delling)"을 나타낸다.
도 2a 내지 도 2b는 항체 1(검정색), 2개의 리간드, 및 항체 2(회색) 사이에 비선형의 형태로 형성된 복합체의 도시이다. 도 2a 내지 도 2d는 항체 1(검정색), 2개의 리간드, 및 항체 2(회색) 사이에 선형의 형태로 형성된 복합체의 도시이다.
도 3a는 Ab1, 단백질 X, 및 5:1, 1:1 및 1:5 몰비로 조합된 Ab1와 단백질 X의 SEC-MALLS 분석의 크로마토그램이다. X축은 용리 시간(분)을 나타낸다. 왼쪽의 Y축은 몰 질량(g/mol)을 나타내고 오른쪽의 Y축은 280 nm에서의 흡광도(AU)를 나타낸다. 도 3b는 5:1, 1:1 및 1:5의 몰비로 조합된 Ab1와 Ab2의 비대칭 유동장 유동 분획화 - MALLS(A4F-MALLS)의 분획도이다. X축은 용리 시간(분)을 나타낸다. 왼쪽의 Y축은 몰 질량(g/mol)을 나타낸다. 오른쪽의 Y축은 215 nm에서의 흡광도(AU)를 나타낸다.
도 4a는 리드 화합물 A(리드 A), 리드 A + 단백질 Y(1:3), 및 리드 화합물 B(리드 B) + 단백질 Y(1:3)의 A4F-MALLS 분석의 분획도이다. 도 4b는 리드 A, 리드 A + 단백질 Y(1:1), 및 리드 B + 단백질 Y(1:1)의 A4F-MALLS 분석의 분획도이다. 도 4c는 리드 A, 리드 A + 단백질 Y(3:1), 및 리드 B + 단백질 Y(3:1)의 A4F-MALLS 분석의 분획도이다. X축은 시간(분)을 나타낸다. 왼쪽의 Y축은 몰 질량(g/mol)을 나타내고 오른쪽의 Y축은 215 nm에서의 흡광도(AU)를 나타낸다.
도 5a 및 도 5b는 리드 A(도 5a) 및 리드 B(도 5b)와의 항-단백질 Y 복합체의 마우스 항-인간 항체 역가의 선 그래프이다. X축은 시간(일)을 나타내고 Y축은 농도(μg/ml)를 나타낸다.
도 6a 및 도 6b는 다양한 항-단백질 Z mAb(도 6a) 또는 Ab3와 다양한 항-단백질 Z mAb(도 6b)의 조합의 농도가 증가하는 토끼 적혈구의 용혈 백분율을 보여주는 선 그래프이다. X축은 mAb 농도(Log [M])를 나타낸다. Y축은 용혈 백분율을 나타낸다.
도 7은 유리 항-단백질 Z mAb1, 단백질 Z, 및 항-단백질 Z mAb1과 단백질 Z의 1 μM:1 μM 조합의 A4F-MALLS 분석의 분획도이다. X축은 용리 시간(분)을 나타낸다. 왼쪽의 Y축은 몰 질량(g/mol)을 나타내고 오른쪽의 Y축은 215 nm에서의 흡광도(AU)를 나타낸다.
도 8은 유리 항-단백질 Z mAb1 및 단백질 Z의 1 μM:1 μM 조합, 항-단백질 Z mAb1, 항-단백질 Z mAb5 및 단백질 Z의 0.5 μM:0.5 μM:1 μM 조합, 및 항-단백질 Z mAb1, 항 단백질 Z mAb7 및 단백질 Z의 0.5 μM:0.5 μM:1 μM 조합의 A4F-MALLS 분석의 분획도이다. X축은 용리 시간(분)을 나타낸다. 왼쪽의 Y축은 몰 질량(g/mol)을 나타내고 오른쪽의 Y축은 215 nm에서의 흡광도(AU)를 나타낸다.
도 9는 유리 mAb 콤보; 항-단백질 Z mAb1 및 단백질 Z의 1 μM:1 μM 조합; 항-단백질 Z mAb1, 항-단백질 Z mAb3 콤보 및 단백질 Z의 0.5 μM:0.5 μM:1 μM 조합; 항-단백질 Z mAb1, 항-단백질 Z mAb6 및 단백질 Z의 0.5μ M:0.5 μM: 1 μM 조합; 및 항-단백질 Z mAb6, 항-단백질 Z mAb7 및 단백질 Z의 0.5 μM:0.5 μM:1 μM 조합의 A4F-MALLS 분석의 분획도이다. X축은 용리 시간(분)을 나타낸다. 왼쪽의 Y축은 몰 질량(g/mol)을 나타내고 오른쪽의 Y축은 215 nm에서의 흡광도(AU)를 나타낸다.
도 10은 유리 mAb 콤보; 항-단백질 Z mAb1 및 단백질 Z의 1 μM:1 μM 조합; 항-단백질 Z mAb1, 항-단백질 Z mAb2 및 단백질 Z의 0.5 μM:0.5 μM:1 μM 조합; 및 항-단백질 Z mAb1, COMP1 mAb 및 단백질 Z의 0.5 μM:0.5 μM:1 μM 조합의 A4F-MALLS 분석의 분획도이다. X축은 용리 시간(분)을 나타낸다. 왼쪽의 Y축은 몰 질량(g/mol)을 나타내고 오른쪽의 Y축은 215 nm에서의 흡광도(AU)를 나타낸다.
도 11은 유리 mAb 콤보; 항-단백질 Z mAb1 및 단백질 Z의 1 μM:1 μM 조합; 항-단백질 Z mAb1, 항-단백질 Z mAb4 및 단백질 Z의 0.5 μM:0.5 μM:1 μM 조합의 A4F-MALLS 분석의 분획도이다. X축은 용리 시간(분)을 나타낸다. 왼쪽의 Y축은 몰 질량(g/mol)을 나타내고 오른쪽의 Y축은 215 nm에서의 흡광도(AU)를 나타낸다.
도 12a 및 도 12b는 0.3 μM:1 μM:1 μM 항-단백질 Z mAb1:COMP1 mAb:단백질 Z, 1 μM:1 μM:1 μM 항-단백질 Z mAb1:COMP1 mAb:단백질 Z, 및 3 μM:1 μM:1 μM 항-단백질 Z mAb1:COMP1 mAb:단백질 Z의 동시 첨가 시의 A4F-MALLS 분석의 분획도(도 12a), 또는 이의 순차적 첨가 시의 A4F-MALLS 분석의 분획도(도 12b)이다. X축은 용리 시간(분)을 나타낸다. 왼쪽의 Y축은 몰 질량(g/mol)을 나타내고 오른쪽의 Y축은 215 nm에서의 흡광도(AU)를 나타낸다.
도 13은 대표적인 mAb, 단백질 W, 및 1 μM:1 μM 비율의 mAb와 단백질 W 조합의 A4F-MALLS 분석의 분획도이다. X축은 용리 시간(분)을 나타낸다. 왼쪽의 Y축은 몰 질량(g/mol)을 나타내고 오른쪽의 Y축은 215 nm에서의 흡광도(AU)를 나타낸다.
도 14는 대표적인 mAb, 단백질 W, 및 1 μM:1 μM 비율의 mAb2와 단백질 W의 조합, mAb3와 단백질 W의 조합, 및 COMP1과 단백질 W의 조합의 A4F-MALLS 분석의 분획도이다. X축은 용리 시간(분)을 나타낸다. 왼쪽의 Y축은 몰 질량(g/mol)을 나타내고 오른쪽의 Y축은 215 nm에서의 흡광도(AU)를 나타낸다.
도 15는 COMP2, 단백질 W, 및 1 μM:1 μM 비율의 COMP2와 단백질 W 조합의 A4F-MALLS 분석의 분획도이다. X축은 용리 시간(분)을 나타낸다. 왼쪽의 Y축은 몰 질량(g/mol)을 나타내고 오른쪽의 Y축은 215 nm에서의 흡광도(AU)를 나타낸다.
도 16은 대표적인 mAb, 단백질 W, 및 1 μM:1 μM 비율의 mAb4와 단백질 W 조합, 및 COMP3과 단백질 W 조합의 A4F-MALLS 분석의 분획도이다. X축은 용리 시간(분)을 나타낸다. 왼쪽의 Y축은 몰 질량(g/mol)을 나타내고 오른쪽의 Y축은 215 nm에서의 흡광도(AU)를 나타낸다.
I.정의
본 개시는, 본원에 기술된 조성물과 방법뿐만 아니라 기술된 실험 조건이 달라질 수 있으므로, 이들로 한정되지 않는다는 것을 이해해야 한다. 또한 본 개시의 범위는 첨부된 청구항에 의해서만 한정되므로 본원에서 사용된 용어는 단지 특정 구현예를 기술하기 위한 목적이며, 한정하도록 의도되지 않음을 이해해야 한다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 개시가 속하는 당업계의 당업자에 의해 널리 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 본원에 기술된 것들과 유사하거나 동일한 임의의 조성물, 방법 및 재료가 본 발명을 실시하거나 시험하는 데 사용될 수 있다. 언급된 모든 문헌은 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다.
현재 청구된 발명을 설명하는 맥락에서 (특히 청구범위의 맥락에서) 단수형("a", "an", "the" 및 유사한 지시어)의 사용은, 본원에서 달리 표시되거나 문맥상 명확히 반대로 표시되지 않는 한, 단수형과 복수형 모두를 포함하는 것으로 해석되어야 한다.
본원에서 값의 범위에 대한 인용은, 본원에서 달리 표시되지 않는 한, 그 범위 내에 속하는 각각의 별도의 값을 개별적으로 참조하는 속기법으로서 역할을 하도록 의도된 것뿐이며, 각각의 별도의 값은 본원에서 개별적으로 인용된 것처럼 명세서에 포함된다.
용어 "약"의 사용은 대략 +/- 10% 범위에서 언급된 값의 위 또는 아래의 값을 설명하기 위한 것이며; 다른 실시예들에서는 상기 값은 대략 +/- 5% 범위에서 언급된 값의 위 또는 아래의 값에 이를 수 있으며; 다른 실시예들에서는 상기 값은 대략 +/- 2% 범위에서 언급된 값의 위 또는 아래의 값에 이를 수 있으며; 다른 실시예들에서는 상기 값은 대략 +/- 1% 범위에서 언급된 값의 위 또는 아래의 값에 이를 수 있다. 선행하는 범위들은 문맥상 명확해지게 하기 위한 것이며, 어떠한 추가 제한도 함축되지 않는다. 본원에 기술된 모든 방법은 본원에서 달리 표시되지 않거나 문맥상 명확히 반박되지 않는 한 임의의 적합한 순서로 수행될 수 있다. 본원에 제공되는 임의의 그리고 모든 실시예, 또는 예시적인 언어(예를 들어, "예컨대")의 사용은, 단지 본 발명을 더욱 잘 조명하기 위한 것이고, 달리 청구되지 않는 한 본 발명의 범주에 대한 한정을 제시하지 않는다. 본 명세서 내의 어떠한 언어도 본 발명의 실시에 필수적인 것으로서 임의의 미-청구 요소를 나타내는 것으로 해석되어서는 안된다.
"단백질"은 펩티드 결합에 의해 서로 연결된 2개 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 분자를 지칭한다. 단백질은 폴리펩티드 및 펩티드를 포함하고, 또한 당화, 지질 부착, 황화, 글루탐산 잔기의 감마-카르복실화, 알킬화, 하이드록실화 및 ADP-리보실화와 같은 변형을 포함할 수 있다. 단백질은 단백질-기반 약물을 포함하여, 과학적 또는 상업적 관심 대상이 될 수 있으며, 단백질은 특히 효소, 리간드, 수용체, 항체 및 키메라 또는 융합 단백질을 포함한다. 단백질은 주지의 세포 배양 방법을 사용하여 다양한 유형의 재조합 세포에 의해 생산되며, 일반적으로 유전자 조작 기술(예를 들어, 키메라 단백질을 인코딩하는 서열, 또는 코돈 최적화된 서열, 인트론리스 서열 등)에 의해 세포 내로 도입되며, 여기서 에피좀으로서 체류할 수도 있고 세포의 게놈 내에 혼입될 수도 있다.
"항체"는 4개의 폴리펩티드 사슬, 즉 이황화 결합에 의해 상호 연결된 2개의 중(H)쇄 및 2개의 경(L)쇄로 이루어진 면역글로불린 분자를 지칭한다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역(HCVR 또는 VH)과 중쇄 불변 영역을 갖는다. 중쇄 불변 영역은 세 개의 도메인, CH1, CH2 및 CH3을 함유한다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역 및 경쇄 불변 영역을 갖는다. 경쇄 불변 영역은 하나의 도메인(CL)으로 구성된다. VH와 VL 영역은, 프레임워크 영역(FR)으로 지칭되는 더 보존적인 영역이 중간에 끼어 있는 상보성 결정 영역(CDR)으로 지칭되는 초가변 영역으로 더 세분화될 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 아미노 말단에서 카르복시 말단의 방향으로 다음 순서로 배열된 3개의 CDR과 4개의 FR을 포함한다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 용어 "항체"는 임의의 이소형 또는 서브클래스의 당화 및 비-당화 면역글로불린에 대한 참조를 포함한다. 용어 "항체"는 항체를 발현하도록 형질감염된 숙주 세포로부터 단리된 항체와 같이, 재조합 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리된 항체 분자를 포함한다. 용어 항체는 또한 하나 초과의 상이한 에피토프에 결합할 수 있는 이종사량체(heterotetrameric) 면역글로불린을 포함하는, 이중특이성 항체를 포함한다. 이중특이적 항체는 미국 특허 출원 제8,586,713호에 일반적으로 기술되어 있으며, 동 문헌은 참조로서 본원에 통합된다.
"Fc 융합 단백질"은 2개 이상의 단백질의 일부 또는 전부를 포함하며, 그 중 1개는 면역글로불린 분자의 Fc 부분이며, 이들은 본래 함께 발견되지 않는다. (Fc 도메인을 포함하는) 항체-유래 폴리펩티드의 다양한 부분에 융합된 특정 이종 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질의 제조는, 예를 들어 Ashkenazi 외, Proc. Natl. Acad. ScL USA 88: 10535, 1991; Byrn 외, Nature 344:677, 1990; 및 Hollenbaugh 외, "Construction of Immunoglobulin Fusion Proteins", in Current Protocols in Immunology, Suppl. 4, pages 10.19.1 - 10.19.11, 1992에 기술되어 있다. "수용체 Fc 융합 단백질"은, 일부 실시예에서는, 힌지 영역 뒤에 면역글로불린의 CH2 및 CH3 도메인을 포함하는, Fc 모이어티에 결합된 수용체의 하나 이상의 세포외 도메인(들)을 포함한다. 일부 구현예에서, Fc-융합 단백질은 하나 이상의 리간드(들)에 결합하는 둘 이상의 구별되는 수용체 사슬을 포함한다. 예를 들어, Fc-융합 단백질은 예를 들어 IL-1 Trap 또는 VEGF Trap과 같은 Trap이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "가용성 리간드"는 세포의 혈장 막을 쉽게 관통할 수 없는 극성 리간드 또는 하전된 리간드를 지칭한다. 대부분의 가용성 리간드는 세포 표면 수용체의 세포외 도메인에 결합한다.
"A4F"는 비대칭 유동장 유동 분획화를 나타내며, 이는 분석물의 분리가 외부 수직 물리장과 샘플의 상호 작용을 통해 달성되는 분획화 기술이다.
다각도 광 산란(MALS)은 샘플에 의해 복수의 각도로 산란된 광을 측정하는 기술을 기술한다. 이는, 용액 중 분자가 어떻게 광을 산란시키는지를 검출함으로써 용액 중 분자의 절대 몰 질량과 평균 크기를 둘 다 결정하는 데 사용된다. 레이저 광원의 시준된 광이 가장 흔히 사용되며, 이 경우 이 기술은 다각도 레이저 광 산란(MALLS)으로 지칭될 수 있다. 실제로 MALS 및 MALLS라는 용어는 상호 교환적으로 사용됩니다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "브라운 운동"은 액체에 현탁된 입자들의 연속적인 운동을 지칭한다.
II. 단백질 복합체를 특성화하는 방법
단클론 항체 병용 요법은 다수의 신호전달 경로가 관여하는 암 및 염증성 병태와 같은 질환에 대한 유망한 치료 전략으로 대두되어 왔다. 또한, 단일 요법만으로 경로가 완전히 억제되지 않을 때, 동일한 경로를 표적으로 하는 하나 이상의 단클론 항체를 투여하는 것이 질환의 발병기전(pathogenesis)에 관여하는 경로를 완전히 차단하는 데 유익할 수 있다. 그러나, 치료 mAb를 가용성, 다량체 표적에 결합시키는 것은 큰 이종 복합체의 형성을 초래할 수 있다. 단백질 복합체의 크기, 형상 및 형태는 다른 인자들 중에서도 면역원성 및 항체 제거 시간에 영향을 미칠 수 있다. 단백질 복합체의 분석은 약물 개발 중에 mAb의 약동학에 대한 통찰력을 제공하는 데 중요하다.
따라서, 단백질 복합체를 특성화하기 위한 방법 및 시스템이 제공된다. 일 구현예는, 비대칭 유동장 유동 분획화를 사용해 의해 샘플을 분획화하고, 다각도 레이저 광 산란을 사용해 샘플에서 이종 단백질 복합체의 몰 질량, 화학량론 및 크기 분포를 결정함으로써, 샘플에서 이종 단백질 약물 생성물:리간드 복합체의 화학량론 및 크기 분포를 평가하는 방법을 제공한다. 단백질 복합체는 전형적으로, 표적 또는 리간드로도 지칭되는 관심 단백질에 특이적으로 결합하는 단백질로 구성된다. 일 구현예에서, 표적에 특이적으로 결합하는 단백질은 항체 또는 융합 단백질이다.
항체 또는 융합 단백질이 그의 표적 또는 리간드와 생체 내 또는 시험관 내에서 조합될 때, 항체:리간드 또는 융합 단백질:리간드의 이종 혼합물이 형성될 수 있다. 일 구현예에서, 단클론 항체(mAb) 또는 융합 단백질과 같은 치료 단백질이 가용성, 다량체 표적에 결합하면 큰 이종 복합체(heterogeneous complex) 또는 큰 헤테로머 복합체(heteromeric complex)가 생성된다. 예를 들어, 큰 단백질 복합체는 3:2, 2:3, 4:4, 6:6, 또는 [2:2]n으로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질:리간드 비를 갖는 단백질 복합체로서의 특징을 가질 수 있다. 큰 이종 복합체는 다수의 다량체 리간드 분자와 다수의 단백질 약물 생성물 분자 사이에 형성된 복합체를 지칭한다. 큰 헤테로머 복합체(large heteromeric complex)라는 용어는, 2개의 상이한 단백질 약물 생성물, 예를 들어, 2개의 상이한 항체, 2개의 상이한 융합 단백질, 또는 상이한 부위에서 동일한 리간드에 결합하는 융합 단백질 및 항체에 의해 결합된 리간드를 지칭한다.
또 다른 구현예는 생체 내, 시험관 내, 또는 둘 모두에서 가용성 표적과 큰 이종 복합체를 형성하는 단백질 약물 생성물을 식별하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 단백질 약물 생성물 및 그의 가용성 리간드를 함유하는 샘플을 제조하여 단백질 약물 생성물:리간드 복합체를 생성하는 단계; 샘플을 분획화하여 단백질 약물 생성물:리간드 복합체를 분리하는 단계; 및 분획화된 단백질 약물 생성물:리간드 복합체를 다각도 레이저 광 산란에 의해 분석하여 단백질 복합체의 크기 및 이질성을 결정하는 단계를 포함한다. 일 구현예에서, 단백질 샘플은 비대칭 유동장 유동 분획화에 의해 분획화된다.
개시된 방법 및 시스템에 대한 추가의 세부 사항이 아래에 제공된다.
A.단백질 복합체를 특성화하기 위한 시스템
일 구현예에서, 상기 시스템은 비대칭 유동장 -유동 분획화(A4F) 시스템 및 다각도 레이저 광 산란(MALLS) 시스템을 포함한다. 상업적으로 이용 가능한 A4F 시스템의 예는 Eclipse?? 3+ A4F 분리 시스템이다. 상업적으로 이용 가능한 MALLS 시스템의 예는 Wyatt Technology Dawn HELEOS® II 레이저 광 산란 기기이다. 상기 시스템은 전형적으로 UV/VIS 검출기 및/또는 굴절률 검출기를 포함한다. 상업적으로 이용 가능한 예시적인 UV/VIS 검출기는 Agilent 1260 Infinity UV 검출기이다. 상업적으로 이용 가능한 예시적인 굴절률 검출기는 Optilab® T-rEX 굴절률 검출기이다. 일 구현예에서, A4F 시스템은 350W 스페이서 및 4 kDa MWCO NADIR® 친수성 PES(PESH) 막이 피팅된 A4F 단 채널(short channel)을 포함한다. 또 다른 구현예에서, A4F 단 채널에는 490W 스페이서 및 10 kDa MWCO Nadir® 재생 셀룰로오스 막이 피팅된다. 예시적인 이동상은 pH 7.0의 10 mM 인산염 및 500 mM NaCl을 포함한다. 그러나, 컬럼 크로마토그래피 분리 대비 A4F의 장점은 이동상의 유형 또는 사용할 수 있는 담체 유체에 대한 제한이 없다는 것이다. 일 구현예에서, 샘플은 60분에 걸쳐 선형 구배를 사용하여 분리된다. 일 구현예에서, 채널 흐름 및 교차 흐름 프로그램은 사례별로 원하는 해상도를 달성하도록 구체적으로 최적화된다. 당업자는 A4F를 사용하여 분리되는 특정 샘플에 요구되는 해상도에 따라 용리 프로파일을 수정하고 최적화할 수 있다는 것을 이해해야 한다.
전형적으로, 샘플은 A4F 채널의 샘플 유입 포트 내로 주입된다. 그런 다음, 담체 유체를 유입 포트와 배출 포트 모두로부터 채널 내로 유동시키고, 일반적으로는 샘플 유입 포트 근처에 있는 채널의 한 지점에서 이들을 만나게 하여 집속 구역(focusing zone)을 형성함으로써, 샘플을 집속시킨다. 집속 기간 동안, 주입된 샘플의 입자들을 본 집속 구역에 유지시켜 분획화 전에 이완시킨다. 마지막 단계는 입자의 분획화 단계이다. 입자들이 채널을 따라 유동함에 따라, 수직으로 대향하는 교차 흐름 분리장이 채널의 바닥을 향해 분자들을 밀어낸다. 분자들이 채널의 바닥 근처에 축적되면, 이들 분자는 교차 흐름장에 대항하여 채널 내로 다시 확산되는 반대 작용을 거치게 된다. 분자들이 채널 내로 다시 확산될 수 있는 정도는, 병진 확산 계수에 의해 정의되는 특성인, 이들의 자연적인 브라운 운동에 의해 좌우되며, 결국은 각 개별 종의 고유한 크기 및 형상과 관련된다. 일반적으로, 작은 입자는 큰 입자보다 더 빠른 확산 계수를 가지고, 교차 유동장에 대항해 채널 내로 더 높이 확산될 수 있다. 채널 내에서의 층류(laminar flow) 속도는 균일하지 않다. 이는, 채널의 중심을 향해 유속이 증가하고 채널의 상부 및 하부 벽을 향해서는 유속이 감소하는 포물선 패턴으로 이동한다. 따라서, 채널을 통해 입자가 운반되는 속도는 입자의 채널 내 위치에 따라 달라지게 된다. 채널의 중심 근처에 위치하여 확산 속도가 더 빠른 것들은 더 빠른 속도로 운반된다. 채널의 바닥 축적 벽 근처의 얕고 느리게 이동하는 스트림 내의 더 큰 입자는 더 작은 입자보다 더 낮은 유동 속도로 운반되고 더 늦게 용리된다. 이는 가장 작은 것에서 가장 큰 것의 용리 순서로 질량에 기초하여 입자를 부드럽게 분리시킨다.
샘플이 A4F 채널을 통해 유동함에 따라, 샘플의 선단 부분은 배출 포트를 통해 채널을 빠져나간다. 다각도 레이저 광 산란(MALLS) 검출기는 A4F 시스템과 유체 연통하며 A4F 배출 포트로부터 샘플을 수용한다. 일부 구현예에서, 샘플은 UV/VIS 검출기를 통과시켜 흡광도의 함수로서 샘플 농도를 측정한다. MALLS 시스템은 편광(또는 레이저)을 샘플 분자 상에 집속시키면 산란된 광은 광 검출기에 의해 검출한다.
다각도 광산란(MALS)은 분자, 입자 또는 단백질 복합체를 포함하는 샘플로부터 산란되는 빛을 측정한다. 이러한 산란은 광학 구성의 설정에 따라 달라지며, 전형적인 실험적 실현에서, 광은 이어서 하나 또는 여러 상이한 각도에서 검출된다. 단일 산란 각 솔루션에서 가장 대중적인 3가지 설계는 90도(직각 광산란 또는 RALS), 7도(낮은 각도 광산란 또는 LALS), 173도(비침습적 후방 광산란 또는 NIBS)이다. 다각도 설정의 경우, 원칙적으로 각도가 고정되는 설정(가장 흔하며, MALS 또는 MALLS 설정으로 불림)과 각도가 가변적인 설정(일반적으로 광산란 측각기 또는 분광계로 지칭됨)이 있다. MALS는 일반적으로 입자 분리 설정의 일부로서 사용되는 다수의 고정된 각도를 갖는 시스템, 예를 들어 A4F를 지칭한다. MALS의 가장 광범위한 적용예는 농도 검출기(RI 또는 단일 파장 UV 등)와 결합된 절대 몰 질량 검출기로서의 적용예이다.
MALS는 다음을 측정하는 데 사용할 수 있다: Mw - 단백질 복합체의 중량-평균 몰 질량; Rg - 단백질 복합체의 평균 반경; A2 - 용액 내 단백질의 용해도.
B.단백질 복합체를 특성화하는 방법
개시된 시스템 및 방법은 샘플 중 단백질 복합체, 예를 들어 단백질 약물 생성물:리간드 복합체를 특성화하는 데 사용될 수 있다. 일 구현예는, 비대칭 유동장 유동 분획화(A4F)에 의해 샘플을 분획화하고, 다각도 레이저 광 산란(MALLS)을 사용해 샘플에서 단백질 복합체의 몰 질량, 화학량론 및 크기 분포를 결정함으로써 샘플에서 이종 단백질 복합체의 화학량론 및 크기 분포를 평가하는 방법을 제공하며, 여기서 복합체는 항체:리간드 복합체 또는 융합 단백질:리간드 복합체를 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, 리간드는 가용성 리간드이다. 일반적으로 항체는 단클론 항체이다. 일 구현예에서, 단백질 복합체는 리간드에 대한 그의 항체 또는 융합 단백질의 비에 의해 특성화된다. 비제한적인 예에서, 항체 또는 융합 단백질 대 리간드의 비는 1:0, 0:1,1:1, 1:2, 2:1, 2:2, 3:2, 2:3, 4:4, 6:6, or [2:2]n으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 항체 또는 융합 단백질 대 리간드의 비는 시험 중인 특정 항체 또는 융합 단백질 및 리간드에 따라 달라질 것임을 이해해야 한다.
1. 단백질 복합체의 혼합물
단백질 복합체의 특징을 결정하기 위해, 복합체의 각 성분에 대한 몰 질량을 실험적으로 결정하여 다양한 화학량론을 갖는 복합체의 예상 몰 질량을 계산할 수 있다. 일 구현예에서, 혼합물 중 각각의 단백질 및 리간드를 개별적으로 분석하여 각 성분에 대한 몰 질량을 결정한다. 일 구현예에서, 단백질 약물 생성물 및 이의 리간드를 혼합하여 단백질 약물 생성물:리간드 복합체를 형성하고, 이어서 그 복합체를 특성화한다. 분획화된 단백질 약물 생성물:리간드를 대상으로 A4F-MALLS를 수행하여 복합체의 몰 질량을 결정한다. 그런 다음, 분획화된 복합체의 계산된 값을 개별 성분의 실험적으로 결정된 몰 질량과 비교하여 각 복합체에 존재하는 개별 성분의 가능한 화학량론 비율을 결정한다. 일 구현예에서, 상기 방법은 1:1 단백질 약물 생성물:리간드 복합체를 검출할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 상기 방법은 임의 비율의 단백질 약물 생성물:리간드를 검출할 수 있다. 비제한적인 예에서, 상기 방법은 1:0, 0:1, 2:1, 1:2, 2:2, 3:2, 2:3, 4:4, 6:6, 또는 [2:2]n의 단백질 약물 생성물:리간드 복합체를 검출할 수 있다. 항체 또는 융합 단백질 대 리간드의 비는 시험 중인 특정 항체 또는 융합 단백질 및 리간드에 따라 달라질 것임을 이해해야 한다. 일부 구현예에서, 복합체는 공통의 가용성 리간드와 복합체화된 다수의 상이한 단백질 약물 생성물을 함유한다.
a. 리간드
단백질 약물 생성물:리간드 복합체 중의 리간드는 단량체 또는 다량체 리간드일 수 있다. 일 구현예에서, 리간드는 가용성 리간드이다. 일부 구현예에서, 가용성 리간드는 막관통 수용체 단백질을 포함하지만 이에 한정되지 않는 막관통 단백질의 세포외 부분에 상응한다.
단량체 리간드는 단 하나의 단백질 또는 하나의 단백질 단위를 함유한다. 다량체 리간드는, 예를 들어 다수의 단백질 또는 단백질 서브유닛을 함유하는 이량체, 삼량체 등일 수 있다. 예를 들어, 리간드는 동종이량체 또는 이종이량체일 수 있다. 일부 구현예에서, 다량체 리간드는 단백질 약물 생성물의 둘 이상의 분자에 결합한다. 도 1a는 예시적인 1:1 항체:리간드 복합체를 도시한다. 도 1b는 예시적인 1:2 항체:리간드 복합체를 도시하고, 도 1c는 내부 항체의 각 아암이 상이한 리간드에 결합하여 큰 이종 복합체를 생성하는 "페이퍼 돌링" 효과의 예를 도시한다.
일 구현예에서, 큰 이종 단백질 약물 생성물:리간드 복합체는 500 kDa 또는 그 이상의 크기를 갖는다. 또 다른 구현예에서, 큰 이종 단백질 약물 생성물:리간드 복합체는 500 내지 4000 kDa의 크기를 갖는다. 또 다른 구현예에서, 큰 이종 단백질 약물 생성물:리간드는 3:2, 2:3, 4:4, 또는 6:6의 단백질 약물 생성물:리간드의 비를 갖는다.
일 구현예에서, 개시된 방법은 다량체 리간드를 표적화 하도록 설계된 리드 단백질 약물 생성물이 큰 이종 단백질 약물 생성물:리간드 복합체를 형성할 것인지 여부를 결정하는 데 사용된다.
일 구현예에서, 개시된 방법은 다량체 리간드가 둘 이상의 단백질 약물 생성물 또는 융합 단백질과 복합체를 형성할 것인지 여부를 결정하는 데 사용될 수 있다. 형성될 수 있는 복합체는 1:0, 0:1, 2:1, 1:2, 2:2, 3:2, 2:3, 4:4, 6:6, 또는 [2:2]n의 단백질:리간드 비를 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다. 도 1a 내지 도 1c는 다량체 리간드와 단클론 항체 사이에서 형성될 수 있는 예시적인 복합체를 도시한다.
b. 다수의 mAb의 조합
동일한 경로 또는 동일한 리간드를 표적화하기 위해 다수의 단백질 약물 생성물을 사용하는 병용 요법이 점차 대중화되고 있다. 일부 구현예에서, 개시된 방법은 단백질 약물 생성물에 의해 형성된 단백질 복합체의 화학량론 및 크기 분포에 기초하여, 동일한 리간드를 표적화하는 항체의 상이한 조합을 구별하는 데 사용될 수 있다. 두 개의 단백질 약물 생성물이 단량체 리간드와 함께 혼합될 때, 단백질 약물 생성물은 헤테로머 복합체를 형성할 가능성이 있다. 본원에서 정의된 바와 같이, 헤테로머 복합체는 동일한 표적 분자에 결합하는 2개의 상이한 단백질 약물 생성물을 지칭한다. 또한, 동일한 항체의 2개의 아암 각각은 2개의 리간드에 결합할 수 있는 능력을 가지며, 이들 리간드는 제2 항체에도 결합하여 헤테로머 복합체를 형성할 수 있다. 도 2a 내지 도 2d는 대표적인 헤테로머 복합체를 보여준다. 도 2a 및 2c는 하나의 단백질 약물 생성물(검정색) 또는 항체가 2개의 리간드에 결합하고, 리간드 중 하나에 제2의 고유한 단백질 약물 생성물(회색)이 또한 결합할 때 형성되는 복합체를 도시한다. 회색 단백질에 또 다른 리간드가 결합한 다음, 이 리간드에 검정색 단백질이 결합하는 경우, 도 2b 및 도 2d에 나타낸 바와 같이, 더 크고 더 이질적인 복합체가 형성될 수 있다.
2. 리드 단백질 약물 생성물의 선택
또 다른 구현예는, 제1 단백질 약물 생성물의 표적을 포함하는 제1 샘플에 제1 단백질 약물 생성물을 첨가하여 이종 단백질:리간드 복합체를 생성하고, 표적을 함유하는 제2 샘플에 제2 단백질 약물 생성물을 첨가하여 단백질:리간드 복합체를 형성함으로써, 리드 단백질 약물 생성물을 선택하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 비대칭 유동장 유동 분획화 - 다각도 레이저 광 산란을 사용해 이종 단백질:리간드 복합체를 분리하고 이종 단백질:리간드 복합체의 크기 분포 및 화학량론을 결정하는 단계를 포함한다. 상기 방법은 또한, 더 적은 이종 단백질:리간드 복합체를 형성하는 단백질 약물 생성물을 리드 표적 단백질 약물로서 선택하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 리간드는 가용성 리간드이다. 가용성 리간드는 단량체 리간드 또는 다량체 리간드일 수 있다. 일반적으로, 단백질 약물 생성물은 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 융합 단백질 또는 재조합 단백질일 수 있다. 단백질 복합체는 항체 또는 융합 단백질 대 리간드의 비가 1:0, 0:1,1:1, 1:2, 2:1, 2:2, 3:2, 2:3, 4:4, 6:6, 또는 [2:2]n으로 이루어지지만 이들로 한정되지 않는 군으로부터 선택되는 단백질 복합체로서 특성화될 수 있다. 또 다른 구현예는 전술한 방법을 사용해 선택된 리드 단백질 약물 생성물을 함유하는 약학적 조성물을 제공한다.
3. 단백질 복합체의 크기 및 형상의 결정
일 구현예에서, 개시된 방법은 단백질 복합체의 크기를 결정하는 데 사용될 수 있다. 단백질 약물 생성물 및 임의로 가용성 리간드의 혼합물을 A4F 분획화를 사용해 분리한다. 그런 다음, 단백질 복합체의 크기 및 화학량론을 MALLS 분석을 사용해 결정할 수 있다. MALLS 분석의 경우, 편광의 빔(또는 레이저)을 샘플 분자 상에 집속하고 산란된 광을 광 검출기로 검출한다. 산란된 광은 다양한 상이한 각도에서 동시에 검출된다. 각 각도에서 산란된 광의 강도는 복합체의 몰 질량에 비례한다. 일 구현예에서, UV/Vis 분광분석기를 사용해 각 단백질 복합체의 농도를 결정한다.
또 다른 구현예에서, 상이한 단백질 약물 생성물 간에 형성된 단백질 복합체의 공통 리간드에 대한 형상/형태는 개시된 방법을 사용하여 구별할 수 있다. 동일한 몰 질량을 갖는 복합체들 사이의 용리 시간 또는 용리 프로파일에 있어서의 차이는 단백질 복합체의 형상 또는 형태에 차이가 있음을 시사한다. 복합체의 몰 질량이 동일하거나 유사하지만 용리 시간이 다르다는 것은, 용리 시간이 더 느린 복합체의 경우, 복합체의 형상 또는 형태에 있어서의 차이로 인해 유체역학적 부피가 증가하였음을 나타낸다.
단백질 복합체의 몰 질량 및 크기의 이질성을 사용해 단백질 약물 생성물의 제거를 예측할 수 있다. 일 구현예에서, 단백질 복합체가 클수록, 단백질 약물 생성물은 신체로부터 더 신속히 제거된다.
C.단백질 복합체 내의 단백질
일 구현예에서, 단백질 복합체 내의 단백질 중 하나는 단백질 약물 생성물이거나 원핵 또는 진핵 세포에서의 발현에 적합한 관심 단백질이다. 예를 들어, 단백질 복합체 내의 단백질은 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 키메라 항체 또는 그의 항원-결합 단편, ScFv 또는 그의 단편, Fc-융합 단백질 또는 그의 단편, 성장 인자 또는 그의 단편, 사이토카인 또는 그의 단편, 또는 세포 표면 수용체의 세포외 도메인 또는 그의 단편일 수 있다. 복합체 내의 단백질은 단일 서브유닛으로 구성된 단순한 폴리펩티드, 또는 2개 이상의 서브유닛을 포함하는 복합 다중 서브유닛 단백질일 수 있다. 관심 단백질은 바이오제약 생성물, 식품 첨가물 또는 보존제, 또는 정제 및 품질 표준에 따른 임의의 단백질 생성물일 수 있다.
일부 구현예에서, 단백질 생성물 내의 단백질은 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 단클론 항체, 다중특이적 항체, 이중특이적 항체, 항원 결합 항체 단편, 단일 사슬 항체, 디아바디, 트리아바디 또는 테트라바디, 이중 가변 도메인 면역글로불린(DVD-IG)으로 명명된 이중특이적 4가 면역글로불린 G-유사 분자, IgD 항체, IgE 항체, IgM 항체, IgG 항체, IgG1 항체, IgG2 항체, IgG3 항체, 또는 IgG4 항체이다. 일 구현예에서, 항체는 IgG1 항체이다. 일 구현예에서, 항체는 IgG2 항체이다. 일 구현예에서, 항체는 IgG4 항체이다. 또 다른 구현예에서, 항체는 키메라 힌지를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 항체는 키메라 Fc를 포함한다. 일 구현예에서, 항체는 키메라 IgG2/IgG4 항체이다. 일 구현예에서, 항체는 키메라 IgG2/IgG1 항체이다. 일 구현예에서, 항체는 키메라 IgG2/IgG1/IgG4 항체이다.
일부 구현예에서, 항체는 항-프로그램 세포 사멸(Programmed Cell Death) 1 항체 (예를 들어, 미국 특허출원 공개 제US2015/0203579A1호에 기술된 것과 같은 항-PD1 항체), 항-프로그램 세포 사멸 리간드-1 (예를 들어, 미국 특허출원 공개 제US2015/0203580A1호에 기술된 것과 같은 항-PD-L1 항체), 항-Dll4 항체, 항-안지오포이에틴(Angiopoetin)-2 항체 (예를 들어, 미국 특허 제9,402,898호에 기술된 것과 같은 항-ANG2 항체), 항-안지오포이에틴-유사 3 항체 (예를 들어, 미국 특허 제9,018,356호에 기술된 것과 같은 항-AngPtl3 항체), 항-혈소판 유래 성장 인자 수용체 항체 (예를 들어, 미국 특허 제9,265,827호에 기술된 것과 같은 항-PDGFR 항체), 항-Erb3 항체, 항-프로락틴 수용체 항체 (예를 들어, 미국 특허 제9,302,015호 기술된 것과 같은 항-PRLR 항체), 항-보체 5 항체 (예를 들어, 미국 특허출원 공개 제US2015/0313194A1호에 기술된 것과 같은 항-C5 항체), 항-TNF 항체, 항-표피 성장 인자 수용체 항체 (예를 들어, 미국 특허 제9,132,192호에 기술된 것과 같은 항-EGFR 항체, 또는 미국 특허출원 공개 제US2015/0259423A1호에 기술된 것과 같은 항-EGFRvIII 항체), 항-전구단백질 전환효소 섭틸리신 켁신(Proprotein Convertase Subtilisin Kexin)-9 항체 (예를 들어, 미국 특허 제8,062,640호 또는 미국 특허 제9,540,449호에 기술된 것과 같은 항-PCSK9 항체), 항-성장 및 분화 인자-8 항체 (예를 들어, 미국 특허 제8,871,209호 또는 제9,260,515호에 기술된 것과 같은, 항-미오스타틴 항체로도 알려진 항-GDF8 항체로서), 항-글루카곤 수용체 (예를 들어, 미국 특허출원 공개 제US2015/0337045A1호 또는 제US2016/0075778A1호에 기술된 것과 같은 항-GCGR 항체), 항-VEGF 항체, 항-IL1R 항체, 인터루킨 4 수용체 항체 (예를 들어, 미국 특허출원 공개 제US2014/0271681A1호 또는 미국 특허 제8,735,095호 또는 제8,945,559호에 기술된 것과 같은 항-IL4R 항체), 항-인터루킨 6 수용체 항체 (예를 들어, 미국 특허 제7,582,298호, 제8,043,617호 또는 제9,173,880호에 기술된 것과 같은 항-IL6R 항체), 항-IL1 항체, 항-IL2 항체, 항-IL3 항체, 항-IL4 항체, 항-IL5 항체, 항-IL6 항체, 항-IL7 항체, 항-인터루킨 33 (예를 들어, 미국 특허 제9,453,072호 또는 제9,637,535호에 기술된 것과 같은 항- IL33 항체), 항-호흡기 세포융합 바이러스(Respiratory syncytial virus) 항체 (예를 들어, 미국 특허 출원 공개 제9,447,173호에 기술된 것과 같은 항-RSV 항체), 항-분화 클러스터 3 (예를 들어, 미국 특허 제9,447,173호 및 9,447,173호, 및 미국 특허 출원 제62/222,605호에 기술된 것과 같은 항-CD3 항체), 항-분화 클러스터 20 (예를 들어, 미국 특허 제9,657,102호 및 제US20150266966A1호, 및 미국 특허 제7,879,984호에 기술된 것과 같은 항-CD20 항체), 항-CD19 항체, 항-CD28 항체, 항- 분화 클러스터-48 (예를 들어, 미국 특허 제9,228,014호에 기술된 것과 같은 항-CD48 항체), (예를 들어, 미국 특허 제9,079,948호에 기술된 것과 같은) 항-Fel d1 항체, 항-중동 호흡기 증후군 바이러스(Middle East Respiratory Syndrome virus) (예를 들어, 미국 특허 출원 공개 제US2015/0337029A1호에 기술된 것과 같은 항-MERS 항체), (예를 들어, 미국 특허출원 공개 제US2016/0215040에 기술된 것과 같은) 항-에볼라 바이러스(Ebola virus) 항체, 항-지카 바이러스(Zika virus) 항체, 항-림프구 활성화 유전자(Lymphocyte Activation Gene) 3 항체 (예, 항-LAG3 항체, 또는 항-CD223 항체), 항-신경 성장 인자(Nerve Growth Factor) 항체 (예를 들어, 미국 특허출원 공개 제US2016/0017029호 및 미국 특허 제8,309,088호 및 제9,353,176호에 기술된 것과 같은 항-NGF 항체) 및 항-단백질 Y 항체로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 이중특이적 항체는 (미국 특허출원 공개 제US2014/0088295A1호 및 제US20150266966A1호에 기술된 것과 같은) 항-CD3 x 항-CD20 이중특이적 항체, 항-CD3 x 항-뮤신(Mucin) 16 이중특이적 항체 (예: 항-CD3 x 항-Muc16 이중특이적 항체), 및 항-CD3 x 항-전립선-특이적 막 항원 이중특이적 항체 (예: 항-CD3 x 항-PSMA 이중특이적 항체)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 관심 단백질은 압식시맙(abciximab), , 아달리무맙(adalimumab), 아달리무맙-아토(adalimumab-atto), 아도-트라스트주맙(ado-trastuzumab), 알렘투주맙(alemtuzumab), 알리로쿠맙(alirocumab), 아테졸리주맙(atezolizumab), 아벨루맙(avelumab), 바실릭시맙(basiliximab), 벨리무맙(belimumab), 벤랄리주맙(benralizumab), 베바시주맙(bevacizumab), 베즐로톡주맵(bezlotoxumab), 블리나투모맙(blinatumomab), 브렌툭시맙 베도틴(brentuximab vedotin), 브로달루맙(brodalumab), 카나키누맙(canakinumab), 캅프로맙 펜데티드(capromab pendetide), 세톨리주맙 페골(certolizumab pegol), 세미플리맙(cemiplimab), 세툭시맙(cetuximab), 데노수맙(denosumab), 디뉴툭시맙(dinutuximab), 두필루맙(dupilumab), 더발루맙(durvalumab), 에쿨리주맙(eculizumab), 엘로투주맙(elotuzumab), 에미시주맙-kxwh(emicizumab-kxwh), 엠탄신알리로쿠맙(emtansinealirocumab), 에비나쿠맙(evinacumab), 에볼로쿠맙(evolocumab), 파시누맙(fasinumab), 골리무맙(golimumab), 구셀쿠맙(guselkumab), 이브리투모맙 타이욱세탄(ibritumomab tiuxetan), 이다루시주맙(idarucizumab), 인플릭시맙(infliximab), 인플릭시맙-abda(infliximab-abda), 인플릭시맙-dyyb(infliximab-dyyb), 이필리무맙(ipilimumab), 익세키주맙(ixekizumab), 메폴리주맙(mepolizumab), 네시투무맙(necitumumab), 네스바쿠맙(nesvacumab), 니볼루맙(nivolumab), 오빌톡삭시맙(obiltoxaximab), 오비누투주맙(obinutuzumab), 오크렐리주맙(ocrelizumab), 오파투무맙(ofatumumab), 올라라투맙(olaratumab), 오말리주맙(omalizumab), 파니투무맙(panitumumab), 펨브롤리주맙(pembrolizumab), 퍼투주맙(pertuzumab), 라무시루맙(ramucirumab), 라니비주맙(ranibizumab), 락시바쿠맙(raxibacumab), 레스리주맙(reslizumab), 리누쿠맙(rinucumab), 리툭시맙(rituximab), 사리루맙(sarilumab), 세쿠키누맙(secukinumab), 실툭시맙(siltuximab), 토실리주맙(tocilizumab), 토실리주맙(tocilizumab), 트라스투주맙(trastuzumab), 트레보그루맙(trevogrumab), 우스테키누맙(ustekinumab), 및 베돌리주맙(vedolizumab)으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 복합체 중의 관심 단백질은 Fc 모이어티 및 다른 도메인을 포함하는 재조합 단백질(예를 들어, Fc-융합 단백질)이다. 일부 구현예에서, Fc-융합 단백질은 Fc 모이어티에 연결된 수용체의 하나 이상의 세포외 도메인(들)을 함유하는, 수용체 Fc-융합 단백질이다. 일부 구현예에서, Fc 모이어티는 힌지 영역에 이어서 IgG의 CH2 및 CH3 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 수용체 Fc-융합 단백질은 단일 리간드 또는 다수의 리간드에 결합하는 둘 이상의 구별되는 수용체 사슬을 함유한다. 예를 들어, Fc-융합 단백질은 IL-1 Trap(예, hIgG1의 Fc에 융합된 Il-1R1 세포외 영역에 융합된 IL-1RAcP 리간드 결합 영역을 함유하는 릴로나셉트(rilonacept); 그 전체가 참조로서 본원에 통합된 미국 특허 제6,927,004호 참조), 또는 VEGF Trap(예, hIgG1의 Fc에 융합된 VEGF 수용체 Flk1의 Ig 도메인 3에 융합된 VEGF 수용체 Flt1의 Ig 도메인 2를 포함하는 아플리버셉트(aflibercept) 또는 집-아플리버셉트(ziv-aflibercept); 미국 특허 번호 7,087,411 및 7,279,159 참조)와 같은, TRAP 단백질이다. 다른 구현예에서, Fc-융합 단백질은 Fc 모이어티에 결합된 항체의 하나 이상의 항원 결합 도메인(들), 예컨대 가변 중쇄 단편 및 가변 경쇄 단편 중 하나 이상을 함유하는, ScFv-Fc-융합 단백질이다.
실시예
실시예 1:A4F 분석은 큰 이종 복합체를 함유하는 샘플에 대해 SEC 분획에 비해 더 우수한 분해능을 제공한다.
방법
SEC-MALLS 이동상 완충액
SEC-MALLS 분석을 위해, SEC 이동상 완충액의 조성은 10 mM 인산나트륨, 500 mM 염화나트륨, pH 7.0이었고, 사용 전에 여과(0.2 μm)하였다.
SEC-MALLS 분석
SEC-MALLS 시스템은 자외선(UV) 다이오드 어레이 검출기가 장착된 Agilent 1200 시리즈 HPLC 시스템과 결합된 Superose 6 GL 컬럼(10 mm x 300 mm; GE Healthcare, cat# 17-5172-01), Wyatt Technology miniDawn TREOS® 레이저 광 산란 기기(LS), 및 Optilab® T-rEX 시차 굴절계(RI) 검출기로 이루어진다. 검출기는 다음 순서로 직렬 연결하였다: UV-LS-RI. LS 및 RI 검출기는 Wyatt Technology에서 제공한 지침에 따라 검교정하였다.
정의된 양의 항-단백질X mAb를 재조합 단백질X와 각각 조합하고 pH 7.4의 1X DPBS에 희석하여 다음 몰비를 얻었다: 5 μM 항-단백질X mAb:1 μM 단백질X, 1 μM 항-단백질X mAb:1 μM 단백질X, 및 1 μM 항-단백질X mAb:5 μM 단백질X. 모든 샘플을 2시간 동안 상온에서 인큐베이션하고, 컬럼에 주입하기 전에 4
Figure pct00001
에서 미여과 상태로 유지시켰다. 컬럼은, 각 샘플의 주입 전에, 0.3 mL/분의 유속으로 이동상 완충액(10 mM 인산나트륨, 500 mM 염화나트륨, pH 7.0 ± 0.1)으로 미리 평형화하였다. 소 혈청 알부민(BSA; 2 mg/mL; 150 μg 샘플 로드)을 별도로 주입하고 시스템 적합성 대조군으로서 포함시켰다.
SEC-MALLS 이동상 완충액(10 mM 인산나트륨, 500 mM 염화나트륨, pH 7.0 ± 0.1)을 분획화 전체에 걸쳐 사용하였다. 각각의 샘플(100~200 μg)을 주입하고 0.3 mL/분의 유속으로 용리하였다. BSA는 동일한 매개변수 설정을 사용하여 분획화하였다.
A4F-MALLS 이동상 완충액
SEC-MALLS 분석을 위해, SEC 이동상 완충액의 조성은 10 mM 인산나트륨, 500 mM 염화나트륨, pH 7.0이었고, 사용 전에 여과(0.2 μm)하였다.
A4F-MALLS
A4F-MALLS 시스템은 자외선(UV) 다이오드 어레이 검출기가 장착된 Agilent 1200 Series HPLC 시스템에 결합된 Eclipse?? 3+ A4F 분리 시스템, Wyatt Technology Dawn HELEOS® II 레이저 광 산란 기기(LS), 및 Optilab® T-rEX 시차 굴절계(RI) 검출기로 이루어졌다. 검출기는 다음 순서로 직렬 연결하였다: UV-LS-RI. LS 및 RI 검출기는 Wyatt Technology에서 제공한 지침에 따라 검교정하였다.
정의된 양의 항-단백질X mAb를 재조합 단백질X와 각각 조합하고 pH 7.4의 1X DPBS에 희석하여 다음 몰비를 얻었다: 5 μM 항-단백질X mAb:1 μM 단백질X, 1 μM 항-단백질X mAb:1 μM 단백질X, 및 1 μM 항-단백질X mAb:5 μM 단백질X. 모든 샘플을 2시간 동안 주변 온도에서 인큐베이션하였고, W350 스페이서 호일(350 μm 스페이서 두께, 2.2 cm 스페이서 폭)이 피팅되고 10 kDa MWCO Nadir 재생 셀룰로오스 막을 사용하는 Eclipse?? 짧은 채널에 주입하기 전에 4℃에서 미여과 상태로 유지시켰다. 채널은, 각 샘플의 주입 전에, 이동상 완충액(10 mM 인산나트륨, 500 mM 염화나트륨, pH 7.0 ± 0.1)으로 미리 평형화하였다. 소 혈청 알부민(BSA; 2 mg/mL; 10 μg 샘플 로드)을 별도로 주입하고 시스템 적합성 대조군으로서 포함시켰다.
분획화 방법은 다음의 4단계로 구성하였다: 주입 단계, 집속 단계, 용리 단계, 및 채널 "세척" 단계. A4F-MALLS 이동상 완충액(10 mM 인산나트륨, 500 mM 염화나트륨, pH 7.0 ± 0.1)을 분획화 방법 전체에 걸쳐 사용하였다. 각각의 샘플(7 μg)을 1분 동안 0.2 mL/분의 유속으로 주입하고, 이어서 1.5 mL/분의 집속 유속으로 2분 동안 집속시켰다. 샘플을 45분 동안 3.0 mL/분에서 0 mL/분까지의 선형 구배 교차 흐름으로 1.0 mL/분의 채널 유속으로 용리하였다. 마지막으로, 교차 흐름을 0 mL/분으로 5분 동안 추가로 유지하여 채널을 세척하였다. BSA는 동일한 매개변수 설정을 사용하여 분획화하였다.
MALLS 데이터 분석
데이터는 ASTRA V 소프트웨어(버전 5.3.4.14, Wyatt Technology)를 사용하여 분석했다. 데이터르는, 과량의 산란 광을 용질 농도 및 중량-평균 몰 질량(Mw)에 상관시키는 다음 등식에 피팅하였다(Wyatt, 1993; Kendrick, 2001)
등식 1:
Figure pct00002
식 중, c는 용질 농도이고, R(?,c)는 산란 각도 및 농도의 함수로서 용질의 초과 레일리 비율이고, Mw는 몰 질량이고, P(?)는 산란된 광의 각도 의존성을 기술하며(회전 반경이 < 50 nm인 입자의 경우 약 1), A2는 삼투압 팽창 시의 제2 비리알 계수(측정이 희석 용액 상에서 수행되므로 무시할 수 있음), 및
등식 2:
Figure pct00003
식 중, no는 용매 굴절률을 나타내고, NA는 아보가드로 수이고, γ0은 진공에서의 입사광의 파장이고, dn/dc는 용질에 대한 특정 굴절률 증분을 나타낸다.
BSA 단량체의 몰 질량은 데이터 수집(시스템 적합성 확인) 중에 광 산란 검출기 및 시차 굴절률 검출기의 검교정 상수를 평가하는 데 사용하였다. UV 및 RI 검출기로 결정한 BSA의 평균 몰 질량의 상대 표준 편차(%RSD)는 ≤ 5.0%였다.
광 산란 검출기에 대한 정규화 계수, 검출기 간 지연 부피 및 및 밴드 확장 조건은 사용된 A4F-MALLS 조건에 대해 수집한 BSA 크로마토그램에서 계산하였다. 이들 값을 다른 모든 샘플에 대해 수집한 데이터 파일에 적용하여 이들 조건에 대해 보정하였다.
dn/dc 값과 215 nm 또는 280 nm에서의 소광 계수(당화에 대해 보정함)는 Astra 소프트웨어에 제공된 단백질 접합체 분석을 사용하여 실험적으로 결정하였다. 보정된 소광 계수 및 dn/dc 값을 사용하여 모든 단백질-단백질 복합체 샘플을 분석하였다.
결과
샘플의 SEC-MALLS 분석은 고차 복합체(용리 부피 = 8~14 mL)에 대해 부실한 분해능을 보였으며 중간 복합체의 경우 구별되지 않았다(도 3a, 표 1). 대조적으로, 샘플의 A4F-MALLS 분석은 고차 복합체(용리 시간 = 약 11~30분)에 대해 월등한 분해능을 보였으며 중간 복합체도 뚜렷하게 구별하였다(도 3b, 표 2).
[표 1] mAb:단백질 X 복합체에 대한 대략적인 몰 질량 및 보유 부피.
Figure pct00004
[표 2] mAb:단백질 X 복합체에 대한 대략적인 몰 질량 및 보유 시간.
Figure pct00005
실시예 2: 항-단백질 Y 복합체.
방법
A4F-MALLS 이동상 완충액
500 mL의 10X DPBS를 HPLC 등급수로 희석하여 1X DPBS, pH 7.4를 총 4.9 L의 부피로 제조하였다. 0.0025%(w/v) 아지드화 나트륨 용액을 항균제로서 첨가하였다. 최종 부피가 5.0 L가 될 때까지 염산(12 M)을 소량씩 증분하면서 서서히 첨가하여 pH를 7.4로 조정하였다. 마지막으로 측정된 완충액의 pH는 7.4였다. 완충액을 새로 제조하고, 사용 전에 여과(0.2 μm)하였다.
A4F MALLS 분석
정의된 양의 항-단백질 Y mAb(리드 A 및 리드 B)를 재조합 인간 단백질 Y와 각각 조합하고 1X DPBS, pH 7.4에서 희석하여 다음의 몰비를 얻었다: 1 μM 항-단백질 Y mAb:3 μM hActA, 1 μM 항-단백질 Y mAb:1 μM 단백질 Y, 및 3 μM 항-단백질 Y mAb:1 μM 단백질 Y. 모든 샘플을 2시간 동안 주변 온도에서 인큐베이션하고, 여과하지 않은 상태로 4℃에서 유지한 후, W490 스페이서 호일(490 μm 스페이서 두께, 2.2 cm 스페이서 폭)이 피팅되고 10 kDa MWCO Nadir 재생 셀룰로오스 막을 사용하는 Eclipse?? 짧은 채널 내에 주입하였다. 각 샘플을 주입하기 전에, 1X DPBS 완충액, pH 7.4로 채널을 미리 평형화시켰다. 소 혈청 알부민(BSA; 2 mg/mL; 10 μg 샘플 로드)을 별도로 주입하고 시스템 적합성 대조군으로서 포함시켰다.
분획화 방법은 다음의 4단계로 구성하였다: 주입 단계, 집속 단계, 용리 단계, 및 채널 "세척" 단계. A4F-MALLS 이동상 완충액(1X DPBS, pH 7.4)을 분획화 방법 전반에 걸쳐 사용하였다. 각각의 샘플(10 μg)을 1분 동안 0.2 mL/분의 유속으로 주입하고, 이어서 1.5 mL/분의 집속 유속으로 2분 동안 집속시켰다. 20분에 걸쳐 1.2 mL/분에서 0 mL/분까지의 선형 구배 교차 흐름을 이용해 1.0 mL/분의 채널 유속으로 샘플을 용리하였다. 마지막으로, 교차 흐름을 0 mL/분으로 5분 동안 추가로 유지시켜 채널을 세척하였다. BSA는 동일한 매개변수 설정을 사용하여 분획화하였다.
마우스 항-인간 항체 역가
mAb A 또는 mAb B 마우스 IgG의 검출에 특이적인 샌드위치 ELISA를 사용해 마우스 항-인간 항체(MAHA) 역가를 결정하였다. 요약하자면, 인산염-완충 식염수(PBS) 중 1 μg/mL의 mAb A 또는 mAb B를 4℃에서 밤새도록 마이크로역가 플레이트에 수동적으로 흡착시킨 후, PBS 중 5% 소 혈청 알부민(BSA)이 포함된 비특이적 결합 블록에 흡착시켰다. 혈청 샘플의 연속 희석물은 1:100에서 시작하는 희석 완충액(PBS 중 0.5% BSA) 중에서 제조하였다. 따라서, 상응하는 희석 인자(100)를 검정의 검출 하한(LOD)으로서 정의되었다. 그런 다음, 샘플을 mAb A 또는 mAb B가 코팅된 플레이트(100 μL/웰)에 첨가하고 4℃에서 16 내지 18시간 동안 인큐베이션하였다. 희석 완충액만 첨가한 웰을 포함시켜 배경 신호를 결정하였다. 이어서, 40 ng/mL의 서양고추냉이 과산화효소(HRP)-접합 항-마우스 Fcγ를 사용해 플레이트에 포획된 mAb A 또는 mAb B 특이적 MAHA를 검출하였다. 발생성 HRP-기질인 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘(TMB)을 사용해 HRP 활성을 검출하고; 검출된 450 nm에서의 광학 밀도(OD450)를 Perkin Elmer Victor X4 멀티모드 플레이트 판독기를 이용해 판독하였다. 결합 신호 대 희석 인자의 데이터는 GraphPad Prism 소프트웨어를 사용하여 비선형 회귀로 분석하고 역가를 계산했다. MAHA 역가는 검정의 배경 신호의 2배에 해당하는 결합 신호에 상응하는 혈청 샘플의 계산된 희석 인자로서 정의하였다.
결과
2개의 리드 mAb는 확연히 다른 복합체를 단백질 Y와 형성하였다. 시험된 모든 조건 하에서, mAb 리드-A는 mAb 리드-B에 비해 더 작고 덜 이질적인 복합체를 단백질 Y와 형성하였다(도 4a 내지 도 4c, 표 3 내지 표 5).
[표 3] mAb:단백질 Y 복합체에 대한 대략적인 몰 질량 및 보유 시간.
Figure pct00006
[표 4] mAb:단백질 Y 복합체에 대한 대략적인 몰 질량 및 보유 시간.
Figure pct00007
[표 5] mAb:단백질 Y 복합체에 대한 대략적인 몰 질량 및 보유 시간.
Figure pct00008
항-단백질 Y 복합체의 크기 및 이질성은 마우스 PK 관찰 결과와 많은 상관관계가 있었다(도 5a 내지 도 5b). 단백질 Y와 리드-B에 대해 관찰된 더 큰 복합체는 보다 빠른 제거율과 상관관계가 있었다(도 5b).
실시예 3: 항-인간 단백질 Z 복합체.
방법
샘플 제조
샘플을 1X DPBS, pH 7.4에서 제조하고, A4F-MALLS에 의한 총 단백질의 분획화 전에 실온에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 샘플은 다음과 같았다:
1 mM 항-단백질 Z mAb1 + 2차 mAb(0.5 μM + 0.5 μM) + 1 μM 보체 단백질 Z(7가지 조합); 또는 1 mM 항-단백질 Z mAb6 + 항-단백질 Z mAb7(0.5 μM + 0.5 μM) + 1 μM 보체 단백질 Z. 2차 항체 목록은 표 6에서 찾아볼 수 있다.
[표 6] 샘플 명명법.
Figure pct00009
A4F MALLS 분석
모든 샘플을 총 2시간 동안 주변 온도에서 인큐베이션하였고, W350 스페이서 호일(350 μm 스페이서 두께, 2.2 cm 스페이서 폭)이 피팅되고 4 kDa MWCO 친수성 PES (PESH) 막을 사용하는 Eclipse?? 짧은 채널에 주입하기 전에 4℃에서 미여과 상태로 유지시켰다. 채널은, 각 샘플의 주입 전에, 이동상 완충액(10 mM 인산나트륨, 500 mM 염화나트륨, pH 7.0 ± 0.1)으로 미리 평형화하였다. BSA(2 mg/mL; 10 μg 샘플 로드)를 별도로 주입하고 시스템 적합성 대조군으로서 포함시켰다.
분획화 방법은 다음의 4단계로 구성하였다: 주입 단계, 집속 단계, 용리 단계, 및 채널 "세척" 단계. A4F-MALLS 이동상 완충액(10 mM 인산나트륨, 500 mM 염화나트륨, pH 7.0 ± 0.1)을 분획화 방법 전체에 걸쳐 사용하였다. 각각의 샘플(7 μg 복합체 또는 4 μg 개발 성분)을 5분 동안 0.2 mL/분의 유속으로 주입하고, 1 mL/분의 집속 유속으로 5분 동안 집속시켰다. 샘플을 45분 동안 2 mL/분에서 0 mL/분까지의 선형 구배 교차 흐름으로 1 mL/분의 채널 유속으로 용리하였다. 마지막으로, 교차 흐름을 0 mL/분으로 5분 동안 추가로 유지하여 채널을 세척하였다. BSA는 동일한 매개변수 설정을 사용하여 분획화하였다.
RBC 용혈 검정
토끼 적혈구(RbRBC)의 용해를 차단하는 항-단백질 Z mAb의 능력을 평가하기 위해 보체 활성화의 척도로서 대체 경로(AP) 용혈 분석을 사용했다. 막 공격 복합체에 의한 토끼 적혈구 용해는 보체 활성화를 실험적으로 측정하는 분석의 기초이다.
원하는 수의 RbRBC를 GVB-Mg2+/EGTA 완충액에서 세척하고 2x108 세포/ml로 재현탁시켰다. 하나의 항-C5 mAb 또는 항-C5 mAb 조합의 효능을 시험하기 위해, 정상 인간 혈청을 GVB-Mg2+/EGTA 완충액에서 50~96%로 희석하여, RBC에 첨가할 때의 최종 농도 25~48%를 달성했다. 용혈 활성을 측정하기 위해 둥근 바닥 96 웰 플레이트를 사용했다. 총 100 μL의 RbRBC(2x108 세포/ml)를 37℃에서 96-웰 플레이트에 도말한 후, 100 μL의 희석된 혈청을 첨가하였다. 세포를 부드럽게 혼합하고 37℃에서 30~120분 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 시간이 지난 후, 세포를 4℃에서 1250xg로 원심분리하였다. 총 100 μL의 상청액을 새로운 96-웰 편평 바닥 플레이트에 옮기고 Spectramax 마이크로플레이트 판독기를 이용해 412 nm에서 판독하였다. 용혈 백분율 계산은 아래 기술된 바와 같이 실시했다.
용혈 백분율은 다음의 등식을 사용하여 흡광도 값으로 계산하였다:
등식 3:
Figure pct00010
이 등식에서 "배경 세포 용해"는 무혈청 GVB-Mg2+/EGTA 완충액으로만 배양한 세포의 A412nm에서의 OD이다. "최대 세포 용해"는 물로 처리된 세포의 A412 nm에서의 OD이다. 최대 용해 억제는 곡선에서 최고 값과 최저 값 간의 차이로서 계산하고, 최고 값에 대한 백분율로서 표현하였다. 자료는 평균 + 평균 표준 오차로서 표시하였다.
결과
COMP1 mAb 또는 다른 단백질 Z mAb와 조합된 항-단백질 Z mAb1(리드 항-단백질 Z mAb)은, 토끼 RBC 용혈을 완전히 차단하지 않는 단일요법(도 6a, 표 7)과 비교해, 대체 경로 활성화를 통해 용혈을 완전히 차단한다(도 6b, 표 8). 항-단백질 Z mAb1:항-단백질 Z mAb 조합 모두가 토끼 RBC의 용혈을 완전히 차단했기 때문에, 면역원성 및/또는 표적 매개 제거와 같이 약물 개발 동안 mAb의 약동학(PK)에 대한 통찰력을 제공할 수 있는, 복합체 형성에 있어서의 차이, 예컨대 크기, 형상 및 배향과 같은 차이가 있는지 밝혀내는 것이 중요했다.
[표 7] 항-단백질 Z 항체가 토끼 RBC 용혈에 미치는 영향.
Figure pct00011
[표 8] 항-단백질 Z 항체 조합이 토끼 RBC 용혈에 미치는 영향.
Figure pct00012
이차 mAb가 없는 경우, 항-단백질 Z mAb1과 단백질 Z는, 이들이 등몰 량으로 혼합될 때 정준 1:1 및 1:2 복합체를 형성하였다(도 7, 표 9).
[표 9] mAb:단백질 Z 복합체에 대한 대략적인 몰 질량 및 보유 시간.
Figure pct00013
항-단백질 Z mAb1과 대부분의 이차 mAb의 조합은 더 작고 잘 정의된 복합체에 유리했는데, 이는 헤테로머 2:2 mAb:단백질 Z 복합체와 일치한다(도 8 및 9 및 표 10 내지 12).
[표 10] mAb:단백질 Z 복합체의 몰 질량.
Figure pct00014
[표 11] mAb:단백질 Z 복합체에 대한 대략적인 몰 질량 및 보유 시간.
Figure pct00015
[표 12] mAb:단백질 Z 복합체에 대한 대략적인 몰 질량 및 보유 시간.
Figure pct00016
항-단백질 Z mAb1/항-단백질 Z mAb3 조합이 단백질 Z와 유사한 크기의 복합체를 형성하였지만, 용리 시간/프로파일의 차이는, 형성된 복합체가 다른 조합과 비교해 형상/배향에서 차이가 있음을 시사한다(도 9). 항-단백질 Z mAb1과 항-단백질 Z mAb2 및 COMP1 mAb와의 조합은 "페이퍼-돌링"을 나타내는 단백질 Z와의 더 크고 더 이질적인 복합체에 유리하였다(도 10, 표 13).
[표 13] mAb:단백질 Z 복합체에 대한 대략적인 몰 질량 및 보유 시간.
Figure pct00017
항-단백질 Z mAb1과 항-단백질 Z mAb4의 조합의 단백질 Z와의 헤테로모 복합체를 형성하는 경향의 감소를 나타냈다(도 11, 표 14). 유리 mAb 및 1:1 mAb:단백질 Z 종의 존재는 단백질 Z와의 헤테로머 복합체 형성이 불완전함을 나타낸다. 단백질 Z와의 호모머 및 헤테로머 복합체의 혼합물에서도 명백하였다.
[표 14] mAb:단백질 Z 복합체에 대한 대략적인 몰 질량 및 보유 시간.
Figure pct00018
실시예 4: 첨가 순서는 항-단백질 Z mAb1, COMP1 mAb 및 단백질 Z 사이에 형성된 복합체의 몰 질량 및 분포에 유의한 영향을 미치지 않는다.
방법
첨가 순서가 복합체 형성에 영향을 미치는지 여부를 결정하기 위해, COMP1 mAb 및 단백질 Z의 등몰 조합을 1X DPBS, pH 7.4에서 제조하여 1 μM COMP1 mAb:1 μM 단백질 Z의 몰비를 얻고, 1시간 동안 주위 온도에서 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 다양한 양의 항-단백질 Z mAb1을 미리 형성된 COMP1 mAb:단백질 Z 복합체에 첨가하고, pH 7.4의 1X DPBS에서 희석하여 다음 몰비를 수득하고, 기기 상에 주입하기 전에 1시간 동안 추가로 인큐베이션 하였다: 0.3 μM 항-단백질 Z mAb1: 1 μM COMP1 mAb: 1 μM 단백질 Z, 1 μM 항-단백질 Z mAb1: 1 μM COMP1 mAb: 1 μM 단백질 Z, 및 3 μM 항-단백질 Z mAb1: 1 μM COMP1 mAb: 1 μM 단백질 Z. 실시예 3의 A4F MALLS 분석 방법을 따랐다.
결과
다른 성분에 항-단백질 Z mAb1을 동시에 첨가하였는지(도 12a, 표 15) 또는 순차적으로 첨가하였는지(도 12b, 표 15) 여부와 상관없이, 몰 질량 및 분포에 있어서 유사한 복합체가 항-단백질 Z mAb1, COMP1 mAb, 및 단백질 Z 사이에 형성되었다. 두 가지 데이터세트 간에는 관찰된 용리 시간에 있어서 약간의 변화가 있지만, 이는 방법 고유의 변동성을 나타내며 비정상적인 것으로 간주되지는 않는다.
[표 15] mAb:단백질 Z 복합체에 대한 대략적인 몰 질량 및 보유 시간.
Figure pct00019
실시예 5: 항-단백질 W 복합체.
방법
A4F-MALLS 이동상 완충액
1.4 g의 일염기성 인산나트륨 1수화물, 10.7 g의 이염기성 인산나트륨 7수화물, 및 500 mL의 5 M 염화나트륨을 조합하여 이동상 완충액(10 mM 인산나트륨, 500 mM 염화나트륨, pH 7.0 ± 0.1)을 제조한 다음; HPLC 등급수로 이 용액을 5.0 L의 부피로 만들었다. 완충액의 최종 측정 pH는 7.0이었다. 사용 전에 이동상 완충액을 여과하였다(0.2 μm).
A4F MALLS 분석
A4F-MALLS 시스템은 자외선(UV) 다이오드 어레이 검출기가 장착된 Agilent 1200 Series HPLC 시스템에 결합된 Eclipse?? 3+ A4F 분리 시스템, Wyatt Technology Dawn HELEOS® II 레이저 광 산란 기기(LS), 및 Optilab® T-rEX 시차 굴절계(RI) 검출기로 이루어졌다. 검출기는 다음 순서로 직렬 연결하였다: UV-LS-RI. LS 및 RI 검출기는 Wyatt Technology에서 제공한 지침에 따라 검교정하였다.
항-단백질 W mAb의 정의된 양들을 각각 단백질 W와 조합하고, 1X DPBS, pH 7.4에서 희석하여 다음의 등몰비를 얻었다: 1 μM 항-단백질 W mAb:1 μM 단백질 W. 모든 샘플을 2시간 동안 주위 온도에서 인큐베이션하고, W350 스페이서 호일(350 μm 스페이서 두께, 2.2 cm 스페이서 폭)이 피팅되고 10 kDa MWCO 재생 셀룰로오스 막을 사용하는 Eclipse?? 짧은 채널에 주입하기 전에, 4℃에서 미여과 상태로 유지시켰다. 채널은, 각 샘플의 주입 전에, 이동상 완충액(10 mM 인산나트륨, 500 mM 염화나트륨, pH 7.0 ± 0.1)으로 미리 평형화하였다. 소 혈청 알부민(BSA; 2 mg/mL; 10 μg 샘플 로드)을 별도로 주입하고 시스템 적합성 대조군으로서 포함시켰다.
분획화 방법은 다음의 4단계로 구성하였다: 주입 단계, 집속 단계, 용리 단계, 및 채널 "세척" 단계. A4F-MALLS 이동상 완충액(10 mM 인산나트륨, 500 mM 염화나트륨, pH 7.0 ± 0.1)을 분획화 방법 전체에 걸쳐 사용하였다. 각각의 샘플(7 μg)을 1분 동안 0.2 mL/분의 유속으로 주입하고, 이어서 1.0 mL/분의 집속 유속으로 3분 동안 집속시켰다. 샘플을 25분 동안 3.0 mL/분에서 0 mL/분까지의 선형 구배 교차 흐름으로 1.0 mL/분의 채널 유속으로 용리하였다. 마지막으로, 교차 흐름을 0 mL/분으로 5분 동안 추가로 유지하여 채널을 세척하였다. BSA는 동일한 매개변수 설정을 사용하여 분획화하였다.
결과:
A4F-MALLS를 사용하여 이량체 다중 도메인 리간드인 단백질 W와 리간드 내의 상이한 도메인에 특이적으로 결합하는 여러 가지 항-단백질 W 항체 사이에 형성된 복합체의 상대 크기 분포를 평가하였다. 단백질 W와의 잠재적 항체 복합체의 이론적 몰 질량 및 예측 화학량론은 표 16에 제시되어 있다.
[표 16] mAb:단백질 W 복합체의 이론적 몰 질량.
Figure pct00020
전반적으로, mAb의 패널 중에서, 도메인 A를 표적으로 하는 mAb1은 등몰비로 조합했을 때 단백질 W와의 이산된 1:1 및 2:2 복합체를 나타내는 우세한 종과 함께 가장 높은 비율의 저차 복합체를 형성하였다(피크 2, 약 289 kDa; 및 피크 3, 약 562 kDa, 도 13, 표 17).
[표 17] 도메인 A를 표적화하는 mAb1과 인간 단백질 W의 복합체의 몰 질량 및 보유 시간.
Figure pct00021
도메인 B를 표적으로 하는 항체(mAb2, mAb3 및 COMP1)의 각각은 단백질 W와 이산된 2:2 복합체를 주로 형성하였고(피크 3, 약 563~580 kDa, 도 14, 표 18), mAb2 및 COMP1은 시험된 다른 mAb들에 비해 가장 균질한 분포의 복합체를 형성하였다. 도메인 A를 표적으로 하는 COMP2는 주로 단백질 W와 1:2 및 2:2 복합체의 혼합물에 유리하였지만(피크 3, 약 550 kDa, 도 15, 표 19), 중간 정도의 큰 이종 복합체도 관찰되었다. 이는, 도메인 A를 또한 표적으로 한 mAb1과는 달리, COMP2가 단백질W 상의 고유한 에피토프에 결합하여, "페이퍼-돌링"이라고 불리는 프로세스에서, 연장된 항체-항원 격자를 형성할 수 있음을 시사한다. 본 샘플에서는, 약 835 kDa의 몰 질량을 갖는 뚜렷한 피크(피크 4)에 이어서 약 1000~1900 kDa 범위의 넓은 몰 질량 분포를 갖는 일련의 넓고, 잘 분해되지 않은 종(피크 5)이 관찰되었다(도 15, 표 19).
[표 18] 도메인 B를 표적으로 하는 mAb와 인간 단백질 W의 복합체의 몰 질량 및 보유 시간.
Figure pct00022
[표 19] 도메인 A를 표적으로 하는 COMP2를 갖는 인간 단백질 W 복합체의 몰 질량 및 보유 시간.
Figure pct00023
개별 성분의 계산된 몰 질량에 기초하여, 피크 4는 단백질 W의 2~3개의 분자를 조절하는 적어도 3개의 mAb 분자를 함유하는 복합체를 나타낼 가능성이 높은 반면, 피크 5는 단백질 W의 4개 이상의 분자를 조절하는 3개 이상의 mAb 분자로 구성된 고차 헤테로머 복합체의 이질적 분포에 상응한다(표 18). 대조적으로, 도메인 C를 표적으로 하는 mAb(mAb4 및 COMP3)는 mAb4와 함께 넓은 분포의 큰 이종 복합체(약 700~8000 kDa 범위의 몰 질량)를 형성하여, 시험된 mAb의 패널 중에서 가장 광범위한 "페이퍼-돌링"을 나타냈다(도 16, 표 20).
[표 20] 도메인 C를 표적으로 하는 mAb를 갖는 인간 단백질 W 복합체의 몰 질량 및 체류 시간.
Figure pct00024
전술한 명세서에서 본 발명을 특정 실시예들에 관하여 설명하였으며, 많은 세부사항이 예시를 위해 제시되었지만, 본 발명이 추가적인 실시예에 영향을 받기 쉬우며 본원에서 설명된 소정의 세부사항들이 본 발명의 기본 원칙을 벗어나지 않으면서 상당히 변화될 수 있다는 것이 당업자에게 명백할 것이다.
본원에 인용된 모든 참고문헌은 그 전체가 참고로 인용된다. 본 발명은 사상 또는 그의 필수 속성으로부터 벗어나지 않고 다른 특정 형태로 구현될 수 있으며, 이에 따라, 본 발명의 범위를 나타내는 것으로서, 전술한 명세서 보다는, 첨부된 청구범위를 참조하여야 한다.

Claims (11)

  1. 샘플 내의 단백질 복합체의 화학량론 및 크기 분포를 평가하기 위한 방법으로서, 상기 방법은:
    비대칭 유동장 유동 분획화(A4F)에 의해 샘플을 분획화하는 단계; 및
    다각도 레이저 광 산란(MALLS)을 사용해 샘플 내의 단백질 복합체의 몰 질량, 화학량론, 및 크기 분포를 결정하는 단계를 포함하되, 이종 복합체는 이종 항체:리간드 복합체 또는 이종 융합 단백질:리간드 복합체로 구성되는, 방법.
  2. 제1항에 있어서, 리간드는 가용성 리간드인, 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 항체는 단클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편인, 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 이중특이적 항체 또는 이의 항원 결합 단편인, 방법.
  5. 리드 단백질 약물 생성물을 선택하기 위한 방법으로서, 상기 방법은:
    제1 단백질 약물 생성물을 제1 단백질 약물 생성물의 표적을 포함하는 제1 샘플에 첨가하여 이종 단백질:리간드 복합체를 생성하는 단계;
    제2 단백질 약물 생성물을 동일한 표적을 함유하는 제2 샘플에 첨가하여 단백질:리간드 복합체를 형성하는 단계;
    비대칭 유동장 유동 분획화 - 다각도 레이저 광 산란을 사용해 이종 단백질:리간드 복합체를 분리하고 이종 단백질:리간드 복합체의 크기 분포 및 화학량론을 결정하는 단계; 및
    더 적은 수의 단백질:리간드 복합체를 형성하는 단백질 약물 생성물을 리드 표적 단백질 약물로서 선택하는 단계를 포함하는, 방법.
  6. 제5항에 있어서, 선택된 단백질 약물 생성물은 3:2, 2:3, 4:4, 6:6, 또는 [2:2]n의 단백질 약물 생성물 대 리간드 비를 갖는 더 적은 단백질 약물 생성물을 형성하는, 방법.
  7. 제5항 또는 제6항에 있어서, 리간드는 가용성 리간드인, 방법.
  8. 제5항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질 약물 생성물은 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 융합 단백질, 또는 재조합 단백질인, 방법.
  9. 제5항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 선택된 단백질 약물 생성물은 1:0, 0:1,1:1, 1:2 및 2:1로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질 약물 생성물 대 리간드 비를 갖는 단백질 약물 생성물을 형성하는, 방법.
  10. 제5항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따라 선택된 리드 단백질 약물 생성물을 포함하는 약학적 조성물.
  11. 단백질 약물 생성물과 이의 리간드 사이에 형성된 단백질 복합체를 특성화하기 위한 방법으로서, 상기 방법은:
    단백질 약물 생성물 및 이의 리간드를 용액 중에서 조합하여 단백질 약물 생성물:리간드 복합체를 포함하는 샘플을 형성하는 단계;
    비대칭 유동장 유동 분획화를 사용해 샘플을 분획화하는 단계; 및
    분획화된 단백질 약물 생성물:리간드 복합체를 대상으로 다각도 레이저 광 산란을 수행하여 단백질 약물 생성물:리간드 복합체의 화학량론 및 크기를 특성화하는 단계를 포함하는, 방법.
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