JP2012525851A - 脂質輸送代謝遺伝子に対する天然アンチセンス転写物の抑制による脂質輸送代謝遺伝子関連疾患の治療 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、それぞれ参照によりその全体が本明細書に組み込まれる2009年5月6日出願米国仮特許出願第61/175,930号、2009年5月7日出願米国仮特許出願第61/176,267号、2009年5月22日出願米国仮特許出願第61/180,646号、2009年10月2日出願米国仮特許出願第61/248,212号および2009年8月19日出願米国仮特許出願第61/235,227号の優先権を主張する。
本明細書において使用される専門用語は、特定の実施形態を記載する目的のためだけであり、本発明の限定となることを意図しない。本明細書において使用される単数形「a」、「an」および「the」は、文脈がそうでないと明確に示さなければ複数形を同様に含んで意味する。さらに用語「含んでいる(including)」、「含む(include)」、「有している(having)」、「有する(has)」、「有する(with)」またはそれらの変形は、詳細な記載および/または特許請求の範囲のいずれにおいても使用され、そのような用語は用語「含む(comprising)」と同様の様式で包括的であることを意図する。
標的
一実施形態において、標的は、脂質輸送代謝遺伝子に関連するセンスおよび/またはアンチセンスの非コードおよび/またはコード配列が含まれるがそれらに限定されない脂質輸送代謝遺伝子の核酸配列を含む。
重鎖形成領域)は、ワトソン-クリック様に塩基対形成する相補的RNA鎖である。
飾は、De Mesmaekerら(1995)、Acc. Chem. Res.、28:366〜374に見出すことができる。
外来性核酸の宿主細胞または生体への輸送は、細胞中または生体中の核酸を直接検出するステップによって評価されうる。そのような検出は、当技術分野において周知のいくつかの方法によって達成されうる。例えば、外来性核酸の存在は、サザンブロットまたは核酸に関連するヌクレオチド配列を特異的に増幅するプライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応(PCR)技術によって検出されうる。外来性核酸の発現も遺伝子発現分析を含む従来法を使用して測定されうる。例えば外来性核酸から産生されるmRNAはノーザンブロットおよび逆転写PCR(RT-PCR)を使用して検出および定量されうる。
本発明の化合物は、診断、治療および予防のためにならびに研究用試薬およびキットの構成要素として利用されうる。さらに、精緻な特異性を有して遺伝子発現を抑制できるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、当業者によって特定の遺伝子の機能を解明するため、または生物学的経路の種々のメンバー間の機能を区別するためにしばしば使用される。
本発明のオリゴヌクレオチドの他の修飾は、オリゴヌクレオチドの活性、細胞分布または細胞への取込みを増強する1つまたは複数の成分または複合体のオリゴヌクレオチドへの化学的連結を含む。これらの成分または複合体は、1級または2級ヒドロキシル基などの官能基に共有結合した複合基を含みうる。本発明の複合基は、干渉物質、レポーター分子、ポリアミン、ポリアミド、ポリエチレングリコール、ポリエーテル、オリゴマーの薬力学特性を増強する基、およびオリゴマーの薬物動態特性を増強する基を含む。典型的な複合基は、コレステロール、脂質、リン脂質、ビオチン、フェナジン、葉酸、フェナントリジン、アントラキノン、アクリジン、フルオレセイン、ローダミン、クマリン、および色素を含む。本発明の文脈において薬力学特性を増強する基は、取込みを改善し、分解への耐性を増強し、および/または標的核酸との配列特異的ハイブリダイゼーションを強化する基を含む。本発明の文脈において薬物動態特性を増強する基は、本発明の化合物の取込み、分布、代謝または排出を改善する基を含む。代表的複合基は、参照により本明細書に組み込まれる1992年10月23日出願の国際特許出願PCT/US92/09196および米国特許第6,287,860号において開示されている。複合体成分は、これだけに限らないがコレステロール成分、コール酸、チオエーテル、例えばヘキシル-S-トリチルチオール、チオコレステロール、脂肪族鎖、例えばドデカンジオールまたはウンデシル残基、リン脂質、例えばジ-ヘキサデシル-rac-グリセロールまたはトリエチルアンモニウム1,2-ジ-O-ヘキサデシル-rac-グリセロ-3-H-ホスホネート、ポリアミンまたはポリエチレングリコール鎖、あるいはアダマンタン酢酸、パルミチル成分、またはオクタデシルアミンもしくはヘキシルアミノ-カルボニル-オキシコレステロール成分などの脂質成分を含む。本発明のオリゴヌクレオチドは、活性原薬、例えばアスピリン、ワルファリン、フェニルブタゾン、イブプロフェン、スプロフェン、フェンブフェン、ケトプロフェン、(S)-(+)-プラノプロフェン、カプロフェン、ダンシルサルコシン、2,3,5-トリヨード安息香酸、フルフェナム酸、フォリン酸、ベンゾチアジアジド、クロロチアジド、ジアセピン、インドメチシン、バルビツール酸、セファ
ロスポリン、サルファ剤、抗糖尿病薬、抗菌剤または抗生物質とも複合体化されうる。
本発明の化合物は、取込み、分布および/または吸収の補助のために、例えばリポソーム、受容体-標的分子、経口、直腸、局所または他の製剤として、他の分子、分子構造または化合物と、混合物と混合、封入、複合体化または他の方法で付随されうる。そのような取込み、分布および/または吸収を補助する製剤の調製を説明する代表的米国特許は、これだけに限らないが、それぞれが本明細書に参照として組み込まれる米国特許5,108,921;5,354,844;5,416,016;5,459,127;5,521,291;5,543,165;5,547,932;5,583,020;5,591,721;4,426,330;4,534,899;5,013,556;5,108,921;5,213,804;5,227,170;5,264,221;5,356,633;5,395,619;5,416,016;5,417,978;5,462,854;5,469,854;5,512,295;5,527,528;5,534,259;5,543,152;5,556,948;5,580,575;および5,595,756を含む。
物は、一緒にまたは連続的に使用されうる。
治療用組成物の処方およびそれらの続く投与(投薬)は、当業者の技能の範囲内であると考えられる。投薬は、数日間から数カ月間続くまたは治療が効果的になるもしくは病態の減退が達成されるまでの治療過程において、治療される病態の重症度および応答性に依存する。最適な投薬計画は、患者身体での薬剤蓄積の測定から算出されうる。当業者は、最適投与量、投薬方法および繰り返し率(repetition rate)を容易に決定できる。最適な投与量は、個々のオリゴヌクレオチドの相対的効力に応じて変動する場合があり、一般にin vitroおよびin vivo動物モデルにおいて効果的であると見出されたEC50sに基づいて概算されうる。一般に投与量は、体重1kgあたり0.01μg〜100gであり、1日に、1週間に、1カ月にもしくは1年に1回もしくは複数回またはさらに2〜20年ごとに1回である場合がある。当業者は、測定された滞留時間および体液または組織における薬剤の濃度に基づいて投薬についての繰り返し率を容易に概算できる。治療の成功に続いて、病態の再発を予防するために患者に維持療法を受けさせることが望ましい場合があり、ここでオリゴヌクレオチドは維持投与において体重1kgあたり0.01μg〜100g、1日1回または複数回から20年ごとに1回の範囲で投与される。
以下の非限定的実施例は、本発明の選択された実施形態を例示するために利用できる。示される構成要素の割合における変動および構成要素における代替は当業者に明らかであり、本発明の実施形態の範囲内であることは理解される。
脂質輸送代謝遺伝子ポリヌクレオチドのアンチセンス鎖および/またはセンス鎖核酸分子に特異的なアンチセンスオリゴヌクレオチドの設計
上に示すとおり用語「に特異的なオリゴヌクレオチド」または「オリゴヌクレオチド標的」は、(i)標的遺伝子の一部分と安定な複合体を形成できる配列、または(ii)標的遺伝子のmRNA転写物の一部分と安定な2重鎖を形成できる配列を有するオリゴヌクレオチドを意味する。
脂質輸送代謝遺伝子ポリヌクレオチドの調節
Albert Einstein-Montefiore Cancer Center, NYから得た518A2細胞を増殖培地(MEM/EBSS (Hyclone cat #SH30024またはMediatech cat # MT-10-010-CV) +10% FBS (Mediatech cat# MT35-011-CV)+ペニシリン/ストレプトマイシン(Mediatech cat# MT30-002-CI))中、37℃、5% CO2で増殖させた。実験前日に、細胞を1mlあたり1.5×105個の密度で6ウエルプレートに再播種し、37℃、5% CO2でインキュベートした。実験当日に6ウエルプレートの培地を新鮮増殖培地に交換した。全てのアンチセンスオリゴヌクレオチドを濃度20μMに希釈した。この溶液2μlをOpti-MEM培地(Gibco cat#31985-070) 400μlおよびLipofectamine 2000 (Invitrogen cat# 11668019) 4μlと室温で20分間インキュベートし、518A2細胞を含む6ウエルプレートの各ウエルに添加した。オリゴヌクレオチド溶液の代わりに水2μlを含む同様の混合物を偽形質移入対照用に使用した。37℃、5% CO2での3〜18時間のインキュベーション後、培地を新鮮増殖培地に交換した。アンチセンスオリゴヌクレオチドの添加の48時間後、培地を除去し、RNAを細胞からPromegaからのSV Total RNA Isolation System (cat # Z3105)またはQiagenからのRNeasy Total RNA Isolationキット(cat# 74181)を製造者の手順書に従って使用して抽出した。RNA 600ngをThermo ScientificからのVerso cDNAキット(cat#AB1453B)またはHigh Capacity cDNA Reverse Transcriptionキットcat# 4368813)を製造者の手順書に記載のとおり使用して実施した逆転写反応に加えた。この逆転写反応からのcDNAをABI Taqman Gene Expression Mix (cat#4369510)およびABI (Applied Biosystems Inc.、Foster City CAによるApplied Biosystems Taqman Gene Expression Assay)によって設計されたプライマー/プローブを使用するリアルタイムPCRによって遺伝子発現をモニターするために使用した。以下のPCRサイクルを使用した: 50℃で2分間、95℃で10分間、(95℃で15秒間、60℃で1分間)を40サイクル、StepOne Plus Real Time PCR Machine (Applied Biosystems)を使用。
リアルタイムPCR結果は、518A2細胞中のABCA1 mRNAのレベルが、ABCA1アンチセンスAK311445に対して設計されたsiRNAのうちの1つでの処置の48時間後に有意に増加していることを示す(図1A)。
ATCC (cat# CRL-1658)由来の3T3細胞を増殖培地(MEM/EBSS (Hyclone cat #SH30024またはMediatech cat # MT-10-010-CV) +10% FBS (Mediatech cat# MT35-011-CV)+ペニシリン/ストレプトマイシン(Mediatech cat# MT30-002-CI))中、37℃、5% CO2で増殖させた。実験前日に、細胞を1mlあたり1.5×105個の密度で6ウエルプレートに再播種し、37℃、5% CO2でインキュベートした。実験当日に6ウエルプレートの培地を新鮮増殖培地に交換した。全てのアンチセンスオリゴヌクレオチドを濃度20μMに希釈した。この溶液2μlをOpti-MEM培地(Gibco cat#31985-070) 400μlおよびLipofectamine 2000 (Invitrogen cat# 11668019) 4μlと室温で20分間インキュベートし、3T3細胞を含む6ウエルプレートの各ウエルに添加した。オリゴヌクレオチド溶液の代わりに水2μlを含む同様の混合物を偽形質移入対照用に使用した。37℃、5% CO2での3〜18時間のインキュベーション後、培地を新鮮増殖培地に交換した。アンチセンスオリゴヌクレオチドの添加の48時間後、培地を除去し、RNAを細胞からPromegaからのSV Total RNA Isolation System (cat # Z3105)またはQiagenからのRNeasy Total RNA Isolationキット(cat# 74181)を製造者の手順書に従って使用して抽出した。RNA 600ngをThermo ScientificからのVerso cDNAキット(cat#AB1453B)またはHigh Capacity cDNA Reverse Transcriptionキットcat# 4368813)を製造者の手順書に記載のとおり使用して実施した逆転写反応に加えた。この逆転写反応からのcDNAをABI Taqman Gene Expression Mix (cat#4369510)およびABI (Applied Biosystems Inc.、Foster City CAによるApplied Biosystems Taqman Gene Expression Assay)によって設計されたプライマー/プローブを使用するリアルタイムPCRによって遺伝子発現をモニターするために使用した。以下のPCRサイクルを使用した: 50℃で2分間、95℃で10分間、(95℃で15秒間、60℃で1分間)を40サイクル、StepOne Plus Real Time PCR Machine (Applied Biosystems)を使用。
リアルタイムPCR結果は、3T3細胞中のABCA1 mRNAのレベルが、マウスABCA1アンチセンスBF133827に対して設計されたオリゴのうちの3つでの処置の48時間後に有意に増加していることを示す(図1C)。
アンチセンスオリゴヌクレオチドでのHepG2細胞の処置
ATCC (cat# HB-8065)由来のHepG2細胞を増殖培地(MEM/EBSS (Hyclone cat #SH30024またはMediatech cat # MT-10-010-CV) +10% FBS (Mediatech cat# MT35-011-CV)+ペニシリン/ストレプトマイシン(Mediatech cat# MT30-002-CI))中、37℃、5% CO2で増殖させた。実験前日に、細胞を1mlあたり0.5×104個の密度で6ウエルプレートに再播種し、37℃、5% CO2でインキュベートした。実験当日に6ウエルプレートの培地を1ウエルあたり1.5mlの新鮮増殖培地で置換した。全てのアンチセンスオリゴヌクレオチドを水で濃度20μMまで希釈した。この溶液2μlを新鮮増殖培地400μlと混合し、HepG2細胞を含む6ウエルプレートの各ウエルに添加した。オリゴヌクレオチド溶液の代わりに水2μlを含む同様の混合物を偽処置対照用に使用した。37℃、5% CO2での3〜18時間のインキュベーション後、培地を新鮮増殖培地に交換した。アンチセンスオリゴヌクレオチドの添加の72時間後、細胞に上に記載のとおり再投薬した。2回目の投薬の48〜72時間後、培地を除去し、RNAを細胞からPromegaからのSV Total RNA Isolation System (cat # Z3105)またはQiagenからのRNeasy Total RNA Isolation kit (cat# 74181)を製造者の手順書に従って使用して抽出した。RNA 600ngをThermo ScientificからのVerso cDNAキット(cat#AB1453B)を製造者の手順書に記載のとおり使用して実施した逆転写反応に加えた。この逆転写反応からのcDNAをABI Taqman Gene Expression Mix (cat#4369510)およびABI (Applied Biosystems Inc.、Foster City CA)によって設計されたプライマー/プローブを使用するリアルタイムPCRによって遺伝子発現をモニターするために使用した。以下のPCRサイクルを使用した: 50℃で2分間、95℃で10分間、(95℃で15秒間、60℃で1分間)を40サイクル、Mx4000 thermal cycler (Stratagene)を使用。アンチセンスオリゴヌクレオチドでの処置後の遺伝子発現における倍数変化を処置試料と偽処置試料との間での18S-標準化dCt値の差に基づいて算出した。
ATCC (cat# HB-8065)由来のHepG2細胞を増殖培地(MEM/EBSS (Hyclone cat #SH30024またはMediatech cat # MT-10-010-CV) +10% FBS (Mediatech cat# MT35-011-CV)+ペニシリン/ストレプトマイシン(Mediatech cat# MT30-002-CI))中、37℃、5% CO2で増殖させた。実験前日に、細胞を1mlあたり1.5×105個の密度で6ウエルプレートに再播種し、37℃、5% CO2でインキュベートした。実験当日に6ウエルプレートの培地を新鮮増殖培地に交換した。全てのアンチセンスオリゴヌクレオチドを濃度20μMに希釈した。この溶液2μlをOpti-MEM培地(Gibco cat#31985-070) 400μlおよびLipofectamine 2000 (Invitrogen cat# 11668019) 4μlと室温で20分間インキュベートし、HepG2細胞を含む6ウエルプレートの各ウエルに添加した。オリゴヌクレオチド溶液の代わりに水2μlを含む同様の混合物を偽形質移入対照用に使用した。37℃、5% CO2での3〜18時間のインキュベーション後、培地を新鮮増殖培地に交換した。アンチセンスオリゴヌクレオチドの添加の48時間後、培地を除去し、RNAを細胞からPromegaからのSV Total RNA Isolation System (cat # Z3105)またはQiagenからのRNeasy Total RNA Isolation kit (cat# 74181)を製造者の手順書に従って使用して抽出した。
RNA 600ngをThermo ScientificからのVerso cDNAキット(cat#AB1453B)を製造者の手順書に記載のとおり使用して実施した逆転写反応に加えた。この逆転写反応からのcDNAをABI Taqman Gene Expression Mix (cat#4369510)およびABI (Applied Biosystems Inc.、Foster City CA)によって設計されたプライマー/プローブを使用するリアルタイムPCRによって遺伝子発現をモニターするために使用した。以下のPCRサイクルを使用した: 50℃で2分間、95℃で10分間、(95℃で15秒間、60℃で1分間)を40サイクル、Mx4000 thermal cycler (Stratagene)を使用。アンチセンスオリゴヌクレオチドでの処置後の遺伝子発現における倍数変化を処置試料と偽形質移入試料との間での18S-標準化dCt値の差に基づいて算出した。
リアルタイムPCR結果は、HepG2細胞中のLCAT mRNAのレベルが、LCATアンチセンスHs.668679に対して設計されたオリゴのうちの2つでの処置の48時間後に有意に増加していることを示す(図1E)。
リアルタイムPCR結果は、HepG2細胞中のLCAT mRNAのレベルが、LCATアンチセンスHs.668679に対して設計されたオリゴのうちの1つでの処置の48時間後に有意に増加していることを示す(図1F)。
リアルタイムPCR結果は、HepG2細胞中のLRP1 mRNAのレベルが、LRP1アンチセンスDC401271へのオリゴでの処置の48時間後に有意に増加していることを示す(図1H)。
リアルタイムPCR結果は、HepG2細胞中のLDLR mRNAのレベルが、LDLRアンチセンスsherflor.aApr07へのアンチセンスオリゴでの処置の48時間後に有意に増加していることを示す。LDLRアンチセンスbloflor.aApr07に対して設計されたオリゴ(CUR-1059-CUR-1063)は、LDLRレベルを上昇させなかった(図1Kおよび1L)。
リアルタイムPCR結果は、HepG2細胞中のAPOE mRNAのレベルが、APOEアンチセンスHs.626623に対して設計されたアンチセンスオリゴのうちの3つでの処置の48時間後に有意に増加していることを示す。APOE4アンチセンスHs.714236に対して設計されたオリゴは、APOE mRNAを有意には上昇させなかった(図1M)。
リアルタイムPCR結果は、HepG2細胞中のApoA1 mRNAのレベルが、ApoA1アンチセンスDA327409extへの一部のアンチセンスオリゴヌクレオチドでの処置の48時間後に有意に増加していることを示す(図1N〜図1P)。
ネイキッドLNAまたはホスホチオエートリゴヌクレオチドでの7日間のHepG2細胞の処置後に対照と比較したApoA1 mRNA (上パネル)およびApoA1天然アンチセンスDA327409ext RNA (下パネル)における倍数変化を示すリアルタイムPCR結果である(図1Q)。
LNAオリゴヌクレオチドでのHepG2細胞の処置後のApoA1 mRNA (橙棒)およびApoA1天然アンチセンスDA327409ext RNA (青棒)における倍数変化を示すリアルタイムPCR結果である(図1R)。
ATCC (cat# CRL-1573)由来のHek293細胞を増殖培地(MEM/EBSS (Hyclone cat #SH30024またはMediatech cat # MT-10-010-CV) +10% FBS (Mediatech cat# MT35-011-CV)+ペニシリン/ストレプトマイシン(Mediatech cat# MT30-002-CI))中、37℃、5% CO2で増殖させた。実験前日に、細胞を1mlあたり1.5×105個の密度で6ウエルプレートに再播種し、37℃、5% CO2でインキュベートした。実験当日に6ウエルプレートの培地を新鮮増殖培地に交換した。全てのアンチセンスオリゴヌクレオチドを濃度20μMに希釈した。この溶液2μlをOpti-MEM培地(Gibco cat#31985-070) 400μlおよびLipofectamine 2000 (Invitrogen cat# 11668019) 4μlと室温で20分間インキュベートし、Hek293細胞を含む6ウエルプレートの各ウエルに添加した。オリゴヌクレオチド溶液の代わりに水2μlを含む同様の混合物を偽形質移入対照用に使用した。37℃、5% CO2での3〜18時間のインキュベーション後、培地を新鮮増殖培地に交換した。アンチセンスオリゴヌクレオチドの添加の48時間後、培地を除去し、RNAを細胞からPromegaからのSV Total RNA Isolation System (cat # Z3105)またはQiagenからのRNeasy Total RNA Isolationキット(cat# 74181)を製造者の手順書に従って使用して抽出した。RNA 600ngをThermo ScientificからのVerso cDNAキット(cat#AB1453B)またはHigh Capacity cDNA Reverse Transcriptionキットcat# 4368813)を製造者の手順書に記載のとおり使用して実施した逆転写反応に加えた。この逆転写反応からのcDNAをABI Taqman Gene Expression Mix (cat#4369510)およびABI (Applied Biosystems Inc.、Foster City CAによるApplied Biosystems Taqman Gene Expression Assay)によって設計されたプライマー/プローブを使用するリアルタイムPCRによって遺伝子発現をモニターするために使用した。以下のPCRサイクルを使用した: 50℃で2分間、95℃で10分間、(95℃で15秒間、60℃で1分間)を40サイクル、Mx4000 thermal cycler (Stratagene)またはStepOne Plus Real Time PCR Machine (Applied Biosystems)を使用。
リアルタイムPCR結果は、Hek293細胞中のLCAT mRNAのレベルが、LCATアンチセンスHs.668679に対して設計されたオリゴのうちの3つでの処置の48時間後に有意に増加していることを示す(図1D)。
ATCC (cat# CRL-1587)由来のVero 76細胞を増殖培地(MEM/EBSS (Hyclone cat #SH30024またはMediatech cat # MT-10-010-CV) +10% FBS (Mediatech cat# MT35-011-CV)+ペニシリン/ストレプトマイシン(Mediatech cat# MT30-002-CI))中、37℃、5% CO2で増殖させた。実験前日に、細胞を1mlあたり1.5×105個の密度で6ウエルプレートに再播種し、37℃、5% CO2でインキュベートした。実験当日に6ウエルプレートの培地を新鮮増殖培地に交換した。全てのアンチセンスオリゴヌクレオチドを濃度20μMに希釈した。この溶液2μlをOpti-MEM培地(Gibco cat#31985-070) 400μlおよびLipofectamine 2000 (Invitrogen cat# 11668019) 4μlと室温で20分間インキュベートし、Vero 76細胞を含む6ウエルプレートの各ウエルに添加した。オリゴヌクレオチド溶液の代わりに水2μlを含む同様の混合物を偽形質移入対照用に使用した。37℃、5% CO2での3〜18時間のインキュベーション後、培地を新鮮増殖培地に交換した。アンチセンスオリゴヌクレオチドの添加の48時間後、培地を除去し、RNAを細胞からPromegaからのSV Total RNA Isolation System (cat # Z3105)またはQiagenからのRNeasy Total RNA Isolationキット(cat# 74181)を製造者の手順書に従って使用して抽出した。RNA 600ngをThermo ScientificからのVerso cDNAキット(cat#AB1453B)またはHigh Capacity cDNA Reverse Transcriptionキットcat# 4368813)を製造者の手順書に記載のとおり使用して実施した逆転写反応に加えた。この逆転写反応からのcDNAをABI Taqman Gene Expression Mix (cat#4369510)およびABI (Applied Biosystems Inc.、Foster City CAによるApplied Biosystems Taqman Gene Expression Assay)によって設計されたプライマー/プローブを使用するリアルタイムPCRによって遺伝子発現をモニターするために使用した。以下のPCRサイクルを使用した: 50℃で2分間、95℃で10分間、(95℃で15秒間、60℃で1分間)を40サイクル、Mx4000 thermal cycler (Stratagene)またはStepOne Plus Real Time PCR Machine (Applied Biosystems)を使用。
リアルタイムPCR結果は、Vero細胞中のLCAT mRNAのレベルが、LCATアンチセンスHs.668679に対して設計されたオリゴのうちの1つでの処置の48時間後に有意に増加していることを示す(図1G)。
Applied Biosystems Gene Expression Assayで使用される検出プローブ
ABCA1: Hs00194045_m1 (ヒト)、Mm01350760_m1 (マウス)
LCAT: Hs00173415_m1
LRP1: Hs00233856_m1 (ヒト)、Mm00464608_m1 (マウス)
LDLR: Hs00181192_m1
ApoE: Hs00171168_m1
ApoA1: Hs00163641_m1、18S cat# 4319413E
ApoA1アンチセンスDA327409extについて特注設計されたアッセイ:
FAM標識プローブ: TTTGGATCTGGACGACTTC (配列番号275)
脂質輸送代謝遺伝子発現の調節
材料および方法
細胞を以下の方法のいずれかで処置した。
HepG2細胞をMEM/EBSS (Hyclone cat #SH30024) +10%FBS+ペニシリン+ストレプトマイシン中、37℃、5%CO2で増殖させた。実験前日に、細胞を1mlあたり1.5×104個の密度で6ウエルプレートに再播種し、37℃、5%CO2に置いた。実験当日に6ウエルプレートの培地を新鮮MEM/EBSS+10%FBSに交換した。IDTによって製造された全てのアンチセンスオリゴヌクレオチドを濃度20μMまで希釈した。この溶液2μlをOpti-MEM media (Gibco cat#31985-070) 400μlとインキュベートし、HepG2細胞を含む6ウエルプレートの各ウエルに添加した。オリゴヌクレオチド溶液の代わりに水2μlを含む同様の混合物を偽形質移入対照用に使用した。アンチセンスオリゴヌクレオチドの添加の72時間後に培地を除去し、上に記載のとおり投薬手順を繰り返した。
反復投薬の48〜72時間後、RNAを細胞からPromegaからのSV Total RNA Isolation System (cat # Z3105)またはQiagenからのRNeasy Total RNA Isolation kit(cat# 74181)を製造者の手順書に従って使用して抽出した。RNA 600ngをThermo ScientificからのVerso cDNAキット(cat#AB1453B)を製造者の手順書に記載のとおり使用して実施した逆転写反応に加えた。この逆転写反応からのcDNAをABI Taqman Gene Expression Mix (cat#4369510)およびABI (Applied Biosystems Inc.、Foster City CA)によって設計されたプライマー/プローブを使用するリアルタイムPCRによって遺伝子発現をモニターするために使用した。以下のPCRサイクルを使用した: 50℃で2分間、95℃で10分間、(95℃で15秒間、60℃で1分間)を40サイクル、Mx4000 thermal cycler (Stratagene)を使用。
アンチセンスオリゴヌクレオチドでの処置後の遺伝子発現における倍数変化を処置試料と偽形質移入試料との間での18S-標準化dCt値の差に基づいて算出した。
ApoA1天然アンチセンスDA327409extについて特注設計されたTaqmanアッセイ用のプライマーおよびプローブ。大文字は未修飾デオキシリボヌクレオチドを示す。
プローブ配列(FAM標識) TTTGGATCTGGACGACTTC (配列番号275)
順方向プライマー配列CTCCTCCTGCCACTTCTTCTG (配列番号276)
逆方向プライマー配列CTGGTGGATGAAGAAGGTTTGC (配列番号277)
ATCC (cat# HB-8065)由来のHepG2細胞を増殖培地(MEM/EBSS (Hyclone cat #SH30024またはMediatech cat # MT-10-010-CV) +10%FBS (Mediatech cat# MT35-011-CV)+ペニシリン/ストレプトマイシン(Mediatech cat# MT30-002-CI))、37℃、5%CO2で増殖させた。実験前日に、細胞を1mlあたり1.5×105個の密度で6ウエルプレートに再播種し、37℃、5%CO2でインキュベートした。実験当日に6ウエルプレートの培地を新鮮増殖培地に交換した。全てのアンチセンスオリゴヌクレオチドを濃度20μMに希釈した。この溶液2μlをOpti-MEM培地(Gibco cat#31985-070) 400μlおよびLipofectamine 2000 (Invitrogen cat# 11668019) 4μlと室温で20分間インキュベートし、HepG2細胞を含む6ウエルプレートの各ウエルに添加した。オリゴヌクレオチド溶液の代わりに水2μlを含む同様の混合物を偽形質移入対照用に使用した。37℃、5%CO2での3〜18時間のインキュベーション後、培地を新鮮増殖培地に交換した。アンチセンスオリゴヌクレオチドの添加の48時間後、培地を除去し、RNAを細胞からPromegaからのSV Total RNA Isolation System (cat # Z3105)またはQiagenからのRNeasy Total RNA Isolation kit (cat# 74181)を製造者の手順書に従って使用して抽出した。
RNA 600ngをThermo ScientificからのVerso cDNAキット(cat#AB1453B)を製造者の手順書に記載のとおり使用して実施した逆転写反応に加えた。この逆転写反応からのcDNAをABI Taqman Gene Expression Mix (cat#4369510)およびABI (Applied Biosystems Inc.、Foster City CA)によって設計されたプライマー/プローブを使用するリアルタイムPCRによって遺伝子発現をモニターするために使用した。以下のPCRサイクルを使用した: 50℃で2分間、95℃で10分間、(95℃で15秒間、60℃で1分間)を40サイクル、Mx4000 thermal cycler (Stratagene)を使用。アンチセンスオリゴヌクレオチドでの処置後の遺伝子発現における倍数変化を処置試料と偽形質移入試料との間での18S-標準化dCt値の差に基づいて算出した。
ApoA1天然アンチセンスDA327409extについて特注設計されたTaqmanアッセイ用のプライマーおよびプローブ。大文字は未修飾デオキシリボヌクレオチドを示す。
プローブ配列(FAM標識) TTTGGATCTGGACGACTTC (配列番号275)
順方向プライマー配列CTCCTCCTGCCACTTCTTCTG (配列番号276)
逆方向プライマー配列CTGGTGGATGAAGAAGGTTTGC (配列番号277)
初代サル肝細胞をRxGen Inc.による培養物に導入し、6ウエルプレートに播種した。それらを以下のとおりオリゴヌクレオチドで処置した。6ウエルプレート中の培地を5% FBS、50 U/mlペニシリンおよび50 ug/mlストレプトマイシン、4 ug/mlインスリン、1 uMデキサメタゾン、10 ug/mlフンジン(InVivogen、San Diego CA)を補充したWilliam's Medium E (Sigma cat#W4128)からなる新鮮増殖培地に交換した。全てのアンチセンスオリゴヌクレオチドを濃度20μMに希釈した。この溶液2μlをOpti-MEM培地(Gibco cat#31985-070) 400μlおよびLipofectamine 2000 (Invitrogen cat# 11668019) 4μlと室温で20分間インキュベートし、細胞を含む6ウエルプレートの各ウエルに添加した。オリゴヌクレオチド溶液の代わりに水2μlを含む同様の混合物を偽形質移入対照用に使用した。37℃、5% CO2での3〜18時間のインキュベーション後、培地を新鮮増殖培地に交換した。アンチセンスオリゴヌクレオチドの添加の48時間後、培地を除去し、RNAを細胞からPromegaからのSV Total RNA Isolation System (cat # Z3105)またはQiagenからのRNeasy Total RNA Isolation kit(cat# 74181)を製造者の手順書に従って使用して抽出した。
RNA 600ngをThermo ScientificからのVerso cDNAキット(cat#AB1453B)を製造者の手順書に記載のとおり使用して実施した逆転写反応に加えた。この逆転写反応からのcDNAをABI Taqman Gene Expression Mix (cat#4369510)およびABI (Applied Biosystems Inc.、Foster City CA)によって設計されたプライマー/プローブを使用するリアルタイムPCRによって遺伝子発現をモニターするために使用した。以下のPCRサイクルを使用した: 50℃で2分間、95℃で10分間、(95℃で15秒間、60℃で1分間)を40サイクル、Mx4000 thermal cycler (Stratagene)を使用。アンチセンスオリゴヌクレオチドでの処置後の遺伝子発現における倍数変化を処置試料と偽形質移入試料との間での18S-標準化dCt値の差に基づいて算出した。ELISAは、MabTech Inc. ApoA1 ELISA kit cat# 3710-11-6を製造者の手順書に従って使用して実施した。
アフリカミドリザルにおけるCUR-962の作用の効果および持続時間の研究
本研究の目的は、脂質輸送代謝遺伝子を制御する不調和性非コードアンチセンス配列のアンチセンスノックダウンの効果を非ヒト霊長類モデルでの静脈投与に続いて評価および比較することであった。APOA1制御配列を抑制するために設計したアンチセンスオリゴヌクレオチド被験物質をCUR-962と記す。
CUR-962: +G*+C*T*A*G*T*C*T*G*+T*+T*+G (配列番号278)
CUR-963 (対照): +G*+T*C*T*G*A*T*G*G*+A*+G*+A (配列番号279)
この研究は、承認された毒物学的原理に従い、調和国際会議(International Conference of Harmonization)(ICH)の3者間で調和されたガイドライン(Harmonized Tripartite Guidelines)(医薬品の臨床試験のための非臨床試験の実施時期についてICH M3(m)、2000年9月)および治療薬の検査に関して一般に認められた手順に従って設計した。
被験物質同一性および調製
被験物質CUR-962は、化学的に安定化されたアンチセンスオリゴヌクレオチドである。静脈内送達のためのビヒクルはリン酸緩衝食塩水(PBS)である。
PBSビヒクル、組成物、バッチ番号、有効期限および保存条件(温度および明/暗)については供給者から得た。
被験物質およびビヒクルはスポンサーおよび製造者によって提供された標準とされる保存条件に従って保存した。
被験物質製剤の試料は濃度、安定性および検査物質製剤の均一性の分析のために凍結保存する。
霊長類は、規制当局に潜在的危険性の指標として許容され、詳細な背景データが入手可能である適切な非げっし類種である。具体的にはアフリカミドリザルは、ヒトの多数の生理学的状態および病態に関して高く臨床的に関連するモデルである。
種:ミドリザル(Chlorocebus sabaeus)、非ヒト霊長類
品種:アフリカミドリザルSt. Kitts原産
この研究は、アフリカミドリザルにおける被験物質の治療効果を評価する主な目的とこの種でのこの種類のオリゴヌクレオチドの全身投与の先行研究とが両立する、可能な限り少ない数の動物を使用して設計した。
体重範囲3〜4kgのアフリカミドリザル成体10匹を研究に使用した。サルは、島に生息する野生集団から人道的に捕獲した薬剤未投与の成体動物である。捕獲されたサルは、可能性があるいかなる腸内寄生虫負担をも排除するために駆虫薬で処置し、研究登録のための選別に先行する最短4週間、検疫で観察した。捕獲したサルの年齢は大きさおよび歯状形によって、研究から高齢の動物を排除して推定した。研究登録に先行して、自発運動および敏捷さの評価を含む臨床検査を各サルに実施した。血液試料を採取し、Antech Diagnostics (Memphis、TN)に包括的臨床化学ならびに全血球計算および脂質プロファイルのために送った(詳細は9.2節および319567928を参照されたい)。St. Kittsコロニーのサルについて確立された正常値と比較して異常な検査値であると決定されたサルは、研究から排除した。この判定基準を満たす8匹のサルを同定するために、必要に応じて追加的動物の選別を伴って10匹のサルを選別した。研究開始前に、選択されたサルを1週間個別収容に慣らすために個別のケージに移す。実験に適するとみなされた動物だけを研究に登録する。研究開始時の実際の(または推定の)年齢および体重範囲は、生データおよび最終報告に詳述する。
最高水準の動物福祉に従い、the St. Kitts Department of Agricultureおよび米国保健社会福祉省によって定められたガイドラインを遵守した。全ての研究は、これらの要件および実験動物の管理および収容に関して適用される全ての行動基準に従って実施される。動物の管理および使用についてのNIHガイドラインに含まれるとおりの獣医医療、手術および検査に関する全ての適用される基準。St. Kitts施設は、指針に定められたとおり手順書を検査し、施設を監査する動物実験委員会を有している。財団は、指針#A4384-01 (Axion Research Foundation/St. Kitts Biomedical Foundation)に定められたとおり実験動物福祉部門に申請された保証を承認している。特別な非ヒト霊長類獣医学的な管理問題およびこの研究に特化される調査によって生じるバイオハザード問題はない。
治療に関連するいかなる臨床症状の検出も可能にするために、動物は手術の前および手術後に屠殺されるまで個々に収容した。個々のケージが位置している霊長類ビルは、間接照明で全体が照らされており、北緯17°で、U.S. D.H.H.Sガイドラインにおいて推奨されるとおりおよそ12時間:12時間の明-暗周期であった。RxGen霊長類ビルを外部と十分に換気した。1年を通じてSt. Kittsで典型的である一定の標的温度23〜35℃に維持するために追加的な気流を天井扇によって確実にした。温度および相対湿度(これも管理されない)の24時間での両極値を毎日測定した。研究中、ケージを定期的に清掃した。
各動物に1日あたりおよそ90グラムの標準的サル用固形飼料餌(TekLad, Madison, WI)を与えた。餌の詳細な栄養組成を記録した。水は、微生物学的な純度について定期的に分析した。保存餌および給水の中の混入物の許容されるレベルについての基準は、それぞれ餌製造者および定期的な施設水評価によって確立された分析仕様内であった。水は、ヒト用の消費に許容されるとする証明のために必要な全ての基準に合致した。
動物識別および無作為化
割り付けを体重および血漿コレステロールプロファイルに基づく層別無作為化の手段によって行った。群への割り付けの前後に、各動物を腹部への刺青によって識別した。刺青は、日常的健康診査の過程でコロニーの全動物に識別の手段として行われる。ケージ図を収容された個体を識別するために作成し、個々のサルをそれらそれぞれのケージに付けた標識タグによってさらに識別した。
各群サル4匹からなる2処置群に動物を割り当てた。特定の動物識別番号を施設番号付けシステムに従って各サルに付けた。このシステムは、文字に続く3桁の数字、例えばY032によって各サルを一意的に識別する。
動物に、1、3および5日目に1日1回、約10分間かけて手動輸液によって静脈内に送達して投薬した。点滴速度は、24mL/kg/時間である。動物は、投薬手順前および投薬手順中にケタミンおよびキシラジンによって鎮静させた。静脈カテーテル(Terumo mini vein infusion set、20ゲージ針、または同様の適切な輸液セット)を伏在血管に挿入した。各サルにおける投薬は、午前8時から10時の間、動物が起きた直後で摂食の前に実施した。血漿コレステロールおよび下の血液化学節に記載の他の脂質レベルを評価するための血液試料を各輸液の直前に採取した。コレステロール測定値への摂食の影響を最小化するために血液採取は両方の試料採取間隔で摂食に先行した。
処置への応答の全ての明らかな兆候を各投薬日に記録した。追加的に動物を少なくとも1週間に1回、外見および一般的状態などの身体的特性について検査した。
体重を治療中および治療後期に1週間ごとに記録した。
個々の摂餌量は定量しなかった。しかし摂食様式をモニターし、大きな変化は記録した。
死亡率と罹患率を記録する。早期屠殺に関するいかなる決定も可能であれば試験責任者とスポンサーのモニタリング科学者との協議の後に行われる。早期に死んでいるまたは殺されることがわかった動物は、病理組織診断のための肝臓、腎臓、心臓および脾臓肺組織の採取を伴う検死の対象になる。早期屠殺事象においては、血液試料を(可能であれば)採取し、パラメーターを測定する。通常の勤務時間後に死んでいることがわかった動物は、一晩冷凍され、次の勤務時間の開始時に検死を行う。動物の状態が早期屠殺を必要とする場合は、ペントバルビタールナトリウムの静脈内過剰投与によって安楽死させる。全ての調査は、動物の使用に関する原則によって管理される。RxGenは、穏やかと特定されたこの研究での手順が遵守しなければならない過酷さのレベルを指示する、霊長類施設に関する米国社会保健福祉省基準に従うことが法律によって定められている。
血液試料
3つの血液試料を血漿コレステロールベースラインを確立するために処置前に全ての動物から得た。血液試料は、処置後に採取し、浅静脈への穿刺を介して取った。いずれの試料採取時点でも採取した容量は、サル成体の総血液量のおよそ4%を表す8mlを超えなかった。
全血球数計算(CBC)、プロトロンビン時間、PTT、フィブリノーゲンおよびD-ダイマーを1、6および11日目に採取した全ての血液試料について測定した(これらの時点のいずれかで混乱が検出された場合は追加的な日にも)。血球計算は、EDTAを含むバキュテナーに採取された全血1mlについて評価した。凝集プロファイル決定は、クエン酸デキストロース(ACD)抗凝固剤を含むバキュテナーに採取された血液およそ2mlについて実施した。
グルコース、血液尿素窒素、クレアチニン、総タンパク質量、アルブミン、総ビリルビン量、アルカリホスファターゼ、アラニンアミノ基転移酵素(ALT)、アルパラギンアミノ基転移酵素(AST)、コレステロール、カルシウム、リン、ナトリウム、カリウム、塩素、A/G比、BUN/クレアチニン(計算)グロブリン(計算)、リパーゼ、アミラーゼ、トリグリセリド、CPK、乳酸脱水素酵素、ガンマグルタミン酸転移酵素(GGT)、マグネシウム、総コレステロールLDL、VLDL、HDL、ApoA1、ApoA2、ApoB、ApoE、ApoLp(a)。スーパー化学(Superchemistry)ならびにLDLおよびHDL測定を全ての血漿試料について行った。ApoA1測定をLDLおよびHDLデータの評価後に選択した試料について行った。
経皮的肝生検をベースライン時および7および17日目に全てのサルについて実施した。14ゲージ生検針(INRAD)を肝臓の右および左の両葉からコア生検2個(長さ約1.0cm)を得るために使用する。生検の成功は、細分前に下に詳述のとおり生検針上の生検試料の目視検査によって確認した。
統計学
血液学、臨床化学および脂質プロファイルについて記述統計学を実施した。適切な生物情報学分析を発現データについて実行した。
試料サイズ決定を、アフリカミドリザルに修飾されたアンチセンスオリゴヌクレオチドを投与し、臨床化学および脂質プロファイル変化および関連する多様性が得られた先行実験に基づいて行った。効能評価のための全対象数は、処置群あたり動物4匹で登録された動物20匹および追加選別動物4匹であった。
結果を以下の図に示す。図1U:ApoA1 mRNA(上パネル)およびタンパク質(下パネル)レベルは、リアルタイムPCRおよびELISAによってそれぞれ決定されたとおりベースラインレベルと比較して、CUR-962(ApoA1アンチセンスDA327409extに対して設計したオリゴヌクレオチド)での処置後にサル肝生検で増加していた(左パネル2つ)。ApoA1 mRNAおよびタンパク質レベルは、in vitroでApoA1レベルに効果を示さないオリゴヌクレオチドを投薬された対照群の同じ期間後に変化しなかった(CUR-963、右パネル2つ)。
Claims (37)
- in vivoまたはin vitroで患者の細胞または組織における脂質輸送代謝遺伝子ポリヌクレオチドの機能および/または発現を調節する方法であって、
配列番号8のヌクレオチド1〜1299、配列番号9のヌクレオチド1〜918、配列番号10のヌクレオチド1〜1550、配列番号11のヌクレオチド1〜329、配列番号12のヌクレオチド1〜1826、配列番号13のヌクレオチド1〜536、配列番号14のヌクレオチド1〜551、配列番号15のヌクレオチド1〜672、配列番号16のヌクレオチド1〜616、配列番号17のヌクレオチド1〜471、配列番号18のヌクレオチド1〜707、配列番号19のヌクレオチド1〜741、配列番号20のヌクレオチド1〜346、配列番号21のヌクレオチド1〜867、配列番号22のヌクレオチド1〜563(図3)中の連続した5〜30ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドの逆相補物に少なくとも50%の配列同一性を有する少なくとも1つの長さ5〜30ヌクレオチドのアンチセンスオリゴヌクレオチドに、前記細胞または組織を接触させ;それによりin vivoまたはin vitroで患者の細胞または組織における脂質輸送代謝遺伝子ポリヌクレオチドの機能および/または発現を調節するステップ
を含む方法。 - in vivoまたはin vitroで患者の細胞または組織における脂質輸送代謝遺伝子ポリヌクレオチドの機能および/または発現を調節する方法であって、
脂質輸送代謝遺伝子ポリヌクレオチドの天然アンチセンスの逆相補物に少なくとも50%の配列同一性を有する少なくとも1つの長さ5〜30ヌクレオチドのアンチセンスオリゴヌクレオチドに、前記細胞または組織を接触させ;それによりin vivoまたはin vitroで患者の細胞または組織における脂質輸送代謝遺伝子ポリヌクレオチドの機能および/または発現を調節するステップ
を含む方法。 - in vivoまたはin vitroで患者の細胞または組織における脂質輸送代謝遺伝子ポリヌクレオチドの機能および/または発現を調節する方法であって、
脂質輸送代謝遺伝子ポリヌクレオチドのアンチセンスオリゴヌクレオチドに少なくとも50%の配列同一性を有する少なくとも1つの長さ5〜30ヌクレオチドのアンチセンスオリゴヌクレオチドに、前記細胞または組織を接触させ;それによりin vivoまたはin vitroで患者の細胞または組織における脂質輸送代謝遺伝子ポリヌクレオチドの機能および/または発現を調節するステップ
を含む方法。 - in vivoまたはin vitroで患者の細胞または組織における脂質輸送代謝遺伝子ポリヌクレオチドの機能および/または発現を調節する方法であって、
脂質輸送代謝遺伝子ポリヌクレオチドの天然アンチセンスの領域を標的にする少なくとも1つのアンチセンスオリゴヌクレオチドに、前記細胞または組織を接触させ;それによりin vivoまたはin vitroで患者の細胞または組織における脂質輸送代謝遺伝子ポリヌクレオチドの機能および/または発現を調節するステップ
を含む方法。 - 脂質輸送代謝遺伝子の機能および/または発現が対照と比較してin vivoまたはin vitroで増大する、請求項4に記載の方法。
- 少なくとも1つのアンチセンスオリゴヌクレオチドが脂質輸送代謝遺伝子ポリヌクレオチドの天然アンチセンス配列を標的にする、請求項4に記載の方法。
- 少なくとも1つのアンチセンスオリゴヌクレオチドが脂質輸送代謝遺伝子ポリヌクレオチドのコードおよび/または非コード核酸配列を含む核酸配列を標的にする、請求項4に記載の方法。
- 少なくとも1つのアンチセンスオリゴヌクレオチドが脂質輸送代謝遺伝子ポリヌクレオチドのオーバーラップおよび/または非オーバーラップ配列を標的にする、請求項4に記載の方法。
- 少なくとも1つのアンチセンスオリゴヌクレオチドが、少なくとも1つの修飾された糖部分、少なくとも1つの修飾されたヌクレオシド間結合、少なくとも1つの修飾されたヌクレオチドおよびそれらの組合せから選択される1つまたは複数の修飾を含む、請求項4に記載の方法。
- 1つまたは複数の修飾が、2'-O-メトキシエチル修飾糖部分、2'-メトキシ修飾糖部分、2'-O-アルキル修飾糖部分、二環性糖部分およびそれらの組合せから選択される少なくとも1つの修飾された糖部分を含む、請求項9に記載の方法。
- 1つまたは複数の修飾が、ホスホロチオエート、2'-O-メトキシエチル(MOE)、2'フルオロ、アルキルホスホネート、ホスホロジチオエート、アルキルホスホノチオエート、ホスホラミデート、カルバミン酸、炭酸、リン酸トリエステル、アセトアミデート、カルボキシメチルエステルおよびそれらの組合せから選択される少なくとも1つの修飾されたヌクレオシド間結合を含む、請求項9に記載の方法。
- 1つまたは複数の修飾が、ペプチド核酸(PNA)、ロックド核酸(LNA)、アラビノ-核酸(FANA)、それらの類似体、誘導体および組合せから選択される少なくとも1つの修飾されたヌクレオチドを含む、請求項9に記載の方法。
- 少なくとも1つのオリゴヌクレオチドが配列番号23〜263に記載の少なくとも1つのオリゴヌクレオチド配列を含む、請求項1に記載の方法。
- in vivoまたはin vitroで哺乳動物の細胞または組織における脂質輸送代謝遺伝子遺伝子の機能および/または発現を調節する方法であって、
脂質輸送代謝遺伝子ポリヌクレオチドのアンチセンスおよび/またはセンス核酸分子の少なくとも約5個の連続する核酸の相補配列に少なくとも50%の配列同一性を有する、脂質輸送代謝遺伝子ポリヌクレオチドのアンチセンスポリヌクレオチドに特異的な長さ5〜30ヌクレオチドの少なくとも1つの低分子干渉RNA(siRNA)オリゴヌクレオチドに、前記細胞または組織を接触させるステップ;ならびに
in vivoまたはin vitroで哺乳動物の細胞または組織における脂質輸送代謝遺伝子の機能および/または発現を調節するステップ
を含む方法。 - 前記オリゴヌクレオチドが、脂質輸送代謝遺伝子ポリヌクレオチドのアンチセンスおよび/またはセンス核酸分子に相補的な少なくとも約5個の連続する核酸の配列に少なくとも80%の配列同一性を有する、請求項14に記載の方法。
- in vivoまたはin vitroで哺乳動物の細胞または組織における脂質輸送代謝遺伝子の機能および/または発現を調節する方法であって、
配列番号1〜7および8〜22に記載の少なくとも1つの核酸配列に少なくとも50%の配列同一性を有する、脂質輸送代謝遺伝子ポリヌクレオチドのセンスおよび/または天然アンチセンス鎖の非コードおよび/またはコード配列に特異的な長さ約5〜30ヌクレオチドの少なくとも1つのアンチセンスオリゴヌクレオチドに、前記細胞または組織を接触させるステップ;および
in vivoまたはin vitroで哺乳動物の細胞または組織における脂質輸送代謝遺伝子の機能および/または発現を調節するステップ
を含む方法。 - 少なくとも1つの修飾を含む合成修飾オリゴヌクレオチドであって、少なくとも1つの修飾が、少なくとも1つの修飾された糖部分、少なくとも1つの修飾されたヌクレオチド間結合、少なくとも1つの修飾されたヌクレオチドおよびそれらの組合せから選択され、前記オリゴヌクレオチドが、正常対照と比較してin vivoまたはin vitroで脂質輸送代謝遺伝子分子の機能および/または発現をハイブリダイズし、かつ調節するアンチセンス化合物であるオリゴヌクレオチド。
- 少なくとも1つの修飾が、ホスホロチオエート、アルキルホスホネート、ホスホロジチオエート、アルキルホスホノチオエート、ホスホラミデート、カルバミン酸、炭酸、リン酸トリエステル、アセトアミデート、カルボキシメチルエステルおよびそれらの組合せからなる群から選択されるヌクレオチド間結合を含む、請求項17に記載のオリゴヌクレオチド。
- 少なくとも1つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む、請求項17に記載のオリゴヌクレオチド。
- ホスホロチオエートヌクレオチド間結合の骨格を含む、請求項17に記載のオリゴヌクレオチド。
- ペプチド核酸、ロックド核酸(LNA)、類似体、誘導体およびそれらの組合せから選択される少なくとも1つの修飾されたヌクレオチドを含む、請求項17に記載のオリゴヌクレオチド。
- 複数の修飾を含み、前記修飾がホスホロチオエート、アルキルホスホネート、ホスホロジチオエート、アルキルホスホノチオエート、ホスホラミデート、カルバミン酸、炭酸、リン酸トリエステル、アセトアミデート、カルボキシメチルエステル、およびそれらの組合せから選択される修飾されたヌクレオチドを含む、請求項17に記載のオリゴヌクレオチド。
- 複数の修飾を含み、前記修飾がペプチド核酸、ロックド核酸(LNA)、アナログ、誘導体、およびそれらの組合せから選択される修飾されたヌクレオチドを含む、請求項17に記載のオリゴヌクレオチド。
- 2'-O-メトキシエチル修飾糖部分、2'-メトキシ修飾糖部分、2'-O-アルキル修飾糖部分、二環性糖部分、およびそれらの組合せから選択される少なくとも1つの修飾された糖部分を含む、請求項17に記載のオリゴヌクレオチド。
- 複数の修飾を含み、前記修飾が2'-O-メトキシエチル修飾糖部分、2'-メトキシ修飾糖部分、2'-O-アルキル修飾糖部分、二環性糖部分、およびそれらの組合せから選択される修飾された糖部分を含む、請求項17に記載のオリゴヌクレオチド。
- 長さ少なくとも約5〜30ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドであり、脂質輸送代謝遺伝子ポリヌクレオチドのアンチセンス鎖および/またはセンス鎖にハイブリダイズし、脂質輸送代謝遺伝子ポリヌクレオチドのアンチセンスおよび/またはセンスのコードおよび/または非コード核酸配列の少なくとも約5個の連続する核酸の相補配列に少なくとも約20%の配列同一性を有する、請求項17に記載のオリゴヌクレオチド。
- 脂質輸送代謝遺伝子ポリヌクレオチドのアンチセンスおよび/またはセンスのコードおよび/または非コード核酸配列の少なくとも約5個の連続する核酸の相補配列に少なくとも約80%配列同一である、請求項17に記載のオリゴヌクレオチド。
- 少なくとも1つの脂質輸送代謝遺伝子ポリヌクレオチドにハイブリダイズし、かつ正常対照と比較してin vivoまたはin vitroで少なくとも1つの脂質輸送代謝遺伝子ポリヌクレオチドの発現および/または機能を調節する、請求項17に記載のオリゴヌクレオチド。
- 配列番号23〜263に記載の配列を含む、請求項17に記載のオリゴヌクレオチド。
- アンチセンス配列、相補配列、対立遺伝子、相同体、アイソフォーム、変種、誘導体、変異体、断片またはそれらの組合せを含む1つまたは複数の脂質輸送代謝遺伝子ポリヌクレオチドに特異的な1つまたは複数のオリゴヌクレオチドを含む組成物。
- オリゴヌクレオチドが配列番号23〜263に記載のヌクレオチド配列のいずれか1つと比較して少なくとも約40%のヌクレオチド配列同一性を有する、請求項30に記載の組成物。
- オリゴヌクレオチドが配列番号23〜263に記載のヌクレオチド配列を含む、請求項30に記載の組成物。
- 配列番号23〜263に記載のオリゴヌクレオチドが1つまたは複数の修飾または置換を含む、請求項32に記載の組成物。
- 1つまたは複数の修飾がホスホロチオエート、メチルホスホネート、ペプチド核酸、ロックド核酸(LNA)分子およびそれらの組合せから選択される、請求項33に記載の組成物。
- 少なくとも1つの脂質輸送代謝遺伝子ポリヌクレオチドおよび/または少なくとも1つのそれにコードされる産物に関連する疾患を予防または治療する方法であって、
前記少なくとも1つの脂質輸送代謝遺伝子ポリヌクレオチドの天然アンチセンス配列に結合し、かつ前記少なくとも1つの脂質輸送代謝遺伝子ポリヌクレオチドの発現を調節する少なくとも1つのアンチセンスオリゴヌクレオチドの治療有効量を患者に投与し;それにより少なくとも1つの脂質輸送代謝遺伝子ポリヌクレオチドおよび/または少なくとも1つのそれにコードされる産物に関連する疾患を予防するまたは治療するステップ
を含む方法。 - 少なくとも1つの脂質輸送代謝遺伝子ポリヌクレオチドに関連する疾患が、心血管疾患または心血管障害、代謝性疾患または代謝性障害(例えば、糖尿病、肥満、脂質異常症、高血糖症、高インスリン血症、高コレステロール血症など)、脂質代謝の障害に関連する疾患または障害、冠動脈疾患、アテローム性動脈硬化、HDL代謝疾患またはHDL代謝障害(例えば、家族性HDL欠損症(FHD)、海青組織球症、タンジール病、魚眼病、LCAT欠損症、低HDLコレステロール血症など)、細胞内におけるコレステロールおよび/またはリン脂質のホメオスタシスに関連する疾患または障害、家族性アミロイド腎症、コレステロール制御の障害に関連する疾患または障害、脂質輸送代謝遺伝子の欠損に関連する疾患または障害、アポリポタンパク質A-I欠損、細胞内におけるコレステロール排出速度が異常に速いまたは異常に遅いことに関連する疾患または障害、膵臓ベータ細胞機能に関連する疾患または障害、糖尿病、代謝性疾患または代謝性障害、関節炎、炎症、自己免疫疾患または自己免疫障害、後天性免疫不全症候群(AIDS)、炎症、神経疾患または神経障害、神経変性疾患または神経変性障害、癌、脂質異常症、メタボリック症候群、老人斑、脳アミロイド血管症、アミロイドーシス、神経膠芽腫、アミロイド沈着に関連する疾患または障害、神経原線維変化症、絨毛癌、星状細胞腫、アミロイドーシス、高脂血症、新生物性形質転換、アテローム斑、閉塞症、転移、肺線維症、壊死、ショック、黒色腫、遺伝性感受性、乾癬、神経膠腫、神経病態、血管疾患、細胞損傷、非小細胞肺癌(NSCLC)、脂肪肉腫、免疫不全性疾患または免疫不全性障害、アレルギー、臓器移植拒絶、糸球体腎症、静脈血栓症、白血病の病理学的過程、骨格疾患または骨格障害、筋疾患または筋障害、感染性生物に関連する疾患または障害、免疫関連疾患または免疫関連障害、神経修復および神経麻痺、神経内分泌分化、全身性非神経障害性アミロイドーシス、アミロイド病、血管新生に依存する腫瘍増殖;血管新生の増大が含まれる症状、例えば、乾癬、未熟児網膜症、脈絡膜疾患、血管新生緑内障、糖尿病性網膜症、薬物乱用、認知機能障害、および神経突起生長の低下を伴う非癌性疾患;正常対照と比較して異常なApoE発現、ApoE機能、ApoE活性;乾癬;ウイルス、細菌、寄生虫、真菌などの
外来生物により引き起こされる疾患または障害から選択される、請求項35に記載の方法。 - in vivo投与のために少なくとも1つのオリゴヌクレオチドを同定および選択する方法であって、
病態に関連する標的ポリヌクレオチドを選択するステップ;
選択された標的ポリヌクレオチドに相補的である、または選択された標的ポリヌクレオチドに対してアンチセンスであるポリヌクレオチドに相補的である少なくとも5個の連続するヌクレオチドを含む少なくとも1つのオリゴヌクレオチドを同定するステップ;
ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でアンチセンスオリゴヌクレオチドと、標的ポリヌクレオチドまたは選択された標的ポリヌクレオチドに対してアンチセンスであるポリヌクレオチドとのハイブリッドの熱的融点を測定するステップ;ならびに
in vivo投与のための少なくとも1つのオリゴヌクレオチドを得られた情報に基づいて選択するステップ
を含む方法。
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