KR20120061068A - 지질 수송 및 대사 유전자에 대한 천연 안티센스 전사체의 억제에 의해 지질 수송 및 대사 유전자 관련된 질환의 치료 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 지질 수송 및 대사 유전자의 발현 및/또는 기능을 조절하는 안티센스 올리고뉴클레오티드, 특히, 지질 수송 및 대사 유전자의 천연 안티센스 폴리뉴클레오티드를 표적으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드에 관한 것이다. 본 발명은 또한 지질 수송 및 대사 유전자의 발현과 관련된 질환 및 장애를 치료함에 있어서 이들 안티센스 올리고뉴클레오티드 및 이의 용도를 확인하는 것에 관한 것이다.
Description
본 출원은 2009년 5월 6일자로 제출된 미국 가특허 출원 61/175,930; 2009년 5월 7일자로 제출된 미국 가특허 출원 61/176,267; 2009년 5월 22일자로 제출된 미국 가특허 출원 61/180,646; 2009년 10월 2일자로 제출된 미국 가특허 출원 61/248,212; 그리고 2009년 8월 19일자로 제출된 미국 가특허 출원 61/235,227을 우선권으로 주장하며, 이들 각각은 전문이 참고문헌에 통합된다.
본 발명의 구체예들은 지질 수송 및 대사 유전자와 연합된 분자들의 발현 및/또는 기능을 조절하는 올리고뉴클레오티드를 포함한다.
DNA-RNA 및 RNA-RNA 혼성화는 DNA 복제, 전사, 및 해독을 포함하는 많은 측면의 핵산 기능에 중요하다. 혼성화는 또한 특정 핵산을 탐지하거나 또는 이의 발현을 변경하는 다양한 기술의 중심이다. 안티센스 뉴클레오티드는 예를 들면, 표적 RNA에 혼성화되어, 그것에 의해 RNA 접합(splicing), 전사, 해독, 및 복제를 간섭함으로써 유전자 발현을 붕괴시킨다. 안티센스 DNA는 DNA-RNA 혼성물이 대부분 유형의 세포에 존재하는 활성인 리보뉴클레아제 H에 의한 절단(digestion)에 기질 역할을 하는 추가 특징을 가진다. 안티센스 분자들은 올리고데옥시뉴클레오티드 (ODNs)의 경우에서와 같이 세포로 전달될 수 있거나, 또는 RNA 분자들과 같은 내생 유전자로부터 발현될 수 있다. FDA는 최근안티센스 약물, VITRAVENE™ (사이토메갈로바이러스 레티니티스 (사 이토메갈로바이러스 retinitis) 치료용)을 승인하였는데, 이는, 안티센스가 치료 용도를 가진다는 것을 반영한다.
요약
본 요약은 본 발명의 특징 및 물질을 간략하게 나타내기 위하여 본 발명의 요약으로 제공된다. 청구범위의 범위 또는 의미를 제한하거나 해석하는 것으로 이용되지 않을 것이라는 이해와 함께 요약이 제공된다.
한 구체예에서, 본 발명은 천연 안티센스 전사체의 임의의 부위를 표적으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드(들)을 이용하여 천연 안티센스 전사체의 작용을 억제시켜 대응하는 센스 유전자를 상향-조절하는 방법을 제공한다. 또한 여기에서 천연 안티센스 전사체의 억제는 siRNA, 리보자임 그리고 소(small) 분자들에 의해 이루어질 수 있는데, 이 또한 본 발명의 범위내에 있는 것으로 간주한다.
한 구체예는 생체내 또는 시험관내에서 환자의 세포 또는 조직내 지질 수송 및 대사 유전자 폴리뉴클레오티드의 기능 및/또는 발현을 조절하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 전술한 세포 또는 조직에 길이가 5 내지 30개의 뉴클레오티드의 안티센스 올리고뉴클레오티드를 접촉시키는 것을 포함하며, 여기서 상기 올리고뉴클레오티드는 서열 번호: 8의 뉴클레오티드 1 내지 1299, 서열 번호: 9의 뉴클레오티드 1 내지 918, 서열 번호:10의 뉴클레오티드 1 내지 1550, 서열 번호:11의 뉴클레오티드 1 내지 329, 서열 번호:12의 뉴클레오티드 1 내지 1826, 서열 번호:13의 뉴클레오티드 1 내지 536, 서열 번호:14의 뉴클레오티드 1 내지 551, 서열 번호:15의 뉴클레오티드 1 내지 672, 서열 번호:16의 뉴클레오티드 1 내지 616, 서열 번호:17의 뉴클레오티드 1 내지 471, 서열 번호:18의 뉴클레오티드 1 내지 707, 서열 번호:19의 뉴클레오티드 1 내지 741, 서열 번호:20의 뉴클레오티드 1 내지 346, 서열 번호:21의 뉴클레오티드 1 내지 867, 서열 번호:22의 뉴클레오티드 1 내지 563(도 3) 내의 5 내지 30개 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드의 역(reverse) 보체에 최소한 50% 서열 동일성을 가지며, 이러한 접촉에 의해 생체내 또는 시험관내 환자의 세포 또는 조직에서 지질 수송 및 대사 유전자 폴리뉴클레오티드의 기능 및/또는 발현을 조절한다.
또다른 바람직한 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 지질 수송 및 대사 유전자 폴리뉴클레오티드의 천연 안티센스 서열을 표적으로 하는데, 예를 들면, 서열 번호: 8-22에서 제시된 뉴클레오티드, 그리고 이에 대한 임의의 변이체들, 대립유전자, 상동체들, 돌연변이들, 유도체들, 단편들 그리고 보체 서열들을 포함한다. 안티센스 올리고뉴클레오티드의 예는 서열 번호: 23-263에 제시된다(도 4-9).
또다른 구체예는 생체내 또는 시험관내에서 환자의 세포 또는 조직내 지질 수송 및 대사 유전자 폴리뉴클레오티드의 기능 및/또는 발현을 조절하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 전술한 세포 또는 조직에 길이가 5 내지 30개의 뉴클레오티드의 안티센스 올리고뉴클레오티드를 접촉시키는 것을 포함하며, 여기서 상기 올리고뉴클레오티드는 지질 수송 및 대사 유전자 폴리뉴클레오티드의 안티센스의 역 보체에 최소한 50% 서열 동일성을 가지며, 이러한 접촉에 의해 생체내 또는 시험관내 환자의 세포 또는 조직에서 지질 수송 및 대사 유전자 폴리뉴클레오티드의 기능 및/또는 발현을 조절한다.
또다른 구체예는 생체내 또는 시험관내에서 환자의 세포 또는 조직내 지질 수송 및 대사 유전자 폴리뉴클레오티드의 기능 및/또는 발현을 조절하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 전술한 세포 또는 조직에 길이가 5 내지 30개의 뉴클레오티드의 안티센스 올리고뉴클레오티드를 접촉시키는 것을 포함하며, 여기서 상기 올리고뉴클레오티드는 지질 수송 및 대사 유전자 안티센스 폴리뉴클레오티드에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드에 최소한 50% 서열 동일성을 가지며, 이러한 접촉에 의해 생체내 또는 시험관내 환자의 세포 또는 조직에서 지질 수송 및 대사 유전자 폴리뉴클레오티드의 기능 및/또는 발현을 조절한다.
바람직한 구체예에서, 조성물은 센스 및/또는 안티센스 지질 수송 및 대사 유전자 폴리뉴클레오티드에 결합하는 하나 이상의 안티센스 올리고뉴클레오티드를 포함한다.
또다른 바람직한 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 변형된 또는 치환된 뉴클레오티드를 포함한다.
또다른 바람직한 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 변형된 결합(bonds)을 포함한다.
또다른 구체예에서, 변형된 뉴클레오티드는 포스포로티오에이트, 메틸포스포네이트, 펩티드 핵산, 2’-O-메틸, 플루오로- 또는 탄소, 메틸렌 또는 기타 잠김 핵산 (LNA) 분자들을 포함하는 변형된 염기를 포함한다. 바람직하게는, 변형된 뉴클레오티드는 α-L-LNA을 포함하는 잠김 핵산 분자들이다.
또다른 바람직한 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 환자의 피하로, 근육내로, 정맥내로 또는 복막내로 투여된다.
또다른 바람직한 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 약제 조성물내에서 투여된다. 치료 섭생은 환자에게 최소한 한 번 안티센스 화합물을 투여하는 것을 포함하나; 그러나, 이러한 치료는 일정 시간에 걸쳐 다중 투약을 포함하도록 변형될 수 있다. 이 치료는 하나 이상의 다른 유형의 치료법과 결합될 수 있다.
또다른 바람직한 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 리포좀에 포집되거나 또는 운반체 분자 (가령, 콜레스테롤, TAT 펩티드)에 부착되될 수 있다.
다른 측면들은 아래에서 설명된다.
도 1:
도 1a는 518A2 세포를 Lipofectamine 2000을 이용하여 도입된 siRNA 올리고뉴클레오티드로 처리한 후, 대조군과 비교하였을 때, ABCA1 mRNA에서 변화배수+표준 편차를 보여주는 실시간 PCR 결과 그래프다. 실시간 PCR 결과에서 518A2 세포들내에 ABCA1 mRNA 수준은 ABCA1 안티센스 AK311445에 대해 기획된 siRNA중 하나로 치료후 48시간에 상당히 증가한다는 것을 보여준다. 막대는 서열 번호: 23-25로 각 처리된 시료에 대응하는 CUR-0521, CUR-0519 및 CUR-0523을 차례로 나타낸다.
도 1b는 518A2 세포를 Lipofectamine 2000을 이용하여 도입된 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드로 처리한 후, 대조군과 비교하였을 때, ABCA1 mRNA에서 변화배수+표준 편차를 보여주는 실시간 PCR 결과 그래프다. 실시간 PCR 결과에서 518A2 세포들내에 ABCA1 mRNA 수준은 ABCA1 안티센스 AK311445에 대해 기획된 올리고중 6개로 치료후 48시간에 상당히 증가한다는 것을 보여준다. 막대는 서열 번호: 26-34로 각 처리된 시료에 대응하는 CUR-1214 내지 CUR-1222를 차례로 나타낸다.
도 1c는 3T3 세포를 Lipofectamine 2000을 이용하여 도입된 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드로 처리한 후, 대조군과 비교하였을 때, ABCA1 mRNA에서 변화배수+표준 편차를 보여주는 실시간 PCR 결과 그래프다. 실시간 PCR 결과에서 3T3 세포들내에 ABCA1 mRNA 수준은 ABCA1 안티센스 BF133827에 대해 기획된 올리고중 3개로 치료후 48시간에 상당히 증가한다는 것을 보여준다. 막대는 서열 번호: 36-38, 40 및 39로 각 처리된 시료에 대응하는 CUR-1087 내지 CUR-1090, CUR-1092 그리고 CUR-1091을 차례로 나타낸다.
도 1d는 Hek293 세포를 Lipofectamine 2000을 이용하여 도입된 siRNA 및 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드로 처리한 후, 대조군과 비교하였을 때, LCAT mRNA에서 변화배수+표준 편차를 보여주는 실시간 PCR 결과 그래프다. 실시간 PCR 결과에서 Hek293 세포들내에 LCAT mRNA 수준은 LCAT 안티센스 Hs.668679에 대해 기획된 올리고중 3개로 치료후 48시간에 상당히 증가한다는 것을 보여준다. 막대는 서열 번호: 41, 42, 58, 56 및 55로 각 처리된 시료에 대응하는 CUR-0476, CUR-0478, CUR-0822, CUR-0820 및 CUR-0819를 차례로 나타낸다.
도 1e는 HepG2 세포를 Lipofectamine 2000을 이용하여 도입된 siRNA 올리고뉴클레오티드로 처리한 후, 대조군과 비교하였을 때, LCAT mRNA에서 변화배수+표준 편차를 보여주는 실시간 PCR 결과 그래프다. 실시간 PCR 결과에서 HepG2 세포들내에 LCAT mRNA 수준은 LCAT 안티센스 Hs.668679에 대해 기획된 올리고중 2개로 치료후 48시간에 상당히 증가한다는 것을 보여준다. 막대는 서열 번호: 41, 42 및 44-47로 각 처리된 시료에 대응하는 CUR-0476, CUR-0478, CUR-0444, CUR-0446, CUR-0448 및 CUR-0450를 차례로 나타낸다.
도 1f는 HepG2 세포를 Lipofectamine 2000을 이용하여 도입된 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드로 처리한 후, 대조군과 비교하였을 때, LCAT mRNA에서 변화배수+표준 편차를 보여주는 실시간 PCR 결과 그래프다. 실시간 PCR 결과에서 HepG2 세포들내에 LCAT mRNA 수준은 LCAT 안티센스 Hs.668679에 대해 기획된 올리고중 1개로 치료후 48시간에 상당히 증가한다는 것을 보여준다. 막대는 서열 번호: 55, 54, 53, 52, 51 및 56-58로 각 처리된 시료에 대응하는 CUR-0819, CUR-0818, CUR-0817, CUR-0816, CUR-0815, CUR-0820, CUR-0821 및 CUR-0822를 차례로 나타낸다.
도 1g는 Vero 세포를 Lipofectamine 2000을 이용하여 도입된 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드로 처리한 후, 대조군과 비교하였을 때, LCAT mRNA에서 변화배수+표준 편차를 보여주는 실시간 PCR 결과 그래프다. 실시간 PCR 결과에서 Vero 세포들내에 LCAT mRNA 수준은 LCAT 안티센스 Hs.668679에 대해 기획된 올리고중 1개로 치료후 48시간에 상당히 증가한다는 것을 보여준다. 막대는 서열 번호: 55, 54, 53, 52, 51 및 56-58로 각 처리된 시료에 대응하는 CUR-0819, CUR-0818, CUR-0817, CUR-0816, CUR-0815, CUR-0820, CUR-0821 및 CUR-0822를 차례로 나타낸다.
도 1h는 HepG2 세포를 Lipofectamine 2000을 이용하여 도입된 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드로 처리한 후, 대조군과 비교하였을 때, LRP1 mRNA에서 변화배수+표준 편차를 보여주는 실시간 PCR 결과 그래프다. 실시간 PCR 결과에서 HepG2 세포들내에 LRP1 mRNA 수준은 LRP1 안티센스 DC401271에 대해 기획된 올리고로 치료후 48시간에 상당히 증가한다는 것을 보여준다. 막대는 서열 번호: 59 내지 61, 63, 62, 67, 65, 64 및 66로 각 처리된 시료에 대응하는 CUR-0767 내지 CUR-0769, CUR-0771, CUR-0770, CUR-0775, CUR-0773, CUR-0772 및 CUR-0774를 차례로 나타낸다.
도 1i는 Vero 세포를 Lipofectamine 2000을 이용하여 도입된 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드로 처리한 후, 대조군과 비교하였을 때, LRP1 mRNA에서 변화배수+표준 편차를 보여주는 실시간 PCR 결과 그래프다. 실시간 PCR 결과에서 Vero 세포들내에 LRP1 mRNA 수준은 LRP1 안티센스 DC401271 및 Hs.711951에 대해 기획된 올리고로 치료후 48시간에 상당히 증가한다는 것을 보여준다. 막대는 서열 번호: 60, 59, 66 및 64로 각 처리된 시료에 대응하는 CUR-0768, CUR-0767, CUR-0774 및 CUR-0772를 차례로 나타낸다.
도 1j는 3T3 세포를 Lipofectamine 2000을 이용하여 도입된 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드로 처리한 후, 대조군과 비교하였을 때, LRP1 mRNA에서 변화배수+표준 편차를 보여주는 실시간 PCR 결과 그래프다. 실시간 PCR 결과에서 3T3 세포들내에 LRP1 mRNA 수준은 LRP1 안티센스 DC401271 및 AW544265에 대해 기획된 올리고로 치료후 48시간에 상당히 증가한다는 것을 보여준다. 막대는 서열 번호: 68-73로 각 처리된 시료에 대응하는 CUR-1017 내지 CUR-1022를 차례로 나타낸다.
도 1k는 HepG2 세포를 Lipofectamine 2000을 이용하여 도입된 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드로 처리한 후, 대조군과 비교하였을 때, LDLR mRNA에서 변화배수+표준 편차를 보여주는 실시간 PCR 결과 그래프다. 실시간 PCR 결과에서 HepG2 세포들내에 LDLR mRNA 수준은 LDLR 안티센스 sherflor.aApr07에 대해 기획된 올리고로 치료후 48시간에 상당히 증가한다는 것을 보여준다. 막대는 서열 번호: 74-79로 각 처리된 시료에 대응하는 CUR-1054 내지 CUR-1059를 차례로 나타낸다.
도 1l는 HepG2 세포를 Lipofectamine 2000을 이용하여 도입된 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드로 처리한 후, 대조군과 비교하였을 때, LDLR mRNA에서 변화배수+표준 편차를 보여주는 실시간 PCR 결과 그래프다. 실시간 PCR 결과에서 HepG2 세포들내에 LDLR mRNA 수준은 LDLR 안티센스 bloflor.aApr07에 대해 기획된 올리고로 치료후 48시간에 상당히 증가한다는 것을 보여준다. 막대는 서열 번호: 79-83로 각 처리된 시료에 대응하는 CUR-1059 내지 CUR-1063를 차례로 나타낸다.
도 1m는 HepG2 세포를 Lipofectamine 2000을 이용하여 도입된 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드로 처리한 후, 대조군과 비교하였을 때, ApoE mRNA에서 변화배수+표준 편차를 보여주는 실시간 PCR 결과 그래프다. 실시간 PCR 결과에서 HepG2 세포들내에 APOE mRNA 수준은 APOE 안티센스 Hs.626623에 대해 기획된 올리고중 3개로 치료후 48시간에 상당히 증가한다는 것을 보여준다. 막대는 서열 번호: 89, 91, 92, 90, 84, 86, 85, 88 및 87로 각 처리된 시료에 대응하는 CUR-0978, CUR-0980, CUR-0981, CUR-0979, CUR-0973, CUR-0975, CUR-0974, CUR-0977 및 CUR-0976를 차례로 나타낸다.
도 1n 내지 1p는 HepG2 세포를 Lipofectamine 2000을 이용하여 도입된 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드로 처리한 후, 대조군과 비교하였을 때, ApoA1 mRNA에서 변화배수+표준 편차를 보여주는 실시간 PCR 결과 그래프다. 실시간 PCR 결과에서 HepG2 세포들내에 ApoA1 mRNA 수준은 ApoA1 안티센스 DA327409ext에 대해 기획된 올리고중 일부로 치료후 48시간에 상당히 증가한다는 것을 보여준다. 막대RH3-RH597은 서열 번호: 171-248로 각 처리된 시료에 대응한다.
도 1q는 HepG2 세포를 naked LNA 또는 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드로 7일에 걸쳐 처리한 후, 대조군과 비교하였을 때, ApoA1 mRNA (위 패널) 및 ApoA1 천연 안티센스 DA327409ext RNA (아래 페널에서) 배수 변화를 나타내는 실시간 PCR 결과를 나타내는 그래프다. #6LNA, #11LNA, #6PS 및 #11PS로 표시된 막대는 차례로 서열 번호: 249 내지 252를 나타낸다.
도 1r은 HepG2 세포를 LNA 올리고뉴클레오티드로 처리한 후, 대조군과 비교하였을 때, ApoA1 mRNA (오랜지색 막대)와 ApoA1 천연 안티센스 DA327409ext RNA (청색 막대)의 배수 변화를 나타내는 실시간 PCR 결과를 나타내는 그래프다. 6-11로 표시된 막대는 차례로 서열 번호: 249, 257 내지 260 그리고 250을 나타낸다.
도 1s는 HepG2 세포를 올리고뉴클레오티드로 처리한 후, 대조군과 비교하였을 때, ApoA1 mRNA (아래 패널)와 단백질(위 패널)의 배수 변화를 나타내는 실시간 PCR 결과를 나타내는 그래프다. CUR-4806 및 CUR-4811으로 표시된 막대는 차례로 서열 번호: 249 그리고 250을 나타낸다.
도 1t는 주요 아프리카 녹색 원숭이 간세포를 천연 ApoA1 안티센스 DA327409ext에 대한 올리고뉴클레오티드로 처리한 후, 대조군과 비교하였을 때, ApoA1 mRNA (아래 패널)의 상향을 나타내는 실시간 PCR 결과를 나타내는 그래프다. CUR-4816 및 CUR-4811으로 표시된 막대는 차례로 서열 번호: 263 그리고 250을 나타낸다.
도 1u는 ApoA1 안티센스 DA327409ext에 대해 기획된 올리고뉴클레오티드, CUR-962로 처리한 후, 실시간 PCR 및 ELISA(우측 패널)에 의해 각각 결정하여 기저 수준과 비교하였을 때, 원숭이 간 생검에서 ApoA1 mRNA 및 단백질 수준이 증가되었다는 것을 보여주는 그래프다. ApoA1 mRNA 또는 단백질 수준은 시험관에서 ApoA1 수준에 영향을 주지 않는 올리고뉴클레오티드(CUR-963) (좌측 패널)로 투여된 대조군에서 동일한 시간 후에 변화가 없었다. CUR-962 및 CUR-963으로 표시된 막대는 차례로 서열 번호: 260 및 261에 대응한다.
도 1v는 인간 및 붉은 털 원숭이(rhesus) ApoA1 천연 안티센스 서열의 나란한 배열과, 이들 서열을 표적하는데 이용되는 올리고뉴클레오티드의 일부 위치를 나타낸다.
도 2는 다음을 나타낸다:
서열 번호: 1: 호모 사피엔스(Homo sapiens) ATP-결합 카세트, 하위-패밀리 A (ABC1), 구성요소 1(ABCA1), mRNA (NCBI Accession No.: NM_005502).
서열 번호: 2: 호모 사피엔스(Homo sapiens) 레시틴-콜레스테롤 아세틸전이효소 (LCAT), mRNA (NCBI Accession No.: NM_000229.1).
서열 번호: 3: 호모 사피엔스(Homo sapiens) 저밀도 지단백질 수용체-관련된단백질 1 (LRP1), mRNA (NCBI Accession No.: NM_002332.2).
서열 번호: 4: 무스 무스쿨루스(Mus musculus) 저밀도 지단백질 수용체-관련된단백질 1 (Lrp1), mRNA (NCBI Accession No.: NM_008512.2).
서열 번호: 5: 호모 사피엔스(Homo sapiens) 저밀도 지단백질 수용체 (LDLR), mRNA (NCBI Accession No.: NM_000527.3).
서열 번호: 6: 호모 사피엔스(Homo sapiens) 아포리포단백질 E (APOE), mRNA (NCBI Accession No.: NM_000041.2).
서열 번호: 7: 호모 사피엔스(Homo sapiens) 아포리포단백질 A-I (APOA1), mRNA (NCBI Accession No.: NM_000039).
도 3은 다음을 나타낸다:
서열 번호: 8: 인간 천연 ABCA1 안티센스 서열 (AK311445)
서열 번호: 9: 마우스 천연 ABCA1 안티센스 서열 (BF133827)
서열 번호: 10: 인간 천연 LCAT 안티센스 서열 (Hs.668679)
서열 번호: 11: 인간 천연 LCAT 안티센스 서열 (Hs.593769)
서열 번호: 12: 인간 천연 LCAT 안티센스 서열 (Hs.387239)
서열 번호: 13: 인간 천연 LRP1 안티센스 서열 (Hs.711951)
서열 번호: 14: 인간 천연 LRP1 안티센스 서열 (DC401271)
서열 번호: 15: 인간 천연 LRP1 안티센스 서열 (BM933147)
서열 번호: 16: 마우스 천연 LRP1 안티센스 서열 (CK626173)
서열 번호: 17: 마우스 천연 LRP1 안티센스 서열 (AW544265)
서열 번호: 18: 인간 천연 ABCA1 안티센스 서열 (bloflor.aApr07)
서열 번호: 19: 인간 천연 ABCA1 안티센스 서열 (sherflor.aApr07)
서열 번호: 20: 천연 APOE 안티센스 서열 (Hs.626623)
서열 번호: 21: 천연 APOE 안티센스 서열 (Hs.714236)
서열 번호: 22: 천연 APOA1 안티센스 서열 (DA327409 extended)
도 4는 ABCA1 안티센스 올리고뉴클레오티드, 서열 번호: 23 내지 40을 나타낸다. ‘r’은 RNA를 나타내고, * 는 포스포로티오에이트 결합을 나타낸다.
도 5는 LCAT 안티센스 올리고뉴클레오티드, 서열 번호: 41 내지 58을 나타낸다. ‘r’은 RNA를 나타내고, * 는 포스포로티오에이트 결합을 나타낸다.
도 6은 LRP1 안티센스 올리고뉴클레오티드, 서열 번호: 59 내지 73을 나타낸다. * 는 포스포로티오에이트 결합을 나타낸다.
도 7은 LDLR 안티센스 올리고뉴클레오티드, 서열 번호: 74 내지 83을 나타낸다. * 는 포스포로티오에이트 결합을 나타낸다.
도 8은 ApoE 안티센스 올리고뉴클레오티드, 서열 번호: 84 내지 92를 나타낸다. * 는 포스포로티오에이트 결합을 나타낸다.
도 9는 ApoA1 안티센스 올리고뉴클레오티드, 서열 번호: 93 내지 263을 나타낸다. ‘r’은 RNA를 나타내고, * 는 포스포로티오에이트 결합을 나타낸다.
도 10은 ABCA1 센스 올리고뉴클레오티드, 서열 번호: 264 내지 266을 나타낸다. 센스 올리고뉴클레오티드 서열 번호: 264 내지 266은 안티센스 올리고뉴클레오티드 서열 번호: 23 내지 24의 역보체다. ‘r’은 RNA를 나타낸다.
도 11은 LCAT 센스 올리고뉴클레오티드, 서열 번호: 275 내지 282를 나타낸다. 센스 올리고뉴클레오티드 서열 번호: 267 내지 274는 차례로 안티센스 올리고뉴클레오티드 서열 번호: 41 내지 48의 역보체다. ‘r’은 RNA를 나타낸다.
도 12는 다음을 나타낸다:
서열 번호: 275 내지 277은 ApoA1 안티센스 DA327409ext에 대해 커스텀 기획된 검사에 대해 각각 프로브 서열, 포워드 프라이머 서열과 리버스 프라이버 서열에 해당된다.
서열 번호: 278은 CUR 962에 대응되며, *는 포스포로티오에이트 결합을 나타내고, 그리고 +는 LNA를 나타낸다.
서열 번호: 279은 CUR 963에 대응되며, *는 포스포로티오에이트 결합을 나타내고, 그리고 +는 LNA를 나타낸다.
도 1a는 518A2 세포를 Lipofectamine 2000을 이용하여 도입된 siRNA 올리고뉴클레오티드로 처리한 후, 대조군과 비교하였을 때, ABCA1 mRNA에서 변화배수+표준 편차를 보여주는 실시간 PCR 결과 그래프다. 실시간 PCR 결과에서 518A2 세포들내에 ABCA1 mRNA 수준은 ABCA1 안티센스 AK311445에 대해 기획된 siRNA중 하나로 치료후 48시간에 상당히 증가한다는 것을 보여준다. 막대는 서열 번호: 23-25로 각 처리된 시료에 대응하는 CUR-0521, CUR-0519 및 CUR-0523을 차례로 나타낸다.
도 1b는 518A2 세포를 Lipofectamine 2000을 이용하여 도입된 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드로 처리한 후, 대조군과 비교하였을 때, ABCA1 mRNA에서 변화배수+표준 편차를 보여주는 실시간 PCR 결과 그래프다. 실시간 PCR 결과에서 518A2 세포들내에 ABCA1 mRNA 수준은 ABCA1 안티센스 AK311445에 대해 기획된 올리고중 6개로 치료후 48시간에 상당히 증가한다는 것을 보여준다. 막대는 서열 번호: 26-34로 각 처리된 시료에 대응하는 CUR-1214 내지 CUR-1222를 차례로 나타낸다.
도 1c는 3T3 세포를 Lipofectamine 2000을 이용하여 도입된 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드로 처리한 후, 대조군과 비교하였을 때, ABCA1 mRNA에서 변화배수+표준 편차를 보여주는 실시간 PCR 결과 그래프다. 실시간 PCR 결과에서 3T3 세포들내에 ABCA1 mRNA 수준은 ABCA1 안티센스 BF133827에 대해 기획된 올리고중 3개로 치료후 48시간에 상당히 증가한다는 것을 보여준다. 막대는 서열 번호: 36-38, 40 및 39로 각 처리된 시료에 대응하는 CUR-1087 내지 CUR-1090, CUR-1092 그리고 CUR-1091을 차례로 나타낸다.
도 1d는 Hek293 세포를 Lipofectamine 2000을 이용하여 도입된 siRNA 및 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드로 처리한 후, 대조군과 비교하였을 때, LCAT mRNA에서 변화배수+표준 편차를 보여주는 실시간 PCR 결과 그래프다. 실시간 PCR 결과에서 Hek293 세포들내에 LCAT mRNA 수준은 LCAT 안티센스 Hs.668679에 대해 기획된 올리고중 3개로 치료후 48시간에 상당히 증가한다는 것을 보여준다. 막대는 서열 번호: 41, 42, 58, 56 및 55로 각 처리된 시료에 대응하는 CUR-0476, CUR-0478, CUR-0822, CUR-0820 및 CUR-0819를 차례로 나타낸다.
도 1e는 HepG2 세포를 Lipofectamine 2000을 이용하여 도입된 siRNA 올리고뉴클레오티드로 처리한 후, 대조군과 비교하였을 때, LCAT mRNA에서 변화배수+표준 편차를 보여주는 실시간 PCR 결과 그래프다. 실시간 PCR 결과에서 HepG2 세포들내에 LCAT mRNA 수준은 LCAT 안티센스 Hs.668679에 대해 기획된 올리고중 2개로 치료후 48시간에 상당히 증가한다는 것을 보여준다. 막대는 서열 번호: 41, 42 및 44-47로 각 처리된 시료에 대응하는 CUR-0476, CUR-0478, CUR-0444, CUR-0446, CUR-0448 및 CUR-0450를 차례로 나타낸다.
도 1f는 HepG2 세포를 Lipofectamine 2000을 이용하여 도입된 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드로 처리한 후, 대조군과 비교하였을 때, LCAT mRNA에서 변화배수+표준 편차를 보여주는 실시간 PCR 결과 그래프다. 실시간 PCR 결과에서 HepG2 세포들내에 LCAT mRNA 수준은 LCAT 안티센스 Hs.668679에 대해 기획된 올리고중 1개로 치료후 48시간에 상당히 증가한다는 것을 보여준다. 막대는 서열 번호: 55, 54, 53, 52, 51 및 56-58로 각 처리된 시료에 대응하는 CUR-0819, CUR-0818, CUR-0817, CUR-0816, CUR-0815, CUR-0820, CUR-0821 및 CUR-0822를 차례로 나타낸다.
도 1g는 Vero 세포를 Lipofectamine 2000을 이용하여 도입된 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드로 처리한 후, 대조군과 비교하였을 때, LCAT mRNA에서 변화배수+표준 편차를 보여주는 실시간 PCR 결과 그래프다. 실시간 PCR 결과에서 Vero 세포들내에 LCAT mRNA 수준은 LCAT 안티센스 Hs.668679에 대해 기획된 올리고중 1개로 치료후 48시간에 상당히 증가한다는 것을 보여준다. 막대는 서열 번호: 55, 54, 53, 52, 51 및 56-58로 각 처리된 시료에 대응하는 CUR-0819, CUR-0818, CUR-0817, CUR-0816, CUR-0815, CUR-0820, CUR-0821 및 CUR-0822를 차례로 나타낸다.
도 1h는 HepG2 세포를 Lipofectamine 2000을 이용하여 도입된 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드로 처리한 후, 대조군과 비교하였을 때, LRP1 mRNA에서 변화배수+표준 편차를 보여주는 실시간 PCR 결과 그래프다. 실시간 PCR 결과에서 HepG2 세포들내에 LRP1 mRNA 수준은 LRP1 안티센스 DC401271에 대해 기획된 올리고로 치료후 48시간에 상당히 증가한다는 것을 보여준다. 막대는 서열 번호: 59 내지 61, 63, 62, 67, 65, 64 및 66로 각 처리된 시료에 대응하는 CUR-0767 내지 CUR-0769, CUR-0771, CUR-0770, CUR-0775, CUR-0773, CUR-0772 및 CUR-0774를 차례로 나타낸다.
도 1i는 Vero 세포를 Lipofectamine 2000을 이용하여 도입된 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드로 처리한 후, 대조군과 비교하였을 때, LRP1 mRNA에서 변화배수+표준 편차를 보여주는 실시간 PCR 결과 그래프다. 실시간 PCR 결과에서 Vero 세포들내에 LRP1 mRNA 수준은 LRP1 안티센스 DC401271 및 Hs.711951에 대해 기획된 올리고로 치료후 48시간에 상당히 증가한다는 것을 보여준다. 막대는 서열 번호: 60, 59, 66 및 64로 각 처리된 시료에 대응하는 CUR-0768, CUR-0767, CUR-0774 및 CUR-0772를 차례로 나타낸다.
도 1j는 3T3 세포를 Lipofectamine 2000을 이용하여 도입된 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드로 처리한 후, 대조군과 비교하였을 때, LRP1 mRNA에서 변화배수+표준 편차를 보여주는 실시간 PCR 결과 그래프다. 실시간 PCR 결과에서 3T3 세포들내에 LRP1 mRNA 수준은 LRP1 안티센스 DC401271 및 AW544265에 대해 기획된 올리고로 치료후 48시간에 상당히 증가한다는 것을 보여준다. 막대는 서열 번호: 68-73로 각 처리된 시료에 대응하는 CUR-1017 내지 CUR-1022를 차례로 나타낸다.
도 1k는 HepG2 세포를 Lipofectamine 2000을 이용하여 도입된 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드로 처리한 후, 대조군과 비교하였을 때, LDLR mRNA에서 변화배수+표준 편차를 보여주는 실시간 PCR 결과 그래프다. 실시간 PCR 결과에서 HepG2 세포들내에 LDLR mRNA 수준은 LDLR 안티센스 sherflor.aApr07에 대해 기획된 올리고로 치료후 48시간에 상당히 증가한다는 것을 보여준다. 막대는 서열 번호: 74-79로 각 처리된 시료에 대응하는 CUR-1054 내지 CUR-1059를 차례로 나타낸다.
도 1l는 HepG2 세포를 Lipofectamine 2000을 이용하여 도입된 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드로 처리한 후, 대조군과 비교하였을 때, LDLR mRNA에서 변화배수+표준 편차를 보여주는 실시간 PCR 결과 그래프다. 실시간 PCR 결과에서 HepG2 세포들내에 LDLR mRNA 수준은 LDLR 안티센스 bloflor.aApr07에 대해 기획된 올리고로 치료후 48시간에 상당히 증가한다는 것을 보여준다. 막대는 서열 번호: 79-83로 각 처리된 시료에 대응하는 CUR-1059 내지 CUR-1063를 차례로 나타낸다.
도 1m는 HepG2 세포를 Lipofectamine 2000을 이용하여 도입된 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드로 처리한 후, 대조군과 비교하였을 때, ApoE mRNA에서 변화배수+표준 편차를 보여주는 실시간 PCR 결과 그래프다. 실시간 PCR 결과에서 HepG2 세포들내에 APOE mRNA 수준은 APOE 안티센스 Hs.626623에 대해 기획된 올리고중 3개로 치료후 48시간에 상당히 증가한다는 것을 보여준다. 막대는 서열 번호: 89, 91, 92, 90, 84, 86, 85, 88 및 87로 각 처리된 시료에 대응하는 CUR-0978, CUR-0980, CUR-0981, CUR-0979, CUR-0973, CUR-0975, CUR-0974, CUR-0977 및 CUR-0976를 차례로 나타낸다.
도 1n 내지 1p는 HepG2 세포를 Lipofectamine 2000을 이용하여 도입된 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드로 처리한 후, 대조군과 비교하였을 때, ApoA1 mRNA에서 변화배수+표준 편차를 보여주는 실시간 PCR 결과 그래프다. 실시간 PCR 결과에서 HepG2 세포들내에 ApoA1 mRNA 수준은 ApoA1 안티센스 DA327409ext에 대해 기획된 올리고중 일부로 치료후 48시간에 상당히 증가한다는 것을 보여준다. 막대RH3-RH597은 서열 번호: 171-248로 각 처리된 시료에 대응한다.
도 1q는 HepG2 세포를 naked LNA 또는 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드로 7일에 걸쳐 처리한 후, 대조군과 비교하였을 때, ApoA1 mRNA (위 패널) 및 ApoA1 천연 안티센스 DA327409ext RNA (아래 페널에서) 배수 변화를 나타내는 실시간 PCR 결과를 나타내는 그래프다. #6LNA, #11LNA, #6PS 및 #11PS로 표시된 막대는 차례로 서열 번호: 249 내지 252를 나타낸다.
도 1r은 HepG2 세포를 LNA 올리고뉴클레오티드로 처리한 후, 대조군과 비교하였을 때, ApoA1 mRNA (오랜지색 막대)와 ApoA1 천연 안티센스 DA327409ext RNA (청색 막대)의 배수 변화를 나타내는 실시간 PCR 결과를 나타내는 그래프다. 6-11로 표시된 막대는 차례로 서열 번호: 249, 257 내지 260 그리고 250을 나타낸다.
도 1s는 HepG2 세포를 올리고뉴클레오티드로 처리한 후, 대조군과 비교하였을 때, ApoA1 mRNA (아래 패널)와 단백질(위 패널)의 배수 변화를 나타내는 실시간 PCR 결과를 나타내는 그래프다. CUR-4806 및 CUR-4811으로 표시된 막대는 차례로 서열 번호: 249 그리고 250을 나타낸다.
도 1t는 주요 아프리카 녹색 원숭이 간세포를 천연 ApoA1 안티센스 DA327409ext에 대한 올리고뉴클레오티드로 처리한 후, 대조군과 비교하였을 때, ApoA1 mRNA (아래 패널)의 상향을 나타내는 실시간 PCR 결과를 나타내는 그래프다. CUR-4816 및 CUR-4811으로 표시된 막대는 차례로 서열 번호: 263 그리고 250을 나타낸다.
도 1u는 ApoA1 안티센스 DA327409ext에 대해 기획된 올리고뉴클레오티드, CUR-962로 처리한 후, 실시간 PCR 및 ELISA(우측 패널)에 의해 각각 결정하여 기저 수준과 비교하였을 때, 원숭이 간 생검에서 ApoA1 mRNA 및 단백질 수준이 증가되었다는 것을 보여주는 그래프다. ApoA1 mRNA 또는 단백질 수준은 시험관에서 ApoA1 수준에 영향을 주지 않는 올리고뉴클레오티드(CUR-963) (좌측 패널)로 투여된 대조군에서 동일한 시간 후에 변화가 없었다. CUR-962 및 CUR-963으로 표시된 막대는 차례로 서열 번호: 260 및 261에 대응한다.
도 1v는 인간 및 붉은 털 원숭이(rhesus) ApoA1 천연 안티센스 서열의 나란한 배열과, 이들 서열을 표적하는데 이용되는 올리고뉴클레오티드의 일부 위치를 나타낸다.
도 2는 다음을 나타낸다:
서열 번호: 1: 호모 사피엔스(Homo sapiens) ATP-결합 카세트, 하위-패밀리 A (ABC1), 구성요소 1(ABCA1), mRNA (NCBI Accession No.: NM_005502).
서열 번호: 2: 호모 사피엔스(Homo sapiens) 레시틴-콜레스테롤 아세틸전이효소 (LCAT), mRNA (NCBI Accession No.: NM_000229.1).
서열 번호: 3: 호모 사피엔스(Homo sapiens) 저밀도 지단백질 수용체-관련된단백질 1 (LRP1), mRNA (NCBI Accession No.: NM_002332.2).
서열 번호: 4: 무스 무스쿨루스(Mus musculus) 저밀도 지단백질 수용체-관련된단백질 1 (Lrp1), mRNA (NCBI Accession No.: NM_008512.2).
서열 번호: 5: 호모 사피엔스(Homo sapiens) 저밀도 지단백질 수용체 (LDLR), mRNA (NCBI Accession No.: NM_000527.3).
서열 번호: 6: 호모 사피엔스(Homo sapiens) 아포리포단백질 E (APOE), mRNA (NCBI Accession No.: NM_000041.2).
서열 번호: 7: 호모 사피엔스(Homo sapiens) 아포리포단백질 A-I (APOA1), mRNA (NCBI Accession No.: NM_000039).
도 3은 다음을 나타낸다:
서열 번호: 8: 인간 천연 ABCA1 안티센스 서열 (AK311445)
서열 번호: 9: 마우스 천연 ABCA1 안티센스 서열 (BF133827)
서열 번호: 10: 인간 천연 LCAT 안티센스 서열 (Hs.668679)
서열 번호: 11: 인간 천연 LCAT 안티센스 서열 (Hs.593769)
서열 번호: 12: 인간 천연 LCAT 안티센스 서열 (Hs.387239)
서열 번호: 13: 인간 천연 LRP1 안티센스 서열 (Hs.711951)
서열 번호: 14: 인간 천연 LRP1 안티센스 서열 (DC401271)
서열 번호: 15: 인간 천연 LRP1 안티센스 서열 (BM933147)
서열 번호: 16: 마우스 천연 LRP1 안티센스 서열 (CK626173)
서열 번호: 17: 마우스 천연 LRP1 안티센스 서열 (AW544265)
서열 번호: 18: 인간 천연 ABCA1 안티센스 서열 (bloflor.aApr07)
서열 번호: 19: 인간 천연 ABCA1 안티센스 서열 (sherflor.aApr07)
서열 번호: 20: 천연 APOE 안티센스 서열 (Hs.626623)
서열 번호: 21: 천연 APOE 안티센스 서열 (Hs.714236)
서열 번호: 22: 천연 APOA1 안티센스 서열 (DA327409 extended)
도 4는 ABCA1 안티센스 올리고뉴클레오티드, 서열 번호: 23 내지 40을 나타낸다. ‘r’은 RNA를 나타내고, * 는 포스포로티오에이트 결합을 나타낸다.
도 5는 LCAT 안티센스 올리고뉴클레오티드, 서열 번호: 41 내지 58을 나타낸다. ‘r’은 RNA를 나타내고, * 는 포스포로티오에이트 결합을 나타낸다.
도 6은 LRP1 안티센스 올리고뉴클레오티드, 서열 번호: 59 내지 73을 나타낸다. * 는 포스포로티오에이트 결합을 나타낸다.
도 7은 LDLR 안티센스 올리고뉴클레오티드, 서열 번호: 74 내지 83을 나타낸다. * 는 포스포로티오에이트 결합을 나타낸다.
도 8은 ApoE 안티센스 올리고뉴클레오티드, 서열 번호: 84 내지 92를 나타낸다. * 는 포스포로티오에이트 결합을 나타낸다.
도 9는 ApoA1 안티센스 올리고뉴클레오티드, 서열 번호: 93 내지 263을 나타낸다. ‘r’은 RNA를 나타내고, * 는 포스포로티오에이트 결합을 나타낸다.
도 10은 ABCA1 센스 올리고뉴클레오티드, 서열 번호: 264 내지 266을 나타낸다. 센스 올리고뉴클레오티드 서열 번호: 264 내지 266은 안티센스 올리고뉴클레오티드 서열 번호: 23 내지 24의 역보체다. ‘r’은 RNA를 나타낸다.
도 11은 LCAT 센스 올리고뉴클레오티드, 서열 번호: 275 내지 282를 나타낸다. 센스 올리고뉴클레오티드 서열 번호: 267 내지 274는 차례로 안티센스 올리고뉴클레오티드 서열 번호: 41 내지 48의 역보체다. ‘r’은 RNA를 나타낸다.
도 12는 다음을 나타낸다:
서열 번호: 275 내지 277은 ApoA1 안티센스 DA327409ext에 대해 커스텀 기획된 검사에 대해 각각 프로브 서열, 포워드 프라이머 서열과 리버스 프라이버 서열에 해당된다.
서열 번호: 278은 CUR 962에 대응되며, *는 포스포로티오에이트 결합을 나타내고, 그리고 +는 LNA를 나타낸다.
서열 번호: 279은 CUR 963에 대응되며, *는 포스포로티오에이트 결합을 나타내고, 그리고 +는 LNA를 나타낸다.
본 발명의 몇 가지 측면들은 설명을 위한 실시예를 참고하여 하기에서 설명된다. 본 발명의 충분한 이해를 제공하기 위하여 다수의 특정 상세한 설명, 관계 및 방법들이 제공됨을 인지해야 한다. 그러나, 당업계 숙련자는 하나 이상의 특정 상세한 내용 없이 또는 기타 방법으로 본 발명을 실시할 수 있다는 것을 인지할 것이다. 본 발명은 일부 작용이 상이한 순서 및/또는 다른 작용 또는 사건과 동시에 발행될 수 있기 때문에 작용 또는 사건의 순서에 제한되지 않는다. 더욱이, 본 발명에 따른 방법을 실행하기 위하여 모든 설명된 작용 또는 사건이 모두 요구되지는 않는다.
여기에서 공개된 모든 유전자, 유전자 이름, 그리고 유전자 산물들은 여기에서 공개된 조성물 및 방법을 적용할 수 있는 특정 종의 상동체에 대응한다 따라서, 이들 용어는 인간 및 마우스의 유전자 및 유전자 산물들을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 특정 종의 유전자 또는 유전자 산물을 공개할 때, 이러한 공개는 설명을 위함이며, 명시적으로 다른 언급이 없는 한 이를 한정시키는 것으로 해석해서는 안된다. 따라서, 예를 들면, 일부 구체예에서는 포유동물 핵산 및 아미노산 서열에 관련된 여기에서 공개된 유전자는 기타 포유동물, 물고기, 양서류, 파충류 및 조류를 포함하나 이에 한정되지 않는 기타 동물들의 동족(homolous) 및/또는 진화종(orthologous) 유전자 및 유전자 산물들을 포함한다. 바람직한 구체예들에서, 유전자 또는 핵산 서열은 사람이다.
정의
여기에서 사용된 정의는 오로지 특정 구체예들을 설명하기 위함이며, 본 발명을 이에 한정시키고자 함은 아니다. 여기에서 사용된 것과 같이, 단수형은 명시적으로 다른 언급이 없는 한, 복수 개념을 포함한다. 더욱이, 상세한 설명 및/또는 청구범위에 이용된 포함하는("including"), 포함하다("includes"), 가지는("having"), 가지다("has"), ~와 함께("with") 또는 이의 변이체들에 대해서, 이러한 용어들은 포함하는("comprising")과 유사한 방법으로 포괄적인 의도이다.
용어 "약(about)" 또는 "대략(approximately)"은 당업계 숙련자가 결정하였을 때 특정 값에 대해 용인가능한 오차 범위내에 있다는 것을 의미하며, 측정 시스템의 한계내에서 그 값이 어떻게 측정되거나 또는 결정되는 지에 따라 부위적으로 달라질 것이다. 예를 들면, "약"은 당업계 실시과정마다 1이내 또는 1이상의 표준 편차를 의미할 수 있다. 대안으로, "약"은 주어진 값의 최대 20%, 바람직하게는 최대 10%, 더 바람직하게는 최대 5%, 그리고 더욱더 바람직하게는 최대 1%의 범위를 의미할 수 있다. 대안으로, 특히 생물학적 시스템 또는 공정에 대해, 이 용어는 값의 10배 범위, 바람직하게는 5-배이내, 그리고 더 바람직하게는 2-배이내를 의미한다. 특정 값이 명세서 및 청구항에 설명된 경우, 다른 언급이 없는 한, 용어 "약"은 특정 값의 수용가능한 오차 범위내에 있는 것을 의미하는 것으로 간주해야만 한다.
여기에서 사용된 것과 같이, 용어 "mRNA"는 표적 유전자의 현재 공지된 mRNA 전사체(들)과 추가로 밝혀질 임의의 추가 전사체를 의미한다.
"안티센스 올리고뉴클레오티드" 또는 "안티센스 화합물"은 또다른 RNA 또는 DNA (표적 RNA, DNA)에 결합하는 RNA 또는 DNA 분자를 의미한다. 예를 들면, 만일 RNA 올리고뉴클레오티드라면, RNA-RNA 상호작용 수단에 의해 또다른 RNA 표적에 결합하고, 표적 RNA의 활성을 변경시킨다(Eguchi et al., (1991) Ann. Rev. Biochem. 60, 631-652). 안티센스 올리고뉴클레오티드는 특정 폴리뉴클레오티드의 발현 및/또는 기능의 하향 또는 상향조절할 수 있다. 이 정의는 치료, 진단, 또는 기타 견지로부터 유용한 임의의 외부 RNA 또는 DNA 분자를 포함한다는 것을 의미한다. 이러한 분자들은 예를 들면, 안티센스 RNA 또는 DNA 분자들, 간섭 RNA (RNAi), micro RNA, 유인(decoy) RNA 분자들, siRNA, 효소 RNA, 치료 편집(editing) RNA 그리고 항진 및 길항 RNA, 안티센스 올리고머 화합물, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 외부 가이드 서열 (EGS) 올리고뉴클레오티드, 선택적 접합(alternate splicers), 프라이머, 프로브, 및 표적 핵산의 최소한 일부위에 혼성되는 기타 올리고머 화합물을 포함한다. 이와 같이, 이들 화합물들은 단일-가닥, 이중-가닥, 부위적으로 단일-가닥, 또는 원형 올리고머 화합물의 형태로 도입될 수 있다.
본 발명의 내용에서, 용어 "올리고뉴클레오티드"는 리보핵산 (RNA) 또는 데옥시리보핵산 (DNA)의 올리고머 또는 폴리머 또는 이의 모방체를 말한다. 용어 "올리고뉴클레오티드"는 데옥시리보뉴클레오시드, 리보뉴클레오시드, 이의 치환된 그리고 알파-아노머 형태, 펩티드 핵산 (PNA), 잠김(locked) 핵산 (LNA), 포스포로티오에이트, 메틸포스포네이트, 그리고 이와 유사한 것을 포함하는, 천연 및/또는 변형된 모노머 또는 링키지의 선형 또는 고리형 올리고머를 또한 포함한다. 올리고뉴클레오티드는 모노머-대-모노머 상호작용의 정규적 패턴, 가령, Watson-Crick 유형의 염기 쌍, Hoogsteen 또는 역 Hoogsteen 유형의 염기 쌍형성, 또는 이와 유사한 것에 의해 표적 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 결합할 수 있다.
올리고뉴클레오티드는 상이한 부위를 포함하는 키메라("chimeric")일 수 있다. 본 발명의 문맥에서, "키메라" 화합물들은 2개 이상 화학 부위, 예를 들면, DNA 부위(들), RNA 부위(들), PNA 부위(들) 등을 포함하는 올리고뉴클레오티드이다. 각 화학 부위는 최소한 한 개의 모노머 단위, 가령, 올리고뉴클레오티드 화합물의 경우 뉴클레오티드로 구성된다. 이러한 올리고뉴클레오티드는 전형적으로 최소한 한 부위를 포함하고, 여기서 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 바람직한 성질들을 나타내도록 변형된다. 올리고뉴클레오티드의 바람직한 성질들은 예를 들면, 뉴클레아제 분해에 대한 증가된 저항성, 증가된 세포의 취입(uptake), 및/또는 표적 핵산에 대한 증가된 결합 친화력을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 올리고뉴클레오티드의 상이한 부위는 따라서 상이한 성질들을 가질 수 있다. 본 발명의 키메라 올리고뉴클레오티드는 상기에서 설명된 것과 같이 2개 이상 올리고뉴클레오티드, 변형된 올리고뉴클레오티드, 올리고뉴클레오시드 및/또는 올리고뉴클레오티드 유사체들의 혼합된 구조로 형성될 수 있다.
올리고뉴클레오티드는 "리지스터(register)"내에서 연결될 수 있는 부위로 구성될 수 있는데, 즉, 모노머가 고유 DNA에서와 같이 연속적으로 연결되거나 또는 스페이스를 통하여 연결될 수 있다. 스페이스는 부위 사이에 공유 “다리”를 구성하고, 바람직한 경우에 약 100개 탄소 원자를 초과하지 않는 길이를 가진다. 스페이스는 상이한 기능성, 예를 들면, 양전하 또는 음전하를 가지며, 특정 핵산 결합 성질들 (인터카레이터(intercalators), 홈 결합자(groove binders), 독소, 형광단(fluorophors) etc.)을 나를 수 있고, 친지성일 수 있으며, 예를 들면, 알파-나선을 유도하는 알라닌을 포함하는 펩티드와 같이, 특정 2차 구조를 유도할 수 있는 등의 상이한 기능을 전달할 수 있다.
여기에서 사용된 것과 같이, "지질 수송 및 대사 유전자"는 모든 패밀리 구성요소들, 돌연변이들, 대립유전자, 단편들, 종, 코딩 및 넌코딩 서열들, 센스 및 안티센스 폴리뉴클레오티드 가닥들, 등을 포함한다.
여기에서 사용된 것과 같이, 단어 ATP-결합 카세트 1; 지질 수송 및 대사 유전자; ABC 수송물질 1; 콜레스테롤 유출 조절 단백질 (CERP), ABCA1, ABC-1, ABC1, CERP; FLJ14958; HDLDT1; TGD는 본 출원에서 호환 사용된다.
여기에서 사용된 것과 같이, 단어 레시틴-콜레스테롤 아세틸전이효소, LCAT, 포스파티딜콜린-스테롤 아세틸전이효소, 포스포리피드-콜레스테롤 아세틸전이효소는 본 출원에서 호환 사용된다.
여기에서 사용된 것과 같이, 단어 A2MR, 알파-2-마크로글로불린 수용체, APOER, 아포리포단백질 E 수용체, APR, CD91, FLJ16451, IGFBP3R, LRP, LRP-1, MGC88725, 프로로우(Prolow)-밀도 지단백질 수용체-관련된단백질 1, TGFBR5는 본 출원에서 호환 사용된다.
여기에서 사용된 것과 같이, 단어 LDLR, FH, FHC, LDLCQ2, LDL 수용체, 저-밀도 지단백질 수용체는본 출원에서 호환 사용된다.
여기에서 사용된 것과 같이, 단어 AD2, Apo-E, ApoE, 아포리포단백질 E, LDLCQ5, LPG, MGC1571는 본 출원에서 호환 사용된다.
여기에서 사용된 것과 같이, 단어 ApoA1, Apo-A1, 아포리포단백질 A1, MGC117399는 본 출원에서 호환 사용된다.
여기에서 사용된 것과 같이, 용어 "~에 특이적인 올리고뉴클레오티드 " 또는 "~을 표적으로 하는 올리고뉴클레오티드" (i) 표적 유전자의 일부분과 안정적인 복합체를 형성할 수 있는, 또는 (ii) 표적 유전자의 mRNA 전사체의 일부분과 안정적인 듀플렉스를 형성할 수 있는 서열을 가진 올리고뉴클레오티드를 말한다. 복합체와 듀플렉스의 안정성은 이론적 계산 및/또는 시험관 분석에 의해 결정할 수 있다. 혼성화 복합체들 및 듀플렉스의 안정성을 결정하는 예시적인 분석들은 하기 실시예에서 설명한다.
여기에서 사용된 것과 같이, 용어 "표적 핵산"은 DNA, 및 이러한 DNA로부터 전사된 RNA (premRNA 및 mRNA를 포함), 그리고 이러한 RNA, 코딩, 넌코딩 서열들, 센스 또는 안티센스 폴리뉴클레오티드로부터 유도된 cDNA를 포함한다. 올리고머 화합물과 이의 표적 핵산의 특이적 혼성화는 이 핵산의 정상적 기능을 간섭한다. 화합물들에 의한 표적 핵산의 기능 조절, 특별히 이에 혼상화되어 기능을 조절하는 것을 일반적으로 "안티센스"라고 한다. 간섭될 DNA의 기능은 예를 들면, 복제 및 전사를 포함한다. 간섭될 RNA의 기능은 모든 중요한 기능, 예를 들면, RNA가 단백질 해독 부위로 전위, RNA로부터 단백질의 해독, 하나 이상의 mRNA 종을 만들기 위한 RNA의 접합, 그리고 RNA에 관여하는 또는 RNA에 의해 실행되는 촉매 활성을 포함하는 기능을 포함한다. 표적 핵산 기능의 이러한 간섭의 전반적인 효과는 인코드된 산물 또는 올리고뉴클레오티드의 발현 조정이다.
RNA 간섭 "RNAi"는 이들의 "표적" 핵산 서열들에 서열-특이적 상동성을 가지는 이중 가닥 RNA(dsRNA) 분자들에 의해 중재된다(Caplen, N. J., et al. (2001) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:9742-9747). 본 발명의 특정 구체예들에서, 중개물질은 5-25개의 뉴클레오티드 "작은 간섭" RNA 듀플렉스 (siRNAs)다. siRNAs는 Dicer로 공지된 RNase 효소에 의해 dsRNA의 프로세싱으로부터 유도된다 (Bernstein, E., et al. (2001) Nature 409:363-366). siRNA 듀플렉스 산물들은 RISC (RNA 유도된 Silencing Complex)라고 불리는 다중-단백질 siRNA 복합체로 다시 모이게 된다. 특정 이론에 결부되는 것을 원하지 않고, 그 다음 RISC는 표적 핵산으로 안내되어 (적합하게는 mRNA), 여기서 siRNA 듀플렉스는 촉매적 방식에서 절단을 중재하기 위하여 서열-특이적 방식으로 상호작용한다(Bernstein, E., et al. (2001) Nature 409:363-366; Boutla, A., et al. (2001) Curr. Biol. 11:1776-1780). 본 발명에 따라 이용될 수 있는 작은 간섭 RNAs는 숙련자들이 잘 알고 있는 당업계에 공지되어 있는 과정에 따라 합성되고 이용될 수 있다. 본 발명의 방법에 적합하게 이용하기 위한 작은 간섭 RNAs는 약 1 내지 약 50개 뉴클레오티드 (nt)를 포함한다. 비-제한적 구체예들의 실시예에서, siRNAs는 약 5 내지 약 40개 nt, 약 5 내지 약 30 개 nt, 약 10 내지 약 30개 nt, 약 15 내지 약 25개 nt, 또는 약 20-25개 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
적당한 올리고뉴클레오티드의 선택은 핵산 서열들을 자동으로 배열하고, 동일 또는 상동 부위를 표시하는 컴퓨터 프로그램을 이용하여 용이하게 한다. 이러한 프로그램을 이용하여 핵산 서열들은 GenBank와 같은 데이터베이스 조사에 의해 또는 PCR 산물의 서열화에 의해 수득된 핵산 서열들을 비교한다. 다양한 종 범위로부터 핵산 서열들을 비교하면 종간에 적당한 수준의 동일성을 나타내는 핵산 서열들을 선별한다. 서열화되지 않은 유전자의 경우, Southern 블랏을 실행하여 표적 종과 기타 종에서 유전자간에 동일성 수준을 결정한다. 당업계에 공지되어 있는 것과 같이, 다양한 수준의 엄격성(stringency)에서 Southern 블랏을 실행함으로써, 동일성의 대략적인 측정이 가능하다. 이러한 과정은 또한 제어해야할 대상에서 표적 핵산 서열에 높은 수준의 상보성을 나타내며, 기타 종에서 대응 핵산 서열에 대해 더 낮은 수준의 상보성을 나타내는 올리고뉴클레오티드의 선택을 허용한다. 당업계 숙련자는 본 발명에 사용하는 적당한 부위 유전자를 선택함에 있어서 상당한 허용범위가 있다는 것을 인지할 것이다.
"효소 RNA"는 효소 활성(Cech, (1988) J. American. Med. Assoc. 260, 3030-3035)을 가진 RNA 분자를 의미한다. 효소 핵산 (리보자임)은 표적 RNA에 우선 결합하여 작용한다. 이러한 결합은 표적 RNA를 절단하도록 작용하는 분자의 효소 부분에 근접하게 있는 효소 핵산의 표적 결합 부분을 통하여 일어난다. 따라서, 효소 핵산은 염기 쌍형성을 통하여 표적 RNA를 먼저 인지하고, 그 다음 이에 결합하고, 그리고 정확한 부위에 일단 결합했다면, 효소적으로 작용하여 표적 RNA를 절단한다.
"유인(decoy) RNA" 는 리간드에 대한 천연 결합 도메인을 모방한 RNA 분자를 의미한다. 따라서, 유인 RNA는 특정 리간드의 결합에 대해 천연 결합 표적과 경쟁한다. 예를 들면, HIV 트란스-활성화 반응(TAR) RNA의 과다발현은 "유인"으로 작용하여 HIV tat 단백질에 효과적으로 결합하고, HIV RNA내에 인코드된 TAR 서열에 이의 결합을 방해하는 것으로 나타났다(Sullenger et al. (1990) 세포, 63, 601- 608). 이는 특정 실시예를 의미한다. 당업계 숙련자들은 이것은 하나의 예일 뿐이며, 당업계에 일반적으로 공지되어 있는 기술을 이용하여 기타 구체예들을 바로 만들 수 있다는 것을 인지할 것이다.
여기에서 사용된 것과 같이, 용어 "모노머"는 전형적으로 소수의 모노머 단위, 약 3-4개부터, 약 수백개의 모노머 단위까지 범위의 올리고뉴클레오티드를 만들기 위하여 포스포디에스테르 결합에 의해 연결된 모노머 또는 이의 유사체를 나타낸다. 포스포디에스테르 링키지(linkages)의 유사체들은 하기에서 더 상세하게 설명하는 것과 같이, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 메틸포스포르네이트, 포스포로셀레네이트, 포스포로아미데이트, 그리고 이와 유사한 것을 포함한다.
용어 “뉴클레오티드”는 자연적으로 생성되는 뉴클레오티드와 자연적으로 생성되지 않는 뉴클레오티드를 포함한다. 기존에 "자연적으로 생성되지 않는" 것으로 간주된 다양한 뉴클레오티드는 실질적으로 자연에서 볼 수 있다는 것은 당업계 숙련자에게 분명하게 해야만 한다. 따라서, "뉴클레오티드"는 공지의 퓨린 및 피리미딘 이형고리를 포함하는 분자들 뿐만 아니라, 이형고리 유사체 및 이의 호변체(tautomers)를 포함한다. 다른 유형의 뉴클레오티드의 예시적인 예는 아데닌, 구아닌, 티민, 시토신, 우라실, 퓨린, 산틴, 디아미노퓨린, 8-옥소-N6-메틸아데닌, 7-데아자산틴, 7-데아자구아닌, N4,N4-에타노시토신, N6,N6-에타노-2,6-디아미노퓨린, 5-메틸시토신, 5-(C3-C6)-알키닐시토신, 5-플루오로우라실, 5-브로모우라실, 슈도이소시토신, 2-하이드록시-5-메틸-4-트리아졸로피리딘, 이소시토신, 이소구아닌, 이노신 및 Benner et al., U.S. Pat No. 5,432,272에서 설명된 "자연적으로 생성되지 않는" 뉴클레오티드를 포함한다. 용어 "뉴클레오티드"는 이들 예들 모두와 이의 유사치 및 이의 호변체를 모두 포함한다. 특히 흥미로운 뉴클레오티드는 아데닌, 구아닌, 티민, 시토신, 우라실을 포함하는 것으로, 이들은 인간에서 치료 및 진단 사용과 관련된 천연 발생 뉴클레오티드로 간주된다. 뉴클레오티드는 Kornberg and Baker, DNA Replication, 2nd Ed. (Freeman, San Francisco, 1992)에서 설명하는 것과 같은 천연 2'-데옥시 및 2'-하이드록시 슈가를 포함하는 천연 뉴클레오시드 및 이들의 유사체들을 포함한다.
뉴클레오티드와 관련된 "유사체들"은 변형된 염기 모이어티 및/또는 변형된 슈가 모이어티를 가지는 합성 뉴클레오티드를 포함한다(Scheit, Mucleotide Analogs, John Wiley, New York, 1980; Freier & Altmann, (1997) Nucl. Acid. Res., 25(22), 4429- 4443, Toulm, J.J., (2001) Nature Biotechnology 19:17-18; Manoharan M., (1999) Biochemica et Biophysica Acta 1489:117-139; Freier S. M., (1997) Nucleic Acid Research, 25:4429-4443, Uhlman, E., (2000) Drug Discovery & Development, 3: 203-213, Herdewin P., (2000) Antisense & Nucleic Acid Drug Dev., 10:297-310); 2'-O, 3`-C-linked [3.2.0] bicycloarabinonucleosides (see e.g. N.K Christiensen., et al, (1998) J. Am. Chem. Soc., 120: 5458-5463; Prakash TP, Bhat B. (2007) Curr Top Med Chem. 7(7):641-9; Cho EJ, et al. (2009) Annual Review of Analytical Chemistry, 2, 241-264). 이러한 유사체들은 결합 성질들 예를 들면, 듀플렉스 또는 트리플렉스 안정성, 특이성, 또는 이와 유사한 것을 강화시키도록 기획된 합성 뉴클레오티드를 포함한다.
여기에서 사용된 것과 같이, "혼성화"는 올리고머 화합물들의 실질적인 보체 가닥들이 쌍을 형성하는 것(페어링)을 말한다. 페어링의 한 기전은 올리고머 화합물들의 가닥들의 상보적 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 염기(뉴클레오티드) 사이에 수소 결합을 포함하며, Watson-Crick, Hoogsteen 또는 역전된 Hoogsteen 수소 결합이 될 수 있다. 예를 들면, 아데닌 및 티민은 수소 결합 형성을 통하여 쌍을 이루는 보체 뉴클레오티드다. 혼성화는 다양한 환경하에서 일어날 수 있다.
안티센스 화합물은 화합물이 표적 핵산에 “특이적으로 결합하여” 표적 핵산의 정상적인 기능을 간섭하여, 그리고 특이적 결합이 바람직한 조건, 가령, 생체내 분석 또는 치료의 경우 생리학적 조건하에, 그리고 시험관 분석의 경우 분석이 실행되는 조건하에서 비-표적 핵산 서열에 안티센스 화합물의 비-특이적 결합을 회피하도록 충분한 보체 수준을 가진다.
여기에서 사용된 것과 같이, "엄격한 혼성화 조건" 또는 "엄격한 조건"은 본 발명의 화합물이 이의 표적 서열에 혼성화되지만, 기타 서열들에는 최소한 수로 혼성화되는 조건을 말한다. 엄격한 조건은 서열-의존적이며, 상이한 환경에서 달라질 것이며, 그리고 본 발명의 문맥에서, 올리고머 화합물들이 표적 서열에 혼성화되는 “엄격한 조건”은 올리고머 화합물들의 성질 및 조성물 그리고 조사될 분석에 의해 결정된다. 일반적으로, 엄격한 혼성화 조건은 Na++ 또는 K++와 같은 무기 양이온(가령, 낮은 이온 강도)과 낮은 염 농도(<0.15M), 올리고머 화합물:표적 서열 복합체의 Tm보다 아래의 20°C 내지 25℃보다 더 높은 온도, 그리고 포름아미드, 디메틸포름아미드, 디메틸 술폭시드, 또는 세제 도데실 설페이트 나트륨과 같은 변성제의 존재를 포함한다. 예를 들면, 혼성화 비율은 1% 포름아미드의 경우 1.1%로 감소된다. 높은 엄격성 혼성화 조건의 예는 60℃에서, 30분간 0.1× 염화나트륨-구연산나트륨 완충액(SSC)/0.1% (w/v) SDS이다.
"상보성"은 여기에서 사용된 것과 같이, 하나 또는 두개의 올리고머 가닥들상에서 2개 뉴클레오티드간에 정확한 페어링 능력을 말한다. 예를 들면, 안티센스 화합물의 특정 위치에 핵염기가 표적 핵산의 특정 위치의 핵염기와 수소결합할 수 있다면, 상기 표적 핵산은 DNA, RNA, 또는 올리고뉴클레오티드 분자이고, 그 다음 올리고뉴클레오티드와 표적 핵산 사이의 위치는 상호적 위치로 간주한다. 올리고머 화합물 및 추가 DNA, RNA, 또는 올리고뉴클레오티드 분자는 각 분자에서 충분한 수의 상보성 위치가 서로 수소 결합할 수 있는 뉴클레오티드에 의해 점유될 때 서로에 대해 상보성이다. 따라서, "특이적으로 혼성화가능한" 그리고 "상보성"은 올리고머 화합물과 표적 핵산 사이에 안정적이고 특이적인 결합이 일어나도록 충분한 수의 뉴클레오티드에 걸쳐 충분한 수준의 정확한 페어링 또는 상보성을 나타낼 때 사용되는 용어들이다.
올리고머 화합물의 서열은 특이적으로 혼성화되는 이의 표적 핵산의 서열에 100% 상보성일 필요가 없다는 것을 인지할 것이다. 더욱이, 올리고뉴클레오티드는 사이에 있는 또는 인접 단편(가령, 루프 구조, 미스매취 또는 헤어핀 구조)은 혼성화 과정에 관여하지 않도록 하나 이상의 단편에 걸쳐 혼성화될 수 있다. 본 발명의 올리고머 화합물들은 이들이 표적으로 하는 표적 핵산 서열내에 표적 부위에 대해 최소한 약 70%, 또는 최소한 약 75%, 또는 최소한 약 80%, 또는 최소한 약 85%, 또는 최소한 약 90%, 또는 최소한 약 95%, 또는 최소한 약 99% 서열 상보성을 포함한다. 예를 들면, 안티센스 화합물의 20개 뉴클레오티드중 18개가 표적 부위에 상보성이어서, 이에 때라 특이적으로 혼성화되는 안티센스 화합물은 90% 상보성을 나타낼 것이다. 이러한 예에서, 나머지 비-상보성 뉴클레오티드는 상보성 뉴클레오티드와 덩어리를 형성하거나 또는 간섭하게 될 수 있고, 그리고 서로 또는 상보성 뉴클레오티드에 인접해있을 필요는 없다. 이와 같이, 표적 핵산과 완전한 상보성을 가진 두 개 부위의 측면에 있는 4개의 비-상보성 뉴클레오티드를 가진 길이가 18개의 뉴클레오티드인 안티센스 화합물은 표적 핵산과 전체적으로 77.8% 상보성을 가질 것이며, 따라서, 본 발명의 범위에 속한다. 표적 핵산 부위와 안티센스 화합물의 상보성 비율은 당업계에 공지되어 있는 BLAST 프로그램 (기본적인 국소 배열 연구 도구) 및 PowerBLAST 프로그램을 이용하여 일상적으로 결정할 수 있다(Altschul et al., (1990) J. Mol. Biol., 215, 403-410; Zhang and Madden, (1997) Genome Res., 7, 649-656). 상동성 비율, 서열 동일성 또는 상보성은 Smith 및 Waterman의 알고리즘(Adv. Appl. Math., (1981) 2, 482-489)을 이용하는 디폴트 세팅을 이용하여 예를 들면, Gap 프로그램(Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 for Unix, 유전자tics Computer Group, University Research Park, Madison Wis.)에 의해 결정될 수 있다.
여기에서 사용된 것과 같이, 용어 "열 융점(Tm)"은 정의된 이온 강도, pH 및 핵산 농도하에서 표적 서열에 상보적인 올리고뉴클레오티드의 50%가 평형상태에서 표적 서열에 혼성화될 때 온도를 말한다. 전형적으로, 엄격성 조건은 염 농도가 pH 7.0 내지 8.3에서 최소한 약 0.01 내지 1.0 M Na 이온 농도(또는 이들의 염)이며, 이 온도는 짧은 올리고뉴클레오티드 (가령, 10 내지 50개 뉴클레오티드)의 경우 최소한 약 30℃이다. 엄격한 조건은 포름아미드와 같은 탈안정화제를 첨가하며 얻을 수도 있다.
여기에서 사용된 것과 같이, "조정(modulation)"은 유전자의 발현을 증가(자극) 또는 감소 (억제)를 의미한다.
폴리뉴클레오티드 서열의 내용에서 이용된 용어 “변이체(variant)”는 야생형 유전자에 관련된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 이 정의에는 예를 들면, "대립유전자(allelic)", "접합(splice)", "종(species)", 또는 "다형성(polymorphic)" 변이체를 포함한다. 접합 변이체는 기준 분자에 대해 상당한 동일성을 가질 수 있지만, mRNA 프로세싱 동안 엑손의 교대 접합으로 인하여 더 많은 또는 더 적은 수의 폴리뉴클레오티드를 가질 수 있다. 대응하는 폴리펩티드는 추가 기능 도메인을 가지거나 또는 도메인이 없을 수 있다. 종 변이체는 종마다 다양한 폴리뉴클레오티드 서열들이다. 본 발명에 특히 유용한 것은 야생형 유전자 산물의 변이체다. 변이체들은 핵산 서열에서 최소한 하나의 돌연변이로 인하여 발생될 수 있고, 그리고 변경된 mRNA 또는 기능 또는 구조가 변경된 또는 변경되지 않은 폴리펩티드를 만들 수 있다. 임의의 주어진 천연 또는 재조합 유전자는 대립유전자가 없거나 하나 또는 많은 대립유전자를 가질 수 있다. 변이체를 발생시키는 공통의 돌연변이적 변화는 뉴클레오티드의 천연 결손, 추가 또는 치환으로 인한 것이다. 이들 유형의 각 변화는 단독으로 일어나거나, 다른 것과 함께 일어날 수 있고, 주어진 서열에서 1회 이상 발생될 수 있다.
생성된 폴리펩티드는 서로에 대해 상당한 아미노산 동일성을 일반적으로 가질 것이다. 다형성 변이체는 주어진 종의 개체간에 특정 유전자의 폴리뉴클레오티드 서열에서 변화이다. 다형성 변이체는 또한 "단일 뉴클레오티드 다형성" (SNPs,) 또는 폴리뉴클레오티드 서열이 한 개 염기에 의해 변화되는 단일 염기 돌연변이를 포함할 수 있다. SNPs의 존재는 예를 들면, 민감성 대 저항성의 질병 상태에 대한 성향을 가진 특정 집단을 나타낼 수 있다.
유도체 폴리뉴클레오티드는 화학 변형을 받게 된 핵산, 예를 들면, 알킬, 아실, 또는 아미노 기에 의해 치환된 핵산을 포함한다. 유도체들, 가령, 유도체 올리고뉴클레오티드는 변형된 슈가 모이어티 또는 슈가 간 링키지와 같은 천연에서 발생되지 않은 부분들을 포함할 수 있다. 이들중 예로는 당업계에 공지되어 있는 포스포로티오에이트 및 기타 황을 포함하는 종들이다. 유도체 핵산은 방사능뉴클레오티드, 효소, 형광 물질, 화학적발광 물질, 발색 물질, 기질, 공인자, 억제, 자성 입자, 그리고 이와 유사한 것을 포함하는 표지를 또한 포함할 수 있다.
"유도체" 폴리펩티드 또는 펩티드는 예를 들면, 글리코실화, 페길화, 포스포릴화, 황산화, 환원/알킬화, 아실화, 화학 결합, 또는 약한 포르말린 처리에 의해 변형된 것이다. 유도체는 방사능동위원소, 형광, 및 효소 표지를 포함하나 이에 한정되지 않는 직간접적으로 탐지가능한 표지를 포함하도록 또한 변형될 수 있다.
여기에서 사용된 것과 같이, 용어 "동물" 또는 "환자"는 예를 들면, 인간, 양, 엘크, 사슴, 뮬 사슴, 밍크, 포유동물, 원숭이, 말, 소, 돼지, 염소, 개, 고양이, 쥐, 마우스, 새, 닭, 파충류, 물고기, 곤충 그리고 거미류를 포함한다.
"포유동물"은 전형적으로 건강관리를 받는(가령, 인간 및 길들여진 동물들) 온혈 포유동물을 포함한다. 예로는 고양이과, 갯과, 말과, 솟과, 그리고 인간, 및 오로지 인간을 포함한다.
"치료하는(Treating)" 또는 "치료(treatment)"는 포유동물에서 질병 상태의 치료를 포함하고, 그리고 (a) 포유동물에서 질병 상태가 일어나는 것을 막고, 특히 포유동물이 이 질병 상태에 걸리기 쉽지만 아직 걸린 것으로 진단받지 않은 경우; (b) 질병 상태를 억제하는, 가령, 질병의 발생을 억제하는; 및/또는 (c) 질병-상태를 완화시키는, 가령, 바람직한 종점에 도달할 때까지 질병 상태의 퇴보시키는 것을 포함한다. 처리는 또한 질병의 증상을 개선(가령, 통증 또는 불편함을 감소)시키는 것을 포함하며, 여기서 이러한 개선은 질병 상태에 직접적으로 영향을 주거나 주지 않을 수 있다(가령, 원인, 전달, 표현 등).
여기에서 사용된 것과 같이, "암"은 백혈병, 림프종, 흑색종, 암종 및 육종을 포함하나 이에 한정되지 않는 포유류에서 발견되는 모든 유형의 암 또는 신형성 또는 악성 종양을 말한다. 암 자체로 암의 악성 세포들을 포함하는 조직을 말한다. 종양의 예는 육종 및 암종, 예를 들면: 섬유육종, 점액육종, 지방육종, 연골육종(chondrosarcoma), 골형성(osteogenic) 육종, 척색종(chordoma), 혈관육종, 다중특발성출혈성육종(endotheliosarcoma), 스튜어트 - 트레브 신드롬 (lymphangiosarcoma), 림프혈관내피육종(lymphangioendotheliosarcoma), 활액육종(synovioma), 중피종(mesothelioma), Ewing 종양, 부드러운 근육결합조직육종(leiomyosarcoma), 횡문근육종, 결장 암종, 췌장암, 유방암, 난소암, 전립선암, 편평 세포 암종, 기저 세포 암종, 선암, 땀샘 암종, 피지선피지선 암종, 유두상 암종, 유두상 선종, 낭선암종, 수질 암종, 기관지 암종, 신장 세포 암종, 간종양, 담관 암종, 융모막암종, 고환종, 배 암종, Wilms 종양, 경부암, 고환 종양, 폐 암종, 소(small) 세포 폐 암종, 방광 암종, 상피 암종, 신경교종, 성상세포종, 수질아세포종, 두개인두종, 뇌실막세포종, 송과체종(pinealoma), 혈관모세포종, 청각 신경교종, 희소돌기아교세포종, 수막종, 흑색종, 신경아세포종, 그리고 망막아종을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 본 발명에 따른 공개된 조성물에 의해 치료될 수 있는 추가적인 암은 예를 들면, Hodgkin 질환, Non-Hodgkin 림프종, 다발성 골수종, 신경아세포종, 유방암, 난소암, 폐암, 횡문근육종, 일차성 혈소판증가증, 일차성 마크로블린혈증, 소-세포 폐 종양, 일차성 뇌종양, 위암, 결장암, 악성 췌장 일슐린종, 악성 암양종, 비뇨기 방광암, 사전악성 피부 병소, 고환암, 림프종, 갑상선 암, 신경아세포종, 식도 암, 비뇨생식기관 암, 악성 고칼슘혈증, 경부암, 자궁내막암, 부신 피질암, 그리고 전립선 암을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
"신경 질환 또는 장애"는 신경계 및/또는 시계의 임의의 질환 또는 장애를 말한다. "신경 질환 또는 장애"는 중추 신경계 (뇌, 뇌간 및 소뇌), 말초 신경계 (뇌신경을 포함), 그리고 자율 신경계 (중추 및 말초 신경계 모두에 위치한 일부)가 관련된 질환 또는 장애를 포함한다. 신경 장애의 예로 두통, 마비 및 혼수, 치매, 발작, 수면 장애, 외상, 감염, 신생물, 신경안과학, 운동 장애, 탈수초화 질환, 척추 장애, 및 말초 신경, 근육 및 신경근 접합점의 장애를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 중독 및 정신병은 양극 장애 및 정신분열증을 포함하나 이에 한정되지 않으며, 이들 또한 신경 장애의 정의에 포함된다. 다음은 본 발명에 따른 조성물 및 방법을 이용하여 치료될 수 있는 몇 가지 신경 장애, 증상, 신호 및 증후군의 목록이다: 후천성 간질 실어; 급성 파종성 뇌척수염; 부신백질이영양증; 노인성 황반 변성; 뇌량의 발육부진; 인지불능; Aicardi 증후군; Alexander 질환; Alpers 질환; 교대성 반신마비; 맥관 치매; 근위축성 척색 경화증; 무뇌증; Angelman 증후군; 혈관종(angiomatosis); 산소결핍; 실어증; 운동불능; 거미집모양의 낭종; 거미집모양의 염증(arachnoiditis); Anronl-Chiari 변형; 동정맥 변형; Asperger 증후군; 기능장애 운동실조; 주의력 결핍 과다행동 장애; 자폐증; 자율 장애; 등 통증; Batten 질환; Behcet 질환; Bell 마비; 양성 필수 안검경련; 양성 초점; 근위축증; 양성 두개내 고혈압; Binswanger 질환; 안검경련; Bloch Sulzberger 증후군; 상완 신경 얼기 부상; 뇌 종기; 뇌 손상; 뇌 종양들(교아종 다형포함); 척추 종양; Brown-Sequard 증후군; Canavan 질환; 손목관절 터널 증후군; 작열통; 중앙 통증 증후군; 중심성교뇌수초용해; 두부 장애; 대뇌 동맥류; 대뇌 동맥경화증; 대뇌 위축; 대뇌 거대증; 대뇌 마비; Charcot-Marie-Tooth 질환; 화학요법-유도된 신경병질 및 신경병증 통증; Chiari 변형; 무도병; 만성 염증성 탈수초화 다발신경병질; 만성통증; 만성 국부 통증 증후군; Coffin Lowry 증후군; 지속적인 발육 상태를 포함하는 혼수; 선천적 안면 양측마비; 피질기저 퇴화; 두개 동맥염; 두개골유합증; Creutzfeldt-Jakob 질환; 누적성 외상 장애; Cushing 증후군; 세포 거대 봉입체 질환; 사이토메갈로바이러스 감염; 춤추는 눈-춤추는 발 증후군; DandyWalker 증후군; Dawson 질환; De Morsier 증후군; Dejerine-Klumke 마비; 치매; 피부근염; 당뇨성 신경병질; 미만성 경화증; 자율신경실조증; 난서증; 난독증; 긴장이상; 조기 유아 간질 뇌증; 빈 Sella 증후군; 뇌염; 뇌류(encephaloceles); 뇌삼차 신경성 혈관종증; 간질; Erb 마비; 본태성 진전증; Fabry's 질환; Fahr's 증후군; 기절; 가족성 강직성 마비; 열병 발작; Fisher 증후군; Friedreich 운동실조; 전두측엽 치매 및 기타 "타우병증"; Gaucher 질환; Gerstmann 증후군; 거대 세포 동맥염; 거대 세포 함유 질환; 구상세포 대뇌피질이영양증; Guillain-Barre 증후군; HTLV-1-관련된 골수증; Hallervorden-Spatz 질환; 두부 손상; 두통; 반측안면 경련증; 유전성 강직성 대마비; 유전성 다발성 신경염증 실조; 이성대상포진; 대상포진; Hirayama 증후군; HIV-관련된 치매 및 신경병질 (또는 AIDS의 신경성 현시); 전전뇌증; Huntington 질환 및 기타 폴리글루타민 반복 질환; 수두무뇌증; 물뇌증; 과콜리졸혈증; 혈중산소감소증; 면역-중재된 뇌척수염; 봉입체 근염; 색조 실조증; 영아 피틴산 축적 질환; 영아 레프슘 질환; 영아 경련; 염증성 근질환; 두개내 낭종; 두개내 고혈압; Joubert 증후군; Keams-Sayre 증후군; Kennedy 질환 Kinsboume 증후군; Klippel Feil 증후군; Krabbe 질환; Kugelberg-Welander 질환; 쿠루병; Lafora 질환; Lambert-Eaton 근무력 증후군; Landau-Kleffner 증후군; 측면 수질 (Wallenberg) 증후군; 학습 장애; Leigh 질환; Lennox-Gustaut 증후군; Lesch-Nyhan 증후군; 백질이영양증; Lewy 몸통 치매; Lissencephaly; locked-in 증후군; Lou Gehrig 질환 (가령, 운동 신경 질환 또는 근위축성 척색 경화증); 요추간반 질환; Lyme 질환--신경 후유증; Machado-Joseph 질환; 큰뇌증; 거대뇌증; Melkersson-Rosenthal 증후군; Menieres 질환; 뇌막염; Menkes 질환; 이염백질이영양증; 소두증; 편두통; Miller Fisher 증후군; 미니-뇌졸증; 미토콘드리아 근병증; Mobius 증후군; 일지성 근위축증; 운동 신경 질환; Moyamoya 질환; 뮤코다당증; 다발경색 치매; 다병소성 운동 신경병질; 다발성 경화증 및 기타 탈수초화 장애; 체위성 저혈압과 다계통 위축증; p 근육 영양실조; 중증근육무기력증; 말이집탈락성 광범위 경화증; 유아의 근간대성 뇌병증; 근질환; 본태성 근긴장; 기면발작; 신경섬유종증; 신경이완성 악성 증후군; AIDS의 신경성 현시; 낭창의 신경 후유증; 신경근육긴장증; 신경 세로이드 리포푸신증; 신경이동 장애; Niemann-Pick 질환; O'Sullivan-McLeod 증후군; 후두 신경통; 구속성 척추 증후군; Ohtahara 증후군; 올리브교 소뇌 위축증; 안구간대경련-근간대경련; 시신경염; 기립성 저혈압; 과사용 증후군; 이상 감각; 신경퇴행성 질환 또는 장애 (Parkinson 질환, Huntington 질환, Alzheimer 질환, 근위축성 척색 경화증 (ALS), 치매, 다발성 경화증 그리고 신경 세포 사멸과 관련된 기타 질환 및 장애); 선천 이상근육근긴장; 종양연관 질환; 돌발발작; Parry Romberg 증후군; Pelizaeus-Merzbacher 질환; 주기적 마비; 말초 신경병질; 통증있는 신경병질 및 신경병증 통증; 지속적인 성장 상태; 전반적 발달 장애; 빛 재채기 반사; 피탄산 축적 질환; Pick 질환; 신경 압박; 뇌하수체 종양; 다발성근염; 공뇌증; 소아마비 증후군; 대상포진후 신경통; 감염후뇌척수염; 체위성 저혈압; Prader-Willi 증후군; 원발성 척색 경화증; 프리온 질환; 진행성 반얼굴 위축; 진행성 다초점 백색질뇌증; 진행성 경화 회백질위축증; 진행성 핵상 마비; 가성뇌종양; Ramsay-Hunt 증후군 (유형 I 및 II); Rasmussen 뇌염; 반사성교감신경이영양증 증후군; Refsum 질환; 반복성 운동 장애; 반복성 스트레스 손상; 하지불안 증후군; 레트로바이러스-연관 골수증; Rett 증후군; Reye 증후군; Saint Vitus 댄스; Sandhoff 질환; Schilder 질환; 뇌갈림증; 중격-시신경 형성장애; 흔들린 아이 증후군; 대상포진; Shy-Drager 증후군; Sjogren 증후군; 수면 무호흡; Soto 증후군; 경련성 마비; 척추 파열; 척추 손상; 척추 종양; 척추 근위축; Stiff-Person 증후군; 발작; Sturge-Weber 증후군; 아급성 경화성 범뇌염; 피질하부 동맥경화성 뇌병; Sydenham 무도병; 실신; 척수공동증; 지연성 운동장애; Tay-Sachs 질환; 일시적 동맥염; 계류 척추 증후군; Thomsen 질환; 흉곽 출구 증후군; Tic Douloureux; Todd 마비; Tourette 증후군; 일과성 허혈 발작; 전염성 해면상뇌증; 횡단성 척추염; 외상성 뇌 손상; 진전; 삼차 신경통; 열대 경직 하반신 마비; 결절성 경화증; 맥관 치매 (다발-경색 치매); 일시적 동맥염을 포함하는 맥관염; Von Hippel-Lindau 질환; Wallenberg 증후군; Werdnig-Hoffman 질환; West 증후군; 편달; Williams 증후군; Wildon 질환; 그리고 Zellweger 증후군을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
"염증"은 전신 염증성 이상 및 단핵세포, 백혈구 및/또는 호중구의 이동 및 견인과 국소적으로 관련된 이상을 말한다. 염증의 예는 병원성 유기체(그람-양성 세균, 그람-음성 세포, 바이러스, 곰팡이 그리고 원생동물문 및 기생충과 같은 기생충을 포함)에 의한 감염, 이식 거부 (신장, 간, 폐, 또는 각막과 같은 고형 장기의 거부와 이식편대 숙주병(GVHD))을 포함한 골수 이식의 거부를 포함), 또는 국소화된 만성 또는 급성 자가면역 또는 알레르기 반응으로 인한 염증을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 자가면역 질환들은 급성 사구체신염; 류마티즘성 또는반응성 관절염; 만성 사구체신염; 염증성 장 질환들 가령, Crohn 질환, 궤양성 결장염 그리고 괴사성 전장염; 과립구 주입 관련 증후군; 염증성 피부질환 가령, 접촉성 피부염, 아토피성 피부염, 건선; 전신 홍반성 루프스(SLE), 자가면역 갑상선염, 다발성 경화증, 그리고 일부 형태의 당뇨병 또는 환자의 자기 면역계의 공격에 의해 병인성 조직 파괴를 야기하는 임의의 기타 자가면역상태를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 알레르기 반응은 알레르기 천식, 만성 기관지염, 급성 그리고 지연된 과민성을 포함한다. 전신 염증성 질환 상태는 외상, 화상, 허혈후에 따른 재관류와 관련된 염증 (가령, 폐, 뇌, 내장 또는 말초 맥관에서 심근경색 및 발작을 포함하 혈전증), 폐혈증, ARDS 또는 다발성 장기부전 증후군을 포함한다. 염증성 세포 모집은 또한 죽상경화성 플라크에서도 발생한다. 염증은 Non-Hodgkin 림프종, We유전자r 육아종증, Hashimoto 갑상선염, 간세포 암종, 흉선 위축, 만성 췌장염, 류마티즘성 관절염, 반응성 림프 비후증, 골관절염, 궤양성 결장염, 유두상 암종, Crohn 질환, 궤양성 결장염, 급성 담낭염, 만성 담낭념, 간경변, 만성 타액선염, 복막염, 급성 췌장염, 만성 췌장염, 만성 위염, 자궁선근종, 자궁내막증, 급성 자궁경관염, 만성 자궁경관염, 림프 비후, 다발성 경화증, 특발성 혈소판 감소 자색반병에 후속되는 비대, 일차성 IgA 신증, 전신 홍반성 루프스, 건선, 폐기종, 만성 신우신염, 그리고 만성 방광염을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
‘심혈관 질환 또는 장애’는 허혈을 일으킬 수 있는 또는 심장의 재관류에 의해 질환을 포함한다. 예로는 아테롬성 동맥경화증, 관상 동맥 질환, 육아종성 심근염, 만성 심근염 (비-육아종성), 일차성 비대성 심근증, 말초 동맥 질환 (PAD), 발작, 협심증, 심근 경색, 심장 마비에 의한 심혈관 조직 손상, 심폐 바이패스에 의한 심혈관 조직 손상, 심장 쇼크, 그리고 지질 수송 및 대사 유전자 활성화와 관련된 조직 손상을 포함하는 당업계 숙련자에게 공지된 또는 심장 또는 맥관구조의 부전 또는 조직 손상과 관련된 이상을 포함하나 이에 한정되지 않는다. CVS 질환들은 아테롬성 동맥경화증, 육아종성 심근염, 심근 경색, 판 모양의 심장 질환에 부차적인 심근 섬유증, 경색없이 심근 섬유증, 일차성 비대성 심근증, 그리고 만성 심근염 (비-육아종증)을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
“대사 질환 또는 장애”는 예를 들면, 인슐린 저항성, 당뇨병, 비만, 손상된 내당성, 혈액 고콜레스테롤, 혈당과다, 과인슐린혈증, 이상지질혈증 및 과다지질혈증을 포함하는 엔도크린계의 광범위한 질환 및 장애를 말한다.
폴리뉴클레오티드 및 올리고뉴클레오티드 조성물 및 분자들
표적:
한 구체예에서, 표적은 지질 수송 및 대사 유전자와 연합된 센스 및/또는 안티센스 넌코딩 및/또는 코딩 서열들을 포함하나 이에 한정되지 않는 지질 수송 및 대사 유전자의 핵산 서열들을 포함한다.
한 구체예에서, 표적들은 ABCA1 유전자와 연합된 센스 및/또는 안티센스 넌코딩 및/또는 코딩 서열을 포함하나 이에 한정되지 않는, ABCA1의 핵산 서열을 포함한다.
한 구체예에서, 표적들은 LCAT 유전자와 연합된 센스 및/또는 안티센스 넌코딩 및/또는 코딩 서열을 포함하나 이에 한정되지 않는, LCAT의 핵산 서열을 포함한다.
한 구체예에서, 표적들은 LRP1 유전자와 연합된 센스 및/또는 안티센스 넌코딩 및/또는 코딩 서열을 포함하나 이에 한정되지 않는, LRP1의 핵산 서열을 포함한다.
한 구체예에서, 표적들은 저밀도 지단백질 수용체 (LDLR) 유전자와 연합된 센스 및/또는 안티센스 넌코딩 및/또는 코딩 서열을 포함하나 이에 한정되지 않는, LDLR의 핵산 서열을 포함한다.
한 구체예에서, 표적들은 아포리포단백질 (ApoA1) 유전자와 연합된 센스 및/또는 안티센스 넌코딩 및/또는 코딩 서열을 포함하나 이에 한정되지 않는, ApoA1의 핵산 서열을 포함한다. 인간 아포리포단백질 A-I (ApoA-I)은 고밀도 지단백질 (HDL) 및 임파 킬로미크론의 주요 단백질 구성원이다. 인간 혈장에서 4가지 주요 순환 지단백질은 다음과 같이 명명되었다: 킬로미크론 (CM), 초저밀도 지단백질 (VLDL), 저밀도 지단백질 (LDL), 및 고밀도 지단백질 (HDL). HDL은 말초 조직으로부터 콜레스테롤을 간 또는 기타 지반백으로 수송함으로써 콜레스테롤의 제거에 관계한다.
ATP-결합 카세트, 서브-패밀리-A (ABCAI) 구성요소 I ABCAI은 세포 지질 제거 경로에서 콜레스테롤 유출 펌프로 기능한다.
ATP-결합 카세트 수송물질 (ABC-수송물질)은 원핵생물에서 인간에 이르는 모든 현존하는 종에서 대표되는 가장 거대하고 가장 고대의 패밀리중 하나인 단백질 슈퍼패밀리의 구성요소들이다. ABC 수송물질들은 아데노신 삼인산염 (ATP) 가수분해의 에너지를 이용하여 막을 가로질러 다양한 기질들의 전위, 그리고 RNA 및 DNA 복구의 해독과 같은 운송과 무관한 공정들을 포함하는 특정 생물학적 공정들을 실행하는 막통과 단백질들이다. 이들은 대사 산물들, 지질 및 스테롤, 그리고 약물을 포함하는 세포외 그리고 세포내 막을 통과하는 광범위한 기질들을 운반한다. 단백질들은 이들의 ATP-결합 카세트 (ABC) 도메인(들)의 서열 및 조직화에 근거하여 ABC 수송물질로 분류된다. ABC 수송물질들은 종양 저항, 낭종성 섬유증, 세균성 다중약물 저항, 그리고 기타 유전된 인간 질환 범주에 관련된다.
ABC1 유전자에 의해 인코드된 막-연합된 단백질은 ATP-결합 카세트 (ABC) 수송물질들의 슈퍼패밀리의 구성요소다. ABC 단백질들은 세포외 및 세포내 막을 통한 다양한 분자들을 수송한다. ABC 유전자들은 7가지 별개의 하위패밀리로 나뉜다(ABCA, MDRITAP, MRP, ALD, OABP, GCN20, White). 이 단백질은 ABCA 하위패밀리의 구성요소다. ABCA 하위패밀리의 구성요소들은 다중세포 진핵생물에서 배타적으로 발견되는 유일한 주요 ABC 하위패닐리를 포함한다. 이의 기질로 콜레스테롤과 함께, 이 단백질은 세포 지질 제거 경로에서 콜레스테롤 유출 펌프로 기능을 한다.
바람직한 구체예들에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 ATP-결합 카세트 분자들과 연합된 질환 또는 장애를 예방 또는 치료하는데 이용된다. ATP-결합 카세트 수송물질 ABC1 (인간 수송물질 하위패밀리 ABCA의 구성요소 1)-콜레스테롤 유출 조절 단백질 (CERP)로도 알려짐-은 ABC1 유전자에 의해 인코드된 인간에 있는 단백질이다. 이러한 수송물질은 세포 콜레스테롤 및 포스포리피드 항상성의 주요 조절물질이다.
ABC1은 고밀도 지단백질 (HDL)에 존재하여, 인간 세포 막으로부터 과도한 콜레스테롤 및 포스포리피드의 제거를 허용한다. 이 단백질은 신체 구석구석에서 필요하기 때문에, 신체는 220-kDa 단백질로 어디서나 합성한다. 간, 소장 및 지방 조직과 같은 지질의 전도(turnover)를 정기적으로 움직이거나 또는 이에 관련된 조직안에 더 많은 양으로 존재한다.
ABC1 수송물질 발현에 작용하거나 또는 이의 해독후 변형시에 작용하는 인자들은 또한 지방산, 콜레스테롤 그리고 또한 사이토킨 그리고 환식 아데노신 단일인산염과 같이 이의 후속적인 기능에 관계한다.
저밀도 지단백질 수용체-관련된단백질 1 (LPR1)은 약 4544개 아미노산; 504575 Da이다. 이 단백질은 85-kDa의 막-결합된 카르복실 아단위 및 비공유적으로 부착된 515-kDa 아미노-말단 아단위의 이종이량체다. 세포내 도메인은 MAFB와 상호작용한다. LPR1은 PIDlIPCLI1, LRP1 및 CUBNI와의 복합체로 발견된다. SNX17, PID1IPCLI1, PDGF, LRPAP1 및 CUBN과 상호작용한다. 세포내 도메인은 SHC1, GULP1 및 DABl와 상호작용한다.
LRP1은 세포이물흡수(세포이물흡수) 및 아팝토시스 세포; 초기 배 발생; 세포 지질 항상성; 킬로미크론 나머지 및 활성화된 LRPAP1 (알파 2-마크로글로불린)의 혈장 청소; 플라스미노겐 활성화물 및 이들의 내생성 억제제 사이의 복합체의 국소 대사에 관련된 세포이물흡수 수용체다.
이론에 결부되지 않고, 이는 APP 대사, 키나제-의존적 세포내 신호생성, 뉴런 칼슘 신호생성 그리고 신경전달과 같은 세포 사건들을 조정할 수 있다.
고밀도 지단백질(HDL)은 혈액내에서 과도한 콜레스테롤을 포착하여, 이를 간으로 되돌린다. 저밀도 지단백질(또는 LDL)은 신체내에서 콜레스테롤의 주요 수송물질이다. 그러나, 수년간에 걸쳐 너무 많은 LDL은 아테롬성동맥경화증 (동맥이 좁아지고, 굳어짐)을 야기하고, 이는 심장 질환 또는 심장 마비로 연결될 수 있다. 이 비율은 HDL 콜레스테롤을 LDL 콜레스테롤로 나누어 결정된다. 예를들면, HDL 콜레스테롤 50 mg/dL 및 LDL 콜레스테롤 150 mg/dL을 가지는 사람의 경우, HDL/LDL 비율은 0.33일 것이다. 목표는 HDL/LDL 비율을 0.3으로 유지시키고, 이상적인 HDL/LDL 비율은 0.4 이상이다.
HDL은 간과 소장 모두에서 단백질이 풍부한 판형 입자로 처음부터 합성된다. HDL의 주요 아포단백질은 apoA-I, apoA-II, apoC-I, apoC-II, 및 apoE이다. 새로 형성된 HDL은 매우 적은 콜레스테롤 및 콜레스테릴 에스테르를 포함한다. HDL은 이들의 처음 원반모양에서 지단백질 입자의 중립 핵에 콜레스테릴 에스테르의 축적을 통하여 구형의 지단백질 입자로 전환된다. 콜레스테롤은 킬로미크론 나머지 VLDL 나머지 (또한 중간 밀도 지단백질 또는IDL)로부터 HDL에 의해 그리고 세포 표면 막으로부터 직접적으로 축적된다. 콜레스테롤은 HDL-연합된 효소 레시틴:콜레스테롤 아세틸전이효소 ("LCAT")의 작용을 통하여 에스테르화된다. LCAT가 레시틴 (포스파티딜콜린)으로부터 지방산을 콜레스테롤의 C-3-OH 기로 전달하기 위하여HDL 표면에서 볼 수 있는 ApoA-I과의 상호작용이 요구된다. 코어 콜레스테릴 에스테르의 이러한 축적은 발생 초기 HDL를 HDL2 및 HDL3으로 전환시킨다. R. I. Levy et al., " The structure , function and metabolism of high - density lipoproteins : A status report ," Circulation , vol . 62, pp . IV4 -8 (1980); and D. I. Silverman et al ., " High - density lipoprotein subfractions ," Am . J. Med ., vol . 94, pp . 636-45 (1993).
HDL은 한외원심분리에 의해 혈장으로부터 보통 분리된다. 정상적인 HDL 밀도 범위는 1.063 g/mL 내지 1.21 g/mL이며, 이는 대개 두 개 범위로 나뉜다: HDL2 (1.063 g/mL 내지 1.125 g/mL) 그리고 HDL3 (1.125 g/mL 내지 1.21 g/mL). 좀더 최근에, HDL중 두 가지 주요 입자 집단들이 2차원 전기영동에 이어, 면역블랏팅과 효소-연계된 차등 항체 면역흡착 분석에 의해 확인되었다. 이들 집단중 하나는 apoA-I 만을 가지는 입자들을 포함하고, 다른 집단은 apoA-I 및apoA-II 모두를 가지는 입자를 포함한다. apoA-I 입자들의 상대적인 비율은 HDL2 분획물에서 가장 높지만, HDL3은 더 많은 apoA-I 및 apoA-II의 조합이다. J. C. Fruchart et al ., " Apolipoproteins A- containing lipoprotein particles : physiological role , quantification , and clinical significance ," Clin . Chem., vol . 38, pp . 793-7 (1992); and B. F. Asztalos et al ., " Normolipidemic subjects with low HDL cholesterol levels have altered HDL subpopulations ," Arterioscler . Thromb . Vasc . Biol., vol . 17, pp . 1885-1893 (1997) 참고.
인간 아포리포단백질 A-I (ApoA-I)는 HDL 및 임파 킬로미크론의 주요 단백질 구성분이다. ApoA-I는 간 및 소장에서 전구물질 단백질 (preproapo A-I)로 주로 합성된다. Preproapo A-I는 세포내에서 절단되어 proapo A-I을 형성하며, 이는 혈장 및 임파로 분비된다. 혈장내에서, 6개의 아미노산이 proapo A-I로부터 절단되어 성숙 ApoA-I를 만든다.
성숙 ApoA-I는 공지의 243개 아미노산 서열로 구성된 글리코실화안된 단일 폴리펩티드다. ApoA-I는 혈장에서 대부분의 콜레스테롤 에스테르 형성을 담당하는 혈장 효소 (레시틴-콜레스테롤 아세틸전이효소 (LCAT))의 공인자로 작용한다. ApoA-I의 감소된 수준은 혈장 지질 수송계의 장애 및 관상 심장 질환 발달을 초래할 수 있다. 낮은 수준의 ApoA-I 및 HDL은 심장 마비 및 기타 아테롬성 맥관 질환의 강력한 위험 인자로 알려져 있다. U.S. 특허 제5,059,528호 및 제6,258,596호 참고.
아포리포단백질 E (ApoE)는 킬로미크론 및 중간-밀도 지단백질 (IDLs)에서 볼 수 있는 아포단백질로서,간 세포 및 말초 세포상의 특이적인 수용체에 결합한다. 중간-밀도 지단백질은 지단백질입자 패밀리에 속하고, 그리고 초저밀도 지단백질 분해로부터 형성된다. IDL은 지방 및 콜레스테롤을 혈류의 물-기반 용액내로 이동시킬 수 있는 지단백질의 5가지 주요 군(킬로미크론, VLDL, IDL, LDL, HDL)중 하나이다. 아포리포단백질 E (ApoE)는 트리글리세리드-풍부한 지단백질 구성분들의 정상적인 분해대사에 중요하다.
APOE 유전자, ApoE는 아포리포단백질 C1 및 아포리포단백질 C2와 클러스터가 되어 염색체 19에 지도를 만든다. ApoE는 4개의 엑손과 3개의 인트론으로 구성되며, 총 3597개 염기쌍을 이룬다. 멜라닌 세포에서, APOE 유전자 발현은 소안구-연합된 전사 인자 (MITF)에 의해 조절될 수 있다. 이 유전자는 세 개 주요 대립유전자, ApoE2, ApoE3, ApoE4와 함께 다형성을 이루어, 이 단백질의 3개 이소폼으로 해독된다: 정상적인 ApoE-E3; 기능이상의 ApoE-E2 및 ApoE-E4. 이들 이소폼은 위치 112와 158에서 오직 단일 아미노산 치환에 의해 서로 상이하다.
레시틴-콜레스테롤 아세틸전이효소 (LCAT)는 간에서 생산되는 혈장 효소로써, 포스파티딜콜린의 sn-2 위치의 지방신이 콜레스테롤의 A-링의 3-하이드록실 기로 트란스아실화에 의해 지단백질의 콜레스테롤이 콜레스테릴 에스테르로 전환되는 것을 촉매한다. 대부분의 LCAT 활성은 고밀도 지단백질(HDL)에서 볼 수 있지만 약 30%는 아포리포단백질 (Apo) B-함유 지단백질에 있다.
아포리포단백질 E 유전자는 3개 주요 대립유전자, ApoE2, ApoE3, ApoE4와 다형성이다. E2는 유전자적 장애 유형 III 고지단백질혈증과 연관되며, 그리고 아테롬성동맥경화증의 증가된 위험 및 감소된 위험 모두와 연관된다. E3는 이 집단의 약 64%에서 찾아볼 수 있다. 이는 "중성" Apo E 유전자 유형으로 간주된다. E4는 아테롬성동맥경화증 및 Alzheimer 질환, 손상된 인지 기능 및 척색 파생 감소의 원인일 수 있다.
LCAT는 역(reverse) 콜레스테롤 수송 경로를 촉진시키는데, 과도한 세포 콜레스테롤은 배출을 위하여 간으로 되돌아가는 경로이다. 이론에 결부되지 않고, 다음 기전들을 포함한다, 예를들면: LCAT는 HDL 수준을 증가시키고, 이 자체는 콜레스테롤의 세포외 수납자들의 양을 증가시킴으로써 세포로부터 콜레스테롤의 유동을 증가시킬 수 있다. 또한, HDL에서 LCAT에 의한 콜레스테롤의 에스테르화는 HDL으로부터 세포로 콜레스테롤의 자발적 역 교환을 제한시킬 수 있고, HDL의 콜레스테롤을 간으로 수송을 촉진시킨다.
바람직한 구체예들에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 지질 수송 및 대사 유전자 패밀리 구성요소들과 연관된 질환 또는 장애의 예방 또는 치료를 위하여 이용된다. 이러한 안티센스 화합물들을 이용하여 수득된 줄기세포로부터 발생된 세포/조직으로 치료될 수 있는 예시적인 지질 수송 및 대사 유전자 중재된 질환 및 장애는 다음을 포함한다: 심혈관 질환 또는 장애, 대사 질환 또는 장애 (가령, 당뇨병, 비만, 이상지질혈증, 혈당과다, 과인슐린혈증, 과콜레스테롤혈증 등), 손상된 지질 대사와 연관된 질환 또는 장애, 관상 동맥 질환, 아테롬성동맥경화증, HDL 대사 질환 또는 장애 (가령, 가족성 HDL 결핍 (FHD), Sea-blue 조직구증, Tangier 질환, 물고기 눈 질환 질환, LCAT 결핍, 저 HDL 콜레스테롤혈증 등), 세포 콜레스테롤 및/또는 포스포리피드 항상성과 연관된 질환 또는 장애, 가족성 아밀로이드 신증, 손상된 콜레스테롤 조절과 연관된 질환 또는 장애, 지질 수송 및 대사 유전자 수송물질의 결핍과 연관된 질환 또는 장애, 아포리포단백질 A-I 결핍, 세포에서 비정상적으로 빠른 또는 비정상적으로 느린 콜레스테롤 유출과 연관된 질환 또는 장애, 췌장 베타 세포 기능과 연관된 질환 또는 장애, 당뇨병, 대사 질환 또는 장애, 관절염, 염증, 자가면역 질환 또는 장애, 후천적 면역 결핍 증후군 (AIDS), 염증, 신경 질환 또는 장애, 신경퇴행성 질환 또는 장애, 암, 이상지질혈증, 대사 증후군, 노인성 반점, 대뇌 아밀로이드 맥관병증, 아밀로이드증, 교아종, 아밀로이드 침착과 연관된 질환 또는 장애, 신경섬유 매듭, 융모막암종, 성상세포종, 아밀로이드증, 과다지질혈증, 신형성 변형, 죽상반, 폐색, 전이, 폐 섬유증, 괴사, 쇼크, 흑색종, 유전적 감수성, 건선, 신경교종, 신경병리학, 맥관 질환, 세포 손상, 비-소 세포 폐 암종 (NSCLCs), 지방육종, 면역결핍 질환 또는 장애, 장기 이식 거부, 알러지, 사구체신염, 정맥 혈전증, 병리적 프로세스 또는 백혈병, 골격 질환 또는 장애, 근육 질환 또는 장애, 감염성 유기체와 연관된 질환 또는 장애, 면역 관련된 질환 또는 장애, 신경 복구 및d 마비, 신경내분비 차등, 전신 비-신경병증 아밀로이드증, 아밀로이드 질환, 혈관신생에 의존적인 종양 성장, 혈관신생 증가를 포함하는 증상을 가진 암이 아닌 질환, 가령, 건선, 조숙한 망막증, 맥락막 질환, 신혈관 녹내장, 당뇨성 망막증, 약물 남용, 손상된 인지 기능, 그리고 정상적인 대조군과 비교하였을 때 감소된 척색 파생, ApoE 비정상적 발현, 기능, 활성, 바이러스, 세균, 기생충, 곰팡이와 같은 외부 유기체로 인한 질환 또는 장애 및 이와 유사한 것들.
바람직한 구체예에서, 지질 수송 및 대사 유전자 안티센스 올리고뉴클레오티드는 장기 이식(가령, 간 이식, 신장 이식, 골수 이식, 심장 이식 등)에 치료요법적으로 이용된다.
바람직한 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 넌코딩 구역을 포함하나 이에 한정되지 않은 지질 수송 및 대사 유전자의 폴리뉴클레오티드에 특이적이다. 지질 수송 및 대사 유전자 표적은 지질 수송 및 대사 유전자의 변이체들; SNP를 포함하는 지질 수송 및 대사 유전자의 돌연변이체들; 지질 수송 및 대사 유전자의 넌코딩 서열들; 대립유전자들, 단편들 그리고 이와 유사한 것을 포함한다. 바람직하게는 올리고뉴클레오티드는 안티센스 RNA 분자다.
본 발명의 구체예에 따르면, 표적 핵산 분자는 지질 수송 및 대사 유전자 폴리뉴클레오티드 단독에 국한되지 않고, 지질 수송 및 대사 유전자의 동소체, 수용체, 상동체들, 넌-코딩 구역 및 상동체들, 그리고 이와 유사한 것 중 임의의 것까지 확장된다.
본 발명의 구체예에 따르면, 표적 핵산 분자는 지질 수송 및 대사 유전자 폴리뉴클레오티드 단독에 국한되지 않고, 지질 수송 및 대사 유전자의 동소체, 수용체, 상동체들, 넌-코딩 구역 및 상동체들, 그리고 이와 유사한 것 중 임의의 것까지 확장된다.
또 다른 바람직한 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 변이체들, 대립유전자들, 상동체들, 돌연변이체들, 유도체들, 단편들 및 상보성 서열들을 포함하나 이에 한정되지 않는 지질 수송 및 대사 유전자 표적의 자연적 안티센스 서열(코딩 및 넌-코딩 구역에 자연적 안티센스)을 표적으로 한다. 바람직하게는 올리고뉴클레오티드는 안티센스 RNA 또는 DNA 분자이다.
또 다른 바람직한 구체예에서, 본 발명의 올리고머 화합물들은 화합물에 있는 하나 이상의 뉴클레오티드 위치에서 상이한 염기가 존재하는 변이체들도 포함한다. 예를 들면, 첫번째 뉴클레오티드가 아데닌이라면, 변이체들은 이 위치에 티미딘, 구아노신, 시티딘 또는 이 위치에 있는 기타 천연 또는 비-천연 뉴클레오티드를 포함하도록 만들어질 수 있다. 안티센스 화합물의 임의의 위치에서 일어날 수 있다. 그 다음 이들 화합물은 표적 핵산의 발현을 억제하는 이들 능력을 측정하기 위하여 여기에서 설명된 방법에 의해 테스트된다.
일부 구체예에서, 안티센스 화합물과 표적 사이에 상동성, 서열 동일성 또는 상보성은 약 50% 내지 약 60%이다. 일부 구체예에서, 안티센스 화합물과 표적 사이에 상동성, 서열 동일성 또는 상보성은 약 60% 내지 약 70%이다. 일부 구체예에서, 안티센스 화합물과 표적 사이에 상동성, 서열 동일성 또는 상보성은 약 70% 내지 약 80%이다. 일부 구체예에서, 안티센스 화합물과 표적 사이에 상동성, 서열 동일성 또는 상보성은 약 80% 내지 약 90%이다. 일부 구체예에서, 안티센스 화합물과 표적 사이에 상동성, 서열 동일성 또는 상보성은 약 90%, 약 92%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99% 또는 약 100%이다.
안티센스 화합물은 화합물이 표적 핵산에 결합하여 표적 핵산의 정상적인 기능을 간섭하여 활성을 잃게 만들 때 특이적으로 하이브리드가능하며, 그리고 특이적 결합이 바람직한 조건들하에서 안티센스 화합물이 비-표적 핵산 서열에 비-특이적 결합을 피할 수 있도록 충분한 상보성이 있다. 이와 같은 조건은 생체내 분석 또는 치료요법적 처리의 경우 생리학적 조건, 그리고 분석이 시험관 분석의 경우에 실시되는 조건 등을 포함한다.
DNA, RNA, 키메라, 치환된 등의 안티센스 화합물은 표적 DNA 또는 RNA 분자에 화합물이 특이적으로 결합하여 표적 DNA 또는 RNA의 정상적인 기능을 간섭하여, 활성을 잃게 만들 때 특이적으로 하이브리드가능하며, 그리고 특이적 결합이 바람직한 조건들하에서 안티센스 화합물이 비-표적 핵산 서열에 비-특이적 결합을 피할 수 있도록 충분한 상보성이 있다. 이와 같은 조건은 생체내 분석 또는 치료요법적 처리의 경우 생리학적 조건, 그리고 분석이 시험관 분석의 경우에 실시되는 조건 등을 포함한다.
또 다른 바람직한 구체예에서, 예를 들면, PCR, 하이브리드화 등을 이용하여 확인되고, 확장된, 서열 번호: 8 내지 22에서 제시된 하나 이상의 서열, 그리고 이와 유사한 것인 안티센스 서열을 포함하나 이에 한정되지 않는 지질 수송 및 대사 유전자의 표적화는 지질 수송 및 대사 유전자의 기능 또는 발현을 조절한다. 한 구체예에서, 기준과 비교하였을 때, 발현 또는 기능은 상향 조절된다. 또 다른 바람직한 구체예에서, 기준과 비교하였을 때, 발현 또는 기능은 하향 조절된다.
또 다른 바람직한 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 PCR, 하이브리드화 등을 이용하여 확인되고, 확장된 안티센스 서열들을 포함하는, 서열 번호: 23 내지 263에서 제시된 핵산 서열들을 포함한다. 이들 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 변형된 뉴클레오티드, 더 짧은 또는 더 긴 단편들, 변형된 결합 그리고 이와 유사한 것을 포함할 수 있다. 변형된 결합 또는 뉴클레오티드간 링키지의 예는 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 또는 이와 유사한 것을 포함한다. 또 다른 바람직한 구체예에서, 뉴클레오티드는 인(phosphorus) 유도체이다. 본 발명의 변형된 올리고뉴클레오티드내 슈가 또는 슈가 유사 모이어티에 부착될 수 있는 인 유도체 (또는 변형된 인산염 기)는 일인산염, 이인산염, 삼인산염, 알킬인산염, 알칸인산염, 포스포로티오에이트 그리고 이와 유사한 것이 될 수 있다. 상기 명시된 인산염 유사체의 준비 및 뉴클레오티드, 변형된 뉴클레오티드 및 올리고뉴클레오티드으로의 결합은 당분야에 공지되어 있기 때문에, 여기에서 설명할 필요는 없다.
안티센스의 특이성 및 감응도는 치료 용도로 당업자에 의해 이용된다. 안티센스 올리고뉴클레오티드는 동물 및 사람에게서 질병 상태를 치료하는 치료 모이어티로 이용될 수 있다. 안티센스 올리고뉴클레오티드는 인간에게 안전하고 효과적으로 투여되었으며, 여러 임상 시도가 현재 진행중이다. 따라서 올리고뉴클레오티드는 세포, 조직, 동물 특히, 인간의 치료를 위한 치료 섭생에 유용하도록 설정될 수 있는 유용한 치료요법적 형태가 될 수 있다.
본 발명의 구체예에서, 올리고머 안티센스 화합물, 특히 올리고뉴클레오티드는 표적 핵산 분자들에 결합하고, 표적 유전자에 의해 인코드된 분자들의 발현 및/또는 기능을 조절한다. 간섭되는 DNA의 기능은 예를 들면, 복제 및 전사를 포함한다. 간섭되는 RNA의 기능은 예를 들면, RNA를 단백질 해독 부위로 전위, RNA로부터 단백질 해독, 하나 이상의 mRNA 종을 만들기 위한 RNA의 접합 및 RNA가 관여하거나 RNA에 의해 실시될 수 있는 촉매 활성과 같은 모든 중요한 기능을 포함한다. 기능은 원하는 기능에 따라 상향-조절되거나 억제될 수 있다.
안티센스 화합물들은 안티센스 올리고머 화합물, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 외부 유도 서열 (EGS) 올리고뉴클레오티드, 선택적 스플라이스, 프라이머, 프로브, 및 표적 서열의 최소한 일부에 하이브리드되는 다른 올리고머 화합물을 포함한다. 이와 같이, 이들 화합물들은 단일-가닥, 이중-가닥, 부분적으로 단일-가닥, 또는 원형 올리고머 화합물의 형태로 도입될 수 있다.
본 발명의 내용에서 특정 핵산 분자에 안티센스 화합물의 표적화는 다단계 프로세스가 될 수 있다. 이 프로세스는 통상적으로 기능이 조절되는 표적 핵산의 확인으로 시작된다. 이 표적 핵산은 예를 들면, 유전자의 발현이 특정 질환 또는 질병 상태와 연관된 세포 유전자(또는 이 유전자로부터 전사된 mRNA) 또는 감염성 물질의 핵산 분자가 될 수 있다. 본 발명에서 표적 핵산은 지질 수송 및 대사 유전자를 인코드한다.
표적화 프로세스는 발현의 조절과 같은 원하는 효과를 얻기 위하여 안티센스 상호작용을 위하여 표적 핵산 내 최소한 하나의 표적 구역, 단편 또는 부위의 결정을 통상적으로 포함한다. 본 발명의 내용에서, 용어 "구역(region)"은 최소한 한 가지 확인가능한 구조, 기능 또는 성질을 가지는 표적 핵산의 일부로 정의된다. 표적 핵산의 구역내에 단편이 있다. 단편(Segments)은 표적 핵산 내에 구역의 더 작은 또는 하위 부분으로 정의된다. 본 발명에서 사용된 부위(Sites)는 표적 핵산내에 위치로 정의된다.
바람직한 구체예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 지질 수송 및 대사 유전자의 천연 안티센스 서열들에 결합하고, 그리고 지질 수송 및 대사 유전자(서열 번호: 1)의 발현 및/또는 기능을 조절한다. 안티센스 서열들의 예로 서열 번호: 8내지 263을 포함한다.
또 다른 바람직한 구체예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 지질 수송 및 대사 유전자 폴리뉴클레오티드의 하나 이상의 단편에 결합하고, 그리고 지질 수송 및 대사 유전자의 발현 및/또는 기능을 조절한다. 단편들은 지질 수송 및 대사 유전자 센스 또는 안티센스 폴리뉴클레오티드의 최소한 5개의 연속 뉴클레오티드를 포함한다.
또 다른 바람직한 구체예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 지질 수송 및 대사 유전자의 천연 안티센스 서열들에 특이적이며, 지질 수송 및 대사 유전자의 천연 안티센스 서열들에 올리고뉴클레오티드가 결합하여 지질 수송 및 대사 유전자의 발현 및/또는 기능이 조절된다.
또 다른 바람직한 구체예에서, 올리고뉴클레오티드 화합물은 서열 번호: 23 내지 263에서 제시된 서열들을 포함하는데, 이의 안티센스 서열들은 예를 들면, PCR, 하이브리드화 등을 이용하여 확인되고 연장된다. 이들 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 변형된 뉴클레오티드, 더 짧은 또는 더 긴 단편들, 변형된 결합 그리고 이와 유사한 것을 포함한다. 변형된 결합 또는 뉴클레오티드간 링키지의 예는 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 또는 이와 유사한 것을 포함한다. 또 다른 바람직한 구체예에서, 뉴클레오티드는 인 유도체를 포함한다. 본 발명의 변형된 올리고뉴클레오티드내에 슈가 또는 슈가 유사체 모이어티에 부착될 수 있는 인 유도체 (또는 변형된 인산염 기)는 일인산염, 이인산염, 삼인산염, 알킬인산염, 알칸인산염, 포스포로티오에이트 그리고 이와 유사한 것이 될 수 있다. 상기 명시된 인산염 유사체의 준비 및 뉴클레오티드, 변형된 뉴클레오티드 및 올리고뉴클레오티드으로의 결합은 당분야에 공지되어 있기 때문에, 여기에서 설명할 필요는 없다.
당분야에 공지된 것과 같이, 해독 개시 코돈은 일반적으로 5'-AUG (전사된 mRNA 분자들에서; 대응하는 DNA 분자에서는 5'-ATG)이기 때문에, 해독 개시 코돈은 "AUG 코돈" "시작 코돈" 또는 "AUG 시작 코돈"으로 지칭되기도 한다. 소수의 유전자는 RNA 서열 5'-GUG, 5'-UUG 또는 5'-CUG을 가지는 해독 개시 코돈을 가지며; 그리고 5'-AUA, 5'-ACG 및 5'-CUG는 생체에서 기능을 하는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 각 경우에 시작 아미노산은 일반적으로 메티오닌(진핵세포의 경우) 또는 포르밀메티오닌(원핵생물의 경우)이지만, 용어 "해독 개시 코돈" 및 "시작 코돈"은 많은 코돈 서열들을 포함할 수 있다. 진핵생물 및 원핵생물 유전자는 두 개 이상의 대체 시작 코돈을 가지는데, 이들중 임의의 것이 특정 세포 유형 또는 조직에서, 또는 특정 조건하에서 해독 개시에 선호적으로 이용될 수 있다. 본 발명의 내용에서, "시작 코돈" 및 "해독 개시 코돈"은 코돈의 서열과 무관하게, 지질 수송 및 대사 유전자를 인코드하는 유전자로부터 전사된 mRNA의 해독을 생체내에서 개시하는데 이용되는 코돈을 지칭한다. 유전자의 해독 종료 코돈 (또는 "중지 코돈")은 다음 세 개 서열중 하나를 가질 수 있다; 5'-UAA, 5'-UAG 및 5'-UGA (대응하는 DNA 서열들은 차례로 각각 5'-TAA, 5'-TAG 및 5'-TGA이다).
용어 "시작 코돈 구역" 및 "해독 개시 코돈 구역"은 해독 개시 코돈으로부터 임의의 방향(가령, 5' 또는 3')으로 약 25 내지 약 50 개의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 mRNA 또는 유전자의 일부분을 지칭한다. 유사하게, 용어 "중지 코돈 구역" 및 "해독 종료 코돈 구역"은 해독 종료 코돈으로부터 어느 방향이건(5' 또는 3') 약 25개 내지 약 50개 연속 뉴클레오티드를 포함하는 mRNA 또는 유전자의 일부분을 말한다. 결과적으로, "시작 코돈 구역" (또는 "해독 개시 코돈 구역") 및 "중지 코돈 구역" (또는 "해독 종료 코돈 구역")은 본 발명의 안티센스 화합물에 효과적으로 표적화되는 모든 구역이다.
오픈 리딩 프레임(ORF) 또는 해독 개시 코돈과 해독 종료 코돈 사이에 구역을 말하는 것으로 당분야에 공지된 "코딩 구역"은 효과적으로 표적화될 수 있는 구역이다. 본 발명의 내용 범위내에서, 표적화된 구역은 유전자의 오픈 리딩 프레임(ORF)의 해독 개시 또는 종료 코돈을 포함하는 유전자내 구역이다.
또 다른 표적 구역은 해독 개시 코돈으로부터 5' 방향으로 mRNA의 일부분을 지칭할 때 당분야에서 공지된 5' 무해독 구역(5'UTR)을 포함하면, 따라서 5' 캡 부위와 mRNA의 해독 개시 코돈 사이에 뉴클레오티드(또는 이 유전자에서 상응하는 뉴클레오티드)도 포함된다. 또 다른 표적 구역은 해독 종료 코돈으로부터 3' 방향으로 mRNA의 일부분을 지칭하는 것으로 당분야에서 공지된 3' 무해독 구역(3'UTR)을 포함하면, 따라서 해독 종료 코돈과 mRNA의 3' 말단 사이에 뉴클레오티드(또는 이 유전자에서 상응하는 뉴클레오티드)도 포함된다. mRNA의 5' 캡 부위는 5'-5' 삼인산염 링키지를 통하여 mRNA의 5'-최말단 잔기에 결합된 N7-메틸화된 구아노신 잔기를 포함한다. mRNA의 5' 캡 구역은 5' 캡 구조 자체 뿐만 아니라 캡 부위에 인접한 첫 50개 뉴클레오티드를 포함하는 것으로 간주된다. 본 발명에 적합한 또 다른 표적 구역은 5' 캡 구역이다.
일부 진핵 mRNA 전사체는 바로 해독되며, 많은 것들은 “인트론”이라고 공지된 하나 이상의 구역을 포함하는데, 이는 해독되기 전에 전사체로부터 잘려나간다. 나머지(그리고 따라서 해독된) 구역들은 “엑손”으로 알려져 있으며, 함께 접목되어, 연속 mRNA를 형성한다. 한 구체예에서, 접목 부위 가령, 인트론-엑손 접합 또는 엑손-인트론 접합 부위를 표적화하는 것은 질병에 이상 접합이 연관되거나 또는 특정 접합 산물의 과다 생산이 질병과 연관되는 상황에서 특히 유용하다. 재배열 또는 결손으로 인한 이상 융합 접합은 표적 부위의 또 다른 구체예다. 상이한 유전자 소스로부터 두 개(또는 그 이상)의 mRNA의 접합 프로세스를 통하여 생산된 mRNA 전사체는 "융합 전사체"로 공지되어 있다. 인트론은 예를 들면, DNA 또는 pre-mRNA를 표적으로 하는 안티센스 화합물을 이용하면 효과적으로 표적화될 수 있다.
또 다른 바람직한 구체예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 표적 폴리뉴클레오티드의 코딩 및/또는 넌-코딩 구역에 결합하여, 표적 분자의 발현 및/또는 기능을 조절한다.
또 다른 바람직한 구체예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 천연 안티센스 폴리뉴클레오티드에 결합하여, 표적 분자의 발현 및/또는 기능을 조절한다.
또 다른 바람직한 구체예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 센스 폴리뉴클레오티드에 결합하여, 표적 분자의 발현 및/또는 기능을 조절한다.
대체(alternative) RNA 전사체는 DNA의 동일한 게놈 구역으로부터 만들어질 수 있다. 이와 같은 대체 전사체들은 일반적으로 "변이체들"로 알려져 있다. 좀더 특이적으로, "pre-mRNA 변이체들"은 동일한 게놈 DNA로부터 생산되지만, 동일한 게놈 DNA로부터 만들어진 다른 전사체와 이들의 시작 또는 중지 위치에서 상이하며, 인트론 및 엑손 서열을 모두 포함하고 있는 전사체다.
접합 동안 하나 이상의 엑손 또는 인트론 구역 또는 이의 일부분을 잘라낼 때, pre-mRNA 변이체들은 더 작은 "mRNA 변이체들"을 만든다. 결과적으로, mRNA 변이체들은 pre-mRNA 변이체들로 프로세스되고, 각 독특한 pre-mRNA 변이체들은 접합의 결과로 독특한 mRNA 변이체를 항상 만들어낸다. 이와 같은 mRNA 변이체들은 또한 "대체 접합 변이체들"로 공지되어 있다. pre-mRNA 변이체의 접합이 발생되지 않는다면, pre-mRNA 변이체는 mRNA 변이체와 동일하게 된다.
변이체들은 전사의 시작 또는 중지에 대한 대체 신호를 이용하여 만들어질 수 있다. Pre-mRNAs 및 mRNAs는 하나 이상의 시작 코돈 또는 중지 코돈을 보유할 수 있다. 대체 시작 코돈을 이용하는 pre-mRNA 또는 mRNA으로부터 기인된 변이체들은 pre-mRNA 또는 mRNA의 “대체 시작 변이체들”로 공지되어 있다. 대체 중지 코돈을 이용하는 이들 전사체들은 pre-mRNA 또는 mRNA의 "대체 중지 변이체들"로 공지되어 있다. 대체 중지 변이체중 한 가지 특정 유형은 "polyA 변이체"이며, 만들어진 다중 전사체들은 전사 기전에 의해 “polyA 중지 신호”중 하나의 대체 선택하고, 따라서, 독특한 polyA 부위에서 종료된 전사체를 만듦으로써 생성된 것이다. 본 발명의 내용 범위에서, 여기에서 설명된 변이체들의 유형이 표적 핵산의 구체예이기도 하다.
안티센스 화합물이 하이브리드되는 표적 핵산 상의 위치는 활성 안티센스 화합물이 표적으로 하는 표적 구역의 최소한 5개 길이의 뉴클레오티드 부분으로 정의된다.
특정 예시적인 표적 단편들의 특이적 서열이 여기에서 제시되어 있지만, 당업자는 이들은 본 발명의 범위내에서 특정 구체예를 설명하고, 묘사하기 위함이라는 것을 인지할 것이다. 추가적인 표적 단편들은 본 내용을 근거하여 당업자들이 용이하게 인지할 수 있다.
설명된 바람직한 표적 단편으로부터 선택된 최소한 5개 길이의 연속 뉴클레오티드 스트레치를 포함하는 길이가 5-100개 뉴클레오티드 표적 단편들은 표적화에 적합한 것으로 간주된다
표적 단편은 설명된 바람직한 표적 단편의 5'-말단으로부터 최소한 5개 연속 뉴클레오티드(나머지 뉴클레오티드는 표적 단편의 5' 말단의 바로 상류에서 시작하고, DNA 또는 RNA가 약 5 내지 약 100개 뉴클레오티드를 포함할 때 까지 연속되는동일한 DNA 또는 RNA의 연속 스트레치다)를 포함하는 DNA 또는 RNA 서열들을 포함할 수 있다. 유사하게, 바람직한 표적 단편은 바람직한 표적 단편의 3'-말단으로부터 최소한 5개 연속 뉴클레오티드(나머지 뉴클레오티드는 표적 단편의 3' 말단의 바로 하류에서 시작하고, DNA 또는 RNA가 약 5 내지 약 100개 뉴클레오티드를 포함할 때 까지 연속되는 동일한 DNA 또는 RNA의 연속 스트레치다)를 포함하는 DNA 또는 RNA 서열들을 포함할 수 있다. 표적 단편을 갖춘 기술 분야에 당업자는 과도한 실험없이 추가적으로 바람직한 표적 단편을 확인할 수 있을 것이다.
하나 이상의 표적 구역, 단편 또는 부위가 확인되었다면, 표적에 충분한 상보성을 가진, 가령, 충분히 잘 하이브리드되고, 원하는 효과를 제공하기 위하여 충분한 특이성을 가진 안티센스 화합물이 선택된다.
본 발명의 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 특정 표적의 안티센스 가닥에 결합한다. 올리고뉴클레오티드는 길이가 최소한 5개 길이의 뉴클레오티드이며, 그리고 표적 뉴클레오티드의 전체 길이를 수용하도록 합성하기 위하여, 서열들을 중첩하는 각 올리고뉴클레오티드 표적이 되도록 합성될 수 있다. 표적은 또한 코딩 뿐만 아니라 넌-코딩 구역을 포함한다.
한 구체예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드에 의해 특정 핵산을 표적하는 것이 바람직하다. 특정 핵산에 안티센스 화합물의 표적화는 다단계 프로세스다. 프로세스는 기능이 조절되는 핵산 서열의 확인으로 통상적으로 시작된다. 이는 예를 들면, 유전자의 발현이 특정 질환 또는 질환 상태와 연관되는 세포 유전자(또는 이 유전자로부터 전사된 mRNA), 또는 넌코딩 RNA(ncRNA)와 같은 넌코딩 폴리뉴클레오티드가 될 수 있다.
RNAs는 (1) 단백질로 해독되는 메신져 RNAs (mRNAs) 및 (2) 단백질-넌코딩 RNAs (ncRNAs)로 분류될 수 있다. ncRNAs는 마이크로RNAs, 안티센스 전사체 및 고밀도의 중지 코돈을 포함하며, 임의의 광범위한 “오픈 리딩 프레임”이 부족한 다른 전사 단위 (TU)를 포함한다. 많은 ncRNAs는 단백질-코딩 좌의 3' 무해독 구역 (3'UTRs)에서 개시 부위로부터 시작되는 것으로 보인다. ncRNAs는 아주 드물고, FANTOM 협회에 의해 서열화된 ncRNA의 최소한 절반은 폴리아데닐화되지 않는 것으로 간주된다. 대부분의 조사자들은 프로세스되고, 세포질로 배출된 폴리아데닐화된 mRNA에 초점을 맞추고 있는 명백한 이유를 가지고 있다. 최근, 폴리아데닐화안된 핵 RNA 세트는 매우 크고, 이와 같은 전사체중 많은 것들은 소위 인터진(intergenic) 구역에서 생성된다(Cheng , J. et al . (2005) Science 308 (5725), 1149-1154; Kapranov , P. et al . (2005). Genome Res 15 (7), 987-997). ncRNAs가 유전자 발현을 조절할 수 있는 기전은 표적 전사체와의 염기쌍에 의한 것이다. 염기쌍에 의해 기능을 하는 RNA는 (1) 동일한 유전적 위치에서, 그러나 이들이 작용하는 RNA에 반대 가닥상에서 인코드되어, 이들 표적에 대해 완벽한 상보성을 나타내는 cis-인코드된 RNAs, 및 (2) 이들이 작용하는 RNA와는 별개의 염색체 위치에서 인코드되며, 표적과 완벽한 염기쌍을 일반적으로 나타내지 않는 trans-인코드된 RNAs로 분류될 수 있다.
이론에 구애되지 않고, 여기에서 설명되는 안티센스 올리고뉴클레오티드에 의한 안티센스 폴리뉴클레오티드의 혼란은 상응하는 센스 메신져 RNA의 발현을 변경시킬 수 있다. 그러나, 이와 같은 조절은 부조화적(discordant)(안티센스 녹다운은 메신져 RNA 상승을 결과한다) 또는 조화적(concordant)(안티센스 녹다운은 수반되는 메신져 RNA 감소를 결과한다)이다. 이와 같은 경우에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 안티센스 전사체의 중첩 또는 중첩되지 않는 부위로 표적화되어, 표적의 녹다운 또는 제거를 초래할 수 있다. 코딩 뿐만 아니라 넌-코딩 안티센스는 동일한 방식으로 표적화될 수 있으며, 그리고 어느 쪽이든 조화 또는 비조화 방식으로 상응하는 센스 전사체를 조절할 수 있다. 표적에 대항하여 이용되는 새로운 올리고뉴클레오티드를 확인하는데 사용되는 전략은 안티센스 올리고뉴클레오티드에 의한 안티센스 RNA 전사체의 녹다운 또는 원하는 표적을 조절하는 임의의 다른 수단에 기초될 수 있다.
전략 1: 부조화적인 조절의 경우, 안티센스 전사체의 녹다운은 통상적(센스) 유전자의 발현을 상승시킨다. 후자 유전자가 공지의 또는 가상 약물 표적에 인코드한다면, 이의 안티센스 반대편의 녹다운은 수용체 항진 또는 효소 자극물질의 작용을 의식적으로 모방할 수 있다.
전략 2: 조화적 조절의 경우, 안티센스 및 센스 전사체 모두 동시에 녹다운 시킬 수 있어, 통상의(센스) 유전자 발현의 상승적 감소를 얻을 수 있다. 예를 들면, 안티센스 올리고뉴클레오티드가 녹다운을 얻는데 이용된다면, 이 전략은 센스 전사체를 표적으로 하는 하나의 안티센스 올리고뉴클레오티드, 그리고 상응하는 안티센스 전사를 표적으로 하는 또 다른 안티센스 올리고뉴클레오티드, 또는 중첩 센스 및 안티센스를 동시에 표적으로 하는 단일 대칭적 안티센스 올리고뉴클레오티드에 적용할 수 있다.
본 발명에 따르면, 안티센스 화합물들은 안티센스 올리고뉴클레오티드, 리보자임, 외부 유도 서열 (EGS) 올리고뉴클레오티드, siRNA 화합물, 단일 또는 이중-가닥 RNA 간섭 (RNAi) 화합물, 가령 siRNA 화합물, 그리고 표적 핵산의 최소한 일부분에 하이브리드하여, 이의 기능을 조절하는 기타 올리고머 화합물들을 포함한다. 이와 같이, 안티센스 화합물들은 DNA, RNA, DNA-like, RNA-like, 또는 이의 혼합물이 될 수 있거나, 또는 하나 이상의 상기 것들의 모방체가 될 수 있다. 이들 화합물은 단일-가닥, 이중-가닥, 원형 또는 헤어핀 올리고머 화합물이 될 수 있으며, 그리고, 내부에 또는 말단이 중배(bulges), 미스메치 또는 루프와 같은 구조적 요소를 포함할 수 있다. 안티센스 화합물은 선형으로 준비될 수 있지만, 결합되거나 원형 및/또는 분지형으로 준비될 수 있다. 안티센스 화합물은 두 가닥 하이브리드되어 전체적으로 또는 부분적으로 이중-가닥 화합물을 형성하거나 또는 하이브리드화를 허용하고, 전체적으로 또는 부분적으로 이중-가닥 화합물의 형성을 위하여 충분히 자가-상보성을 가진 단일 가닥과 같은 구조체를 포함할 수 있다. 두 개 가닥이 서로 자유 3' 또는 5' 말단을 남기고 내부적으로 연결되거나 또는 연속적인 헤어핀 구조 또는 루프를 형성하도록 연결될 수 있다. 헤어핀 구조는 단일 가닥으로 된 연장부를 만드는 5' 또는 3' 말단 상에 오버행(overhang)을 포함할 수 있다. 이중 가닥의 화합물은 선택적으로 양단에 오버행을 포함할 수 있다. 추가 변형은 말단, 선택된 뉴클레오티드 위치, 슈가 위치중 하나에 부착된, 또는 뉴클레오티드간 링키지 중 하나에 부착된 콘쥬게이트 군을 포함할 수 있다. 대안으로, 두 개 가닥은 비-핵산 모이어티 또는 링커 군을 통하여 링크될 수 있다. 한 개 가닥으로부터만 형성된 경우, dsRNA는 듀플렉스를 형성하기 위하여 자체에 둘로 접히는 자가-상보성 헤어핀 유형 분자의 형태를 취할 수 있다. 따라서, dsRNAs는 완전히 또는 부분적으로 이중 가닥이 될 수 있다. 유전자 발현의 특이적 조절은 유전자전이 세포계에서 dsRNA 헤어핀의 안정적 발현에 의해 이루어질 수 있지만, 그러나, 일부 구체예에서, 유전자 발현 또는 기능은 상향 조절된다. 두 개 가닥으로부터 형성될 때, 또는 듀플렉스를 형성하기 위하여 자체에 둘로 접히는 자가-상보성 헤어핀 유형 분자의 형태를 취하는 단일 가닥의 경우, 두 개 가닥(또는 단일 가닥의 듀플렉스 형성 구역)은 Watson-Crick 방식으로 염기쌍을 이루는 상보성 RNA 가닥이다.
일단 시스템내로 도입되면, 본 발명의 화합물들은 표적 핵산의 절단 또는 다른 변형을 얻기 위하여 하나 이상의 효소 또는 구조적 단백질의 작용을 유도하거나 또는 점유-기반 기전(occupancy-based mechanisms)을 통하여 작용할 수 있다. 일반적으로, 핵산 (올리고뉴클레오티드를 포함)은 "DNA-like" (가령, 하나 이상의 2'-데옥시 슈가를 가지고, 그리고 U 염기 대신 일반적으로 T를 가짐) 또는 "RNA-like" (가령, 하나 이상의 2'-하이드록시 또는 2'-변형된 슈가를 가지고, 그리고 T 염기 대신 U 염기를 일반적으로 가짐)으로 설명될 수 있다. 핵산 헬릭스는 한 가지 이상의 구조 유형을 채택할 수 있지만, 가장 흔하게는 A- 및 B-형이 된다. 일반적으로, B-형-유사 구조를 가지는 올리고뉴클레오티드는 "DNA-like"이며, 그리고 A-형-유사 구조를 가지는 올리고뉴클레오티드는 "RNA-like"이다. 일부(키메라) 구체예에서, 안티센스 화합물은 A- 및 B-형 구역을 포함한다.
또 다른 바람직한 구체예에서, 바람직한 올리고뉴클레오티드 또는 안티센스 화합물은 최소한 하나의 안티센스 RNA, 안티센스 DNA, 키메라 안티센스 올리고뉴클레오티드, 변형된 링키지를 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오티드, 간섭 RNA (RNAi), 짧은 간섭 RNA (siRNA); 마이크로, 간섭 RNA (miRNA); 작은, 일시적, RNA (stRNA); 또는 짧은 헤어핀 RNA (shRNA); 작은 RNA-유도된 유전자 활성(RNAa); 작은 활성화 RNAs (saRNAs), 또는 이의 조합을 포함한다.
dsRNA는 또한 “작은 RNA-유도된 유전자 활성화” 또는 RNAa 기전인 유전자 발현을 활성화시킬 수 있다. dsRNAs 표적화 유전자 프로모터는 관련 유전자의 강력한 전사 활성화를 유도한다. RNAa는 “작은 활성화 RNA(saRNA)"로 불리는 합성 dsRNA를 이용하여 인간 세포에서 설명되었다. 현재까지 다른 유기체들에서 RNAa가 보존되는지는 밝혀지지 않았다.
작은 이중-가닥 RNA (dsRNA), 가령, 작은 간섭 RNA (siRNA) 및 마이크로RNA (miRNA)는 RNA 간섭(RNAi)로 알려진 진화론적으로 보존된 기전의 촉발자로 밝혀졌다. RNAi는 리모델링 크로마틴을 통하여 유전자 침묵을 일관되게 유도하여, 전사 억제, 상보성 mRNA 분해 또는 단백질 해독을 차단시킨다. 그러나, 실시예 부분에서 상세하게 설명된 경우에서, 올리고뉴클레오티드는 지질 수송 및 대사 유전자 폴리뉴클레오티드 및 이의 인코드된 산물들의 발현 및/또는 기능을 증가시키는 것으로 보인다. dsRNAs는 작은 활성화된 RNAs (saRNA)로 작용할 수 있다. 이론에 구애되지 않고, 유전자 프로모터에서 서열들을 표적화함으로써, saRNAs는 dsRNA-유도된 전사 활성화 (RNAa)로 불리는 현상에서 표적 유전자 발현을 유도할 수 있다.
추가 구체예에서, 여기에서 확인된 "바람직한 표적 단편"은 지질 수송 및 대사 유전자 폴리뉴클레오티드의 발현을 조절하는 추가 화합물을 스크리닝하는데 이용될 수 있다. "조절물질(modulators)"은 지질 수송 및 대사 유전자을 인코드하는 핵산 분자의 발현을 감소 또는 증가시키는 화합물이며, 바람직한 표적 단편에 상보성인 최소한 5개-뉴클레오티드 부분을 포함한다. 스크리닝 방법은 지질 수송 및 대사 유전자의 센스 또는 천연 안티센스 폴리뉴클레오티드를 인코드하는 핵산 분자의 바람직한 표적 단편을 하나 이상의 후보 조절물질과 접촉시키고, 그리고 지질 수송 및 대사 유전자 폴리뉴클레오티드(가령, 서열 번호: 23-263)를 인코드하는 핵산 분자의 발현을 감소 또는 증가시키는 하나 이상의 후보 조절물질을 선택하는 단계로 구성된다. 상기 후보 조절물질 또는 조절물질들이 지질 수송 및 대사 유전자 폴리뉴클레오티드를 인코드하는 핵산 분자의 발현을 조절(가령, 감소 또는 증가)시킬 수 있는 것으로 일단 확인되면, 그 다음 조절물질은 지질 수송 및 대사 유전자 폴리뉴클레오티드의 기능의 추가 연구, 또는 본 발명에 따른 연구, 진단 또는 치료 물질로 이용될 수 있다.
상기 천연 안티센스 서열의 표적화는 바람직하게는 표적 유전자의 기능을 조절한다. 예를 들면, 지질 수송 및 대사 유전자 유전자(수탁번호 NM_005502, NM_000229, NM_002332, NM_008512, NM_000527.3, NM_000041, NM_000039,; 도 2). 바람직한 구체예에서, 상기 표적은 지질 수송 및 대사 유전자의 안티센스 폴리뉴클레오티드다. 바람직한 구체예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 트지질 수송 및 대사 유전자 폴리뉴클레오티드(가령, 수탁번호 NM_005502, NM_000229, NM_002332, NM_008512, NM_000527, NM_000041, NM_000039; 도 2)의 센스 및/또는 천연 안티센스 서열들, 변이체들, 대립유전자들, 이소폼, 상동체들, 돌연변이체들, 유도체들, 단편들 및 이들의 상보성 서열들이다. 바람직하게는, 상기 올리고뉴클레오티드는 안티센스 분자이며, 그리고 상기 표적은 안티센스 및/또는 센스 지질 수송 및 대사 유전자 폴리뉴클레오티드의 코딩 및 넌코딩 구역을 포함한다.
본 발명의 바람직한 표적 단편은 본 발명의 각 상보성 안티센스 화합물과 복합되어 안정화된 이중-가닥 (duplexed) 올리고뉴클레오티드를 형성할 수도 있다.
이와 같은 이중 가닥의 올리고뉴클레오티드 모이어티는 당분야에서 표적 발현을 조절하고, 해독을 조절하고 뿐만 아니라 안티센스 기전을 통하여 RNA 프로세싱을 조절하는 것으로 알려져 있다. 더욱이, 이중-가닥 모이어티는 화학적 변형을 받을 수도 있다(Fire et al ., (1998) Nature , 391, 806-811; Timmons and Fire , (1998) Nature , 395, 854; Timmons et al ., (2001) Gene , 263, 103-112; Tabara et al ., (1998) Science , 282, 430-431; Montgomery et al ., (1998) Proc . Natl . Acad. Sci . USA , 95, 15502-15507; Tuschl et al ., (1999) Gene Dev ., 13, 3191-3197; Elbashir et al., (2001) Nature , 411, 494-498; Elbashir et al ., (2001) Gene Dev . 15, 188-200). 예를 들면, 이와 같은 이중-가닥 모이어티는 표적에 대한 듀플렉스의 안티센스 가닥의 고유한 하이브리드화에 의해 표적을 저해하여, 표적의 효소적 분해를 촉발시키는 것으로 알려져 있다. (Tijsterman et al ., (2002) Science , 295, 694-697).
바람직한 구체예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 지질 수송 및 대사 유전자 폴리뉴클레오티드 (가령, 수탁번호 NM_005502, NM_000229, NM_002332, NM_008512. NM_000527, NM_000041, NM_000039), 변이체들, 대립유전자들, 이소폼, 상동체들, 돌연변이체들, 유도체들, 단편들 및 이의 상보성 서열들을 표적한다. 바람직하게는 올리고뉴클레오티드는 안티센스 분자다.
본 발명의 구체예에 따르면, 표적 핵산 분자는 지질 수송 및 대사 유전자에만 국한되지 않으며, 지질 수송 및 대사 유전자 분자들의 이소폼, 수용체, 상동체들 그리고 이와 유사한 것까지 확장된다.
또 다른 바람직한 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 지질 수송 및 대사 유전자 폴리뉴클레오티드의 천연 안티센스 서열, 예를 들면, 폴리뉴클레오티드(서열 번호: 8-22) 및 이의 임의의 변이체들, 대립유전자들, 상동체들, 돌연변이체들, 유도체들, 단편들 및 상보성 서열들을 표적한다. 안티센스 올리고뉴클레오티드의 예는 서열 번호: 23-263에서 제시된다.
한 구체예에서, 상기 올리고뉴클레오티드는 예를 들면, 지질 수송 및 대사 유전자 폴리뉴클레오티드와 연합된 넌코딩 센스 및/또는 안티센스 서열들을 포함하나 이에 한정되지 않는 지질 수송 및 대사 유전자 안티센스의 핵산 서열에 상보성이거나 또는 이에 결합하고, 그리고 지질 수송 및 대사 유전자 분자들의 발현 및/또는 기능을 조절한다.
또 다른 바람직한 구체예에서, 상기 올리고뉴클레오티드는 지질 수송 및 대사 유전자 천연 안티센스의 핵산 서열(서열 번호: 8-22에 제시됨)에 상보성이거나 또는 이에 결합하고, 그리고 지질 수송 및 대사 유전자 분자들의 발현 및/또는 기능을 조절한다.
바람직한 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 서열 번호: 23-263의 최소한 5개의 연속 뉴클레오티드 서열들을 포함하고, 지질 수송 및 대사 유전자 분자들의 발현 및/또는 기능을 조절한다.
상기 폴리뉴클레오티드 표적은 지질 수송 및 대사 유전자의 패밀리 멤버, 지질 수송 및 대사 유전자의 변이체들; SNP를 포함하는 지질 수송 및 대사 유전자의 돌연변이체들; 지질 수송 및 대사 유전자의 넌코딩 서열들; 지질 수송 및 대사 유전자의 대립유전자들; 종 변이체들, 단편들 그리고 이와 유사한 것을 포함하는 지질 수송 및 대사 유전자를 포함한다. 바람직하게는 상기 올리고뉴클레오티드는 안티센스 분자다.
또 다른 바람직한 구체예에서, 지질 수송 및 대사 유전자 폴리뉴클레오티드를 표적화하는 상기 올리고뉴클레오티드는 안티센스 RNA, 간섭 RNA (RNAi), 짧은 간섭 RNA (siRNA); 마이크로 간섭 RNA (miRNA); 작은, 일시적 RNA (stRNA); 또는 짧은, 헤어핀 RNA (shRNA); 작은 RNA-유도된 유전자 활성화 (RNAa); 또는, 작은 활성화 RNA (saRNA)를 포함한다.
또 다른 바람직한 구체예에서, 지질 수송 및 대사 유전자 폴리뉴클레오티드(가령, 서열 번호: 8-22)의 표적화는 이들 표적의 발현 또는 기능을 조절한다. 한 구체예에서, 발현 또는 기능은 기준과 비교하였을 때 상향-조절된다. 또 다른 바람직한 구체예에서, 발현 또는 기능은 기준과 비교하였을 때 하향-조절된다.
또 다른 바람직한 구체예에서, 안티센스 화합물은 서열 번호: 23-263에서 제시된 것과 같은 서열들을 포함한다. 이들 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 변형된 뉴클레오티드, 더 짧은 또는 더 긴 단편들, 변형된 결합 그리고 이와 유사한 것을 포함할 수 있다.
또 다른 바람직한 구체예에서, 서열 번호: 23-263은 하나 이상의 LNA 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
바람직한 표적 핵산의 조절은 당분야에 공지된 몇 가지 방식으로 실행될 수 있다. 예를 들면, 안티센스 올리고뉴클레오티드, siRNA 등. 효소적 핵산 분자들(가령, 리보자임)은 뉴클레오티드 염기 서열-특이적 방식으로 다른 별도의 핵산 분자들을 반복적으로 절단하는 능력을 포함하여 하나 이상의 다양한 반응을 촉매할 수 있는 핵산 분자들이다. 이러한 효소적 핵산 분자들은 예를 들면, 임의의 RNA 전사체를 실질적으로 표적화시키는데 이용될 수 있다 (Zaug et al ., 324, Nature 429 1986; Cech, 260 JAMA 3030, 1988; and Jefferies et al ., 17 Nucleic Acids Research 1371, 1989).
이들의 서열-특이성 때문에, trans-절단 효소적 핵산 분자들은 인간 질환에 대한 치료 물질로써 가능성을 보여준다 (Usman & McSwiggen , (1995) Ann . Rep . Med . Chem . 30, 285-294; Christoffersen and Marr , (1995) J. Med . Chem . 38, 2023-2037). 효소적 핵산 분자들은 세포성 RNA의 배경내에 특이적 RNA 표적을 절단하도록 고안될 수 있다. 이러한 절단 이벤트는 mRNA 비-기능성을 제공하여, 이 RNA로부터 단백질 발현을 폐기시킨다. 이러한 방식에서, 질환 상태와 연관된 단백질의 합성이 선택적으로 억제될 수 있다.
일반적으로, RNA 절단 활성을 가진 효소적 핵산은 먼저 표적 RNA에 결합함으로써 작용한다. 이와 같은 결합은 표적 RNA를 절단하기 위하여 작용하는 분자의 효소적 부분에 근접하게 유지된 효소적 핵산의 표적 결합 부분을 통하여 일어난다. 따라서, 효소적 핵산은 우선 표적 RNA를 인지하고, 그 다음 상보성 염기 쌍을 통하여 표적 RNA에 결합하고, 그리고 정확한 부위에 일단 결합되면, 효소적으로 작용하여 표적 RNA를 절단한다. 이러한 표적 RNA의 전략적 절단으로 인코드된 단백질의 합성을 지시하는 능력을 파괴시킬 것이다. 효소적 핵산은 이의 RNA표적에 결합하여 이를 절단시킨 후, RNA로부터 방출되어 또 다른 표적을 찾고, 새로운 표적에 반복적으로 결합하고, 이를 절단할 수 있다.
이와 같은 시험관 선별(발달)의 몇 가지 전략(Orgel , (1979) Proc . R. Soc . London , B 205, 435)이 이용되어, 절단, 및 포스포디에스테르 링키지와 아미드 링키지의 결찰과 같은 다양한 반응을 촉매할 수 있는 새로운 핵산 촉매를 개발하였다(Joyce , 1989, Gene , 82, 83-87; Beaudry et al ., 1992, Science 257, 635-641; Joyce , 1992, Scientific American 267, 90-97; Breaker et al ., 1994, TIBTECH 12, 268; Bartel et al ., 1993, Science 261:1411-1418; Szostak , 1993, TIBS 17, 89-93; Kumar et al ., 1995, FASEB J., 9, 1183; Breaker , 1996, Curr . Op . Biotech ., 7, 442).
촉매 활성을 조절할 수 있는 리보자임의 개발은 유전자 발현을 조절하기 위한 목적으로 RNA-절단 리보자임을 이용하는 임의의 전략에 상당히 기여할 수 있다. 해머 머리모양의 리보자임은 예를 들면, Mg2 + 공인자의 포화 농도 존재(10mM)하에 약 1min-1의 촉매속도(kcat)로 기능을 한다. 인위적인 "RNA 리가아제" 리보자임은 약 100 min-1의 속도로 상응하는 자가-변형 반응을 촉매하는 것으로 나타났다. 또한, DNA로 구성된 기질 결합 팔(arm)을 가지고 있는 특정 변형된 해머머리 리보자임은 100 min-1에 근접한 다중 턴-오버 속도로 RNA 절단을 촉매한다. 최종적으로, 특정 뉴클레오티드 유사체를 가진 해머머리의 촉매 코어내에 특이적 잔기의 대체는 촉매 속도에서 약 10배 개선 변형된 리보자임을 제공한다. 이와 같은 발견은 리보자임이 대부분의 자가-절단 리보자임에 의해 시험관에서 보여주는 것보다 상당히 큰 촉매 속도로 화학적 변형을 촉진시킬 것이라는 것을 설명한다. 그 다음 특정 자가-절단 리보자임의 구조를 최적화시켜 최대 촉매 활성을 제공하거나, 또는 전체적으로 RNA 포스포디에스테르 절단에 대해 상당히 더 빠른 속도를 보여주는 새로운 RNA 모티프를 만드는 것이 가능하다.
“해머머리” 모델을 적용시킨 RNA 촉매에 의해 RNA 기질의 분자내 절단은 1987년 처음 나타났다(Uhlenbeck , O. C. (1987) Nature , 328: 596-600). 상기 RNA 촉매가 회수되었고, 다중 RNA 분자들과 반응되었는데, 이는 진정한 촉매임을 설명하는 것이다.
“해머머리” 모티프에 기초하여 고안된 촉매적 RNA를 이용하여 표적 서열들과 필수적인 염기쌍을 유지하도록 하기 위하여 촉매 RNA내에 적절한 염기 변화를 만듦으로써 특이적 표적 서열들을 절단하였다(Haseloff and Gerlach , (1988) Nature , 334, 585; Walbot and Bruening , (1988) Nature , 334, 196; Uhlenbeck , O. C. (1987) Nature , 328: 596-600; Koizumi , M., (1988) FEBS Lett ., 228: 228-230). 이것은 특이적 표적 서열들을 절단하기 위하여 촉매 RNA의 사용을 허락하며, 그리고 "헤머머리" 모델에 따라 고안된 촉매 RNA는 생체에서 특이적 기질 RNA를 절단하는 것이 가능하다는 것을 나타낸다(Haseloff and Gerlach , (1988) Nature , 334, 585; Walbot and Bruening , (1988) Nature, 334, 196; Uhlenbeck , O. C. (1987) Nature , 328: 596-600 참고).
RNA 간섭 (RNAi)은 포유류 및 포유류 세포에서 유전자 발현을 조절하는 강력한 도구가 되었다. 이와 같은 방식은 발현 플라스미드 또는 바이러스 및 siRNA로 프로세스되는 작은 헤어핀 RNA에 대한 코딩 서열을 이용하여 RNA 자체로 또는 DNA로 작은 간섭 RNA(siRNA) 운반을 요구한다. 이 시스템은 pre-siRNA를 세포질로 효과적으로 운반할 수 있는데, 세포질에서 이들 RNA는 활성이 있으며, 유전자 발현을 위하여 조절된 그리고 조직 특이적인 프로모터의 사용을 허용한다.
바람직한 구체예에서, 올리고뉴클레오티드 또는 안티센스 화합물은 리보핵산 (RNA) 및/또는 데옥시리보핵산 (DNA)의 올리고머 또는 폴리머, 또는 이의 모방체, 키메라, 유사체 또는 동사체를 포함한다. 이 용어는 자연적으로 생성된 뉴클레오티드, 슈가들 및 공유적 뉴클레오티드간 (기본골격) 링키지로 구성된 올리고뉴클레오티드 뿐만 아니라, 유사하게 기능을 하는 비-자연적으로 생성되는 부분들을 포함하는 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 이와 같은 변형된 또는 치환된 올리고뉴클레오티드는 예를 들면, 강화된 세포성 취입, 표적 핵산에 대해 강화된 친화력 그리고 뉴클레아제 존재시 증가된 안정성과 같은 바람직한 성질들 때문에 고유 형태를 능가하는 것이 종종 바람직하다.
본 발명에 따르면, 올리고뉴클레오티드 또는 "안티센스 화합물"은 안티센스 올리고뉴클레오티드 (가령 RNA, DNA, 이의 모방체, 키메라, 유사체 또는 동사체), 리보자임, 외부 유도 서열 (EGS) 올리고뉴클레오티드, siRNA 화합물, 단일- 또는 이중-가닥 RNA 간섭 (RNAi) 화합물 가령, siRNA 화합물, saRNA, aRNA, 및 표적 핵산의 최소한 일부분에 하이브리드되어 이의 기능을 조절하는 기타 올리고머 화합물을 포함한다. 이와 같이, 올리고뉴클레오티드 또는 "안티센스 화합물"은 DNA, RNA, DNA-like, RNA-like, 또는 이의 혼합물들일 수 있고, 또는 하나 이상의 이들의 모방체가 될 수도 있다. 이들 화합물들은 단일-가닥, 이중-가닥, 원형 또는 헤어핀 올리고머 화합물이 될 수 있으며, 그리고 내부 또는 말단 중배(bulges), 미스메치 또는 루프와 같은 구조적 요소들을 포함할 수 있다. 안티센스 화합물들은 일반적으로 선형으로 준비되지만, 원형 및/또는 가지형이 되기 위해 결합하거나 다른 방식으로 준비될 수 있다. 안티센스 화합물은 예를 들면, 두 개 가닥이 하이브리드되어 완전하게 또는 부분적으로 이중-가닥 화합물을 형성하거나 또는 하이브리드화 및 완전하게 또는 부분적으로 이중-가닥 화합물의 형성을 허용하기 위하여 충분한 자가-상보성을 가진 단일 가닥과 같은 구조체를 포함할 수 있다. 두 가닥은 내부적으로 연결되어 자유 3' 또는 5' 말단을 남겨놓거나 또는 연속 헤어핀 구조 또는 루프를 형성하기 위해 연결될 수 있다. 헤어핀 구조는 5' 또는 3' 말단에 단일 가닥의 연장부를 만드는 오버행을 포함할 수 있다. 이중 가닥의 화합물들은 선택적으로 양단에 오버행을 포함할 수 있다. 추가 변형은 말단, 선택된 뉴클레오티드 위치, 슈가 위치중 하나에 부착된, 또는 뉴클레오티드간 링키지 중 하나에 부착된 콘쥬게이트 군을 포함할 수 있다. 대안으로, 두 개 가닥은 비-핵산 모이어티 또는 링커 군을 통하여 링크될 수 있다. 한 개 가닥으로부터만 형성된 경우, dsRNA는 듀플렉스를 형성하기 위하여 자체에 둘로 접히는 자가-상보성 헤어핀 유형 분자의 형태를 취할 수 있다. 따라서, dsRNAs는 완전히 또는 부분적으로 이중 가닥이 될 수 있다. 유전자 발현의 특이적 조절은 유전자전이 세포계에서 dsRNA 헤어핀의 안정적 발현에 의해 이루어질 수 있다(Hammond et al ., (1991) Nat . Rev . Genet ., 2, 110-119; Matzke et al ., (2001) Curr . Opin . Genet . Dev ., 11, 221-227; Sharp , (2001) Gene Dev ., 15, 485-490). 두 개 가닥으로부터 형성될 때, 또는 듀플렉스를 형성하기 위하여 자체에 둘로 접히는 자가-상보성 헤어핀 유형 분자의 형태를 취하는 단일 가닥의 경우, 두 개 가닥(또는 단일 가닥의 듀플렉스 형성 구역)은 Watson-Crick 방식으로 염기쌍을 이루는 상보성 RNA 가닥이다.
일단 시스템내로 도입되면, 본 발명의 화합물들은 표적 핵산의 절단 또는 다른 변형을 얻기 위하여 하나 이상의 효소 또는 구조적 단백질의 작용을 유도할 수 도 있고, 또는 점유-기반 기전(occupancy-based mechanisms)을 통하여 작용할 수도 있다. 일반적으로, 핵산 (올리고뉴클레오티드를 포함)은 "DNA-like" (가령, 하나 이상의 2'-데옥시 슈가를 가지고, 그리고 U 염기 대신 일반적으로 T를 가짐) 또는 "RNA-like" (가령, 하나 이상의 2'-하이드록시 또는 2'-변형된 슈가를 가지고, 그리고 T 염기 대신 U 염기를 일반적으로 가짐)으로 설명될 수 있다. 핵산 헬릭스는 한 가지 이상의 구조 유형을 채택할 수 있지만, 가장 흔하게는 A- 및 B-형이 된다. 일반적으로, B-형-유사 구조를 가지는 올리고뉴클레오티드는 "DNA-like"이며, 그리고 A-형-유사 구조를 가지는 올리고뉴클레오티드는 "RNA-like"이다. 일부(키메라) 구체예에서, 안티센스 화합물은 A- 및 B-형 구역을 포함한다.
본 발명에 따른 안티센스 화합물은 길이가 약 5 내지 약 80 뉴클레오티드 (가령, 약 5 내지 약 80개의 링크된 뉴클레오시드)의 안티센스 부분을 포함할 수 있다. 이는 안티센스 가닥 또는 안티센스 화합물의 일부분의 길이를 말한다. 환언하면, 본 발명의 단일-가닥 안티센스 화합물은 약 5 내지 약 80 뉴클레오티드를 포함하며, 그리고 본 발명의 이중-가닥 안티센스 화합물(예를 들면, dsRNA)은 길이가 5개 내지 약 80개 뉴클레오티드로 된 센스 및 안티센스 가닥 또는 일부분을 포함한다. 이것은 길이가 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개, 30개, 31개, 32개, 33개, 34개, 35개, 36개, 37개, 38개, 39개, 40개, 41개, 42개, 43개, 44개, 45개, 46개, 47개, 48개, 49개, 50개, 51개, 52개, 53개, 54개, 55개, 56개, 57개, 58개, 59개, 60개, 61개, 62개, 63개, 64개, 65개, 66개, 67개, 68개, 69개, 70개, 71개, 72개, 73개, 74개, 75개, 76개, 77개, 78개, 79개, 또는 80개 뉴클레오티드 또는 이 범위내 임의의 수의 안티센스 부분을 포함한다는 것을 당업자는 이해할 것이다.
한 구체예에서, 본 발명의 안티센스 화합물은 길이가 10개 내지 50개 뉴클레오티드의 안티센스 부분을 가진다. 이것은 길이가 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개, 30개, 31개, 32개, 33개, 34개, 35개, 36개, 37개, 38개, 39개, 40개, 41개, 42개, 43개, 44개, 45개, 46개, 47개, 48개, 49개, 또는 50개 뉴클레오티드 또는 이 범위내 임의의 수의 안티센스 부분으로 구체화된다는 것을 당업자는 이해할 것이다. 일부 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 길이가 15개 뉴클레오티드다.
한 구체예에서, 본 발명의 안티센스 화합물은 길이가 12개 또는 13개 내지 30개 뉴클레오티드의 안티센스 부분을 가진다. 이것은 길이가 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개, 또는 30개 뉴클레오티드 또는 이 범위내 임의의 수의 안티센스 부분으로 구체화된다는 것을 당업자는 이해할 것이다.
또 다른 바람직한 구체예에서, 본 발명의 올리고머 화합물은 화합물내에 하나 이상의 뉴클레오티드 위치에 상이한 염기가 존재하는 변이체를 포함한다. 예를 들면, 첫번째 뉴클레오티드가 아데노신이라면, 변이체들은 이 위치에 티미딘, 구아노신 또는 시티딘을 포함하도록 만들어질 수 있다. 안티센스 또는 dsRNA 화합물의 임의의 위치에서 일어날 수 있다. 이들 화합물은 표적 핵산의 발현을 억제하는 이들 능력을 측정하기 위하여 여기에서 설명된 방법에 의해 테스트된다.
일부 구체예에서, 안티센스 화합물과 표적 사이에 상동성, 서열 동일성 또는 상보성은 약 40% 내지 약 60%이다. 일부 구체예에서, 안티센스 화합물과 표적 사이에 상동성, 서열 동일성 또는 상보성은 약 60% 내지 약 70%이다. 일부 구체예에서, 안티센스 화합물과 표적 사이에 상동성, 서열 동일성 또는 상보성은 약 70% 내지 약 80%이다. 일부 구체예에서, 안티센스 화합물과 표적 사이에 상동성, 서열 동일성 또는 상보성은 약 80% 내지 약 90%이다. 일부 구체예에서, 안티센스 화합물과 표적 사이에 상동성, 서열 동일성 또는 상보성은 약 90%, 약 92%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99% 또는 약 100%이다.
또 다른 바람직한 구체예에서, 서열 번호: 8 내지 263에 제시된 핵산 분자들과 같은 안티센스 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 치환 또는 변형을 포함한다. 한 구체예에서, 뉴클레오티드는 잠금 핵산 (LNA)으로 치환된다.
또 다른 바람직한 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 지질 수송 및 대사 유전자 및 서열 번호: 1-7 및 8-22의 서열과 연관된 코딩 및/또는 넌코딩 서열들의 핵산 분자들 센스 및/또는 안티센스의 하나 이상의 구역을 표적한다. 상기 올리고뉴클레오티드는 서열 번호: 1-7 및 8-22의 중첩 구역을 또한 표적한다.
본 발명의 특정 바람직한 올리고뉴클레오티드는 키메라 올리고뉴클레오티드다. 본 발명의 내용에서 "키메라 올리고뉴클레오티드" 또는 "키메라"는 두개 이상의 화학적으로 별개의 구역을 포함하며, 각 구역은 최소 한 개의 뉴클레오티드로 구성되는, 올리고뉴클레오티드다. 이와 같은 올리고뉴클레오티드는 일반적으로 하나 이상의 유익한 성질(예를 들면, 증가된 뉴클레아제 저항성, 세포내로의 증가된 취입, 표적에 대한 증가된 결합 친화력)을 부여하는 변형된 뉴클레오티드의 최소 한 구역과 RNA:DNA 또는 RNA:RNA 하이브리드를 절단할 수 있는 기질이 되는 구역을 포함한다. 예를 들면, RNase H는 RNA:DNA 듀플렉스의 RNA 가닥을 절단하는 세포성 엔도뉴클레아제다. 따라서, RNase H의 활성화는 RNA 표적의 절단을 초래하여, 유전자 발현의 안티센스 조절의 효과를 상당히 강화시킨다. 결과적으로, 동일한 표적 구역에 하이브리드되는 포스포로티오에이트 데옥시올리고뉴클레오티드와 비교하였을 때, 키메라 올리고뉴클레오티드가 사용되면, 더 짧은 올리고뉴클레오티드로 필적할 수 있는 결과를 종종 얻을 수 있다. RNA 표적의 절단은 겔 전기영동 및 필요하다면, 당분야에 공지된 핵산 하이브리드 기술와 연합하여 일반적으로 탐지될 수 있다. 바람직한 한 구체예에서, 키메라 올리고뉴클레오티드는 표적 결합 친화력을 증가시키도록 변형된 최소한 한 구역과, RNAse H에 대한 기질로 작용하는 한 구역을 포함한다. 올리고뉴클레오티드가 이의 표적에 대한 친화력(이 경우, ras를 인코드하는 핵산)은 올리고뉴클레오티드/표적 쌍의 Tm을 측정함으로써 일반적으로 결정되는데, 이것은 올리고뉴클레오티드와 표적이 분리되는 온도이며; 해리는 분광광도계에 의해 탐지된다. Tm이 높을수록 표적에 대한 올리고뉴클레오티드의 친화력이 커진다.
본 발명의 키메라 안티센스 화합물은 상기에서 설명된 것과 같이 두개 이상의 올리고뉴클레오티드, 변형된 올리고뉴클레오티드, 올리고뉴클레오시드 및/또는 올리고뉴클레오티드 모방체의 혼성 구조로 형성될 수 있다. 이와 같은 화합물을 당분야에서 하이브리드(hybrids) 또는 겜퍼(gapmers)라고 한다. 이와 같은 하이브리드 구조의 제조에 대해 교시하는 대표적인 미국 특허는 다음을 포함하나 이에 한정되지 않는다: US 특허 제5,013,830호; 제5,149,797호; 제5,220,007호; 제5,256,775호; 제5,366,878호; 제5,403,711호; 제5,491,133호; 제5,565,350호; 제5,623,065호; 제5,652,355호; 제5,652,356호; 및 제5,700,922호, 이들 각각은 참고문헌에 통합된다.
또 다른 바람직한 구체예에서, 변형된 올리고뉴클레오티드의 구역은 슈가의 2'위치에서 변형된 최소한 뉴클레오티드를 포함하는데, 가장 바람직하게는 2'-O알킬, 2'-O-알킬-O-알킬 또는 2'-플루오르-변형된 뉴클레오티드이다. 다른 바람직한 구체예에서, RNA 변형은 피리미딘의 리보즈, 염기가 소실된 잔기(abasic residues) 또는 RNA의 3' 말단에서 역전된 염기상에 2'-플루오르, 2'-아미노 및 2' O-메틸 변형을 포함한다. 이와 같은 변형은 올리고뉴클레오티드에 통상적으로 통합되며, 그리고 이들 올리고뉴클레오티드는 주어진 표적에 대해 2'-데옥시올리고뉴클레오티드보다 더 높은 Tm(가령, 더 높은 표적 결합 친화력)을 가지는 것을 보여주었다. 증가된 친화력의 효과는 유전자 발현의 RNAi 올리고뉴클레오티드 억제를 상당히 강화시키는 것이다. RNAse H는 RNA:DNA 듀플렉스의 RNA 가닥을 절단하는 세포성 엔도뉴클레아제이며; 따라서, 이 효소의 활성화로 RNA 표적이 절단되며, 그리고 RNAi 억제의 효과는 상당히 강화될 것이다. RNA 표적의 절단은 겔 전기영동에 의해 통상적으로 설명될 수 있다. 또 다른 바람직한 구체예에서, 키메라 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레아제 저항성을 강화시키기 위하여 변형된다. 세포는 핵산을 분해시킬 수 있는 다양한 엑소- 및 엔도-뉴클레아제를 포함한다. 다수의 뉴클레오티드 및 뉴클레오시드 변형은 고유한 올리고데옥시뉴클레오티드 보다 뉴클레아제 절단에 더 저항성을 가지도록 올리고뉴클레오티드가 통합된 것들이다. 뉴클레아제 저항성은 올리고뉴클레오티드를 세포 추출물 또는 분리된 뉴클레아제 용액과 항온처리하고, 통상적으로 겔 전기영동에 의해 시간이 경과한 후에 남아있는 고유 올리고뉴클레오티드의 수준을 측정함으로써 결정된다. 뉴클레아제 저항성을 강화시키도록 변형된 올리고뉴클레오티드는 변형안된 올리고뉴클레오티드보다 더 긴 시간 동안 고유한 상태로 존재한다. 다양한 올리고뉴클레오티드 변형이 뉴클레아제 저항성을 강화시키거나 부여한다는 것이 설명되었다. 최소한 하나의 포스포로티오에이트 변형을 포함하는 올리고뉴클레오티드가 더 바람직하다. 일부 경우, 표적 결합 친화력이 강화된 올리고뉴클레오티드 변형은 독립적으로 뉴클레아제 저항성을 강화시킨다. 일부 바람직한 변형은 De Mesmaeker et al . (1995) Acc . Chem . Res . 28:366-374에서 찾아볼 수 있다.
본 발명에서 구상된 일부 바람직한 올리고뉴클레오티드의 특정 예는 변형된 기본골격을 포함하는 것들, 예를 들면, 포스포로티오에이트, 포스포트리에스테르, 메틸 포스포네이트, 짧은 쇄 알킬 또는 사이클로알킬 인터슈가 링키지 또는 짧은 쇄 이형원자 또는 이형사이클 인터슈가 링키지를 포함한다. 가장 바람직한 것은 포스포로티오에이트 기본골격을 가진 올리고뉴클레오티드 및 이형원자 기본골격을 가진 올리고뉴클레오티드, 특히, CH2--NH--O--CH2, CH,--N(CH3)--O--CH2 [메틸렌(메틸이미노) 또는 MMI 기본골격으로 공지됨], CH2--O--N(CH3)--CH2, CH2--N(CH3)--N(CH3)--CH2 및 O--N (CH3)--CH2--CH2 기본골격을 가지며, 이때 고유 포스포디에스테르 기본골격은 O--P--O--CH로 나타낸다). De Mesmaeker et al . (1995) Acc . Chem . Res . 28:366-374)에서 설명된 아미드 기본골격 또한 바람직하다. 몰포리노 기본골격 구조를 가진 올리고뉴클레오티드 또한 바람직하다(Summerton and Weller, U.S. 특허 제5,034,506호). 다른 바람직한 구체예에서, 펩티드 핵산 (PNA) 기본골격와 같은 올리고뉴클레오티드의 포스포디에스테르 기본골격은 폴리아미드 기본골격과 대체되며, 뉴클레오티드는 폴리아미드 기본골격의 아자 질소 원자에 직간접적으로 결합된다 (Nielsen et al . (1991) Science, 254, 1497). 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 치환된 슈가 모이어티를 또한 포함할 수 있다. 바람직한 올리고뉴클레오티드는 2' 위치에 다음중 하나를 포함한다: OH, SH, SCH3, F, OCN, OCH3OCH3, OCH3O(CH2)nCH3, O(CH2)nNH2 또는 O(CH2)nCH3 이때, n은 1 내지 약 10이다; C1 내지 C10 저가알킬, 알콕시알콕시, 치환된 저가 알킬, 알카릴 또는 아랄킬; Cl; Br; CN; CF3; OCF3; O--, S--, 또는 N-알킬; O--, S--, 또는 N-알케닐; SOCH3; SO2CH3; ONO2; NO2; N3; NH2; 헤테로사이클로알킬; 헤테로사이클로알카릴; 아미노알킬아미노; 폴리알킬아미노; 치환된 실일; RNA 절단기; 리포터기; 삽입기(intercalator); 올리고뉴클레오티드의 약리역학적 성질을 개선시키는 기; 또는 올리고뉴클레오티드 및 유사한 성질을 가진 다른 치환기의 약리역학적 성질을 개선시키는 기. 바람직한 변형은 2'-메톡시에톡시[2'-O-CH2CH2OCH3, 2'-O-(2-메톡시에틸)로 공지되기도 함]을 포함한다(Martin et al ., (1995) Helv . Chim . Acta , 78, 486). 다른 바람직한 변형은 2'-메톡시 (2'-O--CH3), 2'-프로폭시 (2'-OCH2 CH2CH3) 및 2'-플루오르 (2'-F)를 포함한다. 올리고뉴클레오티드상의 다른 위치에 유사한 변형이 있을 수 있는데, 특히, 3' 말단 뉴클레오티드과 5' 말단 뉴클레오티드의 5'위치의 슈가의 3' 위치에 있을 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 또한 펜토퓨라노실기 대신 사이클로부틸과 같은 슈가 모방체를 가질 수 있다.
올리고뉴클레오티드는 또한 추가적으로 또는 대안으로, 뉴클레오티드 (당분야에서 흔히 간단히 “염기”라고 부른다) 변형 또는 치환을 포함할 수 있다. 여기에서 사용된 것과 같이, "변형안된" 또는 "천연" 뉴클레오티드는 아데닌 (A), 구아닌 (G), 티민 (T), 시토신 (C) 및 우라실 (U)을 포함한다. 변형된 뉴클레오티드는 천연 핵산에 드물게 또는 일시적으로 발견되는 뉴클레오티드, 가령, 하이포산틴, 6-메틸아데닌, 5-Me 피리미딘, 특히 5-메틸시토신 (5-메틸-2'데옥시시토신이라고 하기도 하고, 당분야에서 5-Me-C 라고 지칭하기도 함), 5-하이드록시메틸시토신 (HMC), 글리코실 HMC 및 겐토바이오실 HMC, 뿐만 아니라 합성 뉴클레오티드, 가령, 2-아미노아데닌, 2-(메틸아미노)아데닌, 2-(이미다졸일알킬)아데닌, 2-(아미노알킬아미노)아데닌 또는 다른 헤테로치환된 알킬아데닌, 2-티오우라실, 2-티오티민, 5-브로모우라실, 5-하이드록시메틸우라실, 8-아자구아닌, 7-데아자구아닌, N6(6-아미노헥실)아데닌 및 2,6-디아미노퓨린을 포함한다(Kornberg , A., DNA Replication , W. H. Freeman & Co ., San Francisco , 1980, pp75 -77; Gebeyehu , G., et al . (1987) Nucl . Acids Res . 15:4513). 당분야에 공지된 “범용(universal)” 염기, 가령, 이노신이 포함될 수 있다. 5-Me-C 치환은 0.6-1.2℃로 핵산 듀플렉스 안정성을 증가시키는 것으로 확인되었고,(Sanghvi , Y. S., in Crooke, S. T. and Lebleu , B., eds ., Antisense Research and Applications , CRC Press , Boca Raton, 1993, pp . 276-278) 그리고 현재 가장 바람직한 염기 치환이다.
본 발명의 올리고뉴클레오티드의 또 다른 변형은 올리고뉴클레오티드의 활성 또는 세포성 취입을 강화시키는 올리고뉴클레오티드 하나 이상의 모이어티 또는 콘쥬게이트에 화학적으로 연결된 것을 포함한다. 이러한 모이어티는 콜레스테롤 모이어티, 콜레스테릴 모이어티(Letsinger et al ., (1989) Proc . Natl . Acad . Sci . USA , 86, 6553), 콜린산(Manoharan et al . (1994) Bioorg . Med . Chem. Let . 4, 1053), 티오에테르, 가령, 헥실-S-트리틸티올(Manoharan et al . (1992) Ann . N.Y. Acad. Sci . 660, 306; Manoharan et al . (1993) Bioorg . Med . Chem . Let . 3, 2765), 티오콜레스테롤 (Oberhauser et al ., (1992) Nucl . Acids Res . 20, 533), 지방족 쇄, 가령, 도데칸디올 또는 운데실 잔기(Saison - Behmoaras et al . EMBO J. 1991, 10, 111; Kabanov et al . (1990) FEBS Lett . 259, 327; Svinarchuk et al . (1993) Biochimie , 75, 49), 포스포리피드, 가령, 디-헥사데실--rac-글리세롤 또는 트리에틸암모늄 1,2-디-O-헥사데실-rac-글리세로-3-H-포스포네이트(Manoharan et al . (1995) Tetrahedron Lett . 36, 3651; Shea et al . Nucl . Acids Res . 1990, 18, 3777), 폴리아민 또는 폴리에틸렌 글리콜 쇄(Manoharan et al . (1995) Nucleosides & Nucleotides , 14, 969), 또는 아다만탄 아세트산(Manoharan et al . (1995) Tetrahedron Lett . 36, 3651)을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 친지성 모이어티를 포함하는 올리고뉴클레오티드 및 이와 같은 올리고뉴클레오티드를 준비하는 방법들은 당분야에 공지되어 있다. 예를 들면, U.S. 특허 제5,138,045호, 제5,218,105호 및 제5,459,255호.
주어진 올리고뉴클레오티드의 모든 위치들이 균일하게 변형될 필요는 없으며, 그리고 전술한 변형중 하나 이상이 단일 올리고뉴클레오티드에 통합되거나 또는 올리고뉴클레오티드내 단일 뉴클레오티드에만 통합될 수 있다. 본 발명은 여기에서 정의된 키메라 올리고뉴클레오티드가 되는 올리고뉴클레오티드를 포함한다.
또 다른 구체예에서, 본 발명의 핵산 분자는 염기가 소실된(abasic) 뉴클레오티드, 폴리에테르, 폴리아민, 폴리아미드, 펩티드, 탄수화물, 지질 또는 폴리하이드로카본 화합물을 포함하나 이에 한정되지 않는 또 다른 모이어티와 콘쥬게이트된다. 이들 분자들은 슈가, 염기 또는 인산염 기의 몇 군데 위치에서 핵산 분자를 포함하는 임의의 하나 이상의 뉴클레오티드에 링크될 수 있다는 것을 당업자는 인지할 것이다.
본 발명에 이용된 올리고뉴클레오티드는 잘 알려진 고형상 합성 기술을 통하여 통상적으로 그리고 일상적으로 만들어질 수 있다. 이와 같은 합성을 위한 장비는 Applied Biosystems을 포함하는 몇 군데 업자들이 판매한다. 이와 같은 합성을 위한 임의의 기타 수단들이 이용될 수 있으며; 올리고뉴클레오티드의 실질적인 합성은 본 발명의 분야에 숙지된 자의 능력 범위내에 있다. 포스포로티오에이트 및 알킬화된 유도체들과 같은 다른 올리고뉴클레오티드를 준비하기 위한 유사한 기술을 이용하는 것 또한 공지되어 있다. 형광 라벨된, 바이오티닐화된 또는 콜레스테롤-변형된 올리고뉴클레오티드와 같은 기타 변형된 올리고뉴클레오티드를 합성하기 위하여 유사한 기술 및 시판되는 변형된 아미디트(amidites) 및 조절된 포어 글라스(CPG) 산물들, 가령, 바이오틴, 플로오레신, 아크리딘 또는 솔라렌(psoralen)-변형된 아미디트 및/또는 CPG (Glen Research, Sterling VA)으로부터 시판되는 것 이용)을 이용하는 것 또한 공지되어 있다.
본 발명에 따르면, 효과, 특이성 및 작용 기간을 강화시키기 위하여 LNA 모노머와 같은 변형을 이용하면, MOE, ANA, FANA, PS 등과 같은 현재 화학물질로 구성된 올리고뉴클레오티드의 투여 경로를 확장시킨다(Uhlman , et al .,(2000) Current Opinions in Drug Discovery & Development Vol 3 No 2). 현재 올리고뉴클레오티드에서 일부 모노머를 LNA 모노머로 치환시키면 이루어질 수 있다. LNA 변형된 올리고뉴클레오티드는 부모 화합물과 유사한 크기를 가질 수 있고, 또는 더 큰, 또는 바람직하게는 더 작은 크기를 가질 수 있다. 이와 같은 LNA-변형된 올리고뉴클레오티드는 약 70% 미만의, 더욱 바람직하게는 약 60% 미만의, 가장 바람직하게는 약 50% 미만의 LNA 모노머를 포함하며, 이들 크기는 약 5개 내지 25개 뉴클레오티드, 더욱 바람직하게는 약 12개 내지 20 개 뉴클레오티드 사이가 된다.
바람직한 변형된 올리고뉴클레오티드 기본골격은 포스포로티오에이트, 키랄 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포트리에스테르, 아미노알킬포스포트리에스테르, 메틸 및 3'알킬렌 포스포네이트 및 키랄 포스포네이트를 포함하는 기타 알킬 포스포네이트, 포스피네이트, 3'-아미노 포스포르아미데이트 및 아미노알킬포스포르아미데이트를 포함하는 포스포르아미데이트, 티오노포스포르아미데이트, 티오노알킬포스포네이트, 티오노알킬포스포트리에스테르, 및 정상적인 3'-5' 링키지를 가진 보라노포스페이트, 이들의 2'-5' 링크된 유사체들, 그리고 역전된 극성을 가진 것들(이때, 뉴클레오시드 단위의 인접된 쌍은 3'-5'에서 5'-3'로 또는 2'-5'에서 5'-2'로 링크된)을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 다양한 염, 혼합된 염 및 자유 산 형태도 포함된다.
상기 인-함유 링키지의 제조를 교시하는 대표적인 미국 특허는 다음을 포함하나 이에 한정되지 않는다: US 특허 제3,687,808호; 제4,469,863호; 제4,476,301호; 제5,023,243호; 제5,177,196호; 제5,188,897호; 제5,264,423호; 제5,276,019호; 제5,278,302호; 제5,286,717호; 제5,321,131호; 제5,399,676호; 제5,405,939호; 제5,453,496호; 제5,455,233호; 제5,466,677호; 제5,476,925호; 제5,519,126호; 제5,536,821호; 제5,541,306호; 제5,550,111호; 제5,563,253호; 제5,571,799호; 제5,587,361호; 및 제5,625,050호, 이들 각각은 참고문헌에 통합된다.
인 원자를 포함하지 않는 바람직한 변형된 올리고뉴클레오티드 기본골격은 짧은 쇄 알킬 또는 사이클로알킬 뉴클레오시드간 링키지, 혼합된 이형원자 및 알킬 또는 사이클로알킬 뉴클레오시드간 링키지, 또는 하나 이상의 짧은 쇄 이형원자 또는 이형사이클 뉴클레오티시간 링키지에 의해 형성된 기본 골격을 가진다. 이들은 몰포리노 링키지 (뉴클레오시드의 슈가 부분으로부터 일부 형성된); 실로옥산 기본골격; 설파이드, 술포옥시드 및 술폰 기본골격; 포름아세틸 및 티오포름아세틸 기본골격; 메틸렌 포름아세틸 및 티오포름아세틸 기본골격; 알켄 함유 기본골격; 술파메이트 기본골격; 메틸렌이미노 및 메틸렌하이드라지노 기본골격; 술포네이트 및 술폰아미드 기본골격; 아미드 기본골격; 그리고 N, O, S 및 CH2 성분 부분이 혼합된 것을 가지는 것들을 포함한다.
상기 올리고뉴클레오시드의 제조를 교시하는 대표적인 미국 특허는 다음을 포함하나 이에 한정되지 않는다; 미국 특허 제5,034,506호; 제5,166,315호; 제5,185,444호; 제5,214,134호; 제5,216,141호; 제5,235,033호; 제5,264,562호; 제5,264,564호; 제5,405,938호; 제5,434,257호; 제5,466,677호; 제5,470,967호; 제5,489,677호; 제5,541,307호; 제5,561,225호; 제5,596,086호; 제5,602,240호; 제5,610,289호; 제5,602,240호; 제5,608,046호; 제5,610,289호; 제5,618,704호; 제5,623,070호; 제5,663,312호; 제5,633,360호; 제5,677,437호; 및 제5,677,439호, 이들 각각은 참고문헌에 통합된다.
기타 바람직한 올리고뉴클레오티드 모방체에 있어서, 슈가 및 뉴클레오티드간 링키지는 모두, 가령, 뉴클레오티드 단위의 기본 골격은 신규한 군으로 대체된다. 염기 단위는 적합한 핵산 표적 화합물과의 하이브리드화를 위해 유지된다. 올리고머 화합물중 하나인, 우수한 하이브리드화 성질을 가진 것으로 확인된 올리고뉴클레오티드 모방체를 펩티드 핵산 (PNA)이라 지칭한다. PNA 화합물에서, 올리고뉴클레오티드의 슈가-기본 골격은 아미드 함유 기본골격, 특히 아미도에틸글리신 기본골격으로 치환된다. 핵염기는 보유되며, 기본 골격의 아미드 부분의 아자 질소 원자에 직간접적으로 결합된다. PNA 화합물의 제조를 교시하는 대표적인 미국 특허는 US 특허 제5,539,082호; 제5,714,331호; 및 제5,719,262호를 포함하나 이에 한정되지 않으며, 이들 각각은 참고문헌에 통합된다. PNA 화합물의 추가 교시는 Nielsen et al ., (1991) Science , 254, 1497-1500에서 볼 수 있다.
본 발명의 또 다른 바람직한 구체예에서, 포스포로티오에이트 기본골격를 가진 올리고뉴클레오티드, 이형원자 기본골격, 특히, CH2-NH-O-CH2-, -CH2-N(CH3)-O-CH2-(메틸렌(메틸이미노) 또는 MMI 기본골격으로 공지됨), -CH2-O-N(CH3)-CH2-, -CH2N(CH3)-N(CH3)CH2- 및-O-N(CH3)-CH2-CH2-를 가진 올리고뉴클레오시드가 되며, 이때, 고유 포스포디에스테르 기본골격은 상기 언급된 US 특허 제5,489,677호의 -O-P-O-CH2-를 나타내고, 그리고 상기 언급된 US 특허 제5,602,240호의 아미드 기본 골격이다. 또한, 상기 언급된 US 특허 제5,034,506호의 몰포리노 기본골격 구조를 가진 올리고뉴클레오티드가 바람직하다.
변형된 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 치환된 슈가 모이어티를 포함할 수 있다. 바람직한 올리고뉴클레오티드는 2' 위치에 다음중 하나를 포함한다: OH; F; O-, S-, 또는 N-알킬; O-, S-, 또는 N-알케닐; O-, S-또는 N-알키닐; 또는 O 알킬-O-알킬, 이때, 알킬, 알케닐 및 알키닐은 치환된 또는 치환안된 C 내지 CO 알킬 또는 C2 내지 CO 알케닐 및 알키닐이다. 특히 바람직한 것은 O(CH2)nOmCH3, O(CH2)n, OCH3, O(CH2)nNH2, O(CH2)nCH3, O(CH2)nONH2, 및 O(CH2n)ON(CH2)nCH3)2 이며, 이때 n과 m은 1 내지 약 10이 될 수 있다. 다른 바람직한 올리고뉴클레오티드는 2' 위치에 다음중 하나를 포함한다: C 내지 CO, (저가 알킬, 치환된 저가 알킬, 알카릴, 아랄킬, O-알카릴 또는 O-아랄킬, SH, SCH3, OCN, Cl, Br, CN, CF3, OCF3, SOCH3, SO2CH3, ONO2, NO2, N3, NH2, 헤테로사이클로알킬, 헤테로사이클로알카릴, 아미노알킬아미노, 폴리알킬아미노, 치환된 실일, RNA 절단기; 리포터기; 삽입기(intercalator); 올리고뉴클레오티드의 약리역학적 성질을 개선시키는 기; 또는 올리고뉴클레오티드 및 유사한 성질을 가진 다른 치환기의 약리역학적 성질을 개선시키는 기. 바람직한 변형은 알콕시알콕시기인 2'-메톡시에톡시[2'-O-CH2CH2OCH3, 2'-O-(2-메톡시에틸) 또는 2'-MOE로 공지되기도 함]을 포함한다(Martin et al ., (1995) Helv . Chim . Acta , 78, 486). 다른 바람직한 변형은 2'-메톡시에톡시 (2'-O-CH2CH2OCH3, 2'-O-(2-메톡시에틸) 또는 2'-MOE으로 공지되기도 함) (Martin et al ., (1995) Helv. Chim . Acta , 78, 486-504) 가령, 알콕시알콕시 기를 포함한다. 추가 바람직한 변형은 2'-디메틸아미노옥시에톡시, 가령, O(CH2)2ON(CH3)2 기, (하기 실시예에서 설명되는 것과 같이 2'-DMAOE로 공지되기도 함) 그리고 2'-디메틸아미노에톡시에톡시 (당분야에서 2'-O-디메틸아미노에톡시에틸 또는 2'-DMAEOE), 가령, 2'-O-CH2-O-CH2-N(CH2)2을 포함한다.
다른 바람직한 변형은 2'-메톡시(2'-OCH3), 2'-아미노프로폭시(2'-O CH2CH2CH2NH2) 및 2'-플루오르 (2'-F)을 포함한다. 올리고뉴클레오티드의 다른 위치, 특히 3' 말단 뉴클레오티드에서 3' 위치의 슈가 또는 2'-5' 링크된 올리고뉴클레오티드에서, 그리고 5' 말단 뉴클레오티드의 5' 위치에 유사한 변형이 만들어질 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 또한 펜토퓨라노실 슈가 대신 사이클로부틸 모이어티와 같은 슈가 모방체를 가질 수 있다. 이와 같은 변형된 슈가 구조의 제조를 교시하는 대표적인 미국 특허는 다음을 포함하나 이에 한정되지 않는다: US 특허 제4,981,957호; 제5,118,800호; 제5,319,080호; 제5,359,044호; 제5,393,878호; 제5,446,137호; 제5,466,786호; 제5,514,785호; 제5,519,134호; 제5,567,811호; 제5,576,427호; 제5,591,722호; 제5,597,909호; 제5,610,300호; 제5,627,053호; 제5,639,873호; 제5,646,265호; 제5,658,873호; 제5,670,633호; 및 제5,700,920호, 이들 각각은 참고문헌에 통합된다.
올리고뉴클레오티드는 또한 핵염기 (당분야에서 흔히 간단히 “염기”라고 부른다) 변형 또는 치환을 포함할 수 있다. 여기에서 사용된 것과 같이, "변형안된" 또는 "천연" 뉴클레오티드는 아데닌 (A), 구아닌 (G), 티민 (T), 시토신 (C) 및 우라실 (U)을 포함한다. 변형된 뉴클레오티드는 5-메틸시토신 (5-me-C), 5-하이드록시메틸 시토신, 산틴, 하이포산틴, 2-아미노아데닌, 아데닌과 구아닌의 6-메틸 및 다른 알킬 유도체들, 아데닌과 구아닌의 2-프로필 및 다른 알킬 유도체들, 2-티오우라실, 2-티오티민 및 2-티오시토신, 5-할로우라실 및 시토신, 5-프로피닐 우라실 및 시토신, 6-아조 우라실, 시토신 및 티민, 5-우라실 (슈도-우라실), 4-티오우라실, 8-할로, 8-아미노, 8-티올, 8-티오알킬, 8-하이드록실 및 다른 8-치환된 아데닌 및 구아닌, 5-할로 특히 5-브로모, 5-트리플루오르메틸 및 다른 5-치환된 우라실 및 시토신, 7-메틸무아닌 및 7-메틸아데닌, 8-아자구아닌 및 8-아자아데닌, 7-데아자구아닌 및 7-데아자아데닌 그리고 3-데아자구아닌 및 3-데아자아데닌과 같은 다른 합성 및 천연 뉴클레오티드를 포함한다.
또한, 뉴클레오티드는 미국 특허 No. 3,687,808호, 'The Concise Encyclopedia of Polymer Science And Engineering' , pages 858-859, Kroschwitz , J.I., ed . John Wiley & Sons , 1990, those disclosed by Englisch et al ., ' Angewandle Chemie , International Edition' , 1991, 30, page 613, 및 Sanghvi , Y.S., Chapter 15, ' Antisence Research and Applications' , pages 289-302, Crooke, S.T. and Lebleu , B. ea ., CRC Press , 1993에 설명된 것들을 포함한다. 이와 같은 뉴클레오티드의 일부는 본 발명의 올리고머 화합물의 결합 친화력을 증가시키는데 특히 유용하다. 이들은 2-아미노프로필아데닌, 5-프로피닐우라실 및 5-프로피닐시토신을 포함하는 5-치환된 피리미딘, 6-아자피리미딘 및 N-2, N-6 및 0-6 치환된 퓨린을 포함한다. 5-메틸시토신 치환은 핵산 듀플렉스 안정도를 0.6-1.2℃ 증가시킨 것으로 나타났고(Sanghvi , Y.S., Crooke , S.T. and Lebleu , B., eds , 'Antisence Research and Applications' , CRC Press , Boca Raton , 1993, pp . 276-278) 그리고 2'-O메톡시에틸 슈가 변형과 복합하였을 때 특히 바람직한 염기 치환이다.
상기 변형된 뉴클레오티드 및 기타 변형된 뉴클레오티드의 제조를 교시하는 대표적인 미국 특허는 다음을 포함하나 이에 한정되지 않는다: US 특허 제3,687,808호, 제4,845,205호; 제5,130,302호; 제5,134,066호; 제5,175,273호; 제5,367,066호; 제5,432,272호; 제5,457,187호; 제5,459,255호; 제5,484,908호; 제5,502,177호; 제5,525,711호; 제5,552,540호; 제5,587,469호; 제5,596,091호; 제5,614,617호; 제5,750,692호, 및 제5,681,941호, 이들 각각은 참고문헌에 통합된다.
본 발명의 올리고뉴클레오티드의 기타 변형은 올리고뉴클레오티드 하나 이상의 모이어티 또는 콘쥬게이트에 화학적으로 연결되는 것을 포함하는데, 이는 활성, 세포 분포 또는 올리고뉴클레오티드의 세포 취입을 강화시킨다.
이와 같은 모이어티는 콜레스테롤 모이어티(Letsinger et al ., (1989) Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 86, 6553-6556), 담즙산(Manoharan et al ., (1994) Bioorg . Med . Chem . Let ., 4, 1053-1060), 티오에테르, 가령, 헥실-S-트리릴티올 (Manoharan et al ., (1992) Ann . N. Y. Acad . Sci ., 660, 306-309; Manoharan et al ., (1993) Bioorg . Med . Chem . Let ., 3, 2765-2770), 티오콜레스테롤 (Oberhauser et al ., (1992) Nucl . Acids Res ., 20, 533-538), 지방족 쇄 가령, 도데칸디올 또는 운데실 잔기(Kabanov et al ., (1990) FEBS Lett ., 259, 327-330; Svinarchuk et al ., Biochimie , 1993, 75, 49-54), 인지질 가령, 디-헥사데실--rac-글리세롤 또는 트리에틸암모늄 1,2-디-O-헥사데실-rac-글리세로-3-H-포스포네이트(Manoharan et al ., (1995) Tetrahedron Lett ., 36, 3651-3654; Shea et al ., (1990) Nucl . Acids Res ., 18, 3777-3783), 폴리아민 또는 폴리에틸렌 글리콜 쇄(Mancharan et al ., (1995) Nucleoside & Nucleotide , 14, 969-973), 또는 아다만탄 아세트산(Manoharan et al ., (1995) Tetrahedron Lett ., 36, 3651-3654), 팔미틸 모이어티(Mishra et al., (1995) Biochim . Biophys . Acta , 1264, 229-237), 또는 옥타데실아민 또는 헥실아미노-카르보닐-t 옥시콜레스테롤 모이어티(Crooke et al ., (1996) J. Pharmacol . Exp . Ther ., 277, 923-937)와 같은 지질 모이어티를 포함하나 이에 한정되지 않는다.
이와 같은 올리고뉴클레오티드 모이어티의 제법을 교시하는 대표적인 미국 특허는 다음을 포함하나 이에 한정되지 않는다: US 특허 제4,828,979호; 제4,948,882호; 제5,218,105호; 제5,525,465호; 제5,541,313호; 제5,545,730호; 제5,552,538호; 제5,578,717호, 제5,580,731호; 제5,580,731호; 제5,591,584호; 제5,109,124호; 제5,118,802호; 제5,138,045호; 제5,414,077호; 제5,486,603호; 제5,512,439호; 제5,578,718호; 제5,608,046호; 제4,587,044호; 제4,605,735호; 제4,667,025호; 제4,762,779호; 제4,789,737호; 제4,824,941호; 제4,835,263호; 제4,876,335호; 제4,904,582호; 제4,958,013호; 제5,082,830호; 제5,112,963호; 제5,214,136호; 제5,082,830호; 제5,112,963호; 제5,214,136호; 제5,245,022호; 제5,254,469호; 제5,258,506호; 제5,262,536호; 제5,272,250호; 제5,292,873호; 제5,317,098호; 제5,371,241호; 제5,391,723호; 제5,416,203호; 제5,451,463호; 제5,510,475호; 제5,512,667호; 제5,514,785호; 제5,565,552호; 제5,567,810호; 제5,574,142호; 제5,585,481호; 제5,587,371호; 제5,595,726호; 제5,597,696호; 제5,599,923호; 제5,599,928호 및 제5,688,941호, 이들 각각은 참고문헌에 통합된다.
약물 발견: 본 발명의 화합물은 약물 발견 및 표적 유효화 분야에 적용시킬 수 있다. 본 발명은 지질 수송 및 대사 유전자 폴리뉴클레오티드와 질병 상태, 표현형 또는 조건 사이에 존재하는 상관 관계를 설명하기 위하여 약물 발견 노력에서 여기에서 확인된 화합물의 이용 및 바람직한 표적 단편의 이용을 포함한다. 지질 수송 및 대사 유전자 폴리뉴클레오티드를 탐지 또는 조절하는 것을 포함하는 이들 방법은 시료, 조직, 세포 또는 유기체를 본 발명의 화합물과 접촉시키고, 지질 수송 및 대사 유전자 폴리뉴클레오티드의 핵산 또는 단백질 수준을 측정하거나 및/또는 처치후 일정 시간에서 관련된 표현형 또는 화학적 엔드포인트를 측정하고, 그리고 선택적으로 처리안된 샘플의 측정된 값과 본 발명의 추가 화합물로 처리된 화합물의 값을 비교하는 것을 포함한다. 이들 방법은 표적 유효화 프로세스를 위하여 미지의 유전자 기능을 결정하기 위하여, 또는 특정 질환, 상태 또는 표현형의 치료 또는 예방을 위한 표적으로 특정 유전자 산물의 유효성을 결정하기 위한 다른 실험과 나란히 또는 복합하여 실행될 수 있다.
유전자 발현의 상향 조절 또는 억제의 평가:
외인성 핵산을 숙주 세포 또는 유기체로의 전달은 세포 또는 유기체내 핵산이 존재하는 것을 직접적으로 탐지함으로써 평가될 수 있다. 이와 같은 탐지는 당분야에 공지된 몇 가지 방법에 의해 실현될 수 있다. 예를 들면, 외인성 핵산의 존재는 서든 블랏 또는 핵산과 연합된 뉴클레오티드 서열을 특이적으로 증폭시키는 프라이머를 이용한 폴리메라제 쇄 반응(PCR)에 의해 탐지될 수 있다. 외인성 핵산의 발현은 유전자 발현 분석을 포함하는 통상적인 방법을 이용하여 측정될 수 있다. 예를 들면, 외인성 핵산으로부터 생성된 mRNA는 노던 블랏 또는 역 전사 PCR (RT-PCR)을 이용하여 탐지되고 정량화될 수 있다.
외인성 핵산으로부터의 RNA 발현 또한 효소적 활성 또는 리포터 또는 리포터 단백질 활성을 측정함으로써 탐지될 수 있다. 예를 들면, 외인성 핵산이 효과물질 RNA를 생산하고 있다는 것을 나타내는 것과 같이 표적 핵산 발현에서 증가 또는 감소로써 안티센스 조절 활성을 간접적으로 측정할 수 있다. 서열 보존에 근거하여, 프라이머를 고안하고, 이를 표적 유전자의 코딩 구역을 증폭시키는데 이용할 수 있다. 우선, 각 유전자의 가장 많이 발현된 코딩 구역을 이용하여 모델 기준 유전자를 구축할 수 있는데, 이때 임의의 코딩 또는 넌코딩 구역이 이용될 수 있다. 리포터 코딩 구역과 이의 폴리(A) 신호 사이에 각 코딩 구역을 삽입시켜 각 기준 유전자를 어셈블리한다. 이와 같은 플라스미드는 유전자의 상류 부분에 리포터 유전자를 가지고, 그리고 3' 넌-코딩 구역에 잠재적인 RNAi 표적을 가지는 mRNA를 만든다. 리포터 유전자를 조절함으로써 개별 안티센스 올리고뉴클레오티드의 효과를 분석할 수 있다. 본 발명의 방법에 유용한 리포터 유전자는 아세토하이드록시산 합성효소 (AHAS), 알칼리 포스파타제(AP), 베타 갈락토시다제(LacZ), 베타 글루코로니다제(GUS), 클로람페니콜 아세틸전이효소(CAT), 녹색 형광 단백질 (GFP), 적색 형광 단백질 (RFP), 황색 형광 단백질 (YFP), 청록색 형광 단백질 (CFP), 양고추냉이 과산화효소 (HRP), 루시페라제(Luc), 노팔린 합성효소 (NOS), 옥토파인 합성효소 (OCS), 그리고 이들의 유도체들을 포함한다. 암피실린, 블레오마이신, 클로람페니콜, 젠타마이신, 하이그로마이신, 카나마이신, 린코마이신, 메토트렉세이트, 포스피노트리친, 퓨로마이신 및 테트라사이클린에 저항성을 부여하는 다중 선택성 마커가 이용된다. 리포터 유전자의 조절을 결정하는 방법은 당분야에 공지되어 있으며, 이들 방법은 형광 측정법(가령, 형광 분광학, 형광 활성화된 세포 분류(FACS), 형광 현미경), 항생제 저항성 측정을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
지질 수송 및 대사 유전자 단백질 및 mRNA 발현은 당업계에 공지되어 있는 방법들 및 본 명세서 곳곳에서 설명된 방법들을 이용하여 분석할 수 있다. 예를 들면, ELISA와 같은 면역분석을 이용하여 단백질 수준을 결정할 수 있다. ELISAs를 위한 지질 수송 및 대사 유전자 항체는 R&D Systems(Minneapolis, MN) Abcam, Cambridge, MA으로부터 상업적으로 입수가능하다.
구체예들에서, 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드를 이용하여 처리되는 시료(가령 생체내 또는 시험관내 세포 또는 조직들)내의 지질 수송 및 대사 유전자 발현 (가령, mRNA 또는 단백질)은 대조군 시료에서의 지질 수송 및 대사 유전자 발현과 비교하여 평가한다. 예를 들면, 단백질 또는 핵산의 발현은 당업계에 공지되어 있는 방법들을 이용하여 가짜로 처리된 또는 처리안된 시료내에서의 발현과 비교할 수 있다. 대안으로, 원하는 정보에 근거하여 대조군 안티센스 올리고뉴클레오티드 (가령, 변경된 또는 상이한 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드)로 처리된 시료와 비교할 수 있다. 또다른 구체예에서, 처리된 시료 대 처리안된 시료내에서 지질 수송 및 대사 유전자 단백질 또는 핵산의 발현은 처리된 시료 대 처리안된 시료내 상이한 핵산(연구자가 적합하다고 간주하는 임의 표준, 가령, 유지관리(housekeeping) 유전자를 포함)의 발현 차이로 비교할 수 있다.
관찰된 차이는 대조군과의 비교를 위하여 비율 또는 분획형태로 원한다면 표현할 수 있다. 구체예들에서, 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드로 처리된 시료내의 지질 수송 및 대사 유전자 mRNA 또는 단백질의 수준은 대조군 핵산으로 처리된 또는 처리안된 시료와 비교하여 약 1.25배 내지 약 10배 이상 증가 또는 감소된다. 구체예들에서, 지질 수송 및 대사 유전자 mRNA 또는 단백질의 수준은 최소한 약 1.25-배, 최소한 약 1.3-배, 최소한 약 1.4-배, 최소한 약 1.5-배, 최소한 약 1.6-배, 최소한 약 1.7-배, 최소한 약 1.8-배, 최소한 약 2-배, 최소한 약 2.5-배, 최소한 약 3-배, 최소한 약 3.5-배, 최소한 약 4-배, 최소한 약 4.5-배, 최소한 약 5-배, 최소한 약 5.5-배, 최소한 약 6-배, 최소한 약 6.5-배, 최소한 약 7-배, 최소한 약 7.5-배, 최소한 약 8-배, 최소한 약 8.5-배, 최소한 약 9-배, 최소한 약 9.5-배, 또는 최소한 약 10-배 또는 그 이상 증가 또는 감소된다.
키트
, 연구 시약,
진단제
및 치료제
본 발명의 화합물을 진단, 치료 및 예방용으로 이용하거나 연구 시약 및 키트 성분으로 이용할 수 있다. 더욱이, 당업자들은 정교한 특이성으로 유전자 발현을 저해시킬 수 있는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 이용하여 특정 유전자의 기능을 밝히거나 또는 생물학적 경로의 다양한 구성부의 기능들을 구별한다.
키트, 진단 그리고 다양한 생물학적 시스템에 사용하기 위하여, 본 발명의 화합물은 단독으로 또는 다른 화합물 또는 치료제와 복합하여, 세포 및 조직에서 발현되는 유전자의 일부 또는 전체의 발현 패턴을 밝히기 위한 차등적 및/또는 복합적 분석에 도구로 유용하다.
여기에서 사용된 것과 같이, 용어 "생물학적 시스템" 또는 "시스템"은 지질 수송 및 대사 유전자의 산물들을 발현시키는, 또는 이를 발현시키도록 능력을 갖춘 임의의 유기체, 세포, 세포 배양물 또는 조직으로 정의된다. 시스템에는 인간, 유전자전이 동물, 세포, 세포 배양물, 조직, 이형이식편, 이식물 및 이의 조합을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
비-제한적 실시예로써, 하나 이상의 안티센스 화합물로 처리된 세포 또는 조직에서의 발현 패턴은 안티센스 화합물로 처리안된 기준 세포 또는 조직과 비교되며, 그리고 생성된 패턴은 검사되는 유전자의 질병 연관성, 신호 경로, 세포 국소화, 발현 수준, 크기, 구조 또는 기능에 관련되기 때문에 차등적인 유전자 발현 수준에 대해 분석된다. 자극된 또는 자극되지 않은 세포, 그리고 발현 패턴에 영향을 주는 다른 화합물들의 존부하에 이와 같은 분석들이 실행될 수 있다.
당분야에 공지된 유전자 발현 분석 방법의 예로는 DNA 어래이 또는 마이크로어래이 (Brazma and Vilo, (2000) FEBS Lett ., 2000 480, 17-24; Celis , et al ., (2000) FEBS Lett ., 480, 2-16), SAGE (유전자 발현의 일련의 분석)(Madden , et al ., (2000) Drug Discov . Today , 2000, 5, 415-425), READS (절단된 cDNAs의 제한 효소 증폭) (Prashar and Weissman , (1999) Methods Enzymol ., 303, 258-72), TOGA (total gene expression analysis) (Sutcliffe , et al ., (2000) Proc . Natl . Acad . Sci. U.S.A., 97, 1976-81), 단백질 어래이 및 단백체학(proteomics) (Celis , et al ., (2000) FEBS Lett ., 480, 2-16; Jungblut , et al ., Electrophoresis , 1999, 20, 2100-10), 발현된 서열 tag (EST) 서열화(Celis , et al ., (2000) FEBS Lett ., 480, 2-16; Larsson , et al ., (2000) J. Biotechnol., 80, 143-57), 차감성 RNA 핑거프린팅 (SuRF) (Fuchs , et al ., (2000) Anal . Biochem., 286, 91-98; Larson , et al ., (2000) Cytometry , 41, 203-208), 차감성 클로닝, 차등적 디스플레이(DD) (Jurecic and Belmont , (2000) Curr . Opin . mircobiol ., 3, 316-21), 비교성 게놈 하이브리드화 (Carulli , et al ., (1998) J. Cell Biochem . Suppl ., 1998, 31, 286-96), FISH (형광 원위치 하이브리드화) 기술 (Going and Gusterson , (1999) Eur . J. Cancer , 35, 1895-904) 및 대량 분광학 방법(To , Comb . (2000) Chem . High Throughput Screen , 3, 235-41)을 포함한다.
본 발명의 화합물은 이들 화합물이 지질 수송 및 대사 유전자를 인코드하는 핵산에 하이브리드하기 때문에 연구 및 진단에 유용하다. 예를 들면, 효과적인 지질 수송 및 대사 유전자 조절물질로써 여기에서 설명되는 조건 및 효과를 가지고 하이브리드되는 올리고뉴클레오티드는 유전자 증폭 또는 탐지에 유리한 조건하에 효과적인 프라이머 또는 프로브다. 이들 프라이머 및 프로브는 지질 수송 및 대사 유전자를 인코드하는 핵산 분자들의 특이적 탐지를 요구하는 방법 및 지질 수송 및 대사 유전자 탐지 또는 추가 연구에 유용한 이들 핵산 분자들의 증폭에 유용하다. 당분야에 공지된 방법에 의해 안티센스 올리고뉴클레오티드, 특히, 본 발명의 프라이머 및 프로브와 지질 수송 및 대사 유전자를 인코드하는 핵산의 하이브리드를 탐지할 수 있다. 이와 같은 수단은 올리고뉴클레오티드에 효소의 콘쥬게이션, 올리고뉴클레오티드의 방사능라벨링 또는 임의의 다른 적합한 탐지 수단을 포함할 수 있다. 샘플에서 지질 수송 및 대사 유전자의 수준을 탐지하기 위한 탐지 수단을 이용한 키트를 준비할 수 있다.
치료요법적 용도로 당업자는 안티센스의 특이성 및 감응성을 이용한다. 인간을 포함하는 동물의 질병 상태를 치료하는데 치료요법적 모이어티로 안티센스 화합물을 이용하였다. 안티센스 올리고뉴클레오티드 약물은 인간에게 안전하고 효과적으로 투여되었으며, 그리고 다수의 임상 시험이 현재 진행중이다. 따라서, 안티센스 화합물은 세포, 조직 및 동물, 특히 인간의 치료 섭생에 유용하도록 설정되는 유용한 치료 양식이 될 수 있다.
치료용으로, 지질 수송 및 대사 유전자 폴리뉴클레오티드의 발현을 조절하여 치료될 수 있는 질환 또는 장애에 민감한 동물, 특히 인간을 본 발명에 따른 안티센스 화합물을 투여함으로써 치료한다. 예를 들면, 한 가지 비-제한적인 구체예에서, 이 방법은 치료를 요하는 동물에게 지질 수송 및 대사 유전자 조절물질의 치료요법적 효과량을 투여하는 단계를 포함한다. 본 발명의 지질 수송 및 대사 유전자 조절물질은 지질 수송 및 대사 유전자 단백질의 활성을 효과적으로 조절하거나 또는 지질 수송 및 대사 유전자 단백질의 발현을 효과적으로 조절한다. 한 구체예에서, 동물에서 지질 수송 및 대사 유전자의 활성 또는 발현은 기준과 비교하여 약 10% 억제된다. 바람직하게는, 동물에서 지질 수송 및 대사 유전자의 활성 또는 발현은 약 30% 억제된다. 더욱 바람직하게는, 동물에서 지질 수송 및 대사 유전자의 활성 또는 발현은 약 50% 또는 그 이상으로 억제된다. 따라서, 기준과 비교하였을 때, 이 올리고머 화합물은 지질 수송 및 대사 유전자 mRNA의 발현을 최소한 10%, 최소한 50%, 최소한 25%, 최소한 30%, 최소한 40%, 최소한 50%, 최소한 60%, 최소한 70%, 최소한 75%, 최소한 80%, 최소한 85%, 최소한 90%, 최소한 95%, 최소한 98%, 최소한 99%, 또는 100% 조절한다.
한 구체예에서, 동물에서 지질 수송 및 대사 유전자의 활성 또는 발현은 기준과 비교하였을 때 약 10% 증가된다. 동물에서 지질 수송 및 대사 유전자의 활성 또는 발현은 기준과 비교하였을 때 약 30% 증가된다. 더욱 바람직하게는, 동물에서 지질 수송 및 대사 유전자의 활성 또는 발현은 기준과 비교하였을 때 약 50% 또는 그 이상 증가된다. 따라서, 올리고머 화합물은 지질 수송 및 대사 유전자 mRNA의 발현을 기준과 비교하였을 때, 최소한 10%, 최소한 50%, 최소한 25%, 최소한 30%, 최소한 40%, 최소한 50%, 최소한 60%, 최소한 70%, 최소한 75%, 최소한 80%, 최소한 85%, 최소한 90%, 최소한 95%, 최소한 98%, 최소한 99%, 또는 100% 조절한다.
예를 들면, 지질 수송 및 대사 유전자의 발현 감소는 혈청, 혈액, 지방 조직, 간 또는 임의의 기타 체액, 동물의 조직 또는 기관에서 문헌에서 설명되고, 그리고 당업계에 공지되어 있는 방법을 이용하여 측정될 수 있다. 바람직하게는, 분석될 체액, 조직 또는 기관에 포함된 세포는 지질 수송 및 대사 유전자 펩티드를 인코드하는 핵산 분자 및/또는 지질 수송 및 대사 유전자 단백질 자체를 포함한다.
본 발명의 화합물들은 적절한 약리학적으로 허용가능한 희석제 또는 캐리어에 효과량의 화합물을 첨가하여 약제 조성물로 이용될 수 있다. 본 발명의 화합물의 용도 및 방법은 예방학적으로 유용하다.
콘쥬게이트(
Conjugates
)
본 발명의 올리고뉴클레오티드의 또 다른 변형은 올리고뉴클레오티드의 활성, 세포 분포 또는 세포 취입을 강화시키는 하나 이상의 모이어티 또는 콘쥬게이트에 올리고뉴클레오티드를 화학적으로 연결시키는 것을 포함한다. 이와 같은 모이어티 또는 콘쥬게이트는 1차 또는 2차 하이드록시기와 같은 기능기에 공유적으로 결합된 콘쥬게이트기를 포함한다. 본 발명의 콘쥬게이트기는 삽입자, 리포터 분자들, 폴리아민, 폴리아미드, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리에테르, 올리고머의 약력학 성질을 강화시키는 기, 그리고 올리고머의 약동학 성질을 강화시키는 기를 포함한다. 일반적인 콘쥬게이트기는 콜레스테롤, 지질, 인지질, 바이오틴, 페나진, 폴레이트, 페탄트리딘, 안트라퀴논, 아크리딘, 플루오레세인, 로다민, 쿠마린 및 염료를 포함한다. 본 발명의 내용에서 올리고머의 약력학 성질을 강화시키는 기는 취입을 개선시키고, 분해에 저항성을 강화시키고, 및/또는 표적 핵산과 서열 특이적 하이브리드를 강화시키는 기들을 포함한다. 본 발명의 내용에서 올리고머의 약동학 성질을 강화시키는 기는 본 발명의 화합물의 취입, 분포, 대사 또는 배출을 개선시키는 기들을 포함한다. 대표적인 콘쥬게이트 기는 국제 특허 출원 PCT/US92/09196 (1992년 10월 23일 출원) 및 U.S. 특허 제6,287,860호에서 설명되며, 참고문헌에 통합된다. 콘쥬게이트 모이어티는 콜레스테롤 모이어티, 콜린산, 티오에테르, 가령, 헥실-5-트리틸티올, 티오콜레스테롤, 지방족 쇄, 가령, 도데칸디올 또는 운데실 잔기, 인지질 가령, 디-헥사데실-rac-글리세롤 또는 트리에틸암모늄 1,2-디-O-헥사데실-rac-글리세로-3-H포스포네이트, 폴리아민 또는 폴리에틸렌 글리콜 쇄 또는 아다만탄 아세트산, 팔미틸 모이어티, 또는 옥타데실아민 또는 헥실아미노-카르보닐-옥시콜레스테롤 모이어티와 같은 지질 모이어티를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 활성 약물 물질, 예를 들면, 아스피린, 와르파린, 페닐부타존, 이부프로펜, 수프로펜, 펜부펜, 케토프로펜, (S)-(+)-프라노프로펜, 카르프로펜, 단실사르코신, 2,3,5-트리요호드벤조산, 풀루페나민산, 폴린산, 벤조티아디아지드, 클로로티아지드, 디아제핀, 인도메티신, 바르비투레이트, 세팔로스포린, 술파 약물, 당뇨병치료제, 항균제 또는 항생제에 콘쥬게이트될 수도 있다.
이와 같은 올리고뉴클레오티드 콘쥬게이트의 제조를 교시하는 대표적인 미국 특허는 U.S. 특허 제4,828,979호; 제4,948,882호; 제5,218,105호; 제5,525,465호; 제5,541,313호; 제5,545,730호; 제5,552,538호; 제5,578,717호; 제5,580,731호; 제5,580,731호; 제5,591,584호; 제5,109,124호; 제5,118,802호; 제5,138,045호; 제5,414,077호; 제5,486,603호; 제5,512,439호; 제5,578,718호; 제5,608,046호; 제4,587,044호; 제4,605,735호; 제4,667,025호; 제4,762,779호; 제4,789,737호; 제4,824,941호; 제4,835,263호; 제4,876,335호; 제4,904,582호; 제4,958,013호; 제5,082,830호; 제5,112,963호; 제5,214,136호; 제5,082,830호; 제5,112,963호; 제5,214,136호; 제5,245,022호; 제5,254,469호; 제5,258,506호; 제5,262,536호; 제5,272,250호; 제5,292,873호; 제5,317,098호; 제5,371,241호; 제5,391,723호; 제5,416,203호, 제5,451,463호; 제5,510,475호; 제5,512,667호; 제5,514,785호; 제5,565,552호; 제5,567,810호; 제5,574,142호; 제5,585,481호; 제5,587,371호; 제5,595,726호; 제5,597,696호; 제5,599,923호; 제5,599,928호 및 제5,688,941호을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
제제(
Formulations
)
본 발명의 화합물은 다른 분자들, 화합물의 분자 구조 또는 혼합물, 예를 들면, 리포좀, 수용체-표적화된 분자들, 흡수(uptake), 분포 및/또는 흡수를 지원하는 경구, 직장, 국소 또는 기타 제제와 혼합, 포집, 콘쥬게이트 또는 연합될 수 있다. 취입, 분포 및/또는 흡수-지원 제제를 만드는 방법을 교시하는 대표적인 미국 특허는 다음을 포함하나 이에 한정되지 않는다: U.S. 특허 제5,108,921호; 제5,354,844호; 제5,416,016호; 제5,459,127호; 제5,521,291호; 제5,543,165호; 제5,547,932호; 제5,583,020호; 제5,591,721호; 제4,426,330호; 제4,534,899호; 제5,013,556호; 제5,108,921호; 제5,213,804호; 제5,227,170호; 제5,264,221호; 제5,356,633호; 제5,395,619호; 제5,416,016호; 제5,417,978호; 제5,462,854호; 제5,469,854호; 제5,512,295호; 제5,527,528호; 제5,534,259호; 제5,543,152호; 제5,556,948호; 5,580,575호; 및 5,595,756호, 이들 각각은 참고문헌에 통합된다.
비록 안티센스 올리고뉴클레오티드는 표적 발현 및/또는 기능을 조절하기 위하여 벡터로 투여할 필요는 없지만, 본 발명의 구체예는 안티센스 올리고뉴클레오티드의 발현을 위한 발현 벡터 구조체에 관계하는데, 이 벡터 구조체는 프로모터, 하이브리드 프로모터 유전자 서열들을 포함하며, 그리고 강력한 구성 프로모터 활성 프로모터 활성 또는 원하는 경우 유도될 수 있는 프로모터 활성을 보유한다.
구체예에서, 본 발명은 적절한 핵산 운반 시스템과 함께 전술한 안티센스 올리고뉴클레오티드중 최소한 하나를 투여하는 것을 포함한다. 한 구체예에서, 이 시스템은 폴리뉴클레오티드에 작용가능하도록 링크된 비-바이러스 벡터를 포함한다. 이와 같은 비-바이러스 벡터의 예는 올리고뉴클레오티드 만을 포함하거나(가령 서열 번호: 23-263중 임의의 하나 이상) 또는 적합한 단백질, 폴리사카라이드 또는 지질 제제와 복합된 것을 포함한다.
추가로 적합한 핵산 운반 시스템은 바이러스 벡터를 포함하는데, 일반적으로 아데노바이러스, 아데노바이러스-연합된 바이러스(AAV), 헬퍼-의존성 아데노바이러스, 레트로바이러스 또는 Japan-리포좀 (HVJ) 복합체의 헤마글루티닌 바이러스중 최소한 하나로부터 서열을 포함한다. 바람직하게는, 바이러스 벡터는 폴리뉴클레오티드에 작용가능하도록 링크된 강력한 진핵 프로모터 가령, 사이토메갈로바이러스 (CMV) 프로모터를 포함한다.
추가적으로 바람직한 벡터는 바이러스 벡터, 융합 단백질 및 화학적 콘쥬게이트를 포함한다. 레트로바이러스 벡터는 Moloney 뮤린 백혈병 바이러스 및 HIV-계 바이러스를 포함한다. 한 가지 바람직한 HIV-계 바이러스 벡터는 최소한 두 개 벡터를 포함하는데, gag 및 pol 유전자는 HIV 게놈의 것이며, env 유전자는 또 다른 바이러스에서 유래된 것이다. DNA 바이러스 벡터가 바람직하다. 이들 벡터들은 오소폭스(orthopox) 또는 아비폭스(avipox) 벡터와 같은 폭스 벡터, 허피스바이러스 벡터 예를 들면, 허피스 심플렉스 I 바이러스(HSV) 벡터(Geller , A.I. et al ., (1995) J. Neurochem, 64: 487; Lim , F., et al ., in DNA Cloning : Mammalian Systems , D. Glover , Ed . (Oxford Univ . Press , Oxford England ) (1995); Geller , A.I. et al ., (1993) Proc Natl . Acad . Sci.: U.S.A.:90 7603; Geller , A.I., et al ., (1990) Proc Natl . Acad . Sci USA : 87:1149), Adenovirus Vectors ( LeGal LaSalle et al ., Science , 259:988 (1993); Davidson , et al ., (1993) Nat. Genet . 3: 219 ; Yang , et al ., (1995) J. Virol . 69: 2004 ) 및 아데노-연합된 바이러스 벡터(Kaplitt , M.G., et al ., (1994) Nat . Genet . 8:148)를 포함한다.
본 발명의 안티센스 화합물은 임의의 약리학적으로 수용가능한 염, 에스테르 또는 이와 같은 에스테르의 염, 또는 인간을 포함하는 동물에게 투여할 때 생물학적 활성 대사물질 또는 이의 잔기를 제공(직간접적으로)할 수 있는 임의의 다른 화합물을 포함한다.
용어 "약제학적으로 허용가능한 염"은 본 발명의 화합물의 생리학적 그리고 약제학적으로 허용가능한 염을 지칭하는데, 가령, 부모 화합물의 바람직한 생물학적 활성을 보유하지만, 화합물에 바람직하지 못한 독성 효과를 부여하지 않는 염을 말한다. 올리고뉴클레오티드의 경우, 약제학적으로 허용가능한 염의 바람직한 예시 및 이의 용도는 U.S. 특허 제6,287,860호에서 추가 설명되고 있으며, 이는 참고문헌에 통합된다.
본 발명은 본 발명의 안티센스 화합물을 포함하는 약제 조성물 및 제제를 또한 포함한다. 본 발명의 약제 조성물은 국소 또는 전신 치료가 바람직한지 그리고 치료될 부위에 따라 여러 방법으로 투여될 수 있다. 투여는 국소(눈, 질 및 직장 운반을 포함하는 점막 포함), 네블리라이즈를 포함하여 분말 또는 에어로졸의 흡입 또는 들여마시는 것을 통하여 폐; 기관내(intratracheal), 비강, 상피 또는 경피), 구강 또는 장관외가 될 수 있다. 장관외(Parenteral) 투여는 정맥, 동맥내, 피하, 복막 또는 근육 주사 또는 주입; 또는 두개내(intracranial), 가령, 수막강내 또는 뇌실내 투여를 포함한다.
중추 신경계내 조직을 치료하기 위하여, 뇌척수액으로 주입 또는 주사를 통하여 투여할 수 있다. 안티센스 RNA의 뇌척수액으로의 투여는 가령, 전문이 참고문헌에 통합되어 있는 U.S. Pat. App. Pub. No. 2007/0117772, “Methods for slowing familial ALS disease progression,”에서 설명하고 있다.
본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드를 중추신경계의 세포로 투여하고자 할 때, 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드가 혈액-뇌 장벽의 통과를 촉진시킬 수 있는 하나 이상의 물질과 함께 투여할 수 있다. 가령, 내후각뇌피질 또는 해마로 주사할 수 있다. 근육 조직내 운동 뉴우런으로 아데노바이러스 벡터를 투여하여 신경영양성 인자들의 운반은 가령, 전문이 참고문헌에 통합되어 있는 U.S. Pat. 제6,632,427호, “Adenoviral-vector-mediated gene transfer into medullary motor neurons,”에서 설명하고 있다. 뇌, 가령, 선조체(striatum), 시상(thalamus), 해마(hippocampus) 또는 흑질(substantia nigra)과 같은 뇌로 벡터의 직접적 운반은 당업계에 공지되어 있으며, 그리고 가령, 전문이 참고문헌에 통합되어 있는 U.S. Pat. 제6,756,523호, “Adenovirus vectors for the transfer of foreign genes into cells of the central nervous system particularly in brain”에서 설명하고 있다. 주사를 통하여 신속하게 투여할 수 있거나 또는 시간을 두고 서서히 주입 또는 지연 방출 제제의 투여를 통하여 이루어질 수 있다.
본 안티센스 올리고뉴클레오티드는 또한 바람직한 약제 또는 약력학적 성질들을 제공하는 물질에 연결 또는 콘쥬게이트될 수 있다. 예를 들면, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 혈액-뇌 장벽의 침투를 촉진하는 또는 이를 통과하는 것으로 당업계에 공지되어 있는 임의의 물질, 가령, 트란스페린 수용체에 대한 항체에 결합시키고, 정맥 주사를 통하여 투여할 수 있다. 안티센스 화합물은 안티센스 화합물을 더 효과적으로 만들거나 및/또는 혈액-뇌 장벽을 통한 안티센스 화합물의 운반을 증가시키는 바이러스 벡터에 연결시킬 수 있다. 삼투성 혈액-뇌 장벽 파괴는 메소 에리트리톨(meso erythritol), 크실리톨, D(+) 갈락토즈, D(+) 락토즈, D(+) 크실로오즈, 둘시톨, myo-이노시톨, L(-) 푸락토즈, D(-) 만니톨, D(+) 포도당, D(+) 아라비노즈, D(-) 아라비노즈, 셀로비오즈, D(+) 말토오즈, D(+) 라피노즈, L(+) 람노즈, D(+) 멜리비오즈, D(-) 리비오즈, 아도니톨, D(+) 아라비톨, L(-) 아라비톨, D(+) 퓨코스, L(-) 퓨코스, D(-) 릭소스, L(+) 릭소스, 및 L(-) 릭소스을 포함하나 이에 한정되지 않는 슈가의 주입, 또는 글루타민, 리신, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루타민산, 글리신, 히스티딘, 루이신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 티로신, 발린, 및 타우린을 포함하나 이에 한정되지 않는 아미노산을 주입하여 실행할 수 있다. 혈액-뇌 장벽 침투를 강화시키는 방법 및 재료들은 가령, 전문이 참고문헌에 통합되어 있는 U. S. 특허 제4,866,042호, “Method for the delivery of genetic material across the blood brain barrier,” 제6,294,520호, “Material for passage through the blood-brain barrier,” 그리고 제6,936,589호, “Parenteral delivery systems,”에서 설명하고 있다.
본 안티센스 화합물들은 기타 분자들, 분자 구조 또는 화합물의 혼합물과 혼합, 포집, 콘쥬게이트 또는 연합될 수 있는데, 예를 들면, 취입, 분포 및/또는 흡수를 지원하기 위하여 리포좀, 수용체-표적화된 분자, 경구, 직장, 국소 또는 기타 제형이 될 수 있다. 예를 들면, 올리고뉴클레오티드 취입을 용이하게 하기 위하여 제형내에 양이온 지질을 포함시킬 수 있다. 취입을 용이하게 하는 것으로 나타난 이러한 조성물중 하나가 LIPOFECTIN (GIBCO-BRL, Bethesda, MD)이다.
최소한 하나의 2'-O-메톡시에틸 변형을 가진 올리고뉴클레오티드는 경구 투여용으로 특히 유용하다. 국소 투여를 위한 약제 조성물 및 제제는 경피 패취, 연고, 로션, 크림, 겔, 드롭, 좌약, 스프레이, 액상 및 분말을 포함한다. 통상적인 약리학적으로 캐리어, 수용성, 분말 또는 오일 베이스, 농후제 그리고 이와 유사한 것이 필수적이거나 바람직할 수 있다. 피복된 콘돔, 장갑 그리고 이와 유사한 것이 유용할 수 있다.
본 발명의 약제 제제는 통상적으로 단위 약형으로 제공될 수 있는데, 이는 약학 산업분야에 공지된 기술에 따라 제조될 수 있다. 이와 같은 기술은 활성 성분들을 약학적 캐리어 또는 부형제와 연합시키는 단계를 포함한다. 일반적으로, 제제는 활성 성분들을 액상 캐리어 또는 미세하게 분할된 캐리어 또는 이들 모두와 연합되도록 하고, 그 다음 필요에 따라 산물의 모양을 만들어 제조할 수 있다.
본 발명의 조성물은 정제, 캡슐, 겔 캡슐, 액체 시럽, 연질 겔, 좌약 및 관장제를 포함하나 이에 한정되지 않는 많은 가능한 약형으로 제조될 수 있다. 본 발명의 조성물은 액상, 비-액상 또는 혼합형 매질에 현탁액으로 조제될 수 있다. 수용성 현탁액은 카르복시메틸셀룰로오즈, 솔비톨 및/또는 덱스트란을 포함하는 현탁액의 점성을 증가시키는 물질을 더 포함할 수 있다. 현탁액은 안정화제를 포함할 수 있다.
본 발명의 약제 조성물은 용액, 에멸젼, 리포좀-함유 제제를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 약제 조성물 및 제제는 하나 이상의 침투 강화제, 캐리어, 부형제 또는 기타 활성 또는 비활성 성분을 포함할 수 있다.
에멸젼은 일반적으로 액체에 0.1㎛를 초과하는 방울의 형태로 분산된 또 다른 액체로 구성된 이종(heterogeneous) 시스템이다. 에멸젼은 분산된 상에 추가하여 추가 성분, 그리고 수용성 상, 오일상에서 용액으로 존재하는 또는 별도의 상 자체로 존재하는 활성 성분을 포함할 수 있다. 본 발명의 구체예로 마이크로에멸젼이 포함된다. 에멸젼 및 이의 용도는 당분야에 공지되어 있으며, U.S. 특허 제6,287,860호에서 추가 설명된다.
본 발명의 제제는 리포좀 제제를 포함한다. 본 발명에 이용된 것과 같이, 용어 "리포좀"은 구형 이중층 또는 이중층에 배열된 양쪽성 지질로 구성된 소포를 말한다. 리포좀은 단층라멜라 또는 다층라멜라로 친지성 물질로 형성된 막과 운반될 조성물을 포함하는 수용성 내부를 가진다. 양이온성 리포좀은 안정한 복합체를 형성하기 위하여 음전하를 띈 DNA 분자들과 상호작용하는 것으로 보이는 양전하를 띈 리포좀이다. pH-민감성 또는 음전하를 띈 리포좀은 복합체를 형성하기 보다는 DNA를 포집하는 것으로 본다. 양이온성 및 비-양이온성 리포좀은 세포로 DNA을 운반하는데 이용된다.
리포좀은 또한 “공간적으로 안정화된” 리포좀을 포함하는데, 여기에서 사용된 이 용어는 하나 이상의 특화된 지질을 포함하는 리포좀을 말한다. 리포좀에 통합되었을 때, 이와 같은 특화된 지질은 이와 같은 특화된 지질이 없는 리포좀과 비교하였을 때 순환 반감기가 강화된 리포좀을 만든다. 공간적으로 안정화된 리포좀의 예는 리포좀의 소포-형성된 지질 부분이 하나 이상의 글리코리피드를 포함하거나 또는 하나 이상의 친지성 폴리머, 가령, 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 모이어티로 유도화된 것들이다. 리포좀 및 이의 용도는 U.S. 특허 제6,287,860호에서 설명되고 있다.
본 발명의 제약 제제 및 조성물은 계면활성제 또한 포함할 수 있다. 약물, 제제 및 에멸젼에서 계면활성제의 이용은 당분야에 잘 공지되어 있다. 계면활성제 및 이의 용도는 U.S. 특허 제6,287,860호에서 추가 설명되고 있으며, 이는 참고문헌에 통합된다.
한 구체예에서, 본 발명은 핵산, 특히 올리고뉴클레오티드의 효과적인 운반을 위하여 다양한 침투 강화제를 이용한다. 세포 막을 가로질러 비-친지성 약물의 융합을 지원하는 것에 추가하여, 침투 강화제는 또한 친지성 약물의 침투성을 강화시킨다. 침투 강화제는 계면활성제, 지방산, 담즙산, 킬레이트제 그리고 비-킬레이트 비-계면활성제로 된 5가지 넓은 범주중 하나에 속하는 것으로 분류될 수 있다. 침투 강화제 및 이의 용도는 U.S. 특허 제6,287,860호에서 추가 설명되고 있으며, 이는 참고문헌에 통합된다.
당업자는 제제는 투여 경로와 같은 이들의 의도된 용도에 따라 통상적으로 기획된다는 것을 인지할 것이다.
본 발명의 올리고뉴클레오티드와 국소 운반제가 혼합된 국소 투여용 바람직한 제제가 포함되는데, 국소 운반제는 지질, 리포좀, 지방산, 지방산 에스테르, 스테로이드, 킬레이트제 및 계면활성제등이 된다. 바람직한 지질 및 리포좀은 중성(가령, 디올레일-포스파티딜 DOPE 에탄올아민, 디미리스토일포스파티딜 콜린 DMPC, 디스테아로일포스파티딜 콜린), 음성(가령, 디미리스토일포스파티딜 글리세롤 DMPG) 및 양이온(가령, 디올레일테트라메틸아미노프로필 DOTAP 및 디올레일-포스파티딜 에탄올아민 DOTMA)을 포함한다.
국소 또는 기타 투여용으로, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 리포좀내에 포집되거나 양이온 리포좀에 복합체를 형성할 수 있다. 대안으로, 올리고뉴클레오티드는 지질, 특히, 양이온 지질에 복합될 수 있다. 바람직한 지방산 및 에스테르, 이의 약제학적으로 허용가능한 염 그리고 이들의 용도는 U.S. 특허 제6,287,860호에서 추가 설명되어 있다.
경구 투여용 조성물 및 제제는 분말 또는 과립, 미립자, 나노입자, 물 또는 비-수용성 매질에서의 현탁액 또는 용액, 캡슐, 겔 캡슐, 사셋, 태블릿 또는 미니테블릿을 포함한다. 농후제, 향료, 희석제, 에멸젼화제, 분산 보조제 또는 결합제가 바람직할 수 있다. 바람직한 경구 제제는 본 발명의 올리고뉴클레오티드와 하나 이상의 침투 강화제, 계면활성제 및 킬레이터와 함께 투여되는 것들이다. 바람직한 계면활성제는 지방산 및/또는 이의 에스테르 또는 염, 담즙산 및/또는 이의 염을 포함한다. 바람직한 담즙산/염 그리고 지방산 및 이의 용도들은 U.S. 특허 제 6,287,860호에서 추가 설명되고 있으며, 이는 참고문헌에 통합된다. 침투 강화제, 예를 들면, 지방산/염과 담즙산/염의 복합 또한 바람직하다. 특히 바람직한 조합은 라우르산, 카프리산 및 UDCA의 나트륨염이다. 추가 침투 강화제는 폴리옥시에틸렌-9-라우릴 에테르, 폴리옥시에틸렌-20-세틸 에테르를 포함한다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 분무된 건조 과립을 포함하는 과립형으로 경구로 운반될 수 있고, 또는 미립자 또는 나노입자를 형성하기 위하여 복합될 수 있다. 올리고뉴클레오티드 복합제 및 이의 용도는 U.S. 특허 제6,287,860호에 추가 설명되어 있으며, 이는 참고문헌에 통합된다.
장관외, 기관내 또는 심실내 투여를 위한 조성물 및 제제는 완충액, 희석액 및 침투 강화제, 캐리어 화합물 및 기타 약제학적으로 허용가능한 캐리어 또는 부형제를 포함하나 이에 한정되지 않는 기타 적합한 첨가제를 포함하는 멸균 수용액을 포함할 수 있다.
본 발명의 특정 구체예는 하나 이상의 올리고머 화합물 및 비-안티센스 기전에 의해 기능을 하는 하나 이상의 다른 치료제를 포함하는 약제 조성물을 제공한다. 이와같은 화학요법제의 예로는 다우노루비신, 다우노마이신, 닥티노마이신, 독소루비신, 에피루비신, 이다루비신, 에소루비신, 블레오마이신, 마포스파미드, 이포스파미드, 시토신 아라비노시드, 비스클로로에틸-니트로조우레아, 부술판, 미토마이신 C, 악티노마이신 D, 미트라마이신, 프레드니손, 하이드록시프로게스테론, 테스토스테론, 탐옥시펜, 다카르바진, 프로카르바진, 헥사메틸멜라민, 펜타메틸멜라민, 미토산트론, 암사크린, 클로람부칠, 메틸사이클로헥실니트로조우레아, 질소 무스타드, 멜파란, 사이클로포스파미드, 6-멀캅토퓨린, 6-티오구아닌, 시타라빈, 5-아자시티딘, 하이드록시우레아, 데옥시코포르미신, 4-하이드록시퍼옥시사이클로-포스포라미드, 5-플루오르우라실 (5-FU), 5-플루오르데옥시우리딘(5-FUdR), 메토트렉세이트(MTX), 콜치신, 탁솔, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 에토포시드(VP-16), 트리메트레세이트, 이리노테칸, 포토테칸, 겜시타빈, 테니포시드, 시스플라틴 및 디에틸스틸베스트롤(DES)과 같은 암 화학치료 약물을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 화합물과 함께 이용되면, 이와 같은 화학요법제는 개별적으로 (가령, 5-FU 및 올리고뉴클레오티드), 연속적으로(가령, 일정 시간동안 5-FU 및 올리고뉴클레오티드, 그 다음 MTX 및 올리고뉴클레오티드), 또는 하나 이상의 다른 화학요법제(가령, 5-FU, MTX 및 올리고뉴클레오티드, 또는 5-FU, 방사능요법 및 올리고뉴클레오티드)와 병용하여 이용될 수 있다. 비-스테로이드성 소염제를 포함하나 이에 한정되지 않는 소염제 약물 그리고 코르티코스테로이드, 항바이러스 약물(리비비린, 비다라빈, 아시클로비르 및 강시클로비르를 포함하나 이에 한정되지 않는)이 본 발명의 조성물에 복합될 수 있다. 안티센스 화합물 및 다른 비-안티센스 약물의 복합 또한 본 발명의 범위안에 있다. 두 개 이상의 복합 화합물이 함께 또는 연속적으로 이용될 수 있다.
다른 관련된 구체예에서, 본 발명의 조성물은 하나 이상의 안티센스 화합물, 특히 제1핵산을 표적으로 하는 올리고뉴클레오티드 그리고 제 2 핵산 표적을 표적으로 하는 하나 이상의 추가 안티센스 화합물을 포함한다. 예를 들면, 제1 표적은 지질 수송 및 대사 유전자의 특정 안티센스 서열이 되며, 그리고 제 2 표적은 또 다른 뉴클레오티드 서열의 구역이 될 수 있다. 대안으로, 본 발명의 조성물은 동일한 지질 수송 및 대사 유전자 핵산 표적의 상이한 구역을 표적으로 하는 두 개이상의 안티센스 화합물을 포함할 수 있다. 다양한 안티센스 화합물의 예들이 여기에서 설명되며, 기타 화합물들은 당분야에 공지된 적합한 화합물들 중에서 선택될 수 있다. 두 개 이상의 복합 화합물이 함께 또는 연속적으로 이용될 수 있다.
약액주입
(
Dosing
)
:
치료 조성물의 제제 및 이의 후속적인 투여(약액주입)은 당분야의 기술에 속한다. 약액주입은 수 일 내지 수개월 지속되는 치료 과정, 또는 치료 효과 또는 질병 상태의 감소가 수득되는 날까지의 치료 과정과 함께 치료될 질병 상태의 중증도, 반응성에 따라 달라진다. 최적의 약액주입 일정은 환자의 신체에 약물 축적 측량으로부터 계산될 수 있다. 당업자는 최적의 주입량, 방법 및 반복률을 용이하게 결정할 수 있다. 최적의 약량은 개별 올리고뉴클레오티드의 상대적 효능에 따라 다양해질 수 있으며, 그리고 일반적으로 시험관 및 생체내 동물 모델에서 효과가 발견되는 EC50에 근거하여 예측된다. 일반적으로, 투약량은 체중 kg당 0.01㎍ 내지 100 g이 되며, 매일, 주단위, 월단위 또는 년단위로 한번 또는 2년마다 내지 20년마다 한번씩 제공될 수 있다. 당업자는 측정된 잔류 시간 및 체액 또는 조직에서 약물의 농도에 근거하여 약액주입에 대한 반복률을 용이하게 결정할 수 있을 것이다. 성공적인 처치후, 질병 상태의 재발을 방지하기 위하여 환자가 유지요법을 받도록 하는 것이 바람직하며, 이때 올리고뉴클레오티드는 체중 kg당 0.01 ㎍ 내지 100 g 범위의 유지 약량으로, 하루에 1회 이상 내지 매 20년마다 1회로 투여된다.
구체예들에서, 환자는 최소한 약 1㎎/㎏(체중), 최소한 약 2㎎/㎏, 최소한 약 3㎎/㎏, 최소한 약 4㎎/㎏, 최소한 약 5㎎/㎏, 최소한 약 6㎎/㎏, 최소한 약 7㎎/㎏, 최소한 약 8㎎/㎏, 최소한 약 9㎎/㎏, 최소한 약 10㎎/㎏, 최소한 약 15㎎/㎏, 최소한 약 20㎎/㎏, 최소한 약 25㎎/㎏, 최소한 약 30㎎/㎏, 최소한 약 35㎎/㎏, 최소한 약 40㎎/㎏, 최소한 약 45㎎/㎏, 최소한 약 50㎎/㎏, 최소한 약 60㎎/㎏, 최소한 약 70㎎/㎏, 최소한 약 80㎎/㎏, 최소한 약 90㎎/㎏, 또는 최소한 약 100 ㎎/㎏의 약물 투여량으로 치료된다. 안티센스 올리고뉴클레오티드의 특정 주사 투여량은 가령, 전문이 참고문헌에 통합되어 있는 U.S. 특허 제7,563,884호, “Antisense modulation of PTP1B expression”에서 설명하고 있다.
본 발명의 다양한 구체예들이 상기에서 설명되었는데, 이는 예를 든 것이며, 이에 한정되지 않음을 인지해야 한다. 본 발명의 범위 또는 사상을 벗어나지 않고, 본 발명의 내용에 따라 설명된 구체예에 대해 여러 변화가 만들어질 수 있다. 따라서, 본 발명의 범위는 상기 설명된 임의의 구체예에 한정되어서는 안된다.
여기에서 언급된 모든 문헌들은 참고문헌에 통합된다. 본 출원에서 언급된 모든 공고 및 특허 문헌은 각 공개 또는 특허 문헌이 개별적으로 언급된 것과 같은 수준으로 모든 목적을 위하여 참고문헌에 통합된다. 본 서류에 다양한 참고문헌에서, 출원인은 이들을 본 발명의 “선행 기술”로 인정하지 않는다. 본 발명의 조성물 및 방법의 구체예는 다음의 실시예에서 설명된다.
실시예
다음의 비-제한적 실시예는 본 발명의 선택된 구체예들을 설명하는 것이다. 나타낸 성분들에서 비율의 변화 및 대체 성분은 당업자에 자명하며, 본 발명의 구체예의 범위내에 있다.
실시예
1:
지질 수송 및 대사 유전자에 대한
안티센스
핵산 분자 및/또는 지질 수송 및 대사 유전자 폴리뉴클레오티드의 센스 가닥에 특이적인
안티센스
올리고뉴클레오티
드의 기획
상기에서 명시된 것과 같이, 용어 "~특이적인 올리고뉴클레오티드" 또는 "올리고뉴클레오티드 표적"은 (i) 표적 유전자의 부분과 안정적인 복합체를 형성할 수 있는, 또는 (ii) 표적 유전자의 mRNA 전사체의 일부분과 안정적인 듀플렉스를 형성할 수 있는 서열을 가진 올리고뉴클레오티드를 말한다.
적절한 올리고뉴클레오티드의 선택은 핵산 서열들을 자동으로 배열하고, 동일 또는 동사체 구역을 표시하는 컴퓨터 프로그램을 이용하여 실시한다. 이와 같은 프로그램을 이용하여 GenBank와 같은 데이터베이스를 조사하거나 또는 PCR 산물들을 서열화하여 수득된 핵산 서열들을 비교한다. 특정 종 범위로부터 핵산 서열을 비교하면, 종간에 적절한 동일성 수준을 나타내는 핵산을 선택할 수 있다. 유전자가 서열화안된 경우, 서든 블랏을 실시하여 표적 종과 다른 종의 유전자 사이에 동일성 수준을 결정한다. 다양한 엄격성 수준에서 서든 블랏을 실시함으로써, 당분야에 공지된 바와 같이, 적절한 동일성 수준을 얻을 수 있다. 이 과정에 의해 조절되어야 할 개체에서 표적 핵산 서열에 대해서는 높은 수준의 상보성을 나타내고, 그리고 다른 종의 대응하는 핵산 서열들에 대해서는 낮은 수준의 상보성을 나타내는 올리고뉴클레오티드의 선택이 허용된다. 당업자는 본 발명에 사용하기 위한 유전자의 적절한 구역을 선택하는 것에 상당한 허용범위가 있다는 것을 인지할 것이다.
안티센스 화합물은 표적 핵산에 화합물이 결합하여, 표적 핵산의 정상적인 기능을 간섭하여 기능 및/또는 활성이 조절되어 “특이적으로 하이브리드가능하며”, 그리고 특이적 결합이 바람직한 조건들, 가령, 생체 분석 또는 치료요법적 처치의 경우 생리학적 조건, 또는 분석이 시험관 분석으로 실행되는 경우의 조건하에서 비-표적 핵산 서열에 안티센스 화합물의 비-특이적 결합을 회피할 수 있도록 충분한 수준의 상보성이 있다.
여기에서 설명된 올리고뉴클레오티드의 하이브리드화 성질은 당분야에 공지된 하나 이상의 시험관 분석에 의해 결정될 수 있다. 예를 들면, 여기에서 설명된 올리고뉴클레오티드의 성질은 용융 곡선 분석(Melting curve assay)을 이용하여 표적 천연 안티센스와 잠재적인 약물 분자들 사이에 결합 강도를 측정함으로써 수득될 수 있다.
표적 천연 안티센스와 잠재적인 약물 분자(분자) 사이에 결합 강도는 예를 들면, 용융 곡선 분석과 같은 분자간 상호작용의 강도를 측정하는 확립된 방법중 임의의 방법, 가령, 용융 곡선 분석을 이용하여 예측될 수 있다.
용융 곡선 분석은 천연 안티센스/분자 복합체에서 이중 가닥으로부터 단일 가닥 형태로 신속하게 전이가 일어나는 온도를 결정한다. 이 온도는 두 개 분자 사이에 상호작용 강도의 신뢰성있는 척도로 광범위하게 인정된다.
용융 곡선 분석은 실제 천연 안티센스 RNA 분자 또는 분자의 결합 부위에 상응하는 합성 DNA 또는 RNA 뉴클레오티드의 cDNA 복사체를 이용하여 실시된다. 이 분석을 실행하기 위하여 모든 필수 시약을 포함하는 다중 키트를 이용한다(가령 Applied Biosystems Inc . MeltDoctor kit). 이들 키트들은 이중 가닥 DNA (dsDNA) 결합 염료 (가령, ABI HRM 염료, SYBR Green, SYTO, 등) 중 하나를 포함하는 적절한 완충액을 포함한다. dsDNA 염료의 성질은 이들이 자유형에서는 형광을 방출하지 않지만, dsDNA에 결합되면 상당한 형광성이라는 것이다.
이 분석을 실행하기 위하여, cDNA 또는 대응하는 올리고뉴클레오티드를 특정 제조업자의 프로토콜에 명시된 농도에서 분자와 혼합시킨다. 혼합물을 95℃로 가열시켜, 모든 미리-형성된 dsDNA 복합체를 해리시키고, 그 다음 실온으로 서서히 냉각시키거나 또는 키트 제조업자가 정한 다른 낮은 온도로 냉각시켜, DNA 분자들이 어닐(anneal)되도록 한다. 새로 형성된 복합체를 다시 95℃ 가열시키고, 반응에 의해 생성된 형광물질의 양에 대한 데이터를 동시에 수집한다. 형광 강도는 반응에 존재하는 dsDNA의 양에 역비례한다. 키트에 사용가능한 실시간 PCR 장비(가령 ABI’s StepOne Plus 실시간 PCR 시스템 또는 LightTyper instrument, Roche Diagnostics, Lewes, UK)를 이용하여 데이터를 수거할 수 있다.
적합한 소프트웨어(예를 들면, LightTyper (Roche) 또는 SDS Dissociation Curve, ABI)를 이용하여 온도(x-축)에 대해 온도에 따른 형광물질의 네가티브 유도체를 플롯팅하여(y축상에 -d(Fluorescence)/dT) 용융 피크를 만든다. dsDNA 복합체에서 단일 가닥 분자들로의 신속한 전이 온도를 확인하기 위하여 데이터를 분석한다. 이 온도를 Tm 이라고 하며, 두 분자간의 상호작용 강도에 직접적으로 비례한다. 일반적으로, Tm은 40℃를 넘을 것이다.
실시예
2: 지질 수송 및 대사 유전자 폴리뉴클레오티드의 조절
518A2 세포를
안티센스
올리고뉴클레오티드로 처리
Albert Einstein-Montefiore Cancer Center, NY로부터 구한 518A2 세포를 37℃, 5% CO2에서 성장 배지(MEM/EBSS (Hyclone cat #SH30024, 또는 Mediatech cat # MT-10-010-CV) +10% FBS (Mediatech cat# MT35-011-CV)+페니실린/스트렙토마이신(Mediatech cat# MT30-002-CI)에서 성장시켰다. 실험 하루전, 세포는 1.5× 105/㎖의 농도로 6개 웰 플레이트에 재도말시키고, 37℃, 5% CO2에서 항온처리하였다. 실험 당일, 6개 웰 플레이트에 있는 배지는 새로운 성장배지로 대체하였다. 모든 안티센스 올리고뉴클레오티드를 20 μM의 농도가 되도록 희석시켰다. 이 용액 2㎕를 400㎕의 Opti-MEM 배지 (Gibco cat#31985-070) 및 4㎕의 리포펙타민 2000 (Invitrogen cat# 11668019)와 실온에서 20분간 항온처리하고, 518A2 세포가 있는 6개 웰 플레이트의 각 웰에 제공하였다. 올리고뉴클레오티드 용액 대신 물 2㎕를 포함하는 유사 혼합물을 허위-처리된 기준으로 이용하였다. 37℃, 5% CO2에서 3-18시간 동안 항온처리후, 배지를 새로운 성장 배지로 교환하였다. 안티센스 올리고뉴클레오티드를 추가시킨 후 48시간 후, 배지를 제거하였고, SV Total RNA Isolation 시스템(Promega (cat # Z3105)) 또는 RNeasy Total RNA Isolation 키트(Qiagen (cat# 74181))를 이용하여 제조업자의 지시에 따라 세포로부터 RNA를 추출하였다. 600ng의 RNA를 Verso cDNA 키트 (Thermo Scientific (cat#AB1453B)) 또는 High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit(cat# 4368813)을 이용하여 제조업자의 프로토콜에 따라 실시된 역전사 반응에 첨가하였다. 이와 같은 역전사 반응에서 cDNA를 이용하여 ABI Taqman Gene 발현 Mix (cat#4369510) 및 ABI에서 기획한 프라이머/프로브(Applied Biosystems Taqman Gene Expression Assay: Appliend Biosystems Inc., Foster City CA에서 제공)을 이용하여 실시간 PCR에 의해 유전자 발현을 모니터하였다. StepOne Plus Real Time PCR Machine (Applied Biosystems)를 이용하여 다음과 같은 PCR 주기가 이용되었다: 50℃ 2분, 95℃ 10분, Mx4000 thermal cycler (Stratagene)를 이용하여 [95℃ 15초, 60℃ 1분]을 40회.
처리된 샘플과 허위로 처리된 샘플간에 18S-표준화된 dCt 값에서 차이에 근거하여 안티센스 올리고뉴클레오티드로 처리후 유전자 발현에서 폴드 변화가 계산되었다.
결과
:
실시간 PCR 결과에서 ABCA1 안티센스 AK311445에 대해 기획된 siRNA중 1개 로 처리한 후 48시간 시점에서 518A2 세포에서 ABCA1 mRNA 수준은 상당히 증가한다(도 1a).
실시간 PCR 결과에서 ABCA1 안티센스 AK311445에 대해 기획된 올리고중 6개 로 처리한 후 48시간 시점에서 518A2 세포에서 ABCA1 mRNA 수준은 상당히 증가한다(도 1b).
3
T3
세포를
안티센스
올리고뉴클레오티드로 처리
ATCC (cat# CRL-1658)의 3T3 세포를 37℃, 5% CO2에서 성장 배지(MEM/EBSS (Hyclone cat #SH30024, 또는 Mediatech cat # MT-10-010-CV) +10% FBS (Mediatech cat# MT35-011-CV)+페니실린/스트렙토마이신(Mediatech cat# MT30-002-CI)에서 성장시켰다. 실험 하루전, 세포는 1.5× 105/㎖의 농도로 6개 웰 플레이트에 재도말시키고, 37℃, 5% CO2에서 항온처리하였다. 실험 당일, 6개 웰 플레이트에 있는 배지는 새로운 성장배지로 대체하였다. 모든 안티센스 올리고뉴클레오티드를 20 μM의 농도가 되도록 희석시켰다. 이 용액 2㎕를 400㎕의 Opti-MEM 배지 (Gibco cat#31985-070) 및 4㎕의 리포펙타민 2000 (Invitrogen cat# 11668019)와 실온에서 20분간 혼합시키고, 3T3 세포가 있는 6개 웰 플레이트의 각 웰에 제공하였다. 올리고뉴클레오티드 용액 대신 물 2㎕를 포함하는 유사 혼합물을 허위-처리된 기준으로 이용하였다. 37℃, 5% CO2에서 3-18시간 동안 항온처리후, 배지를 새로운 성장 배지로 교환하였다. 안티센스 올리고뉴클레오티드를 추가시킨 후 48시간 후, 배지를 제거하였고, SV Total RNA Isolation 시스템(Promega (cat # Z3105)) 또는 RNeasy Total RNA Isolation 키트(Qiagen (cat# 74181))를 이용하여 제조업자의 지시에 따라 세포로부터 RNA를 추출하였다. 600ng의 RNA를 Verso cDNA 키트 (Thermo Scientific (cat#AB1453B)) 또는 High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit(cat# 4368813)을 이용하여 제조업자의 프로토콜에 따라 실시된 역전사 반응에 첨가하였다. 이와 같은 역전사 반응에서 cDNA를 이용하여 ABI Taqman Gene 발현 Mix (cat#4369510) 및 ABI에서 기획한 프라이머/프로브(Applied Biosystems Taqman Gene Expression Assay: Appliend Biosystems Inc., Foster City CA에서 제공)을 이용하여 실시간 PCR에 의해 유전자 발현을 모니터하였다. StepOne Plus Real Time PCR Machine (Applied Biosystems)를 이용하여 다음과 같은 PCR 주기가 이용되었다: 50℃ 2분, 95℃ 10분, [95℃ 15초, 60℃ 1분]을 40회.
처리된 샘플과 허위로 처리된 샘플간에 18S-표준화된 dCt 값에서 차이에 근거하여 안티센스 올리고뉴클레오티드로 처리후 유전자 발현에서 폴드 변화가 계산되었다.
결과
:
실시간 PCR 결과에서 마우스 ABCA1 안티센스 BF133827에 대해 기획된 올리고중 3개로 처리한 후 48시간 시점에서 3T3 세포에서 ABCA1 mRNA 수준은 상당히 증가한다(도 1c).
실시간 PCR 결과에서 LRP1 안티센스 DC401271 및 AW544265에 대해 기획된 올리고로 처리한 후 48시간 시점에서 3T3 세포에서 LRP1 mRNA 수준은 상당히 증가한다(도 1j).
HepG2
세포를
안티센스
올리고뉴클레오티드로 처리
방법 1: HepG2 세포를 네이키드 안티센스 올리고뉴클레오티드로 처리:
ATCC (cat# HB-8065)의 HepG2 세포를 37℃, 5% CO2에서 성장 배지(MEM/EBSS (Hyclone cat #SH30024, 또는 Mediatech cat # MT-10-010-CV) +10% FBS (Mediatech cat# MT35-011-CV)+페니실린/스트렙토마이신(Mediatech cat# MT30-002-CI)에서 성장시켰다. 실험 하루전, 세포는 1.5× 105/㎖의 농도로 6개 웰 플레이트에 재도말시키고, 37℃, 5% CO2에서 항온처리하였다. 실험 하루전, 세포는 1.5× 105/㎖의 농도로 6개 웰 플레이트에 재도말시키고, 37℃, 5% CO2에서 항온처리하였다. 실험 당일, 6개 웰 플레이트에 있는 배지는 새로운 성장배지 1.5㎖/웰로 대체하였다. 모든 안티센스 올리고뉴클레오티드를 20 μM의 농도가 되도록 희석시켰다. 모든 안티센스 올리고뉴클레오티드를 20 μM의 농도가 되도록 희석시켰다. 이 용액 2㎕를 400㎕의 새로운 배지와 혼합시키고, HepG2 세포가 있는 6개 웰 플레이트의 각 웰에 제공하였다. 올리고뉴클레오티드 용액 대신 물 2㎕를 포함하는 유사 혼합물을 허위-처리된 기준으로 이용하였다. 37℃, 5% CO2에서 3-18시간 동안 항온처리후, 배지를 새로운 성장 배지로 교환하였다. 안티센스 올리고뉴클레오티드를 추가시킨 후 72시간 후, 상기에서 설명한 것과 같이 세포에 다시 투약하였다. 제 2 투약후 48-72시간 후, 배지를 제거하였고, SV Total RNA Isolation System(Promega (cat # Z3105)) 또는 RNeasy Total RNA Isolation 키트(Qiagen (cat# 74181))를 이용하여 제조업자의 지시에 따라 세포로부터 RNA를 추출하였다. 600ng의 RNA를 Verso cDNA 키트 (Thermo Scientific (cat#AB1453B))을 이용하여 제조업자의 프로토콜에 따라 실시된 역전사 반응에 첨가하였다. 이와 같은 역전사 반응에서 cDNA를 이용하여 ABI Taqman Gene 발현 Mix (cat#4369510) 및 ABI에서 기획한 프라이머/프로브(Appliend Biosystems Inc., Foster City CA에서 제공)을 이용하여 실시간 PCR에 의해 유전자 발현을 모니터하였다. Mx4000 thermal cycler (Stratagene)를 이용하여 다음과 같은 PCR 주기가 이용되었다: 50℃ 2분, 95℃ 10분, [95℃ 15초, 60℃ 1분]을 40회. 처리된 샘플과 허위로 처리된 샘플간에 18S-표준화된 dCt 값에서 차이에 근거하여 안티센스 올리고뉴클레오티드로 처리후 유전자 발현에서 폴드 변화가 계산되었다.
방법 2: HepG2 세포를 네이키드 안티센스 올리고뉴클레오티드로 처리:
ATCC (cat# HB-8065)의 HepG2 세포를 37℃, 5% CO2에서 성장 배지(MEM/EBSS (Hyclone cat #SH30024, 또는 Mediatech cat # MT-10-010-CV) +10% FBS (Mediatech cat# MT35-011-CV)+페니실린/스트렙토마이신(Mediatech cat# MT30-002-CI)에서 성장시켰다. 실험 하루전, 세포는 1.5× 105/㎖의 농도로 6개 웰 플레이트에 재도말시키고, 37℃, 5% CO2에서 항온처리하였다. 실험 하루전, 세포는 1.5× 105/㎖의 농도로 6개 웰 플레이트에 재도말시키고, 37℃, 5% CO2에서 항온처리하였다. 실험 당일, 6개 웰 플레이트에 있는 배지는 새로운 성장배지로 대체하였다. 모든 안티센스 올리고뉴클레오티드를 20 μM의 농도가 되도록 희석시켰다. 이 용액 2㎕를 400㎕의 Opti-MEM 배지(Gibco cat#31985-070)와 4㎕의 리포펙타민 2000 (Invitrogen cat# 11668019)와 실온에서 20분간 항온처리하고, HepG2 세포가 있는 6개 웰 플레이트의 각 웰에 제공하였다. 올리고뉴클레오티드 용액 대신 물 2㎕를 포함하는 유사 혼합물을 허위-처리된 기준으로 이용하였다. 37℃, 5% CO2에서 3-18시간 동안 항온처리후, 배지를 새로운 성장 배지로 교환하였다. 안티센스 올리고뉴클레오티드를 추가시킨 후 48시간 후, 배지를 제거하였고, SV Total RNA Isolation 시스템(Promega (cat # Z3105)) 또는 RNeasy Total RNA Isolation 키트(Qiagen (cat# 74181))를 이용하여 제조업자의 지시에 따라 세포로부터 RNA를 추출하였다. 600ng의 RNA를 Verso cDNA 키트 (Thermo Scientific (cat#AB1453B))을 이용하여 제조업자의 프로토콜에 따라 실시된 역전사 반응에 첨가하였다. 이와 같은 역전사 반응에서 cDNA를 이용하여 ABI Taqman Gene 발현 Mix (cat#4369510) 및 ABI에서 기획한 프라이머/프로브(Appliend Biosystems Inc., Foster City CA에서 제공)을 이용하여 실시간 PCR에 의해 유전자 발현을 모니터하였다. Mx4000 thermal cycler (Stratagene)를 이용하여 다음과 같은 PCR 주기가 이용되었다: 50℃ 2분, 95℃ 10분, [95℃ 15초, 60℃ 1분]을 40회. 처리된 샘플과 허위로 처리된 샘플간에 18S-표준화된 dCt 값에서 차이에 근거하여 안티센스 올리고뉴클레오티드로 처리후 유전자 발현에서 폴드 변화가 계산되었다.
결과
:
실시간 PCR 결과에서 LCAT 안티센스 Hs.668679에 대해 기획된 올리고중 2개로 처리한 후 48시간 시점에서 HepG2 세포에서 LCAT mRNA 수준은 상당히 증가한다(도 1e).
실시간 PCR 결과에서 LCAT 안티센스 Hs.668679에 대해 기획된 올리고중 1개로 처리한 후 48시간 시점에서 HepG2 세포에서 LCAT mRNA 수준은 상당히 증가한다(도 1f).
실시간 PCR 결과에서 LRP1 안티센스 DC401271에 대해 기획된 올리고로 처리한 후 48시간 시점에서 HepG2 세포에서 LRP1 mRNA 수준은 상당히 증가한다(도 1h).
실시간 PCR 결과에서 LDLR 안티센스 sherflor.aApr07에 대해 기획된 올리고로 처리한 후 48시간 시점에서 HepG2 세포에서 LDLr mRNA 수준은 상당히 증가된다. LDLr 안티센스 bloflor.aApr07 (CUR-1059-CUR-1063)에 대해 기획된 올리고는 LDLr 수준을 상승시키지 못하였다(도 1k 및 1l).
실시간 PCR 결과에서 APOE 안티센스 Hs.626623에 대해 기획된 올리고로 처리한 후 48시간 시점에서 HepG2 세포에서 APOE mRNA 수준은 상당히 증가된다. APOE4 안티센스 Hs.714236에 대해 기획된 올리고는 APOE mRNA 수준을 상승시키지 못하였다(도 1m).
실시간 PCR 결과에서 ApoA1 안티센스 DA327409ext에 대해 기획된 안티센스 올리고뉴클레오티드의 일부로 처리한 후 48시간 시점에서 HepG2 세포에서 ApoA1 mRNA 수준은 상당히 증가한다(도 1n 내지 1p).
실시간 PCR 결과는 HepG2 세포를 7일에 걸쳐 네이키드 LNA 또는 포스포로티오에이트올리고뉴클레오티드로 처리한 후 대조군과 비교하여 ApoA1 mRNA (상부 패널) 및 ApoA1 천연 안티센스 DA327409ext RNA (하부 패널)의 배수 변화를 나타낸다(도 1q).
실시간 PCR 결과는 HepG2 세포를 LNA 올리고뉴클레오티드로 처리한 후 ApoA1 mRNA (오랜지 막대) 및 ApoA1 천연 안티센스 DA327409ext RNA (블루 막대)의 배수 변화를 나타낸다(도 1r).
Hek293 세포를 안티센스 올리고뉴클레오티드로 처리
ATCC (cat# CRL-1573)의 Hek293 세포를 37℃, 5% CO2에서 성장 배지(MEM/EBSS (Hyclone cat #SH30024, 또는 Mediatech cat # MT-10-010-CV) +10% FBS (Mediatech cat# MT35-011-CV)+페니실린/스트렙토마이신(Mediatech cat# MT30-002-CI)에서 성장시켰다. 실험 하루전, 세포는 1.5× 105/㎖의 농도로 6개 웰 플레이트에 재도말시키고, 37℃, 5% CO2에서 항온처리하였다. 실험 당일, 6개 웰 플레이트에 있는 배지는 새로운 성장배지로 대체하였다. 모든 안티센스 올리고뉴클레오티드를 20 μM의 농도가 되도록 희석시켰다. 이 용액 2㎕를 400㎕의 Opti-MEM 배지(Gibco cat#31985-070)와 4㎕의 리포펙타민 2000 (Invitrogen cat# 11668019)와 실온에서 20분간 항온처리하고, Hek293 세포가 있는 6개 웰 플레이트의 각 웰에 제공하였다. 올리고뉴클레오티드 용액 대신 물 2㎕를 포함하는 유사 혼합물을 허위-처리된 기준으로 이용하였다. 37℃, 5% CO2에서 3-18시간 동안 항온처리후, 배지를 새로운 성장 배지로 교환하였다. 안티센스 올리고뉴클레오티드를 추가시킨 후 48시간 후, 배지를 제거하였고, SV Total RNA Isolation 시스템(Promega (cat # Z3105)) 또는 RNeasy Total RNA Isolation 키트(Qiagen (cat# 74181))를 이용하여 제조업자의 지시에 따라 세포로부터 RNA를 추출하였다. 600ng의 RNA를 Verso cDNA 키트 (Thermo Scientific (cat#AB1453B)) 또는 High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit(cat# 4368813)을 이용하여 제조업자의 프로토콜에 따라 실시된 역전사 반응에 첨가하였다. 600ng의 RNA를 Verso cDNA 키트 (Thermo Scientific (cat#AB1453B)) 또는 High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit(cat# 4368813)을 이용하여 제조업자의 프로토콜에 따라 실시된 역전사 반응에 첨가하였다. 이와 같은 역전사 반응에서 cDNA를 이용하여 ABI Taqman Gene 발현 Mix (cat#4369510) 및 ABI에서 기획한 프라이머/프로브(Applied Biosystems Taqman Gene Expression Assay: Appliend Biosystems Inc., Foster City CA에서 제공)을 이용하여 실시간 PCR에 의해 유전자 발현을 모니터하였다. Mx4000 thermal cycler (Stratagene) 또는 StepOne Plus Real Time PCR Machine (Applied Biosystems)을 이용하여 다음과 같은 PCR 주기가 이용되었다: 50℃ 2분, 95℃ 10분, [95℃ 15초, 60℃ 1분]을 40회.
처리된 샘플과 허위로 처리된 샘플간에 18S-표준화된 dCt 값에서 차이에 근거하여 안티센스 올리고뉴클레오티드로 처리후 유전자 발현에서 폴드 변화가 계산되었다.
결과
:
실시간 PCR 결과에서 LCAT 안티센스 Hs.668679에 대해 기획된 올리고중 3개로 처리한 후 48시간 시점에서 Hek293 세포에서 LCAT mRNA 수준은 상당히 증가한다(도 1d).
Vero 76 세포를 안티센스 올리고뉴클레오티드로 처리
ATCC (cat# CRL-1587)의 Vero 76 세포를 37℃, 5% CO2에서 성장 배지(MEM/EBSS (Hyclone cat #SH30024, 또는 Mediatech cat # MT-10-010-CV) +10% FBS (Mediatech cat# MT35-011-CV)+페니실린/스트렙토마이신(Mediatech cat# MT30-002-CI)에서 성장시켰다. 실험 하루전, 세포는 1.5× 105/㎖의 농도로 6개 웰 플레이트에 재도말시키고, 37℃, 5% CO2에서 항온처리하였다. 실험 당일, 6개 웰 플레이트에 있는 배지는 새로운 성장배지로 대체하였다. 모든 안티센스 올리고뉴클레오티드를 20 μM의 농도가 되도록 희석시켰다. 이 용액 2㎕를 400㎕의 Opti-MEM 배지(Gibco cat#31985-070)와 4㎕의 리포펙타민 2000 (Invitrogen cat# 11668019)와 실온에서 20분간 항온처리하고, Vero 76 세포가 있는 6개 웰 플레이트의 각 웰에 제공하였다. 올리고뉴클레오티드 용액 대신 물 2㎕를 포함하는 유사 혼합물을 허위-처리된 기준으로 이용하였다. 37℃, 5% CO2에서 3-18시간 동안 항온처리후, 배지를 새로운 성장 배지로 교환하였다. 안티센스 올리고뉴클레오티드를 추가시킨 후 48시간 후, 배지를 제거하였고, SV Total RNA Isolation 시스템(Promega (cat # Z3105)) 또는 RNeasy Total RNA Isolation 키트(Qiagen (cat# 74181))를 이용하여 제조업자의 지시에 따라 세포로부터 RNA를 추출하였다. 600ng의 RNA를 Verso cDNA 키트 (Thermo Scientific (cat#AB1453B)) 또는 High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit(cat# 4368813)을 이용하여 제조업자의 프로토콜에 따라 실시된 역전사 반응에 첨가하였다. 이와 같은 역전사 반응에서 cDNA를 이용하여 ABI Taqman Gene 발현 Mix (cat#4369510) 및 ABI에서 기획한 프라이머/프로브(Applied Biosystems Taqman Gene Expression Assay: Appliend Biosystems Inc., Foster City CA에서 제공)을 이용하여 실시간 PCR에 의해 유전자 발현을 모니터하였다. Mx4000 thermal cycler (Stratagene) 또는 StepOne Plus Real Time PCR Machine (Applied Biosystems)을 이용하여 다음과 같은 PCR 주기가 이용되었다: 50℃ 2분, 95℃ 10분, [95℃ 15초, 60℃ 1분]을 40회.
처리된 샘플과 허위로 처리된 샘플간에 18S-표준화된 dCt 값에서 차이에 근거하여 안티센스 올리고뉴클레오티드로 처리후 유전자 발현에서 폴드 변화가 계산되었다.
결과
:
실시간 PCR 결과에서 LCAT 안티센스 Hs.668679에 대해 기획된 올리고중 1개로 처리한 후 48시간 시점에서 Vero 세포에서 LCAT mRNA 수준은 상당히 증가한다(도 1g).
실시간 PCR 결과에서 LRP1 안티센스 DC401271 및 Hs.711951에 대해 기획된 올리고로 처리한 후 48시간 시점에서 Vero 세포에서 LRP1 mRNA 수준은 상당히 증가한다(도 1i).
Applied Biosystems 유전자 발현 분석에 이용된 탐지 프로브:
ABCA1: Hs00194045_m1 (인간), Mm01350760_m1 (마우스)
LCAT: Hs00173415_m1
LRP1: Hs00233856_m1 (인간), Mm00464608_m1 (마우스)
LDLR: Hs00181192_m1
ApoE: Hs00171168_m1
ApoA1: Hs00163641_m1, 18S cat# 4319413E
ApoA1 안티센스 DA327409ext을 위한 커스텀 기획된 분석:
FAM labeled: TTTGGATCTGGACGACTTC (서열 번호: 275)
실시예
3: 지질 수송 및 대사 유전자 발현의 조절
재료 및 방법
세포들은 다음 방법중 하나로 처리되었다:
방법 1: HepG2 세포를 네이키드 안티센스 올리고뉴클레오티드로 처리:
HepG2 세포를 37℃, 5% CO2에서 성장 배지(MEM/EBSS (Hyclone cat #SH30024) +10% FBS+페니실린+스트렙토마이신에서 성장시켰다. 실험 하루전, 세포는 1.5× 104/㎖의 농도로 6개 웰 플레이트에 재도말시키고, 37℃, 5% CO2에서 방치하였다. 실험 당일, 6개 웰 플레이트에 있는 배지는 새로운 MEM/EBSS +10% FBS로 대체하였다. IDT에서 제조된 모든 안티센스 올리고뉴클레오티드를 20 μM의 농도가 되도록 희석시켰다. 모든 안티센스 올리고뉴클레오티드를 20 μM의 농도가 되도록 희석시켰다. 이 용액 2㎕를 400㎕의 새로운 Opti-MEM 배지(Gibco cat#31985-070)와 항온처리하고, HepG2 세포가 있는 6개 웰 플레이트의 각 웰에 제공하였다. 올리고뉴클레오티드 용액 대신 물 2㎕를 포함하는 유사 혼합물을 허위-처리된 기준으로 이용하였다. 안티센스 올리고뉴클레오티드를 추가시킨 후 72시간 후, 상기에서 설명한 것과 같이 세포에 다시 투약하였다. 반복 투약후 48-72시간 후, SV Total RNA Isolation System(Promega (cat # Z3105)) 또는 RNeasy Total RNA Isolation 키트(Qiagen (cat# 74181))를 이용하여 제조업자의 지시에 따라 세포로부터 RNA를 추출하였다. 600ng의 RNA를 Verso cDNA 키트 (Thermo Scientific (cat#AB1453B))을 이용하여 제조업자의 프로토콜에 따라 실시된 역전사 반응에 첨가하였다. 이와 같은 역전사 반응에서 cDNA를 이용하여 ABI Taqman Gene 발현 Mix (cat#4369510) 및 ABI에서 기획한 프라이머/프로브(Appliend Biosystems Inc., Foster City CA에서 제공)을 이용하여 실시간 PCR에 의해 유전자 발현을 모니터하였다. Mx4000 thermal cycler (Stratagene)를 이용하여 다음과 같은 PCR 주기가 이용되었다: 50℃ 2분, 95℃ 10분, [95℃ 15초, 60℃ 1분]을 40회.
처리된 샘플과 허위로 처리된 샘플간에 18S-표준화된 dCt 값에서 차이에 근거하여 안티센스 올리고뉴클레오티드로 처리후 유전자 발현에서 폴드 변화가 계산되었다.
ApoA1 천연 안티센스 DA327409ext를 위한 커스텀 기획된 Taqman 분석을 위한 프라이머 및 프로브. 대문자들은 변형안된 데옥시리부뉴클레오티드를 나타낸다.
프로브 서열 (FAM labeled) TTTGGATCTGGACGACTTC (서열 번호: 275)
포워드 프라이머 Seq. CTCCTCCTGCCACTTCTTCTG (서열 번호: 276)
역 프라이머 Seq. CTGGTGGATGAAGAAGGTTTGC (서열 번호: 277)
방법 2: HepG2 세포를 안티센스 올리고뉴클레오티드로 처리:
ATCC (cat# HB-8065)의 HepG2 세포를 37℃, 5% CO2에서 성장 배지(MEM/EBSS (Hyclone cat #SH30024, 또는 Mediatech cat # MT-10-010-CV) +10% FBS (Mediatech cat# MT35-011-CV)+페니실린/스트렙토마이신(Mediatech cat# MT30-002-CI)에서 성장시켰다. 실험 하루전, 세포는 1.5× 105/㎖의 농도로 6개 웰 플레이트에 재도말시키고, 37℃, 5% CO2에서 항온처리하였다. 실험 당일, 6개 웰 플레이트에 있는 배지는 새로운 성장배지로 대체하였다. 모든 안티센스 올리고뉴클레오티드를 20 μM의 농도가 되도록 희석시켰다. 이 용액 2㎕를 400㎕의 Opti-MEM 배지(Gibco cat#31985-070)와 4㎕의 리포펙타민 2000 (Invitrogen cat# 11668019)와 실온에서 20분간 항온처리하고, HepG2 세포가 있는 6개 웰 플레이트의 각 웰에 제공하였다. 올리고뉴클레오티드 용액 대신 물 2㎕를 포함하는 유사 혼합물을 허위-처리된 기준으로 이용하였다. 37℃, 5% CO2에서 3-18시간 동안 항온처리후, 배지를 새로운 성장 배지로 교환하였다. 안티센스 올리고뉴클레오티드를 추가시킨 후 48시간 후, 배지를 제거하였고, SV Total RNA Isolation 시스템(Promega (cat # Z3105)) 또는 RNeasy Total RNA Isolation 키트(Qiagen (cat# 74181))를 이용하여 제조업자의 지시에 따라 세포로부터 RNA를 추출하였다.
600ng의 RNA를 Verso cDNA 키트 (Thermo Scientific (cat#AB1453B))을 이용하여 제조업자의 프로토콜에 따라 실시된 역전사 반응에 첨가하였다. 이와 같은 역전사 반응에서 cDNA를 이용하여 ABI Taqman Gene 발현 Mix (cat#4369510) 및 ABI에서 기획한 프라이머/프로브(Appliend Biosystems Inc., Foster City CA에서 제공)을 이용하여 실시간 PCR에 의해 유전자 발현을 모니터하였다. Mx4000 thermal cycler (Stratagene)를 이용하여 다음과 같은 PCR 주기가 이용되었다: 50℃ 2분, 95℃ 10분, [95℃ 15초, 60℃ 1분]을 40회. 처리된 샘플과 허위로 처리된 샘플간에 18S-표준화된 dCt 값에서 차이에 근거하여 안티센스 올리고뉴클레오티드로 처리후 유전자 발현에서 폴드 변화가 계산되었다.
ApoA1 천연 안티센스 DA327409ext를 위한 커스텀 기획된 Taqman 분석을 위한 프라이머 및 프로브. 대문자들은 변형안된 데옥시리부뉴클레오티드를 나타낸다.
프로브 서열 (FAM labeled) TTTGGATCTGGACGACTTC (서열 번호: 275)
포워드 프라이머 Seq. CTCCTCCTGCCACTTCTTCTG (서열 번호: 276)
역 프라이머 Seq. CTGGTGGATGAAGAAGGTTTGC (서열 번호: 277)
원숭이 일차 (primary) 간세포의 처리
원숭이 일차 간세포를 RxGen Inc.에 의해 배양물에 도입시키고, 6개웰 플레이트에 도말시켰다. 이들 세포를 다음과 같이 올리고뉴클레오티드로 처리하였다. 6 웰 플레이트상의 배지는 William의 Medium E (Sigma cat#W4128)에 5% FBS, 50 U/ml 페니실린 및 50 ug/ml 스트렙토마이신, 4 ug/ml 인슐린, 1 uM 덱사메타손, 10 ug/ml Fungin (InVivogen, San Diego CA)이 보충된 것을 포함하는 새로 만든 성장 배지로 교체하였다. 모든 안티센스 올리고뉴클레오티드를 20 μM의 농도가 되도록 희석시켰다. 이 용액 2㎕를 400㎕의 Opti-MEM 배지(Gibco cat#31985-070)와 4㎕의 리포펙타민 2000 (Invitrogen cat# 11668019)와 실온에서 20분간 항온처리하고, 세포가 있는 6개 웰 플레이트의 각 웰에 제공하였다. 올리고뉴클레오티드 용액 대신 물 2㎕를 포함하는 유사 혼합물을 허위-처리된 기준으로 이용하였다. 37℃, 5% CO2에서 3-18시간 동안 항온처리후, 배지를 새로운 성장 배지로 교환하였다. 안티센스 올리고뉴클레오티드를 추가시킨 후 48시간 후, 배지를 제거하였고, SV Total RNA Isolation 시스템(Promega (cat # Z3105)) 또는 RNeasy Total RNA Isolation 키트(Qiagen (cat# 74181))를 이용하여 제조업자의 지시에 따라 세포로부터 RNA를 추출하였다.
600ng의 RNA를 Verso cDNA 키트 (Thermo Scientific (cat#AB1453B))을 이용하여 제조업자의 프로토콜에 따라 실시된 역전사 반응에 첨가하였다. 이와 같은 역전사 반응에서 cDNA를 이용하여 ABI Taqman Gene 발현 Mix (cat#4369510) 및 ABI에서 기획한 프라이머/프로브(Applied Biosystems Inc., Foster City CA에서 제공)을 이용하여 실시간 PCR에 의해 유전자 발현을 모니터하였다. Mx4000 thermal cycler (Stratagene)를 이용하여 다음과 같은 PCR 주기가 이용되었다: 50℃ 2분, 95℃ 10분, [95℃ 15초, 60℃ 1분]을 40회. 처리된 샘플과 허위로 처리된 샘플간에 18S-표준화된 dCt 값에서 차이에 근거하여 안티센스 올리고뉴클레오티드로 처리후 유전자 발현에서 폴드 변화가 계산되었다.
MabTech Inc. ApoA1 ELISA kit cat# 3710-11-6을 이용하여 제조업자의 지시에 따라 ELISA를 실행하였다.
그 결과들을 도 1q 내지 1t 에 나타낸다. 도 1q는 포스포로티오에이트 기본골격을 가진 두 가지 올리고뉴클레오티드 즉, 뉴클레오티드간 링키지와 LNA 올리고뉴클레오티드는 탐지된 ApoA1 mRNA (위 패널) 및 ApoA1 안티센스 DA327409ext RNA (아래 패널)의 양으로 측정하였을 때 표적 유전자 발현 조절에 효과적이라는 것으로 보여준다. 도 1r은 DA327409ext에 대항하여 기획된 올리고뉴클레오티드로 처리된 HepG2 세포에서 ApoA1 mRNA (오렌지 막대)와 ApoA1 안티센스 DA327409ext RNA (블루 막대)의 수준을 보여준다. 도 1s는 DA327409ext에 대항하여 기획된 올리고뉴클레오티드로 처리된 HepG2 배양물에서 ApoA1 mRNA (바닥 패널) 및 단백질 (상부 패널)의 투여량 의존적 상향 조절을 보여준다. 도 1t는 DA327409ext에 대항하여 기획된 올리고뉴클레오티드로 처리한 후, 아프리카 녹색 원숭이 일차 간세포에서 ApoA1 mRNA의 상향 조절을 보여준다.
실시예
4: 아프리카 녹색
원숭이에서
CUR
-962의 작용 연구의 효과 및 기간
본 연구의 목적은 인간이 아닌 영장류 모델에서 정맥 투여후 지질 수송 및 대사 유전자를 조절하는 부조화(discordant) 넌코딩 안티센스 서열의 안티센스 녹다운 효과를 평가하고 비교하는 것이다. APOA1 조절 서열을 억제하도록 기획된 안티센스 올리고뉴클레오티드 테스트 물질은 CUR-962로 명시하였다.
CUR-962: +G*+C*T* A*G*T* C*T*G* +T*+T*+G (서열 번호: 278)
CUR-963 (대조군): +G*+T*C* T*G*A* T*G*G* +A*+G*+A (서열 번호: 279)
조절 테스트 지침
본 연구는 용인되는 독물학 원리 및 International Conference of Harmonization (ICH) Harmonized Tripartite Guidelines (Non-Clinical Safety Studies for the Conduct of Human Clinical Trials for Pharmaceuticals ICH M3(m), 2000 November 9)에 따르며, 그리고 일반적으로 치료제를 테스트하기 위하여 일반적으로 용인되는 과정이다.
테스트 및 대조군 물질
테스트 물질 확인 및 준비
테스트 물질, CUR-962은 화학적으로 안정된 안티센스 올리고뉴클레오티드다. 정맥 수송을 위한 비이클은 인산염-완충된 염(PBS)이다.
비이클 특징
PBS 비이클의 경우, 조성물, 배치(batch) 번호, 유효기간 및 저장 조건(온도 및 명/암주기)는 공급업자로부터 얻었다.
테스트 물질 보관 및 취급
테스트 물질 및 비이클은 Sponsor 및 제조업자가 공급하는 제공받은 저장 조건에 따라 보관하였다.
테스트 물질 제제의 분석
테스트 물질 제제 시료는 농도, 안정성, 테스트 물질 제제의 균질성을 분석하기 위하여 저온보존될 것이다.
테스트 시스템 원리
영장류는 잠재적 위험의 지표로 관리 당국이 용인하는, 그리고 광범위한 배경 데이터가 이용가능한, 적합한 비-설치류 종이다. 아프리카 녹색 원숭이는 특히 다중 인간 생리적 상태 및 질환 상태에 대해 매우 임상적으로 관련된 모델이다.
정맥 투여 경로는 가능한 인간의 치료 경로에 상응한다. 테스트 물질의 투여량은 아프리카 녹색 원숭이에서 이미 실행한 유사한 화합물들의 투여량 확인 연구의 결과들에 기초하였다.
아프리카 녹색 원숭이는 영장류에서 100% 상동성을 가진 종간에 테스트 물질의 표적 서열이 보존되기 때문에 선택된 영장류다. 추가적으로, 테스트 물질은 합성 올리고뉴클레오티드다. 결과적으로, 영장류에 투약은 임의의 기타 종보다는 인간에서 볼 수 있는 흡수를 더 반영하는 이들 화합물의 효과에 대한 우수한 평가를 허용한다.
동물
종(species): Chlorocebus sabaeus, 인간이 아닌 영장류
품종(Breed): St. Kitts의 토착 아프리카 녹색 원숭이
출처(Source): RxGen, Lower Bourryeau, St. Kitts, West Indies.
예상 나이: 테스트 동물은 모두 다 자란 것들이다.
예상 체중: 원숭이들은 대략 3-4 kg 체중을 가진다. 실제 범위는 다양할 수 있고, 데이터에 제공할 것이다.
성별: 테스트 동물은 모두 다 자란 암컷이다.
동물의 수: 연구에 적합한 8마리 동물을 확인하기 위하여 10마리 동물을 스크리닝하였다.
연구용 동물의 수: 암컷: 8
연구용 수에 대한 정당화:
본 연구는 아프리카 녹색 원숭이에서 테스트 물질의 치료 효과를 평가하기 위한 1차 목적과 이 종에서 이러한 올리고뉴클레오티드의 전신 투여의 기존 연구와 일관되게 가능한 최소의 수의 동물을 이용하도록 기획되었다.
동물 명세:
다 자란, 3-4kg 체중 범위의 아프리카 녹색 원숭이를 연구에 이용하였다. 이 원숭이들은 섬에 서식하는 야생 집단으로부터 인도주의적으로 포획된 약물-경험이 없는 다자란 동물들이었다. 포획된 원숭이들은 임의의 가능한 내장에 존재하는 기생충을 제거하기 위하여 구충제를 제공하였으며, 연구 등록을 위한 스크리닝 전 최소 4주간 격리시켜 관찰하였다. 포획된 원숭이의 나이는 크기 및 이빨 모양으로 평가하였으며, 연구에서 더 나이든 동물들은 배제하였다. 연구 등록 전, 운동 평가 및 민첨성을 포함한 임상 시험을 각 원숭이에서 실행하였다. 종합적인 임상 화학물질 및 완벽한 혈액 카운트 및 지질 프로파일을 위하여 혈액 시료를 취하고, Antech Diagnostics (Memphis, TN)로 보냈다(상세한 내용은 Section 9.2 및 319567928 참고). St. Kitts 거류지에서 확립한 정상 범위의 원숭이와 비교하여 결정된 비정상적인 실험 수치를 가진 원숭이들은 연구에서 배제하였다. 이 기준을 만족시키는 8마리 원숭이들을 확인하기 위하여, 10마리 원숭이를 스크리닝하였고, 필요에 따라 추가 동물도 스크리닝하였다. 연구 시작 전, 선택된 원숭이들을 개별 우리로 이동시키고, 1주일간 개별 우리에 적응시킬 것이다. 실험에 적합할 것으로 간주되는 동물들만 연구에 등록시킬 것이다. 연구 시작시에 실제(또는 예측) 나이 및 체중 범위를 비가공 데이터 및 최종 보고서에 상세하게 기재할 것이다.
동물 건강 및 복지
동물 복지의 최고 표준은 St. Kitts Department of Agriculture 및 the U.S. Department of Health and Human Services에서 규정한 지침서에 따랐다. 모든 연구는 실험실 동물의 취급 및 거주에 대한 모든 이용가능한 코드 및 요구사항에 따라 실행할 것이다. 수의적인 돌봄 및 시술에 대한 모든 이용가능한 표준은 동물의 돌봄 및 사용에 관한 NIH 지침에 보함된 것을 검토한다. St. Kitts 시설은 의정서를 검토하고, 이 지침에서 요구되는 시설을 살피기 위한 동물 연구 위원회를 유지한다. 이 재단은 지침(Guide, #A4384-01)(Axion Research Foundation/St. Kitts Biomedical Foundation)에서 요구하는 바와 같이, Office of Laboratory Animal Welfare에 제출된 승인 보증서를 보유한다. 이 연구에 명시된 연구에 의해 제기된 인간이 아닌 영장류 동물 돌봄에 관한 특별한 문제 및 생물학적 위협 문제는 없다.
주거 및 환경
임의의 치료-관련된 임상 신호의 탐지를 허용하기 위하여, 외과수술 및 수술후 동물을 희생시킬 때까지 개별적으로 가두어 둔다. 개별 우리들이 있는 영장류 빌딩은 U.S. D.H.H.S 지침서에서 권장하는 바와 같이, 북위 17도에서 환경광으로 전체적으로 12:12 시간 명암 주기를 조명을 제공하였다. RxGen 영장류 빌딩은 외부와 완벽하게 환기 소통된다. St. Kitts 의 전형적인 기온인 일정한 23-25℃의 목표 온도를 유지하기 위하여 천장 팬으로 추가 공기 순환이 가능하도록 하였다. 24시간의 극단의 온도 및 상대습도(또한 조절되지 않을 수 있다)를 매일 측정하였다. 연구하는 동안, 우리는 정기적인 간격으로 청소하였다.
식이 및 물
각 동물은 표준 원숭이 규정식(TekLad, Madison, WI)을 일일 약 90g 제공받았다. 음식물의 특정 영양 조성물은 기록되었다. 미생물 순도에 대해 물은 주기적으로 분석되었다. 저장 음식 및 수분 공급에서 수용가능한 오염물질 수준에 대한 기준은 음식물 제조업자 및 주기적 설비 물 평가에 의해 차례로 확립된 분석 명세내에 속한다. 물은 인간이 소비할 수 있는 허용가능한 검정에 필요한 모든 기준에 부합되었다.
실험 기획
동물 확인 및 무작위화
체중 및 혈장 콜레스테롤 프로파일에 근거하여 계층화시킨 무작위 과정에 의해 할당을 실시하였다. 군으로 할당 전과 후에, 각 동물의 복부에 문신으로 확인하였다. 문신은 통상적인 건강 검진 과정에서 확인 수단으로 모든 거류지 동물에 배속된다. 가두어둔 개체들을 확인하기 위하여 우리 계획(cage plan)을 짜고, 개별 원숭이들은 이들의 각 우리에 라벨을 부착시켜 추가 확인된다.
군의 크기, 투여량 및 확인 번호들
동물들은 각 군에 4마리 원숭이를 포함하는 2개 처리 군에 할당하였다. 설비 번호매김 시스템에 따라 각 원숭이들에게 특정 동물 확인 번호를 부여하였다. 이 번호매김 시스템은 한 개 문자 다음에 3개 숫자 가령, Y032로 각 원숭이들을 특정하게 구별시킨다.
투여 경로 및 빈도
동물은 수작업 주입에 의해 10분에 걸쳐 정맥으로 1일, 3일 및 5일 시점에 일일 1회 투약받았다. 주입 속도는 24 mL/kg/h이 될 것이다. 투약 과정 전 그리고 투약 과정 동안 케타민 및 크실라진으로 동물들을 진정시켰다. 정맥 카테테르(Terumo 미니 정맥 주입 세트, 20 가우지 바늘, 또는 유사한 적합한 주입 세트)를 복재정맥(saphenous vein)으로 삽입하였다. 투약은 동물이 깨어난 직후 오전 8시 내지 10시 그리고 음식물 공급 전에 실시하였다. 하기 Blood Chemistry 부분에서 설명한 것과 같이 혈장 콜레스테를 및 기타 지질 수준을 평가하기 위하여 혈액 시료를 각 주입전에 수거하였다. 콜레스테롤 측정에서 식이 영향을 최소화하기 위하여 샘플링 주기에서 음식물 공급전에 혈액을 수거하였다.
임상적인 관찰
각 투여일에 처치에 대한 모든 가시적인 신호들을 기록하였다. 또한 동물의 외형 및 일반적인 조건과 같은 물리적 속성에 대해 최소한 매주 한 번씩 동물을 점검하였다.
체중
체중은 처리 기간동안 그리고 처리 후 기간 동안 매주 간격으로 기록하였다.
음식물 소비
개별적인 음식물 소비를 정량화하지는 않았다. 그러나, 음식물 공급 패턴을 모니터하였고, 임의의 주요 변화를 기록하였다.
사망률 및 질병률(Mortality and Morbidity)
사망률 및 질병률을 기록할 것이다. 조기(premature) 사망에 관한 임의의 결정은 가능하면 Study Director 및 Sponsor’s Monitoring Scientist와 상담후에 결정될 것이다. 사망하였거나 또는 조기 죽임을 당한 동물은 조직병리학적으로 간, 신장, 심장 및 비장 폐 조직을 수거하여 부검할 것이다. 조기 희생이 된 경우, 혈액 시료를 취하여(가능하다면), 매개변수들을 결정하였다. 정규적인 작업 후 사망한 것으로 확인된 동물은 하룻밤 냉장보관 후, 그 다음 작업시작시에 부검을 실행하였다. 동물의 상태가 미숙한 희생을 요구한다면, 펜토바르비탈 나트륨 과량을 정맥으로 투여하여 안락사시킬 것이다. 모든 연구는 동물 이용에 관한 규정(Principles for Use of Animals)에 의해 제어된다. RxGen는 영장류 설지에 관한 U.S. Department of Health and Human Services 표준에 부응하도록 법으로 요청받으며, 연구내 과정들은 관대하라고 명시된 엄격성 수준을 준수해야 한다고 명령하고 있다.
임상 실험 연구
혈액 시료
혈장 콜레스테롤 기저 수준을 확립하기 위하여 처리전 모든 동물로부터 세 가지 혈액 샘플을 얻었다. 혈액 시료는 처치후 수거하였고, 표면 정맥 천자를 통하여 취한다. 임의의 한 샘플링 시점에서 수거된 용적은 8ml을 초과하지 않았으며, 이는 다자란 원숭이의 전체 혈액 용적의 대략 4%를 나타낸다.
두 가지 기준 시점과 연구 일 시점 1일, 3일, 5일, 7일, 9일, 11일, 13일 및 15일에 혈액 시료를 취하고, 그리고 혼란이 인식된다면, 1군에서 전체 혈장 콜레스테롤이 표준화될 때까지 주단위로 계속 수거하였다. 임상 화학물질, 지질 프로파일 및 응고 프로파일의 평가를 위하여 1일, 6일 및 11일에 8ml의 혈액을 수거하였다. 다른 모든 날에는 혈액 5ml만을 수거하였는데, 이는 임상 화학물질 및 지질 프로파일을 위해서 충분하다.
혈액 시료는 화학 및 혈액학 측정이 있는 날 세 부분으로 나누었다. 25μl의 헤파린을 포함한 혈장 수거 튜브에 한 개 시료를 넣고, 연구 번호, 약량 수준, 일수, 일짜 및 동물 식별 번호가 있는 라벨을 붙였다. 분리 후, 혈장 1ml을 빼내어 상기 상사한 내용을 포함하는 멸균 후 크리오관(cryotube)으로 이동시켜 혈액 화학 분석을 위하여 선적때까지 적절하게 보관하였다. 혈장 한 방울(0.5 ml)을 빼내어 상사한 내용을 포함하는 멸균 후 크리오관(cryotube)으로 이동시켜 혈장 콜레스테롤 분포 및 지질 수송 및 대사 유전자 분석을 위하여 선적때까지 적절하게 보관하였다. 혈장의 추가 1ml 및 0.5ml을 섬광 냉동시키고, 액화 질소에 보관하여 잠재적 추가 분석을 위한 백업 샘플로 사용하기 위하여 보관하였다.
2가지 추가 전혈 혈액 방울(각 2.5ml)은 구연산 덱스트로즈(ACD) 항응고제로 처리하고, 라벨하고, 하기에서 설명하는 응고 및 CBC 측정을 위하여 선적할 때까지 4℃에 보관하였다.
시료는 샘플링 24시간이내에 도달하도록 운반하거나 또는 정해진 적절한 시간에 운반을 하기 위하여 안정된 조건에서 보관하였다.
샘플링 방법 또는 분석 방법이 정상적인 품질 범위를 벗어난 경우에만 중복 샘플을 취하였다. 시료는 라벨된 튜브에서 취하였다.
혈액학
1일, 6일 그리고 11일에 수거한 모든 샘플(이들 시간대중 임의의 시간대에 혼란이 탐지된다면 추가 날에)에서 일반혈액검사(complete blood count: CBC), 프로트롬빈 시간, PTT, 피브리노겐 및 D-다이머를 측정하였다. 혈구수는 EDTA를 포함하는 진공채혈관(vacutainer)에 수거한 전혈 1ml에서 평가하였다. 구연산 덱스트로즈(ACD) 응고방지제를 포함하는 진공채혈관에 수거한 대략 2.0mL 혈액에서 응고 프로파일 결정을 실행하였다.
혈액 화학
포도당, 혈액 요소 질소, 크레아티닌, 전체 단백질, 알부민, 총 비릴루빈, 알칼리 포스파타제, 알라닌 아미노트란스퍼라제(ALT), 아스파르테이트 아미노트란스퍼라제(AST), 콜레스테롤, 칼슘, 인광물질, 나트륨, 칼륨, 염화물, A/G 비율, BUN/크레아틴(계산된) 글로불린(계산된), 리파제, 아밀라제, 트리글리세리드, CPK, 락테이트 데하이드로게나제, 감마 글루타밀 트란스퍼라제(GGT), 마그네슘, 총 콜레스테롤 LDL, VLDL, HDL, ApoA1, ApoA2, ApoB, ApoE, ApoLp(a). 슈퍼케미스트리(Superchemistries) 및 LDL 과 HDL 측정은 모둔 혈장 시료에서 이루어졌다. 지질 수송 및 대사 유전자 측정은 LDL 및 HDL 데이터의 평가후 선택 시료에서 이루어졌다.
슈퍼케미스트리를 위하여 1.0 mL 혈장을, 그리고 콜레스테롤 분포 및 지질 수송 및 대사 유전자 측정을 위하여 0.5mL에서 측정이 실행되었다. 추가 혈장 몇 방울을 수거하였고, 추가 분석을 위하여 저장하였다.
간 생체검사
경피 간 생검은 기저 수준 및 7일과 17일 시점에서 모든 원숭이에서 실행하였다. 14 가우지 생검 바늘(INRAD)을 이용하여 간의 좌우엽으로부터 2개의 코어 생검(길이는 ~1.0 cm)을 수득하였다. 아래 나타낸 것과 같이 세분하기 전 생검 바늘에 생검 시료의 시각적 관찰에 의해 성공적인 생검을 확인하였다.
시료를 모으고, 다음과 같은 방식으로 나누었다. 좌측 엽의 생검중 절반(~0.5㎝)은 조직 병리 및 원위치(in situ) 분석을 위한 단편화를 위하여 파라포름알데히드에 담구었다. 각 나뉜 생검의 나머지 절반과 다른 2개의 고유 생검은 RNAlater (Qiagen) 2ml을 포함하는 라벨된 크리오관에 바로 담구고, RNAlater를 흡출시키고, 액화 질소에서 시료 튜브를 섬광 냉동시킨 후 4℃에서 하룻밤 동안 항온처리하였다. 액화 질소에서 수송후, 전체 RNA는 Trizol 또는 TriReagent 방법을 이용하여 분리하였고, 1.0 cm의 14 g 코어 생검당 ~40μg의 예상 수율(한 마리 원숭이의 총 4개의 모은 코어 생검으로부터 유도한 모은 RNA에 대해 총~80-100 μg, 조직병리 및 원위치를 제외한 성분들은 없음)을 가졌다. 5μg 의 RNA 분획물은 표적-특이적 실시간 qPCR (TaqMan miRNA assay, ABI)에 이용하였다. 나머지 RNA 분획물은 가능한 게놈 와이드 발현 분석을 위하여 남겨두었다.
고정된 조직은 파라핀 임베딩을 위해 처리하였다. 단편들은 H&E를 위하여 착색시키고, Gross Histological 발견에 근거하여 조직병리학적 발견들을 보고하였다. 이 작업에서 만들어진 모든 슬라이드는 연구 번호, 투약 수준, 일수, 날짜, 동물 식별 번호가 기재된 라벨이 붙어있었다.
통계학적 분석
통계
혈액학, 임상 화학 및 지질 프로파일에 설명된 통계를 실행하였다. 적절한 생체정보학적 분석은 발현 테이타에서 실행하였다.
샘플 크기
샘플 크기 결정은 아프리카 녹색 원숭이에 대한 변형된 안티센스 올리고뉴클레오티드를 투여하는 기존 실험과 결과로 생성된 임상 화학, 지질 프로파일 변화 및 연관된 가변성에 근거하여 이루어졌다. 유효 평가에 대한 전체 개체 수는 20마리의 동록된 동물이며, 처리군당 4마리와 4마리의 추가 스크린된 동물들이다.
결과:
결과들은 다음의 도면에 나타낸다. 도 1u: ApoA1 mRNA (상부 패널) 및 단백질 (하부 패널)은 ApoA1 안티센스 DA327409ext에 대해 기획된 올리고뉴클레오티드, CUR-962로 처리한 후, 차례로 실시간 PCR 및 ELISA에 의해 측정하고(2개의 우측 패널), 기저 수준과 비교하여, 원숭이 간 생검에서 증가되었다. ApoA1 mRNA 및 단백질 수준은 시험관에서 ApoA1 수준에 영향을 나타내지 않는 올리고뉴클레오티드(CUR-963, 2개 우측 패널)을 투여한 대조군에서 동일한 시간 경과후 변화가 없었다.
본 발명은 하나 이상의 실행에 대해 설명되고 묘사되었지만, 본 명세서 및 첨부된 도면을 이해하면 당업자는 동등한 변형 및 변화가 있을 수 있다는 것을 인지할 것이다. 또한, 본 발명의 특정 성질들은 몇 가지 실행중 하나에 대해 설명되었지만, 이와 같은 성질이 다른 하나 이상의 성질과 복합될 수 있으며, 이는 임의의 주어진 또는 특정 부분에 바람직할 수 있다.
내용의 요약은 기술 내용을 신속하게 확인할 수 있도록 도와줄 것이다. 이는 다음의 청구범위의 범위 또는 영역을 이해하거나 범위를 한정하는데 이용되어서는 안될 것이다.
SEQUENCE LISTING
<110> CuRNA, Inc.
<120> TREATMENT OF LIPID TRANSPORT AND METABOLISM GENE RELATED DISEASES
BY INHIBITION OF NATURAL ANTISENSE TRANSCRIPT TO A LIPID
TRANSPORT AND METABOLISM
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<313> (1)..(10412)
<400> 1
gtaattgcga gcgagagtga gtggggccgg gacccgcaga gccgagccga cccttctctc 60
ccgggctgcg gcagggcagg gcggggagct ccgcgcacca acagagccgg ttctcagggc 120
gctttgctcc ttgttttttc cccggttctg ttttctcccc ttctccggaa ggcttgtcaa 180
ggggtaggag aaagagacgc aaacacaaaa gtggaaaaca gttaatgacc agccacggcg 240
tccctgctgt gagctctggc cgctgccttc cagggctccc gagccacacg ctgggggtgc 300
tggctgaggg aacatggctt gttggcctca gctgaggttg ctgctgtgga agaacctcac 360
tttcagaaga agacaaacat gtcagctgct gctggaagtg gcctggcctc tatttatctt 420
cctgatcctg atctctgttc ggctgagcta cccaccctat gaacaacatg aatgccattt 480
tccaaataaa gccatgccct ctgcaggaac acttccttgg gttcagggga ttatctgtaa 540
tgccaacaac ccctgtttcc gttacccgac tcctggggag gctcccggag ttgttggaaa 600
ctttaacaaa tccattgtgg ctcgcctgtt ctcagatgct cggaggcttc ttttatacag 660
ccagaaagac accagcatga aggacatgcg caaagttctg agaacattac agcagatcaa 720
gaaatccagc tcaaacttga agcttcaaga tttcctggtg gacaatgaaa ccttctctgg 780
gttcctgtat cacaacctct ctctcccaaa gtctactgtg gacaagatgc tgagggctga 840
tgtcattctc cacaaggtat ttttgcaagg ctaccagtta catttgacaa gtctgtgcaa 900
tggatcaaaa tcagaagaga tgattcaact tggtgaccaa gaagtttctg agctttgtgg 960
cctaccaagg gagaaactgg ctgcagcaga gcgagtactt cgttccaaca tggacatcct 1020
gaagccaatc ctgagaacac taaactctac atctcccttc ccgagcaagg agctggctga 1080
agccacaaaa acattgctgc atagtcttgg gactctggcc caggagctgt tcagcatgag 1140
aagctggagt gacatgcgac aggaggtgat gtttctgacc aatgtgaaca gctccagctc 1200
ctccacccaa atctaccagg ctgtgtctcg tattgtctgc gggcatcccg agggaggggg 1260
gctgaagatc aagtctctca actggtatga ggacaacaac tacaaagccc tctttggagg 1320
caatggcact gaggaagatg ctgaaacctt ctatgacaac tctacaactc cttactgcaa 1380
tgatttgatg aagaatttgg agtctagtcc tctttcccgc attatctgga aagctctgaa 1440
gccgctgctc gttgggaaga tcctgtatac acctgacact ccagccacaa ggcaggtcat 1500
ggctgaggtg aacaagacct tccaggaact ggctgtgttc catgatctgg aaggcatgtg 1560
ggaggaactc agccccaaga tctggacctt catggagaac agccaagaaa tggaccttgt 1620
ccggatgctg ttggacagca gggacaatga ccacttttgg gaacagcagt tggatggctt 1680
agattggaca gcccaagaca tcgtggcgtt tttggccaag cacccagagg atgtccagtc 1740
cagtaatggt tctgtgtaca cctggagaga agctttcaac gagactaacc aggcaatccg 1800
gaccatatct cgcttcatgg agtgtgtcaa cctgaacaag ctagaaccca tagcaacaga 1860
agtctggctc atcaacaagt ccatggagct gctggatgag aggaagttct gggctggtat 1920
tgtgttcact ggaattactc caggcagcat tgagctgccc catcatgtca agtacaagat 1980
ccgaatggac attgacaatg tggagaggac aaataaaatc aaggatgggt actgggaccc 2040
tggtcctcga gctgacccct ttgaggacat gcggtacgtc tgggggggct tcgcctactt 2100
gcaggatgtg gtggagcagg caatcatcag ggtgctgacg ggcaccgaga agaaaactgg 2160
tgtctatatg caacagatgc cctatccctg ttacgttgat gacatctttc tgcgggtgat 2220
gagccggtca atgcccctct tcatgacgct ggcctggatt tactcagtgg ctgtgatcat 2280
caagggcatc gtgtatgaga aggaggcacg gctgaaagag accatgcgga tcatgggcct 2340
ggacaacagc atcctctggt ttagctggtt cattagtagc ctcattcctc ttcttgtgag 2400
cgctggcctg ctagtggtca tcctgaagtt aggaaacctg ctgccctaca gtgatcccag 2460
cgtggtgttt gtcttcctgt ccgtgtttgc tgtggtgaca atcctgcagt gcttcctgat 2520
tagcacactc ttctccagag ccaacctggc agcagcctgt gggggcatca tctacttcac 2580
gctgtacctg ccctacgtcc tgtgtgtggc atggcaggac tacgtgggct tcacactcaa 2640
gatcttcgct agcctgctgt ctcctgtggc ttttgggttt ggctgtgagt actttgccct 2700
ttttgaggag cagggcattg gagtgcagtg ggacaacctg tttgagagtc ctgtggagga 2760
agatggcttc aatctcacca cttcggtctc catgatgctg tttgacacct tcctctatgg 2820
ggtgatgacc tggtacattg aggctgtctt tccaggccag tacggaattc ccaggccctg 2880
gtattttcct tgcaccaagt cctactggtt tggcgaggaa agtgatgaga agagccaccc 2940
tggttccaac cagaagagaa tatcagaaat ctgcatggag gaggaaccca cccacttgaa 3000
gctgggcgtg tccattcaga acctggtaaa agtctaccga gatgggatga aggtggctgt 3060
cgatggcctg gcactgaatt tttatgaggg ccagatcacc tccttcctgg gccacaatgg 3120
agcggggaag acgaccacca tgtcaatcct gaccgggttg ttccccccga cctcgggcac 3180
cgcctacatc ctgggaaaag acattcgctc tgagatgagc accatccggc agaacctggg 3240
ggtctgtccc cagcataacg tgctgtttga catgctgact gtcgaagaac acatctggtt 3300
ctatgcccgc ttgaaagggc tctctgagaa gcacgtgaag gcggagatgg agcagatggc 3360
cctggatgtt ggtttgccat caagcaagct gaaaagcaaa acaagccagc tgtcaggtgg 3420
aatgcagaga aagctatctg tggccttggc ctttgtcggg ggatctaagg ttgtcattct 3480
ggatgaaccc acagctggtg tggaccctta ctcccgcagg ggaatatggg agctgctgct 3540
gaaataccga caaggccgca ccattattct ctctacacac cacatggatg aagcggacgt 3600
cctgggggac aggattgcca tcatctccca tgggaagctg tgctgtgtgg gctcctccct 3660
gtttctgaag aaccagctgg gaacaggcta ctacctgacc ttggtcaaga aagatgtgga 3720
atcctccctc agttcctgca gaaacagtag tagcactgtg tcatacctga aaaaggagga 3780
cagtgtttct cagagcagtt ctgatgctgg cctgggcagc gaccatgaga gtgacacgct 3840
gaccatcgat gtctctgcta tctccaacct catcaggaag catgtgtctg aagcccggct 3900
ggtggaagac atagggcatg agctgaccta tgtgctgcca tatgaagctg ctaaggaggg 3960
agcctttgtg gaactctttc atgagattga tgaccggctc tcagacctgg gcatttctag 4020
ttatggcatc tcagagacga ccctggaaga aatattcctc aaggtggccg aagagagtgg 4080
ggtggatgct gagacctcag atggtacctt gccagcaaga cgaaacaggc gggccttcgg 4140
ggacaagcag agctgtcttc gcccgttcac tgaagatgat gctgctgatc caaatgattc 4200
tgacatagac ccagaatcca gagagacaga cttgctcagt gggatggatg gcaaagggtc 4260
ctaccaggtg aaaggctgga aacttacaca gcaacagttt gtggcccttt tgtggaagag 4320
actgctaatt gccagacgga gtcggaaagg attttttgct cagattgtct tgccagctgt 4380
gtttgtctgc attgcccttg tgttcagcct gatcgtgcca ccctttggca agtaccccag 4440
cctggaactt cagccctgga tgtacaacga acagtacaca tttgtcagca atgatgctcc 4500
tgaggacacg ggaaccctgg aactcttaaa cgccctcacc aaagaccctg gcttcgggac 4560
ccgctgtatg gaaggaaacc caatcccaga cacgccctgc caggcagggg aggaagagtg 4620
gaccactgcc ccagttcccc agaccatcat ggacctcttc cagaatggga actggacaat 4680
gcagaaccct tcacctgcat gccagtgtag cagcgacaaa atcaagaaga tgctgcctgt 4740
gtgtccccca ggggcagggg ggctgcctcc tccacaaaga aaacaaaaca ctgcagatat 4800
ccttcaggac ctgacaggaa gaaacatttc ggattatctg gtgaagacgt atgtgcagat 4860
catagccaaa agcttaaaga acaagatctg ggtgaatgag tttaggtatg gcggcttttc 4920
cctgggtgtc agtaatactc aagcacttcc tccgagtcaa gaagttaatg atgccatcaa 4980
acaaatgaag aaacacctaa agctggccaa ggacagttct gcagatcgat ttctcaacag 5040
cttgggaaga tttatgacag gactggacac caaaaataat gtcaaggtgt ggttcaataa 5100
caagggctgg catgcaatca gctctttcct gaatgtcatc aacaatgcca ttctccgggc 5160
caacctgcaa aagggagaga accctagcca ttatggaatt actgctttca atcatcccct 5220
gaatctcacc aagcagcagc tctcagaggt ggctctgatg accacatcag tggatgtcct 5280
tgtgtccatc tgtgtcatct ttgcaatgtc cttcgtccca gccagctttg tcgtattcct 5340
gatccaggag cgggtcagca aagcaaaaca cctgcagttc atcagtggag tgaagcctgt 5400
catctactgg ctctctaatt ttgtctggga tatgtgcaat tacgttgtcc ctgccacact 5460
ggtcattatc atcttcatct gcttccagca gaagtcctat gtgtcctcca ccaatctgcc 5520
tgtgctagcc cttctacttt tgctgtatgg gtggtcaatc acacctctca tgtacccagc 5580
ctcctttgtg ttcaagatcc ccagcacagc ctatgtggtg ctcaccagcg tgaacctctt 5640
cattggcatt aatggcagcg tggccacctt tgtgctggag ctgttcaccg acaataagct 5700
gaataatatc aatgatatcc tgaagtccgt gttcttgatc ttcccacatt tttgcctggg 5760
acgagggctc atcgacatgg tgaaaaacca ggcaatggct gatgccctgg aaaggtttgg 5820
ggagaatcgc tttgtgtcac cattatcttg ggacttggtg ggacgaaacc tcttcgccat 5880
ggccgtggaa ggggtggtgt tcttcctcat tactgttctg atccagtaca gattcttcat 5940
caggcccaga cctgtaaatg caaagctatc tcctctgaat gatgaagatg aagatgtgag 6000
gcgggaaaga cagagaattc ttgatggtgg aggccagaat gacatcttag aaatcaagga 6060
gttgacgaag atatatagaa ggaagcggaa gcctgctgtt gacaggattt gcgtgggcat 6120
tcctcctggt gagtgctttg ggctcctggg agttaatggg gctggaaaat catcaacttt 6180
caagatgtta acaggagata ccactgttac cagaggagat gctttcctta acaaaaatag 6240
tatcttatca aacatccatg aagtacatca gaacatgggc tactgccctc agtttgatgc 6300
catcacagag ctgttgactg ggagagaaca cgtggagttc tttgcccttt tgagaggagt 6360
cccagagaaa gaagttggca aggttggtga gtgggcgatt cggaaactgg gcctcgtgaa 6420
gtatggagaa aaatatgctg gtaactatag tggaggcaac aaacgcaagc tctctacagc 6480
catggctttg atcggcgggc ctcctgtggt gtttctggat gaacccacca caggcatgga 6540
tcccaaagcc cggcggttct tgtggaattg tgccctaagt gttgtcaagg aggggagatc 6600
agtagtgctt acatctcata gtatggaaga atgtgaagct ctttgcacta ggatggcaat 6660
catggtcaat ggaaggttca ggtgccttgg cagtgtccag catctaaaaa ataggtttgg 6720
agatggttat acaatagttg tacgaatagc agggtccaac ccggacctga agcctgtcca 6780
ggatttcttt ggacttgcat ttcctggaag tgttctaaaa gagaaacacc ggaacatgct 6840
acaataccag cttccatctt cattatcttc tctggccagg atattcagca tcctctccca 6900
gagcaaaaag cgactccaca tagaagacta ctctgtttct cagacaacac ttgaccaagt 6960
atttgtgaac tttgccaagg accaaagtga tgatgaccac ttaaaagacc tctcattaca 7020
caaaaaccag acagtagtgg acgttgcagt tctcacatct tttctacagg atgagaaagt 7080
gaaagaaagc tatgtatgaa gaatcctgtt catacggggt ggctgaaagt aaagaggaac 7140
tagactttcc tttgcaccat gtgaagtgtt gtggagaaaa gagccagaag ttgatgtggg 7200
aagaagtaaa ctggatactg tactgatact attcaatgca atgcaattca atgcaatgaa 7260
aacaaaattc cattacaggg gcagtgcctt tgtagcctat gtcttgtatg gctctcaagt 7320
gaaagacttg aatttagttt tttacctata cctatgtgaa actctattat ggaacccaat 7380
ggacatatgg gtttgaactc acactttttt tttttttttt gttcctgtgt attctcattg 7440
gggttgcaac aataattcat caagtaatca tggccagcga ttattgatca aaatcaaaag 7500
gtaatgcaca tcctcattca ctaagccatg ccatgcccag gagactggtt tcccggtgac 7560
acatccattg ctggcaatga gtgtgccaga gttattagtg ccaagttttt cagaaagttt 7620
gaagcaccat ggtgtgtcat gctcactttt gtgaaagctg ctctgctcag agtctatcaa 7680
cattgaatat cagttgacag aatggtgcca tgcgtggcta acatcctgct ttgattccct 7740
ctgataagct gttctggtgg cagtaacatg caacaaaaat gtgggtgtct ccaggcacgg 7800
gaaacttggt tccattgtta tattgtccta tgcttcgagc catgggtcta cagggtcatc 7860
cttatgagac tcttaaatat acttagatcc tggtaagagg caaagaatca acagccaaac 7920
tgctggggct gcaagctgct gaagccaggg catgggatta aagagattgt gcgttcaaac 7980
ctagggaagc ctgtgcccat ttgtcctgac tgtctgctaa catggtacac tgcatctcaa 8040
gatgtttatc tgacacaagt gtattatttc tggctttttg aattaatcta gaaaatgaaa 8100
agatggagtt gtattttgac aaaaatgttt gtacttttta atgttatttg gaattttaag 8160
ttctatcagt gacttctgaa tccttagaat ggcctctttg tagaaccctg tggtatagag 8220
gagtatggcc actgccccac tatttttatt ttcttatgta agtttgcata tcagtcatga 8280
ctagtgccta gaaagcaatg tgatggtcag gatctcatga cattatattt gagtttcttt 8340
cagatcattt aggatactct taatctcact tcatcaatca aatatttttt gagtgtatgc 8400
tgtagctgaa agagtatgta cgtacgtata agactagaga gatattaagt ctcagtacac 8460
ttcctgtgcc atgttattca gctcactggt ttacaaatat aggttgtctt gtggttgtag 8520
gagcccactg taacaatact gggcagcctt tttttttttt tttttaattg caacaatgca 8580
aaagccaaga aagtataagg gtcacaagtc taaacaatga attcttcaac agggaaaaca 8640
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taattggctt tgcagatatt ggatacccca ttaaatctga cagtctcaaa tttttcatct 8760
cttcaatcac tagtcaagaa aaatataaaa acaacaaata cttccatatg gagcattttt 8820
cagagttttc taacccagtc ttatttttct agtcagtaaa catttgtaaa aatactgttt 8880
cactaatact tactgttaac tgtcttgaga gaaaagaaaa atatgagaga actattgttt 8940
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gaatattaac gctaaaggtg taagacttca gatttcaaat taatctttct atatttttta 9060
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taaagtcaat attgatttta aatataagta atgaaggcat atttccaata actagtgata 9180
tggcatcgtt gcattttaca gtatcttcaa aaatacagaa tttatagaat aatttctcct 9240
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tactgtgtta ccttttaaaa tagtaatttt ttacattttc ctgtgtaaac ctaattgtgg 9540
tagaaatttt taccaactct atactcaatc aagcaaaatt tctgtatatt ccctgtggaa 9600
tgtacctatg tgagtttcag aaattctcaa aatacgtgtt caaaaatttc tgcttttgca 9660
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cacactactg tatttcatta tctgtactga aagcaaatgc tttgtgacta ttaaatgttg 9840
cacatcattc attcactgta tagtaatcat tgactaaagc catttgtctg tgttttcttc 9900
ttgtggttgt atatatcagg taaaatattt tccaaagagc catgtgtcat gtaatactga 9960
accactttga tattgagaca ttaatttgta cccttgttat tatctactag taataatgta 10020
atactgtaga aatattgctc taattctttt caaaattgtt gcatccccct tagaatgttt 10080
ctatttccat aaggatttag gtatgctatt atcccttctt ataccctaag atgaagctgt 10140
ttttgtgctc tttgttcatc attggccctc attccaagca ctttacgctg tctgtaatgg 10200
gatctatttt tgcactggaa tatctgagaa ttgcaaaact agacaaaagt ttcacaacag 10260
atttctaagt taaatcattt tcattaaaag gaaaaaagaa aaaaaatttt gtatgtcaat 10320
aactttatat gaagtattaa aatgcatatt tctatgttgt aatataatga gtcacaaaat 10380
aaagctgtga cagttctgtt ggtctacaga aa 10412
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<211> 1354
<212> DNA
<213> Homo sapiens
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<309> 2010-08-02
<313> (1)..(1354)
<400> 2
ccagggctgg aatggggccg cccggctccc catggcagtg ggtgacgctg ctgctggggc 60
tgctgctccc tcctgccgcc cccttctggc tcctcaatgt gctcttcccc ccgcacacca 120
cgcccaaggc tgagctcagt aaccacacac ggcccgtcat cctcgtgccc ggctgcctgg 180
ggaatcagct agaagccaag ctggacaaac cagatgtggt gaactggatg tgctaccgca 240
agacagagga cttcttcacc atctggctgg atctcaacat gttcctaccc cttggggtag 300
actgctggat cgataacacc agggttgtct acaaccggag ctctgggctc gtgtccaacg 360
cccctggtgt ccagatccgc gtccctggct ttggcaagac ctactctgtg gagtacctgg 420
acagcagcaa gctggcaggg tacctgcaca cactggtgca gaacctggtc aacaatggct 480
acgtgcggga cgagactgtg cgcgccgccc cctatgactg gcggctggag cccggccagc 540
aggaggagta ctaccgcaag ctcgcagggc tggtggagga gatgcacgct gcctatggga 600
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gccagcccca ggcctggaag gaccgcttta ttgatggctt catctctctt ggggctccct 720
ggggtggctc catcaagccc atgctggtct tggcctcagg tgacaaccag ggcatcccca 780
tcatgtccag catcaagctg aaagaggagc agcgcataac caccacctcc ccctggatgt 840
ttccctctcg catggcgtgg cctgaggacc acgtgttcat ttccacaccc agcttcaact 900
acacaggccg tgacttccaa cgcttctttg cagacctgca ctttgaggaa ggctggtaca 960
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gtctttacgg cgtgggcctg cccacgcccc gcacctacat ctacgaccac ggcttcccct 1080
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ccgagctctg tggcctgtgg cagggccgcc agccacagcc tgtgcacctg ctgcccctgc 1200
acgggataca gcatctcaac atggtcttca gcaacctgac cctggagcac atcaatgcca 1260
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cgcctcctga ataaagacct tcctttgcta ccgt 1354
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<211> 14905
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<300>
<308> NM_002332.2
<309> 2010-08-04
<313> (1)..(14905)
<400> 3
cagcggtgcg agctccaggc ccatgcactg aggaggcgga aacaagggga gcccccagag 60
ctccatcaag ccccctccaa aggctcccct acccggtcca cgccccccac cccccctccc 120
cgcctcctcc caattgtgca tttttgcagc cggaggcggc tccgagatgg ggctgtgagc 180
ttcgcccggg gagggggaaa gagcagcgag gagtgaagcg ggggggtggg gtgaagggtt 240
tggatttcgg ggcagggggc gcacccccgt cagcaggccc tccccaaggg gctcggaact 300
ctacctcttc acccacgccc ctggtgcgct ttgccgaagg aaagaataag aacagagaag 360
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agcaggacca gaggggaagg ggctgctgct tgcatcagcc cacaccatgc tgaccccgcc 480
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gacttgcagc cccaagcagt ttgcctgcag agatcaaata acctgtatct caaagggctg 600
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ccccacactc gatgggccca cctgctactg caacagcagc tttcagcttc aggcagatgg 900
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caacacagac ggctccttca tatgtggctg tgttgaagga tacctcctgc agccggataa 1020
ccgctcctgc aaggccaaga acgagccagt agaccggccc cctgtgctgt tgatagccaa 1080
ctcccagaac atcttggcca cgtacctgag tggggcccag gtgtctacca tcacacctac 1140
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gcatgttggg gacagtgctg ctcagacgca gctcaagtgt gcccgcatgc ctggcctaaa 1260
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cccaaaggtg gaacgctgtg acatggatgg gcagaaccgc accaagctcg tcgacagcaa 1560
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tgcctatctg gactatattg aagtggtgga ctatgagggc aagggccgcc agaccatcat 1680
ccagggcatc ctgattgagc acctgtacgg cctgactgtg tttgagaatt atctctatgc 1740
caccaactcg gacaatgcca atgcccagca gaagacgagt gtgatccgtg tgaaccgctt 1800
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ctgccgttcc ggcttcagcc tgggcagtga cgggaagtca tgcaagaagc cggagcatga 2040
gctgttcctc gtgtatggca agggccggcc aggcatcatc cggggcatgg atatgggggc 2100
caaggtcccg gatgagcaca tgatccccat tgaaaacctc atgaaccccc gagccctgga 2160
cttccacgct gagaccggct tcatctactt tgccgacacc accagctacc tcattggccg 2220
ccagaagatt gatggcactg agcgggagac catcctgaag gacggcatcc acaatgtgga 2280
gggtgtggcc gtggactgga tgggagacaa tctgtactgg acggacgatg ggcccaaaaa 2340
gacaatcagc gtggccaggc tggagaaagc tgctcagacc cgcaagactt taatcgaggg 2400
caaaatgaca caccccaggg ctattgtggt ggatccactc aatgggtgga tgtactggac 2460
agactgggag gaggacccca aggacagtcg gcgtgggcgg ctggagaggg cgtggatgga 2520
tggctcacac cgagacatct ttgtcacctc caagacagtg ctttggccca atgggctaag 2580
cctggacatc ccggctgggc gcctctactg ggtggatgcc ttctacgacc gcatcgagac 2640
gatactgctc aatggcacag accggaagat tgtgtatgaa ggtcctgagc tgaaccacgc 2700
ctttggcctg tgtcaccatg gcaactacct cttctggact gagtatcgga gtggcagtgt 2760
ctaccgcttg gaacggggtg taggaggcgc accccccact gtgacccttc tgcgcagtga 2820
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ccagtgcgcc tgtgctgagg accaggtgtt ggacgcagac ggcgtcactt gcttggcgaa 3000
cccatcctac gtgcctccac cccagtgcca gccaggcgag tttgcctgtg ccaacagccg 3060
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tggccgctgc atccccatct cctggacgtg tgatctggat gacgactgtg gggaccgctc 3360
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caatggcaga tgtatcaaca tcaactggag atgcgacaat gacaatgact gtggggacaa 3480
cagtgacgaa gccggctgca gccactcctg ttctagcacc cagttcaagt gcaacagcgg 3540
gcgttgcatc cccgagcact ggacctgcga tggggacaat gactgcggag actacagtga 3600
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tcccagtgtc aagtttggct gcaaggactc agctcggtgc atcagcaaag cgtgggtgtg 3840
tgatggcgac aatgactgtg aggataactc ggacgaggag aactgcgagt ccctggcctg 3900
caggccaccc tcgcaccctt gtgccaacaa cacctcagtc tgcctgcccc ctgacaagct 3960
gtgtgatggc aacgacgact gtggcgacgg ctcagatgag ggcgagctct gcgaccagtg 4020
ctctctgaat aacggtggct gcagccacaa ctgctcagtg gcacctggcg aaggcattgt 4080
gtgttcctgc cctctgggca tggagctggg gcccgacaac cacacctgcc agatccagag 4140
ctactgtgcc aagcatctca aatgcagcca aaagtgcgac cagaacaagt tcagcgtgaa 4200
gtgctcctgc tacgagggct gggtcctgga acctgacggc gagagctgcc gcagcctgga 4260
ccccttcaag ccgttcatca ttttctccaa ccgccatgaa atccggcgca tcgatcttca 4320
caaaggagac tacagcgtcc tggtgcccgg cctgcgcaac accatcgccc tggacttcca 4380
cctcagccag agcgccctct actggaccga cgtggtggag gacaagatct accgcgggaa 4440
gctgctggac aacggagccc tgactagttt cgaggtggtg attcagtatg gcctggccac 4500
acccgagggc ctggctgtag actggattgc aggcaacatc tactgggtgg agagtaacct 4560
ggatcagatc gaggtggcca agctggatgg gaccctccgg accaccctgc tggccggtga 4620
cattgagcac ccaagggcaa tcgcactgga tccccgggat gggatcctgt tttggacaga 4680
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cgtgcaccgg gagaccggct ctgggggctg gcccaacggg ctcaccgtgg actacctgga 4800
gaagcgcatc ctttggattg acgccaggtc agatgccatt tactcagccc gttacgacgg 4860
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gctgtacggg ggggaggtct actggactga ctggcgaaca aacacactgg ctaaggccaa 4980
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gcaggtgtac cacccctccc gccagcccat ggctcccaat ccctgtgagg ccaatggggg 5100
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catcatctcc ttcacggtgc ccgacatcga caacgtcaca gtgctagact acgatgcccg 5340
cgagcagcgt gtgtactggt ctgacgtgcg gacacaggcc atcaagcggg ccttcatcaa 5400
cggcacaggc gtggagacag tcgtctctgc agacttgcca aatgcccacg ggctggctgt 5460
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catggccaac atggatggca gcaatcgcac cctgctcttc agtggccaga agggccccgt 5700
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gctgggcaag gccaccgccc tggccatcat gggggacaag ctgtggtggg ctgatcaggt 5880
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ctgcgagggc gtaggttcct ttctcctgta ctctgtgcat gagggaatca ggggaattcc 6180
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gctggtcaac gtcagcatca gctggcccaa cggcatctca gtggactacc aggatgggaa 6660
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ctgcaagaag actttccggc agtgcagcaa tgggcgctgt gtgtccaaca tgctgtggtg 8220
caacggggcc gacgactgtg gggatggctc tgacgagatc ccttgcaaca agacagcctg 8280
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cagctacttc cgcctgggcg tgaagggcgt gctcttccag ccctgcgagc ggacctcact 8460
ctgctacgca cccagctggg tgtgtgatgg cgccaatgac tgtggggact acagtgatga 8520
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ggctgctcac tgtgaaggca agacgtgcgg cccctcctcc ttctcctgcc ctggcaccca 8820
cgtgtgcgtc cccgagcgct ggctctgtga cggtgacaaa gactgtgctg atggtgcaga 8880
cgagagcatc gcagctggtt gcttgtacaa cagcacttgt gacgaccgtg agttcatgtg 8940
ccagaaccgc cagtgcatcc ccaagcactt cgtgtgtgac cacgaccgtg actgtgcaga 9000
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tgacgaggaa ccgtttctga tcttcgccaa ccggtactac ctgcgcaagc tcaacctgga 9600
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ctaccgagag cagatgatct actggacaga tgtgaccacc cagggcagca tgatccgaag 9720
gatgcacctt aacgggagca atgtgcaggt cctacaccgt acaggcctca gcaaccccga 9780
tgggctggct gtggactggg tgggtggcaa cctgtactgg tgcgacaaag gccgggacac 9840
catcgaggtg tccaagctca atggggccta tcggacggtg ctggtcagct ctggcctccg 9900
tgagcccagg gctctggtgg tggatgtgca gaatgggtac ctgtactgga cagactgggg 9960
tgaccattca ctgatcggcc gcatcggcat ggatgggtcc agccgcagcg tcatcgtgga 10020
caccaagatc acatggccca atggcctgac gctggactat gtcactgagc gcatctactg 10080
ggccgacgcc cgcgaggact acattgaatt tgccagcctg gatggctcca atcgccacgt 10140
tgtgctgagc caggacatcc cgcacatctt tgcactgacc ctgtttgagg actacgtcta 10200
ctggaccgac tgggaaacaa agtccattaa ccgagcccac aagaccacgg gcaccaacaa 10260
aacgctcctc atcagcacgc tgcaccggcc catggacctg catgtcttcc atgccctgcg 10320
ccagccagac gtgcccaatc acccctgcaa ggtcaacaat ggtggctgca gcaacctgtg 10380
cctgctgtcc cccgggggag ggcacaaatg tgcctgcccc accaacttct acctgggcag 10440
cgatgggcgc acctgtgtgt ccaactgcac ggctagccag tttgtatgca agaacgacaa 10500
gtgcatcccc ttctggtgga agtgtgacac cgaggacgac tgcggggacc actcagacga 10560
gcccccggac tgccctgagt tcaagtgccg gcccggacag ttccagtgct ccacaggtat 10620
ctgcacaaac cctgccttca tctgcgatgg cgacaatgac tgccaggaca acagtgacga 10680
ggccaactgt gacatccacg tctgcttgcc cagtcagttc aaatgcacca acaccaaccg 10740
ctgtattccc ggcatcttcc gctgcaatgg gcaggacaac tgcggagatg gggaggatga 10800
gagggactgc cccgaggtga cctgcgcccc caaccagttc cagtgctcca ttaccaaacg 10860
gtgcatcccc cgggtctggg tctgcgaccg ggacaatgac tgtgtggatg gcagtgatga 10920
gcccgccaac tgcacccaga tgacctgtgg tgtggacgag ttccgctgca aggattcggg 10980
ccgctgcatc ccagcgcgtt ggaagtgtga cggagaggat gactgtgggg atggctcgga 11040
tgagcccaag gaagagtgtg atgaacgcac ctgtgagcca taccagttcc gctgcaagaa 11100
caaccgctgc gtgcccggcc gctggcagtg cgactacgac aacgattgcg gtgacaactc 11160
cgatgaagag agctgcaccc ctcggccctg ctccgagagt gagttctcct gtgccaacgg 11220
ccgctgcatc gcggggcgct ggaaatgcga tggagaccac gactgcgcgg acggctcgga 11280
cgagaaagac tgcacccccc gctgtgacat ggaccagttc cagtgcaaga gcggccactg 11340
catccccctg cgctggcgct gtgacgcaga cgccgactgc atggacggca gcgacgagga 11400
ggcctgcggc actggcgtgc ggacctgccc cctggacgag ttccagtgca acaacacctt 11460
gtgcaagccg ctggcctgga agtgcgatgg cgaggatgac tgtggggaca actcagatga 11520
gaaccccgag gagtgtgccc ggttcgtgtg ccctcccaac cggcccttcc gttgcaagaa 11580
tgaccgcgtc tgtctgtgga tcgggcgcca atgcgatggc acggacaact gtggggatgg 11640
gactgatgaa gaggactgtg agccccccac agcccacacc acccactgca aagacaagaa 11700
ggagtttctg tgccggaacc agcgctgcct ctcctcctcc ctgcgctgca acatgttcga 11760
tgactgcggg gacggctctg acgaggagga ctgcagcatc gaccccaagc tgaccagctg 11820
cgccaccaat gccagcatct gtggggacga ggcacgctgc gtgcgcaccg agaaagcggc 11880
ctactgtgcc tgccgctcgg gcttccacac cgtgcccggc cagcccggat gccaagacat 11940
caacgagtgc ctgcgcttcg gcacctgctc ccagctctgc aacaacacca agggcggcca 12000
cctctgcagc tgcgctcgga acttcatgaa gacgcacaac acctgcaagg ccgaaggctc 12060
tgagtaccag gtcctgtaca tcgctgatga caatgagatc cgcagcctgt tccccggcca 12120
cccccattcg gcttacgagc aggcattcca gggtgacgag agtgtccgca ttgatgctat 12180
ggatgtccat gtcaaggctg gccgtgtcta ttggaccaac tggcacacgg gcaccatctc 12240
ctaccgcagc ctgccacctg ctgcgcctcc taccacttcc aaccgccacc ggcgacagat 12300
tgaccggggt gtcacccacc tcaacatttc agggctgaag atgcccagag gcatcgccat 12360
cgactgggtg gccggaaacg tgtactggac cgactcgggc cgagatgtga ttgaggtggc 12420
gcagatgaag ggcgagaacc gcaagacgct catctcgggc atgattgacg agccccacgc 12480
cattgtggtg gacccactga gggggaccat gtactggtca gactggggca accaccccaa 12540
gattgagacg gcagcgatgg atgggacgct tcgggagaca ctggtgcagg acaacattca 12600
gtggcccaca ggcctggccg tggattatca caatgagcgg ctgtactggg cagacgccaa 12660
gctttcagtc atcggcagca tccggctcaa tggcacggac cccattgtgg ctgctgacag 12720
caaacgaggc ctaagtcacc ccttcagcat cgacgtcttt gaggattaca tctatggtgt 12780
cacctacatc aataatcgtg tcttcaagat ccataagttt ggccacagcc ccttggtcaa 12840
cctgacaggg ggcctgagcc acgcctctga cgtggtcctt taccatcagc acaagcagcc 12900
cgaagtgacc aacccatgtg accgcaagaa atgcgagtgg ctctgcctgc tgagccccag 12960
tgggcctgtc tgcacctgtc ccaatgggaa gcggctggac aacggcacat gcgtgcctgt 13020
gccctctcca acgccccccc cagatgctcc ccggcctgga acctgtaacc tgcagtgctt 13080
caacggtggc agctgtttcc tcaatgcacg gaggcagccc aagtgccgct gccaaccccg 13140
ctacacgggt gacaagtgtg aactggacca gtgctgggag cactgtcgca atgggggcac 13200
ctgtgctgcc tccccctctg gcatgcccac gtgccggtgc cccacgggct tcacgggccc 13260
caaatgcacc cagcaggtgt gtgcgggcta ctgtgccaac aacagcacct gcactgtcaa 13320
ccagggcaac cagccccagt gccgatgcct acccggcttc ctgggcgacc gctgccagta 13380
ccggcagtgc tctggctact gtgagaactt tggcacatgc cagatggctg ctgatggctc 13440
ccgacaatgc cgctgcactg cctactttga gggatcgagg tgtgaggtga acaagtgcag 13500
ccgctgtctc gaaggggcct gtgtggtcaa caagcagagt ggggatgtca cctgcaactg 13560
cacggatggc cgggtggccc ccagctgtct gacctgcgtc ggccactgca gcaatggcgg 13620
ctcctgtacc atgaacagca aaatgatgcc tgagtgccag tgcccacccc acatgacagg 13680
gccccggtgt gaggagcacg tcttcagcca gcagcagcca ggacatatag cctccatcct 13740
aatccctctg ctgttgctgc tgctgctggt tctggtggcc ggagtggtat tctggtataa 13800
gcggcgagtc caaggggcta agggcttcca gcaccaacgg atgaccaacg gggccatgaa 13860
cgtggagatt ggaaacccca cctacaagat gtacgaaggc ggagagcctg atgatgtggg 13920
aggcctactg gacgctgact ttgccctgga ccctgacaag cccaccaact tcaccaaccc 13980
cgtgtatgcc acactctaca tggggggcca tggcagtcgc cactccctgg ccagcacgga 14040
cgagaagcga gaactcctgg gccggggccc tgaggacgag ataggggacc ccttggcata 14100
gggccctgcc ccgtcggact gcccccagaa agcctcctgc cccctgccgg tgaagtcctt 14160
cagtgagccc ctccccagcc agcccttccc tggccccgcc ggatgtataa atgtaaaaat 14220
gaaggaatta cattttatat gtgagcgagc aagccggcaa gcgagcacag tattatttct 14280
ccatcccctc cctgcctgct ccttggcacc cccatgctgc cttcagggag acaggcaggg 14340
agggcttggg gctgcacctc ctaccctccc accagaacgc accccactgg gagagctggt 14400
ggtgcagcct tcccctccct gtataagaca ctttgccaag gctctcccct ctcgccccat 14460
ccctgcttgc ccgctcccac agcttcctga gggctaattc tgggaaggga gagttctttg 14520
ctgcccctgt ctggaagacg tggctctggg tgaggtaggc gggaaaggat ggagtgtttt 14580
agttcttggg ggaggccacc ccaaacccca gccccaactc caggggcacc tatgagatgg 14640
ccatgctcaa cccccctccc agacaggccc tccctgtctc cagggccccc accgaggttc 14700
ccagggctgg agacttcctc tggtaaacat tcctccagcc tcccctcccc tggggacgcc 14760
aaggaggtgg gccacaccca ggaagggaaa gcgggcagcc ccgttttggg gacgtgaacg 14820
ttttaataat ttttgctgaa ttcctttaca actaaataac acagatattg ttataaataa 14880
aattgtaaaa aaaaaaaaaa aaaaa 14905
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agtcagggga gcagcggtgc gagctccagg ccagtgcact gaggaggcgg aaacggggga 60
gcccctagtg ctccatcagg cccctaccaa ggcaccccca tcgggtccac gccccccacc 120
ccccaccccg cctcctccca attgtgcatt tttgcagcca gaggcggctc cgagatgggg 180
ctgtgagctt cgccctggga gggggagagg agcgaggagt aaagcagggg tgaagggttc 240
gaatttgggg gcagggggcg cacccgcgtc agcaggccct tcccaggggg ctcggaactg 300
taccatttca cctatgcccc tggttcgctt tgcttaagga aaggataaga atagaagagt 360
cggggagagg aagataaagg gggacccccc aattgggggg ggcgaggaca agaagtaaca 420
ggaccagagg gtgggggctg ctgtttgcat cggcccacac catgctgacc ccgccgttgc 480
tgctgctgct gccgctgctt tcagctctgg tctccggggc cactatggat gcccctaaaa 540
cttgcagccc taagcagttt gcctgcagag accaaatcac ctgtatctca aagggctggc 600
ggtgtgacgg tgaaagagat tgccccgacg gctctgatga agcccctgag atctgtccac 660
agagtaaagc ccagagatgc ccgccaaatg agcacagttg tctggggact gagctatgtg 720
tccccatgtc tcgtctctgc aacgggatcc aggactgcat ggatggctca gacgagggtg 780
ctcactgccg agagctccga gccaactgtt ctcgaatggg ttgtcaacac cattgtgtac 840
ctacacccag tgggcccacg tgctactgta acagcagctt ccagctgcag gcagatggca 900
agacgtgcaa agattttgac gagtgttccg tgtatggcac ctgcagccag ctttgcacca 960
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gctcctgcaa ggccaagaat gagccagtag atcggccgcc agtgctactg attgccaact 1080
ctcagaacat cctagctacg tacctgagtg gggcccaagt gtctaccatc acacccacca 1140
gcacccgaca aaccacggcc atggacttca gttatgccaa tgagaccgta tgctgggtgc 1200
acgttgggga cagtgctgcc cagacacagc tcaagtgtgc ccggatgcct ggcctgaagg 1260
gctttgtgga tgagcatacc atcaacatct ccctcagcct gcaccacgtg gagcagatgg 1320
caatcgactg gctgacggga aacttctact ttgtcgacga cattgacgac aggatctttg 1380
tctgtaaccg aaacggggac acctgtgtca ctctgctgga cctggaactc tacaacccca 1440
aaggcatcgc cttggacccc gccatgggga aggtgttctt cactgactac gggcagatcc 1500
caaaggtgga gcgctgtgac atggatggac agaaccgcac caagctggtg gatagcaaga 1560
tcgtgtttcc acacggcatc accctggacc tggtcagccg cctcgtctac tgggcggacg 1620
cctacctaga ctacatcgag gtggtagact acgaagggaa gggtcggcag accatcatcc 1680
aaggcatcct gatcgagcac ctgtacggcc tgaccgtgtt tgagaactat ctctacgcca 1740
ccaactcgga caatgccaac acgcagcaga agacgagcgt gatccgagtg aaccggttca 1800
acagtactga gtaccaggtc gtcacccgtg tggacaaggg tggtgccctg catatctacc 1860
accagcgacg ccagccccga gtgcggagtc acgcctgtga gaatgaccag tacgggaagc 1920
caggtggctg ctccgacatc tgcctcctgg ccaacagtca caaggcaagg acctgcaggt 1980
gcaggtctgg cttcagcctg ggaagtgatg ggaagtcttg taagaaacct gaacatgagc 2040
tgttcctcgt gtatggcaag ggccgaccag gcatcattag aggcatggac atgggggcca 2100
aggtcccaga tgagcacatg atccccatcg agaaccttat gaatccacgc gctctggact 2160
tccacgccga gaccggcttc atctactttg ctgacaccac cagctacctc attggccgcc 2220
agaaaattga tggcacggag agagagacta tcctgaagga tggcatccac aatgtggagg 2280
gcgtagccgt ggactggatg ggagacaatc tttactggac tgatgatggc cccaagaaga 2340
ccattagtgt ggccaggctg gagaaagccg ctcagacccg gaagactcta attgagggca 2400
agatgacaca ccccagggcc attgtagtgg atccactcaa tgggtggatg tactggacag 2460
actgggagga ggaccccaag gacagtcggc gagggcggct cgagagggct tggatggacg 2520
gctcacaccg agatatcttt gtcacctcca agacagtgct ttggcccaat gggctaagcc 2580
tggatatccc agccggacgc ctctactggg tggatgcctt ctatgaccga attgagacca 2640
tactgctcaa tggcacagac cggaagattg tatatgaggg tcctgaactg aatcatgcct 2700
tcggcctgtg tcaccatggc aactacctct tttggaccga gtaccggagc ggcagcgtct 2760
accgcttgga acggggcgtg gcaggcgcac cgcccactgt gacccttctg cgcagcgaga 2820
gaccgcctat ctttgagatc cgaatgtacg acgcgcagca gcagcaagtg ggtaccaaca 2880
aatgccgggt aaataacgga ggctgcagca gcctgtgcct cgccaccccc gggagccgcc 2940
agtgtgcctg tgccgaggac caggtgttgg acacagatgg tgtcacctgc ttggcgaacc 3000
catcctacgt gcccccaccc cagtgccagc cgggcgagtt tgcctgtgcc aacaaccgct 3060
gcatccagga gcgctggaag tgtgacggag acaacgactg tctggacaac agcgatgagg 3120
ccccagcact gtgccatcaa cacacctgtc cctcggaccg attcaagtgt gagaacaacc 3180
ggtgtatccc caaccgctgg ctctgtgatg gggataatga ttgtggcaac agcgaggacg 3240
aatccaatgc cacgtgctca gcccgcacct gtccacccaa ccagttctcc tgtgccagtg 3300
gccgatgcat tcctatctca tggacctgtg atctggatga tgactgtggg gaccggtccg 3360
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atggcagatg tattaacatc aactggcggt gtgacaacga caatgactgt ggggacaaca 3480
gcgacgaagc cggctgcagt cactcctgct ccagtaccca gttcaagtgc aacagtggca 3540
gatgcatccc cgagcactgg acgtgtgatg gggacaatga ttgtggggac tacagcgacg 3600
agacacacgc caactgtacc aaccaggcta caagacctcc tggtggctgc cactcggatg 3660
agttccagtg ccgcctagat ggcctgtgca tccccctgag gtggcgctgc gacggggaca 3720
ccgactgcat ggattccagc gatgagaaga gctgtgaggg cgtgacccat gtttgtgacc 3780
cgaatgtcaa gtttggctgc aaggactccg cccggtgcat cagcaaggcg tgggtgtgtg 3840
atggcgacag cgactgtgaa gataactccg acgaggagaa ctgtgaggcc ctggcctgca 3900
ggccaccctc ccatccctgc gccaacaaca cctctgtctg cctgcctcct gacaagctgt 3960
gcgacggcaa ggatgactgt ggagacggct cggatgaggg cgagctctgt gaccagtgtt 4020
ctctgaataa tggtggctgt agtcacaact gctcagtggc ccctggtgaa ggcatcgtgt 4080
gctcttgccc tctgggcatg gagctgggct ctgacaacca cacctgccag atccagagct 4140
actgtgccaa gcacctcaaa tgcagccaga agtgtgacca gaacaagttc agtgtgaagt 4200
gctcctgcta cgagggctgg gtcttggagc ctgacgggga aagctgccgc agtctggatc 4260
ccttcaaacc gttcatcatc ttctccaacc gccacgagat caggcgcatt gaccttcaca 4320
agggggacta cagcgtccta gtgcctggcc tgcgcaacac tattgccctg gacttccacc 4380
tcagccagag tgccctctac tggaccgacg tggtagagga caagatctac cgtgggaaac 4440
tcctggacaa cggagccctg accagctttg aggtggtgat tcagtatggc ttggccacac 4500
cagagggcct ggctgtagat tggattgcag gcaacatcta ctgggtggag agcaacctgg 4560
accagatcga agtggccaag ctggacggaa ccctccgaac cactctgctg gcgggtgaca 4620
ttgagcaccc gagggccatc gctctggacc ctcgggatgg gattctgttt tggacagact 4680
gggatgccag cctgccacga atcgaggctg cgtccatgag tggggctggc cgccgaacca 4740
tccaccggga gacaggctct gggggctggc ccaacgggct caccgtggat tacctggaga 4800
agcgcatcct ctggattgat gctaggtcag atgccatcta ttcagcccgg tatgacggct 4860
ccggccacat ggaggtgctt cggggacacg agttcctgtc acacccattt gccgtgacac 4920
tgtacggtgg ggaggtgtac tggaccgact ggcgaacaaa tacactggct aaggccaaca 4980
agtggactgg ccacaacgtc accgtggtac agaggaccaa cacccagccc ttcgacctgc 5040
aggtgtatca cccttcccgg cagcccatgg ctccaaaccc atgtgaggcc aatggcggcc 5100
ggggcccctg ttcccatctg tgcctcatca actacaaccg gaccgtctcc tgcgcctgtc 5160
cccacctcat gaagctgcac aaggacaaca ccacctgcta tgagtttaag aagttcctgc 5220
tgtacgcacg tcagatggag atccggggcg tggacctgga tgccccgtac tacaattata 5280
tcatctcctt cacggtgcct gatatcgaca atgtcacggt gctggactat gatgcccgag 5340
agcagcgagt ttactggtct gatgtgcgga ctcaagccat caaaagggca tttatcaacg 5400
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cagagaagat gggcacgtgc aacaaagccg atggctctgg gtccgtggtg ctgcggaaca 5940
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tctactggtg tgatgctcgg atggacaaga tcgagcgcat cgacctggaa acgggcgaga 6720
accgggaggt ggtcctgtcc agcaataaca tggatatgtt ctccgtgtcc gtgtttgagg 6780
acttcatcta ctggagtgac agaactcacg ccaatggctc catcaagcgc ggctgcaaag 6840
acaatgctac agactccgtg cctctgagga caggcattgg tgttcagctt aaagacatca 6900
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agcagatcaa tgacgatggc tcgggcagga ccaccatcgt ggaaaatgtg ggctctgtgg 7320
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ccatcacccg ccacaccgtg gaccagactc gcccaggggc cttcgagagg gagacagtca 7440
tcaccatgtc cggagacgac cacccgagag cctttgtgct ggatgagtgc cagaacctga 7500
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gcatcatcgc cgtggccaac gacaccaaca gctgtgaact ctccccctgc cgtatcaaca 7920
atggaggctg ccaggatctg tgtctgctca cccaccaagg ccacgtcaac tgttcctgtc 7980
gagggggccg gatcctccag gaggacttca cctgccgggc tgtgaactcc tcttgtcggg 8040
cacaagatga gtttgagtgt gccaatgggg aatgtatcag cttcagcctc acctgtgatg 8100
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gtgtgggtga gttccgctgc cgggatgggt cctgcatcgg gaactccagt cgctgcaacc 8340
agtttgtgga ttgtgaggat gcctcggatg agatgaattg cagtaccaca gactgcagca 8400
gctatttccg cctgggcgtg aaaggtgtcc tcttccagcc gtgcgagcgg acatccctgt 8460
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aggagatgag caaggatctg gaggaggtga aggccaaggt gcagccctac ctggacgact 420
tccagaagaa gtggcaggag gagatggagc tctaccgcca gaaggtggag ccgctgcgcg 480
cagagctcca agagggcgcg cgccagaagc tgcacgagct gcaagagaag ctgagcccac 540
tgggcgagga gatgcgcgac cgcgcgcgcg cccatgtgga cgcgctgcgc acgcatctgg 600
ccccctacag cgacgagctg cgccagcgct tggccgcgcg ccttgaggct ctcaaggaga 660
acggcggcgc cagactggcc gagtaccacg ccaaggccac cgagcatctg agcacgctca 720
gcgagaaggc caagcccgcg ctcgaggacc tccgccaagg cctgctgccc gtgctggaga 780
gcttcaaggt cagcttcctg agcgctctcg aggagtacac taagaagctc aacacccagt 840
gaggcgcccg ccgccgcccc ccttcccggt gctcagaata aacgtttcca aagtggg 897
<210> 8
<211> 1299
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 8
acgcccggga acccccgacc cctctgagcc cggggtactg cgcccgggtc tccacgccca 60
gagatgctcc ccggtctcca ccgtcgggca agccccaagc gcagcagcgc agagtcctgg 120
ggtcaccaga gctcgtacta ggacatcgtc tccccattta acaccgcctc cggtcccatc 180
tgagttgcaa gtggtgggga tgtggggctc cggatcaaag tccccgaaac cgagcacttc 240
ccgaagcctc cttggcctcg aaacaaaaca ataacgccca actccatcat attccagaac 300
tcccaccacc tgcatacaga cattcagctg cacaagcccc ctccatgcta cagtcaacag 360
gatctccagg ccacggctca agcccaggta ctcacatcag tggttctatc aacactcagg 420
acagacccat agaagaggcc caagcaggcc ctggaagtgc atgtggaggc caccaggcaa 480
ggaattctgg agtcccaggt actcataact ctgggtggca tggccccttt gcaccatgga 540
ctgtttgccc ttagaaaggg atggatctga gctgggcgca gtggctcatg cctgtaatcc 600
cagcactttg ggaggccaag gtgggcagct cacctcaggt caggttggtc tcaaactcct 660
gacctcaggc gatccacctc agcctctcaa agtgctggaa ttataggtgt gagccactgt 720
gcccagccca aaatcattct ttttggaatt ttgaagcata taattccaaa aggtatgaag 780
gtaatcactt agattgctct aataagggaa tgggaacagt taagtcctat acaaataaga 840
caaagataag atactacaaa aaggggatga gcccaagaaa aaaatcaaag tcccagagag 900
agaacagcca ttgattctaa atacacaagt ctatggcccc aacccaaact tgtttcacta 960
agaacaacct gtggtttcga gaatctggtc atcccccaca gtgaatacat gaacacattg 1020
taatgtttga aatgtttatt tttcttgttg atttcttact gttagaagag ctaagtgatt 1080
tggcccaaag tggctaagtg attcggccag tttgtacaca gggatataag tttgctgaca 1140
ccaagctcat actttacaaa tgtaatatct tcataaaaca aaaatactgg gccgggcgcg 1200
gtggctcacg cctgtaatcc cagcattttg ggaggccgag gcgggcggat catgagatca 1260
ggagatcgag accatcctgg ctagcagggt gaagccccg 1299
<210> 9
<211> 917
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 9
caaaatggcg tgctaccctg tccaaccttg tctgtagaca gagtcaattg aacactgtct 60
ttgggacttc cgtgcaactg aggtgggcgg gcttgaagca caaagctttc agggagaacc 120
aaactttatg cccaagctgc tctctgccac ccacagggta aatgaatctc atacaggaaa 180
ggcaagagac atgtgacact gttgtctgat ggtcacaagt caagcttttt aaaaagcagc 240
ctgatattgt gagctaacat ggctttctgt aattgaatgc aatgtatttt ctatgcttgt 300
ctgggtaaag ttgaccttgg tttgatttag ctcaagcaat atttcaacag tgcactgggg 360
ctctgagtcc cctgactact gtttgactag agccaggctc tgccctggat ggcaaccaac 420
agcccaggct ctggggcaca gccgggcttt gacaggtctg gggaaatgtt caccggagat 480
gaaaggtttc aaactatgaa actctaaaat ctcaagtcaa aacttttgac aagcacacac 540
aggacatgaa ttacaatcac ccgaagattt ttacaggctt ctcaatttta atgacatgct 600
gacacgtgtc atcagatctc acaacaagat gacacatggg tgtcaggtat ggcgcagaag 660
actagagtcg gggtgtaacc aatgagcatt gtctgttgga cacaggcgaa ttcggcaaac 720
ggacagtgct ggaggcagaa gggtttaaag aaggcaggaa agcccatgtt taacagaatg 780
gggtgacgaa gagggatggg aaggtctaac tcacccgggg gtgggggcac caggggggcc 840
cacggacaca gaaaaccacg caggtcaggc acctacaaag accgaaggaa aaagggacca 900
cgcagaaatc actcacg 917
<210> 10
<211> 1550
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 10
aaagtccaag gtgggaacag ataggtctgg gggcatgggg gctgggccta ataggggccg 60
ggcatggatg ggcctctcct gctcaccgat cctgggctgg gcatcttgtc cttggtgggt 120
gggggccaag gaaggagtgg tggggcttgg cccagagtct ggtgtggctg tgactgacca 180
cagcttgtga tgccccagcc aagacctcag gcacaccccg tcccccactc cgccccccct 240
gggttagaca actgagagtc acagtgtggt gggagaaggg acgtcattcc tctaagggac 300
aagcttttgg cccctcccca caccagggca ggtacttatg tcggggctta tgcagggcag 360
aagggctttg gccaggtcag ctgccagggg ctggggccca ggctccccag ggtctggcgt 420
ggtgcatcag gggcctggtg ggggcttacc gaggatgacg ggccgtgtgt ggttactgag 480
ctcagccttg ggcgtggtgt gcggggggaa gagcacattg aggagccaga agggggcggc 540
aggagggagc agcagcccca gcagcagcgt cacccactgc catggggagc cgggcggccc 600
cattccagcc ctggtgccta ctgccagaga aagcggcact gggctgtcct tatctggtgt 660
gggagtggga ggggccctag ggccagtggg agggacggcc tggccagtgg gggttgtggc 720
cagagattgc cggaaagggg cacagcctca gggagccggc tctgggcctg ggttcagttc 780
cgccttcttc tcttggcgcc aggggaaaca gagccggggc agcaggaggc ccagaactac 840
acaatgtttt attgaaaaag tcaggcctca gctcagctgt ctccattcgg ctcagcttgg 900
tggggggccc tgcccatagt agactgagcc agatcttcct gcaggcagct gggctggact 960
ccctccctgg ctacccttcc cttcgtctct gatggtgaca tccaaacaat aaatatgcaa 1020
taaatagcgc tcctgggctg ggccgggccg gctgccttca aaccccactc ggcccctacc 1080
agtcttctct ggccaggaca ggcctactgg ggtgctagat agtaaagtcc ccaaacatcc 1140
cagggtccca caagacctgg gatccatctc cattttgagg cccaggcctg gtttccaagg 1200
agacctagca aagctgggtc caggacaggg ccaggcaagc agggctggca ggtgggtgct 1260
gggaagaggc tgttacccca gaccacagct tgttatgtcc tggccaagac ctcgactcca 1320
ggccacaaga tgacactggg ctcaggagta gatggtgatg acttcacggc caccaccgcg 1380
caccaacagc acccgctcaa ggccctcggt cagcacctcg aggaactcca tgtagttctc 1440
gtcgccctca ctgttcctgg gtgggccagg catgtttagg agaaccaggc gggcgtcgtg 1500
ggagcgcgtg acaatgactt cattgagctt cacagcagtg tgcatgcgcc 1550
<210> 11
<211> 329
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (134)..(134)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (311)..(311)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (327)..(327)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 11
tttaangttt gatgtttatt ggtggtgtct gatgagcgtt tctcttgtcc agactgtgtt 60
tctctctcca gaccagctcc cagggtacag ggggtgggga gtaggtggta gctgtgtcag 120
tgctgggccc tggngccact ccctagggaa gagcaggtgg ggcctcgggg ggtctggccc 180
tagctctggc agatccatcc tcagtgaagc acatccctgg ggcaaaggca ctcctgaggc 240
caagaccagc atgggcttga tggagccacc ccagggagcc ccaagagaga tgaagccatc 300
aataaagcgg nccttccagg cctgggnct 329
<210> 12
<211> 1826
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 12
tgtcactctg acctcagtgt aggcactgcc tcctctggga agtctttgct gacctgaaag 60
gctcagcctc ttgtgcttcc taagcttttc tcagagcatt tagcttcatt agtaattaaa 120
cttccattag tgaaatgatc tgattaatgg ttgtcactcc cagattttaa ttctaacttt 180
tttttttttt tttttttttg agacccagtc tctttttttt tgagacagtc tcattctgcc 240
gcccagtctg gagtgcaacg acgtgatctc ggctcacggt gacctccacc tcccaggttc 300
aagtgattct cgtgcctcag cctcctgagt agctgggacg acagatgcat gccaccacgc 360
ctggcaaata ttttgtattt tagtagagac gggggtttct gccgtgttgg cctggctggt 420
ctcaaactcc tgagttcggg tgatccgcct gcctcggtct cccggggtgc cgggattaca 480
ggcgtgagcc accgtgcccg gcctctaaac acttgtggcc ctgtcattca cccagcactc 540
aaaaggtcgt ctcacctgcc cttttgggag ctgggagaga cagctcaaat tgtcaccgcc 600
cccccaccgc cccgtgctcc tctgacaggg ctgtgggtgg agccagctcc agtccccgcg 660
cccagcacag aggcaggcac ggtgcacact gcctcaacag ctcgaccagg agagtgggca 720
gctgtacatc tagggtgccc agctcagtcc caggcctcag cagagcccat cttgcctcac 780
tgcacacagc actgagcctg tggctggtga ggagtgaaac ctagtgtggg actctagtgc 840
ctcccttcaa cctgaaacat agccatcagg gcttacggta gcaaaggaag gtctttattc 900
aggaggcggg ggctctgggc tggcagtcgg ggatgcaggg ggaccctggc ggtaggcacc 960
cagcaggatg gcattgatgt gctccagggt caggttgctg aagaccatgt tcagatgctg 1020
tatcccgtgc aggggcagca ggtgcacagg ctgtggctgg cggccctgcc acaggccaca 1080
gagctcggtg ctgcgggtcg ccaccgtgtc atcaccatcc tcatagagca cacccacagg 1140
gtccgtgtag gggaagccgt ggtcgtagat gtaggtgcgg ggcgtgggca ggcccacgcc 1200
gtaaagacag tatacttcca caccaggtgc tgggagtcct gccaggaggt cacgtgactg 1260
cagccacatg taccagcctt cctcaaagtg caggtctgca aagaagcgtt ggaagtcacg 1320
gcctgtgtag ttgaagctgg gtgtggaaat gaacacgtgg tcctcaggcc acgccatgcg 1380
agagggaaac atccaggggg aggtggtggt tatgcgctgc tcctctttca gcttgatgct 1440
ggacatgatg gggatgccct ggttgtcacc tgtggatatg gagcaaggtg ggacagggag 1500
ccaggcctgg ctacccctgg cccacaacct gctgagtgta ggctcagcca gatgctcaat 1560
cttgtccctg cccaatctag acacagactc taagccacag gcttgagcag gcctgatatt 1620
caatgatgct cagtgtcagc ttactcaatg agaagccctg ataagacctc tgttgggtgg 1680
agctgtaggg cttcaaaagg atggcaggga caggcaccat ggctcacccc tgtaatcccg 1740
gcactttggg aggctgaggc aggaggatca cttgaggcca ggagtccgtg accagactgg 1800
gcaatgcagt gagaccctgt ctctac 1826
<210> 13
<211> 536
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 13
tgtttttttt tttttttttt aaagagatgg agtcctgatc tgtcgcccag gctggagttc 60
agtggcacaa tattggccca ctgcaaccct tgaaccttcc cggttcaagt gattctcctg 120
cctaggtctt ctgagtagct gggattacag gtgcccacca ccacgcccag ctaatttttg 180
tggttttagt agagacggag ttttgccatg ttggccaagc tagtctcaaa ctcctgacct 240
caagtgatcg gccggcctca gcctcccaaa gtgctgggat tacaggcttg agccactgcg 300
cctggcccag ttttcccatg tcttgaggca ccactaccca tgcacctcag aatcctccct 360
tgcctttatc cctttgatac agcacatccc aaagtgaatc cccacatggt ccctggttgc 420
tcagactcag tgaaaaaaaa atgaatggtc aagtgagttt tggaaaaccc caaacgcttg 480
aaaaattctt ggcacacata aacatattca aggctctgag aagttctgca gcacaa 536
<210> 14
<211> 551
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 14
accattcagc tgcacccaga tgccccaaga gcaatgagcc cacacgcaga gctggaggac 60
ctgaaaggca acctccaagt cccagatcat gtctctgtgg ggtctggtct ccaagatgcc 120
cccagaaaaa gtgcagcggc tctatgtcga ctttccccaa cacctgcggc atcttctggg 180
tgactggctg gagagccagc cctgggagtt cctggtcggc tccgacgcct tctgctgcaa 240
cttggctagt gccctacttt cagacactgt ccagcacctt caggcctcgg tgggagagca 300
gggggagggg agcaccatct tgcaacacat cagcaccctt gagagcatat atcagaggga 360
ccccctgaag ctggtggcca ctttcagaca aatacttcaa ggagagaaaa aagctgttat 420
ggaacagttc cgccacttgc caatgccttt ccactggaag caggaagaac tcaagtttaa 480
gacaggcttg cggaggctgc agcaccgagt aggggagatc caccttctcc gagaagccct 540
gcagaagggg g 551
<210> 15
<211> 672
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 15
tgtgacaccc ttcctcacgc ttagacagca aagttgcctc ggaagagaag agaagcctgc 60
atgggaatgg ccagcacatc ctaaatgctc cagtggcccg tggttcgtcc cttcgtctca 120
ttgactgcca cagacaggaa gtaggctcag ggacttggca cctacccaac agcaggacgt 180
cctttctggc catactcctg agggtaacaa aatcacatgg aagcccaaag caagccaggc 240
tcaggctcct ctgccctctg ctacttaaca atgtccgtcc ttccccagcc cccctgcaga 300
tgcttctgta tgggaaagcc cctctgcatc taatgacact ctgctttcaa agacgggaca 360
gtccctggtc tctggagagt gaccattcgt ggccttctca gttgacactt ctccgctgag 420
gcatccctta gccctgaacc agaaatgaaa gagccggctc agagtgaaaa ggaagaatag 480
ccatcaatct gctcctgtgt gcaaggagca cagacctggt ctcagactct gcccgtctcc 540
cccgcttccc tgccctctga gtgactcacg gtgcaggctg agggagatgt tgatggtatg 600
ctcatccaca aagcccttca ggccaggcat ccgggcaact tgagctgtgt ctgggcacac 660
tgtcccaacg tg 672
<210> 16
<211> 616
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 16
gacttttatc tgcactgttt caacagcagg tagccagccg tctttttact gcctgcctct 60
ggctgaagct cggcccacac tatcaggact cagccctgta gggatgactc tgccacacag 120
ctacagcacc agctggcaca aatggctttc tctccaactt cctcaggctt ccctgagtca 180
ctgcccagcc ctaggactgg caacaccctg gccctgctca cccatccacc cttggcaaga 240
gggaaagagg aagaagcctg cagagagctg gtgccctgct tccagatgct gctccattct 300
caggccaagc ctcaagatgg ggggaacctg agtgggagcc tctctcctgg cttgcgttcc 360
ctcccacttc tgggaaagca gggcagtgac agtccctgtt ctcatgtgtc tgcccttggc 420
tgggctcccc tcacctcccc aaagaccagg cagggtccca ttcagcagac ctgactgtaa 480
ggaattggca agaaatgacg tccctagcca gcctggcctc ccctttggta tttttgcagc 540
tggagattat tagtctcaag caaaactcct ttgttatcca agcccactcc accacattat 600
tttcctctct cctaaa 616
<210> 17
<211> 471
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 17
gacagggtct tattctgcag ctcgggttga cctggaattc tccaggcaga ccattctggc 60
cttacgttca ctgacatcca cctgcctctg cctcctgagt gctgctgtta aggagtagtt 120
ccagcctata gtgttctgaa atactgttat tttactgtaa tgatagccaa agctaaaatg 180
agttaagaat agttcctttc ttactcgctg tctcgttcct cattcacttg ccccatcttc 240
gtgccctcag aactacccca cccccaatcc tcctttagcc ccagagcctt ctctgaaccc 300
taccccttgc ttcctgtcag catctcaggg ccccctcttt gcttccttaa tctctactgg 360
aaacacagag aactcccctg ccctctgcca ttcttctgct ggagctacct tcccaccctt 420
gtgcaagcca ggcccctcat acccaagcag gtgacaccat ctgtgtccaa c 471
<210> 18
<211> 707
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 18
gagctgcgct caccgctgtt gcctgatttt ggtctaagtg aaggcttgcg gttcagattc 60
caacaacttc cctttgtaaa ggaaatggac aagaaactcc cccctggata tgccttgaag 120
ccagctacag cgtgaggtgg tgcagctaga aagtgctaga aacacacacc agctctcaga 180
agtctggagg aaaacatcag gggtgtagtc tccttgacaa cagaggaaac atcacattct 240
cagccatccc gggagagaga aactaaagtg atgaacaaac aaggccttgc ctaagacttc 300
cttaacattt tctcttaagg aagaggttga ttgaggaaaa atcgccgctt ggacagctga 360
accgaagcca ttcacagcct ctgaagaagc gaggccaccc cagggggtcg gtcccggggg 420
atagctgccc caccgtggct gaagatctcg gctgcagacc aaggaggggc ggggagattc 480
tgaggcaacg tttcaacctc gtaaggaacc gaggccttga gggtggccgg gggcccctct 540
gtgaacttga tcggggctgg tggggcgagg gcgcccccca ggacaaggtg gggacggagg 600
tgtcgccaca gagcacagcg gaaaccgggg acttcgccag gagggcccag gataacggag 660
ggcgactcgt gtatgtcgcg gaggcggctc cggggacccg ggacttg 707
<210> 19
<211> 741
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 19
ggggctccct ctcaacctat tctggcgcct ggagcaagcc ttacctgcag tccccgccgc 60
ggcgaggagc aaggcgacgg tccagcgcaa tttccagccc cagggcccca tgctcgcagc 120
ctctgccagg cagtgtcccg acccggatca cgacctgctg tgtcctagct ggaaaccctg 180
gcttcccgcg attgcactcg gggcccacgt catttacagc atttcaatgt gaggtttcta 240
gcagggggag gagtttgcag tggggtgatt ttcaaatgtc ttcacctcac tgcaagagga 300
ggagtttcga acggccgatg tgacatcggc tttttaaccc gtgaagctct gattcccact 360
ccagtccttc gaaagtgtcg ccagggcagg cgacttgatt tgttgtattt gggtctccgg 420
tgaagagctg acgccccctc aaaattggaa acgcatcttc tgaaagatcc tcctgaaatt 480
tctcgatgtt taactgttaa cattttgctg ttgttgtcca cagaaggata acaacagcct 540
ttcaagatcc tccaatagcc taatgccatt gtcctctctg cctcaaaagg aaaacactaa 600
aaatgttggg aacttccgcc actttctata tttgcctttt cctttctagg aattgtgtat 660
agatttttag cttcctttcg ttgtatattg tttttacatt gttattccaa atcacctaat 720
agacactgat caatcaggaa t 741
<210> 20
<211> 346
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 20
cccacgtata ttttttgttg ttttttgttt tttttctgta aaatgtcccg gttcttccat 60
aacttataaa catgatttat accgaggaga tgggaaagtg gacggggcag ggtggactga 120
ccggggatgg ggaagctcct ctcgctgccc cctcggggcg ggcccaggcc ctttggagga 180
tggggacgcc aggacactcc tccctgaggt tgctggccgc ctctgccctg gtgctgtgaa 240
gtcagagccc cgatactccc cgtccacctg ccagttcaca aacttcgact gctgggtctg 300
gatggccatc ttggacctga gaccggggcc cagctggtga atgacc 346
<210> 21
<211> 867
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 21
accatctttt ttttttttct tttatgcgtg aaacttggtg aatctttatt aaactagggt 60
ccaccccagg aggacggctg gggcggggac agggtctccc gctgcaggct gcgcggaggc 120
aggaggcacg gggtggcgtg gggtcgcatg gctgcaggct tcggcgttca gtgattgtcg 180
ctgggcacag gggcggcgct ggtgcccacg gcagcctgca ccttctccac cagcccggcc 240
cactggcgct gcatgtcttc caccaggggc tcgaaccagc tcttgaggcg ggcctggaag 300
gcctcggcct gcaggcgtat ctgctgggcc tgctcctcca gcttggcgcg cacctccgcc 360
acctgctcct tcacctcgtc caggcggtcg cgggtccggc tgcccatctc ctccatccgc 420
gcgcgcagcc gctcgcccca ggcctgggcc cgctcctgta gcggctggcc ggccagggag 480
cccacagtgg cggcccgcac gcggccctgt tccaccaggg gccccaggcg ctcgcggatg 540
gcgctgaggc cgcgctcggc gccctcgcgg gccccggcct ggtacactgc caggcgcttc 600
tgcaggtcat cggcatcgcg gaggagccgc ttacgcagct tgcgcaggtg ggaggcgagg 660
cgcacccgca gctcctcggt gctctggccg agcatggcct gcacctcgcc gcggtactgc 720
accaggcggc cgcacacgtc ctccatgtcc gcgcccagcc gggcctgcgc cgcctgcagc 780
tccttggaca gccgtgcccg cgtctcctcc gccaccgggg tcagttgttc ctccagttcc 840
gatttgtagg ccttcaactc cttcatg 867
<210> 22
<211> 563
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 22
cagcttctct tgcagctcgt gcagcttctg gcgcgcgccc tcttggagct ctgcgcgcag 60
cggctccacc ttctggcggt agagctccat ctcctcctgc cacttcttct ggaagtcgtc 120
cagatccaaa tggcaaacct tcttcatcca ccaggaccca acccacaggc tacttattgc 180
tggaaaccta cgttgttcct tggattgaag taatctctcc ctcttctggt gcgcccacag 240
cacttgcacc aacagtgggt acccaacaga ctagcgtgcc tgccgaagaa ggggtcctct 300
gacaatcagg ggacaatggg gaattatgct ctccagactt tctacacaca caagtcacac 360
aggaaggaag gtaaagagaa actagagaaa ataatttttg aagaaaaaca tttcaggaag 420
tattgaaagt acacggtaac tcagcctggg gcaggggtgg agggcagcag cactgtttgc 480
tgcagctatg ctccttcctc agtgccctgc acacccggga cttgctcggt gagcatctct 540
cgtgtcagtg acagctagtg tga 563
<210> 23
<211> 54
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
<400> 23
rururgrura rarargrura rurgrargrc rururgrgru rgrurcrarg rcra 54
<210> 24
<211> 54
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
<400> 24
rararurcra rarurgrgrc rurgrururc rurcrurcru rcrurgrgrg rarc 54
<210> 25
<211> 54
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
<400> 25
rarcrcrura rurararuru rcrcrargrc rarcrururu rgrargrarg rgrc 54
<210> 26
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
<400> 26
cccaccactt gcaactcaga 20
<210> 27
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
<400> 27
ttcgggaagt gctcggtttc g 21
<210> 28
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
<400> 28
cccagctcag atccatccct t 21
<210> 29
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
<400> 29
gcctcttcta tgggtctgtc 20
<210> 30
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
<400> 30
gccatgccac ccagagtta 19
<210> 31
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
<400> 31
gctgttctct ctctgggact t 21
<210> 32
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
<400> 32
gttcccattc ccttattag 19
<210> 33
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
<400> 33
cgaatcactt agccactttg 20
<210> 34
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
<400> 34
ctgggattac aggcgtgagc 20
<210> 35
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
<400> 35
catgtctcct gcctttcctg t 21
<210> 36
<211> 21
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
<400> 36
gctcacaata tcaggctgct t 21
<210> 37
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
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<210> 38
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
<400> 38
ggacagggta gcaacgccat t 21
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<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
<400> 39
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
<400> 40
ttgggcatag agtttggttc 20
<210> 41
<211> 54
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
<400> 41
rgrurgrgru rcrargrurc rarcrargrc rcrarcrarc rcrargrarc ruru 54
<210> 42
<211> 54
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
<400> 42
rgrurcrcrc rururcrurc rcrcrarcrc rarcrarcru rgrurgrarc rurc 54
<210> 43
<211> 54
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
<400> 43
rcrargrcra rcrurgrarc rarcrargrc rurarcrcra rcrcrurarc rurc 54
<210> 44
<211> 54
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
<400> 44
rurgrurgrc rururcrarc rurgrargrg rarurgrgra rurcrurgrc rcra 54
<210> 45
<211> 54
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
<400> 45
rargrargra rararcrgrc rurcrarurc rargrarcra rcrcrarcrc rara 54
<210> 46
<211> 54
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
<400> 46
rcrururarg rgrarargrc rarcrararg rargrgrcru rgrargrcrc ruru 54
<210> 47
<211> 54
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
<400> 47
rcrcrurgrg rcrurcrcrc rurgrurcrc rcrarcrcru rurgrcrurc rcra 54
<210> 48
<211> 54
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
<400> 48
rgrururcra rurururcrc rarcrarcrc rcrargrcru rurcrararc rura 54
<210> 49
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
<400> 49
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
<400> 50
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<210> 51
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
<400> 51
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
<400> 52
gtcacagcca caccagactc t 21
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<212> DNA
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<220>
<223> Antisense oligonucleotide
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<223> Antisense oligonucleotide
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<213> Artificial Sequence
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<223> Antisense oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Antisense oligonucleotide
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tcccagctac tcagaagacc t 21
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<223> Antisense oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Antisense oligonucleotide
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<213> Artificial Sequence
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<223> Antisense oligonucleotide
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<220>
<223> Antisense oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
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<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
<400> 66
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
<400> 68
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
<400> 69
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
<400> 70
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
<400> 71
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
<400> 72
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
<400> 74
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
<400> 75
gctgttgtta tccttctgtg 20
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
<400> 77
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
<400> 78
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
<400> 79
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
<400> 80
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
<400> 81
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<210> 82
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
<400> 82
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
<400> 83
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
<400> 84
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<210> 85
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
<400> 85
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<210> 86
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
<400> 86
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
<400> 87
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
<400> 88
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
<400> 89
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
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gattcaccaa gtttcacgca t 21
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
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gacgaggtga aggagcaggt 20
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
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<220>
<223> Antisense oligonucleotide
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<220>
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
<400> 98
cggctccacc ttct 14
<210> 99
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
<400> 99
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
<400> 100
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
<400> 101
cagcttctgg cgcg 14
<210> 102
<211> 14
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
<400> 102
gcgcgcagcg gctc 14
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<211> 14
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
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tccaccttct ggcg 14
<210> 104
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
<400> 104
cggtgtagag ctcc 14
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<211> 14
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
<400> 105
ccatctcctc ctgc 14
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<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
<400> 106
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<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
<400> 107
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<210> 108
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
<400> 108
agtcgtccag atccaaatg 19
<210> 109
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
<400> 109
gtcgtccaga tccaaatgg 19
<210> 110
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
<400> 110
tcgtccagat ccaaatggc 19
<210> 111
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
<400> 111
cgtccagatc caaatggca 19
<210> 112
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
<400> 112
gtccagatcc aaatggcaa 19
<210> 113
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
<400> 113
tccagatcca aatggcaaa 19
<210> 114
<211> 12
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
<400> 114
cagatccaaa tg 12
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<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
<400> 115
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<210> 116
<211> 12
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
<400> 116
agatccaaat gg 12
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<211> 12
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
<400> 117
gatccaaatg gc 12
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<211> 12
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
<400> 118
atccaaatgg ca 12
<210> 119
<211> 12
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
<400> 119
tccaaatggc aa 12
<210> 120
<211> 12
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
<400> 120
ccaaatggca aa 12
<210> 121
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
<400> 121
ccaaatggca aaccttctt 19
<210> 122
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
<400> 122
atggcaaatc ttcttcatc 19
<210> 123
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
<400> 123
aaatggcaaa ccttcttca 19
<210> 124
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
<400> 124
aaatggcaaa tcttcttca 19
<210> 125
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
<400> 125
atggcaaacc ttcttcatc 19
<210> 126
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
<400> 126
ccaaatggca aatcttctt 19
<210> 127
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
<400> 127
atggcaaacc ttctt 15
<210> 128
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
<400> 128
atggcaaatc ttctt 15
<210> 129
<211> 11
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
<400> 129
cttcttcatc c 11
<210> 130
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
<400> 130
ccaggaccca acccaca 17
<210> 131
<211> 14
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
<400> 131
gctacttatt gctg 14
<210> 132
<211> 14
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
<400> 132
tgctggaaac ctac 14
<210> 133
<211> 14
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
<400> 133
ttccttggat tgaa 14
<210> 134
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
<400> 134
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<210> 135
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
<400> 135
caccaacagt gggtac 16
<210> 136
<211> 12
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
<400> 136
caacagacta gc 12
<210> 137
<211> 14
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
<400> 137
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<210> 138
<211> 14
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
<400> 138
gaattatgct ctcc 14
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<211> 14
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
<400> 139
ctccagactt tcta 14
<210> 140
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
<400> 140
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<210> 141
<211> 14
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
<400> 141
gaaactagag aaaa 14
<210> 142
<211> 14
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
<400> 142
aataattttt gaag 14
<210> 143
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
<400> 143
gaagtattga aagt 14
<210> 144
<211> 14
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
<400> 144
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<210> 145
<211> 14
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
<400> 145
ctggggcagg ggtg 14
<210> 146
<211> 14
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
<400> 146
ggggtggagg gcag 14
<210> 147
<211> 14
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
<400> 147
tgctccttcc tcag 14
<210> 148
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
<400> 148
acccgggact tgctc 15
<210> 149
<211> 14
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
<400> 149
tgtcagtgac agct 14
<210> 150
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
<400> 150
tgtcagtgac agctagtgt 19
<210> 151
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
<400> 151
gtcagtgaca gctagtgtg 19
<210> 152
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
<400> 152
tcagtgacag ctagtgtga 19
<210> 153
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
<400> 153
agtgacagct agtgtgagt 19
<210> 154
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
<400> 154
tgacagctag tgtga 15
<210> 155
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
<400> 155
tgacagctag tgtgagtac 19
<210> 156
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
<400> 156
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<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
<400> 157
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<210> 158
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
<400> 158
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
<400> 159
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<210> 160
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
<400> 160
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<210> 161
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
<400> 161
ctagtgtgag tact 14
<210> 162
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
<400> 162
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<210> 163
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
<400> 163
agtgtgagta ctcttatgt 19
<210> 164
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
<400> 164
gtgtgagtac tcttatgtt 19
<210> 165
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
<400> 165
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<210> 166
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
<400> 166
gtgagtactc ttatgttca 19
<210> 167
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
<400> 167
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<210> 168
<211> 14
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
<400> 168
actcttatgt tcag 14
<210> 169
<211> 14
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
<400> 169
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<210> 170
<211> 14
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
<400> 170
gactttgggg acaa 14
<210> 171
<211> 13
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
<400> 171
aaactgagct cca 13
<210> 172
<211> 14
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
<400> 172
agctgcacga gaaa 14
<210> 173
<211> 14
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
<400> 173
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<210> 174
<211> 14
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
<400> 174
gagctccacg aggg 14
<210> 175
<211> 14
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
<400> 175
cgctgcgcgc gggc 14
<210> 176
<211> 14
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
<400> 176
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<210> 177
<211> 14
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
<400> 177
agctctaccg ccag 14
<210> 178
<211> 14
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
<400> 178
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<210> 179
<211> 14
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
<400> 179
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<210> 180
<211> 14
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
<400> 180
gagccgctgc gcgc 14
<210> 181
<211> 14
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
<400> 181
cgccagaagg tgga 14
<210> 182
<211> 14
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
<400> 182
ggagctctac accg 14
<210> 183
<211> 14
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
<400> 183
gcaggaggag atgg 14
<210> 184
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
<400> 184
tttggatctg gacgacttc 19
<210> 185
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
<400> 185
atttggatct ggacgactt 19
<210> 186
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
<400> 186
catttggatc tggacgact 19
<210> 187
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
<400> 187
ccatttggat ctggacgac 19
<210> 188
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
<400> 188
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<210> 189
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
<400> 189
tgccatttgg atctggacg 19
<210> 190
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
<400> 190
ttgccatttg gatctggac 19
<210> 191
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
<400> 191
tttgccattt ggatctgga 19
<210> 192
<211> 12
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
<400> 192
catttggatc tg 12
<210> 193
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
<400> 193
tttgccattt ggatct 16
<210> 194
<211> 12
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
<400> 194
ccatttggat ct 12
<210> 195
<211> 12
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
<400> 195
gccatttgga tc 12
<210> 196
<211> 12
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
<400> 196
tgccatttgg at 12
<210> 197
<211> 12
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
<400> 197
tgccatttgg at 12
<210> 198
<211> 12
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
<400> 198
tttgccattt gg 12
<210> 199
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
<400> 199
aagaaggttt gccatttgg 19
<210> 200
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
<400> 200
gatgaagaag atttgccat 19
<210> 201
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
<400> 201
tgaagaaggt ttgccattt 19
<210> 202
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
<400> 202
tgaagaagat ttgccattt 19
<210> 203
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
<400> 203
gatgaagaag gtttgccat 19
<210> 204
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
<400> 204
aagaagattt gccatttgg 19
<210> 205
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
<400> 205
aagaaggttt gccat 15
<210> 206
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
<400> 206
aagaagattt gccat 15
<210> 207
<211> 11
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
<400> 207
ggatgaagaa g 11
<210> 208
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
<400> 208
tgtgggttgg gtcctgg 17
<210> 209
<211> 14
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
<400> 209
cagcaataag tagc 14
<210> 210
<211> 14
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
<400> 210
gtaggtttcc agca 14
<210> 211
<211> 14
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
<400> 211
ttcaatccaa ggaa 14
<210> 212
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
<400> 212
tgcaagtgct gtgggc 16
<210> 213
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
<400> 213
gtacccactg ttggtg 16
<210> 214
<211> 12
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
<400> 214
gctagtctgt tg 12
<210> 215
<211> 14
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
<400> 215
aggacccctt cttc 14
<210> 216
<211> 14
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
<400> 216
ggagagcata attc 14
<210> 217
<211> 14
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
<400> 217
tagaaagtct ggag 14
<210> 218
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
<400> 218
ccttcctgtg tgactt 16
<210> 219
<211> 14
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
<400> 219
ttttctctag tttc 14
<210> 220
<211> 14
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
<400> 220
cttcaaaaat tatt 14
<210> 221
<211> 14
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
<400> 221
actttcaata cttc 14
<210> 222
<211> 14
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
<400> 222
accgtgtact ttca 14
<210> 223
<211> 14
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
<400> 223
cacccctgcc ccag 14
<210> 224
<211> 14
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
<400> 224
ctgccctcca cccc 14
<210> 225
<211> 14
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
<400> 225
ctgaggaagg agca 14
<210> 226
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
<400> 226
gagcaagtcc cgggt 15
<210> 227
<211> 14
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
<400> 227
agctgtcact gaca 14
<210> 228
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
<400> 228
acactagctg tcactgaca 19
<210> 229
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
<400> 229
cacactagct gtcactgac 19
<210> 230
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
<400> 230
tcacactagc tgtcactga 19
<210> 231
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
<400> 231
actcacacta gctgtcact 19
<210> 232
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
<400> 232
tcacactagc tgtca 15
<210> 233
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
<400> 233
gtactcacac tagctgtca 19
<210> 234
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
<400> 234
agtactcaca ctagctgtc 19
<210> 235
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
<400> 235
agagtactca cactagctg 19
<210> 236
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
<400> 236
aagagtactc acactagct 19
<210> 237
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
<400> 237
taagagtact cacactagc 19
<210> 238
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
<400> 238
ataagagtac tcacactag 19
<210> 239
<211> 14
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
<400> 239
agtactcaca ctag 14
<210> 240
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
<400> 240
cataagagta ctcacacta 19
<210> 241
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Seqiuence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
<400> 241
acataagagt actcacact 19
<210> 242
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
<400> 242
aacataagag tactcacac 19
<210> 243
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
<400> 243
gaacataaga gtactcaca 19
<210> 244
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
<400> 244
tgaacataag agtactcac 19
<210> 245
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
<400> 245
ctgaacataa gagtactca 19
<210> 246
<211> 14
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
<400> 246
ctgaacataa gagt 14
<210> 247
<211> 14
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
<400> 247
aaagtcaaga ggta 14
<210> 248
<211> 14
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
<400> 248
ttgtccccaa agtc 14
<210> 249
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
<400> 249
aagaaggttt gccat 15
<210> 250
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
<400> 250
tcacactagc tgtca 15
<210> 251
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
<400> 251
aagaaggttt gccat 15
<210> 252
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
<400> 252
tcacactagc tgtca 15
<210> 253
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
<400> 253
ctcctcctgc cacttcttct g 21
<210> 254
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
<400> 254
ctggtggatg aagaaggttt gc 22
<210> 255
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
<400> 255
tttggatctg gacgacttc 19
<210> 256
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
<400> 256
caataagtag cctgt 15
<210> 257
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
<400> 257
cacgctagtc tgttg 15
<210> 258
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
<400> 258
cttccttcct gtgtg 15
<210> 259
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
<400> 259
caggctgagt taccg 15
<210> 260
<211> 12
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
<400> 260
gctagtctgt tg 12
<210> 261
<211> 12
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
<400> 261
gtctgatgga ga 12
<210> 262
<211> 6
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
<400> 262
gctagt 6
<210> 263
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
<400> 263
tgccatttgg atctggacg 19
<210> 264
<211> 48
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse complement of the antisense oligonucleotide SEQ ID NO: 23
<400> 264
rcrurgrarc rarcrcrara rgrcrurcra rurarcruru rurarcaa 48
<210> 265
<211> 48
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse complement of the antisense oligonucleotide SEQ ID NO: 24
<400> 265
rcrcrcrarg rargrargra rgrararcra rgrcrcraru rurgratt 48
<210> 266
<211> 48
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse complement of the antisense oligonucleotide SEQ ID NO: 25
<400> 266
rcrurcrurc rararargru rgrcrurgrg rararurura rurarggt 48
<210> 267
<211> 48
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse complement of the antisense oligonucleotide SEQ ID NO: 41
<400> 267
rgrurcrurg rgrurgrurg rgrcrurgru rgrarcrurg rarcrcac 48
<210> 268
<211> 48
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse complement of the antisense oligonucleotide SEQ ID NO: 42
<400> 268
rgrurcrarc rargrurgru rgrgrurgrg rgrargrara rgrgrgac 48
<210> 269
<211> 48
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse complement of the antisense oligonucleotide SEQ ID NO: 43
<400> 269
rgrurargrg rurgrgrura rgrcrurgru rgrurcrarg rurgrctg 48
<210> 270
<211> 48
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse complement of the antisense oligonucleotide SEQ ID NO: 44
<400> 270
rgrcrargra rurcrcraru rcrcrurcra rgrurgrara rgrcraca 48
<210> 271
<211> 48
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse complement of the antisense oligonucleotide SEQ ID NO: 45
<400> 271
rgrgrurgrg rurgrurcru rgrarurgra rgrcrgruru rurcruct 48
<210> 272
<211> 48
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse complement of the antisense oligonucleotide SEQ ID NO: 46
<400> 272
rgrgrcrurc rargrcrcru rcrururgru rgrcrururc rcruraag 48
<210> 273
<211> 48
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse complement of the antisense oligonucleotide SEQ ID NO: 47
<400> 273
rgrargrcra rargrgrurg rgrgrarcra rgrgrgrarg rcrcragg 48
<210> 274
<211> 48
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse complement of the antisense oligonucleotide SEQ ID NO: 48
<400> 274
rgrururgra rargrcrurg rgrgrurgru rgrgrarara rurgraac 48
<210> 275
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe Sequence
<400> 275
tttggatctg gacgacttc 19
<210> 276
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward Primer
<400> 276
ctcctcctgc cacttcttct g 21
<210> 277
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse Primer
<400> 277
ctggtggatg aagaaggttt gc 22
<210> 278
<211> 12
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
<400> 278
gctagtctgt tg 12
<210> 279
<211> 12
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense oligonucleotide
<400> 279
gtctgatgga ga 12
Claims (37)
- 생체내 또는 시험관내에서 환자의 세포 또는 조직내 지질 수송 및 대사 유전자 폴리뉴클레오티드의 기능 및/또는 발현을 조절하는 방법에 있어서,
이 방법은 전술한 세포 또는 조직에 길이가 5 내지 30개의 뉴클레오티드의 안티센스 올리고뉴클레오티드를 접촉시키는 것을 포함하며, 여기서 상기 올리고뉴클레오티드는 서열 번호: 8의 뉴클레오티드 1 내지 1299, 서열 번호: 9의 뉴클레오티드 1 내지 918, 서열 번호:10의 뉴클레오티드 1 내지 1550, 서열 번호:11의 뉴클레오티드 1 내지 329, 서열 번호:12의 뉴클레오티드 1 내지 1826, 서열 번호:13의 뉴클레오티드 1 내지 536, 서열 번호:14의 뉴클레오티드 1 내지 551, 서열 번호:15의 뉴클레오티드 1 내지 672, 서열 번호:16의 뉴클레오티드 1 내지 616, 서열 번호:17의 뉴클레오티드 1 내지 471, 서열 번호:18의 뉴클레오티드 1 내지 707, 서열 번호:19의 뉴클레오티드 1 내지 741, 서열 번호:20의 뉴클레오티드 1 내지 346, 서열 번호:21의 뉴클레오티드 1 내지 867, 서열 번호:22의 뉴클레오티드 1 내지 563(도 3)내의 5 내지 30개 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드의 역(reverse) 보체에 최소한 50% 서열 동일성을 가지며, 이러한 접촉에 의해 생체내 또는 시험관내 환자의 세포 또는 조직에서 지질 수송 및 대사 유전자 폴리뉴클레오티드의 기능 및/또는 발현을 조절하는 방법. - 생체내 또는 시험관내에서 환자의 세포 또는 조직내 지질 수송 및 대사 유전자 폴리뉴클레오티드의 기능 및/또는 발현을 조절하는 방법에 있어서,
이 방법은 전술한 세포 또는 조직에 길이가 5 내지 30개 뉴클레오티드의 최소한 한 개의 안티센스 올리고뉴클레오티드를 접촉시키는 것을 포함하며, 여기서 상기 최소한 한 개의 올리고뉴클레오티드는 지질 수송 및 대사 유전자 폴리뉴클레오티드의 천연 안티센스의 역 보체에 최소한 50% 서열 동일성을 가지며, 이러한 접촉에 의해 생체내 또는 시험관내 환자의 세포 또는 조직에서 지질 수송 및 대사 유전자 폴리뉴클레오티드의 기능 및/또는 발현을 조절하는 방법. - 생체내 또는 시험관내에서 환자의 세포 또는 조직내 지질 수송 및 대사 유전자 폴리뉴클레오티드의 기능 및/또는 발현을 조절하는 방법에 있어서,
이 방법은 전술한 세포 또는 조직에 길이가 5 내지 30개 뉴클레오티드의 최소한 한 개의 안티센스 올리고뉴클레오티드를 접촉시키는 것을 포함하며, 여기서 상기 올리고뉴클레오티드는 지질 수송 및 대사 유전자 폴리뉴클레오티드에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드에 최소한 50% 서열 동일성을 가지며, 이러한 접촉에 의해 생체내 또는 시험관내 환자의 세포 또는 조직에서 지질 수송 및 대사 유전자폴리뉴클레오티드의 기능 및/또는 발현을 조절하는 방법. - 생체내 또는 시험관내에서 환자의 세포 또는 조직내 지질 수송 및 대사 유전자 폴리뉴클레오티드의 기능 및/또는 발현을 조절하는 방법에 있어서,
이 방법은 전술한 세포 또는 조직에 지질 수송 및 대사 유전자 안티센스 폴리뉴클레오티드의 천연 안티센스 올리고뉴클레오티드의 일부분을 표적하는 최소한 하나의 안티센스 올리고뉴클레오티드를 접촉시키는 것을 포함하고, 이러한 접촉에 의해 생체내 또는 시험관내 환자의 세포 또는 조직에서 지질 수송 및 대사 유전자 폴리뉴클레오티드의 기능 및/또는 발현을 조절하는 방법. - 청구항 4에 있어서, 지질 수송 및 대사 유전자의 기능 및/또는 발현은 대조군과 비교하여 생체내 또는 시험관내에서 증가되는 방법.
- 청구항 4에 있어서, 최소한 하나의 안티센스 올리고뉴클레오티드는 지질 수송 및 대사 유전자 폴리뉴클레오티드의 천연 안티센스 서열을 표적으로 하는 방법.
- 청구항 4에 있어서, 최소한 하나의 안티센스 올리고뉴클레오티드는 지질 수송 및 대사 유전자 폴리뉴클레오티드의 코딩 및/또는 넌-코딩 핵산 서열을 포함하는 핵산 서열을 표적으로 하는 방법.
- 청구항 4에 있어서, 최소한 하나의 안티센스 올리고뉴클레오티드는 지질 수송 및 대사 유전자 폴리뉴클레오티드의 중첩 및/또는 비-중첩 서열들을 표적하는 방법.
- 청구항 4에 있어서, 최소한 하나의 안티센스 올리고뉴클레오티드는 최소한 하나의 변형된 슈가 모이어티, 최소한 하나의 변형된 뉴클레오시드간 링키지, 최소한 하나의 변형된 뉴클레오티드 및/또는 이의 조합으로부터 선택된 하나 이상의 변형을 포함하는, 방법.
- 청구항 9에 있어서, 하나 이상의 변형은 2'-O-메톡시에틸 변형된 슈가 모이어티, 2'-메톡시 변형된 슈가 모이어티, 2'-O-알킬 변형된 슈가 모이어티, 또는 바이사이클 슈가 모이어티 및 이의 조합으로부터 선택된 최소한 하나의 변형된 슈가 모이어티를 포함하는, 방법.
- 청구항 9에 있어서, 하나 이상의 변형은 포스포로티오에이트, 2'-O-메톡시에틸(MOE), 2'-플루오르, 알킬포스포네이트, 포스포로디티오에이트, 알킬포스포노티오에이트, 포스포르아미데이트, 카르바메이트, 카르보네이트, 포스페이트 트리에스테르, 아세타마이데이트, 카르복시메틸 에스테르, 및/또는 이의 복합으로부터 선택된 최소한 하나의 변형된 뉴클레오시드간 링키지를 포함하는, 방법.
- 청구항 9에 있어서, 하나 이상의 변형은 올리고뉴클레오티드는 펩티드 핵산(PNA), 잠금 핵산 (LNA), 아라비노-핵산 (FANA), 이의 유사체 또는 유도체 및 이들의 조합으로부터 선택된 최소한 하나의 변형된 뉴클레오티드를 포함하는, 방법.
- 청구항 1에 있어서, 최소한 하나의 올리고뉴클레오티드는 서열 번호: 23 내지 263에 제시된 최소한 하나의 올리고뉴클레오티드 서열을 포함하는, 방법.
- 생체내 또는 시험관에서 포유류의 세포 또는 조직내 지질 수송 및 대사 유전자 의 기능 및/또는 발현을 조절하는 방법에 있어서,
이 방법은 상기 세포 또는 조직을 지질 수송 및 대사 유전자 폴리뉴클레오티드의 안티센스 폴리뉴클레오티드에 특이적인 길이가 5 내지 30개 뉴클레오티드의 짧은 간섭 RNA (siRNA) 올리고뉴클레오티드 최소한 하나와 접촉시키고, 이때 최소한 하나의 siRNA 올리고뉴클레오티드는 지질 수송 및 대사 유전자 폴리뉴클레오티드의 안티센스 및/또는 센스 핵산 분자의 최소한 약 5개 연속 핵산의 상보성 서열에 최소한 50% 서열 동일성을 가지며; 그리고 생체내 또는 시험관에서 포유류의 세포 또는 조직내 지질 수송 및 대사 유전자의 기능 및/또는 발현이 조절되는 것을 포함하는, 방법. - 청구항 14에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드는 지질 수송 및 대사 유전자폴리뉴클레오티드의 안티센스 및/또는 센스 핵산 분자에 상보적인 최소한 약 5개 연속 핵산의 서열에 최소한 80% 서열 동일성을 가지는 방법.
- 생체내 또는 시험관에서 포유류의 세포 또는 조직내 지질 수송 및 대사 유전자의 기능 및/또는 발현을 조절하는 방법에 있어서, 이 방법은
상기 세포 또는 조직을 지질 수송 및 대사 유전자 폴리뉴클레오티드의 센스 및/또는 천연 안티센스 가닥의 넌코딩 및/또는 코딩 서열에 특이적인 길이가 약 5 내지 30개의 뉴클레오티드의 최소한 하나의 안티센스 올리고뉴클레오티드에 접촉시키고, 이때 최소한 하나의 안티센스 올리고뉴클레오티드는 서열 번호: 1-7 및 8-22에 제시된 최소한 하나의 핵산 서열에 최소한 50% 서열 동일성을 가지며; 그리고 생체내 또는 시험관에서 포유류의 세포 또는 조직내 지질 수송 및 대사 유전자의 기능 및/또는 발현이 조절되는 것을 포함하는, 방법. - 최소한 하나의 변형을 포함하는 합성, 변형된 올리고뉴클레오티드에 있어서, 이때 최소한 하나의 변형은 최소한 하나의 변형된 슈가 모이어티; 최소한 하나의 변형된 뉴클레오티드간 링키지; 최소한 하나의 변형된 뉴클레오티드; 그리고 이의 조합으로부터 선택되며, 그리고 상기 올리고뉴클레오티드는 정상적인 기준과 비교하였을 때, 지질 수송 및 대사 유전자에 하이브리드되어, 이들의 발현 또는 기능을 생체내 또는 시험관에서 조절하는 안티센스 화합물인, 합성, 변형된 올리고뉴클레오티드.
- 청구항 17에 있어서, 최소한 하나의 변형은 포스포로티오에이트, 알킬포스포네이트, 포스포로디티오에이트, 알킬포스포노티오에이트, 포스포르아미데이트, 카르바메이트, 카르보네이트, 포스페이트 트리에스테르, 아세타아미데이트, 카르복시메틸 에스테르 또는 이의 복합으로 구성된 군으로부터 선택된 뉴클레오티드간 링키지를 포함하는 합성, 변형된 올리고뉴클레오티드.
- 청구항 17에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드는 최소한 하나의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 링키지를 포함하는, 합성, 변형된 올리고뉴클레오티드.
- 청구항 17에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드는 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 링키지의 기본 골격을 포함하는, 합성, 변형된 올리고뉴클레오티드.
- 청구항 17에 있어서, 펩티드 핵산, 잠금 핵산 (LNA), 이의 유사체, 유도체들 및 이의 복합으로부터 선택된 최소한 하나의 변형된 뉴클레오티드를 포함하는 합성, 변형된 올리고뉴클레오티드.
- 청구항 17에 있어서, 포스포로티오에이트, 알킬포스포네이트, 포스포로디티오에이트, 알킬포스포노티오에이트, 포스포르아미데이트, 카르바메이트, 카르보네이트, 포스페이트 트리에스테르, 아세타아미데이트, 카르복시메틸 에스테르 및 이의 복합으로 구성된 군으로부터 선택된 변형된 뉴클레오티드를 포함하는 다수의 변형을 포함하는 합성, 변형된 올리고뉴클레오티드.
- 청구항 17에 있어서, 펩티드 핵산, 잠금 핵산 (LNA), 이의 유사체, 이의 유도체들 및/또는 이의 복합으로부터 선택된 변형된 뉴클레오티드를 다수 포함하는 합성, 변형된 올리고뉴클레오티드.
- 청구항 17에 있어서, 2'-O-메톡시에틸 변형된 슈가 모이어티, 2'-메톡시 변형된 슈가 모이어티, 2'-O-알킬 변형된 슈가 모이어티, 바이사이클 슈가 모이어티 및 이의 조합으로부터 선택된 최소한 하나의 변형된 슈가 모이어티를 포함하는 합성, 변형된 올리고뉴클레오티드.
- 청구항 17에 있어서, 2'-O-메톡시에틸 변형된 슈가 모이어티, 2'-메톡시 변형된 슈가 모이어티, 2'-O-알킬 변형된 슈가 모이어티, 바이사이클 슈가 모이어티 및 이의 조합으로부터 선택된 변형된 슈가 모이어티를 다수 포함하는 합성, 변형된 올리고뉴클레오티드.
- 청구항 17에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드는 지질 수송 및 대사 유전자 폴리뉴클레오티드의 안티센스 및/또는 센스 가닥에 하이브리드되는 최소한 5개 내지 30개 길이의 뉴클레오티드이며, 여기서 상기 올리고뉴클레오티드는 지질 수송 및 대사 유전자 폴리뉴클레오티드의 안티센스 및/또는 센스 코딩 및/또는 넌코딩 핵산 서열의 최소한 약 5개 연속 핵산의 상보 서열에 최소한 약 20% 서열 동일성을 가지는 합성, 변형된 올리고뉴클레오티드.
- 청구항 17에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드는 지질 수송 및 대사 유전자폴리뉴클레오티드의 안티센스 및/또는 센스 코딩 및/또는 넌코딩 핵산 서열의 최소한 5개 연속 핵산의 상보 서열에 최소한 약 80% 서열 동일성을 가지는 합성, 변형된 올리고뉴클레오티드.
- 청구항 17에 있어서, 정상 대조군과 비교하였을 때, 생체 또는 시험관내에서 최소한 하나의 지질 수송 및 대사 유전자 폴리뉴클레오티드에 하이브리드되어, 이의 발현 및/또는 기능을 조절하는 합성, 변형된 올리고뉴클레오티드.
- 청구항 17에 있어서, 서열 번호: 23 내지 263에 제시된 서열을 포함하는 합성, 변형된 올리고뉴클레오티드.
- 하나 이상의 지질 수송 및 대사 유전자 폴리뉴클레오티드에 특이적인 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 조성물에 있어서, 이때 상기 폴리뉴클레오티드는 안티센스 서열들, 상보성 서열들, 대립유전자들, 상동체들, 이소폼, 변이체들, 유도체들, 돌연변이체들, 단편들 또는 이의 조합을 포함하는 조성물.
- 청구항 30에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드는 서열 번호: 23 내지 263에서 제시되는 임의의 하나의 뉴클레오티드 서열과 비교하였을 때 최소한 약 40%의 뉴클레오티드 서열 동일성을 가지는, 조성물.
- 청구항 30에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드는 서열 번호: 23 내지 263에 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 조성물.
- 청구항 32에 있어서, 서열 번호:23 내지 263에 제시된 상기 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 변형 또는 치환을 포함하는, 조성물.
- 청구항 33에 있어서, 하나 이상의 변형은 포스포르티오레이트, 메틸포스포네이트, 펩티드 핵산, 잠금 핵산 (LNA) 분자 및 이의 조합으로부터 선택된, 조성물.
- 최소한 하나의 지질 수송 및 대사 유전자 폴리뉴클레오티드 및/또는 이의 인코드된 산물들과 관련된 질환의 예방 또는 치료 방법에 있어서, 이 방법은
최소한 하나의 지질 수송 및 대사 유전자 폴리뉴클레오티드의 천연 안티센스 서열에 결합하여, 최소한 하나의 지질 수송 및 대사 유전자 폴리뉴클레오티드의 발현을 조절하는 최소한 하나의 안티센스 올리고뉴클레오티드의 치료요법적 효과량을 환자에 투여하고; 그리고
이러한 투여에 의해 최소한 하나의 지질 수송 및 대사 유전자 폴리뉴클레오티드 및/또는 이의 인코드된 산물들과 관련된 질환을 예방 또는 치료하는 것을 포함하는, 방법. - 청구항 35에 있어서, 최소한 하나의 지질 수송 및 대사 유전자 폴리뉴클레오티드와 관련된 질병은
심혈관 질환 또는 장애, 대사 질환 또는 장애 (가령, 당뇨병, 비만, 이상지질혈증, 혈당과다, 과인슐린혈증, 과콜레스테롤혈증 등), 손상된 지질 대사와 연관된 질환 또는 장애, 관상 동맥 질환, 아테롬성동맥경화증, HDL 대사 질환 또는 장애 (가령, 가족성 HDL 결핍 (FHD), Sea-blue 조직구증, Tangier 질환, 물고기 눈 질환 질환, LCAT 결핍, 저 HDL 콜레스테롤혈증 등), 세포 콜레스테롤 및/또는 포스포리피드 항상성과 연관된 질환 또는 장애, 가족성 아밀로이드 신증, 손상된 콜레스테롤 조절과 연관된 질환 또는 장애, 지질 수송 및 대사 유전자 수송물질의 결핍과 연관된 질환 또는 장애, 아포리포단백질 A-I 결핍, 세포에서 비정상적으로 빠른 또는 비정상적으로 느린 콜레스테롤 유출과 연관된 질환 또는 장애, 췌장 베타 세포 기능과 연관된 질환 또는 장애, 당뇨병, 대사 질환 또는 장애, 관절염, 염증, 자가면역 질환 또는 장애, 후천적 면역 결핍 증후군 (AIDS), 염증, 신경 질환 또는 장애, 신경퇴행성 질환 또는 장애, 암, 이상지질혈증, 대사 증후군, 노인성 반점, 대뇌 아밀로이드 맥관병증, 아밀로이드증, 교아종, 아밀로이드 침착과 연관된 질환 또는 장애, 신경섬유 매듭, 융모막암종, 성상세포종, 아밀로이드증, 과다지질혈증, 신형성 변형, 죽상반, 폐색, 전이, 폐 섬유증, 괴사, 쇼크, 흑색종, 유전적 감수성, 건선, 신경교종, 신경병리학, 맥관 질환, 세포 손상, 비-소 세포 폐 암종 (NSCLCs), 지방육종, 면역결핍 질환 또는 장애, 장기 이식 거부, 알러지, 사구체신염, 정맥 혈전증, 병리적 프로세스 또는 백혈병, 골격 질환 또는 장애, 근육 질환 또는 장애, 감염성 유기체와 연관된 질환 또는 장애, 면역 관련된 질환 또는 장애, 신경 복구 및d 마비, 신경내분비 차등, 전신 비-신경병증 아밀로이드증, 아밀로이드 질환, 혈관신생에 의존적인 종양 성장, 혈관신생 증가를 포함하는 증상을 가진 암이 아닌 질환, 가령, 건선, 조숙한 망막증, 맥락막 질환, 신혈관 녹내장, 당뇨성 망막증, 약물 남용, 손상된 인지 기능, 그리고 정상적인 대조군과 비교하였을 때 감소된 척색 파생, ApoE 비정상적 발현, 기능, 활성, 바이러스, 세균, 기생충, 곰팡이와 같은 외부 유기체로 인한 질환 또는 장애 및 이와 유사한 것들로부터 선택되는 방법. - 생체내 투여용 최소한 하나의 올리고뉴클레오티드를 확인하고 선택하는 방법에 있어서, 이 방법은
질병 상태와 연관된 표적 올리고뉴클레오티드를 선택하고,
선택된 표적 폴리뉴클레오티드에 상보적인 또는 선택된 표적 폴리뉴클레오티드에 안티센스인 폴리뉴클레오티드에 상보적인 최소한 5개의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 최소한 하나의 올리고뉴클레오티드를 확인하고;
엄격성(stringent) 하이브리드화 조건하에서 안티센스 올리고뉴클레오티드와 표적 폴리뉴클레오티드 또는 선택된 표적 올리고뉴클레오티드에 안티센스인 폴리뉴클레오티드의 하이브리드의 열용융점을 측정하고; 그리고
수득된 정보에 기초하여 생체내 투여용 최소한 하나의 올리고뉴클레오티드를 선택하는 것을 포함하는, 방법.
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