HU226192B1 - Salmonella vaccine - Google Patents
Salmonella vaccine Download PDFInfo
- Publication number
- HU226192B1 HU226192B1 HU0005010A HUP0005010A HU226192B1 HU 226192 B1 HU226192 B1 HU 226192B1 HU 0005010 A HU0005010 A HU 0005010A HU P0005010 A HUP0005010 A HU P0005010A HU 226192 B1 HU226192 B1 HU 226192B1
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- flagellin
- vaccine
- bacterium
- salmonella
- gene
- Prior art date
Links
- 229940124842 Salmonella vaccine Drugs 0.000 title 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims abstract description 67
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims abstract description 59
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 claims abstract description 37
- 108010040721 Flagellin Proteins 0.000 claims description 76
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 60
- 210000003495 flagella Anatomy 0.000 claims description 48
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 44
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims description 28
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 claims description 27
- 241000293869 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium Species 0.000 claims description 23
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 21
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 16
- 206010039438 Salmonella Infections Diseases 0.000 claims description 11
- 206010039447 salmonellosis Diseases 0.000 claims description 11
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 claims description 9
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 claims description 6
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 6
- 230000037361 pathway Effects 0.000 claims description 6
- 230000008436 biogenesis Effects 0.000 claims description 4
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 4
- 241001467018 Typhis Species 0.000 claims description 3
- 229940124590 live attenuated vaccine Drugs 0.000 claims description 3
- 229940023012 live-attenuated vaccine Drugs 0.000 claims description 3
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 claims description 3
- 229940031551 inactivated vaccine Drugs 0.000 claims description 2
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 claims 1
- 208000022362 bacterial infectious disease Diseases 0.000 claims 1
- 231100000255 pathogenic effect Toxicity 0.000 claims 1
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 claims 1
- 238000000034 method Methods 0.000 abstract description 23
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 abstract description 2
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 abstract 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 abstract 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 abstract 1
- 101000628535 Homo sapiens Metalloreductase STEAP2 Proteins 0.000 description 23
- 102100026711 Metalloreductase STEAP2 Human genes 0.000 description 23
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 18
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 16
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 description 16
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 16
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 12
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 11
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 11
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 11
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 10
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 10
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 10
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 8
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 8
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 8
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 8
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 8
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 8
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 7
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 7
- 239000006161 blood agar Substances 0.000 description 7
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 7
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 7
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 7
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000004520 agglutination Effects 0.000 description 6
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 6
- 230000004584 weight gain Effects 0.000 description 6
- 235000019786 weight gain Nutrition 0.000 description 6
- 101100238784 Salmonella typhimurium (strain LT2 / SGSC1412 / ATCC 700720) mtfA gene Proteins 0.000 description 5
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 5
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 5
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 5
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 5
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 5
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 5
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 5
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 5
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 5
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 5
- GVJHHUAWPYXKBD-UHFFFAOYSA-N (±)-α-Tocopherol Chemical compound OC1=C(C)C(C)=C2OC(CCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)C)(C)CCC2=C1C GVJHHUAWPYXKBD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 4
- 238000000729 Fisher's exact test Methods 0.000 description 4
- 241000208202 Linaceae Species 0.000 description 4
- 235000004431 Linum usitatissimum Nutrition 0.000 description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 4
- 238000013401 experimental design Methods 0.000 description 4
- 210000003608 fece Anatomy 0.000 description 4
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 4
- 244000144977 poultry Species 0.000 description 4
- 235000013594 poultry meat Nutrition 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 4
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 3
- 101001072091 Homo sapiens ProSAAS Proteins 0.000 description 3
- 102100036366 ProSAAS Human genes 0.000 description 3
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 3
- 241000293871 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhi Species 0.000 description 3
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 3
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 244000144980 herd Species 0.000 description 3
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 3
- 230000004899 motility Effects 0.000 description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 3
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 3
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 3
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 3
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 2
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 2
- 102000009016 Cholera Toxin Human genes 0.000 description 2
- 108010049048 Cholera Toxin Proteins 0.000 description 2
- 206010012735 Diarrhoea Diseases 0.000 description 2
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 2
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 2
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 2
- 241001138501 Salmonella enterica Species 0.000 description 2
- 241000607356 Salmonella enterica subsp. arizonae Species 0.000 description 2
- 241000607662 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Abortusequi Species 0.000 description 2
- 241000392514 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Dublin Species 0.000 description 2
- 241001354013 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Enteritidis Species 0.000 description 2
- 241000531795 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Paratyphi A Species 0.000 description 2
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 229930003427 Vitamin E Natural products 0.000 description 2
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 229960001212 bacterial vaccine Drugs 0.000 description 2
- 244000309466 calf Species 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 210000003555 cloaca Anatomy 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 230000001010 compromised effect Effects 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 2
- WIGCFUFOHFEKBI-UHFFFAOYSA-N gamma-tocopherol Natural products CC(C)CCCC(C)CCCC(C)CCCC1CCC2C(C)C(O)C(C)C(C)C2O1 WIGCFUFOHFEKBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 2
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 2
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 2
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 244000000010 microbial pathogen Species 0.000 description 2
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 2
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 2
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 229930182490 saponin Natural products 0.000 description 2
- 150000007949 saponins Chemical class 0.000 description 2
- 235000017709 saponins Nutrition 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 102000003390 tumor necrosis factor Human genes 0.000 description 2
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 2
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 2
- 229940046009 vitamin E Drugs 0.000 description 2
- 235000019165 vitamin E Nutrition 0.000 description 2
- 239000011709 vitamin E Substances 0.000 description 2
- 241000606748 Actinobacillus pleuropneumoniae Species 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 241000272525 Anas platyrhynchos Species 0.000 description 1
- 108700003860 Bacterial Genes Proteins 0.000 description 1
- 231100000699 Bacterial toxin Toxicity 0.000 description 1
- 241000252983 Caecum Species 0.000 description 1
- 241000193403 Clostridium Species 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 241000938605 Crocodylia Species 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 1
- 102100031780 Endonuclease Human genes 0.000 description 1
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 1
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 1
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 1
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 238000000585 Mann–Whitney U test Methods 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 206010030113 Oedema Diseases 0.000 description 1
- 206010048685 Oral infection Diseases 0.000 description 1
- 101710116435 Outer membrane protein Proteins 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 241000286209 Phasianidae Species 0.000 description 1
- 241000276498 Pollachius virens Species 0.000 description 1
- 241000773293 Rappaport Species 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 241000607729 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Abortus Species 0.000 description 1
- 241000607132 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Gallinarum Species 0.000 description 1
- 241000607683 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Pullorum Species 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229920002125 Sokalan® Polymers 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 1
- 238000000692 Student's t-test Methods 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical compound [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 1
- 206010000210 abortion Diseases 0.000 description 1
- 231100000176 abortion Toxicity 0.000 description 1
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 1
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- PNEYBMLMFCGWSK-UHFFFAOYSA-N aluminium oxide Inorganic materials [O-2].[O-2].[O-2].[Al+3].[Al+3] PNEYBMLMFCGWSK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ILRRQNADMUWWFW-UHFFFAOYSA-K aluminium phosphate Chemical compound O1[Al]2OP1(=O)O2 ILRRQNADMUWWFW-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 238000011888 autopsy Methods 0.000 description 1
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 1
- 239000000688 bacterial toxin Substances 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 229960001506 brilliant green Drugs 0.000 description 1
- HXCILVUBKWANLN-UHFFFAOYSA-N brilliant green cation Chemical compound C1=CC(N(CC)CC)=CC=C1C(C=1C=CC=CC=1)=C1C=CC(=[N+](CC)CC)C=C1 HXCILVUBKWANLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 244000309464 bull Species 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 1
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 1
- 210000004534 cecum Anatomy 0.000 description 1
- 239000002962 chemical mutagen Substances 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M coomassie brilliant blue Chemical compound [Na+].C1=CC(OCC)=CC=C1NC1=CC=C(C(=C2C=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=2C=CC(=CC=2)N(CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=C1 NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000007123 defense Effects 0.000 description 1
- 230000018044 dehydration Effects 0.000 description 1
- 238000006297 dehydration reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000029142 excretion Effects 0.000 description 1
- 239000003889 eye drop Substances 0.000 description 1
- 229940012356 eye drops Drugs 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 230000037433 frameshift Effects 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 108091008053 gene clusters Proteins 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 1
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 1
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 1
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 230000009545 invasion Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- FZWBNHMXJMCXLU-BLAUPYHCSA-N isomaltotriose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C=O)O1 FZWBNHMXJMCXLU-BLAUPYHCSA-N 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 1
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 238000007431 microscopic evaluation Methods 0.000 description 1
- 239000002480 mineral oil Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 125000001446 muramyl group Chemical group N[C@@H](C=O)[C@@H](O[C@@H](C(=O)*)C)[C@H](O)[C@H](O)CO 0.000 description 1
- 239000003471 mutagenic agent Substances 0.000 description 1
- 231100000707 mutagenic chemical Toxicity 0.000 description 1
- 230000001338 necrotic effect Effects 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 238000009304 pastoral farming Methods 0.000 description 1
- 230000002688 persistence Effects 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 1
- 238000007692 polyacrylamide-agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 235000015277 pork Nutrition 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 1
- 238000001338 self-assembly Methods 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 235000010356 sorbitol Nutrition 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 1
- 238000001694 spray drying Methods 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 239000000021 stimulant Substances 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011593 sulfur Substances 0.000 description 1
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 1
- 238000012353 t test Methods 0.000 description 1
- 238000009281 ultraviolet germicidal irradiation Methods 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 1
- 239000007762 w/o emulsion Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/02—Bacterial antigens
- A61K39/025—Enterobacteriales, e.g. Enterobacter
- A61K39/0275—Salmonella
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
- A61P1/12—Antidiarrhoeals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/52—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells
- A61K2039/521—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells inactivated (killed)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/52—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells
- A61K2039/522—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells avirulent or attenuated
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/52—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells
- A61K2039/523—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells expressing foreign proteins
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Immunology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Oncology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Description
A leírás terjedelme 14 oldal (ezen belül 3 lap ábra)
HU 226 192 Β1
A találmány tárgyát vakcinában alkalmazható Salmonella baktériumokon alapuló vakcinák képezik, továbbá ilyen baktériumok alkalmazása képezi a vakcinák gyártásában való alkalmazásra.
A találmány szerinti vakcinák előnyösen alkalmazhatók markervakcinákként, azaz hatásukat a vad típusú fertőzésétől meg lehet különböztetni.
A Salmonella nemzetségbe sorolt baktériumok mind az ember, és mind pedig az állatok hírhedt kórokozói. Csak az Egyesült Államokban, a Sa/mone//a-fertőzéstől szenvedő személyek éves száma meghaladja a kétmilliót. A fertőzést legtöbb esetben fertőzött táplálék okozza. A fertőzés legismertebb forrása a tojás (mind a kacsa- és mind pedig a tyúktojás), tojástartalmú termékek és a nem megfelelőképpen hőkezelt baromfi- és sertéshús. E fertőzésekkel szembeni védekezőképesség különösen csecsemőkben, kisgyermekekben, idős személyekben és immunológiailag legyengített („ImmunD compromised) betegekben alacsony. E csoportokban különösen magas a Sa/mone//a-fertőzés okozta éves elhalálozási ráta. Az utóbbi néhány évtizedben a sokkal hatékonyabb nagyüzemi állattenyésztés az állatsűrűség nagymértékű megnövekedéséhez vezetett. Ennek eredményeként, az állatok - és ezzel összefüggésben a fertőzött táplálék - okozta emberi fertőzések száma láthatóan megnőtt. A Salmonella-fertőzés fő forrásának egyértelműen az állatokat tartják. A fertőzés e forrását azonban igen nehéz szabályozni. Először is, egészséges felnőtt állatokban a Salmonella-fertőzés a legtöbb esetben nem okoz súlyos betegséget, így ezek az állatok a baktériumot huzamosabb ideig hordozhatják. Ez idő alatt ürülékükkel a baktériumot szétterjesztik. Ezzel gyakorlatilag lehetetlen a fiatal, sokkal kevésbé ellenállóképes állatok esetében a fertőzést elkerülni. Másodszor, sok Salmonella faj számos, eltérő gazdaállatot képes fertőzni. Néhány Salmonella faj egy specifikus gazdaszervezetben okoz elsődleges fertőzést, míg más Salmonella faj egyáltalán nem fajspecifikus. Mint elsődlegesen fertőző baktérium, a S. typhi és S. paratyphi gyakran hozható kapcsolatba emberi fertőzéssel. A S. typhi hasmenést (diarét), és ennek eredményeként dehidratációt okoz. E fertőzés a trópusi területeken gyakran előfordul. A S. dublin a szarvasmarhával - különösen a fiatal borjakkal - hozható kapcsolatba, ahol az esetek több mint 50%-ában letális fertőzést okoz. A S. abortus equi lóban, a S. abortus ovi pedig juhokban okoz vetélést. A S. choleraesuis a letális diaré okozója malacokban. A S. typhimurium és S. enteritldis a baromfiak között, a sertésekben, a szarvasmarha-állományban és rágcsálóban salmonellosist okoz. A S. arizonae pulykákat betegít meg. A táplálékként nem hasznosított állatok, mint például a hüllők, is szenvednek Salmonella - például S. arizonae - fertőzéstől.
Hatékony Sa/mone//a-vakcinákra egyértelmű szükséglet mutatkozik. Vakcinákra van szükség az emberek védelmére, az egyik személyről a másikra történő Salmonella-fertőzés átvitele ellen. Vakcinák szükségesek az emberek élelmiszer-eredetű Salmonella-fertőzés elleni védelmére is. Végül vakcinákra van szükség az állatok Salmonella-fertőzés elleni védelmére is.
A kereskedelemben jelenleg számos, különböző Salmonella faj elleni vakcina érhető el. Annak ellenére, hogy ezek vakcinázási szempontból néha hatékonyak, azonban közös hátrányos tulajdonsággal bírnak. Miután e vakcinák ugyanolyan antigénterhelést jelentenek, mint a vad típusú baktérium, általában olyan antitestpopulációt indukálnak, amely a vad típusú baktérium általi fertőzésnek felel meg. Ezért, Salmonella-pozitív állat szérumában lévő antitestek analízise nem teszi világossá, hogy az állat miért pozitív. A pozitív eredményt okozhatja a vakcinálás is, de jó az esélye annak is, hogy a fertőzés kiváltója valamilyen virulens, a szabadból származó törzs. így, ha egy állat Salmonellapozitívnak bizonyult, akkor azt fertőzöttnek tekintik. Ezért úgynevezett markervakcina előállítása lenne kívánatos. A markervakcina olyan vakcina, amelyet a vad típusú fertőzéstől meg lehet különböztetni, például a vad típusú fertőzés által indukált antitestpaneltől különböző antitestpanel alapján. Ilyen eltérő antitestpanel akkor indukálódik, amikor egy immunogén fehérje a vad típusú baktériumban jelen van, de a vakcinálásra alkalmazott mutánsból hiányzik, így a gazdaszervezet a vakcinálást követően az említett fehérje ellen antitestet nem termel.
Egy markerantigénnek legalább a következő jellemzőkkel kell rendelkeznie:
a baktérium életképességének súlyos károsítása nélkül lehessen deletálni, antitesteket indukáljon, a baktérium immunogenitásában ne vegyen részt, hiánya hozzájáruljon a baktérium gyengítéséhez (attenuációjához).
Alkalmas antigénként minden ismert Salmonellaantigén számításba jöhet. Ilyen ismert antigén a flagellum (ostor), amely a S. pullorum és S. gallinarum alfajok kivételével az összes vad típusú Salmonella fajban megtalálható. Vad típusú formában flagellummal rendelkező Salmonella fajokra példák a következők: S. typhimurium, enteritidis, choleraesuis, dublin, typhi, abortus ovi, abortus equi, paratyphi A és B, derby, hadar, heidelberg, agona és arizona. A flagellumok a sejt felszínéből kinyúló hosszú struktúrák, amelyek fontos szerepet játszanak a mozgékonyságban és bizonyos gazdasejtekbe történő betörésben (invázióban). A flagellumok a flagellinnek nevezett fehérjék hosszú polimerjeiből állnak. Ismert, hogy a flagellinek magas antitestszintet indukálnak. Az is ismert, hogy a flagellumok hiánya jelentősen nem befolyásolja a baktérium életképességét a gazdasejten kívül: gyakorlatilag minden Salmonella fajnak léteznek flagellumhiányos mutánsai és ezek képesek in vitro körülmények között szaporodni. Azonban, alkalmas markerként Salmonella flagellumfehérjéket még eddig nem vették figyelembe, mivel e fehérjék nem, vagy csak részben tesznek eleget a markerekkel szemben támasztott négy feltételnek:
- bár nem szükségesek a gazdaszervezeten kívüli túléléshez, fontos szerepet játszanak a baktérium túlélésben és perzisztenciában a gazda - immunitásindukálásban részt vevő - makrofágjaiban [Methner és Barrow, Béri. Münch. Tierartzl.
HU 226 192 Β1
Wschr. 110, 391-396 (1997); Weinstein és munkatársai, Infect. Immun. 46, 819-825 (1984)],
- jelentős mértékben részt vesznek a baktérium immunogenitásában; ez az oka annak is, hogy e proteineket rövid heterológ aminosavszekvenciáknál célba juttatására szállítófehérjeként alkalmazzák [Joys, SAAS Bulletin: Biochem. Biotech. 4, 56-59 (1991); Newton és munkatársai, Science 244, 70-72(1989)],
- hiányuk az attenuációhoz nem járul hozzá [Lockman és Curtiss, Infect. Immun. 58, 137-143 (1990); Methner és Barrow, Béri. Münch. Tierartzl. Wschr. 110, 391-396 (1997)],
- a flagellummal bíró Salmonella baktérium gátolja más, flagellumos Salmonellák kötődését.
A flagellumát elvesztett Salmonella baktérium gátló hatása más, flagellummal bíró Salmonellák kötődésével szemben azonban csökken, növelve ezzel a Salmone//a-fertőzés össz-szintjét [Methner és Barrow, Béri. Münch. Tierártzl. Wschr. 110, 391-396 (1997); Weinstein és munkatársai, Infect. Immun. 46, 819-825 (1984)].
Ezen összetett okokból Sa/mone//a-vakcinákhoz a flagellumot alkalmas, deletálható markerantigénként sohasem vették számításba.
Bár a GB 1109179 sz. szabadalmi irat leír olyan, feltételezett vakcinákat, amelyek flagellinmentes, inaktivált Salmonella typhi vagy S. paratyphi baktériumokon alapulnak, egy évtizeddel később az egyik feltaláló, Anderson felismerte és Μ. H. Wahldannal és munkatársaival együtt publikálta, hogy ezeket a készítményeket nem lehet Sa/mone//a-fertőzéssel szemben védő vakcináknak tekinteni [Wahldan Μ. H. és munkatársai, Bull World Health Organ 52(1), 69-73. old. (1975)]. Továbbá Wahldan és munkatársai ezen későbbi publikációjában kifejezetten hangsúlyozták a flagellummal bíró baktériumok jelentőségét vakcinákban.
Az általános hipotézissel szemben most meglepő módon úgy találtuk, hogy a flagellumok hiánya nincs hatással a Salmonella vakcinálási képességére. Ez különösen meglepő annak a ténynek a tükrében, hogy vad típusú Salmonellával fertőzött állatokban nagy mennyiségű, a flagellumok ellen termelődött antitestet találtunk, mely bizonyítja a flagellum antigén hatását.
A találmány szerinti megoldás kidolgozása során célunk az volt, hogy elsőként állítsunk elő olyan, a Salmonella nemzetségbe tartozó, vad típusú formájában flagellumokat hordozó baktériumot, amely többé nem képes a flagellum, illetve flagellumok antigéndeterminánsai közül legalább egy ellen antitesteket indukálni, illetve, hogy e baktériumot emberek és állatok védelmére szolgáló, salmonellosis elleni vakcinában alkalmazzuk.
A flagellinek olyan, körülbelül 500 aminosavból álló proteinek, melyek számos antigéndeterminánst tartalmaznak, azaz a flagellinen számos olyan régió található, amely ellen a gazdaszervezetben antitestek termelődnek. Ezeket az antigéndeterminánsokat T. M. Joys már azonosította és lokalizálta [Joys, SAAS Bulletin: Biochem. Biotech. 4, 56-59 (1991)]. A találmány szerinti megoldás céljaira alkalmas baktériumként, amely már nem képes a flagellum, illetve flagellumok antigéndeterminánsai közül legalább egy ellen antitesteket indukálni, olyan baktériumot vettünk számításba, amely nem tartalmaz flagellint vagy olyan flagellumot, amelyen az összes antigéndetermináns továbbra is megtalálható. Nem szükséges az összes antigéndeterminánst eltávolítani; elégséges csak az egyik antigéndeterminánst deletálni. Szeropozitív állatok szérumában, az antitesteknek ezen antigéndeterminánsra történő szűrésével különbséget tehetünk a markervakclnával kezelt és a vad típussal fertőzött állatok között. Ilyen antitesteket nem találhatunk a vakcináit állatokban, mivel ezek csak a természetes módon fertőzött állatokban fordulhatnak elő. A szűrés rutinszerűen, könnyen elvégezhető valamilyen egyszerű diagnosztikai eszköz alkalmazásával a következőkben leírtak alapján.
Már sok ismerettel rendelkezünk a flagellin szintézisével és az azt követő, flagellumokká történő érési folyamatról [például: Escherícia coli and Salmonella typhimurium. 10. fej., Flagella and motility. szerk.: Neidhardt és munkatársai, 2. kiadás, ISBN 1-55581-064-5 (1996); Macnab, R. M., Annu. Rév. Génét. 26, 131-158 (1992)]. A flagellum bioszintézise nagyszámú gén összehangolt működését igényli. E gének nemcsak a flagellint kódoló gének, hanem emellett nagyszámú gén vesz részt a flagellum és a flagelláris motor szintézisében. A találmány szerinti baktériumokat elméletileg két úton lehet előállítani. Először, egy vagy több antigéndetermináns mutációval történő megváltoztatására a flagellinproteint kódoló génen mutációkat végzünk. Másodszor, mutációkat végezhetünk a flagellum biogenezisében részt vevő egy vagy több génen. Ez megakadályozza a flagellin vagy akár az egész flagellum bioszintézisét, és sok esetben akár a flagellinnek a bakteriális membránon történő transzportját is. Abban az esetben, ha nem jönnek létre flagellumok, a flagellumban a flagellin specifikus önszerveződése (folding) által meghatározott antigéndeterminánsok hiányozni fognak. Ha a flagellin membránon keresztül történő transzportja nem történik meg, azaz a flagellin a baktérium belső terében marad, a flagellin ellen nem indukálódnak antitestek. A mutáció lehetséges célpontja lehet minden olyan, a technikában ismert gén vagy génklaszter, amely részt vesz a flagellum összeszerelésében és exportjában, azaz például a morfológiai összeszerelési útvonalban (Morphological assembly pathway) és a flagellumspecifikus exportálási útvonalban (Flagellumspecific export pathway). Ezek mindegyikének mutációja olyan baktériumok keletkezéséhez vezet, amelyből a flagellin vagy legalábbis a flagellumok hiányoznak. A tisztánlátás kedvéért, a továbbiakban a „flagelláris biogenesis-útvonalak kifejezésen a flagellumok szintézisének teljes folyamatában részt vevő összes útvonalat értjük.
Ezért, a találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint, a flagelláris biogenesis-útvonal valamely génjén történt mutáció következtében a baktérium nem képes a flagellin vagy a flagellumok antigéndeterminánsai közül legalább egy ellen antitesteket indukálni.
HU 226 192 Β1
Gyakorlati szemszögből nézve, kívánatos lehet azonban az, hogy az egész flagellingént, vagy annak egy szakaszát deletáljuk a vakcinaként alkalmazandó baktériumból, egyszerűen úgy, hogy a flagelláris proteint kódoló gént deletáljuk. Különböző Salmonella fajok flagelláris proteinjeit kódoló gének ismertek. E gének szoros rokonságban vannak egymással, ezért jelentős mértékben homológok. Flagellingéneket már leírtak például a Salmonella enterica [Li és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91., 2552-2556 (1994)], Salmonella enteritidis [Selander és munkatársai, J. Bacteriol. 174, 3587-3592 (1992)], Salmonella dublin [Masten és Joys, J. Bacteriol. 175, 5359-5365 (1993)], Salmonella typhimurium [deVries és munkatársai, Appl. Environm. Microbiol. 64, 5033-5038 (1998)], és Salmonella abortus equi [Hanafusa és munkatársai, Mól. Gén. Génét. 236, 260-266 (1993)] fajokból. Újonnan leírt Salmonella fajok flagellingénjeit, az összes létező és ismert Salmonella flagellingének között fennálló homológia alapján könnyen meg lehet találni: standard hibridizációs technika elegendő a flagellingén lokalizációjához.
Vad típusú, flagellumot hordozó Salmonella baktérium két flagellingént tartalmaz. E két gén közül csak az egyik kapcsolódik be, azaz termel flagellint bármilyen meghatározott időpillanatban. A flagelláris fázisvariációnak nevezett mechanizmusnak köszönhetően az időtartamot tekintve 103-105 generáció váltakozását követően a gének szerepet cserélnek, azaz a nem expresszált gén fog expresszálódni és vice versa [például: Eschericia coli and Salmonella typhimurium. 10. fej., Flagella and motility. szerk.: Neidhardt és munkatársai,
2. kiadás, ISBN 1-55581-064-5 (1996)]. Abból a célból, hogy meggátoljuk a találmány szerinti baktériumtörzseket abban, hogy bizonyos számú generáció után flagellint kezdjenek el expresszálni, mindkét flagellingént működésképtelenné kell tenni. Amennyiben viszont a fáziskapcsoló mechanizmust tesszük működésképtelenné elég, ha csak az éppen abban az időszakban expresszálódó flagellingént ütjük ki („knock out”).
Működésképtelennek az olyan gént nevezzük, amely a továbbiakban flagellint nem kódol. Ez lehet például olyan gén, amelynek kódolószekvenciájából egy - például antigéndeterminánst - kódoló részt eltávolítottunk.
A flagellum bioszintézisben részt vevő flagellinvagy más ismert gén működésképtelenné tétele történhet klasszikus eljárások alkalmazásával. Ilyen eljárás például a vad típusú, flagellumokat termelő baktérium mutagénekkel (például bázisanalógok), UV-besugárzással, illetve hővel történő kezelése [Anderso, Mutagenesis, Methods in cell. biology 48, 31-58, szerk.: Epstein, H. F. és Shakes, D. C.]. Különböző baktériumok (ahol a vad típusnak van flagelluma) flagellumhiányos mutánsainak előállítására szolgáló más eljárásokat már többen leírtak [Liu és munkatársai, Infect. Immun. 56, 1967-1973 (1988); Haas és munkatársai, Mól. Microbiol. 8, 753-760 (1993); Gráf és munkatársai, J. Bacteriol. 176, 6986-6991 (1994)].
A flagellum meglétének vagy hiányának fénymikroszkópos analízisével a flagellumhiányos baktériumokat könnyen lehet szelektálni. Az olyan baktériumokat, amelyekben a flagellinnek, illetve a flagellumoknak legalább egy antigéndeterminánsa hiányzik, a flagellin vagy a flagellum ellen előállított monoklonális antitestekkel végzett kötődési vizsgálattal lehet szelektálni. Ilyen antiflagellum vagy antiflagellin monoklonális antitestek a standardtechnikák szerint előállíthatok, például a technikában ismert eljárással, beltenyésztett egerek flagellumokkal történő immunizálásával [Kohler és Milstein, Natúré 256, 495—497 (1975)]. Az így előállított monoklonális antitesteket mutáns baktériumokkal végzett kötési vizsgálatban alkalmazhatjuk. Az olyan baktériumok, amelyek nem kötődnek a specifikus monoklonális antitesthez, azok a baktériumok melyekből a flagellin vagy a flagellum legalább egy antigéndeterminánsa hiányzik.
A klasszikus mutációs technikákkal okozott mutációk természete ismeretlen. A mutáció lehet pontmutáció, amely véletlenül visszaalakulhat a vad típusba (ez azonban nem valószínű, hogy megtörténik). Ezért inkább a transzpozonmutagenezis a megfelelő választás. Transzpozonmutagenezissel végzett mutáció a technikában jól ismert mutageneziseljárás, amely a mutációt a kromoszóma meghatározott helyére irányítja.
A rekombináns DNS technológia lehetővé teszi azt, hogy a mutáció beillesztése ne véletlenszerűen, hanem előre kiválasztott helyre történjék. Ilyen mutáció lehet inzerció (beillesztés), deléció (törlés), egy nukleotid helyettesítése egy másikkal, illetve ezek kombinációja, azzal az egyetlen kikötéssel, hogy a mutációval megváltoztatott gén a továbbiakban ne kódoljon működőképes flagellint. Ilyen mutációt például bizonyos számú bázispár deléciójával lehet végrehajtani. Még az olyan kisméretű deléciók, mint például 10 bázispár hosszú szakaszok törlése, is képes a flagellint funkcionálisan elrontani. Már egyetlen bázispár deléciója is elvezethet a flagellin funkcionalitásának elvesztéséhez, mivel az ilyen mutáció eredményeként létrejött bázispárok a továbbiakban nem a helyes leolvasási keretben helyezkednek el. Minden egyes, hárommal nem osztható bázispár-deléció vagy inzerció leolvasási keret eltolódást okoz. Előnyösebben hosszabb, például 100 bázispár hosszúságú szakaszt távolítunk el. Még előnyösebben a teljes flagellingént deletáljuk. Könnyen belátható, hogy különösen az olyan mutációk, amelyek stopkodont illesztenek be a nyitott leolvasási keretbe, illetve mutációk, amelyek a nyitott leolvasási keretben kereteltolódást okoznak igen alkalmasak arra, hogy olyan törzshöz jussunk, amely flagellint többé nem kódol. Az olyan flagellingén előállítására, melyből egy vagy több specifikus antlgéndetermináns hiányzik, az irányított mutagenezis eljárást választottuk. A Joys által készített antigéndetermináns-térkép [Joys, SAAS Bulletin: Biochem. Biotech. 4, 56-59 (1991)] alapján, készíthetők olyan mutáns flagellingének, amelyekből egy vagy több specifikus antigéndeterminánst eltávolítunk. A flagellin-negatív mutánsok előállítására alkalmazott mindegyik rekombináns DNS-módszer jól is4
HU 226 192 Β1 mert standardmódszer. A mutánsok előállítása tartalmazza a flagellingén klónozását, a génszekvencia irányított mutagenezissel végzett módosítását, restrikciós enzimmel történt emésztés után végzett a religációt vagy valamilyen, PCR-en alapuló eljárást, majd ezután a vad típusú flagellingén helyettesítését a mutáns génnel (allélcsere vagy allélszubsztitúció). Standard rekombináns DNS-módszerek, mint például a flagellingén klónozása plazmidba, a gén emésztése restrikciós enzimmel, az azt követő endonukleázzal történő kezelés, religáció és a gazdatörzsben történő homológ rekombináció, mind ismert technikák és le vannak írva például a Maniatis/Sambrook kézikönyvben (Molecular cloning: a laboratory manual, szerk.: Sanbrook és munkatársai, ISBN 0-87969-309-6). Irányított mutagenezist lehet végezni, például in vitro irányított mutagenezissel a Transformer® Kit (Clontech) alkalmazásával. PCRtechnikákat alaposan leírnak a Dieffenbach és Dreksler, PCR-primers, a laboratory manual, ISBN 087969-447-5 (1995) című könyvben.
Ezért, a találmány egy előnyösebb megvalósítási módja szerint a találmány tárgyát olyan baktérium képezi, amely a flagellingénen bekövetkezett mutáció következtében nem képes flagellint expresszálni.
Legelőnyösebben, a baktériumokat a S. typhimurium, enteritidis, choleraesuis, dublin, typhi, abortus ovi, abortus equi, paratyphi A és B, derby, hadar, heidelberg, agona és arizonae nemzetségeket tartalmazó csoportból választjuk.
A találmány szerinti megoldás kidolgozása során másik célunk az volt, hogy elsőként állítsunk elő az emberek és állatok védelmére alkalmas, salmonellosis elleni markervakcinát. A találmány szerinti vakcina jellemző tulajdonsága, hogy a fent definiált baktériumot, és gyógyászati szempontból elfogadható vivőanyagot tartalmaz. A találmány szerinti vakcina elsődleges előnye az, hogy az ezzel vakcináit emberek és állatok megkülönböztethetők mind a nem vakcináit emberektől és állatoktól, mind pedig - antitestpaneljük alapján - a vad típusú Salmonellával fertőzött emberektől és állatoktól.
A találmány szerinti vakcinák lehetnek élő, legyengített (attenuált), vagy pedig inaktivált formában. Mindkét esetben, a flagellumok vagy a flagellin legalább egy antigéndeterminánsának hiánya a vakcinálást követően olyan antitestpanelt eredményez, amely könnyen megkülönböztethető a vad típusú fertőzés által indukált paneltől. Az élő vakcinánál előnyösebbek az inaktivált vakcinák, miután ez utóbbiak belső tulajdonsága, hogy biztonságosak. Ezért, a találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint, a találmány tárgyát olyan vakcina képezi, amelyben a baktérium inaktivált formában van jelen.
A találmány szerinti, Salmonalla baktériumon alapuló vakcina azonban előnyben van a többi, inaktivált baktériumot tartalmazó vakcinával szemben, mivel jobban utánozza a természetes fertőzést, és így jobban indukálja az immunrendszert. Ezenfelül, e vakcinák további jelentős előnyökkel rendelkeznek. Az élő, legyengített vakcinák kifejlesztése általában bonyolult és időigényes. Emellett, az attenuálás fokának finombeállítása komplex folyamat: míg a magas fokú virulencia betegséget okoz, addig az alacsony fokú virulencia nem indukál elégséges mértékű védelmet. Meglepetésünkre, a találmány szerinti vakcinák, ezek flagellumokat hordozó megfelelőivel összehasonlítva, a virulenciát illetően nem mutatnak jelentős eltéréseket. Más szavakkal, a flagellingén eltávolítása nem változtatja meg jelentősen az attenuáció szintjét. Ez az a nem várt előny, ami miatt mind a jövőben kifejlesztésre kerülő, mind pedig a bevált létező élő, legyengített vakcinákban felhasználható Salmonella törzsek alkalmazhatók a találmány megvalósítása során, mihelyt valamely törzset a flagellin vagy a flagellumok legalább egy antigéndeterminánsa elleni antitest indukálásra képtelenné tesszük. Ezért, a találmány egy másik előnyös megvalósítási módja szerint, a találmány szerinti vakcinák élő, legyengített baktériumokat tartalmaznak.
Miután adott az, hogy mind kedvtelésből, mind pedig háziállatként tartott állatoknak manapság nagy mennyiségű vakcinákat adagolnak, egyértelmű, hogy több vakcina kombinált alkalmazása volna kívánatos, ha másért nem, a vakcinálás költségeinek csökkentése miatt. Ezért nagyon előnyös más patogén mikroorganizmusok vagy vírusok kiválasztott antigénjeit kódoló, heterológ gének rekombináns hordozójaként élő, legyengített vakcinákat alkalmazni. Az ilyen rekombináns hordozók előnye, hogy az immunitás egyidejűleg két vagy több betegség ellen indukálódik. Élő, legyengített baktériumok alkalmazása a találmány szerinti vakcinában, heterológ gének számára igen alkalmas hordozót szolgáltat. Elméletileg, ilyen heterológ géneket be lehet illeszteni a bakteriális genom bármelyik nem nélkülözhetetlen helyére.
Ezért, a találmány tárgyát képezik olyan, a találmány szerinti baktériumok, amelyekbe heterológ gént illesztünk. Ahogyan fent említettük, ilyen heterológ gén lehet például olyan gén, amely más patogén mikroorganizmusok vagy vírusok kiválasztott antigénjét kódolja. Ilyen gén származhat például patogén herpeszvírusok (azaz a herpeszvírusok strukturális proteinjeit kódoló gének), retrovírusok [például a gp160 burok („envelop”) protein], adenovírusok és hasonlók közül.
Heterológ génhez patogén baktériumokból is hozzájuthatunk. Igen alkalmas bakteriális heterológ gének, például a bakteriális toxinok - mint például Actinobacillus pleuropneumoniae toxinok, Clostridium toxinok -, a külső membránfehérjék és hasonlók.
Egy másik lehetőség olyan gén beillesztése, amely gén az immunrendszert beiindítja, mint például interleukin, TNF (tumor necrosis factor), interferon, vagy más, az immunrendszer szabályozásában részt vevő gén.
A flagellingén beillesztési helyként történő alkalmazásának megvan az az előnye, hogy a heterológ gén beillesztéséhez nem szükséges új beillesztési helyet találni, a beillesztés eredményeként egyben a flagellingén is inaktiválódik, és az újonnan bevitt gén expresszálódhat (a homológ bakteriális génekkel összhangban). Ilyen rekombináns hordozókat rutinszerűen,
HU 226 192 Β1 standard molekuláris biológiai eljárásokkal - mint például allélcsere - lehet konstruálni.
így, a találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint a heterológ gént a flagellingénbe illesztjük. A heterológ gén a flagellingénbe bárhová beilleszthető, illetve beilleszthető a flagellingén helyére, miközben a flagellingént részlegesen vagy teljesen deletáljuk.
A találmány szerinti vakcina, a fent leírt baktériumon kívül, gyógyászatilag elfogadható vivőanyagot is tartalmaz. Ilyen vivőanyag lehet akár víz is, de tartalmazhatja például azt a folyadékot, amiben a baktériumokat tenyésztettük. Egyéb alkalmas vivőanyag például valamilyen, fiziológiai sók megfelelő koncentrációját tartalmazó oldat.
Az adagolásra alkalmas dózis változhat a kor, a tömeg és a vakcinálásra kerülő állat, az adagolás módja és a patogén (ami ellen vakcinálunk) függvényében, A vakcina a baktérium bármilyen, immunválasz kiváltására elégséges, dózisát tartalmazhatja. Például a 103tól a 1O10 baktériumot tartalmazó dózistartomány igen alkalmas.
Esetleg, a vakcinához hozzá lehet adni egy vagy több, adjuváns hatású vegyületet. Az adjuvánsok az immunrendszer nemspecifikus serkentői, melyek fokozzák a gazdaszervezet által a vakcinára adott immunválaszt. A technikában ismert adjuvánsok a Freund-féle komplett és inkomplett adjuváns, E-vitamin, nemionos blokkpolimerek, muramilpeptidek, ISCOM-ok (immuné stimulating complexes, immunstimuláns komplexek, vö. például az EP 109942 európai szabadalmi irat), szaponinok, ásványi olajok, zöldségolajok, és Carbopol. A nyálkahártyán keresztül történő alkalmazásra különösen alkalmas adjuváns például az E. coli-eredetű hőérzékeny toxin (LT), vagy a Cholera toxin (CT). Egyéb alkalmas adjuváns például az alumínium-hidroxid, alumínium-foszfát vagy az alumíniumoxid, olajos emulziók (például Bayol F® vagy a Marcol 52®), szaponinok vagy E-vitamin szolubilizátumok.
Ezért a találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint, a találmány szerinti vakcina adjuvánst is tartalmaz.
További példák, a találmányban alkalmazható, gyógyászatilag elfogadható vivőanyagra vagy hígítóanyagra a következők lehetnek: SPGA, szénhidrátok (például szorbitol, mannitol, keményítő, szacharóz, glükóz, dextrán), fehérjék, mint például albumin vagy kazein, fehérjét tartalmazó hatóanyagok, mint például borjúeredetű szérum, vagy lefölözött tej, és különböző pufferek (például foszfátpuffer). Amennyiben a vakcinához stabilizálószert adunk, a vakcina különösen alkalmas Iiofilizálásra vagy porlasztásos szárításra.
Ezért a találmány egy előnyösebb megvalósítási módja szerint, a találmány szerinti vakcina liofilizált vagy befúvásos szárítással szárított állagú.
A találmány szerinti vakcinát emberekbe vagy állatokba intranazálisan (sprayként), intradermálisan, szubkután, orálisan (aeroszolként), vagy intramuszkulárisan lehet adagolni. Baromfitenyészetekben, ezenfelül, még a szárnyredőkön vagy szemcseppként történő adagolás is alkalmas.
A találmány egy másik megvalósítási módja szerint, a találmány tárgyát képezi a találmány szerinti baktérium alkalmazása az emberek és állatok Salmonella baktériummal történő fertőzése, illetve a fertőzés patológiai hatásai elleni védelemre szolgáló vakcina gyártása.
A találmány tárgyát képezi a találmány szerinti vakcina előállítására szolgáló eljárás is. Ilyen eljárások a találmány szerinti baktériumok, illetve gyógyászati szempontból elfogadható vivőanyag összekeverését tartalmazzák.
A Salmonella flagellinje, vagy flagelluma elleni antitestek jelenlétének/hiányának szűrésére szolgáló diagnosztikai teszt lehet például valamilyen egyszerű ELISA teszt, amelyben az ELISA lemez lyukainak falát flagellumokkal, vagy tisztított flagellinnel, illetve a flagellin egy antigén-tulajdonságú fragmentumát tartalmazó valamilyen rövid polipeptiddel vonjuk be. Előbb a tesztelni kívánt, emberekből vagy állatokból származó szérumot inkubáljuk az ELISA lemezen, majd ezt követi valamilyen jelzett, a releváns emberi vagy állati eredetű antitest elleni antitesttel történő inkubáció, amely kimutatja a flagellin elleni antitestek jelenlétét vagy hiányát.
A diagnosztikai tesztrendszer másik példája, hogy például a flagellint tartalmazó Western-blotot a tesztelni kívánt, emberi vagy állati eredetű szérummal inkubáljuk, majd ezután a blotot analizáljuk.
A Salmonella-eredetQ flagellin elleni antitestek kimutatására szolgáló diagnosztikai teszt előnyösen olyan készlet (kit) formájában van, amely tisztított flagellint tartalmaz. A flagellint például valamilyen alkalmas oszlopon végzett, standard proteinelválasztási eljárásokkal tisztíthatjuk. Másik lehetőség PAAGE-gélen történő elválasztás után végzett Western-blotolás. Mivel a Western-bloton a flagellin, más Salmonella proteinsávoktól elkülönült, specifikus csíkot alkot, így tisztítottnak tekintjük. Emellett, a tisztított proteint flagellint kódoló nukleinsavszekvenciák expresszálásával is előállíthatjuk.
Elméletileg, egy ilyen diagnosztikai tesztrendszer a legegyszerűbb módon a tisztított teljes flagellin, fent leírtak szerinti alkalmazásával kivitelezhető. Emellett, nagyon jól lehet a flagellinnek csak egy bizonyos részét alkalmazni, azzal a kikötéssel, hogy az alkalmazott flagellinfragmentum tartalmazza a protein valamelyik antigéndeterminánsát. Természetéből adódóan, a flagellin összes antigéndeterminánsa antitesttermelést indukál. Ezért, valamelyik flagellinfragmentum, ha csak a flagellin egyetlen antigéndeterminánsát tartalmazza, képes az antiflagellin antitesteket kötni.
Valamilyen, a nem fertőzött, fertőzött és vakcináit emberek és állatok szérumának megkülönböztetésére alkalmas teszt tartalmaz például flagellinnel bevont „A” lyukat, és más Salmonella-eredetű, immunogén tulajdonságú anyaggal, vagy esetleg komplett Salmonella sejtekkel bevont „B” lyukat. Az olyan szérum, amely „A” lyukkal és „B” lyukkal is reagál, természetes fertőzést vagy klasszikus vakcinával történt vakcinálást jelez, míg csak a „B lyukkal reagáló szérum azt jelzi, hogy a vizsgált állatot a markervakcinával vakcinálták.
HU 226 192 Β1
Példák
1. példa
Kémiai mutagenezishez kiindulási anyagként Salmonella typhimurium STMP törzset - olyan legyengített törzs, amelyet élő vakcinaként baromfiakon és sertéseken már teszteltek, és amely jó szintű védelmet biztosított - alkalmaztunk.
Kémiai mutagenezis
S. typhimurium STMP törzset véragar táptalajon tenyésztettünk és pozitív O-antigén B-csoportú agglutinációra és H-antigén 2-es típusú agglutinációra vizsgáltunk. Egy telepet LB-tápközegbe oltottunk és 20 órán keresztül, 37 °C-on, levegőztetés mellett inkubáltuk. Tizenkét órás (egy éjszaka) kultúra 10 μΙ-ét 10 ml LB-tápközegben (3 kultúra) felhígítottuk és 6 órán keresztül, 37 °C-on, levegőztetés mellett, inkubáltuk addig, amíg a tenyészet elérte a 0,5 OD-t 600 nm-en mérve. A tenyészetből az életképes baktériumok számának meghatározására mintát vettünk. A három 10 ml-es tenyészet mindegyikéhez 100-100 μΙ trioxalent (kémiai mutagén a Sigma cégtől, 3 mg/ml DMSO-ban oldva) adtunk és a szuszpenziót 10 cm átmérőjű Petri-csészébe töltöttük. A szuszpenziót UV fénnyel (Transilluminator UVP, 365 nm hullámhossz) 5, 10, illetve 15 percig, 20 cm távolságról besugároztuk. A szuszpenzió 10 μΙ-ét 10 ml, 0,9%-os NaCIoldatba vittük át, amelyből 1/10 arányú hígításokat készítettünk és 100 μΙ-t véragar lemezekre lemezeltünk ki a baktériumok túlélési rátájának meghatározására a mutagenizált tenyészetekben. Olyan tenyészeteket, ahol a túlélési ráta megközelítőleg 3% és 20% volt, 100 ml LB-tápközegben, 600 nm-en mért 0,5 OD eléréséig szaporítottuk. A baktériumokat centrifugálással gyűjtöttük össze, 5 ml LB-tápközegben felszuszpendáltuk és 30%-os glicerinben, -70 °C-on tároltuk.
Mozgásképtelen, flagellumait elvesztett mutánsok szelektálása
A glicerines törzsoldatból a mutagenizált baktériumokat (3%-os túlélés, független mutánsok száma 5000 és 10 000 között) törzsoldatonként 3-3 véragarlemezre oltottuk. A baktériumokat LB-tápközegbe gyűjtöttük és a baktérium koncentrációt 600 nm mért 2,17 értékre állítottuk be. Hat, 10-szeres hígítást készítettünk LB-tápközegben, majd 50 μΙ H2-antiszérumot (Difco) adtunk 450 μΙ baktériumszuszpenzióhoz. A H-antiszérummal végzett szelekciós lépést abból a célból vezettük be, hogy a mutánsokat tartalmazó szuszpenziót a flagellumoktól mentes baktériumokra nézve feldúsítsuk. E szuszpenziót 6 órán keresztül, 37 °C-on, rázatás (250 rpm) mellett inkubáltuk, majd az agglutinációs komplex eltávolítására Eppendorf mini centrifugában 1 percig 1000 rpm-mel centrifugáltuk. A felülúszóból 1, 10 és 100 μΙ-t vér-agarlemezekre kilemezeltünk és a lemezeket 20 órán keresztül, 37 °C-on inkubáltuk.
Eredmények
S. typhimurium STMP mozgásképtelen mutánsának azonosítása
Flagellumoktól mentes baktériumok H2-antiszérummal végzett inkubációval történt szelektálása a szérummal kezelt mutáns-szuszpenzióval (3% túlélés) oltott lemezeken (106 hígítás) körülbelül 40 telep kinövését eredményezte, ezzel szemben a szérummal kezelt STMP szuszpenzióval (3% túlélés) oltott lemezeken (106 hígítás) nem nőttek ki telepek. Ezen eredmény jelezte, hogy olyan mutánsok voltak jelen, amelyek a H2-antiszérummal nem agglutináltak, így valószínűleg flagellumoktól mentesek. A 40 telepet H2-agglutinációra és fénymikroszkóp alkalmazásával mozgásképességre nézve teszteltük. H2-agglutinációra nézve mindegyik mutáns negatív volt, de csak egy mutáns tűnt mozgásképtelennek a fénymikroszkópos vizsgálat során. E mozgásképtelen mutáns pozitívnek bizonyult a B csoportos O-antigén agglutinációban. A mutánst STM2000-nek neveztük el.
Az STM2000, egy S. typhimurium STMP mozgásképtelen mutáns, in vitro stabilitása Az STM2000 fenotípusos stabilitását vér-agarlemezeken végzett 12 in vitro passzázzsal vizsgáltuk. Ugyanezen vizsgálat során, a szülői STMP törzset szintén 12-szer passzázsoltuk. Ezeket a tenyészeteket fénymikroszkóppal vizsgáltuk és a mutáns kultúrában lévő összes baktérium még mindig mozgásképtelennek bizonyult. Bár az STMP baktériumok mozgásképesek voltak, de nem mindegyik sejt egyformán. STMP és STM2000 törzsek összehasonlítása igazolta, hogy a mutáns baktériumokban flagellumok nincsenek.
Az STM2001, egyS. typhimurium STMP mozgásképtelen mutáns, in vitro stabilitása Egy másik kísérletben S. typhimurium SL3261 törzset (letéti szám: SGSC 439, Salmonella Genetic Stock Centre, University of Calgare, Alberta, Canada) NTG alkalmazásával kémiai mutagenezis alá vetettük és mozgásképtelen mutánsokat szelektáltunk a fentiekben leírtak szerint. Egy mutáns, az STM2001, flagellinspecifikus monoklonális antitesttel nem adott reakciót. STM2001-el készült 2D protein gélelektroforézis során kimutattuk, hogy a szülői törzzsel összehasonlítva az STM2001-ből hiányzik az 51 kDa és pl 4,7 flagellinfolt.
E törzs genetikai stabilitását legalább 50 generáción keresztül történt szaporítással vizsgáltuk. Ezen időszak után még mindig nem találtunk visszaváltozott baktériumot, azaz az összes baktérium mozgásképtelen volt.
Az STM2001 törzset CBS 108955 katalógusszámon letétbe helyeztük Hollandiában a Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS), Oosterstraat 1, P. O. Box 273, 340 AG Baarn, Hollandia, intézménynél,
2. példa
Kísérleti terv
Vakcinát állítottunk elő flagellumokat tartalmazó és nem tartalmazó S. enteritidis (S. e.) fág 4-es típusú törzsből. A baktériumokat triptózfoszfát táptalajon tenyésztettük, majd 0,5%-os végkoncentrációjú formaiin hozzáadásával inaktiváltuk. A baktériumsejteket centrifugálással gyűjtöttük össze. A sejteket foszfátpuffer sóoldatban felszuszpendáltuk és „víz az olajban” emulzió formájában, 5*109 baktérium/ml koncentrációjú vakci7
HU 226 192 Β1 nát készítettünk, öt csirkét az S. e. fia* vakcinával, öt csirkét pedig S. e. fia- vakcinával intramuszkulárisan beoltottuk. A 14 és 18 hetes állatokat 0,5 ml vakcinával vakcináltuk. Huszonkét hetes korban az állatokat elvéreztettük és a szérumot az S. e. g,m flagellinjére specifikus dupla antitestet alkalmazó, szendvicsblokkoló ELISA rendszerben (double antibody sandwich blocking ELISA system) teszteltük [van Zijderveld és munkatársai, Vet. Quart. 15, 136-137 (1993)].
Állatok
Közönséges, 14 hetes korú tojócsirkéket Salmonel/a-mentes állományból szereztünk be.
Eredmények
Mind az öt, S. e. fia* vakcinát kapott csirke széruma a specifikus ELISA eljárásban pozitívnek bizonyult („seroconverted), míg az öt, S. e. fia- vakcinát kapott csirke széruma negatív maradt.
3. példa
1. kísértet
Kísérleti terv
Biztonságos alkalmazás felmérésére, étkezési csirkéket („brojler) orálisan (1 ml), szubkután (0,5 ml), illetve intramuszkulárisan (0,5 ml) flagellumokra nézve pozitív Salmonella typhimurium STMP törzzsel, flagellumokra nézve negatív S. typhimurium STM2000, illetve vad típusú S. typhimurium törzzsel fertőztünk. A fertőzést követő egy héten keresztül az állatokat megfigyeltük, majd ezt követően a túlélt csirkéket leöltük és megvizsgáltuk.
Állatok
Kereskedelemben elérhető, háromhetes korú, étkezési csirkéket Salmonellátói mentes állományból szereztük be.
Eredmények
A fertőzést követően, a vad típusú Salmonella typhimuriummai kezelt 10 állat közül 8 elpusztult (1. táblázat). Kórbonctani boncolás során kiderült, hogy a 2 túlélt, vad típusú törzzsel kezelt csirke mája megduzzadt, a májban nekrotikus gócok voltak, emellett a lép is megduzzadt és perikardiális ödéma lépett fel. Az STMP-vel fertőzött csirkék egyikének a mája enyhén duzzadt volt, míg az STM2000-el fertőzött csirkék egyikének a lépe volt enyhén duzzadt. Ebben a két csoportban további abnormális elváltozásokat nem tapasztaltunk.
1. táblázat
| Csoport | STMP | STM2000 | Vad típus |
| Dózis (CFU/ml) | 108.0 | 107·7 | 1O8·0 |
| Mortalitás | 0/10a | 0/10a | 8/105 |
Egy soron belül, az eltérő felső indexbe tett betűkkel jelzett csoportok egymástól különböznek (p<0,5, Fisher-féle egzakt teszt).
2. kísérlet
Kísérleti terv
Biztonságos alkalmazás és hatékonyság felmérésére, 3 és 15 napos, étkezési csirkéket vagy STMP-vel vagy pedig STM2000-el, majd amikor az állatok elérték a 22 napos kort, tetraciklinre rezisztens vad típusú Salmonella typhimuriumma\ orálisan fertőztük (provokációs fertőzés).
Biztonságos alkalmazást a vakcinálást követően klinikai megfigyeléssel és a tömeggyarapodás mérésével mértük fel. A vakcinatörzs bélrendszerben való jelenlétének meghatározását a 10. és 22. napon, a kloakából vett kenet vizsgálatával végeztük. A kénetekkel közvetlenül, vagy Rappaport Vassiliades Broth (RVB) oldatban végzett dúsítást követően, Brilliant Green Agar (BGA) lemezeket inokuláltunk.
A provokációs fertőzést („challenge infection”) követő egy héten keresztül az állatokat megfigyeltük, majd a túlélt egyedeket leöltük és megvizsgáltuk. A májakat, lépeket kloakából vett keneteket és a túlélt, vakcináit csirkék vakbelének tartalmából vett keneteket tetraciklint tartalmazó BGA lemezekre történt (BGAtet) közvetlen szélesztéssel tenyésztettük, a tetraciklinre rezisztens vad típusú Salmonella typhimurium jelenlétének megállapítása céljából. Emellett, a keneteket egy felszaporító tápközegben (tetraciklint tartalmazó puffereit peptonvíz) inkubáltuk, majd BGAtet lemezre kikentük.
Állatok
Kereskedelemben elérhető, háromnapos korú, étkezési csirkéket Salmonellától mentes állományból szereztük be.
Eredmények
A három- és tizenöt napos csibék orális vakcinálása után klinikai elváltozásokat nem tapasztaltunk. A vakcináit csoportban az átlagos tömeggyarapodás nem különbözött a kontrollcsoporttól (3. táblázat). A kloakából, a vakcinálást követő hetedik napon vett kenetben mindkét törzs jelen volt (2. táblázat). Az a tény, hogy az STMP-vel fertőzött csoportban a csirkék nagyobb része, a közvetlen kilemezelés után, tenyészet-pozitívnak bizonyult, jelzi, hogy e törzs nagyobb számban létesít telepeket a bélrendszerben, mint az STM2000 törzs.
2. táblázat
| STMP-pozitív kenetek | STM2000-pozitív kenetek | |||
| Reizolá- ció | közvet- len | dúsított | közvet- len | dúsított |
| 10. nap | 15/15a | nincs | 7/15t> | 14/15 |
| 22. nap | 10/15a | 15/15* | 4/15a | 14/15* |
Egy soron belül, az eltérő felső indexbe tett betűkkel jelzett csoportok egymástól különböznek (p<0,5, Fisher-féle egzakt teszt).
Az STMP csoportban egy csirke elpusztult a provokációs fertőzést követően (7%), ezzel szemben az STM2000 csoportban egyáltalán nem, a vakcinálatlan csoportban viszont 80%-os mortalitást tapasztaltunk (3. táblázat). A kontrollcsoportban a túlélő csirkék esetében egyben alacsonyabb mértékű tömeggyarapodást is tapasztaltunk, mint a vakcináit csoportokban. A provokációs fertőzést követően az STM2000-el vakcináit csoportban a tömeggyarapodás szignifikánsan maga8
HU 226 192 Β1 sabb volt, mint az STMP-vel vakcináit csoport esetében tapasztalt tömeggyarapodás.
3. táblázat
| Csoport | STMP | STM2000 | Kontroll |
| 3. napi dózis | 108.8 | 108.5 | - |
| 15. napi dózis | 10θ.5 | 108.5 | |
| Tömeggyarapodás 3-22. napok során | 639±98a | 594±72a | 624±82a |
| S. t. provokációs dózis a 22. napon | 108.0 | 108.0 | 108.0 |
| Tömeggyarapodás 22-29. napok során | 299±45a | 339±42b | 31±39c |
| Mortalitás | 1/15a | 0/15a | 8/15b |
Egy soron belül, az eltérő felső indexbe tett betűkkel jelzett csoportok egymástól különböznek [p<0,5, Fisher-féle egzakt teszt (mortalitás), illetve két-mintás t-teszt (tömeggyarapodás)].
Ahogyan azt a 4. táblázat mutatja, a lépből és a májból újraizolált, a provokációban alkalmazott baktérium arányait tekintve különbséget nem tapasztaltunk. A kloakából vett kenetek és a vakbéltartalmak vizsgálatával megállapítottuk, hogy bélrendszer kolonizációja szignifikánsabban alacsonyabb volt az STM2000-el vakcináit csoportban.
4. táblázat
| Csoport | Salmonella typhimurium (tet+) pozitív | |||
| STMP-vel vakcináit | STM2000-rel vakcináit | |||
| Reizolá- ció | közvet- len | dúsított | közvet- len | dúsított |
| Lép | 2/14a | nincs | 1/14a | nincs |
| Máj | 1/14a | nincs | 0/15a | nincs |
| Kloáka | 7/14a | 14/14A | 3/15a | 7/15B |
| Vakbél | 13/14a | 14/14* | 5/15b | 9/15B |
Egy soron belül, az eltérő felső indexbe tett betűkkel jelzett csoportok egymástól különböznek (p<0,5, Fisher-féle egzakt teszt).
4. példa
Kísérleti terv
A hatékonyság vizsgálatára, sertéseket orálisan fertőztünk STMP-törzzsel (1O9·0 CFU) vagy STM2000törzzsel (109·3 CFU), majd ezt 2 hét múlva tetraciklinre rezisztens vad típusú Salmonella typhimuriummal (1O11·0 CFU) végzett orális fertőzés követte.
A provokációs törzs elterjesztésének mértékét az ürülékből, a provokálást követő 5. és a 8. napokon vett minták tenyésztésével vizsgáltuk. Nagyjából 5 gramm ürüléket peptonvízbe helyeztünk és 2 órán keresztül inkubáltuk. Ezután 10-szeres hígítási sorozatokat készítettünk sztreptomicint tartalmazó RVB tápközegben, 12 órán keresztül (egy éjszakán át) inkubáltuk, ezután sztreptomicint tartalmazó Tryptose Phosphate Broth táptalajra kilemezeltük. A provokációs törzs legnagyobb hígítású oldatát alkalmaztuk a reizolációs pontszám (a legnagyobb, pozitív eredményt adó hígítás reciproka) kiszámításához.
Nyolc STMP-vel vakcináit sertést és 8 nem vakcináit kontrollt alkalmaztunk az első kísérletben. A második kísérletben 9 sertést STM2000-el vakcináltunk, a kontroll pedig 9, nem vakcináit sertés volt.
Állatok
Mindkét kísérletben 6 hetes SPF-sertéseket alkalmaztunk.
Eredmények
Ahogyan azt az 5. táblázat mutatja, mindkét vakcinatörzs képes volt szignifikánsan csökkenteni a provokációs törzs ürülékkel történő elterjesztését.
5. táblázat
| Átlagos reizolációs pontszám | ||
| 5. nap | 8. nap | |
| STMP (n=8) | 100·93 | 1010a |
| kontroll (n=8) | 106-4 * b | 103.8 b |
| STM2000 (n=9) | 101·°Α | 1013A |
| kontroll (n=9) | 1Q5.0B | 104·9Β |
az eltérő felső indexbe tett betűkkel jelzett csoportok egymástól különböznek (p<0,5, Mann-Whitney-féle U teszt).
Az alábbiakban ismertetjük a leíráshoz tartozó ábrákat.
1. ábra: Az STM2000 és a szülői S. typhimurium
STMP törzsének proteinprofiljának analízisét mutatja be. 1., 11. és 12. sávok: molekulatömeg-markerek (a jelzésnek megfelelően); 2., 5. és 8. sávok: S. typhimurium STMP vér-agartáptalajon 12-szer passzázsokra; 3., 6. és 9. sávok: STM2000 véragartáptalajon 12-szer passzázsolva. 2., 3. és 4. sávok: teljes proteinprofil; 5., 6. és 7. sávok: a szonikálást és centrifugálást követően keletkezett üledék; 8., 9. és 10, sávok: a szonikálást és centrifugálást követően keletkezett felülúszó. A fehérjéket Coomassie Brilliant Blue-val festettük.
2. ábra: S. typhimurium STMP (A) és ennek mozgásképtelen mutánsa (STM2000) (B) elektronmikroszkópos vizsgálatának fényképe.
Claims (9)
- SZABADALMI IGÉNYPONTOK1. Adjuváns, valamint vad típusú formájában flagellumokat hordozó, Salmonella nemzetségbe tartozó baktérium alkalmazása - amely baktérium flagellinHU 226 192 Β1 vagy flagellumok antigéndeterminánsai közül legalább egy ellen képtelen antitesteket indukálni - emberek és állatok védelmére szolgáló, Salmonella baktérium okozta fertőzés vagy a fertőzés patogén hatásai elleni, inaktivált vakcina előállítására.
- 2. Vad típusú formájában flagellumokat hordozó, Salmonella nemzetségbe tartozó baktérium alkalmazása - amely baktérium flagellin vagy flagellumok antigéndeterminánsai közül legalább egy ellen képtelen antitesteket indukálni - emberek és állatok védelmére szolgáló, Salmonella baktérium okozta fertőzés vagy a fertőzés patogén hatásai elleni, élő, legyengített vakcina előállítására.
- 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti alkalmazás, ahol a baktérium a flagelláris biogenezis út génjében bekövetkezett mutáció eredményeként flagellin vagy flagellumok antigéndeterminánsai közül legalább egy ellen képtelen antitesteket indukálni.
- 4. A 3. igénypont szerinti alkalmazás, ahol a mutáció a flagellingénen helyezkedik el.
- 5. Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, ahol a baktérium a következőkből álló csoportból választott: S. typhimurium, enteritidis, choleraesuis, dublin, typhi, abortus ovi, abortus equi, paratyphi A és B, derby, hadar, heidelberg, agona és arizonae.
- 6. Az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, ahol a baktérium heterológ gént hordoz, amely heterológ gén előnyösen a flagellingénbe van illesztve.
- 7. Vakcina az állatok Salmonellosis elleni védelmére, azzal jellemezve, hogy az 1. vagy 3-5. igénypontok bármelyikében meghatározott, inaktivált baktériumot, adjuvánst és gyógyászatilag elfogadott vivőanyagot tartalmaz.
- 8. Vakcina az állatok Salmonellosis elleni védelmére, azzal jellemezve, hogy a 2-5. igénypontok bármelyikében meghatározott, élő, attenuált baktériumot és gyógyászatilag elfogadott vivőanyagot tartalmaz.
- 9. A 7. vagy 8. igénypontok bármelyike szerinti vakcina, azzal jellemezve, hogy fagyasztva szárított, vagy porlasztásos úton szárított formában van.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP99204564 | 1999-12-28 |
Publications (4)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HU0005010D0 HU0005010D0 (hu) | 2001-02-28 |
| HUP0005010A2 HUP0005010A2 (en) | 2002-06-29 |
| HUP0005010A3 HUP0005010A3 (en) | 2004-07-28 |
| HU226192B1 true HU226192B1 (en) | 2008-06-30 |
Family
ID=8241112
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU0005010A HU226192B1 (en) | 1999-12-28 | 2000-12-27 | Salmonella vaccine |
Country Status (15)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US20010021386A1 (hu) |
| EP (1) | EP1112747B1 (hu) |
| JP (1) | JP5745731B2 (hu) |
| AT (1) | ATE269104T1 (hu) |
| AU (1) | AU783508B2 (hu) |
| BR (1) | BR0006291B1 (hu) |
| CA (1) | CA2329676A1 (hu) |
| DE (1) | DE60011560T2 (hu) |
| DK (1) | DK1112747T3 (hu) |
| ES (1) | ES2222152T3 (hu) |
| HU (1) | HU226192B1 (hu) |
| MX (1) | MXPA00012796A (hu) |
| PL (1) | PL206377B1 (hu) |
| PT (1) | PT1112747E (hu) |
| TR (1) | TR200401569T4 (hu) |
Families Citing this family (16)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP4751570B2 (ja) * | 2002-09-11 | 2011-08-17 | 東レ・ダウコーニング株式会社 | オルガノポリシロキサン変性多糖類およびその製造方法 |
| WO2008036675A2 (en) | 2006-09-18 | 2008-03-27 | The Board Of Trustees Of The University Of Arkansas | Compositions and methods of enhancing immune responses |
| US20080260777A1 (en) * | 2007-04-19 | 2008-10-23 | Sotomayor Konky | Composition and method for controlling intestinal pathogenic organisms |
| US7935355B2 (en) * | 2007-04-19 | 2011-05-03 | Nutritional Health Institute Laboratories, Llc | Composition and method for controlling intestinal pathogenic organisms |
| EP2214840B1 (en) * | 2007-10-30 | 2015-05-06 | The Board Of Trustees Of The University Of Arkansas | Compositions and methods of enhancing immune responses to flagellated bacterium |
| BRPI0819229B1 (pt) * | 2007-11-01 | 2019-01-22 | The Board Of Trustees Of The University Of Arkansas | vacinas para reforçar reações imunes contra eimeria |
| CA2960659C (en) | 2007-11-09 | 2021-07-13 | The Salk Institute For Biological Studies | Use of tam receptor inhibitors as immunoenhancers and tam activators as immunosuppressors |
| MX341775B (es) | 2010-01-21 | 2016-09-02 | The Texas A&M Univ System * | Vectores para vacunas y metodos para potenciar respuestas inmunes. |
| DK2579901T3 (da) | 2010-06-09 | 2019-11-04 | Univ Arkansas | Vaccine og fremgangsmåder til reduktion af campylobacterinfektion |
| KR101449417B1 (ko) | 2012-06-20 | 2014-10-27 | 한국외국어대학교 연구산학협력단 | 살모넬라 엔테리카의 박테리오파아지 및 그 용도 |
| EP2934580B1 (en) | 2012-12-20 | 2019-09-18 | Zaklad Badawczo-Wdrozeniowy Osrodka Salmonella "Immunolab" Sp. z o.o. | A polyvalent combined immunising and/or therapeutic preparation for use in bacterial infections or food poisoning, particularly salmonellosis, a method for production of this preparation, its use and a vaccine comprising this preparation |
| EP3610887B8 (en) | 2013-02-14 | 2024-01-24 | The Board of Trustees of the University of Arkansas | Compositions and methods of enhancing immune responses to eimeria or limiting eimeria infection |
| WO2014164607A1 (en) | 2013-03-11 | 2014-10-09 | The Brigham And Women's Hospital, Inc. | Vibro-based delivery system and immune suppression |
| WO2014152508A1 (en) | 2013-03-15 | 2014-09-25 | The Board Of Trustees Of The University Of Arkansas | Compositions and methods of enhancing immune responses to enteric pathogens |
| AR108688A1 (es) | 2016-05-03 | 2018-09-19 | Univ Arkansas | Vector de vacuna de levadura que incluye polipéptidos inmunoestimuladores y antigénicos, métodos para su uso |
| CN111374094B (zh) * | 2020-03-02 | 2022-04-19 | 扬州大学 | 驴源马流产沙门氏菌经皮下致非妊娠期小鼠子宫感染模型的建立方法 |
Family Cites Families (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB1109179A (en) * | 1964-09-30 | 1968-04-10 | Nat Res Dev | Improvements relating to typhoid and paratyphoid vaccines |
| US4886748A (en) * | 1986-03-11 | 1989-12-12 | Shionogi & Co., Ltd. | DNA encoding flagellin and vector having the same |
| US6130082A (en) * | 1988-05-05 | 2000-10-10 | American Cyanamid Company | Recombinant flagellin vaccines |
| JP2793673B2 (ja) * | 1988-05-05 | 1998-09-03 | アメリカン・サイアナミド・カンパニー | 組み換えフラジエリンのワクチン |
| JP3436756B2 (ja) * | 1988-12-19 | 2003-08-18 | アメリカン・サイアナミド・カンパニー | 髄膜炎菌のクラスｉの外膜タンパク質のワクチン |
| WO1995022314A1 (en) * | 1994-02-18 | 1995-08-24 | Innovac Co. | Inoculation of animals with dried, pelleted biological materials |
| GB9621091D0 (en) * | 1996-10-09 | 1996-11-27 | Fondation Pour Le Perfectionem | Attenuated microorganisms strains and their uses |
| US6190669B1 (en) * | 1998-05-13 | 2001-02-20 | University Of Maryland, Baltimore | Attenuated mutants of salmonella which constitutively express the Vi antigen |
-
2000
- 2000-12-19 ES ES00204630T patent/ES2222152T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2000-12-19 AT AT00204630T patent/ATE269104T1/de active
- 2000-12-19 DK DK00204630T patent/DK1112747T3/da active
- 2000-12-19 MX MXPA00012796A patent/MXPA00012796A/es active IP Right Grant
- 2000-12-19 EP EP00204630A patent/EP1112747B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2000-12-19 DE DE60011560T patent/DE60011560T2/de not_active Expired - Lifetime
- 2000-12-19 PT PT00204630T patent/PT1112747E/pt unknown
- 2000-12-19 TR TR2004/01569T patent/TR200401569T4/xx unknown
- 2000-12-20 JP JP2000387225A patent/JP5745731B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2000-12-21 AU AU72453/00A patent/AU783508B2/en not_active Ceased
- 2000-12-27 CA CA002329676A patent/CA2329676A1/en not_active Abandoned
- 2000-12-27 HU HU0005010A patent/HU226192B1/hu not_active IP Right Cessation
- 2000-12-27 US US09/749,025 patent/US20010021386A1/en not_active Abandoned
- 2000-12-27 BR BRPI0006291-0A patent/BR0006291B1/pt not_active IP Right Cessation
- 2000-12-28 PL PL344851A patent/PL206377B1/pl not_active IP Right Cessation
-
2007
- 2007-10-30 US US11/980,864 patent/US20080069843A1/en not_active Abandoned
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DK1112747T3 (da) | 2004-10-25 |
| AU7245300A (en) | 2001-07-05 |
| PL344851A1 (en) | 2001-07-02 |
| MXPA00012796A (es) | 2002-05-23 |
| ES2222152T3 (es) | 2005-02-01 |
| AU783508B2 (en) | 2005-11-03 |
| EP1112747A1 (en) | 2001-07-04 |
| ATE269104T1 (de) | 2004-07-15 |
| TR200401569T4 (tr) | 2004-07-21 |
| CA2329676A1 (en) | 2001-06-28 |
| US20010021386A1 (en) | 2001-09-13 |
| HUP0005010A3 (en) | 2004-07-28 |
| JP5745731B2 (ja) | 2015-07-08 |
| PT1112747E (pt) | 2004-10-29 |
| HUP0005010A2 (en) | 2002-06-29 |
| EP1112747B1 (en) | 2004-06-16 |
| JP2001186874A (ja) | 2001-07-10 |
| PL206377B1 (pl) | 2010-08-31 |
| DE60011560T2 (de) | 2005-08-18 |
| DE60011560D1 (de) | 2004-07-22 |
| HU0005010D0 (hu) | 2001-02-28 |
| BR0006291A (pt) | 2001-11-27 |
| US20080069843A1 (en) | 2008-03-20 |
| BR0006291B1 (pt) | 2014-02-18 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US20080069843A1 (en) | Salmonella vaccine | |
| JP2002521345A (ja) | 鳥類病原体を制御するため生きた弱毒化サルモネラワクチン | |
| Meenakshi et al. | Adjuvanted outer membrane protein vaccine protects poultry against infection with Salmonella enteritidis | |
| BRPI0621490A2 (pt) | cepa mutante atenuada de uma bactéria infectante de espécies veterinárias, vacina para imunização de espécies veterinárias contra uma infecção bacteriana, método para imunizar uma espécie veterinária contra uma infecção bacteriana, uso de uma cepa mutante atenuada e método para distinção sorológica entre animais vacinados e animais infectados por uma cepa alelo-selvagem | |
| US11707515B2 (en) | Modified Brucella vaccine strain for the treatment of brucellosis | |
| CA2678698A1 (en) | Use of an avirulent bordetella mutant as a live vaccine vector | |
| US7045122B2 (en) | Salmonella vaccine | |
| Roland et al. | Expression of Escherichia coli antigens in Salmonella typhimurium as a vaccine to prevent airsacculitis in chickens | |
| Zhang et al. | Protection and immune responses induced by attenuatedSalmonella typhimuriumUK-1 strains | |
| US20120107351A1 (en) | In Ovo Vaccination of Campylobacter in Avian Species | |
| WO2021073778A1 (en) | Compositions and methods for vaccinating piglets against streptococcus | |
| JP4705573B2 (ja) | 弱毒細菌生ワクチン | |
| TW200418874A (en) | Passive vaccine for the prevention of campylobacter colonization, and its preparation method | |
| Pumtang-on | Investigation of Campylobacter jejuni and Campylobacter coli colonisation of commercial free-range chickens | |
| Whitehead | Development and assessment of an attenuated Rhodococcus equi oral vaccine that produces VapA |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| GB9A | Succession in title |
Owner name: INTERVET INTERNATIONAL B.V., NL Free format text: FORMER OWNER(S): AKZO NOBEL N.V., NL |
|
| MM4A | Lapse of definitive patent protection due to non-payment of fees |