KR20150145806A

KR20150145806A - 전사조절 시그마 인자 ＳｉｇＡ-ｖｍ 및 이 인자의 과발현에 의한 글라이코펩타이드 계열 화합물의 생산성 증대 방법

Info

Publication number: KR20150145806A
Application number: KR1020140074984A
Authority: KR
Inventors: 김재종; 임시규; 김동환; 유정현; 이소라; 이금순; 이보미
Original assignee: (주) 제노텍
Priority date: 2014-06-19
Filing date: 2014-06-19
Publication date: 2015-12-31
Also published as: KR101592269B1

Abstract

본 발명은 비리보솜성 펩타이드계 화합물을 생산하는 미생물로부터 필수 유전자의 전사를 담당하는 SigA-vm 단백질을 암호화하는 유전자를 선별하고 도입하여 글라이코펩타이드(glycopeptides), 리포글라이코펩타이드(lipoglycopeptides) 등의 화합물을 포함하는 비리보솜성 펩타이드계 화합물, 바람직하게는 반코마이신(vancomycin), 테이코플라닌(teicoplanin), 발히마이신(balhimycin) 등을 포함하는 글라이코펩타이드계 화합물, 더욱 바람직하게는 반코마이신(vancomycin)의 생산을 증대하는 방법을 제공한다.

Description

전사조절 시그마 인자 ＳｉｇＡ-ｖｍ 및 이 인자의 과발현에 의한 글라이코펩타이드 계열 화합물의 생산성 증대 방법 {Transcription regulating sigma factor SigA-vm and producing method for glycopeptide compounds by overexpressing the sigma factor}

본 발명은 필수 유전자들의 전사에 관련된 시그마인자(sigma factor), 구체적으로는 sigA - vm 유전자의 과발현을 통해 글라이코펩타이드 계열의 이차 대사산물의 생산성을 증대시키는 방법에 관한 것이다.

자연에 존재하는 많은 미생물 중, 특히 방선균은 동식물뿐만 아니라 인류에게도 유용한 이차 대사산물을 생산한다. 방선균들이 생산하는 이차 대사산물들은 특정한 생합성 기구를 필요로 하며 그러한 생합성 기구들 중에는 다수의 단백질 복합체인 비리보좀성 펩타이드 합성 효소(Nonribosomal peptides synthase, NRPS)를 통하여 이차 대사산물을 생산하고 있다. 이러한 NRPS 계열의 대사 산물에는 반코마이신(vancomycin), 테이코플라닌(teicoplanin), 발히마이신(balhimycin) 등의 글라이코펩타이드(Glycopeptides) 또는 리포글라이코펩타이드(lipoglycopeptides) 계열, 마이코박틴(mycobactin), 엔테로박틴(enterobactin) 등의 사이더로포어(siderophores) 계열, 그리고 클로로바이오신, 노보바이오신(novobiocin) 등의 아미노코마린(aminocoumarins) 계열과 같은 산업적으로 매우 유용한 물질들이 있다. 상기와 같이 방선균에서 생산되는 많은 유용한 이차 대사산물들은 화학적 구조의 다양성과 복잡성, 야생형 균주에서의 이차 대사산물의 생산량의 한계 등으로 산업적으로 이용이 매우 어려웠다. 야생형 균주로부터 이차 대사산물의 생산량을 증대시키기 위하여 종래에는 자외선 조사나 NTG(nitrosoguanidine) 등을 이용한 화학적 돌연변이 방법으로 무작위적이고 반복적인 돌연변이를 통해 균주들을 개량하여 왔다. 페니실린을 생산하는 균주는 무작위적 돌연변이 방법을 통해 야생형 균주에 비해 100,000 배 이상 페니실린의 생산량이 증대된 균주를 선별하였다(Rokem JH. (2007). Nat prod Rep. 24:1262-1287). 하지만 이런 무작위적 돌연변이 방법을 통한 이차 대사산물의 생산량 증대방법은 오랜 시간이 소요되며, 노동력을 필요로 하고 또한 생산량이 증대된 균주를 선별할 확률도 낮다고 할 수 있다. 그러나, 최근 분자 유전학의 발전으로 많은 방선균의 전체 게놈 염기서열이 알려지고 있으며 알려진 유전정보를 바탕으로 분자 생물학적 기법을 사용하여 생합성에 관련된 유전자 등의 발현 조절과 대사경로의 최적화 등을 통해 산업적으로 이용 가능한 균주의 개량이 급속히 이루어지고 있다(Zhang L.(2005). Curr Opin Microbial. 8:276-281).

이러한 노력의 일환으로 이차 대사산물의 생합성 유전자군에 존재하는 경로-특이적(pathway-specific) 조절유전자의 활성을 증대시키고자 조절유전자의 프로모터 부위를 인식하는 시그마 인자에 대한 연구들이 진행 중에 있지만, 방선균 내에는 수많은 조절 단백질들과 시그마 인자의 존재로 인해 그 연구 성과는 미미한 실정이다. 스트렙토마이세스 코엘리콜라(Streptomyces coelicolor)의 게놈 상에는 65개의 시그마 인자가 존재하는 것으로 알려져 있으며, 그 중 몇몇 개의 특성은 밝혀져 있다(Mazurakova V. (2006). Arch Microbiol. 186:435-446). 예를 들면, BldN 단백질은 균사체의 성장의 조절과 관련이 있으며, WhiG 단백질은 포자의 형성과 숙성(maturation)에 관련되어 있다. 다양한 스트레스에 반응하는 시그마 인자도 존재하는데, SigG 단백질과 같은 경우 산화 스트레스 반응(oxidative stress response)의 조절에 관여하고 있다. 이러한 시그마 인자 중 HrdB 단백질은 필수유전자들의 전사에 관련된 항존 시그마 인자(housekeeping sigma factor)로 알려져 있고 HrdB 단백질은 프로모터의 -35 부위의 보존 염기서열인 TTGACN과 -10 부위의 TAGAPuT 부위를 인식하고 결합하는 것으로 보고되었다(Strohl WR. (1992). Nucleic Acids. 20:961-974). 스트렙토마이세스 아버미틸리스(Streptomyces avermitilis)의 게놈 상에도 hrdB 유전자가 존재하며 HrdB 단백질의 기능이 아버멕틴(avermectin) 생합성 유전자군 내에 존재하는 조절유전자의 프로모터에 결합하는 것으로 규명되었으며 hrdB 유전자의 조작(engineering)을 통해 산업균주의 아버멕틴 생산량을 증가시킨 사례가 있다(Zhou Y. (2010). PNAS. 107:11250-11254). 스트렙토마이세스 그리세우스(Streptomyces griseus)의 게놈 상에도 hrdB를 포함한 52개의 시그마 인자가 존재하며, HrdB 단백질은 필수유전자들의 전사에 관련된 항존 시그마 인자로 알려져 있다(Otani H. (2013). Mol Microbiol. 87:1223-1236). 상기 연구 결과에 따르면 방선균에 존재하는 항존 시그마 인자인 HrdB 단백질은 약 500여 개의 아미노산으로 구성되어 있으며 이들의 상동성은 약 80% 이상으로, 프로모터의 -35 결합부위와 -10 결합부위, 코어 결합부위 등의 영역들이 보존된 특징이 있으며 필수 유전자들의 전사에 관련된 단백질임을 알 수 있다. NRPS에서 합성되는 비리보좀성 펩타이드 계열의 대사산물로는 반코마이신, 테이코플라닌, 클로로에레모마이신, 답토마이신 등이 대표적이며 특히, 반코마이신은 MRSA(methicillin-resistant staphylococcus aureus)에 대한 최후의 항생제로 알려져 있으며 감염성 질환 치료에 널리 사용되고 있다. 최근 반코마이신 생산균주로 알려진 아미콜라톱시스 오리엔탈리스(Amycolatopsis orientalis)의 전체 게놈 염기서열이 알려져 있고, 게놈 상에 HrdB 단백질과 상동성이 높은 시그마 인자를 포함한 다수의 시그마 인자가 존재하는 것으로 조사되었다.

본 발명의 목적은 글라이코펩타이드 계열의 대사산물, 특히 반코마이신 생산균주인 아미콜라톱시스 오리엔탈리스(Amycolatopsis orientalis)의 게놈 상에 존재하는 다수의 시그마 인자 중 하나인 sigA 유전자의 과발현을 통해 반코마이신의 생산성을 높이는 방법을 제공하려는 것이다.

본 발명자들은 글라이코펩타이드 계열의 항생제 중 반코마이신의 생산균주인 아미콜라톱시스 오리엔탈리스(Amycolatopsis orientalis) KVP2318의 게놈 상에 존재하는 시그마 인자 중 방선균 내에 존재하며 필수 유전자의 전사관련 HrdB 단백질과 상동성이 높은 시그마 인자를 확인하고, 이를 sigA - vm으로 명명하였으며, 이 유전자를 방선균 발현 벡터계에서 구축하고 아미콜라톱시스 오리엔탈리스 KVP2318 균주에 도입하여 과발현시킴으로써 글라이코펩타이드 계열 항생제인 반코마이신의 생산성을 증대시키는 방법을 개발하였다.

본 발명은 반코마이신의 생산성을 증대시키기 위한 대사공학적 방법을 제공하는 것으로서, 좀 더 자세히는 HrdB 유사 단백질을 암호화하는 유전자인 sigA-vm을 발현벡터에 삽입하고 컨쥬게이션을 통해 sigA - vm 유전자의 발현벡터를 반코마이신 생산균주에 도입하여 형질전환시켜 반코마이신의 생산 증대를 이루는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 미생물은 글라이코펩타이드를 비롯한 비리보솜성 펩타이드성 물질을 생산하는 산업적으로 유용한 곰팡이, 효모, 세균이 될 수 있으며, 특히 세균 중 방선균이 될 수 있다. 본 발명에서 생산성을 증대시키고자 하는 비리보솜성 펩타이드 계열의 물질은 비리보솜 펩타이드 생합성 효소군(non-ribosomal peptide synthases, NRPS)에 의해 생산되는 것으로서, 글라이코펩타이드(Glycopeptides), 리포글라이코펩타이드(lipoglycopeptides) 등과 같은 산업적으로 매우 유용한 물질들이다.

구체적으로 본 발명의 내용을 설명하면 대사공학적 방법을 통하여 반코마이신의 생산성 향상을 위해 반코마이신 고생산 산업균주인 아미콜라톱시스 오리엔탈리스 KVP2318에서 다수의 시그마 인자 유전자들을 확보하였고, 확보한 각 시그마 인자의 염기서열을 바탕으로 세 개의 스트렙토마이세스속 균주인 스트렙토마이세스 코엘리콜라(S. coelicolor), 스트렙토마이세스 아버미틸리스(S. avermitilis), 스트렙토마이세스 그리세우스(S.griseus)의 시그마 인자 중 HrdB 단백질과 서열 유사성이 높은 SigA-vm 단백질을 암호화하고 있는 유전자를 확보하였다. 스트렙토마이세스 속의 HrdB 단백질은 DNA 결합 저해(inhibition of DNA binding), 코어 결합(core binding), -10 결합(-10 binding)과 -35 결합(-35 binding) 부위로 구성되어 있으며 아미콜라톱시스 오리엔탈리스(Amycolatopsis orientalis) KVP2318 균주의 SigA-vm 단백질도 위와 같은 구역들이 잘 보존되어 있다. 그러나 세 개의 스트렙토마이세스속 균주의 HrdB 단백질은 500여 개의 아미노산으로 구성되어 있는 반면, 아미콜라톱시스 오리엔탈리스(Amycolatopsis orientalis) KVP2318 균주의 SigA-vm 단백질은 466 개의 아미노산으로 구성되어 있으며, DNA 결합 저해(inhibition of DNA binding) 부위는 세 개의 스트렙토마이세스속 균주의 HrdB 단백질의 서열과 유사성이 높지는 않았다. 하지만 전사 조절 유전자의 프로모터와 결합하는 기능을 가질 것으로 추정되는 코어 결합(core binding), -10 결합(-10 binding)과 -35 결합(-35 binding) 부위의 단백질 서열은 서열 유사성이 상당히 높으며 잘 보존되어 있는 것으로 확인되었다.

아미콜라톱시스 오리엔탈리스(Amycolatopsis orientalis) KVP2318 균주 유래의 시그마 인자, SigA-vm 효소를 암호화하고 있는 유전자를 일반적인 방선균용 프로모터인 ^P ermE ^* 하류에 삽입하여 발현벡터를 제작하였고, 사용된 프로모터는 방선균에서 과발현을 위한 일반적인 프로모터로 본 발명이 이에 의해 제한되는 것은 아니다. 이들 발현벡터를 펩타이드 물질 생산 미생물, 구체적으로 글라이코펩타이드 생산 방선균, 더욱 구체적으로 반코마이신 생산 균주인 아미콜라톱시스 오리엔탈리스(Amycolatopsis orientalis)에 도입하여 발현 벡터계를 통한 SigA-vm 단백질의 과발현을 유발하여 펩타이드 물질, 구체적으로 글라이코펩타이드, 더욱 구체적으로 반코마이신의 생산성이 증대됨을 확인하였다.

상기 재조합 발현벡터가 도입된 형질전환체에서 반코마이신의 생산성을 조사한 결과, 반코마이신의 생산성이 발현벡터 무도입 균주에 비해 15~20% 정도 증가하는 것을 확인하였다.

본 발명은 서열번호 7로 표시되는 sigA - vm 유전자에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 sigA - vm 유전자를 도입하여 형질전환된 글라이코펩타이드 생산 방선균에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 상기 글라이코펩타이드가 반코마이신(vancomycin), 테이코플라닌(teicoplanin) 또는 발히마이신(balhimycin)임을 특징으로 하는, 형질전환된 글라이코펩타이드 생산 방선균에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 상기 sigA - vm 유전자가 글라이코펩타이드 생산 미생물에서 수득한 것임을 특징으로 하는, 글라이코펩타이드 생산 방선균에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 sigA - vm 유전자를 함유하는 발현벡터에 관한 것이다.

뿐만 아니라, 본 발명은

a) sigA - vm 유전자를 발현벡터에 삽입하는 단계;

b) 상기 sigA - vm 유전자가 삽입된 발현벡터로 비리보솜성 펩타이드 화합물 생산 방선균을 형질전환시키는 단계; 및

c) 상기 b) 단계를 거쳐 형질전환된 방선균을 발현시키는 단계;를 포함하는 글라이코펩타이드 화합물의 생산증대방법에 관한 것이다.

본 발명에 의하면, 반코마이신 생합성 관련 전사 조절유전자의 활성화 증대를 위해 시그마 인자인 sigA - vm 유전자를 과발현시킴으로써 반코마이신의 생산성을 증대시킬 수 있음을 확인하였다. 이와 같이, SigA-vm 단백질을 과발현하여 반코마이신을 비롯한 펩타이드계 이차 대사산물의 생산성을 증대시킴으로써 본 발명은 의약학 등의 분야에 유용하게 이용될 수 있다.

도 1은 반코마이신 및 글라이코펩타이드계 항생제 화학구조이다.
도 2a와 도 2b는 방선균 유래의 다양한 SigA-Vm 과 HrdB 단백질의 서열을 비교한 것이다(도 2a와 도 2b는 서로 연결된 도면으로서 편의상 분리한 것이다). 비교 대상인 세 균주는 각각 스트렙토마이세스 코엘리콜라(Streptomyces coelicolor) A3(2), Accession NP_629943, 스트렙토마이세스 아버미틸리스(Streptomyces avermitilis) MA4680, Accession NP_823620 및 스트렙토마이세스 그리세우스(Streptomyces griseus) NBRC 13350, Accession YP_001823213이다. 서열이 기재된 순서에서 위로부터 각각 서열번호 3, 4, 5, 6으로 서열목록에 나타내었다.
도 3은 아미콜라톱시스 오리엔탈리스 KVP2318 균주로부터 확보한 SigA-vm을 과발현하기 위한 벡터의 모식도이다.
도 4는 아미콜라톱시스 오리엔탈리스 KVP2318 균주로부터 확보한 sigA - vm 유전자의 염기서열이다. 이 서열은 서열번호 7이다.

아래에서는 구체적인 실시예를 들어 본 발명의 구성을 더욱 자세하게 설명한다. 그러나, 본 발명의 예시는 본 발명의 구성에 대한 설명을 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위를 제한하지는 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명하다.

실시예 1: 박테리아 계통 및 유전자 조작

본 발명의 재조합 형질전환체 제조를 위하여 반코마이신 고생산 균주인 아미콜라톱시스 오리엔탈리스 KVP2318 균주를 사용하였다. 유전자 조작은 일반적인 과정에 따라서 E. coli DH5a 내에서 수행하였다 (Sambrook J et al. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Edn. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY). pGEM-3zf(+) 벡터(Promega)가 서브클로닝을 위해 사용되었다.

실시예 2: 아미콜라톱시스 오리엔탈리스 KVP2318 균주와 형질전환체의 배양조건

아미콜라톱시스 오리엔탈리스 KVP2318 균주와 발현벡터가 도입된 형질전환체의 발효 배양은 아래의 조건으로 수행하였다. 균주를 500 ㎖ 엘렌마이어 삼각 플라스크에 들어있는 25 ㎖ 배지-1 (1.1% 소이톤 펩톤, 0.3% 효모 추출물, 0.3% 맥아 추출물, 1.7% 덱스트로스, pH 7.5) 에 접종하여 30℃, 220rpm 조건으로 하루 동안 배양하여 활성화한 후, 500 ㎖ 엘렌마이어 삼각 플라스크에 들어있는 25 ㎖ 배지-2 (0.5% 감자단백, 0.5% 생대두분, 0.3% 탄산칼슘, 4.2% 산화전분)에 접종하여 동일 조건에서 2일 동안 배양하였다. 배지-2에서 배양된 배양액을 500 ㎖ 엘렌마이어 삼각 플라스크에 들어있는 25 ㎖ 배지-3 (1.2% 감자단백, 0.1% 염화나트륨, 1.5% 생대두분, 0.9% 포도당, 7.5% 과당, pH 9.5)에 접종하여 34℃, 240rpm으로 65h 동안 배양하였다.

또한, 5ℓ 항아리형 발효기를 이용한 발효 배양은 아래의 조건으로 수행하였다. 균주를 500 ㎖ 엘렌마이어 삼각 플라스크에 들어있는 25 ㎖ 프리-시드(pre-seed) 배지[1.1% 소이톤 펩톤, 0.3% 효모 추출물, 0.3% 맥아 추출물, 1.7% 덱스트로스, pH 7.5]에 30℃, 240rpm의 조건에서 하루 동안 배양하여 활성화한 후, 활성화된 종배양 균주를 3 ℓ 엘렌마이어 플라스크에 들어있는 300 ㎖의 시드 배지[0.5% 감자단백, 0.5% 생대두분, 0.3% CaCO₃, 4.2% 산화전분, 0.05% AZ-20R(antifoam)]에 접종하여 동일 조건에서 이틀 동안 배양을 실시하였다. 시드 배지에서 배양된 배양액을 5 ℓ 항아리형 발효기에 들어있는 2.7 ℓ의 발효 배지[1.8% 감자단백, 0.12% NaCl, 1.8% 생대두분, 2.5% 포도당, 9% FG-60, 0.2% AZ-20R(antifoam), pH 10.5]에 300 ㎖의 양을 접종하여 34℃, DO 60% 이상으로 유지하기 위해 교반과 통기를 하면서 배양하였다.

실시예 3: 반코마이신 발효생산 분석

상기 실시예 2와 같이 배양한 아미콜라톱시스 오리엔탈리스 KVP2318 균주와 발현벡터가 도입된 형질전환체의 배양액에 묽은 황산(pH 1.8)을 9배 첨가하여 혼합한 후 원심분리 및 여과하여 대사물질을 추출하였다. 정량분석은 반코마이신 표준물질(USP reference standard cat. No. 1709007)을 사용하여 실시하였다. 10㎕의 추출액은 흡수파장 280nm, 유속 1㎖/min으로 C18 컬럼 (symmetry C18, 5㎛, 4.6 X 250 mm, Waters)에 도입하여 분석하였다.

실시예 4: sigA - vm 유전자의 염기서열 확보

아미콜라톱시스 오리엔탈리스 KVP2318 균주로부터 확보한 게놈을 대상으로 ion-torrent sequencer를 사용하여 전체 유전체에 대한 염기서열을 분석하였다. 염기서열 분석결과는 분석 프로그램을 통해 데이터베이스를 구축하였고, 그 결과를 바탕으로 다수의 시그마 인자 유전자를 발굴하였다. 발굴된 시그마 인자 중 스트렙토마이세스 코엘리콜라(S. coelicolor), 스트렙토마이세스 아버미틸리스(S. avermitilis), 스트렙토마이세스 그리세우스(S. griseus) 균주에서 밝혀진 HrdB 단백질과의 서열유사성을 비교하여 표 1과 같이 70% 이상의 서열유사성을 가지는 SigA-vm을 선별하였다(도 2a, 도 2b).

*A. orientalis*		*S. coelicolor*		*S. avermitilis*		*S. griseus*
ORF	aa	aa	Identities/Positivities	aa	Identities/Positivities	aa	Identities/Positivities
sigA-vm	466	511	69%/80%	512	70%/80%	514	67%/77%

실시예 5: 발현 플라스미드 제조

선별한 sigA - vm 유전자는 아미콜라톱시스 오리엔탈리스 KVP2318 균주로부터 확보한 게놈 DNA를 주형으로 PCR 방법으로 얻었다. 상기 유전자의 확보시 사용한 프라이머는 표 2와 같다.

프라이머	염기서열 (5'→3')
sigA-vm--5Bg	gaagatctctgcgaaagggcgtaagtggc (BglII)
sigA-vm-3Xb	gctctagagggctcagtccaggtagtcgc (XbaI)

sigA 유전자는 BglII 링커를 첨가한 sigA-vm-5Bg와 XbaI 링커를 첨가한 sigA-vm-3Xb 프라이머를 사용하였으며, PCR 조건은 94℃에서 5분간 변성 후 94℃ 30초, 60℃ 30초, 72℃ 90초로 하여 30회 반복하였다. 위와 같은 조건으로 PCR을 수행하여 1,438 bp의 PCR 산물을 얻었으며 PCR 산물은 XbaI 제한효소로 절단한 후 pGEM 3zf(+) 벡터의 SmaI과 XbaI 자리에 클로닝한 후 염기서열분석을 통해 염기서열을 확인하였다. 염기서열이 확인된 sigA - vm 유전자는 BglII와 XbaI 제한효소로 절단하여 pGEM 3zf(+) 벡터에서 회수하였다. sigA-vm 유전자는 pSET152벡터와 pKC1139벡터의 ^P ermE 하류의 BamHI과 XbaI 제한효소 자리에 각각 삽입하여 pSET152-SigA-vm 및 pKC1139-SigA-vm을 제작하였다 (도 3). 제작한 각 벡터를 실시예 5에 따라 아미콜라톱시스 오리엔탈리스 KVP2318 균주에 도입하였다. 본 실시예에서 사용한 pSET152 벡터와 pKC1139 벡터는 아프라마이신 내성 유전자(acc(3) IV)를 가지고 있으며, 미생물 유전체에 직접 도입할 수 있는 특성이 있다.

실시예 6: 접합에 의한 방선균의 형질전환

발현벡터의 방선균으로의 도입은 E. coli/스트렙토마이세스 간의 콘쥬게이션(conjugation) 방법(Kieser, T. 등,2000)으로 수행하였다.

pSET152-SigA-vm 및 pKC1139-SigA-vm는 비메틸화 주게(non-methylating donor)로 dam-, dcm-인 E.coli ET12567/pUZ8002에 도입하였다. 상기 형질전환된 E. coli를 항생제 25㎍/㎖의 클로람페니콜(chloramphenicol)과, 카나마이신(kanamycin), 아프라마이신(apramycin)이 각각 50㎍/㎖ 되도록 첨가된 LB 배지 (트립톤 10 g/ℓ, 효모 추출물 5 g/ℓ, NaCl 10 g/ℓ)에 접종하고 37℃에서 12~16시간 배양하였고 0.1 ㎖의 배양액을 10 ㎖의 LB 배지에 옮기고 37℃에서 광학밀도 0.4가 될 때까지 배양하였다. 배양액의 세포는 LB 배지로 두 번 세척하고, 0.5 ㎖의 LB로 농축하였다. 아미콜라톱시스 오리엔탈리스 KVP2318 포자액 500㎕를 원심분리하고 500㎕ LB 배지에 현탁한 후 40℃로 30분 동안 열충격을 가했다. 500㎕의 대장균 농축액과 500㎕의 균사액은 서로 혼합한 후 변형 A 배지에 도포하고 30℃에서 20시간 동안 배양한 후 500㎍의 날리딕신산(nalidixic acid)과 1㎎의 아프라마이신(apramycin)을 도말하였다. 형질전환체는 5~7일 후 확인하여 선별하였다.

실시예 7: sigA - vm 과발현 벡터 도입 형질전환체의 반코마이신 생산 확인

sigA - vm 과발현 벡터가 도입된 형질전환체의 반코마이신 생산성을 확인하기 위하여 pSET152-SigA-vm 도입된 3개의 형질전환 균주를 독립적으로 분리하여 엘렌마이어 삼각 플라스크에서 형질전환 균주를 각기 3 반복 시험을 통해 생산성 증대를 확인하였으며(표 3), 5ℓ 항아리형 발효기를 통해 생산성 증대를 재확인하였다(표 4). 그 결과, 표 3 및 표 4와 같이 종래의 반코마이신 생산 균주에 비해 본 발명의 형질전환 균주에 의한 반코마이신의 생산성이 15~20% 정도 증가하는 것을 확인하였고 pSET152 벡터만 도입된 형질전환체는 반코마이신의 생산성에 변화가 거의 없었음을 확인하였다. 또한, 방선균에서 복제가 가능한 pKC1139벡터를 이용하여 제작한 pKC1139-SigA-vm 벡터가 도입된 형질전환 균주도 반코마이신의 생산성이 15~20% 정도 증가하는 것으로 확인하였다. 이를 통하여 전사 조절 유전자의 활성에 관여하는 것으로 추정되는 시그마 인자인 sigA - vm 유전자의 과발현을 이용하면 반코마이신의 생산성 증대를 도모할 수 있음을 알 수 있었다. 이로부터 sigA - vm 유전자가 과발현된 형질전환체에서는 종래의 반코마이신 생산 균주에 비해 전사 조절 유전자의 활성이 증가하여 반코마이신의 생산성 향상에 기여하였음을 추측할 수 있다.

Strains	Vancomycin production (g L^-1)	Yield (%)
A. orientalis	6.1 ± 0.35	100
A. orientalis::pSET152	6.1 ± 0.33	100
A. orientalis::sigA - vm -6	7.3 ± 0.00	120
A. orientalis::sigA-vm-7	7.1 ± 0.12	116
A. orientalis::sigA-vm-8	6.9 ± 0.21	113

Strains	Vancomycin production (g L^-1)	Yield (%)
A. orientalis	5.8	100
A. orientalis::sigA - vm -8	7.0	120

<110> Genotech com. <120> Transcription regulating sigma factor SigA-vm and producing method for glycopeptide compounds by overexpresing the sigma factor <130> Genotech-SigAvm-1406 <160> 2 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 gaagatctct gcgaaagggc gtaagtggc 29 <210> 2 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 gctctagagg gctcagtcca ggtagtcgc 29

Claims

서열번호 7로 표시되는 sigA - vm 유전자.
청구항 1의 sigA - vm 유전자를 도입하여 형질전환된 글라이코펩타이드 생산 방선균.
청구항 2에 있어서,
상기 글라이코펩타이드는 반코마이신(vancomycin), 테이코플라닌(teicoplanin) 또는 발히마이신(balhimycin)임을 특징으로 하는, 형질전환된 글라이코펩타이드 생산 방선균.
청구항 2에 있어서,
sigA - vm 유전자는 글라이코펩타이드 생산 미생물에서 수득한 것임을 특징으로 하는, 글라이코펩타이드 생산 방선균.
청구항 1의 sigA - vm 유전자를 함유하는 발현벡터.
a) 청구항 1의 sigA - vm 유전자를 발현벡터에 삽입하는 단계;
b) 상기 sigA - vm 유전자가 삽입된 발현벡터로 비리보솜성 펩타이드 화합물 생산 방선균을 형질전환시키는 단계; 및
c) 상기 b) 단계를 거쳐 형질전환된 방선균을 발현시키는 단계;를 포함하는 글라이코펩타이드 화합물의 생산증대방법.