DE19518150A1 - Mikrobiologisches Verfahren zur Herstellung von (S,S)-N,N'-Ethylendiamindibernsteinsäure - Google Patents
Mikrobiologisches Verfahren zur Herstellung von (S,S)-N,N'-EthylendiamindibernsteinsäureInfo
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Description
Die vorliegende Erfindung betrifft ein mikrobiologisches Verfahren zur Herstellung von
(S,S)-N,N′-Ethylendiamindibernsteinsäure (im folgenden mit "EDDS" abgekürzt).
Als Komplexbildner in Haushaltswaschmitteln werden in großem Umfang Ethylendiamin
tetraessigsäure (EDTA) und Nitrilotriessigsäure (NTA) eingesetzt. Allerdings sind diese be
kannten Komplexbildner biologisch sehr schwer abbaubar und werden bei der üblichen
biologischen Abwasserreinigung nicht zurückgehalten. Es ist bekannt, daß die (S,S)-Konfi
guration von EDDS gute komplexbildende Eigenschaften hat und gleichzeitig biologisch
abbaubar ist. Diese Verbindung könnte daher als Alternative zu EDTA und NTA eingesetzt
werden, vorausgesetzt, daß für diesen Komplexbildner ein kostengünstiges Herstellungs
verfahren möglich ist.
EDDS hat zwei asymmetrische Kohlenstoffatome. Es sind daher verschiedene stereoiso
mere Formen dieser Verbindung möglich. Die (S,S)-Konfiguration von EDDS entspricht der
Formel
Eine kostengünstige chemische Synthese führt zu einem Gemisch der drei Formen S,S;
R,R; und meso-EDDS. Die Auftrennung dieser stereoisomeren Verbindungen erfordert al
lerdings einen großen technischen Aufwand. Die bisher bekannten direkten Wege zur
Synthese von (S,S)-EDDS basieren auf Ausgangsmaterialien, die an sich kein kosten
mäßig vertretbares Produkt erlauben.
T. Nishikiori et al. haben einen Actinomycetenstamm gefunden, der in der Lage ist, optisch
reines (S,S)-EDDS zu produzieren (T. Nishikiori et al., Production by Actinomycetes of
(S,S)-N,N′-ethylenediaminedisuccinic acid, an inhibitor of phospholipase c; J.Antibiotics 37,
426427 (1984)). Auf der Suche nach Hemmstoffen der Phospholipase C aus einem
Actinomycetenstamm (MG 417-CF 17) wurde (S,S)-EDDS isoliert. Bei der Kultivierung des
Stammes auf einem komplexen Nährmedium, enthaltend 1,5% Baumwollsamenmehl, 1,5%
Glycerin, 2% L-Asparagin und 0,3% Kochsalz, wurden allerdings nur geringe Ausbeuten
von 170 mg/l EDDS erreicht. Außerdem ist die Isolierung sehr aufwendig und erfordert meh
rere Stufen.
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist daher, ein einfaches und kostengünstiges
mikrobiologisches Verfahren zur Herstellung von optisch reinem (S,S)-EDDS bereitzustel
len.
Überraschenderweise wurde nun gefunden, daß die Ausbeute von (S,S)-EDDS gesteigert
und die Aufarbeitung wesentlich vereinfacht werden können, wenn bei einem mikrobiologi
schen Herstellungsverfahren bestimmte optimierte Fermentationsbedingungen eingehalten
werden.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher ein mikrobiologisches Verfahren zur Her
stellung von N,N′-Ethylendiamindibernsteinsäure der Formel (1) durch
- (a) Vorkultivierung eines Stammes aus der Gattung Amycolatopsis auf einem vor gegebenen Nährmedium (1. Vorkultur),
- (b) Animpfung einer Nährlösung der gleichen Zusammensetzung wie die Basis des Pro duktionsfermenters durch die 1. Vorkultur (2. Vorkultur),
- (c) Animpfung der Basisnährlösung im Produktionsfermenter mit der 2. Vorkultur und Inku bation nach vorgegebenen Zeitplan, und
- (d) Zufütterung des Produktionsfermenters im Fed-Batch-Verfahren mit einer Feeding-Lö sung unter aeroben Bedingungen bei einem pH-Wert von 2 bis 8 und einer Temperatur von 15 bis 40°C, dadurch gekennzeichnet, daß die Basisnähr- und Feeding-Lösungen frei sind von zinkhaltigen Spurenelementen.
Für die Vorkultivierung des erfindungsgemäß verwendeten Stammes Amycolatopsis (1.
Vorkultur) kann entweder ein synthetisches oder ein natürliches Medium verwendet werden,
das die für das Wachstum der Mikroorganismen erforderlichen Nährstoffe enthält. Im
Rahmen der vorliegenden Erfindung wird die Vorkultivierung in einem wäßrigen Nähr
medium durchgeführt, das als Kohlenstoffquelle ein Kohlenhydrat, wie z. B. Glucose,
Galactose, Saccharose, Sojamehl usw. oder vorzugsweise Polyole, wie z. B. Glycerol.
Mannitol, usw. oder auch eine Mischung aus Kohlenhydraten und Polyolen enthält.
Anorganische Verbindungen, wie z. B. Dikaliumhydrogen-, Kaliumdihydrogen-, Dinatrium
hydrogen-. Natriumdihydrogenphosphat, Magnesiumsulfat, Magnesiumchlorid, Calcium
chlorid, Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Calciumnitrat oder Magnesiumnitrat usw. können
dem Medium zugegeben werden.
Die Vorkultivierung wird gewöhnlich als Schüttelkultur in einem Erlenmeyerkolben, bei
spielsweise in einem 500 ml Erlenmeyerkolben mit einem seitlichen Einstich und 100 ml
Nährlösung durchgeführt. Eine solche Nährlösung enthält z. B. 2% vollfettes Sojamehl, 2%
Glycerin und deionisiertes Wasser. Die Inkubation wird z. B. bei Temperaturen von 15 bis
40, vorzugsweise 25 bis 30°C während 24 bis 72, vorzugsweise 42 bis 50 Stunden, durch
geführt. Auf dieser Nährlösung wachsen die eingesetzten Stämme gut, bilden aber kein
EDDS.
Sodann impft man eine 2. Vorkultur mit ca. 5 Teilen (bezogen auf das Volumen der 2. Vor
kultur) auf einem Nährmedium an, das dem späteren Produktionsmedium im Fermenter
entspricht. Anschließend wird der Produktionsfermenter mit einem Teil dieser 2. Vorkultur
(ca. 5%) angeimpft. Auf diese Weise sinkt der ursprüngliche Anteil des Nährmediums auf
unter 0,05 g/l im Produktionsfermenter ab, was sich sehr günstig auf die spätere Aufarbei
tung auswirkt.
Die anschließende Fermentation erfolgt gewöhnlich in gerührten und belüfteten oder an
derweitig durchmischten Fermentern bei einer Temperatur von beispielsweise 15 bis 40,
vorzugsweise 25 bis 30°C und einem pH-Wert von beispielsweise 3 bis 8 zu Beginn der
Kultivierung.
Die Basisnährlösung im Fermenter besteht vorzugsweise im wesentlichen aus Glycerin und
zinkfreien anorganischen Salzen, wie z. B. Magnesiumsulfat, Kaliumdihydrogenphosphat,
Ammoniumhydrogenphosphat, Zitronensäure und Eisen(II)-citrat. Die die Basisnährlösung
bildenden Verbindungen werden vor dem Einsatz im Fermenter separat sterilisiert.
Eine für das erfindungsgemäße Verfahren typische Nährlösung hat z. B. die folgende Zu
sammensetzung:
10 bis 50, vorzugsweise 15 bis 30 g/l Glycerin,
0,5 bis 5, vorzugsweise 1 bis 2 g/l MgSO₄·7 H₂O,
7,5 bis 20, vorzugsweise 10 bis 15 g/l KH₂PO₄,
0,5 bis 20, vorzugsweise 1 bis 10 g/l (NH₄)₂HPO₄,
0,1 bis 5, vorzugsweise 0,5 bis 2 g/l Zitronensäure, und
25 bis 100, vorzugsweise 40 bis 80 mg/l Fe(III)-citrat.
10 bis 50, vorzugsweise 15 bis 30 g/l Glycerin,
0,5 bis 5, vorzugsweise 1 bis 2 g/l MgSO₄·7 H₂O,
7,5 bis 20, vorzugsweise 10 bis 15 g/l KH₂PO₄,
0,5 bis 20, vorzugsweise 1 bis 10 g/l (NH₄)₂HPO₄,
0,1 bis 5, vorzugsweise 0,5 bis 2 g/l Zitronensäure, und
25 bis 100, vorzugsweise 40 bis 80 mg/l Fe(III)-citrat.
Die Anzucht der Hauptkultur erfolgt im Batch-Verfahren, bis anhand der pO₂-Kurve eine C-
Limitierung erkennbar ist. Ab diesem Zeitpunkt (ca. 48 Stunden) muß spätestens mit der
Zufütterung begonnen werden (Fed-Batch-Verfahren).
Die Zufütterung (feeding) des Fermenters erfolgt gewöhnlich mit einer kohlenstoffhaltigen
Verbindung, wobei vorzugsweise Glycerin oder eine Mischung aus Glycerin, Glutaminsäure
und Magnesiumsulfat verwendet wird. Die Zufütterung erfolgt gewöhnlich bei statischem
pH-Wert, der zwischen 3 und 8 liegt. Der pH-Wert wird bei Zufütterung von Glycerin alleine
mit Ammoniumsulfat und Schwefelsäure eingestellt, bei Zufütterung des Gemisch es aus
Glycerin, Glutaminsäure und Magnesiumsulfat erfolgt die Einstellung des pH-Wertes mit
Natriumhydroxid und Schwefelsäure.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren im Fed-Batch-Verfahren unter Zinkmangel-Be
dingungen, d. h. mit Zufütterung von Glycerin alleine werden nach einer Zufütterungszeit
von 72 Stunden Ausbeuten von ca. 4 bis 5 g/l Kultur erzielt. Erfolgt die Zufütterung mit ei
nem Glycerin-Glutaminsäuregemisch, lassen sich die Ausbeuten nochmals steigern. Mit
diesem Gemisch lassen sich, wenn Glycerin und Glutaminsäure im molaren Verhältnis von
31 : 1 bis 4 : 1 eingesetzt werden, nach einer Zufütterungszeit von 155 Stunden, 10 g/l Pro
dukt gewinnen.
Bei einem Verfahren aus dem Stand der Technik, d. h. bei einer reinen Batch-Fermentation
mit der Basisnährlösung, werden hingegen lediglich Ausbeuten von ca. 1 bis 1,5 g/l erreicht.
Zur Aufarbeitung der Kultur nach beendeter Fermentation wird diese, gegebenenfalls unter
Zusatz eines Filterhilfsmittels, wie z. B. Hyflo, abfiltriert. Das Kulturfiltrat wird sodann z. B. mit
Salzsäure auf einen stark sauren pH-Wert, z. B. von 1,5 bis 2 eingestellt, abgekühlt und ca.
8 bis 12 Stunden bei ca. 4 C aufbewahrt. Das auskristallisierte (S,S)-EDDS wird abfiltriert
und anschließend umkristallisiert. Das anfallende Rohprodukt enthält über 90% (S,S)-
EDDS. Aus dem Filterrückstand wird weiteres EDDS gewonnen. Die vereinigten Rohpräpa
rate werden sodann umkristallisiert, vorzugsweise aus heißem deionisiertem Wasser und
abgekühlt. Das anfallende Produkt enthält gewöhnlich mehr als 90% (S,S)-EDDS.
Das erfindungsgemäß hergestellte (S,S)-EDDS findet Verwendung als Komplexbildner,
vorzugsweise in Haushaltswaschmitteln. Der in Waschmitteln eingesetzte Komplexbildner
hat die Aufgabe, während des Waschvorgangs durch Bildung von wasserlöslichen Kom
plexen anfallende Fällungen von Erdalkalimetallsalzen, vorzugsweise Calcium- und Mag
nesiumsalzen, die sich auf Wäsche und Geräten als störende Ablagerungen festsetzen und
nach mehreren Waschvorgängen kumulieren können, zu verhindern. Besonders ungünstige
Verhältnisse liegen vor, wenn der Komplexbildner in unterstöchiometrischem Verhältnis in
bezug auf mehrwertige Metallionen vorliegt, beispielsweise beim Spülvorgang. Es kommt
dann vorwiegend zur Ausfällung von Carbonaten und unlöslichen Salzen der Komplexbild
ner mit den Härtebildnern des Wassers. Es kann dann vorkommen, daß durch Kristallisa
tionskeime auf Textilien oder Waschmaschinenteilen größere Kristalle auswachsen. Das er
findungsgemäß hergestellte (S,S)-EDDS, die wie EDTA mit dem entsprechenden Metallion
einen Chelatkomplex bildet, ist in der Lage, die Ausfällung unlöslicher Salze auch bei An
wendung unterstöchiometrischer Mengen an Komplexbildnern zu verhindern oder kann
zumindest bewirken, daß die unlöslichen Salze in amorpher Form anfallen und die Bildung
von scharfkantigen, faserschädigenden Kristallen (z. B. Calcit-Kristalle) weitgehend zurück
gedrängt wird.
Die folgenden Beispiele dienen zur Veranschaulichung der Erfindung.
Für die mikrobiologische Herstellung von (S,S)-EDDS werden die folgenden
Produktionsstämme verwendet:
- 1. Amycolatopsis orientalis, Stamm Nr. MG 41 7-CFI 7 der Sammlung des Instituts of Micro bial Chemistry, Tokyo;
- 2. Amycolatopsis orientalis ssp. iurida, Deutsche Sammlung von Mikroorganismen Nr. 43134; der Stamm wurde ursprünglich als Produzent von Ristocetin beschrieben;
- 3. Amycolatopsis orientalis, ssp. Iurida, Stamm Nr. 7654 des IMET (= externe Sektion der DSM, Jena).
Die Anzucht des Impfmaterials erfolgt in zwei Vorkulturen.
Die Anzucht erfolgt als Schüttelkultur in einem 500 ml Erlenmeyerkolben mit
seitlichem Einstich und 100 ml Nährlösung der folgenden Zusammensetzung:
2% vollfettes Sojamehl;
2% Glycerin, sowie
deionisiertes Wasser, ad 100%.
Die Inkubation erfolgt 48 Stunden bei einer Temperatur von 27°C.
2% vollfettes Sojamehl;
2% Glycerin, sowie
deionisiertes Wasser, ad 100%.
Die Inkubation erfolgt 48 Stunden bei einer Temperatur von 27°C.
Auf dieser Nährlösung wachsen die Stämme gut, bilden aber kein EDDS.
Eine 2. Vorkultur wird mit 5% der 1. Vorkultur auf dem Produktionsmedium
angeimpft. Die Inkubation erfolgt 48 Stunden bei einer Temperatur von 27°C. Das Pro
duktionsmedium hat die folgende Zusammensetzung:
25 g/l Glycerin,
1,2g/l MgSO₄ ·7H₂O,
13,3 g/l KH₂PO₄,
4,0 g/l (NH₄)₂HPO₄₁
1,7 g/l Zitronensäure,
60 mg/l Fe(lll)-citrat, sowie
deionisiertes Wasser, ad 100%.
25 g/l Glycerin,
1,2g/l MgSO₄ ·7H₂O,
13,3 g/l KH₂PO₄,
4,0 g/l (NH₄)₂HPO₄₁
1,7 g/l Zitronensäure,
60 mg/l Fe(lll)-citrat, sowie
deionisiertes Wasser, ad 100%.
Glycerin und MgSO₄·7H₂O werden separat sterilisiert. Die Nährlösung wird 30 Minuten bei
121°C sterilisiert.
Sodann impft man eine 2. Vorkultur mit ca. 5 Teilen (bezogen auf das Volumen der 2. Vor
kultur) auf einem Nährmedium an, das dem späteren Produktionsmedium im Fermenter
entspricht. Anschließend wird der Produktionsfermenter mit einem Teil dieser 2. Vorkultur
(ca. 5%) angeimpft. Auf diese Weise sinkt der ursprüngliche Anteil an Sojamehl von 20 g/l
in der ersten Schüttelkultur auf unter 0,05 g/l im Produktionsfermenter ab, was sich sehr
günstig auf die spätere Aufarbeitung auswirkt.
Die Anzucht erfolgt im Batch-Verfahren, bis anhand der pO₂-Kurve eine C-Limitierung er
kennbar ist. Ab diesem Zeitpunkt (ca. 48 Stunden) wird spätestens mit der Zufütterung be
gonnen.
Die Fermentation wird im Fed-Batch-Verfahren in einem handelsüblichen 5 l Fermenter
durchgeführt. Die Inkubation erfolgt bei statischem pH-Wert von 6,8. Als Feeding-Lösung
wird eine wäßrige, 88,5%ige Glycerin-Lösung verwendet. Der pH-Wert wird mit NH₄OH und
H₂SO₄ eingestellt. Es wird dabei streng darauf geachtet, daß die Feeding-Lösung weitest
gehend frei von Zink-Spurenelementen ist, d. h. die Konzentration an Zn2+-Ionen den Wert
von 2 µmol nicht überschreiten darf.
Der Sauerstoffpartialdruck wird ab Beginn der Zufütterung auf pO₂ 10% reguliert. Die Zu
fütterungsrate beträgt 12 ml/h Feeding-Lösung. Nach einer Zufütterungszeit von 72 Stun
den werden 4,3 bis 4,8 g/l EDDS gewonnen.
Die Aufarbeitung wird folgendermaßen durchgeführt: die gewonnene Kultur (pH-Wert 6,8
bis 7,0) wird unter Zusatz von 2% Hyflo-Super-Cel abfiltriert. Das Kulturfiltrat wird mit Salz
säure auf pH 1,5 bis 1 ,8 eingestellt, abgekühlt und 8 bis 12 Stunden bei 4°C aufbewahrt.
Das auskristallisierte (S,S)-EDDS wird abfiltriert und anschließend umkristallisiert. Das an
fallende Rohprodukt enthält über 90% EDDS. Der Filterrückstand wird mit kalter, stark ver
dünnter Salzsäure (0,01 N) nachgewaschen, anschließend unter Rühren mit 5N NaOH auf
pH 8 eingestellt, abfiltriert und das Filtrat erneut mit konz. Salzsäure auf pH 1,5 eingestellt,
wobei das EDDS ausfällt. Zur Umkristallisation werden die Rohpräparate in heißem deioni
siertem Wasser gelöst und anschließend langsam bis auf 4°C abgekühlt. Das anfallende
Produkt enthält mehr als 90% (S,S)-EDDS.
Man verfährt wie in Beispiel 1 beschrieben, mit dem Unterschied daß man an
stelle von Glycerin alleine als Feeding-Lösung ein Gemisch aus Glycerin, Glutaminsäure
und MgSO₄ verwendet, die folgendermaßen hergestellt wird:
888 g 88,5%iges Glycerin und
64g MgSO₄ · 7H₂O
werden mit Wasser versetzt und im Autoklaven sterilisiert.
465 g Na-Glutamat werden in
3077 ml deionisiertem Wasser gelöst und separat sterilisiert.
Die beiden sterilen Lösungen werden sodann vereinigt.
888 g 88,5%iges Glycerin und
64g MgSO₄ · 7H₂O
werden mit Wasser versetzt und im Autoklaven sterilisiert.
465 g Na-Glutamat werden in
3077 ml deionisiertem Wasser gelöst und separat sterilisiert.
Die beiden sterilen Lösungen werden sodann vereinigt.
Auch hier wird streng darauf geachtet, daß die Feeding-Lösung weitestgehend frei von
Zink-Spurenelementen ist, d. h. die Konzentration an Zn2+-Ionen den Wert von 2 µmol nicht
überschreiten darf.
Der pH-Wert von 6,8 wird mit SN Natriumhydroxid-Lösung und 5N H₂SO₄eingestellt.
Die Zufütterungsrate beträgt 12 ml/h Feeding-Lösung. Nach einer Zufütterungszeit von 155
Stunden werden 10 g/l EDDS gewonnen.
(S,S)-EDDS wird als Cu2+-Komplex mit Hilfe der Ionenpaar-HPLC bestimmt.
Verwendete Säule: Shandon ODS Hypersil (5µm) 125×4,6 mm ⌀, l.D., mit Vorsäule 20×4,6
mm I.D. mit gleicher Füllung.
(A) 10 mM Natrium-Phosphat-Puffer (pH-Wert 7,2) mit 5 mM TBA
(B) Acetonitril
(B) Acetonitril
Fließrate: 2 ml/min
Detektion: 253 nm
Detektion: 253 nm
Die Kulturbrühe wird zentrifugiert, gegebenenfalls verdünnt. 1 ml wird
mit 20 µl einer 100 mM CuSO₄-Lösung versetzt und erneut zentrifugiert. Der Überstand wird
zur Analyse verwendet.
Injektionsvolumen: 20 µl.
Injektionsvolumen: 20 µl.
Claims (6)
1. Verfahren zur Herstellung von N,N′-Ethylendiamindibernsteinsäure der Formel
durch
- (a) Vorkultivierung eines Stammes aus der Gattung Amycolatopsis orientalis auf einem vor gegebenen Nährmedium (1. Vorkultur),
- (b) Animpfung einer Nährlösung der gleichen Zusammensetzung wie die Basis des Pro duktionsfermenters durch die 1. Vorkultur (2. Vorkultur),
- (c) Animpfung der Basisnährlösung im Produktionsfermenter mit der 2. Vorkultur und Inku bation nach vorgegebenen Zeitplan, und
- (d) Zufütterung des Produktionsfermenters im Fed-Batch-Verfahren mit einer Feeding-Lö sung unter aeroben Bedingungen bei einem pH-Wert von 2 bis 8 und einer Temperatur von 15 bis 40°C, dadurch gekennzeichnet, daß die Basisnähr- und Feeding-Lösungen frei sind von zinkhaltigen Spurenelementen.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Basisnährlösung als
Hauptbestandteil Glycerin enthält.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Basisnährlösung
aus
10 bis 50 g/l Glycerin,
0,5 bis 5 g/l MgSO₄·7H₂O,
7,5 bis 20 g/l KH₂PO₄,
0,5 bis 20 g/l (NH₄)₂HPO₄,
0,1 bis 5 g/l Zitronensäure, und
25 bis 100 mg/l Fe(III)-citrat
besteht.
10 bis 50 g/l Glycerin,
0,5 bis 5 g/l MgSO₄·7H₂O,
7,5 bis 20 g/l KH₂PO₄,
0,5 bis 20 g/l (NH₄)₂HPO₄,
0,1 bis 5 g/l Zitronensäure, und
25 bis 100 mg/l Fe(III)-citrat
besteht.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Fee
ding-Lösung aus
- (a) Glycerin oder aus
- (b) einer Mischung aus Glycerin, Glutaminsäure und MgSO₄ besteht.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Fed-
Batchverfahren bei konstantem pH-Wert durchgeführt wird.
6. Verwendung der nach den Verfahren gemäß Anspruch 1 bis 5 hergestellten N,N′-Ethy
lendiamindibernsteinsäure als Komplexbildner für Waschmittel.
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EP96919670A EP0827548B1 (de) | 1995-05-17 | 1996-05-04 | Mikrobiologisches verfahren zur herstellung von (s,s) äthylendiamin-n,n'-di-bernsteinsäure |
JP8534509A JPH11505117A (ja) | 1995-05-17 | 1996-05-04 | (s、s)−n、n’−エチレンジアミン二コハク酸の微生物学的製造方法 |
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AT96919670T ATE213781T1 (de) | 1995-05-17 | 1996-05-04 | Mikrobiologisches verfahren zur herstellung von (s,s) äthylendiamin-n,n'-di-bernsteinsäure |
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AT (1) | ATE213781T1 (de) |
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DE (2) | DE19518150A1 (de) |
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