DE19518150A1

DE19518150A1 - Mikrobiologisches Verfahren zur Herstellung von (S,S)-N,N'-Ethylendiamindibernsteinsäure

Info

Publication number: DE19518150A1
Application number: DE19518150A
Authority: DE
Inventors: Hans Prof Dr Zaehner; Ingeborg Dr Cebulla; Michael Dr Harder
Original assignee: Ciba Geigy AG
Current assignee: BASF Schweiz AG
Priority date: 1995-05-17
Filing date: 1995-05-17
Publication date: 1996-11-21
Also published as: DE69619515D1; EP0827548B1; ATE213781T1; ES2171684T3; AU5813696A; EP0827548A1; WO1996036725A1; US5874262A; JPH11505117A; DE69619515T2

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein mikrobiologisches Verfahren zur Herstellung von (S,S)-N,N′-Ethylendiamindibernsteinsäure (im folgenden mit "EDDS" abgekürzt).

Als Komplexbildner in Haushaltswaschmitteln werden in großem Umfang Ethylendiamin tetraessigsäure (EDTA) und Nitrilotriessigsäure (NTA) eingesetzt. Allerdings sind diese be kannten Komplexbildner biologisch sehr schwer abbaubar und werden bei der üblichen biologischen Abwasserreinigung nicht zurückgehalten. Es ist bekannt, daß die (S,S)-Konfi guration von EDDS gute komplexbildende Eigenschaften hat und gleichzeitig biologisch abbaubar ist. Diese Verbindung könnte daher als Alternative zu EDTA und NTA eingesetzt werden, vorausgesetzt, daß für diesen Komplexbildner ein kostengünstiges Herstellungs verfahren möglich ist.

EDDS hat zwei asymmetrische Kohlenstoffatome. Es sind daher verschiedene stereoiso mere Formen dieser Verbindung möglich. Die (S,S)-Konfiguration von EDDS entspricht der Formel

Eine kostengünstige chemische Synthese führt zu einem Gemisch der drei Formen S,S; R,R; und meso-EDDS. Die Auftrennung dieser stereoisomeren Verbindungen erfordert al lerdings einen großen technischen Aufwand. Die bisher bekannten direkten Wege zur Synthese von (S,S)-EDDS basieren auf Ausgangsmaterialien, die an sich kein kosten mäßig vertretbares Produkt erlauben.

T. Nishikiori et al. haben einen Actinomycetenstamm gefunden, der in der Lage ist, optisch reines (S,S)-EDDS zu produzieren (T. Nishikiori et al., Production by Actinomycetes of (S,S)-N,N′-ethylenediaminedisuccinic acid, an inhibitor of phospholipase c; J.Antibiotics 37, 426427 (1984)). Auf der Suche nach Hemmstoffen der Phospholipase C aus einem Actinomycetenstamm (MG 417-CF 17) wurde (S,S)-EDDS isoliert. Bei der Kultivierung des Stammes auf einem komplexen Nährmedium, enthaltend 1,5% Baumwollsamenmehl, 1,5% Glycerin, 2% L-Asparagin und 0,3% Kochsalz, wurden allerdings nur geringe Ausbeuten von 170 mg/l EDDS erreicht. Außerdem ist die Isolierung sehr aufwendig und erfordert meh rere Stufen.

Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist daher, ein einfaches und kostengünstiges mikrobiologisches Verfahren zur Herstellung von optisch reinem (S,S)-EDDS bereitzustel len.

Überraschenderweise wurde nun gefunden, daß die Ausbeute von (S,S)-EDDS gesteigert und die Aufarbeitung wesentlich vereinfacht werden können, wenn bei einem mikrobiologi schen Herstellungsverfahren bestimmte optimierte Fermentationsbedingungen eingehalten werden.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher ein mikrobiologisches Verfahren zur Her stellung von N,N′-Ethylendiamindibernsteinsäure der Formel (1) durch

(a) Vorkultivierung eines Stammes aus der Gattung Amycolatopsis auf einem vor gegebenen Nährmedium (1. Vorkultur),
(b) Animpfung einer Nährlösung der gleichen Zusammensetzung wie die Basis des Pro duktionsfermenters durch die 1. Vorkultur (2. Vorkultur),
(c) Animpfung der Basisnährlösung im Produktionsfermenter mit der 2. Vorkultur und Inku bation nach vorgegebenen Zeitplan, und
(d) Zufütterung des Produktionsfermenters im Fed-Batch-Verfahren mit einer Feeding-Lö sung unter aeroben Bedingungen bei einem pH-Wert von 2 bis 8 und einer Temperatur von 15 bis 40°C, dadurch gekennzeichnet, daß die Basisnähr- und Feeding-Lösungen frei sind von zinkhaltigen Spurenelementen.

Für die Vorkultivierung des erfindungsgemäß verwendeten Stammes Amycolatopsis (1. Vorkultur) kann entweder ein synthetisches oder ein natürliches Medium verwendet werden, das die für das Wachstum der Mikroorganismen erforderlichen Nährstoffe enthält. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wird die Vorkultivierung in einem wäßrigen Nähr medium durchgeführt, das als Kohlenstoffquelle ein Kohlenhydrat, wie z. B. Glucose, Galactose, Saccharose, Sojamehl usw. oder vorzugsweise Polyole, wie z. B. Glycerol. Mannitol, usw. oder auch eine Mischung aus Kohlenhydraten und Polyolen enthält.

Anorganische Verbindungen, wie z. B. Dikaliumhydrogen-, Kaliumdihydrogen-, Dinatrium hydrogen-. Natriumdihydrogenphosphat, Magnesiumsulfat, Magnesiumchlorid, Calcium chlorid, Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Calciumnitrat oder Magnesiumnitrat usw. können dem Medium zugegeben werden.

Die Vorkultivierung wird gewöhnlich als Schüttelkultur in einem Erlenmeyerkolben, bei spielsweise in einem 500 ml Erlenmeyerkolben mit einem seitlichen Einstich und 100 ml Nährlösung durchgeführt. Eine solche Nährlösung enthält z. B. 2% vollfettes Sojamehl, 2% Glycerin und deionisiertes Wasser. Die Inkubation wird z. B. bei Temperaturen von 15 bis 40, vorzugsweise 25 bis 30°C während 24 bis 72, vorzugsweise 42 bis 50 Stunden, durch geführt. Auf dieser Nährlösung wachsen die eingesetzten Stämme gut, bilden aber kein EDDS.

Sodann impft man eine 2. Vorkultur mit ca. 5 Teilen (bezogen auf das Volumen der 2. Vor kultur) auf einem Nährmedium an, das dem späteren Produktionsmedium im Fermenter entspricht. Anschließend wird der Produktionsfermenter mit einem Teil dieser 2. Vorkultur (ca. 5%) angeimpft. Auf diese Weise sinkt der ursprüngliche Anteil des Nährmediums auf unter 0,05 g/l im Produktionsfermenter ab, was sich sehr günstig auf die spätere Aufarbei tung auswirkt.

Die anschließende Fermentation erfolgt gewöhnlich in gerührten und belüfteten oder an derweitig durchmischten Fermentern bei einer Temperatur von beispielsweise 15 bis 40, vorzugsweise 25 bis 30°C und einem pH-Wert von beispielsweise 3 bis 8 zu Beginn der Kultivierung.

Die Basisnährlösung im Fermenter besteht vorzugsweise im wesentlichen aus Glycerin und zinkfreien anorganischen Salzen, wie z. B. Magnesiumsulfat, Kaliumdihydrogenphosphat, Ammoniumhydrogenphosphat, Zitronensäure und Eisen(II)-citrat. Die die Basisnährlösung bildenden Verbindungen werden vor dem Einsatz im Fermenter separat sterilisiert.

Eine für das erfindungsgemäße Verfahren typische Nährlösung hat z. B. die folgende Zu sammensetzung:
10 bis 50, vorzugsweise 15 bis 30 g/l Glycerin,
0,5 bis 5, vorzugsweise 1 bis 2 g/l MgSO₄·7 H₂O,
7,5 bis 20, vorzugsweise 10 bis 15 g/l KH₂PO₄,
0,5 bis 20, vorzugsweise 1 bis 10 g/l (NH₄)₂HPO₄,
0,1 bis 5, vorzugsweise 0,5 bis 2 g/l Zitronensäure, und
25 bis 100, vorzugsweise 40 bis 80 mg/l Fe(III)-citrat.

Die Anzucht der Hauptkultur erfolgt im Batch-Verfahren, bis anhand der pO₂-Kurve eine C- Limitierung erkennbar ist. Ab diesem Zeitpunkt (ca. 48 Stunden) muß spätestens mit der Zufütterung begonnen werden (Fed-Batch-Verfahren).

Die Zufütterung (feeding) des Fermenters erfolgt gewöhnlich mit einer kohlenstoffhaltigen Verbindung, wobei vorzugsweise Glycerin oder eine Mischung aus Glycerin, Glutaminsäure und Magnesiumsulfat verwendet wird. Die Zufütterung erfolgt gewöhnlich bei statischem pH-Wert, der zwischen 3 und 8 liegt. Der pH-Wert wird bei Zufütterung von Glycerin alleine mit Ammoniumsulfat und Schwefelsäure eingestellt, bei Zufütterung des Gemisch es aus Glycerin, Glutaminsäure und Magnesiumsulfat erfolgt die Einstellung des pH-Wertes mit Natriumhydroxid und Schwefelsäure.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren im Fed-Batch-Verfahren unter Zinkmangel-Be dingungen, d. h. mit Zufütterung von Glycerin alleine werden nach einer Zufütterungszeit von 72 Stunden Ausbeuten von ca. 4 bis 5 g/l Kultur erzielt. Erfolgt die Zufütterung mit ei nem Glycerin-Glutaminsäuregemisch, lassen sich die Ausbeuten nochmals steigern. Mit diesem Gemisch lassen sich, wenn Glycerin und Glutaminsäure im molaren Verhältnis von 31 : 1 bis 4 : 1 eingesetzt werden, nach einer Zufütterungszeit von 155 Stunden, 10 g/l Pro dukt gewinnen.

Bei einem Verfahren aus dem Stand der Technik, d. h. bei einer reinen Batch-Fermentation mit der Basisnährlösung, werden hingegen lediglich Ausbeuten von ca. 1 bis 1,5 g/l erreicht.

Zur Aufarbeitung der Kultur nach beendeter Fermentation wird diese, gegebenenfalls unter Zusatz eines Filterhilfsmittels, wie z. B. Hyflo, abfiltriert. Das Kulturfiltrat wird sodann z. B. mit Salzsäure auf einen stark sauren pH-Wert, z. B. von 1,5 bis 2 eingestellt, abgekühlt und ca. 8 bis 12 Stunden bei ca. 4 C aufbewahrt. Das auskristallisierte (S,S)-EDDS wird abfiltriert und anschließend umkristallisiert. Das anfallende Rohprodukt enthält über 90% (S,S)- EDDS. Aus dem Filterrückstand wird weiteres EDDS gewonnen. Die vereinigten Rohpräpa rate werden sodann umkristallisiert, vorzugsweise aus heißem deionisiertem Wasser und abgekühlt. Das anfallende Produkt enthält gewöhnlich mehr als 90% (S,S)-EDDS.

Das erfindungsgemäß hergestellte (S,S)-EDDS findet Verwendung als Komplexbildner, vorzugsweise in Haushaltswaschmitteln. Der in Waschmitteln eingesetzte Komplexbildner hat die Aufgabe, während des Waschvorgangs durch Bildung von wasserlöslichen Kom plexen anfallende Fällungen von Erdalkalimetallsalzen, vorzugsweise Calcium- und Mag nesiumsalzen, die sich auf Wäsche und Geräten als störende Ablagerungen festsetzen und nach mehreren Waschvorgängen kumulieren können, zu verhindern. Besonders ungünstige Verhältnisse liegen vor, wenn der Komplexbildner in unterstöchiometrischem Verhältnis in bezug auf mehrwertige Metallionen vorliegt, beispielsweise beim Spülvorgang. Es kommt dann vorwiegend zur Ausfällung von Carbonaten und unlöslichen Salzen der Komplexbild ner mit den Härtebildnern des Wassers. Es kann dann vorkommen, daß durch Kristallisa tionskeime auf Textilien oder Waschmaschinenteilen größere Kristalle auswachsen. Das er findungsgemäß hergestellte (S,S)-EDDS, die wie EDTA mit dem entsprechenden Metallion einen Chelatkomplex bildet, ist in der Lage, die Ausfällung unlöslicher Salze auch bei An wendung unterstöchiometrischer Mengen an Komplexbildnern zu verhindern oder kann zumindest bewirken, daß die unlöslichen Salze in amorpher Form anfallen und die Bildung von scharfkantigen, faserschädigenden Kristallen (z. B. Calcit-Kristalle) weitgehend zurück gedrängt wird.

Die folgenden Beispiele dienen zur Veranschaulichung der Erfindung.

Herstellungsbeispiele Beispiel 1

Für die mikrobiologische Herstellung von (S,S)-EDDS werden die folgenden Produktionsstämme verwendet:

1. Amycolatopsis orientalis, Stamm Nr. MG 41 7-CFI 7 der Sammlung des Instituts of Micro bial Chemistry, Tokyo;
2. Amycolatopsis orientalis ssp. iurida, Deutsche Sammlung von Mikroorganismen Nr. 43134; der Stamm wurde ursprünglich als Produzent von Ristocetin beschrieben;
3. Amycolatopsis orientalis, ssp. Iurida, Stamm Nr. 7654 des IMET (= externe Sektion der DSM, Jena).

Die Anzucht des Impfmaterials erfolgt in zwei Vorkulturen.

1. Vorkultur

Die Anzucht erfolgt als Schüttelkultur in einem 500 ml Erlenmeyerkolben mit seitlichem Einstich und 100 ml Nährlösung der folgenden Zusammensetzung:
2% vollfettes Sojamehl;
2% Glycerin, sowie
deionisiertes Wasser, ad 100%.
Die Inkubation erfolgt 48 Stunden bei einer Temperatur von 27°C.

Auf dieser Nährlösung wachsen die Stämme gut, bilden aber kein EDDS.

2. Vorkultur

Eine 2. Vorkultur wird mit 5% der 1. Vorkultur auf dem Produktionsmedium angeimpft. Die Inkubation erfolgt 48 Stunden bei einer Temperatur von 27°C. Das Pro duktionsmedium hat die folgende Zusammensetzung:
25 g/l Glycerin,
1,2g/l MgSO₄ ·7H₂O,
13,3 g/l KH₂PO₄,
4,0 g/l (NH₄)₂HPO₄₁
1,7 g/l Zitronensäure,
60 mg/l Fe(lll)-citrat, sowie
deionisiertes Wasser, ad 100%.

Glycerin und MgSO₄·7H₂O werden separat sterilisiert. Die Nährlösung wird 30 Minuten bei 121°C sterilisiert.

Sodann impft man eine 2. Vorkultur mit ca. 5 Teilen (bezogen auf das Volumen der 2. Vor kultur) auf einem Nährmedium an, das dem späteren Produktionsmedium im Fermenter entspricht. Anschließend wird der Produktionsfermenter mit einem Teil dieser 2. Vorkultur (ca. 5%) angeimpft. Auf diese Weise sinkt der ursprüngliche Anteil an Sojamehl von 20 g/l in der ersten Schüttelkultur auf unter 0,05 g/l im Produktionsfermenter ab, was sich sehr günstig auf die spätere Aufarbeitung auswirkt.

Die Anzucht erfolgt im Batch-Verfahren, bis anhand der pO₂-Kurve eine C-Limitierung er kennbar ist. Ab diesem Zeitpunkt (ca. 48 Stunden) wird spätestens mit der Zufütterung be gonnen.

Die Fermentation wird im Fed-Batch-Verfahren in einem handelsüblichen 5 l Fermenter durchgeführt. Die Inkubation erfolgt bei statischem pH-Wert von 6,8. Als Feeding-Lösung wird eine wäßrige, 88,5%ige Glycerin-Lösung verwendet. Der pH-Wert wird mit NH₄OH und H₂SO₄ eingestellt. Es wird dabei streng darauf geachtet, daß die Feeding-Lösung weitest gehend frei von Zink-Spurenelementen ist, d. h. die Konzentration an Zn²⁺-Ionen den Wert von 2 µmol nicht überschreiten darf.

Der Sauerstoffpartialdruck wird ab Beginn der Zufütterung auf pO₂ 10% reguliert. Die Zu fütterungsrate beträgt 12 ml/h Feeding-Lösung. Nach einer Zufütterungszeit von 72 Stun den werden 4,3 bis 4,8 g/l EDDS gewonnen.

Die Aufarbeitung wird folgendermaßen durchgeführt: die gewonnene Kultur (pH-Wert 6,8 bis 7,0) wird unter Zusatz von 2% Hyflo-Super-Cel abfiltriert. Das Kulturfiltrat wird mit Salz säure auf pH 1,5 bis 1 ,8 eingestellt, abgekühlt und 8 bis 12 Stunden bei 4°C aufbewahrt. Das auskristallisierte (S,S)-EDDS wird abfiltriert und anschließend umkristallisiert. Das an fallende Rohprodukt enthält über 90% EDDS. Der Filterrückstand wird mit kalter, stark ver dünnter Salzsäure (0,01 N) nachgewaschen, anschließend unter Rühren mit 5N NaOH auf pH 8 eingestellt, abfiltriert und das Filtrat erneut mit konz. Salzsäure auf pH 1,5 eingestellt, wobei das EDDS ausfällt. Zur Umkristallisation werden die Rohpräparate in heißem deioni siertem Wasser gelöst und anschließend langsam bis auf 4°C abgekühlt. Das anfallende Produkt enthält mehr als 90% (S,S)-EDDS.

Beispiel 2

Man verfährt wie in Beispiel 1 beschrieben, mit dem Unterschied daß man an stelle von Glycerin alleine als Feeding-Lösung ein Gemisch aus Glycerin, Glutaminsäure und MgSO₄ verwendet, die folgendermaßen hergestellt wird:
888 g 88,5%iges Glycerin und
64g MgSO₄ · 7H₂O
werden mit Wasser versetzt und im Autoklaven sterilisiert.
465 g Na-Glutamat werden in
3077 ml deionisiertem Wasser gelöst und separat sterilisiert.
Die beiden sterilen Lösungen werden sodann vereinigt.

Auch hier wird streng darauf geachtet, daß die Feeding-Lösung weitestgehend frei von Zink-Spurenelementen ist, d. h. die Konzentration an Zn²⁺-Ionen den Wert von 2 µmol nicht überschreiten darf.

Der pH-Wert von 6,8 wird mit SN Natriumhydroxid-Lösung und 5N H₂SO₄eingestellt.

Die Zufütterungsrate beträgt 12 ml/h Feeding-Lösung. Nach einer Zufütterungszeit von 155 Stunden werden 10 g/l EDDS gewonnen.

Bestimmung von (S,S)-EDDS mit Hilfe der HPLC

(S,S)-EDDS wird als Cu²⁺-Komplex mit Hilfe der Ionenpaar-HPLC bestimmt. Verwendete Säule: Shandon ODS Hypersil (5µm) 125×4,6 mm ⌀, l.D., mit Vorsäule 20×4,6 mm I.D. mit gleicher Füllung.

Fließmittel

(A) 10 mM Natrium-Phosphat-Puffer (pH-Wert 7,2) mit 5 mM TBA
(B) Acetonitril

Gradient

Fließrate: 2 ml/min
Detektion: 253 nm

Probenaufbereitung

Die Kulturbrühe wird zentrifugiert, gegebenenfalls verdünnt. 1 ml wird mit 20 µl einer 100 mM CuSO₄-Lösung versetzt und erneut zentrifugiert. Der Überstand wird zur Analyse verwendet.
Injektionsvolumen: 20 µl.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung von N,N′-Ethylendiamindibernsteinsäure der Formel durch

(a) Vorkultivierung eines Stammes aus der Gattung Amycolatopsis orientalis auf einem vor gegebenen Nährmedium (1. Vorkultur),
(b) Animpfung einer Nährlösung der gleichen Zusammensetzung wie die Basis des Pro duktionsfermenters durch die 1. Vorkultur (2. Vorkultur),
(c) Animpfung der Basisnährlösung im Produktionsfermenter mit der 2. Vorkultur und Inku bation nach vorgegebenen Zeitplan, und
(d) Zufütterung des Produktionsfermenters im Fed-Batch-Verfahren mit einer Feeding-Lö sung unter aeroben Bedingungen bei einem pH-Wert von 2 bis 8 und einer Temperatur von 15 bis 40°C, dadurch gekennzeichnet, daß die Basisnähr- und Feeding-Lösungen frei sind von zinkhaltigen Spurenelementen.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Basisnährlösung als Hauptbestandteil Glycerin enthält.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Basisnährlösung aus
10 bis 50 g/l Glycerin,
0,5 bis 5 g/l MgSO₄·7H₂O,
7,5 bis 20 g/l KH₂PO₄,
0,5 bis 20 g/l (NH₄)₂HPO₄,
0,1 bis 5 g/l Zitronensäure, und
25 bis 100 mg/l Fe(III)-citrat
besteht.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Fee ding-Lösung aus

(a) Glycerin oder aus
(b) einer Mischung aus Glycerin, Glutaminsäure und MgSO₄ besteht.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Fed- Batchverfahren bei konstantem pH-Wert durchgeführt wird.

6. Verwendung der nach den Verfahren gemäß Anspruch 1 bis 5 hergestellten N,N′-Ethy lendiamindibernsteinsäure als Komplexbildner für Waschmittel.