ES2745975T3 - Genes y proteínas de biosíntesis de [S,S]-EDDS y método para la biosíntesis de [S,S]-EDDS - Google Patents

Abstract

Proteína o péptido aislado que es funcional para un paso de síntesis parcial de la biosíntesis de [S,S]-etilendiaminodisuccinato, que contiene o consistente en una secuencia aminoacídica que se selecciona del grupo consistente en SEQ ID NO 39, SEQ ID NO 41, SEQ ID NO 43, SEQ ID NO 45, SEQ ID NO 47, SEQ ID NO 49, SEQ ID NO 51, SEQ ID NO 53 y combinaciones de las mismas.

Description

DESCRIPCIÓN

Genes y proteínas de biosíntesis de [S,S]-EDDS y método para la biosíntesis de [S,S]-EDDS

Campo de aplicación y estado de la técnica

[0001] La presente invención se refiere a ácidos nucleicos y proteínas o péptidos aislados para la biosíntesis de [S,S]-etilendiaminodisuccinato ([S,S]-EDDS), vectores de deleción y de expresión, células huésped y mutantes de deleción de la especie Amycolatopsis japonicum, método, así como un kit para la biosíntesis de [S,S]-EDDS.

[0002] El etilendiaminodisuccinato (EDDS, también denominado ácido etilendiaminodisuccínico) es un agente quelante hexadentado. El EDDS posee dos estereocentros y ocurre de manera correspondiente en tres estereoisómeros diferentes, es decir, [R,R]-EDDS, [S,S]-EDDS y [R,S]-(meso)-EDDS]. Se ha demostrado que exclusivamente el estereoisómero [S,S]-EDDs se puede degradar de forma completamente biológica (Schowanek et al., Chemosphere (1997), 34(11): 2375-91).

[0003] El EDDS es además un isómero estructural del etilendiaminotetraacetato (EDTA), un agente quelante hexadentado también ampliamente extendido. Ambos compuestos son muy similares en cuanto a sus características químicas, particularmente en cuanto a su capacidad para la formación de complejos de iones metálicos. Así, el EDDS y el EDTA presentan para una serie entera de iones metálicos constantes de formación de complejos comparables.

[0004] El EDTA se usa ya desde hace muchos decenios a causa de su marcada capacidad para la formación de complejos en los ámbitos más variados para la eliminación de iones metálicos y actualmente es el agente complejante más frecuentemente utilizado. Forma complejos especialmente estables con iones de cobre (II), de níquel (II), de hierro (III) y de cobalto (II), pero también con iones de metales pesados, así como con iones de calcio y de magnesio.

[0005] El EDTA se añade por lo tanto particularmente como ablandador del agua a detergentes, sirve para la estabilización de blanqueadores en el ámbito de la industria papelera y textil y se utiliza como fertilizante en forma de sus complejos de hierro, de cobre y de zinc. Además, el EDTA se utiliza en el ámbito de la medicina para el tratamiento de intoxicaciones por metales pesados.

[0006] Una desventaja es que el EDTA no es degradable de forma biológica y por lo tanto puede detectarse entretanto ubicuamente en aguas. Se clasifica por eso como ecológicamente peligroso, dado que puede liberar metales pesados de sedimentos y de este modo hacerlos biodisponibles.

[0007] Ante estos antecedentes es deseable sustituir el EDTA, en términos de una política sobre sustancias químicas sostenible, por compuestos equivalentes pero biodegradables.

[0008] El EDDS en forma del estereoisómero biodegradable [S,S]-EDDS representa un sustituto fundamentalmente apropiado a causa de las constantes de formación de complejos comparables al EDTA.

[0009] Se conoce la síntesis química del [S,S]-EDDS partiendo de ácido L-aspártico y 1,2-dibromoetano en presencia de cobalto trivalente (Neal and Rose, Inorganic Chemistry (1968), 7(11): 2405-12). A este respecto es una desventaja el ácido bromhídrico producido como subproducto tóxico, que debe eliminarse de modo costoso. Además, la síntesis se realiza utilizando reactivos fósiles.

[0010] Además se conoce un método químico no enantioselectivo, donde se hace reaccionar ácido maleico o anhídrido maleico con etilendiamina, donde se obtienen además de meso-EDDS al 50 % [R,R]-EDDS y [S,S]-EDDS como mezcla racémica. A causa de solo un bajo rendimiento de [S,S]-EDDS y la separación del racemato fundamentalmente muy costosa, este método es sin embargo generalmente inadecuado para una aplicación industrial.

[0011] Se conoce un método para la fabricación biocatalizada de [S,S]-EDDS de la EP 0731 171 A2. Mediante el método allí descrito puede obtenerse [S,S]-EDDS a partir de ácido fumárico y etilendiamina bajo influencia de microorganismos con actividad liasa con una pureza óptica de hasta un 97%. Se conoce otro método biocatalizado para la fabricación de [S,S]-EDDS de la EP 1043 400 A1, donde puede obtenerse [S,S]-EDDS partiendo de ácido maleico y etilendiamina en presencia de microorganismos con actividad malatoisomerasa y iones metálicos con una pureza óptica de hasta un 98%. Ambos métodos biocatalizados se basan sin embargo en el uso de precursores sintéticos que no pueden proporcionar los propios microorganismos utilizados.

[0012] Además se conoce la biosíntesis de [S,S]-EDDS mediante la especie bacteriana Amycolatopsis japonicum (Zwicker et al., Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology (1997); 19(4): 280-285). Sin embargo, a este respecto es una desventaja que la biosíntesis esté sujeta a una dependencia del zinc y ya una concentración de zinc de 2 pM puede provocar en el medio de cultivo una interrupción casi completa de la síntesis de [S,S]-EDDS (Cebulla I., Dissertation (1995), Universidad de Tübingen).

[0013] Además se conoce el desarrollo de un sistema de clonación génica para Amycolatopsis japonicum (Stegmann et al.: "Development of three different gene cloning systems for genetic investigation of the new species Amycolatopsis japonicum MG417-CF17, the ethylenediaminedisuccinic acid producer", Journal of Biotechnology 92 (2001) 195-204).

[0014] Además se conoce que la cepa de los actinomicetos MG417-CF17 es Amycolatopsis japonicum y que esta cepa es capaz de producir [S,S]-EDDS (Goodfellow et al.: "Amycolatopsis japonicum sp. nov., an Ac-tinomycete Producing (S,S)-N,N'-Ethylenediaminedisuccinic Acid", System. Appl. Microbiol. 20, 78-84 (1997)).

[0015] Además se conoce la producción de [S,S]-EDDS partiendo de etilendiamina y ácido fumárico utilizando cepas microbianas diversas (Takahashi et al.: "Production of (S,S)-Ethylenediamine-N,N'-disuccinic acid from Ethylenediamine and Fumaric Acid by Bacteria", Biosci. Biotechnol. Biochem., 63 (7), 1269-1273, 1999).

[0016] Además se conoce el desarrollo de un plug-in de Cytoscape para el análisis de datos de secuenciación de alto rendimiento de genomas microbianos (Tang et al.: "ContigScape: a Cytoscape plugin facilitating microbial genome gap closing", BMC Genomics 2013, 14:289).

[0017] Además se conoce la secuencia de una proteína reguladora de la captación de hierro (n.° de acceso de UNIPROT del EBI: R4SX04).

[0018] Se describe un método bajo condiciones de reacción sin zinc para la producción de [S,S]-EDDS mediante Amycolatopsis japonicum utilizando un medio de cultivo optimizado en WO 96/36725 A1.

[0019] Particularmente problemático en los métodos de biosíntesis genéricos para [S,S]-EDDS es el hecho de que una aplicación de las síntesis a mayor escala resulta difícil o no rentable a causa de la dependencia del zinc y el bajo rendimiento ligado a la misma. Por lo tanto, generar un entorno sin zinc en medios de cultivo, así como en fermentadores está asociado con costes considerables o es casi imposible.

Objetivo y solución

[0020] Ante estos antecedentes es por lo tanto un objetivo de la invención proporcionar proteínas o péptidos, ácidos nucleicos, grupos de genes, vectores, células huésped, células bacterianas, así como método y un kit para la biosíntesis de [S,S]-EDDS.

[0021] Este objetivo se consigue mediante una proteína o un péptido según la reivindicación 1, mediante un ácido nucleico según la reivindicación 2, mediante un grupo de genes con las características de la reivindicación 4, mediante la utilización de una proteína o un péptido según la reivindicación 5, mediante un vector según la reivindicación 6, mediante una célula huésped con las características de la reivindicación 7, mediante un método con las características de la reivindicación 8, así como mediante un kit con las características de la reivindicación 9. Se describen formas de realización preferidas en las reivindicaciones dependientes. La redacción de todas las reivindicaciones se hace por la presente por referencia explícita al contenido de esta descripción.

[0022] Los inventores han logrado por primera vez, en el ejemplo de Amycolatopsis japonicum, identificar y proporcionar genes y proteínas responsables de la biosíntesis de [S,S]-etilendiaminodisuccinato, en lo sucesivo denominado [S,S]-EDDS.

[0023] Además, los inventores han logrado por primera vez aclarar el mecanismo de la dependencia del zinc subyacente a esta biosíntesis.

[0024] Por la presente es posible con particular ventaja una producción de [S,S]-EDDS más económica y más eficiente frente a métodos genéricos, particularmente con mayores rendimientos y mayor pureza. Los objetos de la invención descritos en lo sucesivo forman el fundamento para ello.

[0025] En un primer aspecto, la invención se refiere a una proteína o un péptido aislado, que es funcional preferiblemente para un paso de síntesis parcial de la biosíntesis de [S,S]-EDDs , es decir, permite la realización de un tal paso de síntesis parcial.

[0026] La expresión "biosíntesis" define en términos de la presente invención no solo una síntesis intracelular de [S,S]-EDDS, sino que comprende también la captación en una célula así como la descarga fuera de una célula (transporte a través de una membrana celular).

[0027] La expresión "proteína" puede, en términos de la presente invención, significar no solo una única proteína o péptido según la invención, sino también una combinación de varias proteínas o péptidos diferentes según la invención.

[0028] Una proteína o un péptido según la invención puede producirse químicamente o por recombinación, es decir, mediante biotecnología.

[0029] Alternativamente, una proteína o un péptido según la invención puede provenir de una bacteria, particularmente de una bacteria grampositiva, preferiblemente de una bacteria del género Amycolatopsis, de manera particularmente preferida de una bacteria de la especie Amycolatopsis japonicum o tomarse de una tal bacteria.

[0030] La proteína o péptido contiene o consiste en una secuencia aminoacídica, que se selecciona del grupo consistente en SEQ ID NO 39, SEQ ID NO 41, SEQ ID NO 43, SEQ ID NO 45, SEQ ID NO 47, SEQ ID NO 49, SEQ ID NO 51 y SEQ ID NO 53.

[0031] Preferiblemente, una proteína o un péptido según la invención, que contiene una de las secuencias aminoacídicas especificadas a continuación o consiste en una secuencia tal, presenta la actividad asignada respectivamente:

- SEQ ID NO 39 actividad N-acetiltransferasa,

- SEQ ID NO 41 actividad cisteína dioxigenasa (EC 1.13.11.20),

- SEQ ID NO 43 actividad reguladora de la transcripción de tipo HTH,

- SEQ ID NO 45 actividad amidasa (EC 3.5.1.4),

- SEQ ID NO 47 actividad ornitina cicloamidasa (EC 1.4.1.12),

- SEQ ID NO 49 actividad diaminopimelato descarboxilasa (EC 4.1.1.20),

- SEQ ID NO 51 actividad cistationina p-sintasa (EC 4.2.1.22),

- SEQ ID NO 53 actividad de proteína transportadora.

[0032] La proteína o péptido que contiene o consistente en una secuencia aminoacídica según la SEQ ID NO 53 es responsable particularmente del transporte de [S,S]-EDDS o el complejo de [S,S]-EDDS-zinc fuera de una célula y/o en una célula o al menos está implicado en este transporte.

[0033] La invención se refiere además a un ácido nucleico aislado, que codifica preferiblemente una proteína o un péptido, que es funcional para un paso de síntesis parcial de la biosíntesis de [S,S]-EDDS, es decir, permite la realización de un tal paso de síntesis parcial.

[0034] El ácido nucleico contiene o consiste en una secuencia aminoacídica, que se selecciona del grupo consistente en

a) secuencia aminoacídica, codificante de una proteína o un péptido, que contiene o consistente en una secuencia aminoacídica, que se selecciona del grupo consistente en SEQ ID NO 39, SEQ ID NO 41, SEQ ID NO 43, SEQ ID NO 45, SEQ ID NO 47, SEQ ID NO 49, SEQ ID NO 51 y SEQ ID NO 53 y

b) secuencia aminoacídica, que corresponde a la cadena complementaria de la secuencia aminoacídica según a).

[0035] La expresión "ácido nucleico" puede significar, en términos de la presente invención, no solo un único ácido nucleico según la invención, sino también una combinación de varios ácidos nucleicos diferentes según la invención.

[0036] Además la expresión "ácido nucleico" puede significar, en términos de la presente invención, un ADN o un ARN. Un ácido nucleico según la invención se puede seleccionar particularmente del grupo consistente en un gen o marco de lectura abierto (open reading frame, ORF), ADNc y ARNm.

[0037] Un ácido nucleico según la invención puede producirse químicamente o por recombinación, es decir, por ingeniería genética.

[0038] Alternativamente, un ácido nucleico según la invención puede provenir de una bacteria, particularmente de una bacteria grampositiva, preferiblemente de una bacteria del género Amycolatopsis, de manera particularmente preferida de una bacteria de la especie Amycolatopsis japonicum, o tomarse de una tal bacteria.

[0039] En otro aspecto, la invención se refiere a un ácido nucleico aislado, que codifica preferiblemente para una proteína o un péptido, que es funcional para un paso de síntesis parcial de la biosíntesis de [S,S]-EDDS, es decir, permite la realización de un tal paso de síntesis parcial, donde el ácido nucleico contiene una secuencia aminoacídica o consiste en una tal secuencia, que se selecciona del grupo consistente en SEQ ID NO 40, SEQ ID NO 42, SEQ ID NO 44, SEQ ID NO 46, SEQ ID NO 48, SEQ ID NO 50, SEQ ID NO 52 y SEQ ID NO 54.

[0040] Las secuencias de ácido nucleico citadas arriba codifican preferiblemente como sigue:

SEQ ID NO 40 para una secuencia aminoacídica según la SEQ ID NO 39,

SEQ ID NO 42 para una secuencia aminoacídica según la SEQ ID NO 41,

SEQ ID NO 44 para una secuencia aminoacídica según la SEQ ID NO 43,

SEQ ID NO 46 para una secuencia aminoacídica según la SEQ ID NO 45,

SEQ ID NO 48 para una secuencia aminoacídica según la SEQ ID NO 47,

SEQ ID NO 50 para una secuencia aminoacídica según la SEQ ID NO 49,

SEQ ID NO 52 para una secuencia aminoacídica según la SEQ ID NO 51,

SEQ ID NO 54 para una secuencia aminoacídica según la SEQ ID NO 53.

[0041] El ácido nucleico contiene o consiste en una secuencia aminoacídica, que se selecciona del grupo consistente en SEQ ID NO 40, SEQ ID NO 42, SEQ ID NO 44, SEQ ID NO 46, SEQ ID NO 48, SEQ ID NO 50, SEQ ID NO 52 y SEQ ID NO 54.

[0042] La invención comprende además un grupo de genes o un operón aislado, que preferiblemente es funcional para la biosíntesis de [S,S]-EDDS, es decir, permite la realización de una tal biosíntesis.

[0043] El operón mencionado arriba contiene generalmente además un promotor, así como particularmente uno u opcionalmente varios operadores.

[0044] El grupo de genes u operón contiene o consiste en al menos dos secuencias de ácido nucleico, que se seleccionan del grupo consistente en SEQ ID NO 40, SEQ ID NO 42, SEQ ID NO 44, SEQ ID NO 46, SEQ ID NO 48, SEQ ID NO 50, SEQ ID NO 52, SEQ ID NO 54 y combinaciones de las mismas.

[0045] El grupo de genes u operón puede contener particularmente todas las secuencias de ácido nucleico citadas en el párrafo precedente o consistir en estas secuencias.

[0046] La denominación grupos de genes proviene del conocimiento de que las bacterias y muchos eucariotas aplican generalmente un mecanismo coordinado para la regulación de tales genes, cuyos productos (proteínas o péptidos) están implicados en procesos relacionados, por ejemplo, una biosíntesis. Los genes de este tipo se encuentran juntos en un único cromosoma en estructuras que se denominan grupos de genes, y pueden transcribirse juntos bajo control de una única secuencia reguladora o varias secuencias reguladoras. Sin embargo, un grupo de genes también puede contener fundamentalmente varios promotores y estar controlado también por varios reguladores. Un grupo de genes, un promotor y opcionalmente otras secuencias, que cooperan en la regulación, pueden denominarse también operón.

[0047] En otro aspecto, la invención se refiere a una proteína o un péptido aislado, que es funcional para una inhibición o represión de la biosíntesis de [S,S]-EDd S, es decir, permite una tal inhibición o represión. Preferiblemente, la proteína o péptido es un inhibidor o represor de la transcripción para la biosíntesis de [S,S]-EDDS.

[0048] La proteína o péptido contiene o consiste en una secuencia aminoacídica según la SEQ ID NO 61.

[0049] La proteína es preferiblemente una proteína reguladora de la captación de zinc, una proteína llamada Zur (zinc uptake regulator), es decir, una proteína que presenta actividad reguladora para la captación celular de zinc. En general, una proteína Zur es capaz de unirse a iones de zinc a partir de una concentración determinada y regular el equilibrio de zinc en una célula bacteriana mediante una represión génica o expresión génica dependiente de zinc. Esta regulación de genes dependiente de zinc está mediada en muchas bacterias, en tanto una proteína Zur saturada de zinc, una llamada holoproteína Zur, se une a secuencias de ácido nucleico específicas antes de los genes diana correspondientes, de modo que se impide a la enzima polimerasa de ARN esencial para la transcripción de genes diana el acceso a los mismos. Se impide de este modo la transcripción de los genes diana. Las secuencias de ácido nucleico específicas que funcionan como el sitio de unión de Zur son generalmente promotores/regiones promotoras u operadores.

[0050] Puesto que la regulación dependiente de zinc de la represión génica o expresión génica depende de la concentración de los iones de zinc en el interior celular y fuera de la célula, los sistemas de este tipo sirven particularmente también como sistemas indicadores para la determinación de la concentración de iones de zinc.

[0051] Sorprendentemente ahora los inventores han constatado en el ejemplo de Amycolatopsis japonicum, como se explicará todavía más en detalle en la parte de ejemplo, que los genes diana, que se reprimen en presencia de zinc mediante la proteína o péptido según la invención, que contiene o consistente en la secuencia aminoacídica según la SEQ ID NO 61, son entre otros genes de biosíntesis para la producción de [S,S]-EDDS. Respecto a las secuencias de ácido nucleico de los genes de biosíntesis mencionados se hace referencia a las secuencias citadas en la descripción precedente.

[0052] En otro aspecto, la invención se refiere a un vector de expresión artificial o recombinante, es decir, producido por ingeniería genética, es decir, un vehículo para la transmisión de al menos un ácido nucleico en una célula receptora o huésped, que expresa entonces en el marco de una expresión génica al menos una proteína o un péptido, para la que codifica el al menos un ácido nucleico.

[0053] El vector de expresión contiene al menos un ácido nucleico según la invención. Sin embargo, puede preferirse que el vector de expresión no contenga ningún ácido nucleico que contiene o consistente en la secuencia según la SEQ ID NO 62, o una secuencia homóloga a tal objeto.

[0054] Alternativamente, el vector de expresión puede contener un grupo de genes o un operón o un elemento integrador según la invención.

[0055] El vector de expresión puede ser fundamentalmente un plásmido o un cósmido. Preferiblemente, un plásmido o cósmido puede integrarse en el cromosoma de actinomicetos o existir como plásmido o cósmido replicativo en la célula y contiene un promotor constitutivo o inducible (regulable) correspondiente.

[0056] En una forma de realización preferida, el vector de expresión es un plásmido de la familia pRM, particularmente un plásmido del tipo pRM4, en el que se inserta el al menos un ácido nucleico según la invención o el grupo de genes según la invención.

[0057] Según una forma de realización particularmente preferida, el vector de expresión contiene un promotor sin represión por zinc (None-Zinc-Repressed Promotor), es decir, un promotor que no está sujeto a ninguna regulación por zinc.

[0058] El promotor puede ser fundamentalmente un promotor constitutivo o inducible (regulable). Preferiblemente, el promotor es un promotor expresado fuertemente de manera constitutiva o inducible, que sustituye a un promotor diana Zur existente intracelular. En este caso se realiza la expresión de ácidos nucleicos o grupos de genes según la invención con particular ventaja bajo el control de un promotor independiente de zinc. El promotor no presenta particularmente ningún sitio de unión para una proteína según la invención según la SEQ ID NO 61. Un promotor preferido sin represión por zinc es, por ejemplo, el promotor ermE (promotor de genes de resistencia a eritromicina, PermE).

[0059] El vector de expresión contiene un ácido nucleico según la invención, donde el ácido nucleico contiene o consiste en una secuencia aminoacídica, que se selecciona del grupo consistente en SEQ ID NO 40, SEQ ID NO 42, SEQ ID NO 44, SEQ ID NO 46, SEQ ID NO 48, SEQ ID NO 50, SEQ ID NO 52, SEQ ID NO 54 y combinaciones de las mismas.

[0060] Secuencias de ácido nucleico particularmente preferidas se pueden seleccionar del grupo consistente en SEQ ID NO 48, SEQ ID NO 50, SEQ ID NO 52, SEQ iD NO 54 y combinaciones de las mismas.

[0061] El vector de expresión según la invención es apropiado tanto para la realización de una expresión homóloga como también para la realización de una expresión heteróloga.

[0062] Con respecto a otras características y ventajas del vector de expresión, particularmente de los ácidos nucleicos según la invención, así como del grupo de genes y del operón según la invención, se hace referencia completamente a la descripción precedente.

[0063] En otro aspecto, la invención se refiere a una célula huésped artificial o recombinante, es decir, producida mediante biotecnología.

[0064] Preferiblemente, la célula huésped es una célula huésped productora de [S,S]-EDDS.

[0065] La célula huésped se caracteriza así porque contiene un vector de expresión según la invención. En combinación, la célula huésped puede contener un genoma que, debido a una inserción al menos parcial, particularmente completa, del vector (o genoma del vector), existe modificado.

[0066] En vista de una biosíntesis de [S,S]-EDDS se prefiere que no sea posible en la célula huésped ninguna represión por zinc.

[0067] De manera particularmente preferida, la célula huésped no contiene ningún ácido nucleico codificante de una proteína Zur, particularmente ningún ácido nucleico según la secuencia aminoacídica SEQ ID NO 62 o un ácido nucleico homólogo a tal objeto, y/o ninguna proteína Zur, particularmente ninguna proteína o péptido según la secuencia aminoacídica SEQ ID No 61 o una proteína o un péptido homólogo a tal objeto.

[0068] La célula huésped puede ser fundamentalmente una célula eucariota o procariota.

[0069] Además la célula huésped puede ser una célula huésped homóloga o heteróloga.

[0070] La célula huésped se puede seleccionar particularmente del grupo consistente en células bacterianas, células de levadura y células fúngicas.

[0071] En una forma de realización adicional, la célula huésped es una bacteria grampositiva, preferiblemente una bacteria del género Amycolatopsis o Streptomyces, de manera particularmente preferida una bacteria de la especie Amycolatopsis japonicum o Streptomyces coelicolor.

[0072] En otra forma de realización, la célula huésped puede producirse o ser producible mediante transformación, transducción, transfección o conjugación, particularmente aplicando un vector de expresión según la invención.

[0073] Las técnicas citadas en el párrafo anterior para la introducción de ácidos nucleicos (exógenos), particularmente de ADN y ARN, en células eucariotas y procariotas se conocen fundamentalmente como tales por la persona experta. Se trata de procedimientos estándar de la genética molecular. Para una descripción más detallada se remite por lo tanto a literatura especializada pertinente (por ejemplo, Mülhardt C., Der Experimentator: Molekularbilologie/Genomics (2008); editorial Spektrum, 6a ed. o Kieser T. et al., Practical Streptomyces Genetics (2000); John Innes Foundation o Green and Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2012); Cold Spring Harbor Laboratory, 4a ed.).

[0074] Con respecto a otras características y ventajas de la célula huésped, particularmente de los ácidos nucleicos según la invención, del grupo de genes y del operón según la invención, de las proteínas o de los péptidos según la invención, así como de los vectores de expresión según la invención, se hace referencia completamente a la descripción precedente.

[0075] Además se divulga una célula bacteriana artificial o recombinante, es decir, producida mediante biotecnología, y preferiblemente productora de [S,S]-EDDS, preferiblemente del género Amycolatopsis, particularmente de la especie Amycolatopsis japonicum.

[0076] La célula bacteriana se caracteriza porque no expresa ninguna proteína o péptido que contiene o consistente en una secuencia aminoacídica según la SEQ ID NO 61 y/o no contiene ningún ácido nucleico que contiene o consistente en una secuencia aminoacídica según la SEQ ID NO 62.

[0077] La célula bacteriana puede producirse o ser producible particularmente mediante una deleción al menos parcial, preferiblemente completa, de un ácido nucleico que contiene o consistente en una secuencia aminoacídica según la SEQ ID NO 62, del genoma, particularmente genoma silvestre, de la célula bacteriana. La deleción puede ser en ese caso el resultado de una transformación, transducción, transfección o conjugación. En otras palabras, la célula bacteriana puede ser preferiblemente un mutante de deleción. Alternativamente a la deleción mencionada en este párrafo entra en consideración también el intercambio de un par de bases, una mutación puntual y/o una inactivación a través de una inserción.

[0078] Además la célula bacteriana puede producirse o ser producible también a través de la inserción de un ácido nucleico, por ejemplo, en forma de un plásmido o un casete génico, que contiene o consistente en una secuencia aminoacídica según la SEQ ID NO 62, en el genoma, particularmente genoma silvestre, de una célula bacteriana.

[0079] Con respecto a otras características y ventajas de la célula bacteriana, particularmente del ácido nucleico mencionado en los párrafos anteriores, así como de la proteína o péptido mencionados en los párrafos anteriores, se hace referencia completamente a la descripción precedente.

[0080] En otro aspecto, la invención se refiere a un método para la biosíntesis de [S,S]-EDDS, que incluye los pasos:

a) cultivo de una célula huésped productora de [S,S]-EDDS según la invención o de una célula bacteriana recombinante del género Amycolatopsis, particularmente de Amycolatopsis japonicum, que no expresa ninguna proteína o péptido que contiene o consistente en una secuencia aminoacídica según la SEQ ID NO 61, y/o no contiene ningún ácido nucleico que contiene o consistente en una secuencia aminoacídica según la SEQ ID NO 62, y

b) purificación de [S,S]-EDDS a partir de la célula y/o un medio de cultivo utilizado para la célula.

[0081] En una forma de realización preferida, la célula bacteriana se produce mediante la introducción de un vector de deleción según la invención en la célula bacteriana, particularmente en un tipo silvestre de la célula bacteriana. La introducción del vector puede ocurrir mediante transformación, transducción, transfección o conjugación.

[0082] La célula huésped se produce según otra forma de realización mediante la introducción en la célula de un vector de expresión según la invención.

[0083] Preferiblemente, la célula huésped se produce mediante la introducción de un vector de expresión según la invención en una célula bacteriana del género Amycolatopsis, particularmente la especie Amycolatopsis japonicum.

[0084] En una forma de realización alternativa, la célula huésped se produce mediante la introducción de un vector de expresión según la invención en una célula bacteriana del género Streptomyces, particularmente la especie Streptomyces coelicolor.

[0085] El cultivo de las células empleadas en el marco de un método según la invención puede ocurrir aplicando protocolos estándar conocidos por la persona experta.

[0086] En función de la célula huésped o célula bacteriana utilizada puede ser ventajoso cultivar la célula huésped o bacteriana bajo condiciones sin zinc, particularmente sin sales de zinc.

[0087] Según la invención puede proveerse añadir al menos un compuesto precursor para la biosíntesis de [S,S]-EDDS a un medio de cultivo provisto para el cultivo. Ejemplos para compuestos precursores adecuados pueden ser fundamentalmente aminoácidos proteinógenos y/o no proteinógenos. Se pueden seleccionar compuestos precursores adecuados particularmente del grupo consistente en L-ornitina, L-serina, L-prolina, ácido 2,3-diaminopropiónico, L-aspartato, L-lisina y combinaciones de los mismos.

[0088] Además según la invención puede proveerse que antes de la purificación del [S,S]-EDDS se realice en primer lugar una determinación de la concentración del [S,S]-EDDS producido. Esto puede ocurrir, por ejemplo, mediante HPLC (high performance liquid chromatography o cromatografía líquida de alta resolución), espectroscopia UV/vis o mediante una combinación de ambas técnicas.

[0089] Para una purificación adicional de [S,S]-EDDS puede realizarse un paso en un separador para la separación de componentes (celulares) sólidos. A este le puede seguir un aislamiento de [S,S]-EDDS mediante adsorción de intercambio iónico con una cristalización subsiguiente del precipitado.

[0090] Métodos de este tipo se conocen como tales del estado de la técnica. No juega fundamentalmente ningún papel para la purificación si el [S,S]-EDDS existe de forma intracelular y, por ejemplo, todavía debe hacerse accesible mediante una lisis celular o si se segrega en el sobrenadante por el sistema de exportación.

[0091] Con respecto a otras características y ventajas del método, particularmente de los ácidos nucleicos según la invención, del grupo de genes y del operón según la invención, de las proteínas o de los péptidos según la invención, así como de los vectores según la invención, en particular vectores de deleción y de expresión, se hace referencia completamente a la descripción precedente.

[0092] En otro aspecto, la invención se refiere a un kit para la biosíntesis de [S,S]-EDDS que incluye al menos un componente que se selecciona del grupo consistente en al menos una proteína o un péptido según la invención, al menos un ácido nucleico según la invención, un grupo de genes o un operón según la invención, un vector según la invención (vector de expresión y/o de deleción), una célula huésped según la invención y combinaciones de los mismos.

[0093] Opcionalmente, el kit puede comprender otro componente que se selecciona del grupo consistente en medio de cultivo, tampones y combinaciones de los mismos.

[0094] Con respecto a otras características y ventajas del kit, particularmente de los ácidos nucleicos según la invención, del grupo de genes y del operón según la invención, de las proteínas o de los péptidos según la invención, así como de los vectores según la invención, en particular vectores de deleción y de expresión, se hace referencia también completamente a la descripción precedente.

[0095] Otras características y ventajas de la invención resultan evidentes de los ejemplos siguientes en relación con las figuras y reivindicaciones secundarias. La invención se explica más en detalle particularmente a través de la descripción de la identificación y anotación del grupo de genes de biosíntesis de [S,S]-EDDS. En las formas de realización pueden realizarse características individuales de la invención solas o en combinación con otras características.

Descripción de las figuras

[0096]

La figura 1 muestra esquemáticamente la vía de biosíntesis hipotética de [S,S]-EDDS. (A) Vía de biosíntesis de [S,S]-EDDS. (I) Provisión del precursor Dap; transformación de L-serina con L-ornitina como donador de grupos amino y PLP como cofactor liberando L-prolina. Dap reacciona con oxalacetato hasta IM1. (II) L-aspartato y L-serina reaccionan en presencia de PLP como cofactor hasta IM1. (B) Estructura química de la zwittermicina A (izquierda). La caja discontinua indica el módulo Dap. Vía de biosíntesis de Dap (derecha), cataliza por la acción conjunta concentrada de la zwittermicina A5A (ZWA5A, homólogo de la cisteína sintetasa) y la zwittermicina A5B (ZWA5B, homólogo de la ornitina ciclodeaminasa).

La figura 2 muestra la vía de biosíntesis de [S,S]-EDDS con genes de biosíntesis asociados y el grupo de genes correspondiente. (A) Organización génica del grupo de genes de biosíntesis de [S,S]-EDDS. N-acetiltransferasa (SEQ ID NO 40 (orf1658)), cisteína dioxigenasa (SEQ ID NO 42 (orf 1659)), regulador transcriptómico de tipo HTH (SEQ ID NO 44 (orf1660)), amidasa (SEQ ID NO 46 (orf1661)), ornitina ciclodeaminasa (SEQ ID NO 48 (orf1662)), diaminopimelato descarboxilasa (SEQ ID NO 50 (orf1663)), Dap sintasa (SEQ ID NO 52 (orf1664)) y transportador de eflujo de múltiples fármacos (SEQ ID NO 54 (orf1665). (B) Provisión de los precursores de Dap mediante la transformación de L-serina con L-ornitina como donador de grupos amino y PLP como cofactor, catalizada mediante una acción concentrada de ornitina ciclodeaminasa y una Dap sintasa. (C) Composición de los compuestos precursores Dap y de dos oxalacetatos hasta [S,S]-EDDS. Las flechas están marcadas con los correspondientes genes del grupo de genes (A).

La figura 3 muestra el patrón de transcripción dependiente de metales traza recuperado mediante PCR-RT del grupo de genes de biosíntesis de [S,S]-EDDS en A.japonicum. Se utilizó sigB como gen constitutivo (Housekeeping gene) para normalizar el ARN. Se obtuvieron ARN de cultivos que se cultivaron en medio definido en ausencia de cualquier tipo de oligoelementos (-) o suplementado con soluciones de 25 pM de Fe2+, Zn2+, Ni2+, Co2+ o Mn2+. Se tomaron muestras tras 10 h y 70 h de incubación.

La figura 4 muestra el análisis de HPLC-UV/vis de los sobrenadantes de A. japonicum WT (tipo silvestre) y de un mutante A. japonicum Aorfl662-64 tras 72 h de cultivo en medio M7. (Arriba) Patrón de [S,S]-EDDS [350 mg/l]. (Centro) A. japonicum WT. (Abajo) A. japonicum Aorf1662-64. (Derecha) Espectros específicos UV/vis de [S,S]-EDDS.

La figura 5 muestra el análisis de HPLC-UV/vis de los sobrenadantes de S. coelicolor WT y S. coelicolor-pTWPL1-EDDS tras 72 h de cultivo en medio M7. (Arriba) Patrón de [S,S]-EDDS [350 mg/l]. (Centro) S. coelicolor w T. (Abajo) S. coelicolor-pTWPL1-EDDS. (Derecha) Espectros UV/vis específicos de [S,S]-e Dd S.

La figura 6 muestra la comparación de secuencias aminoacídicas de Zur de S. coelicolor (Zursc) y ORF5768 de A. japonicum (SEQ ID NO 62). (Arriba) Monómero de ZurSC: dominio de unión a ADNⁿ (restos 1-77) no subrayado; hinge loop (restos 78-85) con subrayado continuo; dominio de dimerizaciónC (restos 86-139) con subrayado discontinuo. Los aminoácidos idénticos están marcados con un asterisco (*); los restos similares están marcados por un círculo (°). Sitios de unión de zinc: flecha: ZurSC: D65, C79, H85, H87 y ORF5768: D70, C84, H89 y H91. Desviación de distancias aa relativas en un sitio M (caracterizado con una M). Sitio D (caracterizado con una D): ZurSC: H84, H86, E105, H122 y ORF5768: H88, H90, E109, H126. Sitio C (caracterizado con una C): ZurSC: C90, C93, C130, C133 y ORF5768: C94, C97, C134, H137.

La figura 7 muestra la comparación BLAST de ZnuABC de S. coelicolor y MntABC de B. subtilis con homólogos de A. japonicum. (A ) Organización génica de znuABC de S. coelicolor, de las estructuras similares a operones orf3699, orf3700, orf3702 y orf6504, orf6505, orf6506 de A. japonicum. (B) Comparación de secuencias aminoacídicas, (arriba) ORF3699, ORF3700 y ORF3702 (abajo) ORF6504, ORF6505 y ORF6506 frente a ZnuABC de S. coelicolor (izquierda); frente a MntABC de B. subtilis (derecha). X/X = % identidad/similitud.

La figura 8 muestra el patrón de transcripción dependiente de metales traza obtenido mediante RT-PCR del sistema de captación de metales de A. japonicum. Como gen constitutivo se utilizó sigB para normalizar el ARN. Se obtuvieron ARN de cultivos que se cultivaron en medio M7 definido en ausencia de cualquier oligoelemento (-) o suplementado con soluciones de 25 pM de Fe2+, Zn2+, Ni2+, Co2+ o Mn2+. Se tomaron muestras tras 10 h y 70 h de incubación. Se eligieron orf3700 y orf6504 como sondas para representar todas las estructuras de tipo operón.

La figura 9 muestra esquemáticamente las sondas de ADN de EMSA utilizadas. (Arriba) Locus del gen znuABC de A. japonicum (orf3699-orf3702). (Abajo) Grupo de genes de biosíntesis de [S,S]-EDDS orf1658-orf1665 (corresponde a las SEQ ID NO 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54). Las regiones promotoras con sitios de unión de ZurAJ están marcadas con un círculo abierto y las sondas de EMSA que se utilizaron para comprobar la unión His-ORF5768 están representadas por una línea negra.

La figura 10 muestra los resultados de los ensayos EMS (geles de poliacrilamida tras la tinción con bromuro de etidio): unión dependiente de zinc de His6-ORF5768 purificado a regiones promotoras. Dos casos de unión claros con diferente movilidad se denominaron CF (complejo móvil rápido) y CD (complejo móvil lento). Para la confirmación de la especificidad de los complejos de unión se añadió a la mezcla de unión un fragmento sigB-RT. Se incubó His6-ORF5768 purificado a diferentes concentraciones con aproximadamente 35 nM de sonda de ADN en ausencia o en presencia de zinc (ZnSO4). (A ) Ensayo de unión con sonda de znuCB (compárese con la figura 9). Caso de unión representado por la banda CF. (B) Ensayo de unión con la sonda intergénica orf1661/62 (compárese con la figura 9). Dos casos de unión están representados por la banda CF o la banda CS respectivamente. (C) Ensayo de unión con sondas de promotor de orf1658 y mayores concentraciones de His-ORF5768 (compárese con la figura 9). (D) Ensayo de unión con la sonda de promotor de orf1659/60 intergénica (compárese con la figura 9). Caso de unión representado por la banda CS.

La figura 11 muestra una representación esquemática del vector de deleción pGusA21Aorf5768. (Arriba) orf5768 (corresponde a la SEQ ID NO 62) y genes circundantes. (Abajo) pGusA21Aorf5768. barra izquierda: región flanqueante 5' de orf5768; barra derecha: región flanqueante 3' de orf5768.

La figura 12 muestra la verificación de la integración de pGusA21Aorf5768 en el genoma de A. japonicum tras una transformación directa. (A ) Verificación por PCR de la integración de pGusA21Aorf5768. Perfil WT esperado: 1677 pb (orf5768-SCO-wt-Frag); perfil de pGusA21Aorf5768 integrado esperado: 1293 pb (orf5768-SCO-single Frag). WT: molde de ADNg silvestre; P: molde pGusA21Aorf5768 aislado. (B) Búsqueda de clones de A. japonicum con pGusA21Aorf5768 perdido con ayuda del sistema reportero Gus. El genoma de las colonias azules dispone del plásmido pGusA2lAorf5768 integrado, mientras que las colonias no teñidas lo han perdido.

La figura 13 muestra el análisis de HPLC-UV/vis de los sobrenadantes de A. japonicum WT y A. japonicum Azur (corresponde a la ASEQ ID NO 62) tras 72 h de cultivo en medio M7 con y sin adición de 6 pM de ZnSO4. (Arriba) Patrón de [S,S]-EDDS [350 mg/l]. (2° y 3° desde arriba) A. japonicum WT -/+ 6 pM de ZnSO4. (Abajo) A. japonicum Azur -/+ 6 pM de ZnSO4. (Derecha) Espectros UV/vis específicos de [S,S]-EDDS.

La figura 14 muestra esquemáticamente la construcción del vector pRM4-PermE*orf1662-65. (Arriba) Grupos de genes de [S,S]-EDDS orf1658-1665 (corresponde a la SEQ ID NO 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52 y 54). (Abajo) Representación del vector de expresión homólogo pRM4-PermE*orf1662-65 como mapa plasmídico (orf1662 a orf1665 bajo el control de PermE*. Barra gris: operón orf1662 a orf1665.

La figura 15 muestra el análisis de HPLC-UV/vis de los sobrenadantes de A. japonicum WT y A. japonicum pRM4-PermE*orf1662-65 tras 72 h de cultivo en medio M7 con una adición de 6 pM de ZnSO4. (Arriba) Patrón de [S,S] EDDS [350 mg/l]. (Centro) A. japonicum WT 6 pM de ZnSÜ4. (Abajo) A. japonicum pRM4-PermE*orf1662-65 6 pM de ZnSÜ4. (Derecha) Espectros UV/vis específicos de [S,S]-EDDS.

La figura 16 muestra el análisis de HPLC-UV/vis de los sobrenadantes de S. coelicolor pTWPLI-EDDS tras 72 h de cultivo en medio M7 con una adición de 6 pM de ZnSÜ4. (Arriba) Patrón de [S,S]-EDDS [350 mg/l]. (Centro) S. coelicolor pTWPL1-EDDS - 6 pM de ZnSÜ4. (Abajo) S. coelicolor pTWPL1-Ed d S 6 pM de ZnSÜ4. (Derecha) Espectros UV/vis específicos de [S,S]-EDDS.

Parte de ejemplo

1. Aclaración de la biosíntesis de [S.S1-EDDS

[0097] El genoma de la especie bacteriana productora de [S,S]-EDDS A. japonicum se secuenció en el marco de la presente invención. El genoma de A. japonicum comprende aproximadamente 9,18 MB y comprende 8674 marcos de lectura abiertos predichos (Open Reading Frames, orf). De acuerdo con la herramienta web Antibiotics and Secondary Metabolite Analysis Shell (antiSMASH) para la rápida identificación, anotación y análisis de grupos de genes de biosíntesis para metabolitos secundarios (Medema et al., 2011, Nucleic Acids Res (2011); 39:14 y Blin et al., Nucleic Acids Res (2013); 1-9), el genoma de A. japonicum presenta 26 grupos de genes únicos para metabolitos secundarios. Estos grupos contienen el potencial biosintético para la producción de metabolitos secundarios derivado de seis NRPS (péptido sintetasas no ribosomales), seis PKS (policétido sintasa) tipo I, dos híbridos PKS tipo I/NRPS y un híbrido p Ks tipo III/NRPS (para la producción de un glicopéptido) además de cuatro terpenos, una ectoína, un aminoglicósido y un lantibiótico.

[0098] Se postuló en primer lugar una vía de biosíntesis hipotética de [S,S]-EDDS (figura 1), según la cual el aminoácido no proteinógeno 2,3-L-diaminopropionato (Dap) podría ser un compuesto precursor putativo de [S,S]-EDDS. Dap es, entre otros, un metabolito secundario en la biosíntesis de viomicina por Streptomyces vinaceus y la biosíntesis de zwittermicina A por Bacillus thuringiensis. Ambas vías sintéticas están aclaradas (Thomas et al., Antimicrobial Agents and Chemotherapy (2003); 47(9): 2823-2830 y Zhao et al., FEBS Lett. (2008); 528(20): 3125­ 3131).

[0099] Para B. thuringiensis y S. vinaceus se mostró que Dap se proporciona específicamente para la biosíntesis de zwittermicina A o viomicina. Dap se forma tanto en la biosíntesis de zwittermicina A como también de viomicina a través de la transformación de L-serina con L-ornitina como donador de grupos amino (figura 1). Esta reacción se cataliza a través de la acción concentrada de una Dap sintasa (VioB/ZWA5A) y de una ornitina ciclodeaminasa (VioK/ZWA5B), donde se necesita fosfato de piridoxal (PLP) como cofactor (Thomas et al., Antimicrobial Agents and Chemotherapy (2003); 47(9): 2823-2830 y Zhao et al., FEBS Lett. (2008); 528(20): 3125-3131).

[0100] Un cribado del genoma de A. japonicum utilizando BLAST (Basic Local Alignment Search Tool, en la versión vigente en el momento de la solicitud) con las secuencias aminoacídicas de VioB/ZWA5A o VioK/ZWA5B mostró la presencia de proteínas homólogas que están codificadas por genes que están en proximidad directa uno respecto al otro. El ácido nucleico según la s Eq ID NO 52 codifica así una proteína con un tamaño de 352 aa y presenta un 32/45 %, 26/44 % de identidad/similitud aa con VioB o ZWA5A. La SEQ ID NO 48 codifica una proteína con un tamaño de 327 aa y presenta un 25/39%, 21/40 % de identidad/similitud aa para VioK o ZWA5B. La SEQ ID NO 50 intermedia se denomina diaminopimelato descarboxilasa y la SEQ ID NO 54, transportador de eflujo de múltiples fármacos. Las SEQ ID NO 48, s Eq ID NO 50, SEQ ID NO 52 y SEQ ID NO 54 presentan una configuración génica solapada y están codificadas supuestamente como unidad de transcripción (figura 2).

[0101] Las proteínas o péptidos según las SEQ ID NO 39, SEQ ID NO 41, SEQ ID NO 43 y SEQ ID NO 45 están codificadas aguas arriba del extremo 5' de los genes organizados de tipo operón citados previamente y se denominan N-acetiltransferasa, cisteína dioxigenasa, regulador transcriptómico del tipo HTH o amidasa (figura 2).

[0102] Partiendo de las homologías determinadas arriba se hicieron las siguientes suposiciones:

- Las proteínas o péptidos según las SEQ ID NO 47 y SEQ ID NO 51 catalizan en acción concertada la síntesis del precursor Dap como un primer paso de la biosíntesis de [S,S]-EDDS (figura 2).

- La condensación de Dap con oxalacetato para el compuesto intermedio IM1 está catalizada por una proteína o un péptido según la SEQ ID NO 39 (ácido nucleico según la SEQ ID NO 40: denominado N-acetil transferasa).

- La descarboxilación sucesiva está catalizada por una proteína o un péptido según la SEQ ID NO 49 (SEQ ID NO 48: denominada diaminopimelato descarboxilasa).

- La nueva acetilación con oxalacetato a su vez por una proteína o un péptido según la SEQ ID NO 39.

- La reducción final está catalizada por una proteína o un péptido según la SEQ ID NO 41 (SEQ ID NO 42: denominada cisteína dioxigenasa).

- A efectos de la secreción el [S,S]-EDDS debe pasar además a través de la membrana celular. Esta exportación está mediada por el transportador de eflujo de múltiples fármacos putativo según la SEQ ID NO 53 (figura 2).

[0103] Para demostrar que la región identificada para la biosíntesis de [S,S]-EDDS es en efecto responsable, se utilizó la represión por zinc de la biosíntesis de [S,S]-EDDS. Puesto que el [S,S]-EDDS se forma exclusivamente bajo condiciones esencialmente sin zinc (ya una concentración de 2 pM de zinc provoca una interrupción casi completa de la síntesis de [S,S]-EDDS (Cebulla I., Dissertation (1995), Universidad de Tübingen)), se determinó el patrón de transcripción de los genes de biosíntesis putativos mediante RT-PCR (Real Time Polymerase Chain Reaction), con presencia de zinc y en ausencia de zinc (figura 3).

[0104] Los genes de síntesis de Dap putativos con las secuencias de ácido nucleico según la SEQ ID NO 48 y SEQ ID NO 52, la secuencia intermedia según la SEQ ID NO 50, así como la secuencia según la SEQ ID NO 54 se expresaron exclusivamente durante un cultivo en ausencia de zinc (formación de [S,S]-EDDS), sin embargo, no en presencia de zinc. No se pudo constatar la represión de estos genes mediante otros iones metálicos bivalentes. Los ácidos nucleicos según las SEQ ID NO 40, SEQ ID NO 42, SEQ ID NO 44 y SEQ ID NO 46 presentan un patrón de transcripción común que no se ve afectado por el zinc (figura 3).

[0105] El operón así identificado de la síntesis putativa de [S,S]-EDDS (SEQ ID NO 48, 50, 52 y 54) presenta por lo tanto una transcripción dependiente de zinc.

[0106] Para la detección de una participación de los genes fuertemente influidos por el zinc según las SEQ ID NO 48, 50 y 52, en la síntesis de [S,S]-EDDS se produjo además un mutante con una deleción en el marco de lectura (deleción en marco) de las regiones codificantes de las SEQ ID NO 48, 50 y 52.

[0107] En total se produjeron 12 mutantes de A. japonicum (A. japonicum A SEQ ID NO 48, 50 y 52) con una deleción en marco de las regiones codificantes de las SEQ ID NO 48, 50 y 52. A. japonicum del tipo silvestre (A. japonicum WT) y todos los mutantes producidos se cultivaron en medio de producción de EDDS (compárese con la tabla 1).

Tabla 1: medios de cultivo, tampones

[0108] Mientras que la cepa A. japonicum WT forma [S,S]-EDDS bajo las condiciones elegidas, los 12 mutantes ya no fueron capaces de sintetizar [S,S]-EDDS (figura 4).

[0109] Se pudo demostrar por lo tanto que en A. japonicum es necesaria la estructura de operón que contiene o consistente en una secuencia aminoacídica según las SEQ ID NO 48, 50 y 52 para la biosíntesis de [S,S]-EDDS.

[0110] Para demostrar que el grupo de genes identificado contiene toda la información genética necesaria para la biosíntesis de [S,S]-EDDs , se expresó heterólogamente un cósmido en S. coelicolor que comprende el grupo de genes entero. Este cósmido (pTWPL1-EDDS) contiene los genes según las SEQ ID n O 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56 y 58, así como partes según la SEQ ID NO 2 y la SEQ ID NO 60 (tabla 2).

Tabla 2: 30 genes previamente no descritos de A. japonicum

[0111] La cepa S. coelicolor del tipo silvestre (S. coelicolor WT) y la cepa S. coelicolor con el cósmido pTWPLI -EDDS (S. coelicolor-pTWPL1 -EDDS) integrado en el genoma se cultivó en medio de producción de EDDS. Mientras que la cepa S. coelicolor WT no es capaz de producir, bajo las condiciones elegidas, [S,S]-EDDS, S. coelicolorpTWPL1-EDDS produce cantidades detectables de [S,S]-EDDS en medio de producción de EDDS sin zinc (figura 5).

[0112] La formación de [S,S]-EDDS a través de S. coelicolor-pTWPL1-EDDS muestra que todas las enzimas necesarias para la biosíntesis de [S,S]-EDDS están codificadas en la región génica orf1640-1667 o SEQ ID NO 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56 y 58.

2. Aclaración de la represión por zinc de la biosíntesis de [S.S1-EDDS

[0113] La familia Fur (Ferric uptake regulator) de las proteínas reguladoras de metal globales se nombra según el Ferric Uptake Regulator, Fur, de E. coli (Hantke K., Mol Gen Genet (1981); 182(2): 288-292 y Bagg & Neilands, Biochemistry (1987); 26: 5471-5477). Además de la Fur selectiva para el hierro hay una gran variedad de selectividad de metal y funciones biológicas dentro de la familia Fur. Entre ellas se encuentran, por ejemplo, sensores para el zinc (Zur), manganeso (Mur) y níquel (Nur).

[0114] Las proteínas Fur son generalmente represores de la transcripción que se unen a secuencias de ADN de operador correspondientes, cuando están unidas con sus efectores de iones metálicos cognados (por ejemplo, la Fur unida a hierro se denomina holoFur), por lo cual se impide el acceso de la polimerasa de ARN, lo que lleva a una inhibición (represión) de la expresión de genes subordinados (situados aguas abajo) (Lee & Helmann, Nature (2006); 440 (7082): 363-367). Las proteínas sin metal (por ejemplo, apoFur) poseen fundamentalmente una afinidad pequeña o despreciable para la secuencia del operador correspondiente, lo que lleva a una desinhibición (desactivación de la represión) de los genes diana.

[0115] La capacidad de los miembros de la familia Fur para servir fisiológicamente como sensores para iones de Zn (Il) se descubrió coincidente en las B. subtilis grampositivas con un contenido de GC bajo (ZurBS) y las yproteobacterias E. coli (ZurEc) (Gaballa & Helmann, J. Bacteriol. (1998); 180:5815-21 y Patzer & Hantke, MolMicrobiol (1998); 28: 1199-1210). A continuación, los análisis genómicos han permitido asignaciones preliminares de regulones de Zur probables en numerosas otras bacterias, lo que demuestra la extensión de una regulación de la captación de zinc mediada por Zur en el reino de las bacterias (Panina et al., Proc Natl Acad Sci U S A (2003 ago 19); 100(17): 9912-7). Mientras tanto se caracterizaron bioquímicamente además de ZurBS y ZurEc una multitud de proteínas Zur, como para las gramnegativas Yersinia pestis (ZurYP), Salmonella enterica (ZurSE) y Xanthomonas campestris (Zurxc), las Firmicutes grampositivas con bajo contenido de GC Staphylococcus aureus (ZurSA), Streptococcus suis (ZurSS) y Listeria monocytogenes (ZurLM) y actinobacterias grampositivas con alto contenido de GC Mycobacterium tuberculosis (ZurMT), Corynebacterium diphtheriae (ZurcD), Corynebacterium glutamicum (ZurcG) y S. coelicolor (ZurSc) (Li et al., BMC Microbiol. (2009 Jun 25); 9:128, Feng et al., J Bacteriol. (2008); 190(22): 7567-78, Lindsay & Foster, Microbiology (2001), 147, 1259-66, Campoy et al., Infect. Immun. (2002); 70: 4721-5, Garrido et al., FEMSMicrobiol. Lett. (2003); 221: 31-37, Tang et al., Mol. Plant-Microbe Interact. (2005); 18: 652-8, Maciag et al., J Bacteriol. (2007): 189(3): 730-40, Shin et al., Journal of Bacteriology (2007); junio: 4070-7, Dalet et al., FEMS Microbiol. Lett. (1999); 174: 111-6, Schroder et al., BMC Genomics (2010); 11: 12 y Smith et al., J Bacteriol. (2009); 191(5): 1595-603).

[0116] Se denomina regulón a un grupo de genes cuya actividad está controlada por el mismo regulador. Los regulones bajo el control de proteínas Zur comprenden genes que codifican funciones de adquisición de zinc, como, por ejemplo, sistemas de captación de zinc con afinidad alta (znuABC), zincóforos putativos y parálogos sin zinc de proteínas ribosómicas. Estos genes experimentan una represión a través de la unión de las proteínas holoZur unidas a zinc bajo condiciones ricas en zinc y la desactivación de la represión mediante la disociación de la proteína apoZur sin zinc por el ADN.

[0117] S. coelicolor, un organismo modelo de los actinomicetos con alto contenido de GC, regula la homeostasis de metales y la respuesta al estrés por peróxido entre otros con cuatro proteínas caracterizadas bioquímicamente de la familia Fur (FurASc, CatRSc, NurSc y ZurSc) (Hahn et al., J Bacteriol. (2000); 182(13): 3767-74, Ahn et al., Mol. Microbiol. (2006); 59:1848-58 y Shin et al., Journal of Bacteriology (2007); junio: 4070-7).

[0118] Un análisis BLAST de A. japonicum con las secuencias aa de las cuatro proteínas individuales de la familia Fur de S. coelicolor mostró que el genoma de A. japonicum codifica tres homólogos de proteínas de la familia Fur, correspondientes a las secuencias de ácido nucleico orf1667 (corresponde a la SEQ ID NO 58), orf3462 y orf5768 (corresponde a la SEQ ID NO 62).

[0119] Los homólogos de la familia Fur ORF1667 (corresponde a la SEQ ID NO 57) y ORF3462 son muy similares a FurASc de S. coelicolor (62/75 % y 67/79 % de identidad/similitud aa). FurASc de S. coelicolor está implicada en la respuesta adaptiva al estrés por peróxido y ejerce una regulación negativa sobre un operón con el gen furAsc mismo y catC, que codifica una catalasa-peroxidasa (Hahn et al., J Biol Chem. (2000); 275(49): 38254-60).

[0120] La tercera proteína homóloga de la familia Fur con una secuencia aminoacídica según la SEQ ID NO 61 es muy similar a ZurSC de S. coelicolor y presenta respecto a esta un 67/85 % de identidad/similitud aa (figura 6).

[0121] La alta similitud de la ZurSC de S. coelicolor caracterizada bioquímicamente y de homólogos de A. japonicum (ZurAJ) codificados por una secuencia aminoacídica según la SEQ ID NO 62 (u orf5768) implica que esta proteína o péptido según la SEQ ID NO 61 es la proteína sensible al zinc de la familia Fur de A. japonicum, que media una represión dependiente de zinc de genes diana correspondientes.

[0122] ZurSC es el regulador negativo del sistema de captación de zinc con alta afinidad (ZnuABC) en S. coelicolor (Shin et al., Journal of Bacteriology (2007); junio: 4070-7). Un análisis BLAST del genoma de A. japonicum con las secuencias aminoacídicas de ZnuABC de S. coelicolor mostró dos sistemas homólogos que están codificados por orf3699, orf3700 y orf3702 u orf6504, orf6505 y orf6506 (figura 7).

[0123] Se sabe que la expresión del operón znuABC de S. coelicolor está bajo la represión estricta de ZurSC, donde el zinc es un cofactor (Shin et al., Journal of Bacteriology (2007); junio: 4070-7). Por lo tanto, se examinó la transcripción de orf3700 y orf6504 como representantes de todos los sistemas en dependencia de la presencia de zinc, así como otros metales diferentes, para detectar cuál de los dos sistemas de captación de zinc putativos media la captación de zinc altamente afín en A. japonicum (figura 8).

[0124] El segmento de ADN orf3700 se expresó bajo ausencia de metal, así como en presencia de hierro, níquel, cobalto y, sin embargo, no en presencia de zinc (figura 8). Este patrón de transcripción mostró claramente la represión rigurosa y mediada exclusivamente por zinc de orf3700 en A. japonicum. De esto se pudo concluir que el sistema de captación codificado por orf3699, orf3700 y orf3702 representa el sistema de captación de zinc con alta afinidad (ZnuABC) de A. japonicum.

[0125] Para confirmar que esta proteína homóloga a ZurSC según la SEQ ID NO 61 (codificada por la SEQ ID NO 62) es la proteína reactiva al zinc de la familia Fur de A. japonicum y media la represión dependiente de zinc del sistema de captación de zinc (znuABC) y de los genes de biosíntesis de [S,S]-EDDS putativos, se realizaron análisis electroforéticos de afinidad (EMS-Assays, Electrophoretic Mobility Shift Assays).

[0126] La unión de la proteína o péptido según la SEQ ID NO 61 se examinó utilizando la región promotora situada aguas arriba en el extremo 5' de los genes represores de zinc orf3700 y orf1662 (corresponde a la SEQ ID NO 46) y también todas las otras regiones promotoras predichas en el grupo de genes de biosíntesis de [S,S]-EDDS putativo (región aguas arriba de orf1658, región intermedia de orf1659 y orf1660, región intermedia de orf1661 y orf1662) en dependencia del zinc como cofactor (figura 9).

[0127] Para examinar si el regulador de la captación de zinc homólogo ORF5768 (ZurAJ, corresponde a la SEQ ID NO 61) media la represión dependiente de zinc de orf3700, orf1662 y los otros genes dentro del grupo de genes de biosíntesis de [S,S] a través de la unión a las regiones promotoras correspondientes (círculos abiertos, figura 9), se realizaron ensayos EMS (Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMS Assay) o también Band Shift Assay). Para ello se proporcionó el regulador de la captación de zinc homólogo ORF5768 con una etiqueta de Histidina6, se purificó y se aisló. Igualmente se proporcionaron las secuencias de ADN correspondientes (secuencias promotoras), que tuvieron que examinarse como promotores supuestamente regulados por zinc (círculos abiertos, figura 9).

[0128] La reacción de unión se realizó incubando las secuencias promotoras (aproximadamente 35 nM) con diferentes cantidades de His6-ORF5768 en 10 pl de tampón de unión durante 20 min a 29°C con o sin adición de zinc (tabla 1). Para excluir uniones no específicas de His6-ORF5768 se realizó la adición de un fragmento sigB-RT (258 pb) como control negativo (figura 10).

[0129] Así se pudo constatar mediante EMSA una unión dependiente de zinc (es decir, en presencia de zinc) de His6-ORF5768 en aquellas sondas de EMSA que representan la región promotora znuABC, así como las regiones promotoras orf1659-60 y orf1661-62. No se constató ninguna unión en la región promotora orf1658 (figura 10).

3. Producción de una cepa productora de [S.S1-EDDS con desactivación de la represión por zinc

[0130] Para la producción de un cepa productora de [S,S]-EDDS de A. japonicum con desactivación de la represión por zinc se siguieron tres estrategias:

(1) Deleción del gen regulador de la captación de zinc (y por ello de la proteína represora Zur) SEQ ID NO 62.

(2) Expresión de los genes de biosíntesis de [S,S]-EDDS bajo control de promotores sin represión por zinc (None-Zinc-Repressed Promoters). Intercambio de los promotores diana de Zur.

(3) Expresión heteróloga de los genes de biosíntesis de [S,S]-EDDS en células huésped en las que la represión por zinc ya no está disponible.

3.1 Deleción del gen regulador de la captación de zinc SEQ ID NO 62

[0131] Bajo la suposición de que los genes de biosíntesis de [S,S]-EDDS experimentan una represión a través de ZurAJ (ORF5768 o proteína o péptido según la SEQ ID NO 61) con zinc como cofactor, se realizó una deleción de la región codificante según la SEQ ID NO 62 para producir una cepa productora de [S,S]-EDDS con desactivación de la represión por zinc.

[0132] Para lograr la deleción en marco de la región codificante según la SEQ ID NO 62 (corresponde a orf5768) a través de una recombinación homóloga, se construyó el vector de deleción pGusA21Aorf5768, que contiene la región aguas abajo y aguas arriba de orf5768, que es similar a pGusA21-us1662+ds1664 (AG Stegmann). Se obtuvo un pGusA2lAorf5768 no metilado negativo de E. coli ET12567 y se utilizó para la transformación directa de A. japonicum (figura 11).

[0133] Se transfirieron colonias resistentes contra la apramicina de A. japonicum, que se obtuvieron tras la transformación con pGusA21Aorf5768 no metilado, a placas HA. Las colonias en crecimiento se recubrieron con solución de X-Gluc (5-bromo-4-cloro-3-indolil-p-D-glucorónido) y se seleccionaron colonias azules mediante PCR (figura 12, positivos para el gen reportero gusA: clon 1, 6, 7, 8, 12) para otro control de casos de entrecruzamiento único.

[0134] Se aisló ADN genómico de estos clones y se controlaron mediante PCR los casos de entrecruzamiento único de los plásmidos en el genoma de A. japonicum en presencia de un casete de resistencia a apramicina y se dedujeron específicamente con cebadores para confirmar una integración de pGusA21Aorf5768 en el genoma. Utilizando el par de cebadores de orf5768-SCO-FP y orf5768-SCO-RP se amplificó un fragmento con 1677 pb (orf5768-SCO-wt-Frag) y/o un fragmento con 1293 pb (orf5768-SCO-single Frag), que representa el genoma silvestre o el genoma con pGusA21Aorf5768 integrado (figura 12).

[0135] Los clones de A. japonicum con pGusA21Aorf5768 integrado en el genoma (clones 1, 6, 7 y 8) se unieron y utilizaron para la inducción de un entrecruzamiento doble (recombinación homóloga), donde las células se cultivaron bajo estrés térmico.

[0136] En total se produjeron tres mutantes de A. japonicum (A. japonica Azur) en una deleción en marco de la región codificante de la SEQ ID NO 62. A. japonicum WT y todos los mutantes producidos se cultivaron en medio de producción de EDDS (compárese con la tabla 1). Mientras que la cepa A. japonicum WT bajo las condiciones ricas en zinc no formó [S,S]-EDDS, ninguno de los tres mutantes mostró una represión por zinc (figura 13).

[0137] Por lo tanto pudo demostrarse que la deleción del represor reactivo al zinc de A. japonicum (zurAJ o secuencia aminoacídica según la SEQ ID NO 62) lleva a una producción de [S,S]-EDDS independiente de zinc.

3.2 Expresión de los genes de biosíntesis de [S.S1-EDDS bajo el control de promotores sin represión por zinc

[0138] Una segunda estrategia para la producción de una cepa productora de [S,S]-EDDS con desactivación de la represión por zinc se provee para evitar la represión por zinc mediada por Zur (proteína o péptido según la SEQ ID NO 61) a través de un intercambio de los promotores diana de Zur por promotores expresados relativamente fuerte de manera constitutiva o inducibles. Para ello se eligió el conocido promotor expresado de manera constitutiva PermE* para expresar el operón de [S,S]-EDDS (SEQ ID NO 48, 50, 52 y 54, corresponde a orf1662-65) bajo su control. El plásmido producido pRM4-PermE*orf1662-65 se transfirió a A. japonicum WT y así obtener A. japonicum pRM4-PermE*orf1662-65 (figura 14).

[0139] A. japonicum WT y A. japonicum pRM4-PermE*orf1662-65 se cultivaron entonces en medio de producción de EDDS (compárese con la tabla 1), suplementado con solución de 6 pM de ZnSO4. Los datos según la figura 15 muestran que con A. japonicum WT bajo las condiciones elegidas no se produce ninguna producción de [S,S]-EDDS. Por el contrario, resulta ya una producción de [S,S]-EDDS detectable en presencia de zinc a través de la

Claims (9)

REIVINDICACIONES

1. Proteína o péptido aislado que es funcional para un paso de síntesis parcial de la biosíntesis de [S,S]-etilendiaminodisuccinato, que contiene o consistente en una secuencia aminoacídica que se selecciona del grupo consistente en SEQ ID NO 39, SEQ ID NO 41, SEQ ID NO 43, SEQ ID NO 45, SEQ ID NO 47, SEQ ID NO 49, SEQ ID NO 51, SEQ ID NO 53 y combinaciones de las mismas.

2. Ácido nucleico aislado, que contiene o consistente en una secuencia aminoacídica que se selecciona del grupo consistente en

a) una secuencia aminoacídica, que codifica una proteína o un péptido según la reivindicación 1,

b) una secuencia aminoacídica, que corresponde a la cadena complementaria de la secuencia aminoacídica según a) y combinaciones de las mismas.

3. Ácido nucleico aislado según la reivindicación 2, que contiene o consistente en una secuencia aminoacídica que se selecciona del grupo consistente en SEQ ID NO 40, SEQ ID NO 42, SEQ ID NO 44, SEQ ID NO 46, SEQ ID No 48, SEQ ID NO 50, SEQ ID NO 52, SEQ ID NO 54 y combinaciones de las mismas.

4. Grupo de genes u operón aislado, que contiene o consistente en al menos dos secuencias de ácido nucleico que se seleccionan del grupo consistente en SEQ ID NO 40, SEQ ID NO 42, SEQ ID NO 44, SEQ ID NO 46, SEQ ID NO 48, SEQ ID NO 50, SEQ ID NO 52, SEQ ID NO 54 y combinaciones de las mismas.

5. Utilización de una proteína o un péptido, que contiene o consistente en una secuencia aminoacídica según la SEQ ID NO 61, para una represión de la biosíntesis de [S,S]-etilendiaminodisuccinato.

6. Vector de expresión, que contiene al menos un ácido nucleico según la reivindicación 2 o 3 o un grupo de genes o un operón según la reivindicación 4.

7. Célula huésped recombinante, que contiene un vector de expresión según la reivindicación 6.

8. Método para la biosíntesis de [S,S]-etilendiaminodisuccinato, que incluye los pasos:

a) cultivo de una célula huésped productora de [S,S]-etilendiaminodisuccinato según la reivindicación 7 o una célula bacteriana recombinante del género Amycolatopsis, particularmente de Amycolatopsis japonicum, que no expresa ninguna proteína o péptido, que contiene o consistente en una secuencia aminoacídica según la SEQ ID NO 61, y/o no contiene ningún ácido nucleico, que contiene o consistente en una secuencia aminoacídica según la SEQ ID NO 62, y

b) purificación de [S,S]-etilendiaminodisuccinato a partir de la célula y/o de un medio de cultivo utilizado para la célula.

9. Kit para la biosíntesis de [S,S]-etilendiaminodisuccinato, que incluye un componente que se selecciona del grupo consistente en al menos una proteína o un péptido según la reivindicación 1, al menos un ácido nucleico según la reivindicación 2 o 3, un grupo de genes o un operón según la reivindicación 4, un vector según la reivindicación 6, una célula huésped según la reivindicación 7 y combinaciones de los mismos.