JP5416272B2 - 壊死マーカーprdx4に対するモノクローナル抗体及びその用途 - Google Patents
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Description
[態様1]配列番号1で示されるアミノ酸配列、又は、該アミノ酸配列において一個又は数個のアミノ酸が置換、欠失及び/又は挿入されたアミノ酸配列若しくは該アミノ酸配列と90%以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、該アミノ酸配列とタンパク質としての同一の機能、活性、又は性質を示すアミノ酸配列をコードする遺伝子の発現産物から成る壊死マーカーに対するモノクローナル抗体。
[態様2]壊死マーカーが配列番号1で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質の部分ポリペプチドから成る、態様2記載のモノクローナル抗体。
[態様3]ハイブリドーマNITE ABP-1062(YKP4 C8505 FCS(+))によって産生される、態様1または2記載のモノクローナル抗体。
[態様4]態様1ないし3のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体を用いて壊死マーカーの量を測定することにより、壊死巣を検出する方法。
[態様5]試料中に含まれる態様1ないし3のいずれか一項に記載の壊死マーカーから選択された一つ又はそれらの任意の組み合わせから成る壊死マーカーの濃度を測定し、その測定値が正常レベルよりも上昇していることを指標として壊死巣を検出する、態様4記載の方法。
[態様6]試料として全血又は血清を使用する、態様4又は5記載の方法。
[態様7]壊死巣が、各種固形癌、心筋梗塞、脳梗塞、壊死後性肝硬変 (postnecrotic cirrhosis)、壊死性膵炎 (necrotizing pancreatitis)、壊死性筋膜炎 (necrotizing fasciitis)、動脈硬化性壊疽、糖尿病性壊疽、又は、閉塞性壊疽に関連することを特徴とする、態様4ないし6のいずれか一項に記載の方法。
[態様8]態様4ないし7のいずれか一項に記載の方法に用いる検出キットであって、態様1ないし3のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体を含む該キット。
[態様9]配列番号1で示されるアミノ酸配列、又は、該アミノ酸配列において一個又は数個のアミノ酸が置換、欠失及び/又は挿入されたアミノ酸配列若しくは該アミノ酸配列と90%以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、該アミノ酸配列とタンパク質としての同一の機能、活性、又は性質を示すアミノ酸配列をコードする遺伝子の発現産物から成る壊死マーカーと特異的に反応する化合物と標識化合物又は治療に有効な化合物から成る、画像診断用又は治療用コンジュゲート。
[態様10]態様9に記載のコンジュゲートを活性成分として含む、画像診断用キット又は医薬組成物。
一方、「通常の培養条件」とは、例えば、血清含有DMEM 培地(Dulbecco’s modified Eagle medium) 中で、2x104〜1x105個/mlの細胞密度で、37℃, 5% CO2存在下95%空気の気相、飽和湿度の条件で培養することを意味する。
更に、「より高濃度で存在する(高発現する)タンパク質」とは、例えば、通常の培養条件で培養した細胞と比較して、蛍光標識二次元ディファレンスゲル電気泳動において約2倍以上の蛍光強度があり、壊死が誘導された細胞内で経時的に増加するスポットに含まれるタンパク質を意味する。
(1)配列番号1で示されるアミノ酸配列、
(2)(1)の各アミノ酸配列において一個又は数個のアミノ酸が置換、欠失及び/又は挿入されたアミノ酸配列、又は(1)の各アミノ酸配列と90%以上、好ましくは95%以上、更に好ましくは98%以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、(1)の各アミノ酸配列とタンパク質としての同一の機能、活性、又は性質を示すアミノ酸配列。
致死表現系を持つ細胞を同定するための種々の方法が存在する。壊死(ネクローシス)細胞またはアポトーシス細胞において、細胞形態、または細胞透過性の変化、つまり細胞膜の「水泡化」が観察される。種々の色素、染色および抗体が、そのような方法で利用可能であり、限定はしないで、ヨウ化プロピジウム、抗体Apo2.7およびカスパーゼ色素等が含まれる。
トリパンブルーは青色の色素である。無傷の膜を持つ生細胞は、細胞間区画からトリパンブルーを排除するため、染色されない。死細胞および瀕死細胞の細胞膜は透過性があるため、細胞質が青色に染色される。
ヨウ化プロピジウム(PI)は蛍光のDNA間在分子である。無傷の膜を持つ生細胞は、細胞間区画からPIを排除するため、非蛍光である。死細胞および瀕死細胞はPIに対して易感染性で、透過性あるため、蛍光である。PI染色技法は壊死およびアポトーシス細胞に等しく利用される。
アネキシンVは、ホスファチジルセリンなどの陰イオン性リン脂質部位に結合する。生細胞の細胞膜は脂質二重層構造をとっており、細胞膜の内膜と外膜でリン脂質に偏りがあり、ホスファチジルセリンは通常内膜に局在している。多くの細胞がアポトーシスを起こしている時、この脂質は細胞外膜上に転位し、露出する。この転位により、外来より加えた蛍光共役アネキシンVが、脂質と相互作用することが可能となり、それによって、アポトーシスを起こしている細胞を標識することが可能である。そこで、蛍光共役アネキシンVに標識されない死細胞を分取することにより、壊死細胞を分離することが可能になる。
本発明の方法は、壊死巣を形成している細胞モデルとしてネクローシスを誘導した細胞を必要とする。そこで、子宮頚がん細胞株のHeLa細胞にネクローシスを誘導し、壊死巣を形成する細胞モデル系を作製した。一般的に、HeLa細胞は接着性細胞であり、2x105〜1x106個の細胞を10cm2シャーレ上で足場依存的に培養する。通常培養では血清含有DMEM 培地(Dulbecco’s modified Eagle medium) 10mlに、2x104〜1x105個/mlの密度で、37℃, 5% CO2存在下95%空気の気相、飽和湿度の条件で培養する。HeLa細胞は増殖能が高く、栄養豊富な血清含有DMEM培地中では、2〜3日で10cm2シャーレがコンフルエントになるまで増殖する。HeLa細胞は癌細胞株なのでシャーレがコンフルエント状態になっても接触阻害はかからず増殖可能であるが、過剰に増殖させるとすみやかに細胞死を起こす。今回、HeLa細胞を1x107個/mlという高密度、さらにチューブ中で浮遊させる足場なしの状態で、チューブに蓋をした嫌気条件で培地交換せずに1週間〜2週間培養することにより、壊死巣に特徴的な低栄養、低酸素、高密度および足場非依存的な細胞の環境を再現した。
HeLa細胞を10 cm2シャーレで、100 units/ml ペニシリン・ストレプトマイシン(Gibco BRL)および10% FBS(JRH社)を添加したDMEM培地(Gibco BRL)中で通常培養した。増殖したHeLa細胞をトリプシン・EDTA(Gibco BRL)で10cm2 シャーレから剥がし、氷冷したPBS(-)で2回洗浄し、1 x 10 7 個の細胞を1.5 mlのチューブに移し、1mlの上記DMEM培地あるいは10% FBSを添加しないDMEM培地中で15日間培養した。培地にはpH指示薬を添加し、細胞呼吸による酸素消費により酸素濃度の低下を3日目以降確認したが、蓋をしたまま培養を継続した。
1.2.1 トリパンブルーによる染色
ネクローシスを誘導したHeLa細胞を遠心分離して回収し、氷冷したPBS(-)で2回洗浄した。回収したHeLa細胞を氷冷したPBS(-)で約1 x 106個/ mlになるように懸濁し、1/10容量の0.4% トリパンブルー/PBSバッファー溶液(Gibco BRL)を加えて混和し、室温で3〜5分間インキュベーションした後、顕微鏡下で観察した。無色の生細胞、青色に染色された死細胞および瀕死細胞数をそれぞれ計測した。
致死表現型を有する細胞には大別してネクローシスとアポトーシス(プログラム細胞死)が考えられる。壊死巣ではネクローシス細胞がアポトーシス細胞よりも比重が大きいと考えられ、細胞死を区別するため、さらに細胞を蛍光色素で染色した。ネクローシスを誘導したHeLa細胞を遠心分離して回収し、氷冷したPBS(-)で2回洗浄した。回収した細胞にアネキシンV (Annexin-V-Fluos :終濃度20 μl/ml; Roche)およびヨウ化プロピジウム(PI):終濃度1μg/ml, 株式会社同仁化学研究所)を含む染色Hepesバッファー溶液(10 mM Hepes-NaOH (pH 7.4), 140 mM NaCl, 5mM CaCl2)100 μlを加えて室温で10〜15分間インキュベーションし、蛍光顕微鏡下(励起光;488 nm, 検出;515-565 nm)で観察した。一方、10 cm2シャーレに培養したHeLa細胞を、1mM 過酸化水素を含む10%FCS含有DMEM培地に代えて1時間培養し、氷冷したPBS(-)で2回洗浄し、通常の10% FCS含有DMEM培地に戻して5時間培養し、アポトーシスを誘導した。そのHeLa細胞を同様にAnnexin-V-Fluos およびPIで染色し、蛍光顕微鏡下で観察した。
2.1 細胞抽出液の調製
実施例1において10% FCS添加DMEM培地でネクローシスを誘導して1日目〜6日目のHeLa細胞および通常培養したHeLa細胞を回収し、氷冷したPBS(-)で2回洗浄した。氷冷した500-1,000μlの可溶化バッファー(20 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% NP-40)を加えて細胞を懸濁し、1.5 mlチューブに移した。チューブを4 ℃で30分間回転させながら細胞の可溶性画分を抽出し、15,000rpmで15分間遠心分離し、その上清を細胞抽出液とした。回収した細胞抽出液を、2D-Clean up kit(80-6484-51, Amersham)を用い、そのプロトコールに従って精製し、適量のlysis buffer ( 30 mM Tris (pH 8.5), 7M Urea, 2M Thiourea, 4% CHAPS, 5mM 酢酸マグネシウム)に溶解し、遠心分離した後、その上清を細胞抽出精製液とした。
細胞抽出精製液に含まれるタンパク質をProtein Assay試薬( 500-0006, Bio-Rad )を用い、そのプロトコールに従ってBradford法に基づき定量した。具体的には、細胞抽出精製液1μlに0.1 N HCl 1μlと精製水8μlを加えてサンプル溶液とした。タンパク質標準液としてBSA溶液(23209, Thermo)を0.25-1 mg/mlに希釈し、その1μlにlysis buffer 1μlと0.1 N HCl 1μlを加えて全量を10μlとした。同様に精製水8μlにlysis buffer 1μlと0.1 N HCl 1μlを加えてブランク溶液とした。それぞれのサンプル溶液、標準溶液およびブランク溶液に、5倍希釈したProtein Assay試薬を200μlずつ加えてよく混和し、室温で5分間放置した。Protein Assay試薬を混和してから1時間以内に測定波長595 nmで吸光度を測定し、BSA標準溶液の吸光度から検量線を求め、細胞抽出精製液に含まれるタンパク質量を算出した。
通常培養およびネクローシスを誘導して1〜6日目のHeLa細胞から調製した細胞抽出精製液25μgずつを、それぞれCy3(CyDye DIGE Fluor Cy3, GE Healthcare)およびCy5(CyDye DIGE Fluor Cy5, GE Heaithcare)で別々に標識し、10mM Lysine(SIGMA社)を加えて蛍光標識反応を停止した。Cy3およびCy5で標識したそれぞれのHeLa細胞抽出精製液を等量混合し、一次元電気泳動用サンプルバッファー (8M Urea, 2% CHAPS, 0.5% IPG Buffer(17-6004-40, GE), 0.002% ブロモチモールブルー溶液)を加えてよく混合し、15,000rpmで5分間遠心分離し、その上清をサンプル溶液とした。そのサンプル溶液中でpH3-11のイオン勾配を有する24cmの一次元目専用ゲル(Immobiline DryStrip pH 3-11NL, 17-6003-77, GE Healthcare)を12時間膨潤し、一次元目専用等電点電気泳動システム装置(Ettan IPGphor 3 IEF System, GE Healthcare)を用いて段階的に電圧をあげながら細胞抽出精製液に含まれるタンパク質を等電点電気泳動で分離した。次に10% ポリアクリルアミドゲル(Acrylamide:17-1310-01, GE Healthcare)を用いた二次元目の電気泳動により、細胞内可溶化タンパク質をさらに分子量で分離した。二次元電気泳動により分離した蛍光標識タンパク質はバリアブルイメージアナライザー(Typhoon TRIO+, GE Healthcare) で検出し、ゲルイメージは2D-DIGE専用解析ソフトDeCyder(GE Healthcare)を用いてスポットを解析し、それぞれの細胞内でのタンパク質発現を比較した。
ネクローシスを誘導したHeLa細胞で発現量の増加したタンパク質をMALD-TOF/MSで同定した。具体的には、上記の二次元電気泳動後の10%ポリアクリルアミドゲルをトリス、6-アミノカプロン酸、メタノール系のバッファー溶液中で2mA/cm2ゲル面積の定電流で90分間通電し、ゲル中のタンパク質を電気的にPVDF膜(ProBlott(登録商標), ABI社)に転写した。PVDF膜上のタンパク質をクマシーブルー R-350(17-0518-01, GE Healthcare)で染色して可視化し、目的とするスポットを剃刀で切り出し、1fmolのリシリルエンドペプチダーゼ(125-05061, Wako)を加えて37℃で16時間消化し、その断片化ペプチドをNuTip (登録商標)ピペットチップ(Glygen Corp.)で精製し、MALD-TOF/MS(Voyager-DETMPRO, AB SCIEX社)で解析した。得られたフラグメントをタンパク質解析用データベースと比較して、該タンパクに関する情報を得た。
ネクローシスを誘導したHeLa細胞で発現量の増加したタンパク質のN末端アミノ酸を、エドマン分解により順次分解して一次構造決定した。具体的には、上記の2.4で得られたタンパク質が転写されたPVDF膜をクマシーブルー R-350(GE)で染色し、目的とするスポットを剃刀で切り出し1.5 mlチューブに移した。PVDF膜を少量のアセトニトリルで湿らせた後、1 ml のMilli-Q水を加えて激しく攪拌した後、Milli-Q水を除く洗浄操作を5回繰り返し、全自動タンパク質一次構造解析装置(PPSQ33A, 島津製作所)でアミノ酸配列を自動解析した。
(1)ペルオキシレドキシン4:WETEERPRT
(2)Erp29:LHTKGALPL
質量分析法およびN末端アミノ酸分析により同定した表1に記載の壊死巣特異的マーカータンパク質のうち、市販抗体が入手可能な以下に示す5種類についてウエスタンブロッティング法で確認した。具体的には、上記の2.4で得られたタンパク質が転写されたPVDF膜の非特異吸着をブロックエース(UK-B80, DSファーマ)を用いてブロッキングした後、PBS(-)で至適濃度(100〜2,000倍)に希釈した一次抗体を加え、静かに振とうしながら室温で1時間反応させた。PBSTで3回洗浄後、ビオチン標識抗IgG抗体(BA-1400, VECTASTAINN社)を加え、静かに振とうしながら室温で30分間反応させた。PBSTで3回洗浄後、アビジンービオチン標識西洋ワサビペルオキシダーゼ複合体溶液(VEC社)を加えて静かに振とうしながら室温で30分間反応させ、PBSTで3回洗浄した後、ペルオキシダーゼの基質である3, 3’-Diaminobenzidine(DAB;SK-4105, VEC社)溶液を加え、発色シグナルが観察されたところでPVDF膜をMilli-Q水に移して発色を停止させた。ネガティブコントロールとして、抗Bip抗体についてはそのブロッキングペプチド(#1084, Cell Signaling)、抗ペルオキシレドキシン4、抗カルレティクリン及び抗ERp57各抗体に対しては抗マウスIgGコントロール抗体、抗Erp29抗体に対しては抗ウサギIgGコントロール抗体を用いて同様にウエスタンブロッティングを行った。
(1)ペルオキシレドキシン4:Peroxiredoxin 4 antibody [7A1], ab 16943, Abcam (スポット番号1)
(2)ERp29:ERp29 antibody, ab40982, Abcam (スポット番号2)
(3)カルレティクリン:Calreticulin mouse mAb, ab54922, Abcam (スポット番号5)
(4)Bip:Bip(C50B12) Rabbit mAb, #3177, Cell Signaling (スポット番号6)
(5)ERp57:Monoclonal Anti-ERp57 (TO-2), E5031, SIGMA (スポット番号9)
3.1免疫動物の感作および細胞融合
壊死巣特異的マーカーとして同定されたタンパク質のうち、ペルオキシレドキシン4断片またはERp29断片については、実施例2で同定したN末端アミノ酸配列を基にして、各々の配列を認識するマウスモノクローナル抗体を作製した。
細胞融合後のハイブリドーマは96穴プレートで培養し、通常のHAT培地により選別した。コロニー形成がみられたウエルの培養上清について、免疫原の抗原ペプチドに結合する抗体を含むかどうか、ELISA法によってスクリーニングした。ペルオキシレドキシン4断片のN末端ペプチド+システイン(WETEERPRTC)またはERp29断片N末端ペプチド+システイン(LHTKGALPLC)、あるいは新たに化学合成してHPLCで精製したぺルオキシレドキシン4断片のN末端8残基ペプチド(WETEERPR)またはERp29断片N末端8残基ペプチド(LHTKGALP)を200 μg/mlの濃度になるようにPBS(-)で希釈し、その50 μlずつを96穴イムノプレート(Maxisorp, Nunc社)に分注した。4℃で一晩静置して合成ペプチドをプレートに固定し、PBS(-)で2回洗浄し、ブロックエース(DSファーム)を加えて室温で1時間ブロッキングした後、0.1% Triton-X 100含有PBS(-)(PBST)で2回洗浄した。コロニー形成ウエルの培養上清100 μlを加えて室温で1時間インキュベーションした後、PBSTで2回洗浄し、ビオチン標識抗マウスIgG抗体(BA-1400, VEC社)と室温で30分間反応させ、PBSTで3回洗浄した。さらに、アビジン-ビオチン標識ペルオキシダーゼ複合体溶液(Mouse IgG ABC kit, VECTASTAIN社)と室温で30分間反応させ、PBSTで3回洗浄した後、ペルオキシダーゼの基質である2,2’-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)(ABTS; SK-4500, VEC社)溶液を加えて室温で発色するまでインキュベーションし、マイクロプレートリーダーを用いて、測定波長405 nmの吸光度を測定して各クローンにより生じる吸光度シグナルを評価した。タイターの高いウエルを選択して、限界希釈法によりモノクローナル抗体産生ハイブリドーマをクローニングした。
4.1 組織免疫染色法
ヒト乳がん組織の癌部と非癌部(N=5)およびヒト肺がん組織の癌部と非癌部(N=5)の組織切片を用いて、壊死巣特異的マーカータンパク質を認識する抗体を評価した。乳がん患者および肺がん患者由来組織サンプルのパラフィン包埋切片は(株)医学生物学研究所から入手した。各組織のパラフィン包埋切片は、キシレンおよびエタノールを用いて常法に従って脱パラフィンし、組織切片をPBS(-)で3回洗浄し、10mM クエン酸バッファー(pH 6.0)で抗原を賦活化し、0.3% H2O2中30分間静置して内在性のペルオキシダーゼを失活させた後、ウマ血清で非特異吸着をブロッキングした。壊死巣マーカーに対する抗体(ペルオキシレドキシン4断片のN末端ペプチドおよびERp29断片のN末端ペプチドを認識するモノクローナル抗体(実施例3で最終的に得られた、夫々、5クローンの中の一つ)、及び実施例2に記載の5種類の市販抗体)をそれぞれPBS(-)で至適濃度(250〜1,000倍)に希釈して、ブロッキング後の組織切片と室温でそれぞれ1時間反応させた後、PBS(-)で3回洗浄し、ビオチン標識抗IgG抗体(BA-1400, VEC社)と室温で30分反応させた。組織切片をPBS(-)で3回洗浄した後、アビジンービオチン標識西洋ワサビペルオキシダーゼ複合体(VEC社)と室温で30分間反応させ、PBS(-)で3回洗浄した後、ペルオキシダーゼの基質である3, 3’-Diaminobenzidine(DAB;SK-4105, VEC)溶液を加え、室温で約2分間インキュベーションして組織を免疫染色した。発色した組織切片を蒸留水につけて反応を停止させた後、ヘマトキシリン液で対比染色を行い、非水性封入剤(MGK-S、松浪硝子工)で封入した後、顕微鏡下で組織を観察した。
ハイブリドーマ(YKP4 C8505 FCS(+)の培養上清から抗ヒトPRDX4モノクローナル抗体をプロテインAカラムで精製した。即ち、PBS(-)で平衡化したHiTrapAカラム1mlに培養上清を50ml添加し、PBS(-) 5mlでカラムを洗浄した後、0.17 Mの(pH2.3)緩衝液でカラムから溶出した。溶出画分は280nmの吸光度でモニタリングしながら1mlずつ分取し、吸光度の高い画分をブラッドフォード法(Bio-Rad社)で測定して精製モノクローナル抗体を得た。
実施例5で精製した抗ヒトPRDX4モノクローナル抗体のアイソタイプをマウスモノクローナル抗体アイソタイピングキット(MMT1, Serotec社) で確認した。マニュアルに準じ、精製したモノクローナル抗体150μlを反応チューブに添加して室温で30秒反応させた。反応液をボルテックスミキサーでよく混和した後、アイソタイピングストリップを反応チューブに入れてアイソタイプを判定した。その結果、その結果、抗ヒトPRDX4モノクローナル抗体のアイソタイプはIgG1/κであった。
実施例5で得られた精製モノクローナル抗体の親和定数及び解離定数をBIACore システム(Biacore AB Corporation:現在は GEヘルスケア・ジャパン株式会社が供給する)を用いて、表面プラズモン共鳴現象(SPR)を測定することにより得た。すなわち、抗原となるビオチン化ペプチドを合成して得て、それをHBバッファーで1mg/mlに希釈して作製したペプチド溶液100μlをセンサチップSAにBIACore システムの機器使用マニュアルに従って固定した。精製したモノクローナル抗体を0.25μg/ml 〜80 μg/mlの濃度範囲で2倍希釈系列を作製し、そのうち45μlをBIACoreシステム(流速30μl/min)に添加してBIACore システムの機器使用マニュアルに従って抗原となるペプチドに対する結合量を測定した。その結果、抗ヒトPRDX4モノクローナル抗体の親和定数及び解離定数として1.26 x 108及び7.9 x 10-9を得た(図3)。
1)抗ヒトPRDX4モノクローナル抗体のIn-111標識 0.05M borate buffer pH8.5に溶解した各IgG抗体と0.05M borate buffer pH8.5に溶解したN-[(R)-2-amino-3-p-isothiocyanato-phenyl]propyl]-trans -(S,S)-cyclohexane-1,2-diamine-pentaacetic acid(DTPA)を、分子量比で1対2.5の割合で混合し、37度で16時間反応させた。塩化インジウム([In-111]Cl3)を等量の1M acetate buffer pH6.0と混合し、室温で5分間静置した後、等量の上記DTPAとIgGの反応物を混合し、室温で30分静置した。セルロースアセテート電気泳動により、[In-111]DTPA-IgGと[In-111]DTPAに分離し、IgGに結合したDTPAの数を求めた。上記DTPAとIgGの反応物をSephadex G50担体にアプライし、未結合のDTPAを取り除き、DTPA-IgGを精製した。この精製DTPA-IgGを上述の方法により、In-111標識し、Sephadex G50担体により、未反応のIn-111を除去した[In-111]DTPA-IgGを使用し、以下の実験を実施した。図4は、セルロースアセテート電気泳動により精製前と精製後のDTPA-IgGの泳動後のオートラジオグラフィーの写真を示す。
[In-111]DTPA-IgG投与4日目の撮像終了後に、腫瘍を摘出し、凍結標本を複数作製し、作製した複数の標本のうち隣接標本でオートラジオグラフィーとヘマトキシリン・エオシン染色(HE染色)を実施した。図7では、腫瘍の切片が、左からオートラジオグラフィー、HE染色、その2つの重ね合わせが並べてある。腫瘍切片のHE染色では、中央付近の壊死部は青色に乏しく弱いが赤色がかった色に、外側の正常な癌組織部位と中央を取り巻く壊死巣周辺部位は赤みがかった青色に染まっていた。図7に示される様に、摘出した腫瘍(大きさ:約13.6mm X 18.3mm)の中央の壊死部を取り巻く壊死巣周辺部位に[In-111]DTPA-IgGが選択的に集積することが明らかとなった。すなわち、オートラジオグラフィーとHE染色の写真を重ね合わせると、中央付近の壊死巣を取り巻く壊死巣周辺部位にIn-111標識モノクローナル抗体の集積が認められると判断された。
摘出した腫瘍の病理より、核が残っている壊死細胞に[In-111]DTPA-IgGが集積し、核が脱落した壊死細胞には集積しないことが明らかとなった。このことは、壊死して時間があまり経過していない細胞及びその近傍に壊死マーカータンパク質が残存していることを示しているものと思われる。すなわち、図8では、中央付近の壊死部では細胞の形態がくずれて核が認められないこと、また壊死部周辺部では細胞の核が認められるが正常な癌細胞と形態が異なること、腫瘍の外側付近の周辺部は核と細胞質が明確であり正常な癌細胞の形態であることがわかる。図中の顕微鏡写真の中のバーは100ミクロンメーターを示す。
Claims (9)
- 配列番号1で示されるアミノ酸配列からなる壊死マーカーに対する抗体を含む、壊死巣検出剤。
- 壊死マーカーに対する抗体が、ハイブリドーマNITE BP-1062(YKP4 C8505 FCS(+))によって産生されるモノクローナル抗体である、請求項1記載の壊死巣検出剤。
- 配列番号1で示されるアミノ酸配列から成る壊死マーカーに対する抗体又はハイブリドーマNITE BP-1062(YKP4 C8505 FCS(+))によって産生されるモノクローナル抗体を用いて壊死マーカーの量を測定することにより、壊死巣を検出する方法。
- 試料中に含まれる配列番号1で示されるアミノ酸配列からなる壊死マーカーの濃度を測定し、その測定値が正常レベルよりも上昇していることを指標として壊死巣を検出する、請求項3記載の方法。
- 試料として全血又は血清を使用する、請求項3又は4記載の方法。
- 壊死巣が、各種固形癌、心筋梗塞、脳梗塞、壊死後性肝硬変 (postnecrotic cirrhosis)、壊死性膵炎 (necrotizing pancreatitis)、壊死性筋膜炎 (necrotizing fasciitis)、動脈硬化性壊疽、糖尿病性壊疽、又は、閉塞性壊疽に関連することを特徴とする、請求項3ないし5のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項3ないし6のいずれか一項に記載の方法に用いる検出キットであって、配列番号1で示されるアミノ酸配列から成る壊死マーカーに対する抗体又はハイブリドーマNITE BP-1062(YKP4 C8505 FCS(+))によって産生されるモノクローナル抗体を含む該キット。
- 配列番号1で示されるアミノ酸配列からなる壊死マーカーに対する抗体又はハイブリドーマNITE BP-1062(YKP4 C8505 FCS(+))によって産生されるモノクローナル抗体と標識化合物からなるコンジュゲートを含む、壊死巣検出用の画像診断剤。
- 請求項8に記載のコンジュゲートを活性成分として含む、画像診断用キット。
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JP2008267963A (ja) | 大腸ガンの診断または検出のための組成物及び方法 |
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