CN105807061B - 电离辐射生物标记的筛选方法及由此确定的b8x1j0、upf1蛋白的用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种电离辐射生物标记的筛选方法和采用该方法确定的B8X1J0和UPF1蛋白在制备放射性工作人员健康监护指标试剂盒中的用途。所述筛选方法包括：分别采集放射、非放射工作人员血清标本，按照累积照射剂量对放射工作人员的血清进行分组；以非放射工作人员血清为对照，采用iTRAQ技术筛选放射工作人员的血清差异表达蛋白，确定差异表达上调蛋白B8X1J0和差异表达下调蛋白UPF1共同作为放射性工作人员健康监护的生物标记。利用本发明可快速找到多个蛋白表达水平上调、下调的差异表达蛋白，根据蛋白差异比值大小以及蛋白相关功能可筛选蛋白B8X1J0和蛋白UPF1共同作为放射性工作人员健康监护的生物标志。

Description

电离辐射生物标记的筛选方法及由此确定的B8X1J0、UPF1蛋 白的用途

技术领域

本发明属于生物标记技术领域，具体涉及电离辐射生物标记的筛选方法及由此确定的B8X1J0、UPF1蛋白的用途。

背景技术

电离辐射生物标志(biomarkers of ionizing radia-tion)是指用物理学和生物学等方法检测并区别放射性损伤或非放射性损伤。或者说，电离辐射生物标志是反映放射损伤的特有标志，这种生物标志为放射性疾病的诊断和治疗提供可靠的依据。物理学检测是应用计数的方法定量检测蓄积体内的放射性物质。随着细胞和分子生物学迅猛发展，人们对电离辐射所致细胞和分子结构的改变也有了深刻的认识。电离辐射可引起细胞突变、染色体畸变及基因表达等不同水平规律性改变，这些改变称为电离辐射生物标志。利用电离辐射引起机体的生物学变化，或者说显示了生物标志，测其受照剂量的方法称为生物学检测。一般来说，生物学检测与物理学检测可互相补充和验证。在比较复杂的情况下，生物学检测更优于物理学检测,能够准确地估算照射剂量。目前，作为电离辐射生物标志有染色体畸变、微核(照射后分裂一次的双核淋巴细胞)、体细胞突变等。

由于细胞和分子生物学的发展，流式细胞术(FCM)和聚合链式反应(PCR)及其他技术的应用，DNA单链和双链断裂可作为电离辐射的早期生物标志。一般，低到0.05Gy照射可检测到DNA碱基损伤，而且检测的样品很快能够获得。但是，到目前为止，应用分子变化作为电离辐射的生物标志还很不成功。首先，检测分子变化的敏感性低，特异的靶小，诱导其变化需要较大剂量；其次，大多分子损伤修复快，分子变化不能反映整个照射剂量。因此，很少用分子标志评价早先照射或低剂量率照射的损伤情况。

在低水平照射后，基因表达发生变化。应用基因芯片和PCR技术可迅速检出多基因的变化。但有人认为，由于其反应短暂，不能用作电离辐射生物标志。

iTRAQ技术(isobaric tags for relative and absolute quant itation，同位素标记的相对与绝对定量技术)是近年来最新开发的一种新的蛋白质组学定量研究技术，最多可同时标记8个样品，能对蛋白质水解的肽段同时进行标记，采用串联质谱方法，可以对肽段进行精确的鉴别和定量。一般能够得到500至600种蛋白，以及不同样品间蛋白质表达的差异。iTRAQ技术具有以下技术特点和优势：1.定量敏感、反应速度快；2.标记完全，标记效率高达97％以上；3.较高的重复性，能简化质谱的复杂程度、提高离子强度；4.可对多达8种不同样本同时进行定量分析；5.定性与定量可同时进行。

发明内容

针对现有技术中存在的缺陷，本发明的一个目的是提供一种电离辐射生物标记的筛选方法，采用本方法可快速找到受照人员血清差异表达蛋白，从而可确定B8X1J0、UPF1蛋白为显著的电离辐射生物标志。

本发明的另一个目的是提供上述确定的B8X1J0、UPF1蛋白为显著的电离辐射生物标志在制备放射工作人员健康监护指标试剂盒中的用途。

为达到以上目的，本发明采用的技术方案是：电离辐射生物标记的筛选方法，包括以下步骤：分别采集放射工作人员与非放射工作人员血清的标本，按照累积照射剂量对放射工作人员的血清进行分组；以非放射工作人员血清样本为对照，采用iTRAQ法筛选放射工作人员的血清差异表达蛋白，根据蛋白差异比值大小以及蛋白功能确定差异表达上调蛋白B8X1J0和差异表达下调蛋白UPF1共同作为电离辐射生物标记。

本发明利用iTRAQ技术，通过比较分析不同剂量组与对照组血清标本中蛋白质种类和数量,可快速找到多个蛋白表达水平上调、下调的差异表达蛋白，根据蛋白差异比值大小以及蛋白相关功能可筛选差异表达上调蛋白B8X1J0和差异表达下调蛋白UPF1作为显著的电离辐射生物标志物。本发明提供的差异表达上调蛋白B8X1J0和差异表达下调蛋白UPF1可用于制备放射性工作人员健康监护指标试剂盒。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明作进一步描述。

实施例

1.样品的制备

采集xx厂工作人员血清，按累积照射剂量进行分组，将累积剂量≥200mSv的工作人员分为高剂量组，共6人；累积剂量介于100mSv-200mSv之间的工作人员分为中剂量组，共9人；累积剂量≤100mSv的工作人员分为低剂量组，共9人；将机关工作人员分为对照组，共9人。

对上述四组血清样品，分别使用Agi lent H-14去除血清样品中的高丰度蛋白质，对低丰度蛋白质组分进行浓缩后，加入STD buffer(4％SDS,150mMTrisHCl pH8.0)，混匀，沸水浴5min，离心去上清。

利用BCA法分别对经上述处理的各组低丰度蛋白质进行蛋白质浓度测定，并进行12.5％SDS-PAGE电泳检测。

对四组蛋白质样本，各取300μg样品进行酶解和OD280肽段定量。

2.肽段标记

各组样品分别取约100μg,用八种iTRAQ(113-121)试剂按照Applied Biosystem公司iTRAQ试剂盒说明书进行标记，标记方法见表1。每组样品重复标记两次。

表1

样品	A	A	B	B	C	C	D	D
									iTRAQ标记试剂	113	114	115	116	117	118	119	121

注：A：对照组；B：低剂量组；C：中剂量组；D：高剂量组

3.SCX(强阳离子柱)分级

将标记后的所有肽段混合，使用Polysulfoethyl 4.6x100mm column(5μm,)交换柱(缓冲液A相为10mM KH₂PO₄,pH 3.0,25％CAN；B相为10mM KH₂PO₄,pH 3.0,500mMKCl,25％CAN)，进行SCX预分级；SCX分级后，收集穿流及洗脱馏分约30份，根据SCX色谱图合并成4份，冻干后用C18Cartridge(Sigma)脱盐。

4.质谱分析

4.1毛细管高效液相色谱

对每份脱盐后的样品，采用纳升流速HPLC液相系统Easy nLC进行分离。缓冲液：A相为0.1％甲酸水溶液，B相为0.1％甲酸乙腈水溶液(乙腈为84％)。色谱柱以95％的A相平衡。样品由自动进样器上样到上样柱Thermo scientific EASY column(2cm*100μm，5μm，C18)，再经分析柱Thermo scientific EASY column(75μm*100mm，3μm，C18)分离，流速为250nl/min。相关液相梯度如下：0-100分钟，B相线性梯度从0％到35％；100-108分钟，B相线性梯度从35％到100％；108-120分钟，B相维持在100％。

4.2质谱鉴定

每份样品经毛细管高效液相色谱分离后用Q-Exact ive质谱仪进行质谱分析。分析时长为120min，扫描范围为300-1800m/z，每次全扫描后采集10个碎片图谱。

5.数据分析

通过Mascot2.2和Proteome Discoverer1.3软件检索uniprot_Human.fasta数据库，进行查库鉴定及定量分析。

本次实验共四组样本，分别为A,B,C,D。每组样品重复标记两次。定量时以A组两次标记标签的均值为内参，其他各组蛋白质的iTRAQ比值均采取各通道标签与内参的比值。根据同位素报告基团的相对含量进行蛋白质定量，蛋白差异比值≥1.2(P≤0.05)或者≤0.8(P≤0.05)被认为存在表达差异，其中蛋白差异比值≥1.2的为蛋白表达上调；蛋白差异比值≤0.8为蛋白表达下调。

如表2所示，放射工作人员低剂量组中，表达上调26个蛋白，表达下调22个蛋白；中剂量组中，表达上调28个蛋白，表达下调17个蛋白；高剂量组中，表达上调16个蛋白，表达下调18个蛋白；三个剂量组共同表达上调有3个蛋白，表达下调有6个蛋白。

表2

在差异表达上调蛋白中，B8X1J0蛋白的低剂量组与高剂量组的蛋白差异比值均高于B4E2K8、Q0ZCH9蛋白，其中剂量组的蛋白差异比值均低于B4E2K8、Q0ZCH9蛋白；经文献调研，B4E2K8、Q0ZCH9蛋白未见相关功能报道。因此，选取B8X1J0蛋白作为电离辐射生物标志，可作为受照人员健康监护的一项指标。

在差异表达下调蛋白中，UPF1蛋白的三个剂量组的蛋白差异比值均小于APOC3、H0YLI6和APOA2蛋白，与G3V5C9和PLF4蛋白相差不多，经文献调研，关于G3V5C9和PLF4蛋白的功能研究甚少，因此，选取UPF1蛋白作为电离辐射生物标志，可作为受照人员健康监护的另一项指标。

综上，根据蛋白差异比值大小以及蛋白相关功能筛选出差异表达上调蛋白B8X1J0与差异表达下调蛋白UPF1共同作为放射区工作人员健康监护的新指标。

采用本发明提供的筛选方法确定的蛋白B8X1J0和UPF1可作为电离辐射生物标记来制备放射工作人员健康监护指标试剂盒，即B8X1J0、UPF1蛋白检测试剂盒。通常，这种试剂盒应包括蛋白提取试剂盒、酶联免疫吸附(ELISA)试剂以及B8X1J0和UPF1蛋白的抗体。

本领域技术人员可按照试剂盒常规的使用方法来使用上述试剂盒，主要包括：采集放射性工作人员血液，提取蛋白，采用酶联免疫吸附(ELISA)方法测定放射性工作人员B8X1J0、UPF1蛋白的表达水平。

上述实施例只是对本发明的举例说明，本发明也可以以其它的特定方式或其它的特定形式实施，而不偏离本发明的要旨或本质特征。因此，描述的实施方式从任何方面来看均应视为说明性而非限定性的。本发明的范围应由附加的权利要求说明，任何与权利要求的意图和范围等效的变化也应包含在本发明的范围内。

Claims (2)

1.电离辐射生物标记的筛选方法，包括以下步骤：

分别采集放射工作人员与非放射工作人员的血清标本，按照累积照射剂量对放射工作人员的血清进行分组；

以非放射工作人员的血清样本为对照，采用iTRAQ法筛选放射工作人员的血清差异表达蛋白，根据蛋白差异比值大小以及蛋白功能确定差异表达上调蛋白B8X1J0和差异表达下调蛋白UPF1共同作为电离辐射生物标记。

2.蛋白B8X1J0和UPF1的检测试剂在制备放射工作人员健康监护指标试剂盒中的用途，所述的蛋白B8X1J0和UPF1采用权利要求1所述的筛选方法确定，并作为电离辐射生物标记。