WO2006090836A1 - 電離放射線の被曝量測定方法 - Google Patents

電離放射線の被曝量測定方法 Download PDF

Info

Publication number
WO2006090836A1
WO2006090836A1 PCT/JP2006/303415 JP2006303415W WO2006090836A1 WO 2006090836 A1 WO2006090836 A1 WO 2006090836A1 JP 2006303415 W JP2006303415 W JP 2006303415W WO 2006090836 A1 WO2006090836 A1 WO 2006090836A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
type
protein
ionizing radiation
lygdi
tissue
Prior art date
Application number
PCT/JP2006/303415
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Masaaki Tatsuka
Original Assignee
Hiroshima University
Two Cells Co., Ltd.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hiroshima University, Two Cells Co., Ltd. filed Critical Hiroshima University
Priority to US11/884,945 priority Critical patent/US20080283763A1/en
Priority to AU2006216188A priority patent/AU2006216188A1/en
Priority to EP06714554A priority patent/EP1857819A4/en
Publication of WO2006090836A1 publication Critical patent/WO2006090836A1/ja

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
    • G01N33/6842—Proteomic analysis of subsets of protein mixtures with reduced complexity, e.g. membrane proteins, phosphoproteins, organelle proteins
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/914—Hydrolases (3)
    • G01N2333/948—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • G01N2333/95—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99)
    • G01N2333/964—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue
    • G01N2333/96425—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals
    • G01N2333/96427—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals in general
    • G01N2333/9643—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals in general with EC number
    • G01N2333/96466—Cysteine endopeptidases (3.4.22)

Definitions

  • the present invention relates to a method for measuring the exposure dose of ionizing radiation, which makes it possible to directly know the biological effects of ionizing radiation applied to a living body by utilizing a biochemical reaction. Related.
  • thermoluminescence dosimeters To measure the exposure dose of ionizing radiation, it is common to use physical reactions caused by ionizing radiation. Specifically, film batches, thermoluminescence dosimeters, pocket dosimeters, etc. are used. (Practical revision of radiation management for the chief of the Japan Isotope Association Rev. 2 1992 pl40).
  • the film batch is a case in which a photographic emulsion-coated resin film is housed in a case, and the black emulsion is shown in proportion to the radiation dose to which the photographic emulsion is exposed along with the photosensitive action.
  • a thermoluminescence dosimeter is a dosimeter that utilizes luminescence (fluorescence) generated when a crystalline substance irradiated with radiation is heated, and is an electron that is separated in the crystal by irradiation with electron radiation.
  • the dose of ionizing radiation is measured using the principle that holes are emitted when holes recombine by thermal stimulation.
  • the pocket dosimeter measures the exposure dose of ionizing radiation from the current value that flows when the gas sealed in the ionization chamber ionizes according to the radiation dose.
  • the physical measurement method measures the dose of the irradiated ionizing radiation as a dose absorbed by various measuring devices.
  • the surface of the living body is irradiated. Therefore, the dose of radiation that has reached the inside of the living body cannot be measured. For example, when exposed to 32 P gamma rays, which are less transmissive, the film badge will react, but much of the radiation will be weakened by clothing or other shielding. For this reason, the exposure dose measured by the above physical method does not necessarily accurately reflect the dose actually exposed to the living body.
  • the physical measurement method described above has the power to accurately reflect the influence of radiation having different RBE (Radiation Biological Effectiveness) on the living body.
  • RBE Room Biological Effectiveness
  • neutron IGy and X-ray IGy are known to have a biological effect of neutrons that is twice to ten times that of X-rays.
  • the method only displays the same 1 Gy.
  • the physical method has a concept of “effective dose” for calibrating the difference in radiation quality, and is introduced by law.
  • it is necessary to calculate the exposure dose after specifying the exposed radiation quality and tissue.
  • the exposure dose for each tissue must be calculated using the “tissue weighting factor” for each organ, and the exposure dose must be expressed as the sum of the exposure dose for each tissue. .
  • tissue weighting factor for each organ
  • the exposure dose must be expressed as the sum of the exposure dose for each tissue.
  • the effective dose obtained in this way can accurately indicate the effect on each individual! Met.
  • An ionizing radiation exposure measuring method comprising:
  • a kit for measuring the exposure dose of ionizing radiation, and immunoplot the expression level of at least one of LyGDI protein type 1 and type 3 caspase degradation products contained in tissue from which biological force was collected or blood force was also extracted A kit for measuring an exposure dose of ionizing radiation comprising an antibody for measurement by a method.
  • apoptosis occurs by irradiation with ionizing radiation.
  • This apoptosis involves the action of the tumor suppressor gene product p53, and the induction of apoptosis involves the involvement of a signal system via mitochondria and the activity of the downstream protease caspase group.
  • the associated DNA-degrading enzymes are involved, and apoptosis may cause the cleavage of various molecules in the cell. Is known.
  • a LyGDI protein (a molecule called GDI-D4, RhoGDI2, RhoGDI ⁇ , which is highly expressed in blood cells, Factors that inhibit the process by which GDP is released from G protein and become active) are known.
  • the human LyGDI protein represented by SEQ ID NO: 1 is a type 3 cassette on the C-terminal side of the 19th aspartic acid (18th for the mouse LyGDI protein represented by SEQ ID NO: 2). It is known that there is a site that is cleaved by a space, and there is a site that is cleaved by type 1 caspase at the end of 55th aspartic acid (54th in mouse LyGDI protein).
  • the present inventor has shown that the expression level of LyGDI protein type 1 and type 3 caspase degradation products varies with the dose of ionizing radiation, and the tissue And they found that their expression patterns differ depending on blood, and based on this, the present invention was completed.
  • the influence of the exposed ionizing radiation force on the living body can be directly measured even if the measuring apparatus is not carried in advance.
  • ionizing radiation can be absorbed into the living body even in the event of exposure due to nuclear material production accidents, nuclear power plant accidents, sudden nuclear material leaks such as nuclear weapons. It is possible to grasp the impact on the site more accurately.
  • the exposure dose of ionizing radiation can be measured with higher accuracy than the conventional methods of measuring the number of white blood cells and the deformation force exposure dose. Furthermore, according to the present invention, a minute amount of exposure dose that cannot be grasped by a change in white blood cells can be measured by a blood test.
  • FIG. 1 is a diagram schematically showing the structure of a human LyGDI protein.
  • FIG. 2 is a diagram showing amino acid sequences of human LyGDI protein and mouse LyGDI protein, and cleavage sites by type 1 caspase and type 3 caspase.
  • Fig. 3 shows the results of immunoplotting proteins from which thymus tissue strength of mice was also extracted.
  • FIG. 4 schematically shows changes in the exposure dose of mouse thymus tissue and the expression level of type 1 or type 3 caspase degradation products.
  • FIG. 5 shows the results of immunoplotting proteins from which bone marrow tissue strength of mice was also extracted.
  • FIG. 6 shows the results of immunoplotting proteins extracted from spleen tissue strength of mice.
  • FIG. 7 shows the results of immunoplotting proteins from which intestinal epithelial tissue strength of mice was also extracted.
  • FIG. 8 shows the result of immunoplotting a protein from which blood force of a mouse was also extracted.
  • FIG. 9 shows the result of immunoplotting a protein from which leukocyte strength in human peripheral blood is also extracted.
  • FIG. 10 shows the result of immunoplotting a protein from which leukocyte strength in human peripheral blood was also extracted.
  • the present invention is based on the fact that when a living body is exposed to ionizing radiation, the appearance pattern of degradation products due to type 1 and type 3 caspase of the LyGD I protein changes according to the exposure dose. It is characterized by measuring the dose of ionizing radiation.
  • the method for measuring the exposure dose of ionizing radiation includes (a) extracting a protein from tissue or blood force collected from a living body, and (b) LyG DI protein contained in the extracted protein. Measuring the expression level of at least one of the type 1 and type 3 caspase degradation products. Therefore, details related to the following will be described in detail.
  • the target for measuring the exposed ionizing radiation dose can be measured without limitation as long as it is a tissue and blood that constitutively expresses LyGDI protein.
  • thymus tissue is preferred among thymus tissue, bone marrow tissue, spleen tissue, intestinal epithelial tissue or blood, but blood can be sufficiently measured.
  • the blood contains peripheral blood containing thymic cells (T cells).
  • T cells thymic cells
  • examples of organisms from which these tissues or blood are collected include mammals such as mice, dogs, cats, pigs, and cattle. If blood is a body that can be collected from humans, tissues can be collected. May be collected from humans.
  • Peripheral blood is preferable as the blood used in the method for measuring radiation exposure according to the present invention because peripheral blood can be easily collected.
  • Collection of vital tissue or blood is a normal method, specifically a surgical method using a messenger for tissue, aspiration with a syringe for blood, and precipitation of blood cells with a centrifuge , Can be performed.
  • Protein extraction is also performed by a normal method, specifically by suspending tissue or blood cells in a buffer solution and crushing the tissue or cells with a homogenizer or a French press. If necessary, denaturing agents, antioxidants, etc. may be added to the buffer solution, and nucleic acids such as DNA contained in the cell disruption solution and fats contained in the cell membrane may be removed.
  • any method can be used as long as it can specifically measure the expression level of the protein to be expressed, but the method using antigen-antibody reaction, specifically, the immuno-plot method (Western blot) can be used. Method), ELISA method can be used.
  • an anti-LyGDI antibody against LyGDI protein, an antibody against type 1 or type 3 caspase degradation product, and the like can be used.
  • LyGDI protein and caspase degradation product will be described. An explanation will be given using LyGDI proteins derived from humans and mice as examples. The amino acid sequences of these proteins are represented by FIG.
  • the type 3 caspase cleavage site of LyGDI protein is on the C-terminal side of 19th aspartic acid in humans, and on the C-terminal side of 18th aspartic acid in mice.
  • the type 1 caspase cleavage site of LyGDI protein is located on the C-terminal side of 55th aspartic acid in the case of human, and on the C-terminal side of 54th aspartic acid in the case of mouse. Therefore, the amino acid sequence of the type 3 caspase degradation product of human LyGDI protein is represented by SEQ ID NO: 3, the amino acid sequence of the type 3 caspase degradation product of mouse LyGDI protein is represented by SEQ ID NO: 4, and 1 of human LyGDI protein.
  • the amino acid sequence of the type caspase degradation product is represented by SEQ ID NO: 5
  • the amino acid sequence of the mouse LyGDI protein type 1 caspase degradation product is represented by SEQ ID NO: 6.
  • the type 1 or type 3 caspase degradation product has, for example, one or several amino acids deleted, substituted or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NOs: 3 to 6.
  • a known immunoplot method can be used. Specifically, the protein is extracted using a buffer solution to which a denaturing agent such as sodium dodecyl sulfate (SDS) is added, and then polyatyramide gel electrophoresis is performed. After electrophoresis is complete, transfer the protein on the gel to a PVDF membrane or -trocellulose membrane and visualize it using anti-LyGDI protein antibody, etc. The expression level of is measured.
  • a denaturing agent such as sodium dodecyl sulfate (SDS)
  • SDS sodium dodecyl sulfate
  • a known ELISA method can also be used when measuring the expression level of a type 1 or type 3 caspase degradation product by ELISA. Specifically, an anti-LyGDI protein antibody or the like is bound to a solid phase such as polystyrene, a protein extract is added thereto, and the enzyme-labeled antibody is reacted and visualized, whereby type 1 or Measure the expression level of type 3 caspase degradation product.
  • the expression patterns of type 1 and type 3 caspase degradation products are different, so when exposure to a small amount of ionizing radiation, there are two indicators, namely LyGDI, to accurately measure the exposure dose. It is preferable to measure the expression level of both type 1 caspase degradation products and type 3 caspase degradation products.
  • the expression level of full-length LyGDI U prefer to measure.
  • the full-length LyGDI is, for example, an amino acid sequence having one, several amino acids deleted, substituted or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 2, and Contains proteins that include sites cut by type 1 or type 3 caspase.
  • the dose of ionizing radiation can be measured by the following method. First, the change in the expression level of type 1 or type 3 caspase degradation product with respect to the dose of ionizing radiation as shown in FIG. Create a schematic diagram of Then, the expression level of type 1 or type 3 caspase degradation product contained in tissue or blood collected from the vital force is measured by Western blotting or the like, and the exposure dose of ionizing radiation is measured from the schematic diagram.
  • the expression level of the type 1 or type 3 caspase degradation product in the extracted protein when not exposed to ionizing radiation and after exposure.
  • the amount of type 1 or type 3 caspase degradation product at the time of non-ionizing radiation exposure cannot be measured. It is possible to suspect exposure to ionizing radiation simply by measuring the expression level.
  • the ionizing radiation exposure measurement kit of the present invention includes an antibody for measuring the expression level of at least one of LyGDI protein type 1 and type 3 caspase degradation products by immunoplotting.
  • the antibody is not particularly limited as long as it is used for immunoplot and is an antibody against at least one of type 1 and type 3 caspase degradation products of LyGDI protein.
  • a 7-week-old male mouse (C57BLZ6NCrj (trade name), Charles River Japan) was bred in a normal environment until 8-9 weeks of age, and then an X-ray generator (Shin-ai No. (trade name, manufactured by Shimadzu Corporation) ), 200 kVp, 25 mA), and the whole body was irradiated with X-rays (ionizing radiation) at an irradiation dose rate of 0.6 Gy.
  • the irradiation amount exposure amount was adjusted according to the irradiation time.
  • mice were dissected to collect thymus tissue, and the collected tissue was minced with a scalpel and solubilized in SDS-sample buffer to obtain a solubilized sample.
  • the composition of SDS-sample buffer is 5% glycerol, 25 mM TrisHCl (pH 6.8), 1% SDS.
  • Electrophoresis Prepare a 12% polyacrylamide gel (separation gel), overlay 4% polyacrylamide gel (concentrated gel) on it, and apply the above soluble sample to 20 g per lane. Electrophoresis (electrophoretic conditions are as follows. The electrophoretic current in the concentrated gel was 20 mA, the electrophoretic current in the separation gel was 40 mA, and Tris-glycine buffer was used as the running buffer;)). After the electrophoresis was completed, the concentrated gel was cut off, and the separated gel was equilibrated (twice) for 5 minutes with a transfer buffer.
  • the separation gel was 3 mL of 40% acrylamide stock solution: Lower gel buffer (1.5 M TrisHCl (pH 8.8), 0.4% SDS) 2.5 mL sterilized milli-Q water 4.5 mL, 10 % Ammonium persulfate aqueous solution 50 L, N, N, ⁇ , N, -Tetramethylethylenediamine 10 L was mixed.
  • Lower gel buffer 1.5 M TrisHCl (pH 8.8), 0.4% SDS
  • the concentrated gel is composed of 0.5 mL of 40% acrylamide stock solution, Upper gel buffer.
  • Tris-glycine buffer is 25 mM Tris, 192 mM glycine, 0.1%
  • the composition of the transfer buffer is 25 mM Tris, 192 mM glycine, 10% methanol.
  • the equilibrated gel was transferred to a polyvinylidene difluoride membrane (PVDF: Nippon Aidichi Co., Ltd.) in a transfer buffer by a semi-dry method (100 mA, 3 hours). After the transfer, the PVDF membrane was blocked with PBST containing 5% skim milk for 1 hour.
  • PVDF polyvinylidene difluoride membrane
  • a LyGDI protein C-terminal recognition antibody (manufactured by Santa Cruz, Power Tag No. Sc-604) was bound for 1 hour and washed twice with PBST for 5 minutes.
  • alkaline phosphatase-labeled anti-mouse IgG H + L
  • Fig. 3 The results are shown in Fig. 3.
  • Fig. 3 (a) the type 1 caspase degradation product (17 kDa) disappeared once in the low exposure dose range ( ⁇ 0.1 Gy), but reappeared at 0.5 Gy or more.
  • the type 3 caspase degradation product (21 kDa) was prominently expressed when the whole-body irradiation dose exceeded 5 Gy.
  • Fig. 3 (b) a decrease in the expression of type 1 caspase degradation product (17 kDa) was observed even at a dose as low as 4 mGy.
  • FIG. 4 schematically shows the change in the expression level of the type 1 or type 3 caspase degradation product with respect to the exposure dose. As is clear from this figure, there is a certain relationship between the exposure dose and the expression pattern of type 1 and type 3 caspase degradation products. The amount of ionizing radiation that was exposed to can be estimated.
  • the 21 kDa band on the film is a degradation product of type 3 caspase, indicating that an antibody that recognizes the type 3 caspase cleavage point (an antibody that recognizes the N-terminal side of the long chain after cleavage, KLH Confirmation was performed by immunoplotting the same PVDF membrane using a non-specific antibody: a monoclonal antibody with the amino acid sequence SKLNYKPPPQKC (SEQ ID NO: 7) as an antigen (data not shown). By immunoplotting with LyGDI protein N-terminal recognition antibody (Phamingen, catalog No. 66456E), N-terminal fragments that appear to have been cleaved at each caspase may also appear. Confirmed (data not shown) o Based on these information, it was confirmed that the 17 kDa band caspase degradation product and the 21 kDa band were the type 3 caspase degradation product.
  • Fig. 7 As shown in this figure, intestinal epithelial tissue constantly produced a type 3 caspase degradation product (21 kDa) in a non-irradiated state (OGy). On the other hand, expression of full-length LyGDI protein was not observed above 5 Gy, and type 3 caspase degradation product was not observed above 12 Gy. In addition, type 1 caspase degradation product was almost unexpressed. This is said to be due to the fact that small intestinal epithelial cells fall off due to irradiation.
  • the expression patterns of type 1 and type 3 degradation products change depending on the dose of ionizing radiation in tissues and blood collected from mouse force, and vice versa. For example, it was confirmed that the exposure dose of ionizing radiation could be measured by examining the expression patterns of type 1 and type 3 degradation products.
  • a subject (adult male, 49 years old) performed a normal panoramic shot once on his jaw (radiation dose) using a dental panoramic X-ray apparatus (trade name: auto lOOOOex, manufactured by Asahi Roentgen). : About 20mGy).
  • a lead apron was worn at the time of photography.
  • Blood peripheral blood was collected before X-ray irradiation and 6 hours after irradiation, and after separating leukocytes, it was dissolved in SDS-sample buffer and the amount of protein was quantified.
  • Antibody l sc—6047G (trade name, manufactured by SantaCruz, goat polyclonal antibody with LyGDI C-terminal region as epitope)
  • Antibody 2 66586E (trade name, manufactured by Pharmingen, full-length LyGDI is used as an antigen, and is epitope-mapped, rabbit antibody polyclonal antibody)
  • Antibody 3 71-6300 (Brand name, 2 1! 1 ⁇ 2 (manufactured by Usagi Polyclonal Antibody with Epitope at the center of LyGDI)
  • Antibody 4 97A1015 (trade name, manufactured by Active Motif, mouse monoclonal antibody that recognizes the N-terminus of ⁇ 19—LyGDI)
  • Subject (cancer patient, adult male, 67 years old) was irradiated with ionizing radiation to the abdomen using a linac irradiation device for cancer treatment (trade name: Mevatron 67-6300, manufactured by Siemens) (radiation dose: approx. 2Gy).
  • linac irradiation device for cancer treatment trade name: Mevatron 67-6300, manufactured by Siemens
  • Blood peripheral blood was collected before irradiation and 6 hours after irradiation, and after separating white blood cells, it was dissolved in SDS sample buffer and the amount of protein was quantified.
  • Antibody 1 sc—6047G (trade name, manufactured by SantaCruz)
  • Antibody 2: 66586E (trade name, manufactured by Pharmingen)
  • Antibody 4 97A1015 (trade name, manufactured by Active Motif)
  • the influence of the exposed ionizing radiation force on the living body can be directly measured without carrying a measurement device in advance.
  • ionizing radiation is given to living bodies even in the event of exposure due to nuclear material production accidents, nuclear power plant accidents, sudden nuclear material leaks such as nuclear weapons. The impact can be grasped more accurately.

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Measurement Of Radiation (AREA)

Abstract

　（ａ）生体から採取した組織または血液からタンパク質を抽出し、（ｂ）抽出したタンパク質に含まれるＬｙＧＤＩタンパク質の１型及び３型カスペース分解物の少なくとも一つの発現量を測定する、電離放射線の被曝量測定方法。

Description

明 細 書
電離放射線の被曝量測定方法
技術分野
[0001] 本発明は、生物化学的反応を利用して、生体に対して照射された電離放射線ゃ電 磁波の生物的影響を直接的に知り得るようにした、電離放射線の被曝量測定方法に 関する。
背景技術
[0002] 電離放射線の被曝量を測定には、電離放射線による物理的反応を利用するのが 一般的であり、具体的には、フィルムバッチ、熱ルミネセンス線量計、ポケット線量計 等などが利用されている（日本アイソトープ協会 主任者のための放射線管理の実際 改訂 2版 1992年 pl40)。
[0003] ここで、フィルムバッチとは、写真乳剤を塗布した榭脂フィルムをケースに収容した ものであり、写真乳剤が感光作用とともに被曝した放射線の線量に比例して黒ィ匕作 用を示すことを利用して電離放射線の被曝量を計測する。また、熱ルミネセンス線量 計は、放射線照射された結晶性物質を加熱したときに生ずるルミネセンス (蛍光)を 利用した線量計であって、電子放射線を照射することによって結晶内で分離した電 子ゃ正孔が、熱刺激によって再結合するときに発光する原理を利用して電離放射線 の被曝量を計測する。さらに、ポケット線量計は、電離箱内に封入されたガスが放射 線量に応じて電離し、その際に流れる電流値から、電離放射線の被曝量を計測する
[0004] これら物理的な測定方法は、高い信頼性と安定性を備えており、低コストで誰でも 簡単に扱うことができるものの、次に掲げるような問題点があった。
[0005] まず、上記物理学的な測定方法は、照射された電離放射線の線量を各種測定機 器が吸収した線量として測定する。しかし、この線量と生体の健康に直接影響する生 体の吸収線量とがー致する力否かについては、特に低線量域では、疑問がもたれて いる。
[0006] また、これと関連するが、上記の物理学的な測定方法では、生体の表面に照射さ れた線量のみを測定して 、るので、生体内部に到達した放射線の線量を測定できな い。例えば、透過性の低い32 Pのガンマ線による被曝の場合、フィルムバッジは反応 するものの、照射された放射線の多くは、衣服などの遮蔽物によって弱められてしま う。そのため、上記物理的な方法で測定した被曝線量は、生体が実際に被曝した線 量を必ずしも正確に反映して 、な 、ことになる。
[0007] さらに、上記の物理学的な測定方法は、 RBE (Radiation Biological Effective ness：生物学的効果比）の異なる放射線の生体への影響を正確に反映できな力つた 。例えば、同じ IGyであっても、中性子線の IGyと X線の IGyでは、中性子線の生物 学的な効果は X線の 2倍から 10倍あることが知られている力 上記物理学的な方法 では同じ 1 Gyとしか表示されない。
[0008] もちろん、上記物理学的な方法には、線質の違!、を校正するために「実効線量」と いう概念があり、法律上も導入されている。しかし、「実効線量」に校正するためには、 被曝した線質 ·組織などを特定したうえで被曝線量を計算しなければならな 、。例え ば、一人の人間への影響を調べるためには、臓器別の「組織荷重係数」によって各 組織別の被曝量を求め、各組織の被曝量の総和として被曝線量を表さなければなら ない。しかし、組織ごとの重量や「組織荷重係数」には微妙な個体差があるため、この ようにして求めた実効線量が各個人に対しての影響を正確に示す力どうかにつ!、て 疑問であった。
[0009] カロえて、上記物理学的な測定方法の場合、あら力じめフィルムバッジなどの測定装 置を準備していなければ測定できない。そのため、例えば、原発事故のように、一般 人が突発的に被曝した場合の線量は直接的に測定できず、間接的に推計せざるを 得なかった。
[0010] このように、上記物理的な測定方法にお!、ては、被曝した電離放射線が生体に与 える影響については計算により間接的かつ不確実に推計するしかなぐ被曝する可 能性がある場合には、フィルムノッジなどの測定装置を予め準備しておかなければ ならなかった。
本発明の上記及び他の特徴及び利点は、添付の図面とともに考慮することにより、 下記の記載力 より明らかになるであろう。 発明の開示
[0011] 本発明によれば、以下の手段が提供される：
(1) (a)生体力も採取した組織または血液力もタンパク質を抽出し、（b)抽出したタン パク質に含まれる LyGDIタンパク質の 1型及び 3型カスペース分解物の少なくとも一 つの発現量を測定する、
ことを含んでなる電離放射線の被曝量測定方法、
(2) LyGDIタンパク質の 1型カスペース分解物及び 3型カスペース分解物の発現量 を測定することを特徴とする上記（1)項に記載の電離放射線の被曝量測定方法、
(3) LyGDIタンパク質の 1型及び 3型カスペース分解物の発現量を免疫プロット法に よって測定することを特徴とする上記（1)又は（2)項に記載の電離放射線の被曝量 測定方法、
(4)タンパク質を、採取した胸腺組織、骨髄組織、脾臓組織、腸管上皮組織および 血液の 、ずれかから抽出することを特徴とする上記（1)から（3)項の何れかに記載の 電離放射線の被曝量測定方法、
(5)タンパク質を、採取した胸腺組織から抽出することを特徴とする上記（1)から (3) 項の何れかに記載の電離放射線の被曝量測定方法、
(6)タンパク質を、採取した血液力も抽出することを特徴とする上記（1)力も (3)項の 何れかに記載の電離放射線の被曝量測定方法、及び
(7)電離放射線の被曝量測定用キットであって、生体力 採取した組織または血液 力も抽出したタンパク質に含まれる LyGDIタンパク質の 1型及び 3型カスペース分解 物の少なくとも一つの発現量を免疫プロット法により測定するための抗体を含んでな る電離放射線の被曝量測定用キット。
[0012] 電離放射線が生体に与える影響の一つとしてはアポトーシスが挙げられ、胸腺組 織等においても、電離放射線の照射によりアポトーシスが生じることが古くから観察さ れている。このアポトーシスには、がん抑制遺伝子産物 p53の働きが関与しており、 アポトーシスの誘導には、ミトコンドリアを介するシグナル系の関与と、その下流因子 であるタンパク質分解酵素カスペース群の活性ィ匕と、それに伴う DNA分解酵素が関 係しており、アポトーシスによって細胞内の種々の分子の分断ィ匕ゃ活性ィ匕が起こるこ とが知られている。
[0013] ところで、上記タンパク質分解酵素カスペース群によって分断されるタンパク質の一 つとして、血液系細胞で高発現している LyGDIタンパク質（GDI— D4、 RhoGDI2、 RhoGDI βとも呼ばれる分子で、 Rhoファミリーの Gタンパク質から GDPが遊離され て活性型になる過程を抑制している因子）が知られている。配列番号 1で表されるヒト LyGDIタンパク質は、図 1及び図 2に示すように、 19番目ァスパラギン酸 (配列番号 2で表されるマウス LyGDIタンパク質では 18番目。）の C末端側に 3型カスペースに より切断される部位があり、 55番目ァスパラギン酸 (マウス LyGDIタンパク質では 54 番目。）のじ末端側に 1型カスペースにより切断される部位があることが知られている。
[0014] 本発明者は、 LyGDIタンパク質と電離放射線との関係を鋭意研究した結果、電離 放射線の照射により 1型及び 3型カスペースが活性ィ匕することを見い出して 、る (Rad iation Research, 162, pp. 287— 295, 2004 ; Molecular Carcinoge nesis, 39, pp. 206— 220, 2004、等参照）。
本発明者は上記研究に基づきさらに研究を進めた結果、電離放射線の照射量によ つて LyGDIタンパク質の 1型及び 3型カスペース分解物の発現量が特有の変化を示 すこと、また、組織及び血液によってそれらの発現パターンが異なることを見出し、こ れに基づき本発明を完成させるに至った。
[0015] 本発明によれば、生体力 採取したタンパク質の構造の変化力 放射線の被曝線 量を測定することができる。
具体的には、本発明にかかる電離放射線の被曝量測定方法によって、予め測定装 置を携帯していなくても、被曝した電離放射線力も生体が受ける影響を直接的に測 定できる。また、被曝時にフィルムバッジなどを装着していなくともよいので、万一、核 燃料製造事故、原子力発電所事故、核兵器などの突発的な核物質漏洩による被曝 にあった場合でも電離放射線が生体に与える影響を、より正確に把握できる。
また、本発明によれば、白血球の数や変形力 被曝線量を測定するこれまでの方 法に比べ、精度よく電離放射線の被曝量を測定することができる。さらに、本発明に よれば、血液検査により、白血球の変化では把握できな力つた微量の被曝線量も測 定することができる。 図面の簡単な説明
[0016] [図 1]図 1は、ヒト LyGDIタンパク質の構造を模式的に示す図である。
[図 2]図 2は、ヒト LyGDIタンパク質及びマウス LyGDIタンパク質のアミノ酸配列と、 1 型カスペース及び 3型カスペースによる切断部位を示す図である。
[図 3]図 3は、マウスの胸腺組織力も抽出したタンパク質を免疫プロットした結果を示 す。
[図 4]図 4は、マウスの胸腺組織の被曝線量と 1型又は 3型カスペース分解物の発現 量変化を模式的に示す。
[図 5]図 5は、マウスの骨髄組織力も抽出したタンパク質を免疫プロットした結果を示 す。
[図 6]図 6は、マウスの脾臓組織力ゝら抽出したタンパク質を免疫プロットした結果を示 す。
[図 7]図 7は、マウスの腸管上皮組織力も抽出したタンパク質を免疫プロットした結果 を示す。
[図 8]図 8は、マウスの血液力も抽出したタンパク質を免疫プロットした結果を示す。
[図 9]図 9は、ヒト末梢血中の白血球力も抽出したタンパク質を免疫プロットした結果を 示す。
[図 10]図 10は、ヒト末梢血中の白血球力も抽出したタンパク質を免疫プロットした結 果を示す。
発明を実施するための最良の形態
[0017] 本発明は、生体が電離放射線に被曝した場合、その被曝線量に応じて前記 LyGD Iタンパク質の 1型及び 3型カスペースによる分解物の出現パターンが変化することに 基づき、生体が被曝した電離放射線の線量を測定することを特徴とする。
[0018] 具体的には、本発明に係る電離放射線の被曝量測定方法は、（a)生体から採取し た組織または血液力もタンパク質を抽出し、（b)抽出したタンパク質に含まれる LyG DIタンパク質の 1型及び 3型カスペース分解物の少なくとも一つの発現量を測定する 、ことを含んでいる。そこで、以下に関連する事項について詳説する。
[0019] (測定対象）
この電離放射線の被曝量測定方法により、被曝した電離放射線量を測定する対象 としては、 LyGDIタンパク質を構成的に発現して ヽる組織及び血液であれば特に限 定することなく測定できるが、カスペース分解反応の起こり易さを考慮すれば、胸腺 組織、骨髄組織、脾臓組織、腸管上皮組織又は血液が好ましぐなかでも胸腺組織 が好ましいが、血液でも十分に測定することができる。なお、上記血液は、胸腺系細 胞 (T細胞）を含有する末梢血を含んでいる。また、これらの組織または血液を採取す る生体としては、マウス、犬、猫、豚、牛などの哺乳動物が挙げられるが、血液であれ ばヒトから採取してもよぐ遺体であれば組織をヒトから採取してもよい。血液のうち、 末梢血は採取が容易であるため、本発明の放射線被曝量の測定方法に用いられる 血液としては、末梢血が好ましい。
[0020] (組織または血液の採取及びタンパク質の抽出）
生体力 の組織または血液の採取は、通常の方法、具体的には、組織であればメ スなどを使用する外科的な方法、血液であれば注射器による吸引及び遠心分離機 による血球細胞の沈殿、により行うことができる。また、タンパク質の抽出も通常の方 法、具体的には緩衝液に組織または血球細胞を懸濁し、ホモジナイザーやフレンチ プレスなどにより組織または細胞を破砕することにより行う。なお、必要に応じて、緩 衝液に変性剤ゃ抗酸化剤などを加えてもよぐ細胞破砕液に含まれる DNA等の核 酸や細胞膜などに含まれる脂肪を除去してもよ ヽ。
[0021] (測定方法）
1型又は 3型カスペース分解物（本明細書において、それぞれ、 Δ 55— LyGDI、 Δ 19— LyGDIとも 、う）の発現量（出現量とも!、う）を測定するため方法としては、あ るタンパク質の発現量を特異的に測定できる方法であれば特に限定することなく使 用することができるが、なかでも抗原抗体反応を利用する方法、具体的には免疫プロ ット法（ウェスタンブロット法）、 ELISA法が使用できる。なお、抗体としては、 LyGDI タンパク質に対する抗 LyGDI抗体、 1型又は 3型カスペース分解物に対する抗体な どを使用することができる。
[0022] ここで、 LyGDIタンパク質およびカスペース分解物について説明する。 ヒト及びマウス由来の LyGDIタンパク質を例として説明する。これらタンパク質のァ ミノ酸配列は図 2、配列番号 1及び 2によって表される。
LyGDIタンパク質の 3型カスペース切断部位は、ヒトの場合 19番目のァスパラギン 酸の C末端側にあり、マウスの場合 18番目のァスパラギン酸の C末端側にある。また 、 LyGDIタンパク質の 1型カスペース切断部位は、ヒトの場合 55番目のァスパラギン 酸の C末端側にあり、マウスの場合 54番目のァスパラギン酸の C末端側にある。 従って、ヒト LyGDIタンパク質の 3型カスペース分解物のアミノ酸配列は配列番号 3 で表され、マウス LyGDIタンパク質の 3型カスペース分解物のアミノ酸配列は配列番 号 4で表され、ヒト LyGDIタンパク質の 1型カスペース分解物のアミノ酸配列は配列 番号 5で表され、マウス LyGDIタンパク質の 1型カスペース分解物のアミノ酸配列は 配列番号 6で表される。
なお、本明細書において、 1型または 3型カスペース分解物は、例えば、配列番号 3〜6で表されるアミノ酸配列において、 1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しく は付加されたアミノ酸配列力もなり、かつ、 1型または 3型カスペースにより切断された タンパク質を含む。
[0023] 免疫プロット法により 1型又は 3型カスペース分解物の発現量を測定する場合は、 公知の免疫プロット法を使用することができる。具体的には、ドデシル硫酸ナトリウム（ SDS)等の変性剤を加えた緩衝液を使用してタンパク質を抽出したのち、ポリアタリ ルアミドゲル電気泳動を行う。電気泳動が完了したのち、ゲル上のタンパク質を PVD F膜や-トロセルロース膜等に転写し、抗 LyGDIタンパク質抗体等を使用して可視 ィ匕することによって、 1型又は 3型カスペース分解物の発現量を測定する。
[0024] また、 ELISA法により 1型又は 3型カスペース分解物の発現量を測定する場合にも 、公知の ELISA法を使用することができる。具体的には、ポリスチレンなどの固相に 抗 LyGDIタンパク質抗体等を結合させ、そこにタンパク質抽出液を添加し、酵素標 識抗体を反応させて可視化することにより、固相に結合した 1型又は 3型カスペース 分解物の発現量を測定する。
[0025] なお、電離放射線被曝時の線量に依存する生体反応は、 LyGDIタンパク質の分 断ィ匕の観点から、二相性に分類される。 ひとつは、 lGy以上の線量域で観察される、 3型カスペースの活性ィ匕を伴い Δ 19 —LyGDIの出現してくるアポトーシス誘導シグナルが細胞内でオンになる相である。 他方は、それ以下の線量域で、アポトーシス誘導シグナルはオンになっていることが 検出できません力 替わりに、 Δ 55— LyGDIの出現が消失する相である。
以上のように、 1型及び 3型カスペース分解物の発現パターンはそれぞれ異なるの で、微量の電離放射線を被曝した場合、その被曝量を正確に測定するためには、ふ たつの指標、すなわち LyGDIタンパク質の 1型カスペース分解物及び 3型カスペ一 ス分解物の両方の発現量を測定することが好まし 、。
[0026] 実施例 1 4及び 1 5に示すように、組織及び血液によっては、 1型および 3型カス ペース分解物のいずれかが全く発現しない場合がある。また、実施例 1—4で示すよ うに、電離放射線の被曝量の上昇に伴い、抽出したタンパク質中の Δ 19— LyGDI の発現量が上昇することはなぐ全長 LyGDI及び Δ 19— LyGDIの発現量の減少が 観察される場合がある。
従って、より正確に電離放射線の被曝量を測定するために、場合によっては、抽出 したタンパク質中の 1型または 3型カスペース分解物の発現量の測定の他に、全長 L yGDIの発現量を測定することが好ま U、。
なお、本明細書において、全長 LyGDIは、例えば、配列番号 1または 2で表される アミノ酸配列において、 1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたァ ミノ酸配列力 なり、かつ、 1型または 3型カスペースにより切断される部位を含むタン パク質を含む。
[0027] 本発明において、電離放射線の被曝量の測定は以下の方法により行うことができる まず、図 4のような電離放射線の被曝量に対する 1型または 3型カスペース分解物 の発現量の変化の模式図を作成する。そして、生体力 採取した組織または血液に 含まれる 1型または 3型カスペース分解物の発現量をウェスタン ·ブロット法などにより 測定し、模式図から電離放射線の被曝量を測定する。
また、本発明の好ましい態様として、電離放射線の被曝量を測定使用とするサンプ ルが大量にある場合、一次スクリーニングを ELISA法により行い、電離放射線の被 曝が疑われるサンプルについてはウェスタン 'ブロット法により 1型または 3型カスペ ース分解物の発現量を測定し、電離放射線の被曝量を測定する方法がある。
本発明においては、電離放射線非被曝時と被曝後の抽出タンパク質中の 1型また は 3型カスペース分解物の発現量を測定することが好ましい。しかし、電離放射線非 被曝時の 1型または 3型カスペース分解物の発現量を測定することができな 、場合で あっても、分解物の発現量の変動が大きければ、電離放射線の被曝後の発現量を 測定するだけで、電離放射線の被曝を疑うことができる。
[0028] 本発明の電離放射線の被曝量測定用キットには、 LyGDIタンパク質の 1型及び 3 型カスペース分解物の少なくとも一つの発現量を免疫プロット法により測定するため の抗体を含む。該抗体は、免疫プロット法に用いられ、かつ LyGDIタンパク質の 1型 及び 3型カスペース分解物の少なくとも一つに対する抗体であれば、特に限定はされ ない。
[0029] 以下、本発明を実施例に基いてさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定 されるものではない。
実施例
[0030] 実施例 1 マウス個体レベルでの試験
実施例 1—1
(X線全身照射）
7週齢のォスのマウス（C57BLZ6NCrj (商品名）、日本チャールズリバ一）を 8〜9 週齢まで通常の環境で飼育したのち、 X線発生装置（島津製作所製 Shin— ai号（ 商品名）、 200kVp、 25mA)により、 X線 (電離放射線)を照射線量率 0. 6Gyで全身 に照射した。なお、照射量 (被曝量)は照射時間によって調節した。
[0031] (組織の採取と胸腺タンパク質の抽出）
放射線照射後、マウスを解剖して胸腺組織を採取し、採取した組織をメスでミンチ にし、 SDS- sample bufferに可溶化して可溶化サンプルとした。なお、 SDS— sa mple bufferの組成は、 5% glycerol, 25mM TrisHCl(pH6. 8)、 1% SDS である。
[0032] (電気泳動） 12%のポリアクリルアミドゲル (分離ゲル）を作製し、そこに 4%のポリアクリルアミド ゲル (濃縮ゲル)を重層し、上記の可溶ィ匕サンプルを 1レーンあたり 20 gとなるように アプライして電気泳動 (泳動条件は以下のとおりである。濃縮ゲルにおける泳動電流 は 20mA、分離ゲルにおける泳動電流は 40mAであり、 running bufferには Tris- glycine bufferを使用した。；)）を行った。電気泳動終了後、濃縮ゲルを切り離し、 分離ゲルを transfer bufferにより 5分間平衡ィ匕（2回）した。
[0033] なお、分離ゲルは、 40% アクリルアミドストック溶液 3mL、： Lower gel buffer ( 1. 5M TrisHCl(pH8. 8)、 0. 4% SDS) 2. 5mレ滅菌ミリ Q水 4. 5mL、 10% 過硫酸アンモ-ゥム水溶液 50 L、 N, N, Ν，， N， -テトラメチルエチレンジァミン 10 Lを混合して作製した。
[0034] また、濃縮ゲルは、 40%アクリルアミドストック溶液 0. 5mL、 Upper gel buffer
(0. 5M TrisHCl(pH6. 8)、 0. 4%SDS) 1. 25mL、滅菌ミリ Q水 3. 25mL、 10 % 過硫酸アンモ-ゥム水溶液 30 L、N, N, N，， N，-テトラメチルエチレンジアミ ン 8 Lを混合して作製した。
[0035] さらに、 Tris- glycine bufferの組成は 25mM Tris、 192mM グリシン、 0. 1%
SDSであり、 transfer bufferの組成は 25mM Tris, 192mM グリシン、 10% メタノールである。
[0036] (免疫ブロッテイング）
平衡化したゲルをセミドライ法により transfer buffer中でポリビ-リデンジフルオラ イド膜 (PVDF:日本エイド一 (株)製）に転写した（100mA、 3時間)。転写終了後、 P VDF膜を 5%スキムミルク含有 PBSTで 1時間ブロッキングした。
[0037] ブロッキング終了後、 LyGDIタンパク質の C末端認識抗体（Santa Cruz社製、力 タログ No. Sc— 604)を 1時間結合させ、 PBSTを用いて 5分間、 2回洗浄した。次い でアルカリフォスファターゼ標識抗マウス IgG (H+L) (プロメガ (株)製)を 1時間結合 させ、 PBSTを用いて 5分間、 3回洗浄した。 0. 1M Tris (pH9. 5)水溶液を用いて 5分間リンスしたのち、 CDP- Star (登録商標） Western Blot Chemiluminescen ce Reagent (NEN Life Science Products, Inc.製）を用いて 5分間室温で インキュベートした。インキュベート後、フィルム（アマシャム バイオサイエンス (株）製 )に露光した。
[0038] (結果）
その結果を図 3に示す。図 3 (a)に示すように、 1型カスペース分解物（17kDa)は 低い被曝線量域 (〜0. lGy)で一度消失するが、 0. 5Gy以上で再度発現すること が分力つた。また、 3型カスペース分解物（21kDa)は、全身照射量が 5Gy以上にな ると顕著に発現すること分力つた。さらに、図 3 (b)に示すように、 4mGyという低い線 量の照射によっても、 1型カスペース分解物（17kDa)の発現の減少が観察された。
[0039] そこで上記の結果から、被曝線量に対する 1型又は 3型カスペース分解物の発現 量の変化を図 4に模式的に示す。この図から明らかなように、被曝線量と 1型及び 3 型カスペース分解物の発現パターンの間には一定の関係があり、これらカスペース 分解物の発現量をそれぞれ定量することによって、その個体が被曝した電離放射線 量を推計することができる。
[0040] なお、フィルム上の 21kDaのバンドが 3型カスペース分解物であることは、 3型カス ペース切断点を認識する抗体 (切断後の長鎖の N末端側を認識する抗体、 KLHコ ンジユゲーシヨン：アミノ酸配列 SKLNYKPPPQKC (配列番号 7)のオリゴペプチド を抗原とするモノクローナル抗体）により、同じ PVDF膜を免疫プロットすることによつ て確認した（データは示さない。 ) oまた、同じ PVDF膜を LyGDIタンパク質の N末認 識抗体（Phamingen社製、カタログ No. 66456E)によって免疫プロットすることによ り、それぞれのカスペースで切断されてできたと思われる N末端側断片が出現してい ることも確認した (データは示さない。 ) oそして、これらの情報により、 17kDaのバンド 力 型カスペース分解物、 21kDaのバンドが 3型カスペース分解物であることを確認 した。
[0041] 実施例 1 2
(骨髄組織による測定）
骨髄組織を使用して実施例 1 1と同様の手順により、 1型及び 3型スペース分解 物の発現量を調べた。その結果を図 5に示す。この図に示すように、骨髄組織では極 少量の 1型カスペース分解物（17kDa)が非照射時に恒常的に発現していた力 1G y以上の線量域で消失した。また、 0. 5Gy以上の線量域で、全長 LyGDIタンパク質 の量が減少傾向にあり、それと反比例して 13kDa付近に LyGDIタンパク質の C末端 認識マウス抗体と特異的に反応するタンパク質の増加が観察された。
[0042] 実施例 1 3
(脾臓組織による測定）
脾臓組織を使用して実施例 1—1と同様の手順により、 1型及び 3型スペース分解 物の発現量を調べた。その結果を図 6に示す。この図に示すように、脾臓組織では、 恒常的に 1型カスペース分解物（17kDa)が観察された。また、極少量の 3型カスペ ース分解物（21kDa)の生成が lGy以上の線量域で観察された。
[0043] 実施例 1 4
(腸管上皮組織による測定）
腸管上皮組織を使用して実施例 1—1と同様の手順により、 1型及び 3型スペース 分解物の発現量を調べた。その結果を図 7に示す。この図に示すように、腸管上皮 組織では、非照射の状態 (OGy)で恒常的に 3型カスペース分解物（21kDa)が産生 されていた。一方、 5Gy以上で、全長 LyGDIタンパク質の発現が観察されなくなり、 12Gy以上で 3型カスペース分解物も観察されなくなった。また、 1型カスペース分解 物はほとんど発現していな力つた。これは、放射線照射により、小腸上皮細胞が脱落 すること〖こよると居、われる。
[0044] 実施例 1—5
(血液による測定）
血液を使用して実施例 1 1とほぼ同様の手順により、 1型及び 3型カスペース分解 物の発現量を調べた。その結果を図 8に示す。この図に示すように、 12Gy以上の高 被曝線量域で 1型カスペース分解物（17kDa)が観察された。また、 3型カスペース 分解物はほとんど発現していな力つた。
[0045] 実施例1 1〜1 5の結果から、マウス力 採取した組織及び血液において、電離 放射線の被曝量により 1型及び 3型分解物の発現パターンが変化して ヽること、逆に いえば、 1型及び 3型分解物の発現パターンを調べることによって、電離放射線の被 曝量を測定できることが確認できた。
[0046] 実施例 2 ヒトのレベルでの試験 実施例 2—1
(電離放射線の照射）
被験者 (成人男子、 49歳）に対して、歯科用パノラマ X線撮影装置 (商品名： auto lOOOex、朝日レントゲン社製)を用いて、通常パノラマ撮影を顎部に 1回行った (放 射線量:約 20mGy)。なお、撮影時には、鉛エプロンを着用した。
[0047] (血液採取とサンプルの調製）
X線照射前と照射後 6時間後に血液 (末梢血)を採取し、白血球を分離後、 SDS- sample bufferで溶解しタンパク質量を定量した。
[0048] (電気泳動とウェスタン ·プロット）
SDS- PAGEによりタンパク質を分離後、次の 4種類の抗体を用 、てウェスタン · ブロットを行った。
抗体 l : sc— 6047G (商品名、 SantaCruz社製、 LyGDIの C末領域をェピトープと する山羊ポリクロナル抗体）
抗体 2 : 66586E (商品名、 Pharmingen社製、全長 LyGDIを抗原として作成され、 ェピトープマッピングされて ヽな 、ゥサギポリクロナル抗体）
抗体3 : 71—6300 (商品名、2 1!½(1社製、 LyGDIの中央部分をェピトープとするゥ サギポリクロナル抗体）
抗体 4 : 97A1015 (商品名、 Active Motif社製、 Δ 19—LyGDIの N末端を認識 するマウスモノクロナル抗体）
[0049] (結果）
その結果を図 9に示す。図 9 (a)、（b)および（c)に示すように、 Δ 55— LyGDIの発 現量は、非照射時と比較して、照射後に減少した。これに対し、図 9 (d)に示すように 、 Δ 19— LyGDIの発現量は非照射時と照射後で変化はな力つた。
[0050] 実施例 2— 2
(電離放射線の照射）
被験者 (担癌患者、成人男子、 67歳）に対して、癌治療用リニアック照射装置 (商品 名：メバトロン 67— 6300、シーメンス社製)を用いて腹部に電離放射線を照射した（ 放射線量:約 2Gy)。 [0051] (血液採取とサンプルの調製）
放射線照射前と照射後 6時間後に血液 (末梢血)を採取し、白血球を分離後、 SDS sample bufferで溶解しタンパク質量を定量した。
[0052] (電気泳動とウェスタン ·プロット）
SDS- PAGEによりタンパク質を分離後、次の 3種類の抗体を用 、てウェスタン · ブロットを行った。
抗体 1： sc— 6047G (商品名、 SantaCruz社製）
抗体 2： 66586E (商品名、 Pharmingen社製）
抗体 4： 97A1015 (商品名、 Active Motif社製）
[0053] (結果）
その結果を図 10に示す。図 10 (a)、（b)および（c)に示すように、 A 55-LyGDI 及び Δ 19— LyGDIの発現量はともに、非照射時と比較して、照射後に増加した。
[0054] 以上の結果から、 X線パノラマ撮影時のような低い線量域の放射線を照射した場合 、 Δ 55— LyGDIの発現量の減少が電離放射線の照射後 6時間後に観察された。ま た、マウスの場合とは異なり、ヒトでは Δ 19— LyGDIは恒常的に末梢血中の白血球 で発現していた力 X線パノラマ撮影によりその発現量が変化することはな力つた。 一方、癌治療放射線照射のような比較的高い線量域の放射線を照射した場合、照 射から 6時間後、 Δ 55— LyGDIの発現量の増加と共に、 Δ 19— LyGDIの発現量も 増加していた。
これらの結果から、マウスの場合と同様に、ヒトにおいても、 A 55—LyGDI、 Δ 19 — LyGDI等の変様 LyGDIの発現量の変動力 電離放射線によって被曝したこと、 及び被曝量を調べる生体マーカーとなることを示している。
産業上の利用の可能性
[0055] 本発明に力かる電離放射線の被曝量測定方法によって、予め測定装置を携帯して いなくても、被曝した電離放射線力も生体が受ける影響を直接的に測定できる。また 、被曝時にフィルムバッジなどを装着していなくともよいので、万一、核燃料製造事故 、原子力発電所事故、核兵器などの突発的な核物質漏洩による被曝にあった場合 でも電離放射線が生体に与える影響を、より正確に把握できる。 本発明をその実施態様とともに説明したが、我々は特に指定しない限り我々の発明 を説明のどの細部においても限定しょうとするものではなぐ添付の請求の範囲に示 した発明の精神と範囲に反することなく幅広く解釈されるべきであると考える。

Claims

請求の範囲
[1] (a)生体力 採取した組織または血液力 タンパク質を抽出し、
(b)抽出したタンパク質に含まれる LyGDIタンパク質の 1型及び 3型カスペース分解 物の少なくとも一つの発現量を測定する、
ことを含んでなる電離放射線の被曝量測定方法。
[2] LyGDIタンパク質の 1型カスペース分解物及び 3型カスペース分解物の発現量を 測定することを特徴とする請求項 1に記載の電離放射線の被曝量測定方法。
[3] LyGDIタンパク質の 1型及び 3型カスペース分解物の発現量を免疫プロット法によ つて測定することを特徴とする請求項 1又は 2に記載の電離放射線の被曝量測定方 法。
[4] タンパク質を、採取した胸腺組織、骨髄組織、脾臓組織、腸管上皮組織および血 液のいずれかから抽出することを特徴とする請求項 1から請求項 3の何れかに記載の 電離放射線の被曝量測定方法。
[5] タンパク質を、採取した胸腺組織から抽出することを特徴とする請求項 1から請求項
3の何れかに記載の電離放射線の被曝量測定方法。
[6] タンパク質を、採取した血液から抽出することを特徴とする請求項 1から請求項 3の 何れかに記載の電離放射線の被曝量測定方法。
[7] 電離放射線の被曝量測定用キットであって、生体力 採取した組織または血液から 抽出したタンパク質に含まれる LyGDIタンパク質の 1型及び 3型カスペース分解物の 少なくとも一つの発現量を免疫プロット法により測定するための抗体を含んでなる電 離放射線の被曝量測定用キット。
PCT/JP2006/303415 2005-02-25 2006-02-24 電離放射線の被曝量測定方法 WO2006090836A1 (ja)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US11/884,945 US20080283763A1 (en) 2005-02-25 2006-02-24 Method of Measuring Exposed Dose of Ionizing Radiation
AU2006216188A AU2006216188A1 (en) 2005-02-25 2006-02-24 Method of measuring exposure dosage of ionizing radiation
EP06714554A EP1857819A4 (en) 2005-02-25 2006-02-24 METHOD OF MEASURING CONTACT DOSE IONIZING RADIATION

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2005-050497 2005-02-25
JP2005050497 2005-02-25

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2006090836A1 true WO2006090836A1 (ja) 2006-08-31

Family

ID=36927469

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2006/303415 WO2006090836A1 (ja) 2005-02-25 2006-02-24 電離放射線の被曝量測定方法

Country Status (6)

Country Link
US (1) US20080283763A1 (ja)
EP (1) EP1857819A4 (ja)
CN (1) CN101184998A (ja)
AU (1) AU2006216188A1 (ja)
RU (1) RU2007135360A (ja)
WO (1) WO2006090836A1 (ja)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105807061A (zh) * 2014-12-29 2016-07-27 中国辐射防护研究院 电离辐射生物标记的筛选方法及由此确定的b8x1j0、upf1蛋白的用途

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101661017B (zh) * 2009-09-22 2011-02-16 湖南科技大学 一种用于铀污染检测的美洲商陆铀诱导下差异表达的标准蛋白斑点质谱图的获取方法及运用
CN101975964A (zh) * 2010-08-23 2011-02-16 苏州大学 高迁移率族蛋白b1作为电离辐射生物剂量计的应用
CN107090496A (zh) * 2017-03-28 2017-08-25 南方医科大学 一种8Gy电离辐射的检测方法
CN117130035A (zh) * 2017-08-18 2023-11-28 南京中硼联康医疗科技有限公司 生物剂量计及具有其的中子捕获治疗系统

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
FUKUDA E. ET AL.: "Jurkat Saibo o Mochiita Hoshasen Otosei Tanpakushitsu no Morateki Kaiseki (Proteome analysis of cellular responses to radiation in Jurkat cells)", NAGASAKI MEDICINAL JOURNAL, TOKUSHUGO, vol. 79, 2004, pages 263 - 266, XP003000016 *
See also references of EP1857819A4 *
XINWENG ZHOU: "Nuclear Translocation of Cleaved LyGDI Dissociated from Rho and Rac during Trp53-Depencent Ionizing Radiation-Induced Apoptosis of Thymus Cells In Vitro", RADIATION RESEARCH, vol. 162, September 2004 (2004-09-01), pages 287 - 295, XP003000015 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105807061A (zh) * 2014-12-29 2016-07-27 中国辐射防护研究院 电离辐射生物标记的筛选方法及由此确定的b8x1j0、upf1蛋白的用途
CN105807061B (zh) * 2014-12-29 2018-08-21 中国辐射防护研究院 电离辐射生物标记的筛选方法及由此确定的b8x1j0、upf1蛋白的用途

Also Published As

Publication number Publication date
EP1857819A1 (en) 2007-11-21
EP1857819A4 (en) 2008-07-23
RU2007135360A (ru) 2009-03-27
AU2006216188A1 (en) 2006-08-31
CN101184998A (zh) 2008-05-21
US20080283763A1 (en) 2008-11-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE60028040T2 (de) Annexin-proteine und auto-antikörper als serummarker für lungenkrebs und ösophaguskrebs
RU2161042C2 (ru) Обнаружение и лечение рака
WO2003089904A2 (en) Aib1 as a prognostic marker and predictor of resistance to encocrine therapy
JPH05509308A (ja) がん関連ｓｃｍ認織因子、その生成法および使用法
WO2006090836A1 (ja) 電離放射線の被曝量測定方法
JP2023529026A (ja) Ｍｈｃ－ｉ発現を調節するための方法及びその免疫療法の使用
KR20120057562A (ko) 피브린 및 피브리노겐 분해 생성물의 검출 및 관련된 제조 방법 및 암의 검출 및 모니터링을 위한 용도
CN103648585A (zh) 基于多肽辐射毒性血清标记的处置规划
KR20120049758A (ko) Ｃｌｉｃ１을 측정하는 제제를 포함하는 방사선 저항성 또는 민감성 진단용 조성물 및 이의 용도
ES2534330T3 (es) Método de análisis biológico para anticuerpo contra el receptor de la hormona estimuladora tiroidea, kit de medición para el anticuerpo, y célula modificada genéticamente novedosa para su uso en el método de análisis biológico o en el kit de medición
Huang et al. Serum amyloid A1 as a biomarker for radiation dose estimation and lethality prediction in irradiated mouse
JP4853866B2 (ja) 電離放射線の被曝量測定方法
Bensimon Etzol et al. DosiKit, a new immunoassay for fast radiation biodosimetry of hair and blood samples
CN115028713A (zh) 一种抗冠状病毒n蛋白的抗体及其应用
CN1215406A (zh) 检测程序性细胞凋亡抗原的单克隆抗体
CN110890133B (zh) 急性反应期蛋白saa1在构建电离辐射后致死性预测模型或制备试剂盒、试剂的应用方法
KR101270761B1 (ko) 방사선 피폭 진단용 마커 트랜스알돌라아제, 그 마커의 발현수준을 측정하는 방사선 피폭 진단용 조성물, 그 조성물을 포함하는 방사선 피폭 진단용 키트, 및 그 마커를 이용한 방사선 피폭을 진단하는 방법
RU2408284C2 (ru) Способ прогнозирования исходов предоперационной лучевой терапии плоскоклеточных карцином головы и шеи
KR101776922B1 (ko) 저선량 방사선 노출에 대한 특이 반응 지표로서 다클론 Ikaros (serine 391/393) 인산화 항체 개발 및 이의 용도
RU2548783C1 (ru) Способ дооперационного определения объема хирургического лечения высокодифференцированного рака щитовидной железы
KR101232228B1 (ko) 방사선 피폭 진단용 마커 포스포글리세레이트 키나제, 그 마커의 발현수준을 측정하는 방사선 피폭 진단용 조성물, 그 조성물을 포함하는 방사선 피폭 진단용 키트, 및 그 마커를 이용한 방사선 피폭을 진단하는 방법
Ahn et al. Development of LGI1 antibody encephalitis after treatment of lung cancer
JP7227589B2 (ja) 疾患の発症に関する診断のための情報を提供する方法
US20230016321A1 (en) Uses and applications in cancer and other proliferative condi-tions of oncoprotein csp80 and agents interacting with oncoprotein csp80
CN107515305A (zh) 宫颈癌标志物ebp50及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 200680013920.0

Country of ref document: CN

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2006216188

Country of ref document: AU

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2006714554

Country of ref document: EP

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2006216188

Country of ref document: AU

Date of ref document: 20060224

Kind code of ref document: A

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 2006216188

Country of ref document: AU

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2007135360

Country of ref document: RU

Ref document number: 4259/CHENP/2007

Country of ref document: IN

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 11884945

Country of ref document: US

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 2006714554

Country of ref document: EP