KR101776922B1

KR101776922B1 - 저선량 방사선 노출에 대한 특이 반응 지표로서 다클론 Ikaros (serine 391/393) 인산화 항체 개발 및 이의 용도

Info

Publication number: KR101776922B1
Application number: KR1020160002872A
Authority: KR
Inventors: 양광희; 남선영; 조성준; 강한아
Original assignee: 한국수력원자력 주식회사
Priority date: 2016-01-08
Filing date: 2016-01-08
Publication date: 2017-09-11
Also published as: KR20170083704A

Abstract

본 발명은 저선량 방사선 노출에 대한 특이 반응 지표로서 다클론 Ikaros (serine 391/393) 인산화 항체 및 상기 다클론항체의 저선량 방사선 노출 여부 평가 용도에 관한 것이며, 상기와 같은 본 발명에 따라, 저선량 방사선 (10, 50 mGy)에 노출된 면역세포주(IM-9) 및 C57BL/6 생쥐의 비장세포에서 특이적으로 세포증식 효과가 일어남을 확인하였고, 이러한 저선량 방사선 특이반응 현상이 면역세포의 분화와 증식에 관여하는 Ikaros라는 단백질의 인산화 활성과 관련이 있음을 발견하게 되었고, Ikaros 단백질의 serine 391과 serine 393번째 아미노산 잔기가 저선량 방사선에 의해 동시에 인산화 되는 부위임을 점돌연변이 클론을 제작하여 밝혀냈다.
특히, 저선량 방사선에 의해 Ikaros 단백질이 serine 391과 serine 393번째 아미노산 잔기가 동시에 인산화 되었을 경우에만 전사조절활성인 DNA 결합 활성이 조절되는 것을 밝혀내어, Ikaros 단백질이 serine 391과 serine 393번째 아미노산 잔기가 동시에 인산화된 부위를 인식하는 다클론 Ikaros 단백질 항체를 제조하여, 이를 통하여 저선량 방사선에 의한 생체의 특이 반응으로 면역세포의 증식효과를 검출할 수 있게 되어 생체 검출 지표로 이용할 수 있게 되었다.

Description

저선량 방사선 노출에 대한 특이 반응 지표로서 다클론 Ikaros (serine 391/393) 인산화 항체 개발 및 이의 용도{ANTI-IKAROS POLYCLONAL ANTIBODIES WITH SERINE 391/393 PHOSPORYLATION AND USE THEREOF AS INDICATOR OF SPECIFIC PROPERTY DUE TO LOW LEVEL RADIATION(LOW DOSE IONIZING RADIATION) EXPOSURE}

본 발명은 저선량 방사선 노출에 대한 특이 반응 지표로서 다클론 Ikaros (serine 391/393) 인산화 항체 및 상기 다클론항체를 이용한 저선량 방사선 노출 여부 평가 용도에 관한 것이다.

현재 사회적 논란이 되고 있는 방사선의 인체 영향에 대한 과학적 기전을 해석하고자, 개체뿐만 아니라 세포와 분자 수준에서의 과학적 근거를 마련하고자 노력하고 있지만, 100 mSv 이하의 저선량 방사선 영역에서는 현재까지 재현성 있는 사실 기전을 입증하지 못해 논쟁의 대상이 되고 있는 실정이다.

방사선은 조혈조직 및 장관조직에 손상을 주어 백혈구 감소증 (leukopenia)을 유발하고 장 점막으로부터 정상 세균총 (normal flora)의 침투성을 증가시키며, 따라서 특이 또는 비특이적인 면역방어 기전이 손상되어 감염성 질환에 대한 저항성이 감소되는 등 암과 같은 질병과 연관이 많은 인자로 알려져 있다. 이러한 방사선에 의한 영향은 혈액·조직 장벽 (blood tissue barrier)의 손상과 식세포 (phagocyte) 수의 감소, 그리고 섭식된 생물을 죽이는 능력과 혈청 보체수준의 감소 및 면역반응의 장해 등으로 나타난다.

2 내지 7 Gy의 방사선에 피폭되면 림프구의 수는 현저히 감소되어, 수 시간 내에 최소수로 되었다가 시간 경과에 따라 서서히 증가되지만, 방사선에 피폭된 후 3-4주가 지나야 정상수준으로 회복될 수 있다. 한편, 0.25 내지 1 Gy 정도의 저선량 방사선을 조사하면 방사선을 조사하지 않은 동물에 비하여 항체형성이 지연되며 일시적으로 매우 높은 항체역가 (antibody peak titer)가 관찰된다. 그러나 0.25 Gy 이하의 저선량 범위에서는 일어날 수 있는 기전이 명확하지 않아, 호메시스 이론과 대립되어 현재까지 논쟁의 여지로 남아 있다 [Stebbing, 1982].

실제 저선량 방사선은 개체성장을 촉진시키고, 생체의 면역기능 항진 및 수명을 연장시킨다는 보고가 있다 [Luckey T.D. et al., 1982]. 사람에서도 이러한 방사선 호메시스에 대한 연구 보고가 있어 Bloom 등 (1987)은 0.5 Gy 이하에서는 인체의 세포성 면역이 항진된다고 보고하였고, Nambi와 Soman (1987)은 연간 0.03 uSv (0.3 mrem) 에서는 암의 발생률을 감소시킨다고 보고하였다. 그러나 방사선 노출에 대한 인체 영향 연구 시, 100 mSv 이하의 저선량 방사선의 영향이 인체 영향으로 표현되기까지 오랜 시간이 소요되고 이를 검출하는 데 많은 한계가 있다. 결국, 이와 관련한 연구는 현상학적 효과를 관찰하는 수준일 뿐, 구체적인 영향 기전이 밝혀지지 않아 여전히 논란의 여지를 남겨 놓고 있다.

본 발명자들은 0.25 Gy이하의 영역인 10, 50 mGy의 저선량 방사선 자극이 림프구 (IM-9 세포주 및 생쥐의 비장세포)의 면역기능을 증가시킬 수 있는 잠재적 역할로서 일시적인 세포증식 효과를 관찰하게 되어, 면역세포의 증식능력을 향상시킬 수 있는 면역세포 내 특이 유전 단백체의 변화를 확인할 수 있는 생체 지표를 발굴해 보고자 하였다.

본 발명자들은 그동안 알려진 저선량 방사선 영향 중 세포증식 효과와 관련하여, 인간 면역세포주인 IM-9 세포와 C57BL/6 생쥐의 비장세포 (면역세포의 집합조직체)를 이용하여, 10, 50 mGy의 저선량 방사선에 노출되었을 때 세포증식이 일어남을 확인하였으며, 면역반응 촉진 시 림프구의 분화와 증식에 중요한 조절인자로 알려져 있는 Ikaros 유전단백체가 저선량 방사선 노출로 인해 특이적으로 인산화되는 반응을 확인하였다. 특히, 이러한 Ikaros 단백질의 인산화는 면역세포가 증식하는 데 있어 밀접한 관련이 있음을 발견하고, Ikaros 단백질의 저선량 방사선 특이적 인산화 부위인 serine 391/393번을 찾아내었다. 또한 저선량 방사선에 의하여 Ikaros 단백질의 serine 391/393번 아미노산 부위가 동시에 인산화 되는 경우에만 DNA 결함활성이 조절됨을 확인하였다.

따라서 두 개의 인산화부위를 동시에 인식할 수 있는 다클론 Ikaros (serine391/393) 인산화 항체가 저선량 방사선에 의한 면역세포 증식의 생체지표로 이용할 수 있음을 이용하여, 개체 수준의 저선량 방사선 영향 기전을 해석함에 있어 연구 수단 (tool)으로 중요한 역할을 할 수 있음을 확인함으로써 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은, 저선량 방사선 노출에 대한 특이 반응 지표가 될 수 있는 변형 단백질과 해당 단백질을 검출할 수 있는 수단을 제공함에 있다. 또한 이러한 수단을 이용하여 저선량 방사선 노출 여부와 면역 반응의 진행상황을 확인할 수 있는 방법을 제공함에 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 인산화 된 이카로스(Ikaros, IK1) 단백질에 특이적으로 결합하는 항-IK1 다클론항체를 제공한다.

바람직하게는, 상기 인산화는 이카로스 단백질의 아미노산 잔기 중에서 serine 391과 serine 393이 동시에 인산화 된 것이다.

바람직하게는, 상기 다클론항체는 serine 391과 serine 393이 동시에 인산화 된 이카로스 펩티드를 항원으로 투여하여 면역화 반응을 유도한 포유동물의 혈액에서 분리한 것이다.

바람직하게는, 상기 다클론항체는 항원으로 최초 투여한 후 2주 간격으로 2회 추가투여 하여 면역화 반응을 유도한 다음, 1주가 경과한 토끼의 혈액에서 분리한 것이다.

또한 본 발명은 상기 항-IK1 다클론항체를 포함하는 저선량 방사선 노출 여부 평가용 조성물을 제공한다.

바람직하게는, 상기 저선량 방사선은, 누적 선량이 10 내지 50 mGy 범위의 방사선 선량이다.

바람직하게는, 상기 방사선은, 알파선, 베타선, 감마선, 전자선, 자외선 및 X선으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상이다.

바람직하게는, 상기 항-IK1 다클론항체는, 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는, 발색효소 및 형광물질로 구성된 군에서 선택되는 적어도 어느 하나로 태깅(tagging)된다.

또한 본 발명은 누적 선량이 10 내지 50 mGy 범위의 방사선에 노출되거나, 노출되었을 것으로 예상되는 포유류 대상(subject)으로부터 생물학적 시료를 채취하는 단계; 제1항의 항-IK1 다클론항체와 상기 생물학적 시료를 접촉시키는 단계; 및 상기 생물학적 시료 내에 존재하는, 아미노산 잔기 중에서 serine 391과 serine 393이 동시에 인산화 된 이카로스(IK1) 단백질의 양을 정량하는 단계를 포함하는, 저선량 방사선 노출 여부 평가 방법을 제공한다.

상기와 같은 본 발명에 따르면, 저선량 방사선 (10, 50 mGy)에 노출된 면역세포주(IM-9) 및 C57BL/6 생쥐의 비장세포에서 특이적으로 세포증식 효과가 일어남을 확인하였고, 이러한 저선량 방사선 특이반응 현상이 면역세포의 분화와 증식에 관여하는 Ikaros라는 단백질의 인산화 활성과 관련이 있음을 발견하게 되었다. 또한 Ikaros 단백질의 serine 391과 serine 393번째 아미노산 잔기가 저선량 방사선에 의해 동시에 인산화되는 부위임을 점돌연변이 클론을 제작하여 밝혀냈다.

특히, 저선량 방사선에 의해 Ikaros 단백질이 serine 391과 serine 393번째 아미노산 잔기가 동시에 인산화되었을 경우에만 전사조절 활성인 DNA 결합활성이 조절되는 것을 밝혀내어 Ikaros 단백질이 serine 391과 serine 393번째 아미노산가 동시에 인산화된 부위를 인식하는 다클론 Ikaros 단백질 항체를 제조하여, 이를 통하여 저선량 방사선에 의한 생체의 특이 반응으로 면역세포의 증식효과를 검출할 수 있게 됨에 따라, 저선량 방사선의 노출 여부 및 생체 영향 연구 중 개체 내 면역방어 조절에 대한 새로운 기전 및 기능을 확인할 수 있는 생체 검출 지표로 이용할 수 있는 효과가 있다.

도 1은 사람 면역세포주 (IM-9)과 C57BL/6 생쥐의 비장세포에 대하여 이온화 방사선을 각각 선량별로 조사하여 세포 생존율을 확인하고 저선량 방사선에 의한 생존율 증가 효과가 Ikaros 유전자의 존재 유무에 따라 결정됨을 확인한 그래프.
도 2는 Ikaros 단백질의 아미노산 서열이며, 그 중 저선량 방사선 특이적 인산화 부위를 표시한 도식이다.
도 3은 Ikaros 단백질의 기능성 도메인구조도. 저선량 특이적 인산화부위를 확인하기 위해 제작된 점돌연변이 클론들 (M2, M3, M23)의 서열이 표시되어 있다.
도 4는 Ikaros 단백질이 저선량 방사선에 특이적으로 인산화 되는 것을, 항 인산화 serine/threoine 항체를 이용한 Western blot 분석을 통해 보여준 결과도. Ikaros 단백질의 DNA 결합활성이 serine 391번과 393번이 동시에 인산화된 경우에만 조절되는 것이 확인된다.
도 5는 Ikaros단백질의 serine 391번 과 393번이 동시에 인산화된 부위를 인식할 수 있는 항체 제작에 이용된 항원의, 인산화 펩타이드 서열 및 해당 서열의 소수성도 및 항원성도.
도 6은 다클론 Ikaros 인산화특이적 항체 생성의 특이성 검증을 위해 사용된 blocking test를 시행하여 Western blot 분석법으로 보여준 사진.
도 7은 다클론 Ikaros 인산화특이적 항체가 serine 391과 393의 인산화를 동시에 인식함을 Western blot 분석법으로 확인한 사진.
도 8은 다클론 Ikaros 인산화특이적 항체를 이용하여 저선량 방사선을 조사하였을 때 특이적으로 증가하는 Ikaros의 인산화를 Western blot 분석법으로 확인한 사진.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 인산화 된 이카로스(Ikaros, IK1) 단백질에 특이적으로 결합하는 항-IK1 다클론항체를 제공한다.

상기 인산화는 이카로스 단백질의 아미노산 잔기 중에서 serine 391과 serine 393이 동시에 인산화되는 것이 바람직하다.

상기 다클론항체는 serine 391과 serine 393이 동시에 인산화 된 이카로스 펩티드를 항원으로 투여하여 면역화 반응을 유도한 포유동물의 혈액에서 분리한 것이 바람직하다.

상기 다클론항체는 항원으로 최초 투여한 후 2주 간격으로 2회 추가투여 하여 면역화 반응을 유도한 다음, 1주가 경과한 토끼의 혈액에서 분리한 것이 바람직하다.

또한 본 발명은 상기 항-IK1 다클론항체를 포함하는 저선량 방사선 노출 여부 평가용 조성물을 제공한다. 상기 저선량 방사선은, 누적 선량이 10 내지 50 mGy 범위의 방사선 선량이다.

상기 방사선은, 알파선, 베타선, 감마선, 전자선, 자외선 및 X선으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인 것이 바람직하다.

상기 항-IK1 다클론항체는, 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는, 발색효소 및 형광물질로 구성된 군에서 선택되는 적어도 어느 하나로 태깅(tagging)되는 것이 바람직하다.

상기 저선량 방사선 노출 여부 평가 방법은 저선량 방사선에 의한 생체 영향 연구로 이용될 수 있으며, 개체 내 면역방어 조절에 대한 새로운 기전 및 기능을 확인할 수 있는 생체 검출 지표로 이용될 수 있다.

예를 들어, (1) 방사선작업종사자 및 일반인의 방사선 피폭 영향을 평가함에 있어, 체내 면역 조절 변화를 확인하는 생체 지표로 활용 가능하며, (2) 저선량 방사선 노출에 대한 개체 수준의 생체 면역방어효과 기전을 연구함에 있어, 방사선과 질병 발생과의 인과관계, 체내 면역조절 기작 등을 검증하는 새로운 연구 tool로 활용할 수 있고, (3) 방호적 측면의 방사선 인체 영향에 대한 새로운 과학적 패러다임을 제시함에 있어 연구용 생체지표로 활용할 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1. 저선량방사선에 의한 생존율 증가 효과가 Ikaros 유전자의 존재 유무의 상관관계 확인

사람 면역세포주 (IM-9)과 C57BL/6 생쥐의 비장세포에 대하여 이온화방사선 (137Cs, 204 mGy/min, Gammacell 40 Exactor, Best Theratronics Ltd.)을 각각 선량별로 조사하여 세포 생존율을 확인하였다.

그 결과 저선량방사선 0.01, 0.05 Gy의 선량에 노출 시 특이적으로 면역세포 생존율이 증가됨을 확인하였다(도 1 A와 B 참조).

특히 면역세포의 분화 및 증식관련 인자로 알려진 Ikaros 유전자(IK1)를 Knock-down 시켰을 때(siIK), 저선량방사선인 50mGy(0.05 Gy)에 의한 세포증식 효과(세포 생존율 증가 효과)가 상쇄됨을 확인하였는데 이는 저선량방사선에 의한 세포증식효과가 Ikaros-의존적임을 보여주는 결과이다. 그 결과로 Ikaros 유전자가 방사선에 의한 세포 생존율을 증가시키는 주요 조절 인자임을 확인할 수 있었다(도 1 C와 D 참조).

결국 저선량 방사선에 의한 생존율 증가 효과가 Ikaros 유전자의 존재 유무에 따라 결정됨을 확인하였다.

실시예 2. 저선량 방사선에의한 Ikaros 단백질의 인산화 및 DNA 결합활성 조절 확인

(1) 저선량 방사선에 의한 Ikaros 단백질의 인산화

상기 실시예 1.에서 보인바와 같이 Ikaros가 저선량방사선에 의한 세포 생존율 증가효과에 중요한 역할을 함에 따라, 저선량 방사선에 의해 Ikaros 단백질의 활성이 변화될 수 있는지를 확인하였다. 우선, Ikaros 단백질의 DNA 결합활성이 단백질 인산화에 의해 조절됨이 보고됨에 따라, 저선량 방사선에 의한 Ikaros 단백질 인산화 여부를 확인하였다. 이를 위하여 인간 B 림프구 세포주인 IM-9에 다양한 선량 (0.05, 5, 30 Gy)의 방사선을 조사한 후, 그로부터 세포 용해물 (cell lysate)을 추출하였다. 추출된 세포용해물을 항-Ikaros 항체를 이용하여 Immuno-precipitation 법을 이용하여 Ikaros 단백질 혼합물을 분리하였다. 분리된 Ikaros 단백질 혼합물을 8% SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)로 분리하였고, 이를 Western blot 분석법으로 분석하였다. 구체적으로, 상기 SDS-PAGE가 끝난 젤에 포함된 단백질은 nitrocellulose 멤브레인 (membrane)에 옮겨 블랏 (blot)을 제작하였다. 단백질이 포함된 블랏은 3% 탈지분유 (skim milk)가 포함된 PBST (Phosphate Buffered Saline with Tween 20)로 1시간 동안 차단(blocking)시켰다. 그 다음, 항-serine/threonine 인산화 항체를 3% skim milk/PBST에 1:1000으로 희석한 후, blot에 첨가하고 4 ℃에서 밤새 반응시켰다. 그런 다음, 상기 블랏을 PBST로 세척하고, 3% skim milk/PBST에 1:5000으로 희석한 2차 항체, 항-토끼 IgG-HRP (anti-rabbit IgG-HRP) (Cell signaling, 미국)로 상온에서 1시간 동안 반응시킨 후, PBST로 세척하였다. 상기와 같이 세척된 블랏에 ECL Prime (enhanced chemiluminescent Prime) (GE Healthcare, 미국)을 처리하고, LAS-4000 image reader를 이용하여 발광된 영상을 얻었다. 그 결과, Ikaros 단백질이 저선량 방사선 (0.05 Gy) 특이적으로 인산화됨을 확인할 수 있었다 (도 4의 A 참조).

(2) 저선량 방사선에 의해 인산화되는 Ikaros 단백질 부위 확인

저선량 방사선에 의하여 특이적으로 인산화되는 Ikaros 단백질의 아미노산 잔기를 확인하기 위해, (도 3)에서 보여진 바와 같이 다양한 돌연변이 Ikaros 단백질을 발현하는 DNA 백터를 제작하였다. 이들 돌연변이들은 야생형 (wild type) Ikaros 단백질과 다르게 serine이 alanine으로 치환된 것으로 인산화가 될 수 없는 클론들이다. 야생형 Ikaros와 다양한 돌연변이 (M2, M3, M23) 클론들을 인간 세포주 (293T)에 과발현시킨 후, 그로부터 세포 용해물 (cell lysate)을 추출하였다. 이를 이용하여, 상기 (1)에 명시한 방법과 동일하게 immuno-precipitation한 후, Western blot 분석을 수행하였다. 그 결과, Ikaros 단백질의 아미노산 serine 391과 serine 393 부위가 저선량 방사선에 의해 특이적으로 인산화됨을 확인하였다(도 4의 B 참조).

(3) Ikaros 단백질 serine 391/393 인산화가 DNA 결합활성에 주는 영향

추가적으로 저선량 방서선에 의해 인산화되는 Ikaros 단백질 serine 391/393 부위가 DNA 결합 활성에도 영향을 주는지 확인하였다. 이를 위하여 야생형 Ikaros와 다양한 돌연변이 (M2, M3, M23) 클론들을 인간 세포주 (293T)에 과발현시킨 후, 저선량 방사선을 조사하였다. 그로부터 핵 추출물 (nuclear extreact)를 분리하였다. 이를 이용하여, Ikaros 단백질이 결합할 수 있는 특이적 DNA probe를 함께 사용하여 Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA)를 수행하였다. 그 결과, 저선량 방사선에 의해 Ikaros 단백질 serine 391/393 잔기 모두가 인산화 될 때 DNA 결합 활성이 조절됨을 확인하였다 (도 4의 C 참조). Ikaros의 DNA 결합활성 조절은 세포 생존에 중요한 역할임을 고려할 때, 저선량 방사선에 의해 조절되는 Ikaros의 인산화는 DNA 결합활성을 통한 세포 생존에 중요한 역할을 한다는 것을 의미하는 것이다.

실시예 3. 항체 제조용 항원의 선정 및 제작

(1) 항체 제조용 항원의 선정

Ikaros 단백질 serine 391/393 부위의 인산화를 특이적으로 결합하는 다클론 항체(polyclonal antibody)를 제조하기 위한 항원 펩티드를 제작하였다.

(도 5)와 같이, Ikaros 단백질의 serine 391번과 393번 아미노산 잔기가 동시에 인산화된 부위를 포함하는 길이 13mer의 인산화 펩티드를 제작하였으며, 인산화 부위를 제외한 나머지 아미노산 잔기 모두는 인간 및 생쥐의 Ikaros 아미노산 서열과 완전히 부합되는 서열로 구성하였다.

일반적으로 소수성도 (hydrophobicity)가 낮고 항원성(antigenicity)이 높은 부분을 이용하는 것이 항체 생성에 있어 성공율이 높으므로, (도 5)의 두 그래프에서 보이는 바와 같이 소수성도 (hydrophobicity)와 항원성(antigenicity)을 참고하여, Ikaros의 인산화 폴리펩티드 서열을 선정하였다.

(2) 항체 제조용 항원의 제작

상기 (1)에서 항원으로 선정된 Ikaros 인산화 펩티드(serine 391/393 동시 인산화 잔기 포함)의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 영인프런티어 회사에 주문하여 제작하였다.

실시예 4. 항체의 제조

상기 실시예 3.에서 제작된 항원(폴리펩티드)을 영인프런티어에 의뢰하여 수령한 후, 하기 [표 1]과 같은 과정으로 생후 8-10주령의 1.8-2.2 ㎏ 체중의 수컷 뉴질랜드 흰토끼(코아텍, 한국)에 주입하여, 다클론 항체의 생성을 유도하였다.

구체적으로, 상기 토끼에 1 ㎎의 항원을 CFA (Complete Freund's Adjuvant)에 혼합하여 유화제를 만든 후, 여러 부위에 피하주사(subcutaneous injection)하여 사전 면역화 (pre-immunization) 시켰다. 상기 사전 면역화 시점으로부터 4주 경과한 후 부터, 0.5 ㎎의 항원을 IFA(Incomplete Freund's Adjuvant)에 혼합한 유화제를 여러 부위에 나누어 피하주사 (subcutaneous injection)하는 과정을 2주 간격으로 3번 수행하여 1차, 2차 및 3차 면역화를 수행하였다. 상기 3차 면역화 시점으로부터 1주 경과한 후, 토끼에서 심장채혈법 (heart puncture)으로 모든 피를 채혈하고 원심분리를 통하여 혈청을 수득하였다.

<표 1 : 항체의 제조과정>

실시예 5. 혈청내 항체의 특이성 확인

일반적으로 다클론 인산화 특이적 항체의 생성에는 인산화된 아미노산을 포함하는 항원결정기(epitope)를 인식하는 항체와 인산화되지 않은 것을 인식하는 항체가 동시에 생산되는 경향이 있다.

따라서, 실시예 4.에서 얻어진 혈청을 이용하여 항체 특이성을 확인하였다. 이를 위하여 야생형 Ikaros와 다양한 돌연변이 (M2, M3, M23) 클론들을 인간 세포주 (293T)에 과발현시킨 후, 그로부터 세포 용해물 (cell lysate)을 추출하였다. 추출된 세포 용해물에서 분리한 세포 내 단백질들을 8% SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)로 분리하였고, 이를 Western blot 분석법으로 분석하였다. 구체적으로, 상기 SDS-PAGE가 끝난 젤에 포함된 단백질은 nitrocellulose 멤브레인 (membrane)에 옮겨 블랏 (blot)을 제작하였다. 단백질이 포함된 블랏은 3% 탈지분유 (skim milk)가 포함된 PBST (Phosphate Buffered Saline with Tween 20)로 1시간 동안 차단(blocking)시켰다. 그 다음, 상기 실시예 3.에서 분리된 혈청을 3% skim milk/PBST에 1:1000으로 희석한 후, 항체의 특이성 (specificity)를 확인하기 위해 인산화된 항원 (phospho-peptide) 또는 인산화되지 않은 같은 서열의 항원을 희석된 혈청 용액에 2 mg/ml의 농도로 첨가하고 상온에서 30분간 반응시켰다. 그 다음 혈청용액을 blot에 첨가하고 4 ℃에서 밤새 반응시켰다. 그런 다음, 상기 블랏을 PBST로 세척하고, 3% skim milk/PBST에 1:5000으로 희석한 2차 항체, 항-토끼 IgG-HRP (anti-rabbit IgG-HRP) (Cell signaling, 미국)로 상온에서 1시간 동안 반응시킨 후, PBST로 세척하였다. 상기와 같이 세척된 블랏에 ECL Prime (enhanced chemiluminescent Prime) (GE Healthcare, 미국)을 처리하고, LAS-4000 image reader를 이용하여 발광된 영상을 얻었다.

그 결과, 다수의 비특이적이고 다양한 크기의 단백질들이 검출되었지만, Ikaros 단백질 밴드 또한 특이적으로 검출되는 것을 확인하였다 (도 6 참조). 야생형 Ikaros의 경우, 인산화되지 않은 항원이 전처리된 블랏에서는 검출되던 특이적 단백질 밴드가 인산화된 항원이 전처리된 블랏에서는 나타나지 않은 것으로 보아, 분리된 혈청이 인산화 특이적 항체를 포함하는 것임을 알 수 있다(도 6의 상위 패널 참조 ; 적절한 표현으로 변경요망). 또한, 이 항체는 M2, M3와 같은 하나의 점 돌연변이 뿐만 아니라 M23의 두개의 점 돌연변이까지 인식하지 않은 것으로 보아 Ikaros의 391번과 393번 serine이 동시에 인산화 되었을 때만 인식하는 항체임을 확인하였다(도 6의 하위 패널 참조).

실시예 6. 혈청 내 항체의 분리 정제

상기 실시예 4.에서 제작된 혈청은 특이적 항체를 포함하고는 있으나 다량의 비특이적 항체 또한 포함하고 있음을 실시예 5.에서 확인하였다.

따라서, 상기 혈청을 영인프런티어에 의뢰하여 항체를 분리 정제하였다. 구체적으로, 혈청내 항체의 분리정제는 두단계로 진행되었으며, IgG 정제와 항원 친화성 정제 (affinity purification) 이다.

첫번째로, 혈청을 미리 준비된 Protean A-agarose 레진 (resin)이 들어있는 컬럼(column)에 주입하였다. 주입된 혈청이 resin을 따라 자연스럽게 흐르도록 컴럼의 하부를 열어주어 레진과 항체(IgG)가 결합되도록 하였다. 다시 컬럼을 PBS를 이용하여 세척하고, 0.1M 구연산 (citric acid, pH 2.5-3.0)을 이용하여 항체를 용출시켰다. 총 5개의 용출물을 취하였으며, 각각은 용출 즉시 1M Tris (pH9.0)용액을 이용하여 중성화시켰다.

IgG 정제법에 의해 정제된 인산화항체 (IgG)는 항원친화성 정제법으로 정제되었으며, 방법은 다음과 같다. 우선 인산화 아미노산 잔기를 포함하는 Ikaros 항원을 Affigel에 비가역적으로 결합시켰다. 항원과 결합된 Affigel 레진을 컬럼에 주입하였고, 여기에 앞서 명시된 IgG 정제된 항체용액을 컬럼에 주입하였다. 주입된 혈청이 레진을 따라 자연스럽게 흐르도록 컴럼의 하부를 열어주어 resin과 항체 (IgG)가 결합되도록 하였다. 다시 컬럼에 PBS를 이용하여 세척하고, 0.1M 구연산 (citric acid, pH 2.5-3.0)을 이용하여 항체를 용출시켰다. 총 5개의 용출물을 취하였으며, 각각은 용출 즉시 1M Tris (pH9.0)용액을 이용하여 중성화시켰다. 그 결과, 2.25 mg/ml의 농도로 총 1.05 mg의 항체를 분리 정제하였다. 분리 정제된 항체는 항 p-IK1/S391/S393으로 명명하였다.

실시예 7. 분리 정제된 항체의 특이성 확인

항 p-IK1/S391/S393의 항체 특이성을 확인하기 위하여, 상기 실시예 5.에서 명시한 것과 유사한 방법을 시행하였다. 구체적으로, 야생형 Ikaros와 다양한 돌연변이 (M2, M3, M23) 클론들을 인간 세포주 (293T)에 과발현시킨 후, 그로부터 세포 용해물을 추출하였다. 추출된 세포 용해물에서 분리한 세포 내 단백질들을 8% SDS-PAGE로 분리하였고, 이를 Western blot 분석법으로 분석하였다. 구체적으로, 상기 SDS-PAGE가 끝난 젤에 포함된 단백질은 nitrocellulose 멤브레인(membrane)에 옮겨 블랏(blot)을 제작하였다. 단백질이 포함된 블랏은 3% 탈지분유 (skim milk)가 포함된 PBST(Phosphate Buffered Saline with Tween 20)로 1시간 동안 차단(blocking)시켰다. 그 다음, 상기 실시예 3.에서 분리 정제된 항 p-IK1/S391/S393항체를 3% skim milk/PBST에 1:1000으로 희석한 후, 블랏에 첨가하고 4 ℃에서 밤새 반응시켰다. 그런 다음, 상기 블랏을 PBST로 세척하고, 3% skim milk/PBST에 1:5000으로 희석한 2차 항체, 항-토끼 IgG-HRP(anti-rabbit IgG-HRP)(Cell signaling, 미국)로 상온에서 1시간 동안 반응시킨 후, PBST로 세척하였다. 상기와 같이 세척된 블랏에 ECL Prime (enhanced chemiluminescent Prime) (GE Healthcare, 미국)을 처리하여 LAS-4000 image reader를 이용하여 발광된 영상을 얻었다. 그 결과, 상기 실시예 5.에서 보였던 다수의 비특이적 단백질 밴드들이 검출되지 않음을 확인하였고, Ikaros 단백질 밴드만이 특이적으로 검출됨을 확인하였다 (도 7 참조). 이러한 결과는, 항 p-IK1/ S391/S393 항체가 순수하게 분리 정제되었음을 보여주는 것이다.

실시예 8. 항 p-IK1/S391/S393 항체를 이용한 저선량 방사선 표지인자로서 Ikaros 단백질의 활용

(1) 과발현 Ikaros 세포주에서 항 p-IK1/S391/S393 항체를 이용한 저선량 방사선 특이적 Ikaros 단백질 인산화의 검출

야생형 Ikaros와 돌연변이인 M23 (StoA) 클론들을 인간 세포주, 293T에 과발현 시켰다. 48시간 후, 감마선 발생장치 (137Cs, 204 mGy/ min, Gammacell 40 Exactor, Best Theratronics Ltd.)를 이용하여 50 mGy의 선량을 세포주에 조사하였으며, 그로부터 1시간 후, 세포 용해물 (cell lysate)을 추출하였다. 추출된 세포 용해물 (cell lysate)에서 분리한 세포 내 단백질들을 8% SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis)로 분리하였고, 상기 실시예 7.에서 명시한 바와 같이 Westen blot 분석법을 시행하였다. 그 결과, 예상했던 대로, 돌연변이 Ikaros(StoA)에서는 인산화 된 Ikaros 단백질 밴드가 보이지 않았지만, 야생형에서는 인산화 된 Ikaros 단백질 밴드가 명확하게 확인되었다. 더욱이, 야생형 Ikaros의 인산화 밴드는 저선량 방사선 (50mGy)에서 유의적으로 증가됨을 확인하였다 (도 8 A 참조).

(2) 인간의 면역세포주에서 항 p-IK1/S391/S393 항체를 이용한 저선량 방사선 특이적 내생 Ikaros (endogenous Ikaros) 단백질 인산화의 검출

Ikaros가 면역세포 특이적으로 발현되는 유전자임을 감안하여, 인간의 B 림프구, IM-9 (B lymphocyte) 세포주를 이용하여 저선량 특이적으로 Ikaros 인산화가 증가되는지 재확인하였다. 이를 위하여 감마선 발생장치 (137Cs, 204mGy/min, Gammacell 40 Exactor, Best Theratronics Ltd.)를 이용하여 10, 50 mGy또는 5 Gy의 선량을 IM-9세포주에 조사하였다. 그로부터 1시간 후, 세포 용해물을 추출하였다. 추출된 세포 용해물에서 분리한 세포 내 단백질들을 8% SDS-PAGE로 분리하였고, 상기 실시예 6.에서 명시한 바와 같이 Western blot 분석법을 시행하였다. 그 결과, 예상했던 대로, 정상조건에서는 약하게 검출되었던 내생 Ikaros의 인산화가 저선량 방사선 (10, 50mGy)에 의해 조사량에 따라 분명하게 증가됨을 확인하였고, 반면 고선량방사선 (5 Gy)에서는 오히려 다시 감소하는 추세를 보였다 (도 8 B 참조). 이는 Ikaros의 인산화가 저선량 방사선에 특이적으로 반응하는 것임을 보여주는 것이고, 항 p-IK1/S391/S393 항체가 이를 효과적으로 검출할 수 있는 도구로서 이용될 수 있음을 검증한 것이다.

이상, 본 발명내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의해 정의된다고 할 것이다.

Claims

인산화 된 이카로스(Ikaros, IK1)단백질의 serine 391과 serine393 아미노산에 특이적으로 결합하는 항-IK1 다클론항체.
제 1항에 있어서,
상기 인산화는 이카로스 단백질의 아미노산 잔기 중에서 serine 391과 serine 393이 동시에 인산화된 것을 특징으로 하는 항-IK1 다클론항체.
제 2항에 있어서,
상기 다클론항체는 serine 391과 serine 393이 동시에 인산화된 이카로스 펩티드를 항원으로 투여하여 면역화 반응을 유도한 인간을 제외한 포유동물의 혈액에서 분리한 것을 특징으로 하는 항-IK1 다클론항체.
제 3항에 있어서,
상기 다클론항체는 항원으로 최초 투여한 후 2주 간격으로 2회 추가투여 하여 면역화 반응을 유도한 다음, 1주가 경과한 토끼의 혈액에서 분리한 것을 특징으로 하는 항-IK1 다클론항체.
제1항의 항-IK1 다클론항체를 포함하는 저선량 방사선 노출 여부 평가용 조성물.
제 5항에 있어서,
상기 저선량 방사선은,
누적 선량이 10 내지 50 mGy 범위의 방사선 선량인 것을 특징으로 하는 저선량 방사선 노출 여부 평가용 조성물.
제 6항에 있어서,
상기 방사선은,
알파선, 베타선, 감마선, 전자선, 자외선 및 X선으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 저선량 방사선 노출 여부 평가용 조성물.
제 6항에 있어서,
상기 항-IK1 다클론항체는,
검출 가능한 신호를 생성할 수 있는, 발색효소 및 형광물질로 구성된 군에서 선택되는 적어도 어느 하나로 태깅(tagging)된 것을 특징으로 하는 저선량 방사선 노출 여부 평가용 조성물.
누적 선량이 10 내지 50 mGy 범위의 방사선에 노출되거나, 노출되었을 것으로 예상되는 인간을 제외한 포유류 대상(subject)으로부터 생물학적 시료를 채취하는 단계;
제1항의 항-IK1 다클론항체와 상기 생물학적 시료를 접촉시키는 단계; 및
상기 생물학적 시료 내에 존재하는, 아미노산 잔기 중에서 serine 391과 serine 393이 동시에 인산화된 이카로스(IK1) 단백질의 양을 정량하는 단계를 포함하는, 저선량 방사선 노출 여부 평가 방법.