KR20120049758A - Ｃｌｉｃ１을 측정하는 제제를 포함하는 방사선 저항성 또는 민감성 진단용 조성물 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 방사선 저항성 또는 민감성 진단용 마커를 선별하고, 또한 상기 마커의 존재를 측정하는 제제를 포함하는 조성물을 포함하는 방사선 저항성 또는 민감성 진단용 키트 및 이를 이용하여 방사선 저항성 또는 민감성을 진단 또는 암환자의 방사선 치료 예측방법에 관한 것이다.
본 발명의 방사선 저항성 또는 민감성 진단용 조성물을 사용함으로, 방사선 치료대상 암세포의 방사선 저항성 또는 민감성을 판단하여 맞춤화된 방사선 치료를 제공하며, 암환자에서 방사선 치료 적용 대상의 다양화를 통해 치료 효과 증진 및 부작용을 감소시킬 수 있다. 또한 방사선 치료환자의 예후를 판단(치료효과의 예측이 가능)하는데 사용할 수 있다.

Description

ＣＬＩＣ１을 측정하는 제제를 포함하는 방사선 저항성 또는 민감성 진단용 조성물 및 이의 용도 {Composition for diagnosis of radio-resistance or radio-sensitive marker and use thereof}
본 발명은 방사선 저항성 또는 민감성 진단용 마커를 선별하고, 또한 상기 마커의 존재를 측정하는 제제를 포함하는 조성물을 포함하는 방사선 저항성 또는 민감성 진단용 키트 및 이를 이용하여 방사선 저항성 또는 민감성을 진단 또는 암환자의 방사선 치료 예측방법에 관한 것이다.
전 세계에 걸쳐 암은 인간의 건강을 위협하는 심각한 문제이다. 현재 암을 치료하거나 진단하기 위하여 많은 방법과 기술들이 개발되고 있으나, 더 안전하고 효과적인 치료 방법을 찾기 위한 기술이 개발되고 있다.
통계적으로 암 환자의 약 30-50%는 치료시기 중 한 시점에 방사선 치료를 받는다. 그러나, 방사선 치료의 유효성은 암의 성질, 환자 및 방사선이 기타 치료와 조합되는 것에 따라 다양하다. 일반적으로 방사선 치료가 널리 시행되고 있는 암으로는 두경부암, 후두암, 자궁경부암, 인두암, 폐암, 뇌암, 유방암, 대장암 등이 있다. 이들 암종이 방사선 치료의 주요 대상이 될지라도 방사선 치료시 반응이 좋지 않은 경우가 빈번하므로 치료 효율을 높이는 전략이 필요하다. 이와 더불어 방사선 치료가 잘 되어 초기반응은 좋을지라도 재발하는 경우가 빈번하여 재발 암에 대한 대책을 세우는 것도 방사선 치료의 효율을 높이는데 중요하다. 암세포에 대한 방사선 치료의 감수성의 차이가 존재하지만 방사선 치료 전에 개인별로 방사선에 대한 감수성을 예측할 수 있는 기술을 개발하면, 개인별로 방사선 처리량을 조절하여 암을 치료함으로써, 개인에게 가장 적합한 방사선 치료를 제공할 수 있다.
방사선 치료 전에 암세포의 방사선에 대한 감수성을 알아보기 위해, 암세포를 분리하여 방사선을 조사한 후, 암세포의 사멸 정도를 정확하고 신속하게 분석하는 방법이 필요하다. 가장 직접적이고 이상적인 방법은 세포에 트립판 블루(trypan blue) 등을 처리한 후 현미경과 세포수 측정기를 이용하여 살아있는 세포를 세는 것이지만 시간과 너무 많은 노력이 요구되며, 검체 수가 많을 경우에는 사용할 수가 없는 문제점이 있다. 조직학적 소견이나 병기가 같은 암 환자의 경우에도 방사선 감수성은 매우 다르며, 이에 영향을 주는 많은 인자들이 있는 것으로 알려져 있다. 종양이 방사선 저항성을 가지게 되는 이유 중 가장 큰 요인으로 종양 세포의 내적인 방사선 감수성이다. 암세포가 방사선에 조사되면 복잡한 분자생물학적 변화에 의해 사망하거나 회복이 되는데 이러한 과정의 신호전달에 관여된 유전자와 단백질의 기능을 조절하는 기전들이 밝혀졌으며 근래에 와서 이러한 모든 것이 방사선 치료의 효과를 증진시킬 수 있는 표적이 될 수 있는 것으로 알려졌다(Park HJ., J Korean Soc Ther Radiol Oncol 2004; 22:S6, Choi EK., J Korean Soc Ther Radiol Oncol 2004; 22:S7). 지금까지 방사선 저항성에 대한 연구들이 진행되어 이 중 일부는 방사선 저항성을 극복하기 위한 방사선 민감제의 개발에 기초가 되고 있다. 현재까지 밝혀진 방사선 저항성과 관련된 인자들로는 시클로옥시게나아제-2(Terakado N, Shintani S, Yano J, Chunnan L,Mihara M, Nakashiro K, et al., Oral Oncol 2004; 40:383-9), 상피세포 성장 인자 수용체(EGFR)(Milas L, FanZ, Andratschke NH, Ang KK., Int J Radiat Oncol Biol Phys 2004; 58(3); 966-71), 시클린 D1(Milas L, Akimoto T, Hunter NR, Mason KA, Buchmiller L, Yamakawa M, et al., Int J Radiat Oncol Biol Phys 2002;52; 514-21), 인슐린-유사 성장인자 1 수용체(IGFBP-1 receptor), 망간 수퍼옥시드 디스뮤타아제, 수르비빈(survivin) 등이 있으나 아직까지는 부분적으로 기전이 밝혀져 있으며 방사선 치료 결과의 유용한 예측 인자로 활용되고 방사선 민감도를 증가시킬 수 있는 마커는 미비한 실정이다.
후두암은 두경부암에서 가장 큰 하위군으로 세계에서 6번째로 빈번히 발생하는 암이다. 흡연과 알콜 소비가 증가하면서 후두암종의 주요 위험인자가 되며, 사람 유두종 바이러스 또한 또 하나의 잠재적 요소로 작용한다. 악성종양을 제거하기 위한 주요 치료방법 중 하나의 방법으로 방사선치료를 많이 사용하며, 일반적으로 후두암을 치료하기 위해 외과적인 수술, 화학요법과 함께 방사선 치료를 병행하며 다양한 형태의 암을 치료하기 위해 통상적으로 이용된다. 따라서 이러한 후두암에서 저항성을 진단할 수 있는 마커가 필요한 실정이다.
이에, 본 발명자들은 암의 방사선 저항성 여부를 진단할 수 있는 마커를 찾기 위해 예의 노력한 결과, 방사선 저항성 세포주를 구축하고 방사선 저항성 세포주와 대조군 세포주를 2-D 젤로 분석하여 발현의 차이를 보이는 유전자를 확인하여, 신규한 방사선 저항성 진단용 마커에 관한 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 CLIC1(Chloride intracellular channel protein 1, NCBI GenBank Accession No. NM_001288) 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질의 수준을 측정하는 제제를 포함하는 암세포의 방사선 저항성 또는 민감성 진단용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 CLIC1 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머를 사용하여 암환자의 생물학적 시료로부터 mRNA 수준을 측정하는 단계; 및 상기 mRNA 수준의 변화를 정상 대조구 시료의 mRNA 수준과 비교하는 단계를 포함하는 암 환자의 방사성 저항성 진단을 위한 정보의 제공 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 CLIC1의 단백질에 특이적인 항체를 암 환자의 생물학적 시료와 접촉시켜 항원-항체 복합체 형성으로 단백질 수준을 확인하는 단계; 및 상기 단백질 형성량의 변화를 정상 대조군 시료의 단백질 수준과 비교하는 단계를 포함하는 암 환자의 방사선 저항성 또는 민감성 진단을 위한 정보의 제공 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 암환자의 방사선 치료 예후 예측에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 방사선 치료를 받은 환자의 시료로부터 CLIC1의 mRNA 또는 이의 단백질의 수준을 정상 세포의 발현 수준과 비교하여 방사선 저항성 또는 민감성 진단용 마커를 검출하는 방법을 제공하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서 본 발명은 CLIC1(Chloride intracellular channel protein 1, NCBI GenBank Accession No. NM_001288) 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질의 수준을 측정하는 제제를 포함하는 암세포의 방사선 저항성 또는 민감성 진단용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에서의 용어, "CLIC1(Chloride intracellular channel protein 1)" 이란, 세포내 염화물 채널 단백질로서, 주로 세포의 핵에 존재하며 세포의 부피, pH, 세포주기 및 세포사멸을 조절하는 기능을 가지고 있다. 이 단백질은 음이온 선택적인 채널활성을 가지며, 이량체 또는 단량체를 형성함으로써 핵과 원형질막에서 기능을 나타낸다. 그러나 CLIC1과 방사선 민감성 및 저항성의 연관성에 대해서는 현재까지 알려진 바가 없다. CLIC1과 방사선저항성과의 관계에 대해서 본 발명자들이 처음으로 규명하였으며, 본 발명의 일 구현예에 따르면, CLIC1이 방사선저항성 세포주에서 발현이 감소된 것을 확인하며, CLIC1이 방사선 민감성 유전자임을 확인하였다.
또한, 상기 방사선-저항성 또는 방사선-민감성 진단용 마커는 APRT1(Adenine phosphoribosyltransferase, NCBI GenBank Accession No. NM_000485), PRDX2(Peroxiredoxin-II, NCBI GenBank Accession No. NM_005809), TRM112L(TRM112-like protein, NCBI GenBank Accession No. NM_016404), PCBP2(Poly(rC)-binding protein 2, NCBI GenBank Accession No. NM_001098620), TALDO1(Transaldolase-1, NCBI GenBank Accession No. NM_006755), ECH1(Enoyl Coenzyme A hydratase 1, NCBI GenBank Accession No. NM _001398), PSMA1(Proteasome subunit alpha type-1, NCBI GenBank Accession No. NM_148976), PRPS2(Phosphoribosyl pyrophosphate synthetase 2, NCBI GenBank Accession No. NM_001039091), NP(Nucleoside phosphorylase, NCBI GenBank Accession No. NM_000270), PSMA6(Proteasome subunit alpha type-6, NCBI GenBank Accession No. NM_002791), TPI1(Triosephosphate isomerase, NCBI GenBank Accession No. NM_000365), ALD(Aldehyde reductase, NCBI GenBank Accession No. NM_006066), EB1(End-binding protein 1, NCBI GenBank Accession No. NM_012325), TCP1(T-complex 1, NCBI GenBank Accession No. NM_030752) 및 PDIA3(Protein disulfide-isomerase A3, NCBI GenBank Accession No. NM_005313)로 이루어진 군으로부터 선택된 1개 이상의 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질의 수준을 측정하는 제제를 포함하는 암세포의 방사선 저항성 진단용 조성물에 관한 것이 바람직하다.
본 발명에서 용어 "방사선-저항성(radio-resistance)"은 방사선 조사에 의해 쉽게 영향을 받지 않으며, 방사선에 노출시 세포 복구 또는 증식에 거의 변화가 없는 상태를 말한다.
본 발명에서 용어 "방사선-민감성(radio-sensitive)"은 방사선 조사에 의해 쉽게 영향을 받으며, 방사선에 노출시 세포 복구 또는 증식에 변화를 보이는 상태를 말한다.
본 발명의 방사선 저항성 또는 민감성 진단용 조성물은 정상 암세포 대비 방사선 저항성 암세포에서 차등적 발현수준을 갖는 유전자로 구성되어, 개체나 세포의 방사선 저항성을 판단할 수 있게 한다. 즉, 본 발명의 방사선 저항성 진단용 조성물의 발현 수준이 대조군 보다 높거나 낮은 개체나 암세포는 방사선 저항성 또는 민감성을 갖는 것으로 판단할 수 있다.
본 발명의 실시예에서 방사선 민감성 진단용 마커로는 CLIC1(Chloride intracellular channel protein 1)와 EB1(End-binding protein 1)으로 방사선 저항성 암세포주에서 상기 방사선 민감성 진단용 마커의 발현수준이 대조군 보다 낮게 발현되며, 반면에, 방사선 저항성 진단용 마커로는 APRT1(Adenine phosphoribosyltransferase), PRDX2(Peroxiredoxin-II), TRM112L(TRM112-like protein), PCBP2(Poly(rC)-binding protein 2), TALDO1(Transaldolase-t), ECH1(Enoyl Coenzyme A hydratase 1), PSMA1(Proteasome subunit alpha tvpe-1) PRPS2(Phosphoribosyl pyrophosphate synthetase 2), NP(Nucleoside phosphorylase), PSMA6(Proteasome subunit alpha type-6), TPI1(Triosephosphate isomerase), ALD(Aldehyde reductase), EB1(End-binding protein 1), TCP1(T-complex 1) 또는 PDIA3(Protein disulfide-isomerase A3)으로 방사선 저항성 암세포주에서 상기 방사선 저항성 진단용 마커의 발현수준이 대조군 보다 높게 발현되는 것을 확인하였다.
방사선 치료 대상 암의 방사선 저항성 또는 민감성 여부 및 그 수준을 판단하면, 이를 반영하여 방사선 치료의 방사선 조사량을 정할 수 있기 때문에, 방사선 치료의 효율 및 치료 결과를 증진시킬 수 있다.
본 발명에서 용어, "마커 또는 진단 마커(diagnosis marker)"란, 암 세포 또는 암 질환을 가진 개체를 방사선 저항성 세포 또는 개체, 방사선 민감성 세포 또는 개체와 구분하여 진단할 수 있는 물질로, 정상 암세포에 비하여 방사선 저항성을 가진 암세포 또는 개체에서 증가 또는 감소를 보이는 폴리펩티드, 단백질 또는 핵산 (예: mRNA 등), 지질, 당지질, 당단백질 또는 당 (예: 단당류, 이당류, 올리고당류 등) 등과 같은 유기 생체 분자들을 포함한다.
또한 본 발명의 상기 조성물에 의해 측정할 수 있는 암은 본 발명의 마커 유전자의 발현차이에 의해 구별할 수 있는 암은 제한없이 포함되나, 바람직하게는 두경부암, 후두암, 자궁경부암, 인두암, 폐암, 뇌암, 유방암, 대장암 등이며, 보다 바람직하게는 두경부암 또는 후두암이다.
생물학적 시료 중의 유전자 발현 수준은 mRNA 또는 단백질의 양을 확인함으로써 확인할 수 있다.
본 발명에서 용어,“mRNA 발현수준 측정”이란, 방사선 저항성 및 민감성을 진단하기 위하여 생물학적 시료에서 상기 마커 유전자들의 mRNA 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로 mRNA의 양을 측정한다. 이를 위한 분석 방법으로는 역전사 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소반응(Competitive RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소반응(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅(Northern blotting), DNA 칩 등이 있으나 이로 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 “단백질 발현수준 측정”이란, 방사선 저항성 또는 민감성을 진단하기 위하여 생물학적 시료에서 상기 마커 유전자로부터 발현된 단백질의 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로, 바람직하게는, 상기 유전자의 단백질에 대하여 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 단백질의 양을 확인할 수 있다. 이를 위한 분석 방법으로는 웨스턴 블롯, 엘라이자(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA), 방사선면역분석(Radioimmunoassay, RIA), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역 확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), 유세포분석(Fluorescence Activated Cell Sorter, FACS), 단백질 칩(protein chip) 등이 있으나 이로 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 유전자 mRNA의 수준을 측정하는 제제는 상기 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머를 공지의 데이터 베이스에 공지된 상기 유전자의 서열을 바탕으로 당업자가 다양한 프로그램을 이용하여 제작할 수 있다.
본 발명에서의 용어 "프라이머"란, 짧은 자유 3'말단 수산화기를 가지는 핵산 서열로 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 중합효소 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. 본 발명의 프라이머는, 각 마커 유전자 특이적인 프라이머로 7개 내지 50개의 뉴클레오타이드 서열을 가진 센스 및 안티센스 핵산이다. 프라이머는 DNA 합성의 개시점으로 작용하는 프라이머의 기본 성질을 변화시키지 않는 추가의 특징을 혼입할 수 있다. 본 발명의 프라이머는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비제한적인 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오타이드 하나 이상의 동족체로의 치환 및 뉴클레오타이드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다. 핵산은 하나 이상의 부가적인 공유 결합된 잔기, 예를 들면, 단백질(예: 뉴클레아제, 독소, 항체, 시그날 펩타이드, 폴리-L-리신 등), 삽입제(예: 아크리딘, 프소랄렌 등), 킬레이트화제(예: 금속, 방사성 금속, 철, 산화성 금속 등) 및 알킬화제를 함유할 수 있다. 본 발명의 핵산 서열은 또한 검출 가능한 시그널을 직접적으로 또는 간접적으로 제공할 수 있는 표지를 이용하여 변형시킬 수 있다. 표지의 예로는 방사성 동위원소, 형광성 분자, 비오틴 등이 있다.
또한 상기 유전자의 단백질 수준을 측정하는 제제는 상기 단백질에 특이적인 항체를 포함하는 것인 암세포의 방사선 저항성 또는 민감성 진단용 조성물이다.
본 발명에서의 용어,“항체”란, 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상, 항체는 마커 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 다클론 항체, 단클론 항체 및 재조합 항체를 모두 포함한다. 상기한 바와 같이 방사선 저항성 및 민감성 마커 단백질이 규명되었으므로, 이를 이용하여 항체를 생성하는 것은 당업계에 널리 공지된 기술을 이용하여 용이하게 제조할 수 있다. 다클론 항체는 상기한 방사선 저항성 또는 민감성 마커 단백질 항원을 동물에 주사하고 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 당업계에 널리 공지된 방법에 의해 생산할 수 있다. 이러한 다클론 항체는 염소, 토끼, 양, 원숭이, 말, 돼지, 소 개 등의 임의의 동물 종 숙주로부터 제조 가능하다. 단클론 항체는 당업계에 널리 공지된 하이브리도마 방법(hybridoma method)(Kohler 및 Milstein (1976) European Jounral of Immunology 6:511-519 참조), 또는 파지 항체 라이브러리(Clackson et al, Nature, 352:624-628, 1991; Marks et al, J. Mol. Biol., 222:58, 1-597, 1991) 기술을 이용하여 제조될 수 있다. 상기 방법으로 제조된 항체는 겔 전기영동, 투석, 염 침전, 이온교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 등의 방법을 이용하여 분리, 정제할 수 있다.
또한 본 발명의 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, Fab, F(ab'), F(ab') 2 및 Fv 등이 있다.
본 발명에서의 용어, "암세포"는 다세포 생물체의 조직 또는 기관에서 조절되지 않은 성장을 나타내는 임의의 세포를 말한다.
본 발명의 방사선 저항성 진단용 마커는 후두암 세포주를 사용하여 방사선 저항성 세포주를 확립한 뒤 2D-PAGE 방법으로 유전자 발현의 양을 대조군(정상 후두암세포;HEp-2 세포)과 비교하여 발굴하였으며 이 마커들은 방사선 치료의 효과를 증진시키기 위해 이용될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 방사선 저항성 세포주를 구축하기 위해, 후두암 세포주에 2Gy의 감마선을 15주간 주당 2회씩 조사하는 단계를 60 Gy에 도달할 때까지 반복하였다. 이 방법을 통해 확립된 방사선 저항성 세포주를 대상으로 집락형성 분석법에 의해 방사선 저항성 여부를 판단하였다. 방사선 저항성 세포주와 대조군 세포주를 2D-PAGE 분석법으로 실험하여 두 세포주간에 발현의 차이가 나는 유전자를 확인하였다. 방사선 저항성 세포주에서 대조군에 비해 낮은 발현량을 보이는 것으로 확인된 유전자는 염기서열을 분석해 본 결과, CLIC1 또는 EB1 과 반대로, 방사선 저항성 세포주에서 대조군에 비해 높은 발현량을 보이는 것으로 확인된 유전자는 염기서열을 분석해 본 결과, APRT1, PRDX2, TRM112L, PCBP2, TALDO1, ECH1, PSMA1, PRPS2, NP, PSMA6, TPI1, ALD, TCP1 또는 PDIA3으로 모두 16개 였다. 이들 유전자는 아직까지 문헌에서 방사선, 특히 방사선 저항성과 민감성 연관된 기능을 갖는 것으로 개시된 바 없는 신규한 방사선 저항성 또는 민감성 진단용 마커로 확인되었다.
본 발명에서의 용어, "방사선조사(irradiation)"란, 예를 들면, X-선, 자외선, 알파 입자 및 감마선을 포함하는 전자기 방사선 또는 알파 또는 베타 입자의 작용에 대한 노출을 포함한다.
본 발명에서의 용어, "그레이(Gy)"는 대표적인 생물학 조직 1kg에서 1J을 방출하는 방사선의 양이다.
또 하나의 양태로서 본 발명은 상기 방사선 저항성 또는 민감성 진단용 조성물을 포함하는 방사선 저항성 또는 민감성 진단용 키트에 관한 것이다. 상기 키트는 RT-PCR 키트, DNA 칩 키트, 마이크로어레이 또는 단백질 칩 키트인 것을 특징으로 한다. 본 발명에 따른 진단용 키트는 상기 방사선 저항성 또는 민감성 진단용 조성물을 사용하여 당업계에서 사용되는 통상의 방법에 따라 제조할 수 있다. 또한, 상기 방사선 저항성 또는 민감성 유전자의 발현변화 측정은 본 발명에 따른 방사선-저항성 또는 방사선-민감성 진단용 마커를 포함하는 키트를 사용하여 수행할 수 있다.
본 발명에서의 용어, "키트"란, CLIC1, EB1, APRT1, PRDX2, TRM112L, PCBP2, TALDO1, ECH1, PSMA1, PRPS2, NP, PSMA6, TPI1, ALD, TCP1 또는 PDIA3 유전자의 mRNA 발현 수준 또는 단백질의 발현 수준을 확인하여 암세포의 방사선 저항성 또는 민감성 여부를 진단할 수 있는 도구를 의미한다. 본 발명의 암세포의 방사선 저항성 여부 진단용 키트에는 방사선저항성 진단마커로서 CLIC1, EB1, APRT1, PRDX2, TRM112L, PCBP2, TALDO1, ECH1, PSMA1, PRPS2, NP, PSMA6, TPI1, ALD, TCP1 또는 PDIA3 유전자 발현수준을 측정하기 위한 프라이머, 프로브 또는 선택적으로 마커를 인지하는 항체뿐만 아니라 분석 방법에 적합한 1종 이상의 다른 구성성분 조성물, 용액, 또는 장치가 포함될 수 있다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 CLIC1 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머를 사용하여 암환자의 생물학적 시료로부터 mRNA 수준을 측정하는 단계; 및 상기 mRNA 수준의 변화를 정상 대조구 시료의 mRNA 수준과 비교하는 단계를 포함하는 암 환자의 방사성 저항성 또는 민감성 진단을 위한 정보의 제공 방법에 관한 것이다. 또한 APRT1, PRDX2, TRM112L, PCBP2, TALDO1, ECH1, PSMA1, PRPS2, NP, PSMA6, TPI1, ALD, TCP1 및 PDIA3 중에서 선택되는 1개 이상의 유전자의 mRNA 수준을 추가로 측정 및 비교하는 단계를 포함하는 암 환자의 방사선 저항성 또는 민감성을 진단을 위한 정보의 제공 방법을 포함하는 것이 바람직하다.
또 하나의 양태로서 본 발명은 CLIC1의 단백질에 특이적인 항체를 암 환자의 생물학적 시료와 접촉시켜 항원-항체 복합체 형성으로 단백질 수준을 확인하는 단계; 및 상기 단백질 형성량의 변화를 정상 대조군 시료의 단백질 수준과 비교하는 단계를 포함하는 암 환자의 방사선 저항성 또는 민감성 진단을 위한 정보의 제공 방법에 관한 것이다. 또한 APRT1, PRDX2, TRM112L, PCBP2, TALDO1, ECH1, PSMA1, PRPS2, NP, PSMA6, TPI1, ALD, TCP1 또는 PDIA3 중에서 선택되는 1개 이상의 유전자의 단백질 수준을 추가로 측정 및 비교하는 단계를 포함하는 암 환자의 방사선 저항성 또는 민감성 진단을 위한 정보의 제공 방법을 포함하는 것이 바람직하다.
본 발명의 목적상 암세포에서 CLIC1와 EB1 유전자의 mRNA와 단백질의 발현수준이 낮으면 방사선 저항성을 나타내는 암세포로 판단할 수 있으며, 반면에 상기 유전자의 발현수준이 높으면 방사선 민감성을 나타내는 암세포로 판달할 수 있다. 또한, APRT1, PRDX2, TRM112L, PCBP2, TALDO1, ECH1, PSMA1, PRPS2, NP, PSMA6, TPI1, ALD, TCP1 또는 PDIA3 유전자의 mRNA와 단백질의 발현수준이 높으면 방사선 저항성 암세포로 판단할 수 있고, 반면에 낮으면 방사선 민감성 암세포주로 판단할 수 있다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 암환자의 방사선 치료 예후 예측에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 방사선 치료를 받은 환자의 시료로부터 CLIC1의 mRNA 또는 이의 단백질의 수준을 정상 세포의 발현 수준과 비교하여 방사선 저항성 진단용 마커를 검출하는 방법에 관한 것이다. 또한, APRT1, PRDX2, TRM112L, PCBP2, TALDO1, ECH1, PSMA1, PRPS2, NP, PSMA6, TPI1, ALD, TCP1 또는 PDIA3 중에서 선택되는 1개 이상의 유전자의 mRNA 또는 단백질 수준을 추가로 측정 및 비교하는 단계를 포함하는 방사선 저항성 또는 민감성 진단용 마커를 검출하는 방법을 포함하는 것이 바람직하다. 본 발명의 방법에서, 상기 암세포는 두경부암, 후두암, 자궁경부암, 인두암, 폐암, 뇌암, 유방암, 대장암 유래일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는 상기 암세포는 두경부암 또는 후두암 유래이다.
본 발명에서의 용어, "예후 예측"이란, 방사선 조사 후, 정상 대조군과 비교하여 방사선저항성 암세포주에서 발현차이를 보이는 유전자를 통해 방사선 저항성 또는 민감성 암세포를 예측하는 것이다.
본 발명에서의 용어, "화학요법 억제제"는 질병의 치료 또는 제어에 이용되는 임의의 화학물질을 포함한다. 암 화학요법억제제의 예는 DIDS(4,4'-diisothiocyanatostilbene- 2,2'-disulfonic acid) 또는 IAA94(indanyloxyacetic acid-94)를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서의 용어, "차등적 발현"은 샘플 내 본 발명의 동일한 하나 이상의 바이오마커의 발현 수준과 비교한 것으로서 하나의 샘플 내 바이오마커의 mRNA의 양 또는 수준을 측정함으로써, 본 발명의 하나 이상의 바이오마커의 mRNA의 발현 수준에 있어서의 차이를 말한다. "차등적으로 발현된"은 샘플의 집단 내 단백질 발현의 양 또는 수준과 비교하여 샘플 또는 샘플 집단 내 본 발명의 바이오마커에 의해 암호화된 단백질의 측정을 또한 포함할 수 있다. 차등적 발현은 본 발명에 기술된 바와 같이 및 당해 분야의 숙련자에 의해 이해되는 바와 같이 측정할 수 있다.
본 발명에서의 용어, "유전자 발현 패턴" 또는 "유전자 발현 프로파일" 또는 "유전자 특징"은 암세포의 방사선저항성과 민감성 관련된 유전자의 상대적 발현을 말하며, 조합된 패턴이 본 발명의 바이오 마커 중 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12개 또는 모두를 포함하는 본 발명의 1개 이상의 바이오 마커의 발현 수준의 분석 결과임을 나타낸다. 유전자 발현 패턴 또는 유전자 발현 프로파일 또는 유전자 특징은 mRNA 및/또는 본 발명의 바이오 마커에 상응하는 유전자에 의해 발현된 단백질의 발현의 측정으로부터 수득될 수 있다.
본 발명의 실시예에서는 CLIC1의 기능과 역할 ROS생성과의 연관성에 대해 알아보았다. 보다 상세하게는 모HEp-2, RR-HEp-2 세포에서의 CLIC1의 발현을 웨스턴블롯 및 면역 형광 광학현미경 분석을 통하여, CLIC1이 후두암 세포에서 획득된 방사선저항성의 음성적인 조절자인 것을 확인하였으며, 화학적 억제제를 사용하여 CLIC1의 역할에 대해 알아보았다. 따라서, CLIC1 활성의 억제나 발현의 억제가 HEp-2세포의 방사선 저항성 표현형을 획득하는데에 중요한 역할을 한다는 것을 알 수 있었다.
또한, CLIC1의 정규장소 밖의 과발현 실험을 통해 CLIC1이 HEp-2 후두암세포의 방사선 민감성에 기여한다는 것을 알 수 있었으며, 방사선 민감성을 보인 세포주에서 CLIC1이 많이 발현된 것을 관찰할 수 있었고, 반면에 방사선저항성을 보인 세포주에서는 CLIC1이 적게 발현되는 것을 통해 CLIC1 발현이 방사선 민감도에서 중요한 역할을 하여 암세포주에서 방사선민감성과 저항성을 보이는데 크게 연관되어 있다는 것을 알 수 있었다. 또한 모HEp-2, RR-HEp-2 세포에서 DCF 염색을 이용하여 각 세포의 ROS 생성을 상대적인 DCF 값으로 측정한 실험을 통해, CLIC1이 ROS 생성의 양성적인 조절자로서 작용을 하며, ROS 신호전달경로의 조절을 통해 HEp-2 세포의 방사선 민감도를 변경할 수 있다는 것을 알 수 있었다.
본 발명의 방사선 저항성 또는 민감성 진단용 조성물을 사용함으로, 방사선 치료대상 암세포의 방사선 저항성 또는 민감성을 판단하여 맞춤화된 방사선 치료를 제공하며, 암환자에서 방사선 치료 적용 대상의 다양화를 통해 치료 효과 증진 및 부작용을 감소시킬 수 있다. 또한 방사선 치료환자의 예후를 판단(치료효과의 예측이 가능)하는데 사용할 수 있다.
도 1은 방사선저항성 HEp-2 사람 후두암 세포주 확립에 관한 것이다. (A) 모 HEp-2, RR-HEp-2 및 RR-HEp-2 변이체 (#6, 12, 13 및 18)세포들을 공지된 방사선량으로 노출 시킨 결과, 집락형성 생존분획 결과를 나타낸 것이다. 생존분획은 다음과 같은 공식에 의해 측정되었다.: 방사선 처리 후 생성된 콜로니의 수 / 뿌려진 세포 수 X 대조군의 플레이팅 효율로 계산되어 진다. (B) 모HEp-2, RR-HEp-2 및 RR-#6 세포들을 방사선 0 또는 4 Gy 조사 후, 콜로니 형성을 트립판-블루 염색으로 가시화한 도이다. (C) 모HEp-2, RR-HEp-2 및 RR-#6 세포들을 0 또는 10 Gy의 방사선 조사 후, 24시간 배양하고, EGFR, ERBB-2, Hsp90, Bcl-xl 및 Mn-SOD의 전사수준을 전형적인 RT-PCR로 측정한 것이다. GAPDH는 로딩 대조군으로 사용하였다. (D) 모HEp-2, RR-HEp-2 및 RR-#6 세포들을 0 또는 10 Gy의 방사선 조사 후, 24시간 배양하고, EGFR, ERBB-2, Hsp90, Bcl-xl 및 Mn-SOD의 전사수준을 정량적인 RT-PCR 로 측정한 것이다.
도 2는 모HEp-2, RR-HEp-2 및 RR-HEp-2 변이체 세포들에서 세포증식과 세포사멸에서 방사선의 효과에 대한 것이다. (A) 60mm 플레이트에 2X104 세포의 밀도로 세포를 깔고, 0(대조군) 또는 4 Gy의 방사선을 조사 후, 공지된 날짜대로 배양한 후 트립판 블루 용액으로 살아있는 세포의 총수를 계수하였다. (B) 세포를 0 또는 10 Gy의 방사선 조사한 후, 48시간 배양하였다. 그 후, 세포 생존률을 FACScan 유세포분석기로 측정하였고, PI-양성세포의 퍼센트(세포사멸)로 나타내었다. (C) 세포를 0 또는 10 Gy의 방사선 조사 후, 48시간 배양하였다. 그 후, 절단된 PARP의 단백질수준을 웨스턴블롯으로 측정하였고(위), 핵기포(nuclear blebbing)정도를 DAPI 염색으로 측정하였다(아래). β-엑틴은 로딩 대조군으로 사용한 것이다.
도 3은 모HEp-2세포주와 RR-HEp-2 변이체 세포들간의 차등적 발현을 보이는 단백질들의 이차원적 젤 분석결과를 나타낸 것이다. (A) 모HEp-2세포주와 RR-HEp-2 세포를 48시간 배양하고, 각 세포주에서 용해물을 모았다. 각 단백질 150㎍을 고정된 12% 폴리아크릴아마이드겔의 pH 4-7 기울기 스트립상에서 분리시켰다. 단백질들은 실버염색으로 가시화하였고, PdQuest 소프트웨어를 사용하여 나타내었다. 차등적 발현양상을 보인 단백질 스팟을 검은 화살표로 표시하였고, 번호를 매겼다. (B) A에서 지시한 동정된 16개의 스팟을 확대한 그림이다. (C) A에서 공지된 15개의 단백질 스팟을 웨스턴블롯으로 측정하였다. β-엑틴은 로딩 대조군으로 사용한 것이다. (D) A에서 공지된 스팟 8번(TRM112L)의 전사수준을 전형적인 RT-PCR에 의해 측정하였다. GADPH 는 로딩 대조군으로 사용하였다. (E) 모 HEp-2 와 RR-HEp-2 변이체 (#6, 12, 13 및 18) 세포를 48시간 동안 배양한 후, 각 세포주의 세포용해물을 모았다. 단백질은 실버염색을 통해 가시화하였으며, HEp-2세포와 분리된 RR-HEp-2 아형클론의 확대이미지를 각 단백질 발현 상대적인 비율로 나타내었다.
도 4는 모HEp-2, RR-HEp-2 및 RR-#6 세포에서의 CLIC1의 발현을 나타낸 것이다. (A) 도 3A에서 공지된 스팟 2번의 확대한 것이다(위). 이를 CLIC1으로 명명하였으며, MALDI-TOF 질량 스펙트로미터 분석으로 확인한 것이다(아래). (B) 모HEp-2, RR-HEp-2 및 RR-#6 세포를 48시간 배양하고, CLIC1 의 단백질(위)과 mRNA(아래)의 발현양을 웨스턴블롯과 RT-PCR로 나타낸 것이다. β-엑틴은 로딩 대조군으로 사용한 것이며, GADPH는 세포내 대조군으로 사용하였다. (C) 모HEp-2 와 RR-HEp-2 세포를 48시간동안 배양한 후, 각 세포에서의 CLIC 1 발현의 광학이미지를 보여준 것(좌)이며, DAPI 염색으로 핵을 가시화한 것이다(우). (D) 모HEp-2세포주를 10Gy 방사선을 조사한 후, 공지한 시간(위) 또는 24시간(아래) 배양하였다. CLIC1의 단백질 수준과 절단된 PARP 수준을 웨스턴블롯으로 측정하였고, β-엑틴은 로딩 대조군으로 사용하였다. CLIC1의 광학이미지는 면역형광염색법을 사용하였으며, DAPI를 사용하여 핵을 가시화하였다.
도 5는 (A) 방사선 조사 후, 모HEp-2세포주에서 CLIC1 억제에 의한 세포사멸의 차단을 보여준 것이다. (B) CON은 방사선을 조사하지 않은 대조군을 나타낸 것이며, VEH는 10 Gy의 방사선을 조사한 운반체 단독을 나타내는 것이며, 100 mM DIDS, 10 mM IAA94 또는 5mM NAC 이 존재할 때, 48시간 배양 후, 모HEp-2세포주에서의 절단된 PARP와 CLIC1의 발현을 웨스턴블롯으로 측정한 것이다. (C) HEp-2세포를 각 공지한 방사선량으로 조사하고 10μM의 IAA94가 존재할 때와 부재(CON)할 때를 비교해서 생존분획을 나타낸 것이다. (D 내지 F) HEp-2 세포에 대조군 siRNA(siCON)을 형질감염시킨 군 또는 100nM의 CLIC1 siRNA(siCLIC1)을 형질감염시킨 군을 48시간동안 배양한 후, 10 Gy의 방사선을 조사한 후, 추가적으로 48시간을 더 배양 하였다(D와 E). (F)는 공지한 방사선량으로 조사하였다. 세포생존은 FACScan 유세포분석기를 사용하여 측정하였으며, PI-양성세포의 퍼센트로 나타내었다(A 내지 D). 절단된 PARP의 단백질수준과 CLIC1의 단백질발현수준은 웨스턴블롯으로 측정하였다(B와 E). β-엑틴은 로딩 대조군으로 사용하였다. 집락형성 생존분획은 트립판 블루염색에 의해 집락형성이 가시화되었으며, 자동화 콜로니 계수기에 의해 정량화되었다(C와 F).
도 6은 방사선 조사 후, RR-HEp-2세포에서 정규장소 밖의 CLIC1의 과발현에 의한 세포사멸유도를 나타낸 것이다. CON은 RR-HEp-2세포에 빈 벡터를 형질감염시킨 것이며, CLIC1-myc는 myc-태그된 CLIC1 발현벡터를 형질감염시킨 것을 나타낸 것이다. 상기 세포를 24시간 배양한 후 10 Gy의 방사선을 조사한 후, 추가적으로 48시간 배양하였다. (A) 광현미경을 사용하여 세포의 형태를 관찰하였으며, (B) 세포생존을 FACScan 유세포분석기를 통해서 측정하였으며, 이를 PI-양성세포의 퍼센트로 나타내었다. (C) 절단된 PARP의 단백질수준과 CLIC1의 단백질 발현수준은 웨스턴블롯으로 측정하였다. (D) β-엑틴은 로딩 대조군으로 사용하였다. 집락형성 생존분획은 트립판 블루염색에 의해 집락형성이 가시화되었으며, 자동화 콜로니 계수기에 의해 정량화되었다.
도 7은 5가지 다른 편평암세포주에서 CLIC1의 기능을 본 것이다. (A) SW756, NCI-H596, SiHa, SNU899 및 SNU1076세포를 48시간동안 배양하였다(위). 0 또는 4 Gy의 방사선을 조사하였다(아래). CLIC1의 단백질 발현수준은 웨스턴블롯으로 측정하였다(위). 콜로니 형성은 자동화 콜로니 계수기에 의해 정량화되었다(아래). β-엑틴은 로딩 대조군으로 사용하였다(B와 C). (B) CON은 SNU1076세포에 빈 벡터를 형질감염시킨 것이며, CLIC1-myc는 myc-태그된 CLIC1 발현벡터를 SNU1076세포에 형질감염시킨 것을 나타낸 것이다. 상기 세포를 24시간 배양하였다. (C) SW756H세포에 대조군 siRNA(siCON)를 형질감염시킨 군 또는 100nM의 CLIC1 siRNA(siCLIC1)를 형질감염시킨 군을 48시간 동안 배양한 것이다. 이들을 10 Gy의 방사선을 조사 후 추가적으로 48시간 배양하였다. 절단된 PARP단백질 수준과 Myc(CLIC1) 및 CLIC1은 웨스턴블롯을 통해 측정되었다(위). β-엑틴은 로딩 대조군으로 사용하였다. 세포생존은 FACScan 유세포분석기를 사용하여 측정하였으며, PI-양성세포의 퍼센트로 나타내었다(아래).
도 8은 HEp-2세포에서 방사선에 반응하여 CLIC1과 ROS 생성과의 연관성을 나타낸 것이다. (A) 모HEp-2, RR-HEp-2 및 RR-#6 세포에서의 0 또는 10 Gy의 방사선을 조사한 후, 12시간 후 DCF 염색을 이용해서 세포의 ROS 생성을 상대적인 DCF 값으로 나타내었다. (B) HEp-2세포에서 0 Gy(CON) 또는 10 Gy 방사선을 처리한 VEH, 10μM IAA94의 존재하의 세포의 ROS 생성을 DCF 염색의 상대적인 수준을 나타내었다. NAC 5mM은 방사선-유도 ROS 생성을 감소시키는 양성대조군으로 사용되었다. (C 내지 E) HEp-2세포에 대조군 siRNA(siCON)을 형질감염시킨 군 또는 100nM의 CLIC1 siRNA(siCLIC1)을 형질감염시킨 군을 48시간 동안 배양한 것이다. 0 또는 10 Gy의 방사선을 조사한 후, 12시간 후 DCF 염색을 이용해서 세포의 ROS 생성을 상대적인 DCF 값으로 나타내었다. (D 및 F) CON은 RR-HEp-2세포에 빈 벡터를 형질감염시킨 것이며, CLIC1-myc는 myc-태그된 CLIC1 발현벡터를 형질감염시킨 것을 나타낸 것이다. 이를 24시간 동안 배양하였다. 0 또는 10 Gy의 방사선을 조사한 후, 12시간 후 DCF 염색을 이용해서 세포의 ROS 생성을 상대적인 DCF 값으로 나타내었다. CLIC1, Mn-SOD 및 PRDX2의 전사수준을 정량적인 RT-PCR과 전형적인 RT-PCR로 측정하였다. GAPDH는 로딩 대조군으로 사용하였다.
이하, 본 발명을 실시예를 통해 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 하기의 실시예는 설명을 위해 제시되는 것이며, 본 발명의 범위를 한정하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
실시예 1. 세포의 준비 및 처리
사람 후두암세포주인 HEp-2 세포와 사람 자궁경부암 세포주 SiHa 및 SW756 세포와 사람 편평상피 기관지 암세포 NCI-H596세포를 American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA)로부터 구매하였다. 사람 후두암 세포주 SNU-899 와 SNU-1076 세포는 한국 세포주은행에서 얻었다. HEp-2, SiHa 및 SW756 세포는 10% FBS가 포함된 DMEM (Gibco-BRL, Rockville, MD, USA) 배지에서 배양하였으며, NCI-H596, SNU899 및 SNU1076 세포는 10% FBS가 포함된 RPMI 1640 배지에서 배양하였다. 모든 세포는 5% CO2가 있는 37℃ 배양기에서 배양하였다. 세포는 3.81 Gy/min 방사선량으로 137Cs선(Atomic Energy of Canada, Mississauga, Canada)을 사용하여 조사하였다.
억제제실험에서, 방사선 조사하기 전에 하기의 화학물질을 30분간 처리하였다. 이는 CLIC1의 활성을 억제하기 위한 것으로, DIDS(4,4'-diisothiocyanatostilbene-2,2'-disulfonic acid) 와 IAA94( indanyloxyacetic acid-94)을 사용하였다. NAC(N-acetyl cysteine)은 ROS 생성을 보기 위해 사용하였다.
실시예 2. 방사선저항성 사람 HEp-2 후두암세포주의 확립 및 특성 확인
방사성저항성 후두암세포주를 확립하기 위해, HEp-2세포를 5X103 세포/cm2의 밀도로 100mm 디쉬에 세포를 깔고, 하룻동안 배양하였다. 그 후, HEp-2세포를 총 방사선량이 60 Gy에 축적될 때까지 15주 동안 일주일에 2번씩 2Gy의 방사선에 노출시켰다. 방사선이 조사된 세포가 80~90% 자라면 계대배양하고, 이어서 방사선조사를 계속하였다.
2-1. 집락형성분석
방사선 민감성은 집락형성분석법(Clonogenic assay)으로 측정하였다. 보다 상세하게는 모HEp-2세포주 또는 RR-HEp-2세포주에 0~6 Gy의 다양한 범위의 방사선량을 단독 조사하였다. 방사선조사 후 즉시 세포를 트립신 처리를 해서 떼어내고 희석한 후, 60mm 조직 배양 디쉬에 다양한 밀도로 세포를 깔았다. 대조군의 경우 200개 세포, 2 Gy 방사선 처리 세포군의 경우 400개 세포, 4 Gy 방사선 처리 세포군의 경우 1500개 세포, 6 Gy 방사선 처리 세포군의 경우 3000개 세포를 깔았다. 10~14일이 지난 후, 콜로니를 99.5%의 메탄올로 고정시키고, 트립판 블루용액으로 염색하여 관찰하였다.
그 결과, 방사선 조사된 HEp-2 세포군(이하 'RR-HEp-2'라 명명함)과 RR-HEp-2 세포군에서 분리된 아형 클론(RR-#6,12,13 및 18)들은 모HEp-2세포(대조군세포)에 비해 0~6Gy의 범위의 방사선조사에서 더욱 높은 방사선저항성을 나타내었다(도 1A). 4 Gy 방사선조사 후, 집락(colony)이 형성되었고, 이는 트립판 블루 염색을 통해 볼 수 있었다. 특히, 모HEp-2세포에 비교하여, RR-HEp-2세포와 RR-#6세포에서 크게 증가한 것을 관찰할 수 있었다(도 1B).
2-2. 전형적인 PCR분석과 정량적인 PCR분석
RNA STAT-60 (Tel-Test B,Friendswood, TX, USA)을 사용하여 전체 RNA를 분리하였다. 역전사반응은 ImProm-IITM 역전자효소를 (Promega)를 사용하여 70℃에서 5분간의 결합반응과 42℃에서 60분간의 첫가닥의 연장반응을 수행하였다. 전형적인 PCR 분석을 위해 하기와 같은 프라이머와 반응조건을 사용하여 실험을 진행하였다. CLIC1에 대한 프라이머는 센스 5'-atggctgaagaacaaccg-3' (서열번호 1) 및 안티센스 5'-ttatttgagggactttga-3' (서열번호 2)의 프라이머쌍, Bcl-xl에 대한 프라이머는 센스 5'-cgggcattcagtgacctgac-3' (서열번호 3) 및 안티센스 5'-tcaggaaccagcggttgaag-3' (서열번호 4)의 프라이머쌍, EGFR에 대한 프라이머는 센스 5'-cgtcgctatcaaggaattaag-3' (서열번호 5) 및 안티센스 5'-tggtgggtatagattctgtg-3' (서열번호 6)의 프라이머쌍, GAPDH 에 대한 프라이머는 센스 5'-catctctgccccctctgctga-3' (서열번호 7) 및 안티센스 5'-ggatgaccttgcccacagcct-3' (서열번호 8)의 프라이머쌍, ERBB2에 대한 프라이머는 센스 5'-catatgtctcccgccttctg-3' (서열번호 9) 및 안티센스 5'-cccacacagtcacaccataac-3' (서열번호 10)의 프라이머쌍, Hsp90에 대한 프라이머는 센스 5'-ttggaggaacgaagaataaagg-3' (서열번호 11) 및 안티센스 5'-gggctctgaattccaactgtc-3' (서열번호 12)의 프라이머쌍, Mn-SOD에 대한 프라이머는 센스 5'-tgttacagcccagatagc-3' (서열번호 13) 및 안티센스 5'-cagttacattctcccagttg-3' (서열번호 14)의 프라이머쌍, PRDX2 에 대한 프라이머는 센스 5'-aaagggaagtacgtggtc-3' (서열번호 15) 및 안티센스 5'-gggcttaatcgtgtcactg-3' (서열번호 16)의 프라이머쌍, TRM112-like protein에 대한 프라이머는 센스 5'-cttacccacaatctgctg-3' (서열번호 17) 및 안티센스 5'-gaacatacgtccagattcc-3' (서열번호 18)의 프라이머쌍을 사용하여 55℃에서 결합반응을 시키고, 31회 반응시켰다.
정량적인 실시간 PCR의 경우, chromo 4 cycler (Bio-Rad) 및 SYBR Premix ExTaqTM (Takara Bio, Shiga, Japan)을 사용하여 실험을 진행하였고, 증폭신호는 GAPDH 에 대한 타겟유전자를 표준화하였다.
RR-HEp-2세포의 방사선저항성 표현형을 확인하기 위해 방사선치료에서 암 방사선저항성에 연관된 EGFR, Bcl-2, Hsp 및 SOD 계의 몇 가지 조절신호분자의 전사패턴을 비교해 보았다(도 1C). 전형적인 PCR 결과, 모HEp-2세포에 비교하여, RR-HEp-2세포와 RR-#6세포에서 크게 증가한 것을 관찰할 수 있었으며, 이는 정량적인 실시간 PCR 데이터와 일치하는 결과를 보였다(도 1D).
2-3. 세포증식분석
모HEp-2세포와 RR-HEp-2세포의 세포증식과 사멸에서 방사선조사의 효과를 알아보기 위해, 대조군으로 방사선을 조사하지 않은 세포와 4 또는 10 Gy 방사선을 조사한 세포를 명시된 기간동안 배양하였다. 대조군과 방사선 조사한 군 모두에서 모HEp-2세포에 비교하여, RR-HEp-2세포와 RR-#6세포에서 더욱 활발히 세포가 증식함을 알 수 있었다(도 2A). 이는 확립된 RR-HEp-2 세포주는 방사선의 성장억제효과를 극복하는 능력을 가지고 있음을 암시하는 것이다.
2-4. FACS를 통한 세포사멸분석
10Gy의 방사선 조사는 모HEp-2세포주의 세포사멸을 야기시켰다. 반면, RR-#6 과 RR-#13 아형군을 포함하는 RR-HEp-2세포주에서는 방사선 매개 세포사멸은 억제되는 것을 FACS 분석을 통해 알 수 있었다(도 2B).
2-5. 웨스턴블롯을 통한 세포사멸분석
세포를 50mM Tris-HCl (pH 7.4), 150mM NaCl, 1% Nonidet P-40 및 0.1% SDS이 포함된 완충용액에 용해시켰다. 단백질은 SDS-PAGE 상에서 분리시키며, 니트로셀룰로오스 멤브레인으로 옮겼다. 멤브레인을 5% 탈지분유에 차단시키고, 이차항체를 상온에서 1시간 붙였다. 그 후, 다음과 같은 항체를 사용하여, 검출하는데 사용하였다. 래빗 폴리클로날 항-절단된 폴리 ADP-리보오스 폴리머레이즈 (PARP) (Asp214) (Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA), 마우스 모노클로날 항-벡타엑틴(Sigma), 마우스 모노클로날 항-CLIC1, 항-EB1, 항-PSMA1, 항-PSMA6, 항-TPI1, 항-AKR1A1 (ALD) 및 항-PDIA3 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), 래빗 폴리클로날 항-ECH1 (Santa Cruz Biotechnology), 고트 폴리클로날 항-NP 및 항-TCP1 (Santa Cruz Biotechnology), 마우스 폴리클로날 항-APRT 및 항-TALDO1(Abcam, Cambridge, UK), 래빗 폴리클로날 항-PRPS2 (Abcam), 래빗 폴리클로날 항-PRDX2 (Lab frontier, Seoul, Korea), 및 마우스 모노클로날 항-PCBP2(ABGENT, San Diego, CA, USA). 블롯은 퍼옥시다이즈가 접합된 이차항체와 ECL 시스템(Amersham Life Sciences, Piscataway, NJ, USA)을 사용하여 현상하였다. 세포사멸의 전형적인 마커인 절단된 PARP의 수준과 핵기포(nuclear blebbing)의 PI(propidium iodide)염색 결과(도 2C)에서도 RR-HEp-2세포주에서 방사선 매개 세포사멸이 억제되는 결과를 얻을 수 있었다. 이러한 결과는 전형적인 생리학적, 분자적 특성을 확인해 볼 때, 확립된 RR-HEp2 세포주는 방사선저항성 표현형을 가진다는 것을 확인하였다.
실시예 3. 모HEp-2세포주와 RR-HEp-2세포에서의 차등적인 단백질 발현양상 확인
3-1. 2-D PAGE 분석
RR-HEp 세포 또는 분리된 아형클론들에서 발현이 다르게 조절되는 단백질에 대해 확인해 보기 위해서 모HEp-2세포주와 모든 RR-HEp-2세포군의 단백질발현 프로파일을 2-D PAGE 분석을 통해 확인하였다.
모HEp-2세포주와 RR-HEp-2세포주를 2-D PAGE 완충용액 200㎕에 용해시켜서, 프루브 초음파 세포 파쇄기(Branson Ultrasonic Corporation, Danbury, USA)를 이용하여 초음파를 쬐어 세포를 분쇄한 후, 12000rpm에서 15분간 원심분리하였다. 단백질의 농도는 마이크로 브래드포드 어세이(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)로 측정하였고, 각 150㎍의 세포 용해물을 재수화 완충용액과 섞어주었다. 첫번째 일차원적 분리는 IPG 스트립에서 IPGphor 등전점 시스템을 이용하여 수행하였다. 총 포커싱 시간은 60000Vh 이며, 포커싱이 끝난 후, 스트립은 평형을 유지시켰다. 이차원적 전기영동은 PROTEAN II xi 2-D 세포 (Bio-Rad Laboratories) 시스템에서 12.5% SDS-PAGE (18.3 X 20 cm)을 이용하여 5시간 동안 50 mA로 진행하였다. 2-D 젤의 모든 단백질 스팟(spot)은 SDS-PAGE 후에 실버-염색방법을 이용하여 시각화하였다. 보다 상세하게는 2-D PAGE 후, 젤은 40% 에탄올과 10% 아세트산을 포함하는 첫번째 용액에 30분간 처리하여 고정시켰다. 고정된 젤은 30% 에탄올과 0.1% 글루타알데히드, 0.2% 티오황산나트륨 및 6.8% 아세트산 나트륨(w/w)을 포함하는 두번째 용액에 30분간 처리하였다. 그 후, 젤을 이차증류수에 5분간 3번 세척하였다. 세척한 젤은 0.25% 질산은과 0.01% 포름알데히드가 포함된 세번째 용액에 반응시켰다. 그 후, 젤을 이차증류수에 2분간 세척하였다. 스폿은 2.5% 탄산나트륨과 0.01% 포름알데히드가 포함된 용액으로 가시화하였다. 1.5% EDTA-2Na2H2O로 현상을 중지 시켰으며, 실버염색이 끝난 후, 젤은 200 해상도로 스캔하였고, ImagemasterTM 2D platinum software (Amersham Bioscience)로 분석하였다.
그 결과, 각 젤에서 ImagemasterTM 2D platinum software에 의해 평균 850 단백질을 관찰할 수 있었으며, 4번의 독립적인 실험을 수행하여 1.5배 이상 변화가있는 20개의 단백질 스팟을 선정하였다(도 3A). 모세포주와 차이가 나는 단백질 20개는 표 1에 나타내었다.
Figure pat00001
3-2. MALDI - TOF 분석
20개의 단백질들 중, 16개의 단백질을 MALDI-TOF 매스 MS분석에 의해 성공적으로 동정하였다.
MALDI-TOF 매스 MS분석방법은 다음과 같다. 먼저, 차등적으로 발현된 단백질 스팟들은 젤에서 잘라내었다. 모든 스팟은 실버염색을 탈염시키고, 젤을 트립신을 이용하여 분해시켰다. MALDI-TOF 플레이트에 마른 트립신 처리된 펩타이드을 동시에 CHCA(Sigma-Aldrich Chemie,Taufkirchen, Germany)용액으로 구성된 매트릭스에 적용하였다. MS 모드에서 Voyager-DETM STR Workstation (Applied Biosystems, Framingham, MA, USA)을 이용하여 MS로 분석하였다. 각각의 스펙트럼을 DataExplorerTM (version 4.5,Applied Biosystems) 소프트웨어에서 열었고, 가장 높은 질량이 60 미만인 것들을 S/N 한계점 초기 셋팅에 의해 선택하였으며, 개선된 베이스 라인으로 수정하였다. 스펙트럼은 트립신 자가분해 (m/z 842.5100, 2211.1046 및 2283.1807)로 인해 두 개 이상의 펩타이드로 측정하였다. 피크목록은 Mascot public interface로 복사되며, Very intense trypsin peaks (m/z 842.5100, 1045.5642, 2211.1046 및 2283.1807)는 상기 피크 목록에서 제외된다. 단백질의 동정은 직렬 질량 스펙트로 메트릭 데이터를 기본으로 PMF로 획득 하였으며, Swiss-Prot 단백질 데이터 베이스로부터 정보를 얻었다. 편집된 피크목록은 Swiss-Prot 데이터베이스에 의해 검색된 것이다.
그 결과, HEp-2세포와 RR-HEp-2세포의 각 젤 이미지를 확대해서 나타냈다(도 3B). 동정된 16개의 단백질 중 14개의 단백질 (APRT1, PRDX2, TRM112L, PCBP2,TALDO1, ECH1, PSMA1/6, PRPS2, NP, TPI1, ALD, TCP1 및 PDIA3)이 모HEp-2세포에 비교하여, RR-HEp-2세포에서의 발현수준이 증가되는 것을 확인하였다. 반면에, CLIC1과 EB1 단백질들은 RR-HEp-2세포에서 발현수준이 감소한 것을 확인하였다. 표 1에서 알 수 있듯이, PCBP2의 단백질 발현수준은 RR-HEp-2세포에서 모HEp-2세포주보다 2.49배 높게 나타나며, 반면 CLIC1단백질은 RR-HEp-2세포에서 모HEp-2세포주보다 2.05배 낮게 나타나는 것을 알 수 있다. PRDX2는 유방암과 두경부암세포의 방사선저항성을 증가시키는 항-산화 단백질로 알려져 있으며, 따라서 RR-HEp-2세포에서 1.86배 발현이 증가됨을 관찰할 수 있었다. 이는 2-D 젤 데이터와 세포의 방사선저항성 표현형과 연관성이 있음을 나타내는 결과이다.
3-3. 웨스턴분석을 통한 단백질분석
다른 발현양상을 보인 단백질들은 웨스턴블롯 분석을 통해 더욱 심도있게 분석해 보았다(도 3C). 상기 실시예 2-5의 웨스턴블롯 분석방법과 동일하게 실험을 진행하였다.
그 결과, RR-HEp-2세포에서 CLIC1과 EB1의 단백질발현이 줄어든 것을 관찰할 수 있었으며, 반면에 다른 모든 단백질들은 RR-HEp-2세포에서 상향-조정된 된 것을 알 수 있었다. 특히, TRM112L 단백질은 본 발명에서 동정된 신규한 단백질이다. 이 TRM112L의 mRNA 발현수준은 예상한 바와 같이 모HEp-2세포보다 RR-HEp-2세포에서 더욱 높게 발현되었다(도 3D). 따라서 TRM112L의 단백질 발현 또한 RR-HEp-2 세포에서 높을 것이다. 모Hep-2세포와 방사선저항성 RR-HEp-2세포간의 단백질 유전정보 결과를 확인하기 위해 각각의 같은 단백질 스팟을 RR-HEp-2 아형클론(RR-#6, 12, 13 및 18)의 2-D 젤 맵과 비교를 통해 분석하였다. HEp-2세포와 분리된 RR-HEp-2 아형 클론의 각 젤 이미지를 확대하여 나타내었다(도 3E). 이상하게도 분리된 아형클론에서 단지 8개의 단백질 스팟만이 모HEp-2세포와 비교하여, 적게 발현된 것을 관찰하였다. 이는 RR-HEp-2 세포에서 8개의 단백질 스팟의 단백질유전정보 분석결과 비교와 상반된 패턴을 보여주었다. 주목할 만한 점은, 동정된 단백질의 대부분은 방사선저항성/스트레스 반응의 조절자로서 역할을 한다는 것이다(표 2).
Figure pat00002
실시예 4. CLIC1의 기능 확인
4-1. CLIC1의 기능분석
방사선저항성 표현형의 세포에서 발현이 크게 감소한 CLIC1의 기능에 대해 알아보았다. RR-HEp-2 세포에서 스팟 2의 발현이 모HEp-2세포주와 비교해서 발현이 감소한 것을 알 수 있었으며(도 4A), MALDI-TOF-MS을 사용하여 CLIC1을 동정하였다(도 4A). HEp-2세포주를 이용하여 직접적으로 CLIC1 발현을 관찰하였다. 웨스턴블롯과 실시간 PCR 분석을 통해 RR-HEp-2세포에서 CLIC1의 단백질과 mRNA 발현 모두 확연히 감소한 것을 확인하였다(도 4B). 이러한 결과는 RR-HEp-2세포에서 CLIC1 의 급격한 단백질 감소을 보여주는 것이며, 이는 전사적 조절에 의한 것이라고 할 수 있다. HEp-2 및 RR-HEp-2 세포에서 CLIC1의 세포내의 위치를 결정하기 위해 면역 형광 광학현미경 분석을 수행하였다. CLIC1은 주로 핵에 분포하고 있으며, 정상 HEp-2세포의 세포질에서 낮은 수준으로 퍼져있음을 확인하였다. 그러나, RR-HEp-2 세포에서의 CLIC1의 발현은 핵과 세포질 모두에서 매우 적은 것을 확인할 수 있었다(도 4C). 흥미롭게도, 모HEp-2세포에서는 방사선 조사 시간에 따라 CLIC1의 발현이 상향조절됨을 확인할 수 있었다(도 4D). 이것으로 CLIC1이 방사선-반응성 단백질임을 확인하였다. 또한, CLIC1 단백질의 유도와 함께 절단된 PARP도 방사선조사 시간에 따라 발현양이 증가됨을 관찰할 수 있었다(도 4D).
이러한 결과를 종합해보면, CLIC1은 후두암 세포에서 획득된 방사선저항성의 음성적인 조절자임을 시사한다.
4-2. 화학적억제제를 이용한 CLIC1기능 분석
후두암세포의 획득된 방사선저항성 표현형에서 CLIC1의 역할에 대해 밝히기 위해 화학적 억제제를 사용하여 HEp-2세포에서 잃어버린 기능을 알아보았다.
HEp-2세포는 10Gy 방사선조사 후, 세포사멸을 겪었다. 반면에, 특별한 억제제로서 IAA94(indanyloxyacetic acid-94) 또는 일반적인 염화물 채널 억제제로서 DIDS(4,40-diisothiocyanatostilbene-2,20-disulfonic acid)을 미리 처리하여 CLIC1 을 불활성화시키면, 눈에 띄게 방사선에 의한 세포사멸축적이 차단되는 것을 알 수 있었다(도 5A). NAC(N-acetyl cysteine)는 ROS 생성을 감소함으로써 방사선-유도 세포사멸을 억제하는 양성대조군으로 사용하였다. 절단된 PARP의 발현은 방사선조사된 HEp-2세포에서 유도되었으며, 같은 CLIC1 화학억제제의 선처리에 의해 감소 되었으며(도 5B), 비슷한 세포사멸양상을 보였다.
화학 억제제들의 항-세포자멸사 효과를 확인하기 위해, HEp-2세포에서 0~6Gy 범위의 방사선을 조사하여 상기 실시예 2-1과 유사한 방법으로 집락형성 분석을 수행하였다. IAA94의 선처리는 아무런 처리도 하지 않은 대조군에 비해 HEp-2세포에서 세포생존을 유도하였다(도 5C).
다음으로, HEp-2 세포의 방사선-유도 세포사멸에서 CLIC1의 직접적인 녹-다운 효율을 알아보았다. 이는 siRNA(small interfering RNA)의 일시적인 형질감염에 의해 수행되었다. CLIC1-특이적인 siRNA를 바이오니아에서 구매하였고, 이 siRNA 올리고뉴클레오나이드를 90℃에서 20분간 가열하여 이차원적 구조로 분해시켰다. 센스가닥과 안티센스가닥을 30℃에서 1시간 정도 결합시켰다. Metafectine reagent (Biontex, M.unchen, Germany)을 이용하여 모HEp-2세포로 100nM siRNA를 형질감염시킨 후, 세포 성장 배지에서 37℃에서 48시간 배양하였다. CLIC1의 발현이 siRNA 형질감염에 의해 크게 억제되는 것을 웨스턴블롯 분석으로 확인할 수 있었다(도 5E). 이러한 환경하에서, HEp-2 세포의 방사선 유도세포사멸은 대조군 siRNA 형질감염 HEp-2 세포와 비교해 볼 때, 억제된 것을 관찰할 수 있었다(도 5D). 추가적으로 집락형성분석에서 siRNA를 사용하여 CLIC1 발현의 억제를 보니, 이것은 화학억제제를 사용하여, CLIC1 활성을 억제한 결과와 같은 결과를 보였다(도 5F). 이것은 CLIC1 활성의 억제나 발현의 억제는 HEp-2 세포의 방사선저항성 표현형을 획득하는데에 중요한 역할을 한다는 것을 알 수 있다. 다음으로, 비교적으로, 모 HEp-2 세포에서는 억제되어 나타나지만 RR-HEp-2 세포에서 얻어진 CLIC1의 기능에 대해 연구하였다.
4-3. CLIC1의 발현분석
CLIC1의 정규장소 밖의 발현 실험을 통해 알아보았다. HEp-2 세포에서 얻은 CLIC1 cDNA를 BamHI 과 XhoI 의 제한효소로 잘라서 이와 상응하는 부위의 pcDNA 3.1(+) Myc/His 벡터에 클로닝하였다. RR-HEp-2 세포는 Metafectine reagent (Biontex)를 이용하여 대조군 벡터 또는 CLIC1 발현벡터에 형질감염시켰다. Metafection-DNA 복합체는 상온에서 20분간 배양하고, 세럼이 없는 배지에 희석하여 세포에 첨가하였다. 24시간 동안 성장배지에서 배양한 후, 형질감염된 세포를 방사선 조사 후, 추가적으로 48시간 배양한 후, 정규장소 밖의 CLIC1 발현을 관찰하였다.
예상했던 바와 같이, 방사선에 반응한 세포사멸은 대조군 벡터가 형질감염된 세포에 비교하여, myc-태그된 CLIC1 발현벡터가 형질감염된 RR-HEp-2세포에서 더욱 명확하게 관찰 되어졌다(도 6A). 도 6A에서와 같이, 세포의 형태의 변화와 함께 RR-HEp-2세포에서 정규장소 밖의 CLIC1 과발현은 방사선 조사후, 세포사멸을 매우 빠르게 촉진시키는 것을 알 수 있다. 이는 FACScan 유세포분석기로 측정하였다(도 6B). 정규장소 밖의 CLIC1단백질의 과발현을 웨스턴블롯으로 관찰하였으며, 그 결과, 동일한 CLIC1 의 과발현된 상태에서, 방사선 조사 전 후의 절단된 PARP의 발현양의 확연한 차이를 관찰할 수 있었다(도 6C). 또한 집락형성분석에서 CLIC1의 과발현이 다양한 양의 방사선노출에서 RR-HEp-2세포의 생존을 억제한다는 것을 밝혔다(도 6D).
따라서, CLIC1이 HEp-2 후두암세포의 방사선민감성에 기여한다는 것을 알 수 있다.
실시예 5. CLIC1의 역할
다른 편평세포암종 세포주에서 방사선 저항성이 발달하는데 CLIC1의 역할에 대해 조사해보았다. 보다 상세하게는 5가지의 암세포주를 사용하였다. 자궁경부암세포로 SiHa와 SW756, 간암세포로 NCI-H596, 후두암세포로 SNU-899 와 SNU-1076 을 사용하여 실험하였다. 각 세포주의 방사선-민감성을 4Gy 방사선에 반응하는 집락 형성비율로 측정하였다. 집락형성분석에서 SW756, NCI-H596 및 SiHa세포에서는 방사선민감성 표현형이 나타났으며, SNU899 및 SNU1076 세포에서는 방사성저항성 표현형을 보였다(도 7A). 이와 함께, 방사선 민감성을 보인 세포주에서 방사선저항성을 보인 세포주에 비해 CLIC1이 더욱 많이 발현된 것을 관찰할 수 있었다. 이는 CLIC1 발현이 편평세포암종에서 방사선 민감도에서 중요한 역할을 한다는 것을 시사한다. SNU1076세포에서 정규장소 밖의 CLIC1의 과발현은 방사선-유도 세포사멸을 촉진시키는 반면, SW756세포에서 siRNA-매개된 CLIC1 억제는 방사선-유도 세포사멸을 억제한다는 것을 절단된 PARP의 웨스턴블롯 분석과 FACScan 유세포분석기를 통해 측정하였다(도 7B 및 7C). 이러한 결과로 CLIC1이 편평세포암종 세포주에서 방사선민감성과 저항성을 보이는데 크게 연관되어 있다는 것을 알 수 있었다.
실시예 6. CLIC1 과 ROS 생성의 연관성
방사선-유도 ROS 생성이 세포사멸의 매개자로서 매우 중요한 역할을 하기 때문에, 사람 HEp-2 후두암세포주에서 방사선이 세포 ROS 수준을 조절하는데 관여하는지에 대해 조사해 보았다.
10 Gy의 방사선을 조사한 세포를 10㎍/㎖ 의 DCF-H (2′,7′-dihydrodichlorofluorescein)와 함께 20분간 배양한 후, ROS를 검출하였다. 세포를 트립신화하여 회수한 후, 차가운 PBS로 3번 세척하고, FACScan 유세포분석기로 측정하였다. 세포내의 DCF-H의 수준은 488nm 의 자극파장에서 측정하였다. 데이터의 분석은 CellQuest (BD Biosciences,Mountain View, CA, USA)소프트웨어와 평균 형광강도로 분석하였다.
그 결과, 예상과 같이 모HEp-2세포에서는 방사선 조사후, ROS 생성이 확연히 증가한 것을 관찰할 수 있었으며, 반면에 RR-HEp-2 세포에서는 ROS 수준이 특별히 변화하지 않았다는 것을 관찰할 수 있었다(도 8A).
CLIC1이 ROS 생성과 관련이 있는지에 대해 알아보기 위해, HEp-2 세포를 IAA94의 존재나 부재하는 경우에 방사선을 조사하였다. 그 결과, IAA94가 존재하여, CLIC1의 활성이 억제되었을 경우, 방사선-유도 ROS 생성이 급격히 줄어드는 것을 관찰할 수 있었다(도 8B). 또한 si-RNA를 사용하여, 직접적으로 CLIC1 발현을 억제한 경우에도 방사선-유도 ROS 생성이 억제된 것을 관찰할 수 있었다(도 8C). 다음으로 이들은 RR-HEp-2 세포에서 CLIC1 과 ROS 생성의 연관성에 관해 알아보기 위해 CLIC1 발현벡터 시스템을 사용하여 실험하였다. RR-HEp-2세포에서 방사선 조사 후, 정규장소 밖의 CLIC1 과발현은 세포 ROS 축적을 이끌었다(도 8D).
이것을 종합해 볼 때, CLIC1이 ROS 생성의 양성적인 조절자로서 작용을 하며, ROS 신호전달경로의 조절을 통해 HEp-2 세포의 방사선 민감도를 변경할 수 있다.
또 다른 실험으로, HEp-2 세포에서 CLIC1이 항산화 효소인 Mn-SOD 또는 PRDX2의 수준을 직접적으로 조절하는지에 대해 알아보았다. 도 8E 및 8F 에서 보여주듯이, HEp-2세포에서 CLIC1 siRNA 에 의한 CLIC1 발현의 조절 또는 RR-HEp-2세포에서 정규장소 밖에서의 CLIC1 과발현은 방사선 조사하지 않았을 때는 Mn-SOD 및 PRDX2의 전사수준이 변화하지 않았다. 이는 실시예 2-2의 PCR분석방법과 유사하게 실험을 진행하엿으며, 그 결과, 정량적인 실시간 PCR(좌)과 전형적인 PCR(우)분석으로 나타났다.
도 8C 에서 보여지듯이, HEp-2세포에서 siRNA에 의한 CLIC1의 하향조절은 방사선에 반응하여, 세포내 ROS 생성을 저해한다는 것을 알 수 있었다. 하지만, Mn-SOD 및 PRDX2의 전사수준은 유도되지 않았으며, 오히려 그들의 발현이 급격히 감소한 것을 관찰할 수 있었다(도 8E). 이전의 데이터에서 RR-HEp-2세포에서 정규장소밖의 CLIC1 과발현은 방사선 조사에 따라 세포내 ROS 생성을 촉진 시킨데 반해(도 8D), Mn-SOD 및 PRDX2의 전사수준 감소하지 않았고, 오히려 그들의 발현이 증가되는 것을 관찰할 수 있었다(도 8F). 이러한 결과는 Mn-SOD 또는 PRDX2의 수준은 CLIC1 발현과는 독립적이며, 그보다는 세포 내 ROS 수준에 더욱 의존적이라는 것을 알 수 있다.
<110> Korea institute of radiological and medical sciences <120> Composition for diagnosis of radio-resistance or radio-sensitive marker and use thereof <130> PA100666KR <160> 18 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer for CLIC1 <400> 1 atggctgaag aacaaccg 18 <210> 2 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-sense primer for CLIC1 <400> 2 ttatttgagg gactttga 18 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer for Bcl-xl <400> 3 cgggcattca gtgacctgac 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-sense primer for Bcl-xl <400> 4 tcaggaacca gcggttgaag 20 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer for EGFR <400> 5 cgtcgctatc aaggaattaa g 21 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-sense primer for EGFR <400> 6 tggtgggtat agattctgtg 20 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer for GAPDH <400> 7 catctctgcc ccctctgctg a 21 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-sense primer for GAPDH <400> 8 ggatgacctt gcccacagcc t 21 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer for ERBB2 <400> 9 catatgtctc ccgccttctg 20 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-sense primer for ERBB2 <400> 10 cccacacagt cacaccataa c 21 <210> 11 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer for Hsp90 <400> 11 ttggaggaac gaagaataaa gg 22 <210> 12 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-sense primer for Hsp90 <400> 12 gggctctgaa ttccaactgt c 21 <210> 13 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer for Mn-SOD <400> 13 tgttacagcc cagatagc 18 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-sense primer for Mn-SOD <400> 14 cagttacatt ctcccagttg 20 <210> 15 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer for PRDX2 <400> 15 aaagggaagt acgtggtc 18 <210> 16 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-sense primer for PRDX2 <400> 16 gggcttaatc gtgtcactg 19 <210> 17 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer for TRM112-like protein <400> 17 cttacccaca atctgct 17 <210> 18 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-sense primer for TRM112-like protein <400> 18 gaacatacgt ccagattcc 19

Claims (14)

  1. CLIC1(Chloride intracellular channel protein 1, NCBI GenBank Accession No. NM_001288) 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질의 수준을 측정하는 제제를 포함하는 암세포의 방사선 저항성 또는 민감성 진단용 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 APRT1(Adenine phosphoribosyltransferase, NCBI GenBank Accession No. NM_000485), PRDX2(Peroxiredoxin-II, NCBI GenBank Accession No. NM_005809), TRM112L(TRM112-like protein, NCBI GenBank Accession No. NM_016404), PCBP2(Poly(rC)-binding protein 2, NCBI GenBank Accession No. NM_001098620), TALDO1(Transaldolase-1, NCBI GenBank Accession No. NM_006755), ECH1(Enoyl Coenzyme A hydratase 1, NCBI GenBank Accession No. NM _001398), PSMA1(Proteasome subunit alpha type-1, NCBI GenBank Accession No. NM_148976), PRPS2(Phosphoribosyl pyrophosphate synthetase 2, NCBI GenBank Accession No. NM_001039091), NP(Nucleoside phosphorylase, NCBI GenBank Accession No. NM_000270), PSMA6(Proteasome subunit alpha type-6, NCBI GenBank Accession No. NM_002791), TPI1(Triosephosphate isomerase, NCBI GenBank Accession No. NM_000365), ALD(Aldehyde reductase, NCBI GenBank Accession No. NM_006066), EB1(End-binding protein 1, NCBI GenBank Accession No. NM_012325), TCP1(T-complex 1, NCBI GenBank Accession No. NM_030752) 및 PDIA3(Protein disulfide-isomerase A3, NCBI GenBank Accession No. NM_005313) 으로 이루어진 군에서 선택되는 1개 이상의 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질의 수준을 측정하는 제제를 추가로 포함하는 암세포의 방사선 저항성 또는 민감성 진단용 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 암은 두경부암, 후두암, 자궁경부암 또는 대장암인 것인 암세포의 방사선 저항성 또는 민감성 진단용 조성물.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 유전자 mRNA의 수준을 측정하는 제제는 상기 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머를 포함하는 것인 암세포의 방사선 저항성 또는 민감성 진단용 조성물.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 유전자의 단백질 수준을 측정하는 제제는 상기 단백질에 특이적인 항체를 포함하는 것인 암세포의 방사선 저항성 또는 민감성 진단용 조성물.
  6. 제1항 또는 제2항의 조성물을 포함하는 암세포의 방사선 저항성 또는 민감성 진단용 키트.
  7. 제6항에 있어서, 상기 키트는 RT-PCR 키트, DNA 칩 키트, 마이크로어레이 및 단백질 칩 키트인 것을 특징으로 하는 암세포의 방사선 저항성 또는 민감성 진단용 키트.
  8. CLIC1 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머를 사용하여 암환자의 생물학적 시료로부터 mRNA 수준을 측정하는 단계; 및
    상기 mRNA 수준의 변화를 정상 대조구 시료의 mRNA 수준과 비교하는 단계를 포함하는 암 환자의 방사성 저항성 또는 민감성 진단을 위한 정보의 제공 방법.
  9. 제8항에 있어서, APRT1(Adenine phosphoribosyltransferase, NCBI GenBank Accession No. NM_000485), PRDX2(Peroxiredoxin-II, NCBI GenBank Accession No. NM_005809), TRM112L(TRM112-like protein, NCBI GenBank Accession No. NM_016404), PCBP2(Poly(rC)-binding protein 2, NCBI GenBank Accession No. NM_001098620), TALDO1(Transaldolase-1, NCBI GenBank Accession No. NM_006755), ECH1(Enoyl Coenzyme A hydratase 1, NCBI GenBank Accession No. NM _001398), PSMA1(Proteasome subunit alpha type-1, NCBI GenBank Accession No. NM_148976), PRPS2(Phosphoribosyl pyrophosphate synthetase 2, NCBI GenBank Accession No. NM_001039091), NP(Nucleoside phosphorylase, NCBI GenBank Accession No. NM_000270), PSMA6(Proteasome subunit alpha type-6, NCBI GenBank Accession No. NM_002791), TPI1(Triosephosphate isomerase, NCBI GenBank Accession No. NM_000365), ALD(Aldehyde reductase, NCBI GenBank Accession No. NM_006066), EB1(End-binding protein 1, NCBI GenBank Accession No. NM_012325), TCP1(T-complex 1, NCBI GenBank Accession No. NM_030752) 및 PDIA3(Protein disulfide-isomerase A3, NCBI GenBank Accession No. NM_005313) 로 이루어진 군에서 선택되는 1개 이상의 유전자의 mRNA 수준을 추가로 측정 및 비교하는 단계를 포함하는 암 환자의 방사선 저항성 또는 민감성 진단을 위한 정보의 제공 방법.
  10. CLIC1의 단백질에 특이적인 항체를 암 환자의 생물학적 시료와 접촉시켜 항원-항체 복합체 형성으로 단백질 수준을 확인하는 단계; 및
    상기 단백질 형성량의 변화를 정상 대조군 시료의 단백질 수준과 비교하는 단계를 포함하는 암 환자의 방사선 저항성 또는 민감성 진단을 위한 정보의 제공 방법.
  11. 제10항에 있어서, APRT1(Adenine phosphoribosyltransferase, NCBI GenBank Accession No. NM_000485), PRDX2(Peroxiredoxin-II, NCBI GenBank Accession No. NM_005809), TRM112L(TRM112-like protein, NCBI GenBank Accession No. NM_016404), PCBP2(Poly(rC)-binding protein 2, NCBI GenBank Accession No. NM_001098620), TALDO1(Transaldolase-1, NCBI GenBank Accession No. NM_006755), ECH1(Enoyl Coenzyme A hydratase 1, NCBI GenBank Accession No. NM _001398), PSMA1(Proteasome subunit alpha type-1, NCBI GenBank Accession No. NM_148976), PRPS2(Phosphoribosyl pyrophosphate synthetase 2, NCBI GenBank Accession No. NM_001039091), NP(Nucleoside phosphorylase, NCBI GenBank Accession No. NM_000270), PSMA6(Proteasome subunit alpha type-6, NCBI GenBank Accession No. NM_002791), TPI1(Triosephosphate isomerase, NCBI GenBank Accession No. NM_000365), ALD(Aldehyde reductase, NCBI GenBank Accession No. NM_006066), EB1(End-binding protein 1, NCBI GenBank Accession No. NM_012325), TCP1(T-complex 1, NCBI GenBank Accession No. NM_030752) 및 PDIA3(Protein disulfide-isomerase A3, NCBI GenBank Accession No. NM_005313)로 이루어잔 군에서 선택되는 1개 이상의 유전자의 단백질 수준을 추가로 측정 및 비교하는 단계를 포함하는 암 환자의 방사선 저항성 또는 민감성 진단을 위한 정보의 제공 방법.
  12. 암환자의 방사선 치료 예후 예측에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 방사선 치료를 받은 환자의 시료로부터 CLIC1의 mRNA 또는 이의 단백질의 수준을 정상 세포의 발현 수준과 비교하여 방사선 저항성 또는 민감성 진단용 마커를 검출하는 방법.
  13. 제12항에 있어서, APRT1(Adenine phosphoribosyltransferase, NCBI GenBank Accession No. NM_000485), PRDX2(Peroxiredoxin-II, NCBI GenBank Accession No. NM_005809), TRM112L(TRM112-like protein, NCBI GenBank Accession No. NM_016404), PCBP2(Poly(rC)-binding protein 2, NCBI GenBank Accession No. NM_001098620), TALDO1(Transaldolase-1, NCBI GenBank Accession No. NM_006755), ECH1(Enoyl Coenzyme A hydratase 1, NCBI GenBank Accession No. NM _001398), PSMA1(Proteasome subunit alpha type-1, NCBI GenBank Accession No. NM_148976), PRPS2(Phosphoribosyl pyrophosphate synthetase 2, NCBI GenBank Accession No. NM_001039091), NP(Nucleoside phosphorylase, NCBI GenBank Accession No. NM_000270), PSMA6(Proteasome subunit alpha type-6, NCBI GenBank Accession No. NM_002791), TPI1(Triosephosphate isomerase, NCBI GenBank Accession No. NM_000365), ALD(Aldehyde reductase, NCBI GenBank Accession No. NM_006066), EB1(End-binding protein 1, NCBI GenBank Accession No. NM_012325), TCP1(T-complex 1, NCBI GenBank Accession No. NM_030752) 및 PDIA3(Protein disulfide-isomerase A3, NCBI GenBank Accession No. NM_005313)로 이루어진 군에서 선택되는 1개 이상의 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질 수준을 추가로 측정 및 비교하는 단계를 포함하는 방사선 저항성 또는 민감성 진단용 마커를 검출하는 방법.
  14. 제12항 또는 제13항에 있어서, 상기 암은 두경부암, 후두암, 자궁경부암 또는 대장암인 것인 방법.







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